JPH0648993B2 - インシュリンの製造方法 - Google Patents
インシュリンの製造方法Info
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- JPH0648993B2 JPH0648993B2 JP61060995A JP6099586A JPH0648993B2 JP H0648993 B2 JPH0648993 B2 JP H0648993B2 JP 61060995 A JP61060995 A JP 61060995A JP 6099586 A JP6099586 A JP 6099586A JP H0648993 B2 JPH0648993 B2 JP H0648993B2
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- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
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- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
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- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は生合成インシュリン前駆体からのヒトインシュ
リンの調製に関する。
リンの調製に関する。
ヒトインシュリンは２つのペプチド鎖、すなわち２１個
のアミノ酸残基を含むＡ鎖と３０個のアミノ酸残基を含
むＢ鎖からなる。Ａ鎖とＢ鎖は、それぞれＡ７とＢ７お
よびＡ２０とＢ１９のシスティニル基を結ぶ２つのジス
ルフィド橋により一緒に結合している。第三のジスルフ
ィド橋がＡ６とＡ１１のシスティニル基の間に形成され
る。
のアミノ酸残基を含むＡ鎖と３０個のアミノ酸残基を含
むＢ鎖からなる。Ａ鎖とＢ鎖は、それぞれＡ７とＢ７お
よびＡ２０とＢ１９のシスティニル基を結ぶ２つのジス
ルフィド橋により一緒に結合している。第三のジスルフ
ィド橋がＡ６とＡ１１のシスティニル基の間に形成され
る。
ヒトインシュリンはプレプロインシュリンの形で膵臓に
おいてインビボ生産される。プレプロインシュリンは、
２４個のアミノ酸残基のプレペプチドとこれに続く８６
個のアミノ酸残基とからなり、次の構成：プレペプチド
−Ｂ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｃ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａ（Ｃは
３１個のアミノ酸残基のＣ−ペプチドである）を有する
ものである。
おいてインビボ生産される。プレプロインシュリンは、
２４個のアミノ酸残基のプレペプチドとこれに続く８６
個のアミノ酸残基とからなり、次の構成：プレペプチド
−Ｂ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｃ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａ（Ｃは
３１個のアミノ酸残基のＣ−ペプチドである）を有する
ものである。
小島細胞からの排出の間、プレペプチドが開裂除去し次
いでプロインシュリンはジスルフィドが折りたたまれて
ジスルフィド橋を形成する構造となる。Ｃ−ペプチド
は、次いでタンパク質加水分解で削除され成熟したヒト
インシュリンになる。
いでプロインシュリンはジスルフィドが折りたたまれて
ジスルフィド橋を形成する構造となる。Ｃ−ペプチド
は、次いでタンパク質加水分解で削除され成熟したヒト
インシュリンになる。
幾つかの試みがインシュリン製造、特に組換えＤＮＡ技
術を用いたヒトインシュリンの製造についてなされてき
た。ヨーロッパ特許出願公開第００５５９４５Ａ号で
は、大腸菌からのプロインシュリンまたはミニプロイン
シュリンの調製が記載されている。この方法は、キメラ
ポリペプチドの発現、このキメラポリペプチドのインビ
トロ開裂およびＡ鎖−Ｂ鎖間のジスフィド結合のインビ
トロ形成とＡ鎖−Ｂ鎖間の橋かけ鎖の削除によりヒトイ
ンシュリンを得ることからなる。ヨーロッパ特許出願公
開第６８７０１号には、大腸菌の形質転換によりいくら
か短かくしたＣ−ペプチドで変性されたプロインシュリ
ンの調製が提案されている。
術を用いたヒトインシュリンの製造についてなされてき
た。ヨーロッパ特許出願公開第００５５９４５Ａ号で
は、大腸菌からのプロインシュリンまたはミニプロイン
シュリンの調製が記載されている。この方法は、キメラ
ポリペプチドの発現、このキメラポリペプチドのインビ
トロ開裂およびＡ鎖−Ｂ鎖間のジスフィド結合のインビ
トロ形成とＡ鎖−Ｂ鎖間の橋かけ鎖の削除によりヒトイ
ンシュリンを得ることからなる。ヨーロッパ特許出願公
開第６８７０１号には、大腸菌の形質転換によりいくら
か短かくしたＣ−ペプチドで変性されたプロインシュリ
ンの調製が提案されている。
上記方法は、主として、大腸菌を形質転換微生物として
使用するという事実に由来する幾つかの欠点を有する。
発現産物は細胞から分泌されるだけでなく大腸菌宿主微
生物において細胞内に蓄積される。しかしながら、プレ
プロインシュリンまたは変性されたプレプロインシュリ
ン型の発現したポリペプチド産物の蓄積は、発現産物の
酵素分解の危険性を増加する。さらに、プロセッシン
グ、折りたたみおよびジスルフィド橋の確立は明らかに
インビトロで行なわねばならない。
使用するという事実に由来する幾つかの欠点を有する。
発現産物は細胞から分泌されるだけでなく大腸菌宿主微
生物において細胞内に蓄積される。しかしながら、プレ
プロインシュリンまたは変性されたプレプロインシュリ
ン型の発現したポリペプチド産物の蓄積は、発現産物の
酵素分解の危険性を増加する。さらに、プロセッシン
グ、折りたたみおよびジスルフィド橋の確立は明らかに
インビトロで行なわねばならない。
哺乳動物ポリペプチドの発現に対しより都合の良い系は
真核生物細胞であると思われ、真核生物特に酵母におい
て外来遺伝子を発現させる幾つかの試みがなされてき
た。酵母におけるインターフェロンの発現はヨーロッパ
特許出願公開第００６００５７Ａ号に記載され、酵母と
異種のタンパク質の酵母における発現と分泌はヨーロッ
パ特許出願公開第００８８６３２Ａ号、同第００６２０
１Ａ号および同第０１２３５４４Ａ号に記載されてい
る。
真核生物細胞であると思われ、真核生物特に酵母におい
て外来遺伝子を発現させる幾つかの試みがなされてき
た。酵母におけるインターフェロンの発現はヨーロッパ
特許出願公開第００６００５７Ａ号に記載され、酵母と
異種のタンパク質の酵母における発現と分泌はヨーロッ
パ特許出願公開第００８８６３２Ａ号、同第００６２０
１Ａ号および同第０１２３５４４Ａ号に記載されてい
る。
酵母における“プレ”−プロインシュリンの発現方法お
よび発現した“プレ”−プロインシュリンのプロセッシ
ングと分泌方法はヨーロッパ特許出願公開第０１２１８
８４Ａ号に記載されている。しかしながら、プロインシ
ュリン型のインシュリン前駆体は酵母において酵素分解
を受けやすく、その結果、もしあるとしても分泌された
プロインシュリンまたは成熟インシュリンが非常に低い
収率で得られるだけであるということが出願人により示
されている。酵母においてはヒトプロインシュリンおよ
びいくらか短かくしたＣ−ペプチドを有するプロインシ
ュリン類似物がＣ−ペプチド領域の側方に位置する２つ
の二塩基性配列で酵素分解を特に受けやすいということ
が示されている。明らかにこれらの開裂はＳ−Ｓ橋の確
立前に生じ、その結果、Ｃ−ペプチド、Ａ鎖およびＢ鎖
が形成される。
よび発現した“プレ”−プロインシュリンのプロセッシ
ングと分泌方法はヨーロッパ特許出願公開第０１２１８
８４Ａ号に記載されている。しかしながら、プロインシ
ュリン型のインシュリン前駆体は酵母において酵素分解
を受けやすく、その結果、もしあるとしても分泌された
プロインシュリンまたは成熟インシュリンが非常に低い
収率で得られるだけであるということが出願人により示
されている。酵母においてはヒトプロインシュリンおよ
びいくらか短かくしたＣ−ペプチドを有するプロインシ
ュリン類似物がＣ−ペプチド領域の側方に位置する２つ
の二塩基性配列で酵素分解を特に受けやすいということ
が示されている。明らかにこれらの開裂はＳ−Ｓ橋の確
立前に生じ、その結果、Ｃ−ペプチド、Ａ鎖およびＢ鎖
が形成される。
本発明の目的は、Ａ部分とＢ部分の間に正しく位置した
ジスルフィド橋を有しながら酵母において高収率で発生
し、ヒトインシュリンへ容易に転化されうるインシュリ
ン前駆体を提供するものである。
ジスルフィド橋を有しながら酵母において高収率で発生
し、ヒトインシュリンへ容易に転化されうるインシュリ
ン前駆体を提供するものである。
プロインシュリン型の幾つかのインシュリン前駆体（プ
ロインシュリンを含む）が研究されてきている（表１参
照）。当該前駆体をコードするＤＮＡ配列を酵母ベクタ
ー系へ挿入し、上記の技術および後述する技術にしたが
って酵母へ形質転換する。インシュリン前駆体をコード
する遺伝子は、前駆体遺伝子の上流側で融合する酵母識
別性分泌シグナルおよびプロセッシングシグナルをコー
ドするＤＮＡ配列を有する。この研究において、リーダ
ーの最後の４つの残基（Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌ
ａ）をコードする部分を除去した変性ＭＦα１リーダー
配列が用いられる。変性されたＭＦα１リーダーはプロ
セッシングシグナルとして二塩基性配列Ｌｙｓ−Ａｒｇ
を含み、これが次に前駆体をコードする遺伝子の５′−
末端と融合する。全ての構築においてリーダー配列が開
裂除去され、すなわち全てのインシュリン前駆体遺伝子
の上流の二塩基性配列Ｌｙｓ−Ａｒｇで開裂が生じるこ
とが見い出された。しかしながら、Ｃ−ペプチドまたは
変性されたＣ−ペプチドの測方に位置する２つの二塩基
性配列を含むすべてのインシュリン前駆体構築物におい
て、正しくジスルフィド橋が位置する以前に両方の二塩
基性部位でプロセッシングが見られ、発酵液から一本鎖
の非プロセス前駆体分子が単離されなかった。したがっ
て酵母はプロインシュリン型のインシュリン前駆体製造
用発現型系とし使用することができない。
ロインシュリンを含む）が研究されてきている（表１参
照）。当該前駆体をコードするＤＮＡ配列を酵母ベクタ
ー系へ挿入し、上記の技術および後述する技術にしたが
って酵母へ形質転換する。インシュリン前駆体をコード
する遺伝子は、前駆体遺伝子の上流側で融合する酵母識
別性分泌シグナルおよびプロセッシングシグナルをコー
ドするＤＮＡ配列を有する。この研究において、リーダ
ーの最後の４つの残基（Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌ
ａ）をコードする部分を除去した変性ＭＦα１リーダー
配列が用いられる。変性されたＭＦα１リーダーはプロ
セッシングシグナルとして二塩基性配列Ｌｙｓ−Ａｒｇ
を含み、これが次に前駆体をコードする遺伝子の５′−
末端と融合する。全ての構築においてリーダー配列が開
裂除去され、すなわち全てのインシュリン前駆体遺伝子
の上流の二塩基性配列Ｌｙｓ−Ａｒｇで開裂が生じるこ
とが見い出された。しかしながら、Ｃ−ペプチドまたは
変性されたＣ−ペプチドの測方に位置する２つの二塩基
性配列を含むすべてのインシュリン前駆体構築物におい
て、正しくジスルフィド橋が位置する以前に両方の二塩
基性部位でプロセッシングが見られ、発酵液から一本鎖
の非プロセス前駆体分子が単離されなかった。したがっ
て酵母はプロインシュリン型のインシュリン前駆体製造
用発現型系とし使用することができない。
驚くべきことに、ここにおいて、ヒトインシュリンのＡ
鎖とＢ鎖を１つの二塩基性配列でのみ結合したとき（表
１の構築物７−１０）、酵母において二塩基性配列での
開裂が起こらず、ジスルフィド橋が正しく位置した一本
鎖インシュリン前駆体が当該インシュリン前駆体をコー
ドするＤＮＡ配列で形質転換された酵母株から発酵液中
で高収率にて得られるということが見い出された。本発
明は、前駆体をコードする遺伝子の上流に位置するリー
ダー配列でＬｙｓ−Ａｒｇでの完全開裂が見られるの
で、より一層驚くべきものであろう。
鎖とＢ鎖を１つの二塩基性配列でのみ結合したとき（表
１の構築物７−１０）、酵母において二塩基性配列での
開裂が起こらず、ジスルフィド橋が正しく位置した一本
鎖インシュリン前駆体が当該インシュリン前駆体をコー
ドするＤＮＡ配列で形質転換された酵母株から発酵液中
で高収率にて得られるということが見い出された。本発
明は、前駆体をコードする遺伝子の上流に位置するリー
ダー配列でＬｙｓ−Ａｒｇでの完全開裂が見られるの
で、より一層驚くべきものであろう。
Ａ鎖とＢ鎖の間に１つの二塩基性配列を含むこの種のイ
ンシュリン前駆体は後述するようにインビトロ消化によ
りヒトインシュリンへ簡単に転化することができるの
で、本発明はヒトインシュリン製造のための経済的に魅
力のある方法を提供するものである。
ンシュリン前駆体は後述するようにインビトロ消化によ
りヒトインシュリンへ簡単に転化することができるの
で、本発明はヒトインシュリン製造のための経済的に魅
力のある方法を提供するものである。
第一に、本発明は、次式Ｉ： Ｂ−Ｘ−Ｙ−Ａ （Ｉ） （式中、ＢおよびＡはヒトインシュリンにおけるように
架橋結合したヒトインシュリンのＢ鎖およびＡ鎖であ
り、ＸおよびＹはそれぞれリシンまたはアルギニン残基
を表わす。）で表わされる新規インシュリン前駆体を提
供するものである。
架橋結合したヒトインシュリンのＢ鎖およびＡ鎖であ
り、ＸおよびＹはそれぞれリシンまたはアルギニン残基
を表わす。）で表わされる新規インシュリン前駆体を提
供するものである。
上記式（Ｉ）のインシュリン前駆体は、Ｂ−Ｌｙｓ−Ｌ
ｙｓ−Ａ、Ｂ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａ、Ｂ−Ａｒｇ−Ｌｙ
ｓ−ＡおよびＢ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａであり、最初の２
つが最も好ましい。
ｙｓ−Ａ、Ｂ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａ、Ｂ−Ａｒｇ−Ｌｙ
ｓ−ＡおよびＢ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａであり、最初の２
つが最も好ましい。
本発明の第二の点によれば、酵母における前記インシュ
リン前駆体の製造方法を提供するものであり、この方法
により、インシュリン前駆体をコードするＤＮＡ配列か
らなる発現ビヒクルを適当な培養基で培養し、この培養
基からインシュリン前駆体を回収する。
リン前駆体の製造方法を提供するものであり、この方法
により、インシュリン前駆体をコードするＤＮＡ配列か
らなる発現ビヒクルを適当な培養基で培養し、この培養
基からインシュリン前駆体を回収する。
このように形質転換された酵母株を培養すると、本発明
による４つのインシュリン前駆体の全てが高収率で培養
液から単離され、特にＢ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−ＡとＢ−Ｌ
ｙｓ−Ａｒｇ−Ａが高収率で発現する。したがって、発
現レベルの点から、これら２つの前駆体が好ましいもの
であろう。
による４つのインシュリン前駆体の全てが高収率で培養
液から単離され、特にＢ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−ＡとＢ−Ｌ
ｙｓ−Ａｒｇ−Ａが高収率で発現する。したがって、発
現レベルの点から、これら２つの前駆体が好ましいもの
であろう。
発現産物を単離し、インシュリン免疫反応性物質（ＩＲ
Ｉ−ペプチド）を精製し、そして微量配列分析により特
性を決定した。上記式（Ｉ）の前駆体が、３つのジスル
フィド橋により次の1/2システイン残基：Ａ６−Ａ１
１、Ａ７−Ｂ７、Ａ２０−Ｂ１９が連結された一本鎖分
子であること、すなわち酵母においてヒトインシュリン
と比較してジスルフィド橋を正しい位置に有する前駆体
が発現することが見い出された。新規インシュリン前駆
体の構造を図１に示す。
Ｉ−ペプチド）を精製し、そして微量配列分析により特
性を決定した。上記式（Ｉ）の前駆体が、３つのジスル
フィド橋により次の1/2システイン残基：Ａ６−Ａ１
１、Ａ７−Ｂ７、Ａ２０−Ｂ１９が連結された一本鎖分
子であること、すなわち酵母においてヒトインシュリン
と比較してジスルフィド橋を正しい位置に有する前駆体
が発現することが見い出された。新規インシュリン前駆
体の構造を図１に示す。
本発明はさらに、酵母宿主において上記インシュリン前
駆体を効率良く製造するためならびに栄養培地へこの前
駆体を分泌するための新規発現ビヒクルを提供するもの
である。発現ビヒクルは、酵母宿主において安定に維持
される複製系、上記式（Ｉ）のインシュリン前駆体をコ
ードするＤＮＡ配列およびプロモーターならびにターミ
ネーター配列からなる。
駆体を効率良く製造するためならびに栄養培地へこの前
駆体を分泌するための新規発現ビヒクルを提供するもの
である。発現ビヒクルは、酵母宿主において安定に維持
される複製系、上記式（Ｉ）のインシュリン前駆体をコ
ードするＤＮＡ配列およびプロモーターならびにターミ
ネーター配列からなる。
発現ビヒクルは、所望産物をコードするＤＮＡ配列の上
流に、発現産物を酵母分泌系へ向けさせそして増殖培地
へ発現産物を分泌するのを確実にする予備領域(preregi
on)を含んでもよい。この予備領域は、分泌をもたらす
天然産生シグナルもしくはリーダーペプチドまたは合成
配列であってよく、一般に、分泌の間所望産物から開裂
し培養液からただちに単離される成熟産物を残す。
流に、発現産物を酵母分泌系へ向けさせそして増殖培地
へ発現産物を分泌するのを確実にする予備領域(preregi
on)を含んでもよい。この予備領域は、分泌をもたらす
天然産生シグナルもしくはリーダーペプチドまたは合成
配列であってよく、一般に、分泌の間所望産物から開裂
し培養液からただちに単離される成熟産物を残す。
酵母に対し、非常に適したリーダー配列は酵母MFα１リ
ーダー配列である〔クルジャン，ジェイ．(Kurjan,J.)
