DK157938B - Dna-sekvens for insulinprecursorer, vektorer indeholdende denne sekvens, gaerstammer transformeret med disse vektorer samt en fremgangsmaade til fremstilling af insulinprecursorerne og en fremgangsmaade til fremstilling af humaninsulin - Google Patents

Description

DK 157938 B

Den foreliggende opfindelse angår DNA-sekvenser, der koder for insulinprecursorer, vektorer# der indeholder sådanne sekvenser, gærstammer transformeret med disse vektorer samt en fremgangsmåde til fremstilling af sådanne insulinprecursorer og en fremgangsmåde til fremstilling af humaninsulin.

2 DK 157938B

5

Insulin er tidligere blevet syntetiseret (fra syntetiske A- og B-kæder) eller re-syntetiseret (fra A- og B-kæder fra naturlige kilder) ved kombination af de to kæder i en oxidationsproces / hvorved de seks cysteinsulfhydrylgrupper i de reducerede 10 kæder (4 i A-kæden og 2 i B-kæden) omdannes til disulfidbroer.

Ved denne metode dannes disulfidbroerne i vid udstrækning tilfældigt, hvilket betyder, at udbyttet af insulin med korrekt anbragte disulfidbroer mellem henholdsvis cysteinresterne A-6 og A-ll, A-7 og B-7 og A-20 og B-19 er meget lav.

15 Efter opdagelsen af proinsulin som en biologisk precur sor for insulin blev det observeret, at A- og B-polypeptidkæderne i det lineært-kædede, totalt reducerede proinsulin (hvilke kæder svarer henholdsvis til A- og B-kæderne i insulin) kunne kombineres oxidativt med meget mindre vilkårlighed af disulfidbroerne 20 til opnåelse af væsentligt højere udbytte af korrekt foldet proinsulin i sammenligning med kombinationen af frie A- og B-kæder (D.F. Steiner et al.: Proc.Nat.Acad.Sci. 60 (1968), 622). Skønt der kun blev opnået høje udbytter ved proinsulinkoncentrationer for lave til at gøre processen gennemførlig i en præparativ ska- '· 25 la, blev funktionen af C-(d.v.s. connecting peptid)-kæden i B-C-A-polypeptidsekvensen af proinsulin tydeligt demonstreret, nemlig den funktion at bringe de seks cysteinrester i rumligt favorable positioner til en korrekt oxidation til proinsulin.

Det dannede proinsulin kan fungere som en in vitro pre-30 cursor for insulin derved, at "connecting"-peptidet kan fjernes ad enzymatisk vej (W. Kemmler et al.: j.Biol.Chem 246 (1971), 6786).

Det er siden blevet påvist, at proinsulinlignende forbindelser med kortere forbindende kæder end C-peptidet og flanke-' 35 ret ved begge ender af specifikke, enzymatiske eller kemiske spaltningssteder (de såkaldte miniproinsuliner (A. Wollmer et al., Hoppe-Seyler's Z. Physiol.Chem. 355 (11974), 1471 - 1476 og Dietrich Brandenburg et al., Hoppe-Seyler's Z.Physiol.Chem. 354 (1973), 1521 - 1524)) også kan tjene som insulinprecursorer.

J

Forsøg på at tilvejebringe biosyntetisk ^nsujli^J ^ insulin identisk med humaninsulin, har fulgt den samme strategi som til syntetisering af insulin. Insulin A- og B-kæderne er blevet udtrykt i separate værtsorganismer, isoleret derfra og 5 derpå kombineret som beskrevet ovenfor (R.E. Chance et al.: Diabetes Care 4 (1982), 147). Fremskaffelsen af A- og B-kæderne ved separate gæringsprocesser fulgt af en kombination af kæderne er ifølge sagens natur upraktisk.

De fordoblede gæringsomkostninger kan undgås ved at 10 vælge proinsulin- eller miniproinsulinstrategien.

Ved de første forsøg blev E. coli transformeret med kloningsvektorer, der koder for præproinsulin eller proinsulin, der kan udskilles som sådan (W. Gilbert et al.: Europæisk patentansøgning nr. 6694) eller akkumuleres intracellulært som hybride 15 genprodukter (D.V. Goeddel et al.: Europæisk patentansøgning nr. 55945). Miniproinsulinruten er også blevet forsøgt i E. coli, jfr. D.V. Goeddel, supra, og europæisk patentpublikation nr.

' 68701, der foreslår fremstilling af modificerede proinsuliner med et mere eller mindre forkortet C-peptid.

20 Disse metoder lider imidlertid af adskillige ulemper, der hovedsageligt beror på det faktum, at E. coli anvendes som værtsorganisme. Således skal spaltning, foldning og etablering af disulfidbroer ske in vitro, idet E. coli ikke er i stand til at maturere det udtrykte produkt. Intracellulær akkumulering vil 25 desuden forøge risikoen for enzymatisk nedbrydning af det udtrykte produkt.

Det er ligeledes forsøgt at fremstille insulin i gær ved at indføre et præproinsulingen indsat i en egnet vektor. Tanken var, at gær skulle være i stand til at udtrykke præproinsu-30 lin, som herefter ligesom i de humane celler skulle spaltes til proinsulin, hvorpå disulfidbroerne dannes, og slutteligt C-pep-tidet fraspaltes proteolytisk ved spaltning ved de to par basiske aminosyrer, der flankerer C-peptidet til dannelse af modent insulin, jfr. europæisk patentpublikation nr. 121884.

35 Det har imidlertid vist sig, at insulinprecursorer af

proinsulintypen, i hvilke to basiske aminosyrer flankerer C-peptidet, er følsomme overfor enzymatisk nedbrydning i gær, hvorfor der ved denne fremstillingsmetode slet ikke eller kun i meget lave udbytter opnås udskilt proinsulin eller modent insulin. I

4 gær er det blevet vist, at human proinsulin og proinsulinanaloger med et mere eller mindre forkortet C-peptid er særlS|£ fUps&ralnl 8 B overfor enzymatisk spaltning ved de to dibasiske sekvenser, der flankerer C-peptidregionen. Tilsyneladende sker disse spaltninger 5 før etableringen af S-S-broerne resulterende i dannelse af C-peptid, A-kæde og B-kæde.

Det er formålet med den foreliggende opfindelse at overvinde disse ulemper ved at tilvejebringe biosyntetiske insu-linprecursorer, der genereres med i vid udstrækning korrekt an-10 bragte disulfidbroer mellem A- og B-kæderne og som yderligere er væsentligt mere modstandsdygtige mod proteolytisk nedbrydning end de hidtil kendte biosyntetiske insulinprecursorer.

En enkeltkædet insulinprecursor bestående af en forkor-Bi B29 tet insulin B-kæde fra Phe til Lys , som fortsætter i en 15 fuldstændig A-kæde fra Gly til AsnA , B (1-29)-A( 1-21) er kendt (Jan Markussen, "Proteolytic degradation of proinsulin and of the intermediate forms",: Proceedings of the Symposium on Proinsulin, Insulin and C-Peptide, Tokushima, 12 - 14. Juli, 1978, Udgivere: S. Baba et al.). Insulinprecursoren B(l-29)-A(l-21) fremstilles 20 ved en semisyntetisk proces ud fra svineinsulin. Først fremstilles insulin B(l-29)- og A(1-21)kæderne og kobles til et lineært peptid B(1-29)-A(l-21). Forbindelsen oxideres i den hexathiole form in vitro til dannelse af det enkeltkædede des-(B30)-insulinmolekyle.

25 Den foreliggende opfindelse er baseret på den overras kende erkendelse, at den enkeltkædede insulinprecursor B(l-29)-A(l-21) og derivater deraf med en brokæde, der forbinder den C-terminale ende af B (1-29)-kæden med den N-terminale ende af A(l-21)-kæden udtrykkes i høje udbytter og med korrekt anbragte di-30 sulfidbroer ved dyrkning af gærstammer transformeret med DNA-sekvenser, der koder for sådanne insulinprecursorer. Beviset, for at de udtrykte insulinprecursorer har korrekt anbragte disulfidbroer, er, at precursorerne kan omdannes til et produkt, der er identisk med humaninsulin, jfr. de efterfølgende eksempler 14-18.

35 Ifølge sit første aspekt tilvejebringer den foreliggen de opfindelse en DNA-sekvens til brug i en gærvektor, hvilken sekvens består af en nukleotidkombination, som koder for en insulinprecursor med formlen

B(l-29)-(Xn-Y)m-A(l-21) I

5

DK 15 7 9 3 8 B

hvor er en peptidkæde med n aminosyrerester, Y er Lys eller

Arg, n er et helt tal fra 0 til 33, m er 0 eller 1, B(l-29) er en

Bl B29 forkortet B-kæde af human insulin fra Phe til Lys og A(1-21) er A-kæden af human insulin, idet dog peptidkæden -x -Y- ikke kan 5 indeholde to nabostillede basiske aminosyrerester (d.v.s. Lys eller Arg).

Foretrukne insulinprecursorer af formel I er B(l-29)-A(l-21), d.v.s. m=0 i formel I, og forbindelser med en relativt kort brokæde mellem B(1—29)— og A(1-21)-kæden.

