JPS61221200A - インシュリンの製造方法 - Google Patents
インシュリンの製造方法Info
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- JPS61221200A JPS61221200A JP61060995A JP6099586A JPS61221200A JP S61221200 A JPS61221200 A JP S61221200A JP 61060995 A JP61060995 A JP 61060995A JP 6099586 A JP6099586 A JP 6099586A JP S61221200 A JPS61221200 A JP S61221200A
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- insulin
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- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
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- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
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- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/37—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi
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- C07K14/575—Hormones
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- C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は新規生合成インシュリン前駆体および該生合成
インシュリン前駆体からのヒトインシュリンの調製に関
する。
インシュリン前駆体からのヒトインシュリンの調製に関
する。
ヒトインシュリンは２つのペプチド鎖、すなわち２１個
のアミノ酸残基を含むＡ鎖と３０個のアミノ酸残基を含
むＢ鎖からなる。Ａ鎖とＢ鎖は、それぞれＡ７とＢ７お
よびＡ２０とＢ１９のシステイニル基を結ぶ２つのジス
ルフィド橋により一緒に結合している。第三のジスルフ
ィド橋がＡ６とＡｌｌのシステイニル基の間に形成され
る。
のアミノ酸残基を含むＡ鎖と３０個のアミノ酸残基を含
むＢ鎖からなる。Ａ鎖とＢ鎖は、それぞれＡ７とＢ７お
よびＡ２０とＢ１９のシステイニル基を結ぶ２つのジス
ルフィド橋により一緒に結合している。第三のジスルフ
ィド橋がＡ６とＡｌｌのシステイニル基の間に形成され
る。
ヒトインシュリンはプレプロインシュリンの形で膵臓に
おいてインビボ生産される。プレプロインシュリンは、
２４個のアミノ酸残基のプレペプチドとこれに続く８６
個のアミノ酸残基とからなり、次の構成：プレペプチド
−Ｂ −Ａｒｇ −Ａｒｇ −Ｃ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａ
（Ｃは３１個のアミノ酸残基のＣ−ペプチドである）
を有するものである。
おいてインビボ生産される。プレプロインシュリンは、
２４個のアミノ酸残基のプレペプチドとこれに続く８６
個のアミノ酸残基とからなり、次の構成：プレペプチド
−Ｂ −Ａｒｇ −Ａｒｇ −Ｃ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａ
（Ｃは３１個のアミノ酸残基のＣ−ペプチドである）
を有するものである。
小島細胞からの排出の間、プレペプチドが開裂除去し次
いでプロインシュリンはジスルフィドが折りたたまれて
ジスルフィド橋を形成する構造となる。Ｃ−ペプチドは
、次いでタンパク質加水分解で削除され成熟したヒトイ
ンシュリンになる。
いでプロインシュリンはジスルフィドが折りたたまれて
ジスルフィド橋を形成する構造となる。Ｃ−ペプチドは
、次いでタンパク質加水分解で削除され成熟したヒトイ
ンシュリンになる。
幾つかの試みがインシュリン製造、特に組換えＤＮＡ技
術を用いたヒトインシュリンの製造についてなされてき
た。ヨーロッパ特許出願公開第００５５９４５Ａ号では
、大腸菌からのプロインシュリンまたはミニプロインシ
ュリンの調製が記載されている。この方法は、キメラポ
リペプチドの発現、このキメラポリペプチドのインビト
ロ開裂およびＡＩＪｊ−Ｂ核間のジスルフィド結合のイ
ンビトロ形成とＡ鎖−Ｂ核間の橋かけ鎖の削除によりヒ
トインシュリンを得ることからなる。ヨーロッパ特許出
願公開第６８７０１号には、大腸菌の形質転換によりい
くらか短かくしたＣ−ペプチドで変性されたプロインシ
ュリンの調製が提案されている。
術を用いたヒトインシュリンの製造についてなされてき
た。ヨーロッパ特許出願公開第００５５９４５Ａ号では
、大腸菌からのプロインシュリンまたはミニプロインシ
ュリンの調製が記載されている。この方法は、キメラポ
リペプチドの発現、このキメラポリペプチドのインビト
ロ開裂およびＡＩＪｊ−Ｂ核間のジスルフィド結合のイ
ンビトロ形成とＡ鎖−Ｂ核間の橋かけ鎖の削除によりヒ
トインシュリンを得ることからなる。ヨーロッパ特許出
願公開第６８７０１号には、大腸菌の形質転換によりい
くらか短かくしたＣ−ペプチドで変性されたプロインシ
ュリンの調製が提案されている。
上記方法は、主として、大腸菌を形質転換微生物として
使用するという事実に由来する幾つかの欠点を有する。
使用するという事実に由来する幾つかの欠点を有する。
発現産物は細胞から分泌されるだけでなく大腸菌宿主微
生物において細胞内に蓄積される。しかしながら、プレ
プロインシュリンまたは変性されたプレプロインシュリ
ン型の発現したポリペプチド産物の蓄積は、発現産物の
酵素分解の危険性を増加する。さらに、プロセッシング
、折りたたみおよびジスルフィド橋の確立は明らかにイ
ンビトロで行なわねばならない。
生物において細胞内に蓄積される。しかしながら、プレ
プロインシュリンまたは変性されたプレプロインシュリ
ン型の発現したポリペプチド産物の蓄積は、発現産物の
酵素分解の危険性を増加する。さらに、プロセッシング
、折りたたみおよびジスルフィド橋の確立は明らかにイ
ンビトロで行なわねばならない。
哺乳動物ポリペプチドの発現に対しより都合の良い系は
真核生物細胞であると思われ、真核生物特に酵母におい
て外来遺伝子を発現させる幾つかの試みがなされてきた
。酵母におけるインターフェロンの発現はヨーロッパ特
許出願公開第００６００５７Ａ号に記載され、酵母と異
種のタンパク質の酵母における発現と分泌はヨーロッパ
特許出願公開第００８８６３２Ａ号、同第００６２０１
Ａ号および同第０１２３５４４Ａ号に記載されている。
真核生物細胞であると思われ、真核生物特に酵母におい
て外来遺伝子を発現させる幾つかの試みがなされてきた
。酵母におけるインターフェロンの発現はヨーロッパ特
許出願公開第００６００５７Ａ号に記載され、酵母と異
種のタンパク質の酵母における発現と分泌はヨーロッパ
特許出願公開第００８８６３２Ａ号、同第００６２０１
Ａ号および同第０１２３５４４Ａ号に記載されている。
酵母における“プレ”−プロインシュリンの発現方法お
よび発現した“プレ”−プロインシュリンのプロセッシ
ングと分泌方法はヨーロッパ特許出願公開第０１２１８
８４Ａ号に記載されている。しかしながら、プロインシ
ュリン型のインシュリン前駆体は酵母において酵素分解
を受けやすく、その結果、もしあるとしても分泌された
プロインシュリンまたは成熟インシュリンが非常に低い
収率で得られるだけであるということが出願人により示
されている。酵母においてはヒトプロインシュリンおよ
びいくらか短かくしたＣ−ペプチドを有するプロインシ
ュリン類似物がＣ−ペプチド領域の側方に位置する２つ
の二塩基性配列で酵素分解を特に受けやすいということ
が示されている。明らかにこれらの開裂はＳ−８橋の確
立前に生じ、その結果、Ｃ−ペプチド、Ａ鎖およびＢ鎖
が形成される。
よび発現した“プレ”−プロインシュリンのプロセッシ
ングと分泌方法はヨーロッパ特許出願公開第０１２１８
８４Ａ号に記載されている。しかしながら、プロインシ
ュリン型のインシュリン前駆体は酵母において酵素分解
を受けやすく、その結果、もしあるとしても分泌された
プロインシュリンまたは成熟インシュリンが非常に低い
収率で得られるだけであるということが出願人により示
されている。酵母においてはヒトプロインシュリンおよ
びいくらか短かくしたＣ−ペプチドを有するプロインシ
ュリン類似物がＣ−ペプチド領域の側方に位置する２つ
の二塩基性配列で酵素分解を特に受けやすいということ
が示されている。明らかにこれらの開裂はＳ−８橋の確
立前に生じ、その結果、Ｃ−ペプチド、Ａ鎖およびＢ鎖
が形成される。
°〔発明の目的および構成〕
本発明の目的は、Ａ部分とＢ部分の間に正しく位置した
ジスルフィド橋を有しながら酵母において高収率で発生
し、ヒトインシュリンへ容易に転化されうるインシュリ
ン前駆体を提供するものである。
ジスルフィド橋を有しながら酵母において高収率で発生
し、ヒトインシュリンへ容易に転化されうるインシュリ
ン前駆体を提供するものである。
ブロイ′−ンシュリン型の幾つかのインシュリン前駆体
（プロインシュリンを含む）が研究されてきている（表
１参照）、当該前駆体をコードするＤＮＡ配列を酵母ベ
クター系へ挿入し、上記の技術および後述する技術にし
たがって酵母へ形質転換する。インシュリン前駆体をコ
ードする遺伝子は、前駆体遺伝子の上流側で融合する酵
母識別性分泌シグナルおよびプロセッシングシグナルを
コードするＤＮＡ配列を有する。この研究において、リ
ーダーの最後の４つの残基（Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−
Ａ ｌａ）をコードする部分を除去した変性肝α１リー
ダー配列が用いられる。変性されたＭＦα１リーダーは
プロセッシングシグナルとして二塩基性配列Ｌｙｓ−Ａ
ｒｇを含み、これが次に前駆体をコードする遺伝子の５
′−末端と融合する。全ての構築においてリーダー配列
が開裂除去され、すなわち全てのインシュリン前駆体遺
伝子の上流の二塩基性配列Ｌｙｓ−Ａｒｇで開裂が生じ
ることが見い出された。しかしながら、Ｃ−ペプチドま
たは変性されたＣ−ペプチドの測方に位置する２つの二
塩基性配列を含むすべてのインシュリン前駆体構築物に
おいて、正しくジスルフィド橋が位置する以前に両方の
二塩基性部位でプロセッシングが見られ、発酵液から一
本鎖の非プロセス前駆体分子が単離されなかった。した
がって酵母はプロインシュリン型のインシュリン前駆体
製造用発現型系とし使用することができない。
（プロインシュリンを含む）が研究されてきている（表
１参照）、当該前駆体をコードするＤＮＡ配列を酵母ベ
クター系へ挿入し、上記の技術および後述する技術にし
たがって酵母へ形質転換する。インシュリン前駆体をコ
ードする遺伝子は、前駆体遺伝子の上流側で融合する酵
母識別性分泌シグナルおよびプロセッシングシグナルを
コードするＤＮＡ配列を有する。この研究において、リ
ーダーの最後の４つの残基（Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−
Ａ ｌａ）をコードする部分を除去した変性肝α１リー
ダー配列が用いられる。変性されたＭＦα１リーダーは
プロセッシングシグナルとして二塩基性配列Ｌｙｓ−Ａ
ｒｇを含み、これが次に前駆体をコードする遺伝子の５
′−末端と融合する。全ての構築においてリーダー配列
が開裂除去され、すなわち全てのインシュリン前駆体遺
伝子の上流の二塩基性配列Ｌｙｓ−Ａｒｇで開裂が生じ
ることが見い出された。しかしながら、Ｃ−ペプチドま
たは変性されたＣ−ペプチドの測方に位置する２つの二
塩基性配列を含むすべてのインシュリン前駆体構築物に
おいて、正しくジスルフィド橋が位置する以前に両方の
二塩基性部位でプロセッシングが見られ、発酵液から一
本鎖の非プロセス前駆体分子が単離されなかった。した
がって酵母はプロインシュリン型のインシュリン前駆体
製造用発現型系とし使用することができない。
驚（べきことに、ここにおいて、ヒトインシュリンのＡ
ＩとＢ鎖を１つの二塩基性配列でのみ結合したとき（表
１の構築物？−１０）、酵母において二塩基性配列での
開裂が起こらず、ジスルフィド橋が正しく位置した一本
鎖インシュリン前駆体が当該インシュリン前駆体をコー
ドするＤＮＡ配列で形質転換された酵母株から発酵液中
で高収率にて得られるということが見い出された。本発
明は、前駆体をコードする遺伝子の上流に位置するリー
ダー配列でＬｙｓ−Ａｒｇでの完全開裂が見られるので
、より一層驚くべきものであろう。
ＩとＢ鎖を１つの二塩基性配列でのみ結合したとき（表
１の構築物？−１０）、酵母において二塩基性配列での
開裂が起こらず、ジスルフィド橋が正しく位置した一本
鎖インシュリン前駆体が当該インシュリン前駆体をコー
ドするＤＮＡ配列で形質転換された酵母株から発酵液中
で高収率にて得られるということが見い出された。本発
明は、前駆体をコードする遺伝子の上流に位置するリー
ダー配列でＬｙｓ−Ａｒｇでの完全開裂が見られるので
、より一層驚くべきものであろう。
Ａ鎖とＢ鎖の間に１つの二塩基性配列を含むこの種のイ
ンシュリン前駆体は後述するようにインビトロ消化によ
りヒトインシュリンへ簡単に転化することができるので
、本発明はヒトインシュリン製造のための経済的に魅力
のある方法を提供するものである。
ンシュリン前駆体は後述するようにインビトロ消化によ
りヒトインシュリンへ簡単に転化することができるので
、本発明はヒトインシュリン製造のための経済的に魅力
のある方法を提供するものである。
第一に、本発明は、次式：
％式％（）
（式中、Ｂおよび△はヒトインシュリンにおけるように
架橋結合したヒトインシュリンのＢ鎖およびＡ鎖であり
、ＸおよびＹはそれぞれリシンまたはアルギニン残基を
表わす。）で表わされる新規インシュリン前駆体を提供
するものである。
架橋結合したヒトインシュリンのＢ鎖およびＡ鎖であり
、ＸおよびＹはそれぞれリシンまたはアルギニン残基を
表わす。）で表わされる新規インシュリン前駆体を提供
するものである。
上記式（１）のインシュリン前駆体は、Ｂ−Ｌｙｓ −
Ｌｙｓ −Ａ、 Ｂ −Ｌｙｓ −Ａｒｇ −Ａ、 Ｂ
−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−ＡおよびＢ −Ａｒｇ −Ａｒｇ
−Ａであり、最初の２つが最も好ましい。
Ｌｙｓ −Ａ、 Ｂ −Ｌｙｓ −Ａｒｇ −Ａ、 Ｂ
−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−ＡおよびＢ −Ａｒｇ −Ａｒｇ
−Ａであり、最初の２つが最も好ましい。
本発明の第二の点によれば、酵母における前記インシュ