とヘルスコウィッツ，アイ．(Herskowitz,I.)、Ｃｅｌ
ｌ ３０、（１９８２）、９３３−９４３〕。
ーダー配列である〔クルジャン，ジェイ．(Kurjan,J.)
とヘルスコウィッツ，アイ．(Herskowitz,I.)、Ｃｅｌ
ｌ ３０、（１９８２）、９３３−９４３〕。
発現ビヒクルは宿主微生物中で複製しうるプラスミドま
たは宿主微生物染色体へ組込まれうるプラスミドでよ
い。使用するビヒクルは、それぞれ選択的開裂部位によ
り分離された所望ＤＮＡ配列の繰り返し配列の発現をコ
ードする。
たは宿主微生物染色体へ組込まれうるプラスミドでよ
い。使用するビヒクルは、それぞれ選択的開裂部位によ
り分離された所望ＤＮＡ配列の繰り返し配列の発現をコ
ードする。
所望ＤＮＡ配列の発現は所望産物をコードするＤＮＡ配
列に正しく位置するプロモーター配列の制御下であり、
この結果宿主微生物に所望産物が発現する。酵母宿主固
有の遺伝子からのプロモーターを使用するのが好まし
く、たとえばＴＰＩ（トリオース ホスフェート イソ
メラーゼ）遺伝子のプロモーターまたはMFα１−プロモ
ーターである。
列に正しく位置するプロモーター配列の制御下であり、
この結果宿主微生物に所望産物が発現する。酵母宿主固
有の遺伝子からのプロモーターを使用するのが好まし
く、たとえばＴＰＩ（トリオース ホスフェート イソ
メラーゼ）遺伝子のプロモーターまたはMFα１−プロモ
ーターである。
所望産物のＤＮＡ配列の後には転写終結配列が続く。こ
の転写終結配列は、好ましくは、酵母宿主に固有の遺伝
子からのもの、たとえばＴＰＩ−遺伝子またはMFα１遺
伝子のターミネーターである。
の転写終結配列は、好ましくは、酵母宿主に固有の遺伝
子からのもの、たとえばＴＰＩ−遺伝子またはMFα１遺
伝子のターミネーターである。
本発明はまた上記式（Ｉ）のインシュリン前駆体をコー
ドする新規合成ＤＮＡ配列を提供するものである。新規
ＤＮＡ配列は化学的に合成された３０量体オリゴヌクレ
オチドを用いてヒトプロインシュリン遺伝子をインビト
ロでの突然変異誘発でループアウト(loop out)し、もと
のＣ−ペプチドコード配列を欠失させることにより構築
される。
ドする新規合成ＤＮＡ配列を提供するものである。新規
ＤＮＡ配列は化学的に合成された３０量体オリゴヌクレ
オチドを用いてヒトプロインシュリン遺伝子をインビト
ロでの突然変異誘発でループアウト(loop out)し、もと
のＣ−ペプチドコード配列を欠失させることにより構築
される。
この型のインシュリン前駆体は、ケムラー(Kemmler)に
より記載されたプロインシュリンからインシュリンへの
インビトロ転化と同様の方法〔ケムラーら(Kemmler et
al.)、The Journal of Biological Chemistry、２４６
（１９７１）、６７８６−６７９１〕により、トリプシ
ンおよびカルボキシペプチダーゼＢを用いてインビトロ
消化により、ＸおよびＹアミノ酸残基を除去することに
よりヒトインシュリンへ転化されうる。
より記載されたプロインシュリンからインシュリンへの
インビトロ転化と同様の方法〔ケムラーら(Kemmler et
al.)、The Journal of Biological Chemistry、２４６
（１９７１）、６７８６−６７９１〕により、トリプシ
ンおよびカルボキシペプチダーゼＢを用いてインビトロ
消化により、ＸおよびＹアミノ酸残基を除去することに
よりヒトインシュリンへ転化されうる。
したがって本発明は、インシュリンを前駆体の水溶液を
トリプシンおよびカルボキシペプチダーゼＢで処理し、
その後ヒトインシュリン該溶液から回収することからな
る、上記式（Ｉ）で表わされるインシュリン前駆体を成
熟したヒトインシュリンへ酵素的に転化する方法を提供
するものである。
トリプシンおよびカルボキシペプチダーゼＢで処理し、
その後ヒトインシュリン該溶液から回収することからな
る、上記式（Ｉ）で表わされるインシュリン前駆体を成
熟したヒトインシュリンへ酵素的に転化する方法を提供
するものである。
酵素転化は、トリプシンとカルボキシペプチダーゼＢが
反応混合物中に同時に存在することによる一段階法で行
なってもよい。一段階反応はほぼ中性pHにて若干高めた
温度で行なわれるのが好ましい。ヒトインシュリンの収
率は約５０％である。より優れた収率は、Ｂ−Ｘ−Ａｒ
ｇ−Ａ型のインシュリン前駆体を二段階で転化すること
により得られる。このような二段階転化において、最初
の工程ではトリプシンを使用し、消化産物を単離し、続
いてカルボキシペプチダーゼＢで消化する。トリプシン
消化を高いpHたとえばpH１１〜１２の範囲でそして低温
（約４℃）で行なうことにより、ヒトインシュリンの総
収率は約８０％であった。高いpHでのトリプシン消化に
おける高収率を得るために、Ｂ３２に位置するアミド酸
残基（第１図参照）はアルギニンでなければならない
（式ＩにおいてＹ＝Ａｒｇ）。この基はいまだに主とし
て陽電荷に帯電し、トリプシン開裂を受けやすい。した
がって、酵母において高いレベルで発現し非常に高収率
でヒトインシュリンへ転化されるので前駆体Ｂ−Ｌｙｓ
−Ａｒｇ−Ａが最も好ましい前駆体であろう。
反応混合物中に同時に存在することによる一段階法で行
なってもよい。一段階反応はほぼ中性pHにて若干高めた
温度で行なわれるのが好ましい。ヒトインシュリンの収
率は約５０％である。より優れた収率は、Ｂ−Ｘ−Ａｒ
ｇ−Ａ型のインシュリン前駆体を二段階で転化すること
により得られる。このような二段階転化において、最初
の工程ではトリプシンを使用し、消化産物を単離し、続
いてカルボキシペプチダーゼＢで消化する。トリプシン
消化を高いpHたとえばpH１１〜１２の範囲でそして低温
（約４℃）で行なうことにより、ヒトインシュリンの総
収率は約８０％であった。高いpHでのトリプシン消化に
おける高収率を得るために、Ｂ３２に位置するアミド酸
残基（第１図参照）はアルギニンでなければならない
（式ＩにおいてＹ＝Ａｒｇ）。この基はいまだに主とし
て陽電荷に帯電し、トリプシン開裂を受けやすい。した
がって、酵母において高いレベルで発現し非常に高収率
でヒトインシュリンへ転化されるので前駆体Ｂ−Ｌｙｓ
−Ａｒｇ−Ａが最も好ましい前駆体であろう。
最後に、本発明は、前記式Ｉで表わされるインシュリン
前駆体をコードするＤＮＡ配列からなる複製可能な発現
ビヒクルで形質転換された酵母株を適当な栄養培地で培
養し、このインシュリン前駆体を培養基から回収したヒ
トインシュリンへ転化することからなるヒトインシュリ
ンの調製方法を提供するものである。
前駆体をコードするＤＮＡ配列からなる複製可能な発現
ビヒクルで形質転換された酵母株を適当な栄養培地で培
養し、このインシュリン前駆体を培養基から回収したヒ
トインシュリンへ転化することからなるヒトインシュリ
ンの調製方法を提供するものである。
本発明は説明したトリプシンとカルボキシペプチダーゼ
Ｂによる転化に限定されるものではない。同様な特異生
を有する他のインビトロ酵素系が見い出される場合には
このような酵素系も同様に使用されうる。
Ｂによる転化に限定されるものではない。同様な特異生
を有する他のインビトロ酵素系が見い出される場合には
このような酵素系も同様に使用されうる。
１．ヒトプロインシュリンＢ−Ｃ−Ａをコードする遺伝
子の調製ヒト膵臓から精製された総ＲＮＡ〔キルウィ
ン，ジェイ．エム．(Chirgwin,J.M.)、プルジビラ，エ
−．イ−．(Przybyla,A.E.)、マクドナルド，アール．
ジェイ．(McDonald,R.J.)とラッター，ダブリェ．ジェ
イ．(Rutter,W.J.)、Biochemistry 18.(1979)5294-529
9〕を、ＡＭＶ逆転写酵素と１．ストランドプライマー
としてｄ(GCTTTATTCCATCTCTC)を用いて逆転写する〔ベ
ール，イー．(Boel,E.)、ブースト，ジェイ．(Vuust,
J.)、ノリス，エフ．(Norris,F.)、ノリス，ケー．(Nor
ris,K.)、ウィンド，エー．(Wind,A.)、リーフェルド，
ジェイ．エフ．(Rehfeld,J.F.)とマーカー，ケー．エ
−．(Marcker,K.A.)、Proc.Matl.Acad.Sci.USA ８０、
（１９８３）、２８６６−２８６９）。ヒトプロインシ
ュリンｃＤＮＡを調製用尿素−ポリアクリルアミドゲル
精製した後、第二のストランドを、ＤＮＡポリメラーゼ
大分画と２．ストランドプライマーとしてd(CAGATCACTG
TCC)を用いてこのテンプレート上で合成する。Ｓ１ヌク
レアーゼ消化後、ヒトプロインシュリン ｄｓ．ｃＤＮ
Ａをポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製し、末
端にターミナルトランスフェラーゼを付け、大腸菌にお
いてpBR 327〔ソルベロンら(Sorberon et.a1)、Gene
９、（１９８０）、２８７−３０５〕のＰｓｔＩ部位で
クローンする。このプラスミドを有する正しいクローン
を、制限エンドヌクレアーゼ分析により組換え体から同
定し、ヌクレオチド配列決定により同定する〔マキサ
ム，エー．(Maxam,A.)とギルバート，ダブリュ．(Gilbe
rt,W.)、Methods in Enzymology.６５（１９８０）、４
９９−５６０．サンガー，エフ．(Sanger,F.)、ニクレ
ン，エス．(Nicklen,S.)とカウルソン，エー．アール．
(Coulson,A.R.)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、７４（１９
７７）、５４６３−５４６７〕。
子の調製ヒト膵臓から精製された総ＲＮＡ〔キルウィ
ン，ジェイ．エム．(Chirgwin,J.M.)、プルジビラ，エ
−．イ−．(Przybyla,A.E.)、マクドナルド，アール．
ジェイ．(McDonald,R.J.)とラッター，ダブリェ．ジェ
イ．(Rutter,W.J.)、Biochemistry 18.(1979)5294-529
9〕を、ＡＭＶ逆転写酵素と１．ストランドプライマー
としてｄ(GCTTTATTCCATCTCTC)を用いて逆転写する〔ベ
ール，イー．(Boel,E.)、ブースト，ジェイ．(Vuust,
J.)、ノリス，エフ．(Norris,F.)、ノリス，ケー．(Nor
ris,K.)、ウィンド，エー．(Wind,A.)、リーフェルド，
ジェイ．エフ．(Rehfeld,J.F.)とマーカー，ケー．エ
−．(Marcker,K.A.)、Proc.Matl.Acad.Sci.USA ８０、
（１９８３）、２８６６−２８６９）。ヒトプロインシ
ュリンｃＤＮＡを調製用尿素−ポリアクリルアミドゲル
精製した後、第二のストランドを、ＤＮＡポリメラーゼ
大分画と２．ストランドプライマーとしてd(CAGATCACTG
TCC)を用いてこのテンプレート上で合成する。Ｓ１ヌク
レアーゼ消化後、ヒトプロインシュリン ｄｓ．ｃＤＮ
Ａをポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製し、末
端にターミナルトランスフェラーゼを付け、大腸菌にお
いてpBR 327〔ソルベロンら(Sorberon et.a1)、Gene
９、（１９８０）、２８７−３０５〕のＰｓｔＩ部位で
クローンする。このプラスミドを有する正しいクローン
を、制限エンドヌクレアーゼ分析により組換え体から同
定し、ヌクレオチド配列決定により同定する〔マキサ
ム，エー．(Maxam,A.)とギルバート，ダブリュ．(Gilbe
rt,W.)、Methods in Enzymology.６５（１９８０）、４
９９−５６０．サンガー，エフ．(Sanger,F.)、ニクレ
ン，エス．(Nicklen,S.)とカウルソン，エー．アール．
(Coulson,A.R.)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、７４（１９
７７）、５４６３−５４６７〕。
ヒトプロインシュリンｃＤＮＡクローンの単離のために
使用される１．ストランドプライマーと２．ストランド
プライマーは、ポリスチレン支持体上でホホトリエステ
ルアプローチを用いて半自動的カラム合成により合成さ
れる〔エイチ．イトー(H.Ito)、ワイ．イケ（Y.Ike)、
エス．イカタ(S.Ikata)、とケイ．イタクラ(K.Itakur
a)、Nucleic Acids Research １０、（１９８２）、１
７５５−７６９〕。
使用される１．ストランドプライマーと２．ストランド
プライマーは、ポリスチレン支持体上でホホトリエステ
ルアプローチを用いて半自動的カラム合成により合成さ
れる〔エイチ．イトー(H.Ito)、ワイ．イケ（Y.Ike)、
エス．イカタ(S.Ikata)、とケイ．イタクラ(K.Itakur
a)、Nucleic Acids Research １０、（１９８２）、１