10 Når m=l er n fortrinsvis 1-33, mere foretrukket 1-15, 1-8 eller 1-5 og mest foretrukket 1-3 eller 1-2. x udvælges fortrinsvis fra gruppen, der består af Ala, Ser og Thr, hvor de enkelte X'er er ens eller forskellige. Eksempler på sådanne foretrukne forbindelser er B(1-29)-Ser-Lys~A(1-21) og B(l-29)-Ala-15 Ala-Lys-A(l-21).

Ifølge sit andet aspekt tilvejebringer den foreliggende opfindelse en i gær replicerbar vektor, der er i stand til at udtrykke en DNA-sekvens, der koder for insulinprecursorer med formlen (I) .

20 Vektoren er et plasmid, der er i stand til at replice res i gær.

Ifølge et tredje aspekt tilvejebringer den foreliggende opfindelse en fremgangsmåde til fremstilling af insulinprecursorer med formel I i"gær, ved hvilken en transformeret gærstamme, 25 der indeholder et plasmid, der er i stand til at udtrykke insulinpr ecur sorerne, dyrkes i et passende næringsmedium efterfulgt af isolering af insulinprecursorerne.

Ifølge et fjerde aspekt tilvejebringer den foreliggende opfindelse en gærstamme transformeret med en vektor, der er i 30 stand til at udtrykke en DNA-sekvens, der koder for insulinpre-cursorerne i gær.

Insulinprecursorerne kan udtrykkes med yderligere protein forud for insulinprecursoren. Det yderligere protein kan have til funktion at beskytte insulinprecursoren mod f.eks. in 35 vivo nedbrydning med organismens egne enzymer eller kan have til funktion at tilvejebringe den nødvendige information til at transportere det ønskede protein ind i det periplasmiske hulrum og til slut over cellevæggen ud i mediet.

6

DK 157938B

Det yderligere protein indeholder et selektivt spaltningssted, der støder op til N-terminalen af B(1-29)-kæden af insulinprecursoren, hvorved der sikres en senere fraspaltning af det yderligere protein enten af mikroorganismen selv eller ved 5 senere enzymatisk eller kemisk spaltning.

Når insulinprecursorerne udtrykkes i gær , kan den yderligere aminosyresekvens indeholde to basiske aminosyrer (f.eks. Lys-Lys, Arg-Arg, Lys-Arg eller Arg-Lys) stødende op til N-terminalen af B(1-29)-kæden af insulinprecursoren, idet gær er 10 i stand til at spalte peptidbindingen mellem de basiske aminosyrer og precursoren. Også et Glu-Ala eller Asp-Ala-spaltnings-sted stødende op til det ønskede protein tilvejebringer en fra-skillelse af den yderligere aminosyresekvens ved hjælp af gæren selv ved hjælp af et dipeptidaseenzym, som produceres af gæren.

15 Insulinprecursorerne kan udskilles med en aminosyrese kvens knyttet til B(1-29)-kæden af precursoren, forudsat at denne aminosyresekvens indeholder et selektivt spaltningssted stødende op til B(1-29)-kæden til senere fraspaltning af den overflødige aminosyresekvens. Da insulinprecursorerne ikke indeholder methio-20 nin, vil cyanogenbromidspaltning ved methionin stødende op til det ønskede protein være operativt. På samme måde tilvejebringer arginin- og lysin-spaltningssteder stødende op til det ønskede protein spaltning med trypsinlignende proteaser.

For at tilvejebringe udskillelse kan DNA-sekvensen, der 25 koder for insulinprecursorerne, forbindes med en yderligere DNA-sekvens, der koder for et signalpeptid, signalpeptidet spaltes fra af den transformerede mikroorganisme under udskillelsen af det udtrykte proteinprodukt fra cellerne, hvorved der sikres en mere enkel isolering af det ønskede produkt. Det udskilte produkt 30 kan være insulinprecursoren eller kan indehold en yderligere N-terminal aminosyresekvens, der skal fjernes senere som forklaret ovenfor.

Udskillelse kan tilvejebringes ved i vektoren at indsætte gær MFal-leadersekvensen (Kurjan, J. og Herskowitz, I., 35 Cell 30, (1982), 933 - 943).

Udtrykkeisen af den ønskede DNA-sekvens vil være under kontrol af en promotorsekvens, der er korrekt anbragt i forhold til DNA-sekvensen, som koder for det ønskede proteinprodukt, hvorved det ønskede protein udtrykkes i værtsorganismen. Der kan 7

DK 157938 B

fortrinsvis anvendes en promotor fra et gen, der er hjemmehørende i værtsorganismen. DNA-sekvensen af det ønskede protein vil være efterfulgt af en transscriptionsterminatorsekvens, fortrinsvis en terminatorsekvens fra et gen, der er hjemmehørende i værtsorga-5 nismen. Foretrukne promotor- og terminatorsekvenser er henholdsvis promotoren og terminatoren for triosephosphatisomerase (TPI)-genet.

Der kan også anvendes andre promotorer, såsom phospho-glyceratkinase (PGK1)- og MFal-promotoren.

10 Den foreliggende opfindelse tilvejebringer yderligere en fremgangsmåde til fremstilling af human insulin, ved hvilken en gærstamme transformeret med en replicerbar vektor, der indeholder en DNA-sekvens, der koder for insulinprecursorerne med den ovennævnte formel I, dyrkes i et egnet næringsmedium, insulin-15 precursorerne udvindes fra dyrkningsmediet og omdannes in vitro til human insulin.

De ved fremgangsmåden fremstillede insulinprecursorer kan omdannes til humaninsulin ved transpeptidering med en L-threoninester i nærværelse af trypsin eller et trypsinderivat, 20 som beskrevet i beskrivelsen til dansk patentansøgning nr. 574/80 efterfulgt af omdannelse af threoninesteren af humaninsulin til humaninsulin på kendt måde.

Hvis insulinprecursorerne udskilles med en yderligere aminosyresekvens hæftet på N-terminalen af B(1-29)-kæden, bør en 25 sådan aminosyresekvens enten fjernes in vitro før transpeptideringen eller bør indeholde mindst en basisk aminosyre stødende op til N-terminalen af B( 1-29)-kæden, da trypsin vil spalte peptid-bindingen mellem den basiske aminosyre og aminogruppen i Phe under transpeptideringen.

30 Opfindelsen skal forklares nærmere under henvisning til tegningen på hvilken 8 fig. 1 viser fremstillingen af plasmid ^ ® fig. 2 viser fremstillingen af plasmid pMT475, fig. 3 viser fremstillingen af plasmid pMT212, fig. 4 viser fremstillingen af plasmid pMT479r 5 fig. 5 viser fremstillingen af plasmid pMT319f fig. 6 viser fremstillingen af plasmid pMT598, fig. 7 viser fremstillingen af plasmid pMT610, fig. 8 viser fremstillingen af plasmid pT5 og fig. 9 viser fremstillingen af plasmid pMT639.

10 I tegningerne og i dele af den følgende beskrivelse an vendes udtrykket B' i stedet for B(l-29) og A i stedet for A(l-21). Udtrykket B'A er følgelig ækvivalent med udtrykket B(l-29)-A(l-21).

15 1. Fremstilling af et gen, der koder for humanproinsulin B-C-A Helt oprenset RNA (Chirgwin, J.M. Przybyla, A.E., McDonald, R.J. & Rutter, W.J., Biochemistry 18, (1979) 5294 -5299) fra humanpancreas blev reverstransskriberet (Boel, E.,

Vuust, J., Norris, F., Norris, K., Wind, A., Rehfeld, J.F. & 20 Marcker, K.A., Proc.Natl.Acad.Sci. USA 80, (1983), 2866 - 2869) med AMV reverstransskriptase og d(GCTTTATTCCATCTCTC) som 1. strengsprimer. Efter præperativ urinstofpolyacrylamidgeloprens-ning af humanproinsulin-cDNA blev den anden streng syntetiseret på denne templat med DNA polymerase stort fragment og e 25 d(CAGATCACTGTCC) som andenstrengsprimer. Efter Si nucleasefor-døjelse blev humanproinsulin dobbeltstrenget cDNA oprenset ved polyacrylamidgelelektroforese, enden blev dannet med terminal transferase og dobbeltstrenget cDNA blev klonet i Pstl-stedet på pBR327 (Sorberon et al., Gene 9, (1980), 287 - 305) i E. coli. En 30 korrekt klon, der indeholder et plasmid, der koder for humanproinsulin blev identificeret blandt rekombinanterne ved hjælp af restriktionsendonucleaseanalyse og bekræftet ved nucleotidsekven-tering (Maxam, A., & Gilbert, W., Methods in Enzymology, 65 (1980), 499 - 560. Sanger, F., Nicklen, S. & Coulson, A.R., 35 Proc.Natl.Acad.Sci. USA 74, (1977), 5463 - 5467).

