DK158270B - Fremgangsmaade til fremstilling af human insulinprecursorer og af human insulin samt dna- sekvenser og plasmider til anvendelse i disse fremgangsmaader - Google Patents

Description

DK 158270B

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af biosyntetiske insulinprecursorer og en fremgangsmåde til fremstilling af human insulin ud fra sådanne biosyntetiske insulinprecursorer samt DNA-sekvenser og plasmider til anven-5 delse i disse fremgangsmåder.

Human insulin består af to peptidkæder, A-kæden, der indeholder 21 aminosyrerester og B-kæden, der indeholder 30 aminosyrerester. A- og B-kæden er knyttet sammen gennem to disul-fidbroer, der forbinder cysteinrester ved A7 til B7 og ved A20 10 til B19. En tredje disulfidbro forbinder cysteinresten A6 med All.

Human insulin produceres in vivo i pancreas i form af præproinsulin. Præproinsulin består af et præpeptid på 24 aminosyrerester efterfulgt af proinsulin, der indeholder 86 aminosyre-15 rester i konfigurationen: præpeptid-B-Arg-Arg-C-Lys-Arg-A, hvor C er C-peptidet på 31 aminosyrerester.

Under udskillelsen fra β-cellerne spaltes præpeptidet fra, og proinsulin folder derpå til en struktur, i hvilken disul-fidbroerne dannes. C-kæden fraspaltes derpå proteolytisk, hvorved 20 der fås modent human insulin.

Adskillige forsøg er blevet gjort på at fremstille insulin, og især human insulin ved hjælp af rekombinant DNA-teknologi. I europæisk patentansøgning nr. 0055945 A beskrives fremstillingen af proinsulin eller miniproinsuliner i E. coli.

25 Processen omfatter udtrykkelse af kimært polypeptid, in vitro spaltning af det kimære polypeptid og in vitro dannelse af disul-fidbroer mellem A- og B-kæden og fraskæring af brokæden mellem A-og B-kæden til dannelse af human insulin. I europæisk patentansøgning nr. 68701 er der foreslået fremstilling af modificerede 30 proinsuliner med et mere eller mindre forkortet C-peptid ved transformering af E. coli.

De ovennævnte metoder lider af adskillige ulemper, der hovedsageligt beror på det faktum, at E. coli anvendes som trans-formantorganisme. Det udtrykte produkter udskilles ikke fra cel-35 lerne, men akkumuleres intracellulært i E. coli-værtsorganismen. Akkumulering af det udtrykte polypeptidprodukt af præproinsulin eller modificerede typer af præproinsulin forøger imidlertid

DK 158270 B

2 risikoen for enzymatisk nedbrydning af det udtrykte produkt. Spaltning, foldning og etablering af disulfidbroer skal desuden tilsyneladende foretages in vitro.

Et mere velegnet system til udtrykkelse af pattedyr-5 polypeptider synes at være eukaryotceller, og der er blevet gjort adskillige forsøg på at udtrykke fremmede gener i eukaryoter, især i gær. Udtrykkelse af interferon er beskrevet i europæisk patentansøgning nr. 0060057 A, og udtrykkelse og udskillelse i gær af proteiner, der er heterologe i forhold til gær er beskre-10 vet i europæisk patentansøgning nr. 0088632 A, 0116201 A og 0123544 A.

En fremgangsmåde til udtrykkelse af "præ"-proinsulin (dvs. proinsulin med et signalpetid knyttet til den N-terminale aminosyre i proinsulingenet) i gær og spaltning og udskillelse af 15 det udtrykte "præ"-proinsulin er beskrevet i europæisk patentansøgning nr. 0121884 A. Det er imidlertid påvist af ansøgerne, at insulinprecursorer af proinsulintypen er følsomme overfor enzymatisk nedbrydning i gær resulterende i meget lave udbytter, hvis der overhovedet fås nogen, af udskilt proinsulin eller 20 modent insulin. I gær er det blevet vist, at human proinsulin og proinsulinanaloger med et mere eller mindre forkortet C-peptid er ........... .· særlig følsomme overfor enzymatisk spaltning ved de to dibasiske sekvenser, der flankerer C-peptidregionen. Tilsyneladende sker disse spaltninger før etableringen af S-S-broerne resulterende i 25 dannelse af C-peptid, A-kæde og B-kæde.

Det er formålet med den foreliggende opfindelse at tilvejebringe biosyntetiske insulinprecursorer, der dannes i høje udbytter i gær med korrekt anbragte disulfidbroer mellem A- og B-kæderne, og som let kan omdannes i human insulin.

30 Adskillige insulinprecursorer af proinsulintypen, ind befattende proinsulin er blevet undersøgt (se den efterfølgende tabel 1). DNA-sekvenser, der koder for de pågældende precursorer, blev indsat i et gærvektorsystem og transformeret i gær ifølge den ovenfor beskrevne teknik og den efterfølgende detaljerede 35 beskrivelse. Foran genet, der koder for insulinprecursoren, blev der anbragt en DNA-sekvens, der koder for gærsekretions- og spaltningssignaler. I den foreliggende undersøgelse blev en modi-

3 DK 158270 B

ficeret MFal-leadersekvens anvendt, i hvilken segmentet, der koder for de sidste fire rester (Glu-Ala-Glu-Ala) i leader var blevet fjernet. Den modificerede MFa leader indeholder som spaltningssignaler en dibasisk sekvens Lys-Arg, der er forbundet til 5 5'enden af precursorgenet. Det viste sig, at leadersekvensen blev fraspaltet i alle konstruktionerne, d.v.s. der skete spaltning ved den dibasiske sekvens Lys-Arg ovenfor alle insulinprecursor-generne. I alle insulinprecursorgenerne, der indeholder 2 dibasiske sekvenser, som flankerer C-peptidet eller et modificeret C-10 peptid, skete der imidlertid spaltning ved begge dibasiske steder før etableringen af korrekt anbragte disulfidbroer, og der kunne ikke isoleres et enkeltkædet uspaltet precursormolekyle fra gæringsvæsken. Følgelig kan gær ikke anvendes som ekspressionssystem til fremstilling af insulinprecursorer af proinsulintypen. 15 Det har nu overraskende vist sig, at hvis A- og B- kæderne i human insulin forbindes med kun én dibasisk sekvens (konstruktionerne 7 - 10 i tabel 1), sker der ingen spaltning ved den dibasiske sekvens i gær, og der fås enkeltkædede insulinprecursorer med korrekt anbragte disulfidbroer i høje udbytter i 20 gæringsvæsken fra en gærstamme transformeret med en DNA-sekvens, der koder for den pågældende insulinprecursor. Den foreliggende opfindelse synes desto mere overraskende, fordi en fuldstændig spaltning iagttages ved Lys-Arg i leadersekvensen anbragt foran precursorgenet.

25 Da insulinprecursorer af denne type indeholdende en enkelt dibasisk sekvens mellem A- og B-kæden let kan omdannes til human insulin ved spaltning in vitro som forklaret i yderligere detaljer i det følgende, tilvejebringer den foreliggende opfindelse en økonomisk attraktiv fremgangsmåde til fremstilling af 30 human insulin.

I sit første aspekt tilvejebringer den foreliggende opfindelse en DNA-sekvens, der er ejendommelig ved, at den består af en sådan nucleotidkombination, som er nødvendig for kodning for en human insulinprecursor med formlen: 35

4 DK 158270B

B-X-Y-A (I) i hvilken B og A er B- og A-kæderne i human insulin tværbundet som i human insulin og X og Y hver uafhængigt er lysin- eller 5 argininrester.

Insulinprecursorer med den ovennævnte formel (I) er B-Lys-Lys-A, B-Lys-Arg-A, B-Arg-Lys-A og B-Arg-Arg-A, idet de to førstnævnte foretrækkes.

Ifølge et andet aspekt af den foreliggende opfindelse 10 tilvejebringes der et plasmid, der er ejendommeligt ved, at det indeholder en DNA-sekvens, der koder for de ovenfor definerede insulinprecursorer med formlen (I).

Ifølge et tredje aspekt af den foreliggende opfindelse tilvejebringes der en fremgangsmåde til fremstilling af en insu-15 linprecursor med formlen (I) som ovenfor defineret, og denne fremgangsmåde er ejendommelig ved, at en gærstamme transformeret med et plasmid ifølge krav 2 dyrkes i et egnet dyrkningsmedium, og at insulinprecursoren udvindes fra dyrkningsmediet.

