FI87801C

FI87801C - Foerfarande foer framstaellning av maenniskoinsulinprekursorer samt i foerfarandet anvaenda dna-sekvensen och plasmider

Info

Publication number: FI87801C
Application number: FI861198A
Authority: FI
Inventors: Kjeld Norris; Lars Thim; Mogens Trier Hansen
Original assignee: Novo Nordisk As
Priority date: 1985-03-22
Filing date: 1986-03-21
Publication date: 1993-02-25
Also published as: JPH088871B2; JPH0823985A; IE58842B1; ES557227A0; FI87801B; CA1340823C; AU586855B2; GR860764B; JPH06133777A; PT82241A; PT82241B; MX163837B; NO172646C; IE860737L; FI861198A0; JP2553326B2; DK129385D0; NO172646B; ES553231A0; AU5500586A

Description

1 87801

Menetelmä ihmisinsuliiniprekursorien valmistamiseksi sekä menetelmässä käytettävät DNA-sekvenssit ja plasmidit

Keksintö koskee uusia biosynteettisiä insuliinin prekursoreja ja ihmisinsuliinin valmistusta tällaisista biosynteettisistä insuliinin prekursoreista.

Ihmisinsuliini koostuu kahdesta peptidiketjusta, joista A-ket.ju sisältää 21 aminohappotähdettä ja B-ketju 30 aminohappotähdettä. A- ja B-ketju ovat liittyneet yhteen kahdella disul-fidisillalla, jotka liittävät A7-tähteen B7-tähteeseen ja A20-tähteen B19-tähteeseen vastaavasti. A6-tähteen ja All-tähteen välillä on kolmas disulfiäisiltä.

Ihmisinsuliinia muodostuu in vivo haimassa preproinsuliinin muodossa. Preproinsuliinissa on 24 aminohappotähteen prepepti-di ja sitä seuraava 86 aminohappotähteen proinsuliini rakenteen ollessa kaikkiaan seuraava: prepeptidi-B-Arg-Arg-C-Lys-Arg-A, jossa C on 31 aminohappotähteestä koostuva C-peptidi.

. : : Saarekesoluista erittymisen aikana prepeptidi irtoaa pois ja :*·: proinsuliini taittuu rakenteeseen, jossa disulfidisillat muo- dostuvat. Sen jälkeen C-peptidi leikataan pois proteolyytti-sesti ja tuloksena on kypsä ihmisinsuliini.

Insuliinin ja erityisesti ihmisinsuliinin valmistusta on yritetty yhdistelmä-DNA-tekniikan avulla useaan kertaan. Eurooppalaisessa patenttijulkaisussa 0055945 A selostetaan proinsu-liinin tai miniproinsuliinien valmistusta E. colin avulla.

: .. Menetelmässä ilmennetään kimeerinen polypeptidi, katkaistaan tämä kimeerinen polypeptidi in vitro ja muodostetaan in vitro disulfidisidokset A- ja B-ketjun välille ja leikataan A- ja B-ketjuja yhdistävä siltaketju pois niin, että syntyy ihmisinsuliini. Eurooppalaisessa patenttijulkaisussa 68701 ehdotetaan muunnettujen proinsuliinien valmistusta, joissa on 2 87801 enemmän tai vähemmän lyhennetty C-peptidi, suorittamalla E. colin transformointi.

Edellä mainitut menetelmät sisältävät useita heikkouksia, jotka pääasiassa johtuvat transformoinnissa käytetystä E. colista. Ilmentyneet tuotteet eivät erity ulos soluista ja kertyvät E. coli-isäntäorganismin solujen sisälle. Kun preproinsuliinin tai muunnetun preproinsuliinin tyyppiä oleva ilmentynyt polypeptidi kertyy solujen sisään, kasvaa ilmentyneen tuotteen entsymaattisen hajoamisen riski. Lisäksi prosessointi, kokoontaittaminen ja disulfidisiltojen muodostaminen pitää ilmeisesti suorittaa in vitro.

Edullisempi systeemi nisäkkäiden polypeptidien ilmentämiseksi näyttävät olevan eukaryoottisolut ja useita yrityksiä onkin tehty vieraiden geenien ilmentämiseksi eukaryooteissa, erityisesti hiivassa. Interferonin ilmentämistä hiivassa on selostettu eurooppalaisessa patenttijulkaisussa 0060057A ja hiivalle heterologisten proteiinien ilmentymistä ja erittymistä on selostettu eurooppalaisissa patenttijulkaisuissa 0088632A, 0116201A ja 0123544A.

-···. Menetelmää "pre"-proinsuliinin ilmentämiseksi hiivassa ja ilmen- ·...: tyneen "pre”-proinsuliinin prosessointia ja erittymistä on selostettu eurooppalaisessa patenttijulkaisussa 0121884A.

Nyt esillä olevan keksinnön tekijät ovat kuitenkin osoittaneet, että proinsuliinityyppiset insuliinin prekursorit ovat herkkiä entsymaattiselle hajoamiselle hiivassa, mikä johtaa mataliin tai mitättömiin erittyneen proinsuliinin tai kypsän insuliinin saantoihin. On osoitettu hiivassa, että ihmisen proinsuliini ja proinsuliinianalogit, joissa on enemmän tai vähemmän lyhennetty C-peptidi, ovat erityisen herkkiä entsymaattiselle katkeamiselle, joka kohdistuu kahteen C-peptidi-alueen vieressä olevaan kaksiemäksiseen sekvenssiin. Ilmeisesti nämä katkeamiset tapahtuvat ennen S-S-siltojen syntymistä, ja seurauksena on C-peptidin, A-ketjun ja B-ketjun muodostuminen.

3 87801

Esillä oleva keksintö tarjoaa insuliinin prekursoreja, jotka syntyvät suurilla saannoilla hiivassa, ja joissa on oikealla tavalla sijaitsevat disulfidisillat A- ja B-ryhmien välillä, ja jotka voidaan helposti muuntaa ihmisen insuliiniksi.

Useita proinsuliinityyppisiä insuliinin prekursoreja, proinsu-liini mukaanluettuna, on tutkittu (ks. taulukko 1 jäljempänä). Kyseisiä prekursoreja koodittavat DNA-sekvenssit sijoitettiin hiivan vektorisysteemiin ja suoritettiin hiivan transformointi edellä kuvatulla menetelmällä, jota on jäljempänä kuvattu myös yksityiskohtaisesti. Insuliinin prekursoria koodittava geeni varustettiin hiivan tunnistamia eritys- ja prosessointi-signaaleja koodittavalla DNA-sekvenssillä, joka oli liitetty prekursorigeenin ylävirtaan. Esillä olevassa tutkimuksessa käytettiin muunnettua MFal-johtosekvenssiä, josta johtosekvens-sin neljää viimeistä tähdettä (Glu-Ala-Glu-Ala) koodittava jakso oli poistettu. Muunnettu MFal-johtosekvenssi sisältää proses-sointisignaaleina kaksiemäksisen Lys-Arg-sekvenssin, joka sen jälkeen liitetään prekursoria koodittavan geenin 5'-päähän. Havaittiin, että johtosekvenssi irtosi kaikissa rakenteissa W eli katkeaminen tapahtui kaksiemäksisessä Lys-Arg-sekvenssissä, joka oli insuliinin prekursorin geenien ylävirrassa. Kuitenkin " kaikissa insuliinin prekursorirakenteissa, joissa oli 2 kaksi- ··' emäksistä sekvenssiä C-peptidin tai muunnetun C-peptidin vieressä, havaittiin kummankin kaksiemäksisen kohdan prosessoituminen ennen disulfidisiltojen syntymistä, ja näin ollen fermentaatio-liuoksesta ei pystytty eristämään yhtään yksisäikeistä pro-. , sessoitumatonta prekursorimolekyyliä. Näin ollen hiivaa ei voida käyttää ilmentämisjärjestelmänä proinsuliinityyppisten insuliinin prekursorien tuottamisessa.

Nyt on yllättäen havaittu, että liitettäessä ihmisen insuliinin A- ja B-ketju toisiinsa vain yhdellä kaksiemäksisellä sekvens-; sillä (taulukon 1 mukaiset rakenteet 7-10), ei kaksiemäksisen sekvenssin katkeamista esiinny hiivassa ja yksiketjuisia insuliinin prekursoreja, joissa on oikeassa asemassa olevat di-sulfidisillat, saadaan suurilla saannoilla fermentointiliemistä, t 4 87801 joissa on kasvatettu kyseistä insuliinin prekursoria kooditta-valla DNA-sekvenssillä transformoituneita hiivakantoja.

Esillä oleva keksintö näyttää sitäkin yllättävämmältä, kun ajatellaan, että prekursoria koodittavan geenin ylävirrassa sijaitsevassa johtosekvenssissä havaittiin Lys-Arg:n täydellinen katkeaminen.

Koska tämäntyyppiset insuliinin prekursorit, joissa on yksi kaksiemäksinen sekvenssi A- ja B-ketjun välissä, voidaan helposti muuntaa ihmisinsuliiniksi in vitro suorittamalla pilkkominen jäljempänä tarkemmin selostetulla tavalla, tarjoaa tämä keksintö taloudellisesti houkuttelevan tavan tuottaa ihmisinsu-liinia.

Ensinnäkin tämä keksintö tarjoaa yleisen kaavan I mukaisia uusia insuliinin prekursoreja B-X-Y-A (I) jossa B ja A tarkoittavat ihmisinsuliinin B- ja A-ketjua silloitettuina yhteen kuten ihmisinsuliinissa ja kukin ryhmistä X ja Y voi olla lysiini tai arginiini.

