JPH088871B2 - インシュリン前駆体をコードするｄｎａ配列 - Google Patents

インシュリン前駆体をコードするｄｎａ配列

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JPH088871B2
JPH088871B2 JP5121394A JP12139493A JPH088871B2 JP H088871 B2 JPH088871 B2 JP H088871B2 JP 5121394 A JP5121394 A JP 5121394A JP 12139493 A JP12139493 A JP 12139493A JP H088871 B2 JPH088871 B2 JP H088871B2
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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は新規生合成インシュリン
前駆体および該生合成インシュリン前駆体からのヒトイ
ンシュリンの調製に関する。
【０００２】
【従来の技術】ヒトインシュリンは２つのペプチド鎖、
すなわち２１個のアミノ酸残基を含むＡ鎖と３０個のア
ミノ酸残基を含むＢ鎖からなる。Ａ鎖とＢ鎖は、それぞ
れＡ７とＢ７およびＡ２０とＢ１９のシスティニル基を
結ぶ２つのジスルフィド橋により一緒に結合している。
第三のジスルフィド橋がＡ６とＡ１１のシスティニル基
の間に形成される。
【０００３】ヒトインシュリンはプレプロインシュリン
の形で膵臓においてインビボ生産される。プレプロイン
シュリンは、２４個のアミノ酸残基のプレペプチドとこ
れに続く８６個のアミノ酸残基とからなり、次の構成：
プレペプチド-B-Arg-Arg-C-Lys-Arg-A（Ｃは３１個のア
ミノ酸残基のＣ−ペプチドである）を有するものであ
る。
【０００４】小島細胞からの排出の間、プレペプチドが
開裂除去し次いでプロインシュリンはジスルフィドが折
りたたまれてジスルフィド橋を形成する構造となる。Ｃ
−ペプチドは、次いでタンパク質加水分解で削除され成
熟したヒトインシュリンになる。
【０００５】幾つかの試みがインシュリン製造、特に組
換えＤＮＡ技術を用いたヒトインシュリンの製造につい
てなされてきた。ヨーロッパ特許出願公開第００５５９
４５Ａ号では、大腸菌からのプロインシュリンまたはミ
ニプロインシュリンの調製が記載されている。この方法
は、キメラポリペプチドの発現、このキメラポリペプチ
ドのインビトロ開裂およびＡ鎖−Ｂ鎖間のジスルフィド
結合のインビトロ形成とＡ鎖−Ｂ鎖間の橋かけ鎖の削除
によりヒトインシュリンを得ることからなる。ヨーロッ
パ特許出願公開第６８７０１号には、大腸菌の形質転換
によりいくらか短くしたＣ−ペプチドで変性されたプロ
インシュリンの調製が提案されている。
【０００６】上記方法は、主として、大腸菌を形質転換
微生物として使用するという事実に由来する幾つかの欠
点を有する。発現産物は細胞から分泌されるだけでなく
大腸菌宿主微生物において細胞内に蓄積される。しかし
ながら、プレプロインシュリンまたは変性されたプレプ
ロインシュリン型の発現したポリペプチド産物の蓄積
は、発現産物の酵素分解の危険性を増加する。さらに、
プロセッシング、折りたたみおよびジスルフィド橋の確
立は明らかにインビトロで行わねばならない。
【０００７】哺乳動物ポリペプチドの発現に対しより都
合の良い系は真核生物細胞であると思われ、真核生物特
に酵母において外来遺伝子を発現させる幾つかの試みが
なされてきた。酵母におけるインターフェロンの発現は
ヨーロッパ特許出願公開第００６００５７Ａ号に記載さ
れ、酵母と異種のタンパク質の酵母における発現と分泌
はヨーロッパ特許出願公開第００８８６３２Ａ号、同第
００６２０１Ａ号および同第０１２３５４４Ａ号に記載
されている。
【０００８】酵母における“プレ”−プロインシュリン
の発現方法および発現した“プレ”−プロインシュリン
のプロセッシングと分泌方法はヨーロッパ特許出願公開
第０１２１８８４Ａ号に記載されている。しかしなが
ら、プロインシュリン型のインシュリン前駆体は酵母に
おいて酵素分解を受けやすく、その結果、もしあるとし
ても分泌されたプロインシュリンまたは成熟インシュリ
ンが非常に低い収率で得られるだけであるということが
出願人により示されている。
【０００９】酵母においてはヒトプロインシュリンおよ
びいくらか短くしたＣ−ペプチドを有するプロインシュ
リン類似物がＣ−ペプチド領域の側方に位置する２つの
二塩基性配列で酵素分解を特に受けやすいということが
示されている。明らかにこれらの開裂はＳ−Ｓ橋の確立
前に生じ、その結果、Ｃ−ペプチド、Ａ鎖およびＢ鎖が
形成される。
【００１０】
【発明の目的および構成】本発明の目的は、Ａ部分とＢ
部分の間に正しく位置したジスルフィド橋を有しながら
酵母において高収率で発生し、ヒトインシュリンへ容易
に転化されうるインシュリン前駆体を提供するものであ
る。
【００１１】プロインシュリン型の幾つかのインシュリ
ン前駆体（プロインシュリンを含む）が研究されてきて
いる（表１参照）。当該前駆体をコードするＤＮＡ配列
を酵母ベクター系へ挿入し、上記の技術および後述する
技術にしたがって酵母へ形質転換する。インシュリン前
駆体をコードする遺伝子は、前駆体遺伝子の上流側で融
合する酵母識別性分泌シグナルおよびプロセッシングシ
グナルをコードするＤＮＡ配列を有する。
【００１２】この研究において、リーダーの最後の４つ
の残基（Glu-Ala-Glu-Ala)をコードする部分を除去した
変性ＭＦα１リーダー配列が用いられる。変性されたＭ
Ｆα１リーダーはプロセッシングシグナルとして二塩基
性配列Lys-Arg を含み、これが次に前駆体をコードする
遺伝子の５′−末端と融合する。全ての構築においてリ
ーダー配列が開裂除去され、すなわち全てのインシュリ
ン前駆体遺伝子の上流の二塩基性配列Lys-Arg で開裂が
生じることが見い出された。
【００１３】しかしながら、Ｃ−ペプチドまたは変性さ
れたＣ−ペプチドの側方に位置する２つの二塩基性配列
を含むすべてのインシュリン前駆体構築物において、正
しくジスルフィド橋が位置する以前に両方の二塩基性部
位でプロセッシングが見られ、発酵液から一本鎖の非プ
ロセス前駆体分子が単離されなかった。したがって酵母
はプロインシュリン型のインシュリン前駆体製造用発現
型系とし使用することができない。
【００１４】驚くべきことに、ここにおいて、ヒトイン
シュリンのＡ鎖とＢ鎖を１つの二塩基性配列でのみ結合
したとき（表１の構築物７−１０）、酵母において二塩
基性配列での開裂が起こらず、ジスルフィド橋が正しく
位置した一本鎖インシュリン前駆体が当該インシュリン
前駆体をコードするＤＮＡ配列で形質転換された酵母株
から発酵液中で高収率にて得られるということが見い出
された。本発明は、前駆体をコードする遺伝子の上流に
位置するリーダー配列でLys-Arg での完全開裂が見られ
るので、より一層驚くべきものであろう。
【００１５】Ａ鎖とＢ鎖の間に１つの二塩基性配列を含
むこの種のインシュリン前駆体は後述するようにインビ