9 2. Fremstilling af gener, der koder for humaninsulQip^:ec^r^<^:^r^ ^

Genet, der koder for B(1-29)-A(1-21) af humaninsulin blev fremstillet ved "site specific mutagenesis" af humanproinsu-linsekvensen med en 75bp i ramme deletion i den region, der koder 5 for C-peptidet, indsat i en cirkulær, enkeltstrenget M-13 bakte-riophag vektor. En modificeret fremgangsmåde (K. Norris et al., Nuel.Acids.Res. 11 (1983) 5103 - 5112) blev anvendt, ved hvilken en kemisk syntetiseret 19-mer deletionsprimer blev hybridiseret til M-13 templaten. Efter en kort enzymatisk forlængningsreaktion 10 blev der tilsat en "universal" 15-mer M-13 dideoxysekventerings-primer efterfulgt af enzymatisk forlængning og ligering. Et dobbeltstrenget restriktionsfragment (BamHl-Hind III) blev skåret ud af det delvist dobbeltstrengede cirkulære DNA og ligeret i pBR322, der var skåret med BamHI og Hind III.

15 Den opnåede ligeringsblanding blev anvendt til at transformere E. coli, og transformanter indeholdende et plasmid pMT319 indeholdende genet kodende for B(1-29)-A(1-21) af humaninsulin blev identificeret.

Gener, der koder for B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21) og 20 B(1-29)-Ser-Lys-A(1-21) blev fremstillet ved indsættelse af et fragment, der koder for MFal-B-C-A i M-13 bakteriophagen og site specific mutagenesis af den humane proinsulinsekvens med henholdsvis kemisk syntetiseret 30-mer og 27-mer deletionsprimere og den førnævnte "universelle" 15-mer M13 dideoxysekventerings-25 primer. Et dobbeltstrenget restriktionsfragment (Xbal-EcoRl) blev skåret ud af det delvist dobbeltstrengede cirkulære DNA og ligeret til henholdsvis pUCl3 og pT5. Ved transformering og retrans-formering af E. coli blev der identificeret transformanter med et plasmid pMT598 indeholdende genet, der koder for B(l-29)-Ala-30 Ala-Lys-A(l-21), og pMT630 indeholdende genet, der koder for B(1-29)-Ser-Lys-A(1-21) .

Et gen, der koder' for B(l-29)-Thr-Arg-Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-Lys-A(l-21) blev fremstillet på samme måde som ovenfor beskrevet ved indsættelse af et fragment, der koder for MFal-35 B(1-29)-A(l-21) i en M13 mpll bakteriophag og site specific mutagenesis af B(1-29)-A( 1-21)-sekvensen med en kemisk syntetiseret 46-mer deletionsprimer (5'-CACACCCAAGACTAAAGAAGCTGAAGACTTGCAAAGAGGCATTGTG-3') og den universelle primer. Ligeledes blev ved en lignende fremgangsmåde 10

DK 157938 B

fremstillet et gen, der koder for B(l-29)-Thr-Arg-Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-Val-Gly-Gln-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-Gln-Lys-A(l-21).

5 3. Plasmidkonstruktioner

Genet kodende for B(1-29)-A(1-21) af humaninsulin (ΒΆ) blev isoleret som et restriktionsfragment fra pMT319 og kombineret med fragmenter kodende for TPI-promotoren (TPIp) (T. Alber og G. Kawasaki. "Nucleotide Sequence of the Triose Phosphate Isome-10 rase Gene of Saccharomyces cerevisiae." J.Mol.Applied Genet. 1 (1982) 419 - 434), MFal leader sekvensen (J. Kurjan and I. Herskowitz,. Structure of a Yeast Pheromone Gene (MFa): "A Putative α-Factor Precursor Contains four Tandem Copies of mature α-Factor," Cell 30 (1982) 933 - 943) og transskriptionstermine-15 ringssekvensen fra TPI fra S. cerevisiae (TPIT). Disse fragmenter tilvejebringer sekvenser til at sikre en høj hyppighed af transskription af det B'A-kodende gen og tilvejebringer også en præ- , sekvens, der kan bevirke lokalisering af B'A i sekretionsvejen og dens eventuelle udskillelse i vækstmediet. Denne udskillelses-20 enhed for ΒΆ (TPIp-MFal leader - ΒΆ - TPI^) blev derpå indsat i en plasmidvektor, der indeholder gær 2μ replikationsinitierings-sitet og en selekterbar markør, LEU 2, til dannelse af pMT344, en gærudtrykkeIsesvektor for B'A.

Ved in vivo modning af α-faktor i gær fjernes de sidste 25 (C-terminale) seks aminosyrer af MFal leaderpeptidet (Lys-Arg-Glu-Ala-Glu-Ala) fra a-faktorprecursoren ved sekvensvis virkning af en endopeptidase, der genkender Lys-Arg sekvensen, og en aminodipeptidase, der fjerner Glu-Ala-aminosyreresten (Julius, D. et al. Cell 32 (1983) 839 - 852). For at eliminere behovet for 30 gæraminodipeptidasen, blev den sekvens, der koder for C-termina-len Glu-Ala-Glu-Ala i MFal-leaderen fjernet fra pMT344 via in vitro mutagenese. Det fremkomne gærudtrykkelsesplasmid, pMT475, indeholder en indsat del, der koder for TPIp-MFal-leader (minus Glu-Ala-Glu-Ala) -ΒΆ-ΤΡΙΤ.

35 I en foretrukket konstruktion blev den modificerede udtrykkelsesenhed overført til et stabilt, højkopitalsgærplasmid CPOT, (ATCC nr. 39685), der kan selekteres for udelukkende ved tilstedeværelsen af glucose i vækstmediet. Den fremkomne gærud-trykkelsesvektor for B'A blev benævnt pMT479.

11

DK 157 9 3 8 B

Fragmenter, der koder for MFal-leaderen (minus Glu-Ala-Glu-Ala)-B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21) blev isoleret som et restriktionsfragment fra pMT598 og sat sammen med fragmenter, der koder for TPI-promotoren og TPI-terminatoren, og overført til det 5 før nævnte højkopitalsgærplasmid CPOT. Den fremkomne gærudtryk-kelsesvektor for B{1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21) blev kaldt pMT610.

Fragmentet, der indeholder den indsatte TPIp-MFal-leader (minus Glu-Ala-Glu-Ala)-B(1-29)-Ser-Lys-A(1-21J-TPI^ blev isoleret som et restriktionsfragment fra pMT630 og overført til 10 CPOT. Den fremkomne gærudtrykkelsesvektor for B(l-29)-Ser-Lys-A(l-21) blev kaldt pMT639.

Fragmentet, der indeholder den indsatte sekvens TPIp-MFal-leader (minus Glu-Ala-Glu-Ala)-B(1-29)-Thr-Arg-Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-Lys-A(l-21)-TPIT blev indsat i et højkopitalsgær-15 plasmid DPOT, som er et CPOT-derivat, indeholdende et Sphl-

BamHI-fragment af pBR322 indsat i et SpHl-BamHI-fragment af CPOT. Den fremkomne gærudtrykkelsesvektor for B(l-29)-Thr-Arg-Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-Lys-A(l-21) blev kaldt pll26.

20 4. Transformering

Plasmiderne pMT344 og pMT475 blev transformeret i S. cerevisiae leu 2 mutanter ved hjælp af selektion for leucin-prototrofi som beskrevet af Hinnen et al. (A. Hinnen, J.B. Hicks 25 og G.R. Fink, "Transformation of Yeast", Proc.Nat.Aca.Sci. 75 (1978) 1929).

Plasmidet pMT479, pMT610, pMT639 og pll26 blev transformeret i S. cerevisiae stammer, der har deletioner i TPI-genet, ved selektering for vækst på glucose. Sådanne stammer er normalt 30 ude af stand til at gro på glucose som den eneste kulstofkilde og gror meget langsomt på et galactoselactatmedium. Denne defekt skyldes en mutation i triosephosphatisomerasegenet, opnået ved en deletion og erstatning af en væsentlig del af dette gen med S. cerevisiae LEU 2 genet. På grund af vækstdefekten er der en stærk 35 selektering for et plasmid, der indeholder et gen, som koder for TPI. CPOT og DPOT indeholder Schizo.pombe TPI genet.

DK 157938B

5. Udtrykkelse af humaninsulinprecursorer i gær

Udtrykkelsesprodukterne af humaninsulintypen blev målt ved radioimmunoassay for insulin som beskrevet af Heding, L. (Diabetologia 8f 260 - 66, 1972) med den eneste undtagelse, at 5 den pågældende insulinprecursorstandard blev anvendt i stedet for en insulinstandard. Renheden af standarderne var ca. 98% bestemt ved HPLC, og den aktuelle koncentration af peptidet i standarden blev bestemt ved aminosyreanalyse. Udtrykkelsesmængderne af immunoreaktive humaninsulinprecursorer i de transformerede gær-10 stammer er angivet i tabel I.