Edellä olevan kaavan (I) mukaiset insuliinin prekursorit ovat Lys-A, B-Lys-Arg-A, B-Arg-Lys-A ja B-Arg-Arg-A, joista kaksi ensin mainittua asetetaan etusijalle.

Toiseksi tämä keksintö tarjoaa menetelmän edellä mainittujen insuliinin prekursorien tuottamiseksi hiivassa siten, että hii-vakantaa, joka on transformoitunut insuliinin prekursoria koo-dittavan DNA-sekvenssin sisältävällä ilmentämisvälineellä, viljellään sopivassa elatusaineessa ja insuliinin prekursori otetaan talteen elatusaineesta.

Kun tällä tavoin transformoituneita hiivakantoja viljeltiin, saatiin elatusaineesta talteen kaikkia neljää tämän keksinnön mukaista insuliinin prekursoria suurella saannolla, ja B-Lys-Lys-A sekä B-Lys-Arg-A ilmentyivät suurimmilla saannoilla.

5 37801

Ilmentymisen määrän kannalta katsottuna, ovat nämä kaksi pre-kursoria edullisimpia.

Ilmentymistuotteet eristettiin ja insuliinina immunoreagoiva materiaali (IRI-peptidit) puhdistettiin ja tunnistettiin mikro-sekvenssianalyysillä. Havaittiin, että edellä olevan kaavan (I) mukaiset prekursorit ovat yksiketjuisia molekyylejä, joissa kolme disulfidisiltaa liittää yhteen seuraavat puolikysteiini-t Hh teet* : A(> — A I 1 , Λ7-Π7 ja Λ20-ΜΊ « | | pi <*km aot i I I hirnut yväl hiivassa siten, että ne saavat oikein sijaitsevat disulfidi-sillat ihmisinsuliiniin verrattuna. Uusien insuliinin prekur-sorien rakenne on esitetty kuvassa 1.

Edelleen keksintö tarjoaa uusia ilmentämisvälineitä edellä mainittujen insuliinin prekursorien tehokkaaksi tuottamiseksi hiivaisännässä ja prekursorien erittämiseksi ravintoalustaan. Ilmentämisvälineet sisältävät replikaatiojärjestelmän, jonka avulla tapahtuu stabiili pysyminen yllä hiivaisännässä, sekä edellä mainitun kaavan (I) mukaisia insuliinin prekursoreja koodittavan DNA-sekvenssin ja promoottori- ja terminaattori-sekvenssit.

...... Ilmentämisväline voi sisältää haluttua tuotetta koodittavan DNA- sekvenssin ylävirrassa prealueen, joka varmistaa ilmentyneen tuotteen ohjautumisen hiivan eritysjärjestelmään ja ilmentyneen tuotteen erittymisen kasvualustaan. Tämä prealue voi olla luonnostaan esiintyvä signaali- tai johtopeptidi tai erittymisen aikaansaava synteettinen sekvenssi, joka tavallisesti katkeaa irti halutusta tuotteesta erittymisen yhteydessä jättäen jäljelle kypsän tuotteen, joka voidaan eristää kasvualustasta.

: Erittäin hyvin hiivoissa käytettäväksi soveltuva johtosekvenssi on hiivan MFal-johtosekvenssi /Kurjan, J. ja Herskowitz, I.,

Cell 30, (1982), 933-9437.

6 87801 *.....

Ilmentämisväline voi olla plasmidi, joka kykenee replikoituinaan isäntämikro-organismissa tai kykenee integroitumaan isäntä-organismin kromosomiin. Käytetty väline voi koodittaa halutun DNA-sekvenssin toistuvia sekvenssejä, jotka on erotettu toisistaan selektiivisillä katkaisukohdilla.

Halutun DNA-sekvenssin ilmentyminen on sellaisen promoottori-sekvenssin ohjauksessa, joka sijaitsee oikealla tavalla haluttua tuotetta koodittavan DNA-sekvenssin suhteen, johtaakseen halutun tuotteen ilmentymiseen isäntäorganismissa. On edullista käyttää hiivaisännälle synnynnäistä promoottoria, esimerkiksi TPI-geenin (trioosifosfaatti-isomeraasi) promoottoria tai MFal-promoottoria.

Halutun tuotteen DNA-sekvenssiä seuraa transkriptionlopetus-sekvenssi, joka mielellään on hiivaisännälle synnynnäinen terminaattorisekvenssi, esimerkiksi TPI-geenin tai MFal-geenin terminaattori.

Esillä oleva keksintö tarjoaa myös uusia synteettisiä DNA-sek-venssejä, jotka koodittavat edellä olevan kaavan (I) mukaisia insuliinin prekursoreja. Uudet DNA-sekvenssit rakennettiin ihmisen proinsuliinigeenin in vitro-silmukointimutageneesilla käyttämällä kemiallisesti syntetisoituja 30-meerisiä oligonukleo-tideja poistamaan alkuperäiset C-peptidiä koodittavat sekvenssit.

Esillä olevan tyyppiset insuliinin prekursorit voidaan muuntaa ihmisinsuliiniksi poistamalla X- ja Y-aminohappotähteet suorittamalla pilkkominen in vitro trypsiinillä ja karboksi-peptidaasi Brllä toimimalla vastaavasti kuin julkaisussa Kemmlor /Remmiei' et ai.. The Journal of Biological Chemistry, 246 (1971), 6786-6791/ on kuvattu proinsuliinin muuntaminen insuliiniksi in vitro.

Näin ollen keksintö tarjoaa myös menetelmän edellä olevan kaavan (I) mukaisten insuliinin prekursorien entsymaattiseksi 7 87801 muuntamiseksi kypsäksi ihmisinsuliiniksi siten, että insuliinin prekursorin vesiliuos käsitellään trypsiinillä ja karboksi-peptidaasi B:llä ja sen jälkeen ihmisinsuliini otetaan talteen liuoksesta.

Entsymaattinen muuntaminen voidaan suorittaa yksivaiheisena prosessina trypsiinillä ja karboksipeptidaasi B:llä, jotka ovat samanaikaisesti läsnä reaktioseoksessa. Yksivaiheinen reaktio on edullista suorittaa suunnilleen neutraalissa pH:ssa ja hieman korotetussa lämpötilassa. Ihmisinsuliinin saanto oli tällöin noin 50 %. Parempia saantoja saatiin suorittamalla kaksivaiheinen konversio tyyppiä B-X-Arg-A oleville insuliinin prekursoreille. Tällaisessa kaksivaiheisessa muuntamisessa trypsiiniä käytetään ensimmäisessä vaiheessa, hajotus-tuote eristetään ja pilkotaan sen jälkeen karboksipeptidaasi B:llä. Kun trypsiinihajotus suoritettiin korkeassa pH:ssa, esim. alueella 11-12, ja matalassa lämpötilassa (noin 4°C), ihmisinsuliinin kokonaissaanto oli noin 80 %. Jotta trypsiini-hajotuksessa saavutettaisiin suuri saanto korkeassa pH:ssa, pitää B32-asemassa (ks. kuva 1) olevan aminohappotähteen olla arginiini (Y = Arg kaavassa I), koska tämä tähde on vielä pääasiassa positiivisesti varautunut ja altis trypsiinityyppi-selle katkeamiselle. Näin ollen prekursori B-Lys-Arg-A ehkä ·;- on paras prekursori, koska se ilmentyy suurina määrinä hiivas-- -· sa ja voidaan muuntaa ihmisinsuliiniksi hyvin suurilla saannoilla.

Lopuksi tämä keksintö tarjoaa menetelmän ihmisinsuliinin valmistamiseksi siten, että hiivakantaa, joka on transformoitunut edellä olevan kaavan I mukaista insuliinin prekursoria koodattavan DNA-sekvenssin sisältävällä replikoituvalla ilmentämis-plasmidilla, viljellään sopivassa elatusalustassa, ja insuliinin prekursorit otetaan talteen kasvualustasta ja muunnetaan ihmisinsuliiniksi.

8 87801

Esillä olevaa keksintöä ei haluta rajoittaa kuvattuun trypsii-nillä ja karboksipeptidaasi B:llä tapahtuvaan hajottamiseen.

Jos löydetään muita in vitro-entsyymisysteemejä, joilla on sama spesifisyys, voidaan niitä käyttää yhtä hyvin.

Keksintöä valaistaan tarkemmin liitteinä olevien kuvien avulla, joista kuva 1 esittää kaavan (I) mukaisten insuliinin prekursorien rakennetta, kuva 2 esittää plasmidin pMT579 valmistusta, kuva 3 esittää plasmidin pMT585 valmistusta, kuva 4 esittää plasmidin pMT644 valmistusta, kuva 5 esittää plasmidin pMTöll valmistusta, kuva 6 esittää plasmidin pMT650 valmistusta, kuva 7 esittää plasmidin pMT658 valmistusta, ja kuva 8 esittää B-Lys-Arg-A:n muuntamista ihmisinsuliiniksi in vitro.

1. Ihmisen proinsuliinia B-C-A koodittavan geenin valmistus Kokonais-RNA puhdistettiin /Chirgwin, J.M., Przybyla, A.E., McDonald, R.J. & Rutter, W.J., Biochemistry 18, (1979) 5294-52997 ihmisen haimasta ja suoritettiin käänteiskopiointi — ’ /Boel, E., Vuust, J., Norris, F., Norris, K., Wind, A., Rehfeld, ••f J.F. & Marcker, K.A., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80, (1983), 2866-28697 AMV-käänteiskopioijaentsyymillä ja käyttämällä 1. säikeen alukkeena oligonukleotidia d(GCTTTATTCCATCTCTC). Kun ihmisen proinsuliinin cDNA oli puhdistettu preparatiivisella . . urea-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla, toinen säie syntetisoitiin tälle templaatille käyttämällä DNA-polymeraasin suurta fragmenttia sekä 2. säikeen alukkeena oligonukleotidia d(CAGATCACTGTCC). Kun oli suoritettu hajotus Sl-nukleaasilla, - ihmisen proinsuliinin kaksisäikeinen cDNA puhdistettiin poly- akryyliamidigeelielektroforeesilla, hännitettiin terminaalisel-la transferaasilla ja kloonattiin plasmidin pBR327 Pstl-kohtaan /Sorberon et ai-, Gene 9, (1980), 287-305/ E. colissa. Oikea 9 ft 78 01 klooni, joka sisälsi plasmidin, tunnistettiin rekombinanteis-ta restriktioendonukleaasianalyysillä ja varmistettiin sekvens-sinmäärityksellä /Maxam, A., & Gilbert, W., Methods in Enzymology, 65^ (1980), 499-560. Sanger, F., Nicklen, S. & Coulson, A.R., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, JA (1977), 5463-54677.