ーリン前駆体の製造方法を提供するものであり、この方
法により、インシュリン前駆体をコードするＤＮＡ配列
からなる発現ビヒクルを適当な培養基で培養し、この培
養基からインシュリン前駆体を回収する。
ーリン前駆体の製造方法を提供するものであり、この方
法により、インシュリン前駆体をコードするＤＮＡ配列
からなる発現ビヒクルを適当な培養基で培養し、この培
養基からインシュリン前駆体を回収する。
このように形質転換された酵母株を培養すると、本発明
による４つのインシュリン前駆体の全てが高収率で培養
液から単離され、特にＢ−Ｌｙｓ−Ｌ ｙｓ−、ＡとＢ
−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａが高収率で発現する。したがって
、発現レベルの点から、これら２つの前駆体が好ましい
ものであろう。
による４つのインシュリン前駆体の全てが高収率で培養
液から単離され、特にＢ−Ｌｙｓ−Ｌ ｙｓ−、ＡとＢ
−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａが高収率で発現する。したがって
、発現レベルの点から、これら２つの前駆体が好ましい
ものであろう。
発現産物を単離し、インシュリン免疫反応性物質（ＩＲ
Ｉ−ペプチド）を精製し、そして微量配列分析により特
性を決定した。上記式（Ｉ）の前駆体が、３つのジスル
フィド橋により次の１／２システィン残基：Ａ６−Ａｌ
ｌ、Ａ７−８７、Ａ２０−８１９が連結された一本鎖分
子であること、すなわち酵母においてヒトインシュリン
と比較してジスルフィド橋を正しい位置に有する前駆体
が発現することが見い出された。新規インシュリン前駆
体の構造を図１に示す。
Ｉ−ペプチド）を精製し、そして微量配列分析により特
性を決定した。上記式（Ｉ）の前駆体が、３つのジスル
フィド橋により次の１／２システィン残基：Ａ６−Ａｌ
ｌ、Ａ７−８７、Ａ２０−８１９が連結された一本鎖分
子であること、すなわち酵母においてヒトインシュリン
と比較してジスルフィド橋を正しい位置に有する前駆体
が発現することが見い出された。新規インシュリン前駆
体の構造を図１に示す。
本発明はさらに、酵母宿主において上記インシュリン前
駆体を効率良く製造するためならびに栄養培地へこの前
駆体を分泌するための新規発現ビヒクルを提供するもの
である。発現ビヒクルは、酵母宿主において安定に維持
される複製系、上記式（１）のインシュリン前駆体をコ
ードするＤＮＡ配列およびプロモーターならびにターミ
ネータ−配列からなる。
駆体を効率良く製造するためならびに栄養培地へこの前
駆体を分泌するための新規発現ビヒクルを提供するもの
である。発現ビヒクルは、酵母宿主において安定に維持
される複製系、上記式（１）のインシュリン前駆体をコ
ードするＤＮＡ配列およびプロモーターならびにターミ
ネータ−配列からなる。
発現ビヒクルは、所望産物をコードするＤＮＡ配列の上
流に、発現産物を酵母分泌系へ向けさせそして増殖培地
へ発現産物を分泌するのを確実にする予備領域（ｐｒｅ
ｒｅｇｉｏｎ）を含んでもよい。この予備領域は、分泌
をもたらす天然産生シグナルもしくはリーダーペプチド
または合成配列であってよく、一般に、分泌の間所望産
物から開裂し培養液からただちに単離される成熟産物を
残す。
流に、発現産物を酵母分泌系へ向けさせそして増殖培地
へ発現産物を分泌するのを確実にする予備領域（ｐｒｅ
ｒｅｇｉｏｎ）を含んでもよい。この予備領域は、分泌
をもたらす天然産生シグナルもしくはリーダーペプチド
または合成配列であってよく、一般に、分泌の間所望産
物から開裂し培養液からただちに単離される成熟産物を
残す。
酵母に対し、非常に適したリーダー配列は酵母ＭＦα１
リーダー配列である〔クルシャン、ジェイ。
リーダー配列である〔クルシャン、ジェイ。
（Ｋｕｒｊａｎ、Ｊ、） とヘルスコウィッッ、アイ。
（Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ、１．） 、Ｃｅ１ｌ ３０
、（１９Ｂ２）、９３３−９４３） 。
、（１９Ｂ２）、９３３−９４３） 。
発現ビヒクルは宿主微生物中で複製しうるプラスミドま
たは宿主微生物染色体へ組込まれうるプラスミドでよい
。使用するビヒクルは、それぞれ選択的開裂部位により
分離された所望ＤＮＡ配列の繰り返し配列の発現をコー
ドする。
たは宿主微生物染色体へ組込まれうるプラスミドでよい
。使用するビヒクルは、それぞれ選択的開裂部位により
分離された所望ＤＮＡ配列の繰り返し配列の発現をコー
ドする。
所望ＤＮＡ配列の発現は所望産物をコードするＤＮＡ配
列に正しく位置するプロモーター配列の制御下であり、
この結果宿主微生物に所望産物が発現する。酵母宿主固
有の遺伝子からのプロモーターを使用するのが好ましく
、たとえばＴＰＩ（トリオース ホスフェート イソメ
ラーゼ）遺伝子のプロモーターまたは肝α１−プロモー
ターである。
列に正しく位置するプロモーター配列の制御下であり、
この結果宿主微生物に所望産物が発現する。酵母宿主固
有の遺伝子からのプロモーターを使用するのが好ましく
、たとえばＴＰＩ（トリオース ホスフェート イソメ
ラーゼ）遺伝子のプロモーターまたは肝α１−プロモー
ターである。
所望産物のＤＮＡ配列の後には転写終結配列が続く。こ
の転写終結配列は、好ましくは、酵母宿主に固有の遺伝
子からのもの、たとえばＴＰＩ−遺伝子またはＭＦα１
遺伝子のターミネータ−である。
の転写終結配列は、好ましくは、酵母宿主に固有の遺伝
子からのもの、たとえばＴＰＩ−遺伝子またはＭＦα１
遺伝子のターミネータ−である。
本発明はまた上記式（１）のインシュリン前駆体をコー
ドする新規合成りＮＡ配列を提供するものである。新規
ＤＮＡ配列は化学的に合成された３０を体オリゴヌクレ
オチドを用いてヒトプロインシュリン遺伝子をインビト
ロでの突然変異誘発でループアウト（ｌｏｏｐ ｏｕｔ
） Ｌ／、もとのＣ−ペプチドコード配列を欠失させる
ことにより構築される。
ドする新規合成りＮＡ配列を提供するものである。新規
ＤＮＡ配列は化学的に合成された３０を体オリゴヌクレ
オチドを用いてヒトプロインシュリン遺伝子をインビト
ロでの突然変異誘発でループアウト（ｌｏｏｐ ｏｕｔ
） Ｌ／、もとのＣ−ペプチドコード配列を欠失させる
ことにより構築される。
この型のインシュリン前駆体は、ケムラー（Ｋｅｍｍｌ
ｅｒ）により記載されたプロインシュリンからインシュ
リンへのインビトロ転化と同様の方法（ケムラーら（Ｋ
ｅｍｍｌｅｒ ｅｔ ａｌ、）、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａ
ｌ ｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、
２４６（１９７１） 、６７８６−６７９１）により
、トリプシンおよびカルボキシペプチダーゼＢを用いて
インビトロ消化により、ＸおよびＹアミノ酸残基を除去
することによりヒトインシュリンへ転化されうる。
ｅｒ）により記載されたプロインシュリンからインシュ
リンへのインビトロ転化と同様の方法（ケムラーら（Ｋ
ｅｍｍｌｅｒ ｅｔ ａｌ、）、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａ
ｌ ｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、
２４６（１９７１） 、６７８６−６７９１）により
、トリプシンおよびカルボキシペプチダーゼＢを用いて
インビトロ消化により、ＸおよびＹアミノ酸残基を除去
することによりヒトインシュリンへ転化されうる。
したがって本発明は、インシュリンを前駆体の水溶液を
トリプシンおよびカルボキシペプチダーゼＢで処理し、
その後ヒトインシュリン該溶液から回収することからな
る、上記式（１）で表わされるインシュリン前駆体を成
熟したヒトインシュリンへ酵素的に転化する方法を提供
するものである。
トリプシンおよびカルボキシペプチダーゼＢで処理し、
その後ヒトインシュリン該溶液から回収することからな
る、上記式（１）で表わされるインシュリン前駆体を成
熟したヒトインシュリンへ酵素的に転化する方法を提供
するものである。
酵素転化は、トリプシンとカルボキシペプチダーゼＢが
反応混合物中に同時に存在することによる一段階法で行
なってもよい。一段階反応はほぼ中性ｐｉにて若干高め
た温度で行なわれるのが好ましい。ヒトインシュリンの
収率は約５０％である。
反応混合物中に同時に存在することによる一段階法で行
なってもよい。一段階反応はほぼ中性ｐｉにて若干高め
た温度で行なわれるのが好ましい。ヒトインシュリンの
収率は約５０％である。
より優れた収率は、Ｂ−Ｘ−Ａｒｇ−Ａ型のインシュリ
ン前駆体を二段階で転化することにより得られる。この
ような二段階転化において、最初の工程ではトリプシン
を使用し、消化産物を単離し、続いてカルボキシペプチ
ダーゼＢで消化する。トリプシン消化を高いｐＨたとえ
ばｐＨ１１〜１２の範囲でそして低温（約４℃）で行な
うことにより、ヒトインシュリンの縮収率は約８０％で
あった。高いｐＨでのトリプシン消化における高収率を
得るために、Ｂ３２に位置するアミノ酸残基（第１図参
照）はアルギニンでなければならない（式ＩにおいてＹ
＝Ａｒｇ）。この基はいまだに主として賜電荷に帯電し
、トリプシン開裂を受けやすい。したがって、酵母にお
いて高いレベルで発現し非常に高収率でヒトインシュリ
ンへ転化されるので前駆体Ｂ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａが最
も好ましい前駆体であろう。
ン前駆体を二段階で転化することにより得られる。この
ような二段階転化において、最初の工程ではトリプシン
を使用し、消化産物を単離し、続いてカルボキシペプチ
ダーゼＢで消化する。トリプシン消化を高いｐＨたとえ
ばｐＨ１１〜１２の範囲でそして低温（約４℃）で行な
うことにより、ヒトインシュリンの縮収率は約８０％で
あった。高いｐＨでのトリプシン消化における高収率を
得るために、Ｂ３２に位置するアミノ酸残基（第１図参
照）はアルギニンでなければならない（式ＩにおいてＹ
＝Ａｒｇ）。この基はいまだに主として賜電荷に帯電し
、トリプシン開裂を受けやすい。したがって、酵母にお
いて高いレベルで発現し非常に高収率でヒトインシュリ
ンへ転化されるので前駆体Ｂ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａが最
も好ましい前駆体であろう。
最後に、本発明は、前記式■で表わされるインシュリン
前駆体をコードするＤＮＡ配列からなる複製可能な発現
ビヒクルで形質転換された酵母株を適当な栄養培地で培
養し、このインシュリン前駆体を培養基から回収しヒト
インシュリンへ転化することからなるヒトインシュリン
の調製方法を提供するものである。
前駆体をコードするＤＮＡ配列からなる複製可能な発現
ビヒクルで形質転換された酵母株を適当な栄養培地で培
養し、このインシュリン前駆体を培養基から回収しヒト
インシュリンへ転化することからなるヒトインシュリン
の調製方法を提供するものである。
本発明は説明したトリプシンとカルボキシペプチダーゼ
Ｂによる転化に限定されるものではない同様な特異生を
有する他のインビトロ酵素系が見い出される場合にはこ
のような酵素系も同様に使用されうる。
Ｂによる転化に限定されるものではない同様な特異生を
有する他のインビトロ酵素系が見い出される場合にはこ
のような酵素系も同様に使用されうる。
１、 ヒトプロインシュリンＢ−Ｃ−Ａをコードする遺
伝子の調製ヒト膵臓から精製された総ＲＮＡ（キルウィ
ン、ジェイ、エム、 （Ｃｈｉｒｇｗｉｎ、Ｊ、Ｍ、）
、プルジビラ、ニー、イー、 （Ｐｒｚｙｂｙｌａ、
Ａ、Ｅ、）、マクドナルド、アール、ジエイ、 （Ｍｃ
Ｄｏｎａｌｄ、 Ｒ，Ｊ、）とラッター、ダブリヱ、ジ
ェイ、（Ｒｕｔｔｅｒ＋Ｗ、Ｊ、）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ １Ｂ、（１９７９）５２９４−５２９９）
を、ＡＭＶ逆転写酵素と１．ストランドプライマーとし
てｄ（ＧＣＴＴＴＡＴＴＣＣＡＴＣＴＣＴＣ）を用いて
逆転写する〔ベール、イー、 （Ｂｏｅ１４−）、ブー
スト、ジェイ、（Ｖｕｕｓｔ。
伝子の調製ヒト膵臓から精製された総ＲＮＡ（キルウィ
ン、ジェイ、エム、 （Ｃｈｉｒｇｗｉｎ、Ｊ、Ｍ、）
、プルジビラ、ニー、イー、 （Ｐｒｚｙｂｙｌａ、
Ａ、Ｅ、）、マクドナルド、アール、ジエイ、 （Ｍｃ
Ｄｏｎａｌｄ、 Ｒ，Ｊ、）とラッター、ダブリヱ、ジ
ェイ、（Ｒｕｔｔｅｒ＋Ｗ、Ｊ、）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ １Ｂ、（１９７９）５２９４−５２９９）
を、ＡＭＶ逆転写酵素と１．ストランドプライマーとし
てｄ（ＧＣＴＴＴＡＴＴＣＣＡＴＣＴＣＴＣ）を用いて
逆転写する〔ベール、イー、 （Ｂｏｅ１４−）、ブー
スト、ジェイ、（Ｖｕｕｓｔ。
Ｊ、）、ノリス、エフ、 （Ｎｏｒｒｉｓ、Ｆ、）、ノ
リス、ケー。
リス、ケー。
（Ｎｏｒｒｉｓ、に、） 、ウィンド、ニー、 （Ｗｉ
ｎｄ、Ａ、）、り一フェルド、ジエイ、エフ、 （Ｒｅ
ｈｆｅｌｄ、Ｊ、Ｆ、）とマーカー、グー。ニー、（Ｍ
ａｒｃｋｅｒ、に、Ａ、） 、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。
ｎｄ、Ａ、）、り一フェルド、ジエイ、エフ、 （Ｒｅ
ｈｆｅｌｄ、Ｊ、Ｆ、）とマーカー、グー。ニー、（Ｍ
ａｒｃｋｅｒ、に、Ａ、） 、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。
＾ｃａｄ、ｓｃｉ、ＵｓＡ ８０． （１９８３）、
２８６６−２８６９） 、ヒトプロインシュリンｃＤＮ
Ａを調製用尿素−ポリアクリルアミドゲル精製した後、
第二のストランドを、ＤＮＡポリメラーゼ大分画と２．
ストランドプライマーとしてｄ （ＣＡＧＡＴＣＡＣＴ
ＧＴＣＣ）を用いてこのテンプレート上で合成する。Ｓ
ｌヌクレアーゼ消化後、ヒトプロインシュリンｄｓ、ｃ
ＤＮＡをボ！Ｊアクリルアミドゲル電気泳動により精製
し、末端にターミナルトランスフェラーゼを付け、大腸
菌においてｐＢＲ３２７（ソルベロンら（Ｓｏｒｂｅｒ
ｏｎ ｅｔ。
２８６６−２８６９） 、ヒトプロインシュリンｃＤＮ
Ａを調製用尿素−ポリアクリルアミドゲル精製した後、
第二のストランドを、ＤＮＡポリメラーゼ大分画と２．
ストランドプライマーとしてｄ （ＣＡＧＡＴＣＡＣＴ
ＧＴＣＣ）を用いてこのテンプレート上で合成する。Ｓ
ｌヌクレアーゼ消化後、ヒトプロインシュリンｄｓ、ｃ
ＤＮＡをボ！Ｊアクリルアミドゲル電気泳動により精製
し、末端にターミナルトランスフェラーゼを付け、大腸
菌においてｐＢＲ３２７（ソルベロンら（Ｓｏｒｂｅｒ
ｏｎ ｅｔ。
ａｌ） 、Ｇｅｎｅ ９、（１９８０）、２８７−３
０５ ）のＰｓｔ１部位でクローンする。このプラスミ
ドを有する正しいクローンを、制限エンドヌクレアーゼ
分析により組換え体から同定し、ヌクレオチド配列決定
により同定する〔マキサム、ニー、 （Ｍａｙａｍ、Ａ
、）とギルバート、ダブリュ、 （Ｇｉｌｂｅｒｔ、