Ved dyrkning af således transformerede gærstammer blev 20 der isoleret høje udbytter af alle de her omhandlede fire insulinprecursorer fra kulturvæsken, idet B-Lys-Lys-A og B-Lys-Arg-A udtrykkes i de højeste udbytter. Hvad angår ekspressionsniveauer foretrækkes følgelig disse to precursorer.

Ekspressionsprodukterne blev isoleret og insulinimmuno-25 reaktivt materiale (IRI-peptider) blev oprenset og karakteriseret ved mikrosekvensanalyse.

Det blev påvist, at precursorerne med den ovennævnte formel (I) er enkeltkædede molekyler, i hvilke tre disulfidbroer forbinder følgende halvcysteinrester: A6-A11, A7-B7 og A20-B19, 30 d.v.s. precursorerne udtrykkes i gær med korrekt anbragte disul-fidbroer sammenlignet med human insulin. Strukturerne af de hidtil ukendte insulinprecursorer er vist i fig. 1.

Plasmiderne kan foran DNA-sekvensen, der koder for det ønskede produkt, indeholde en præregion, der sikrer, at det ud-35 trykte produkt ledes ind i gærens sekretionssystem, og at det udtrykte produkt secerneres i vækstmediet. Denne præregion, som kan være et naturligt signal- eller leaderpeptid eller en synte-

5 DK 158270 B

tisk sekvens, der tilvejebringer udskillelse, fraspaltes sædvanligvis fra det ønskede produkt under secerneringen, hvorved det modne produkt direkte kan isoleres fra kulturvæsken.

En velkendt leadersekvens for gær er gær MFal-leaderse-5 kvensen (Kurjan, J. og Herskowitz, I., Cell 30, (1982), 933-943).

Udtrykkeisen af den ønskede DNA-sekvens vil være under kontrol af en promotorsekvens anbragt korrekt i forhold til DNA-sekvensen, der koder for det ønskede produkt, resulterende i udtrykkelse af det ønskede produkt i værtsorganismen. Der anven-10 des fortrinsvis en promotor fra et gen, der findes i den anvendte gærvært, f.eks. promotoren for TPI (triosephosphat isomerase)-genet eller MFal-promotoren.

DNA-sekvensen for det ønskede produkt vil være efterfulgt af en transskriptionsterminatorsekvens, fortrinsvis en 15 terminatorsekvens fra et gen, der findes i gærværten, f.eks. terminatoren for TPI-genet eller MFal-genet.

DNA-sekvenserne, der koder for insulinprecursorerne med den ovennævnte formel (I) blev konstrueret ved in vitro mutage-nese-udloopning af human proinsulingenet under anvendelse af 20 kemisk syntetiserede 30-mer oligonucleotider til fjernelse af de oprindelige, C-peptidkodende sekvenser.

Den foreliggende type af insulinprecursorer kan omdannes til human insulin ved fjernelse af X- og Y-aminosyreresterne ved in vitro spaltning med trypsin og carboxypeptidase B ved en 25 metode analog med in vitro omdannelsen af proinsulin i insulin som beskrevet af Kemmler (Kemmler et al., The Journal of Biological Chemistry, 246 (1971), 6786 - 6791).

Den foreliggende opfindelse tilvejebringer endelig en fremgangsmåde til fremstilling af human insulin, hvilken frem-30 gangsmåde er ejendommelig ved, at en gærstamme transformeret med et plasmid ifølge krav 2 dyrkes i et egnet dyrkningsmedium, og at insulinprecursoren udvindes fra dyrkningsmediet og omdannes til human insulin ved enzymatisk behandling på i og for sig kendt måde.

6 DK 158270B

Ifølge den foreliggende opfindelse foretages den enzymatiske omdannelse af insulinprecursorerne med den ovennævnte formel (I) i modent human insulin fortrinsvis ved, at en vandig opløsning af insulinprecursorerne behandles med trypsin og car-5 boxypeptidase B.

Den enzymatiske omdannelse kan udføres som en éttrins-proces, ved hvilken trypsin og carboxypeptidase B samtidig er til stede i reaktionsblandingen. Ettrinsreaktionen udføres fortrinsvis ved omtrent neutral pH og let forhøjede temperaturer. Udbyt-10 tet af human insulin er ca. 50%. Bedre udbytter opnås ved en totrinsomdannelse af insulinprecursorerne af typen B-X-Arg-A. Ved en sådan totrinsomdannelse anvendes trypsin i det første trin, det spaltede produkt isoleres og spaltes derpå yderligere med carboxypeptidase B. Ved at udføre trypsinspaltningen ved højt pH, 15 f.eks. i området fra 11 til 12, og ved lav temperatur (ca. 4°C) er det samlede udbytte af human insulin ca. 80%. For at opnå et højt udbytte ved trypsinspaltningen ved højt pH, skal aminosyre-resten anbragt i position B32 (se fig. 1) være arginin (Y = Arg i formel I), da denne rest stadig er hovedsagelig positivt ladet og 20 tilgængelig for trypsinspaltning. Følgelig kan precursoren B-Lys-Arg-A være den mest foretrukne precursor, da den udtrykkes i høje niveauer i gær og omdannes i human insulin i meget høje udbytter.

Opfindelsen skal illustreres i yderligere detaljer 25 under henvisning til tegningen, på hvilken

Fig. 1 illustrerer strukturen af insulinprecursorerne med formlen (I)/

Fig. 2 illustrerer fremstillingen af plasmid pMT579, 30 Fig. 3 illustrerer fremstillingen af plasmid pMT585,

Fig- 4 illustrerer fremstillingen af plasmid pMT644,

Fig. 5 illustrerer fremstillingen af plasmid pMT611,

Fig. 6 illustrerer fremstillingen af plasmid pMT650,

Fig. 7 illustrerer fremstillingen af plasmid pMT658, og 35 .Fig. 8 illustrerer in vitro omdannelsen af B-Lys-Arg-A til human insulin.

DK 158270 B

7 1. _Fremstilling af et gen, der koder for human proinsulin

B-C-A

Helt oprenset RNA (Chirgwin, J.M. Przybyla, A.E., McDonald, R.J. & Rutter, W.J., Biochemistry _1£, (1979) 5294-5299) 5 fra human pancreas blev reverstransskriberet (Boel, E., Vuust, J. , Norris, F., Norris, K., Wind, A., Rehfeld, J.F. & Marcker, K. A., Proc.Natl.Acad.Sci. USA 8Ό, (1983), 2866-2869) med AMV reverstransskriptase og d(GCTTTATTCCATCTCTC) som 1. strengsprimer. Efter prasperativ urinstofpolyacrylamidgeloprensning af 10 human proinsulin-cDNA blev den anden streng syntetiseret på denne templat med DNA polymerase stort fragment og d(CAGATCACTGTCC) som 2. strengsprimer. Efter Si nucleasefordøjelse blev human proinsulin ds. cDNA oprenset ved polyacrylamidgelelektroforese, forsynet med ender med terminal transferase og klonet i Pstl-stedet på 15 pBR327 (Sorberon et al., Gene £, (1980), 287-305) i E. coli. En korrekt klon, der indeholder plasmidet, blev identificeret blandt rekombinanterne ved hjælp af restriktionsendonucleaseanalyse og bekræftet ved nucleotidsekventering (Maxam, A., 4 Gilbert, W., Methods in Enzymology, J55 (1980), 499-560. Sanger, F., Nicklen, 20 S. & Coulson, A.R., Proc.Natl.Acad.Sci. USA 74, (1977), 5463- 5467) .

1. og 2. strengsprimerne, GCTTTATTCCATCTCTC og CAGATCACTGTCC, der anvendes til isolering af human proinsulin cDNA-klonen, blev syntetiseret ved semiautomatisk kolonnesyntese 25 under anvendelse af phosphortriestermetoden på en polystyrenbærer (H. Ito, Y. Ike, S. Ikata og K. Itakura (1982) Nucleic Acids Research 1£, 1755-769).

