JP2664123B2 - スーパーオキシドジスムターゼ遺伝子 - Google Patents
スーパーオキシドジスムターゼ遺伝子Info
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Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】スーパーオキシドジスムターゼ(S
uper oxide dismutase)(「SOD」)は確かに、ほとんどの
生物において見いだされる種々の異なる酵素である。哺
乳動物における１つの機能は、食作用中に天然に産生さ
れる物質であるスーパーオキシドを破壊することであ
る。スーパーオキシドジスムターゼは、酵素と会合した
金属に基礎を置くファミリーとして特徴付けられ、この
金属は鉄、マンガン、銅、及び銅−亜鉛の間で異なる。
例えばウシ−肝臓からのスーパーオキシドジスムターゼ
は臨床的に使用されており、特に、ヒトを含む動物にお
ける抗炎症剤として使用されている。他の用途には、宿
主が種々のスーパーオキシド導発剤、例えば放射線、パ
ラコート等に暴露されることによって生ずるスーパーオ
キシドイオンの除去、ある種の変性疾患、例えば気腫の
予防又は治療、食物の防腐、等が含まれる。従って、特
に、抗炎症剤として又は他の医療目的のために生体内で
使用するために、生理的に許容されるスーパーオキシド
ジスムターゼが安定供給されることが重要である。ヒト
に適用するためには、生ずる可能性がある免疫応答を回
避し又は最小にするために均質な酵素を用いるのが好ま
しい。組換DNA技法を用いることにより、スーパーオキ
シドジスムターゼの所望の生物学的活性、例えば免疫活
性及び酵素活性を有する生成物を効率的に製造する機会
が存在する。 【０００２】 【従来の技術】ヒト−赤血球Cu-Znスーパーオキシドジ
スムターゼのアミノ酸配列は、Jabusch等、Biochemistr
y (1980) 19:2310-2316;及びBarra等、FEBS Letters (1
980) 120:53-55に記載されている。ウシ−赤血球Cu-Zn
SODがSteinman等、J.Biol.Chem.(1974) 249:7326-7338
に記載されている。SOD-1 cDNAクローンがLineman-Hurw
itz等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA (1982) 79:2808-2811
に記載されている。開始コドンから上流の非翻訳領域の
変化が翻訳の効率に及ぼす影響については、Gheysen
等、Gene(1982) 17:55-63; Thummel等、J.Virol(1981)
37:683-697; 及びMatteucci及びHeyneker、Nucl.Acids
Res.(1983) 11:3113-3121を参照のこと。 【０００３】（発明の要旨）ヒト−Cu−Znスーパーオキ
シドジスムターゼの生物学的活性を示すポリペプチドの
効率的な産生が、構造遺伝子の大部分のcDNAを調製し、
リボゾーム結合部位からコード領域中の退化ヌクレオチ
ドに伸びる種々の配列をもたらすアダプターの混合物に
連結し、そして翻訳シグナルを有する完全遺伝子を発現
ベクターに挿入することにより示される。微生物を形質
転換することにより、ヒト−Cu−Znスーパーオキシドジ
スムターゼの生物学的活性を示す有効なポリペプチドの
効率的な生産がもたらされる。遺伝子はさらに、適当な
宿主における分泌のための分泌及びプロセシングシグナ
ルと結合するために使用することができる。 【０００４】ポリペプチドの発現を増強するための新規
な方法が提供され、この方法においては、翻訳開始領域
の種々の配列、すなわちリボゾーム結合部位と翻訳開始
部位との間の領域及びポリペプチドの最初のいくつかの
5'-コドン中の種々の配列（遺伝的コードの冗長な制約
により許容される場合において）を有するアダプターの
混合物が使用される。 【０００５】N-末端においてアセチル化されたポリペプ
チド、及びこのアセチル化ポリペプチドの製造方法も提
供される。目的ポリペプチドの構造遺伝子の5'末端に特
定のアセチル化シグナル配列を設けることにより、この
遺伝子が酵母中で発現される場合にN-末端アミノ酸がア
セチル化されるであろう。アセチル化シグナル配列は、
少なくとも最初の２個のN-末端アミノ酸をコードし、こ
こで第１のアミノ酸はアラニン又はグリシンのいずれか
であり、そして第２のアミノ酸は極性アミノ酸であっ
て、通常はスレオニン、セリン又はアスパラギン酸であ
る。酵母中で産生されるヒト−スーパーオキシドジスム
ターゼのアセチル化は最初の２個のアミノ酸がそれぞれ
アラニン及びスレオニンである場合に示される。 【０００６】（具体的な説明）ヒト−Cu-Znスーパーオ
キシドジスムターゼ(hSOD)の生物学的活性を有するポリ
ペプチドの効率的な発現のための方法及び構成物が提供
される。この方法は、発現宿主における発現のために最
適化された翻訳開始領域と共にhSODのアミノ酸配列の実
質的な部分をコードするDNA配列(hSOD遺伝子)を使用す
る。このhSOD遺伝子は、便利には細胞外培地からSOD生
成物を回収するために分泌を可能にする条件のもとで、
宿主中での発現に適するベクターに挿入する。 【０００７】hSOD及び他のポリペプチドのN-末端アセチ
ル化のための方法及び構成物も提供される。これ以後、
アセチル化とはポリペプチド及び蛋白質のアミノ末端へ
の付加を意味し、天然にも観察されるようなアミノ酸側
鎖、例えばリジンの修飾と対照される。ポリペプチド及
び蛋白質のアセチル化は多くの理由により有用である。
細胞質hSODの場合のようにポリペプチドの天然状態がア
セチル化を含む場合、アセチル化を含む発現法は、望ま
しい天然構造及び配置を有する生成物を提供する。生成
物が医療として使用され、そして／又は試験管内もしく
は生体内診断に使用される場合、アセチル化物は、宿主
に投与され、そして／又は生物学的サンプルに暴露され
た場合に、免疫原性を最小にし又は除去するであろう。
さらに、アセチル化ポリペプチドは一層安定でありそし
てプロテアーゼによる分解に対して一層耐性であり、そ
れ故に細胞、血液、体液及び組織液中に長時間存在する
であろう。 【０００８】hSOD又は他のポリペプチドの構造遺伝子は
その5'-末端にアセチル化シグナル配列を含有し、この
シグナル配列は酵母発現宿主にアセチル化を行わせる。
アセチル化シグナル配列はポリペプチド中の少なくとも
最初の２個のN-末端アミノ酸をコードする。第１のアミ
ノ酸はアラニン、グリシン又はセリンであり、第２のア
ミノ酸は極性アミノ酸又は芳香族アミノ酸であり、通常
はスレオニン、セリン、アスパラギン酸又はフェニルア
ラニンである。 【０００９】これらのアミノ酸は、発現されるべきポリ
ペプチド中に天然に存在する天然N-末端アミノ酸であっ
てよい。これは、第１アミノ酸及び第２アミノ酸がそれ
ぞれアラニン及びスレオニンであるhSODの場合である。
酵母中で発現されそしてアセチル化されるであろう他の
天然アセチル化蛋白質には次のものが含まれる。 【００１０】 【表１】【００１１】この発明はまた、天然にはアセチル化され
ないポリペプチド及び蛋白質をアセチル化するためにも
有用である。アセチル化は、ポリペプチドの構造遺伝子
の5'-末端にアセチル化シグナル配列を連結することに
よって達成される。このアセチル化シグナル配列は少な
くとも２個のアミノ酸（上に記載した）をコードし、そ
して10個まで又はそれ以上のアミノ酸、好ましくは５個
より少ないアミノ酸をコードすることができる。ポリペ
プチドの目的とする活性の妨害又は喪失を制限するため
に追加されるアミノ酸が少ない方が一般に望ましい。便
利には、よく知られている方法に従ってシグナル配列を
合成し、そして構造遺伝子に連結する。アセチル化シグ
ナル配列を構造遺伝子に付加する代りに、ポリペプチド
の最初の２個のアミノ酸の内の１個又は両者を置き換え
るために構造遺伝子の5'-末端を変形することも場合に
よっては可能であろう。このような変形は種々の常法に
従って行うことができる。例えば、構造遺伝子をその5'
-末端の近傍で切断して既知数のヌクレオチドを除去す
る。次に、切断後の接着末端に合成オリゴヌクレオチド
を連結する。このオリゴヌクレオチドは塩基対を復元し
そして置き換えて所望のアセチル化シグナル配列をもた
らすであろう。この方法に代えて、例えばファージM13
を用いる部位特定変異誘発法を用いて構造遺伝子の5'-
末端に適当な変形を行うことができる。 【００１２】hSODを製造するためにはhSODをコードする
DNA配列を得ることが必要である。 【００１３】このような配列を完成するための１つの方
法は、hSODを産生する細胞由来のメッセンジャーRNAか
らcDNAをクローニングする方法である。便利には、この
目的のためにヒト肝臓細胞を用いることができる。DNA
コード配列は未知であるが少なくとも一部分のアミノ酸
配列が知られている場合、cDNAをクローニングした後、
このcDNAを、アミノ酸残基の特定の連鎖をコードするヌ
クレオチドの可能性のあるすべての配列を有するプロー
ブ混合物を用いてスクリーニングする。合成すべき異な
るヌクレオチド配列の数を最小にするようにアミノ酸残
基を選択するのが一般であるが、ヌクレオチドがコード
するアミノ酸残基の選択は幾分任意である。 【００１４】hSODについては、少なくとも19-24位のア
ミノ酸残基をコードするDNA配列を便利に使用すること
ができ、特に、約15以上で且つ約20以下の塩基を有する
プローブ、さらに便利には約17塩基を有するプローブを
使用する。次に、ラベルされたプローブとハイブリド形
成したと思われるクローンを制限酵素で消化し、DNA断
片を画分し、そしてhSOD中のアミノ酸残基の前記の場合
と異なる連鎖をコードする第２シリーズのプローブを特
に用いてハイブリド形成を繰り返す。便利には、これら
のアミノ酸残基は109-114位の残基である。両プローブ
に陽性である１個又は複数個のクローンを見い出し、そ
してこれを、hSODの少なくとも実質的な部分をコードす
るcDNAの入手源として使用することができよう。 【００１５】全く驚くべきことに、hSODについて発表さ
れているアミノ酸配列とcDNAによってコードされている
アミノ酸配列とが、有為な個数の残基において異なるこ
とが見出された。具体的には、２つの公表された配列[J
ahusch等、Biochemistry(1980) 19:2310-2316; 及びBar
ra等、FEBS Letters(1980) 120:153-156)が異なってい
る場合、正しい帰属は11位の残基がアスパラギン酸；17
位の残基がイソロイシン；26位の残基がアスパラギン；
49位の残基がグルタミン酸；52位の残基がアスパラギン
酸；53位の残基がアスパラギン；92位の残基がアスパラ
ギン酸；98位の残基がセリンである（図４参照のこ
と）。 【００１６】リボゾーム結合部位と一般にAUGである翻
訳開始コドンとの間の分離が翻訳に及ぼす影響がはっき
りしないため、この発明の方法は、リボゾーム結合部位
と開始コドンとを分離する距離及びヌクレオチドを変え
る技法を提供する。リボゾーム結合部位と開始コドンと
の間のスペーサー中に、一般に約６〜15個、さらに一般
には約６〜12個のヌクレオチドが存在する。開始コドン
から下流の塩基配列もまた翻訳効率に影響するから、こ
の発明の方法はさらに、遺伝的コードの冗長な制限によ
って許容されるように、ポリペプチドの最初の数個の5'
-コドンの範囲内でヌクレオチド配列の変化（但し長さ
の変化ではない）を提供する。この変形は、開始部位か
ら下流の４コドン以下、さらに一般には２コドンを意図
する。 【００１７】多数のリンカーを調製する。このリンカー
においては、２個以上のヌクレオチド、通常は３個以上
のヌクレオチドであって10個以下のヌクレオチド、通常
は約６個以下のヌクレオチドが異なり、これには、スペ
ーサー内であれば４ヌクレオチドのそれぞれ、あるいは
ポリペプチド構造遺伝子内であれば遺伝的コードの冗長
性によって許容されるように２個、３個又は４個のヌク
レオチドの構成員が含まれる。さらにヌクレオチドの構
成員を異にするリンカーを調製して配列のみならず長さ
も異なる１群のリンカーを得る。長さの相違は、リンカ
ーの合成中に支持体の一部を取り出し、そして適当であ
れば次の段階において合成を継続し、種々の配列長さを
有するリンカーを得る。通常、リンカー混合物は１個以
上６個以下、通常は４個以下のヌクレオチドにより長さ
を異にするであろう。 【００１８】これは、不存在塩基が末端にある場合に便
利に例示することができる。各段階の支持体の一部分を
取り出し、そして各段階において４種類全てのヌクレオ
チド(dNTP)を与えながら、支持体に結合した鎖を用いな
がら合成を続ける。次に、これらの単鎖を部分的に相補
的な単鎖にハイブリド形成せしめる。この場合可変領域
はオーバーハングとなるであろう。こうして、ヌクレオ
チド及び長さの両方において異なるオーバーハングを有
する種々の一連のリンカーが得られるであろう。この後
のハイブリド形成操作、連結操作又はクローニング操作
中の適当な時点でオーバーハング領域を満たし(fill i
n)て、さらに操作することができる二重鎖材料を得る。
この方法は一般に、そして好ましくは試験管内におい
て、DNAポリメラーゼＩのKlenow断片を用いて行う。こ
の方法に代えて、ある場合には、オーバーハングを単鎖
としてクローニングし、形質転換(transform又はtransf
ect)された宿主中で満たす(fill in)することができ
る。相補鎖へのハイブリド形成は、可変ヌクレオチド連
鎖から上流に、リンカーが連結されるべき末端配列中に
存在する配列に相補的である5'-配列を有することによ
って達成することができる。次に、欠損塩基を試験管内