Tabel 1

Udtrykkelsesniveauer for immunoreaktive humaninsulinprecursorer i 15 gær__________

Immunoreaktive insulinprecur sorer Gærstamme Plasmid Konstruktion (nmol/liter _ supernatant)_ 20 MT 350 (DSM 2957) pMT 344 B(1-29)-A( 1-21) 100 MT 371 (DSM 2958) pMT 475 B(1-29)-A(1-21) 192 MT 519 (DSM 2959) pMT 479 B( 1-29 )-A( 1-21) 2900 MT 620 (DSM 3196) pMT 610 B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A(l-21) 1200 - 1600 MT 649 (DSM 3197) pMT 639 B(1-29)-Ser-Lys-A( 1-21) 1600 25 ZA 426 p 1126 B (1-29) -Thr-Arg-Glu-Ala-Glu- 200

Asp-Leu-Gln-Lys-A(1-21) B(1-29)-Gly-Ser-Lys-A( 1-21) 1260 B (1-29) -Thr-Leu-Lys-A (1-21) 670 B (1-29) -Asp-Thr-Lys-A (1-21) 2900 30 B( 1-29)-His-Thr-Lys-A( 1-21) 580 B (1-29) -Asp-Ala-Lys-A (1-21) 2500 B( 1-29 )-Asp-Gly-Lys-A( 1-21) 3340 B (1-29) -Ser-Ser-Glu-Asn-Thr- 620

Trp-Asp-Lys-A (1-21) 35 B (1-29) -Gly-Ala-Gly-Pro-Thr- 880

Pro-Gly-Lys-A( 1-21) B (1-29) -Val-Pro-Pro-Val-Thr- 560

Glu-Asp-Lys-A (1-21) * 13

DK 157938 B

Isoleringen og karakteriseringen af udtrykkelsesproduk-ter er angivet i eksemplerne 7 - 9 og 12 - 13.

6. Omdannelse af humaninsulinprecursorerne til B30 estere af 5 humaninsulin

Omdannelsen af humaninsulinprecursorerne til humaninsu-linestere kan følges kvantitativt ved HPLC (højtryksvæskekromatografi) på omvendt fase. En 4 x 300 mm '^Bondapak C18 kolonne" (Waters Ass.) blev anvendt, og elueringen blev udført med en 10 puffer, der indeholdt 0,2 M ammoniumsulphat (indstillet til en pH-værdi på 3,5 med svovlsyre) og indeholdende 26 - 50% aceto-nitril. Den optimale acetonitrilkoncentration afhænger af, hvilken ester man ønsker at fraskille fra insulinprecursoren. I tilfælde af humaninsulinmethylester opnås fraskillelsen i ca. 26% 15 (v/v) acetonitril.

Før påføringen på HPLC kolonnen blev proteinerne i reaktionsblandingen udfældet ved tilsætning af 10 rumfang acetone. Bundfaldet blev isoleret ved centrifugering, tørret i vakuum og opløst i 1 M eddikesyre-.

20

Eksempel 1

Konstruktion af et gen, der koder for B(1-29)-A(1-21) insulin s' 25 Materialer og metoder

Den "universelle" 15-mer M13 dideoxysekventeringsprimer d(TCCCAGTCACGACGT), T4 DNA-ligase og restriktionsenzymer blev opnået fra New England Biolabs. DNA-polymerase I "Klenow

fragment" og T4-polynucleotidkinase, blev købt hos P-L

32 30 Biochemicals. (γ- P)-ATP (7500 Ci/nmol) blev opnået fra New

England Nuclear. Supporten for oligonucleotidsyntesen var 5'-0- 2 dimethoxytrityl-N -isobutyryldeoxyguanosin bundet via en 3'-0-succinylgruppe til aminomethyleret 1% tværbundne polystyrenpiller fra Bachem.

35 14

Konstruktion af M13 mplO insHX^Pst fag DK 157938 B

Den M13 mplO afledte fag mplO insHX blev konstrueret ved kloning af det 284 bp store proinsulinkodende Hind III-XbaI-fragment, isoleret fra p285, i Hind III-XbaI skåret M13 mplO RF.

5 M13 mplO RF kan fås fra P-L Biochemicals, Inc. Milwaukee, Wis. (Katalog nr. 1541).

M13 mplO insHX^Pst blev konstrueret fra mplO insHX, RF ved fuldstændig Pstl-fordøjelse efterfulgt af ligering og transformering af E. coli JM103. Den resulterende fag indeholder den -10 humanproinsulinkodende sekvens, med en 75 bp i ramme deletion i den C-peptidkodende del. Enkeltstrengede fag blev fremstillet som beskrevet af Messing.J. og Vieira, J., (1982), Gene 19, 269 -276).

15 Oligodeoxyribonukleotidsyntese 19-mer deletionsprimeren d(CACACCCAAGGGCATTGTG) blev syntetiseret ved triestermetoden på en 1% tværbundet polystyrensupport (Ito, H., Ike, Y., Ikuta, S. og Itakura, K. (1982) j''

Nucl.Acids Res. 10, 1755 - 1769). Polymeren blev pakket i en kort 20 kolonne, og opløsningsmidler og reagenser blev leveret semi- automatisk ved hjælp af en HPLC-pumpe og et kontrolmodul. Oligo-nucleotidet blev oprenset efter deprotektion ved HPLC på en LiChrosorb RP18 kolonne (Chrompack (Fritz, H.-J., Belagaje, R., Brown, E.L., Fritz, R.H., Jones, R.A., Lees, R.G. og Khorana, 25 H.G. (1978) Biochemistry 17, 1257 - 1267)).

DK 157938B

Til kolonihybridisering blev oligonukleotidet mærket uden tilsætning af "kold" ATP som beskrevet (Boel, E., Vuust, J., Norris, F., Norris, K., Wind, A., rehfeld, J. og Marcker, K.

(1983) Proc.Natl.Acad.Sci. USA 80, 2866 - 2869).

5

Oligodeoxyribonukleotid- "pr imed"-DNA-syntese

Enkeltstrenget M13 mplO insHXAPst (0,4 pmol) blev 32

inkuberet med den 19-mer 5'—( P)-mærkede oligodeoxyribonukleo-tidprimer (10 pmol) i 20 μΐ 50 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 10 mM MgCl2 og 1 mM DDT i 5 min. ved 55°C og opvarmet i 30 minutter ved 11°C. Derpå blev 9 μΐ d-NTP-blanding bestående af 2,2 mM af hver dATP, dCTP, dGTP, dTTP, 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl2, 50 mM NaCl, 1 mM DDT tilsat efterfulgt af 7 enheder E. coli DNA-polymerase I (Klenow). Blandingen blev holdt ved 11 °C i 30 minut-15 ter og opvarmet til 65°C i 10 minutter. Den universelle 15-mer primer for dideoxysekventering (4 pmol) blev tilsat, og blandingen blev opvarmet til 65°C i yderligere ét minut. Efter afkøling til 11°C blev der tilsat 26 μΐ af en opløsning indeholdende 20 mM

Tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgCl-, 10 .mM DTT, 0,8 mM af hver dATP, 1 3 20 dCTP, dGTP, dTTP, 2,4 mM ATP og 10 enheder T4 ligase efterfulgt af 9,5 enheder E. ooli DNA-polymerase I (Klenow). Slutrumfanget af blandingen var 64 μΐ. Efter inkubering i 3 timer ved 11°C blev der tilsat 20 μΐ 4M natriumacetat, og rumfanget blev indstillet til 200 μ I·* med TE-puffer (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM 25 EDTA).

Blandingen blev ekstraheret to gange med phenol/chloro-form. 0,9 μg (0,3 pmol) af det oprensede store fragment af pBR322 spaltet med BamHI og Hind III blev tilsat som bærer-DNA. Efter æterekstraktion af den vandige fase blev DNA isoleret ved 30 ethanoludfældning.

Endonukleasefordøjelse

DNA, fremstillet som beskrevet ovenfor, blev fordøjet henholdsvis med 16 og 20 enheder af restriktionsendonukleaserne 35 BamHI og Hind III i et totalt rumfang af 22 μΐ puffer (50 mM

NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl2# 1 mM DDT, 4 mM spermi-din). Blandingen blev ekstraheret med fenol/chloroform efterfulgt 16 at æter, og DNA blev isoleret ved ethanoludfældninP^

løst i 12 μΐ H20. 2 μΐ blev anvendt til elektroforese på en 7 M

urinstof 6% polyacrylamid gel.

5 Ligering

Til en del af DNA (5 μΐ) blev der sat en ny portion af det oprensede store fragment af pBR322 skåret med BamHI og Hind III (0,38 μg) og 400 enheder T4 DNA ligase i et totalt rumfang på 41 μΐ indeholdende 66 mM Tris-HCl, pH 7,4, 10 mM MgCl2, 1 mM ATP, 10 10 mM DDT, 40 μg/ml gelatine. Ligeringen blev udført ved 16°C i 16 timer.

Transformering 20,5 μΐ af ligeringsblandingen blev anvendt til at 15 transformere CaCl2 behandlet E.coli MC 1000 (r , m+). Bakterierne blev udspredt på LB-agarplader og selekteret for resistens mod ampicillin (100 μg/ml). Der blev opnået 2,6 x 10^ kolonier pr. pmol M13 mplO insHX Pst.