７５５−７６９〕。
２．Ｂ−Ｘ−Ｙ−Ａをコードする遺伝子の調製４つのイ
ンシュリン前駆体Ｂ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａ、Ｂ−Ｌｙｓ
−Ａｒｇ−Ａ、Ｂ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−ＡおよびＢ−Ａｒ
ｇ−Ａｒｇ−Ａをコードする遺伝子は、線状ヒトプロイ
ンシュリン配列Ｂ−Ｃ−Ａをコードする断片を環状の一
重らせんＭ−１３バクテリオファジベクターに挿入し、
ヒトプロインシュリン配列をそれぞれ化学的に合成され
た３０量体欠失プライマーKFN ４１、KFN ４、KFN
４２およびKFN １８と“万能(universal)”１５量体Ｍ
１３ジデオモシ配列プライマーで部位特異的突然変異
〔ケイ．ノリスら、Nucl.Acids.Pes.、１１（１９８
３）、５１０３−５１１２〕することにより作られる。
二重らせん制限分画(Xbal-Ecor1)を部分的二重らせん環
状ＤＮＡで切り離し、PUC１３またはpT５へ連結する。
大腸菌の形質転換および再形質転換により、所望の遺伝
子を含むプラスミドを有する形質転換体が同定される。
ンシュリン前駆体Ｂ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａ、Ｂ−Ｌｙｓ
−Ａｒｇ−Ａ、Ｂ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−ＡおよびＢ−Ａｒ
ｇ−Ａｒｇ−Ａをコードする遺伝子は、線状ヒトプロイ
ンシュリン配列Ｂ−Ｃ−Ａをコードする断片を環状の一
重らせんＭ−１３バクテリオファジベクターに挿入し、
ヒトプロインシュリン配列をそれぞれ化学的に合成され
た３０量体欠失プライマーKFN ４１、KFN ４、KFN
４２およびKFN １８と“万能(universal)”１５量体Ｍ
１３ジデオモシ配列プライマーで部位特異的突然変異
〔ケイ．ノリスら、Nucl.Acids.Pes.、１１（１９８
３）、５１０３−５１１２〕することにより作られる。
二重らせん制限分画(Xbal-Ecor1)を部分的二重らせん環
状ＤＮＡで切り離し、PUC１３またはpT５へ連結する。
大腸菌の形質転換および再形質転換により、所望の遺伝
子を含むプラスミドを有する形質転換体が同定される。
４つの突然変異欠失プライマーKFN ４、KFN １８、KF
N ４１およびKFN ４２は、自動ＤＮＡ合成機〔アプラ
イド バイオシステムズ(Applied Biosystems)３８０Ａ
型〕にて、ホスホロアミダイト化学と市販の試薬を用い
て合成される〔エス．エル．ビューケージ(S.L.Beaucag
e)とエム．エイチ．カルサース(M.H.Caruthers)（１９
８１）Tetrahedron Letters ２２、１８５９−１８６
９〕。変性状態下にポリアクリルアミドゲル電気泳動に
よりオリゴヌクレオチドを精製する。４つの切失プライ
マーは次のようである： ３．プラスミド構築 ヒトインシュリン前駆体をコードする遺伝子を、ＴＰＩ
プロモーター(TPIp)〔ティ．アルバー．(T.Alber)とジ
ィ．カワサキ(G.Kawasaki)Nucleotide Sequence of the
Triose Phosphate Isomerase Gene of Saccharomyces
cerevisiae、J.Mol. Applied Genet.1（１９８２）４１
９−４３４〕、MFα１リーダー配列〔ジェイ．クルジャ
ン〔J.Kurjan)とアイ．ヘルスコウイッツ(I.Herskowit
z)、structure of a Yeast Pheromone Gene (MFα):A P
utative α-Factor Precursor Contains four Tandem
Copies of Mature α-Factor.Cell ３０（１９８２）
９３３−９４３〕および酵母菌(S.cerevisiae)のＴＰＩ
からの転写ターミネータ配列TPITをコードする断片と組
合わせる。これらの断片(TPIT)は、インシュリン前駆体
をコードする遺伝子を高い割合で転写することのできる
配列をもたらし、ならびにインシュリン前駆体を分泌経
路へ局在化させおよび増殖培地への実際的排出を行ない
うる予備配列をももたらす。
N ４１およびKFN ４２は、自動ＤＮＡ合成機〔アプラ
イド バイオシステムズ(Applied Biosystems)３８０Ａ
型〕にて、ホスホロアミダイト化学と市販の試薬を用い
て合成される〔エス．エル．ビューケージ(S.L.Beaucag
e)とエム．エイチ．カルサース(M.H.Caruthers)（１９
８１）Tetrahedron Letters ２２、１８５９−１８６
９〕。変性状態下にポリアクリルアミドゲル電気泳動に
よりオリゴヌクレオチドを精製する。４つの切失プライ
マーは次のようである： ３．プラスミド構築 ヒトインシュリン前駆体をコードする遺伝子を、ＴＰＩ
プロモーター(TPIp)〔ティ．アルバー．(T.Alber)とジ
ィ．カワサキ(G.Kawasaki)Nucleotide Sequence of the
Triose Phosphate Isomerase Gene of Saccharomyces
cerevisiae、J.Mol. Applied Genet.1（１９８２）４１
９−４３４〕、MFα１リーダー配列〔ジェイ．クルジャ
ン〔J.Kurjan)とアイ．ヘルスコウイッツ(I.Herskowit
z)、structure of a Yeast Pheromone Gene (MFα):A P
utative α-Factor Precursor Contains four Tandem
Copies of Mature α-Factor.Cell ３０（１９８２）
９３３−９４３〕および酵母菌(S.cerevisiae)のＴＰＩ
からの転写ターミネータ配列TPITをコードする断片と組
合わせる。これらの断片(TPIT)は、インシュリン前駆体
をコードする遺伝子を高い割合で転写することのできる
配列をもたらし、ならびにインシュリン前駆体を分泌経
路へ局在化させおよび増殖培地への実際的排出を行ない
うる予備配列をももたらす。
発現プラスミドはさらに複製の酵母２μオリジン(origi
n)と選択性マーカーLEU2とからなる。
n)と選択性マーカーLEU2とからなる。
酵母におけるα−ファクターのインビボ成熟化の間、Ｌ
ｙｓ−Ａｒｇ−配列を識別するエンドペプチダーゼとＧ
Ｉｕ−Ａｌａ残基を除去するアミノジペプチダーゼの逐
次作用により〔ジュリウス．ディ．ら(Julius,D.et a
l.)Cell ３２（１９８３）８３９−８５２〕、α−フ
ァクター前駆体からMFαリーダーペプチドの最後（Ｃ−
末端）の６つのアミノ酸(Lys-Arg-Glu-Ala-Glu-Ala)を
除去する。酵母アミノジペプチダーゼの必要性を排際す
るために、MFα１リーダーのＣ−末端Ｇｌｕ−Ａｌａ−
Ｇｌｕ−Ａｌａをコードする配列をインビトロ突然変異
を経て除去する。
ｙｓ−Ａｒｇ−配列を識別するエンドペプチダーゼとＧ
Ｉｕ−Ａｌａ残基を除去するアミノジペプチダーゼの逐
次作用により〔ジュリウス．ディ．ら(Julius,D.et a
l.)Cell ３２（１９８３）８３９−８５２〕、α−フ
ァクター前駆体からMFαリーダーペプチドの最後（Ｃ−
末端）の６つのアミノ酸(Lys-Arg-Glu-Ala-Glu-Ala)を
除去する。酵母アミノジペプチダーゼの必要性を排際す
るために、MFα１リーダーのＣ−末端Ｇｌｕ−Ａｌａ−
Ｇｌｕ−Ａｌａをコードする配列をインビトロ突然変異
を経て除去する。
好ましい構築において、変性された発現単位は安定で高
いコピー数の酵母プラスミドCPOT(ATCC NO.３９６８
５）へ移される。これは増殖培地中でグルコースの存在
下により簡単に選択することができる。プラスミドCPOT
はベクターC1/1に基づくが、これは最初のpBR３２２ B
gl1-BamH1断片をpUC１３からの同様なBgl1-BamH1断片で
置換し続いてBamH1-Sal1断片としてS.pombe TPI遺伝子
(POT)を挿入してCPOTとする。C1/1はヨーロッパ特許出
願第０１０３４０９Ａ号に記載のようにpJDB ２４８
〔ベッグスら(Beggs et al)、Nature ２７５、１０４
−１０９（１９７８）〕から誘導される。
いコピー数の酵母プラスミドCPOT(ATCC NO.３９６８
５）へ移される。これは増殖培地中でグルコースの存在
下により簡単に選択することができる。プラスミドCPOT
はベクターC1/1に基づくが、これは最初のpBR３２２ B
gl1-BamH1断片をpUC１３からの同様なBgl1-BamH1断片で
置換し続いてBamH1-Sal1断片としてS.pombe TPI遺伝子
(POT)を挿入してCPOTとする。C1/1はヨーロッパ特許出
願第０１０３４０９Ａ号に記載のようにpJDB ２４８
〔ベッグスら(Beggs et al)、Nature ２７５、１０４
−１０９（１９７８）〕から誘導される。
４．形質転換 上記のように調製したプラスミドは、グルコース増殖を
選択することによりＴＰＩ遺伝子に欠失を有する酵母
(S.cerevsiae)株へ形質転換される。このような株は、
通常、単一の炭素源としてのグルコース増殖に不安定で
ありガラクトース乳酸培地で非常にゆっくり増殖する。
この欠陥はトリオースリン酸イソメラーゼ遺伝子におけ
る突然変異によるもので、この遺伝子の大部分を欠失さ
せ酵母(S.cerevsiae)LEU2遺伝子で再置換させることに
より得られうる。増殖欠失のために、ＴＰＩをコードす
る遺伝子を含むプラスミドに対し強い選択性がある。
選択することによりＴＰＩ遺伝子に欠失を有する酵母
(S.cerevsiae)株へ形質転換される。このような株は、
通常、単一の炭素源としてのグルコース増殖に不安定で
ありガラクトース乳酸培地で非常にゆっくり増殖する。
この欠陥はトリオースリン酸イソメラーゼ遺伝子におけ
る突然変異によるもので、この遺伝子の大部分を欠失さ
せ酵母(S.cerevsiae)LEU2遺伝子で再置換させることに
より得られうる。増殖欠失のために、ＴＰＩをコードす
る遺伝子を含むプラスミドに対し強い選択性がある。
５．酵母におけるインシュリン前駆体の発現 異なったインシュリン前駆体をコードするプラスミドを
含む酵母株をＹＤＤ培地〔シャーマン，エフ．ら(Sherm
an,F.et al)、Methods in Yeast Genetics、コールド
スプリング ハーバー ラボラトリィ(Cold Spring Har
bor Laboratory)１９８１〕で増殖する。それぞれの株
に対し、２のバッフルフラスコ中のそれぞれ１の２
つの培地を、６００ｎｍのＯＤが約１５に達する（約４
８時間）まで３０℃で振とうする。遠心分離後、上清を
別の分析のために除去する。免疫反応性インシュリン
（ＩＲＩ）を、構築物１−６に対する標準物として半合
成ヒトインシュリン〔ノボインダストリィ社NOVO Indus
tri A/C)〕を用いてラジオイムノアッセイ〔ヘディン
グ，エル．(Heding,L.) Diabetologia ８（１９７
２）、２６０−２６６〕により測定する。半合成ヒトイ
ンシュリンまたは当該インシュリン前駆体を構築物７−
１０として用いる。インシュリン前駆体、Ｂ−Ａｒｇ−
Ａｒｇ−Ｃ−ペプチド−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａ（ヒトプロ
インシュリン）に対し、免疫反応性Ｃ−ペプチド（ＩＲ
Ｃ）の発現レベルをヒトＣ−ペプチドラジオイムノアッ
セイ（ヘディング，エル．ジィ．Diabetologia １１、
（１９７５）５４１−５４８）を使用することにより測
定する。この分析において、１２５Ｉ−Ｔｙｒ−ヒト−
Ｃ−ペプチドをトレーサーとして用い、ヒトＣ−ペプチ
ドとヒトプロインシュリンとに全く同じに反応するモル
モットの抗−ヒト−Ｃ−ペプチド血清、Ｍ１２２８〔フ
ァーバー，オ−．ケイ．(Faber,O.K.)らHoppe Seyler's
Z.Physiol.Chem.３５７（１９７６）７５１−７５７〕
を抗体として用いる。ヒトプロインシュリンを標準物と
して用いる〔クルーセ，ブイ．ら（Ｋｒｕｓｅ，Ｖ．ｅ
ｔ ａｌ．）Diabetolgia２７、（１９８４）４１４−
４１５〕。形質転換酵母株の発酵液における免疫反応性
インシュリンと免疫反応性Ｃ−ペプチドの発現レベルを
表１にまとめる。
含む酵母株をＹＤＤ培地〔シャーマン，エフ．ら(Sherm
an,F.et al)、Methods in Yeast Genetics、コールド
スプリング ハーバー ラボラトリィ(Cold Spring Har