又は生体内において満たす。 【００１９】リンカーはその配列内に、リボゾーム結合
部位と開始コドンとの間の領域の少なくとも一部分を含
有し、好ましくは開始コドンに近い側のヌクレオチドを
含有する。リンカーはさらに、開始コドン及び構造遺伝
子の部分、リボゾーム結合部位、並びにリボゾーム結合
部位から上流の塩基（転写制御配列を含み又は含まな
い）を含有することができる。 【００２０】通常、リンカーは約５塩基以上、さらに一
般的には約20塩基以上であり、そして通常約200塩基以
下、さらに一般的には約100塩基以下である。リンカー
が約35塩基より大である場合、これは通常は次のように
して修正されるであろう。すなわち、相補鎖の一部分の
みと相同な約10〜35塩基の単鎖配列を用い、すなわちオ
ーバーハングを有する相補的なオーバーラップ配列を
得、そして種々の単鎖をハイブリド形成し、連結し、そ
して変化及び／又は種々の長さのオーバーハングを上記
のようにして満たして接着末端及び／又は平滑末端を有
する所望のリンカーを調製する。 【００２１】構造遺伝子が、開始コドンから通常約50塩
基以下下流に便利な制限部位を有する場合には、構造遺
伝子を含有する断片を制限酵素処理し、そしてリンカー
の相補的な接着末端に連結し、又は平滑末端に満たして
この平滑末端をリンカーの平滑末端に連結する。構造遺
伝子が完全であり、そしてリーディングフレームが開始
コドンと整合することを保証するようにリンカーを工夫
する。 【００２２】前記のように、リンカーの調製において、
ヌクレオチド、すなわちコード鎖中の４種類の可能なヌ
クレオチドのそれぞれの無作為な連鎖（前記の遺伝的コ
ードの制限の規則に従う）を有し、そしてリボゾーム結
合部位と開始コドンを仲介又は架橋する領域を規定する
ヌクレオチドの１個又は複数個が欠けて種々の長さを有
する一連のリンカーを得る。単鎖から調製されるこれら
のリンカーを他の単鎖又は二重鎖DNA鎖に連結して、リ
ボゾーム結合部位のみならずリボゾーム結合部位から上
流の塩基も含むことができる延長されたリンカーを得る
ことができる。これに代えて、リンカーは比較的小形で
あり、リボゾーム結合部位の内側又はこれに隣接する部
位から始まり開始コドン部位又は構造遺伝子の内側に延
びるものであってもよい。 【００２３】この発明の構成物を得るために種々の断片
を連結する特定の順番は臨界的ではないが、便利にはま
ず構造遺伝子をリンカーに連結する。このDNA構成物
は、構造遺伝子のみならず、リボゾーム結合部位及びリ
ボゾーム結合部位から上流の任意の追加のヌクレオチド
を含むであろう。さらに、リボゾーム結合部位と開始コ
ドンとの間のヌクレオチド鎖のヌクレオチドの種類及び
個数に実質的な多様性が存在するであろう。この発明の
DNA構成物は、該DNA構成物挿入部位から上流に必要な転
写開始制御配列を有し、下流に転写停止制御配列を有す
る適当な発現ベクターに挿入される。すなわち、リンカ
ーはその5'末端において転写開始制御シグナル配列に接
しそしてその3'においてコード領域の少なくとも一部
分、及び転写及び翻訳停止配列に接して位置するであろ
う（5'-及び3'-は転写の方向を意味する）。 【００２４】適当な宿主に導入するためのプラスミド又
はウイルスDNAを調製した後（通常、操作の適当な段階
において種々のオーバーハング領域を満たすことを含
む）、宿主を形質転換（それぞれ、transform又はtrans
fect）し、クローニングし、クローンをストリークし、
そして目的生成物、例えばhSODの産生を測定することに
よって効率的な発現について個々のクローンを選択す
る。生成物の種々の産生レベルを決定するためにスクリ
ーニングすべきクローンの数は、合成リンカーに導入さ
れた長さの多様性及び配列の変化の程度に依存し、そし
て比例するであろう。例えばこの発明の具体例におい
て、４種類の長さの変化、及びリンカー中の６個のヌク
レオチドの各々における４重の変化が存在すれば、可能
な組換配列の数は5440である。通常、少なくとも数百、
好ましくは数千又はそれより多くのクローンをスクリー
ニングするであろう。スクリーニングは、ニトロセルロ
ース又は他の適当な材料の濾紙に移した宿主細胞コロニ
ー又はウイスルプラークのウエスタンブロット法（生成
物の抗体検出）を用いて効率的に行うことができる。こ
の方法に代えて、電気泳動法により、多数のレーンを用
意して各レーンに個々のクローンを割り当て、生成物の
バンドの染色強度、オートラジオグラフィー又はウエス
タンブロットの観察により、直接的に比較して最も効率
的に発現するクローンを見出すことができる。適当であ
れば、さらに定量的な免疫測定又は酵素測定を使用する
ことができるが、通常は前記のスクリーニング法で十分
である。 【００２５】所望により、この構成物を、この発現構成
物の制御シグナルを認識する他の宿主に移すことがで
き、あるいは他の宿主における効率的な発現を得るため
に必要な制御シグナルを適当な部位に導入することによ
って発現構成物を変形することができる。 【００２６】所望により、hSODを第２のリーダー及びプ
ロセシングシグナルに連結して、hSODの分泌及びプロセ
シングを得ることができる。種々の分泌のリーダー及び
プロセシングシグナルが文献に記載されている。例え
ば、米国特許第4,336,336号、及び同第4,338,397号、並
びに1983年8月12日に出願された係属中の米国特許出願
第522,909号、及び1983年4月26日に出願された係属中の
米国特許出願第488,857号を参照のこと。これらの対応
部分を引用によりこの明細書に組み入れる。 【００２７】宿主として特に好ましいものは、細菌、藻
類、菌類等のごとき原核生物及び真核生物の両者を含む
単細胞微生物である。特に、E.コリ(E.coli)、B.ズブチ
リス(B.subtillis)、S.セレビシエー(S.cerevisiae)、
ストレプトミセス(Streptomyces)、ニューロスポラ(Neu
rospora)が宿主となり得る。 【００２８】単細胞微生物中で用いるために広範囲の種
類のベクターを使用することができ、ベクターはプラス
ミド及びウイルスから誘導することができる。ベクター
は単コピーベクター、又は低コピーもしくは高コピーベ
クターのいずれであってもよい。 【００２９】ベクターはクローニング及び／又は発現の
ために機能するであろう。ベクターに関する多くの文献
が存在し、多くのベクターを商業的に入手することがで
き、そしてベクター及びその制限地図並びに特性を記載
した手引書まで存在するから、ここで検討する必要はな
い。よく知られているように、ベクターは選択を可能に
するマーカーを含有するのが普通であり、このマーカー
は細胞毒剤耐性、栄養要求性又は免疫性をもたらすであ
ろう。しばしば、異なる特性をもたらす多数のマーカー
が使用される。 【００３０】マーカーのほかに、ベクターは複製糸を有
し、そして発現ベクターの場合には通常、転写開始及び
停止の両制御シグナル、例えばプロモーター（単一プロ
モーター又は多数縦列プロモーター）、mRNAキャップ配
列、TATAボックス、エンハンサー、ターミネーター、ポ
リアデニル化配列、及びターミネーターと関連する１個
又は複数個の終止コドンを含有するであろう。翻訳のた
めには、リボゾーム結合部位及び１個又は複数個の終止
コドンがしばしば存在するであろう。もっとも、終止コ
ドンは通常は構造遺伝子と関連しているであろう。これ
とは異なって、これらの制御配列は、ベクターに導入さ
れる構造遺伝子を含有する断片上に存在することもでき
る。 【００３１】通常、構造遺伝子を発現ベクターに挿入す
るために便利な位置に１個又は複数個の制限部位が存在
するであろう。一旦挿入した後、構造遺伝子を含有する
発現ベクターを適当なベクターに導入し、そして宿主を
クローニングしてhSODの効率的な発現を得ることができ
よう。 【００３２】ある場合には、特殊な性質、例えば発現の
温度感受性、転写制御のためのオペレーター又はアクチ
ベーター等をベクターに備えることができる。特に有利
なものは、外的手段、例えば温度、インデューサー、コ
ンプレッサー等により転写を制御することができる能力
であり、この能力がある場合には外的化合物、通常は有
機化合物により転写を誘導し又は抑制することができ
る。 【００３３】hSODが細胞内に産生される場合には、細胞
培養物が高濃度に達した時に便利には遠心分離により細
胞を分離し、溶解し、そして種々の方法、例えば抽出、
アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動、透析、
又はこれらの組み合せによりhSODを分離する。生成物が
分泌される場合には、培地について上記と同様の方法を
用いる。しかしながらこの場合、細胞溶解物の場合に比
べて、培地中の全蛋白質に対する目的生成物の割合が実
質上高いであろう。 【００３４】産生されたhSODは天然のヒト−スーパーオ
キシドジスムターゼと実質上同一のアミノ酸配列を有
し、アミノ酸の相違は一般に５個より少なく、さらに一
般的には２個より少ない。組換hSOD(r-hSOD)は、天然の
hSODと実質上同一の生物学的性質を有する。生物学的性
質には免疫的性質が含まれ、真正なhSODに対して生じた
抗体がr-hSODと交差反応する。さらに、hSODについて用
いる一般的なバイオアッセイにおいて、r-hSOD生成物は
蛋白質重量に対して実質的な比率を示し、通常は真正は
hSODの約10％以上、好ましくは約50％以上、さらに好ま
しくは約80％以上である。代表的な測定法がMarklund及
びMarklund, Eur. J. Biochem.(1974) 47:469-474に記
載されている。次に、例によりこの発明をさらに詳細に
説明する。但し、これによりこの発明の範囲を限定する
ものではない。 【００３５】 【実施例】hSOD cDNAの分子クローニング 成人の肝臓から、グアニジニウムチオシアナート／塩化
リチウム法［Cathala等、DNA(1983) 2:329-335］により
全RNAを調製した。ポリA RNAを用いて２重鎖cDNAを合成
し(Maniatis等、Molecular Cloning, 213-242, Cold Sp
ring Harbor,1982)、そしてこれをセファロースCL4Bカ
ラムに通して350bpより大きいcDNAを濃縮した［Fiddes
及びGoodman, Nature (1979) 281:351-356］。cDNAをp
lot 4のPst I部位に挿入した。p lot 4は、pBR322の誘
導体であって、PstI-EcoRI部位に代えて次に配列を有す
る。 【００３６】 【外１】 【００３７】ｃＤＮＡの挿入にはオリゴdG:dCテーリン
グ法(Maniatis等、前掲)を使用した。この混合物により
E.コリ D1210株を形質転換し、そして形質転換体を10μ
g／mlのテトラサイクリンを含有するL-寒天［Kushner
S.R.(1978) In:Genetic Engineering, Boyer H.B.及びN
icosia S.編、（エルゼビル／北オランダ、アムステル
ダム）17頁］上で選択した。肝臓cDNAライブラリーを構
成するプラスミドDNAを、直径９cmのペトリ皿当り約3,0
00コロニーの密度でプレートした約62,000個の組換コロ
ニーから直接に調製した(Maniatis等、Molecular Cloni
ng, 86〜94頁、Cold Spring Harbor, 1982)。 【００３８】r-hSODクローンの分離 菌株D1210を肝臓cDNAライブラリーにより形質転換し、
そして約40,000のクローンが直径14cmのペトリ皿９枚の上に
増殖した。コロニーをニトロセルロース紙上に移し、そ
してプラスミドDNAのクロラムフェニコール増幅を行っ
た後、細胞を溶解し、そして濾紙をハイブリド形成のた
めに調製した［Ish-Horowicz及びBurke,Nucleic Acids
Research (1981) 9:2989-2998］。オリゴヌクレオチド
プローブを使用してハイブリド形成によるスクリーニン
グを行った。このプローブは、蛋白質のアミノ酸残基第
19-24位をコードするmRNAに相補的な酵素的に放射性ラ
ベルした化学合DNA分子から成り(Jabusch等、前掲；Bar
ra等、前掲)、このプローブ混合物は次の配列を有す
る。 【００３９】 【外２】 【００４０】ペプチドをコードするために示された可能
性のすべて（32種類）を調製した。プローブを、32Ｐを
用いて比活性が１〜３×108cpm／μgとなるようにラベ
ルし、そしてミリポアフィルター(0.45μm)で濾過して
使用した。濾紙を、30℃にて６時間、４×SSC、２×デ
ンハート溶液、40mM燐酸ナトリウム、pH7.5、300μg／m
l超音波処理したサケ試験DNA中で前ハイブリド形成し
た。ハイブリド形成は、２×106cpm／ml hSOD DNAプロ
ーブを含有する上記と同じ溶液中で30℃にて20時間行っ
た。濾紙を、４×SSC中で15分間室温にて１回洗浄し、
そして15分間ずつ２回30℃にて洗浄し、吸取紙を用いて
乾燥し、そして増強スクリーンを用いて-70℃にて24時
間オートラジオグラフ処理した。二重陽性シグナルに対
応するマスタープレート上の領域をL-ブロスに拾い上
げ、そしてミニスクリーン法(Maniatis等、Molecular C
loning, 178,368-369,Cold Spring Harbor, 1982)によ
りプラスミドDNAを調製した。このDNAをPst Iで切断
し、そしてサザンブロセット分析［Southern J., Mol.B
iol.(1975) 98:503-517］にかけた。この方法において
は、まず、あらかじめラベルしたプローブ（アミノ酸残
基第19-24位に対応）とハイブリド形成せしめ、そして
次に追加の放射性ラベルプローブとハイブリド形成せし