1. ja 2. säikeen alukkeet GCTTTATTCCATCTCTC ja CAGATCACTGTCC, joita käytettiin ihmisen proinsuliinin cDNA-kloonin eristämiseen, syntetisoitiin puoliautomaattisella kolonnisynteesi11ä käyttämällä fosfotriesterimenetelmää polystyreenikantaja-ainees-sa /H. Ito, Y. Ike, S. Ikata, ja K. Itakura Nucleic Acids Research 10, (1982), 1755-7697- 2. B-X-Y-A:ta koodittavien geenien valmistus

Neljää insuliinin prekursoria B-Lys-Lys-A, B-Lys-Arg-A, B-Arg-Lys-A ja B-Arg-Arg-A koodittavat geenit valmistettiin liittämällä lineaarista ihmisen proinsuliinisekvenssiä B-C-A koodittava fragmentti rengasmaiseen yksisäikeiseen M-13-bakteriofaagivektoriin ja suorittamalla ihmisen proinsuliini-sekvenssin paikkaspesifinen mutageneesi käyttämällä kemiallisesti syntetisoituja 30-meerisiä deleetioalukkeita KFN41, KFN4, KFN42 ja KFN18 vastaavasti sekä "universaalista" 15-mee- ..... ristä M13-dideoksisekventointipriimeriä /K.Norris et ai., Nucl.

- : Acids. Res., 11. (1983), 5103-51127' Kaksisäikeinen restriktio- fragmentti (Xbal-EcoRI) leikattiin irti osittain kaksisäikeises-tä rengasmaisesta DNArsta ja liitettiin plasmidiin UC13 tai pT5. E. coli transformoitiin ja uudelleentransformoitiin ja sellaiset transformantit, jotka sisälsivät plasmidin, jossa oli haluttu geeni, tunnistettiin.

Kyseiset neljä mutageenistä deleetiopriimeriä KFN4, KFN18, KFN41 ja KFN42 syntetisoitiin automaattisella DNA-syntetisaattorilla (Applied Biosystenis Model 380 A) käyttämäl lä Fosforiamidii.lt l-kemiaa ja kaupallisesti saatavissa olevia reagensseja /S.L. Beaucage ja M.H. Caruthers (1981) Tetrahedron Letters 22, 1859-18697- Oligonukleotidit puhdistettiin polyakryyliamidi- 10 87 801 geelielektroforeesilla käyttämällä denaturoivia olosuhteita. Kyseiset neljä deleetiopriimeriä ovat seuraavat: KFN Sekvenssi

4 TCCACAATGCCTCTCTTAGTCTTGGGTGTG

18 TCCACAATGCCTCTTCTGGTCTTGGGTGTG

41 TCCACAATGCCCTTCTTGGTCTTGGGTGTG

42 TCCACAATGCCCTTTCTGGTCTTGGGTGTG

3. Plasmidien rakentaminen

Ihmisinsuliinin prekursoreja koodittaviin geeneihin yhdistettiin TPI-promoottoria (TPIp) koodittava fragmentti /T. Alber ja G. Kawasaki. Nucleotide Sequence of the Triose Phosphate Isomerase Gene of Saccharomyces cerevisiae. J. Mol. Applied Genet. 1 (1982) 419-4347, MFal-johtosekvenssi /J. Kurjan ja I. Herskowitz., Structure of a Yeast Pheromone Gene (MFa): A Putative a-Factor Precursor Contains four Tandem Copies of Mature α-Factor. Cell 30 (1982) 933-94^7 ja S. cerevisiaen transkriptionlopetus-sekvenssi (TPIT). Nämä fragmentit (TPIT) tarjoavat sekvenssejä, jotka takaavat insuliinin prekursoria koodittavan geenin korkean transkriptiotason ja mukana on myös presekvenssi, joka saa aikaan insuliinin prekursorin hakeutumisen erittymis-järjestelmään ja lopuksi erittymisen kasvualustaan.

Ilmentämisplasmidit sisältävät lisäksi hiivan 2 yu-replikonin ja valintamerkin LEU2.

Kun α-tekijä kypsyy hiivassa in vivo, MFa-johtopeptidin viimeiset (C-pää) kuusi aminohappoa (Lys-Arg-Glu-Ala-Glu-Ala) poistuvat α-tekijän prekursorista endopeptidaasin, joka tunnistaa Lys-Arg-sekvenssin, ja aminodipeptidaasin, joka poistaa Glu-Ala-tähteet, peräkkäisellä toiminnalla /Julius, D. et ai. Cell 32 (1983) 839-8527· Jotta hiivan aminodipeptidaasia ei tarvittaisi, poistettiin MFal-johtosekvenssin C-pään Glu-Ala-Glu-Ala-osaa koodittava sekvenssi in vitro-mutageneesillä.

u 37801 V ’ ' ' .

I ’ 1

Edullisessa rakennustoteutuksessa muunnetut ilmentämisyksiköt siirrettiin stabiiliin, suuren kopiomäärän tuottavaan hiiva-plasmidiin CPOT (ATCC n:o 39685), joka voidaan valita vain sen perusteella, onko kasvualustassa läsnä glukoosia. Plasmidi CPOT perustuu vektoriin C1/1, jota on muunnettu korvaamalla alkuperäinen pBR322 Bgl1-BamHI-fragmentti plasmidista pUC13 saadulla vastaavalla Bgl1-BamHI-fragmentilla ja sen jälkeen liittämällä mukaan S. pomben TPl-geeni (POT) BamHI-Sali-fragmenttina, jolloin saadaan CPOT. C1/1 on johdettu pJDB 248:sta Beggs et ai., Nature 275, 104-109 (1978),kuten eurooppalaisessa patenttihakemuksessa 01034094A on selostettu.

4. Trans formo int i

Edellä kuvatulla tavalla valmistetuilla plasmideilla transformoitiin S. cerevisiae-kannat, joiden TPI-geenissä oli deleetio, joka mahdollistaa valinnan glukoosilla kasvun suhteen. Tällaiset kannat eivät normaalisti kykene kasvamaan, jos ainoana hiili-lähteenä on glukoosi ja ne kasvavat hyvin hitaasti galaktoosi-laktaattialustassa. Tämä puute johtuu trioosifosfaatti-isome-raasigeenissä olevasta mutaatiosta, joka on saatu aikaan poistamalla suurin osa tästä geenistä ja korvaamalla ko. osa S. cerevisiaen LEU 2-geenillä. Tämän kasvupuutteen vuoksi on olemassa suuri valintapaine sen plasmidin hyväksi, joka sisältää TPI:tä koodittavan geenin.

5. Insuliinin prekursorien ilmentäminen hiivassa Näitä eri insuliinin prekursoreja koodittavia plasmideja sisältäviä hiivakantoja kasvatettiin YPD-alustassa (Sherman, F. et ai., Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory 1981). Kustakin kannasta tehtiin kaksi 1 litran ravisteluviljel-mää ohjauslevyillä varustettuihin 2 litran pulloihin ja ravisteltiin 30°C:ssa, kunnes 600 nm:ssä mitattu 0D-arvo oli noin 15 (noin 48 h). Sentrifugoinnin jälkeen emä liuos poistettiin jatkoanalysointia varten. Immunoreaktiivinen insuliini (IRI) mitattiin radioimmunomäärityksellä /Heding, L., Diabetologia 8 (1972), 260-2667 käyttämällä puolisynteettistä ihmisinsuliinia 37801 12 (NOVO Industri A/S) standardina rakenteille 1-6. Puolisynteettistä ihmisinsuliinia tai kyseistä insuliinin prekursoria käytettiin rakenteissa 7-10. Insuliinin prekursorille B-Arg-Arg-C-peptidi-Lys-Arg-A (ihmisen proinsuliini) immunoreaktiivisen C-peptidin (IRC) ilmentymistaso mitattiin käyttämällä ihmisen C-peptidin radioimmunomääritystä /Heding, L.G. Diabetologia 11, 125 (1975) 541-548/· Tässä määrityksessä käytettiin I-Tyr-ihmis-C-peptidiä merkkiaineena ja marsun anti-ihmis-C-peptidiseerumia, M1228 /Faber, O.K. et ai., Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem.

357 (1976) 751-757), joka reagoi yhtä hyvin ihmisen C-peptidin ja ihmisen proinsuliinin kanssa, käytettiin vasta-aineena.

Ihmisen proinsuliinia käytettiin standardina /Kruse, V. et ai., Diabetologia 21_, (1984) 414-4157* Immunoreaktiivisen insuliinin ja immunoreaktiivisen C-peptidin ilmentymistasot transformoituneiden hiivakantojen fermentaatioliuoksissa on esitetty yhteenvetona taulukossa 1.