bor Laboratory)１９８１〕で増殖する。それぞれの株
に対し、２のバッフルフラスコ中のそれぞれ１の２
つの培地を、６００ｎｍのＯＤが約１５に達する（約４
８時間）まで３０℃で振とうする。遠心分離後、上清を
別の分析のために除去する。免疫反応性インシュリン
（ＩＲＩ）を、構築物１−６に対する標準物として半合
成ヒトインシュリン〔ノボインダストリィ社NOVO Indus
tri A/C)〕を用いてラジオイムノアッセイ〔ヘディン
グ，エル．(Heding,L.) Diabetologia ８（１９７
２）、２６０−２６６〕により測定する。半合成ヒトイ
ンシュリンまたは当該インシュリン前駆体を構築物７−
１０として用いる。インシュリン前駆体、Ｂ−Ａｒｇ−
Ａｒｇ−Ｃ−ペプチド−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａ（ヒトプロ
インシュリン）に対し、免疫反応性Ｃ−ペプチド（ＩＲ
Ｃ）の発現レベルをヒトＣ−ペプチドラジオイムノアッ
セイ（ヘディング，エル．ジィ．Diabetologia １１、
（１９７５）５４１−５４８）を使用することにより測
定する。この分析において、１２５Ｉ−Ｔｙｒ−ヒト−
Ｃ−ペプチドをトレーサーとして用い、ヒトＣ−ペプチ
ドとヒトプロインシュリンとに全く同じに反応するモル
モットの抗−ヒト−Ｃ−ペプチド血清、Ｍ１２２８〔フ
ァーバー，オ−．ケイ．(Faber,O.K.)らHoppe Seyler's
Z.Physiol.Chem.３５７（１９７６）７５１−７５７〕
を抗体として用いる。ヒトプロインシュリンを標準物と
して用いる〔クルーセ，ブイ．ら（Ｋｒｕｓｅ，Ｖ．ｅ
ｔ ａｌ．）Diabetolgia２７、（１９８４）４１４−
４１５〕。形質転換酵母株の発酵液における免疫反応性
インシュリンと免疫反応性Ｃ−ペプチドの発現レベルを
表１にまとめる。
菌株MT ５９３、MT ６１６、MT ６５５およびMT ６
６０は、全て１９８５年１月１６日にドイッチェ ザン
ムルング フォン ミクロオルガニスメン（ＤＳＭ）
（グッチゲン、ドイツ国）にそれぞれ受託番号DSM ３
１９４、DSM ３１９５ DSM ３１９８およびDSM ３
１９９をもって国際寄託された。
６０は、全て１９８５年１月１６日にドイッチェ ザン
ムルング フォン ミクロオルガニスメン（ＤＳＭ）
（グッチゲン、ドイツ国）にそれぞれ受託番号DSM ３
１９４、DSM ３１９５ DSM ３１９８およびDSM ３
１９９をもって国際寄託された。
表１から明らかなように、本発明による前駆体の発現レ
ベルとプロインシュリン型前駆体、すなわちＣ−ペプチ
ドまたは変性Ｃ−ペプチドの側方にある一対の二塩基性
アミノ酸を含む前駆体の発現レベルには顕著な差異があ
る。
ベルとプロインシュリン型前駆体、すなわちＣ−ペプチ
ドまたは変性Ｃ−ペプチドの側方にある一対の二塩基性
アミノ酸を含む前駆体の発現レベルには顕著な差異があ
る。
６．インシュリン前駆体のヒトインシュリンへの転化 インシュリン前駆体のヒトインシュリンへの転化は、二
段階酵素法： により、または反応混合物中にトリプシンとカルボキシ
ペプチダーゼＢが同時に存在する組合わせ一段階法のい
ずれかにより行なわれる。
段階酵素法： により、または反応混合物中にトリプシンとカルボキシ
ペプチダーゼＢが同時に存在する組合わせ一段階法のい
ずれかにより行なわれる。
上記式中および以下の明細書中、酵素開裂法のより良き
説明のために、Ａ鎖およびＢ鎖間のジスルフィド橋は括
弧 により示される。上記式中、 は一本鎖インシュリン前駆体である（図１）； は、残基NO.３２（ＬｙｓまたはＡｒｇ）と残基NO.３３
（Ａ１＝Ｇｌｙ）の間のペプチド結合が加水分解された
２本鎖インシュリン前駆体中間体である； はヒトインシュリンである。Ｂ−Ｘ−Ｙ−Ａ型の残りの
式において、Ａ鎖とＢ鎖は天然インシュリンにおけるよ
うにジスルフィド橋により接続されているものである。
説明のために、Ａ鎖およびＢ鎖間のジスルフィド橋は括
弧 により示される。上記式中、 は一本鎖インシュリン前駆体である（図１）； は、残基NO.３２（ＬｙｓまたはＡｒｇ）と残基NO.３３
（Ａ１＝Ｇｌｙ）の間のペプチド結合が加水分解された
２本鎖インシュリン前駆体中間体である； はヒトインシュリンである。Ｂ−Ｘ−Ｙ−Ａ型の残りの
式において、Ａ鎖とＢ鎖は天然インシュリンにおけるよ
うにジスルフィド橋により接続されているものである。
酵素転化はインシュリン前駆体の水溶液中で行なわれ
る。トリプシン型は本発明の実施のための物質ではな
い。トリプシンは、通常ウシおよびブタ膵臓から高純度
で得られる非常に特徴のある酵素である。トリプシン様
特異性を有する酵素、すなわちプラスミン、クロストリ
ペインおよびアクロモバクターリチカス(Achromobacter
lyticus)プロテアーゼもまた使用される。
る。トリプシン型は本発明の実施のための物質ではな
い。トリプシンは、通常ウシおよびブタ膵臓から高純度
で得られる非常に特徴のある酵素である。トリプシン様
特異性を有する酵素、すなわちプラスミン、クロストリ
ペインおよびアクロモバクターリチカス(Achromobacter
lyticus)プロテアーゼもまた使用される。
高い転化率を得るために、カルボキシペプチダーゼＡ活
性を含まない非常に高純度のカルボキシペプチダーゼＢ
を使用することが重要である。これは、市販されている
カルボキシペプチダーゼＢを、たとえばアフィニティク
ロマトグラフィーまたはイオン交換クロマトグラフィに
より精製することにより達成されうる。これに代わり、
カルボキシペプチダーゼＡ阻害剤たとえばε−アミノ−
ｎ−カプロン酸またはカルボベンゾキシグリシンを消化
混合物へ加えてもよい。
性を含まない非常に高純度のカルボキシペプチダーゼＢ
を使用することが重要である。これは、市販されている
カルボキシペプチダーゼＢを、たとえばアフィニティク
ロマトグラフィーまたはイオン交換クロマトグラフィに
より精製することにより達成されうる。これに代わり、
カルボキシペプチダーゼＡ阻害剤たとえばε−アミノ−
ｎ−カプロン酸またはカルボベンゾキシグリシンを消化
混合物へ加えてもよい。
一段階転化は、若干高めた温度（３５〜４０℃）で、pH
７〜８にて行なうのが好ましい。トリプシンとカルボキ
シペプチダーゼＢの濃度は約５μｇ／mlであり、基質濃
度は約１mg／mlであるのが好ましい。
７〜８にて行なうのが好ましい。トリプシンとカルボキ
シペプチダーゼＢの濃度は約５μｇ／mlであり、基質濃
度は約１mg／mlであるのが好ましい。
二段階転化法において、トリプシン消化は高pHで行なう
のが好ましい。高pH（１１〜１２の範囲）では、インシ
ュリン前駆体分子におけるリシンアミノ酸残基（たとえ
ば図１中Ｂ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−ＡにおけるＢ２９−Ｌｙ
ｓとＢ３１−Ｌｙｓ）がほとんど非荷重（リシン残基の
pkaは約９．０）であり、トリプシンでの開裂が起こら
ない。しかしながら、たとえば において、Ｂ３２−アルギニン残基（pka＝１２）はま
だ主として陽性に帯電しており、したがってトリプシン
開裂を受けうる。Ｂ２２−アルギニン残基での開裂は非
常に遅い速度で起こるだけであり、これはたぶん立体障
害に帰因するものであろう。
のが好ましい。高pH（１１〜１２の範囲）では、インシ
ュリン前駆体分子におけるリシンアミノ酸残基（たとえ
ば図１中Ｂ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−ＡにおけるＢ２９−Ｌｙ
ｓとＢ３１−Ｌｙｓ）がほとんど非荷重（リシン残基の
pkaは約９．０）であり、トリプシンでの開裂が起こら
ない。しかしながら、たとえば において、Ｂ３２−アルギニン残基（pka＝１２）はま
だ主として陽性に帯電しており、したがってトリプシン
開裂を受けうる。Ｂ２２−アルギニン残基での開裂は非
常に遅い速度で起こるだけであり、これはたぶん立体障
害に帰因するものであろう。
のトリプシン消化の間安定なpH値は、 の高収率に対し重要である。pHを１１．８−１１．９に
安定化する目的で幾つかの異なった緩衝液系が試され
た。通常高pH値で使用される緩衝液系ＨＰＯ４ −−／Ｐ
Ｏ４ −−がpH１１．８で良好な緩衝能を有する。しかし
ながら、この緩衝系は３つの主な欠点を有する。第一
に、ＨＰＯ４ −−／ＰＯ４ −−−溶液のpHは温度変化に
非常に敏感で、たとえば２５℃から４℃への変化でpH値
が０．７pH単位減るであろう。第二に、Ｃａ＋＋（これ
はトリプシンの安定化のために存在している場合があ
る）が、Ｃａ３（ＰＯ４）２とＣａＨＰＯ４の溶解度が
比較的低いので沈でんするであろう。第三に、緩衝系Ｈ
ＰＯ４ −−／Ｈ２ＰＯ４ −とＨ２ＰＯ４ −−／Ｈ３ＰＯ
４の作用のために瞬時に消化混合物を酸性化する（反応
を停止する）ことができない。その結果、この系は、酸
性化の間、一定期間中性pHとなり、この間にトリプシン
がただちに不所望産物des（Ｂ３０）インシュリンを作
ることになる。これらの欠点の結果として、むしろ一般
的でない緩衝系Ｈ２Ｏ／ＯＨ−が使用される。この系は
上述の欠点を有さない。
安定化する目的で幾つかの異なった緩衝液系が試され
た。通常高pH値で使用される緩衝液系ＨＰＯ４ −−／Ｐ
Ｏ４ −−がpH１１．８で良好な緩衝能を有する。しかし
ながら、この緩衝系は３つの主な欠点を有する。第一
に、ＨＰＯ４ −−／ＰＯ４ −−−溶液のpHは温度変化に
非常に敏感で、たとえば２５℃から４℃への変化でpH値
が０．７pH単位減るであろう。第二に、Ｃａ＋＋（これ
はトリプシンの安定化のために存在している場合があ
る）が、Ｃａ３（ＰＯ４）２とＣａＨＰＯ４の溶解度が
比較的低いので沈でんするであろう。第三に、緩衝系Ｈ
ＰＯ４ −−／Ｈ２ＰＯ４ −とＨ２ＰＯ４ −−／Ｈ３ＰＯ
４の作用のために瞬時に消化混合物を酸性化する（反応
を停止する）ことができない。その結果、この系は、酸
性化の間、一定期間中性pHとなり、この間にトリプシン
がただちに不所望産物des（Ｂ３０）インシュリンを作
ることになる。これらの欠点の結果として、むしろ一般
的でない緩衝系Ｈ２Ｏ／ＯＨ−が使用される。この系は
上述の欠点を有さない。
へのトリプシン消化の最適条件は、 約２０mg／ml、トリプシン２００μｇ／ml；緩衝液：３
７．５ｍＭ ＮａＯＨ（この結果、２５℃で測定された
pHは１１．８６であった）；温度約４℃と培養期間約８
０分である。
７．５ｍＭ ＮａＯＨ（この結果、２５℃で測定された
pHは１１．８６であった）；温度約４℃と培養期間約８
０分である。
の収率は９０．５％であった。
トリプシン転化産物 は、幾つかの一般的方法、たとえば調製用ＨＰＬＣ、吸
着クロマトグラフィ、およびイオン交換クロマトグラフ
ィにより精製される。
着クロマトグラフィ、およびイオン交換クロマトグラフ
ィにより精製される。
はほぼ定量的に （ヒトインシュリン）へカルボキシペプチダーゼＢの消
化により転化される。この転化の最適条件は、 約５mg／ml、カルボキシペプチダーゼＢ約５μｇ／ml；
緩衝液：５０ｍＭ トリス ＨＣｌ、pH＝９．３、温度
約３７℃および培養時間約３０分である。収率は の転化率９９．５％であった。
化により転化される。この転化の最適条件は、 約５mg／ml、カルボキシペプチダーゼＢ約５μｇ／ml；
緩衝液：５０ｍＭ トリス ＨＣｌ、pH＝９．３、温度
約３７℃および培養時間約３０分である。収率は の転化率９９．５％であった。
インシュリン前駆体 のヒトインシュリンへの転化は、逆相高圧液体クロマト
グラフィ（ＨＰＬＣ）により定量的に追跡され、図８で
示される。
グラフィ（ＨＰＬＣ）により定量的に追跡され、図８で
示される。
図８に関して、 を５０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液pH＝９．３に５mg／ml
の濃度に溶かし、３７℃にて５μｇ／mlカルボキシペプ
チダーゼＢ（ベーリンガーBoehringer）で消化する。ア
リコートを消化混合物からｔ＝０（Ａ）、ｔ＝２分
（Ｂ）、ｔ５分（Ｃ）およびｔ＝３０分（Ｄ）で除去
し、４ＮＨＣｌでpH＝１．５に酸性化し、平衡化した５
μヌクレオシル(Nucleosil) ＲＰＣ−１８カラム（４
×２００mm）上でＨＰＬＣにより分析し、３０℃で流速
１ml／分にて３３ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、１．５ｍＭ
Ｈ２ＳＯ４含有２９．４％（ｖ／ｖ）アセトニトリル
で平均に溶出する。２１４ｎｍでのＵＶ吸収によりペプ
チドを検出する。３０分後に転化が完了し、エタノール
を消化混合物へ加えて６０％（ｖ／ｖ）とする。シュリ
ヒトクルール，ジェイ．ら(Schlichtkrull,J. et al.)
