FI89183C - Dna-sekvens som kodar foer insulinprekursorer, vektorer innehaollande denna sekvens, insulinprekursorer och foerfarande foer framstaellning av dessa samt foerfarande foer framstaellning av humaninsulin - Google Patents

Description

1 89183

Insuliinin prekursoreja koodaava DNA-sekvenssi, tällaisen sekvenssin sisältävät vektorit, insuliinin prekursorit ja menetelmä niiden valmistamiseksi sekä menetelmä ihmisen insuliinin valmistamiseksi Tämä keksintö koskee biosynteettisiä insuliinin prekursoreja koodaavia DNA-sekvenssejä, tällaisia sekvenssejä sisältäviä vektoreita, menetelmää tällaisten insuliinin prekursorien valmistamiseksi ja menetelmää ihmisen insuliinin valmistamiseksi sekä ihmisen insuliinin prekursoreja.

Ennestään insuliinia on syntetisoitu (synteettisestä A- ja B-ketjusta) tai uudelleensyntetisoitu (luonnosta johdetusta A- ja B-ketjusta) yhdistämällä kyseiset kaksi ketjua hapettamalla niin, että pelkistyneiden ketjujen 6 kysteiinin sulfhydryyliryhmää (4 A-ketjussa, 2 B-ketjussa) muuttuvat disulfidisidoksiksi. Tässä menetelmässä disulfidisidokset muodostuvat suurelta osin satunnaisesti, mikä merkitsee sitä, että saadaan erittäin pienellä saannolla sellaista insuliinia, jossa disulfidisillat sijaitsevat oikein kysteiini-tähteiden A-6 ja A-11, A-7 ja B-7 ja A-20 ja B-19 välillä vastaavasti.

Sen jälkeen, kun oli keksitty, että proinsuliini on insuliinin biologinen prekursori, havaittiin, että suoraketjuisen, täysin pelkistyneen proinsuliinin A- ja B-polypeptidiosat : (ne, jotka vastaavat insuliinin A- ja B-ketjua) voitiin yh- distää hapetuksen kautta paljon vähemmän satunnaisia disul-fidisidoksia synnyttäen niin, että saatiin oikealla tavalla ”·'· ryhmittynyttä proinsuliinia oleellisesti ottaen suuremmalla saannolla kuin saatiin vapaiden A- ja B-ketjujen yhdistämi sellä [D.F. Steiner et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. £0. (1968), ;* 622] . Vaikkakin suuria saantoja saatiin vain niin pienillä proinsuliiniväkevyyksillä, ettei menetelmä ollut toteutta-miskelpoinen preparatiivisessa mittakaavassa, tuli proinsu- 2 89183 liinin B-C-A-polypeptidisekvenssin C-osan (so. liitospepti-di) eli osan, joka tuo 6 kysteiinitähdettä proinsuliiniksi hapettumisen kannalta oikeisiin avaruusasemiin, selvästi osoitetuksi.

Saatu proinsuliini voi toimia insuliinin prekursorina in vitro, sillä liitospeptidi on poistettavissa entsymaattisin keinoin [W. Kemmler et ai., J. Biol. Chem. 246, (1971), 6786].

Sittemmin on osoitettu, että proinsuliinin kaltaiset yhdisteet, joissa on C-peptidiä lyhemmät liitososat, joiden kummassakin päässä on spesifinen entsymaattinen tai kemiallinen katkaisukohta [ns. miniproinsuliinit (A. Wollmer et ai., Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. 355 (1974), 1471-1476 ja Dietrich Brandenburg et ai., Hoppe-Seyler's Z. Physiol.

Chem. 354 (1973), 1521-1524)] voivat myös toimia insuliinin prekursoreina.

Yrityksissä saada aikaan biosynteettisiä insuliineja, jotka ovat erityisesti identtisiä ihmisinsuliinin kanssa, on noudatettu Selmoja strategisia keinoja kuin synteettisten insuliinien valmistuksessa. Insuliinin A- ja B-ketjut on ilmennetty erillisissä isäntäorganismeissa, eristetty niistä ja liitetty sen jälkeen yhteen edellä kuvatulla tavalla [R.E. Chance et ai.: Diabetes Care 1 (1982), 147]. Mikro-organismit on transformoitu preproinsuliinia tai proinsuliinia koo-dittavilla kloonausvektoreilla, joiden tuotteet voivat erittyä sellaisinaan (W. Gilbert et ai.: EP-patenttijulkaisu n:o 6694) tai kertyä solun sisään yhdistelmägeenituotteiksi (D.V. Goeddel et ai.: EP-patenttijulkaisu n:o 55 945). Mini-proinsuliinikeinoa on myös kokeiltu (D.V. Goeddel, supra).

A- ja B-ketjujen valmistaminen erillisillä fermentointi-menetelmillä ja ketjujen yhdistäminen sen jälkeen on sinänsä epäkäytännöllistä. Kaksoisfermentoinnin epämukavuus voidaan välttää valitsemalla proinsuliini- tai miniproinsuliinistra- 3 89183 tegia. Kuitenkin proinsuliinin käytöstä biosynteettisen insuliinin prekursorina voi seurata tiettyjä haittoja. Proin-suliinilla, joka erittyy fermentointiliemeen sellaisenaan tai kertyy isäntäorganismiin solunsisäisesti, mahdollisesti yhdistelmägeenituotteenä, on taipumus sisältää oleellisesti satunnaisia disulfidisidoksia. Tällaisen "sotkuisen" tuotteen järjestäminen oikein ryhmitellyksi proinsuliiniksi voidaan suorittaa joko suoraan (H.-G. Gattner et ai.: DK-pa-tenttihakemus n:o 4523/83) tai käyttämällä yksiketjuista heksa-S-sulfonaattia (F.B. Hill: EP-patenttijulkaisu n-.o 37 255). Uudelleenryhmittely johtaa tavallisesti jonkinasteiseen polymeroitumiseen ja tästä seuraa tarve käyttää työläitä puhdistusvaiheita talteenotossa.

Lisäksi proinsuliinityyppisillä insuliinin prekursoreilla on taipumus hajota entsymaattisesti joko isäntäsolujen sisällä tai fermentointiliemeen erittymisen jälkeen. Hiivoissa on osoitettu, että ihmisen proinsuliini on erityisen herkkä entsymaattiselle katkeamiselle kahdessa kaksiemäksisessä sekvenssikohdassa (Arg31-Arg32 ja Lys64-Arg65). Ilmeisesti nämä katkeamiset tapahtuvat ennen S-S-siltojen syntymistä ja muodostuu C-peptidi, A-ketju ja B-ketju.

Esillä olevan keksinnön tarkoituksena on välttää nämä haitat tarjoamalla biosynteettisiä insuliinin prekursoreja, joissa on syntyessään suurelta osin oikein sijaitsevat disulfidi-sillat A- ja B-osien välillä ja jotka ovat lisäksi oleellisesti vastustuskykyisempiä proteolyyttiselle hajoamiselle kuin tähän mennessä tunnetut biosynteettiset insuliiinin prekursorit.

Ennestään tunnetaan yksiketjuinen insuliinin prekursori, joka sisältää insuliinin lyhennetyn B-ketjun aminohaposta PheB1 aminohappoon LysB29, joka jatkuu täydellisenä A-ketjuna aminohaposta Gly^ aminohappoon Asn7121, B(1-29)-A(l-21) (Jan Markussen, "Proteolytic degradation of proinsulin and of the intermediate forms", Proceedings of the Symposium on Proin- 4 89183 sulin, Insulin and C-peptide, Tokushima, 12.-14. heinäkuuta, 1978, Toim.: S. Baba et al.). Tämä insuliinin prekursori B(1-29)-A{1-21) valmistetaan puolisynteettisesti sian insuliinista. Ensin valmistettiin insuliinin B(l-29)- ja A(l-2l)-ketju ja liitettiin ne yhteen niin, että saatiin lineaarinen peptidi B(1-29)-A(l-21). Tämä heksatiolimuodossa oleva yhdiste hapetettiin in vitro niin, että saatiin yksi-ketjuinen des-(B30)-insuliinimolekyyli.

Esillä oleva keksintö perustuu siihen yllättävään havaintoon, että edellä mainittu yksiketjuinen insuliinin prekursori B(1-29)-A(l-21) ja sen johdannaiset, joissa siltaketju yhdistää B(1-29)-ketjun karboksyy1ipään A{1-21)-ketjun aminopäähän, ilmentyvät suurilla saannoilla ja oikein sijaitsevin disulfidisilloin, kun viljellään tällaisia insuliinin prekursoreja koodittavilla DNA-sekvensseillä transformoituneita hiivakantoja.

Ensinnäkin tämä keksintö tarjoaa DNA-sekvenssin käytettäväksi hiivavektorissa, joka sekvenssi muodostuu sellaista insuliinin prekursoria koodaavasta nukleotidiyhdistelmästä, jolla on kaava

B(l-29)- (Xn-Y)m-A(l-21) I

jossa kaavassa Xj, on peptidiketju, jossa on n luonnonmukaisesti esiintyvää aminohappotähdettä, Y on Lys tai Arg, n on kokonaisluku 0-33, m on 0 tai 1, B(l-29) on ihmisen insuliinin lyhennetty B-ketju ulottuen aminohaposta PheB1 aminohappoon LysB29 ja A(l-21) on ihmisen insuliinin A-ketju edellyttäen, että peptidiketju -Xn-Y- ei sisällä kahta vierekkäistä emäksistä aminohappotähdettä.

Edullisia edellä mainitun kaavan I mukaisia insuliinin prekursoreja ovat B(1-29)-A(l-2i), so. m - 0 kaavassa I, ja yhdisteet, joissa on suhteellisen lyhyt siltaketju B(l-29)-ja A(l-21)-ketjun välillä.

li 5 89183

Kun m = 1, on n mielellään 1-33, mieluummin 1-15, vielä mieluummin 1-8 tai 1-5 ja mieluimmin 1-3 tai 1-2. X voidaan mielellään valita joukosta Ala, Ser ja Thr ja yksittäiset X:t voivat olla samoja tai erilaisia. Tällaisia edullisia yhdisteitä ovat esimerkiksi B(l-29)-Ser-Lys-A(l-21) ja B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21).

