FI87800C - Foerfarande foer framstaellning av glukagon i jaest - Google Patents

Description

1 87800

Menetelmä glukagonin tuottamiseksi hiivassa Tämä keksintö kohdistuu menetelmään glukagonin tuottamiseksi hiivassa.

Glukagoni on polypeptidinen hormoni, jota haimassa sijaitsevien Langerhansin saarekkeiden α-solut erittävät. Se on yksiketjuinen polypeptidi, joka käsittää 29 aminohappoa seuraavassa järjestyksessä.

His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-

Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-

Asn-Thr (I)

Glukagonia käytetään veren liian alhaisen glukoositason (hypoglykemia) hoitoon sen aineenvaihdunnallisten vaikutusten johdosta. Glukagoni vaikuttaa edelleen sileään lihaksistoon kouristuksia laukaisevasti (spasmolyyttisesti), ja sillä on vatsan eritystä inhiboivaa vaikutusta.

Glukagonia voidaan eristää haimauutteista. Glukagonin eristäminen teurastettujen eläinten haimoista on monimutkainen prosessi, ja se edellyttää suurten haimamäärien käyttämis-*·.··: tä. Lisäksi glukagoni on herkkä proteolyyttiselle hajoami- selle, joten haimasta eristämällä saatu tuote on epähomo-.·. geenistä ja haiman glukagonipitoisuudesta saadaan talteen ainoastaan noin 1/4.

;; EP-patenttijulkaisun 44168 perusteella tunnetaan glukagonin kappaleet tai johdannaiset, joilla on seuraava yleinen kaava : R1 - R2 (II) -jossa R1 tarkoittaa ketjua His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp, ja R2 2 87800 tarkoittaa OH-ryhmää, peptidiketjuja -Phe-Val-Gln-Trp-Leu tai Met-Asn-Thr, tai vastaavaa peptidiketjua, joka on identtinen kahden viimeksi mainitun peptidiketjun kanssa, kuitenkin edellyttäen, että mainitusta kahdesta viimeksi mainitusta peptidiketjusta puuttuu yksi tai useampi aminohappo.

Kaavan (II) mukaisilla yhdisteillä on samankaltaista spas-molyyttistä vaikutusta sekä samankaltaista, vatsahappojen eritystä inhiboivaa vaikutusta kuin glukagonillakin, mutta niillä ei ole lainkaan aineenvaihdunnallista vaikutusta, tai tämä vaikutus on erittäin pientä tai mitätöntä. Näin ollen kaavan (II) mukaisia yhdisteitä pidetään glukagonia parempina siinä tapauksessa, että ainoastaan spasmolyytti-nen vaikutus tai vatsahappojen eritystä inhiboiva vaikutus on toivottavaa.

Kaavan (II) mukaisia yhdisteitä voidaan valmistaa joko luonnollisesta glukagonista tai peptidisynteesissä yleisesti tunnetuilla, sangen vaivalloisilla menetelmillä. Edullisin kaavan (II) mukainen yhdiste on glukagoni (1-21).

Tässä julkaisussa numerot, jotka on esitetty suluissa sanan glukagoni jälkeen, tarkoittavat aminohappojen lukumäärää. Luonnollinen glukagoni sisältää 29 aminohappoa, ja siitä käytetään merkintää glukagoni (1-29) (tai pelkästään sanaa glukagoni). Glukagoni (1-21) sisältää luonnollisesti esiintyvän glukagonin ensimmäiset 21 aminohappoa, ja niin edelleen .

Tämän keksinnön tavoitteena on saada aikaan taloudellisesti kannattavampi kaupallinen menetelmä glukagonin valmistamiseksi yhdistelmä-DNA-tekniikkaa soveltamalla.

Tämä keksintö perustuu siihen yllättävään havaintoon, että glukagonia voidaan ilmentää homogeenisena materiaalina saannon ollessa korkea, sellaisessa supernatantissa, joka 3 -7300 on peräisin tällaisia tuotteita koodaavilla DNA-ketjuilla transformoidun hiivakannan viljelmästä.

Tämän keksinnön mukaisesti saadaan aikaan menetelmä gluka-gonin tuottamiseksi hyvinä saantoina hiivassa siten, että transformoitua hiivakantaa, joka sisältää glukagonia koo-daavan geenin käsittävän replikoituvan ilmentymisvektorin, viljellään sopivalla ravintoalustalla, minkä jälkeen gluka-goni otetaan talteen ravintoalustalta.

Glukagonia (1-29) koodaava geeni voi olla synteettinen geeni tai se voi olla peräisin glukagonin cDNA-kloonista tai glukagonin genomisesta kloonista.

Glukagonia valmistetaan mieluiten siten, että glukagonin koodaava synteettinen geeni istutetaan sopivaan hiivan DNA-ilmentymisvektoriin, sopiva isäntänä toimiva hiivakanta transformoidaan tällä ilmentymisvektorilla ja tätä transformoitua mikro-organismia viljellään, minkä jälkeen gluka-goni otetaan talteen viljelyalustalta.

Kun sopiva hiivaisäntä transformoitiin edellä mainitulla ilmentymisen välittäjällä, niin toivottua tuotetta saatiin tuotetuksi hyvinä saantoina. Yllättävästi muodostunut glu-kagoni oli hyvin homogeenista ja kasvatuksen aikana hiivan : tuottamien entsyymien ei todettu pilkkovan glukagonin 17- .·. : ja 18-asemassa sijaitsevaa kaksiemäksistä aminohappoketjua

Arg-Arg. Tämä on erittäin yllättävää, sillä hiivan tiedetään tuottavan trypsiinin kaltaisia endopeptidaasientsyy-.! mejä, jotka pilkkovat spesifisesti tällaisia kahden emäksi sen aminohapon muodostamia kohtia.

Tätä keksintöä kuvataan edelleen liitteenä olevien piirustusten avulla, joissa piirustuksissa: 4 87800 kuva 1 esittää plasmidin pMT290 rakennetta, kuva 2 esittää plasmidin pMT544, pKFN6 ja pMT612 rakennetta, kuva 3 esittää plasmidin pKFN23 rakennetta, kuvat 4 ja 5 esittävät tietyn, plasmidista pMT544 peräisin olevan ketjun in vitro mutageneesiä, kuva 6 esittää hiivan supernatantin analyyttistä, HPLC:n avulla saatua profiilia ennen puhtaan, todellisen glukago-nin lisäämistä ja sen lisäämisen jälkeen, sekä kuva 7 esittää väkevöidyn, DEAE-läpivirtaaman preparatii-vista fraktiointia.

Glukagonia (1-29) koodaava synteettinen geeniketju on muodostettu edellä esitetyn aminohappoketjun (I) perusteella lukuisista oligonukleotideistä käyttämällä sellaisia aminohappokodoneita, joita käytetään mieluiten proteiinien hyväksi ilmentymiseksi hiivassa (Bennetzen J.L. et ai., (1982), The Journal of Biological Chemistry, 257. 3026-3031). Lisäksi tämän molekyylin asianmukaisiin kohtiin sisällytettiin restriktioentsyymien tunnistamiskohtia geenin spesifisen pilkkomisen mahdollistamiseksi, mikä helpottaa tunnusomaisten piirteiden selvittämistä sekä mutageneesiä. Tämän keksinnön puitteissa pyrittiin välttämään sekundäärisiä rakenteita, jotka mahdollisesti häiritsevät ligaatio-ja täyttymisreaktioita.

5 37300

Glukagonin kappaleita tai johdannaisia koodaavia synteettisiä geenejä voidaan muodostaa glukagonin(1-29) geenin avulla. Glu-kagonia(1-21) koodaava synteettinen geeni muodostettiin korvaamalla glukagonin(1-29) geenissä glukagonia(16-29) vastaava res-triktiokappale synteettisellä DNA-kappaleella, joka vastaa glu-kagonia(16-21). Glukagonin muita kappaleita tai johdannaisia koodaavien synteettisten geenien valmistaminen glukagonin(1-29) synteettisestä geenistä on selvää alan asiantuntijalle, kuten myöskin se, miten tällaisia kappaleita tai johdannaisia koodaava synteettinen geeni valmistetaan näitä tuotteita koodanvan koko geenin synteesillä oiigonukleotidejä käyttäen.

Glukagonin(1-29) geeni voidaan saada myös glukagonin cDNA-kloo-nista. Naudan haimasta peräisin oleva preproglukagoni-cDNA on eristetty ja sen ketju on selvitetty (L.C. Lopez et ai., (1983), Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 80, 5485-5489). Tämä preproglukagoni-cDNA koodaa signaali- tai esipeptidiä (prepep-tidi), Nl^-päätteistä peptidiä, glukagonia sekä kahta karbok-syylipäätteistä, glukagonin kaltaista peptidiä (GLP-1 ja GLP-2). Tämän keksinnön tavoitteita ajatellen glukagoniketju voidaan pilkkoa syntetoidusta cDNA:sta, ja siihen voidaan liittää py-säytyskodoni Thr(29) kodonin jälkeen, kohtaspesifistä mutage-neesiä käyttäen.