2._ Fremstilling af gener kodende for B-X-Y-A

30 Gener, der koder for de fire insulinprecursorer B-Lys-

Lys-A, B-Lys-Arg-A, B-Arg-Lys-A og B-Arg-Arg-A blev fremstillet ved indsætning af et fragment, der koder for den lineære human proinsulinsekvens B-C-A i en cirkulær, enkeltstrenget M-13 bakte-riophagvektor og site specifik mutagenese af human proinsulin-35 sekvensen med henholdsvis kemisk syntetiserede 30-mer deletions-primere KFN41, KFN4, KFN42 og KFN18, og en "universal" 15-mer M13 dideoxysekventeringsprimer (K. Norris et al., Nucl.Acid.Res., 11

8 DK 158270B

(1983), 5103 - 5112). Et dobbeltstrenget restriktionsfragment (Xbal-EcoRI) blev skåret ud af det delvist dobbeltstrengede cirkulære DNA og ligeret i pUC13 eller pT5. Ved transformering og retransformering af E. coli, blev der identificeret transforman-5 ter, der indeholder plasmider, der indeholder det ønskede gen.

De fire mutagenesedeletionsprimere KFN4, KFN18, KFN41 og KFN42 blev syntetiseret på en automatisk DNA syntesizer (Applied Biosystems Model 380 A) under anvendelse af phosphor-amiditkemi og kommercielt tilgængelige reagenser (S.L. Beaucage 10 og M.H. Caruthers (1981) Tetrahedron Letters 22^, 1859-1869). Oligonucleotiderne blev oprenset ved polyacrylamidgelelektro-forese under denaturerende betingelser. De fire deletionsprimere er som følger: 15 KFN Sekvens

4 TCCACAATGCCTCTCTTAGTCTTGGGTGTG

18 TCCACAATGCCTCTTCTGGTCTTGGGTGTG

41 TCCACAATGCCCTTCTTGGTCTTGGGTGTG

42 TCCACAATGCCCTTTCTGGTCTTGGGTGTG

20 3._ Plasmidkonstruktioner

Gener, der koder for human insulinprecursorerne blev kombineret med fragmenter, der koder for TPI-promotoren (TPI^) 25 (T.Alber og G. Kawasaki. Nucleotide Sequence of the Triose Phosphate Isomerase Gene of Saccharomyces cerevisiae, J.Mol.Applied Genet. 1 (1982) 419-434), MFal-leadersekvensen (J. Kurjan og I. Herskowitz,. Structure of a Yeast Pheromone Gene (MFa): A Putative α-Factor Precursor Contains four Tandem Copies 30 of Mature α-Factor., Cell 30 (1982) 933-943) og transskriptions-terminatorsekvensen fra TPI fra S. cerevisiae, TPIT. Disse fragmenter tilvejebringer sekvenser til sikring af en høj hyppighed af transskriptionen for genet, der koder for insulinprecursoren, og tilvejebringer også en præsekvens, der kan bevirke lokalise-35 ring af insulinprecursoren i sekretionsvejen og dens senere secernering i vækstmediet.

9 DK 158270B

Udtrykkelsesplasmidet indeholder desuden et gær 2μ replikationsinitieringssite og en selekterbar markør LEU2.

Ved in vivo modning af α-faktor i gær fjernes de sidste (C-terminale) seks aminosyrer af MFa-leaderpeptidet (Lys-Arg-5 Glu-Ala-Glu-Ala) fra α-faktor precursoren ved sekvensvis indvirkning af en endopeptidase, der genkender Lys-Arg sekvensen, og en aminodipeptidase, der fjerner Glu-Ala-resterne (Julius, D. et al. Cell 3_2 (1983) 839-852). For at eliminere behovet for gæraminodi-peptidasen, blev den sekvens, der koder for den C-terminale Glu-10 Ala-Glu-Ala i MFal-leaderen fjernet ved in vitro mutagenese.

I en foretrukket konstruktion blev de modificerede udtrykkelsesenheder overført til et stabilt højkopigærplasmid CPOT, (ATCC nr. 39685), for hvilket der kan selekteres udelukkende ved tilstedeværelse af glucose i vækstmediet. Plasmid CPOT er 15 baseret på vektoren Cl/1, der er blevet modificeret ved at substituere det originale pBR322 Bgll - BamHI-fragment med det lignende Bgll - BamHI-fragment fra pUCl3, og påfølgende indsætning af S. pombe-TPI-genet (POT) som et BamHI - Sall-fragment til dannelse af CPOT. Cl/1 er afledt fra pJDB 248, Beggs et al., 20 Nature 275, 104-109 (1978) som beskrevet i EP patentansøgning nr. 0103409 A.

4._Transformering

Plasmider fremstillet som ovenfor blev transformeret 25 ind i S. cerevisiae stammer, der har en deletion i TPI-genet, idet der blev selekteret for vækst på glucose. Sådanne stammer er normalt ikke i stand til at gro på glucose som den eneste carbon-kilde og gror meget langsomt på et galactoselactatmedium. Denne defekt skyldes en mutation i triosephosphatisomerasegenet, der 30 opnås ved deletion og erstatning af en væsentlig del af dette gen med S. cerevisiae LEU2-genet. På grund af denne vækstdefekt sker der en stærk selektering for et plasmid, der indeholder et gen, der koder for TPI.

10 DK 158270 B

5._Udtrykkelse af insulinprecursorer i gær Gærstammer indeholdende plasmider kodende for forskellige insulinprecursorer blev dyrket på YPD medium (Sherman, F. et al., Methods in Yeast Genetics, Cold Spring 5 Harbor Laboratory 1981). For hver stamme blev to kulturer hver på 1 liter rystet i rystekolber på 2 liter ved 30°C, indtil de havde nået en OD ved 600 nm på ca. 15 (ca. 48 t). Efter centrifugering blev supernatanten fjernet til yderligere analyse. Immunoreaktivt insulin (IRI) blev målt ved radioimmunoassay (Heding, L., 10 Diabetologia ^ (1972), 260 - 266) ved anvendelse af semisyntetisk human insulin (NOVO Industri A/S) som standard for konstruktionerne 1-6. Semisyntetisk human insulin eller de pågældende insulinprecursorer blev anvendt til konstruktionerne 7-10. For insulinprecursoren, B-Arg-Arg-C-peptid-Lys-Arg-A (human proinsu-15 lin) blev ekspressionsniveauet af immunoreaktivt C-peptid (IRC) målt ved anvendelse af et human C-peptid radioimmunoassay (Heding, L.G. Diabetologia 11, (1975) 541 - 548). I dette assay 125 blev der anvendt I-mærket Tyr-human-C-peptid, og marsvine-anti-human-C-peptid serum, M1228 (Faber, O.K. et al., Hoppe-20 Seyler's Z. Physiol.Chem. 357 (1976) 751 - 767, som reagerer lige godt med human C-peptid og human proinsulin blev anvendt som antistof. Human proinsulin blev anvendt som standard (Kruse, V. et al., Diabetologia 27 (1984) 414 - 415). Ekspressionsniveauerne af immunoreaktivt insulin og immunoreaktivt C-peptid i gærings-25 væsken fra den transformerede gærstamme er vist i tabel 1.

Udtrykkelsesniveauer for immunoreaktivt insulin og immunoreaktivt C-peptid i fermenteringsmediet fra de transformerede gærstammer er angivet i tabel 1.

11 DK 158270 B

1> CJ

ϊΙ fi 1—I

"S - ^ I I I I I I I I I

<D Ό ^ H G -ri h o -p v.

|||

.¾ H

ti s ro oo'a’vor-'aoHoooo ro h. s ,—irHi—ii—i h cn o vo o t'' U rj Η

0-H\OOOOOOHHOJH ώ t—li—I

3 3 0 !>t I i® i S iaa CA Η -H — 2 ____ 8 m m co F5 oioioioi

s i—li—Ii—li—I

g ro ro co co s s s s s n ro 8 8 8 8 K ro cnocsiHcNiH^DOinro n ii οΟ'Φ'νΤΓοηοΗνοίΓίσι Ξ co unfovD^DVD^^o^o^OLn £> 1 '^ÉÉÉÉÉÉÉÉ 1 t g S * g gi Ύ i § Ξ co Cr> km T T T i d to r ro ΰ id tp oi o

g co η >i H fi to O

U G * O R f< (=3 H ^ ω ro ci; Y I T I O d «> T d d tn to <ϋ o ffi ,y cn ro h >i to G ^

g ti G R ø J R rtl -η Q

Η to 1¾ i I L L L * r i Oj 3 d d 0 Qi .

g ro co co ro η h S o d

m ^ :* ,< R ø 0 <3 m -H

z d !_□ i i T T i O h π ro dOddtn ø d M -S i 8 S ro tu >ι -π to g £ ΠΗΐ1? S ·§

K T -H^rdrdidd -h O

p i) Η ri ri Η Η M

gi O α ,< < <1 <: ø O.