Toiseksi keksintö tarjoaa hiivassa replikoituvan vektorin, joka kykenee ilmentämään kaavan I mukaista insuliinin pre-kursoria koodittavan DNA-sekvenssin.

Vektori on plasmidi, joka kykenee replikoitumaan hiivassa.

Kolmanneksi esillä oleva keksintö tarjoaa menetelmän kaavan I mukaisten insuliinin prekursorien tuottamiseksi hiivassa siten, että transformoitunutta hiivakantaa, joka sisältää insuliinin prekursoreja ilmentämään kykenevän plasmidin, viljellään sopivassa ravintovällaineessa ja sen jälkeen eristetään insuliinin prekursorit.

Neljänneksi keksintö tarjoaa uusia ihmisen insuliinin prekursoreja, joilla on kaava B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(l-2l) tai B (1-29)-Ser-Lys-A(1-21) .

joissa kaavoissa symbolit ovat edellä määriteltyjä.

Keksinnössä käytetään hiivakantaa, joka on transformoitunut vektorilla, joka kykenee ilmentämään hiivassa insuliinin prekursoreja koodittavan DNA-sekvenssin.

Insuliinin prekursorit voivat ilmentyä siten, että niissä on lisäproteiini insuliinin prekursorin edessä. Lisäproteiini voi suojata insuliinin prekursoria esim. endogeenisten entsyymien hajottavalta vaikutukselta in vivo tai se voi sisältää informaatiota, joka on tarpeen halutun proteiinin siir- 6 89183 tämisessä periplasmiseen tilaan ja lopulta solun seinän läpi kasvualustaan.

Lisäproteiinissa on selektiivinen katkaisukohta insuliinin prekursorin B(1-29)-ketjun N-pään vieressä, joka tekee mahdolliseksi lisäproteiinin lohkaisemisen mikro-organismin itsensä toimesta tai myöhemmässä vaiheessa entsymaattisesti tai kemiallisesti.

Kun insuliinin prekursori ilmentyy hiivassa, lisäaminohap-posekvenssi voi sisältää kaksi emäksistä aminohappoa (esim. Lys-Lys, Arg-Arg, Lys-Arg tai Arg-Lys) insuliinin prekursorin B(1-29)-ketjun N-pään vieressä, koska hiiva kykenee katkaisemaan peptidisidoksen, joka on emäksisten aminohappojen ja prekursorin välissä. Myös halutun proteiinin vieressä oleva Glu-Ala- tai Asp-Ala-katkaisukohta mahdollistaa lisä-aminohapposekvenssin erottamisen hiivan itsensä toimesta hiivan tuottaman dipeptidaasientsyymin avulla.

Insuliinin prekursorit voivat erittyä prekursorien B(l-29)-ketjuun liittyneen aminohapposekvenssin avulla edellyttäen, että tämä aminohapposekvenssi sisältää selektiivisen kat-kaisukohdan B(1-29)-ketjun vieressä ylimääräisen aminohapposekvenssin myöhempää lohkaisua varten. Jos insuliinin prekursorit eivät sisällä metioniinia, toimii katkaisu halutun proteiinin viereisessä metioniinissa syanogeenibromidilla. Samoin halutun proteiinin vieressä olevat arginiini- ja ly-siinikatkaisukohdat mahdollistavat katkaisun trypsiinin kaltaisilla proteaaseilla.

Erittymistarkoituksia varten voidaan insuliinin prekursore-ja koodittavaan DNA-sekvenssiin liittää signaalipeptidiä koodittava lisäsekvenssi. Transformoitunut mikro-organismi katkaisee signaalipeptidin irti ilmentyneen proteiinituotteen erittyessä solusta, josta syystä halutun tuotteen erottaminen on helpompaa. Erittynyt tuote voi olla insuliinin

Il 1 89183 prekursori tai se voi sisältää N-päässä lisäaminohapposek-venssin, joka poistetaan myöhemmin, kuten edellä on selostettu.

Erittyminen voidaan saada aikaan sisällyttämällä vektoriin hiivan MFal-johtosekvenssi [Kurjan, J. ja Herskowitz, I.,

Cell 3£, (1982), 933-943].

Halutun DNA-sekvenssin ilmentyminen on promoottorisekvens-sin ohjauksessa, joka sijaitsee oikeassa paikassa haluttua proteiinia koodittavan sekvenssin suhteen niin, että haluttu proteiini ilmentyy isäntäorganismissa. Mielellään käytetään promoottorina isäntäorganismille synnynnäisen geenin promoottoria. Halutun proteiinin DNA-sekvenssin perässä on transkription lopetussekvenssi, joka on mielellään isäntä-organismin synnynnäisen geenin transkription lopetussekvenssi. Edullisia promoottori- ja lopetussekvenssejä ovat tri-oosifosfataasi-isomeraasigeenin (TPI) promoottori ja lopettaja vastaavasti.

Voidaan käyttää muitakin promoottoreja, kuten fosfoglyse-raattikinaasin (PGK1) ja MFal:n promoottoria.

Edelleen keksintö koskee menetelmää ihmisen insuliinin valmistamiseksi siten, että hiivakantaa, joka on transformoitu replikoituvalla vektorilla, joka sisältää edellä olevan kaavan I mukaisia insuliinin prekursoreja koodittavan DNA-sekvenssin, viljellään sopivassa ravintovällaineessa, insuliinin prekursorit otetaan talteen kasvuvällaineesta ja muunnetaan ihmisen insuliiniksi in vitro.

Tämän keksinnön mukaiset insuliinin prekursorit voidaan muuntaa kypsäksi ihmisen insuliiniksi suorittamalla transpeptidaatio 8 89183 L-treoniiniesterillä trypsiinin tai trypsiinijohdannaisen läsnäollessa, kuten DK-patenttihakemuksessa 574/80 (julkaisu sisällytetään tähän patenttihakemukseen viitteeksi) on selostettu, jonka jälkeen ihmisen insuliinin treoniiniesteri muunnetaan ihmisen insuliiniksi ennestään tunnetuilla menetelmillä.

Jos insuliinin prekursorit erittyvät sellaisessa muodossa, että niissä on lisäaminohappoketju B(1-29)-ketjun N-päässä, pitäisi tällainen aminohapposekvenssi joko poistaa in vitro ennen transpeptidaatiota tai sen pitäisi sisältää vähintään yksi emäksinen aminohappo B(1-29)-ketjun N-pään vieressä, koska

Bl trypsiini katkaisee emäksisen aminohapon ja Phe -aminoryhmän välisen sidoksen transpeptidaation aikana.

Liitteenä olevat piirrokset esittävät keksinnön edullista toteutustapaa.

Kuva 1 esittää plasmidin pMT344 valmistusta, kuva 2 esittää plasmidin pMT475 valmistusta, kuva 3 esittää plasmidin pMT212 valmistusta, kuva 4 esittää plasmidin pMT479 valmistusta, kuva 5 esittää plasmidin pMT319 valmistusta, kuva 6 esittää plasmidin pMT598 valmistusta, kuva 7 esittää plasmidin pMT610 valmistusta, kuva 8 esittää plasmidin pT5 valmistusta ja kuva 9 esittää plasmidin pMT639 valmistusta.

Kuvissa ja osassa seuraavaa selostusta käytetään merkintää B' tarkoittamaan samaa kuin B(l-29) ja merkintää A tarkoittamaan samaa kuin A(1-21). Näin ollen merkintä B'A tarkoittaa samaa kuin B(1-29)-A(l-21).

1. Ihmisen proinsuliinia B-C-A koodittavan geenin valmistus Ihmisen haimasta puhdistettu kokonais-RNA ^Chirgwin, J.M., Przybyla, A.E., McDonald, R.J. & Rutter, W.J., Biochemistry 18, (1979) 5294-5299/ käänteiskopioitiin /Boel, E., Vuust, J., 9 89183

Norris, F., Norris, K., Wind, A., Rehfeld, J.F. & Marcker, K.A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, (1983), 2866-2869/ AMV-käänteis-kopioijaentsyymillä käyttämällä 1. säikeen aluketta d(GCTTTATTCCATCTCTC). Ihmisen proinsuliinin cDNA puhdistettiin preparatiivisella urea-polyakryyliamidigeelillä ja toinen säie syntetisoitiin tällä templaatilla käyttämällä DNA-polymeraasin suurta osaa ja 2. säikeen aluketta d(CAGATCACTGTCC). cDNA pilkottiin Sl-nukleaasilla, puhdistettiin polyakryyliamidigeelielektro-foreesilla, hännitettiin terminaalisella transferaasilla ja kloonattiin pBR327:n /^Sorberon et ai,, Gene (1980), 287-3057 Pstl-kohtaan E.colissa. Oikea klooni, jossa oli ihmisen proinsu-liinia B-C-A koodittava geeni, tunnistettiin yhdistelmäplasmi-deista suorittamalla restriktioendonukleaasianalyvsi ja varmistettiin nukleotidien sekventoinnilla /Maxam, A., & Gilbert, W. , Methods in Enzymology, 6Ji (1980), 499-560. Sanger, F., Nicklen,S. & Coulson, A.R., Proc.Natl.Acad.Sei. USA 74, (1977), 5463-54677· 2. Ihmisen insuliinin prekursoreja koodittavien geenien val- mistaminen_

Ihmisen insuliinin rakennetta B(1-29)-A(1-21) koodittava geeni valmistettiin suorittamalla ihmisen proinsuliinisekvenssille paikkaspesifinen mutatointi poistamalla 75 emäsparia C-peptidiä koodittavasta alueesta liitettynä yksisäikeiseen M-13-bakterio-faagivektoriin. Käytettiin muunnettua menetelmää /K. Norris et ai., Nucl.Acids.Res. n (1983) 5103-51127, jossa kemiallisesti syntetisoitu 19-meerinen deleetioaluke pariutettiin M13-templaattiin. Lyhyen entsymaattisen jatkamisreaktion jälkeen lisättiin "universaalinen” 15-meerinen Ml3-dideoksisekventointi-aluke ja sen jälkeen suoritettiin entsymaattinen jatkaminen ja yhteenliittäminen. Osittain kaksisäikeisestä rengasmaisesta DNA:sta leikattiin irti kaksisäikeinen restriktiojakso (BamHI-Hindlll) ja leikattu jakso liitettiin plasmidiin pBR322, joka oli sitä ennen katkaistu restriktioentsyymeillä BamHI ja Hindin.