Toivotun tuotteen geeni voidaan sulauttaa muuta proteiinia koo-. daavaan DNA-ketjuun, minkä tarkoituksena on suojata ilmentynyt proteiini esimerkiksi endogeenisten entsyymien in vivo hajoittamista vastaan, tai liittää ilmentyneeseen proteiiniin tarpeellinen informaation proteiinin kuljettamiseksi periplasmi-seen tilaan ja lopulta soluseinämän läpi viljelyalustaan.

Mikäli geeni ilmentyy yhteensulautuneena tuotteena, niin käy-\tehtävissä tulisi olla keino glukagoniosan pilkkomiseksi täl-' ‘ laisesta yhteonsu1autuneesta tuotteesta. Tätä tarkoitusta vnr- • ten kodoneja, jotka koodaavat selektiivisen pilkkoutumiskohdan sisältävää aminohappoketjua, istutetaan ylimääräistä proteiinin koodaavan DNA-ketjun ja toivottua tuotetta koodaavan geenin väliin. Tällainen ylimääräinen proteiini voidaan irrottaa 6 87800 toivotun proteiinin erittymisen aikana itse transformoidun mikro-organismin avulla. Mikäli esimerkiksi glukagonin N-pään viereen istutetaan kahta emäksistä aminohappoa (kuten Lys-Arg, Arg-Arg, Lys-Arg tai Arg-Lys) koodaavia kodoneita, niin hiiva saattaa pilkkoa näiden emäksisten aminohappojen ja glukagonin välisen peptidisidoksen erittymisen aikana.

Toivottu proteiini saattaa myös erittyä siten, että tämän toivotun proteiinin N-päähän on liittynyt ylimääräinen pro-teiiniketju, kuitenkin edellyttäen, että tämä ylimääräinen proteiini sisältää selektiivisen pilkkoutumiskohdan toivotun proteiinin N-pään vieressä, jotta tämä liiallinen aminohappo-ketju voitaisiin myöhemmin irrottaa toivotusta tuotteesta joko entsymaattisesti tai kemiallisesti.

Erittymistä ajatellen tämä ylimääräinen DNA-ketju voi koodata signaalipeptidiä. Lisäksi tämä ylimääräinen DNA-ketju voi koodata johtopeptidiketjua. Transformoitu mikro-orqanismi pilkkoo signaali- ja johtopeptidin ilmentyneestä proteiinituotteesta sen soluista erittymisen aikana, mikä johtaa toivotun tuotteen helpompaan eristämistoimenpiteeseen. Hiivan tapauksessa erittäin sopiva johtopeptidijärjestelmä on hiivan MFal-johtoketju tai sen osa (Kurjan, J. ja Herkowitz, I., Cell (1982) 933-943). Kuitenkin tämän keksinnön puitteissa voidaan käyttää mitä tahansa sellaista signaali- tai johto-ketjua, joka saa aikaan erittymisen hiivassa, ja tämän keksinnön ei ole tarkoitus rajoittua johonkin spesifiseen eritty-misjärjestelmään.

Ilmentymistä ajatellen, promoottoriketju sijoitetaan toivottua proteiinituotetta koodaavan DNA-ketjun suhteen ylävirtaan. Tällöin käytetään mieluiten promoottoria, joka on peräisin isäntäorganismina toimivassa hiivassa luonnollisesti esiintyvästä geenistä, kuten esimerkiksi TPJ- (trioosi-fosfaatti-isomeraasi) geenin promoottoria. Toivottua tuotetta koodaavan DNA-ketjun jälkeen sijaitsee kopioinnin päättäjäketju, mieluiten sellainen päättä jäket ju, joka on peräisin isäntä-• : organismina toimivassa hiivassa luonnollisesti esiintyvästä geenistä kuten esimerkiksi TPI-geenin tai MFal-geenin päättäjä.

7 3 7 8 G O

Toivot t-un proteiinituotetta koodnavn DNA-ketju, joka on sulautettu yhteen as i .annin k a i sen promoottori - , johto- ja päättäjn-Ketjuu kanssa, istutetaan ilmentymisen välittäjään tämän toivotun proteiinituotteen ilmentämiseksi hiivassa.

Tämä ilmentymisen välittäjä voi olla olasmidi, joka kykenee replikoituinaan hiivassa tai joka kykenee yhtenäistymään hiivan kromosomeihin. Tämä plasmidi voidaan edullisesti stabiloida isäntänä- toimivassa mikro-orqanismissa tapahtuvaa plasmidihä-vikki.ä vastaan siten, että siihen sisällytetään i sän t äso I u jen elinkelpoisuudelle tai normaalille kasvulle oleellinen geeni, esimerkiksi geeni, joka koodein solun jakautumista, so l use i nämän biosynteesiä, proteiinisynteesiä, jne.

Glukaqonin(1-79) synteettinen geeni muodostettiin ligaatiolla lukuisista o 1 iqonuk1eotideistä, jonka jälkeen tämä osittain kaksijuosteinen rakenne täydennettiin entsymaattisesti.

Öliqonuk leo t idi t syn te to i t i. in automaattisella DNA-syntetisaat-torilla, kemiallista fosforamid1ίttimeneleImää ja kantajana toimivaa silikaa käyttäen (S.L. Beaucaqe ja M.H. Carnthers (1981) Tetrahydron letters 22_, 10Γ>9-1869), tai puoliautomaattisella koloonisynteesillä käyttäen fosfotriesterimenetelmää ja di -ja trinukleotidien muodostamia kokonaisuuksia sekä Dolysty- ____: reenikantajaa (fl. Ito, Y. Ike, .S. Ikata ja K. Itakura (1982) . - Nucleic Acids Res. Π), 1755-1769). Oiiqonukleotidien syntetoin-Γ . ti pienemmistä yksiköistä peräkkäisillä kytkentäreaktioilla on alalla hyvin tunnettu menetelmä. Glukaqon ia ( 1-29 ) koodaava *·* synteettinen qeeni syntetoitiin seuraavasti: 33-meeri (I) : GAGCACTCTCAGGGTACCTTCACTTCTGACTA C (I) : ·.: ligntoitiin 33-meeriin (11) TCTAAATACTTGGACTCTAGAAGAGCCCAAGAC (II) *. 13-meerin (III) atttagagtagtc du) avulla, jolloin saatiin 66-meeri (I-Π) : 8 87800

I-!-n-ϋ-I

II I '

Lisäksi 73-meeri RV'I (Ί V i in 1 iua t:<> \ mn 1 l n Voisiinsa U-mppi'i (III ) , 16-ineer i ( V ) cttctagagtcx:aagt (v > sekä 44-meeri (IV): CCGAAGCTTAGGTGTTCATCAACCATTGGACGAAGTCTTGGGCT (IV) 33-meerin (II) läsnHol Ipnsa ,-—-1 .'nr'1—n—T7—1 jolloin saatiin 73-wppri (ill V - I V) .

Tämä 66-raeei‘i ( I - I I ) ja '1 I -ιιιοιί1 i ( 1 1 I V - I V ) , j<> i < 1<mi I 1 piiä I täydentävät toisiaan 14 emä k s on suilleen, liiteli iin loisi in.*; n, ja 3'-päitn jatkoi ti In en IsymaalI ises I i , jolloin saatiin 100 emäsoarin mittainen kaks, i. juo» le inen ONA-molekyyli , joka esitetään seuraavassa siilien s isä I l y tel ty ine re:; t r ik t iokoli t ineen (suuret kirjaimet: kemiallisesti syntetoitu; pienet kirjaimet: entsymaattisesti täydennetty) '· I-i-1 |-U-

His-Ser-Gln-Gly-llir-Plie-nir-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arq-Arq 123456789 10 11 12 13 14 15 16 17 18

‘ ·.· HqlAl Ddel Kpnl IlinCl Xbal MboII

. ·. GAG CAC TCI’ C.\G GG1’ ACC TiX' ACT ΊΧΓΓ GAC TAC ΊΧ,Τ AAA TAG TIG GAO TcF'AGA AGA etc qtq aqa qlc eoa Iqq nau tqa aqa CTG ATG AGA TIT MV, AAC Cl'G AGA ΊΧΓΓ ΊΧΓΓ I-Il-|μ ·*·. m ν . . ; Ala-Gln-Aso-Plie-Va I -Gin -‘IVx>l pu-Met-Asn-'llir-Knd 19 /{) 71 77 73 74 7Γ> /V 77 70 79

Ban 1.1 TtiilH I DJeJ Hind3 GCC CAA GAC lie qte caa t.qq itq atq aac acc taa qcttcqq ·...* CGG GIT CTG AAG CAG G1*J’ ACC AAC TAC ITG TGG ATI’ CGAAGCCj

IV

9 87800 Tämän synteettisen geenin Kpnl-Hind3-kappale istutettiin plasmi-diin (pLaC48, joka oli katkaistu entsyymeillä Kpnl ja Hind3) ligaasilla T4. Ligaatioseosta käytettiin asianmukaisesti esi-käsiteltyjen E. coli-solujen transformoimiseen. Uudestaan toteutetun transformaation jälkeen glukagonia(4-29) koodaavan oikean ketjun sisältävä transformantti (pKFN4) tunnistettiin.