H tn o L i > L X -

I s V'P'PV'P'f'i'i'fl I

R G (jiOiSitJidiQiOitO ΙΟ θ' Λ

1 .§* I

S3 H tJitJ'bltJltOO'tJ'p'BlM Ό

I I I

S H pQCQfflmcQcqfflCQfflffl S

1 s i B I ^ • S · j H 2¾ hcm. (Ο'^ιηνοΓ'Οοσίο Ό

i—I -P

m co li i- tn o lo

c-*I i—I

12

DK 1S8270B

Det fremgår af tabel 1, at der er en slående forskel mellem udtrykkelsesniveauerne af precursorerne ifølge opfindelsen og precursorer af proinsulintypen d.v.s. sådanne, der indeholder et par basiske aminosyrer, som flankerer C-peptidet eller et 5 modificeret C-peptid.

6._Omdannelse af insulinprecursorerne til human insulin

Omdannelsen af insulinprecursorerne til human insulin 10 kan udføres enten ved en totrins enzymatisk proces: I [ Trypsin ( [ B-X-Y-A B-X-Y A (1) 15

I [ Carboxypeptidase B | I

B-X-Y A _^ B A (2) eller ved en kombineret et-trinsproces, ved hvilken trypsin og 20 carboxypeptidase B findes samtidig i reaktionsblandingen.

I de ovennævnte formler og dele af den følgende tekst er disulfidbroen mellem A- og B-kæden illustreret ved en vandret kantet parentes ("| ]") til bedre illustrering af den enzyma- I-1 tiske spaltningsproces. I de ovennævnte formler er B-X-Y-A den 25 enkædede insulinprecursor (fig. 1), ά-Χ-Υ A. er den intermediære tokædede insulinprecursor, i hvilken peptidbindingen mellem aminosyreresterne nr. 32 (Lys eller Arg) og aminosyreresterne nr. 33 (Al = Gly) er blevet hydrolyseret; B A er human insulin. I de øvrige formler af typen Å-X-Y-A er det underforstået, at A- og 30 B-kæderne er forbundet ved disulfidbroer, som i naturligt insulin.

Den enzymatiske omdannelse udføres i en vandig opløsning af insulinprecursorerne. Trypsintypen er ikke afgørende for udøvelsen af opfindelsen. Trypsin er et velkarakteriseret enzym 35 tilgængeligt i høj renhed, især fra okse- og svinepancreas.

Enzymer med trypsinlignende specificitet, f.eks. plasmin, clostripain og Achromobacter lyticus protease kan også anvendes.

13 DK 15 8 2 7 O B

For at opnå høje omdannelsesudbytter er det vigtigt at anvende højtrenset carboxypeptidase B, der ikke indeholder carboxypeptidase A aktivitet. Dette kan opnås ved at rense kommercielt tilgængeligt carboxypeptidase B, f.eks. ved affini-5 tetskromatografi eller ionbytterkromatografi. Alternativt kan carboxypeptidase A inhibitorer, såsom £-amino-n-capronsyre eller carbobenzoxyglycin sættes til spaltningsblandingen.

Ettrinsomdannelsen udføres fortrinsvis ved let forhøjede temperaturer (fra 35 - 40°C) og ved pH fra 7 til 8. Trypsin-10 og carboxypeptidase B-koncentrationen er fortrinsvis ca. 5 μg/ml/ og substratkoncentrationen er ca. 1 mg/ml.

Ved totrinsomdannelsesprocessen udføres trypsinspalt- ningen fortrinsvis ved højt pH. Ved et højt pH (i området fra 11 - 12) er lysinaminosyreresterne i insulinprecursormolekylet i-1 15 (f.eks. B29-Lys og B31-Lys i B-Lys-Arg-A, fig. 1) næsten uladede (pKa for lysinresten er tilnærmelsesvis 9,0), og spaltning med I-1 trypsin sker ikke. I f.eks. B-Lys-Arg-A er imidlertid B32-argi-ninresten (pKa = 12) stadig hovedsageligt positivt ladet og således følsom for trypsinspaltning. Spaltning ved B22-argininresten 20 sker kun med meget lav hastighed sandsynligvis p.g.a. steriske hindringer.

_En stabil pH-værdi under trypsinspaltningen af B-Lys-Arg-A er kritisk for et højt udbytte af Å-Lys-Arg Å. Adskillige puffersystemer er blevet prøvet med det fomål at 25 stabilisere pH-værdien ved 11, 8 - 11,9. Puffersystemet HPC>4 /p04 , der normalt anvendes ved høje pH-værdier har en god pufferkapacitet ved pH 11,8. Dette puffersystem lider imidlertid af tre væsentlige ulemper. For det første: pH-værdien af en opløsning af HPO^ /PO^ er meget følsom overfor temperatur-30 variationer, og en ændring fra f.eks. 25°C til 4°C kan formindske pH-værdien med 0,7 pH enheder. For det andet: Ca++ (der kan være til stede for at stabilisere trypsin) vil udfældes, fordi opløse-lighedsproduktet af Ca^tPO^^ °9 CaHPO^ er forholdsvist lavt. For det tredie: det er ikke muligt at gøre spaltningsblandingen sur 35 (for at stoppe reaktionen) momentant på grund af indvirkningen af puffersystemet HP04--/H2P04"" og H2P04 /H3P04 · Dette system vil under acidificeringen give et neutralt pH i en periode, i hvilken 14

DK 15 8 2 7 O B

trypsin øjeblikkeligt vil danne det uønskede produkt des(B30)insulin. Som et resultat af disse ulemper .er det temmelig usædvanlige puffersystem I^O/OH blevet anvendt. Dette system lider ikke af de ovennævnte ulemper. Optimale betingelser for trypsinspalt-5 ningen af B-X-Arg-A til B-X-Arg A fandtes at være ca. 20 mg/ml B-X-Arg A, 200 μg/ml trypsin; pufferopløsning: 37,5 mM NaOH (resulterende pH målt ved 25°C var 11,86); temperatur ca. 4°C og inkubationstid ca. 180 min. Udbyttet var 90,5% for B-Lys-Arg A.

Produktet B-X-Arg 1 fra trypsinomdannelsen kan renses 10 på et antal konventionelle metoder f.eks. præparativ HPLC, absorptionskromatografi og ionbytterkromatografi. ά-X-Arg Å kan i—l næsten kvantitativt omdannes til B A (human insulin) ved spaltning med carboxypeptidase B. Optimale betingelser for denne om- r~........1 dannelse viste sig at være ca. 5 mg/ml B-X-Arg A og ca. 5 μΐ/ml 15 carboxypeptidase B; pufferopløsning: 50 mM TRIS-HC1, pH = 9,3, temperatur ca. 37°C og inkubationstid ca. 30 min. Udbyttet var l-—“1 99,5% for omdannelse af B-Lys-Arg A. _

Omdannelse af insulinprecursoren B-Lys-Arg A i human insulin blev fulgt kvantitativt ved revers phase højttryksvæske- 20 kromatografi (HPLC) og er illustreret i fig. 8.

I-Γ

Idet der refereres til fig. 8, blev B-Lys-Arg A opløst til en koncentration på 5 mg/ml i 50 mM TRIS-HC1 puffer, pH = 9,3 og spaltet med 5 μg/ml carboxypeptidase B (Boehringer) ved 37C. Prøver blev udtaget fra spaltningsblandingen ved t = 0(A), t = 2 25 min. (B), t = 5 min. (C), og t = 30 min. (D), indstillet til en pH-værdi på 1,5 med 4 N HC1 og analyseret ved HPLC på en 5 μ Nucleosil® RP C-18 kolonne (4 x 200 mm) ækvilibreret og isokra-tisk elueret med 33 mM (NH4)2SO^, 1,5 mM ^SO^ indeholdende 29,4% (v/v) acetonitril ved 30°C ved et flow på 1 ml/min. Peptider blev 30 påvist ved UV-absorption ved 214 nm. Omdannelsen var fuldstændig efter 30 min., og ethanol blev sat til blandingen til 60% (v/v).