13 87801

I I *“ rH

I -H U -H ^ Ο Ή ^ Ή

d ϋ § -p « g ^ I I I I I I I * I

g ro c λη d ή g Q) -H <u \ η p > cu —'

-P H

O (¾ U) I H .—

nj I C -rH 00 ^ VO [- 00 rH OOOO

+J I Η -Η -H \ rH rH r I rH I I fO O VO Ο Γη C-PC-HO O OOOOO H H (N H

g d Μ d -h g >1 e to c rH 3 4-) g φ ή d \ β h p > m — g in σι to t σν cT> σ\ ct\

r—( rH rH rH

ro co co ro S a a a a h w w cn ω d C q a Q D u) οι “ 2 S !j CTsOCNHCNrHVOOvnrr) d 3 ,H r; o O 't 'f m n HvoLHCh jj.-ini u-imvOvovovovovovom dl m t; gifdiHEHE-iHE-iEjlHEH β u gNggsaaaaa -h α ω oi 3 <C β H I d C £

H tn X

Η ϋ «3 ® rH <1 to

H I

hui ra Cn C

C >i P < < (0 Ο -H PI < I I > v> I d 3 n I U) Cn tn 4-·

3 >. β >ι P P -P

H 4-) * H ^ <1 1¾ -H

-.da) <;O ii d

(rt π I I I U) U) O

h h dd>i>i<: o

Jj (Ji 0) Ή P) p I ,V

• :d P PI o I

:m rf I I I I tr> β d

....: g TadCCP :0 d -rH

u) W Q) rH rH rtj β d β

:nj >, < P O O I GO) -H

— H d p I I I I CO -Η ·Η -H

H-η d O d d >i U)d rH

• :d P -H | H p Q) Q) p ΛίΛ! d ::: g o w .H U « P P ω d w

h L d I I I I I * E C

a) p β h d d d d c -H

JJ'Hfli jJiHrHrHiHrH U

V M> D. < < < < V5 S

CUM d I I I I I Λ a) P a) ^ .3 m r.

CS Q. ri) I rH rH rH rH φ C

c oooaup<c<< ω d β d I I.....lii ai

. rH -rH ^ *H

Hdd ^raratp g Q1-H4J J_|PPPPPP>i>iP x) 0) Η -p Ή

H h -H I I I I I I I I I I

rn 3 H H d* d U) d O'* d 0)0) β - r—l CO rf] t—I Ch g H* . I I I..... ΰ

3 pqmfflcqmfflcqcQmpQ 4J

: ·.: i c ,.. g Φ d •Η β 2

Ο β H

•h o o d Λί ·· ·— (jjnjp; HrHrn^rvnvo r-cocTiO * «oi ^ 14 37801

Taulukosta 1 ilmenee, että on olemassa hämmästyttävä ero keksinnön mukaisten prekursorien ja proinsuliinityyppisten prekurso-rien eli sellaisten, joissa on kaksiemäksinen aminohappopari C-peptidin tai muunnetun C-peptidin kummallakin puolella, ilmentymistasoissa.

6. Insuliinin prekursorien muuntaminen ihmisinsuliiniksi Insuliinin prekursorien muuntaminen ihmisinsuliiniksi voidaan suorittaa joko kaksivaiheisella entsymaattisella prosessilla Γ-1 Trypsiini i---1 B-X-Y-A _> B-X-Y A (1)

I I Karboksipeptidaasi B ] I

B-X-Y-A ___* B A (2) tai yhdistetyllä yksivaiheisella prosessilla, jossa trypsiini ja karboksipeptidaasi B ovat läsnä reaktioseoksessa samanaikaisesti .

Edellä olevissa kaavoissa ja osassa seuraavaa tekstiä A- ja B-ketjua yhdistävät disulfidisillat on kuvattu kaarella ("I I"), jotta entsymaattinen katkaisu ilmenisi selvemmin. Edellä ole- I 1 i : vissa kaavoissa B-X-Y-A on yksiketjuinen insuliinin prekurso- i i ri (kuva 1); B-X-Y A on kaksiketjuinen insuliinin prekurso- rivälituote, jossa tähteen n:o 32 (Lys tai Arg) ja tähteen n:o 33 (Ai = Gly) välinen peptidisidos on hydrolysoitunut; ja i-r B A on ihmisinsuliini. Muissa B-X-Y-A-tyyppisissä kaavoissa pidetään selvänä, että A- ja B-ketju ovat liittyneet toisiinsa disulfidisilloilla, kuten luonnoninsuliinissa.

' Entsymaattinen muuntaminen suoritetaan insuliiniprekursorien vesiliuoksessa. Trypsiinin käyttö ei ole tämän keksinnön kohde. Trypsiini on ennestään hyvin tunnettu entsyymi, jota on .··.. saatavissa erittäin puhtaana erityisesti naudan tai sian haimasta. Entsyymejä, joilla on trypsiininkaltainen spesifisyys, kuten plasmiinia, klostripainia ja Achromobacter lyticus-proteaasia, voidaan myös käyttää.

15 37801

Jotta konversiossa saavutettaisiin hyvä saanto, on tärkeätä käyttää erittäin puhdasta karboksipeptidaasi B:tä, joka ei sisällä karboksipeptidaasi A-aktiivisuutta. Tämä voidaan saavuttaa puhdistamalla kaupallisesti saatavissa oleva karboksipeptidaasi B esim. affiniteettikromatografisesti tai ioninvaihto-kromatografisesti. Vaihtoehtoisesti voidaan pilkkomisseokseen lisätä karboksipeptidaasi A:n inhibiittoria, kuten ε-amino-n-kapronihappoa tai karbobentsoksiglysiiniä.

Yksivaiheinen muuntaminen on edullista suorittaa hieman korotetussa lämpötilassa (35-40°C) välillä 7-8 olevassa pH:ssa. Trypsiinin ja karboksipeptidaasi B:n pitoisuudet ovat mielellään noin 5 ^ug/ml ja substraatin pitoisuus on noin 1 mg/ml.

Kaksivaiheisessa muuntamisessa trypsiinillä tapahtuva pilkkominen on edullista suorittaa korkeassa pH-arvossa. Korkeassa pH-arvossa (alueella 11-12) insuliinin prekursorimolekyylin lysiiniaminohappotähteet (esim. B29-Lys ja B31-Lys B-Lys-Arg-A:ssa, kuva 1) ovat lähes varauksettomia (lysiinitähteen pKa on noin 9,0), eikä trypsiini saa aikaan katkeamista. Kuitenkin esim.

I----1 B-Lys-Arg-A:ssa on B32-arginiinitähde (pKa - 12) vielä pääasiallisesti positiivisesti varattuna ja näin ollen altis trypsiinin aikaansaamalle katkaisulle. B22-arginiinitähteen katkeaminen tapahtuu vain hyvin pienellä nopeudella luultavasti — steerisestä esteestä johtuen. pH:n pysyminen stabiilina I r B-Lys-Arg-A:n trypsiinihajotuksen aikana on kriittinen korkean I--—-1 B-Lys-Arg A-saannon saavuttamiseksi. Useita erilaisia pusku-risysteemejä on kokeiltu, jotta pH saataisiin stabiloiduksi . . välille 11,8-11,9. Puskurisysteemillä käytetään HPO^ /PO^ jota tavallisesti käytetään korkeissa pH-arvoissa, on hyvä puskurointikyky pH:ssa 11,8. Tähän puskurisysteemiin liittyy kuitenkin kolme päähaittaa. Ensinnäkin ΗΡΟ^ /PO^ -liuoksen pH on hyvin herkkä lämpötilanvaihteluille ja muutos esim.

25°C:sta 4°C:een voi alentaa pH-arvoa 0,7 pH-yksiköllä. Toi-· seksi Ca++ (jota saattaa olla läsnä trypsiinin stabiloimiseksi) saostuu, koska Ca3(P04)2:n ja CaHPO^n liukoisuustulo on suhteel- Π 7 8 01 lisen pieni. Kolmanneksi ei ole mahdollista tehdä hajotus-seosta happamaksi (pysäyttää reaktiota) hetkessä, johtuen puskurijärjestelmien HPO^ /I^PO^ ja H^PO^ /H^PO^ vaikutuksesta. Kun tätä systeemiä säädetään happamaksi, syntyy joksikin aikaa neutraali tila, jonka kuluessa trypsiini kehittää välittömästi des(B30)insuliinia, joka on ei-toivottu tuote. Näistä haitoista johtuen on käytetty melko epätavallista puskurisysteemiä H2O/OH-. Tähän systeemiin ei liity edellä mainittuja haittoja.

Optimaalisten olosuhteitten trypsiinillä tapahtuvalle hajotuk-I 1 1 1 selle, jossa B-X-Arg-A muuttui B-X-Arg A:ksi, havaittiin olevan noin 20 mg/ml l-J-X-Arg A:ta; 200 ^ug/ml trypsiiniä; puskuri-liuoksena 37,5 mM NaOH (näin syntyi pH 11,86, kun mittaus suoritettiin 25°C:ssa); lämpötila noin 4°C ja inkubointiaika noin 180 min. Näin tuli B-Lys-Arg A:n saannoksi 90,5 %.

I-1

Trypsiinillä tapahtuneen konversion tuote B-X-Arg A voidaan puhdistaa monilla tavanomaisilla menetelmillä, kuten prepara- tiivisella HPLC:llä, absorptiokromatografisesti ja ioninvaihto- kromatografisesti. B-X-Arg A voidaan lähes kvantitatiivi-I 1 sesti muuntaa B A:ksi (ihmisinsuliiniksi) suorittamalla pilkkominen karboksipeptidaasi B:llä. Optimaalisiksi olosuhteiksi I 1 tässä muuntamisessa havaittiin noin 5 mg/ml B-X-Arg A:ta

ja noin 5 ^ug/ml karboksipeptidaasi B:tä; puskuriliuoksena 50 mM

Tris HC1 pH 9,3, lämpötila noin 37°C ja inkubointiaika noin 1-1 30 minuuttia. B-Lys-Arg A:n konversiossa oli saanto 99,5 %.