Ｗ、）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、
６５ （１９８０） 、４９９−５６０．サンガー、
エフ、（Ｓａｎｇｅｒ、Ｆ、）、ニクレン、ニス、（Ｎ
ｉｃｋｌｅｎ、Ｓ、）とカウルソン、ニー、アール、（
Ｃｏｕｌｓｏｎ＋Ａ、Ｒ，）、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａ
ｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、 ７４ （１９７７） 、
５４６３−５４６７） 。
０５ ）のＰｓｔ１部位でクローンする。このプラスミ
ドを有する正しいクローンを、制限エンドヌクレアーゼ
分析により組換え体から同定し、ヌクレオチド配列決定
により同定する〔マキサム、ニー、 （Ｍａｙａｍ、Ａ
、）とギルバート、ダブリュ、 （Ｇｉｌｂｅｒｔ、
Ｗ、）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、
６５ （１９８０） 、４９９−５６０．サンガー、
エフ、（Ｓａｎｇｅｒ、Ｆ、）、ニクレン、ニス、（Ｎ
ｉｃｋｌｅｎ、Ｓ、）とカウルソン、ニー、アール、（
Ｃｏｕｌｓｏｎ＋Ａ、Ｒ，）、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａ
ｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、 ７４ （１９７７） 、
５４６３−５４６７） 。
ヒトプロインシュリンｃＤＮＡクローンの単離のために
使用される１、ストランドプライマーと２゜ストランド
プライマーは、ポリスチレン支持体上でホホトリエステ
ルアプローチを用いて半自動的カラム合成により合成さ
れる〔エイチ、イト−（Ｈ，Ｉｔｏ） 、ワイ、イケ（
Ｙ、Ｉｋｅ） 、ニス、イカタ（Ｓ、Ｉｋａｔａ） 、
とケイ、イタクラ（Ｋ、 Ｉｔａｋｕｒａ）、Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ １０、（１９
８２）、１７５５−７６９） 。
使用される１、ストランドプライマーと２゜ストランド
プライマーは、ポリスチレン支持体上でホホトリエステ
ルアプローチを用いて半自動的カラム合成により合成さ
れる〔エイチ、イト−（Ｈ，Ｉｔｏ） 、ワイ、イケ（
Ｙ、Ｉｋｅ） 、ニス、イカタ（Ｓ、Ｉｋａｔａ） 、
とケイ、イタクラ（Ｋ、 Ｉｔａｋｕｒａ）、Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ １０、（１９
８２）、１７５５−７６９） 。
２、 ８− Ｘ −Ｙ −Ａをコードする遺伝子の調製
４つのインシュリン前駆体Ｂ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａ。
４つのインシュリン前駆体Ｂ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａ。
Ｂ −Ｌｙｓ −Ａｒｇ −Ａ、 Ｂ −Ａｒｇ −Ｌ
ｙｓ −ＡおよびＢ −Ａｒｇ −Ａｒｇ −Ａをコー
ドする遺伝子は、線状ヒトプロインシュリン配列Ｂ−Ｃ
−Ａをコードする断片を環状の−重らせんＭ−１３バク
チリオフアジベクターに挿入し、ヒトプロインシュリン
配列をそれぞれ化学的に合成された３０量体欠失プライ
マーＫＦＮ ４１、ＫＦＮ ４、ＫＦＮ ４２およびＫ
ＦＮ １Ｂと“万能（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ）’ １５量
体Ｍ１３ジデオモシ配列ブライマーで部位特異的突然変
異〔ケイ、フリユら、Ｎｕｃｌ、八ｃｉｄｓ、Ｒｅｓ、
、旦（１９８３） 、５１０３−５１１２）すること
により作られる。二重らせん制限分画（Ｘｂａｌ−ｔ！
ｃｏｒ １ ）を部分的二重らせん環状ＤＮＡで切り離
し、ＰＵＣ１３またはｐＴ５へ連結する。大腸菌の形質
転換および再形質転換により、所望の遺伝子を含むプラ
スミドを有する形質転換体が同定される。
ｙｓ −ＡおよびＢ −Ａｒｇ −Ａｒｇ −Ａをコー
ドする遺伝子は、線状ヒトプロインシュリン配列Ｂ−Ｃ
−Ａをコードする断片を環状の−重らせんＭ−１３バク
チリオフアジベクターに挿入し、ヒトプロインシュリン
配列をそれぞれ化学的に合成された３０量体欠失プライ
マーＫＦＮ ４１、ＫＦＮ ４、ＫＦＮ ４２およびＫ
ＦＮ １Ｂと“万能（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ）’ １５量
体Ｍ１３ジデオモシ配列ブライマーで部位特異的突然変
異〔ケイ、フリユら、Ｎｕｃｌ、八ｃｉｄｓ、Ｒｅｓ、
、旦（１９８３） 、５１０３−５１１２）すること
により作られる。二重らせん制限分画（Ｘｂａｌ−ｔ！
ｃｏｒ １ ）を部分的二重らせん環状ＤＮＡで切り離
し、ＰＵＣ１３またはｐＴ５へ連結する。大腸菌の形質
転換および再形質転換により、所望の遺伝子を含むプラ
スミドを有する形質転換体が同定される。
４つの突然変異欠失プライマーＫＦＮ ４、ＫＦＮ １
Ｂ、ＫＦＮ ４１およびにＰＮ ４２は、自動ＤＮＡ合
成機〔アプライド バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）３８０Ａ型）にて、ホスホロ
アミダイト化学と市販の試薬を用いて合成される〔ニス
、エル、ビューケージ（Ｓ、Ｌ、Ｂｅａｕｃａｇｅ）と
エム、エイチ、カルサース（Ｍ、Ｈ，Ｃａｒｕｔｈｅｒ
ｓ）（１９８１） Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ
ｅｒｓ ２２．１８５９−１８６９）。変性状態下にポ
リアクリルアミドゲル電気泳動によりオリゴヌクレオチ
ドを精製する。４つの切火プライマーは次のようである
：以下余白 ＫＦＮ 配 列 ４ ＴＣＣＡＣＡＡＴＧＣＣＴＣＴＣＴＴＡＧＴＣＴ
ＴＧＧＧＴＧＴＧ１８ ＴＣＣＡＣＡＡＴＧＣＣＴＣ
ＴＴＣＴＧＧＴＣＴＴＧＧＧＴＧＴＧ４１ ＴＣＣＡ
ＣＡＡＴＧＣＣＣＴＴＣＴＴＧＧＴＣＴＴＧＧＧＴＧＴ
Ｇ４２ ＴＣＣＡＣ＾＾ＴＧＣＣＣＴＴＴＣＴＧＧＴ
ＣＴＴＧＧＧＴＧＴＧ３、プラスミド構築 ヒトインシュリン前駆体をコードする遺伝子を、ＴＰＩ
プロモーター（ＴＰＩｐ） （ティ、アルバー、（Ｔ。
Ｂ、ＫＦＮ ４１およびにＰＮ ４２は、自動ＤＮＡ合
成機〔アプライド バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）３８０Ａ型）にて、ホスホロ
アミダイト化学と市販の試薬を用いて合成される〔ニス
、エル、ビューケージ（Ｓ、Ｌ、Ｂｅａｕｃａｇｅ）と
エム、エイチ、カルサース（Ｍ、Ｈ，Ｃａｒｕｔｈｅｒ
ｓ）（１９８１） Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ
ｅｒｓ ２２．１８５９−１８６９）。変性状態下にポ
リアクリルアミドゲル電気泳動によりオリゴヌクレオチ
ドを精製する。４つの切火プライマーは次のようである
：以下余白 ＫＦＮ 配 列 ４ ＴＣＣＡＣＡＡＴＧＣＣＴＣＴＣＴＴＡＧＴＣＴ
ＴＧＧＧＴＧＴＧ１８ ＴＣＣＡＣＡＡＴＧＣＣＴＣ
ＴＴＣＴＧＧＴＣＴＴＧＧＧＴＧＴＧ４１ ＴＣＣＡ
ＣＡＡＴＧＣＣＣＴＴＣＴＴＧＧＴＣＴＴＧＧＧＴＧＴ
Ｇ４２ ＴＣＣＡＣ＾＾ＴＧＣＣＣＴＴＴＣＴＧＧＴ
ＣＴＴＧＧＧＴＧＴＧ３、プラスミド構築 ヒトインシュリン前駆体をコードする遺伝子を、ＴＰＩ
プロモーター（ＴＰＩｐ） （ティ、アルバー、（Ｔ。
Ａ ｌ ｂｅｒ）とシイ、カワサキ（Ｇ、Ｋａｗａｓａ
ｋｉ）ＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅＳｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ
ｔｈｅ Ｔｒｉｏｓｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｒｓｏｔ
ｍｅｒａｓｅＧｅｎｅ ｏｆ ５ａｃｃｈａｒｏ＋ｎｙ
ｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、 Ｊ、Ｍｏｌ。
ｋｉ）ＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅＳｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ
ｔｈｅ Ｔｒｉｏｓｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｒｓｏｔ
ｍｅｒａｓｅＧｅｎｅ ｏｆ ５ａｃｃｈａｒｏ＋ｎｙ
ｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、 Ｊ、Ｍｏｌ。
Ａｐｐｌｉｅｄ Ｇｅｎｅｔ、 １ （１９Ｂ２） ４
１９−４３４） 、ＭＦα１リーダー配列〔ジェイ、ク
ルシャン（Ｊ、Ｋｕｒｊａｎ〕とアイ。
１９−４３４） 、ＭＦα１リーダー配列〔ジェイ、ク
ルシャン（Ｊ、Ｋｕｒｊａｎ〕とアイ。
ヘルスコウイッツ（１、Ｈｅｒｓｋｏｗｉ ｔｚ）、５
ｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆａ Ｙｅａｓｔ Ｐｈｅｒｏｎ
＋ｏｎｅ Ｇｅｎｅ （ＭＦα）：Ａ Ｐｕｔａｔｉｖ
ｅα−Ｆａｃｔｏｒ Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ Ｃｏｎ
ｔａｉｎｓ ｆｏｕｒ ＴａｎｄｅｍＣｏｐｉｅｓ
ｏｆ Ｍａｔｕｒｅ α−Ｆａｃｆｏｒ、Ｃｅ１ｌ
３０ （１９８２）９３３−９４３）および酵母菌（
Ｓ、 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＴＰ■からの転写ター
ミネータ配列ＴＰＩｔをコードする断片と組合わせる。
ｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆａ Ｙｅａｓｔ Ｐｈｅｒｏｎ
＋ｏｎｅ Ｇｅｎｅ （ＭＦα）：Ａ Ｐｕｔａｔｉｖ
ｅα−Ｆａｃｔｏｒ Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ Ｃｏｎ
ｔａｉｎｓ ｆｏｕｒ ＴａｎｄｅｍＣｏｐｉｅｓ
ｏｆ Ｍａｔｕｒｅ α−Ｆａｃｆｏｒ、Ｃｅ１ｌ
３０ （１９８２）９３３−９４３）および酵母菌（
Ｓ、 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＴＰ■からの転写ター
ミネータ配列ＴＰＩｔをコードする断片と組合わせる。
これらの断片（ＴＰｂ）は、インシュリン前駆体をコー
ドする遺伝子を高い割合で転写することのできる配列を
もたらし、ならびにインシュリン前駆体を分泌経路へ局
在化させおよび増殖培地への実際的排出を行ないうる予
備配列をももたらす。
ドする遺伝子を高い割合で転写することのできる配列を
もたらし、ならびにインシュリン前駆体を分泌経路へ局
在化させおよび増殖培地への実際的排出を行ないうる予
備配列をももたらす。
発現プラスミドはさらに複製の酵母２μオリジン（ｏｒ
ｉｇｉｎ）と選択性マーカーＬＢＵ２とからなる。
ｉｇｉｎ）と選択性マーカーＬＢＵ２とからなる。
酵母におけるα−ファクターのインビボ成熟化の間、Ｌ
ｙｓ−Ａｒｇ−配列を識別するエンドペプチダーゼとＧ
ｌｕ−Ａｌａ残基を除去するアミノジペプチダーゼの逐
次作用により〔ジュラウス。ディ。
ｙｓ−Ａｒｇ−配列を識別するエンドペプチダーゼとＧ
ｌｕ−Ａｌａ残基を除去するアミノジペプチダーゼの逐
次作用により〔ジュラウス。ディ。
ら（Ｊｕｌｉｕｓ、Ｄ、ｅｔ ａｌ、）Ｃｅｌｌ ３２
（１９８３） ８３９−８５２）、α−ファクター前駆
体から肝αリーダーペプチドの最後（Ｃ−末端）の６つ
のアミノ酸（Ｌｙｓ＝Ａｒｇ −Ｇｌｕ −Ａｌａ −
Ｇｌｕ二Ａ ｌａ）を除去する。酵母アミノジペプチダ
ーゼの必要性を排除するために、肝α１リーダーのＣ−
末端Ｇｌｕ−Ａｌａ Ｇｌｕ−Ａｌａをコードする配
列をインビトロ突然変異を経て除去する。
（１９８３） ８３９−８５２）、α−ファクター前駆
体から肝αリーダーペプチドの最後（Ｃ−末端）の６つ
のアミノ酸（Ｌｙｓ＝Ａｒｇ −Ｇｌｕ −Ａｌａ −
Ｇｌｕ二Ａ ｌａ）を除去する。酵母アミノジペプチダ
ーゼの必要性を排除するために、肝α１リーダーのＣ−
末端Ｇｌｕ−Ａｌａ Ｇｌｕ−Ａｌａをコードする配
列をインビトロ突然変異を経て除去する。
好ましい構築において、変性された発現単位は安定で高
いコピー数の酵母プラスミドＣＰＯＴ （ＡＴＣＣＮｕ
３９６８５）へ移される。これは増殖培地中でグルコ
ースの存在下により簡単に選択することができる。プラ
スミドＣＰＯＴはベクター０１／１に基づくが、これは
最初のｐＢＲ３２２Ｂｇｌｌ−ＢａｍＨ１断片をｐｕｃ
１３からの同様なりｇｌｌ−Ｂａｍ旧断片で置換し続
いてＢａｍＨｌ−Ｓａｌｌ断片としてＳ、ｐｏｍｂｅ
ＴＰＩ遺伝子（ＰＯＴ）を挿入してＣＰＯＴとする。０
１／１はヨーロッパ特許出願第０１０３４０９八号に記
載のようにｐＪＯＢ ２４８ （ベソグスら（Ｂｅｇｇ
ｓ ｅｔ ａｌ） 、Ｎａｔｕｒｅ ２７５．１０４−
１０９（１９７８） ）から誘導される。
いコピー数の酵母プラスミドＣＰＯＴ （ＡＴＣＣＮｕ
３９６８５）へ移される。これは増殖培地中でグルコ
ースの存在下により簡単に選択することができる。プラ
スミドＣＰＯＴはベクター０１／１に基づくが、これは
最初のｐＢＲ３２２Ｂｇｌｌ−ＢａｍＨ１断片をｐｕｃ
１３からの同様なりｇｌｌ−Ｂａｍ旧断片で置換し続
いてＢａｍＨｌ−Ｓａｌｌ断片としてＳ、ｐｏｍｂｅ
ＴＰＩ遺伝子（ＰＯＴ）を挿入してＣＰＯＴとする。０
１／１はヨーロッパ特許出願第０１０３４０９八号に記
載のようにｐＪＯＢ ２４８ （ベソグスら（Ｂｅｇｇ
ｓ ｅｔ ａｌ） 、Ｎａｔｕｒｅ ２７５．１０４−
１０９（１９７８） ）から誘導される。
４、形質転換
上記のように調製したプラスミドは、グルコース増殖を
選択することによりＴＰＩ遺伝子に欠失を有する酵母（
Ｓ、ｃｅｒｅｖｓｉａｅ）株へ形質転換される。
選択することによりＴＰＩ遺伝子に欠失を有する酵母（
Ｓ、ｃｅｒｅｖｓｉａｅ）株へ形質転換される。
このような株は、通常、単一の炭素源としてのグルコー
ス増殖に不安定でありガラクトース乳酸培地で非常にゆ
っくり増殖する。この欠陥はトリオースリン酸イソメラ
ーゼ遺伝子における突然変異によるもので、この遺伝子
の大部分を欠失させ酵母（Ｓ、ｃｅｒｅｖ＠ｉａ、ｅ）
ＬＥＵ２遺伝子で再置換させることにより得られうる。
ス増殖に不安定でありガラクトース乳酸培地で非常にゆ
っくり増殖する。この欠陥はトリオースリン酸イソメラ
ーゼ遺伝子における突然変異によるもので、この遺伝子
の大部分を欠失させ酵母（Ｓ、ｃｅｒｅｖ＠ｉａ、ｅ）
ＬＥＵ２遺伝子で再置換させることにより得られうる。
増殖欠失のために、ＴＰＩをコードする遺伝子を含むプ
ラスミドに対し強い選択性がある。
ラスミドに対し強い選択性がある。
５、酵母におけるインシュリン前駆体の発現具なったイ
ンシュリン前駆体をコードするプラスミドを含む酵母株
をＹＤＤ培地〔ジャーマン。
ンシュリン前駆体をコードするプラスミドを含む酵母株
をＹＤＤ培地〔ジャーマン。