B A blev renset ved anionbytterkromatografi på en QAE-Sephadex® kolonne som beskrevet af Schlichtkrull, J. et al., (1974)

Horm.Metab.Res.Suppl., Ser. 5, p. 134 - 143. B: B-kæde, A: A-35 kæde, K: Lys, R: Arg. Det fremgår af fig. 8, at produktet fra trypsxnspaltningen B-Lys-Arg A næsten kvantitativt omdannes i B A ved spaltning med carboxypeptidase B.

15 DK 158270 B

Omdannelsen af insulinprecursoren i human insulin er angivet i eksempel 10, 11 og 12, og karakteriseringen af human insulin er angivet i eksempel 13.

5

Eksempel 1

Konstruktion af et gærplasmid pMT585 til udtrykkelse af B-Lys-Arg-A.

Et 4,3 kb EcoRV-Xbal og et 3,3 kb EcoRI-EcoRV-fragment 10 fra pMT342 blev ligeret til et 0,6 kb EcoRI-Xbal-fragment fra pM215. Plasmid pMT342 er gærvektoren pMT212 med en indsat TPIp-MFal-leader-BCA-TPI,p-sekvens. Konstruktionen af pMT342 og pMT212 er beskrevet i EP patentansøgning nr. 0068701 A. Plasmid pM215 blev konstrueret ved subkloning af EcoRI-Xbal-fragment 15 indeholdende den proinsulinkodende sekvens B-C-A fra p285 (ATCC nr. 20681) i pUC13 (konstrueret som beskrevet for pUC8 og pUC9 af Vieira et al., Gene 19^: 259-268 (1982)) og påfølgende in vitro loop-out fjernelse af de 12 baser, der koder for Glu-Ala-Glu-Ala ved sammenknytningen mellem MFal-leaderen og proinsulin B-C-A.

20 P285 indeholder sekvensen TPIp-MFal-leader-B-C-A-TPIT og er blevet deponeret i gærstamme Z33 (ATCC nr. 20681). Dens konstruktion er beskrevet i US patentansøgning S.N. 547.748 fra 1. november 1983.

Ligering af de ovennævnte fragmenter fra pMT342 og 25 pM215 giver plasmid pMT462, der indeholder sekvensen MFal-leader-(minus Glu-Ala-Glu-Ala)-B-C-A. til omdannelse af det B-C-A-koden-de fragment i et B-Lys-Arg-A-kodende fragment blev der anvendt en modificeret site specifik mutageneseprocedure (K. Norris et al., ibid.). Et 0,6 kb EcoRI-Xbal fragment fra pMT462 kodende for 30 MFal-leader-(minus Glu-Ala-Glu-Ala)-B-C-A blev indsat i phag M13 mplO RF (Messing, J. og Vieria, J. (1983) ikke-publicerede resultater), og DNA blev skåret med Xbal-EcoRI. Enkeltstrenget M13 phag indeholdende det ovennævnte EcoRI-Xbal fragment blev inkuberet med 30-mer deletionsprimer KFN4 og "universal" 15-mer M13 35 primeren d(TCCCAGTCACGACGT) (New England Biolabs), opvarmet til 90°C i 5 minutter og langsomt afkølet til stuetemperatur for at tillade annealing. Det delvist dobbeltstrengede DNA blev frem-

DK 158270 B

16 stillet ved tilsætning af en d-NTP-blanding, Klenow Polymerase og T4 ligase. Efter fenolekstraktion, ethanoludfældning og resuspen-dering blev DNA skåret med restriktionsenzymerne Apal, Xbal og ECoRI. Efter en yderligere fenolekstraktion, ethanoludfældning og 5 resuspension blev DNA ligeret til pUC13 skåret med EcoRI-Xbal. Ligeringsblandingen blev transformeret i en E. coli (r m+)-stamme, og plasmider blev fremstillet ud fra et antal transformanter. Plasmidpræparaterne blev skåret med EcoRI og Xbal, og sådanne præparater, der udviste bånd ved både 0,5 og 0,6 kb blev trans-10 formeret i E. coli. Ved retransformering blev der udvalgt en transformant, der kun indeholder pUCl3 med et indsat fragment på 0,5 kb. Sekvensen af EcoRI-Xbal-fragmentet fra dette plasmid, pMT579, blev derpå bekræftet ved Maxam-Gilbert metoden til at kode for MFal-leader-(minus Glu-Ala-Glu-Ala)-B-Lys-Arg-A. Kon-15 struktionen af pMT579 blev vist i fig. 2. Xbal-EcoRI-fragmentet fra pMT579 blev forsynet med TPI-promotor og TPI-terminator ved ligering af et 0,5 kb Xbal-EcoRI-fragment fra pMT579 med et 5,5 kb Xbal-EcoRI-fragment fra pT5. Konstruktionen af pT5, der indeholder den indsatte sekvens TPIp-MFal-leader-B-C-A-TPIT, er 20 illustreret i fig. 3. Det fremkomne plasmid pMT583, der indeholder den indsatte sekvens TPIp-MFal-leader-(minus Glu-Ala-Glu-Ala) -B-Lys-Arg-A-TPIT, blev derpå skåret med BamHI og delvist med Sphl, og 2,1 kb fragmentet blev indsat i CPOT, skåret med BamHI og Sphl. Det fremkomne plasmid pMT585 blev anvendt til transfor-25 mering af gær. Konstruktionen af pMT583 og pMT585 er vist i fig.

3.

Eksempel 2

Konstruktion af et gærplasmid pMT611 til udtrykkelse af B-Arg-30 Arg-A

Fragmentet, der koder for B-C-A, fra pMT462 (se eksempel I), blev omdannet til B-Arg-Arg-A ved en procedure analog med den i eksempel 1 beskrevne ved site specifik mutagenese med en blanding af 30mer deletionsprimeren KFN18 og "universal" 15-mer 35 M13 primeren som illustreret i fig. 5. Sekvensen af det indsatte EcoRI-Xbal fragment i plasmid pMT599 blev bestemt ved Maxam-Gilbert metoden til at kode for MFal-leader-(minus Glu-Ala-Glu-

17 DK 158270 B

Ala)-B-Arg-Arg-A. Xbal-EcoRI fragmentet fra pMT599 blev forsynet med TPI-promotor og TPI-terminator ved ligering af et 0,5 kb Xbal-EcoRI-fragment fra pMT599 med et 5,5 kb Xbal-EcoRI-fragment fra pT5. Det fremkomne plasmid pMT602 indeholder fragmentet 5 TPIp-MFal-leader-(minus Glu-Ala-Glu-Ala)-B-Arg-Arg-A-TPI^, og blev derpå skåret med BamHI og delvist med Sphl, og 2,1 kb fragmentet blev indsat i CPOT skåret med BamHI og Sphl. Det fremkomne plasmid pMT611 blev anvendt til transformering af gær. Konstruktionen af plasmid pMT611 er beskrevet i fig. 5.

10

Eksempel 3

Konstruktion af et gærplasmid pMT650 til udtrykkelse af B-Lys-Lys-A

Fragmentet, der koder for B-C-A fra pMT462 (se eksempel 15 1), blev omdannet til B-Lys-Lys-A ved en procedure som beskrevet i eksempel 1 ved site specifik mutagenese med en blanding med 30mer deletionsprimeren KFN41 og "universal" 15-mer M13 primeren som illustreret i fig. 6.

Efter udfyldning med Klenow polymerase og ligering med 20 T4 ligase blev det delvist dobbeltstrengede DNA fordøjet med

Apal, EcoRI og Xbal og ligeret til et 5,5 kb Xbal-EcoRI-fragment fra plasmid pT5 (se eksempel 1). Efter transformation og retrans-formation i E. coli, blev der isoleret et plasmid pMT652, der indeholder det indsatte fragment MFal-leader-(minus Glu-Ala-Glu-25 Ala)-B-Lys-Lys-A, og sekvensen af dette fragment blev bekræftet som beskrevet ovenfor.