トロ消化によりヒトインシュリンへ簡単に転化すること
ができるので、本発明はヒトインシュリン製造のための
経済的に魅力のある方法を提供するものである。
【００１６】第一に、本発明は、次式： Ｂ−Ｘ−Ｙ−Ａ （Ｉ） （式中、ＢおよびＡはヒトインシュリンにおけるように
架橋結合したヒトインシュリンのＢ鎖およびＡ鎖であ
り、ＸおよびＹはそれぞれリシンまたはアルギニン残基
を表す。）で表される新規インシュリン前駆体を提供す
るものである。上記式（Ｉ）のインシュリン前駆体は、
B-Lys-Lys-A 、B-Lys-Arg-A 、B-Arg-Lys-A およびB-Ar
g-Arg-A であり、最初の２つが最も好ましい。
【００１７】本発明の第二の点によれば、酵母における
前記インシュリン前駆体の製造方法を提供するものであ
り、この方法により、インシュリン前駆体をコードする
ＤＮＡ配列からなる発現ビヒクルを適当な培養基で培養
し、この培養基からインシュリン前駆体を回収する。こ
のように形質転換された酵母株を培養すると、本発明に
よる４つのインシュリン前駆体の全てが高収率で培養液
から単離され、特にB-Lys-Lys-A とB-Lys-Arg-A が高収
率で発現する。したがって、発現レベルの点から、これ
ら２つの前駆体が好ましいものであろう。
【００１８】発現産物を単離し、インシュリン免疫反応
性物質（ＩＲＩ−ペプチド）を精製し、そして微量配列
分析により特性を決定した。上記式（Ｉ）の前駆体が、
３つのジスルフィド橋により次の１／２システイン残
基：Ａ６−Ａ１１、Ａ７−Ｂ７、Ａ２０−Ｂ１９が連結
された一本鎖分子であること、すなわち酵母においてヒ
トインシュリンと比較してジスルフィド橋を正しい位置
に有する前駆体が発現することが見い出された。新規イ
ンシュリン前駆体の構造を図１に示す。
【００１９】本発明はさらに、酵母宿主において上記イ
ンシュリン前駆体を効率良く製造するためならびに栄養
培地へこの前駆体を分泌するための新規発現ビヒクルを
提供するものである。発現ビヒクルは、酵母宿主におい
て安定に維持される複製系、上記式（Ｉ）のインシュリ
ン前駆体をコードするＤＮＡ配列およびプロモーターな
らびにターミネーター配列からなる。
【００２０】発現ビヒクルは、所望産物をコードするＤ
ＮＡ配列の上流に、発現産物を酵母分泌系へ向けさせそ
して増殖培地へ発現産物を分泌するのを確実にする予備
領域（preregion)を含んでもよい。この予備領域は、分
泌をもたらす天然産生シグナルもしくはリーダーペプチ
ドまたは合成配列であってよく、一般に、分泌の間所望
産物から開裂し培養液からただちに単離される成熟産物
を残す。
【００２１】酵母に対し、非常に適したリーダー配列は
酵母ＭＦα１リーダー配列である〔クルジャン，ジェ
イ．(Kurjan,J.) とヘルスコウィッツ，アイ．(Herskow
itz,I.）、Cell ３０、（１９８２）、９３３−９４
３〕。発現ビヒクルは宿主微生物中で複製しうるプラス
ミドまたは宿主微生物染色体へ組込まれうるプラスミド
でよい。使用するビヒクルは、それぞれ選択的開裂部位
により分離された所望ＤＮＡ配列の繰り返し配列の発現
をコードする。
【００２２】所望ＤＮＡ配列の発現は所望産物をコード
するＤＮＡ配列に正しく位置するプロモーター配列の制
御下であり、この結果宿主微生物に所望産物が発現す
る。酵母宿主固有の遺伝子からのプロモーターを使用す
るのが好ましく、たとえばＴＰＩ（トリオース ホスフ
ェート イソメラーゼ）遺伝子のプロモーターまたはＭ
Ｆα１−プロモーターである。
【００２３】所望産物のＤＮＡ配列の後には転写終結配
列が続く。この転写終結配列は、好ましくは、酵母宿主
に固有の遺伝子からのもの、たとえばＴＰＩ−遺伝子ま
たはＭＦα１遺伝子のターミネーターである。本発明は
また上記式（Ｉ）のインシュリン前駆体をコードする新
規合成ＤＮＡ配列を提供するものである。新規ＤＮＡ配
列は化学的に合成された３０量体オリゴヌクレオチドを
用いてヒトプロインシュリン遺伝子をインビトロでの突
然変異誘発でループアウト（loop out）し、もとのＣ−
ペプチドコード配列を欠失させることにより構築され
る。
【００２４】この型のインシュリン前駆体は、ケムラー
（Kemmler)により記載されたプロインシュリンからイン
シュリンへのインビトロ転化と同様の方法〔ケムラーら
（Kemmler et al.) 、The Journal of Biological Chem
istry 、２４６（１９７１）、６７８６−６７９１〕に
より、トリプシンおよびカルボキシペプチダーゼＢを用
いてインビトロ消化により、ＸおよびＹアミノ酸残基を
除去することによりヒトインシュリンへ転化されうる。
【００２５】したがって本発明は、インシュリンを前駆
体の水溶液をトリプシンおよびカルボキシペプチダーゼ
Ｂで処理し、その後ヒトインシュリン該溶液から回収す
ることからなる、上記式（Ｉ）で表されるインシュリン
前駆体を成熟したヒトインシュリンへ酵素的に転化する
方法を提供するものである。
【００２６】酵素転化は、トリプシンとカルボキシペプ
チダーゼＢが反応混合物中に同時に存在することによる
一段階法で行ってもよい。一段階反応はほぼ中性pHにて
若干高めた温度で行われるのが好ましい。ヒトインシュ
リンの収率は約５０％である。より優れた収率は、Ｂ−
Ｘ−Arg −Ａ型のインシュリン前駆体を二段階で転化す
ることにより得られる。このような二段階転化におい
て、最初の工程ではトリプシンを使用し、消化産物を単
離し、続いてカルボキシペプチダーゼＢで消化する。ト
リプシン消化を高いpHたとえばpH１１〜１２の範囲でそ
して低温（約４℃）で行うことにより、ヒトインシュリ
ンの総収率は約８０％であった。
【００２７】高いpHでのトリプシン消化における高収率
を得るために、Ｂ３２に位置するアミノ酸残基（第１図
参照）はアルギニンでなければならない（式Ｉにおいて
Ｙ＝Ａｒｇ）。この基はいまだに主として陽電荷に帯電
し、トリプシン開裂を受けやすい。したがって、酵母に
おいて高いレベルで発現し非常に高収率でヒトインシュ
リンへ転化されるので前駆体B-Lys-Arg-A が最も好まし
い前駆体であろう。
【００２８】最後に、本発明は、前記式Ｉで表されるイ
ンシュリン前駆体をコードするＤＮＡ配列からなる複製
可能な発現ビヒクルで形質転換された酵母株を適当な栄
養培地で培養し、このインシュリン前駆体を培養基から
回収しヒトインシュリンへ転化することからなるヒトイ
ンシュリンの調製方法を提供するものである。本発明は
説明したトリプシンとカルボキシペプチダーゼＢによる
転化に限定されるものではない。同様な特異性を有する
他のインビトロ酵素系が見い出される場合にはこのよう
な酵素系も同様に使用されうる。
【００２９】
【本発明の構成および効果】
１．ヒトプロインシュリンＢ−Ｃ−Ａをコードする遺伝
子の調製ヒト膵臓から精製された総ＲＮＡ〔キルウィ
ン，ジェイ．エム．（Chirgwin, J.M.) 、プルジビラ,
エー. イー. （Przybyla, A.E.）、マクドナルド，アー
ル．ジェイ．（McDonald,R.J.)とラッター, ダブリェ.