めた。このプローブはアミノ酸残基第109-114位に対応
し、そして次の配列を有する（可能なすべての変形、す
なわち72種類の変形が存在する）。 【００４１】 【外３】 【００４２】１つのプラスミドプール(pSOD1)が両プロ
ーブとハイブリド形成する520bpのcDNA挿入部を含有し
ていた。コロニーを精製し、そしてこのクローンからプ
ラスミドDNAを調製した後、Maxam及びGilbertの方法［P
roc. Natl. Acad. Sci. USA(1977)74:560-564］により
配列決定した。結果を図４に示す。hSOD cDNAクローンp
SOD1は、hSODのアミノ酸10-153位のコード領域、１個の
翻訳終止コドン、及び3'非翻訳領域を構成する。従っ
て、発現ベクター構成物においては、アミノ酸1-9位を
コードする領域の塩基配列はhSODの公表されているアミ
ノ酸配列(Jabusch等、前掲；Barra等、前掲）から導
き、そして多様なリンカーセグメントの部分として化学
的に合成する（下記を参照のこと）。プラスミドplot5
の造成（図２及び図３参照のこと）。 【００４３】ハイブリドtrp-lac(tac)プロモーター［De
Boer等、Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983) 80:21-2
5］を含有するプラスミドplot1を次のようにして造成し
た。ptrpL1［Edman等、Nature (1981) 291:503-506］の
180bp HgiA-TaqI断片、及びpKB268 ［Bachman及びPtash
ne, Cell(1978) 13:65-71］からの58bp Hpa II-EcoRI断
片をゲル分離し、そしてこれらの断片を、Pst I及びEco
RIにより消化したpBR322に連結する。得られたプラスミ
ドを用いてD1210株を形質転換し、そしてテトラサイク
リン耐性についてクローンを選択した。プラスミドplot
3を次のようにして造成した。tacプロモーターを含有
するplot 1の155bp Fnu 4HI-EcoRI断片［Fnu 4HI部位は
DNAポリメラーゼＩのKlenow断片（「pol IK」又は「po
l.Klen.」）を用いて平滑末端化したもの］、及び次の
配列、 【００４４】 【外４】 【００４５】を有するΠAN7の18bp Eco RI-PstIポリリ
ンが断片をゲル分離した。pBR322をEcoRIで消化し、pol
IKを用いて平滑末端化し、次にPst Iで消化し、そして
ゲル精製して得た断片に、上記２個の断片を連結した。
この連結混合物を用いてD1210株を形質転換し、そして1
0μg／mlのテトラサイクリンを含有するL-プレート上で
選択した。 【００４６】プラスミドplot5を次のようにして造成し
た。まず、pBR322中のEcoRI-PvuII間をΠAN7のポリリン
カーで置き換えたプラスミドを造成した。これを行うた
めに、プラスミドΠAN7をHind IIIで消化し、pol IKを
用いて満たすことによって平滑末端化し、そしてこうし
て変形したプラスミドΠAN7に、合成した自己相補的Pvu
IIリンカー分子（d(5'-CCAGCTGG-3')）を連結した。Ec
oRI及びPvu IIで消化した後、得られた44bpのポリリン
カー断片（４塩基のオーバーハングを有する）をゲル分
離し、そしてEcoRI-Pvu II置換体としてpBR322にクロー
ニングした。 【００４７】プラスミドplot 3をEcoRIで消化し、そし
てフェノール／クロロホルム抽出及びエタノール沈澱を
行った後、突出している5'-末端をSlヌクレアーゼ［Pal
miter, Biochemistry (1974) 13:3606-3615;Hallewell
及びEmtage, Gene(1980)9:27-47］で処理することによ
って平滑末端化した。フェノール／クロロホルム抽出及
びエタノール沈澱を行った後、DNAをCla Iで消化し、po
l IKにより平滑末端化し、そして調製用ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動によりtacプロモーターを含有する237
bp断片を分離した。次に、この平滑末端tacプロモータ
ー断片をpBR322ポリリンカープラスミド（図３参照）の
Pvu II部位に挿入し、そしてtacプロモーターがpBR322
のβ−ラクタマーゼ遺伝子の方向に転写を指令するクロ
ーンを得た。 【００４８】r-hSODを発現するplot5誘導体の造成 図１に示す合成DNA分子F(26)、C(16)、B(31)、D(11)、E
(13)、及び4(24)をホスホルアミダイト法により合成し
た。単鎖4(24)は、Ｘで示されている各部位において４
種類すべての塩基を用いて合成した。さらに、24マーの
他に21マー、22マー、及び23マーが得られるように24マ
ーの合成からシリカを除去した。シリカ支持体から取り
出した後、４種類の混合物を適当な比率で混合して可能
な単鎖のそれぞれが等モル量となるようにした。この混
合物を次の段階において単一生成物として処理した。 【００４９】分子F(26)、C(16)、B(31)、及びD(11)を等
モル量に混合し、そして10μgをT4ポリヌクレオチドキ
ナーゼを用いて燐酸化した。フェノール／エーテル抽出
の後、追加の非燐酸化合成DNA分子4(24)、及びE(13)を
加え、全ての断片が等モル量となるようにした。この等
モル混合物は、133μlの0.3Ｘキナーゼ緩衝液中に13μg
のDNAを含有する。 【００５０】一定速度で70℃から20℃に60分間にわたっ
て冷却することによりアニーリングした後、200μlの連
結混合物中14℃にて4時間単鎖を連結し、フェノール／
クロロホルム抽出、及びエタノール沈澱を行い、そして
4(24)及びE(13)の5'-末端をT4ポリヌクレオチドキナー
ゼ(Maniatis等、前掲)を用いて燐酸化した。調製用ゲル
電気泳動を用いて、5'-及び3'-オーバーハングを有する
完全に連結された53bpの材料を分離した。 【００５１】次に、上記の精製断片混合物を、図１に示
すようにhSOD cDNAの460bp TaqI-PstI断片に連結した。
この断片自体は、454bp TaqI-AluI hSOD断片を分離し、
これをpol IKを用いて平滑末端化し、そしてこれをplot
5のEcoRI-Sal I部位（図３）（同様にして平滑末端化
しておく）に挿入することにより造成した。この組換体
からプラスミドDNAを調製した後、460bp TaqI-PstI hSO
D断片を調製用ポリアクリルアミドゲル電気泳動により
分離した。抽出及び沈澱を行った後、460bp Taq I-PstI
hSOD断片に合成断片を連結することによって得られた5
15bp断片をpolIKにより満たし（525-528bp)、そして次
にSal Iで消化し、そして得られた519-522bp hSOD断片
をポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離した。次
に、この断片を、Pvu II及びSal Iで消化しそして次に
アルカリホスファターゼで処理したplot 5に挿入した。
こうして得られたプラスミドを使用してD1210株を形質
転換した。D1210株の形質転換後に得られた組換体を100
μg／mlのアンピシリンを含有するL-寒天上で選択し
て、種々のSOD発現を行う１群のクローン(plot5/SODと
称する)を得た。 【００５２】r-hSODの発現及びplot5／SODプラスミドの
選択 全E.コリ蛋白質をSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動
により分析するために、１夜培養したものを１mlのL-ブ
ロス中に30倍に希釈し、そして37℃にて90分間振盪して
増殖せしめ、O.D.650を約0.2とした。IPTG（イソプロピ
ルチオガラクトシド）を最終濃度が２mMとなるように加
え、そして培養物をさらに３時間インキュベートした。
遠心分離した後、細胞ペレットを50μlのゲルローディ
ング緩衝液［Laemmli, Nature (1970) 227:680-685］に
再懸濁し、そして１分間凍結し、２分間煮沸し、そして
10秒間渦流攪拌する操作を３回反復することによって溶
解した。 【００５３】電気泳動による分離（Laemmli, 前掲）を
行った後、蛋白質バンドをクーマシーブルーにより染色
し、そして各クローンにより産生されたSODの量を算出
した。次にこの結果を、真正ヒトSODに対する抗体を用
いるウエスタンブロット法により確認した。300を超え
るクローンを分析した。示されたSOD発現レベルは、ほ
とんど又は全く発現しないものから全可溶性細胞蛋白質
の５〜10％に達するものまで多様であった。300以上の
クローンの内６クローンについての結果を、Maxam及びG
ilbertの方法（前掲）により決定したDNA分子4(24)の特
定の配列とともに表２に示す。 【００５４】 【表２】 【００５５】γ−hSODの測定 酵素測定を行うため、100mlの培養物を上記のようにし
てインキュベートした。細胞ペレットを同容量の直径0.
45〜0.5mmのガラスビーズ（Braun AG）及び同容量の測
定緩衝液（50mM Tris-カコジレート、pH8.2、1mMジエ
チレントリアミンペンタ酢酸）と共に1.5mlのミクロフ
ュージチューブ中4℃にて渦流攪拌する（10×20秒間）
ことにより可溶性細胞抽出物を調製した。このチューブ
をミクロフュージ（Beckman）中で1分間回転せしめるこ
とにより細胞片をペレット化した。上清液を、1mM硫酸
亜鉛及び1mM硫酸銅を含有する測定緩衝液に対して、4℃
にて4時間透析した。 【００５６】ピロガロール法（Marklund及びMarklund、
前掲）の方法を用いてSODの測定を行った。反応混合物
として測定緩衝液中0.2mMピロガロールを用い、５分間
にわたって反応速度を測定した。この測定においては、
Hewlett-Packard 8450分光光度計を420nmにて使用し
た。４種類の異る測定サンプル、すなわちE.コリ抽出
物、真正hSOD、及び真正hSODに対するラビット抗体と共
に前インキュベートした前記2種類のサンプルを調製し
た。各サンプルをキュベット中で25℃にて１分間インキ
ュベートした後、ピロガロールを加え、そして25℃にお
いて測定した。抗体サンプルは、測定緩衝液中で５μl
の抗体と共に室温にて10分間前インキュベートした。こ
れらの条件は100ngの純hSODを不活性化するのに十分で
あることが見出された。 【００５７】次の表３に試験したクローンの1つ（pSODX
8）の結果を示す。 【００５８】 【表３】 【００５９】これらのデータは、全可溶性細胞蛋白質の
約15%がhSODであることを示している（対照として使用
した純−ヒトCu−Zn SODが十分に活性であると仮定す
る）。全可溶性細胞蛋白質の5〜10%がhSODとして移動す
ることを示す前記の電気泳動データと相まって、実質的
な画分、おそらく産生されたhSODの大部分が活性である
ことが明らかである。 【００６０】クローニングされた遺伝子の正しい配列を
Maxam及びGilbert（前掲）の方法により決定した。さら
に、N-末端の最初の12アミノ酸を自動エドマン分解法に
より決定した。検出されたアミノ酸酸列を次に示す。 【００６１】 【外５】 【００６２】検出された第1 ALA残基はインプットした
ペプチドの濃度とおよそ等モルの濃度で存在し、ブロッ
クされたアミノ酸末端が存在しないことが示された。使
用したアミノ酸分析法によってはCYS残基は検出されな
かったが、この存在はヌクレチオ配列から推定された。 【００６３】すなわち、（N−ホルミル）メチオニンは
細菌発現生成物から除去されており、そしてこの物質は
正しいアミノ酸配列、すなわち、細胞質hSOD残基1-10に
ついて報告されている配列と同一であったが、N-末端AL
A残基はアセチル化されていなかった。さらに、E.コリ
中で産生されたポリペプチドは、荷電の相違を検出する
1%アガロースゲル（pH8.6）電気泳動（コーニングユニ
バーサル電気泳動フィルム；Clausen,Immunochemical T
echnique ,530-531項に従って染色）において天然蛋白
質よりゆっくりと移動し、やはりアセチル化の不存在が
示された。さらに、細菌hSODポリペプチド及び精製され
た真正な（アセチル化された）天然蛋白質の両者のトリ
プシン分解ペプチドの分析から、すべてのトリプシン分
解ペプチドは同一であるが、細菌N-末端ペプチドのみは
異なる移動、すなわちN-アセチル基が欠けているペプチ
ドについて予想される電荷を伴う移動をすることが示さ
れた。 【００６４】酵母における発現 γ−hSOD遺伝子を酵母ベクターに移すために、plot5/SO
Dプラスミドクローンを、コード領域の5'-末端における
Nco I制限部位についてスクリーニングした。ATG開発コ
ドンの5'に存在する可変ヌクレオチドがCCであるプラス
ミドにおいて、配列CCATGGがNco I部位を与える。クロ
ーンをスクリーニングし、そして1個を選択し、そしてp
hSODと命名した。 【００６５】プラスミドphSODをNco I及びSal Iで消化
し、そして550bpの断片を得た。この断片は、5'-末端の
１個の非翻訳ヌクレオチド、及びhSODの完全なコード領
域を含有する。pPGAP（GAPプロモータを担持する酵母発
現ベクター、後記の方法により調製）をNco I及びSal I
により消化し、そしてアルカリホスファターゼで処理
し、そしてpPGAP中のNco I-Sal I断片を前記のSal I-Nc
o I断片で置換してpPGAPSODを得た。pPGAPSODをBam HI
で消化して2kb断片を得、これをゲル分離し、これをpC1