Plasmid pMT652 blev spaltet med Xbal-EcoRI, og 0,5 kb fragmentet blev ligeret med et 7,8 kb Xbal-KpnI-fragment og et 4,3 kb KpnI-EcoRI-fragment fra pMT644. Det fremkomne plasmid 30 pMT650 indeholder det indsatte fragment TPIp-MFal-leader-(minus Glu-Ala-Glu-Ala)-B-Lys-Lys-A-TPIT og indeholder desuden genet kodende for TPI (POT) fra CPOT. Konstruktionen af plasmid pMT650 er illustreret i fig. 6, og konstruktionen af pMT644 er vist i fig. 4. Plasmiderne pUCl2 og pUCl8, anvendt til konstruktion af 35 pMT644, blev konstrueret som beskrevet for pUC13 (Vieira et al., ibid.). Plasmid p601 (se fig. 4) indeholder det indsatte fragment TPIp-MFal-leader-B'A-TPIT med flankerende Bglll- og BamHI-sites.

18 DK 15827 OB

B'A betyder B(1-29)-A(1-21), hvor B(l-29) er en forkortet B-kæde

Bl B2 9 af human insulin fra Phe til Lys , og A(1-21) er A-kæden af human insulin. Konstruktionen af en DNA-sekvens, der koder for B'A, er beskrevet i EP patentansøgning nr. 0068701 A. pMT650 blev 5 anvendt til transformering af gær.

Eksempel 4

Konstruktion af plasmid pMT658 til udtrykkelse af B-Arg-Lys-A Plasmid pMT658 blev konstrueret som beskrevet for 10 pMT650 i eksempel 3 med undtagelse af, at der blev anvendt en 30mer deletionsprimer KFN42 i stedet for KFN41. Der blev også anvendt en mere direkte konstruktion af pMT644-derivatet: efter in vitro mutagenese, d.v.s. efter udfyldning med Klenow polymerase og ligering med T4 ligase, blev delvist dobbeltstrenget DNA 15 fordøjet med Apal, EcoRI og Xbal og ligeret til et 7,8 kb Xbal-Kpnl- og et 4,3 kb KpnI-EcoRI-fragment fra pMT644. Ligeringsblandingen blev anvendt til transformering i E. coli (r**m+), og plasmid blev fremstillet fra et antal transformanter. Et plasmidpræ-parat, der viste Xbal-EcoRI-fragmenter ved både 0,6 og 0,5 kb, 20 blev retransformeret i E. coli til dannelse af en stamme, der indeholder et plasmid pMT658 indeholdende 0,5 kb-, men ikke 0,6 kb EcoRI-Xbal-fragmentet. pMT658 indeholder det indsatte fragment TPIp-MFal-leader-(minus Glu-Ala-Glu-Ala)-B-Arg-Lys-A-TPI^. Sekvensen af segmentet, der koder for B-Arg-Lys-A, blev verifi-25 ceret ved Maxam-Gilbert DNA-sekventering. Konstruktionen af pMT658 er illustreret i fig. 7. pMT658 blev anvendt til transformering af gær.

Eksempel 5 30 Transformering S. cerevisiae-stamme MT501 (E2-7B X E11-3C a/a,Atpi/^ tpi,pep 4-3/pep 4-3) blev dyrket på YPGaL (1% Bacto gærekstrakt, 2% Bacto pepton, 2% galactose, 1% lactat) til på 0,6. 100 ml kulturvæske blev høstet ved centrifugering, vasket med 10 ml 35 vand, recentrifugeret og resuspenderet i 10 ml 1,2 M sorbitol, 25 mM Na2EDTA pH = 8,0, 6,7 mg/ml dithiotreitol. Suspensionen blev inkuberet ved 30°C i 15 minutter og centrifugeret, og cellerne

19 DK 158270 B

blev resuspenderet i 10 ml 1,2 M sorbitol, 10 mM Na2EDTA, 0,1 M natriumcitrat pH = 5,8 og 2 mg Novozym®234. Suspensionen blev inkuberet ved 30°C i 30 minutter, cellerne blev opsamlet ved centrifugering, vasket i 10 ml 1,2 M sorbitol og i 10 ml CAS (1,2 5 M sorbitol, 10 mM CaCl2, 10 mM Tris (Tris = Tris(hydroxymethyl) -aminometal) pH = 7,5) og resuspenderet i 2 ml CAS. Til transformering blev 0,1 ml af de CAS-resuspenderede celler blandet med ca. 1 μg plasmid pMT585 og henstillet ved stuetemperatur i 15 minutter. Derpå blev der tilsat 1 ml 20% polyethylenglycol 10 4000, 10 mM CaCl2, 10 mM Tris pH = 7,5, og blandingen blev henstillet i yderligere 30 minutter ved stuetemperatur. Blandingen blev centrifugeret og pillerne resuspenderet i 0,1 ml SOS (1,2 M sorbitol, 33% v/v YPGAL, 6,7 mM CaCl2/ 14 μg/ml leucin) og inkuberet ved 30°C i to timer. Suspensionen blev derpå centrifugeret, 15 og bundfaldet blev resuspenderet i 0,5 ml 1,2 M sorbitol. Der blev tilsat 6 ml topagar (SC-mediet ifølge Sherman et al., (Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory 1981) med leucin udeladt og indeholdende 1,2 M sorbitol plus 2,5% agar), og suspensionen blev udhældt på toppen af plader indehol-20 dende det samme agarstørknede, sorbitolholdige medium. Transfor-mantkolonier blev udtaget efter 3 dage ved 30°C, reisoleret og anvendt til at starte flydende kulturer. En sådan transformant MT593 (=MT501/pMT585) blev valgt til yderligere karakterisering.

Plasmiderne pMT611, pMT650 og pMT658 blev transformeret 25 i S. cerevisiae stamme MT501 som beskrevet ovenfor, og transformanterne MT616 (=MT501/pMT611), MT655 (=MT501/pMT650) og MT660 (=MT501/pMT658) blev isoleret.

De transformerede mikroorganismer MT593, MT616, MT655 og MT660 er blevet deponeret af ansøgeren ved Deutsche Sammlung 30 von Mikroorganismen (DSM), Grisebachstrasse 8, D-3400 Gottingen d. 16 januar 1985 og fik henholdsvis deponeringsnumrene DSM 3194, DSM 3195, DSM3198 og DSM3199. DSM, der er et internationalt deponeringsinstitut anerkendt af Budapesttraktaten af 1977 sikrer permanensen af ovennævnte deponeringer og offentlighedens adgang 35 dertil ifølge regel 9 og 11 i førnævnte traktat.

20 DK 158270 B

De deponerede mikroorganismer DSM 3194, 3195, 3198 og 3199 er Saccharomyces cerevisiae stammer. De væsentlige forskelle på disse stammer og kendte S. cerevisiae stammer er, at det kromosomale gen for triosephosphatisomerase er inaktiveret (del-5 vist deleteret) i alle stammerne, og at de indeholder et recombinant plasmid kodende for en insulinprecursor som angivet i tabel 1.

Eksempel 6 10 Oprensning af B-Lys-Arg-A fra gærstamme MT593 (DSM 3194) Gærstamme MT593 (DSM 3194) blev dyrket på et YPD medium. En 1 liter kultur i en 2 liter rystekolbe blev rystet ved 30°C til O°goonm 15- Efter centrifugering blev ekspressionsprodukter fra 815 ml supernatant isoleret som følger: 15 En kolonne (1,5 x 9 cm) af LiChroprep® RP-18 (Merck art. 9303) blev vasket med 30 ml 50 mM NH^HCO^ indeholdende 60% (v/v) ethanol. Kolonnen blev ækvilibreret med 50 ml 50 mM NH^HCO^. Der blev tilsat 95 ml 96% ethanol til 815 ml af gærsuper nat anten, og blandingen blev pumpet gennem kolonnen i løbet 20 af natten (flow 45 ml/h).