ジェイ. （Rutter,W.J.)、Biochemistry１８．（１９７
９）５２９４−５２９９〕を、ＡＭＶ逆転写酵素と１．
ストランドプライマーとしてｄ(GCTTTATTCCATCTCTC) を
用いて逆転写する〔ベール，イー．（Boel,E.)、ブース
ト，ジェイ．（Vuust,J.) 、ノリス，エフ．（Norris,
F.)、ノリス, ケー．（Norris,K.)、ウィンド, エー．
（Wind,A.)、リーフェルド, ジェイ. エフ．（Rehfeld,
J.F.) とマーカー，ケー．エー．（Marcker,K.A.）、Pr
oc.Natl.Acad.Sci.USA ８０、（１９８３）、２８６６
−２８６９〕。
【００３０】ヒトプロインシュリンｃＤＮＡを調製用尿
素−ポリアクリルアミドゲル精製した後、第二のストラ
ンドを、ＤＮＡポリメラーゼ大分画と２．ストランドプ
ライマーとしてｄ（CAGATCACTGTCC)を用いてこのテンプ
レート上で合成する。Ｓ１ヌクレアーゼ消化後、ヒトプ
ロインシュリンｄｓ．ｃＤＮＡをポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動により精製し、末端にターミナルトランスフ
ェラーゼを付け、大腸菌においてｐＢＲ ３２７〔ソル
ベロンら（Sorberon et.al）、Gene ９、（１９８
０）、２８７−３０５〕のＰｓｔＩ部位でクローンす
る。
【００３１】このプラスミドを有する正しいクローン
を、制限エンドヌクレアーゼ分析により組換え体から同
定し、ヌクレオチド配列決定により同定する〔マキサ
ム，エー．（Maxam,A.) とギルバート, ダブリュ．（Gi
lbert,W.) 、Methods in Enzymology.６５（１９８
０）、４９９−５６０．サンガー、エフ．（Sanger,
F.)、ニクレン, エス，（Nicklen,S.）とカウルソン，
エー．アール．（Coulson,A.R.）、Proc.Nat1.Acad.Sc
i.USA、７４（１９７７）、５４６３−５４６７〕。
【００３２】ヒトプロインシュリンｃＤＮＡクローンの
単離のために使用される１．ストランドプライマーと
２．ストランドプライマーは、ポリスチレン支持体上で
ホホトリエステルアプローチを用いて半自動的カラム合
成により合成される〔エイチ．イトー（H.Ito)、ワイ．
イケ（Y.Ike)、エス. イカタ（S.Ikata)、とケイ．イタ
クラ（K.Itakura)、Nucleic Acids Research １０、
（１９８２）、１７５５−７６９〕．
【００３３】２．Ｂ−Ｘ−Ｙ−Ａをコードする遺伝子の
調製 ４つのインシュリン前駆体B-Lys-Lys-A 、B-Lys-Arg-A
、B-Arg-Lys-A およびB-Arg-Arg-A をコードする遺伝
子は、線状ヒトプロインシュリン配列Ｂ−Ｃ−Ａをコー
ドする断片を環状の一重らせんＭ−１３バクテリオファ
ジベクターに挿入し、ヒトプロインシュリン配列をそれ
ぞれ化学的に合成された３０量体欠失プライマーＫＦＮ
４１、ＫＦＮ４、ＫＦＮ４２およびＫＦＮ１８と“万能
（universal)”１５量体Ｍ１３ジデオモシ配列プライマ
ーで部位特異的突然変異〔ケイ．ノリスら、Nucl.Acid
s.Res. 、１１（１９８３）、５１０３−５１１２〕す
ることにより作られる。二重らせん制限分画（ＸｂａＩ
−ＥｃｏＲＩ）を部分的二重らせん環状ＤＮＡで切り離
し、ＰＵＣ１３またはｐＴ５へ連結する。大腸菌の形質
転換および再形質転換により、所望の遺伝子を含むプラ
スミドを有する形質転換体が同定される。
【００３４】４つの突然変異欠失プライマーＫＦＮ４、
ＫＦＮ１８、ＫＦＮ４１およびＫＦＮ４２は、自動ＤＮ
Ａ合成機〔アプライド バイオシステムズ（Applied Bi
osystems）３８０Ａ型〕にて、ホスホロアミダイト化学
と市販の試薬を用いて合成される〔エス．エル．ビュー
ケージ（S.L.Beaucage) とエム. エイチ. カルサース
（M.H.Caruthers)（１９８１）Tetrahedron Letters ２
２、１８５９−１８６９〕。変性状態下にポリアクリル
アミドゲル電気泳動によりオリゴヌクレオチドを精製す
る。４つの切失プライマーは次のようである：
【００３５】 ＫＦＮ 配 列 ４ TCCACAATGCCTCTCTTAGTCTTGGGTGTG （配列番号：１） １８ TCCACAATGCCTCTTCTGGTCTTGGGTGTG （配列番号：２） ４１ TCCACAATGCCCTTCTTGGTCTTGGGTGTG （配列番号：３） ４２ TCCACAATGCCCTTTCTGGTCTTGGGTGTG （配列番号：4 ）
【００３６】３．プラスミド構築 ヒトインシュリン前駆体をコードする遺伝子を、ＴＰＩ
プロモーター（ＴＰＩｐ）〔ティ．アルバー．（T.Albe
r)とジィ．カワサキ（G.Kawasaki)NucleotideSequence
of the Triose Phosphate Isomerase Gene of Saccharo
myces cerevisiae 、J.Mol.Applied Genet.１（１９８
２）４１９−４３４〕、ＭＦα１ リーダー配列〔ジェ
イ．クルジャン（J.Kurjan) とアイ. ヘルスコウイッツ
（I.Herskowitz) 、structure of a Yeast Pheromone G
ene （ＭＦα）：A Putative α−Factor Precursor C
ontains four Tandem Copies of Mature α−Facfor.C
ell ３０（１９８２）９３３−９４３〕および酵母菌
（S.cerevisiae) のＴＰＩからの転写ターミネータ配列
ＴＰＩT をコードする断片と組合せる。
【００３７】これらの断片（ＴＰＩT ）は、インシュリ
ン前駆体をコードする遺伝子を高い割合で転写すること
のできる配列をもたらし、ならびにインシュリン前駆体
を分泌経路へ局在化させおよび増殖培地への実際的排出
を行いうる予備配列をももたらす。発現プラスミドはさ
らに複製の酵母２μオリジン（origin) と選択性マーカ
ーＬＥＵ２とからなる。
【００３８】酵母におけるα−ファクターのインビボ成
熟化の間、Lys-Arg-配列を識別するエンドペプチダーゼ
とGlu-Ala 残基を除去するアミノジペプチダーゼの逐次
作用により〔ジュリウス．ディ．ら（Julius,D.et al.)
Cell ３２（１９８３）８３９−８５２〕、α−ファク
ター前駆体からＭＦαリーダーペプチドの最後（Ｃ−末
端）の６つのアミノ酸（Lys-Arg-Glu-Ala-Glu-Ala)を除
去する。酵母アミノジペプチダーゼの必要性を排除する
ために、ＭＦα１リーダーのＣ−末端Glu-Ala-Glu-Ala
をコードする配列をインビトロ突然変異を経て除去す
る。
【００３９】好ましい構築において、変性された発現単
位は安定で高いコピー数の酵母プラスミドＣＰＯＴ（AT
CC Ｎｏ．３９６８５）へ移される。これは増殖培地中
でグルコースの存在下により簡単に選択することができ
る。プラスミドＣＰＯＴはベクターＣ１／１に基づく
が、これは最初のｐＢＲ ３２２ ＢｇｌＩ−ＢａｍＨ
Ｉ断片をｐＵＣ１３からの同様なＢｇｌＩ−ＢａｍＨＩ
断片で置換し続いてＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ断片としてS.