エフ、ら（Ｓｈｅｒｍａｎ、Ｆ、ｅｔ ａｌ） 、Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ ｉｎ ＹｅａｓｔＧｅｎｅｔｉｃｓ、コー
ルドスプリングハーバーラボラトリイ（Ｃｏｌｄ Ｓｐ
ｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）１９
８１）で増殖する。それぞれの株に対し、２１のパンフ
ルフラスコ中のそれぞれ１１の２つの培地を、６００ｎ
−〇〇Ｄが約１５に達する（約４８時間）まで３０℃で
振とうする。遠心分離後、上清を別の分析のために除去
する。免疫反応性インシュリン（ＩＲＩ）を、構築物１
−６に対する標準物として半合成ヒトインシュリン（ノ
ボインダストリイ社Ｎ０ＶＯＩｎｄｕｓｔｒｉ Ａ／Ｃ
））を用いてラジオイムノアッセイ 〔ヘディング、エ
ル、 （Ｈｅｄｉｎｇ、Ｌ、）Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉ
ａ ８ （１９７２）、２６０−２６６ ）により測定
する。半合成ヒトインシュリンまたは当該インシュリン
前駆体を構築物７−１０として用いる。インシュリン前
駆体、Ｂ −Ａｒｇ −Ａｒｇ −Ｃ−ペプチド−Ｌｙ
ｓ−Ａｒｇ−Ａ （ヒトプロインシュリン）に対し、免
疫反応性Ｃ−ペプチド（ＩＲＣ）の発現レベルをヒトＣ
−ペプチドラジオイムノアッセイ（ヘディング、エル、
シイ、 Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ １１％（１９７
５） ５４１−５４８）を使用することにより測定する
。
ｔｈｏｄｓ ｉｎ ＹｅａｓｔＧｅｎｅｔｉｃｓ、コー
ルドスプリングハーバーラボラトリイ（Ｃｏｌｄ Ｓｐ
ｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）１９
８１）で増殖する。それぞれの株に対し、２１のパンフ
ルフラスコ中のそれぞれ１１の２つの培地を、６００ｎ
−〇〇Ｄが約１５に達する（約４８時間）まで３０℃で
振とうする。遠心分離後、上清を別の分析のために除去
する。免疫反応性インシュリン（ＩＲＩ）を、構築物１
−６に対する標準物として半合成ヒトインシュリン（ノ
ボインダストリイ社Ｎ０ＶＯＩｎｄｕｓｔｒｉ Ａ／Ｃ
））を用いてラジオイムノアッセイ 〔ヘディング、エ
ル、 （Ｈｅｄｉｎｇ、Ｌ、）Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉ
ａ ８ （１９７２）、２６０−２６６ ）により測定
する。半合成ヒトインシュリンまたは当該インシュリン
前駆体を構築物７−１０として用いる。インシュリン前
駆体、Ｂ −Ａｒｇ −Ａｒｇ −Ｃ−ペプチド−Ｌｙ
ｓ−Ａｒｇ−Ａ （ヒトプロインシュリン）に対し、免
疫反応性Ｃ−ペプチド（ＩＲＣ）の発現レベルをヒトＣ
−ペプチドラジオイムノアッセイ（ヘディング、エル、
シイ、 Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ １１％（１９７
５） ５４１−５４８）を使用することにより測定する
。
この分析において、鵞”Ｊ−Ｔｙｒ−ヒト−Ｃ−ペプチ
ドをトレーサーとして用い、ヒトＣ−ペプチドとヒトプ
ロインシュリンとに全く同じに反応するモルモットの抗
−ヒト−Ｃ−ペプチド血清、Ｍ１２２８ （ファーバー
、オー、ケイ、 （Ｆａｂｅｒ、Ｏ，に、）らＨｏｐｐ
ｅ ５ｅｙｌｅｒ’ｓＺ、Ｐｈｙｓｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、
３５７ （１９７６）７５１−７５７）を抗体として
用いる。ヒトプロインシュリンを標準物として用いる〔
クルーセ、ブイ、ら（Ｋｒｕｓｅ、Ｖ、 ｅｔ ａｌ、
）Ｄｉａｂｅｔｏ１ｇｉａ２７、（１９８４） ４１４
−４１５）、。形質転換酵母株の発酵液における免疫反
応性インシュリンと免疫反応性Ｃ−ペプチドの発現レベ
ルを１木にまとめる。
ドをトレーサーとして用い、ヒトＣ−ペプチドとヒトプ
ロインシュリンとに全く同じに反応するモルモットの抗
−ヒト−Ｃ−ペプチド血清、Ｍ１２２８ （ファーバー
、オー、ケイ、 （Ｆａｂｅｒ、Ｏ，に、）らＨｏｐｐ
ｅ ５ｅｙｌｅｒ’ｓＺ、Ｐｈｙｓｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、
３５７ （１９７６）７５１−７５７）を抗体として
用いる。ヒトプロインシュリンを標準物として用いる〔
クルーセ、ブイ、ら（Ｋｒｕｓｅ、Ｖ、 ｅｔ ａｌ、
）Ｄｉａｂｅｔｏ１ｇｉａ２７、（１９８４） ４１４
−４１５）、。形質転換酵母株の発酵液における免疫反
応性インシュリンと免疫反応性Ｃ−ペプチドの発現レベ
ルを１木にまとめる。
菌株酊５９３、ＭＴ ６１６、ＭＴ ６５５およびＭＴ
６６０は、ン、ドイツ日）にそれぞれ受託番号ＤＳＭ
３１９４、ＤＳＭ ３１９５、ＤＳＭ ３１９８およ
びＤＳＭ ３１９９をもって国際寄託された。
６６０は、ン、ドイツ日）にそれぞれ受託番号ＤＳＭ
３１９４、ＤＳＭ ３１９５、ＤＳＭ ３１９８およ
びＤＳＭ ３１９９をもって国際寄託された。
以下余白
表１から明らかなように、本発明による前駆体の発現レ
ベルとプロインシュリン型前駆体、すなわちＣ−ペプチ
ドまたは変性Ｃ−ペプチドの側方にある一対の二塩基性
アミノ酸を含む前駆体の発現レベルには顕著な差異があ
る。
ベルとプロインシュリン型前駆体、すなわちＣ−ペプチ
ドまたは変性Ｃ−ペプチドの側方にある一対の二塩基性
アミノ酸を含む前駆体の発現レベルには顕著な差異があ
る。
６、 インシュリン前駆体のヒトインシュリンへの転化
インシュリン前駆体のヒトインシュリンへの転化は、二
段階酵素法： により、または反応混合物中にトリプシンとカルボキシ
ペプチダーゼＢが同時に存在する組合わせ一段階法のい
ずれかにより行なわれる。
段階酵素法： により、または反応混合物中にトリプシンとカルボキシ
ペプチダーゼＢが同時に存在する組合わせ一段階法のい
ずれかにより行なわれる。
上記式中および以下の明細書中、酵素開裂法のより良き
説明のために、Ａ鎖およびＢ核間のジスルフィド橋は括
弧（“７ ”＞により示される。上記式中、にＸ−７ワ
１は一本鎖インシュリン前駆体である（図１）；［Ｔ７
７Ｔｌは、残基！１ｈ３２ｃＬ、ｙｓまたはＡ ｒｇ）
と残基階３３（Ａ Ｉ ＝ Ｇｌｙ）の間のペプチド結
合が加水分解された２本鎖インシュリン前駆体中間体で
ある；に−ワ１はヒトイアシ、す７７ある。Ｂ−Ｘ−Ｙ
−Ａ型の残りの式において、Ａ鎖とＢ鎖は天然インシュ
リンにおけるようにジスルフィド橋により接続されてい
るものである。
説明のために、Ａ鎖およびＢ核間のジスルフィド橋は括
弧（“７ ”＞により示される。上記式中、にＸ−７ワ
１は一本鎖インシュリン前駆体である（図１）；［Ｔ７
７Ｔｌは、残基！１ｈ３２ｃＬ、ｙｓまたはＡ ｒｇ）
と残基階３３（Ａ Ｉ ＝ Ｇｌｙ）の間のペプチド結
合が加水分解された２本鎖インシュリン前駆体中間体で
ある；に−ワ１はヒトイアシ、す７７ある。Ｂ−Ｘ−Ｙ
−Ａ型の残りの式において、Ａ鎖とＢ鎖は天然インシュ
リンにおけるようにジスルフィド橋により接続されてい
るものである。
酵素転化はインシュリン前駆体の水溶液中で行なわれる
。トリプシン型は本発明の実施のための物質ではない。
。トリプシン型は本発明の実施のための物質ではない。
トリプシンは、通常ウシおよびブタ膵臓から高純度で得
られる非常に特徴のある酵素である。トリプシン様特異
性を有する酵素、すなわちプラスミン、クロストリペイ
ンおよびアクロモバクターリチカス（Ａｃｈｒｏｍｏｂ
ａｃｔｅｒ １ｙｔｉｃｕｓ）プロテアーゼもまた使用
される。
られる非常に特徴のある酵素である。トリプシン様特異
性を有する酵素、すなわちプラスミン、クロストリペイ
ンおよびアクロモバクターリチカス（Ａｃｈｒｏｍｏｂ
ａｃｔｅｒ １ｙｔｉｃｕｓ）プロテアーゼもまた使用
される。
高い転化率を得るために、カルボキシペプチダーゼＡ活
性を含まない非常に高純度のカルボキシペプチダーゼＢ
を使用することが重要である。これは、市販されている
カルボキシペプチダーゼＢを、たとえばアフィニティク
ロマトグラフィーまたはイオン交換クロマトグラフィに
より精製することにより達成されうる。これに代わり、
カルボキシペプチダーゼＡ阻害剤たとえばε−アミノ−
ｎ−カプロン酸またはカルボベンゾキシグリシンを消化
混合物へ加えてもよい。
性を含まない非常に高純度のカルボキシペプチダーゼＢ
を使用することが重要である。これは、市販されている
カルボキシペプチダーゼＢを、たとえばアフィニティク
ロマトグラフィーまたはイオン交換クロマトグラフィに
より精製することにより達成されうる。これに代わり、
カルボキシペプチダーゼＡ阻害剤たとえばε−アミノ−
ｎ−カプロン酸またはカルボベンゾキシグリシンを消化
混合物へ加えてもよい。
一段階転化は、若干高めた温度（３５〜４０ｔ）で、ｐ
Ｈ７〜８にて行なうのが好ましい。トリプシンと７、ル
ポキシペプチダーゼＢの濃度は約５μｇ／ｍｌであり、
仁質濃度は約１■／ ｍ ｌであるのが好ましい。
Ｈ７〜８にて行なうのが好ましい。トリプシンと７、ル
ポキシペプチダーゼＢの濃度は約５μｇ／ｍｌであり、
仁質濃度は約１■／ ｍ ｌであるのが好ましい。
二段階転化法において、トリプシン消化は高ｐＨで行な
うのが好ましい。高ｐＨ（１１〜１２の範囲）′？：は
、インシュリン前駆体分子におけるリシンアミノ酸残基
（たとえば図１中Ｂ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−ＡにおけるＢ２
９−ＬｙｓとＢ５１−Ｌｙｓ）がほとんど非荷重（リシ
ン残基のｐｋａは約９．０）であり、トリプシンで残基
（ｐｋａ＝ １２ ）はまだ主として陽性に帯電してお
り、したがってトリプシン開裂を受けうる。
うのが好ましい。高ｐＨ（１１〜１２の範囲）′？：は
、インシュリン前駆体分子におけるリシンアミノ酸残基
（たとえば図１中Ｂ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−ＡにおけるＢ２
９−ＬｙｓとＢ５１−Ｌｙｓ）がほとんど非荷重（リシ
ン残基のｐｋａは約９．０）であり、トリプシンで残基
（ｐｋａ＝ １２ ）はまだ主として陽性に帯電してお
り、したがってトリプシン開裂を受けうる。
Ｂ２２−アルギニン残基での開裂は非常に遅い速度プシ
ン消化の間安定なｐＨ値は、 −Ｌｙｓ−Ａｒｇ −の
高収率に対し重要である。ｐＨを１１．８−１１．９に
安定化する目的で幾つかの異なった緩衝液系が試された
。通常高ｐＨ値で使用される緩衝液系ＨＰＯ４’−／ｐ
ｏ、−−がｐｔｎｉ、ｅで良好な緩衝能を有する。しか
しながら、この緩衝系は３つの主な欠点を有する。
ン消化の間安定なｐＨ値は、 −Ｌｙｓ−Ａｒｇ −の
高収率に対し重要である。ｐＨを１１．８−１１．９に
安定化する目的で幾つかの異なった緩衝液系が試された
。通常高ｐＨ値で使用される緩衝液系ＨＰＯ４’−／ｐ
ｏ、−−がｐｔｎｉ、ｅで良好な緩衝能を有する。しか
しながら、この緩衝系は３つの主な欠点を有する。
第一に、ＨＰＯａ’−／ ＰＯ４−−一溶液のｐＨは温
度変化に非常に敏感で、たとえば２５℃から４℃への変
化でｐＨ値が０．７ ｐＨ単位減るであろう。第二に、
Ｃａ−（これは゛トリプシンの安定化のために存在して
いる場合がある）が、Ｃａｓ （ＰＯａ”） ｚとＣａ
ＨＰＯ，の溶解度が比較ｆ、低いので沈でんするであろ
う。第三に、緩衝系ＨＰＯａ’−／ ＨｚＰＯ４−とＨ
，ＰＯ４−／Ｈ，ＰＯ４の作用のために瞬時に消化混合
物を酸性化する（反応を停止する）ことができない。そ
の結果、この系は、酸性化の間、一定期間中性ｐｉとな
り、この間にトリプシンがただちに不所望産物ｄｅｓ
（Ｂ３０）インシュリンを作ることになる。これらの欠
点の結果として、むしろ一般的でない緩衝系Ｈ，０１０
Ｈ−が使用プシン消化の最適条件は、［７７７＾■−１
約２０ｒＮＩ／ｍｊ？、トリプシン２００μｇ ／ｒｎ
ｌ ；緩衝液：３７．５ｍＭ ＮａＯＨ（この結果、２
５℃で測定されたｐＨは１１．８６であった）；温度約
４℃と培養期間約８０分である。ξ＝「π：７庁−１の
収率は９０．５％であった。
度変化に非常に敏感で、たとえば２５℃から４℃への変
化でｐＨ値が０．７ ｐＨ単位減るであろう。第二に、
Ｃａ−（これは゛トリプシンの安定化のために存在して
いる場合がある）が、Ｃａｓ （ＰＯａ”） ｚとＣａ
ＨＰＯ，の溶解度が比較ｆ、低いので沈でんするであろ
う。第三に、緩衝系ＨＰＯａ’−／ ＨｚＰＯ４−とＨ
，ＰＯ４−／Ｈ，ＰＯ４の作用のために瞬時に消化混合
物を酸性化する（反応を停止する）ことができない。そ
の結果、この系は、酸性化の間、一定期間中性ｐｉとな
り、この間にトリプシンがただちに不所望産物ｄｅｓ
（Ｂ３０）インシュリンを作ることになる。これらの欠
点の結果として、むしろ一般的でない緩衝系Ｈ，０１０
Ｈ−が使用プシン消化の最適条件は、［７７７＾■−１
約２０ｒＮＩ／ｍｊ？、トリプシン２００μｇ ／ｒｎ
ｌ ；緩衝液：３７．５ｍＭ ＮａＯＨ（この結果、２
５℃で測定されたｐＨは１１．８６であった）；温度約
４℃と培養期間約８０分である。ξ＝「π：７庁−１の
収率は９０．５％であった。
トリプシン転化産物１丁７７７−’ｌは、幾つかの一般
的方法、たとえば調製用ＨＰＬＣ１吸着クロマトグラフ
ィ、およびイオン交換クロマトグラフィにより精製され
る。ＦＴ７７７−１はほぼ定量的にに一ワ１（ヒトイン
シュリン）へカルボキシペプチダーゼＢの消化により転
化される。この転化ノ最適条件ハ、１７７Ｍ約５ ｍｇ
／ ｍ １、カルボキシペプチダーゼＢ約５μｇ ／
ｍ ｌ ；緩衝液：５０ｍＭ）リス ＨＯ２、ｐｌ＝
９．３、温度約３７℃および培養時間約３０分である
。収率はインシュリン前駆体ＦゴτＷのヒト インシュリンへの転化は、逆相高圧液体クロマトグラフ
ィ（ＨＰＬＣ）により定量的に追跡され、図８で示され
る。
的方法、たとえば調製用ＨＰＬＣ１吸着クロマトグラフ
ィ、およびイオン交換クロマトグラフィにより精製され
る。ＦＴ７７７−１はほぼ定量的にに一ワ１（ヒトイン
シュリン）へカルボキシペプチダーゼＢの消化により転
化される。この転化ノ最適条件ハ、１７７Ｍ約５ ｍｇ
／ ｍ １、カルボキシペプチダーゼＢ約５μｇ ／
ｍ ｌ ；緩衝液：５０ｍＭ）リス ＨＯ２、ｐｌ＝
９．３、温度約３７℃および培養時間約３０分である
。収率はインシュリン前駆体ＦゴτＷのヒト インシュリンへの転化は、逆相高圧液体クロマトグラフ
ィ（ＨＰＬＣ）により定量的に追跡され、図８で示され
る。
図８に関して、 −Ｌｙｓ −Ａｒｇ ＠ ５ Ｑ
ｍＭトリス−ＨＣｆ緩衝液ｐＨ＝９．３に５ ｍｇ
／ ｍ ＩＩの濃度に溶かし、３７℃にて５μｇ／ｍ１
カルボキシペプチダーゼＢ（ベーリンガーＢｏｅｈｒｉ
ｎｇｅｒ）で消化する。アリコートを消化混合物からｔ
＝ｏ（Ａ）、ｔ＝２分（Ｂ）、ｔ５分（Ｃ）およびｔ＝
３０分（Ｄ）で除去し、４ ＮＨｔＪでｐｕ＝ｉ、ｓに
酸性化し、平衡化した５μヌクレオシル（Ｎｕｃｌｅｏ
ｓｉｌ）ＯＲＰＣ−１８カラム（４Ｘ ２００ｍｍ）上
でＨＰＬＣにより分析し、３０℃で流速１ｍ１／分にて
３３ ｍＭ （ＮＨｎ）ｔｓＯｎ、１、５ ｍＭ Ｈｔ