/1、及びpC1/1GAL4/370のBamHI部位に挿入し、それぞれ
プラスミドおよびpC1/1GAPSOD、及びpC1/1GALGAPSODを
得た。 【００６６】プラスミドpC1/1はpJDB219〔Beggs,Nature
(1978)275:104〕の誘導体であり、pJDB219中の細菌プラ
スミドpMB9に対応する領域が、pC1/1においてはpBR322
により置き換えられている。分泌及びプロセシングシグ
ナルを有する発現ベクターの調製については米国特許出
願第522,909号を参照のこと。 【００６７】GAL1/GAL10制御領域（GAL4遺伝子発現生成
物により制御される）を含有する制御され得る酵母発現
ベクターであるプラスミドpC1/1GAL4/370は後記のよう
にして調製する。 【００６８】プラスミドpC1/1GAPSOD、及びpC1/1GALGAP
SODを、すでに記載されているようにして〔Hinnen等、P
roc.Natl.Acad.Sci.USA(1978)75:1929-1933〕、酵母215
0ー2ー3株（ワシントン大学、Lee Hartwellから入手でき
る）に形質転換した。次の表４に示す発現結果が得られ
た。 【００６９】 【表４】 【００７０】hSODレベルを、標準として真正hSODを用い
る標準的放射免疫測定法により測定した。GAPプロモー
ターからの構成的合成は全細胞蛋白質の10〜30%のオー
ダーの非常に高いレベルのhSOD産生を導いた。ガラクト
ースによる誘導もほとんど同様に機能し細胞蛋白質の約
7%をhSODとして産生した。 【００７１】hSODがこのような高レベルで産生される場
合には、完全な酵素的すなわち触媒的活性を回収するた
めに、補欠群として亜鉛イオン及び銅イオンを、生成蛋
白質に、硫酸亜鉛及び硫酸銅の両者の1mM溶液に対する
透析により与えることが必要である。この方法に代え
て、亜鉛イオン及び／又は銅イオンを10の増殖培地に含
有せしめることができ、この方法はさらに、高レベルの
hSODを産生する菌株を選択するための手段、及び／又は
非選択培地でのhSODを発現するプラスミドベクターの喪
失を回避するための手段を提供する。 【００７２】pPGAPの造成 pBR322のHindIII部位にGAPDH遺伝子GAP49〔Holland及び
Holland，J.Biol.Chem.(1979)254:5466-5474〕を含有す
るHindIII断片を挿入することにより調製されたプラス
ミドpGAP1をHinfIで消化し、そして500bp断片を分離し
た。この断片をBal31で切断して約50bp又は90bpを除去
し、次にHindIIIリンカーに連結し、そしてHindIIIで消
化した。pBR322をHindIIIで消化し、次にアルカリホス
ファターゼで処理し、そして約450bp又は410bpの断片を
挿入してpGAP128を得た。 【００７３】pGAP128をHindIIIで消化し、この断片をKl
enow断片及びdNTPにより平滑末端化し、そして生成した
450bp断片をゲル電気泳動により分離した。この断片をS
maIで消化し、アルカリホスファターゼで処理したplot5
に挿入してプラスミドplot5pGAP128を得た。このプラス
ミドは約-400〜+27bpのGAPDHプロモーター及びコード領
域を含有する。 【００７４】GAPDHターミネーターとショートプロモー
ター領域の間に多制限部位リンカーを有する酵母発現ベ
クターpPGAPを次のようにして調製した。プラスミドplo
tGAP128をBamHI及びTaqIで消化して-400〜-26bpのGAPDH
プロモーターを有する約390bp BamHI-TaqI断片を得
た。BamI-TaqI断片を、-25〜-1bpのGAPDHプロモーター
及びNcoIを含むいくつかの制限部位を含有し、そして次
の配列、 【００７５】 【外６】 【００７６】を有する合成断片に連結してBamHI-SalI断
片を得、これをBamHI及びSalIにより消化し、そしてこ
れを用いて、BamHI-SalI消化されアルカリホスファター
ゼ処理されたpBR322のBamHI-SalI断片と置き換えた。連
結した後、プラスミドpGAPNRSを得、これをBamHI及びSa
lIで消化して400bpBamHI-SalI断片を生成せしめ、これ
をゲル分離した。この断片を、GAPDHターミネーター領
域及び3'コード領域のショートセグメントを含有する約
900bpSalI-BamHI断片に連結し、そして生成した1.4kb
BamHI-BamHI断片をBamHIで消化した。GAPDH遺伝子GAP49
（Holland及びHolland、前掲）を含有する3.3kbBamHI断
片をpBR322のBamHI部位に挿入することによって得られ
たプラスミドであるpGAP2をSalI及びBamHIで消化するこ
とにより、SalI-BamHIGAPDHターミネーター断片を得
た。プラスミドpGAP2及びpGAP1は次のようにして得た。
全酵母DNAを制限酵素Sau3Aにより部分消化した後に得ら
れた断片をλ−ファージCharon28〔Blattner等、Scienc
e(1977)196:161-169〕に挿入することにより酵母遺伝子
ライブラリーを調製した。このファージライブラリー
を、酵母GAPDHmRNAに相補的なDNAを用いてスクリーニン
グし、そしてこれらのクローンの１つからの酵母GAPDH
遺伝子を、pBR322のBamHI部位における約3.3kbBamHI断
片（pGAP-2）として、又はpBR322のHindIII部位におけ
る約2.1kbHindIII断片（pGAP-1）ととしてサブクローニ
ングした。 【００７７】pBR322をEcoRI及びSalIで消化し、平滑末
端化し、そしてBamHIリンカーに連結し、次にBamHIで消
化し、そしてBamHI-BamHI3.8kb断片をゲル分離し、自己
連結により再環化し、クローニングし、そしてpBRΔR1-
Salと命名した。1.4kbBamHI-BamHI断片を、BamHIで消化
されそしてアルカリホスファターゼで処理されたpBRΔR
1-Salベクターに挿入して、ampγの逆向きに方向付けら
れた約5.3kbのプラスミドpPGAPを得た。 【００７８】制御されたGALを含有するプラスミドの造
成 プラスミドpLGSD5はGuarente等、（1982)前掲に記載さ
れている方法により調製する。このプラスミドを次のよ
うにして操作した。XhoIにより制限処理した後、オーバ
ーハングをDNAポリメラーゼIのKlenow断片（Klenow断
片）を用いて満たし、EcoRIリンカー（GGAATTCC)と連結
し、そして次にEcoRI及びSau3Aを用いて完全消化して37
0bp断片を得、そしてゲル電気泳動により分離した。こ
の断片は、酵母のGAL1遺伝子及びGAL10遺伝子の間に遺
伝子間配列（intergenic sequence）を含み、そしてGAL
1遺伝子及びGAL10遺伝子のGAL4制御配列を備える。 【００７９】この断片を、EcoRI及びBamHIで完全消化さ
れそして次にアルカリホスファターゼで処理してオリゴ
マー化を防止したpBR322に挿入し、プラスミドpBRGAL4
を得た。 【００８０】プラスミドpBRGAL4をSau3Aにより完全消化
し、オーバーハングをKlenow断片で満たし、そして得ら
れた平滑末端化断片をSalIリンカー（CGTCGACG）に連結
し、次にSalI及びXhoIで消化した。得られた370bp断片
をゲル電気泳動により分離した。この断片は、Xho及びS
alI末端を伴ってもとの370bp酵母GAL4制御配列を有す
る。 【００８１】次に、この断片をプラスミドplot5にクロ
ーニングした。次の配列、 【００８２】 【外７】 【００８３】を有する40bpポリンカー断片をEcoRI-PvuI
I置換体としてpBR322に挿入し、次にtrp-lacプロモータ
ー〔Russell及びBennett,Gene(1982) 20:230-245〕をPv
uII部位中に、転写の方向がホリリンター配列に向けら
れるように挿入することによってplot5を調製した。plo
t5をSalIにより完全に消化し、次にアルカリホスファタ
ーゼで処理し、そして370bp断片をplot5に挿入すること
によってプラスミドplot5GAL4/370を得た。次に、この
プラスミドをBamHI及びSalIにより完全に消化して、ポ
リリンカー断片の6bpによって延長された固有の断片を
得た。次にこの断片を、BamHI及びSalIで完全に消化さ
れそして再環化を防止するためにアルカリホスファター
ゼで処理されたpCl/lに連結した。得られたプラスミド
をpCl/lGAL4/370と命名した。 【００８４】BamHI-SalIは断片はベクターpCl/lのpBR32
2部分中に位置する。 【００８５】酵母において産生されたphSODポリペプチ
ドは天然のヒト−蛋白質と同一であることが示された。
酵母において産生されたhSODの移動は、ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動（ドデシル硫酸ナトリウムを用いる又
は用いない）、及びアガロースゲル電気泳動（前記参
照）のいずれかにおいてもヒト−蛋白質と同一であっ
た。さらに、高度に精製した酵母ポリペプチドを12サイ
クルのエドマン分解にかけた場合、その配列はＥ．コリ
において産生された前記のヒト蛋白質（残基1-10）につ
いて報告されている配列と同一であった。しかしなが
ら、検出レベルは蛋白質インプットについてのモル基準
で期待されるレベルの５〜10％に過ぎなかった。この低
下した検出レベルは、N-末端アミノ酸がブロックされて
いること、すなわちおそらくアセチル化されていること
を示している。この結果を、酵母産生hSOD及び真正アセ
チル化ヒト物質からのトリプシン分解ペプチドの比較分
析により確認した。この結果により、すべての予想され
たトリプシン分解蛋白質はN-末端の分解物を含む２つの
サンプルにおいて同一であり、従って酵母発現生成物中
にアセチル化N-末端ALAが存在することが示された。 【００８６】ヒトSOD遺伝子の分離 ヒトSOD遺伝子を分離するために、ヒトゲノムを代表す
るバクテリオファージλライブラリー［R.Lawn等、(197
8)Cell 15:1157-1174］を、ヒトSODcDNAから作られた放
射性ラベルDNAプローブを用いてスクリーニングした。1
00万個のファージプラークをスクリーニングし、13個の
ハイブリド形成陽性のプラークを精製した。ファージDN
Aの制限エンドヌクレオチド分析により、少なくとも５
つの異なる遺伝子が存在することが示され、他のSOD関
連遺伝子及び遺伝子生成物が存在することが示唆され
た。このような遺伝子の１つの候補は最近発見された細
胞外Cu/ZnSOD［S.Marklund、(1982)Proc.Natl.Sci.USA
79:7634-7638］である。真正細胞質Cu/Zn SOD遺伝子を
関連遺伝子から区別するため、本発明者等は、アミノ酸
残基19-26、及び3'非翻訳領域中のターミネーターコド
ンから3'のヌクレオチド193-213に対応する合成DNAプロ
ーブ5'-AATGCTTCCCCACACC-3'、及び5'-CTCAGTTAAAATGTC
TGTTTG-3'を用いた。13のゲノムDNAの内の１個のみがこ
れらのプローブとハイブリド形成し、これが真正なヒト
細胞質SOD遺伝子であることが示された。このことは、
図５に示すように、N-末端領域のDNA配列分析により確
認された。この場合、蛋白質配列により決定されたアミ
ノ酸酸列が確認される。これはまた、SODについてプレ
蛋白質が存在しないことを示している。開始メチオニン
コドンから９ヌクレオチド5'側にイン−フレームターミ
ネーションコドンが存在するからである。図５に示すよ
うに、ヒトCu/Zn SOD遺伝子は介在配列を含有する。図
６に示すSOD遺伝子の地図は、１個より多くの介在配列
が存在することを示す。 【００８７】以上、例示及び例によりこの発明を詳細に
説明したが、この発明の範囲内において多くの変化・変
法が考えられよう。 【００８８】なお、Ｅ．コリ D1210(pSOD×8）株は1983
年９月27日にATCCに寄託され、ATCCNo39453の受託番号
が与えられた。酵母2150-2-3(pCl/lGAPSOD)株、並びに
Ｅ．コリ D1210(pSOD11)株及びD1210(pS2OR)株が1984年
５月９日にATCCに寄託され、それぞれ受託番号ATCC No2
0708,No39679,及びNo39680が与えられた。 【００８９】なお、この発明は次の方法を含む。 【００９０】微生物においてスーパーオキシドジスムタ
ーゼを製造する方法であって、該微生物を栄養培地中で
増殖せしめることを含んで成り、該微生物が微生物中で
機能するDNA構成物を含有し、該DNA構生物が転写の下流
方向に、 (1)プロモーター； (2)リボゾーム結合部位； (3)開始コドン； (4)前記開始コドンとリーディングフレーム が整合しており、そして3'-末端に終止コドンを有する
ヒト−スーパーオキシドジスムターゼ構造遺伝子；及び (5)転写ターミネーター；を含有し、これによって前記
スーパーオキシドジスムターゼを産生することを特徴と
する方法。
uper oxide dismutase)(「SOD」)は確かに、ほとんどの
生物において見いだされる種々の異なる酵素である。哺
乳動物における１つの機能は、食作用中に天然に産生さ
れる物質であるスーパーオキシドを破壊することであ
る。スーパーオキシドジスムターゼは、酵素と会合した
金属に基礎を置くファミリーとして特徴付けられ、この
金属は鉄、マンガン、銅、及び銅−亜鉛の間で異なる。
例えばウシ−肝臓からのスーパーオキシドジスムターゼ
は臨床的に使用されており、特に、ヒトを含む動物にお
ける抗炎症剤として使用されている。他の用途には、宿