pombe 遺伝子（ＰＯＴ）を挿入してＣＰＯＴとする。Ｃ
ｌ／１はヨーロッパ特許出願第０１０３４０９Ａ号に記
載のようにｐＪＤＢ２４８〔ベッグスら（Beggs et a
l)、Nature ２７５、１０４−１０９（１９７８）〕か
ら誘導される。
【００４０】４．形質転換 上記のように調製したプラスミドは、グルコース増殖を
選択することによりＴＰＩ遺伝子に欠失を有する酵母
（S.cerevsiae)株へ形質転換される。このような株は、
通常、単一の炭素源としてのグルコース増殖に不安定で
ありガラクトース乳酸培地で非常にゆっくり増殖する。
この欠陥はトリオースリン酸イソメラーゼ遺伝子におけ
る突然変異によるもので、この遺伝子の大部分を欠失さ
せ酵母（S.cerevsiae)ＬＥＵ２遺伝子で再置換させるこ
とにより得られうる。増殖欠失のために、ＴＰＩをコー
ドする遺伝子を含むプラスミドに対し強い選択性があ
る。
【００４１】５．酵母におけるインシュリン前駆体の発
現 異なったインシュリン前駆体をコードするプラスミドを
含む酵母株をＹＤＤ培地（シャーマン，エフ．ら（Sher
man,F.et al)、Methods in Yeast Genetics 、コールド
スプリング ハーバー ラボラトリィ（Cold Spring
Harbor Laboratory)１９８１〕で増殖する。それぞれの
株に対し、２Ｌのバッフルフラスコ中のそれぞれ１Ｌの
２つの培地を、６００nmのＯＤが約１５に達する（約４
８時間）まで３０℃で振とうする。遠心分離後、上清を
別の分析のために除去する。
【００４２】免疫反応性インシュリン（ＩＲＩ）を、構
築物１−６に対する標準物として半合成ヒトインシュリ
ン〔ノボインダストリィ社NOVO Industri Ａ／Ｃ）〕を
用いてラジオイムノアッセイ〔ヘディング，エル．（He
ding,L.)Diabetologia８（１９７２）、２６０−２６
６〕により測定する。半合成ヒトインシュリンまたは当
該インシュリン前駆体を構築物７−１０として用いる。
インシュリン前駆体、B-Arg-Arg-C-ペプチド-Lys-Arg-A
（ヒトプロインシュリン）に対し、免疫反応性Ｃ−ペプ
チド（ＩＲＣ）の発現レベルをヒトＣ−ペプチドラジオ
イムノアッセイ（ヘディング，エル．ジィ．Diabetolog
ia １１、（１９７５）５４１−５４８）を使用するこ
とにより測定する。
【００４３】この分析において、 125Ｉ-Tyr- ヒト−Ｃ
−ペプチドをトレーサーとして用い、ヒトＣ−ペプチド
とヒトプロインシュリンとに全く同じに反応するモルモ
ットの抗−ヒト−Ｃ−ペプチド血清、Ｍ１２２８〔ファ
ーバー，オー．ケィ．(Faber,O.K. ）らHoppe Seyler′
sZ.Physiol.Chem.３５７（１９７６）７５１−７５７〕
を抗体として用いる。ヒトプロインシュリンを標準物と
して用いる〔クルーセ，ブイ．ら（Kruse,V.et al.）Di
abetolgia ２７、（１９８４）４１４−４１５〕。形質
転換酵母株の発酵液における免疫反応性インシュリンと
免疫反応性Ｃ−ペプチドの発現レベルを表１にまとめ
る。
【００４４】菌株ＭＴ５９３、ＭＴ６１６、ＭＴ６５５
およびＭＴ６６０は、全て１９８５年１月１６日にドイ
ッチェ サンムルング フォン ミクロオルガニスメン
（ＤＳＭ）（グッチゲン、ドイツ国）にそれぞれ受託番
号ＤＳＭ３１９４、ＤＳＭ３１９５、ＤＳＭ３１９８お
よびＤＳＭ３１９９をもって国際寄託された。
【００４５】
【表１】
【００４６】表１から明らかなように、本発明による前
駆体の発現レベルとプロインシュリン型前駆体、すなわ
ちＣ−ペプチドまたは変性Ｃ−ペプチドの側方にある一
対の二塩基性アミノ酸を含む前駆体の発現レベルには顕
著な差異がある。
【００４７】６．インシュリン前駆体のヒトインシュリ
ンへの転化 インシュリン前駆体のヒトインシュリンへの転化は、二
段階酵素法：
【化１】 により、または反応混合物中にトリプシンとカルボキシ
ペプチダーゼＢが同時に存在する組合せ一段階法のいず
れかにより行われる。
【００４８】上記式中および以下の明細書中、酵素開裂
法のより良き説明のために、Ａ鎖およびＢ鎖間のジスル
フィド橋は括弧
【化２】 により示される。上記式中、
【化３】 は一本鎖インシュリン前駆体である（図１）；
【化４】 は、残基Ｎｏ．３２（Lys またはArg)と残基Ｎｏ．３３
（Ａｌ＝Ｇｌｙ）の間のペプチド結合が加水分解された
２本鎖インシュリン前駆体中間体である；
【化５】 はヒトインシュリンである。Ｂ−Ｘ−Ｙ−Ａ型の残りの
式において、Ａ鎖とＢ鎖は天然インシュリンにおけるよ
うにジスルフィド橋により接続されているものである。
【００４９】酵素転化はインシュリン前駆体の水溶液中
で行われる。トリプシン型は本発明の実施のための物質
ではない。トリプシンは、通常ウシおよびブタ膵臓から
高純度で得られる非常に特徴のある酵素である。トリプ
シン様特異性を有する酵素、すなわちプラスミン、クロ
ストリペインおよびアクロモバクターリチカス（Achrom
obacter lyticus)プロテアーゼもまた使用される。
【００５０】高い転化率を得るために、カルボキシペプ
チダーゼＡ活性を含まない非常に高純度のカルボキシペ
プチダーゼＢを使用することが重要である。これは、市
販されているカルボキシペプチダーゼＢを、たとえばア
フィニティクロマトグラフィーまたはイオン交換クロマ
トグラフィにより精製することにより達成されうる。こ
れに代わり、カルボキシペプチダーゼＡ阻害剤たとえば
ε−アミノ−ｎ−カプロン酸またはカルボベンゾキシグ
リシンを消化混合物へ加えてもよい。
【００５１】一段階転化は、若干高めた温度（３５〜４
０℃）で、pH７〜８にて行うのが好ましい。トリプシン
とカルボキシペプチダーゼＢの濃度は約５μg ／mlであ
り、基質濃度は約１mg／mlであるのが好ましい。二段階
転化法において、トリプシン消化は高pHで行うのが好ま
しい。高pH（１１〜１２の範囲）では、インシュリン前
駆体分子におけるリシンアミノ酸残基（たとえば図１中
B-Lys-Arg-A におけるＢ２９−Lys とＢ３１−Lys)がほ
とんど非荷重（リシン残基のｐｋａは約９．０）であ
り、トリプシンでの開裂が起こらない。しかしながら、
たとえば
【化６】 において、Ｂ３２−アルギニン残基（ｐｋａ＝１２）は
まだ主として陽性に帯電しており、したがってトリプシ
ン開裂を受けうる。Ｂ２２−アルギニン残基での開裂は
非常に遅い速度で起こるだけであり、これはたぶん立体
障害に起因するものであろう。
【００５２】
【化７】 のトリプシン消化の間安定なpH値は、
【化８】 の高収率に対し重要である。pHを１１．８−１１．９に
安定化する目的で幾つかの異なった緩衝液系が試され
た。通常高pH値で使用される緩衝液系ＨＰＯ4 --／ＰＯ
4 --がpH１１．８で良好な緩衝能を有する。しかしなが
ら、この緩衝系は３つの主な欠点を有する。第一に、Ｈ
ＰＯ4 --／ＰＯ4 --- 溶液のpHは温度変化に非常に敏感
で、たとえば２５℃から４℃への変化でpH値が０．７pH
単位減るであろう。
【００５３】第二に、Ｃａ++（これはトリプシンの安定
化のために存在している場合がある）が、Ｃａ3(ＰＯ4)