ＳＯａ含有２９．４％（Ｖ／Ｖ）アセトニトリルで平均
に溶出する。２１４ｎｍでのＵＶ吸収によりペプチドを
検出する。３０分後に転化が完了し、エタノールを消化
混合物へ加えて６０％（ｖ ／ ｖ ）とする、シュリ
ヒトクルール、ジェイ、ら（Ｓｃｈｌｉｃｈｔｋｒｕｌ
ｌ、 Ｊ、 ｅｔ ａｌ、） （１９７４） Ｈｏｒｔ
ｍ、 Ｍｅｔａｂ。
ｍＭトリス−ＨＣｆ緩衝液ｐＨ＝９．３に５ ｍｇ
／ ｍ ＩＩの濃度に溶かし、３７℃にて５μｇ／ｍ１
カルボキシペプチダーゼＢ（ベーリンガーＢｏｅｈｒｉ
ｎｇｅｒ）で消化する。アリコートを消化混合物からｔ
＝ｏ（Ａ）、ｔ＝２分（Ｂ）、ｔ５分（Ｃ）およびｔ＝
３０分（Ｄ）で除去し、４ ＮＨｔＪでｐｕ＝ｉ、ｓに
酸性化し、平衡化した５μヌクレオシル（Ｎｕｃｌｅｏ
ｓｉｌ）ＯＲＰＣ−１８カラム（４Ｘ ２００ｍｍ）上
でＨＰＬＣにより分析し、３０℃で流速１ｍ１／分にて
３３ ｍＭ （ＮＨｎ）ｔｓＯｎ、１、５ ｍＭ Ｈｔ
ＳＯａ含有２９．４％（Ｖ／Ｖ）アセトニトリルで平均
に溶出する。２１４ｎｍでのＵＶ吸収によりペプチドを
検出する。３０分後に転化が完了し、エタノールを消化
混合物へ加えて６０％（ｖ ／ ｖ ）とする、シュリ
ヒトクルール、ジェイ、ら（Ｓｃｈｌｉｃｈｔｋｒｕｌ
ｌ、 Ｊ、 ｅｔ ａｌ、） （１９７４） Ｈｏｒｔ
ｍ、 Ｍｅｔａｂ。
Ｒｅｓ、 ５ｕｐｐ１．、５ｅｔ−５，ｐ１３４−１４
３に記載されているようにＱＡＥ−セファデックス（Ｓ
ｅｐｈａｄｅｘ） ”カラム上で陰イオン交換クロマト
グラフィにより精製する。Ｂ：Ｂ鎖、Ａ：Ａ鎖、 Ｋ
： Ｌｙｓ、 Ｒ： Ａｒｇｍ図８から、トリプシン消
化物にＬｙｓｍからの産物は、カルボキシペプチダーゼ
Ｂを用いた消化によりほとんど定量的にｙへ転化される
。
３に記載されているようにＱＡＥ−セファデックス（Ｓ
ｅｐｈａｄｅｘ） ”カラム上で陰イオン交換クロマト
グラフィにより精製する。Ｂ：Ｂ鎖、Ａ：Ａ鎖、 Ｋ
： Ｌｙｓ、 Ｒ： Ａｒｇｍ図８から、トリプシン消
化物にＬｙｓｍからの産物は、カルボキシペプチダーゼ
Ｂを用いた消化によりほとんど定量的にｙへ転化される
。
インシュリン前駆体のヒトインシュリンへの転化は例１
ｏ 、 ｉｉ 、および２０に示され、例１３ではヒト
インシュリンの特性決定が示される。
ｏ 、 ｉｉ 、および２０に示され、例１３ではヒト
インシュリンの特性決定が示される。
（４）（実施例）
例１ ： Ｂ −Ｌｙｓ −Ａｒｇ −Ａの発現のため
の酵母プラスミドｐ）ＩＴ ５８５の構築 ｐＭ７３４２からの４．３ ｋｂ ＥｃｏＲＶ−Ｘｂａ
ｌと３．３ｋｂＢｃｏＲ１−ＥｃｏＲＶ断片をｐＭ ２
１５の０．６ ｋｂ ＥｃｏＲｌ−Ｘｂａｌ断片と連結
する。プラスミドｐＭＴ ３４２は、挿入されたＴＰＩ
ｐ−肝αｌリーダーＢＣＡ−ＴＰ１．−配列を有する酵
母ベクターｐＭ７２１２である。ｐＭＴ ３４２とｐＭ
Ｔ２１２ノ構築は、ヨーロッパ特許出願１１ｈＯ０６８
７０１Ａ号に記載されている。プラスミドｐＭ ２１５
は、プロインシュリンコード配列Ｂ−Ｃ−Ａを含むＥｃ
ｏＲｌ−Ｘｂａｌ断片をｐ２８５（ＡＴＣＣＮｌ ２０
６８１）からｐＵｃ１３ （ヴイエイラら（Ｖｉｅｉ
ｒａ ｅｔ ａｌ、）、Ｇｅｎｅ １９ ：２５９−２
６８（１９８２）によりｐｕｃｓとｐ［Ｉｃ９について
記載されているように構築される〕ヘサブクローンし、
続いてＭＦα１リーダーとプロインシュリンＢ−Ｃ−Ａ
との接続位置にあるＧｌｕ −Ａｌａ −Ｇｌｕ −Ａ
ｌａをコードする１２個の塩基をインビトロでループか
ら外すことにより構築される。Ｐ２Ｓ５は挿入ＴＰＩｐ
−ＭＦα１リーダー Ｂ−ＣＡ ＴＰＩｔを含み、酵
母株Ｚ３３（ＡＴＣＣＮ１２０６８１）に付着させる。
の酵母プラスミドｐ）ＩＴ ５８５の構築 ｐＭ７３４２からの４．３ ｋｂ ＥｃｏＲＶ−Ｘｂａ
ｌと３．３ｋｂＢｃｏＲ１−ＥｃｏＲＶ断片をｐＭ ２
１５の０．６ ｋｂ ＥｃｏＲｌ−Ｘｂａｌ断片と連結
する。プラスミドｐＭＴ ３４２は、挿入されたＴＰＩ
ｐ−肝αｌリーダーＢＣＡ−ＴＰ１．−配列を有する酵
母ベクターｐＭ７２１２である。ｐＭＴ ３４２とｐＭ
Ｔ２１２ノ構築は、ヨーロッパ特許出願１１ｈＯ０６８
７０１Ａ号に記載されている。プラスミドｐＭ ２１５
は、プロインシュリンコード配列Ｂ−Ｃ−Ａを含むＥｃ
ｏＲｌ−Ｘｂａｌ断片をｐ２８５（ＡＴＣＣＮｌ ２０
６８１）からｐＵｃ１３ （ヴイエイラら（Ｖｉｅｉ
ｒａ ｅｔ ａｌ、）、Ｇｅｎｅ １９ ：２５９−２
６８（１９８２）によりｐｕｃｓとｐ［Ｉｃ９について
記載されているように構築される〕ヘサブクローンし、
続いてＭＦα１リーダーとプロインシュリンＢ−Ｃ−Ａ
との接続位置にあるＧｌｕ −Ａｌａ −Ｇｌｕ −Ａ
ｌａをコードする１２個の塩基をインビトロでループか
ら外すことにより構築される。Ｐ２Ｓ５は挿入ＴＰＩｐ
−ＭＦα１リーダー Ｂ−ＣＡ ＴＰＩｔを含み、酵
母株Ｚ３３（ＡＴＣＣＮ１２０６８１）に付着させる。
その構築は米国特許出願第５４７．７４８号（１９８３
年１１月１日）に記載されている。
年１１月１日）に記載されている。
ｐＭＴ ３４２とｐＭ ２１５からの上記断片の連結に
より、挿入ＭＦαｌリーダー（Ｇｌｕ −Ａｌａ −Ｇ
ｌｕ −Ａｌａが除かれている）−Ｂ−Ｃ−Ａを有する
プラスミドｐＭ７４６２が得られる。Ｂ−Ｃ−Ａをコー
ドする断片をＢ −Ｌｙｓ −Ａｒｇ −Ａをコードす
る断片へ転化するために、変形した部位特異的突然変異
法（ケイ、ノリスら、前出）を用いる。ＭＦα１リーダ
ー−（Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａが除かれている
）−Ｂ−Ｃ−ＡをコードするｐＭＴ ４６２からの０．
６ｋｂｆ！ｃｏＲ１−Ｘｂａｌ断片を、Ｘｂａｌ−Ｅｃ
ｏＲｌで切断したファージＭ １３＋ｗｐｌＯＲＦ （
メシング、ジェイ、 （Ｍｅｓｓｉｎｇ、 Ｊ、）とヴ
イエリア、ジェイ、 （Ｖｉｅｒｉａ、 Ｊ、） （１
９８３）未公開の結果〕ＤＮＡへ挿入する。上記Ｅｃｏ
Ｒ１−Ｘｂａｌ挿入部を含む−重らせんＭ１３ファージ
を、３０量体′欠失ブライマーＫＦＮ４と“万能″１５
量体Ｍ１３ブライマーｄ （ＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡ
ＣＧＴ） にューイングランドバイオラボズＮｅｗ Ｅ
ｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）とともに培養し、９０
℃で５分間加熱し、室温までゆっくり冷却し、アニーリ
ングさせる。次いで部分的二重らせんＤＮＡをｄ−ＮＴ
Ｐ−ミックス、タレノウポリメラーゼとＴ４リガーゼを
加えることにより作る。フェノールで抽出し、エタノー
ルで沈でんおよび再懸濁後に、制限酵素Ａｐａｌ ＝
Ｘｂａｌ ＊およびＥｃｏＲ１でＤＮＡを切断する。別
にフェノールで抽出し、エタノールで沈でんおよび再懸
濁後に、ＤＮＡをＥｃｏＲｌ−Ｘｂａｌ切断ｐｕｃ １
３に連結する。連結混合物を大腸菌（ｒ−ｍ” ）株へ
形質転換し、幾つかの形質転換体からプラスミドを調製
する。プラスミド調製物をＢｃｏＲｌ とＸｂａｌで切
断し、０．５ｋｂと０．６ｋｂの両方でバンドを示すこ
れら調製物を大腸菌へ再度形質転換する。再形質転換体
から０．５ｋｂ挿入部を有するＩ）ＵＣ１３のみを有す
る形質転換体を選択する。このプラスミドｐＭＴ ５７
９のＥｃｏＲｌ−Ｘｂａｌ挿入部の配列は、マキサム−
ギルバート法により肝α１リーダー−（Ｇｌｕ−Ａｌａ
−Ｇｌｕ−Ａｌａが除かれている） −Ｂ−Ｌｙｓ−Ａ
ｒｇ−Ａをコードすることが確認された。９Ｍ７５７９
の構築を図２に示す、 ｐＭＴ ５７９からのＸｂａｌ
−ＢｃｏＲ１挿入部は、９Ｍ７５７９の０．５ ｋｂ
Ｘｂａｌ−ＥｃｏＲ１断片をｐＴ５の５．５ｋｂＸｂａ
ｌ−ＥｃｏＲ１断片と連結することによりＴＰＩプロモ
ーターとＴＰＩターミネータ−を備えている。
より、挿入ＭＦαｌリーダー（Ｇｌｕ −Ａｌａ −Ｇ
ｌｕ −Ａｌａが除かれている）−Ｂ−Ｃ−Ａを有する
プラスミドｐＭ７４６２が得られる。Ｂ−Ｃ−Ａをコー
ドする断片をＢ −Ｌｙｓ −Ａｒｇ −Ａをコードす
る断片へ転化するために、変形した部位特異的突然変異
法（ケイ、ノリスら、前出）を用いる。ＭＦα１リーダ
ー−（Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａが除かれている
）−Ｂ−Ｃ−ＡをコードするｐＭＴ ４６２からの０．
６ｋｂｆ！ｃｏＲ１−Ｘｂａｌ断片を、Ｘｂａｌ−Ｅｃ
ｏＲｌで切断したファージＭ １３＋ｗｐｌＯＲＦ （
メシング、ジェイ、 （Ｍｅｓｓｉｎｇ、 Ｊ、）とヴ
イエリア、ジェイ、 （Ｖｉｅｒｉａ、 Ｊ、） （１
９８３）未公開の結果〕ＤＮＡへ挿入する。上記Ｅｃｏ
Ｒ１−Ｘｂａｌ挿入部を含む−重らせんＭ１３ファージ
を、３０量体′欠失ブライマーＫＦＮ４と“万能″１５
量体Ｍ１３ブライマーｄ （ＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡ
ＣＧＴ） にューイングランドバイオラボズＮｅｗ Ｅ
ｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）とともに培養し、９０
℃で５分間加熱し、室温までゆっくり冷却し、アニーリ
ングさせる。次いで部分的二重らせんＤＮＡをｄ−ＮＴ
Ｐ−ミックス、タレノウポリメラーゼとＴ４リガーゼを
加えることにより作る。フェノールで抽出し、エタノー
ルで沈でんおよび再懸濁後に、制限酵素Ａｐａｌ ＝
Ｘｂａｌ ＊およびＥｃｏＲ１でＤＮＡを切断する。別
にフェノールで抽出し、エタノールで沈でんおよび再懸
濁後に、ＤＮＡをＥｃｏＲｌ−Ｘｂａｌ切断ｐｕｃ １
３に連結する。連結混合物を大腸菌（ｒ−ｍ” ）株へ
形質転換し、幾つかの形質転換体からプラスミドを調製
する。プラスミド調製物をＢｃｏＲｌ とＸｂａｌで切
断し、０．５ｋｂと０．６ｋｂの両方でバンドを示すこ
れら調製物を大腸菌へ再度形質転換する。再形質転換体
から０．５ｋｂ挿入部を有するＩ）ＵＣ１３のみを有す
る形質転換体を選択する。このプラスミドｐＭＴ ５７
９のＥｃｏＲｌ−Ｘｂａｌ挿入部の配列は、マキサム−
ギルバート法により肝α１リーダー−（Ｇｌｕ−Ａｌａ
−Ｇｌｕ−Ａｌａが除かれている） −Ｂ−Ｌｙｓ−Ａ
ｒｇ−Ａをコードすることが確認された。９Ｍ７５７９
の構築を図２に示す、 ｐＭＴ ５７９からのＸｂａｌ
−ＢｃｏＲ１挿入部は、９Ｍ７５７９の０．５ ｋｂ
Ｘｂａｌ−ＥｃｏＲ１断片をｐＴ５の５．５ｋｂＸｂａ
ｌ−ＥｃｏＲ１断片と連結することによりＴＰＩプロモ
ーターとＴＰＩターミネータ−を備えている。
挿入部ＴＰＩｐ−肝α１リーダー−Ｂ Ｃ−Ａ−ＴＰ
Ｉｔを有するｐＴ５の構築を図３に示す。得られた挿入
部ＴＰＩｐ−ＭＦ ａ １リーダー （Ｇｌｕ−Ａｌａ
−Ｇｌｕ −Ａｌａが除かれる） −Ｂ −Ｌｙｓ −
Ａｒｇ −Ａ −ＴＰｂを含むプラスミドｐＭＴ ５８
３を、次いでＢａ５Ｈ１と部分的に５ｐｈｌで切断し、
ＢａｍＨｌと５ｐｈｌで切断したＣＰＯＴに２．１ｋｂ
断片を挿入する。得られたプラスミドｐＭＴ ５８５は
酵母の形質転換に用いられる。９Ｍ７５８３と９Ｍ７５
８５の構築を図３に示す。
Ｉｔを有するｐＴ５の構築を図３に示す。得られた挿入
部ＴＰＩｐ−ＭＦ ａ １リーダー （Ｇｌｕ−Ａｌａ
−Ｇｌｕ −Ａｌａが除かれる） −Ｂ −Ｌｙｓ −
Ａｒｇ −Ａ −ＴＰｂを含むプラスミドｐＭＴ ５８
３を、次いでＢａ５Ｈ１と部分的に５ｐｈｌで切断し、
ＢａｍＨｌと５ｐｈｌで切断したＣＰＯＴに２．１ｋｂ
断片を挿入する。得られたプラスミドｐＭＴ ５８５は
酵母の形質転換に用いられる。９Ｍ７５８３と９Ｍ７５
８５の構築を図３に示す。
例２ ： Ｂ −Ａｒｇ −Ａｒｇ −Ａ発現のための
酵母プラスミドｐＭ７６１１の構築 ｐＭＴ ４６２からのＢ−Ｃ−Ａコード断片（例１参照
）を、例１に記載した方法と同じ方法により、図５に示
すように、３０量体欠失プライマーＫＦＮ１８と“万能
”１５量体Ｍ１３プライマーの混合物を用いた部位特異
的突然変異によりＢ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａへ転化する。
酵母プラスミドｐＭ７６１１の構築 ｐＭＴ ４６２からのＢ−Ｃ−Ａコード断片（例１参照
）を、例１に記載した方法と同じ方法により、図５に示
すように、３０量体欠失プライマーＫＦＮ１８と“万能
”１５量体Ｍ１３プライマーの混合物を用いた部位特異
的突然変異によりＢ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａへ転化する。
プラスミドｐＭＴ ５９９のＥｃｏＲｌ−Ｘｂａｌ挿入
部の配列は、マクサム−ギルバート法により、肝α１リ
ーダー （Ｇｌｕ −Ａｌａ −Ｇｌｕ −Ａｌａが除
゛かれる） −Ｂ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａをコー
ドすることが確認された。ｐＭＴ ５９９からのＸｂａ
ｌ−ＥｃｏＲ１挿入部は、ｐＭＴ ５９９の０．５ ｋ
ｂ Ｘｂａｌ−［！ｃｏＲ１断片とｐＴ５の５、５ ｋ
ｂ Ｘｂａｌ−ＥｃｏＲ１断片を連結することによりＴ
ＰＩプロモーターとＴＰＩターミネータ−を有する。挿
入部ＴＰＩｐ−ＭＦ α１リーダー−（Ｇｌｕ−Ａｌａ
−Ｇｌｕ−Ａｌａが除かれる） −Ｂ −Ａｒｇ −Ａ
ｒｇ−Ａ−ＴＰｌアを含む得られたプラスミドｐＭ７６
０２をＢａｍＨｌと部分的に５ｐｈｌで切断し、２．１
ｋｂ断片をＢａ５ａｌと５ｐｈｌで切断したＣＰＯＴに
挿入する。得られたプラスミドｐＭ７６１１が酵母の形
質転換のために用いられる。プラスミドｐＭＴ ６１１
の構築を図５に示す。
部の配列は、マクサム−ギルバート法により、肝α１リ
ーダー （Ｇｌｕ −Ａｌａ −Ｇｌｕ −Ａｌａが除
゛かれる） −Ｂ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａをコー
ドすることが確認された。ｐＭＴ ５９９からのＸｂａ
ｌ−ＥｃｏＲ１挿入部は、ｐＭＴ ５９９の０．５ ｋ
ｂ Ｘｂａｌ−［！ｃｏＲ１断片とｐＴ５の５、５ ｋ
ｂ Ｘｂａｌ−ＥｃｏＲ１断片を連結することによりＴ
ＰＩプロモーターとＴＰＩターミネータ−を有する。挿
入部ＴＰＩｐ−ＭＦ α１リーダー−（Ｇｌｕ−Ａｌａ
−Ｇｌｕ−Ａｌａが除かれる） −Ｂ −Ａｒｇ −Ａ
ｒｇ−Ａ−ＴＰｌアを含む得られたプラスミドｐＭ７６
０２をＢａｍＨｌと部分的に５ｐｈｌで切断し、２．１
ｋｂ断片をＢａ５ａｌと５ｐｈｌで切断したＣＰＯＴに
挿入する。得られたプラスミドｐＭ７６１１が酵母の形
質転換のために用いられる。プラスミドｐＭＴ ６１１
の構築を図５に示す。
例３ ： Ｂ −Ｌｙｓ −Ｌｙｓ −Ａを発現するた
めの酵母プラスミドｐＭＴ ６５０の構築 ｐＭＴ ４６２からのＢ−Ｃ−Ａコード断片（例１参照
）を、例′１で記載した方法と同じ方法により、図６に
示すように３０量体欠失プライマーＫＦＮ ４１と“万
能”１５量体Ｍ１３ブライマーの混合物で部位特異的突
然変異によりＢ −Ｌｙｓ −Ｌｙｓ −Ａへ転化する
。
めの酵母プラスミドｐＭＴ ６５０の構築 ｐＭＴ ４６２からのＢ−Ｃ−Ａコード断片（例１参照
）を、例′１で記載した方法と同じ方法により、図６に
示すように３０量体欠失プライマーＫＦＮ ４１と“万