（１９７４）Horm.Metab.Res.Suppl.,Ser-5,ｐ１３４−
１４３に記載されているようにＱＡＥ−セファデックス
(Sephadex) カラム上で陰イオン交換クロマトグラフィ
により精製する。
の濃度に溶かし、３７℃にて５μｇ／mlカルボキシペプ
チダーゼＢ（ベーリンガーBoehringer）で消化する。ア
リコートを消化混合物からｔ＝０（Ａ）、ｔ＝２分
（Ｂ）、ｔ５分（Ｃ）およびｔ＝３０分（Ｄ）で除去
し、４ＮＨＣｌでpH＝１．５に酸性化し、平衡化した５
μヌクレオシル(Nucleosil) ＲＰＣ−１８カラム（４
×２００mm）上でＨＰＬＣにより分析し、３０℃で流速
１ml／分にて３３ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、１．５ｍＭ
Ｈ２ＳＯ４含有２９．４％（ｖ／ｖ）アセトニトリル
で平均に溶出する。２１４ｎｍでのＵＶ吸収によりペプ
チドを検出する。３０分後に転化が完了し、エタノール
を消化混合物へ加えて６０％（ｖ／ｖ）とする。シュリ
ヒトクルール，ジェイ．ら(Schlichtkrull,J. et al.)
（１９７４）Horm.Metab.Res.Suppl.,Ser-5,ｐ１３４−
１４３に記載されているようにＱＡＥ−セファデックス
(Sephadex) カラム上で陰イオン交換クロマトグラフィ
により精製する。
Ｂ：Ｂ鎖，Ａ：Ａ鎖，Ｋ：Ｌｙｓ，Ｒ：Ａｒｇ。
図８から、トリプシン消化物 からの産物は、カルボキシペプチダーゼＢを用いた消化
によりほとんど定量的に へ転化される。
によりほとんど定量的に へ転化される。
インシュリン前駆体のヒトインシュリンへの転化は例１
０，１１，および２０に示され、例１３ではヒトインシ
ュリンの特性決定が示される。
０，１１，および２０に示され、例１３ではヒトインシ
ュリンの特性決定が示される。
（実施例） 例１：Ｂ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａの発現のための酵母 プラスミドpMT５８５の構築 pMT３４２からの４．３kb EcoRV-Xbalと３．３kb EcoR1
-EcoRV断片をpM２１５の０．６kb EcoR1-Xba1断片と連
結する。プラスミドpMT３４２は、挿入されたTPIp-MFα
１リーダーＢＣＡ−ＴＰＩＴ−配列を有する酵母ベクタ
ーpMT２１２である。pMT３４２とpMT２１２の構築は、
ヨーロッパ特許出願NO.００６８７０１Ａ号に記載され
ている。プラスミドpM２１５は、プロインシュリンコー
ド配列Ｂ−Ｃ−Ａを含むEcoR1-Xba1断片をｐ２８５(ATC
C NO.２０６８１）からpUC１３ 〔ヴィエイラら(Viei
ra et al.)、Gene １９：２５９−２６８（１９８２）
によりpUC8とpUC9について記載されているように構築さ
れる〕ヘサブクローンし、続いてMFα１リーダーとプロ
インシュリンＢ−Ｃ−Ａとの接続位置にあるＧｌｕ−Ａ
ｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａをコードする１２個の塩基をイン
ビトロでループから外すことにより構築される。ｐ２８
５は挿入TPIp-MFα１リーダー−Ｂ−Ｃ−Ａ−TPITを含
み、酵母株Ｚ３３(ATCC NO.２０６８１）に付着させ
る。その構築は米国特許出願第５４７，７４８号（１９
８３年１１月１日）に記載されている。
-EcoRV断片をpM２１５の０．６kb EcoR1-Xba1断片と連
結する。プラスミドpMT３４２は、挿入されたTPIp-MFα
１リーダーＢＣＡ−ＴＰＩＴ−配列を有する酵母ベクタ
ーpMT２１２である。pMT３４２とpMT２１２の構築は、
ヨーロッパ特許出願NO.００６８７０１Ａ号に記載され
ている。プラスミドpM２１５は、プロインシュリンコー
ド配列Ｂ−Ｃ−Ａを含むEcoR1-Xba1断片をｐ２８５(ATC
C NO.２０６８１）からpUC１３ 〔ヴィエイラら(Viei
ra et al.)、Gene １９：２５９−２６８（１９８２）
によりpUC8とpUC9について記載されているように構築さ
れる〕ヘサブクローンし、続いてMFα１リーダーとプロ
インシュリンＢ−Ｃ−Ａとの接続位置にあるＧｌｕ−Ａ
ｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａをコードする１２個の塩基をイン
ビトロでループから外すことにより構築される。ｐ２８
５は挿入TPIp-MFα１リーダー−Ｂ−Ｃ−Ａ−TPITを含
み、酵母株Ｚ３３(ATCC NO.２０６８１）に付着させ
る。その構築は米国特許出願第５４７，７４８号（１９
８３年１１月１日）に記載されている。
pMT３４２とpM２１５からの上記断片の連結により、挿
入MFα１リーダー（Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａが
除かれている）−Ｂ−Ｃ−Ａを有するプラスミドpMT４
６２が得られる。Ｂ−Ｃ−Ａをコードする断片をＢ−Ｌ
ｙｓ−Ａｒｇ−Ａをコードする断片へ転化するために、
変形した部位特異的突然変異法（ケイ．ノリスら，前
出）を用いる。MFα１リーダー−（Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇ
ｌｕ−Ａｌａが除かれている）−Ｂ−Ｃ−Ａをコードす
るpMT４６２からの０．６kb EcoR1-Xba1断片を、Xba1-E
coR1で切断したファージＭ１３mp10RF〔メシング，ジェ
イ．(Messing,J.)とヴィエリア，ジェイ．(Vieria,J.)
（１９８３）未公開の結果〕ＤＮＡへ挿入する。上記Ec
oR1-Xba1挿入部を含む一重らせんＭ１３ファージを、３
０量体欠失プライマーKFN4と“万能”１５量体Ｍ１３プ
ライマーｄ(TCCCAGTCACGACGT)（ニューイングランドバ
イオラボズ New England Biolabs)とともに培養し、９
０℃で５分間加熱し、室温までゆっくり冷却し、アニー
リングさせる。次いで部分的二重らせんＤＮＡをｄ−Ｎ
ＴＰ−ミックス，クレノウポリメラーゼとＴ４リガーゼ
を加えることにより作る。フェノールで抽出し、エタノ
ールで沈でんおよび再懸濁後に、制限酵素Apal，Xbal，
およびEcoR1でＤＮＡを切断する。別にフェノールで抽
出し、エタノールで沈でんおよび再懸濁後に、ＤＮＡを
EcoR1-Xba1切断pUC１３に連結する。連結混合物を大腸
菌（ｒ−ｍ＋）株へ形質転換し、幾つかの形質転換体か
らプラスミドを調製する。プラスミド調製物をEcoR1とX
ba1で切断し、０．５kbと０．６kbの両方でバンドを示
すこれら調製物を大腸菌へ再度形質転換する。再形質転
換体から０．５kb挿入部を有するpUC１３のみを有する
形質転換体を選択する。このプラスミドpMT５７９のEco
R1-Xba1挿入部の配列は、マキサム−ギルバート法によ
りMFα１リーダー−（Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａ
が除かれている）−Ｂ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａをコードす
ることが確認された。pMT５７９の構築を図２に示す。p
MT５７９からのXbal-EcoR1挿入部は、pMT５７９の０．
５kb Xba1-EcoR1断片をpT５の５．５kb Xba1-EcoR1断片
と連結することによりＴＰＩプロモーターとＴＰＩター
ミネーターを備えている。挿入部PTIp-MFα１リーダー
−Ｂ−Ｃ−Ａ−TPITを有するpT５の構築を図３に示す。
得られた挿入部TPIp-MFα１リーダー−（ＧＩｕ−Ａｌ
ａ−Ｇｌｕ−Ａｌａが除かれる）−Ｂ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ
−Ａ−TPITを含むプラスミドpMT５８３を、次いでBamH1
と部分的にSph1で切断し、BamH1とSph1で切断したCPOT
に２．１kb断片を挿入する。得られたプラスミドpMT５
８５は酵母の形質転換に用いられる。pMT５８３とpMT５
８５の構築を図３に示す。
入MFα１リーダー（Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａが
除かれている）−Ｂ−Ｃ−Ａを有するプラスミドpMT４
６２が得られる。Ｂ−Ｃ−Ａをコードする断片をＢ−Ｌ
ｙｓ−Ａｒｇ−Ａをコードする断片へ転化するために、
変形した部位特異的突然変異法（ケイ．ノリスら，前
出）を用いる。MFα１リーダー−（Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇ
ｌｕ−Ａｌａが除かれている）−Ｂ−Ｃ−Ａをコードす
るpMT４６２からの０．６kb EcoR1-Xba1断片を、Xba1-E
coR1で切断したファージＭ１３mp10RF〔メシング，ジェ
イ．(Messing,J.)とヴィエリア，ジェイ．(Vieria,J.)