Näin saadulla yhteenliittämisseoksella transformoitiin E.coli ja tunnistettiin transformantit, joissa oli ihmisen insuliinin 10 891 83 osaa B(l-29)-A(l-21) koodittavan geenin sisältävä plasmidi pMT319.

Geenit, jotka koodittavat yhdistettä B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A(l-21) ja yhdistettä B(1-29)-Ser-Lys-A(1-21), valmistettiin vastaavasti sijoittamalla MFal-B-C-A:ta koodittava jakso M-13-bakteriofaagiin ja suorittamalla paikkaspesifinen mutatointi ihmisen proinsuliinisekvenssille käyttämällä kemiallisesti syntetisoitua 30-meeristä ja 27-meeristä deleetioaluketta vastaavasti ja edellä mainittua "universaalista" 15-meeristä M13-dideoksisekventointialuketta. Osaksi kaksisäikeisestä rengasmaisesta DNA:sta leikattiin irti kaksisäikeinen restriktiojakso (Xbal-EcoRl) ja liitettiin plasmidiin pUC13 ja pT5 vastaavasti. Transformoimalla ja uudelleentransformoimalla E.coli saatiin transformantit, joissa oli plasmidi pMT598 sisältäen B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21):tä koodittavan geenin tai plasmidi pMT630 sisältäen B(1-29)-Ser-Lys-A(1-21):tä koodittavan geenin vastaavasti .

yhdistettä B(1-29)-Thr-Arg-Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-Lys-A(l-21) koodittava geeni valmistettiin edellä kuvatulla tavalla sijoittamalla MFal-B(1-29)-A(l-21):tä koodittava geeni M13 mpll-bakteriofaagiin ja suorittamalla B(1-29)-A(l-21):n paikka-spesifinen mutatointi käyttämällä kemiallisesti syntetisoitua 46-meeristä deleetioaluketta (5'-CACACCCAAGACTAAAGAAGCTGAAGACTTGCAAAGAGGCATTGTG-3') ja "universaalista" aluketta. Samalla tavalla rakennettiin myös yhdistettä B(1-29)-Thr-Arg-Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-Val-Gly-Gln-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-Gln-Lys-A(1-21) koodittava geeni.

3. Plasmidien rakentaminen

Ihmisen insuliinin jaksoa B(l-29)-A(l-21) (B'A) koodittava geeni eristettiin restriktiojaksona plasmidista pMT319 ja yhdistettiin TPI-promoottoria (TPIp) koodittaviin jaksoihin /T. Alber ja G. Kawasaki. Nucleotide Sequence of the Triose Phosphate Isomerase Gene of Saccharomyces cerevisiae. J.Mol.Applied Genet. 1 (1982) li 11 89183 419-4347/ MFal-johtosekvenssiin /J. Kurjan ja I. Herskowitz,. Structure of a Yeast Pheromone Gene (MFa): A Putative a-Factor Precursor Contains four Tandem Copies of Mature α-Factor. Cell 30 (1982) 933-9437 ja S. cerevisiaen TPI:n transkription lopetus-sekvenssiin (ΤΡΙ^,) . Nämä jaksot antavat sekvenssejä, jotka takaavat B'A:ta koodittavan geenin suuren transkriptiotehon ja antavat myös presekvenssin, joka pystyy saamaan aikaan B'A:n hakeutumisen orittymismekanismiin ja viimein erittymisen kasvualustaan. Tämä B'A:n ilmentymisyksikkö (TPIp-MFal-johtosekvenssi-B'A—ΤΡΙ,ρ) sijoitettiin sen jälkeen plasmidivektoriin, joka sisälsi hiivan 2^u-replikoitumisen alkukohdan ja valintamerkin LEU2, ja saatiin plasmidi pMT344, joka on hiivassa toimiva B'A:n ilmen-tämisvektori.

Kun α-tekijä kypsyy hiivassa in vivo, MFal-johtopeptidin viimeiset (C-pään) kuusi aminohappoa (Lys-Arg-Glu-Ala-Glu-Ala) poistuvat α-tekijän prekursorista, kun Lys-Arg-sekvenssin tunnistava endopeptidaasi ja Glu-Ala-tähteet poistava aminodipeptidaasi toimivat peräkkäin 7Julius» D· et ai. Cell 32^ (1983) 839-85^7·

Jotta ei tarvittaisi hiivan aminodipeptidaasia, MFal-johtosek-venssin C-pään Glu-Ala-Glu-Ala-ketjua koodittava sekvenssi poistettiin in vitro mutatoinnilla. Näin saatu hiivan ilmentämis-plasmidi pMT475 sisältää liitännäisen, joka koodittaa yhdistettä TPIp-MFal-johtosekvenssi (miinus Glu-Ala-Glu-Ala)-BΆ-ΤΡΙΤ.

Edullisessa rakentamisessa muunnettu ilmentämisyksikkö siirrettiin stabiiliin, suuren kopiomäärän tuottavaan hiivan plasmidiin CPOT (ATCC n:o 39685), joka voidaan valita vain sen perusteella, että kasvualusta sisältää glukoosia. Näin saadulle vektorille, joka ilmentää hiivassa yhdistettä ΒΆ, annettiin nimi pMT479.

Jakso, joka koodittaa MFal-johtosekvenssi (miinus Glu-Ala-Glu-Ala) -B (1-29) -Ala-Ala-Lys-A(l-21) :tä, eristettiin restriktio-jaksona plasmidista pMT598 ja siihen yhdistettiin TPI-promoottoria ja TPI-lopettajaa koodittavat jaksot ja siirrettiin edellä mainittuun suuren kopiomäärän tuottavaan hiivaplasmidiin CPOT.

12 8 91 8 3 Näin saadulle ilmentämisvektorille, joka ilmentää yhdistettä B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21) hiivassa, annettiin nimi pMT610.

Jakso, joka sisälsi liitännäisen TPIp-MFal-johtosekvenssi (miinus Glu-Ala-Glu-Ala)-B(1-29)-Ser-Lys-A(l-21)-TPIT, eristettiin restriktiojaksona plasmidista pMT630 ja siirrettiin CPOTrhen. Näin saatiin vektori, joka ilmentää yhdistettä B(1-29)-Ser-Lys-A(1-21) hiivassa, ja vektorille annettiin nimeksi pMT6 39 .

Jakso, joka sisälsi liitännäisenä TPIp-MFal-johtosekvenssi (miinus Glu-Ala-Glu-Ala)-B(1-29)-Thr-Arg-Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-Lys-A(l-21) -TPI^m, sijoitettiin suuren kopiomäärän tuottavaan hiivaplasmidiin DPOT, joka on CPOT:n johdannainen sisältäen pBR322:n Sphl-BamHI-jakson liitettynä CPOT:n Sphl-BamHI-jaksoon. Näin saadulle vektorille, joka ilmentää yhdistettä B(l-29)-Thr-Arg-Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-Lys-A(l-21) hiivassa, annettiin nimi pll26.

4. Transformointi

Plasmideilla pMT344 ja pMT475 suoritettiin S. cerevisiae leu 2-mutanttien transformointi ja suoritettiin valinta leusiini-prototrofian suhteen Hinnen et al:n kuvaamalla tavalla /Ä. Hinnen, J.B. Hicks ja G.R. Fink. Transformation of Yeast. Proc.Nat.Aca. Sei. 75 (1978) 1929?.

Plasmideilla pMT479, pMT610, pMT639 ja pll26 transformoitiin 5. cerevisiaen-kannat, joissa oli deleetio TPI-geenissä, ja suoritettiin valinta glukoosilla kasvun suhteen. Tällaiset kannat eivät normaalisti kykene kasvamaan, jos glukoosi on ainut hiililähde, ja ne kasvavat hyvin hitaasti galaktoosilaktaatti-alustassa. Puute johtuu mutaatiosta trioosifosfaatti-isomeraasi-geenissä, joka on saatu aikaan poistamalla suurin osa tätä geeniä ja korvaamalla se S. cerevisiaen LEU 2-geenillä. Kasvukyvyn vajavuuden vuoksi tapahtuu suuri valinta sellaisen plasmidin hyväksi, joka sisältää TPI:tä koodittavan geenin. pMT479 sisältää Schizo. pombe TPI-geenin.

li 13 891 83 5. Ihmisen insuliinin prekursorien ilmentäminen hiivassa Ihmisen insuliinin tyyppiset ilmentymistuotteet mitattiin insuliinille tarkoitetulla radioimmunomäärityksellä (Heding, L., Diabetologia 8, 260-66, 1972) kuitenkin niin, että kyseisenä standardina käytettiin insuliinin prekursoria eikä insuliinia. Standardien puhtaus oli noin 98 % HPLCrllä mitattuna ja peptidin todellinen pitoisuus standardissa määritettiin aminohappoanalyy-sillä. Transformoituneiden hiivakantojen ilmentämät ihmisen immunoreaktiivisen insuliinin pitoisuudet on esitetty yhteenvetona taulukossa 1.

Taulukko 1

Hiivan ilmentämien ihmisen immunoreaktiivisten insuliinin prekursorien pitoisuudet

Hiivakanta Plasmidi Rakenne Imnunoreaktii- vinen insuliini prekursori ranol/l emä- _ _ _ liuosta_ MT 350 (DSM 2957) pMT 344 B(1-29)-A(1-21) 100 MT 371 (DSM 2958) pMT 475 B(1-29)-A(1-21) 192 MT 519 (DSM 2959) pMT 479 B(1-29)-A(l-21) 2900 MT 620 (DSM 3196) pMT 610 B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A(l-21) 1200-1600 MT 649 (DSM 3197) pMT 6 39 B(l-29)-Ser-Lys-A(l-21) 1600 ZA 4 26 pll26 B(l-29)-Thr-Arg-Glu-Ala-Glu-

Asp-Leu-Gln-Lys-A(l-21) 200

Ilmentymistuotteiden eristäminen ja tunnistaminen on selostettu esimerkeissä 7-9 ja 12-13.