20 Kolonihybridisering 123 transformerede kolonier blev overført til friske ampicillinplader og dyrket natten over ved 37°C. Kolonierne blev overført til Whatman 540 filtrerpapir og fikseret (Gergen, J.P.,

Stern, R.H. og Wensink, P.C. (1979), Nucl.Acids Res. 7, 2115 - 25 2136). En præhybridisering blev udført i en lukket plastikpose med 6 ml 0,9 M NaCl, 0,09 M Tris-HCl pH 7,5 0,006 M EDTA, 0,2%

Ficoll, 0,2% polyvinylpyrrolidon, 0,2% okseserumalbumin, 0,1% SDS

og 50 μg/ml laksesperm DNA i to timer ved 65°C. Derpå blev der 6 32 tilsat 8,5 x 10 cpm P-mærket 19-mer, og hybridiseringen blev 30 udført natten over ved 45°C. Filtratet blev vasket 3 gange ved 0°C i 5 minutter med 0,9 M NaCl, 0,09 M natriumcitrat og blev derpå autoradiograferet og vasket en gang ved 45°C i et minut og autoradiograferet igen. Efter vask ved 45°C blev der identificeret 3 kolonier, der indeholdt muterede plasmider.

35

Endonukleaseanalyse af muterede plasmider

Plasmider fra de formodede muterede kolonier blev fremstillet ved rapidmetoder (Ish-Horowicz, D. og Burke, J.F. (1981), Nucl.Acids Res. 9, 2989 - 2998) fordøjet med en blanding af BamHI

DK 157938B

og Hind III og derpå analyseret ved elektroforese på en 2% agarosegel. Tilstedeværelsen af et 179 bp fragment bekræftede, at de 3 kolonier indeholdt muteret plasmid.

5 Retransformering

Kolonierne identificeret som "mutant"-holdige plasmider er afkommet af en heteroduplex. Rene mutanter kunne opnås ved retransformering af CaC^-behandlet E. coli MC1000 (r , m+) med plasmid fra 2 af mutantkolonierne. Fra hver plade blev der isole-10 ret 5 ampicillinresistente kloner, plasmid-DNA blev fremstillet og analyseret ved endonucleasespaltning som nævnt ovenfor. Henholdsvis 3 ud af 5 og 5 ud af 5 påvistes at være rene mutanter.

Et plasmid pMT319 blev udvalgt til videre anvendelse.

15 DNA-sekvensanalyse 5 μg pMT319 blev spaltet med BamHI under standardbetingelser, ekstraheret med fenol og udfældet med ethanol. Udfyldning af de BamHI-cohæsive ender blev udført med Klenow DNA-polymerase 32 I, dCTP, dGTP, dTTP og a- P-dATP.· 20 Efter ekstraktion med fenol og udfældning med ethanol 32 blev DNA fordøjet med EcoRI. Det -P mærkede fragment med deletionen blev oprenset ved elektroforese på en 2% agarosegel og sekventeret ved Maxam-Gilbertmetoden (Maxam, A. og Gilbert, W (1980) Methods in Enzymology 65, 499 - 560) 25

Eksempel 2

Konstruktion af et gærplasmid pMT344 til udtrykkelse af B(l-29)-A(l-21) af humaninsulin (B'A) 30 Plasmid pMT319, der indeholder genet kodende for B'A og er konstrueret som beskrevet ovenfor, blev skåret med restriktionsenzymerne Hind III og Xbal, og et 0,18 kb fragment blev isoleret (T. Maniatis, E.F. Fritsch og J. Sambrook, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Press 1982) fra en 2% agarose gel. På 35 lignende måde blev et fragment (6,5 kb Xhol - Hind III) indeholdende S. cerevisiae TPI-promotoren (TPlp) (T. Alber og G.

Kawasaki, "Nucleotide Sequence of the Triose Phosphate Isomerase Gene of Saccharomyces cerevisiae", J.Mol. Applied Genet. 1 (1982) 419 - 434) og MFal-leadersekvensen (J. Kurjan og I. Herskowitz, 18

DK 157938B

"Structure of a Yeast Pheromone Gene (MFa): A Putative a-Factor Precursor Contains four Tandem Copies of Mature α-Factor", Cell 30 (1982) 933 - 943) isoleret fra plasmid p285. p285 indeholder den indsatte sekvens TPIp-MFal-leader-B-C-A- TPI^, og er deponeret 5 i gærstamme Z33 (ATCC nr. 20681). Et fragment (0,7 kb Xbal -BamHI) indeholdende TPI-transskriptionstermineringssekvenserne (TPIT) (T. Alber og G. Kawasaki, "Nucleotide Sequence of the Triose Phosphate Isomerase Gene of Saccharomyces cerevisiae", J. Mol. Applied Genet. 1 (1982) 419 - 434) blev også isoleret fra· 10 p285. Endelig blev et 5,4 kb Xhol - BamHI fragment isoleret fra gærvektoren YEP13 (J.R. Broach, "Construction of High Copy Yeast Vectors Using 2 μιη Circle Sequences", Methods Enzymology 101 (1983) 307 - 325). De ovennævnte fire fragmenter blev ligeret (T. Maniatis, E.F. Fritsch, og J. Sambrook, "Molecular Cloning," Cold 15 Spring Harbor Press 1982) og transformeret i E. coli (T.

Maniatis, E.F. Fritsch og J. Sambrook, "Molecular Cloning ", Cold Spring Harbor Press 1982), idet der blev selekteret for ampicillin resistens. Plasmider blev isoleret fra transformanter-ne, og strukturen af en af disse, pMT344, blev verificeret ved 20 hjælp af restriktionsmapning. Fremstillingen og de væsentlige egenskaber af pMT344 er beskrevet i fig. 1.

Eksempel 3 25 Konstruktion af et gærplasmid pMT475 til udtrykkelse af B(l-29)-A(l-21) af humaninsulin (B'A) efter en modificeret MFal-leader.

Til konstruktion af et plasmid til udtrykkelse af B'A efter en MFal-leader (J. Kurjan og I. Herskowitz, "Structure of a Yeast Pheromone Gene (MFa): A Putative α-Factor Precursor 30 Contains four Tandem Copies of Mature α-Factor", Cell 30 (1982) 933 - 943), der mangler sine sidste fire aminosyrer (Glu Ala Glu Ala), blev 0,14 kb Xbal - EcoRII-fragmentet indeholdende A- og en del af B'-sekvensen isoleret fra pMT319. På samme måde blev den 5' proximale del af B'-genet isoleret fra et 0,36 kb EcoRI -35 EcoRII-fragment fra pM215. Dette plasmid pM215 blev konstrueret ved subkloning af EcoRI - Xbal-fragmentet indeholdende proinsulin-B-C-A-genet fra p285 i pUC13 (konstrueret som beskrevet for pUC8 og pUC9 af Vieira et al., Gene 19: 259 - 268 (1982)) og efterfølgende in vitro loop-out fjernelse af de 12 baser, der

19 DK 157938B

koder for Glu-Ala-Glu-Ala ved sammenføjningen mellem MFal-leaderen og proinsulin B-C-A-genet. Disse to stykker, der dækker B'A-genet, blev ligeret til pUCl3-vektoren fordøjet med EcoRI -Xbal (jrf. fig. 2) til dannelse af pMT473. Det modificerede gen, 5 der var indeholdt i et 0,5 kb EcoRI - Xbal-fragment, blev isoleret fra pMT473 og derpå ligeret til to fragmenter (4,3 kb Xbal -EcoRV og 3,3 kb EcoRV - EcoRI) fra pMT342. pMT342 er gærvektoren pMT212 med den indsatte sekvens TPIp-MFal-leader-B-C-A-TPIT. Det fremkomne plasmid, pMT475, indeholder den indsatte sekvens: 10 TPIp-MFal-leader-(minus Glu-Ala-Glu-Ala) - ΒΆ-ΤΡΙΤ. Konstruktionen af plasmiderne pMT342, 473 og 475 er beskrevet i fig. 2. Konstruktionen af vektoren pMT212 er vist i fig. 3. Plasmidet pMLB1034 er beskrevet af M.L. Berman et al., Advanced Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor (1982), 49 - 51, og pUCl2 blev kon-15 strueret som beskrevet for pUCl3 (Vieira et al., ibid.).

Eksempel 4

Indføring af B(l-29)-A(l-21) (B'A)-genet i et stabilt gærplasmid 20 pMT479

Det modificerede ΒΆ-gen fra pMT475 blev isoleret som et 2,1 kb BamHI-partielt Sphl-fragment og ligeret til et ca. 11 kb BamHI - Sphl-fragment af plasmid CPOT (ATCC No. 39685) til dannelse af plasmid pMT479 (fig. 4). Plasmid CPOT er baseret på 25 vektoren Cl/1, der er blevet modificeret ved at erstatte det originale pBR322 Bgll - BamHI-fragment med det lignende Bgll -BamHI-fragment fra pUC13 og efterfølgende indføring af S.pombe-TPI-genet (EP patentansøgning nr. 85303702.6) som et BamHI -Sall-fragment til dannelse af CPOT. Cl/1 er afledt fra pJDB248, 30 Beggs et al., Nature 275, 104 - 109 (1978) som beskrevet i EP patentansøgning 0103409A.