主が種々のスーパーオキシド導発剤、例えば放射線、パ
ラコート等に暴露されることによって生ずるスーパーオ
キシドイオンの除去、ある種の変性疾患、例えば気腫の
予防又は治療、食物の防腐、等が含まれる。従って、特
に、抗炎症剤として又は他の医療目的のために生体内で
使用するために、生理的に許容されるスーパーオキシド
ジスムターゼが安定供給されることが重要である。ヒト
に適用するためには、生ずる可能性がある免疫応答を回
避し又は最小にするために均質な酵素を用いるのが好ま
しい。組換DNA技法を用いることにより、スーパーオキ
シドジスムターゼの所望の生物学的活性、例えば免疫活
性及び酵素活性を有する生成物を効率的に製造する機会
が存在する。 【０００２】 【従来の技術】ヒト−赤血球Cu-Znスーパーオキシドジ
スムターゼのアミノ酸配列は、Jabusch等、Biochemistr
y (1980) 19:2310-2316;及びBarra等、FEBS Letters (1
980) 120:53-55に記載されている。ウシ−赤血球Cu-Zn
SODがSteinman等、J.Biol.Chem.(1974) 249:7326-7338
に記載されている。SOD-1 cDNAクローンがLineman-Hurw
itz等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA (1982) 79:2808-2811
に記載されている。開始コドンから上流の非翻訳領域の
変化が翻訳の効率に及ぼす影響については、Gheysen
等、Gene(1982) 17:55-63; Thummel等、J.Virol(1981)
37:683-697; 及びMatteucci及びHeyneker、Nucl.Acids
Res.(1983) 11:3113-3121を参照のこと。 【０００３】（発明の要旨）ヒト−Cu−Znスーパーオキ
シドジスムターゼの生物学的活性を示すポリペプチドの
効率的な産生が、構造遺伝子の大部分のcDNAを調製し、
リボゾーム結合部位からコード領域中の退化ヌクレオチ
ドに伸びる種々の配列をもたらすアダプターの混合物に
連結し、そして翻訳シグナルを有する完全遺伝子を発現
ベクターに挿入することにより示される。微生物を形質
転換することにより、ヒト−Cu−Znスーパーオキシドジ
スムターゼの生物学的活性を示す有効なポリペプチドの
効率的な生産がもたらされる。遺伝子はさらに、適当な
宿主における分泌のための分泌及びプロセシングシグナ
ルと結合するために使用することができる。 【０００４】ポリペプチドの発現を増強するための新規
な方法が提供され、この方法においては、翻訳開始領域
の種々の配列、すなわちリボゾーム結合部位と翻訳開始
部位との間の領域及びポリペプチドの最初のいくつかの
5'-コドン中の種々の配列（遺伝的コードの冗長な制約
により許容される場合において）を有するアダプターの
混合物が使用される。 【０００５】N-末端においてアセチル化されたポリペプ
チド、及びこのアセチル化ポリペプチドの製造方法も提
供される。目的ポリペプチドの構造遺伝子の5'末端に特
定のアセチル化シグナル配列を設けることにより、この
遺伝子が酵母中で発現される場合にN-末端アミノ酸がア
セチル化されるであろう。アセチル化シグナル配列は、
少なくとも最初の２個のN-末端アミノ酸をコードし、こ
こで第１のアミノ酸はアラニン又はグリシンのいずれか
であり、そして第２のアミノ酸は極性アミノ酸であっ
て、通常はスレオニン、セリン又はアスパラギン酸であ
る。酵母中で産生されるヒト−スーパーオキシドジスム
ターゼのアセチル化は最初の２個のアミノ酸がそれぞれ
アラニン及びスレオニンである場合に示される。 【０００６】（具体的な説明）ヒト−Cu-Znスーパーオ
キシドジスムターゼ(hSOD)の生物学的活性を有するポリ
ペプチドの効率的な発現のための方法及び構成物が提供
される。この方法は、発現宿主における発現のために最
適化された翻訳開始領域と共にhSODのアミノ酸配列の実
質的な部分をコードするDNA配列(hSOD遺伝子)を使用す
る。このhSOD遺伝子は、便利には細胞外培地からSOD生
成物を回収するために分泌を可能にする条件のもとで、
宿主中での発現に適するベクターに挿入する。 【０００７】hSOD及び他のポリペプチドのN-末端アセチ
ル化のための方法及び構成物も提供される。これ以後、
アセチル化とはポリペプチド及び蛋白質のアミノ末端へ
の付加を意味し、天然にも観察されるようなアミノ酸側
鎖、例えばリジンの修飾と対照される。ポリペプチド及
び蛋白質のアセチル化は多くの理由により有用である。
細胞質hSODの場合のようにポリペプチドの天然状態がア
セチル化を含む場合、アセチル化を含む発現法は、望ま
しい天然構造及び配置を有する生成物を提供する。生成
物が医療として使用され、そして／又は試験管内もしく
は生体内診断に使用される場合、アセチル化物は、宿主
に投与され、そして／又は生物学的サンプルに暴露され
た場合に、免疫原性を最小にし又は除去するであろう。
さらに、アセチル化ポリペプチドは一層安定でありそし
てプロテアーゼによる分解に対して一層耐性であり、そ
れ故に細胞、血液、体液及び組織液中に長時間存在する
であろう。 【０００８】hSOD又は他のポリペプチドの構造遺伝子は
その5'-末端にアセチル化シグナル配列を含有し、この
シグナル配列は酵母発現宿主にアセチル化を行わせる。
アセチル化シグナル配列はポリペプチド中の少なくとも
最初の２個のN-末端アミノ酸をコードする。第１のアミ
ノ酸はアラニン、グリシン又はセリンであり、第２のア
ミノ酸は極性アミノ酸又は芳香族アミノ酸であり、通常
はスレオニン、セリン、アスパラギン酸又はフェニルア
ラニンである。 【０００９】これらのアミノ酸は、発現されるべきポリ
ペプチド中に天然に存在する天然N-末端アミノ酸であっ
てよい。これは、第１アミノ酸及び第２アミノ酸がそれ
ぞれアラニン及びスレオニンであるhSODの場合である。
酵母中で発現されそしてアセチル化されるであろう他の
天然アセチル化蛋白質には次のものが含まれる。 【００１０】 【表１】【００１１】この発明はまた、天然にはアセチル化され
ないポリペプチド及び蛋白質をアセチル化するためにも
有用である。アセチル化は、ポリペプチドの構造遺伝子
の5'-末端にアセチル化シグナル配列を連結することに
よって達成される。このアセチル化シグナル配列は少な
くとも２個のアミノ酸（上に記載した）をコードし、そ
して10個まで又はそれ以上のアミノ酸、好ましくは５個
より少ないアミノ酸をコードすることができる。ポリペ
プチドの目的とする活性の妨害又は喪失を制限するため
に追加されるアミノ酸が少ない方が一般に望ましい。便
利には、よく知られている方法に従ってシグナル配列を
合成し、そして構造遺伝子に連結する。アセチル化シグ
ナル配列を構造遺伝子に付加する代りに、ポリペプチド
の最初の２個のアミノ酸の内の１個又は両者を置き換え
るために構造遺伝子の5'-末端を変形することも場合に
よっては可能であろう。このような変形は種々の常法に
従って行うことができる。例えば、構造遺伝子をその5'
-末端の近傍で切断して既知数のヌクレオチドを除去す
る。次に、切断後の接着末端に合成オリゴヌクレオチド
を連結する。このオリゴヌクレオチドは塩基対を復元し
そして置き換えて所望のアセチル化シグナル配列をもた
らすであろう。この方法に代えて、例えばファージM13
を用いる部位特定変異誘発法を用いて構造遺伝子の5'-
末端に適当な変形を行うことができる。 【００１２】hSODを製造するためにはhSODをコードする
DNA配列を得ることが必要である。 【００１３】このような配列を完成するための１つの方
法は、hSODを産生する細胞由来のメッセンジャーRNAか
らcDNAをクローニングする方法である。便利には、この
目的のためにヒト肝臓細胞を用いることができる。DNA
コード配列は未知であるが少なくとも一部分のアミノ酸
配列が知られている場合、cDNAをクローニングした後、
このcDNAを、アミノ酸残基の特定の連鎖をコードするヌ
クレオチドの可能性のあるすべての配列を有するプロー
ブ混合物を用いてスクリーニングする。合成すべき異な
るヌクレオチド配列の数を最小にするようにアミノ酸残
基を選択するのが一般であるが、ヌクレオチドがコード
するアミノ酸残基の選択は幾分任意である。 【００１４】hSODについては、少なくとも19-24位のア
ミノ酸残基をコードするDNA配列を便利に使用すること
ができ、特に、約15以上で且つ約20以下の塩基を有する
プローブ、さらに便利には約17塩基を有するプローブを
使用する。次に、ラベルされたプローブとハイブリド形
成したと思われるクローンを制限酵素で消化し、DNA断
片を画分し、そしてhSOD中のアミノ酸残基の前記の場合
と異なる連鎖をコードする第２シリーズのプローブを特
に用いてハイブリド形成を繰り返す。便利には、これら
のアミノ酸残基は109-114位の残基である。両プローブ
に陽性である１個又は複数個のクローンを見い出し、そ
してこれを、hSODの少なくとも実質的な部分をコードす
るcDNAの入手源として使用することができよう。 【００１５】全く驚くべきことに、hSODについて発表さ
れているアミノ酸配列とcDNAによってコードされている
アミノ酸配列とが、有為な個数の残基において異なるこ
とが見出された。具体的には、２つの公表された配列[J
ahusch等、Biochemistry(1980) 19:2310-2316; 及びBar
ra等、FEBS Letters(1980) 120:153-156)が異なってい
る場合、正しい帰属は11位の残基がアスパラギン酸；17
位の残基がイソロイシン；26位の残基がアスパラギン；
49位の残基がグルタミン酸；52位の残基がアスパラギン
酸；53位の残基がアスパラギン；92位の残基がアスパラ
ギン酸；98位の残基がセリンである（図４参照のこ
と）。 【００１６】リボゾーム結合部位と一般にAUGである翻
訳開始コドンとの間の分離が翻訳に及ぼす影響がはっき
りしないため、この発明の方法は、リボゾーム結合部位
と開始コドンとを分離する距離及びヌクレオチドを変え
る技法を提供する。リボゾーム結合部位と開始コドンと
の間のスペーサー中に、一般に約６〜15個、さらに一般
には約６〜12個のヌクレオチドが存在する。開始コドン
から下流の塩基配列もまた翻訳効率に影響するから、こ
の発明の方法はさらに、遺伝的コードの冗長な制限によ
って許容されるように、ポリペプチドの最初の数個の5'
-コドンの範囲内でヌクレオチド配列の変化（但し長さ
の変化ではない）を提供する。この変形は、開始部位か
ら下流の４コドン以下、さらに一般には２コドンを意図
する。 【００１７】多数のリンカーを調製する。このリンカー
においては、２個以上のヌクレオチド、通常は３個以上
のヌクレオチドであって10個以下のヌクレオチド、通常
は約６個以下のヌクレオチドが異なり、これには、スペ
ーサー内であれば４ヌクレオチドのそれぞれ、あるいは
ポリペプチド構造遺伝子内であれば遺伝的コードの冗長
性によって許容されるように２個、３個又は４個のヌク
レオチドの構成員が含まれる。さらにヌクレオチドの構
成員を異にするリンカーを調製して配列のみならず長さ
も異なる１群のリンカーを得る。長さの相違は、リンカ
ーの合成中に支持体の一部を取り出し、そして適当であ
れば次の段階において合成を継続し、種々の配列長さを
有するリンカーを得る。通常、リンカー混合物は１個以
上６個以下、通常は４個以下のヌクレオチドにより長さ
を異にするであろう。 【００１８】これは、不存在塩基が末端にある場合に便
利に例示することができる。各段階の支持体の一部分を
取り出し、そして各段階において４種類全てのヌクレオ
チド(dNTP)を与えながら、支持体に結合した鎖を用いな
がら合成を続ける。次に、これらの単鎖を部分的に相補
的な単鎖にハイブリド形成せしめる。この場合可変領域
はオーバーハングとなるであろう。こうして、ヌクレオ
チド及び長さの両方において異なるオーバーハングを有
する種々の一連のリンカーが得られるであろう。この後
のハイブリド形成操作、連結操作又はクローニング操作
中の適当な時点でオーバーハング領域を満たし(fill i
n)て、さらに操作することができる二重鎖材料を得る。
この方法は一般に、そして好ましくは試験管内におい
て、DNAポリメラーゼＩのKlenow断片を用いて行う。こ
の方法に代えて、ある場合には、オーバーハングを単鎖
としてクローニングし、形質転換(transform又はtransf
ect)された宿主中で満たす(fill in)することができ
る。相補鎖へのハイブリド形成は、可変ヌクレオチド連
鎖から上流に、リンカーが連結されるべき末端配列中に
存在する配列に相補的である5'-配列を有することによ
って達成することができる。次に、欠損塩基を試験管内
又は生体内において満たす。 【００１９】リンカーはその配列内に、リボゾーム結合
部位と開始コドンとの間の領域の少なくとも一部分を含
有し、好ましくは開始コドンに近い側のヌクレオチドを
含有する。リンカーはさらに、開始コドン及び構造遺伝
子の部分、リボゾーム結合部位、並びにリボゾーム結合
部位から上流の塩基（転写制御配列を含み又は含まな
い）を含有することができる。 【００２０】通常、リンカーは約５塩基以上、さらに一
般的には約20塩基以上であり、そして通常約200塩基以
下、さらに一般的には約100塩基以下である。リンカー
が約35塩基より大である場合、これは通常は次のように
して修正されるであろう。すなわち、相補鎖の一部分の
みと相同な約10〜35塩基の単鎖配列を用い、すなわちオ
ーバーハングを有する相補的なオーバーラップ配列を
得、そして種々の単鎖をハイブリド形成し、連結し、そ
して変化及び／又は種々の長さのオーバーハングを上記
のようにして満たして接着末端及び／又は平滑末端を有