Tämän jälkeen glukagonia(1-29) koodaava synteettinen geeni muodostettiin istuttamalla glukagonin(4-29) geeni sellaiseen hiiva-plasmidiin, joka sisälsi synteettisen, glukagoni(1-3)-ketjun. Ligaatio tapahtuu Kpnl-kohdassa.

Glukagonia(1-21) koodaava synteettinen geeni muodostettiin glukagonin ( 1-29 ) geenistä korvaamalla glukagonia(16-29) vastaava Xbal-Hind3-kappale glukagonia(16-21) vastaavalla synteettisellä Xbal-Hind3-kappaleella: (S) er Arg Arg Ala Gin Asp End 16 17 18 19 20 21 22

Xbal Hind3 _

5' CTAGAAGAGCCCAAGACTA 3' TTCTCGGGTTCTGATTCGA

Plasmidin muodostaminen ‘ ' Synteettinen oiigonukleotidi, joka koodaa glukagonin ensimmäistä : neljää aminohappoa, ja joka päättyy Kpnl-kohtaan, sijoitettiin _'·· hiivavektoriin MFal-johtoketjun jälkeen (J. Kurjan ja I.

: Herskowitz, Structure of a Yeast Pheromone Gene MFa: A Putative : α-Factor Precursor Contains four Tandem Copies of Mature a-Factor,

Cell 30 (1982) 933-943), Alkuperäinen Hind3-kohta, joka sijaitsee α-tekijän johtoketjun päässä, tuhoutui kytkettäessä.

Tätä kytkeytymistä havainnollistetaan seuraavassa: 10 37300 I u-tokijä I glukagoni 1-4

Glu Ala His Ser Gin Gly Thr "Hind3 Kpnl

AGCTCACTCTCAAGGTAC GTGAGAGTTC

Tuloksena olevassa plasmidissa pNT290 qlukaqoniqeenin se osa, joka oli lähinnä promoottoria, sijaitsi välittömästi NIFal- johtajan Lys-Arg-Glu-Ala-Glu-Ala-ketjun jälkeen, ja TPI-pro- moottorin (TPI ) säätelyn alaisena. Tähän plasmidiin voidaan o istuttaa qlukaqonia(4-29) koodaava ketju plasmidista oKFN4.

Tämä plasmidi ei kuitenkaan sisällä ainuttakaan kopioinnin päättämiseen tarvittavaa hiivasignaalia. Tällaisten oäättämis-kohtien on osoitettu lisäävän kloonatun proteiinin saantoa jopa kymmenkertaiseksi (J. Mellor et ai. Gene 24^ (1983) 1-14).

Tästä syystä hiivan ilmentymisvektorissa pMT544 plasmidista pMT409 peräisin oleva, α-tekijän muodostama kopioitumisen päättäjäketju (MFctl,p) sijoitettiin glukagoni-istut teen jälkeen.

Kokonaisuutta TPI^-MFal-johta ja-glukagoni (1-29 )-MFal-p koodaa-van istutteen sisältämä plasmidi PMT544 sisälsi edelleen N-pään jatketta Glu-Ala-Glu-Ala koodaavan ketjun, jonka jatkeen hiiva poistaa tämän keksinnön mukaisen muodosteen tapauksessa ainoastaan suurin piirtein molekyylien koi mannosta osasta.

MFul-johtajan C-pään Glu-Ala-Glu-Ala-ketjua koodaava l)NA-ketju poistettiin plasmidista pMT544 poistavalla in vitro mutagenee-sillä. Tuloksena oleva hiivan ilmentymisplasmidi pKFN6 sisälsi istutteen, johon oli koodautunut kokonaisuus TPI^-MFal-johtaja (miinus Glu-Ala-Glu-Ala ) -glukagoni (1-29 )-MFotl^.

... Edullisimmassa muodosteessa tämä ilmentyvä yksikkö siirrettiin stabiiliin hiivaplasmidiin CPOT (ATCC no. 39685), jonka kopioiden lukumäärä on suuri, ja joka voidaan valikoida pelkästään ' : kasvualustassa läsnäolevan glukoosin perusteella. Tuloksena . . olevalle, qlukaqonia (1.-29 ) koodaavalle hiivan ilmentymisplasmi-dille annettiin numeroksi pMT612.

JI 37800

Kokonaisuul! I'S TP I -MF<t|.-joh 1*3 Jr (mi. I nun Olu-Ala-Glu-Aln)-glukaqoni (1-2 1 ) --Ml·' ulkooJaavan Istutteen sisältävä plasmidi muodostettiin plasmidista oKFNG korvaamalla qlukaqonia(IG-21) koodaava XbaL-llind.3-knppa 1 e synteettisellä, qlukaqonia ( 10-29 ) koodaavalla Xbal-Hind 3-kappaleel la .

Edullisiminassa muodosteessä tämä edellä mainittu ilmentymis-yksikkö siirrettiin hiivan p.lasinidiin CPOT (ATCC no. 39685). Tuloksena* saadulle, q lukaqon i.a( 1 -2 l ) koodaavalle hiivan ilmen-tyniisplasmidi 1. le anneltiin numeroksi pKFN23.

Transformaatio

Plasmidi pMT612 transformoi t iin sellaisiin S. cerevisiae-kan-toihin, joiden trioosi-fostaattl-isomeraasia (TPl) koodaava geeni oli puutteellinen, käyttämällä valikointiperusteena glukoosin avulla tapahtuvaa kasvua. Tällaiset kannat eivät tavallisesti kykene kasvamaan siten, että glukoosi toimii ainoana hiilen lähteenä, ja ne kasvavat hyvin hitaasti qalaktoosi-laktaatti-alustalla. Tämä puutteellisuus johtuu TPI-qeenissä esiintyvästä mutaatiosta, joka on muodostunut siten, että tämän geenin suurin osa on irrotettu ja korvattu S. cerevisiae-hiivan LEU 2-geenillä. Kasvun puutteellisuuksista johtuen TPI:tä koodaavan geenin sisältävä plasmidi valikoituu voimakkaasti. Plasmidi pM'J’612 sisältää Schizzo. pombe-organismin TPI-geenin.

Plasmidi pMT544 transformoitiin S. cerevisiae-hiivan LEU 2-mutanttiin leusiini-prototrofien valikoinnin avulla (A.

·.· * Hinnen, J.B. Hichs ja G.R. Fink, "Transformation of Yeast", Proc. Nat. Aca. Scc. 75 ( 1978) 1929).

. Plasmidi pKFN23 transformoitiin sellaiseen S. cerevisiae- kantaan, jonka TPl-geeni oli puutteellinen, käyttämällä valikointiperusteena glukoosin avulla tapahtuvaa kasvua. Trans-. . formoitu kanta KFN31 valittiin myöhempää käyttöä varten.

’ Tämän patenttihakemuksen laatija on tallentanut plasmidin pMT612 sisältävän transformoidun kannan MT615 saksalaiseen 12 87 800 mikro-organismikokoelmaan Deutshe Sammlung von Mikro-organismen (DSM), Griesebachstrasse 8, D-3400 Gottingen tammikuun 10. päivänä 1985, ja sille annettiin tunnusnumeroksi DSM 3184.

Tämän patenttihakemuksen laatija on tallentanut kannan KFN31 DSM-kantakokoelmaan joulukuun 13. päivänä 1985, ja kannalle on annettu tunnusnumeroksi DSM 3608. DSM on kansainvälinen, Budapestin sopimuksen 1977 valtuuttama kantakokoelma, joka huolehtii tallennetuista kannoista, sekä siitä, että nämä kannat ovat yleisön käytettävissä edellä mainitun sopimuksen sääntöjen 9 ja 11 mukaisesti, vastaavasti.