Eksempel 5 35 Transformering S. cerevisiae stamme MT118 (a, leu 2, ura 3, trp 1) blev dyrket på YPD-medium (Sherman et al., Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, 1981) til ODgoo 2,1. 100 ml kulturvæske blev høstet ved centrifugering, vasket med 10

DK 157938B

ml vand, recentrifugeret og resuspenderet i 10 ml 1,2 M sorbitol, 25 mM Na2EDTA pH= 8,0, 6,7 mg/ml dithiotreitol. Suspensionen blev inkuberet ved 30°C i 15 minutter og centrifugeret, og cellerne blev resuspenderet i 10 ml 1,2 M sorbitol, 10 mM 5 Na2EDTA, 0,1 M natriumcitrat pH = 5,8 og 2 mg Novozym®234.

Suspensionen blev inkuberet ved 30°C i 30 minutter, cellerne blev opsamlet ved centrifugering, vasket i 10 ml 1,2 M sorbitol og i 10 ml CAS (1,2 M sorbitol, 10 mM CaCl2* 10 mM Tris (Tris =

Tris(hydroxymethyl)-aminometan) pH = 7,5) og resuspenderet i 2 ml 10 CAS. Til transformering blev 0,1 ml af de CAS-resuspenderede celler blandet med ca. 1 μg plasmid pMT344 og henstillet ved stuetemperatur i 15 minutter. Derpå blev der tilsat 1 ml 20% polyethylenglycol 4000, 10 mM CaCl2, 10 mM Tris pH = 7,5, og blandingen blev henstillet i yderligere 30 minutter ved stuetem-15 peratur. Blandingen blev centrifugeret og pillerne resuspenderet i 0,1 ml SOS (1,2 M sorbitol, 33% v/v YPD, 6,7 mM CaCl2, 14 μg/ml leucin) og inkuberet ved 30°C i to timer. Suspensionen blev derpå centrifugeret, og bundfaldet blev resuspenderet i 0,5 ml 1,2 M sorbitol. Der blev tilsat 6 ml topagar ved 52°C (SC-mediet ifølge 20 Sherman et al., (Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory 1981) med leucin udeladt og indeholdende 1,2 M sorbitol plus 2,5% agar) ved 52°C, og suspensionen blev udhældt på plader indeholdende det .samme agarstørknede, sorbitolholdige medium. Transformantkolonier blev taget op efter 3 dage ved 30°C, 25 reisoleret og anvendt til at starte flydende kulturer. En sådan transformant MT350 (=MT 118/pMT344) blev valgt til yderligere karakterisering.

Plasmid pMT 475 blev transformeret i S. cerevisiae stamme MT362 (a,leu2) ved den samme procedure som ovenfor, og 30 transformanten MT371 (=MT362/pMT475) blev isoleret.

Transformering af pMT479 i stamme E2-7B X E11-3C (a/α, ^tpi/^tpi, PeP 4-3/pep 4-3 (denne stamme vil blive refereret til som MT501) blev udført på samme måde med den modifikation, at stammen MT501 før transformering blev dyrket på YPGaL 35 (1% Bacto gærekstrakt, 2% Bacto pepton, 2% galactose og 1% lactat) til ODgQQ på 0,6, og at SOS-opløsningen indeholdt YPGaL i stedet for YPD. En transformant MT519 (=MT501/pMT479) blev valgt til yderligere karakterisering.

21

DK 157938 B

De transformerede mikroorganismer MT 350, MT 371 og MT 519 er blevet deponeret ved Deutsche Sammlung von Mikororganismen (DSM), Griesebachstrasse 8, D-3400 Gottingen, den 15. maj 1984 og fik tildelt deponeringsnumrene henholdsvis DSM 2957, DSM 2958 5 og DSM 2959.

Eksempel 6

Udtrykkelse af B(1-29)-A(1-21) insulin i gær 10 Stammerne MT350 (DSM 2957) og MT371 (DSM 2958) blev dyrket på et syntetisk komplet medium SC (Sherman et al., Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory 1981) med leucin udeladt. Hver stamme blev dyrket i 2 énliters kulturer i toliters rystekolber ved 30°C, indtil de nåede en ΟΟ600ηπι på 7-10. De blev 15 derpå centrifugeret, og supernatanten blev fjernet til yderligere analyse.

Stamme MT519 (DSM 2959) blev dyrket på lignende måde, men på et YPD-medium (Sherman et al., Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, 1981) til en på 15. Der 20 blev derpå centrifugeret, og supernatanten blev fraskilt til yderligere analyse som ovenfor.

Eksempel 7

25 Udtrykkelse af B(l-29)-A(l-21) insulin i gærstamme MT350 (DSM

2957) Gærstamme MT350 (DSM 2957) blev dyrket som beskrevet i eksempel 6, og udtrykkelsesprodukterne fra 1100 ml af supernatanten fra denne stamme blev isoleret som følger: 30 10 g LiChroprep® RP-18 (Merck, art. 9303) blev vasket 3 gange med 50 mM NH^HCO^, 60% EtOH og blev derpå pakket i en 6 x 1 cm kolonne. Kolonnen blev ækvilibreret med 50 ml 50 mM NH^HCO^.

Der blev tilsat 55 ml 96% EtOH til 1100 ml af gærsupernatanten, og blandingen blev påført kolonnen i løbet af natten (flow: 70 35 ml/time).

Kolonnen blev vasket med 10 ml 0,5 M NaCl og 10 ml H2O/ og peptiderne blev elueret med 50 mM Ntf^HCOg, 60% EtOH. Eluatet (5 ml) blev koncentreret ved vakuumcentrifugering til 1,4 ml (til fjernelse af ethanol), og rumfanget blev indstillet til 10 ml med

22 DK 157938B

25 mM HEPES puffer pH = 7,4. Blandingen blev påført en antiinsu-lin-immunoabsorptionskolonne (AIS-kolonne) (2,5 x 4,5 cm), der var blevet vasket 4 gange med 5 ml NaFAM-puffer (Heding, L., Diabetologia 8, 260 - 66, 1972) og to gange med 5 ml 25 mM 5 HEPES-puffer før påføringen. Efter påføringen fik kolonnen lov til at henstå i 30 minutter ved stuetemperatur og blev derpå vasket 10 gange med 4 ml 25 mM HEPES-puffer. Peptiderne blev elueret med 20% HAc. pH-værdien af eluatet blev indstillet til 7,0 med NH^OH, og blandingen blev koncentreret til 500 μΐ ved 10 vakuumrotation.

Prøven fra det forrige trin blev yderligere oprenset på HPLC på en 10 μ Waters μBondopak C-18 kolonne (3,9 x 300 mm). A-og B-pufferne var henholdsvis 0,1% TFA i H20 og 0,07% TFA i MeCN. Kolonnen blev ækvilibreret med 25% B (flow: 1,5 ml/minut), og 15 peptiderne blev elueret med en lineær gradient af MeCN (1%/minut) og påvist ved 276 nm. Udbyttet i hvert trin af oprensningen blev bestemt ved radioimmunoassay som tidligere beskrevet, og tabel 2 gengiver oprensningen. Det samlede udbytte var 68%.

t

DK 157938 B

23

Tabel 2

Oprensning af udtrykkelsesprodukterne fra gærstamme MT350-super-5 natant

Oprensningstrin Rumfang (ml) Immunoreaktivt B(l-29)-A(l-21)-______insulin (nmol)_ 10 Supernatant 1100 110* RP-8 10 116

Anti-insulin sepharose 0,5 116 HPLC_2jJj_75_ 15 * Fortyndningseffekt blev iagttaget i denne prøve

Kun én top indeholdende immunoreaktivt B(1-29)-A(1-21) insulinmateriale blev påvist fra HPLC-kolonnen. Peptidmaterialet 20 fra denne top blev isoleret og underkastet aminosyresekvensana-lyse. Sekvensanalysen blev udført med en Gasfasesekvanator (Applied Biosystem Model 470A) som beskrevet af Hewick, R.M. et al. (J.Biol.Chem. 256, 7990-7997, 1981). Fra sekventeringsresul-taterne kunne det konkluderes, at udtrykkelsesprodukterne bestod 25 af 3 peptider: (Glu-Ala)2-B(l-29)-A(l-21) insulin 89%

Glu-Ala-B(1-29)—A(1-21) insulin 2% B(1-29)-A(1-21) insulin 9% 30

Peptiderne fandtes i de angivne forholdsvise mængder.

Eksempel 8

35 Udtrykkelse af B(1-29)-A(1-21) insulin i gærstamme MT371 (DSM

2958) Gærstamme MT371 (DSM 2958) blev dyrket som beskrevet ovenfor i eksempel 6, og udtrykkelsesprodukterne fra 665 ml supernatant fra denne stamme blev isoleret som beskrevet i eksem- £.*± - - - - - — pel 7. Det samlede udbytte var 50 nmol svarende til 39%. Peptidmaterialet blev isoleret fra HPLC-kolonnen og sekvensbestemt som beskrevet i eksempel 7. Fra sekvensresulaterne (18 aminosyre-rester fra N-terminalen) kunne det konkluderes, at peptidet var 5 homogent B(l-29)-A(l-21) insulin.