6. Ihmisen insuliinin prekursorin muuntaminen ihmisen insulii- _nin B30-estereiksi_

Ihmisen insuliinin prekursorien muuttumista ihmisen insuliinin estereiksi voidaan seurata kvantitatiivisesti HPLC:llä (korkea-painenestekromatografia) käänteisfaasissa. Käytettiin 4 x 300 mm "^uBondapak C18 column"-pylvästä (Waters Ass.) ja eluoinnissa puskuria, jossa oli 0,2 M ammoniumsulfaattia (pH säädetty rikki- hapolla arvoon 3,5) ja 26-50 % asetonitriiliä. Optimaalinen l4 891 83 asetonitriilipitoisuus riippuu siitä, mikä esteri insuliinin prekursorista halutaan saada erotetuksi. Esimerkiksi ihmisen insuliinin metyyliesteri voidaan erottaa käyttämällä noin 26 tilavuus-% asetonitriiliä.

Ennen HPLC-pylvääseen sijoittamista reaktioseoksen proteiinit saostettiin lisäämällä 10 tilavuutta asetonia. Sakka sentrifu-goitiin talteen, kuivattiin vakuumissa ja liuotettiin 1 M etikka-happoon .

Esimerkki 1 B(1-29)-A(l-21)-insuliinia koodittavan geenin rakentaminen "Universaalinen" 15-meerinen Ml3-dideoksisekventointialuke d(TCCCAGTCACGACGT), T4 DNA-ligaasi ja restriktioentsyymit saatiin New England Biolabs-yhtiöstä. DNA-polymeraasi I:n Klenow- jakso ja T.-polynukleotidikinaasi saatiin P-L Biochemicals- 4 32 yhtiöstä. (γ- P)-ATP (7500 Ci(mmol) saatiin New England

Nuclear-yhtiöstä. Oligonukleotidisynteesissä käytetty kantaja- 2 aine oli 5'-O-dimetoksitrityyli-N -isobutyryylideoksiguanosiini sidottuna 3'-O-sukkinyyliryhmän kautta aminometyloituihin 1 % silloittuneisiin polystyreenihelmiin (Bachem).

M13 mplO insHXAPst-faagin rakentaminen;

Ml3 mpl0:sta johdettu faagi mplO insHX rakennettiin kloonaamalla faagista p285 eristetty 284 emäsparin proinsuliinia koodittava Hindlll-Xbal-jakso Hindlll-Xbal:llä katkaistuun M13 mplO RF-faagiin. M13 mplO RF on saatavissa P-L Biochemicals, Inc.-yhtiöstä, Milwaukee, Wis. (luettelonumero 1541).

Ml3 mplO insHXAPst rakennettiin mplO insHx,RF:stä siten, että suoritettiin täydellinen katkaisu Pstl:llä, liitettiin yhteen ja transformoitiin E. coli JM103. Näin saatu faagi sisältää ihmisen proinsuliinia koodittavia sekvenssejä siten, että C-peptidiä koodattavalla alueella on 75 emäsparin kehysdeleetio. Yksisäikeinen faagi valmistettiin menetelmällä Messing, J. ja Vieira, J. (1982) Gene 19, 269-276.

li is 89183

Oiigodeoksiribonukleotidisynteesi; 19-meerinen deleetioaluke d(CACACCCAAGGGCATTGTG) syntetisoitiin triesterimenetelmällä 1-prosenttisesti silloittuneella polysty-reenikantaja-aineella /Ito, H., Ike, Y., Ikuta, S., ja Itakura K.

(1982) Nucl.Acids Res. 10, 1755-1769). Polymeeri pakattiin lyhyeen pylvääseen ja liuottimet ja reagenssit tuotiin puoliau-tomaattisesti HPLC-pumpun ja ohjausmoduulin avulla. Oligonukleo-tidi puhdistettiin suojauksen poiston jälkeen HPLC:llä LiChrosorb RP18-pylväässä /Chrompack (Fritz, H.-J., Belagaje, R. , Brown, E.L., Fritz, R.H., Jones, R.A., Lees, R.G., ja Khorana, H.G. (1978) Biochemistry 17, 1257-12677- 32

Oligodeoksiribonukleotidin 5'- P-leimaus 19-meeri leimattiin 5'-päästä 60 ^,ul:ssa reaktioseosta, jossa oli 50 mM Tris-HCl pH 9,5, 10 mM MgCl~, 5 mM DTT, 0,4 % glyserolia, 32 Δ 120 pmol ATP, 50 ^uCi (γ- P)-ATP (10 pmol), 120 pmol oligo-nukleotidia ja 30 yksikköä T4-polynukleotidikinaasia. Reaktio suoritettiin 37°C:ssa 30 minuutissa ja keskeytettiin kuumentamalla 100°C:ssa 3 minuuttia. Leimattu oligonukleotidi erotet- 32 tiin reagoimattomasta (γ- P)-ATP:stä kromatografiapylväässä (Sephadex G50 superfine, 1x8 cm) 0,05 M trietyyliammoniumbi-karbonaatissa pH 7,5.

Pesäkehybridisointia varten oligonukleotidi leimattiin lisäämättä "kylmää" ATP:tä, kuten on selostettu julkaisussa /Boel, E., Vuust, J., Norris, F., Norris, K., Wind, A., Rehfeld, J., ja Marcker, K. (1983) Proc.Natl.Acad.Sci. USA 80, 2866-2869).

Oligodeoksiribonukleotidialukkeella suoritettu DNA:n synteesi:

Yksisäikeistä M13 mplO insHXAPst:tä (0,4 pmol) inkuboitiin 32

19-meerisen 5* — ( P)-leimatun oligodeoksiribonukleotidialukkeen (10 pmol) kanssa 20 ^ul:ssa reaktioseosta, jossa oli 50 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgC^ ja 1 mM DDT, 5 minuuttia 55°C:ssa ja pariutettiin 30 minuuttia ll°C:ssa. Sitten lisättiin 9 ^,ul d-NTP-seosta, jossa oli dATP, dCTP, dGTP ja dTTP 2,2 mM kutakin, 20 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgC^, 50 mM

ie 89183

NaCl ja 1 mM DDT, ja sen jälkeen 7 yksikköä E. colin DNA-poly-meraasi I:tä (Klenow). Saatua seosta pidettiin 30 minuuttia ll°C:ssa ja kuumennettiin 10 minuuttia 65°C:ssa. 15-meerinen universaalinen aluke dideoksisekventointia varten (4 pmol) lisättiin ja saatua seosta kuumennettiin 65°C:ssa vielä minuutti. Jäähdytettiin ll°C:een ja sen jälkeen lisättiin 26 ^ul liuosta, jossa oli 20 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgC^, 10 mM DTT, dATP, dCTP, dGTP ja dTTP 0,8 mM kutakin, 2,4 mM ATP ja 10·^ yksikköä T4-ligaasia, ja sen jälkeen 9,5 yksikköä E. colin DNA-polymeraasi I:tä (Klenow). Seoksen lopullinen tilavuus oli 64 ^,ul. Kun oli inkuboitu 3 tuntia ll°C:ssa, lisättiin 20 ^-ul 4 M natriumasetaattia ja tilavuus säädettiin 200 ^uliksi TE-puskurilla (10 mM Tris-HCl pH 8,9 1 mM EDTA).

Seos uutettiin kahdesti fenoli/kloroformilla. Lisättiin 0,9 ^ug (0,3 pmol) puhdistettua BamHI:llä ja HindIII:lla katkaistua pBR322:n suurta jaksoa kantaja-DNA:ksi. Vesifaasi uutettiin eetterillä ja DNA erotettiin etanolisaostuksella.

Hajotus endonukleaaseilla

Edellä kuvatulla tavalla valmistettu DNA hajotettiin vastaavasti 16 ja 20 yksiköllä restriktioendonukleaaseja BamHI ja Hind III 22 yul:n kokonaistilavuudessa puskuria (50 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgC^, 1 mM DTT, 4 mM spermidiiniä) . Seos uutettiin fenoli/kloroformilla ja sen jälkeen eetterillä ja DNA erotettiin etanolisaostuksella ja liuotettiin sen jälkeen 12 puitaan vettä. 2 ^ul käytettiin elektroforeesissa 7 M ureassa, joka oli tehty 6 % polyakryyliamidigeeliin.

Yhteenliittäminen:

Osaan DNA:ta (5 ^ul) lisättiin uutta BamHI:llä ja Hindlllslla leikattua puhdistettua pBR322:n suurta jaksoa (0,38 ^ug) ja 400 yksikköä T4 DNA-ligaasia 41 ^ul:n kokonaistilavuudessa, jossa oli 66 mM Tris-HCl pH 7,4, 10 mM MgC^, 1 mM ATP, 10 mM DDT ja 40 ^ug/ml liivatetta. Yhteenliittäminen suoritettiin 16°C:ssa 16 tunnissa.

li 17 8 9 1 83

Transformointi: 20,5 ^,ul:lla yhteenliittämisseosta transformoitiin CaC^^la käsitelty E. coli MC 1000 (r~, m+). Bakteeria viljeltiin LB-agarlevyillä ja valittiin ampisilliinin vastustuskyvyn suhteen 3 (100 ^ug/ml). Näin saatiin 2,6 x 10 pesäkettä per pmol Ml3 mplO insHXAPst.

Pesäkehydridisointi; 123 transformoitunutta pesäkettä poimittiin tuoreille ampisillii-nilevyille ja kasvatettiin yön yli 37°C:ssa. Pesäkkeet siirrettiin Whatman 540-suodatinpaperille ja kiinnitettiin /Gergen, J.P., Stern, R.H., ja Wensink, P.C. (1979), Nucl.Acids Res. 7, 2115-21367. Esihybridisointi suoritettiin suljetussa muovipussissa 6 mlrssa liuosta, jossa oli 0,9 M NaCl, 0,09 M Tris-HCl pH 7,5, 0,006 M EDTA, 0,2 % Ficoll, 0,2 % polyvinyylipyrrolidonia, 0,2 % naudan seerumialbumiinia, 0,1 % SDS ja 50 ^ug/ml lohen sperman DNA:ta, 2 tunnissa 65°C:ssa. Sitten lisättiin 8,5 x 10^ 32 cpm P-merkittyä 19-meeriä ja suoritettiin hybridisointi 45°C:ssa yön aikana. Suodatin pestiin kolmeen kertaan (0°C, 5 minuuttia) liuoksella, jossa oli 0,9 M NaCl ja 0,09 M natrium-sitraattia, sen jälkeen suoritettiin autoradiografia, pestiin kerran 45°C:ssa 1 minuutti ja autoradiografoitiin uudestaan.