Kokeellinen osa Esimerkki 1

Oligodeoksiribonukleotidien synteesi

Suojattuja deoksiribonukleosidi-31-p-kloorifenyylifosfaatteja sekä suojattuja di- ja trinukleotidi-3'-p-kloorifenyylifosfaat-teja valmistettiin menetelmällä, joka kuvataan julkaisussa (G.R. Gough, K.J. Collier, H.L. Weith sekä P.T. Gilham (1979) Nucleic Acids Research T_, 1955-1964 ).

Pyridiinistä tehtiin vedetöntä palautusjäähdyttämällä sitä kalsiumhydridin kanssa, ja tislaamalla se tämän jälkeen tämän kuivausaineen päältä.

87800 13 formiin valmistetulla 10-prosenttisella trikloorietikkahapolla, mitä seurasi pesu kloroformilla ja pyrdiinillä. Kytkemisreak-tio toteutettiin injektoimalla käsin 0,1 M dimetoksitrityyli-tymidiini-3'-0-p-kloorifenyylifosfaattia, 0,3 M l-mesityleeni-sulfonyyli-3-nitro-l,2,4-triatsolia ja l M N-metyyli-imidatsolia vedettömässä pyridiinissä (B.S. Sproat ja W. Banwarth (1983) Tetrahedron Letters 2j4, 5771-5774 ). Kytkemisreaktion annettiin edetä huoneen lämpötilassa 30 minuuttia, jonka jälkeen polymeeri pestiin pyridiinillä ja kloroformilla. Tämän jakson pituus oli 85 minuuttia. Samalla tavalla suojatut di- ja tri-nukleotidi-3'-O-p-kloorifenyylifosfaatit kytkettiin kantajaan kiinnitettyyn, kasvavaan oligonukleotidiin. Suojaavat ryhmät poistettiin osittain täysin suojatusta 33-meeristä, ja tämä 33-meeri irroitettiin kantajasta käsittelemällä sitä 0,5 M tetrametyyliguanidinium-pyridiini-2-aldoksimaatilla, joka oli valmistettu pyridiinin ja veden seokseen (4:1), 37°C:n lämpötilassa 24 tunnin ajan. (C.B. Reese, R. C. Titmas ja L. Yau (1978) Tetrahedron Letters, 2727 - 2730). Emäksiä suojaavat ryhmät poistettiin käsittelemällä tuotetta väkevällä ammoniakilla 55°C:n lämpötilassa 24 tunnin ajan. Lopuksi dimetoksi-ryhmät poistettiin käsittelemällä tuotetta etikkahapon 80-prosenttisella vesiliuoksella huoneen lämpötilassa 30 minuuttia. Tämä 33-meeri (I) puhdistettiin HPLC-kromatografisesti C18-kolonnilla tunnettua menetelmää käyttäen (H.J. Fritz, R. Belagaje, E. Brown, R.H. Fritz, R.A. Jones, R.G. Lees ja *:*: H.G. Khorana (1978) Biochemistry V7, 1257-1267).

·’· | Samalla tavalla syntetoitiin 13-meeri (III), 16-meeri (V), 44- meeri (IV) sekä ne kaksi oligonukleotidiä (10-meeri ja 1.8-meeri), joita käytettiin glukagonin (1-4) synteettisinä kytkijöinä ! ’ α-tekijä-johtoketjun ja glukagoni(1-29)-geenin yhteensulautta- miseksi. 33-meeri (II) ne kaksi 19-meeriä, joita käytettiin glukagonia (1-2.1) koodaavan geenin muodostamiseksi, sekä 26-meeri-” nen mutageeninen poistoprimeeri syntetoitiin automaattisella V ' DNA-syntetlsaat tori l la (Applied Biosystems, malli 380A), käyttäen fosforamidiittimenete.lmää ja kaupallisesti saatavia reagensseja.

14 87800

Esimerkki 2

Glukagonia(4-29) koodaavan geenin synteesi

Oligonukleotidit merkittiin 5'-päistään tunnetulla menetelmällä (K. Norris, F. Norris, L. Christiansen ja N. Fiil (1983)

Nucleic Acids Research l_l_, 5103-5112).

Seosta, joka oli valmistettu 10 mikrolitraan vettä, ja joka 3 2 käsitti 10 pmol sekä oligomeeriä T että 5'- P-merkittyä oligo-meeriä II sekä 20 pmol oligomeeriä III, lämmitettiin 60°C:n < lämpötilassa 5 minuuttia, jonka jälkeen se jäähdytettiin jäissä. Siihen lisättiin lO^ul 132 mM Tris-HCl-seosta (pH 7,4), 20 mM MgC^, 2 mM ATP, 20 mM DTT, lOO^ug/ml gelatiinia ja 0,5^ul T4-ligaasia (200 yksikköä). Ligaatioreaktio toteutettiin 16°C:n lämpötilassa 2,5 tunnin aikana, jolloin noin 2/3 oli ligatoitu-nut. Tuloksena oleva 66-meeri (I-II) puhdistettiin käyttämällä denaturoivaa PAGE-menetelmää ja puskurilla eluoimista.

32

Samalla tavalla ligatoitiin keskenään 20 pmol 5'- P-merkittyä 32 oligomeeriä V, 20 pmol 5'- P-merkittyä oligomeeriä III ja 20 pmol oligomeeriä IV siten, että läsnä oli 25 pmol oligomeeriä II, 16°C:n lämpötilassa 2,5 tunnin ajan. Tuloksena oleva 73-meeri (III-V-IV) puhdistettiin denaturoivaa PAGE-menetelmää ja puskurilla eluoimista käyttäen.

Seosta, joka käsitti 2 pmol sekä oligomeeriä (I-II) että oligo-·· * meeriä (III-V-IV) 9^ul 50 mM Tris-HCl-seoksessa (pH 7,8), 5 mM

" MgC^, 10 mM DTT ja 50^ug/ml gelatiinia, lämmitettiin 3 minuu- ...· tin ajan 80°C:n lämpötilassa, jonka jälkeen se jäähdytettiin 30 minuutin aikana 45°C:n lämpötilaan. Sen jälkeen, kun reak-: . tioseosta oli seisotettu 15 minuutin ajan 45°C:n lämpötilassa, reaktioseos jäähdytettiin 16°C:n lämpötilaan, ja siihen lisät-tiin lyUl dNTP-seosta (dATP, dCTP, dGTP, dTTP, 5 mM kutakin) ja l^,ul DNA-polymeraasia I, Klenow-kappale (3,5 yksikköä). Täydentymisreaktion annettiin edetä 60 minuutin ajan 16°C:n ‘ lämpötilassa, jonka jälkeen DNA eristettiin fenolilla uuttamalla *...· ja etanolilla seostamalla. DNA pilkottiin entsyymeillä Kpnl ja Hind3, ja se ligatoitiin plasmidista pLaC48 saatuun suu-reen Ppnl-Hind3-kappaleeseen (plasmidi pLaC48 on plasmidin pBR322 johdannainen, joka sisältää yhden ainoan Kpnl- ja Hind3-kohdan).

is 87800 Tämä ligaatioseos transformoitiin asianmukaisesti käsiteltyihin E. coli-soluihin, käyttäen valikointiperusteena ampisil-liinin vastustuskykyä. Synteettisen glukagoni(4-29)-geenin sisältävää plasmidia pKFN4 kantava pesäke tunnistettiin res-triktioentsyymeillä toteutetun analyysin (Xbal, Kpnl ja Hind3) sekä DNA-ketjun määrityksen avulla (A. Maxam ja W. Gilbert (1980) Methods Enzymol. 65^ 499-560).

Esimerkki 3

Hiivaplasmidien muodostaminen glukagonin(1-29) ilmentämiseksi Plasmidi p285 leikattiin restriktioentsyymillä Xbal, jonka jälkeen syntyneet päät tehtiin epäreaktiivisiksi käsittelemällä Klenow-polymeraasi11a sekä deoksiribonukleotiditrifosfaateillä. Sen jälkeen, kun DNA oli uutettu fenoliin, saostettu etanolilla ja suspendoitu uudestaan, se pilkottiin entsyymillä Hind3, ja 10,5 kiloemäsparin suuruinen kappale eristettiin. Tämä kappale sisälsi TPI-promoottorin (T. Alber ja G. Kawasaki, J. Mol. Applied Genet., 1_, (1982), 419-434) sekä MFul - johtoket jun.