能”１５量体Ｍ１３ブライマーの混合物で部位特異的突
然変異によりＢ −Ｌｙｓ −Ｌｙｓ −Ａへ転化する
。
タレノウポリメラーゼで充てんしＴ４リガーゼで連結後
、部分的二重らせんＤＮＡをＡｐａｌ 、 Ｉ！ｃｏＲ
１およびＸｂａｌで消化させ、プラスミドｐＴ５からの
５、５ ｋｂ Ｘｂａｌ−ＢｃｏＲ１断片（例１参照）
で連結する。
、部分的二重らせんＤＮＡをＡｐａｌ 、 Ｉ！ｃｏＲ
１およびＸｂａｌで消化させ、プラスミドｐＴ５からの
５、５ ｋｂ Ｘｂａｌ−ＢｃｏＲ１断片（例１参照）
で連結する。
大腸菌へ形質転換および再形質転換後、挿入部ＭＦαｌ
リーダー−（Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａが除か
れる） −Ｂ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａを含むプラスミドｐ
ＭＴ ６５２を単離し、挿入部の配列を上記のように確
認する。
リーダー−（Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａが除か
れる） −Ｂ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａを含むプラスミドｐ
ＭＴ ６５２を単離し、挿入部の配列を上記のように確
認する。
プラスミドｐＭＴ ６５２をＸｂａｌ−ＥｃｏＲｌで開
裂し、０、５ ｋｂ断片をｐＭＴ ６４４の７．８ ｋ
ｂ Ｘｂａｌ−Ｋｐｎｌと４．３ｋｂの）［ｐｎｌ−Ｅ
ｃｏＲ１断片で連結する。得られたプラスミドｐＭ７６
５０は挿入部ＴＰＩｐ−ＭＦα１リーダー（Ｇｌｕ−Ａ
ｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａが除かれる）−Ｂ−Ｌｙｓ −Ｌ
ｙｓ −Ａ−ＴＰＩｔを含み、さらにＣＰＯＴからのＴ
ＰＩコード遺伝子（ＰＯＴ）を含む。プラスミドｐＭ７
６５０の構築を図６に示し、９Ｍ７６４４の構築を図４
に示す。９Ｍ７６４４の構築に用いられるプラスミドｐ
Ｕｃ １２とｐｕｃ １８をｐＵＣ１３ニツイテ記載し
た（ヴイエイラら、前出）ように構築する。プラスミド
ｐ６０１ （図４参照）は、８ｇ１２とＢａｍＨ１部位
が側方に接続する挿入部ＴＰＩｐ−ＭＦα１リーダー−
Ｂ ’ Ａ−ＴＰｌ、を含む。Ｂ’ＡはＢ （１−２９
） −Ａ（１−２１） （ここで、Ｂ（１−２９）は
Ｐｈｅ”からり、５８１９までの短かくしたヒトインシ
ュリンＢｉ（であり、Ａ（１−２１）はヒトインシュリ
ンＡ鎖である）を表わす。Ｂ’ＡをコードするＤＮＡ配
列の構築はヨーロッパ特許出願第００６８７０１Ａ号に
記載されている。酵母の形質転換にｐＭＴ ６５０が用
いられる。
裂し、０、５ ｋｂ断片をｐＭＴ ６４４の７．８ ｋ
ｂ Ｘｂａｌ−Ｋｐｎｌと４．３ｋｂの）［ｐｎｌ−Ｅ
ｃｏＲ１断片で連結する。得られたプラスミドｐＭ７６
５０は挿入部ＴＰＩｐ−ＭＦα１リーダー（Ｇｌｕ−Ａ
ｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａが除かれる）−Ｂ−Ｌｙｓ −Ｌ
ｙｓ −Ａ−ＴＰＩｔを含み、さらにＣＰＯＴからのＴ
ＰＩコード遺伝子（ＰＯＴ）を含む。プラスミドｐＭ７
６５０の構築を図６に示し、９Ｍ７６４４の構築を図４
に示す。９Ｍ７６４４の構築に用いられるプラスミドｐ
Ｕｃ １２とｐｕｃ １８をｐＵＣ１３ニツイテ記載し
た（ヴイエイラら、前出）ように構築する。プラスミド
ｐ６０１ （図４参照）は、８ｇ１２とＢａｍＨ１部位
が側方に接続する挿入部ＴＰＩｐ−ＭＦα１リーダー−
Ｂ ’ Ａ−ＴＰｌ、を含む。Ｂ’ＡはＢ （１−２９
） −Ａ（１−２１） （ここで、Ｂ（１−２９）は
Ｐｈｅ”からり、５８１９までの短かくしたヒトインシ
ュリンＢｉ（であり、Ａ（１−２１）はヒトインシュリ
ンＡ鎖である）を表わす。Ｂ’ＡをコードするＤＮＡ配
列の構築はヨーロッパ特許出願第００６８７０１Ａ号に
記載されている。酵母の形質転換にｐＭＴ ６５０が用
いられる。
例４ ： Ｂ −Ａｒｇ −Ｌｙｓ −Ａ発現のための
プラスミドｐＭ７６５８の構築 例３で９Ｍ７６５０について記載したようにしてただし
ＫＦＮ ４１の代わりにＫＦＮ ４２の３０量体欠失プ
ライマーを用いてプラスミドｐＭ７６５８を構築する。
プラスミドｐＭ７６５８の構築 例３で９Ｍ７６５０について記載したようにしてただし
ＫＦＮ ４１の代わりにＫＦＮ ４２の３０量体欠失プ
ライマーを用いてプラスミドｐＭ７６５８を構築する。
また、さらに直接的な９Ｍ７６４４の構築が選択される
：インビトロ突然変異、すなわちタレノウポリメラーゼ
で充てんしＴ４リガーゼで連結後、部分的二重らせんＤ
ＮＡをＡｐａｌ 、 ＥｃｏＲｌおよびＸｂａｌで消化
し、９Ｍ７６４４の７．８ ｋｂ Ｘｂａｌ−Ｋｐｎｌ
と４．３ｋｂＫｐｎｌ−ＥｃｏＲ１断片と連結する。連
結混合物を大腸菌（ｒ−ｍ”）へ形質転換させ、幾つか
の形質転換体からプラスミドを調製する。０．６と０．
５ｋｂの両方にＸｂａｌ−ＨｃｏＲ１断片を示す１つの
プラスミド調製物を大腸菌へ再度形質転換し、０．６ｋ
ｂではなく０、５ ｋｂ Ｉ！ｃｏＲ１−Ｘｂａｌ断片
を含むプラスミドｐＭ７６５８を含む株とする。９Ｍ７
６５８は挿入部ＴＰＩｐ−１’ｌＦα１リーダー−（Ｇ
ｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａが除かれる）−Ｂ −Ａ
ｒｇ −Ｌｙｓ −Ａ −ＴＰＩｔを含む。
：インビトロ突然変異、すなわちタレノウポリメラーゼ
で充てんしＴ４リガーゼで連結後、部分的二重らせんＤ
ＮＡをＡｐａｌ 、 ＥｃｏＲｌおよびＸｂａｌで消化
し、９Ｍ７６４４の７．８ ｋｂ Ｘｂａｌ−Ｋｐｎｌ
と４．３ｋｂＫｐｎｌ−ＥｃｏＲ１断片と連結する。連
結混合物を大腸菌（ｒ−ｍ”）へ形質転換させ、幾つか
の形質転換体からプラスミドを調製する。０．６と０．
５ｋｂの両方にＸｂａｌ−ＨｃｏＲ１断片を示す１つの
プラスミド調製物を大腸菌へ再度形質転換し、０．６ｋ
ｂではなく０、５ ｋｂ Ｉ！ｃｏＲ１−Ｘｂａｌ断片
を含むプラスミドｐＭ７６５８を含む株とする。９Ｍ７
６５８は挿入部ＴＰＩｐ−１’ｌＦα１リーダー−（Ｇ
ｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａが除かれる）−Ｂ −Ａ
ｒｇ −Ｌｙｓ −Ａ −ＴＰＩｔを含む。
Ｂ −Ａｒｇ −Ｌｙｓ −Ａをコードするセグメント
の配列はマキサム−ギルバー）ＤＮＡ−配列法により変
化する。９Ｍ７６５８の構築を図７に示す、 ｐＭＴ６
５８は酵母の形質転換に用いられる。
の配列はマキサム−ギルバー）ＤＮＡ−配列法により変
化する。９Ｍ７６５８の構築を図７に示す、 ｐＭＴ６
５８は酵母の形質転換に用いられる。
例５：形質転換
酵母（Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株ＭＴ ５０１（Ｅ
２−７ＢＸＥ１１−３Ｃａ ／ ａ 、Δｔｐｉ／ｌｐ
ｉ 、Δｐｅｐ４−３／ ｐｅｐ４−３）を、ＹＰＧ
ａＬ（１％バクト酵母抽出液、２％バタトペプトン、２
％ガラクトース、１％酪酸）中でＯＤ、。。、０．６ま
で増殖する。
２−７ＢＸＥ１１−３Ｃａ ／ ａ 、Δｔｐｉ／ｌｐ
ｉ 、Δｐｅｐ４−３／ ｐｅｐ４−３）を、ＹＰＧ
ａＬ（１％バクト酵母抽出液、２％バタトペプトン、２
％ガラクトース、１％酪酸）中でＯＤ、。。、０．６ま
で増殖する。
培養液１００ｆｆｌを遠心分離により採取し、水ｌＱｍ
ｆで洗い、再遠心分離し、ｌＱｍｌの１．２Ｍソルビト
ール、２５ ｍＭ ＮａｔＥＤＴＡ ｐＨ＝ ８．０
。
ｆで洗い、再遠心分離し、ｌＱｍｌの１．２Ｍソルビト
ール、２５ ｍＭ ＮａｔＥＤＴＡ ｐＨ＝ ８．０
。
６．７■／ ｍ Ｉ！ジチオトレイトール中に再懸濁す
る。
る。
懸濁液を３０℃で１５分間インキュベートし、遠心分離
し、細胞を１０ｍ１！の１．２Ｍソルビトール、１０
ｍ Ｍ ＮａｚＥＤＴＡ−０，１Ｍクエン酸ナトリウム
ｐＨ＝５．８、ノボザイム（Ｎｏｖｏｚｙｍ） ９２３
４２ ｗ中で再懸濁する。Ｍ濁液を３０℃で３０分間イ
ンキュベートし、遠心分離により細胞を集め、１０ｍ１
の１．２Ｍソルビトールと１０ｍｆｆ１のＣＡＳ（１，
２Ｍソルビトール、１０ｍＭＣａＣ１ｔ１１０ｍＭ ト
リス（トリス−トリス（ヒドロキシメチル）−アミノメ
タン）ｐＨ＝７．５）で洗浄し、’１ｍｌのＣＡＳに再
懸濁する。形質転換のために、ＣＡＳ−再懸濁細胞０．
１ｍｌをほぼ１ｇｇのプラスミドｐＭＴ５８５と混合し
、室温で１５分間放置する。１ｍｌの２０％ポリエチレ
ングリコール４０００．１０ｍＭＣａＣ１ｇ 、１０
ｍＭ Ｉ・リスｐＨ＝７．５を加え、混合物をさらに室
温で３０分間放置する。混合物を遠心分離し、ベレット
をＱ、１ｒｒｌの５ＯＳ（１，２Ｍソルビトール、３３
％ｖ ／ ｖ ＹＰＧａＬ 、 ６．７ ｍＭＣａＣ
ｌｔ 、１４８ｇ ／ ｍＡ’ロイシン）に再懸濁し、
３０℃で２時間インキエベートする。次いで懸濁液を遠
心分離し、ペレットを０．５ｍｊ！の１．２ Ｍソルビ
トールに再懸濁する。６ｍｌの寒天上層〔セルマンら（
Ｓｈｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ、）のＳＣ培地（Ｍｅｔｈ
ｏｄｓｉｎ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、コール
ドスプリングハーバーラボラトリイ、 １９８１）であ
って、ロイシンが排除され１．２Ｍソルビトールと２．
５％寒天を含むもの〕を５２℃で加え、この＠濁液を同
種の寒天固化物とソルビトールを含む培地を有するプレ
ートの表面に注入する。３０℃で３日後形質転換体コロ
ニーを取り出し、再単離し、液体培地を始めるのに用い
る。このような形質転換体ＭＴ ５９３（＝ＭＴ ５０
１／ｐＭＴ ５８５）の１つを、さらに特性決定のため
に選択する。
し、細胞を１０ｍ１！の１．２Ｍソルビトール、１０
ｍ Ｍ ＮａｚＥＤＴＡ−０，１Ｍクエン酸ナトリウム
ｐＨ＝５．８、ノボザイム（Ｎｏｖｏｚｙｍ） ９２３
４２ ｗ中で再懸濁する。Ｍ濁液を３０℃で３０分間イ
ンキュベートし、遠心分離により細胞を集め、１０ｍ１
の１．２Ｍソルビトールと１０ｍｆｆ１のＣＡＳ（１，
２Ｍソルビトール、１０ｍＭＣａＣ１ｔ１１０ｍＭ ト
リス（トリス−トリス（ヒドロキシメチル）−アミノメ
タン）ｐＨ＝７．５）で洗浄し、’１ｍｌのＣＡＳに再
懸濁する。形質転換のために、ＣＡＳ−再懸濁細胞０．
１ｍｌをほぼ１ｇｇのプラスミドｐＭＴ５８５と混合し
、室温で１５分間放置する。１ｍｌの２０％ポリエチレ
ングリコール４０００．１０ｍＭＣａＣ１ｇ 、１０
ｍＭ Ｉ・リスｐＨ＝７．５を加え、混合物をさらに室
温で３０分間放置する。混合物を遠心分離し、ベレット
をＱ、１ｒｒｌの５ＯＳ（１，２Ｍソルビトール、３３
％ｖ ／ ｖ ＹＰＧａＬ 、 ６．７ ｍＭＣａＣ
ｌｔ 、１４８ｇ ／ ｍＡ’ロイシン）に再懸濁し、
３０℃で２時間インキエベートする。次いで懸濁液を遠
心分離し、ペレットを０．５ｍｊ！の１．２ Ｍソルビ
トールに再懸濁する。６ｍｌの寒天上層〔セルマンら（
Ｓｈｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ、）のＳＣ培地（Ｍｅｔｈ
ｏｄｓｉｎ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、コール
ドスプリングハーバーラボラトリイ、 １９８１）であ
って、ロイシンが排除され１．２Ｍソルビトールと２．
５％寒天を含むもの〕を５２℃で加え、この＠濁液を同
種の寒天固化物とソルビトールを含む培地を有するプレ
ートの表面に注入する。３０℃で３日後形質転換体コロ
ニーを取り出し、再単離し、液体培地を始めるのに用い
る。このような形質転換体ＭＴ ５９３（＝ＭＴ ５０
１／ｐＭＴ ５８５）の１つを、さらに特性決定のため
に選択する。
プラスミドｐＭＴ ６１１ 、ｐＭＴ ６５０およびｐ
ＭＴ ６５８を上記と同じ方法で酵母（Ｓ、 ｃｅｒｅ
ｖｉｓｉａｅ）株ＭＴ５０１へ形質転換し、形質転換体
ＭＴ ６１６ （＝ＭＴ ５０１／ｐＭＴ ６１１）、
ＭＴ ６５５ （＝ＭＴ ５０１／ｐＭＴ ６５０）お
よびＭＴ ６６０ （＝ＭＴ ５０１／ｐＭＴ ６５Ｂ
）を単離する。
ＭＴ ６５８を上記と同じ方法で酵母（Ｓ、 ｃｅｒｅ
ｖｉｓｉａｅ）株ＭＴ５０１へ形質転換し、形質転換体
ＭＴ ６１６ （＝ＭＴ ５０１／ｐＭＴ ６１１）、
ＭＴ ６５５ （＝ＭＴ ５０１／ｐＭＴ ６５０）お
よびＭＴ ６６０ （＝ＭＴ ５０１／ｐＭＴ ６５Ｂ
）を単離する。
形質転換体微生物ＭＴ ５９３、ＭＴ ６１６、Ｈ↑６
５５および酊６６０は、出願人により、１９８５年１月
１６日に、メン（ＤＳＭ）、グリースバッハストラーセ
８、Ｄ−３４００ゲツチンゲンに寄託され、それぞれ参
照番号ＤＳＭ ３１９４、ＤＳＭ ３１９５、ＤＳＭ
３１９８およびＤＳＭ ３１９’を記録する。ＤＳＭは
１９７７年のブタペスト条約下に委任された国際寄託機
関であり、前記条約のそれぞれ９条および１１条により
、上記寄託物の永続性と公衆による入手可能性を提供す
る。
５５および酊６６０は、出願人により、１９８５年１月
１６日に、メン（ＤＳＭ）、グリースバッハストラーセ
８、Ｄ−３４００ゲツチンゲンに寄託され、それぞれ参
照番号ＤＳＭ ３１９４、ＤＳＭ ３１９５、ＤＳＭ
３１９８およびＤＳＭ ３１９’を記録する。ＤＳＭは
１９７７年のブタペスト条約下に委任された国際寄託機
関であり、前記条約のそれぞれ９条および１１条により
、上記寄託物の永続性と公衆による入手可能性を提供す
る。
例６：酵母株ＭＴ ５９３（ＤＳＭ ３１９４）からＢ
−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａの精製 酵母株ＭＴ ５９３（ＤＳＭ ３１９４）をＹＰＤ培地
で増殖する。
−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａの精製 酵母株ＭＴ ５９３（ＤＳＭ ３１９４）をＹＰＤ培地
で増殖する。
２１のバッフルフラスコ中の１１の培養液ヲＯＤ、。。
、が１５になるまで３０℃で振とうする。
遠心分離後、上清８１５ｍＡ’から発現産物を次のよう
に単離する： リクロプレプ（ＬｉＣｈｒｏｐｒｅｐ） ＠ ＲＰ−１
８（メルク。
に単離する： リクロプレプ（ＬｉＣｈｒｏｐｒｅｐ） ＠ ＲＰ−１
８（メルク。
商品番号９３０３）のカラム（１，５Ｘ９ａａ）を、６
０％（ｖ／ｖ）エタノール含有５０ ｍＭ ＮＨＪＣＯ
ｓ３０ｒｒｌで洗う。カラムを５０ｍｊ！の５０ｍＭＮ
Ｈ４ＨＣＯ３で平衡化する。９５ｍ１の９６％エタノー
ルを８１５ｍｊ！の酵母上清へ加え、混合物を一晩カラ
ムへポンプ注入する（流速４５ｍｊ！／ｈ）。
０％（ｖ／ｖ）エタノール含有５０ ｍＭ ＮＨＪＣＯ
ｓ３０ｒｒｌで洗う。カラムを５０ｍｊ！の５０ｍＭＮ
Ｈ４ＨＣＯ３で平衡化する。９５ｍ１の９６％エタノー
ルを８１５ｍｊ！の酵母上清へ加え、混合物を一晩カラ
ムへポンプ注入する（流速４５ｍｊ！／ｈ）。
カラムを１５ｍＩｔの０．１ Ｍ ＮａＣ１、次いで１
５ｍｌ１のｎｚｏで洗い、ペプチド物質を６０％（Ｖ／