2 とＣａＨＰＯ4 の溶解度が比較的低いので沈でんする
であろう。第三に、緩衝系ＨＰＯ4 --／Ｈ2 ＰＯ4 - と
Ｈ2 ＰＯ4 --／Ｈ3 ＰＯ4の作用のために瞬時に消化
混合物を酸性化する（反応を停止する）ことができな
い。その結果、この系は、酸性化の間、一定期間中性pH
となり、この間にトリプシンがただちに不所望産物ｄｅ
ｓ（Ｂ３０）インシュリンを作ることになる。これらの
欠点の結果として、むしろ一般的でない緩衝系Ｈ2 Ｏ／
ＯＨ- が使用される。この系は上述の欠点を有さない。
【００５４】
【化９】 へのトリプシン消化の最適条件は、
【化１０】 約２０mg／ml、トリプシン２００μｇ／ml；緩衝液：３
７．５ｍＭ ＮａＯＨ（この結果、２５℃で測定された
pHは１１．８６であった）；温度約４℃と培養期間約８
０分である。
【化１１】 の収率は９０．５％であった。
【００５５】トリプシン転化産物
【化１２】 は幾つかの一般的方法、たとえば調製用ＨＰＬＣ、吸着
クロマトグラフィ、およびイオン交換クロマトグラフィ
により精製される。
【化１３】 はほぼ定量的に
【化１４】 （ヒトインシュリン）ヘカルボキシペプチダーゼＢの消
化により転化される。この転化の最適条件は、
【化１５】 約５mg／ml、カルボキシペプチダーゼＢ約５μg ／ml；
緩衝液：５０ｍＭトリスＨＣｌ、pH＝９．３、温度約３
７℃および培養時間約３０分である。収率は
【化１６】 の転化率９９．５％であった。
【００５６】インシュリン前駆体
【化１７】 のヒトインシュリンへの転化は、逆相高圧液体クロマト
グラフィ（ＨＰＬＣ）により定量的に追跡され、図８で
示される。図８に関して、
【化１８】 を５０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液pH＝９．３に５mg／ml
の濃度に溶かし、３７℃にて５μg ／mlカルボキシペプ
チダーゼＢ（ベーリンガーBoehringer）で消化する。
【００５７】アリコートを消化混合物からｔ＝０
（Ａ）、ｔ＝２分（Ｂ）、ｔ５分（Ｃ）およびｔ＝３０
分（Ｄ）で除去し、４ＮＨＣｌでpH＝１．５に酸性化
し、平衡化した５μヌクレオシル（Nucleosil)（商標）
ＲＰＣ−１８カラム（４×２００mm）上でＨＰＬＣによ
り分析し、３０℃で流速１ml／分にて３３ｍＭ（ＮＨ4)
2 ＳＯ 4 、１．５ｍＭ Ｈ2 ＳＯ4 含有２９．４％（ｖ
／ｖ）アセトニトリルで平均に溶出する。２１４nmでの
ＵＶ吸収によりペプチドを検出する。３０分後に転化が
完了し、エタノールを消化混合物へ加えて６０％（ｖ／
ｖ）とする。
【００５８】シュリヒトクルール，ジェイ．ら（Schlic
htkrull, J. et al.）（１９７４）Horm. Metab.Res. S
uppl.,Ser-５，ｐ１３４−１４３に記載されているよう
にＱＡＥ−セファデックス（Sephadex）（商標）カラム
上で陰イオン交換クロマトグラフィにより精製する。
Ｂ：Ｂ鎖，Ａ：Ａ鎖，Ｋ：Ｌｙｓ，Ｒ：Ａｒｇ。図８か
ら、トリプシン消化物
【化１９】 からの産物は、カルボキシペプチダーゼＢを用いた消化
によりほとんど定量的に
【化２０】 へ転化される。インシュリン前駆体のヒトインシュリン
への転化は例１０，１１，および２０に示され、例１３
ではヒトインシュリンの特性決定が示される。
【００５９】
【実施例】例１ ．B-Lys-Arg-A の発現のための酵母プラスミドｐＭ
Ｔ５８５の構築 ｐＭＴ３４２からの４．３kb ＥｃｏＲＶ−ＸｂａＩと
３．３kb ＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＶ断片をｐＭ２１５の
０．６kb ＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ断片と連結する。プラ
スミドｐＭＴ３４２は、挿入されたＴＰＩｐ−ＭＦα１
リーダーＢＣＡ−ＴＰＩT-配合を有する酵母ベクターｐ
ＭＴ２１２である。ｐＭＴ３４２とｐＭＴ２１２の構築
は、ヨーロッパ特許出願Ｎｏ．００６８７０１Ａ号に記
載されている。
【００６０】プラスミドｐＭ２１５は、プロインシュリ
ンコード配列Ｂ−Ｃ−Ａを含むＥｃｏＲ１−Ｘｂａｌ断
片をｐ２８５（ATCC Ｎｏ．２０６８１）からｐＵＣ１
３〔ヴィエイラら（Vieira et al.)、Gene １９：２５
９−２６８（１９８２）によりｐＵＣ８とｐＵＣ９につ
いて記載されているように構築される〕ヘサブクローン
し、続いてＭＦα１リーダーとプロインシュリンＢ−Ｃ
−Ａとの接続位置にあるGlu-Ala-Glu-Ala をコードする
１２個の塩基をインビトロでループから外すことにより
構築される。Ｐ２８５は挿入ＴＰＩｐ−ＭＦα１リーダ
ー−Ｂ−Ｃ−Ａ−ＴＰＩT を含み、酵母株Ｚ３３（ATCC
Ｎｏ．２０６８１）に付着させる。その構築は米国特
許出願第５４７，７４８号（１９８３年１１月１日）に
記載されている。
【００６１】ｐＭＴ３４２とｐＭ２１５からの上記断片
の連結により、挿入ＭＦα１リーダー（Glu-Ala-Glu-Al
a が除かれている）−Ｂ−Ｃ−Ａを有するプラスミドｐ
ＭＴ４６２が得られる。Ｂ−Ｃ−Ａをコードする断片を
B-Lys-Arg-A をコードする断片へ転化するために、変形
した部位特異的突然変異法（ケイ．ノリスら，前出）を
用いる。ＭＦα１リーダー（Glu-Ala-Glu-Ala が除かれ
ている）−Ｂ−Ｃ−ＡをコードするｐＭＴ４６２からの
０．６kb ＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ断片を、ＸｂａＩ−Ｅ
ｃｏＲＩで切断したファージＭ１３ｍｐ１０ＲＦ〔メシ
ング，ジェイ．（Messing,J.) とヴィエリア, ジェイ.
(Vieria,J.) （１９８３）未公開の結果〕ＤＮＡへ挿入
する。
【００６２】上記ＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ挿入部を含む一
重らせんＭ１３ファージを、３０量体欠失プライマーＫ
ＦＮ４と“万能”１５量体Ｍ１３プライマーｄ（TCCCAG
TCACGACGT)（ニューイングランドバイオラボズNew Engl
and Biolabs)とともに培養し、９０℃で５分間加熱し、
室温までゆっくり冷却し、アニーリングさせる。次いで
部分的二重らせんＤＮＡをｄ−ＮＴＰ−ミックス，クレ
ノウポリメラーゼとＴ４リガーゼを加えることにより作
る。フェノールで抽出し、エタノールで沈でんおよび再
懸濁後に、制限酵素ＡｐａＩ，ＸｂａＩ，およびＥｃｏ
ＲＩでＤＮＡを切断する。
【００６３】別にフェノールで抽出し、エタノールで沈
でんおよび再懸濁後に、ＤＮＡをＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ
切断ｐＵＣ１３に連結する。連結混合物を大腸菌（ｒ-
ｍ+) 株へ形質転換し、幾つかの形質転換体からプラス
ミドを調製する。プラスミド調製物をＥｃｏＲＩとＸｂ
ａＩで切断し、０．５kbと0 ．６kbの両方でバンドを示
すこれら調製物を大腸菌へ再度形質転換する。再形質転
換体から０．５kb挿入部を有するｐＵＣ１３のみを有す
る形質転換体を選択する。
【００６４】このプラスミドｐＭＴ５７９のＥｃｏＲＩ