Plasmidin p285 muodostaminen on kuvattu US-patenttihakemukses-sa 547 748, päivätty 1 marraskuuta 1983. p285 sisältää istut teen TPIp-MFa1-johtaja B-C-A-TPIT, ja se on tallennettu hiiva-kantaan Z 33 (ATCC no. 20681). Plasmidi pBoel5 (plasmidin pBoel5) (plasmidin pUC8 johdannainen, jossa on Kpnl-kohdan sisäl- ____. tävä synteettinen Hinc2-Hind3-istute) leikattiin restriktioent- . . syymillä Ndel, päät tehtiin epäreaktiivisiksi Klenow-polymeraa- y ' silla, kuten edellä, leikattiin entsyymillä Kpnl ja lopuksi ’· '"· 0,3 kiloemäsparin suuruinen kappale eristettiin. Nämä kaksi kappaletta ligatoitiin keskenään edellä kuvatulla tavalla val-mistetun, synteettisen glukagoni (1-4 ) -kytki jän avulla, liittä-mällä pUC8-istutteen Kpnl-kohta MFa 1-johtoket jun 263-asemassa sijatsevaan Hind3-kohtaan. Monien kopioiden liittymisen vält-tämiseksi tätä kytkijää ei fosforyloitu ennen liqaatiota.

MFal-johtoket jun päässä sijaitseva a likuperäinen Hind3-kohta .1. ei muodostunut uudestaan kytkijän vaikutuksesta. Tämä liqaa- y. tioseos transformoitiin E. coli-soluihin, käyttäen valikointi- *y perusteena ampisilliinin vastustuskykyä.

Tällöin saatiin plasmidi pMT290 (kuva 1), jolla oli toivotun lainen restriktiokartta.

37800 16

Glukagonia (1-29) koodaavan kokonaisen geenin, ja tämän geenin jälkeen kopioitumisen päättäjäketjun sisältävän ilmentyvän plasmidin saamiseksi plasmidista pMT290 saatu 6,5 kiloemaspa-rin Xhol-Kpnl-kappale ligatoitiin plasmidista pMT409 (pMT183, josta puuttuu 0,7 kiloemäsparin Xbal-BamHl-kappale) saatuun 5,1 kiloemäsparin Hind3-Xhol-kappaleeseen, sekä plasmidista pKFN4 peräisin olevaan, glukagonia (4-29) koodaavaan synteettiseen Kpnl-Hind3-kappaleeseen. Plasmidi pMTl83 on YEP 13-johdannainen, joka sisältää 2,1 kiloemäsparin Sphl-BamH3-istutteen. Tämä istute koodaa S. cerevisiae-hiivan MFal-geenin ilmentymistä Schizzosaccharomyces pombe-hiivasta saadun alkoholidehydroge-naasipromoottorin säätelemänä. Tämä istute sisältää samoin BamH3-kohdan lähellä olevassa osassaan MFal-geenistä peräisin olevat ketjut, jotka määräävät kopioitumisen päättymisen. Tämä ligaatioseos transformoitiin E. coli-soluihin, käyttäen valikoin-tiperusteena ampisilliinin vastustuskykyä. Yksi tuloksena olevista plasmideista, pMT544,(kuva 2), jolla on odotettu restriktiokartta, koodaa glukagonin (1-29) ilmentymistä, mutta se sisältää edelleen ketjun, joka koodaa N-pään jatketta Glu-Ala-Glu-Ala. Glu-Ala-Glu-Ala-jatketta koodaava ketju poistettiin plasmidista pMT544 in vitro mutageneesillä, jolloin saatiin pKFN6. pMT544 tehtiin lineaariseksi pilkkomalla se qlukagoniqeenissä sijaitsevasta ainoasta Xbal-kohdasta. 51-mononukleotidejä poistettiin täten saadun kaksijuosteisen DNA-molekyylin 3'-päistä käsittelemällä Exo III-nukleaasilla. Tämä Exo III-nukleaasilla käsittely • suoritettiin 23°C:n lämpötilassa sellaisissa olosuhteissa, joissa tämän lineaariseksi tehdyn plasmidin kummastakin 3'-päästä saatiin poistetuksi noin 250 nukleotidiä (L. Guo ja R. WU. (1983), Methods in Enzymology 100, 60-96). 26-meerinen kinaasi-' käsitelty mutageeninen poistoprimeeri d (CTTTGG AT A A A A G AC ACTCTC A AGGT) liitettiin mutaatiokohtaan (kuva .·**. 4). Kaksijuosteinen rengasmainen DNA-molekyyli muodostettiin • täydentämällä Klenow-polymeraasilla ja ligatoimalla T4-ligaa- silla. Glukagonigeenin alkuperäinen Xbal-kohta tuhoutui Klenow- l7 37 800 täydentämisen ja sitä seuraavan ligaation aiKana. E. coli- bakteereiden (MT172) transformoimisen jälkeen mutantit tunnis- 3 2 tettiin hybridisoimalla pesäkkeet 5'- P-merkityllä 26-meerisel-lä mutageneesin poistoprimeerillä. 8 mutantista saadut plasmi- dit analysoitiin pilkkomalla ne entsyymeillä Kpnl ja Pstl, jolloin tavoiteltu 12 emäksen poistuminen varmistui. 3 näistä kahdeksasta mutantista oli "puhtaita" mutantteja, mutta niistä saadut plasmidit transformoitiin kuitenkin uudestaan E. coli-bak-teeriin (MT172).

Tämän jälkeen glukagonigeenissä sijaitseva, tuhoutunut Xbal-kohta muodostettiin uudestaan ligatoimalla plasmidista pMT544 saadut, 4,4 kiloemäsparin suuruinen BamHl-Xhol-kappale ja 0,9 kiloemäs-parin suuruinen BamHl-Kpnl-kappale (sisältää glukagoni(4-29)-geenin) kahdesta plasmidista, joista oli poistunut 12 emäsparia, saadun, 6,6 kiloemäsparin suuruisen Xhol-Kpnl-kappaleen kanssa (katso kuva 5).

Näitä kahta ligaatioseosta käytettiin E. coli- bakteereiden (MT172) transformoimiseen, ja näistä transformanteista eristettyjä plasmideja seulottiin Xbal-kohdan läsnäolon selvittämiseksi (Xbal + EcoRl-pilkkominen). Poistuminen varmistettiin siten, että neljästä plasmidista saadun Xbal-Sall-kappaleen DNA-ketju ****'· määritettiin (A. Maxam ja W. Gilbert (1980) Methods in : : * Enzymology 6j^, 499-560). Yksi plasmidi, pKFN6, valittiin muita toimenpiteitä varten.

. Plasmidista pKFN6 saatu 2,1 kiloemäsparin suuruinen BamHl-Sphl- • · kappale (osittainen), joka sisälsi ketjun TPI^-MFal-johtaja (miinus Glu-Ala-Glu-Ala)-glukagoni(1-29)-MFalT ligatoitiin S. pombe-hiivan TPI-geenin sisältävän plasmidin CPOT BamHl-Sphl-’ " kappaleeseen, joka oli noin 11 kiloemäsparin suuruinen. Tämä V ‘ ligaatioseos transformoitiin E.coli-bakteereihin, käyttäen vali- kointiperusteena ampisilliinin vastustuskykyä. Tuloksena saatiin plasmidi pMT612 (katso kuva 2).

• * 18 87800

Esimerkki 4

Hiivaplasmidien muodostaminen glukagonin(1-21) ilmentämiseksi 0,9 kiloemäsparin suuruinen BamHl-Hind3-kappale, ja 11 kilo-emäsparin suuruinen Xbal-BamHi-kappale, jotka molemmat saatiin plasmidista pKFN6, ligatoitiin glukagonia(16-21) koodaavaan synteettiseen, 19 emäsparin suuruiseen Hind3-Xbal-kappaleeseen {katso edellä). Tätä ligaatioseosta käytettiin E. coli-baktee-reiden (MT172) transformoimiseen, käyttäen vaiikointiperusteena ampisilliinin vastustuskykyä. 12 transformantin olasmidit analysoitiin BamHl + Xbal-pilkkomisella. Tämän jälkeen yhdestä näistä plasmideista saatu 2,1 kiloemäsparin BamHl-Sphl-kappale (osittainen) ligatoitiin S. pombe-hiivan TPI-geenin sisältävästä plasmidista CPOT saatuun, noin 11 kiloemäsparin suuruiseen BamHl-Sphl-kappaleeseen. Tätä 1igaatiosesta käytettiin E. coli-baktee-reiden (MT172) transformoimiseen, käyttäen valikointiperusteena ampisilliinin vastustuskykyä.