Kolonnen blev vasket med 15 ml 0,1 M NaCl og derpå med 15 ml H20, og peptidmaterialet blev elueret med 50 mM NH4HCC>3 indeholdende 60% (v/v) ethanol. Eluatet (4,5 ml) blev koncentreret til 1,1 ml ved vacuumcentrifugering (Savant vacuumcentrifuge) 25 for at fjerne ethanol, og rumfanget blev indstillet til 10 ml med 25 mM HEPES puffer ved pH = 7,4. Blandingen blev påført en anti-insulinsepharosekolonne (2,5 x 4,5 cm), der før anvendelsen var blevet vasket med 20 ml NaFAM puffer (Heding, L., Diabetologia 8 (1972), 260-66) og med 10 ml 25 mM HEPES puffer pH = 7,4. Efter 30 påføringen fik kolonnen lov til at henstå i 30 minutter ved stuetemperatur og blev derpå vasket med 40 ml 25 mM HEPES puffer, pH = 7,4. Peptidmaterialet blev elueret med 20% eddikesyre, og pH-værdien af eluatet blev indstillet til 7,0 med NH^OH.

Eluatet fra det foregående trin blev koncentreret til 35 250 μΐ ved vacuumrotation, og peptider blev yderligere oprenset ved reverse phase HPLC på en 5 μ Waters Novapak C-18 kolonne (3,9 x 150 mm). A- og B-pufferne var henholdsvis 0,1% TFA i ^0 og

21 DK 158270 B

0,07% TFA i acetonitril. Kolonnen blev ækvilibreret med 25% B ved et flow på 0,75 ml/min., og peptiderne blev elueret med en lineær gradient (1% acetonitril per min.) og detekteret ved 276 nm. Hovedtoppen eluerede med en retentionstid på 13,15 min., og 5 peptidmaterialet fra denne top blev isoleret ved lyophilisering af eluatet. Peptidmaterialet blev karakteriseret som beskrevet i eksempel 8. Udbyttet fra hvert trin af oprensningen blev bestemt ved radioimmunoassay som beskrevet tidligere, og oprensningen er angivet i tabel 2. Det samlede udbytte var 39%.

10

Tabel 2

Oprensning af B-Lys-Arg-A fra gærstammen MT593_

Oprensningstrin Rumfang (ml) Immunoreaktiv 15 _B-Lys-Arg-A (nmol)

Supernatant 815 813 RP-18 kolonne 10 620

Anti-insulin- sepharose-kolonne 4 450 20 Præparativ HPLC 2 320

Eksempel 7

Oprensning af B-Lys-Lys-A, B-Arg-Lys-A og B-Arg-Arg-A henholdsvis 25 fra gærstammerne MT655 (DSM 3198), MT660 (DSM 3199) og MT 616 (DSM 3195)

De ovenfor nævnte gærstammer blev dyrket som beskrevet tidligere i eksempel 6, og ekspressionsprodukterne blev oprenset fra de forskellige supernatanter hovedsageligt som beskrevet i 30 eksempel 6. De samlede udbytter er angivet i tabel 3.

Tabel 3 Gærstammen Supernatant Peptidud- Samlet ud- _volumen (ml) bytte (nmol) bytte (%) 35 MT655 (DSM 3198) 750 ml 689 53 MT660 (DSM 3199) 500 ml 395 38 MT616 (DSM 3195)_600 ml_301_49

22 DK 158270 B

Eksempel 8

Karakterisering af B-Lys-Arg-A oprenset fra gærstamme MT593 (DSM 3194) B-Lys-Arg-A blev oprenset som beskrevet i eksempel 6.

5 Aminosyresammensætningen af peptidet blev bestemt som følger: 139,6 μg (19 nmol) blev hydrolyseret i 100 μΐ 6 N HCl i 24 timer ved 110°C. Hydrolysatet blev analyseret på en Beckman Model 121 M aminosyreanalysator. Der blev fundet følgende aminosyresammensæt-ning: 10

Tabel 4

Aminosyreanalyse af oprenset B-Lys-Arg-A

Aminosyre Fundet Teoretisk Aminosyre Fundet Teoretisk Asx* 2,92 3 Val 3,71 4 15 Thr 2,77 3 Ile 1,62 2

Ser 2,59 3 Leu* 6,03 6

Glx* 7,01 7 Tyr 3,83 4

Pro 1,37 1 Phe* 2,93 3

Gly* 3,95 4 Lys* 1,96 2 20 Ala* 1,03 1 His* 2,01 2 1/2 Cys 5,47 6 Arg* 2,08 2 *) Aminosyre anvendt til normalisering 25 Ca. 5 nmol peptidmateriale blev underkastet en aminosy- resekvénsanalyse. Sekvensanalysen blev udført med en gasfasese-kvensator (Applied Biosystem Model 470 A) som beskrevet af Moody, A.J., Thim, L. og Valverde, I. (FEBS Lett., Γ72 (1984), 142-148). Der blev fundet følgende resultater:

23 DK 158270 B

Tabel 5

Aminosyresekvensanalyse af oprenset B-Lys-Arg-A Cyclus PTH-aminosyrere st Udbytte (pmol) T ' Phe Bl ~ ~ 1700 5 2 Val 977 3 Asn 2100 4 Gin 951 5 His 1327 6 Leu 1717 10 7 Cys 8 Gly 938 9 Ser 184 10 His 591 11 Leu 718 15 12 Val 777 13 Glu 363 14 Ala . 491 15 Leu 408 16 Tyr 723 20 17 Leu 724 18 Val 631 19 Cys 20 Gly 187 21 Glu 239 25 22 Arg 413 23 Gly 240 24 Phe 456 25 Phe 425 26 Tyr 223 30 27 Thr 78 28 Pro 109 29 Lys 158 30 Thr B30 59 31 Lys 94 35 32 Arg 58 33 Gly Al 56 34 Ile 179 35 Val 103 36 Glu 83 40 37 Gin 136 38 Cys 39 Cys 40 Thr 17 41 Ser Spor 45 42 Ile 53 43 Cys 44 Ser Spor 45 Leu 60 46 Tyr 43 50 47 Gin Spor 48 Leu 64 49 Glu 40 50 Asn 29 51 Tyr Spor 55 52 Cys 53 Asn A21 30

Det repetitive udbytte var 92,1%.

μ . DK 158270 Β

Eksempel 9

Karakterisering af B-Lys-Lys-A, B-Arg-Lys-A og B-Arg-Arg-A oprenset henholdsvis fra gærstammer MT655 (DSM 3198), MT660 (DSM 3199) og MT616 (DSM 3195) 5 Peptidmaterialet blev oprenset fra de ovennævnte gær stammer som beskrevet i eksempel 6. Peptiderne blev underkastet en aminosyresekvensanalyse som beskrevet i eksempel 8. Fra sekvensresultaterne (ikke vist) kunne det konkluderes, at den dibasiske sekvens, der forbinder B- og A-kæden, var henholdsvis 10 Lys-Lys (MT655), Arg-Lys (MT660) og Arg-Arg (MT616). Oprensede peptider blev underkastet en aminosyreanalyse som beskrevet i eksempel 7. Aminosyresammensætningen blev fundet at være i overensstemmelse med det teoretiske (resultater kun vist for B-Lys-Lys-A) .

15

Tabel 6

Aminosyreanalyse af oprenset B-Lys-Lys-A

Aminosyre Fundet Teoretisk Aminosyre Fundet Teoretisk Asx* 2,95 3 Val 3,74 4 20 Thr 2,77 3 Ile 1,68 2

Ser 2,59 3 Leu* 6,05 6

Glx* 6,92 7 Tyr 3,84 4

Pro 1,14 1 Phe* 2,97 3

Gly* 3,95 4 Lys* 2,94 3 25 Ala* 1.03 1 His* 1,96 2 1/2 Cys 5,44 6 Arg* 1,05 1 *) Aminosyre anvendt til normalisering 30

Eksempel 10

Omdannelse af B-Lys-Arg-A til human insulin (éttrinsproces) 10 mg B-Lys-Arg-A blev opløst i 10 ml 0,23 M TRIS-HCl 35 puffer pH = 7,5. Opløsningen blev opvarmet til 37°C, og der blev tilsat 50 μg trypsin (NOVO Industri A/S) og 50 μg carboxypepti-dase B (Boehringer) begge opløst i 100 μΐ vand til tid 0. Prøver

25 DK 158270 B

af reaktionsblandingen blev fjernet på tidspunktet 0 min., 2 min., 10 min., 40 min. og 80 min. Enzymreaktionen blev stoppet ved at gøre prøverne sure til pH = 2,5 med 1 M HCl.