−ＸｂａＩ挿入部の配列は、マキサム−ギルバート法に
よりＭＦα１リーダー−（Glu-Ala-Glu-Ala が除かれて
いる）- B-Lys-Arg-A をコードすることが確認された。
ｐＭＴ５７９の構築を図２に示す。ｐＭＴ５７９からの
ＸｂａＩ−ＥｃｏＲＩ挿入部は、ｐＭＴ５７９の０．５
kb ＸｂａＩ−ＥｃｏＲＩ断片をｐＴ５の５．５kb Ｘ
ｂａＩ−ＥｃｏＲＩ断片と連結することによりＴＰＩプ
ロモーターとＴＰＩターミネーターを備えている。挿入
部ＴＰＩｐ−ＭＦα１リーダー−Ｂ−Ｃ−Ａ−ＴＰＩT
を有するｐＴ５の構築を図３に示す。
【００６５】得られた挿入部ＴＰＩｐ−ＭＦα１リーダ
ー−（Glu-Ala-Glu-Ala が除かれる）-B-Lys-Arg-A-TPI
T を含むプラスミドｐＭＴ５８３を、次いでＢａｍＨＩ
と部分的にＳｐｈＩで切断し、ＢａｍＨＩとＳｐｈＩで
切断したＣＰＯＴに２．１kb断片を挿入する。得られた
プラスミドｐＭＴ５８５は酵母の形質転換に用いられ
る。ｐＭＴ５８３とｐＭＴ５８５の構築を図３に示す。
【００６６】例２．B-Arg-Arg-A 発現のための酵母プラ
スミドｐＭＴ６１１の構築 ｐＭＴ４６２からのＢ−Ｃ−Ａコード断片（例１参照）
を、例１に記載した方法と同じ方法により、図５に示す
ように、３０量体欠失プライマーＫＦＮ１８と“万能”
１５量体Ｍ１３プライマーの混合物を用いた部位特異的
突然変異によりB-Arg-Arg-A へ転化する。プラスミドｐ
ＭＴ５９９のＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ挿入部の配列は、マ
クサム−ギルバート法により、ＭＦα１リーダー−（Gl
u-Ala-Glu-Ala が除かれる）-B-Arg-Arg-Aをコードする
ことが確認された。
【００６７】ｐＭＴ５９９からのＸｂａＩ−ＥｃｏＲＩ
挿入部は、ｐＭＴ５９９の０．５kbＸｂａＩ−ＥｃｏＲ
Ｉ断片とｐＴ５の５．５kb ＸｂａＩ−ＥｃｏＲＩ断片
を連結することによりＴＰＩプロモーターとＴＰＩター
ミネーターを有する。挿入部ＴＰＩｐ−ＭＦα１リーダ
ー（Glu-Ala-Glu-Ala が除かれる）-B-Arg-Arg-A-TPI T
を含む得られたプラスミドｐＭＴ６０２をＢａｍＨＩと
部分的にＳｐｈＩで切断し、２．１kb断片をＢａｍＨＩ
とＳｐｈＩで切断したＣＰＯＴに挿入する。得られたプ
ラスミドｐＭＴ６１１が酵母の形質転換のために用いら
れる。プラスミドｐＭＴ６１１の構築を図５に示す。
【００６８】例３．B-Lys-Lys-A を発現するための酵母
プラスミドｐＭＴ６５０の構築 ｐＭＴ４６２からのＢ−Ｃ−Ａコード断片（例１参照）
を、例１で記載した方法と同じ方法により、図６に示す
ように３０量体欠失プライマーＫＦＮ４１と“万能”１
５量体Ｍ１３プライマーの混合物で部位特異的突然変異
によりB-Lys-Lys-A へ転化する。
【００６９】クレノウポリメラーゼで充てんしＴ４リガ
ーゼで連結後、部分的二重らせんＤＮＡをＡｐａＩ，Ｅ
ｃｏＲＩおよびＸｂａＩで消化させ、プラスミドｐＴ５
からの５．５kb ＸｂａＩ−ＥｃｏＲＩ断片（例１参
照）で連結する。大腸菌へ形質転換および再形質転換
後、挿入部ＭＦα１リーダー−（Glu-Ala-Glu-Ala が除
かれる）-B-Lys-Lys-Aを含むプラスミドｐＭＴ６５２を
単離し、挿入部の配列を上記のように確認する。
【００７０】プラスミドｐＭＴ６５２をＸｂａＩ−Ｅｃ
ｏＲＩで開裂し、０．５kb断片をｐＭＴ６４４の７．８
kb ＸｂａＩ−ＫｐｎＩと４．３kbのＫｐｎＩ−Ｅｃｏ
ＲＩ断片で連結する。得られたプラスミドｐＭＴ６５０
は挿入部ＴＰＩｐ−ＭＦα１リーダー（Glu-Ala-Glu-Al
a が除かれる）-B-Lys-Lys-A-TPIT を含み、さらにＣＰ
ＯＴからのＴＰＩコード遺伝子（ＰＯＴ）を含む。プラ
スミドｐＭＴ６５０の構築を図６に示し、ｐＭＴ６４４
の構築を図４に示す。
【００７１】ｐＭＴ６４４の構築に用いられるプラスミ
ドｐＵＣ１２とｐＵＣ１８をｐＵＣ１３について記載し
た（ヴィエイラら，前出）ように構築する。プラスミド
ｐ６０１（図４参照）は、Ｂｇ１２とＢａｍＨＩ部位が
側方に接続する挿入部ＴＰＩｐ−ＭＦα１リーダー−
Ｂ′Ａ−ＴＰＩT を含む。Ｂ′ＡはＢ（１−２９）−Ａ
（１−２１）（ここで、Ｂ（１−２９）はＰｈｅB1から
ＬｙｓB29 までの短くしたヒトインシュリンＢ鎖であ
り、Ａ（１−２１）はヒトインシュリンＡ鎖である）を
表す。Ｂ′ＡをコードするＤＮＡ配列の構築はヨーロッ
パ特許出願第００６８７０１Ａ号に記載されている。酵
母の形質転換にｐＭＴ６５０が用いられる。
【００７２】例４．B-Arg-Lys-A 発現のためのプラスミ
ドｐＭＴ６５８の構築 例３でｐＭＴ６５０について記載したようにしてただし
ＫＦＮ４１の代わりにＫＦＮ４２の３０量体欠失プライ
マーを用いてプラスミドｐＭＴ６５８を構築する。ま
た、さらに直接的なｐＭＴ６４４の構築が選択される：
インビトロ突然変異、すなわちクレノウポリメラーゼで
充てんしＴ４リガーゼで連結後、部分的二重らせんＤＮ
ＡをＡｐａＩ，ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩで消化し、ｐ
ＭＴ６４４の７．８kb ＸｂａＩ−ＫｐｎＩと４．３kb
ＫｐｎＩ−ＥｃｏＲＩ断片と連結する。
【００７３】連結混合物を大腸菌（ｒ- ｍ+ ）へ形質転
換させ、幾つかの形質転換体からプラスミドを調製す
る。０．６と０．５kbの両方にＸｂａｌ−ＥｃｏＲ１断
片を示す１つのプラスミド調製物を大腸菌へ再度形質転
換し、０．６kbではなく０．５kbＥｃｏＲ１−Ｘｂａｌ
断片を含むプラスミドｐＭＴ６５８を含む株とする。ｐ
ＭＴ６５８は挿入部ＴＰＩｐ−ＭＦα１リーダー−（Gl
u-Ala-Glu-Ala が除かれる）-B-Arg-Lys-A-TPIT を含
む。
【００７４】B-Arg-Lys-A をコードするセグメントの配
列はマキサム−ギルバートＤＮＡ−配列法により変化す
る。ｐＭＴ６５８の構築を図７に示す。ｐＭＴ６５８は
酵母の形質転換に用いられる。
【００７５】例５．形質転換 酵母（S.cerevisiae) 株ＭＴ５０１（Ｅ２−７Ｂ×Ｅ１
１−３Ｃ ａ／α，Δｔｐｉ／ｔｐｉ，Δｐｅｐ４−３
／ｐｅｐ４−３）を、ＹＰＧａＬ（１％バクト酵母抽出
液、２％バクトペプトン、２％ガラクトース、１％酪
酸）中でＯＤ600n m ０．６まで増殖する。
【００７６】培養液１００mlを遠心分離により採取し、
水１０mlで洗い、再遠心分離し、１０mlの１．２Ｍソル
ビトール、２５ｍＭ Ｎａ2 ＥＤＴＡ pH＝８．０、
６．７mg／mlジチオトレイトール中に再懸濁する。懸濁
液を３０℃で１５分間インキュベートし、遠心分離し、
細胞を１０mlの１．２Ｍソルビトール、１０ｍＭ Ｎａ
2 ＥＤＴＡ、０．１Ｍクエン酸ナトリウムpH＝５．８、
ノボザイム（Novozym)（商標）２３４ ２mg中で再懸濁
する。懸濁液を３０℃で３０分間インキュベートし、遠
心分離により細胞を集め、１０mlの１．２Ｍソルビトー
ルと１０mlのＣＡＳ（１．２Ｍソルビトール、１０ｍＭ
ＣａＣｌ2 、１０ｍＭトリス（トリス＝トリス（ヒド