Synteettisen glukagoni(1-21)-geenin sisältävää plasmidia pKFN23 kantava pesäke tunnistettiin analysoimalla restriktioentsyymien (BamHl + Xbal sekä Hind3+Pstl) avulla 0,7 kiloemäsparin suuruinen 32 P-merkitty Sai1-Sphl-kappale, ja määrittämällä sen DNA-ketju. Esimerkki 5 . Glukagonin(1-29) ilmentäminen hiivakannassa MT556 S. cerevisiae-kantaa 362 (leu 2) kasvatettiin YPD-alustalla • * " * (Sherman et ai., Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor • * '· ** Laboratory, 1981) optisen tiheyden OD^-qq arvoon 2,1. 100 ml tästä viljelmästä sentrifugoitiin, ja solut otettiin talteen, M.: ne pestiin 10 millilitralla vettä, sentrifugoitiin uudestaan : * ‘ ja suspendoitiin uudestaan 10 millilitraan liuosta, joka sisälsi 1,2 M sorbitolia, 25 mM Na2EDTA, pH 8,0, 6,7 mg/ml ditiotrei-tolia. Tätä suspensiota inkuboitiin 30°C:n lämpötilassa 15 .··*. minuuttia, se sentrifugoitiin ja solut suspendoitiin uudestaan * 10 ml liuosta, joka sisälsi 1,2 M sorbitolia, 10 mM Na EOTA,

0,1 M natriumsitraattia, pH 5,8, 2 mg entsyymiä Novozym w 2 34 . Tätä suspensiota inkuboitiin 30°C:n lämpötilassa 30 minuuttia, solut otettiin talteen sentrifugoimalla, ne pestiin 10 milli-,···. litralla 1,2 M sorbitolia ja 10 millilitralla CAS-liuosta (1,2 M

sorbitoli, 10 mM CaCl2, 10 nM Tris (Tris = Tris(hydroksimetyyli)- 19 37 800 v aminometaani, pH 7,5), ja suspendoitiin uudestaan 2 mi 11i1itraan CAS-liuosta. Transformaation toteuttamiseksi 0,1 ml CAS-liuok-seen suspendoituja soluja sekoitettiin suurin piirtein 1 mikro-grammaan plasmidia pMT544, ja jätettiin huoneen lämpötilaan 15 minuutiksi. Tähän seokseen lisättiin 1 ml liuosta, joka sisälsi 20% polyetyleeniglykolia 4000, 10 mM CaCl^, 10 mM Tris, pH 7,5, ja tätä seosta seisotettiin jälleen 30 minuuttia huoneen lämpötilassa. Tämä seos sentrifugoitiin, ja solukasauma suspendoitiin uudestaan 0,1 millilitraan SOS-liuosta (1,2 M sorbitoli, 33% v/v YPD, 6,7 mM CaC^» 14^ug/ml leusiini), ja sitä inkuboitiin 30°C:n lämpötilassa 2 tuntia. Tämän jälkeen tämä suspensio sentrifugoitiin, ja solukasauma suspendoitiin uudestaan 0,5 millilitraan 1,2 M sorbitolia. Tähän lisättiin 6 ml pinta-agaria (SC-alusta, joka on esitetty julkaisussa Sherman et ai., Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, 1981, ja josta leusiini jätettiin pois, ja joka sisältää 1,2 M sorbitolia ja 2,5% agaria), lämpötila 52°C, ja tätä suspensiota kaadettiin tätä samaa, agarin av\illa kiinteäksi tehtyä, sorbitolia sisältävää alustaa sisältävien maljojen pinnalle. Transformanttipesäk-keet kerättiin 3 vuorokauden kuluttua 30°C:n lämpötilassa, ne eristettiin uudestaan ja niitä käytettiin siirrosteena nestemäisissä viljelmissä. Yksi tällainen transformantti MT556 (=MT362/-pMT544) valittiin tunnusomaisten piirteiden lisäselvittämistä varten.

: Kantaa MT566 kasvatettiin synteettisessä, täydellisessä sc-alus- tässä (Sherman et al·., Methods in Yeast Genetics, Cold Soring Harbor Laboratory, 1981), josta puuttui leusiini. Yhden litran .suuruista viljelmää ravisteltiin 2 litran suuruisissa pulloissa, joihin oli laitettu virtauksen estolevyt, 30°C:n lämpötilassa, kunnes optinen tiheys ODgQ0 °ϋ saavuttanut arvon 7-10. Tämän jälkeen tämä viljelmä sentrifugoitiin, ja supernatantti poistet-tiin sen lisäanalyysiä varten.

• » ·

Glukagonin kaltainen immunoreaktiivisuus (GLI) määritettiin kan-.···, nasta MT556 saadusta supernatantista radioimmunokokeella, käyt- täen antiglukagoniseerumia K-6248 (Heding L.G., (1983) Handbook « · · of Experimental Pharmacology, Glucagon I: P.J. Lefebvre, toi- • · · 20 87800 mittaja Springer Verlag, sivut 189-202). Tämä vasta-aine tunnistaa glukagonimolekyylin keskellä sijaitsevan ketjun.

Immunoaktiivisen glukagonin(1-29) iImentymistaso transformoiduissa hiivasoluissa oli 177 nmol/litra supernatanttia.

GLT-peptidit otettiin talteen MT556-supernatantista. 800 mil- 125 ....

lilitraan supernatanttia lisättiin I-glukagoni-merkitsinta sekä 96-prosenttista etanolia, alkoholipitoisuuden saamiseksi (r) 5 prosentiksi (v/v). Supernatantti väkevöitiin Sep-Pak -kolonnilla (Waters), ja 2/3 tästä tiivisteestä, joka vastasi 533 millilitraa supernatanttia, puhdistettiin antiglukagonin immunoabsorbantilla täytetyllä kolonnilla.

Tästä antiglukagonikolonnista saatu eluaatti jaettiin fraktioihin HPLC-kromatograf isesti ^uBondapak C-18-kolonnilla, 10^,u, 3,9-300 mm (Waters). A- ja B-puskurit olivat 0,1% TFA vedessä sekä 0,07% TFA MeCN-liuottimessa, vastaavasti. Kolonni tasapainotettiin 25-prosenttisella B-puskurilla (virtausnopeus 1,5 ml/min), ja peptidit eluoitiin MeCN-liuottimen lineaarista gra-dienttia (1% minuutissa) käyttäen, ja ne ilmaistiin aallonpituudella 276 nm.

GLI-tuotetta vastaava piikki eluoituu samalla alueella kuin standardina käytetty haiman glukagoni(1-29). Tämä fraktio ) väkevöitiin, liuotettiin uudestaan ja sen aminohappoketju mää- : ritettiin. Eristettyjen peptidiketjujen analyysi toteutettiin kaasufaasianalysaattorilla (Moody, A.J., Thim, L., Valverde, . .·· I. FEBS Lett., Γ72 (1984 ), 142-148).

Tällöin saatiin seuraavat tulokset: « - · 2i 87800 GLI peptidien puhdistaminen MT556-kannasta

Vaihe Tilavuus, GLI (vasta-aine Saanto, ml K-6248), nmol %

Supernatantti 800 142 100

Sep-Pak-tiiviste 2 111 78

Antiglukagonikolonni 0,2 29 20 HPLC 2,0 11 8

Ketjujen analyysistä saatujen tulosten perusteella voitaisiin päätellä, että ilmentyneet tuotteet käsittivät kolme peptidiä:

Glu-Ala-Glu-Ala-glukagoni(1-29) 3 3%

Glu-Ala-qlukagoni(1-29) sekä 33% glukagoni(1-29 ) 33% Näitä kolmea peptidiä oli läsnä edellä esitettyinä suhteellisina määrinä.

Edelleen voitaisiin päätellä, että Arg-Arg-ketju oli vahingoittumaton kaikissa kolmessa peptidissä.

Esimerkki 6

Glukagonin(1-29) ilmentyminen hiivakannassa MT615 S.cerevisiae-kanta MT501 /E2-7B x E11-3C (a/α,Δ tpi/Atpi, pep4-. . 3/pep4-3^7 transformoitiin plasmidilla pMT612 esimerkissä 4 *' ; esitetyllä tavalla, kuitenkin sillä erolla, että 1) ennen trans- ’· "· formoimista kantaa MT501 kasvatettiin YPGaL-alustalla (1% Bacto- hiivauute, 2% Bacto-peptoni, 2% galaktoosi, 1% laktaatti) opti-seen tiheyteen OD6Q0 2) SOS-liuos sisälsi YPD-alustan ‘ asemesta YPGaL-alustaa. Tunnusomaisten piirteiden lisäselvitystä varten valittiin yksi transformantti MT615 (=MT501/pMT612).

; Kantaa MT615 kasvatettiin kuten kannan MT5 56 tapauksessa esite- tään, mutta YPD-alustalla (Sherman et ai., Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, 1981), optiseen tihey-·-; · teen OD600 15.