Kun oli pesty 45°C:ssa, voitiin tunnistaa 3 pesäkettä, joissa oli mutatoitunut plasmidi.

Mutatoituneiden plasmidien endonukleaasianalyysi Oletetuista mutanttipesäkkeistä valmistettiin plasmidit nopealla menetelmällä /Ish-Horowicz, D. ja Burke, J.F. (1981), Nucl.Acids Res. 9, 2989-29987/ pilkottiin BamHI:n ja HindIII:n seoksella ja analysoitiin sen jälkeen elektroforeettisesti 2 % agaroosi-geelillä. 179 emäsparin jakson läsnäolo vahvisti, että 3 pesäkettä sisälsi mutanttiplasmidin.

Uudelleentransformointi "Mutanteiksi” tunnistetut pesäkkeet sisältävät plasmideja, ; : jotka ovat heterokahdenteen jälkeläisiä. Puhdas mutantti is 89183 voitiin saada transformoimalla CaCl_:lla käsitelty E. coli — + ^ MC1000 (r , m ) uudestaan 2 mutanttipesäkkeen plasmideilla. Kustakin levystä eristettiin 5 ampisilliinille vastustuskykyistä kloonia, valmistettiin plasmidi-DNA ja suoritettiin analyysi endonukleaasipilkonnalla edellä kuvatulla tavalla. 3 viidestä ja 5 viidestä vastaavasti osoittautuivat puhtaiksi mutanteiksi. Yksi plasmidi, pMT319, valittiin jatkokäyttöön.

DNA-sekvenssin analyysi 5 yug plasmidia pMT319 pilkottiin BamHI:llä standardiolosuhteis- sa, uutettiin fenolilla ja saostettiin etanolilla. BamHI:n tuottamat lomittaiset päät täytettiin käyttämällä Klenow DNA- 32 polymeraasi I:tä, dCTP:tä, dGTP:tä, ,^dTTP:tä ja a- P-dATP:tä.

Fenoliuuton ja etanolisaostuksen jälkeen DNA pilkottiin 32

EcoRI:llä. P:llä leimattu jakso, jossa oli deleetio, puhdistettiin elektroforeesilla 2 % agaroosigeelillä ja sekventoitiin Maxamin ja Gilbertin menetelmällä (Maxam, A. ja Gilbert, W.

(1980) Methods in Enzymology 65, 499-560).

Esimerkki 2

Hiivaplasmidin pMT344 rakentaminen ihmisen insuliinin B(l-29)- A(l-21);n ilmentämiseksi (B'A)__

Plasmidi pMT319, jossa oli B'A:ta koodittava geeni, ja joka oli rakennettu edellä kuvatulla tavalla, leikattiin restriktioentsyy-meillä Hindlll ja Xbal ja 0,18 ke:n jakso /T. Maniatis, E.F. Fritsch, ja J. Sambrook. Molecular Cloning. Cold Spring Harbor Press 19827 eristettiin 2 % agaroosigeelistä. Samoin eristettiin US-patenttihakemuksen S.N. 547 748 (1. marraskuuta, 1983) mukaisesti valmistetusta plasmidista p285 jakso (6,5 ke Xhol-Hindlll), joka sisälsi S.cerevisiaen TPI-promoottorin (TPIp) /T. Alber ja G. Kawasaki. Nucleotide Sequence of the Triose Phosphate Isomerase Gene of Saccharomyces cerevisiae, J.Mol. Applied Genet. 1 (1982) 419-4347 ja MFal-johtosekvenssin /J. Kurjan ja I. Herskowitz, Structure of a Yeast Pheromone Gene (MFa): A Putative α-Factor Precursor Contains four Tandem Copies of Mature α-Factor. Cell 30 (1982) 933-9427 p285 sisältää I, is 89183 liitännäisen TPIp-MF 1-johtosekvenssi -B-C-A- TPIT ja se on taltioituna hiivakantaan Z33 (ATCC n:o 20681). Jakso (0,7 ke Xbal-BamHI), jossa oli TPI:n transkription lopetussekvenssit (TPIT) /T. Alber ja G. Kawasaki, Nucleotide Sequence of the Triose Phosphate Isomerase Gene of Saccharomyces cerevisiae.

J. Mol. Applied Genet. 1 (1982)419-43£7 eristettiin myös plas-midista p285. Lopuksi eristettiin 5,4 ke:n XhoI-BamHI-jakso hiivan vektorista YEpl3 /J.R. Broach. Construction of High Copy Yeast Vectors Using 2 ^um Circle Sequences. Methods Enzymology 101 (1983) 307-3257. Edellä mainitut neljä jaksoa liitettiin yhteen /T. Maniatis, E.F. Fritsch, ja J. Sambrook. Molecular Cloning. Cold Spring Harbor Press 19827, liitännäisillä suoritettiin E. colin transformointi /T. Maniatis, E.F. Fritsch, ja J. Sambrook. Molecular Cloning. Cold Spring Harbor Press 19827 ja suoritettiin valinta ampisilliiniresistenssin suhteen. Plasmidit eristettiin transformanteista ja yhden plasmidin, pMT344, rakenne varmistettiin restriktiokartoituksella. pMT344:n rakentaminen ja pääpiirteet on esitetty kaaviollisesti kuvassa 1.

Esimerkki 3

Hiivaplasmidin pMT475 rakentaminen ihmisen insuliinin B(l-29)-A(l-21):n ilmentämiseksi siten, että B'A on muunnetun MFal-johto- sekvenssin jäljessä_

Jotta saataisiin rakennetuksi plasmidi B'A:n ilmentämiseksi MFal-johtosekvenssin jälkeen /J. Kurjan ja I. Herskowitz,

Structure of a Yeast Pheromone Gene (MFa): A Putative a-Factor Precursor Contains four Tandem Copies of Mature α-Factor. Cell 30 (1982) 933-94^7, josta viimeksimainitusta puuttuu viimeiset neljä aminohappoa (Glu-Ala-Glu-Ala), plasmidista pMT319 eristettiin 0,14 ke:n Xbal-EcoRII-jakso, jossa oli A-sekvenssi ja osa B'-sekvenssiä. Samoin eristettiin B'-geenin 5'-pään läheinen osa 0,36 ke:n EcoRI-EcoRII-jaksona plasmidista pM215. Plasmidi pM215 rakennettiin alakloonaamalla EcoRI-Xbal-jakso, jossa oli plasmidin p285 B-C-A-proinsuliinigeenin plasmidiin pUC13 /rakennettu samoin kuin pUC8 ja pUC9 julkaisussa Vieira et ai., Gene 19: 259-268 (1982)7 ja sen jälkeen poistettiin in vitro 20 39 1 83 silmukoimalla 12 emästä, jotka koodittavat aminohappoketjua Glu-Ala-Glu-Ala, MFal-johtosekvenssin ja B-C-A-proinsuliini-geenin välistä. Nämä kaksi B'A-geenin kattavaa jaksoa liitettiin EcoRI-Xb.al:llä leikattuun pUC13-vektoriin (ks. kuva 2), jolloin saatiin pMT473. Saatu muunnettu geeni, joka sisältyi plasmidista pMT473 eristettyyn 0,5 ke:n EcoRI-Xbal-jaksoon, liitettiin sen jälkeen plasmidista pMT342 saatuihin kahteen jaksoon (4,3 ke:n Xbal-EcoRV ja 3,3 ke:n EcoRV-EcoRI). pMT342 on hiivavektori pMT212, johon on sijoitettu TPIp-MFal-johto-sekvenssi-B-C-A-TPIT. Saatu plasmidi pMT475 sisältää liitännäisen TPIp-MFal-johtosekvenssi (miinus Glu-Ala-Glu-Ala)-BΆ-TPIT> Plasmidien pMT342, pMT473 ja pMT475 rakentaminen on esitetty kaaviollisesti kuvassa 2. Vektorin pMT212 rakentaminen on esitetty kuvassa 3. Plasmidi pMLBl034 on kuvattu julkaisussa M.L. Berman et ai., Advanced Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor (1982), 49-51 ja pUC12 rakennettiin samoin kuin pUC13 (Vieira et ai, ibid.).

Esimerkki 4 B(1-29)-A(l-21)-geenin (Β'Α-geeni) sijoittaminen stabiiliin hiivaplasmidiin pMT479_

Plasmidista pMT475 saatu muunnettu B'A-geeni eristettiin 2,1 ke:n BamHI - osittainen Sphl-jaksona ja liitettiin noin 11 ke:n BamHI-Sphl-jaksoon, joka oli saatu plasmidista CPOT (ATCC n:o 39685), jolloin saatiin plasmidi pMT479 (kuva 4). Plasmidi CPOT perustuu vektoriin Cl/1, joka on muunnettu korvaamalla alkuperäinen pBR322:n Bgl1-BamHI-jakso samanlaisella pUC13:sta saadulla Bgl1-BamHI-jaksolla ja liittämällä sen jälkeen S. pombe TPI-geeni (POT) (US-patenttihakemus S.N. 614 734, jätetty virastoon 25. toukokuuta, 1984) BamHI-Sall-jaksona, jolloin saadaan CPOT. Cl/1 on johdettu plasmidista pJBD248, Beggs et ai., Nature 275, 104-109 (1978) kuten on selostettu eurooppalaisessa patenttihakemuksessa n:o 0103409A.