ｖ）エタノール含有５０ ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯｓで溶出
する。
５ｍｌ１のｎｚｏで洗い、ペプチド物質を６０％（Ｖ／
ｖ）エタノール含有５０ ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯｓで溶出
する。
溶出液（４，５ｍ１）を減圧遠心分離〔サバント（Ｓａ
ｖａｎｔ）減圧遠心分離〕により１．１ｍＩ！まで濃縮
してエタノールを除き、容量をｐＨ７，４にて２５ｍＭ
ＨＥＰＥＳ緩衝液で１０ｍ１に調整する。サンプルを
抗インシュリンセファロースカラム（２，５Ｘ４．５０
１）へ施こす。このカラムは予めＮａＦＡＭ緩衝液（ヘ
ッディング、エル、 Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ８
（１９７２Ｌ２６０−６６） ２０ ｍｌと１０ｍｊ！
の２５ ｍ Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ＝７．４で洗浄
する。施用後、カラムを室温で３０分間放置し、その後
４０ｍ１の２５ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐ）Ｉ ＝ ７
．４で洗う。ペプチド物質を２０％酢酸で溶出し、溶出
液のｐＨをＮＨ，ＯＨで７．０に調整する。
ｖａｎｔ）減圧遠心分離〕により１．１ｍＩ！まで濃縮
してエタノールを除き、容量をｐＨ７，４にて２５ｍＭ
ＨＥＰＥＳ緩衝液で１０ｍ１に調整する。サンプルを
抗インシュリンセファロースカラム（２，５Ｘ４．５０
１）へ施こす。このカラムは予めＮａＦＡＭ緩衝液（ヘ
ッディング、エル、 Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ８
（１９７２Ｌ２６０−６６） ２０ ｍｌと１０ｍｊ！
の２５ ｍ Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ＝７．４で洗浄
する。施用後、カラムを室温で３０分間放置し、その後
４０ｍ１の２５ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐ）Ｉ ＝ ７
．４で洗う。ペプチド物質を２０％酢酸で溶出し、溶出
液のｐＨをＮＨ，ＯＨで７．０に調整する。
前記工程からの溶出液を減圧回転で２５０μｌまで濃縮
し、さらに５μウオーターズノバパツク（Ｗａｔｅｒｓ
Ｎｏｖａｐａｋ）Ｃ−１８カラム（３，９Ｘ １５０
ｍｍ）での逆相ＩＩ Ｐ Ｌ Ｃにより精製する。Ａお
よびＢ緩衝液は、それぞれ、０．１％ＴＦＡ水溶液と０
．０７％ＴＦＡ−アセトニトリル液である。カラムを２
５％Ｂで流速０．７５ｍｊ２７分にて平衡化し、ペプチ
ドを直線状勾配物（１％アセトニトリル／分）で溶出し
、２７６ｎｏ＋で検出する。１３．１５分の保持時間で
主ピークが溶出し、このピークからのペプチド物質を溶
出液の凍結乾燥により単離する。ペプチド物質は例８で
記載したように特性決定が行なわれる。精製の各工程に
おける収率は前記したラジオイムノアッセイにより決定
される。表２は精製を要約する。全収率は３９％であっ
た。
し、さらに５μウオーターズノバパツク（Ｗａｔｅｒｓ
Ｎｏｖａｐａｋ）Ｃ−１８カラム（３，９Ｘ １５０
ｍｍ）での逆相ＩＩ Ｐ Ｌ Ｃにより精製する。Ａお
よびＢ緩衝液は、それぞれ、０．１％ＴＦＡ水溶液と０
．０７％ＴＦＡ−アセトニトリル液である。カラムを２
５％Ｂで流速０．７５ｍｊ２７分にて平衡化し、ペプチ
ドを直線状勾配物（１％アセトニトリル／分）で溶出し
、２７６ｎｏ＋で検出する。１３．１５分の保持時間で
主ピークが溶出し、このピークからのペプチド物質を溶
出液の凍結乾燥により単離する。ペプチド物質は例８で
記載したように特性決定が行なわれる。精製の各工程に
おける収率は前記したラジオイムノアッセイにより決定
される。表２は精製を要約する。全収率は３９％であっ
た。
以下余白
例７：それぞれ酵母株ＭＴ ６５５（ＤＳＭ ３１９Ｂ
）、ＭＴ ６６０（ＤＳＭ ３１９９）およびＭＴ ６
１６（ＤＳＭ ３１９５）からのＢ −Ｌｙｓ −Ｌｙ
ｓ −ＡＳＢ −Ａｒｇ−Ｌｙｓ−ＡおよびＢ −Ａｒ
ｇ −Ａｒｇ −Ａの精製 上記記載の酵母株を予め例６で記載したように増殖し、
発現産物を例６で記載したように実質的に異なった上清
から精製する。表３に縮収率をまとめる。
）、ＭＴ ６６０（ＤＳＭ ３１９９）およびＭＴ ６
１６（ＤＳＭ ３１９５）からのＢ −Ｌｙｓ −Ｌｙ
ｓ −ＡＳＢ −Ａｒｇ−Ｌｙｓ−ＡおよびＢ −Ａｒ
ｇ −Ａｒｇ −Ａの精製 上記記載の酵母株を予め例６で記載したように増殖し、
発現産物を例６で記載したように実質的に異なった上清
から精製する。表３に縮収率をまとめる。
以下余白
表３
例８：酵母株ＭＴ ５９３（ＤＳＭ ３１９４）から精
製されたＢ −Ｌｙｓ −Ａｒｇ −Ａの特性決定Ｂ
−Ｌｙｓ −Ａｒｇ −Ａを例６で記載のように精製す
る。ペプチドのアミノ酸組成を次のように決定する：
１３９．６／ｊ ｇ （１９ｎｍｏｌ）を１１０℃で２
４時間１００μｌの６ ＮＨＣｌ中で加水分解する。加
水分解をベックマン型１２１Ｍアミノ酸分析機で分析す
る。
製されたＢ −Ｌｙｓ −Ａｒｇ −Ａの特性決定Ｂ
−Ｌｙｓ −Ａｒｇ −Ａを例６で記載のように精製す
る。ペプチドのアミノ酸組成を次のように決定する：
１３９．６／ｊ ｇ （１９ｎｍｏｌ）を１１０℃で２
４時間１００μｌの６ ＮＨＣｌ中で加水分解する。加
水分解をベックマン型１２１Ｍアミノ酸分析機で分析す
る。
次のアミノ酸組成がみられた：
以下余白
表４
約５ Ｈｏｌのペプチド物質をアミノ酸配列分析する。
配列分析は、ムーディ、エイ、ジエイ、 （Ｍｏｏｄｙ
。
。
八、Ｊ、）、チム、エル、（Ｔｈｉｓ、 Ｌ、）および
ヴアルベルデ、アイ、（Ｖａｌｖｅｒｄｅ、 １．）（
ＦＥＢＳ Ｌｅｆｔ、、 １７２（１９８４）、 １４
２−１４８）により記載されているように、ガスフェー
ズセキュエンサ−（アプライドバイオシステムモデル４
７０Ａ）で行なわれる。結果は次のようである： 以下余白 表５ 表 ５ （続き） 表 ５ （続き） 精製されたＢ −Ｌｙｓ −Ａｒｇ −Ａのアミノ酸配
列分析平均的反復性収率は９２．１％であった。
ヴアルベルデ、アイ、（Ｖａｌｖｅｒｄｅ、 １．）（
ＦＥＢＳ Ｌｅｆｔ、、 １７２（１９８４）、 １４
２−１４８）により記載されているように、ガスフェー
ズセキュエンサ−（アプライドバイオシステムモデル４
７０Ａ）で行なわれる。結果は次のようである： 以下余白 表５ 表 ５ （続き） 表 ５ （続き） 精製されたＢ −Ｌｙｓ −Ａｒｇ −Ａのアミノ酸配
列分析平均的反復性収率は９２．１％であった。
例９：それぞれ酵母株ＭＴ ６５５（ＤＳＭ ３１９Ｂ
）、ＭＴ ６６０（ＤＳＭ ３１９９）およびＭＴ ６
１６（ＤＳＭ ３１９５）から精製されたＢ −Ｌｙｓ
−Ｌｙｓ −Ａ、Ｂ −Ａｒｇ −Ｌｙｓ −Ａおよ
びＢ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａの特性決定 ペプチド物質を例６で記載したように上記の酵母株から
精製する。ペプチドを例８で記載のようにアミノ酸配列
分析へかける。配列結果（示さず）から、Ｂ鎖とＡ鎖を
連結する二塩基性配列は、それぞれＬ ｙｓ −Ｌ ｙ
ｓ （ＭＴ ６５５）、Ａｒｇ −Ｌｙｓ（ＭＴ ６６
０）およびＡｒｇ −Ａｒｇ（ＭＴ ６１６）であった
。精製したペプチドを例７に記載したようにアミノ酸分
析にかける。アミノ酸組成は理論どうりに見い出された
（結果をＢ −Ｌｙｓ −Ｌｙｓ −Ａについてのみ示
す）。
）、ＭＴ ６６０（ＤＳＭ ３１９９）およびＭＴ ６
１６（ＤＳＭ ３１９５）から精製されたＢ −Ｌｙｓ
−Ｌｙｓ −Ａ、Ｂ −Ａｒｇ −Ｌｙｓ −Ａおよ
びＢ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａの特性決定 ペプチド物質を例６で記載したように上記の酵母株から
精製する。ペプチドを例８で記載のようにアミノ酸配列
分析へかける。配列結果（示さず）から、Ｂ鎖とＡ鎖を
連結する二塩基性配列は、それぞれＬ ｙｓ −Ｌ ｙ
ｓ （ＭＴ ６５５）、Ａｒｇ −Ｌｙｓ（ＭＴ ６６
０）およびＡｒｇ −Ａｒｇ（ＭＴ ６１６）であった
。精製したペプチドを例７に記載したようにアミノ酸分
析にかける。アミノ酸組成は理論どうりに見い出された
（結果をＢ −Ｌｙｓ −Ｌｙｓ −Ａについてのみ示
す）。
以下全白
表６
例１０：ヒトインシュリンへのＢ −Ｌｙｓ −Ａｒｇ
−人の転化（一段階法） １０ ｕＢ −Ｌｙｓ −Ａｒｇ −Ａを１０ｒｒｌの
０．２３Ｍトリス−ＨＣｌ緩衝液ｐＨ＝７．５に溶かす
。溶液を３７℃まで加熱し、５０Ｍｇトリプシン（ノボ
インダストリイ社）と５０Ｍｇカルボキシペプチダーゼ
Ｂ（ベーリンガー）の両方を１００μｌの水に溶かした
ものを加える（０時）。反応混合物のアリコートを時間
０分、２分、１０分、４０分および８０分で取り出す。
−人の転化（一段階法） １０ ｕＢ −Ｌｙｓ −Ａｒｇ −Ａを１０ｒｒｌの
０．２３Ｍトリス−ＨＣｌ緩衝液ｐＨ＝７．５に溶かす
。溶液を３７℃まで加熱し、５０Ｍｇトリプシン（ノボ
インダストリイ社）と５０Ｍｇカルボキシペプチダーゼ
Ｂ（ベーリンガー）の両方を１００μｌの水に溶かした
ものを加える（０時）。反応混合物のアリコートを時間
０分、２分、１０分、４０分および８０分で取り出す。
Ｉ Ｍ ＨＣｌ、でサンプルをｐＨ２，５まで酸性化し
て酵素反応を停止する。
て酵素反応を停止する。
Ｂ −Ｌｙｓ −Ａｒｇ −Ａのヒトインシュリンへの
転化をヌクレオシル（マーチェリーナゲル）の５μＲＰ
Ｃ−１８カラム（４Ｘ２００ｍｎ＋）において逆相ＨＰ
ＬＣにより追跡する。Ａ緩衝液はＨｇＳＯ４でｐＨ＝
３．５に調整された２５％アセトニトリルからなり、Ｂ
ＥＩ衝液は４５％アセトニトリル、０．１５Ｍ （ＮＨ
ｎ）ｚｓＯｎ、１、５ ｍＭ Ｈ，ＳＯ４である。８０
％Ａ緩衝液／２０％Ｂ緩衝液からなる混合物を用いて平
均的系で行なわれる。溶媒とカラムの温度は３０℃であ
り、ペプチドは２１４ｎａ＋で検出される。
転化をヌクレオシル（マーチェリーナゲル）の５μＲＰ
Ｃ−１８カラム（４Ｘ２００ｍｎ＋）において逆相ＨＰ
ＬＣにより追跡する。Ａ緩衝液はＨｇＳＯ４でｐＨ＝
３．５に調整された２５％アセトニトリルからなり、Ｂ
ＥＩ衝液は４５％アセトニトリル、０．１５Ｍ （ＮＨ
ｎ）ｚｓＯｎ、１、５ ｍＭ Ｈ，ＳＯ４である。８０
％Ａ緩衝液／２０％Ｂ緩衝液からなる混合物を用いて平
均的系で行なわれる。溶媒とカラムの温度は３０℃であ
り、ペプチドは２１４ｎａ＋で検出される。
上記一段階法における最適収率はインキュベーション１
０分後に得られる。この時点で、反応混合物は、４５％
ヒトインシュリン、１０％Ｄｅｓ −Ｂ２Ｏ−インシュ
リンおよび４５％Ａｒｇ−Ａｏ−インシュリンからなる
。転化の収率を高めるために、二段階法が案出された（
例１１）。
０分後に得られる。この時点で、反応混合物は、４５％
ヒトインシュリン、１０％Ｄｅｓ −Ｂ２Ｏ−インシュ
リンおよび４５％Ａｒｇ−Ａｏ−インシュリンからなる
。転化の収率を高めるために、二段階法が案出された（
例１１）。
例１１：ヒトインシュリンへのＢ −Ｌｙｓ −Ａｒｇ
−Ａの転化（二段階法） Ｈｚｏ ２６．４ｍｌを −Ｌｙｓ −Ａｒｇ −４７
１ａｇへ加える。混合物を４℃まで急冷し、３．０ｍｊ
２の０．２５Ｍ ＮａＯＨを加え、これによりインシュ
リン前駆体を溶かす。水２００μｌ中のトリプシン（ノ
ボインダストリイ社）６ｇを加える。反応を５時間４℃
で行ない、４ＮＨＣ１６００μｌを加えて停止する。
−Ａの転化（二段階法） Ｈｚｏ ２６．４ｍｌを −Ｌｙｓ −Ａｒｇ −４７
１ａｇへ加える。混合物を４℃まで急冷し、３．０ｍｊ
２の０．２５Ｍ ＮａＯＨを加え、これによりインシュ
リン前駆体を溶かす。水２００μｌ中のトリプシン（ノ
ボインダストリイ社）６ｇを加える。反応を５時間４℃
で行ない、４ＮＨＣ１６００μｌを加えて停止する。
ＨＰＬＣ（例１０で記載した方法）により測定された収
率はＦ丁Ｌｙｓ−Ａｒｇ ９１．５％であり、残り
８．５％の主な部分は未消化Ｗ−ｌで あった。生成物を、オクタデシルジメ“チリシリル置換
シリカ（平均粒径：１５μ、孔径：１００人）のカラム
（５Ｘ２５ｃｍ）にて調製用ＨＰＬＣにより精製する。
率はＦ丁Ｌｙｓ−Ａｒｇ ９１．５％であり、残り
８．５％の主な部分は未消化Ｗ−ｌで あった。生成物を、オクタデシルジメ“チリシリル置換
シリカ（平均粒径：１５μ、孔径：１００人）のカラム
（５Ｘ２５ｃｍ）にて調製用ＨＰＬＣにより精製する。
カラムを平衡化し、流速２ Ｎ／ｈにて３７％（Ｖ／Ｖ
）エタノールを含む０．１８５Ｍ ＭＣｌ１０．６ｍＭ
ＨＣＩ （ｐＨ＝３．１５）で溶出（平均）する。Ｂ
−Ｌｙｓ−Ａｒｇ Ａが４．３カラム容量で溶出し、ヒ
トインシュリンロー３０エステルの結晶化について予め
記載された結晶化方法〔マルクッセン、ジェイ。
）エタノールを含む０．１８５Ｍ ＭＣｌ１０．６ｍＭ
ＨＣＩ （ｐＨ＝３．１５）で溶出（平均）する。Ｂ
−Ｌｙｓ−Ａｒｇ Ａが４．３カラム容量で溶出し、ヒ
トインシュリンロー３０エステルの結晶化について予め
記載された結晶化方法〔マルクッセン、ジェイ。
（Ｍａｒｋｕｓｓｅｎ、Ｊ、）（１９８４） “Ｄｉ
、ａｂｅｔｅｓ Ｒｅ５ｅａｒｃｈνｏｌ Ｉ 、
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｐａｒｔ
Ｂ”ｐ、 ４０３−４１１、 レールナーとポ
ール版〕によりアルコール性プールから単離する。
、ａｂｅｔｅｓ Ｒｅ５ｅａｒｃｈνｏｌ Ｉ 、
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｐａｒｔ
Ｂ”ｐ、 ４０３−４１１、 レールナーとポ
ール版〕によりアルコール性プールから単離する。
結晶を凍結乾燥し、５０ｍＭ Ｉ−リスー〇ＣＩ緩衝
液（ｐＨ＝ ９．３ ）中に濃度１０ｍｇ／ｍｊ！にて
溶解する。インシュリン前駆体中間体を、３７℃で４０
時間カルボキシペプチダーゼＢ（４０μｇ／ｍｌ）で消
化することによりヒトインシュリンへ転化する。この消
化混合物へエタノールを最終濃度６０％（ｖ ／ ｖ
）となるように加え、ヒトインシュリンを、シュリッヒ
トクルールら（ＳｃｈｌｉｃｈｔＫｒｕｌｌ ｅｔ ａ
ｌ、）により、Ｈｏｒｎ＋、 Ｍｅｔａｂ、 Ｒｅｓ、
５ｕｐｐ１．＋Ｓｅｒ、 ５ （１９７４） １３４
−１４３に記載されているように、ＱＡＥ−セファデッ
クス（ファルマシア）カラムにおいて陰イオン交換クロ
マトグラフィにより混合物から精製する。
液（ｐＨ＝ ９．３ ）中に濃度１０ｍｇ／ｍｊ！にて
溶解する。インシュリン前駆体中間体を、３７℃で４０
時間カルボキシペプチダーゼＢ（４０μｇ／ｍｌ）で消
化することによりヒトインシュリンへ転化する。この消
化混合物へエタノールを最終濃度６０％（ｖ ／ ｖ
）となるように加え、ヒトインシュリンを、シュリッヒ
トクルールら（ＳｃｈｌｉｃｈｔＫｒｕｌｌ ｅｔ ａ
ｌ、）により、Ｈｏｒｎ＋、 Ｍｅｔａｂ、 Ｒｅｓ、
５ｕｐｐ１．＋Ｓｅｒ、 ５ （１９７４） １３４