Glukagoni eristettiin MT6l5-kannan supernatant· is ta. Kaksi oris-.· ·. tämistä toteutettiin. Ensimmäisessä eristyksessä supernatant 1st n saadut peptidit sidottiin Merck Cl8-kolonniin, eluoitiin 60% 22 8 7 80 0 etanolilla, jonka jälkeen ne jaettiin fraktioihin Waters-yhtiön HPLC SP-ioninvaihtimella. Tämä menetelmä oli ainoastaan osittain .12 5 menestyksellinen, sillä merkitsimena käytetty I-glukaqoni saostui kvantitatiivisesti sinä aikana, kun C18-eluaattia käsiteltiin SP-ioninvaihtimella tapahtuvaa erottamista varten. Toisessa eristysmenetelmässä MT615-supernatantin peptidit sidottiin SP-Sephadex-hartsiin, eluoitiin ja jaettiin fraktioihin HPLC-kromatografisesti käänteisfaasia käyttäen. GFjT-peptidien saanto mitattiin RTA-määri, tyksen avulla (Hedinq L.G., (1971) Radiologi.-cal determination of pancreatic and gut glucagon in plasma, Dia-betologia 1_, 10-19) käyttäen antiglukagoniseerumia K6248 ja K5563 (joka tunnistaa glukagonin C-päässä sijaitsevan osan), (Heding L.G., (1983) Handbook of Experimental Pharmacology,

Glucagon I: P.J. Lefebvre, toim. Springer Verlag, sivut 189-202) .

Eristäminen I

12 5 I-sian glukagonia lisättiin 900 millilitraan MT615-superna-tanttia, panos 1, ja 800 ml jaettiin fraktioihin seuraavasti. Näytteen etanolipitoisuus asetettiin 5 prosentiksi, ja se johdettiin Merck-yhtiön Lichroprep C18-kolonnin, 4,8 x 1,5 cm, 25-40^u, läpi suurin piirtein virtausnopeudella 200 ml/tunti.

Sen jälkeen, kun kolonni oli pesty 50 millilitralla 5% etanolia 25 mH ammoniumformaattipuskurissa, pH 3,5, sekä 15-prosenttisel-la etanolilla tässä samassa puskurissa, pidättyneet peptidit : : t eluoitiin 60% etanolilla ammoniumformaattipuskurissa.

Kun raakapeptidit laimennettiin vedellä (sekä ionivahvuuden että . .·. orgaanisen liuottimen pitoisuuden alentamiseksi), syntyi runsaas- . . 125 .. ..

• · ti sakkaa, joka sisälsi suurimman osan I-glukagonista. Tama esti sen, ettei SP-ionivaihdinta voitu käyttää pH-alueella 3-5. Sakka liuotettiin pH-arvossa 9,0, ja saostettiin uudestaan pH:ssa

4,0. Näyte liuotettiin 2,5 mM ammoniumformaattiin, pH 7,5, 20-' prosentt isossa asetoni tv i 11 i ssä , Waters yhtiön |)|·: Λ E I on I ν.ι 1 h 1 I

· ’ · me11 a toteutettavaa fraktioihin jakamLsta varten. Kun näyte joh- 125 dettiin kolonniin, niin I-glukagoni ei sitoutunut. DEAE-kolonnin läpivirtaama väkevöitiin näin ollen vakuumissa, ja peptidit jaettiin fraktioihin HPLC-kromatografisesti käänteisfaa-siä käyttäen, Nucleosil C18-kolonnilla, 5 ^u, 25 x 4,6 mm.

23 87800

Eristäminen 2

Kaksi grammaa SP-Sephadex C25-hartsia (myös muita, ominaisuuksiltaan sopivia ioninvaihtajia voidaan käyttää) lisättiin 200 millilitraan MT615-supernatanttia, panos 2, (pH asetettu arvoon 4,3) ja tätä suspensiota sekoitettiin huoneen lämpötilassa 20 minuuttia. SP-Sephadex suodatettiin lasiseen, halkaisijaltaan 2,5 cm suuruiseen kromatografia-kolonniin, pestiin 50 millilit-ralla 25 mM ammoniumformaattia, pH 3,5, ja sitoutuneet peptidit eluoitiin 500 mM ammoniumformaatilla, pH 8,4. Glukagoni eristettiin tästä eluaatista HPLC-kromatoqrafisesti käänteisfaasiko-lonnia Nucleosil C18, 250 x 4,6 mm käyttäen.

Glukagonin kaltaisen immunoreaktiivisuuden (GLI) jakautuminen fraktioinnin aikana mitattiin RTA-menetelmällä, käyttäen sellaisia vasta-aineita, jotka tunnistavat qlukaqonin(lI - I6) sekä glukagonin C-päässä sijaitsevan osan (K6248 ja K5563, vastaavasti ) .

HPLC-kromatografinen glukagonimäärä fraktioissa arvioitiin HPLC-kromatografisesti. Käytetyssä menetelmässä näyte analysoitiin ensin ilman glukagonilisäystä, jonka jälkeen glukagonipiikki tunnistettiin lisäämällä näytteeseen glukagonia sisäiseksi standardiksi. Näytteen sisältämä HPLC-kromatografinen glukagonimäärä laskettiin tämän jälkeen UV-ilmaisimen tuottamasta glukagoni-piikistä. Pohjaviivana piikin korkeuden määrittämiseksi käytet-'·*’· tiin glukagonipiikin molemmin puolin UV-ilmaisimen tuottamaa vii- \\ · vaa. Oletettiin, että 1 mg (290 nmol) glukagonia milli litrassa : sisältävän liuoksen absorbtio aallonpituudella 276 nm on 2,0 cm-*.

• · « • · ·

Tulokset • « · ' ~ HPLC-kromatografisen glukagonin ja GLI-peptidien pitoisuudet . . MT615-panoksissa 1 ja 2 on esitetty taulukossa 1.

• · «* • · ·

Pelkän käsittelemättömän MT615-supernatantin (panos 1) (ylempi käyrä), sekä supernatantin, johon on lisätty 3^ug glukagonia (alempi käyrä) , analyyttiset HPLC-kromatogrammit on esitetty kuvassa 6. Käytetty kolonni oli Macherey-Nagel-yhtiön Nucleosil 24 87800 C18, 5^u, 250 x 4,6 mm, joka oli tasapainoitettu 100 mM ammonium-formaatilla, pH 3,5, 25-prosenttisessa asetonitriilissä, virtausnopeudella 1,0 ml/min. Näyte eluoitui kahden minuutin kuluttua asetonitriilin gradientilla ammoniumformaatissa (25 prosentista 30 prosenttiin 3 minuutin aikana, sitten 30 prosentista 40 prosenttiin 35 minuutin aikana). Kolonnista poistuvan ainevirran UV-absorbanssia seurattiin aallonpituudella 280 nm, koko asteikon ollessa 0,08 A-yksikköä. HPLC-kromatografinen glukagoni esitetään ylemmässä kuvassa. Nähdään, että peptidipiikki (R^ 20,38) kasvo!, kun glukagonia lisältiin, ja liiman materiaalin oletettiin olevan HPLC-kromatografista glukagonia.

Väkevöidyn DEAE-läpivirtaaman preparatiivinen fraktiointi on esitetty kuvassa 7. HPLC-erottaminen toteutettiin kuvan 6 yhteydessä esitetysti, paitsi että UV-absorbanssi mitattiin aallonpituudella 280 nm, koko asteikko 1,28 A-yksikköä. Ylempi kuva esittää väkevöidyn DEAE-läpivirtaaman preparatiivista HPLC-erot-tamista ja alempi kuva esittää GLI-peptidin jakautumista fraktioissa. Kolonnista saatava ainevirta väkevöitiin vakuumissa, pakastekuivattiin ja liuotettiin 0,1-prosenttiseen etikkahappoon 60-prosenttisessa etanolissa GLI-koetta varten. R^-arvolla 20,51 eluoituvan "glukagonin" ketju on täysin selvitetty, ja tämän piikin on osoitettu olevan glukagonia.

·:**: Fraktioihin jakamisen aikana MT615-panoksesta 1 talteensaatu 12 5 : I-glukagoni, HPLC-glukagoni ja GLI on esitetty taulukossa 2, .·. : ja panoksesta 2 talteensaatu HPLC-glukagoni on esitetty taulu- kossa 3.

Päätellään, että hiivamuodoste MT615 tuottaa glukagonia määränä, ' · joka on alueella 250-1000 nmol/1 (HPLC-analyysin perusteella).

Λ ·

Taulukko 1 : Kahden MT615-panoksen "glukagonimäärät11

Panos HPLC-glukagoni GLI (nmol/l) ' _ ( nmo L / 1.) Kb7.4 8 K5S6 3 MT615, panos 1 250 1516 557 C;*: MT615, panos 2 960 3708 2145 * * · 25 8 7 8 0 0

Taulukko 2 "Glukagonin" saanto MT615-panoksesta 1 Näyte I-glukagoni HPLC-glukagoni GLI (nmol) _ %_ (nmol)_ K6248 K5563

Alussa (800 ml) 100 197 1212 446

Lichroprep, 60 % etanoli (30 ml) 81 91(46%) 690 600 DEAE-alku (24 ml) 72 48(24%) 421 448 DEAE BT (35 ml) 47 67(34%) 287 404

Prep HPLC, alku (2 ml) ' 35 31(16%) 200 200 "Glukagoni" (0,5 ml) ei mää- 44(22%) 31(3%) 43(10%) ritetty laimentamisen vaikutus näkyy useimmissa näytteissä, ja esitetyt arvot ovat kahden tai kolmen laimennoksen keskiarvoja.