Esimerkki 5 Transformointi S. cerevisiae-kantaa MT118 (a, leu 2, ura 3, trp 1) kasvatettiin li 2i '6 9 1 8 3 YPD-alustassa (Sherman et al.. Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, 1981) ODg0Q-arvoon 2,1. 100 ml vil jelmää otettiin talteen sentrifugoimalla, pestiin 10 ml:ssa vettä ja sentrifugoitiin uudestaan ja suspendoitiin uudestaan 10 ml:aan liuosta, jossa oli 1,2 M sorbitolia, 25 mM Na2EDTA pH 8,0 ja 6,7 mg/ml ditiotreitolia. Saatua suspensiota inkuboi-tiin 30°C:ssa 15 minuuttia, sentrifugoitiin ja solut suspendoitiin uudestaan 10 ml:aan liuosta, jossa oli 1,2 M sorbitolia, 10 mM Na2EDTA, 0,1 M natriumsitraattia pH 5,8 ja 2 mg NovozyiiS' 234-entsyymiä. Saatua suspensiota inkuboitiin 30 minuuttia 30°C:ssa, solut sentrifugoitiin talteen, pestiin 10 ml :11a 1.2 M sorbitolia ja 10 ml :11a CAS-liuosta /1,2 M sorbitoli, 10 mM CaCl2, 10 mM Tris (Tris = tris(hydroksimetyyli)aminometaani) pH = 7,57 ja suspendoitiin uudestaan 2 ml:aan CAS-liuosta. Transformointia varten 0,1 ml:aan CAS-liuokseen uudelleensuspen-doituja soluja sekoitettiin noin 1 ^,ug plasmidia pMT344 ja seos jätettiin huoneen lämpötilaan 15 minuutiksi. Lisättiin 1 ml (20 % polyetyleeniglykolia 4000, 10 mM CaC^, 10 mM Tris pH 7,5) ja saatu seos jätettiin vielä 30 minuutiksi huoneen lämpötilaan. Seos sentrifugoitiin ja pelletti suspendoitiin uudestaan 0,1 ml:aan SOS-liuosta (1,2 M sorbitolia, 33 tilavuus-% YPD, 6,7 mM CaCl2, 14 ,ug/ml leusiinia) ja inkuboitiin 2 tuntia

O

30 C:ssa. Sitten suspensio sentrifugoitiin ja pelletti suspendoitiin uudestaan 0,5 ml:aan 1,2 M sorbitolia. Lisättiin 6 ml peiteagaria (Sherman et al:n SC-alusta (Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, 1981) ilman leusiinia ja sisältäen 1.2 M sorbitolia sekä 2,5 % agaria) 52°C:ssa ja suspensio kaadettiin levyjen päälle, jotka sisälsivät samaa agarilla kiinteytettyä, sorbitolipitoista alustaa. Transformanttipesäk-keet poimittiin sen jälkeen, kun oli kasvatettu 3 vuorokautta 30°C:ssa, eristettiin uudestaan ja käytettiin nestemäisten kasvatusten aloittamiseen. Jatkotutkimuksiin valittiin yksi tällainen transformantti MT350 (=MT 118/pMT344).

Plasmidi pMT475 siirrettiin S. cerevisiae-kantaan MT362 (a,leu2) samoin kuin edellä ja eristettiin transformantti MT371 (=MT362/ pMT4 7 5).

22 89 1 83

Plasmidin pMT479 siirtäminen kantaan E2-7B X E11-3C (a/α, Atpi/Atpi, pep 4-3/pep 4-3; tästä kannasta käytetään nimeä MT501) suoritetaan samoin kuin edellä, mutta seuraavin muunnoksin: 1) ennen transformointia kantaa MT501 kasvatettiin YPGaL-alustassa (1 % Bacto-hiivaa, 2 % Bacto-peptonia, 2 % galaktoosia, 1 % laktaattia) ODg^-arvoon 0,6. 2) SOS-liuos sisälsi YPGaL;ää eikä YPD:tä. Jatkotutkimuksiin valittiin yksi transformantti MT519 (=MT501/pMT479).

Tämän patentin hakija taltioi transformoituneet mikro-organismit MT350, MT371 ja MT519 kokoelmaan Deutsche Sammlung von Mikroorganismen (DSM), Griesebachstrasse 8, D-3400 Göttingen, 15. toukokuuta 1984, jolloin niille annettiin kokoelmanumerot DSM 2957, DSM 2958 ja DSM 2959 vastaavasti.

Esimerkki 6 B(1-29)-A(l-21)-insuliinin ilmentyminen hiivassa Kantoja MT350 (DSM 2957) ja MT371 (DSM 2958) kasvatettiin synteettisessä täydellisessä SC-alustassa (Sherman et ai., Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory 1981), josta puuttui leusiini. Kummastakin kannasta kasvatettiin ravistelu-viljelminä kaksi 1 litran viljelmää 2 litran pulloissa, jotka oli varustettu ohjauslevyillä, 30°C:ssa, kunnes 0D6O0nm-arvoksi tuli 7-10. Sitten viljelmät sentrifugoitiin ja emäliuokset otettiin talteen jatkoanalysointia varten.

Kantaa MT519 (DSM 2959) kasvatettiin vastaavalla tavalla, mutta YPD-alustassa (Sherman et ai., Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, 1981) ja 0D600nm~arvoon 15, sentrifu-goitiin ja emäliuos erotettiin analysointia varten edellä kuvatulla tavalla.

Esimerkki 7 B(1-29)-A(1-21)-insuliinin ilmentäminen hiivakannassa MT350 (DSM 2957)_

Hiivakantaa MT350 (DSM 2957) kasvatettiin samoin kuin edellä esimerkissä 6 on esitetty ja 1100 ml:sta tämän kannan emäliuosta n 23 89183 erotettiin ilmentymistuotteet seuraavalla tavalla: 10 g LiChroprei^*P-18 (Merck, art. 9303) pestiin 3 kertaa liuoksella, jossa oli 50 mM NH^HCO^ ja 60 % EtOH, ja sen jälkeen pakattiin 6 x 1 cm pylvääseen. Pylväs tasapainotettiin 50 ml :11a 50 mM NH.HC0o. 1100 ml:aan hiivan emäliuosta lisättiin 55 ml 96 % EtOH ja seos laskettiin pylvään läpi yön aikana (virtaus: 70 ml/h).

Pylväs pestiin 10 ml :11a 0,5 M NaCl ja 10 ml:11a H2O ja peptidit eluoitiin liuoksella, jossa oli 50 mM NH^HCO^ ja 60 % EtOH. Eluaatti (5 ml) väkevöitiin vakuumisentrifugoinnilla 1,4 ml:ksi (etanolin poistamiseksi) ja sen jälkeen tilavuudeksi säädettiin 10 ml lisäämällä liuosta, jossa oli 25 mM HEPES-puskuria pH 7,4. Näyte sijoitettiin anti-insuliini-immunoabsorptiopylvääseen (AIS-pylväs) (2,5 x 4,5 cm), joka oli sitä ennen pesty 4 kertaa 5 ml :11a NaFAM-puskuria (Heding, L., Diabetologia 8, 260-66, 1972) ja kaksi kertaa 5 ml :11a 25 mM HEPES-puskuria. Näytteen sijoittamisen jälkeen pylvään annettiin seisoa 30 minuuttia huoneen lämpötilassa ja sen jälkeen se pestiin 10 kertaa 4 ml:11a 25 mM HEPES-puskuria. Peptidit eluoitiin 20 % HAc:llä. Eluaatin pH säädettiin ammoniumhydroksidilla arvoon 7,0 ja kerättyjen jakeiden tilavuus säädettiin 500 ^ul:aan vakuumi-rotaatiolla.

Saatu näyte puhdistettiin HPLC-menetelmällä 10 ^u Waters yuBondopak C-18-pylväässä (3,9 x 300 mm). A- ja B-puskurit olivat 0,1 % TFA H20:ssa ja 0,07 % TFA MeCN:ssä vastaavasti.

Pylväs tasapainotettiin 25 %:lla B:tä (virtaus: 1,5 ml/min) ja peptidit eluoitiin MeCN:n lineaarisella gradientilla (1 %/min) ja havaittiin 276 nm:ssä. Kunkin puhdistusvaiheen saanto määritettiin edellä kuvatulla radioimmunomäärityksellä ja puhdistuksen yhteenveto on esitetty taulukossa 2. Kokonaissaanto 011 68 %.

24 8 9 1 8 3

Taulukko 2

Hiivakannan MT350 ilmentymistuotteiden puhdistaminen emä-liuoksesta

Puhdistusvaihe Tilavuus (ml) Immunoreaktiivinen B(1-29)-A(1-21)-insuliini _ _ _(nmo 1)_

Emäliuos 1100 110* RP-18 10 116

Anti-insuliini

Sepharose 0,5 116 HPLC 2,5 75 *Tässä näytteessä havaittiin laimenemisilmiö HPLC-pylväästä havaittiin vain yksi piikki, joka sisälsi immu-noreaktiivista B(l-29)-A(l-21)-insuliinia. Tämän piikin sisältämä peptidimateriaali eristettiin ja sille suoritettiin amino-happosekventointi. Sekvenssianalyysi suoritettiin kaasufaasi-sekventaattorilla (Applied Biosystem Model 470A) menetelmällä Hewick, R.M. et ai. (J. Biol.Chem. 256, 7990-7997, 1981). Sekventointituloksista voitiin päätellä, että ilmentymistuotteet koostuivat 3 peptidistä: (Glu-Ala)2-B(1-29)-A(l-21)-insuliini 89 %

Glu-Ala-B (l-29)-A (1-21)-insuliini 2 % B(1-29)-A(l-21)-insuliini 9 %

Peptidejä oli mainitut suhteelliset määrät.

Esimerkki 8 B(1-29)-A(l-21)-insuliinin ilmentyminen hiivakannassa MT371 (DSM 2958)_

Hiivakantaa MT371 (DSM 2958) kasvatettiin esimerkissä 6 kuvatulla tavalla ja 665 mlrsta tämän kahnan emäliuosta erotettiin ilmentymistuotteet esimerkissä 7 kuvatulla tavalla. Kokonaissaanto oli 50 nmol, mikä vastaa 39 %. Peptidimateriaali eristettiin HPLC-pylväästä ja sekventoitiin esimerkissä 7 kuvatulla tavalla.

li

Sekventointituloksista (18 tähdettä N-päästä) voitiin päätellä, että peptidi oli homogeeninen B(1-29)-A(l-21)-insuliini.

25 891 83 Näiden tulosten vertailu esimerkissä 7 saatuihin tuloksiin osoittaa, että on hyvä poistaa Glu-Ala-Glu-Ala-sekvenssi MFotl:n C-päästä. Esimerkistä 7 ilmenee, että hiivan dipeptidaasientsyy-mi ei lohkaise kovinkaan tehokkaasti Glu-Ala- eikä Glu-Ala-Glu-Ala-sekvenssiä B(1-29)-A(l-21)-insuliinista ennen insuliinin prekursorin erittymistä hiivasoluista.