1 ——1

Insuliinin prekursorin B-Lys-Arg A muuttumista ihmisinsuliiniksi seurattiin kvantitatiivisesti käänteisfaasi-korkeapaine-nestekromatografisesti (HPLC), kuten kuvassa 8 on esitetty.

I-1

Kuvan 8 mukaisesti B-Lys-Arg A liuotettiin pitoisuuteen 5 mg/ml ; ·- 50 mM Tris.HCl-puskuriin, pH 9,3, ja pilkottiin karboksi peptidaasi B:llä (5 yug/ml) (Boehringer) 37°C:ssa. Hajotus-seoksesta otettiin näytteet ajankohtina t = 0 (A), t = 2 min (B), .. t = 5 min (C) ja t = 30 min (D) , pH säädettiin 4 N suolahapolla arvoon 1,5 ja analysoitiin HPLC:llä 5 ^u Nucleosil® RP C-18- n 37801 pylväässä (4 x 200 mm), joka oli tasapainotettu eluointipusku-rilla ja eluointi suoritettiin isokraattisesti 30°C:ssa virtausnopeudella 1 ml/min käyttämällä puskuria, jossa oli 33 mM (NH4)2S04, 1,5 mM H2S04, ja joka sisälsi 29,4 tilavuus-% asetonitriiliä. Peptidit havaittiin UV-absorptiolla aallonpituudella 214 nm. Konversio tapahtui täydellisesti 30 minuutissa ja sen jälkeen hajotusseokseen lisättiin etanolia 60 i i tilavuus-%. B A puhdistettiin anioninvaihtokromatografi-sesti QAE-Sephadej^-pylväässä julkaisussa Schlichtkrull, J. et ai., (1974) Horm. Metab.Res.Suppl., Ser. 5, sivut 134-143.. kuvatulla tavalla. B: B-ketju, A: A-ketju, K: Lys, R: Arg. Kuvasta 8 voidaan havaita, että trypsiinihajotuksessa syntynyt l ‘i i i tuote B-Lys-Arg A muuttui lähes kvantitatiivisesti B A:ksi, kun suoritettiin hajotus karboksipeptidaasi B:llä.

Insuliinin prekursorien muuntaminen ihmisinsuliiniksi on esitetty esimerkeissä 10, 11 ja 12 ja ihmisinsuliinin karakterisointi on suoritettu esimerkissä 13.

Esimerkki 1

Hiivaplasmidin pMT585 rakentaminen B-Lys-Arg-A:n ilmentämiseksi Plasmidin pMT342 4,3 ke:n EcoRV-Xbal- ja 3,3 ke:n EcoRl-EcoRV-fragmentti liitettiin plasmidin pM215 0,6 ke:n EcoRl-Xbal-” fragmenttiin. Plasmidi pMT342 on hiivavektori pMT212, johon on liitetty TPIp-MFotl-johto-BCA-TPIT-sekvenssi. pMT342:n - : ja pMT212:n rakentaminen on selostettu eurooppalaisessa patentti hakemuksessa 0068701A. Plasmidi pM215 rakennettiin alakloonaa-malla plasmidista p285 (ATCC n:o 20681) saatu EcoRl-Xbal-fragmentti, joka sisälsi proinsuliinia koodittavan sekvenssin B-C-A, plasmidiin pUCl3 /rakennettu samoin kuin plasmidit pUC8 ja pUC9 julkaisussa Vieira et ai., Gene 19: 259-268 (1982/7» ja sen jälkeen poistamalla in vitro-silmukoinnilla 12 emästä, jotka koodittavat Glu-Ala-Glu-Ala-sekvenssiä, jotka sijaitsevat ; MFal-johtosekvenssin ja proinsuliinin B-C-A välissä. p285 --· sisältää TPIp-MFal-johto-B-C-A-TPIT-liitännäisen, ja se on taltioitu hiivakantaan Z33 (ATCC n:o 20681).

is 87801

Edellä mainittujen plasmideista pMT342 ja 215 saatujen fragmenttien yhteenliittäminen antaa plasmidin pMT462, joka sisältää MFal-johtosekvenssin (minus Glu-Ala-Glu-Ala) ja B-C-A:n.

Jotta B-C-A:ta koodittava fragmentti saataisiin muunnetuksi B-Lys-Arg-A:ta koodittavaksi fragmentiksi, käytettiin muunnettua paikkaspesifistä mutageneesimenettelyä (K. Norris et ai., ibid.). Plasmidin pMT462 0,6 ke:n EcoRl-Xbal-fragmentti, joka koodittaa MFal-johto-(minus Glu-Ala-Glu-Ala)-B-C-A:ta, liitettiin faagin M13 mplO RF /Messing, J. ja Vieriä, J. (1983) Unpublished results/ DNArhan, joka oli katkaistu Xbal-EcoRI:llä. Yksisäikeistä M13-faagia, jossa oli edellä mainittu EcoRI-Xbal-liitännäinen, inkuboitiin 30-meerisen deleetio-alukkeen KFN4 ja "universaalisen” 15-meerisen M13-alukkeen d (TCCCA.GTCACGACGT) (New England Biolabs) kanssa, kuumennettiin 90°C:een 5 minuutiksi ja jäähdytettiin hitaasti huoneen lämpötilaan, jotta pariutuminen pääsi tapahtumaan. Sitten tehtiin osittain kaksisäikeinen DNA lisäämällä dNTP-seos, Klenow-polymeraasi ja T4-ligaasi. Sen jälkeen suoritettiin fenoliuutto, saostus etanolilla ja uudelleensuspendointi ja DNA leikattiin restriktioentsyymeillä Apal, Xbal ja EcoRl. Uutettiin uudestaan fenolilla, saostettiin etanolilla ja suoritettiin uudelleen-suspendointi ja DNA liitettiin EcoRl-Xbal: llä leikattuun plasmi-diin pUC13. E. coli (r m+)-kanta transformoitiin liittämis-seoksella ja useista transformanteista valmistettiin plasmidit. Plasmidivalmisteet leikattiin EcoRl:llä ja Xbalrllä, ja niillä valmisteilla, joissa oli sekä 0,5 että 0,6 ke:tä osoittava vyöhyke, transformoitiin uudestaan E. coli. Uudelleentrans-formoinnin jälkeen valittiin transformantti, joka sisälsi vain ; sellaisen pUC13, jossa oli 0,5 ke:n liitännäinen. Tämän pMT579-plasmidin EcoRl-Xbal-liitännäisen sekvenssi varmistettiin Maxamin ja Gilbertin menetelmällä, ja sen todettiin koo-dittavan MFal-johto-(minus Glu-Ala-Glu-Ala)-B-Lys-Arg-A-... sekvenssiä. Plasmidin pMT579 rakentaminen on esitetty kuvassa - 2. Plasmidin pMT579 0,5 ke:n Xbal-EcoRl-liitännäinen varustet tiin TPI-promoottorilla ja TPI-terminaattorilla liittämällä siihen 5,5 ke:n Xbal-EcoRl-fragmentti plasmidista pMT5. Kuvassa 3 on esitetty plasmidin pT5 rakentaminen, joka sisältää TPIp- is 87801 MFal-johto-B-C-A-TPIT-liitännäisen. Näin syntynyt plasmidi pMT583, joka sisältää liitännäisen TPIp-MFal-johto-(minus Glu-Ala-Glu-Ala)-B-Lys-Arg-A-TPIT, leikattiin sen jälkeen BamHl:llä ja osittain Sphl:llä ja 2,1 ke:n fragmentti sijoitettiin BamHl:llä ja Sphl:llä katkaistuun CPOTriin. Näin saatiin plasmidi pMT585, jota käytettiin hiivan transformoin-tiin. Plasmidien pMT583 ja pMT585 rakentaminen on esitetty kuvassa 3.

Esimerkki 2

Hiivaplasmidin pMT611 rakentaminen B-Arg-Arg-A:n ilmentämiseksi Plasmidista pMT462 saatu B-C-A:ta koodittava fragmentti (ks. esimerkki 1) muutettiin B-Arg-Arg-A:ta koodittavaksi fragmentiksi soveltamalla esimerkissä 1 kuvattua paikkaspesifistä mutageneesiä käyttämällä 30-meeristä deleetiopriimeriä KFN18 ja "universaalista" 15-meeristä Ml3-priimeriä, kuten kuvassa 5 on esitetty. Plasmidin pMT599 EcoRl-Xbal-liitännäisen sekvenssi varmistettiin Maxamin ja Gilbertin menetelmällä ja sen todettiin koodittavan MFal-johto-(minus Glu-Ala-Glu-Ala)-B-Arg-Arg-A: ta. Plasmidin pMT599 0,5 ke:n liitännäinen varustettiin TPI-pro- moottorilla ja TPI-terminaattorilla liittämällä siihen 5,5 ke:n .Xbal-EcoRl-fragmentti pläsmidista pT5. Saatu plasmidi pMT602, joka sisälsi liitännäisen TPIp-MFal-johto-(minus Glu-Ala-Glu-Ala)-B-Arg-Arg-A-TPIT, leikattiin sen jälkeen BamHl:llä ja osittain Sphlsllä ja 2,1 ke:n fragmentti sijoitettiin BamHl:llä ja Sphlrllä leikattuun CP0T:iin. Näin saadulla plasmidilla pMT611 transformoitiin hiiva. Plasmidin pMT611 rakentaminen on esitetty kuvassa 5.