Taulukko 3 "Glukaqonin" saanto MT615-panoksesta 2 Näyte HPLC-qlukagoni (nmol)

Alku (200 ml) 192 SP-suodos (215 ml) 40 (21%)a SP-eluaatti (18 ml) 117 (61%) HPLC-C18 (1 ml) 118 (61%) * Λ « 1 1 ” 1 a) "Glukagonin" piikki oli hyvin pieni ja vaikeasti kvantioi- ** 1" tavissa.

·.:/1 Esimerkki 7

Glukagonin(1-21) ilmentyminen hiivakannassa KFN31 S. cerevisiae-kanta MT663 (2/a, Atpi/Atip, pep4-3/pep4-3) trans-formoitiin plasmidilla pKFN23 esimerkissä 6 esitetyllä tavalla. Yksi transformantti KFN31 (=MT663/pKFN23) valittiin tunnusomais-^ ten piirteiden lisäselvitystä varten. Kantaa KFN31 kasvatet- * ’ tiin, kuten kannan MT613 tapauksessa esitetään (katso esimerkki • · 6) optisen tiheyden OD^qq arvoon 15.

· · • 1 1 26 3 7 8 0 0

Ilmentymisen taso

Glukagonin(1-21) määrä hiivan supernatantissa määritettiin HPLC-analyyttisesti seuraavalla tavalla:

Liuotin A: 0,1% (v/v) trifluorietikkahappo (TFA) vedessä Liuotin B: 0,07% (v/v) TFA asetonitriilissä (MeCN)

Kolonni: RP-C18 Nova-Pak ® , 5^u, 4,6 x 150 mm (Waters)

Virtausnopeus: 1,5 ml/min.

Ilmaisin: UV-absorbtion aallonpituudella 280 nm

Eluutio: 0-2 min: isokraattinen eluutio, 10% B/90% A

2-22 min: eluutio gradienttia käyttäen, seoksesta 10% B/90% A seokseen 30% B/70% A, mikä vastaa nopeutta 1% MeCN/min.

Standardi: Synteettinen glukagoni(1-21) (NOVO Industri A/S).

Edellä esitetyssä HPLC-järjestelmässä eluoituneen glukagonin (1-21) retentioaika oli 17,36 minuuttia. Kun hiivakannan KFN31 supernatanttia injektoitiin eri suuruisia määriä, niin glukago-nin(l-21) ilmentymisen tasoksi voitiin todeta 0,88^umol/l /HPLC-glukagoni (

Glukagonin(1-21) puhdistaminen

Lichroprep® RP-18-kolonni (Merck, numero 9303; 1x9 cm) pestiin 30 millilitralla 50 mM NH4HC03-liuosta, joka sisälsi 60% (v/v) etanolia. Tämän jälkeen tämä kolonni tasapainoitettiin *:*·: 50 millilitralla NH^HCO^-liuosta, joka sisälsi 5% (v/v) etanolia.

• ·/: 450 millilitraan supernatanttia lisättiin 23,5 ml 96% etanolia, .·.1 ja tätä seosta pumpattiin kolonnin läpi yön yli (virtausnopeu- della 25 ml/h ) .

Kolonni pestiin 15 millilitralla 0,1 M NaCl-liuosta, ja sitten • · 15 millilitralla vettä, ja peptidimateriaali eluoitiin 50 mM

NH^HCO^-liuosta, joka sisälsi 60% (v/v) etanolia. 3 millilitran fraktioita kerättiin. Peptidimateriaali eluoitui fraktioissa : n:o 6 ja 7, ja nämä fraktiot yhdistettiin ja haihdutettiin 1 millilitraksi vakuumisentrifugoinnilla (Savant vakuumisentri-fugi) etanolin poistamiseksi. Tähän tiivisteeseen lisättiin 1 ml 25 mM HEPES-puskuria, pH 7,4, jonka jälkeen tiiviste joh-:.V dettiin anti-glukagoni-Sepharose-kolonnin (1,5 x 2,5 cm) läpi, : joka kolonni oli ennen käyttöä tasapainoitettu 10 millilitralla 27 87800 25 mM HEPES-puskuria, pH 7,4. Tiivisteen käsittelemisen jälkeen kolonnin annettiin seistä huoneen lämpötilassa 30 minuuttia, jonka jälkeen se pestiin 10 millilitralla 25 mM HEPES-puskuria, pH 7,4. Peptidimateriaali eluoitiin 20% (v/v) etik-kahapolla, ja eluaatin pH asetettiin arvoon 7,0 NH^OH-liuoksella.

Edellisessä vaiheessa saatu eluaatti tiivistettiin 500 mikrolit-raksi vakuumissa pyöröhaihduttimella, ja glukagoni(1-21) puhdistettiin edelleen HPLC-kromatografisesti käänteisfaasia käyttäen, edellä kuvatulla kromatografiajärjestelmällä. Näyte jaettiin viiteen osaan, kukin tilavuudeltaan 100^,ul. Retentioaikaa 17,36 min. vastaavana piikkinä eluoituva peptidimateriaali otettiin talteen. Peptidimateriaali kuivattiin vakuumisentrifugissa, ja se liuotettiin uudestaan 100 mikrolitraan 0,1% (v/v) etikkahap-poa. Glukagonin(1-21) kokonaissaanto oli 85%.

Tunnusomaiset piirteet

Puhdistetun glukagonin(1-21) tunnusomaiset piirteet selvitettiin aminohappoanalyysin avulla (Thim, L. ja Moody, A.J., Bio-chim. Biophys.Acta 703 (1982) 134-141) sekä aminohappoketjun analyysin avulla (Moody, A.J., Thim, L. ja Valverde, I. FEBS Lett., 172 (1984) 142-148). Tulokset on esitetty taulukoissa 4 ja 5, vastaavasti.

Taulukko 4 • ;*: Hiivakannasta KFN31 puhdistetun glukagonin(1-21) aminohappo- analyysi___________

Aminohappo Todettu Teoreettinen Aminohappo Todettu Teoreettinen . : : Asx* 2,82 3 Leu* 1,06 1

Thr 1,75 2 Tyr 1,74 2

Ser** 3,29 4 Lys* 1,10 1 .·. : Glx* 1,98 2 His* 0,95 1

Gly 1,83 2 Arg* 1,87 2

Ala* 1,11 1 * Normalisointiin käytetty aminohappo '·*·" ** Hydrolyysin aikana esiintyvää häviötä ei pyritty korjaamaan, mikä se- *.’: : littää Seriinin alhaisen arvon.

28 878Q0

Taulukko 5

Hiivakannasta KFN31 puhdistetun glukagonin(1-21) aminohappo-ketjun analyysi_

Jakson n:o PTH-aminohappo Saanto (pmol) 1 His 879 2 Ser 427 3 Gin 2321 4 Gly 1343 5 Thr 664 6 Phe 1740 7 Thr 396 8 Ser 176 9 Asp 619 10 Tyr 998 11 Ser 143 12 Lys 570 13 Tyr 751 14 Leu 708 15 Asp 274 16 Ser 70 17 Arg 186 18 Arg 279 19 Ala 423 • 20 Gin 365 • 1 1 1 , . 21 Asp 41 ! » 1> Ä 3 · 1 l - Gln^- ja Gln2Q-aminohapon perusteella laskettu keskimääräinen toistuva saanto oli 90^.

» » · « · ψ 1 1· • ·» » » » m #·» • » * ·» « « · • » ·

Claims (2)

29 8 7 800

1. Förfarande för framställning av glukagon i jäst, känne-tecknat av att en transformerad jäststam innehällande en reproducerbar expressionsvehikel innefattande en gen, som kodar för expression av glukagon, odlas i ett lämpligt nä-ringsmedium följt av utvinning av den uttryckta produkten.

1. Menetelmä glukagonin tuottamiseksi hiivassa, tunnettu siitä, että transformoitua hiivakantaa, joka sisältää gluka-gonia koodaavan geenin käsittävän replikoituvan ilmentymis-vektorin, viljellään sopivalla ravintoalustalla, minkä jälkeen glukagoni otetaan talteen ravintoalustalta.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että glukagonia koodaava geeni on synteettinen geeni.

2. Förfarande enligt patentkravet 1, kännetecknat av att den gen, som kodar för expression av glukagon, är en syn-tetisk gen.