Sammenligning af disse resultater med resultaterne i eksempel 7 antyder hensigtsmæssigheden i fjernelse af Glu-Ala-Glu-Ala-sekvensen fra C-terminalen af MFal-leaderen. Det fremgår af eksempel 7, at gærdipeptidaseenzymet ikke fungerer særlig 10 effektivt ved fraspaltning af Glu-Ala og Glu-Ala-Glu-Ala fra B(1-29)-A(1-21)-insulinet før udskillelse af insulinprecursoren fra gærcellerne.

15 Eksempel 9

Udtrykkelse af B(1-29)-A(1-21) insulin i gærstamme MT519 (DSM

2959) Gærstamme MT519 (DSM 2959) blev dyrket som beskrevet ovenfor i eksempel 6, og udtrykkelsesprodukter fra 70 ml af 20 supernatanten blev isoleret som beskrevet i eksempel 7. Det samlede udbytte var 116 nmol, svarende til 57%. Peptidet blev sekvensbestemt som beskrevet i eksempel 7. Peptidet blev vurderet til at være homogent B(1-29)-A(1-21) insulin ud fra de 42 amino-syrerester identificeret fra den N-terminale ende. Omtrent 5 nmol 25 af peptidet blev hydrolyseret i 100 μΐ 6N HC1 i 24 timer ved 110°C. Hydrolysatet blev analyseret på en Beckman Model 121M aminosyreanalysator. Følgende aminosyresammensætning blev fundet:

. DK 157938B

25

Tabel 3

Aminosyreanalyse af oprenset B(1-29)-A(1-21) insulin 5 Aminosyre Fundet Teoretisk itAminosyre Fundet Teoretisk

Asx* 2,97 3 Val 3,37 4

Thr 1,77 2 Ile 1,65 2

Ser 2,45 3 Leu* 5,65 6 10 Glx* 6,68 7 Tyr 3,51 4

Pro 1,33 1 Phe* 2,73 3

Gly* 3,95 4 Lys* 0,95 1

Ala* 1,22 1 His* 1,84 2

Cys 0,5 4,54 6 Arg* 1,13 1 15 * Aminosyre anvendt til normalisering Eksempel 10 20 Konstruktion af et gærplasmid pMT610 til udtrykkelse af B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)

Et 4,3 kb EcoRV-Xbal og et 3,3 kb EcoRI-EcoRV fragment fra pMT342 (se eksempel 3) blev ligeret til et 0,6 kb EcoRI-Xbal fragment af pM215 (se eksempel 3). Det fremkomne plasmid pMT462 25 indeholder indsatsen MFal-leaderen-(minus Glu-Ala-Glu-Ala)-B-C-A. Til konvertering af fragmentet, der koder for B-C-A, til et fragment, der koder for B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21), anvendtes den modificerede site specific mutagenesis fremgangsmåde (K. Norris et al., ibid.). Et 0,6 kb EcoRI-Xbal-fragment fra pMT462, der 30 koder for MFal-leaderen-(minus Glu-Ala-Glu-Ala)-B-C-A, blev indsat i M13 mplO RF fag skåret med Xbal-EcoRI. Enkeltstrenget M13 fag indeholdende det ovenfor nævnte EcoRI-Xbal fragment blev inkuberet med en 30-mer d(TTCACAATGCCCTTAGCGGCCTTGGGTGTG) primer (KFN15) og den "universelle" 15-mer M13 primer d(TCCCAGTCACGACGT) 35 (se eksempel 1), opvarmet til 90°C i 5 minutter og langsomt nedkølet til stuetemperatur for at tillade annealing. Derpå fremstilledes delvist dobbeltstrenget DNA ved tilsætning af en d-NTP-blanding, Klenow Polymerase og T4 ligase. Efter fenolekstraktion, ethano ludfældning og resuspension blev DNA skåret med 40 restriktionsenzymer Apal, Xbal og EcoRl. Efter en yderligere fenolekstraktion, ethanoludfældning og resuspension blev DNA ligeret til EcoRI-Xbal skåret pUC13. Ligeringsblandingen blev transformeret i en E. coli (r m+)-stamme, og plasmider blev fremstillet fra en del af transformanterne. Plasmidpræparaterne blev

DK 187938B

skåret med EcoRl og Xbal, og de præparater, der viste bånd ved både 0,5 og 0,6 kb, blev retransformeret i E. coli. Fra retrans-formeringen blev der udvalgt en transformant indeholdende kun pUC13 med en 0,5 kb indsats. Sekvensen af EcoRl-Xbal indsatsen i 5 dette plasmid pMT598 blev derpå bekræftet ved Maxam-Gilbert metoden til at kode for MFal-leaderen-(minus Glu-Ala-Glu-Ala)-B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A(l-21). Xbal-EcoRI indsatsen fra pMT598 blev forsynet med TPI-promotoren og TPI-terminator ved ligering af et 0,5 kb Xbal-EcoRI fragment fra pMT598 med et 5,5 kb Xbal-EcoRI 10 fragment fra pT5. Konstruktionen af pT5 indeholdende indsatsen TPIp-MFal-leader-B-C-A-TPIT er vist i fig. 8. Det fremkomne plasmid pMT601 indeholdende indsatsen TPIp-MFal-leader-(minus Glu-Ala-Glu-Ala)-B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)-TPIT blev skåret med BamHl og delvist med Sphl, og 2,1 kb fragmentet blev indsat i 15 CPOT skåret med BamHl og Sphl. Det fremkomne plasmid pMT610 blev anvendt til transformering af gær.

Eksempel 11 20 Konstruktion af et gærplasmid pMT639 til udtrykkelse af B(l-29)-Ser-Lys-A(l-21)

Fragmentet fra pMT462 (se eksempel 10), der koder for BCA, blev konverteret til B(1-29)-Ser-Lys-A(1-21) ved en fremgangsmåde svarende til den i eksempel 10 beskrevne ved site 25 specific mutagenesis med en blanding af en 27-mer d(TCCACAATGCCCTTAGACTTGGGTGTG) primer KFN36 og den "universelle" 15-mer M13 primer. Efter udfyldning med Klenow polymerase og ligering med T4 ligase blev det delvist dobbeltstrengede DNA fordøjet med Apal, EcoRl og Xbal og ligeret til 5,5 kb Xbal-EcoRI 30 fragmentet fra plasmid pT5 (se eksempel 10). Efter transformering og retransformering i E. coli blev et plasmid pMT630 indeholdende indsatsen MFal-leader-(minus Glu-Ala-Glu-Ala)-B(l-29)-Ser-Lys-A(1-21) isoleret, og sekvensen af indsatsen blev bekræftet. Den videre fremgangsmåde til opnåelse af plasmid pMT639 indeholdende 35 indsatsen TPIp-MFal-(minus Glu-Ala-Glu-Ala)- B(l-29)-Ser-Lys-A(1-21)-TPIT var som beskrevet i eksempel 10. Konstruktionen af pMT639 er vist i fig. 9.

27

DK 15 7 9 3 8 B

Eksempel 12

Udtrykkelse af B (1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21) i gærstamme MT620 S. cerevisiae stamme MT501 (se eksempel 5) blev transformeret med pMT610 som beskrevet for pMT479 i eksempel 5. Trans-5 formantkolonier blev opsamlet efter 3 dage ved 30°C, genisoleret og anvendt til start af flydende kulturer. En af disse transfor-manter MT620 = (MT501/pMT610) blev udvalgt til yderligere karakterisering. MT620 blev deponeret af ansøgeren hos Deutsche Sammlung von Mikroorganismen (DSM), den 16. januar 1985 og fik 10 referencenummeret DSM3196.

MT620 blev dyrket på YPD medium. En toliters kultur i to liters rystekolber blev rystet ved 30°C til ODgøonm 15.

Efter centrifugering blev supernatanten fjernet til yderligere analyse. Udtrykkelsesniveauet bestemt ved radioimmunoassay var 15 1,2 μπιοΐ/ΐ. Udtrykkelsesprodukterne fra 840 ml af supernatanten blev renset som beskrevet i eksempel 7. (RP-18 kolonne, Anti-insulin Sepharose og HPLC). Det samlede udbytte var 100 nmol svarende til ca. 10%. Peptidmaterialet blev isoleret fra HPLC-kolonnen og sekventeret som beskrevet i eksempel 7. 35 Edman-20 nedbrydningscyklus'er blev udført (tabel 4). Fra sekventerings-resultatene blev positionen af kæden med tre aminosyrerester (Ala-Ala-Lys), der adskiller B(l-29)- og A(1-21)-kæderne, bekræftet (se tabel 4).

5

DK 157938B

28

Tabel 4

Sekvensanalyse af B(l-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21) isoleret fra kulturmediet af stamme MT620.