Esimerkki 3

Hiivaplasmidin pMT65Q rakentaminen B-Lys-Lys-A:n ilmentämiseksi Plasmidista pMT462 saatu B-C-A:ta koodittava fragmentti (ks. esimerkki 1) muunnettiin B-Lys-Lys-A:ta koodittavaksi fragmen-·.- tiksi soveltamalla esimerkissä 1 kuvattua paikkaspesifistä - mutageneesiä käyttämällä 30-meeristä deleetiopriimeriä KFN41 ja "universaalista" 15-meeristä Ml3-priimeriä, kuten kuvassa 6 on esitetty.

20 8 7 8 01

Kun oli suoritettu täyttäminen Klenow-polymeraasilla ja liittäminen T4-ligaasilla, osittain kaksisäikeinen DNA pilkottiin Apal:llä, EcoRlrllä ja Xbal:llä ja liitettiin plasmidista pT5 saatuun 5,5 ke:n Xbal-EcoRl-fragmenttiin (ks. esimerkki 1). Suoritettiin E. colin transformointi ja uudelleentransformointi, jonka tuloksena eristettiin plasmidi pMT652, joka sisälsi liitännäisenä MFal-johto-(minus Glu-Ala-Glu-Ala)-B-Lys-Lys-A-sekvenssin, ja liitännäisen sekvenssi varmistettiin edellä kuvatulla tavalla.

Plasmidi pMT652 katkaistiin Xbal-EcoRl:llä ja 0,5 ke:n fragmentti liitettiin plasmidin pMT644 7,8 ke:n Xbal-Kpnl-fragmenttiin ja 4,3 ke:n Kpnl-EcoRl-fragmenttiin. Näin saatu plasmidi pMT650 sisältää liitännäisen TPIp-MFal-johto-(minus Glu-Ala-Glu-Ala)-B-Lys-Lys-A-TPIT ja lisäksi se sisältää CP0T:stä saadun TPI:tä koodattavan geenin (POT). Plasmidin pMT650 rakentaminen on kuvattu kuvassa 6 ja plasmidin pMT644 rakentaminen kuvassa 4. Plasmidit pUC12 ja pUC18, joita käytettiin pMT644:n rakentamisessa, rakennettiin samoin kuin pUC13 (ks. Vieira et ai., ibid). Plasmidi p601 (ks. kuva 4) sisältää liitännäisen TPIp-MFal-johto-B'A-TPIT, jonka vieressä on Bgl2-kohta ja BamHl-kohta. B'A tarkoittaa lyhennettyä B(1-29)-A(l-21):tä, jossa B(l-29) on ihmisen insulii- · gl β29 nin lyhennetty B-ketju Phe :stä Lys :ään ja A(l-21) on ihmisen insuliinin A-ketju. B'A:ta koodittavan DNA-sekvenssin rakentaminen on selostettu eurooppalaisessa patenttijulkaisussa n:o 0068701A. Plasmidia pMT650 käytettiin hiivan transformointiin.

: Esimerkki 4

Plasmidin pMT658 rakentaminen B-Arg-Lys-A:n ilmentämiseksi ‘ .! Plasmidi pMT658 rakennettiin samoin kuin esimerkissä 3 on kuvattu plasmidin pMT650 kohdalla, mutta KFN41:n tilalla käytettiin 30-meeristä deleetiopriimeriä KFN42. Plasmidin pMT644 rakentamiseen valittiin myös suorempi tapa: in vitro-mutageneesin jälkeen eli sen jälkeen, kun oli suoritettu täyttäminen Klenow-polymeraasilla ja yhteenliittäminen T4-ligaasilla, osittain kaksisäikeinen DNA ..···. pilkottiin Apal:llä, EcoRl:llä ja Xbal:llä ja liitettiin plasmidista pMT644 saatuun 7,8 ke:n Xbal-Kpnl- ja 4,3 ke:n Kpnl-EcoRl-fragmenttiin. E. coli (r m+) transformoitiin liittämisseoksella 2i 37801 ja useista transformanteista valmistettiin plasmidi. E. coli uudelleentransformoitiin yhdellä plasmidivalmisteella, joka osoitti sisältävänsä sekä 0,6 että 0,5 ke:n Xbal-EcoRl-fragmentin, jotta saatiin kanta, jossa oli plasmidi pMT658, jossa taas oli 0,5 ke:n EcoRl-Xbal-fragmentti, mutta ei vastaavaa 0,6 ke:n fragmenttia. pMT658 sisältää liitännäisen TPIp-MIb 1-johto-(minus Glu-Ala-Glu-Ala)-B-Arg-Lys-A-TPIT. B-Arg-Lys-A:ta koodittavan segmentin sekvenssi varmistettiin Maxamin ja Gilbertin menetelmällä. Plasmidin pMT658 rakentaminen on esitetty kuvassa 7. Plasmidia pMT658 käytettiin hiivan transformointiin.

Esimerkki 5 Transformointi S. cerevisiae-kantaa NT501 (E2-7B X E11-3C a/α, Atpi/tpi, Apep 4-3/pep 4-3) kasvatettiin YPGaL-alustalla (1 % Bacto-hiivauutetta, 2 % Bacto-peptonia, 2 % galaktoosia, 1 % laktaattia) 0°goo nm” arvoon 0,6.

100 ml viljelmää otettiin talteen sentrifugoimalla, pestiin 10 ml:11a vettä, sentrifugoitiin uudestaan ja suspendoitiin uudestaan 10 mlraan liuosta, jossa oli 1,2 M sorbitolia, 25 mM Na2EDTA pH 8,0 ja 6,7 mg/ml ditiotreitolia. Suspensiota inkuboitiin 15 minuuttia 30°C:ssa, sentrifugoitiin ja solut suspendoitiin uudestaan 10 ml:aan liuosta, jossa oli 1,2 M sorbitolia, 10 mM Na2EDTA, 0,1 M natriumsitraattia pH 5,8 ja 2 mg Novoz y„fs> 234 . Suspensiota inkuboitiin 30 minuuttia 30°C:ssa, solut sentrifugoitiin talteen, pestiin 10 ml:lla 1,2 M sorbitolia ja 10 ml:lla CAS-liuosta (1,2 M sorbitoli, 10 mM CaCl2, 10 mM Tris (Tris =

Tris(hydroksimetyyli)aminometaani) pH 7,5) ja suspendoitiin uudestaan 2 ml:aan CAS-liuosta. Transformointia varten 0,1 ml:aan CAS-liuokseen uudelleensuspendoituja soluja sekoitettiin noin 1 ^,ug plasmidia pMT585 ja jätettiin huoneen lämpötilaan 15 minuutiksi. Lisättiin 1 ml liuosta, jossa oli 20 % polyetyleeniglykoli 4000, 10 mM CaCl2 ja 10 mM Tris pH 7,5, ja saatu seos jätettiin huoneen lämpötilaan vielä 30 minuutiksi. Seos sentrifugoitiin ja pelletti uudelleensuspendoitiin 0,1 ml:aan SOS-liuosta (1,2 M

22 δ 7801 sorbitolia, 33 tilavuus-% YPGaL, 6,7 mM CaCl» ja 14 ,ug/ml O 1 * leusiinia), ja inkuboitiin 2 tuntia 30 C:ssa. Sitten suspensio sentrifugoitiin ja pelletti uudelleensuspendoitiin 0,5 ml:aan 1,2 M sorbitolia. 6 ml 52°C:sta pinta-agaria (SC-alustaa Sherman et ai., (Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, 1981), josta leusiini oli jätetty pois, ja joka sisälsi 1,2 M sorbitolia sekä 2,5 % agaria) lisättiin ja saatu suspensio kaadettiin levyjen päälle, jotka sisälsivät samaa agarilla kiinteytettyä, sorbitolipitoista alustaa. Inkuboitiin 3 vuorokautta 30°C:ssa, poimittiin transformanttipesäkkeet, uudelleeneristettiin ja käytettiin nestemäisten viljelmien aloittamiseen. Yksi tällainen transformantti MT593 (=MT501/pMT585) valittiin jatkotutkimuksiin.

S. cerevisiae-kanta MT501 transformoitiin plasmideilla pMT611, pMT650 ja pMT658 edellä kuvatulla tavalla ja transformantit MT616 (=MT501/pMT611), MT655 (=MT501/pMT650) jaMT660 (=MT501/ pMT658) eristettiin.

Tämän patenttihakemuksen tekijä on taltioinut transformoituneet mikro-organismit MT593, MT616, MT655 ja MT660 kokoelmaan Deutsche Sammlung von Mikroorganismen (DSM), Griesebachstrasse 8, D-3400 Göttingen, 16. tammikuuta, 1985, jossa niille on annettu kokoelmanumerot DSM 3194, DSM 3195, DSM 3198 ja DSM 3199 vastaavasti. DSM on kansainvälinen taltiointilaitos, joka on saanut valtuutuksen Budapestin sopimuksessa 1977 ja säilyttää edellä mainitut taltioidut kannat ja asettaa ne yleisesti saataville mainitun sopimuksen kohtien 9 ja 11 mukaisesti.

Esimerkki 6 B-Lys-Arg-A:n puhdistaminen hiivakannasta MT593 (DSM 3194) Hiivakantaa MT593 (DSM 3194) kasvatettiin YPD-alustassa. Yhden litran viljelmää ravisteltiin 2 litran pullossa, joka oli varustettu ohjauslevyillä, 30°C:ssa, kunnes 0D600nm-arvo °ϋ . ··*, Sentrifugoinnin jälkeen ilmentymistuotteet eristettiin 815 ml:sta emäliuosta seuraavalla tavalla: 23 37801 (¾

LiChroprep^ RP-18-pylväs (Merck, art. 9303) (1,5 x 9 cm) pestiin 30 ml:11a liuosta, jossa oli 50 mM NH4HC03, ja joka sisälsi 60 tilavuus-% etanolia. Pylväs tasapainotettiin 50 ml:11a 50 mM NH^HCO^. 815 ml:aan hiivan emäliuosta lisättiin 95 ml 96 % etanolia ja seos pumpattiin pylvään läpi yön aikana.