する所望のリンカーを調製する。 【００２１】構造遺伝子が、開始コドンから通常約50塩
基以下下流に便利な制限部位を有する場合には、構造遺
伝子を含有する断片を制限酵素処理し、そしてリンカー
の相補的な接着末端に連結し、又は平滑末端に満たして
この平滑末端をリンカーの平滑末端に連結する。構造遺
伝子が完全であり、そしてリーディングフレームが開始
コドンと整合することを保証するようにリンカーを工夫
する。 【００２２】前記のように、リンカーの調製において、
ヌクレオチド、すなわちコード鎖中の４種類の可能なヌ
クレオチドのそれぞれの無作為な連鎖（前記の遺伝的コ
ードの制限の規則に従う）を有し、そしてリボゾーム結
合部位と開始コドンを仲介又は架橋する領域を規定する
ヌクレオチドの１個又は複数個が欠けて種々の長さを有
する一連のリンカーを得る。単鎖から調製されるこれら
のリンカーを他の単鎖又は二重鎖DNA鎖に連結して、リ
ボゾーム結合部位のみならずリボゾーム結合部位から上
流の塩基も含むことができる延長されたリンカーを得る
ことができる。これに代えて、リンカーは比較的小形で
あり、リボゾーム結合部位の内側又はこれに隣接する部
位から始まり開始コドン部位又は構造遺伝子の内側に延
びるものであってもよい。 【００２３】この発明の構成物を得るために種々の断片
を連結する特定の順番は臨界的ではないが、便利にはま
ず構造遺伝子をリンカーに連結する。このDNA構成物
は、構造遺伝子のみならず、リボゾーム結合部位及びリ
ボゾーム結合部位から上流の任意の追加のヌクレオチド
を含むであろう。さらに、リボゾーム結合部位と開始コ
ドンとの間のヌクレオチド鎖のヌクレオチドの種類及び
個数に実質的な多様性が存在するであろう。この発明の
DNA構成物は、該DNA構成物挿入部位から上流に必要な転
写開始制御配列を有し、下流に転写停止制御配列を有す
る適当な発現ベクターに挿入される。すなわち、リンカ
ーはその5'末端において転写開始制御シグナル配列に接
しそしてその3'においてコード領域の少なくとも一部
分、及び転写及び翻訳停止配列に接して位置するであろ
う（5'-及び3'-は転写の方向を意味する）。 【００２４】適当な宿主に導入するためのプラスミド又
はウイルスDNAを調製した後（通常、操作の適当な段階
において種々のオーバーハング領域を満たすことを含
む）、宿主を形質転換（それぞれ、transform又はtrans
fect）し、クローニングし、クローンをストリークし、
そして目的生成物、例えばhSODの産生を測定することに
よって効率的な発現について個々のクローンを選択す
る。生成物の種々の産生レベルを決定するためにスクリ
ーニングすべきクローンの数は、合成リンカーに導入さ
れた長さの多様性及び配列の変化の程度に依存し、そし
て比例するであろう。例えばこの発明の具体例におい
て、４種類の長さの変化、及びリンカー中の６個のヌク
レオチドの各々における４重の変化が存在すれば、可能
な組換配列の数は5440である。通常、少なくとも数百、
好ましくは数千又はそれより多くのクローンをスクリー
ニングするであろう。スクリーニングは、ニトロセルロ
ース又は他の適当な材料の濾紙に移した宿主細胞コロニ
ー又はウイスルプラークのウエスタンブロット法（生成
物の抗体検出）を用いて効率的に行うことができる。こ
の方法に代えて、電気泳動法により、多数のレーンを用
意して各レーンに個々のクローンを割り当て、生成物の
バンドの染色強度、オートラジオグラフィー又はウエス
タンブロットの観察により、直接的に比較して最も効率
的に発現するクローンを見出すことができる。適当であ
れば、さらに定量的な免疫測定又は酵素測定を使用する
ことができるが、通常は前記のスクリーニング法で十分
である。 【００２５】所望により、この構成物を、この発現構成
物の制御シグナルを認識する他の宿主に移すことがで
き、あるいは他の宿主における効率的な発現を得るため
に必要な制御シグナルを適当な部位に導入することによ
って発現構成物を変形することができる。 【００２６】所望により、hSODを第２のリーダー及びプ
ロセシングシグナルに連結して、hSODの分泌及びプロセ
シングを得ることができる。種々の分泌のリーダー及び
プロセシングシグナルが文献に記載されている。例え
ば、米国特許第4,336,336号、及び同第4,338,397号、並
びに1983年8月12日に出願された係属中の米国特許出願
第522,909号、及び1983年4月26日に出願された係属中の
米国特許出願第488,857号を参照のこと。これらの対応
部分を引用によりこの明細書に組み入れる。 【００２７】宿主として特に好ましいものは、細菌、藻
類、菌類等のごとき原核生物及び真核生物の両者を含む
単細胞微生物である。特に、E.コリ(E.coli)、B.ズブチ
リス(B.subtillis)、S.セレビシエー(S.cerevisiae)、
ストレプトミセス(Streptomyces)、ニューロスポラ(Neu
rospora)が宿主となり得る。 【００２８】単細胞微生物中で用いるために広範囲の種
類のベクターを使用することができ、ベクターはプラス
ミド及びウイルスから誘導することができる。ベクター
は単コピーベクター、又は低コピーもしくは高コピーベ
クターのいずれであってもよい。 【００２９】ベクターはクローニング及び／又は発現の
ために機能するであろう。ベクターに関する多くの文献
が存在し、多くのベクターを商業的に入手することがで
き、そしてベクター及びその制限地図並びに特性を記載
した手引書まで存在するから、ここで検討する必要はな
い。よく知られているように、ベクターは選択を可能に
するマーカーを含有するのが普通であり、このマーカー
は細胞毒剤耐性、栄養要求性又は免疫性をもたらすであ
ろう。しばしば、異なる特性をもたらす多数のマーカー
が使用される。 【００３０】マーカーのほかに、ベクターは複製糸を有
し、そして発現ベクターの場合には通常、転写開始及び
停止の両制御シグナル、例えばプロモーター（単一プロ
モーター又は多数縦列プロモーター）、mRNAキャップ配
列、TATAボックス、エンハンサー、ターミネーター、ポ
リアデニル化配列、及びターミネーターと関連する１個
又は複数個の終止コドンを含有するであろう。翻訳のた
めには、リボゾーム結合部位及び１個又は複数個の終止
コドンがしばしば存在するであろう。もっとも、終止コ
ドンは通常は構造遺伝子と関連しているであろう。これ
とは異なって、これらの制御配列は、ベクターに導入さ
れる構造遺伝子を含有する断片上に存在することもでき
る。 【００３１】通常、構造遺伝子を発現ベクターに挿入す
るために便利な位置に１個又は複数個の制限部位が存在
するであろう。一旦挿入した後、構造遺伝子を含有する
発現ベクターを適当なベクターに導入し、そして宿主を
クローニングしてhSODの効率的な発現を得ることができ
よう。 【００３２】ある場合には、特殊な性質、例えば発現の
温度感受性、転写制御のためのオペレーター又はアクチ
ベーター等をベクターに備えることができる。特に有利
なものは、外的手段、例えば温度、インデューサー、コ
ンプレッサー等により転写を制御することができる能力
であり、この能力がある場合には外的化合物、通常は有
機化合物により転写を誘導し又は抑制することができ
る。 【００３３】hSODが細胞内に産生される場合には、細胞
培養物が高濃度に達した時に便利には遠心分離により細
胞を分離し、溶解し、そして種々の方法、例えば抽出、
アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動、透析、
又はこれらの組み合せによりhSODを分離する。生成物が
分泌される場合には、培地について上記と同様の方法を
用いる。しかしながらこの場合、細胞溶解物の場合に比
べて、培地中の全蛋白質に対する目的生成物の割合が実
質上高いであろう。 【００３４】産生されたhSODは天然のヒト−スーパーオ
キシドジスムターゼと実質上同一のアミノ酸配列を有
し、アミノ酸の相違は一般に５個より少なく、さらに一
般的には２個より少ない。組換hSOD(r-hSOD)は、天然の
hSODと実質上同一の生物学的性質を有する。生物学的性
質には免疫的性質が含まれ、真正なhSODに対して生じた
抗体がr-hSODと交差反応する。さらに、hSODについて用
いる一般的なバイオアッセイにおいて、r-hSOD生成物は
蛋白質重量に対して実質的な比率を示し、通常は真正は
hSODの約10％以上、好ましくは約50％以上、さらに好ま
しくは約80％以上である。代表的な測定法がMarklund及
びMarklund, Eur. J. Biochem.(1974) 47:469-474に記
載されている。次に、例によりこの発明をさらに詳細に
説明する。但し、これによりこの発明の範囲を限定する
ものではない。 【００３５】 【実施例】hSOD cDNAの分子クローニング 成人の肝臓から、グアニジニウムチオシアナート／塩化
リチウム法［Cathala等、DNA(1983) 2:329-335］により
全RNAを調製した。ポリA RNAを用いて２重鎖cDNAを合成
し(Maniatis等、Molecular Cloning, 213-242, Cold Sp
ring Harbor,1982)、そしてこれをセファロースCL4Bカ
ラムに通して350bpより大きいcDNAを濃縮した［Fiddes
及びGoodman, Nature (1979) 281:351-356］。cDNAをp
lot 4のPst I部位に挿入した。p lot 4は、pBR322の誘
導体であって、PstI-EcoRI部位に代えて次に配列を有す
る。 【００３６】 【外１】 【００３７】ｃＤＮＡの挿入にはオリゴdG:dCテーリン
グ法(Maniatis等、前掲)を使用した。この混合物により
E.コリ D1210株を形質転換し、そして形質転換体を10μ
g／mlのテトラサイクリンを含有するL-寒天［Kushner
S.R.(1978) In:Genetic Engineering, Boyer H.B.及びN
icosia S.編、（エルゼビル／北オランダ、アムステル
ダム）17頁］上で選択した。肝臓cDNAライブラリーを構
成するプラスミドDNAを、直径９cmのペトリ皿当り約3,0
00コロニーの密度でプレートした約62,000個の組換コロ
ニーから直接に調製した(Maniatis等、Molecular Cloni
ng, 86〜94頁、Cold Spring Harbor, 1982)。 【００３８】r-hSODクローンの分離 菌株D1210を肝臓cDNAライブラリーにより形質転換し、
そして約40,000のクローンが直径14cmのペトリ皿９枚の上に
増殖した。コロニーをニトロセルロース紙上に移し、そ
してプラスミドDNAのクロラムフェニコール増幅を行っ
た後、細胞を溶解し、そして濾紙をハイブリド形成のた
めに調製した［Ish-Horowicz及びBurke,Nucleic Acids
Research (1981) 9:2989-2998］。オリゴヌクレオチド
プローブを使用してハイブリド形成によるスクリーニン
グを行った。このプローブは、蛋白質のアミノ酸残基第
19-24位をコードするmRNAに相補的な酵素的に放射性ラ
ベルした化学合DNA分子から成り(Jabusch等、前掲；Bar
ra等、前掲)、このプローブ混合物は次の配列を有す
る。 【００３９】 【外２】 【００４０】ペプチドをコードするために示された可能
性のすべて（32種類）を調製した。プローブを、32Ｐを
用いて比活性が１〜３×108cpm／μgとなるようにラベ
ルし、そしてミリポアフィルター(0.45μm)で濾過して
使用した。濾紙を、30℃にて６時間、４×SSC、２×デ
ンハート溶液、40mM燐酸ナトリウム、pH7.5、300μg／m
l超音波処理したサケ試験DNA中で前ハイブリド形成し
た。ハイブリド形成は、２×106cpm／ml hSOD DNAプロ
ーブを含有する上記と同じ溶液中で30℃にて20時間行っ
た。濾紙を、４×SSC中で15分間室温にて１回洗浄し、
そして15分間ずつ２回30℃にて洗浄し、吸取紙を用いて
乾燥し、そして増強スクリーンを用いて-70℃にて24時
間オートラジオグラフ処理した。二重陽性シグナルに対
応するマスタープレート上の領域をL-ブロスに拾い上
げ、そしてミニスクリーン法(Maniatis等、Molecular C
loning, 178,368-369,Cold Spring Harbor, 1982)によ
りプラスミドDNAを調製した。このDNAをPst Iで切断
し、そしてサザンブロセット分析［Southern J., Mol.B
iol.(1975) 98:503-517］にかけた。この方法において
は、まず、あらかじめラベルしたプローブ（アミノ酸残
基第19-24位に対応）とハイブリド形成せしめ、そして
次に追加の放射性ラベルプローブとハイブリド形成せし
めた。このプローブはアミノ酸残基第109-114位に対応
し、そして次の配列を有する（可能なすべての変形、す
なわち72種類の変形が存在する）。 【００４１】 【外３】 【００４２】１つのプラスミドプール(pSOD1)が両プロ
ーブとハイブリド形成する520bpのcDNA挿入部を含有し
ていた。コロニーを精製し、そしてこのクローンからプ
ラスミドDNAを調製した後、Maxam及びGilbertの方法［P
roc. Natl. Acad. Sci. USA(1977)74:560-564］により
配列決定した。結果を図４に示す。hSOD cDNAクローンp
SOD1は、hSODのアミノ酸10-153位のコード領域、１個の
翻訳終止コドン、及び3'非翻訳領域を構成する。従っ
て、発現ベクター構成物においては、アミノ酸1-9位を
コードする領域の塩基配列はhSODの公表されているアミ
ノ酸配列(Jabusch等、前掲；Barra等、前掲）から導
き、そして多様なリンカーセグメントの部分として化学