−１４３に記載されているように、ＱＡＥ−セファデッ
クス（ファルマシア）カラムにおいて陰イオン交換クロ
マトグラフィにより混合物から精製する。
精製奪合む転化の異なった工程での収率を表７に示す。
以下余白
表７
例１２ ： Ｂ −Ｌｙｓ −Ｌｙｓ −Ａのヒトイン
シュリンへの転化（一段階法） Ｂ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａ １０＋ｇを例１０に記載の
ようにヒトインシュリンへ転化する。ＨＰＬＣがら判断
されるようにヒトインシュリンの全収率は４８％であっ
た。他の生成物は、Ｌｙｓ−Ａｏ−インシュリン（４２
％）、Ｄｅｓ−８３０−インシュリン（９％）および少
量の非同定化成分（１％）として同定された。
シュリンへの転化（一段階法） Ｂ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａ １０＋ｇを例１０に記載の
ようにヒトインシュリンへ転化する。ＨＰＬＣがら判断
されるようにヒトインシュリンの全収率は４８％であっ
た。他の生成物は、Ｌｙｓ−Ａｏ−インシュリン（４２
％）、Ｄｅｓ−８３０−インシュリン（９％）および少
量の非同定化成分（１％）として同定された。
例１３ ： Ｂ −Ｌｙｓ −Ａｒｇ −Ａから調製さ
れたヒトインシュリンの結晶化 ヒトインシュリンを例１１に記載のように調製し、次の
分析により特性決定を行なった：ａ）ヒトインシュリン
は、尿素含有ポリアクリルアミドゲルにおいて塩基性デ
ィスク電気泳動で１つのバンドのみを示す（シュリッヒ
トクルールら＊ Ｈｏｒｍ、 Ｍｅｔａｂｏｌ、 Ｒｅ
ｓ、、 ５ｕｐｐｌ＋Ｓｅｒ、 ５（１９７４） １３
４−１４３）。バンドは膵臓ヒトインシュリンとして移
動する。
れたヒトインシュリンの結晶化 ヒトインシュリンを例１１に記載のように調製し、次の
分析により特性決定を行なった：ａ）ヒトインシュリン
は、尿素含有ポリアクリルアミドゲルにおいて塩基性デ
ィスク電気泳動で１つのバンドのみを示す（シュリッヒ
トクルールら＊ Ｈｏｒｍ、 Ｍｅｔａｂｏｌ、 Ｒｅ
ｓ、、 ５ｕｐｐｌ＋Ｓｅｒ、 ５（１９７４） １３
４−１４３）。バンドは膵臓ヒトインシュリンとして移
動する。
ｂ）Ｚｎ”の存在下でヒトインシュリンを結晶化するこ
とにより、一定形状の斜方六面体結晶が得られる（シュ
リッヒトクルール、 Ａｃｔａ ＣｈｅＩｌ。
とにより、一定形状の斜方六面体結晶が得られる（シュ
リッヒトクルール、 Ａｃｔａ ＣｈｅＩｌ。
５ｃａｎｄ、 １０（１９５６） １４５９−１４６４
に記載の方法）。
に記載の方法）。
Ｃ）ヒトインシュリンの生物学的活性をマウスの血糖消
耗試験で測定する。評価された効力は、インシュリンに
ついての第４回国際標準（ｔｈｅ４ｔｈ Ｉｎｔｅｒｎ
ａｔｉｏｎａｌ ５ｔａｎｄａｒｄ）を用いると２８．
１１、Ｕ、／■（ｐ Ｏ，０５信頬限界； ２５．７−
３０．７１．Ｕ、 ／■）であった。
耗試験で測定する。評価された効力は、インシュリンに
ついての第４回国際標準（ｔｈｅ４ｔｈ Ｉｎｔｅｒｎ
ａｔｉｏｎａｌ ５ｔａｎｄａｒｄ）を用いると２８．
１１、Ｕ、／■（ｐ Ｏ，０５信頬限界； ２５．７−
３０．７１．Ｕ、 ／■）であった。
ｄ）ヒトインシュリンのアミノ酸組成を、６ ＮＨＣｌ
中で２４時間、４８時間および９６時間１１０℃で加水
分解後に測定し、ＴＨｒ、 Ｓｅｔ、 ＰｒｏおよびＮ
Ｏ３についての値を直線状回帰線（１＝０）により測定
する。Ｖａｌとｌｉｅの値が加水分解の不明確な時間へ
外挿される。１／２Ｃｙｓの値を４Ｍメタンスルホン酸
中で２４時間加水分解後に測定する。アミノ酸組成を表
８に記す。
中で２４時間、４８時間および９６時間１１０℃で加水
分解後に測定し、ＴＨｒ、 Ｓｅｔ、 ＰｒｏおよびＮ
Ｏ３についての値を直線状回帰線（１＝０）により測定
する。Ｖａｌとｌｉｅの値が加水分解の不明確な時間へ
外挿される。１／２Ｃｙｓの値を４Ｍメタンスルホン酸
中で２４時間加水分解後に測定する。アミノ酸組成を表
８に記す。
以下余白
図１は式■で表わされるインシュリン前駆体の構成を示
す模式図、 図２はプラスミドｐＭＴ ５７９の調製を示す模式図、
図３はプラスミドｐＭＴ ５８５の調製を示す模式図、
図４はプラスミドｐＭＴ ６４４の調製を示す模式図、
図５はプラスミドｐＭＴ ６１１の調製を示す模式図、
図６はプラスミドｐＭ７６５０の調製を示す模式図、図
７はプラスミドｐＭ７６５８の調製を示す模式図、およ
び 図８はＢ −Ｌｙｓ −Ａｒｇ −Ａのヒトインシュリ
ンへのインビトロ転化を逆相高圧液体クロマトグラフィ
ーにより測定した結果を示すグラフである。 以下余白
す模式図、 図２はプラスミドｐＭＴ ５７９の調製を示す模式図、
図３はプラスミドｐＭＴ ５８５の調製を示す模式図、
図４はプラスミドｐＭＴ ６４４の調製を示す模式図、
図５はプラスミドｐＭＴ ６１１の調製を示す模式図、
図６はプラスミドｐＭ７６５０の調製を示す模式図、図
７はプラスミドｐＭ７６５８の調製を示す模式図、およ
び 図８はＢ −Ｌｙｓ −Ａｒｇ −Ａのヒトインシュリ
ンへのインビトロ転化を逆相高圧液体クロマトグラフィ
ーにより測定した結果を示すグラフである。 以下余白
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、次式 I ： Ｂ−Ｘ−Ｙ−Ａ（ I ） （式中、ＢおよびＡはヒトインシュリンにおけるように
架橋結合したヒトインシュリンのＢ鎖およびＡ鎖であり
、ＸおよびＹはそれぞれリシンまたはアルギニンである
。）で表わされるヒトインシュリン前駆体。 ２、Ｂ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａである特許請求の範囲第１
項記載のヒトインシュリン前駆体。 ３、Ｂ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａである特許請求の範囲第１
項記載のヒトインシュリン前駆体。 ４、Ｂ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａである特許請求の範囲第１
項記載のヒトインシュリン前駆体。 ５、Ｂ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａである特許請求の範囲第１
項記載のヒトインシュリン前駆体。 ６、次式 I ： Ｂ−Ｘ−Ｙ−Ａ（ I ） （式中、ＢおよびＡはヒトインシュリンにおけるように
架橋結合したヒトインシュリンのＢ鎖およびＡ鎖であり
、ＸおよびＹはそれぞれリシンまたはアルギニンである
。）で表わされるヒトインシュリン前駆体をコードする
配列からなるＤＮＡ配列。 ７、酵母において特許請求の範囲第６項記載のＤＮＡ配
列を発現しうる複製可能な発現ビヒクル。 ８、次式： Ｂ−Ｘ−Ｙ−Ａ（ I ） （式中、ＢおよびＡはヒトインシュリンにおけるように
架橋結合したヒトインシュリンのＢ鎖およびＡ鎖であり
、ＸおよびＹはそれぞれリシンまたはアルギニンである
。）で表わされるヒトインシュリン前駆体をコードする
ＤＮＡ配列を含む発現ビヒクルを適当な培養基で培養し
、インシュリン前駆体を培養基から回収することからな
る前記式 I で表わされるヒトインシュリン前駆体の製
法。 ９、次式 I ： Ｂ−Ｘ−Ｙ−Ａ（ I ） （式中、ＢおよびＡはヒトインシュリンにおけるように
架橋結合したヒトインシュリンのＢ鎖およびＡ鎖であり
、ＸおよびＹはそれぞれリシンまたはアルギニンである
。）で表わされるヒトインシュリン前駆体をコードする
ＤＮＡ配列を含む発現ビヒクルで形質転換された酵母株
を適当な培養基で培養し、インシュリン前駆体を培養基
から回収し、酵素処理によりヒトインシュリンへ転化す
ることからなるヒトインシュリンの製法。 １０、次式 I ： Ｂ−Ｘ−Ｙ−Ａ（ I ） （式中、ＢおよびＡはヒトインシュリンにおけるように
架橋結合したヒトインシュリンのＢ鎖およびＡ鎖であり
、ＸおよびＹはそれぞれリシンまたはアルギニンである
。）で表わされるインシュリン前駆体の水溶液をトリプ
シンとカルボキシプペチダーゼＢで処理し、その後該溶
液からヒトインシュリンを回収することからなる前記式
I で表わされるインシュリン前駆体をヒトインシュリ
ンへ酵素的に転化する方法。 １１、トリプシンとカルボキシペプチダーゼＢを用いた
一段階二元酵素処理からなる特許請求の範囲第１０項記
載の方法。 １２、トリプシンでインシュリン前駆体を処理しその後
反応生成物をカルボキシペプチダーゼＢで処理すること
からなる特許請求の範囲第１０項記載の方法。 １３、トリプシン処理をｐＨ１１〜１２の範囲で行なう
特許請求の範囲第１２項記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DK1293/85 | 1985-03-22 | ||
| DK129385A DK129385A (da) | 1985-03-22 | 1985-03-22 | Peptider og fremstilling deraf |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5121394A Division JPH088871B2 (ja) | 1985-03-22 | 1993-05-24 | インシュリン前駆体をコードするｄｎａ配列 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61221200A true JPS61221200A (ja) | 1986-10-01 |
| JPH0648993B2 JPH0648993B2 (ja) | 1994-06-29 |
Family
ID=8103207
Family Applications (3)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61060995A Expired - Lifetime JPH0648993B2 (ja) | 1985-03-22 | 1986-03-20 | インシュリンの製造方法 |
| JP5121394A Expired - Lifetime JPH088871B2 (ja) | 1985-03-22 | 1993-05-24 | インシュリン前駆体をコードするｄｎａ配列 |
| JP7178875A Expired - Lifetime JP2553326B2 (ja) | 1985-03-22 | 1995-07-14 | インシュリン前駆体をコードするｄｎａ配列 |
Family Applications After (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5121394A Expired - Lifetime JPH088871B2 (ja) | 1985-03-22 | 1993-05-24 | インシュリン前駆体をコードするｄｎａ配列 |
| JP7178875A Expired - Lifetime JP2553326B2 (ja) | 1985-03-22 | 1995-07-14 | インシュリン前駆体をコードするｄｎａ配列 |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0195691B1 (ja) |
| JP (3) | JPH0648993B2 (ja) |
| AT (1) | ATE69266T1 (ja) |
| AU (1) | AU586855B2 (ja) |
| CA (1) | CA1340823C (ja) |
| DE (1) | DE3682303D1 (ja) |
| DK (1) | DK129385A (ja) |
| ES (2) | ES8802402A1 (ja) |
| FI (1) | FI87801C (ja) |
| GR (1) | GR860764B (ja) |
| IE (1) | IE58842B1 (ja) |
| MX (1) | MX163837B (ja) |
| NO (1) | NO172646C (ja) |
| NZ (1) | NZ215570A (ja) |
| PT (1) | PT82241B (ja) |
| ZA (1) | ZA861953B (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0285298A (ja) * | 1988-06-23 | 1990-03-26 | Hoechst Ag | ミニ‐プロインシュリン、その製造および使用 |
| JP2006520384A (ja) * | 2003-03-14 | 2006-09-07 | ノベックス・コーポレイション | インスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲート、プロインスリンポリペプチド−オリゴマーコンジュゲートおよびこれらの合成方法 |
| JP2019530473A (ja) * | 2016-09-06 | 2019-10-24 | ケミカル アンド バイオファーマスーティカル ラボラトリーズ オブ パトラ エス．エー．Ｃｈｅｍｉｃａｌ ＆ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｏｆ Ｐａｔｒａｓ Ｓ．Ａ． | プロインスリン誘導体 |
Families Citing this family (37)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DK58285D0 (da) * | 1984-05-30 | 1985-02-08 | Novo Industri As | Peptider samt fremstilling og anvendelse deraf |
| EP0208418B1 (en) * | 1985-06-12 | 1991-10-30 | Lubrizol Genetics Inc. | Modified zein |
| PH25772A (en) * | 1985-08-30 | 1991-10-18 | Novo Industri As | Insulin analogues, process for their preparation |
| DK437786D0 (da) * | 1986-09-12 | 1986-09-12 | Nordisk Gentofte | Insulinprecursorer |
| US5426036A (en) * | 1987-05-05 | 1995-06-20 | Hoechst Aktiengesellschaft | Processes for the preparation of foreign proteins in streptomycetes |
| DE3837271A1 (de) * | 1988-11-03 | 1990-05-10 | Hoechst Ag | Verfahren zur selektiven spaltung von fusionsproteinen |
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