Pylväs pestiin 15 ml:lla 0,1 M NaCl ja sen jälkeen 15 ml:lla ^0 ja peptidimateriaali eluoitiin liuoksella, jossa oli 50 mM NH^HCO^, ja joka sisälsi 60 tilavuus-% etanolia. Eluaatti (4,5 ml) väkevöitiin 1,1 ml:ksi vakuumisentrifugoinnilla (Savant-vakuu-misentrifugi) etanolin poistamiseksi ja tilavuus säädettiin 10 ml:ksi 25 mM HEPES-puskurilla, pH 7,4. Näyte sijoitettiin anti-insuliinisefaroosipylvääseen (2,5 x 4,5 cm), joka tätä ennen oli pesty 20 ml :11a NaFAM-puskuria _/Heding, L., Diabetologia 8 (1972), 260-2667 ja 10 ml:11a 25 mM HEPES-puskuria pH 7,4. Näytteen sijoittamisen jälkeen pylvään annettiin seisoa 30 minuuttia huoneen lämpötilassa ja sen jälkeen pestiin 40 ml:11a HEPES-puskuria, pH 7,4. Peptidimateriaali eluoitiin 20 %:sella etikkahapolla ja eluaatin pH säädettiin ammoniumhydroksidilla arvoon 7,0.

Edellä saatu eluaatti väkevöitiin 250 yul:ksi vakuumirotaatiol-la ja peptidit jatkopuhdistettiin käänteisfaasi-HPLC:llä, 5 yu ..... Waters Novapak C-18 column (3,9 x 150 mm). A- ja B-puskuri • olivat 0,1 % TFA vedessä ja 0,07 % TFA asetonitriilissä vastaa- vasti. Pylväs tasapainotettiin käyttämällä 25 % B:tä virtausnopeudella 0,75 ml/min ja peptidit eluoitiin lineaarisella gradientilla (1 % asetonitriiliä minuutissa) ja detektoitiin aallonpituudella 276 nm. Pääpiikin eluoitumisen retentioaika oli 13,15 minuuttia ja tämän piikin sisältämä peptidimateriaali eristettiin lyofilisoimalla eluaatista. Peptidimateriaali : .. karakterisoitiin esimerkissä 8 kuvatulla tavalla. Jokaisen puhdistusvaiheen saanto määritettiin radioimmunologisesti, . kuten edellä on selostettu, ja puhdistuksesta on esitetty yhteenveto taulukossa 2. Kokonaissaanto oli 39 %.

24 873G1

Taulukko 2 B-Lys-Arg-A:n puhdistaminen hiivakannasta MT593

Puhdistusvaihe Tilavuus (ml) Immunoreaktiivinen _ _ B-Lys-Arg-A (nmol)

Emäliuos 815 813 RP-18-pylväs 10 620

Anti-insuliinisefaroosi- pylväs 4 450

Preparatiivinen HPLC 2 320

Esimerkki 7

B-Lys-Lys-A:n, B-Arg-Lys-A:n ja B-Arg-Arg-A:n puhdistus hiiva-kannoista MT655 (DSM 3198), MT660 (DSM 3199) ja MT616 (DSM

3195), vastaavasti_

Mainittuja hiivakantoja kasvatettiin esimerkissä 6 kuvatulla tavalla ja eri emäliuoksista puhdistettiin ilmentymistuotteet oleellisesti ottaen samoin kuin esimerkissä 6. Kokonaissaannoista on esitetty yhteenveto taulukossa 3.

Taulukko 3

Hiivakanta Emäliuoksen Peptidin Kokonaistilavuus (ml) saanto saanto _ _ (nmol) (%)_ MT655 (DSM 3198) 750 ml 689 53 MT660 (DSM 3199) 500 ml 395 38 MT616 (DSM 3195) 600 ml 301 49

Esimerkki 8

Hiivakannasta MT593 (DSM 3194) puhdistetun B-Lys-Arg-A:n karakterisointi________ B-Lys-Arg-A puhdistettiin esimerkin 6 mukaisesti. Peptidin aminohappokoostumus määritettiin seuraavasti: 139,6 ^ug (19 nmol) hydrolysoitiin 100 ^ulissa 6 N HCl:a 24 tuntia 110 C:ssa. Hydrolysaatti analysoitiin Beckman Model 121 M-aminohappoanaly-saattorilla. Aminohappokoostumuksen havaittiin olevan seuraava: 25 37801

Taulukko 4

Puhdistetun B-Lys-Arq-A:n aminohappoanalyysi

Aminohappo Löydetty Teoreet- Aminohappo Löydetty Teoreettinen _ _ tinen _ _

Asx* 2,92 3 Vai 3,71 4

Oir 2,77 3 Ile 1,62 2

Ser 2,59 3 Leu* 6,03 6

Glx* 7,01 7 Tyr 3,83 4

Pro 1,37 1 Phe* 2,93 3

Gly* 3,95 4 Lys* 1,96 2

Ala* 1,03 1 His* 2,01 2 1/2 Cys 5,47 6 Arg* 2,08 2 *) Normalisointiin käytetty aminohappo

Noin 5 nmolrlle peptidimateriaalia suoritettiin aminohappo-sekvenssin määritys. Sekvenssinmääritys suoritettiin Gas Phase Sequencerillä (Applied Biosystems Model 470 A), kuten julkaisussa Moody, A.J., Thim, L. ja Valverde, I. /FEBS Lett., 172 (1984), 142-1487 on selostettu. Saatiin seuraavat tulokset: 26 87801

Taulukko 5

Puhdistetun B-Lys-Arg-A:n aminohapposekvenssin määritys Syklit PTH-aminohappotähde Saanto (pnol) 1 Phe B1 1700 2 Vai 977 3 Ash 2100 4 Gin 951 5 His 1327 6 Leu 1717 7 Cys 8 Gly 938 9 Ser 184 10 His 591 11 Leu 718 12 Vai 777 13 Glu 363 14 Ala 491 15 Leu 408 16 Tyr 723 17 Leu 724 18 Vai 631 19 Cys 20 Gly 187 21 Glu 239 22 Arg 413 23 Gly 240 24 Phe 456 25 Phe 425 26 Tyr 223 27 Thr 78 28 Pro 109 : 29 Lys 158 I.. 30 Thr B30 59 *.· : 31 Lys 94 .....: 32 Arg 58 33 Gly Ai 56 ”*·: 34 Ile 179 35 Vai 103 36 Glu 83 37 Gin 136 38 Cys 39 Cys 40 Thr 17 • 41 Ser hieman 42 Ile 53 43 Cys 44 Ser hieman 45 Leu 60 : 46 Tyr 43 ·’ 47 Gin hieman 48 Leu 64 49 Glu 40 ...* 50 Asn 29 51 Tyr hieman 52 Cys 53 Asn A21 30

Keskimääräinen toistuva saanto oli 92,1 %.

27 87801

Esimerkki 9

Hiivakannoista B-Lys-I.ys-A:n, B-Arg-Lys-A:n ja B-Arg-Arg-A:n puhdistettujen MT655 (DSM 3198), MT660 (DSM 3199) ja MT616 (DSM 3195) karakterisointi vastaavasti_

Peptidimateriaali puhdistettiin edellä mainituista hiivakannoista esimerkissä 6 kuvatulla tavalla. Peptideille suoritettiin aminohapposekvenssin määritys esimerkissä 8 kuvatulla tavalla. Sekvenssituloksista (ei mainittu) voitiin päätellä, että B- ja A-ketjua toisiinsa yhdistävät kaksiemäksiset sekvenssit olivat Lys-Lys (MT655), Arg-Lys (MT660) ja Arg-Arg (MT616), vastaavasti. Puhdistetuille peptideille suoritettiin aminohap-poanalyysi esimerkissä 7 kuvatulla tavalla. Aminohappokoostumukset havaittiin yhtäpitäviksi teoreettisten laskelmien kanssa (tulokset on esitetty vain B-Lys-Lys-A:lie).

Taulukko 6

Puhdistetun B-Lys-Lys-A;n aminohappoanalyysi

Aminohappo Löydetty Teoreet- Aminohappo Löydetty Teoreet-___ tinen _ _ tinen

Asx* 2,95 3 Vai 3,74 4

Thr 2,77 3 Ile 1,68 2 ' Ser 2,59 3 Leu* 6,05 6

Glx* 6,92 7 Tyr 3,84 4

Pro 1,14 1 Phe* 2,97 3

Gly* 3,95 4 Lys* 2,94 3

Ala* 1,03 1 His* 1,96 2 1/2 Cys 5,44 6 Arg* 1,05 1 *) Normalisoinnissa käytetty aminohappo Esimerkki 10 B-Lys-Arg-A:n muuntaminen ihmisen insuliiniksi (yksivaiheinen menetelmä)_ 10 mg B-Lys-Arg-A:ta liuotettiin 10 ml:aan 0,23 M Tris.HCl-: puskuria, pH 7,5. Liuos kuumennettiin 37°C:een ja ajankohtana O lisättiin 50 ^,ug trypsiiniä (NOVO Industri A/S) ja 50 ^ug karboksipeptidaasi B:tä (Boehringer), jotka kumpikin oli liuotettu 28 87801 100 yUlsaan vettä. Reaktioseoksesta otettiin näytteet ajankohtina 0 min, 2 min, 10 min, 40 min ja 80 min. Entsyymi-reaktio pysäytettiin säätämällä näytteiden pH arvoon 2,5 lisäämällä 1 M suolahappoa.