（１９８３）未公開の結果〕ＤＮＡへ挿入する。上記Ec
oR1-Xba1挿入部を含む一重らせんＭ１３ファージを、３
０量体欠失プライマーKFN4と“万能”１５量体Ｍ１３プ
ライマーｄ(TCCCAGTCACGACGT)（ニューイングランドバ
イオラボズ New England Biolabs)とともに培養し、９
０℃で５分間加熱し、室温までゆっくり冷却し、アニー
リングさせる。次いで部分的二重らせんＤＮＡをｄ−Ｎ
ＴＰ−ミックス，クレノウポリメラーゼとＴ４リガーゼ
を加えることにより作る。フェノールで抽出し、エタノ
ールで沈でんおよび再懸濁後に、制限酵素Apal，Xbal，
およびEcoR1でＤＮＡを切断する。別にフェノールで抽
出し、エタノールで沈でんおよび再懸濁後に、ＤＮＡを
EcoR1-Xba1切断pUC１３に連結する。連結混合物を大腸
菌（ｒ−ｍ＋）株へ形質転換し、幾つかの形質転換体か
らプラスミドを調製する。プラスミド調製物をEcoR1とX
ba1で切断し、０．５kbと０．６kbの両方でバンドを示
すこれら調製物を大腸菌へ再度形質転換する。再形質転
換体から０．５kb挿入部を有するpUC１３のみを有する
形質転換体を選択する。このプラスミドpMT５７９のEco
R1-Xba1挿入部の配列は、マキサム−ギルバート法によ
りMFα１リーダー−（Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａ
が除かれている）−Ｂ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａをコードす
ることが確認された。pMT５７９の構築を図２に示す。p
MT５７９からのXbal-EcoR1挿入部は、pMT５７９の０．
５kb Xba1-EcoR1断片をpT５の５．５kb Xba1-EcoR1断片
と連結することによりＴＰＩプロモーターとＴＰＩター
ミネーターを備えている。挿入部PTIp-MFα１リーダー
−Ｂ−Ｃ−Ａ−TPITを有するpT５の構築を図３に示す。
得られた挿入部TPIp-MFα１リーダー−（ＧＩｕ−Ａｌ
ａ−Ｇｌｕ−Ａｌａが除かれる）−Ｂ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ
−Ａ−TPITを含むプラスミドpMT５８３を、次いでBamH1
と部分的にSph1で切断し、BamH1とSph1で切断したCPOT
に２．１kb断片を挿入する。得られたプラスミドpMT５
８５は酵母の形質転換に用いられる。pMT５８３とpMT５
８５の構築を図３に示す。
例２：Ｂ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａ発現のための酵母プラス
ミドｐpMT６１１の構築 pMT４６２からのＢ−Ｃ−Ａコード断片（例１参照）
を、例１に記載した方法と同じ方法により、図５に示す
ように、３０量体欠失プライマーKFN１８と“万能”１
５量体Ｍ１３プライマーの混合物を用いた部位特異的突
然変異によりＢ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａへ転化する。プラ
スミドpMT５９９のEcoR1-Xba1挿入部の配列は、マクサ
ム−ギルバート法により、MFα１リーダー−（Ｇｌｕ−
Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａが除かれる）−Ｂ−Ａｒｇ−Ａ
ｒｇ−Ａをコードすることが確認された。pMT５９９か
らのXbal-EcoR1挿入部は、pMT５９９の０．５kb Xba1-E
coR1断片とpT５の５．５kb Xba1-EcoR1断片を連結する
ことによりＴＰＩプロモーターとＴＰＩターミネーター
を有する。挿入部TPIp-MFα１リーダー−（Ｇｌｕ−Ａ
ｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａが除かれる）−Ｂ−Ａｒｇ−Ａｒ
ｇ−Ａ−TPITを含む得られたプラスミドpMT６０２をBam
H1と部分的にSph1で切断し、２．１kb断片をBamH1とSph
1で切断したCPOTに挿入する。得られたプラスミドpMT６
１１が酵母の形質転換のために用いられる。プラスミド
pMT６１１の構築を図５に示す。
ミドｐpMT６１１の構築 pMT４６２からのＢ−Ｃ−Ａコード断片（例１参照）
を、例１に記載した方法と同じ方法により、図５に示す
ように、３０量体欠失プライマーKFN１８と“万能”１
５量体Ｍ１３プライマーの混合物を用いた部位特異的突
然変異によりＢ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａへ転化する。プラ
スミドpMT５９９のEcoR1-Xba1挿入部の配列は、マクサ
ム−ギルバート法により、MFα１リーダー−（Ｇｌｕ−
Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａが除かれる）−Ｂ−Ａｒｇ−Ａ
ｒｇ−Ａをコードすることが確認された。pMT５９９か
らのXbal-EcoR1挿入部は、pMT５９９の０．５kb Xba1-E
coR1断片とpT５の５．５kb Xba1-EcoR1断片を連結する
ことによりＴＰＩプロモーターとＴＰＩターミネーター
を有する。挿入部TPIp-MFα１リーダー−（Ｇｌｕ−Ａ
ｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａが除かれる）−Ｂ−Ａｒｇ−Ａｒ
ｇ−Ａ−TPITを含む得られたプラスミドpMT６０２をBam
H1と部分的にSph1で切断し、２．１kb断片をBamH1とSph
1で切断したCPOTに挿入する。得られたプラスミドpMT６
１１が酵母の形質転換のために用いられる。プラスミド
pMT６１１の構築を図５に示す。
例３：Ｂ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａを発現するための酵母プ
ラスミドpMT６５０の構築 pMT４６２からのＢ−Ｃ−Ａコード断片（例１参照）
を、例１で記載した方法と同じ方法により、図６に示す
ように３０量体欠失プライマーKFN ４１と“万能”１
５量体Ｍ１３プライマーの混合物で部位特異的突然変異
によりＢ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａへ転化する。
ラスミドpMT６５０の構築 pMT４６２からのＢ−Ｃ−Ａコード断片（例１参照）
を、例１で記載した方法と同じ方法により、図６に示す
ように３０量体欠失プライマーKFN ４１と“万能”１
５量体Ｍ１３プライマーの混合物で部位特異的突然変異
によりＢ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａへ転化する。
クレノウポリメラーゼで充てんしＴ４リガーゼで連結
後、部分的二重らせんＤＮＡをApal，EcoR1およびXba1
で消化させ、プラスミドpT５からの５．５kb Xba1-EcoR
1断片（例１参照）で連結する。大腸菌へ形質転換およ
び再形質転換後、挿入部MFα１リーダー−（Ｇｌｕ−Ａ
ｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａが除かれる）−Ｂ−Ｌｙｓ−Ｌｙ
ｓ−Ａを含むプラスミドpMT６５２を単離し、挿入部の
配列を上記のように確認する。
後、部分的二重らせんＤＮＡをApal，EcoR1およびXba1
で消化させ、プラスミドpT５からの５．５kb Xba1-EcoR
1断片（例１参照）で連結する。大腸菌へ形質転換およ
び再形質転換後、挿入部MFα１リーダー−（Ｇｌｕ−Ａ
ｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａが除かれる）−Ｂ−Ｌｙｓ−Ｌｙ
ｓ−Ａを含むプラスミドpMT６５２を単離し、挿入部の
配列を上記のように確認する。
プラスミドpMT６５２をXba1-EcoR1で開裂し、０．５kb
断片をpMT６４４の７．８kb Xba1-Kpn1と４．３kbとKpn
1-EcoR1断片で連結する。得られたプラスミドpMT６５０
は挿入部TPIp-MFα１リーダー（Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌ
ｕ−Ａｌａが除かれる）−Ｂ−Ｌｙｓ−ｙｓ−Ａ−TPIT
を含み、さらにCPOTからのＴＰＩコード遺伝子（ＰＯ
Ｔ）を含む。プラスミドpMT６５０の構築を図６に示
し、pMT６４４の構築を図４に示す。pMT６４４の構築に
用いられるプラスミドpUC１２とpUC１８をpUC１３につ
いて記載した（ヴィエイラら、前出）ように構築する。
プラスミドｐ６０１（図４参照）は、Bg１２とBamH1部
位が側方に接続する挿入部TPIp-MFα１リーダー−Ｂ′
Ａ−TPITを含む。Ｂ′ＡはＢ（１−２９）−Ａ（１−２
１）（ここで、Ｂ（１−２９）はPheB1からＬｙｓ
Ｂ２９までの短かくしたヒトインシュリンＢ鎖であり、
Ａ（１−２１）はヒトインシュリンＡ鎖である）を表わ
す。Ｂ′ＡをコードするＤＮＡ配列の構築はヨーロッパ
特許出願第００６８７０１Ａ号に記載されている。酵母
の形質転換にpMT６５０が用いられる。
断片をpMT６４４の７．８kb Xba1-Kpn1と４．３kbとKpn
1-EcoR1断片で連結する。得られたプラスミドpMT６５０
は挿入部TPIp-MFα１リーダー（Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌ
ｕ−Ａｌａが除かれる）−Ｂ−Ｌｙｓ−ｙｓ−Ａ−TPIT
を含み、さらにCPOTからのＴＰＩコード遺伝子（ＰＯ
Ｔ）を含む。プラスミドpMT６５０の構築を図６に示
し、pMT６４４の構築を図４に示す。pMT６４４の構築に
用いられるプラスミドpUC１２とpUC１８をpUC１３につ
いて記載した（ヴィエイラら、前出）ように構築する。
プラスミドｐ６０１（図４参照）は、Bg１２とBamH1部
位が側方に接続する挿入部TPIp-MFα１リーダー−Ｂ′
Ａ−TPITを含む。Ｂ′ＡはＢ（１−２９）−Ａ（１−２
１）（ここで、Ｂ（１−２９）はPheB1からＬｙｓ
Ｂ２９までの短かくしたヒトインシュリンＢ鎖であり、
Ａ（１−２１）はヒトインシュリンＡ鎖である）を表わ
す。Ｂ′ＡをコードするＤＮＡ配列の構築はヨーロッパ
特許出願第００６８７０１Ａ号に記載されている。酵母
の形質転換にpMT６５０が用いられる。
例４：Ｂ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａ発現のためのプラスミド
pMT６５８の構築 例３でpMT６５０について記載したようにしてただしKFN
４１の代わりにKFN４２の３０量体欠失プライマーを
用いてプラスミドpMT６５８を構築する。また、さらに
直接的なpMT６４４の構築が選択される：インビトロ突
然変異、すなわちクレノウポリメラーゼで充てんしＴ４
リガーゼで連結後、部分的二重らせんＤＮＡをApa1，Ec
oR1およびXba1で消化し、pMT６４４の７．８kb Xba1-Kp
n1と４．３kb Kpn1-EcoR1断片と連結する。連結混合物
を大腸菌（ｒ−ｍ＋）へ形質転換させ、幾つかの形質転
換体からプラスミドを調製する。０．６と０．５kbの両
方にXba1-EcrR1断片を示す１つのプラスミド調製物を大
腸菌へ再度形質転換し、０．６kbではなく０．５kbEcrR
1-Xba1断片を含むプラスミドpMT６５８を含む株とす
る。pMT６５８は挿入部TPIp-MFα１リーダー−（Ｇｌｕ
−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａが除かれる）−Ｂ−Ａｒｇ−
Ｌｙｓ−Ａ−TPITを含む。
pMT６５８の構築 例３でpMT６５０について記載したようにしてただしKFN
４１の代わりにKFN４２の３０量体欠失プライマーを
用いてプラスミドpMT６５８を構築する。また、さらに
直接的なpMT６４４の構築が選択される：インビトロ突
然変異、すなわちクレノウポリメラーゼで充てんしＴ４
リガーゼで連結後、部分的二重らせんＤＮＡをApa1，Ec
oR1およびXba1で消化し、pMT６４４の７．８kb Xba1-Kp
n1と４．３kb Kpn1-EcoR1断片と連結する。連結混合物
を大腸菌（ｒ−ｍ＋）へ形質転換させ、幾つかの形質転
換体からプラスミドを調製する。０．６と０．５kbの両
方にXba1-EcrR1断片を示す１つのプラスミド調製物を大
腸菌へ再度形質転換し、０．６kbではなく０．５kbEcrR
1-Xba1断片を含むプラスミドpMT６５８を含む株とす
る。pMT６５８は挿入部TPIp-MFα１リーダー−（Ｇｌｕ
−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａが除かれる）−Ｂ−Ａｒｇ−
Ｌｙｓ−Ａ−TPITを含む。
Ｂ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａをコードするセグメントの配列
はマキサム−ギルバートＤＮＡ−配列法により変化す
る。pMT６５８の構築を図７に示す。pMT６５８は酵母の
形質転換に用いられる。
はマキサム−ギルバートＤＮＡ−配列法により変化す
る。pMT６５８の構築を図７に示す。pMT６５８は酵母の
形質転換に用いられる。
例５：形質転換 酵母(S.cerevisiae)株 MT５０１(E2-7B×E11-3C ａ／
α，Δtpi/tpi，Δpep4-3/pep4-3)を、YPGal（１％バク
ト酵母抽出液、２％バクトペプトン、２％ガラクトー
ス、１％酪酸）中で0D600nm０．６まで増殖する。
α，Δtpi/tpi，Δpep4-3/pep4-3)を、YPGal（１％バク
ト酵母抽出液、２％バクトペプトン、２％ガラクトー
ス、１％酪酸）中で0D600nm０．６まで増殖する。
培養液１００mlを遠心分離により採取し、水１０mlで洗
い、再遠心分離し、１０mlの１．２Ｍソルビトール、２
５ｍＭ Ｎａ２ＥＤＴＡ pH＝８．０、６．７mg/mlジ
チオトレイトール中に再懸濁する。懸濁液を３０℃で１
５分間インキュベートし、遠心分離し、細胞を１０mlの
１．２Ｍソルビトール、１０ｍＭ Ｎａ２EDTA、０．１
Ｍクエン酸ナトリウムpH＝５．８、ノボザイム(Novozy
m) ２３４ ２mg中で再懸濁する。懸濁液を３０℃で３
０分間インキュベートし、遠心分離により細胞を集め、
１０mlの１．２Ｍソルビトールと１０mlのＣＡＳ（１．
２Ｍソルビトール、１０ｍＭCaCl2、１０ｍＭ トリス
（トリス＝トリス（ヒドロキシメチル）−アミノメタ
ン）pH＝７．５）で洗浄し、２mlのＣＡＳに再懸濁す
る。形質転換のために、ＣＡＳ−再懸濁細胞０．１mlを
ほぼ１μｇのプラスミドpMT５８５と混合し、室温で１
５分間放置する。１mlの２０％ポリエチレングリコール
４０００、１０ｍＭCaCl2、１０ｍＭトリスpH＝７．５
を加え、混合物をさらに室温で３０分間放置する。混合
物を遠心分離し、ペレットを０．１mlのＳＯＳ（１．２
Ｍソルビトール、３３％ｖ／ｖ YPGaL、６．７ｍＭ C
aCl2、１４μｇ／mlロイシン）に再懸濁し、３０℃で２
時間インキュベートする。次いで懸濁液を遠心分離し、
ペレットを０．５mlの１．２Ｍソルビトールに再懸濁す
る。６mlの寒天上層〔セルマンら(Sherman et al.)のＳ
Ｃ培地(Methods in Yeast Genetics)、コールド スプ
リング ハーバー ラボラトリィ，１９８１）であっ
て、ロイシンが排除され１．２Ｍソルビトールと２．５
％寒天を含むもの〕を５２℃で加え、この懸濁液を同種
の寒天固化物とソルビトールを含む培地を有するプレー
トの表面に注入する。３０℃で３日後形質転換体コロニ
ーを取り出し、再単離し、液体培地を始めるのに用い
る。このような形質転換体MT５９３（＝MT５０１／pMT
５８５）の１つを、さらに特性決定のために選択する。
い、再遠心分離し、１０mlの１．２Ｍソルビトール、２
５ｍＭ Ｎａ２ＥＤＴＡ pH＝８．０、６．７mg/mlジ
チオトレイトール中に再懸濁する。懸濁液を３０℃で１
５分間インキュベートし、遠心分離し、細胞を１０mlの
１．２Ｍソルビトール、１０ｍＭ Ｎａ２EDTA、０．１
Ｍクエン酸ナトリウムpH＝５．８、ノボザイム(Novozy
m) ２３４ ２mg中で再懸濁する。懸濁液を３０℃で３
０分間インキュベートし、遠心分離により細胞を集め、
１０mlの１．２Ｍソルビトールと１０mlのＣＡＳ（１．
２Ｍソルビトール、１０ｍＭCaCl2、１０ｍＭ トリス
（トリス＝トリス（ヒドロキシメチル）−アミノメタ
ン）pH＝７．５）で洗浄し、２mlのＣＡＳに再懸濁す
る。形質転換のために、ＣＡＳ−再懸濁細胞０．１mlを
ほぼ１μｇのプラスミドpMT５８５と混合し、室温で１
５分間放置する。１mlの２０％ポリエチレングリコール
４０００、１０ｍＭCaCl2、１０ｍＭトリスpH＝７．５
を加え、混合物をさらに室温で３０分間放置する。混合
物を遠心分離し、ペレットを０．１mlのＳＯＳ（１．２
Ｍソルビトール、３３％ｖ／ｖ YPGaL、６．７ｍＭ C
aCl2、１４μｇ／mlロイシン）に再懸濁し、３０℃で２