Cyclus nr. PTH-aminosyrerest Udbytte, (pmol) 1 Phe 3351 2 Val 1738 10 3 Asn 5169 4 . Gin 2750 _5_His_2045_ 6 Leu 1405 7 Cys 15 8 Gly 1372 9 Ser 345 10 His 1105 Π Leu 2225 12 Val 1963 20 13 Glu 1219 14 Ala 1514 15 Leu 1793 T§ Tyr Γ757 17 Leu 1354 25 18 Val 1765 19 Cys 20 Gly 882 -Π-gE-Γ0Ϊ3 22 Arg 1100 30 23 Gly 1123 24 Phe 1492 25 Phe 2042 26 Tyr 1014 27 Thr 195 35 28 Pro 710 29 BOQLys 1173 30 2yAla 1026 31 Ala 555 32 Lys 1175 40 33 A.Gly 552 34 Ile 518 35 _Val_548_

Middelrepetitivudbyttet var 95,6%.

45

Eksempel 13

Udtrykkelse af B(l-29)-Ser-Lys-A(l-21) i gærstamme MT643 S. cerevisiae stamme MT501 blev transformeret med 50 pMT639 som beskrevet for pMT479 i eksempel 5.

En transformant MT643 = (MT501/pMT639) blev udvalgt til yderligere karakterisering. MT643 blev deponeret af ansøgeren ved DSM den 16. januar 1985 og fik referencenr. DSM 3197.

29

DK 157938 B

MT643 blev dyrket som beskrevet i eksempel 12. Efter centrifugering blev supernatanten fjernet til yderligere analyse.

Udtrykkelsesniveauet af insulinprecursoren bestemt ved radioimmunoassay var 1,6 μπιοΐ/ΐ. Udtrykkelsesprodukter fra super-5 natanten fra stamme MT643 blev isoleret som beskrevet i eksempel 7. Peptidmaterialet isoleret fra HPLC kolonnen blev underkastet sekvensanalyse som beskrevet i eksempel 7. Fra sekvensresultaterne (ikke vist) blev positionen af kæden med to aminosyrerester (Ser-Lys), der adskiller B(l-29)- og A(1-21)-kæderne, bekræftet.

10

Eksempel 14

Konvertering af B(1-29)-A(1-21) til ThrtBu^-OBu^CBSO) human insulin

15 20 mg af B(l-29)-A(l-21) blev opløst i 0,1 ml 10 M

eddikesyre. Der tilsattes 0,26 ml af 1,54 M Thr(Bu*")-0But i N,N-dimethylacetamid. Blandingen blev afkølet til 12°C. 2,8 mg trypsin opløst i 0,035 ml 0,05 M calciumacetat blev tilsat. Efter 72 timer ved 12°C blev proteinerne udfældet ved tilsætning af 4 ml 20 acetone, isoleret ved centrifugering og tørret i vacuum. Konverteringen af B(1-29)-A(1-21) til Thr(Bu^)-OBu^(B30) human insulin var 64% ved HPLC.

25 Eksempel 15

Konvertering af B(1-29)-A(1-21) til Thr-Ome(B30) human insulin 20 mg af B(1-29)-A(1-21) blev opløst i 0,1 ml af 10 M eddikesyre. Der tilsattes 0,26 ml af 1,54 M Thr-OMe i en blanding af dimethyl sulphoxid og butan-1,4-diol 1/1 (v/v). 1 mg lysyl-30 endopeptidase fra Achromobacter lyticus (Wako Pure Chemical

Industries, Osaka, Japan) i 0,07 ml vand blev tilsat. Efter 120 timer ved 25°C blev proteinerne udfældet ved tilsætning af 4 ml acetone, isoleret ved centrifugering og tørret i vacuum. Konverteringen af B(1-29)—A(1-21) til Thr-Ome(B30) human insulin var 35 75% ved HPLC.

DK 157938 B

30

Eksempel 16

Konvertering af B(1-29)-Ser-Lys-A(1-21) til Thr-OBut(B30) human insulin 20 mg af B(l-29)-Ser-Lys-A(l-21) blev opløst i 0,1 ml 5 af en blanding af 34,3% eddikesyre (v/v) og 42,2% N,N-dimethyl-formamid (v/v) i vand. Der tilsattes 0,2 ml 2 M Thr-0But som hydroacetatsalt i N,N,dimethylformamid. Blandingen blev thermo-statteret ved 12°C. Der tilsattes 2 mg trypsin i 0,05 ml 0,05 M calciumacetat. Efter 24 timer ved 12°C blev proteinerne udfældet 10 ved tilsætning af 4 ml acetone, isoleret ved centrifugering og tørret i vacuum. Konverteringen af B(1-29)-Ser-Lys-A(1-21) til Thr-OB^(B30) human insulin var 85% ved HPLC.

15 Eksempel 17

Konvertering af B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21) til Thr-OBut(B30) human insulin 20 mg B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21) blev opløst i 0,1 ml af en blanding af 34,3% eddikesyre (v/v) og 42,2% N,N dimethyl-20 formamid (v/v) i vand. Der tilsattes 0,2 ml 2 M Thr-OBu1' som hydroacetatsalt i Ν,Ν-dimethylformamid. Blandingen blev thermo-statteret ved 12°C. Der tilsattes 2 mg trypsin i 0,05 ml 0,05 M calciumacetat. Efter 96 timer ved 12°C blev proteinerne udfældet ved tilsætning af 4 ml acetone, isoleret ved centrifugering og 25 tørret i vacuum. Konverteringen af B( 1-29 )-Ala-Ala-Lys-A( 1-21) til Τ]ιτ-ΟΒϋ^(Β30) human insulin var 84% ved HPLC.

Eksempel 18 30 Fremstilling af human insulin fra forskellige human insulinestere

Human insulinesterne i de rå acetoneudfældninger blev renset ved gelfiltration og anionbytterchromatografi som beskrevet i Methods in Diabetes Research vol. 1, p. 407-408 (Eds. J.

35 larner & S. Pohl (John Wiley Sons, New York, 1984)). Fremgangsmåden kunne anvendes i forbindelse med en hvilken som helst af de tre human insulin estere. Fraspaltningen af de forskellige estergrupper, som gav human insulinudbytter på næsten 100%, blev ud-

DK 157938 B

ført ved hydrolyse af Thr-OMe(B30) human insulin og ved acidolyse t t med trifluoreddikesyre af Thr(Bu )-OBu (B30) human insulin og af Thr-OBu^(B30) human insulin som beskrevet ibid. p. 409.

5

Claims (8)

32 DK 157938B

1. DNA-sekvens til brug i en gærvektor, kende tegnet ved, at den består af en nukelotidkombination, som koder for en insulinprecursor med formlen B(l-29)-(Xn-Y)m-A(l-21) (I) 10 hvor Xn er en peptidkæde med n naturligt forekommende aminosyre- rester, Y er Lys eller Arg, n er et helt tal fra 0 til 33, m er 0 Bl eller 1, B(l-29) er en forkortet B-kæde af humaninsulin fra Phe B2 9 til Lys og A(l-21) er A-kæden af humaninsulin, idet dog pep- 15 tidkæden -X -Y- ikke kan indeholde to nabostillede basiske amino-n syrerester.

2. DNA-sekvens ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den består af en nukleotidkombination, som koder for en 20 insulinprecursor med formlen B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(l-21) eller B(l-29)-Ser-Lys-A(l-21).

3. En i gær replicerbar vektor, kendetegnet ved, at den indeholder en DNA-sekvens ifølge krav 1 eller 2.

4. Gærstamme til brug ved fremstilling af en insulinprecursor, kendetegnet ved, at den er transformeret 30 med en vektor ifølge krav 3.

5. Fremgangsmåde til fremstilling af en insulinprecursor med formlen

35 B(l-29)-(X -Y) -A(l-21) (I) n m hvor XR er en peptidkæde med n naturligt forekommende aminosyre- rester, Y er Lys eller Arg, n er et helt tal fra 0 til 33, m er 0 Bl eller 1, B(l-29) er en forkortet B-kæde af humaninsulin fra Phe

33 DK 157938 B B29 til Lys og A(l-21) er A-kæden af humaninsulin, med den betingelse, at peptidkæden -X -Y- ikke indeholder to nabostillede basiske aminosyrerester, kende- tegnet ved, at en gærstamme ifølge krav 4 dyrkes i et egnet næringsmedium efter-5 fulgt af udvinding af insulinprecursoren på i og for sig kendt måde.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 5 til fremstilling af en insulinprecursor med formlen B(l-29)-A(l-21), kendete g- 10. e t ved, at der som gærstamme anvendes DSM 2959 eller en variant eller mutant deraf med i det væsentlige samme egenskaber.

7. Fremgangsmåde ifølge krav 5 til fremstilling af en insulinprecursor med formlen B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21), k e n- 15 detegnet ved, at der som gærstamme anvendes DSM 3196 eller en variant eller mutant deraf med i det væsentlige samme egenskaber.

8. Fremgangsmåde til fremstilling af humaninsulin, 20 kendetegnet ved, at en gærstamme ifølge krav 4 dyrkes i et egnet næringsmedium, hvorpå den udtrykte insulinprecursor udvindes fra kulturvæsken og omdannes til humaninsulin på i og for sig kendt måde. 25