ロキシメチル）−アミノメタン）pH＝７．５）で洗浄
し、２mlのＣＡＳに再懸濁する。
【００７７】形質転換のために、ＣＡＳ−再懸濁細胞
０．１mlをほぼ１μg のプラスミドｐＭＴ５８５と混合
し、室温で１５分間放置する。１mlの２０％ポリエチレ
ングリコール４０００、１０ｍＭ ＣａＣｌ2 、１０ｍ
ＭトリスpH＝７．５を加え、混合物をさらに室温で３０
分間放置する。混合物を遠心分離し、ペレットを０．１
mlのＳＯＳ（１．２Ｍソルビトール、３３％ｖ／ｖ Ｙ
ＰＧａＬ、６．７ｍＭＣａＣｌ2 、１４μg ／mlロイシ
ン）に再懸濁し、３０℃で２時間インキュベートする。
次いで懸濁液を遠心分離し、ペレットを０．５mlの１．
２Ｍソルビトールに再懸濁する。
【００７８】６mlの寒天上層〔セルマンら（Sherman et
al.）のＳＣ培地（Methodsin Yeast Genetics）、コー
ルド スプリング ハーバー ラボラトリィ，１９８
１）であって、ロイシンが排除され１．２Ｍソルビトー
ルと２．５％寒天を含むもの〕を５２℃で加え、この懸
濁液を同種の寒天固化物とソルビトールを含む培地を有
するプレートの表面に注入する。３０℃で３日後形質転
換体コロニーを取り出し、再単離し、液体培地を始める
のに用いる。このような形質転換体ＭＴ５９３（＝ＭＴ
５０１／ｐＭＴ５８５）の１つを、さらに特性決定のた
めに選択する。
【００７９】プラスミドｐＭＴ６１１、ｐＭＴ６５０お
よびｐＭＴ６５８を上記と同じ方法で酵母（S.cerevisi
ae）株ＭＴ５０１へ形質転換し、形質転換体ＭＴ６１６
（＝ＭＴ５０１／ｐＭＴ６１１）、ＭＴ６５５（＝ＭＴ
５０１／ｐＭＴ６５０）およびＭＴ６６０（＝ＭＴ５０
１／ｐＭＴ６５８）を単離する。
【００８０】形質転換体微生物ＭＴ５９３、ＭＴ６１
６、ＭＴ６５５およびＭＴ６６０は、出願人により、１
９８５年１月１６日に、ドイチェ ザンムルング フォ
ン ミクロオルガニスメン（ＤＳＭ）、グリースバッハ
ストラーセ８、Ｄ−３４００ゲッチンゲンに寄託され、
それぞれ参照番号ＤＳＭ３１９４、ＤＳＭ３１９５、Ｄ
ＳＭ３１９８およびＤＳＭ３１９９を記録する。ＤＳＭ
は１９７７年のブタペスト条約下に委任された国際寄託
機関であり、前記条約のそれぞれ９条および１１条によ
り、上記寄託物の永続性と公衆による入手可能性を提供
する。
【００８１】例６．酵母株ＭＴ５９３（ＤＳＭ３１９
４）からB-Lys-Arg-A の精製 酵母株ＭＴ５９３（ＤＳＭ３１９４）をＹＰＤ培地で増
殖する。２ｌのバッフルフラスコ中の１ｌの培養液をＯ
Ｄ600nm が１５になるまで３０℃で振とうする。遠心分
離後、上清８１５mlから発現産物を次のように単離す
る：リクロプレプ（LiChroprep）（商標）ＲＰ−１８
（メルク，商品番号９３０３）のカラム（１．５×９c
m）を、６０％（ｖ／ｖ）エタノール含有５０ｍＭ Ｎ
Ｈ4 ＨＣＯ3 ３０mlで洗う。カラムを５０mlの５０ｍＭ
ＮＨ4 ＨＣＯ3 で平衡化する。９５mlの９６％エタノ
ールを８１５mlの酵母上清へ加え、混合物を一晩カラム
へポンプ注入する（流速４５ml／ｈ）。
【００８２】カラムを１５mlの０．１Ｍ ＮａＣｌ、次
いで１５mlのＨ2 Ｏで洗い、ペプチド物質を６０％（ｖ
／ｖ）エタノール含有５０ｍＭ ＮＨ4 ＨＣＯ3 で溶出
する。溶出液（４．５ml) を減圧遠心分離〔サバント
（Savant）減圧遠心分離〕により１．１mlまで濃縮して
エタノールを除き、容量をpH７．４にて２５ｍＭ ＨＥ
ＰＥＳ緩衝液で１０mlに調整する。サンプルを抗インシ
ュリンセファロースカラム（２．５×４．５cm）へ施こ
す。このカラムは予めＮａＦＡＭ緩衝液（ヘッディン
グ，エル，Diabetologia８（１９７２），２６０−６
６）２０mlと１０mlの２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液pH＝
７．４で洗浄する。施用後、カラムを室温で３０分間放
置し、その後４０mlの２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液、pH
＝７．４で洗う。ペプチド物質を２０％酢酸で溶出し、
溶出液のpHをＮＨ4 ＯＨで７．０に調整する。
【００８３】前記工程からの溶出液を減圧回転で２５０
μl まで濃縮し、さらに５μウォーターズ ノバパック
（Waters Novapak）Ｃ−１８カラム（３．９×１５０m
m）での逆相ＨＰＬＣにより精製する。ＡおよびＢ緩衝
液は、それぞれ、０．１％ＴＦＡ水溶液と０．０７％Ｔ
ＦＡ−アセトニトリル液である。カラムを２５％Ｂで流
速０．７５ml／分にて平衡化し、ペプチドを直線状勾配
物（１％アセトニトリル／分）で溶出し、２７６nmで検
出する。１３．１５分の保持時間で主ピークが溶出し、
このピークからのペプチド物質を溶出液の凍結乾燥によ
り単離する。ペプチド物質は例８で記載したように特性
決定が行われる。精製の各工程における収率は前記した
ラジオイムノアッセイにより決定される。表２は精製を
要約する。全収率は３９％であった。
【００８４】
【表２】
【００８５】例７．それぞれ酵母株ＭＴ６５５（ＤＳＭ
３１９８）、ＭＴ６６０（ＤＳＭ３１９９）およびＭＴ
６１６（ＤＳＭ３１９５）からのB-Lys-Lys-A 、B- Arg-
Lys-A およびB-Arg-Arg-A の精製 上記記載の酵母株を予め例６で記載したように増殖し、
発現産物を例６で記載したように実質的に異なった上清
から精製する。表３に総収率をまとめる。
【００８６】
【表３】
【００８７】例８．酵母株ＭＴ５９３（ＤＳＭ３１９
４）から精製されたB-Lys-Arg-A の特性決定 B-Lys-Arg-A を例６で記載のように精製する。ペプチド
のアミノ酸組成を次のように決定する：１３９．６μｇ
（１９nmol）を１１０℃で２４時間１００μlの６ＮＨ
Ｃｌ中で加水分解する。加水分解をベックマン型１２１
Ｍアミノ酸分析機で分析する。次のアミノ酸組成がみら
れた。
【００８８】
【表４】
【００８９】約５nmolのペプチド物質をアミノ酸配列分
析する。配列分析は、ムーディ，エイ．ジェイ．（Mood
y,A.J.）、チム，エル．（Thim，L.）およびヴァルベル
デ，アイ．(Valverde,I.) （FEBS Left.，１７２（１９
８４），１４２−１４８）により記載されているよう
に、ガスフェーズセキュエンサー（アプライド バイオ
システムモデル４７０Ａ）で行われる。結果は次のよう
である。
【００９０】
【表５】
【００９１】
【表６】
【００９２】
【表７】
【００９３】例９．それぞれ酵母株ＭＴ６５５（ＤＳＭ
３１９８）、ＭＴ６６０（ＤＳＭ３１９９）およびＭＴ
６１６（ＤＳＭ３１９５）から精製されたB-Lys-Ly s-A
、B-Arg-Lys-A およびB-Arg-Arg-A の特性決定 ペプチド物質を例６で記載したように上記の酵母株から
精製する。ペプチドを例８で記載のようにアミノ酸配列
分析へかける。配列結果（示さず）から、Ｂ鎖とＡ鎖を
連結する二塩基性配列は、それぞれLys-Lys （ＭＴ６５
５）、Arg-Lys（ＭＴ６６０）およびArg-Arg （ＭＴ６
１６）であった。精製したペプチドを例７に記載したよ
うにアミノ酸分析にかける。アミノ酸組成は理論どうり