時間インキュベートする。次いで懸濁液を遠心分離し、
ペレットを０．５mlの１．２Ｍソルビトールに再懸濁す
る。６mlの寒天上層〔セルマンら(Sherman et al.)のＳ
Ｃ培地(Methods in Yeast Genetics)、コールド スプ
リング ハーバー ラボラトリィ，１９８１）であっ
て、ロイシンが排除され１．２Ｍソルビトールと２．５
％寒天を含むもの〕を５２℃で加え、この懸濁液を同種
の寒天固化物とソルビトールを含む培地を有するプレー
トの表面に注入する。３０℃で３日後形質転換体コロニ
ーを取り出し、再単離し、液体培地を始めるのに用い
る。このような形質転換体MT５９３（＝MT５０１／pMT
５８５）の１つを、さらに特性決定のために選択する。
プラスミドpMT６１１、pMT６５０およびpMT６５８を上
記と同じ方法で酵母(S.cerevisiae)株MT５０１へ形質転
換し、形質転換体MT６１６（＝MT５０１／pMT６１
１）、MT６５５（＝MT５０１／pMT６５０）およびMT６
６０（＝MT５０１／pMT６５８）を単離する。
記と同じ方法で酵母(S.cerevisiae)株MT５０１へ形質転
換し、形質転換体MT６１６（＝MT５０１／pMT６１
１）、MT６５５（＝MT５０１／pMT６５０）およびMT６
６０（＝MT５０１／pMT６５８）を単離する。
形質転換体微生物MT５９３、MT６１６、MT６５５および
MT６６０は、出願人により、１９８５年１月１６日に、
ドイチェ ザンムルング フォン ミクロオルガニスメ
ン（ＤＳＭ）、グリースバッハストラーセ８、Ｄ−３４
００ゲッチンゲンに寄託され、それぞれ参照番号DSM
３１９４、DSM ３１９５、DSM ３１９８およびDSM
３１９９を記録する。ＤＳＭは１９７７年のブタペスト
条約下に委任された国際寄託機関であり、前記条約のそ
れぞれ９条および１１条により、上記寄託物の永続性と
公衆による入手可能性を提供する。
MT６６０は、出願人により、１９８５年１月１６日に、
ドイチェ ザンムルング フォン ミクロオルガニスメ
ン（ＤＳＭ）、グリースバッハストラーセ８、Ｄ−３４
００ゲッチンゲンに寄託され、それぞれ参照番号DSM
３１９４、DSM ３１９５、DSM ３１９８およびDSM
３１９９を記録する。ＤＳＭは１９７７年のブタペスト
条約下に委任された国際寄託機関であり、前記条約のそ
れぞれ９条および１１条により、上記寄託物の永続性と
公衆による入手可能性を提供する。
例６：酵母株MT ５９３（DSM ３１９４）からＢ−Ｌ
ｙｓ−Ａｒｇ−Ａの精製 酵母株MT ５９３（DSM ３１９４）をＹＰＤ培地で増
殖する。
ｙｓ−Ａｒｇ−Ａの精製 酵母株MT ５９３（DSM ３１９４）をＹＰＤ培地で増
殖する。
２のバッフルフラスコ中の１の培養液をＯＤ600nm
が１５になるまで３０℃で振とうする。遠心分離後、上
清８１５mlから発現産物を次のように単離する： リクロプレプ(LiChroprep) RP−１８（メルク，商品番
号９３０３）のカラム（１．５×９cm）を、６０％（ｖ
／ｖ）エタノール含有５０ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３ ３０
mlで洗う。カラムを５０mlの５０ｍＭＮＨ４ＨＣＯ３で
平衡化する。９５mlの９６％エタノールを８１５mlの酵
母上清へ加え、混合物を一晩カラムへポンプ注入する
（流速４５ml／ｈ）。
が１５になるまで３０℃で振とうする。遠心分離後、上
清８１５mlから発現産物を次のように単離する： リクロプレプ(LiChroprep) RP−１８（メルク，商品番
号９３０３）のカラム（１．５×９cm）を、６０％（ｖ
／ｖ）エタノール含有５０ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３ ３０
mlで洗う。カラムを５０mlの５０ｍＭＮＨ４ＨＣＯ３で
平衡化する。９５mlの９６％エタノールを８１５mlの酵
母上清へ加え、混合物を一晩カラムへポンプ注入する
（流速４５ml／ｈ）。
カラムを１５mlの０．１Ｍ ＮａＣｌ、次いで１５mlの
Ｈ２Ｏで洗い、ペプチド物質を６０％（ｖ／ｖ）エタノ
ール含有５０ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３で溶出する。溶出液
（４．５ml）を減圧遠心分離〔サバント(Savant)減圧遠
心分離〕により１．１mlまで濃縮してエタノールを除
き、容量をpH７．４にて２５ｍＭ HEPES緩衝液で１０m
lに調整する。サンプルを抗インシュリンセファロース
カラム（２．５×４．５cm）へ施こす。このカラムは予
めNaFAM緩衝液（ヘッディング，エル，Diabetologia８
（１９７２），２６０−６６）２０mlと１０mlの２５ｍ
Ｍ HEPES緩衝液pH＝７．４で洗浄する。施用後、カラ
ムを室温で３０分間放置し、その後４０mlの２５ｍＭ
HEPES緩衝液、pH＝７．４で洗う。ペプチド物質を２０
％酢酸で溶出し、溶出液のpHをＮＨ４ＯＨで７．０に調
整する。
Ｈ２Ｏで洗い、ペプチド物質を６０％（ｖ／ｖ）エタノ
ール含有５０ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３で溶出する。溶出液
（４．５ml）を減圧遠心分離〔サバント(Savant)減圧遠
心分離〕により１．１mlまで濃縮してエタノールを除
き、容量をpH７．４にて２５ｍＭ HEPES緩衝液で１０m
lに調整する。サンプルを抗インシュリンセファロース
カラム（２．５×４．５cm）へ施こす。このカラムは予
めNaFAM緩衝液（ヘッディング，エル，Diabetologia８
（１９７２），２６０−６６）２０mlと１０mlの２５ｍ
Ｍ HEPES緩衝液pH＝７．４で洗浄する。施用後、カラ
ムを室温で３０分間放置し、その後４０mlの２５ｍＭ
HEPES緩衝液、pH＝７．４で洗う。ペプチド物質を２０
％酢酸で溶出し、溶出液のpHをＮＨ４ＯＨで７．０に調
整する。
前記工程からの溶出液を減圧回転で２５０μまで濃縮
し、さらに５μウォーターズ ノバパック(Waters Nova
pak)Ｃ−１８カラム（３．９×１５０mm）での逆相HPLC
により精製する。ＡおよびＢ緩衝液は、それぞれ、０．
１％ＴＦＡ水溶液と０．０７％ＴＦＡ−アセトニトリル
液である。カラムを２５％Ｂで流速０．７５ml／分にて
平衡化し、ペプチドを直線状勾配物（１％アセトニトリ
ル／分）で溶出し、２７６ｎｍで検出する。１３．１５
分の保持時間で主ピークが溶出し、このピークからのペ
プチド物質を溶出液の凍結乾燥により単離する。ペプチ
ド物質は例８で記載したように特性決定が行なわれる。
精製の各工程における収率は前記したラジオイムノアッ
セイにより決定される。表２は精製を要約する。全収率
は３９％であった。
し、さらに５μウォーターズ ノバパック(Waters Nova
pak)Ｃ−１８カラム（３．９×１５０mm）での逆相HPLC
により精製する。ＡおよびＢ緩衝液は、それぞれ、０．
１％ＴＦＡ水溶液と０．０７％ＴＦＡ−アセトニトリル
液である。カラムを２５％Ｂで流速０．７５ml／分にて
平衡化し、ペプチドを直線状勾配物（１％アセトニトリ
ル／分）で溶出し、２７６ｎｍで検出する。１３．１５
分の保持時間で主ピークが溶出し、このピークからのペ
プチド物質を溶出液の凍結乾燥により単離する。ペプチ
ド物質は例８で記載したように特性決定が行なわれる。
精製の各工程における収率は前記したラジオイムノアッ
セイにより決定される。表２は精製を要約する。全収率
は３９％であった。
例７：それぞれ酵母株MT ６５５(DSM ３１９８）、MT
６６０（DSM ３１９９）およびMT ６１６(DSM ３
１９５）からのＢ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａ、Ｂ−Ａｒｇ−
Ｌｙｓ−ＡおよびＢ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａの精製 上記記載の酵母株を予め例６で記載したように増殖し、
発現産物を例６で記載したように実質的に異なった上清
から精製する。表３に総収率をまとめる。
６６０（DSM ３１９９）およびMT ６１６(DSM ３
１９５）からのＢ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａ、Ｂ−Ａｒｇ−
Ｌｙｓ−ＡおよびＢ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａの精製 上記記載の酵母株を予め例６で記載したように増殖し、
発現産物を例６で記載したように実質的に異なった上清
から精製する。表３に総収率をまとめる。
例８：酵母株MT ５９３(DSM ３１９４）から精製され
たＢ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａの特性決定 Ｂ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａを例６で記載のように精製す
る。ペプチドのアミノ酸組成を次のように決定する：１
３９．６μｇ（１９ｎｍｏｌ）を１１０℃で２４時間１
００μの６ＮＨＣｌ中で加水分解する。加水分解をベ
ックマン型１２１Ｍアミノ酸分析機で分析する。次のア
ミノ酸組成がみられた： 約５ｎｍｏｌのペプチド物質をアミノ酸配列分析する。
配列分析は、ムーディ，エイ．ジェイ．(Moody,A.J.)、
チム，エル．(Thim,L.)およびヴァルベルデ，アイ．(Va
lverde,I.)(FEBS Left.，１７２ （１９８４），１４
２−１４８）により記載されているように、ガスフェー
ズセキュエンサー（アプライド バイオシステムモデル
４７０Ａ）で行なわれる。結果は次のようである： 例９：それぞれ酵母株MT ６５５(DSM ３１９８）、MT
６６０(DSM ３１９９）およびMT ６１６(DSM ３１９
５）から精製されたＢ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａ、Ｂ−Ａｒ
ｇ−Ｌｙｓ−ＡおよびＢ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａの特性決
定 ペプチド物質を例６で記載したように上記の酵母株から
精製する。ペプチドを例８で記載のようにアミノ酸配列
分析へかける。配列結果（示さず）から、Ｂ鎖とＡ鎖を
連結する二塩基性配列は、それぞれＬｙｓ−Ｌｙｓ（MT
６５５）、Ａｒｇ−Ｌｙｓ（MT ６６０）およびＡｒ
ｇ−Ａｒｇ（MT ６１６）であった。精製したペプチド
を例７に記載したようにアミノ酸分析にかける。アミノ
酸組成は理論どうりに見い出された（結果をＢ−Ｌｙｓ
−Ｌｙｓ−Ａについてのみ示す）。
たＢ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａの特性決定 Ｂ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａを例６で記載のように精製す
る。ペプチドのアミノ酸組成を次のように決定する：１
３９．６μｇ（１９ｎｍｏｌ）を１１０℃で２４時間１
００μの６ＮＨＣｌ中で加水分解する。加水分解をベ
ックマン型１２１Ｍアミノ酸分析機で分析する。次のア
ミノ酸組成がみられた： 約５ｎｍｏｌのペプチド物質をアミノ酸配列分析する。
配列分析は、ムーディ，エイ．ジェイ．(Moody,A.J.)、
チム，エル．(Thim,L.)およびヴァルベルデ，アイ．(Va
lverde,I.)(FEBS Left.，１７２ （１９８４），１４
２−１４８）により記載されているように、ガスフェー
ズセキュエンサー（アプライド バイオシステムモデル
４７０Ａ）で行なわれる。結果は次のようである： 例９：それぞれ酵母株MT ６５５(DSM ３１９８）、MT
６６０(DSM ３１９９）およびMT ６１６(DSM ３１９
５）から精製されたＢ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａ、Ｂ−Ａｒ
ｇ−Ｌｙｓ−ＡおよびＢ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａの特性決
定 ペプチド物質を例６で記載したように上記の酵母株から
精製する。ペプチドを例８で記載のようにアミノ酸配列
分析へかける。配列結果（示さず）から、Ｂ鎖とＡ鎖を
連結する二塩基性配列は、それぞれＬｙｓ−Ｌｙｓ（MT
６５５）、Ａｒｇ−Ｌｙｓ（MT ６６０）およびＡｒ
ｇ−Ａｒｇ（MT ６１６）であった。精製したペプチド
を例７に記載したようにアミノ酸分析にかける。アミノ
酸組成は理論どうりに見い出された（結果をＢ−Ｌｙｓ
−Ｌｙｓ−Ａについてのみ示す）。
例１０：ヒトインシュリンへのＢ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａ
の転化（一段階法） １０mgＢ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａを１０mlの０．２３Ｍト
リス−ＨＣｌ 緩衝液pH＝７．５に溶かす。溶液を３７
℃まで加熱し、５０μｇトリプシン（ノボインダストリ
ィ社）と５０μｇカルボキシペプチダーゼＢ（ベーリン
ガー）の両方を１００μの水に溶かしたものを加える
（０時）。反応混合物のアリコートを時間０分、２分、
１０分、４０分および８０分で取り出す。１Ｍ ＨＣｌ
でサンプルをpH２．５まで酸性化して酵素反応を停止す
る。
の転化（一段階法） １０mgＢ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａを１０mlの０．２３Ｍト
リス−ＨＣｌ 緩衝液pH＝７．５に溶かす。溶液を３７
℃まで加熱し、５０μｇトリプシン（ノボインダストリ
ィ社）と５０μｇカルボキシペプチダーゼＢ（ベーリン
ガー）の両方を１００μの水に溶かしたものを加える
（０時）。反応混合物のアリコートを時間０分、２分、
１０分、４０分および８０分で取り出す。１Ｍ ＨＣｌ
でサンプルをpH２．５まで酸性化して酵素反応を停止す
る。
Ｂ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａのヒトインシュリンへの転化を
ヌクレオシル（マーチェリーナゲル）の５μＲＰＣ−１
８カラム（４×２００mm）において逆相ＨＰＬＣにより
追跡する。Ａ緩衝液はＨ２ＳＯ４でpH＝３．５に調整さ
れた２５％アセトニトリルからなり、Ｂ緩衝液は４５％
アセトニトリル、０．１５Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４、１．
５ｍＭ Ｈ２ＳＯ４である。８０％Ａ緩衝液／２０％Ｂ
緩衝液からなる混合物を用いて平均的系で行なわれる。
溶媒とカラムの温度は３０℃であり、ペプチドは２１４
ｎｍで検出される。
ヌクレオシル（マーチェリーナゲル）の５μＲＰＣ−１
８カラム（４×２００mm）において逆相ＨＰＬＣにより
追跡する。Ａ緩衝液はＨ２ＳＯ４でpH＝３．５に調整さ
れた２５％アセトニトリルからなり、Ｂ緩衝液は４５％
アセトニトリル、０．１５Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４、１．
５ｍＭ Ｈ２ＳＯ４である。８０％Ａ緩衝液／２０％Ｂ
緩衝液からなる混合物を用いて平均的系で行なわれる。
溶媒とカラムの温度は３０℃であり、ペプチドは２１４
ｎｍで検出される。
上記一段階法における最適収率はインキュベーション１
０分後に得られる。この時点で、反応混合物は、４５％
ヒトインシュリン、１０％Ｄｅｓ−Ｂ３０−インシュリ
ンおよび４５％Ａｒｇ−Ａｏ−インシュリンからなる。
転化の収率を高めるために、二段階法が案出された（例
１１）。
０分後に得られる。この時点で、反応混合物は、４５％
ヒトインシュリン、１０％Ｄｅｓ−Ｂ３０−インシュリ
ンおよび４５％Ａｒｇ−Ａｏ−インシュリンからなる。
転化の収率を高めるために、二段階法が案出された（例
１１）。
例１１：ヒトインシュリンへのＢ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａ
の転化（二段階法） Ｈ２Ｏ ２６．４mlを ４７１mgへ加える。混合物を４℃まで急冷し、３．０ml
の０．２５Ｍ ＮａＯＨを加え、これによりインシュリ
ン前駆体を溶かす。水２００μ中のトリプシン（ノボ
インダストリィ社）６ｇを加える。反応を５時間４℃で
行ない、４ＮＨＣｌ ６００μを加えて停止する。Ｈ
ＰＬＣ（例１０で記載した方法）により測定された収率
は ９１．５％であり、残り８．５％の主な部分は未消化 であった。生成物を、オクタデシルジメチリシリル置換
シリカ（平均粒径：１５μ，孔径：１００Å）のカラム
（５×２５cm）にて調製用ＨＰＬＣにより精製する。カ
ラムを平衡化し、流速２／ｈにて３７％（ｖ／ｖ）エ
タノールを含む０．１８５Ｍ ＫＣｌ／０．６ｍＭ Ｈ
Ｃｌ（pH＝３．１５）で溶出（平均）する。Ｂ−Ｌｙｓ
−Ａｒｇ Ａが４．３カラム容量で溶出し、ヒトインシ
ュリンＢ−３０エステルの結晶化について予め記載され
た結晶化方法〔マルクッセン，ジェイ．(Markussen,J.)