的に合成する（下記を参照のこと）。プラスミドplot5
の造成（図２及び図３参照のこと）。 【００４３】ハイブリドtrp-lac(tac)プロモーター［De
Boer等、Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983) 80:21-2
5］を含有するプラスミドplot1を次のようにして造成し
た。ptrpL1［Edman等、Nature (1981) 291:503-506］の
180bp HgiA-TaqI断片、及びpKB268 ［Bachman及びPtash
ne, Cell(1978) 13:65-71］からの58bp Hpa II-EcoRI断
片をゲル分離し、そしてこれらの断片を、Pst I及びEco
RIにより消化したpBR322に連結する。得られたプラスミ
ドを用いてD1210株を形質転換し、そしてテトラサイク
リン耐性についてクローンを選択した。プラスミドplot
3を次のようにして造成した。tacプロモーターを含有
するplot 1の155bp Fnu 4HI-EcoRI断片［Fnu 4HI部位は
DNAポリメラーゼＩのKlenow断片（「pol IK」又は「po
l.Klen.」）を用いて平滑末端化したもの］、及び次の
配列、 【００４４】 【外４】 【００４５】を有するΠAN7の18bp Eco RI-PstIポリリ
ンが断片をゲル分離した。pBR322をEcoRIで消化し、pol
IKを用いて平滑末端化し、次にPst Iで消化し、そして
ゲル精製して得た断片に、上記２個の断片を連結した。
この連結混合物を用いてD1210株を形質転換し、そして1
0μg／mlのテトラサイクリンを含有するL-プレート上で
選択した。 【００４６】プラスミドplot5を次のようにして造成し
た。まず、pBR322中のEcoRI-PvuII間をΠAN7のポリリン
カーで置き換えたプラスミドを造成した。これを行うた
めに、プラスミドΠAN7をHind IIIで消化し、pol IKを
用いて満たすことによって平滑末端化し、そしてこうし
て変形したプラスミドΠAN7に、合成した自己相補的Pvu
IIリンカー分子（d(5'-CCAGCTGG-3')）を連結した。Ec
oRI及びPvu IIで消化した後、得られた44bpのポリリン
カー断片（４塩基のオーバーハングを有する）をゲル分
離し、そしてEcoRI-Pvu II置換体としてpBR322にクロー
ニングした。 【００４７】プラスミドplot 3をEcoRIで消化し、そし
てフェノール／クロロホルム抽出及びエタノール沈澱を
行った後、突出している5'-末端をSlヌクレアーゼ［Pal
miter, Biochemistry (1974) 13:3606-3615;Hallewell
及びEmtage, Gene(1980)9:27-47］で処理することによ
って平滑末端化した。フェノール／クロロホルム抽出及
びエタノール沈澱を行った後、DNAをCla Iで消化し、po
l IKにより平滑末端化し、そして調製用ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動によりtacプロモーターを含有する237
bp断片を分離した。次に、この平滑末端tacプロモータ
ー断片をpBR322ポリリンカープラスミド（図３参照）の
Pvu II部位に挿入し、そしてtacプロモーターがpBR322
のβ−ラクタマーゼ遺伝子の方向に転写を指令するクロ
ーンを得た。 【００４８】r-hSODを発現するplot5誘導体の造成 図１に示す合成DNA分子F(26)、C(16)、B(31)、D(11)、E
(13)、及び4(24)をホスホルアミダイト法により合成し
た。単鎖4(24)は、Ｘで示されている各部位において４
種類すべての塩基を用いて合成した。さらに、24マーの
他に21マー、22マー、及び23マーが得られるように24マ
ーの合成からシリカを除去した。シリカ支持体から取り
出した後、４種類の混合物を適当な比率で混合して可能
な単鎖のそれぞれが等モル量となるようにした。この混
合物を次の段階において単一生成物として処理した。 【００４９】分子F(26)、C(16)、B(31)、及びD(11)を等
モル量に混合し、そして10μgをT4ポリヌクレオチドキ
ナーゼを用いて燐酸化した。フェノール／エーテル抽出
の後、追加の非燐酸化合成DNA分子4(24)、及びE(13)を
加え、全ての断片が等モル量となるようにした。この等
モル混合物は、133μlの0.3Ｘキナーゼ緩衝液中に13μg
のDNAを含有する。 【００５０】一定速度で70℃から20℃に60分間にわたっ
て冷却することによりアニーリングした後、200μlの連
結混合物中14℃にて4時間単鎖を連結し、フェノール／
クロロホルム抽出、及びエタノール沈澱を行い、そして
4(24)及びE(13)の5'-末端をT4ポリヌクレオチドキナー
ゼ(Maniatis等、前掲)を用いて燐酸化した。調製用ゲル
電気泳動を用いて、5'-及び3'-オーバーハングを有する
完全に連結された53bpの材料を分離した。 【００５１】次に、上記の精製断片混合物を、図１に示
すようにhSOD cDNAの460bp TaqI-PstI断片に連結した。
この断片自体は、454bp TaqI-AluI hSOD断片を分離し、
これをpol IKを用いて平滑末端化し、そしてこれをplot
5のEcoRI-Sal I部位（図３）（同様にして平滑末端化
しておく）に挿入することにより造成した。この組換体
からプラスミドDNAを調製した後、460bp TaqI-PstI hSO
D断片を調製用ポリアクリルアミドゲル電気泳動により
分離した。抽出及び沈澱を行った後、460bp Taq I-PstI
hSOD断片に合成断片を連結することによって得られた5
15bp断片をpolIKにより満たし（525-528bp)、そして次
にSal Iで消化し、そして得られた519-522bp hSOD断片
をポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離した。次
に、この断片を、Pvu II及びSal Iで消化しそして次に
アルカリホスファターゼで処理したplot 5に挿入した。
こうして得られたプラスミドを使用してD1210株を形質
転換した。D1210株の形質転換後に得られた組換体を100
μg／mlのアンピシリンを含有するL-寒天上で選択し
て、種々のSOD発現を行う１群のクローン(plot5/SODと
称する)を得た。 【００５２】r-hSODの発現及びplot5／SODプラスミドの
選択 全E.コリ蛋白質をSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動
により分析するために、１夜培養したものを１mlのL-ブ
ロス中に30倍に希釈し、そして37℃にて90分間振盪して
増殖せしめ、O.D.650を約0.2とした。IPTG（イソプロピ
ルチオガラクトシド）を最終濃度が２mMとなるように加
え、そして培養物をさらに３時間インキュベートした。
遠心分離した後、細胞ペレットを50μlのゲルローディ
ング緩衝液［Laemmli, Nature (1970) 227:680-685］に
再懸濁し、そして１分間凍結し、２分間煮沸し、そして
10秒間渦流攪拌する操作を３回反復することによって溶
解した。 【００５３】電気泳動による分離（Laemmli, 前掲）を
行った後、蛋白質バンドをクーマシーブルーにより染色
し、そして各クローンにより産生されたSODの量を算出
した。次にこの結果を、真正ヒトSODに対する抗体を用
いるウエスタンブロット法により確認した。300を超え
るクローンを分析した。示されたSOD発現レベルは、ほ
とんど又は全く発現しないものから全可溶性細胞蛋白質
の５〜10％に達するものまで多様であった。300以上の
クローンの内６クローンについての結果を、Maxam及びG
ilbertの方法（前掲）により決定したDNA分子4(24)の特
定の配列とともに表２に示す。 【００５４】 【表２】 【００５５】γ−hSODの測定 酵素測定を行うため、100mlの培養物を上記のようにし
てインキュベートした。細胞ペレットを同容量の直径0.
45〜0.5mmのガラスビーズ（Braun AG）及び同容量の測
定緩衝液（50mM Tris-カコジレート、pH8.2、1mMジエ
チレントリアミンペンタ酢酸）と共に1.5mlのミクロフ
ュージチューブ中4℃にて渦流攪拌する（10×20秒間）
ことにより可溶性細胞抽出物を調製した。このチューブ
をミクロフュージ（Beckman）中で1分間回転せしめるこ
とにより細胞片をペレット化した。上清液を、1mM硫酸
亜鉛及び1mM硫酸銅を含有する測定緩衝液に対して、4℃
にて4時間透析した。 【００５６】ピロガロール法（Marklund及びMarklund、
前掲）の方法を用いてSODの測定を行った。反応混合物
として測定緩衝液中0.2mMピロガロールを用い、５分間
にわたって反応速度を測定した。この測定においては、
Hewlett-Packard 8450分光光度計を420nmにて使用し
た。４種類の異る測定サンプル、すなわちE.コリ抽出
物、真正hSOD、及び真正hSODに対するラビット抗体と共
に前インキュベートした前記2種類のサンプルを調製し
た。各サンプルをキュベット中で25℃にて１分間インキ
ュベートした後、ピロガロールを加え、そして25℃にお
いて測定した。抗体サンプルは、測定緩衝液中で５μl
の抗体と共に室温にて10分間前インキュベートした。こ
れらの条件は100ngの純hSODを不活性化するのに十分で
あることが見出された。 【００５７】次の表３に試験したクローンの1つ（pSODX
8）の結果を示す。 【００５８】 【表３】 【００５９】これらのデータは、全可溶性細胞蛋白質の
約15%がhSODであることを示している（対照として使用
した純−ヒトCu−Zn SODが十分に活性であると仮定す
る）。全可溶性細胞蛋白質の5〜10%がhSODとして移動す
ることを示す前記の電気泳動データと相まって、実質的
な画分、おそらく産生されたhSODの大部分が活性である
ことが明らかである。 【００６０】クローニングされた遺伝子の正しい配列を
Maxam及びGilbert（前掲）の方法により決定した。さら
に、N-末端の最初の12アミノ酸を自動エドマン分解法に
より決定した。検出されたアミノ酸酸列を次に示す。 【００６１】 【外５】 【００６２】検出された第1 ALA残基はインプットした
ペプチドの濃度とおよそ等モルの濃度で存在し、ブロッ
クされたアミノ酸末端が存在しないことが示された。使
用したアミノ酸分析法によってはCYS残基は検出されな
かったが、この存在はヌクレチオ配列から推定された。 【００６３】すなわち、（N−ホルミル）メチオニンは
細菌発現生成物から除去されており、そしてこの物質は
正しいアミノ酸配列、すなわち、細胞質hSOD残基1-10に
ついて報告されている配列と同一であったが、N-末端AL
A残基はアセチル化されていなかった。さらに、E.コリ
中で産生されたポリペプチドは、荷電の相違を検出する
1%アガロースゲル（pH8.6）電気泳動（コーニングユニ
バーサル電気泳動フィルム；Clausen,Immunochemical T
echnique ,530-531項に従って染色）において天然蛋白
質よりゆっくりと移動し、やはりアセチル化の不存在が
示された。さらに、細菌hSODポリペプチド及び精製され
た真正な（アセチル化された）天然蛋白質の両者のトリ
プシン分解ペプチドの分析から、すべてのトリプシン分
解ペプチドは同一であるが、細菌N-末端ペプチドのみは
異なる移動、すなわちN-アセチル基が欠けているペプチ
ドについて予想される電荷を伴う移動をすることが示さ
れた。 【００６４】酵母における発現 γ−hSOD遺伝子を酵母ベクターに移すために、plot5/SO
Dプラスミドクローンを、コード領域の5'-末端における
Nco I制限部位についてスクリーニングした。ATG開発コ
ドンの5'に存在する可変ヌクレオチドがCCであるプラス
ミドにおいて、配列CCATGGがNco I部位を与える。クロ
ーンをスクリーニングし、そして1個を選択し、そしてp
hSODと命名した。 【００６５】プラスミドphSODをNco I及びSal Iで消化
し、そして550bpの断片を得た。この断片は、5'-末端の
１個の非翻訳ヌクレオチド、及びhSODの完全なコード領
域を含有する。pPGAP（GAPプロモータを担持する酵母発
現ベクター、後記の方法により調製）をNco I及びSal I
により消化し、そしてアルカリホスファターゼで処理
し、そしてpPGAP中のNco I-Sal I断片を前記のSal I-Nc
o I断片で置換してpPGAPSODを得た。pPGAPSODをBam HI
で消化して2kb断片を得、これをゲル分離し、これをpC1
/1、及びpC1/1GAL4/370のBamHI部位に挿入し、それぞれ
プラスミドおよびpC1/1GAPSOD、及びpC1/1GALGAPSODを
得た。 【００６６】プラスミドpC1/1はpJDB219〔Beggs,Nature
(1978)275:104〕の誘導体であり、pJDB219中の細菌プラ
スミドpMB9に対応する領域が、pC1/1においてはpBR322
により置き換えられている。分泌及びプロセシングシグ
ナルを有する発現ベクターの調製については米国特許出
願第522,909号を参照のこと。 【００６７】GAL1/GAL10制御領域（GAL4遺伝子発現生成
物により制御される）を含有する制御され得る酵母発現
ベクターであるプラスミドpC1/1GAL4/370は後記のよう
にして調製する。 【００６８】プラスミドpC1/1GAPSOD、及びpC1/1GALGAP
SODを、すでに記載されているようにして〔Hinnen等、P
roc.Natl.Acad.Sci.USA(1978)75:1929-1933〕、酵母215