Esimerkki 9 B(1-29)-A(1-21)-insuliinin ilmentyminen hiivakannassa MT519 (DSM 2959)_

Hiivakantaa MT519 (DSM 2959) kasvatettiin esimerkissä 6 kuvatulla tavalla ja ilmentymistuotteet eristettiin 70 ml:sta emäliuos-ta esimerkissä 7 kuvatulla tavalla. Kokonaissaanto oli 116 nmol, mikä vastaa 57 %. Peptidi sekventoitiin esimerkissä 7 kuvatulla tavalla. N-päästä identifioitujen 42 tähteen perusteella arvioituna oli peptidi homogeeninen B(1-29)-A(l-21)-insuliini. Noin 5 nmol peptidiä hydrolysoitiin 100 ^ulrssa 6 N HC1 24 tuntia llO°C:ssa. Hydrolysaatti analysoitiin aminohappoanalysaattoril-la (Beckman Model 121M). Seuraava aminohappokoostumus löytyi:

Taulukko 3

Puhdistetun B(1-29)-A(l-21)-insuliinin aminohappoanalyysi Aminohappo Löydetty Laskettu Aminohappo Löydetty Lasket t

Asx1 2,97 3 Vai 3,37 4

Thr 1,77 2 Ile 1,65 2

Ser 2,45 3 Leu1 5,65 6

Glx1 6,68 7 Tyr 3,51 4

Pro 1,33 1 Phe1 2,73 3

Gly1 3,95 4 Lys1 0,95 1

Ala1 1,22 1 His1 1,84 2

Cys 0,5 4,54 6 Arg1 1,13 1

Normalisoinnissa käytetty aminohappo 26 89 1 83

Esimerkki 10

Hiivaplasmidin pMT610 rakentaminen B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A(l-21):n ilmentämistä varten_ 4,3 ke:n EcoRV-Xbal-jakso ja 3,3 ke:n EcoRI-EcoRV-jakso, jotka oli saatu plasmidista pMT342 (ks. esimerkki 3), liitettiin 0,6 ke:n EcoRI-Xbal-jaksoon, joka oli saatu plasmidista pM215 (ks. esimerkki 3). Saatu plasmidi pMT462 sisältää liitännäisen MFal-johtosekvenssi(miinus Glu-Ala-Glu-Ala)-B-C-A. Jotta saataisiin B-C-A:ta koodittava jakso B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(l-21):tä koodittavaksi jaksoksi, käytettiin muunnettua paikkaspesifistä mutatointia (K. Norris et ai., ibid.). Plasmidista pMT642 saatu 0,6 ke:n EcoRI-Xbal-jakso, joka koodittaa peptidiä MFal-johtosekvenssi(miinus Glu-Ala-Glu-Ala)-B-C-A, sijoitettiin Xbal-EcoRI-leikattuun M13 mplO RF-faagiin. Yksisäikeistä M13-faagia, jossa oli edellä mainittu EcoRI-Xbal-liitännäinen, inku-boitiin 30-meerisen d(TTCACAATGCCCTTAGCGGCCTTGGGTGTG)-priimerin (KFN15) ja "universaalisen" 15-meerisen Ml3-priimerin d(TCCCAGTCACGACGT) (ks. esimerkki 1) kanssa kuumentamalla 5 minuuttia 90°C:ssa ja jäähdyttämällä sen jälkeen hitaasti huoneen lämpötilaan parittumistarkoituksessa. Osittain kaksisäikeinen DNA valmistettiin lisäämällä dNTP-seos, Klenow-polymeraasi ja T4-ligaasi. Sitten suoritettiin fenoliuutto, etanolisaostus ja uudelleensuspendointi ja DNA leikattiin restriktioentsyymeillä Apal, Xbal ja EcoRI. Suoritettiin uudestaan fenoliuutto, etanolisaostus ja uudelleensuspendointi ja DNA liitettiin EcoRI-Xbal :llä leikattuun plasmidiin pUC13. E. coli (r m+)-kanta transformoitiin yhteenliittämisseoksella ja useista transforman-teista valmistettiin plasmidit. Plasmidivalmisteet leikattiin EcoRI:llä ja Xbalrllä ja niillä valmisteilla, joissa oli vyöhykkeet sekä 0,5 että 0,6 ke:ssä, transformoitiin E. coli uudestaan. Uudelleentransformointiin valittiin transformantti, jossa oli vain pUC13, joka sisälsi 0,5 ke:n liitännäisen. Tämän plasmidin pMT598 EcoRI-Xbal-liitännäisen sekvenssi varmistettiin Maxamin ja Gilbertin menetelmällä todeten, että se kooditti peptidiä MFal-johtosekvenssi(miinus Glu-Ala-Glu-Ala)-B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21). Plasmidin pMT598 Xbal-EcoRI-liitännäinen varustettiin TPI-promoottorilla ja TPI-lopettajalla liittämällä li pMT598:n 0,5 ke:n Xbal-EcoRI-jaksoon pT5:n 5,5 ke:n Xbal-EcoRI- jakso. Plasmidin pT5-rakentaminen, jossa on TPIp-MFal-johto- 27 891 83 sekvenssi-B-C-Α-ΤΡΙ,ρ, on esitetty kuvassa 8. Saatu plasmidi pMT601, joka sisältää liitännäisen TPIp-MFal-johtosekvenssi-(miinus Glu-Ala-Glu-Ala)-B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)-TPIT, leikattiin BamHI:llä ja osittain Sphlrllä ja 2,1 ke:n jakso sijoitettiin CP0T:hen, joka oli leikattu BamHI:llä ja Sphlrllä. Näin saatua plasmidia pMT610 käytettiin hiivan transformointiin.

Esimerkki 11

Hiivaplasmidin pMT639 rakentaminen B(1-29)-Ser-Lys-A(l-21):n ilmentämiseksi__

Plasmidin pMT462 (ks. esimerkki 10) BCArta koodittava jakso muunnettiin B (1-29)-Ser-Lys-A(1-21):tä koodittavaksi suorittamalla esimerkin 10 mukainen paikkaspesifinen mutatointi seoksella, jossa oli 27-meeristä d(TCCACAATGCCCTTAGACTTGGGTGTG)-priimeriä KFN36 ja "universaalista" 15-meeristä M13-priimeriä. Kun oli suoritettu täyttäminen Klenow-polymeraasilla ja liittäminen T4-ligaasilla, osittain kaksisäikeinen DNA pilkottiin Apalrllä, EcoRIrllä ja Xbalrllä ja liitettiin yhteen plasmidista pT5 saadun 5,5 ke:n Xbal-EcoRI-jakson kanssa (ks. esimerkki 10).

Kun oli suoritettu E. colin transformointi ja uudelleentransfor-mointi, eristettiin plasmidi pMT630, jossa oli liitännäinen MFal-johtosekvenssi(miinus Glu-Ala-Glu-Ala)-B(1-29)-Ser-Lys-A(l-21), ja liitännäisen sekvenssi varmistettiin. Jatkotoimenpiteet plasmidin pMT639 aikaansaamiseksi, joka sisältää liitännäisen TPIp-MFal(miinus Glu-Ala-Glu-Ala)-B(1-29)-Ser-Lys-A(1-21)-TPIT, suoritettiin esimerkin 10 mukaisesti. Plasmidin pMT639 rakentaminen on esitetty kuvassa 9.

Esimerkki 12 B (1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21):n ilmentäminen hiivakannassa MT620 S.cerevisiae-kanta MT501 (ks. esimerkki 5) transformoitiin plasmidilla pMT610 samoin kuin esimerkissä 5 on selostettu plasmidin pMT479 kohdalla. Transformanttipesäkkeet poimittiin sen jälkeen, kun niitä oli kasvatettu 3 vuorokautta 30°C:ssa, 28 89 1 83 eristettiin uudestaan ja käytettiin nestemäisten viljelmien aloittamiseen. Yksi tällainen transformantti, MT620 = (MT501/pMT610), valittiin jatkotarkasteluun. Tämän patentin hakija taltioi MT620:n kokoelmaan Deutsche Sammlung von Mikroorganismen (DSM), 16. tammikuuta 1985, jolloin se sai kokoelmanumeron DSM 3196.

MT620-kantaa kasvatettiin YPD-alustassa. Kahta litran viljelmää ravisteltiin 2 litran pulloissa, jotka oli varustettu ohjausle-vyillä, 30°C:ssa, kunnes ODgQ0nm-arvoksi tuli 15. Suoritettiin sentrifugointi ja emäliuos otettiin talteen jatkotutkimuksia varten. Radioimmunomäärityksellä mitattu ilmentymistaso oli 1,2 ^umol/1. 840 ml:sta emäliuosta puhdistettiin ilmentymis-tuotteet esimerkin 7 mukaisesti (RP-18-pylväs, anti-insuliini, Sepharose ja HPLC). Kokonaissaanto oli 100 nmol vastaten n.

10 %. Peptidimateriaali eristettiin HPLC-pylväästä ja sekven-toitiin esimerkin 7 mukaisesti. Suoritettiin 35 Edmanin hajotus-sykliä (taulukko 4). Sekvenssitulokset varmistivat B(l-29)- ja A(1-21)-ketjua toisistaan erottavan 3 aminohappotähteen muodostaman ketjun (Ala-Ala-Lys) sijainnin.

29 89183

Taulukko 4

Kannan MT620 kasvualustasta eristetyn B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(l-21):n sekvenssianalyysi______

Sykli nro PTH-aminohappotähde Saanto (pinol) 1 Phe 3381 2 Vai 1738 3 Asn 5169 4 Gin 2750 5 His 2045 6 Leu 1405 7 Cys 8 Gly 1372 9 Ser 345 10 His 1105 11 Leu 2228 12 Vai 1963 13 Glu 1219 14 Ala 1514 15 Leu 1793 16 Tyr 1707 17 Leu 1354 18 Vai 1765 19 Cys 20 Gly 882 21 Glu 1019 22 Arg 1100 23 Gly 1123 24 Phe 1492 25 Phe 2042 26 Tyr 1014 27 Thr 195 28 Pro 710 28 B Lys 1173 30 Ala 1026 31 Ala 885 32 Lys 1175 33 A,Gly 552 34 -‘-Ile 518 35 Vai 548

Keskimääräinen saanto toistettuna oli 95,6 %.