B-Lys-Arg-A:n muuttumista ihmisen insuliiniksi seurattiin kään-teisfaasi-HPLC: llä käyttämällä Nucleosil 5 RP C-18-pylvästä (4 x 200 mm) (Macherey Nagel). A-puskuri sisälsi 25 % aseto-nitriiliä ja pH oli säädetty rikkihapolla arvoon 3,5 ja B-puskuri sisälsi 45 % asetonitriiliä, 0,15 M (NH^^SO^ ja 1,5 mM ^SO^. Eluointi suoritettiin isokraattisella systeemillä käyttämällä seosta, jossa oli 80 % A-puskuria/20 % B-puskuria, virtausnopeuden ollessa 1 ml/min. Liuottimien ja pylvään lämpötila oli 30°C ja peptidit detektoitiin aallonpituudella 214 nm.

Optimaalinen saanto yksivaiheisessa prosessissa saatiin 10 minuutin inkuboinnilla. Tässä vaiheessa reaktioseos sisälsi 45 % ihmisen insuliinia, 1.0 % des-B30-insuliinia ja 45 % Arg-Ao-insuliinia. Saannon parantamiseksi suunniteltiin kaksivaiheinen muuntaminen (esimerkki 11).

’* Esimerkki 11 B-Lys-Arg-A:n muuntaminen ihmisen insuliiniksi (kaksivaiheinen menetelmä) . 1--1 26,4 ml vettä lisättiin 471 mg:aan B-Lys-Arg-A:ta. Seos jääh- : dytettiin 4°C:een ja lisättiin 3,0 ml 0,25 M natriumhydroksi- dia, jonka seurauksena insuliinin prekursori liukeni. Lisättiin 6 mg trypsiiniä (NOVO Industri A/S) 200 ^ul:ssa vettä.

• : Reaktion annettiin edetä 5 tuntia 4°C:ssa ja sen jälkeen se py säytettiin lisäämällä 600 ^ul 4 N suolahappoa. Saanto määritettynä HPLCrllä (menetelmä esitetty esimerkissä 10) oli 9.1,5 % B-Lys-Arg A;ta ja pääosa jäljellejääneestä 8,5 %:sta oli : B-Lys-Arg-A:ta. Tuote (B-Lys-Arg A) puhdistettiin preparatii- . visessa HPLC-pylväässä (5 x 25 cm) (oktadekyylidimetyylisilyy-

Iillä substituoitu piidioksidi) (keskimääräinen hiukkaskoko 15 yu, huokoskoko 100 A). Pylväs tasapainotettiin ja eluoitiin 29 87801 (isokraattinen) liuoksella, jossa oli 0,185 M KCl/0,6 mM HC1 (pH = 3,15), ja joka sisälsi 37 tilavuus-% etanolia, virtaus- i--—| nopeudella 2 1/h. B-Lys-Arg A eluoitui 4,3 pylvästilavuuden kohdalla ja eristettiin alkoholipitoisesta yhteenkerätystä määrästä kiteyttämällä kuten on esitetty ihmisen insuliinin B-30-esterien kiteytyksen kohdalla julkaisussa Markussen, J.

(1984) "Diabetes Research Voi. I, laboratory Methods Part B" sivut 403-411, toim. Larner ja Pohl.

Kiteet lyofilisoitiin ja liuotettiin 50 mM Tris-HCl-puskuriin (pH 9,3) pitoisuuteen 10 mg/ml. Insuliinin prekursorivälituote muunnettiin ihmisen insuliiniksi pilkkomalla karboksipeptidaasi B:llä (40 ^ug/ml) 40 tuntia 37°C:ssa. Sen jälkeen pilkkomis-seokseen lisättiin etanolia niin, että lopulliseksi pitoisuudeksi tuli 60 tilavuus-% ja ihmisinsuliini puhdistettiin seoksesta suorittamalla ioninvaihtokromatografia QAE-Sephadex-pylväässä (Pharmacia), kuten on selostettu julkaisussa Schlichtkrull et ai. /Horm.Metab.Res.Suppl., Ser. 5 (1974) 134-1437·

Eri muuntamisvaiheiden saannot puhdistukset mukaanlukien on : : : esitetty taulukossa 7.

Taulukko 7 B-Lys-Arg-A;n muuntaminen ihmisinsuliiniksi

Vaihe Tuote Määrä (mg) Saanto (%)

- 1 I

Lähtöaine B-Lys-Arg-A 471 100 I-1

Trypsiinihajotus B-Lys-Arg A 431 91,5 i-1 HPLC-kertymä B-Lys-Arg A 399 84,7 I i -Karboksipeptidaasi B A (ihmisinsuliini) 379 80,5 B-hajotus I-1 QAE-kertymä B A (ihmisinsuliini) 359 76,2 30 3 7 3 01

Esimerkki 12 B-Lys-Lys-A:n muuntaminen ihmisinsuliiniksi (yksivaiheinen menetelmä)_ 10 mg B-Lys-Lys-A:ta muunnettiin ihmisinsuliiniksi esimerkissä 10 kuvatulla tavalla. Ihmisinsuliinin kokonaissaanto HPLCrllä määritettynä oli 48 %. Muut tunnistetut tuotteet olivat Lys-Ao-insuliini (42 %), des-B30-insuliini (9 %) ja vähäinen määrä tunnistamattomia aineosia (1 %).

Esimerkki 13 B-Lys-Arg-A:sta valmistetun ihmisinsuliinin karakterisointi Ihmisinsuliini valmistettiin esimerkin 11 mukaisesti ja karakterisoitiin seuraavilla analyyseillä: a) Ihmisinsuliini antaa vain yhden vyöhykkeen emäksisessä kiekkoelektroforeesissa käytettäessä ureapitoisia polyakryyli-amidigeelejä /Method described by Schlichtkrull et ai., Horm. Metabol.Res., Suppl. Ser. 5 (1974) 134-14^7- Vyöhyke liikkui kuten ihmisen haiman insuliini.

b) Säännöllisen muotoisia romboedrisiä kiteitä saatiin, kun ihmisinsuliini kiteytettiin Zn++:n läsnäollessa /Method described by Schlichtkrull, Acta Chem. Scand. 10 (1956) 1459-14647.

c) Ihmisinsuliinin biologinen aktiivisuus määritettiin kykynä poistaa sokeri hiiren verestä. Arvioitu voimakkuus oli 28,1 IU/mg (p 0,05 confidens-rajat: 25,7-30,7 IU/mg) käyttämällä insuliinia varten tarkoitettua 4. kansainvälistä standardia.

d) Ihmisinsuliinin aminohappokoostumus määritettiin näytteistä, joita oli hydrolysoitu 24, 48 ja 96 tuntia 110°C:ssa 6 N suolahapon kanssa, ja Thr:n, Ser:n, Pro:n ja NH^:n arvot määritettiin regressiosuoralla (t 0). Vai :n ja '1 k::n arvot ekstrapoloitiin äärettömään hydrolyysiaikaan. 1/2 Cys:n arvo määritettiin hydrolysoimalla 24 tuntia 4 M metaanisulfonihapossa. Aminohappokoostumus on esitetty taulukossa 8.

3i 87 801

Taulukko 8 B-Lys-Arg-A:sta valmistetun ihmisinsuliinin aminohappokoostumus Aminohappo Aminohappotähde/molekyyli _ Löydetty Teoreettinen

Asx 2,95 3

Thr 2,90 3

Ser 3,00 3

Glx 6,95 7

Pro 1,06 1

Gly 3,95 4

Ala 1,04 1 1/2 Cys 5,65 6

Vai 4,10 4

Ile 2,00 2

Leu 6,00 6

Tyr 3,94 4

Phe 2,93 3

Lys 1,01 1

His 1,96 2

Arg 1,02 1 (NH3) (5,60) (6)

Claims

32 87801

1. DNA-sekvenssi, tunnettu siitä, että se koostuu sellaisesta nukleotidikombinaatiosta, joka koodaa kaavan (I) mukaista ihmisinsuliiniprekursoria B-X-Y-A (I) jossa kaavassa B ja A tarkoittavat ihmisinsuliinin B- ja A-ketjua silloitettuina yhteen kuten ihmisinsuliinissa ja kukin ryhmistä X ja Y voi olla lysiini tai arginiini.

2. Plasmidi, tunnettu siitä, että se sisältää patenttivaatimuksen 1 mukaisen DNA-sekvenssin.

3. Menetelmä kaavan (I) mukaisten ihmisinsuliinin prekur-sorien valmistamiseksi B-X-Y-A (I) jossa kaavassa B ja A tarkoittavat ihmisinsuliinin B- ja A-ketjua silloitettuina yhteen kuten ihmisinsuliinissa ja kukin ryhmistä X ja Y voi olla lysiini tai arginiini, tunnettu siitä, että hiivakantaa, joka on transformoitu patent-] tivaatimuksen 2 mukaisella plasmidilla, viljellään sopivassa kasvualustassa ja ihmisinsuliinin prekursori otetaan talteen kasvualustasta.

4. Menetelmä ihmisinsuliinin tuottamiseksi, tunnettu siitä, että hiivakanta, joka on transformoitu patenttivaatimuksen 2 mukaisella plasmidilla, viljellään sopivassa kasvualustassa ja ihmisinsuliinin prekursori otetaan talteen kasvualustasta ja muunnetaan ihmisinsuliiniksi sinänsä tunnetulla entsymaattisella käsittelyllä.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että entsymaattinen käsittely käsittää kaksi vaihetta, joista ensimmäisessä vaiheessa käsitellään trypsiinillä ja toisessa vaiheessa käsitellään karboksipeptidaasi B:llä. 33 87801

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että trypsiinikäsittely suoritetaan pH-alueella 11-12.