Omdannelse af B-Lys-Arg-A i human insulin blev fulgt 5 ved revers phase HPLC på en 5 μ RP C-18 kolonne (4 x 200 mm) af Nucleosil (Machery Nagel). A pufferen bestod af 25% acetonitril indstillet til pH = 3,5 med ^SO^, og B pufferen var 45% acetonitril, 0,15 M (NH^^SO^, 1,5 mM ^SO^. Elueringen blev udført i et isokratisk system under anvendelse af en blanding af 80% A-10 puffer/20% B-puffer ved et flow på 1 ml/min. Temperaturen af opløsningsmiddel og kolonne var 30°C, og peptiderne blev detek-teret ved 214 nm.

Det optimale udbytte ved den ovennævnte éttrinsproces blev opnået efter 10 minutters inkubering. På dette tidspunkt 15 bestod reaktionsblandingen af 45% human insulin, 10% Des-B30-insulin og 45% Arg-A0-insulin. For at forøge udbyttet af omdannelsen blev der udarbejdet en totrinsproces (eksempel 11).

Eksempel 11 20 Omdannelse af B-Lys-Arg-A i human insulin (totrinsproces) 26,4 ml ^0 blev sat til 471 mg B-Lys-Arg-Å. Blandingen blev afkølet til 4°C, og der tilsattes 3,0 ml 0,25 M NaOH, hvorved insulinprecursoren blev opløst. Derpå tilsattes 6 mg trypsin (NOVO Industri A/S) i 200 μΐ vand. Reaktionen blev udført 25 ved 4°C i 5 timer og standset ved tilsætning af 600 μΐ 4 N HCl. Udbyttet bestemt ved HPLC (på den i eksempel 10 angivne måde) var 91,5% B-Lys-Arg A, og hovedparten af de resterende 8,5% var ... *-r „ , -r ikke-fordøjet B-Lys-Arg-A. Produktet (B-Lys-Arg A) blev oprenset ved præparativ HPLC på en kolonne (5 x 25 cm) af octadecyldime-30 thylsilylsubstitueret silica (middelpartikelstørrelse 15 μ, porestørrelse 100 Å). Kolonnen blev ækvilibreret og elueret (isokratisk) med 0,185 M KCl/0,6 mM HCl (pH = 3,15) indeholdende 37% (v/v) ethanol ved en gennemløbshastighed på 2 liter/timer. B--1

Lys-Arg A elueret ved 4,3 kolonnerumfang og blev isoleret fra 35 den alkoholiske pool ved den tidligere beskrevne krystallise-

26 DK 158270 B

ringsprocedure til krystallisering af human insulin B-30 estere (Markussen, J. (1984) i "Diabetes Research Vol I, Laboratory Methods Part B", 403-411, eds. Larner og Pohl).

Krystallerne blev lyophiliseret og opløst i 50 mM 5 TRIS-HC1 puffer (pH =9,3) i en koncentration på 10 mg/ml. Insu-linprecursorintermediatet blev omdannet til human insulin ved fordøjelse med carboxypeptidase B (40 μg/ml) ved 37°C i 40 timer. Der blev derpå sat ethanol til den fordøjede blanding til en slutkoncentration på 60% (v/v), og human insulin blev oprenset 10 fra blandingen ved anionbytterchromatografi på en QAE-Sephadex (Pharmacia) kolonne som beskrevet af Schlichtkrull et al. (Horm.Metab.Res.Suppl., Ser. 5 (1974) 134-143).

Udbytterne ved de forskellige trin for omdannelsen omfattende oprensningen er angivet i tabel 7.

15

Tabel 7

Omdannelse af B-Lys-Arg-A i human insulin

Trin_Produkt_Mængde (mg) Udbytte (%) i-r 20 Udgangsmateriale B-Lys-Arg-A 471 100 i-r

Trypsinfordøjelse B-Lys-Arg A 431 91,5 i-1 HPLC-pool B-Lys-Arg A 399 84,7 25 ΓΊ

Carboxypeptidase-B-fordøj else B A (human insulin) 379 80,5 1 [ QAE-pool B A (human insulin) 359 76,2 30

Eksempel 12

Omdannelse af B-Lys-Lys-A i human insulin (éttrinsproces) 10 mg B-Lys-Lys-A blev omdannet til human insulin som beskrevet i eksempel 10. Det samlede udbytte af human insulin 35 bedømt ved HPLC var 48%. De øvrige produkter blev identificeret som Lys-A0-insulin (42%), Des-B30-insulin (9%) og mindre mængder uidentificerede komponenter (1%).

27 DK 158270 B

Eksempel 13

Karakterisering af human insulin fremstillet ud fra B-Lys-Arg-A

Human insulin blev fremstillet som beskrevet i eksempel 11 og karakteriseret ved følgende analyse: 5 a) Human insulinet viser kun et bånd på basisk discelektroforese i urinstofholdige polyacrylamidgeler (metoden beskrevet af Schlichtkrull et al., Horm.Metabol.Res., Suppl.Ser. 5 (1974) 134-143). Båndet migrerede som pancreatisk human insulin.

b) Regulært formede romboedriske krystaller blev opnået ved 10 krystallisering af human insulin i nærværelse af Zn++ (metode beskrevet af Schlichtkrull, Acta Chem.Scand. 10 (1956) 1459-1464) .

c) Den biologiske aktivitet af human insulin blev bestemt ved en museblodsukker depletionstest. Den estimerede styrke var 28,1 15 I.U./mg (p 0,05: 25,7-30,7 I.U./nag) under anvendelse af 4. internationale standard for insulin.

d) Aminosyresammensætningen af human insulin blev bestemt efter hydrolyse ved 110°C i 24 timer, 48 timer og 96 timer i 6 N HC1, og værdierne for Thr, Ser, Pro og NH^ blev bestemt ved lineær 20 regression (t = 0). Værdierne for Val og Ile blev ekstrapoleret til uendelig hydrolysetid. Værdien for 1/2 Cys blev bestemt efter hydrolyse i 24 timer i 4 M methansulfonsyre. Aminosyresammensætningen er angivet i tabel 8.

28 DK 158270 B

Tabel 8

Aminosyresammensætning af human insulin fremstillet ud fra B-Lys-Arg-A.

5 Aminosyre Aminosyrerest/molekyle _Fundet Teoretisk_

Asx 2,95 3

Thr 2,90 3

Ser 3,00 3 10 Glx 6,95 7

Pro 1,06 1

Gly 3,95 4

Ala 1,04 1 1/2 Cys 5,65 6 15 Val 4,10 4

Ile 2,00 2

Leu 6,00 6

Tyr 3,94 4

Phe 2,93 3 20 Lys 1,01 1

His 1,96 2

Arg 1,02 1 (NH3) (5,60) (6)

Claims (6)

29 DK 158270 B NYE PATENTKRAV 5

1. DNA-sekvens, kendetegnet ved, at den består af en sådan nucleotidkombination, som er nødvendig for kodning for en human insulinprecursor med formlen B-X-Y-A (I) i hvilken B og A er B- og A-kæden i human insulin tværbundet som 15 i human insulin, og X og Y hver uafhængigt er lysin eller argi-nin.

2. Plasmid kendetegnet ved, at det indeholder en DNA-sekvens ifølge krav 1. 20

3. Fremgangsmåde til fremstilling af en human insulinprecursor med formlen B-X-Y-A (I), i hvilken B og A er B- og A-kæden i human insulin tværbundet som 25 i human insulin, og X og Y hver uafhængigt er lysin eller arginin, kendetegnet ved, at en gærstamme transformeret med et plasmid ifølge krav 2, dyrkes i et egnet dyrkningsmedium, og at human insulinprecursoren udvindes fra dyrkningsmediet.

4. Fremgangsmåde til fremstilling af human insulin, kendetegnet ved, at en gærstamme transformeret med et plasmid ifølge krav 2, dyrkes i et egnet dyrkningsmedium, og at human insulinprecursoren udvindes fra dyrkningsmediet og omdannes 35 til human insulin ved enzymatisk behandling på i og for sig kendt måde.

30 DK 158270 B

5. Fremgangsmåde ifølge krav 4, kendetegnet ved, at den enzymatiske behandling omfatter to trin, idet første trin er en behandling med trypsin og andet trin er en behandling med carboxypeptidase B. 5

6. Fremgangsmåde ifølge krav 5, kendetegnet ved, at trypsinbehandlingen gennemføres ved en pH-værdi fra 11 til 12.