Esimerkki 13 B(1-29)-Ser-Lys-A(1-21):n ilmentyminen hiivakannassa MT643 S. cerevisiae-kanta MT501 transformoitiin plasmidilla pMT639, kuten esimerkissä 5 on selostettu plasmidin pMT479 kohdalla.

30 891 83

Jatkotutkimuksiin valittiin yksi transformantti, MT643 = (MT501/pMT639). Tämän patentin hakija taltioi MT643-kannan DSM-kokoelmiin 16. tammikuuta 1985, jolloin sille annettiin numero DSM 3197.

MT643-kantaa kasvatettiin esimerkissä 12 kuvatulla tavalla. Sentrifugoinnin jälkeen emäliuos otettiin talteen jatkotutkimuksia varten.

Insuliinin prekursorin ilmentymistaso oli radioimmunomäärityk-sellä mitattuna 1,6 ^umol/l. MT643-kannan emäliuoksen sisältämät ilmentymistuotteet eristettiin esimerkissä 7 kuvatulla tavalla. HPLC-pylväästä erotetulle peptidimateriaalille suoritettiin sekventointi esimerkissä 7 kuvatulla tavalla. Sekventoin-titulos (ei yksityiskohtaisesti ilmoitettu) osoitti, että kahden aminohappotähteen muodostama ketju (Ser-Lys) erottaa B(l-29)- ja A(1-21)-ketjun toisistaan.

Esimerkki 14 B (1-29)-A(l-21) :n muuntaminen Thr (Bu*") -OBu^ (B30)-ihmisinsulii- niksi___________ 20 mg B(1-29)-A(1-21)-insuliinia liuotettiin 0,1 mlraan 10 M etikkahappoa. Lisättiin 0,26 ml Thr(Bu^)-0But:n 1,54 M N,N-dimetyyliasetamidiliuosta. Seos jäähdytettiin 12°C:een. Lisättiin 2,8 mg trypsiiniä, joka oli liuotettu 0,035 ml:aan 0,05 M kalsiumasetaattia. Seosta inkuboitiin 72 tuntia 12°C:ssa, proteiinit saostettiin lisäämällä 4 ml asetonia, erotettiin sentrifugoimalla ja kuivattiin vakuumissa. B(1-29)-A(l-21):n muuntuminen Thr(But)-0Bufc(B30)-ihmisinsuliiniksi tapahtui 64-prosenttisesti HPLC-menetelmällä mitattuna.

Esimerkki 15 B(1-29)-A(l-21):n muuntaminen Thr-OMe(B30)-ihmisinsuliiniksi 20 mg B(1-29)-A(l-21)-insuliinia liuotettiin 0,1 ml:aan 10 M etikkahappoa. Lisättiin 0,26 ml liuosta, jossa oli 1,54 M Thr-OMe dimetyylisulfoksidin ja butaanidioli-1,4:n seoksessa li 3i 89183 (1:1 tilavuusosina). Lisättiin 1 mg Achromobacter lyticuksen lysyyliendopeptidaasia (Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japani) 0,07 ml:ssa vettä. Seosta inkuboitiin 120 tuntia 25°C:ssa, proteiinit saostettiin lisäämällä 4 ml asetonia, erotettiin sentrifugoimalla ja kuivattiin vakuumissa. B(l-29)-A(l-21):n muuttuminen Thr-OMe(B30)-ihmisinsuliiniksi tapahtui 75-prosenttisesti HPLC-menetelmällä mitattuna.

Esimerkki 16 B (1-29)-Ser-Lys-A(1-21):n muuntaminen Thr-OBu^(B30)-ihmisinsu- liiniksi_ 20 mg B(1-29)-Ser-Lys-A(1-21) liuotettiin 0,1 ml:aan seosta, jossa oli 34,3 % (tilavuus/tilavuus) ja 42,2 % (tilavuus/tilavuus) N, N-dimetyyliformamidia vedessä. Lisättiin 0,2 ml liuosta, jossa oli 2 M Thr-0But:n hydroasetaattisuolaa N,N-dimetyyli-formamidissa. Seoksen lämpötila säädettiin termostaatilla arvoon 12°C. Lisättiin 2 mg trypsiiniä 0,05 ml:ssa 0,05 M kal-siumasetaattia. Seosta inkuboitiin 24 tuntia 12°C:ssa, proteiinit saostettiin lisäämällä 4 ml asetonia, erotettiin sentrifugoimalla ja kuivattiin vakuumissa. B(1-29)-Ser-Lys-A(1-21):n muuttuminen Thr-0But(B30)-ihmisinsuliiniksi tapahtui 85-prosentti-sesti HPLC-nenetelmällä määritettynä.

Esimerkki 17 B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21):n muuntaminen Thr-0But(B30)-ihmis-insuliiniksi_ 20 mg B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)-insuliinia liuotettiin 0,1 ml:aan seosta, jossa oli 34,3 % etikkahappoa (tilavuusosina) ja 42,2 % N,N-dimetyyliformamidia (tilavuusosina) vedessä. Lisättiin 0,2 ml liuosta, jossa oli 2 M Thr-OBu^rn hydroasetaattisuolaa N,N-dimetyyliformamidissa. Seoksen lämpötila säädettiin termostaatilla 12°C:een. Lisättiin 2 mg trypsiiniä 0,05 mlrssa O, 05 M kalsiumasetaattia. Seosta inkuboitiin 96 tuntia 12°C:ssa, erotettiin sentrifugoimalla ja kuivattiin vakuumissa. B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A (1-21) :n muuttuminen Thr-OBu^ (B30)-ihmisinsuliiniksi tapahtui 84-prosenttisesti HPLC-menetelmällä mitattuna.

32 89 1 83

Esimerkki 18

Ihmisinsuliinin valmistaminen erilaisista ihmisinsuliinies-tereistä_

Epäpuhtaiden asetonisakkojen sisältämät ihmisinsuliiniesterit puhdistettiin geelisuodatuksella ja anioninvaihtokromatografiällä, kuten on selostettu julkaisussa Methods in Diabetes Research Voi. 1, p. 407-408 /Eds. J. Larner & S. Pohl (John Wiley Sons,

New York, 1984^7· Menetelmää voidaan soveltaa kaikkiin näihin kolmeen ihmisinsuliiniesteriin. Eri esteriryhmien lohkaisu niin, että saatiin ihmisen insuliinia lähes 100 % saannolla, tapahtui hydrolysoimalla Thr-OMe(B30)-ihmisinsuliini ja asidolysoimalla Thr(But)-0But(B30)-ihmisinsuliini ja Thr-0But(B30)-ihmisinsuliini trifluorietikkahapolla, kuten edellä mainitussa julkaisussa sivulla 409 on selostettu.

Claims (8)

33 891 83

1. DNA-sekvenssi käytettäväksi hiivavektorissa, tunnettu siitä, että se muodostuu sellaista insuliinin prekursoria koodaavasta nukleotidiyhdistelmästä, jolla on kaava B(l-29) - (Xn-Y)m-A(l-21) I jossa kaavassa Xn on peptidiketju, jossa on n luonnonmukaisesti esiintyvää aminohappotähdettä, Y on Lys tai Arg, n on kokonaisluku 0-33, m on 0 tai 1, B(l-29) on ihmisen insuliinin lyhennetty B-ketju ulottuen aminohaposta PheB1 aminohappoon LysB29 ja A(l-21) on ihmisen insuliinin A-ketju edellyttäen, että peptidiketju -Xjj-Y- ei sisällä kahta vierekkäistä emäksistä aminohappotähdettä.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen DNA-sekvenssi, tunnettu siitä, että se muodostuu sellaista insuliinin prekursoria koodaavasta nukleotidiyhdistelmästä, jolla on kaava B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21) tai B(1-29)-Ser-Lys-A(l-21) .

3. Hiivassa replikoitumiskykyinen vektori, tunnettu siitä, että se sisältää patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukaisen DNA-sekvenssin.

4. Menetelmä insuliinin prekursorin valmistamiseksi, jolla on kaava B(l-29)- (Xn-Y)m-A(l-21) I jossa kaavassa ^ on peptidiketju, jossa on n luonnonmukaisesti esiintyvää aminohappotähdettä, Y on Lys tai Arg, n on kokonaisluku 0-33, m on 0 tai 1, B(l-29) on ihmisen insuliinin lyhennetty B-ketju ulottuen aminohaposta PheB1 aminohappoon Lys829 ja A(1-21) on ihmisen insuliinin A-ketju edellyttäen, että peptidiketju -Xn-Y- ei sisällä kahta vierekkäistä 34 89183 emäksistä aminohappotähdettä, tunnettu siitä, että hiivakan-taa, joka on transformoitu patenttivaatimuksen 3 mukaisella vektorilla, viljellään sopivassa ravintovällaineessa, minkä jälkeen insuliinin prekursori otetaan talteen sinänsä tunnetulla tavalla.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä kaavan B(1-29)-A(l-21) mukaisen insuliinin prekursorin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että hiivakantana käytetään kantaa DSM 2959.

6. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä kaavan B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(l-21) mukaisen insuliinin prekursorin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että hiivakantana käytetään kantaa DSM 3196.

7. Menetelmä ihmisen insuliinin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että hiivakantaa, joka on transformoitu patenttivaatimuksen 3 mukaisella vektorilla, viljellään sopivassa ra-vintoväliaineessa, minkä jälkeen ilmentynyt insuliinin prekursori otetaan talteen kasvunesteestä ja muutetaan ihmisen insuliiniksi sinänsä tunnetulla tavalla.

8. Ihmisen insuliinin prekursori, tunnettu siitä, että sillä on kaava B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A(l-21) tai B(1- 29)-Ser-Lys-A(l-21). jossa kaavassa B(l-29) on ihmisen insuliinin lyhennetty B-ketju ulottuen aminohaposta PheB1 aminohappoon Lys829 ja A(l-21) on ihmisen insuliinin A-ketju. li 35 89183