（１９８４）“Diabetes Research Vol I, Laboratory
Methods Part B"ｐ．４０３−４１１，レールナーとポ
ール版〕によりアルコール性プールから単離する。
の転化（二段階法） Ｈ２Ｏ ２６．４mlを ４７１mgへ加える。混合物を４℃まで急冷し、３．０ml
の０．２５Ｍ ＮａＯＨを加え、これによりインシュリ
ン前駆体を溶かす。水２００μ中のトリプシン（ノボ
インダストリィ社）６ｇを加える。反応を５時間４℃で
行ない、４ＮＨＣｌ ６００μを加えて停止する。Ｈ
ＰＬＣ（例１０で記載した方法）により測定された収率
は ９１．５％であり、残り８．５％の主な部分は未消化 であった。生成物を、オクタデシルジメチリシリル置換
シリカ（平均粒径：１５μ，孔径：１００Å）のカラム
（５×２５cm）にて調製用ＨＰＬＣにより精製する。カ
ラムを平衡化し、流速２／ｈにて３７％（ｖ／ｖ）エ
タノールを含む０．１８５Ｍ ＫＣｌ／０．６ｍＭ Ｈ
Ｃｌ（pH＝３．１５）で溶出（平均）する。Ｂ−Ｌｙｓ
−Ａｒｇ Ａが４．３カラム容量で溶出し、ヒトインシ
ュリンＢ−３０エステルの結晶化について予め記載され
た結晶化方法〔マルクッセン，ジェイ．(Markussen,J.)
（１９８４）“Diabetes Research Vol I, Laboratory
Methods Part B"ｐ．４０３−４１１，レールナーとポ
ール版〕によりアルコール性プールから単離する。
結晶を凍結乾燥し、５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ緩衝液
（pH＝９．３）中に濃度１０mg／mlにて溶解する。イン
シュリン前駆体中間体を、３７℃で４０時間カルボキシ
ペプチダーゼＢ（４０μｇ／ml）で消化することにより
ヒトインシュリンへ転化する。この消化混合物へエタノ
ールを最終濃度６０％（ｖ／ｖ）となるように加え、ヒ
トインシュリンを、シュリッヒトクルールら(Schlicht
Krull et al.)により、Horm.Metab.Res.Suppl.,Ser.５
（１９７４）１３４−１４３に記載されているように、
QAE−セファデックス（ファルマシア）カラムにおいて
陰イオン交換クロマトグラフィにより混合物から精製す
る。
（pH＝９．３）中に濃度１０mg／mlにて溶解する。イン
シュリン前駆体中間体を、３７℃で４０時間カルボキシ
ペプチダーゼＢ（４０μｇ／ml）で消化することにより
ヒトインシュリンへ転化する。この消化混合物へエタノ
ールを最終濃度６０％（ｖ／ｖ）となるように加え、ヒ
トインシュリンを、シュリッヒトクルールら(Schlicht
Krull et al.)により、Horm.Metab.Res.Suppl.,Ser.５
（１９７４）１３４−１４３に記載されているように、
QAE−セファデックス（ファルマシア）カラムにおいて
陰イオン交換クロマトグラフィにより混合物から精製す
る。
精製を含む転化の異なった工程での収率を表７に示す。
例１２：Ｂ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａのヒトインシュリンへ
の転化（一段階法） Ｂ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａ １０mgを例１０に記載のよう
にヒトインシュリンへ転化する。ＨＰＬＣから判断され
るようにヒトインシュリンの全収率は４８％であった。
他の生成物は、Ｌｙｓ−Ａｏ−インシュリン（４２
％）、Ｄｅｓ−Ｂ３０−インシュリン（９％）および少
量の非同定化成分（１％）として同定された。
の転化（一段階法） Ｂ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａ １０mgを例１０に記載のよう
にヒトインシュリンへ転化する。ＨＰＬＣから判断され
るようにヒトインシュリンの全収率は４８％であった。
他の生成物は、Ｌｙｓ−Ａｏ−インシュリン（４２
％）、Ｄｅｓ−Ｂ３０−インシュリン（９％）および少
量の非同定化成分（１％）として同定された。
例１３：Ｂ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａから調製されたヒトイ
ンシュリンの結晶化 ヒトインシュリンを例１１に記載のように調製し、次の
分析により特性決定を行なった： ａ）ヒトインシュリンは、尿素含有ポリアクリルアミド
ゲルにおいて塩基性ディスク電気泳動で１つのバンドの
みを示す（シュリッヒトクルールら，Horm.Metabol.Re
s.,Suppl.Ser.５（１９７４）１３４−１４３）。バン
ドは膵臓ヒトインシュリンとして移動する。
ンシュリンの結晶化 ヒトインシュリンを例１１に記載のように調製し、次の
分析により特性決定を行なった： ａ）ヒトインシュリンは、尿素含有ポリアクリルアミド
ゲルにおいて塩基性ディスク電気泳動で１つのバンドの
みを示す（シュリッヒトクルールら，Horm.Metabol.Re
s.,Suppl.Ser.５（１９７４）１３４−１４３）。バン
ドは膵臓ヒトインシュリンとして移動する。
ｂ）Ｚｎ＋＋の存在下でヒトインシュリンを結晶化する
ことにより、一定形状の斜方六面体結晶が得られる（シ
ュリッヒトクルール，Acta Chem.Scand.１０（１９５
６）１４５９−１４６４に記載の方法）。
ことにより、一定形状の斜方六面体結晶が得られる（シ
ュリッヒトクルール，Acta Chem.Scand.１０（１９５
６）１４５９−１４６４に記載の方法）。
ｃ）ヒトインシュリンの生物学的活性をマウスの血糖消
耗試験で測定する。評価された効力は、インシュリンに
ついての第４回国際標準(the 4th International Stand
ard)を用いると２８．１Ｉ．Ｕ．／mg（ｐ０．０５信頼
限界：２５．７−３０．７１．Ｕ．／mg）であった。
耗試験で測定する。評価された効力は、インシュリンに
ついての第４回国際標準(the 4th International Stand
ard)を用いると２８．１Ｉ．Ｕ．／mg（ｐ０．０５信頼
限界：２５．７−３０．７１．Ｕ．／mg）であった。
ｄ）ヒトインシュリンのアミノ酸組成を、６ＮＨＣｌ中
で２４時間、４８時間および９６時間１１０℃で加水分
解後に測定し、THr.Ser.ProおよびＮＨ３についての値
を直線状回帰線（ｔ＝０）により測定する。ＶａｌとＩ
ｌｅの値が加水分解の不明確な時間へ外挿される。1/2
Ｃｙｓの値を４Ｍメタンスルホン酸中で２４時間加水分
解後に測定する。アミノ酸組成を表８に記す。
で２４時間、４８時間および９６時間１１０℃で加水分
解後に測定し、THr.Ser.ProおよびＮＨ３についての値
を直線状回帰線（ｔ＝０）により測定する。ＶａｌとＩ
ｌｅの値が加水分解の不明確な時間へ外挿される。1/2
Ｃｙｓの値を４Ｍメタンスルホン酸中で２４時間加水分
解後に測定する。アミノ酸組成を表８に記す。
図１は式Ｉで表わされるインシュリン前駆体の構成を示
す模式図、 図２はプラスミドpMT ５７９の調製を示す模式図、 図３はプラスミドpMT ５８５の調製を示す模式図、 図４はプラスミドpMT ６４４の調製を示す模式図、 図５はプラスミドpMT ６１１の調製を示す模式図、 図６はプラスミドpMT ６５０の調製を示す模式図、 図７はプラスミドpMT ６５８の調製を示す模式図、 および 図８はＢ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａのヒトインシュリンへの
インビトロ転化を逆相高圧液体クロマトグラフィーによ
り測定した結果を示すグラフである。
す模式図、 図２はプラスミドpMT ５７９の調製を示す模式図、 図３はプラスミドpMT ５８５の調製を示す模式図、 図４はプラスミドpMT ６４４の調製を示す模式図、 図５はプラスミドpMT ６１１の調製を示す模式図、 図６はプラスミドpMT ６５０の調製を示す模式図、 図７はプラスミドpMT ６５８の調製を示す模式図、 および 図８はＢ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａのヒトインシュリンへの
インビトロ転化を逆相高圧液体クロマトグラフィーによ
り測定した結果を示すグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭56−150051（ＪＰ，Ａ) 特開 昭57−163352（ＪＰ，Ａ) 特開 昭59−196093（ＪＰ，Ａ)
Claims (5)
- 【請求項１】次式Ｉ： Ｂ−Ｘ−Ｙ−Ａ （Ｉ） （式中、ＢおよびＡはヒトインシュリンにおけるように
架橋結合したヒトインシュリンのＢ鎖およびＡ鎖であ
り、ＸおよびＹはそれぞれリジンまたはアルギニンであ
る。）で表わされるヒトインシュリン前駆体をコードす
るDNA配列を含む発現ビヒクルで形質転換された酵母株
を適当な培地で培養し、インシュリン前駆体を回収し、
酵素処理によりヒトインシュリンへ転化することを含ん
でなるヒトインシュリンの製法。 - 【請求項２】前記酵素処理が、トリプシン及びカルボキ
シペプチダーゼＢによる、インシュリン前駆体を含有す
る水溶液の処理である、特許請求の範囲第１項に記載の
方法。 - 【請求項３】トリプシンとカルボキシペプチダーゼＢを
用いた一段階二元酵素処理を含んでなる特許請求の範囲
第２項記載の方法。 - 【請求項４】トリプシンでインシュリン前駆体を処理し
その後反応生成物をカルボキシペプチダーゼＢで処理す
ることからなる特許請求の範囲第２項記載の方法。 - 【請求項５】トリプシン処理をpH11〜12の範囲で行なう
特許請求の範囲第２項又は第４項記載の方法。
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| US5426036A (en) * | 1987-05-05 | 1995-06-20 | Hoechst Aktiengesellschaft | Processes for the preparation of foreign proteins in streptomycetes |
| DE3837271A1 (de) * | 1988-11-03 | 1990-05-10 | Hoechst Ag | Verfahren zur selektiven spaltung von fusionsproteinen |
| CA1340772C (en) * | 1987-12-30 | 1999-09-28 | Patricia Tekamp-Olson | Expression and secretion of heterologous protiens in yeast employing truncated alpha-factor leader sequences |
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| DE58906966D1 (de) * | 1988-06-23 | 1994-03-24 | Hoechst Ag | Mini-Proinsulin, seine Herstellung und Verwendung. |
| US6875589B1 (en) | 1988-06-23 | 2005-04-05 | Hoechst Aktiengesellschaft | Mini-proinsulin, its preparation and use |
| EP0367163B1 (de) * | 1988-11-03 | 1996-01-03 | Hoechst Aktiengesellschaft | Verfahren zur Herstellung eines Insulin-Vorprodukts in Streptomyceten |
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| DE3844211A1 (de) * | 1988-12-29 | 1990-07-05 | Hoechst Ag | Neue insulinderivate, verfahren zu deren herstellung, ihre verwendung und eine sie enthaltende pharmazeutische zubereitung |
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| NZ239652A (en) * | 1990-09-05 | 1992-09-25 | Hoechst Ag | Hydrolysis of preproinsulin to insulin and analogues using clostripain and optionally carboxypeptidase |
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| KR100381494B1 (ko) * | 1997-06-30 | 2003-07-22 | 바이오 테크놀로지 제네랄 코오포레이션 | 인간인슐린의제조방법 |
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