0ー2ー3株（ワシントン大学、Lee Hartwellから入手でき
る）に形質転換した。次の表４に示す発現結果が得られ
た。 【００６９】 【表４】 【００７０】hSODレベルを、標準として真正hSODを用い
る標準的放射免疫測定法により測定した。GAPプロモー
ターからの構成的合成は全細胞蛋白質の10〜30%のオー
ダーの非常に高いレベルのhSOD産生を導いた。ガラクト
ースによる誘導もほとんど同様に機能し細胞蛋白質の約
7%をhSODとして産生した。 【００７１】hSODがこのような高レベルで産生される場
合には、完全な酵素的すなわち触媒的活性を回収するた
めに、補欠群として亜鉛イオン及び銅イオンを、生成蛋
白質に、硫酸亜鉛及び硫酸銅の両者の1mM溶液に対する
透析により与えることが必要である。この方法に代え
て、亜鉛イオン及び／又は銅イオンを10の増殖培地に含
有せしめることができ、この方法はさらに、高レベルの
hSODを産生する菌株を選択するための手段、及び／又は
非選択培地でのhSODを発現するプラスミドベクターの喪
失を回避するための手段を提供する。 【００７２】pPGAPの造成 pBR322のHindIII部位にGAPDH遺伝子GAP49〔Holland及び
Holland，J.Biol.Chem.(1979)254:5466-5474〕を含有す
るHindIII断片を挿入することにより調製されたプラス
ミドpGAP1をHinfIで消化し、そして500bp断片を分離し
た。この断片をBal31で切断して約50bp又は90bpを除去
し、次にHindIIIリンカーに連結し、そしてHindIIIで消
化した。pBR322をHindIIIで消化し、次にアルカリホス
ファターゼで処理し、そして約450bp又は410bpの断片を
挿入してpGAP128を得た。 【００７３】pGAP128をHindIIIで消化し、この断片をKl
enow断片及びdNTPにより平滑末端化し、そして生成した
450bp断片をゲル電気泳動により分離した。この断片をS
maIで消化し、アルカリホスファターゼで処理したplot5
に挿入してプラスミドplot5pGAP128を得た。このプラス
ミドは約-400〜+27bpのGAPDHプロモーター及びコード領
域を含有する。 【００７４】GAPDHターミネーターとショートプロモー
ター領域の間に多制限部位リンカーを有する酵母発現ベ
クターpPGAPを次のようにして調製した。プラスミドplo
tGAP128をBamHI及びTaqIで消化して-400〜-26bpのGAPDH
プロモーターを有する約390bp BamHI-TaqI断片を得
た。BamI-TaqI断片を、-25〜-1bpのGAPDHプロモーター
及びNcoIを含むいくつかの制限部位を含有し、そして次
の配列、 【００７５】 【外６】 【００７６】を有する合成断片に連結してBamHI-SalI断
片を得、これをBamHI及びSalIにより消化し、そしてこ
れを用いて、BamHI-SalI消化されアルカリホスファター
ゼ処理されたpBR322のBamHI-SalI断片と置き換えた。連
結した後、プラスミドpGAPNRSを得、これをBamHI及びSa
lIで消化して400bpBamHI-SalI断片を生成せしめ、これ
をゲル分離した。この断片を、GAPDHターミネーター領
域及び3'コード領域のショートセグメントを含有する約
900bpSalI-BamHI断片に連結し、そして生成した1.4kb
BamHI-BamHI断片をBamHIで消化した。GAPDH遺伝子GAP49
（Holland及びHolland、前掲）を含有する3.3kbBamHI断
片をpBR322のBamHI部位に挿入することによって得られ
たプラスミドであるpGAP2をSalI及びBamHIで消化するこ
とにより、SalI-BamHIGAPDHターミネーター断片を得
た。プラスミドpGAP2及びpGAP1は次のようにして得た。
全酵母DNAを制限酵素Sau3Aにより部分消化した後に得ら
れた断片をλ−ファージCharon28〔Blattner等、Scienc
e(1977)196:161-169〕に挿入することにより酵母遺伝子
ライブラリーを調製した。このファージライブラリー
を、酵母GAPDHmRNAに相補的なDNAを用いてスクリーニン
グし、そしてこれらのクローンの１つからの酵母GAPDH
遺伝子を、pBR322のBamHI部位における約3.3kbBamHI断
片（pGAP-2）として、又はpBR322のHindIII部位におけ
る約2.1kbHindIII断片（pGAP-1）ととしてサブクローニ
ングした。 【００７７】pBR322をEcoRI及びSalIで消化し、平滑末
端化し、そしてBamHIリンカーに連結し、次にBamHIで消
化し、そしてBamHI-BamHI3.8kb断片をゲル分離し、自己
連結により再環化し、クローニングし、そしてpBRΔR1-
Salと命名した。1.4kbBamHI-BamHI断片を、BamHIで消化
されそしてアルカリホスファターゼで処理されたpBRΔR
1-Salベクターに挿入して、ampγの逆向きに方向付けら
れた約5.3kbのプラスミドpPGAPを得た。 【００７８】制御されたGALを含有するプラスミドの造
成 プラスミドpLGSD5はGuarente等、（1982)前掲に記載さ
れている方法により調製する。このプラスミドを次のよ
うにして操作した。XhoIにより制限処理した後、オーバ
ーハングをDNAポリメラーゼIのKlenow断片（Klenow断
片）を用いて満たし、EcoRIリンカー（GGAATTCC)と連結
し、そして次にEcoRI及びSau3Aを用いて完全消化して37
0bp断片を得、そしてゲル電気泳動により分離した。こ
の断片は、酵母のGAL1遺伝子及びGAL10遺伝子の間に遺
伝子間配列（intergenic sequence）を含み、そしてGAL
1遺伝子及びGAL10遺伝子のGAL4制御配列を備える。 【００７９】この断片を、EcoRI及びBamHIで完全消化さ
れそして次にアルカリホスファターゼで処理してオリゴ
マー化を防止したpBR322に挿入し、プラスミドpBRGAL4
を得た。 【００８０】プラスミドpBRGAL4をSau3Aにより完全消化
し、オーバーハングをKlenow断片で満たし、そして得ら
れた平滑末端化断片をSalIリンカー（CGTCGACG）に連結
し、次にSalI及びXhoIで消化した。得られた370bp断片
をゲル電気泳動により分離した。この断片は、Xho及びS
alI末端を伴ってもとの370bp酵母GAL4制御配列を有す
る。 【００８１】次に、この断片をプラスミドplot5にクロ
ーニングした。次の配列、 【００８２】 【外７】 【００８３】を有する40bpポリンカー断片をEcoRI-PvuI
I置換体としてpBR322に挿入し、次にtrp-lacプロモータ
ー〔Russell及びBennett,Gene(1982) 20:230-245〕をPv
uII部位中に、転写の方向がホリリンター配列に向けら
れるように挿入することによってplot5を調製した。plo
t5をSalIにより完全に消化し、次にアルカリホスファタ
ーゼで処理し、そして370bp断片をplot5に挿入すること
によってプラスミドplot5GAL4/370を得た。次に、この
プラスミドをBamHI及びSalIにより完全に消化して、ポ
リリンカー断片の6bpによって延長された固有の断片を
得た。次にこの断片を、BamHI及びSalIで完全に消化さ
れそして再環化を防止するためにアルカリホスファター
ゼで処理されたpCl/lに連結した。得られたプラスミド
をpCl/lGAL4/370と命名した。 【００８４】BamHI-SalIは断片はベクターpCl/lのpBR32
2部分中に位置する。 【００８５】酵母において産生されたphSODポリペプチ
ドは天然のヒト−蛋白質と同一であることが示された。
酵母において産生されたhSODの移動は、ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動（ドデシル硫酸ナトリウムを用いる又
は用いない）、及びアガロースゲル電気泳動（前記参
照）のいずれかにおいてもヒト−蛋白質と同一であっ
た。さらに、高度に精製した酵母ポリペプチドを12サイ
クルのエドマン分解にかけた場合、その配列はＥ．コリ
において産生された前記のヒト蛋白質（残基1-10）につ
いて報告されている配列と同一であった。しかしなが
ら、検出レベルは蛋白質インプットについてのモル基準
で期待されるレベルの５〜10％に過ぎなかった。この低
下した検出レベルは、N-末端アミノ酸がブロックされて
いること、すなわちおそらくアセチル化されていること
を示している。この結果を、酵母産生hSOD及び真正アセ
チル化ヒト物質からのトリプシン分解ペプチドの比較分
析により確認した。この結果により、すべての予想され
たトリプシン分解蛋白質はN-末端の分解物を含む２つの
サンプルにおいて同一であり、従って酵母発現生成物中
にアセチル化N-末端ALAが存在することが示された。 【００８６】ヒトSOD遺伝子の分離 ヒトSOD遺伝子を分離するために、ヒトゲノムを代表す
るバクテリオファージλライブラリー［R.Lawn等、(197
8)Cell 15:1157-1174］を、ヒトSODcDNAから作られた放
射性ラベルDNAプローブを用いてスクリーニングした。1
00万個のファージプラークをスクリーニングし、13個の
ハイブリド形成陽性のプラークを精製した。ファージDN
Aの制限エンドヌクレオチド分析により、少なくとも５
つの異なる遺伝子が存在することが示され、他のSOD関
連遺伝子及び遺伝子生成物が存在することが示唆され
た。このような遺伝子の１つの候補は最近発見された細
胞外Cu/ZnSOD［S.Marklund、(1982)Proc.Natl.Sci.USA
79:7634-7638］である。真正細胞質Cu/Zn SOD遺伝子を
関連遺伝子から区別するため、本発明者等は、アミノ酸
残基19-26、及び3'非翻訳領域中のターミネーターコド
ンから3'のヌクレオチド193-213に対応する合成DNAプロ
ーブ5'-AATGCTTCCCCACACC-3'、及び5'-CTCAGTTAAAATGTC
TGTTTG-3'を用いた。13のゲノムDNAの内の１個のみがこ
れらのプローブとハイブリド形成し、これが真正なヒト
細胞質SOD遺伝子であることが示された。このことは、
図５に示すように、N-末端領域のDNA配列分析により確
認された。この場合、蛋白質配列により決定されたアミ
ノ酸酸列が確認される。これはまた、SODについてプレ
蛋白質が存在しないことを示している。開始メチオニン
コドンから９ヌクレオチド5'側にイン−フレームターミ
ネーションコドンが存在するからである。図５に示すよ
うに、ヒトCu/Zn SOD遺伝子は介在配列を含有する。図
６に示すSOD遺伝子の地図は、１個より多くの介在配列
が存在することを示す。 【００８７】以上、例示及び例によりこの発明を詳細に
説明したが、この発明の範囲内において多くの変化・変
法が考えられよう。 【００８８】なお、Ｅ．コリ D1210(pSOD×8）株は1983
年９月27日にATCCに寄託され、ATCCNo39453の受託番号
が与えられた。酵母2150-2-3(pCl/lGAPSOD)株、並びに
Ｅ．コリ D1210(pSOD11)株及びD1210(pS2OR)株が1984年
５月９日にATCCに寄託され、それぞれ受託番号ATCC No2
0708,No39679,及びNo39680が与えられた。 【００８９】なお、この発明は次の方法を含む。 【００９０】微生物においてスーパーオキシドジスムタ
ーゼを製造する方法であって、該微生物を栄養培地中で
増殖せしめることを含んで成り、該微生物が微生物中で
機能するDNA構成物を含有し、該DNA構生物が転写の下流
方向に、 (1)プロモーター； (2)リボゾーム結合部位； (3)開始コドン； (4)前記開始コドンとリーディングフレーム が整合しており、そして3'-末端に終止コドンを有する
ヒト−スーパーオキシドジスムターゼ構造遺伝子；及び (5)転写ターミネーター；を含有し、これによって前記
スーパーオキシドジスムターゼを産生することを特徴と
する方法。
【図面の簡単な説明】
【図１】DNAリンカー配列及びその使用を示す流れ図。
【図２】Plot5/SODの調整を示す流れ図。
【図３】Plot5/SODの調整を示す流れ図。
【図４】ヒトSOD cDNAのコード鎖(5'→3')及び得られる
翻訳生成物のそれぞれの配列を示す。 【図５】分離されたヒトSOD遺伝子の配列を示す。 【図６】分離されたSOD遺伝子の制限地図を示す。
翻訳生成物のそれぞれの配列を示す。 【図５】分離されたヒトSOD遺伝子の配列を示す。 【図６】分離されたSOD遺伝子の制限地図を示す。
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フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所
Ｃ１２Ｒ 1:645）
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 １．アセチル化されたヒトCu-Znスーパーオキシドジス
ムターゼの製造方法であって、該方法は、ヒトCu-Znス
ーパーオキシドジスムターゼをコードするDNA配列を酵
母宿主に導入する工程を含み、該DNA配列はその５’末
端にアセチル化配列を含み、該アセチル化シグナル配列
が第１位にアラニン、これに続く第２位にスレオニンを
含み、該アセチル化シグナル配列が、酵母宿主をして該
ヒトCu-ZnスーパーオキシドジスムターゼのＮ末端アミ
ノ酸をアセチル化せしめる、方法。
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