に見い出された（結果をB-Lys-Lys-A についてのみ示
す）。
【００９４】
【表８】
【００９５】例１０．ヒトインシュリンへのB-Lys-Arg-
A の転化（一段階法） １０mgB-Lys-Arg-A を１０mlの０．２３Ｍトリス−ＨＣ
ｌ緩衝液pH＝７．５に溶かす。溶液を３７℃まで加熱
し、５０μg トリプシン（ノボインダストリィ社）と５
０μg カルボキシペプチダーゼＢ（ベーリンガー）の両
方を１００μlの水に溶かしたものを加える（０時）。
反応混合物のアリコートを時間０分、２分、１０分、４
０分および８０分で取り出す。１Ｍ ＨＣｌでサンプル
をpH２．５まで酸性化して酵素反応を停止する。
【００９６】B-Lys-Arg-A のヒトインシュリンへの転化
をヌクレオシル（マーチェリーナゲル）の５μＲＰＣ−
１８カラム（４×２００mm）において逆相ＨＰＬＣによ
り追跡する。Ａ緩衝液はＨ2 ＳＯ4 でpH＝３．５に調整
された２５％アセトニトリルからなり、Ｂ緩衝液は４５
％アセトニトリル、０．１５Ｍ（ＮＨ4)2 ＳＯ4 、１．
５ｍＭ Ｈ2 ＳＯ4 である。８０％Ａ緩衝液／２０％Ｂ
緩衝液からなる混合物を用いて平均的系で行われる。溶
媒とカラムの温度は３０℃であり、ペプチドは２１４nm
で検出される。
【００９７】上記一段階法における最適収率はインキュ
ベーション１０分後に得られる。この時点で、反応混合
物は、４５％ヒトインシュリン、１０％Ｄｅｓ−Ｂ３０
−インシュリンおよび４５％Arg-Ao- インシュリンから
なる。転化の収率を高めるために、二段階法が案出され
た（例１１）。
【００９８】例１１．ヒトインシュリンへのB-Lys-Arg-
A の転化（二段階法） Ｈ2 Ｏ２６．４mlを
【化２１】 ４７１mgへ加える。混合物を４℃まで急冷し、３．０ml
の０．２５Ｍ ＮａＯＨを加え、これによりインシュリ
ン前駆体を溶かす。水２００μl 中のトリプシン（ノボ
インダストリィ社）６ｇを加える。反応を５時間４℃で
行い、４ＮＨＣｌ６００μl を加えて停止する。ＨＰＬ
Ｃ（例１０で記載した方法）により測定された収率は
【化２２】 ９１．５％であり、残り８．５％の主な部分は未消化
【化２３】 であった。
【００９９】生成物を、オクタデシルジメチリシリル置
換シリカ（平均粒径：１５μ、孔径：１００Å）のカラ
ム（５×２５cm）にて調製用ＨＰＬＣにより精製する。
カラムを平衡化し、流速２ｌ／ｈにて３７％（ｖ／ｖ）
エタノールを含む０．１８５Ｍ ＫＣｌ／０．６ｍＭ
ＨＣｌ（pH＝３．１５）で溶出（平均）する。B-Lys-Ar
g Ａが４．３カラム容量で溶出し、ヒトインシュリンＢ
−３０エステルの結晶化について予め記載された結晶化
方法〔マルクッセン、ジェイ．（Markussen, J.)（１９
８４）“Diabetes Research Vol I, Laboratory Method
s Part Ｂ”ｐ．４０３−４１１，レールナーとポール
版〕によりアルコール性プールから単離する。
【０１００】結晶を凍結乾燥し、５０ｍＭ トリス−Ｈ
Ｃｌ緩衝液（pH＝９．３）中に濃度１０mg／mlにて溶解
する。インシュリン前駆体中間体を、３７℃で４０時間
カルボキシペプチダーゼＢ（４０μg ／ml）で消化する
ことによりヒトインシュリンへ転化する。この消化混合
物へエタノールを最終濃度６０％（ｖ／ｖ）となるよう
に加え、ヒトインシュリンを、シュリッヒトクルールら
（Schlicht Krull etal. ) により、Horm.Metab.Res.Su
ppl.,Ser.５（１９７４）１３４−１４３に記載されて
いるように、ＱＡＥ−セファデックス（ファルマシア）
カラムにおいて陰イオン交換クロマトグラフィにより混
合物から精製する。精製を含む転化の異なった工程での
収率を表９に示す。
【０１０１】
【表９】
【０１０２】例１２．B-Lys-Lys-A のヒトインシュリン
への転化（一段階法） B-Lys-Lys-A １０mgを例１０に記載のようにヒトインシ
ュリンへ転化する。ＨＰＬＣから判断されるようにヒト
インシュリンの全収率は４８％であった。他の生成物
は、Lys-Ao- インシュリン（４２％）、Ｄｅｓ−Ｂ３０
−インシュリン（９％）および少量の非同定化成分（１
％）として同定された。
【０１０３】例１３．B-Lys-Arg-A から調製されたヒト
インシュリンの結晶化 ヒトインシュリンを例１１に記載のように調製し、次の
分析により特性決定を行った： ａ）ヒトインシュリンは、尿素含有ポリアクリルアミド
ゲルにおいて塩基性ディスク電気泳動で１つのバンドの
みを示す（シュリッヒトクルールら，Horm.Metabol.Re
s.,Suppl.Ser.５（１９７４）１３４−１４３）。バン
ドは膵臓ヒトインシュリンとして移動する。
【０１０４】ｂ）Ｚｎ++の存在下でヒトインシュリンを
結晶化することにより、一定形状の斜方六面体結晶が得
られる（シュリッヒトクルール，Acta Chem.Scand.１０
（１９５６）１４５９−１４６４に記載の方法）。 ｃ）ヒトインシュリンの生物学的活性をマウスの血糖消
耗試験で測定する。評価された効力は、インシュリンに
ついての第４回国際標準（the ４th International Sta
ndard)を用いると２８．１Ｉ．Ｕ．／mg（ｐ０．０５信
頼限界：２５．７−３０．７Ｉ．Ｕ．／mg）であった。
【０１０５】ｄ）ヒトインシュリンのアミノ酸組成を、
６ＮＨＣｌ中で２４時間、４８時間および９６時間１１
０℃で加水分解後に測定し、ＴＨｒ．Ｓｅｒ．Ｐｒｏお
よびＮＨ3 についての値を直線状回帰線（ｔ＝０）によ
り測定する。ＶａｌとＩｌｅの値が加水分解の不明確な
時間へ外挿される。１／２Ｃｙｓの値を４Ｍメタンスル
ホン酸中で２４時間加水分解後に測定する。アミノ酸組
成を表１０に記す。
【０１０６】
【表１０】
【０１０７】
【配列表】
配列番号：１ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 TCCACAATGC CTCTCTTAGT CTTGGGTGTG ３０
【０１０８】配列番号：２ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 TCCACAATGC CTCTTCTGGT CTTGGGTGTG ３０
【０１０９】配列番号：３ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 TCCACAATGC CCTTCTTGGT CTTGGGTGTG ３０
【０１１０】配列番号：４ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 TCCACAATGC CCTTTCTGGT CTTGGGTGTG ３０
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は式Ｉで表されるインシュリン前駆体の構
成を示す模式図である。
【図２】図２はプラスミドｐＭＴ５７９の調製を示す模
式図である。
【図３】図３はプラスミドｐＭＴ５８５の調製を示す模
式図である。
【図４】図４はプラスミドｐＭＴ６４４の調製を示す模
式図である。
【図５】図５はプラスミドｐＭＴ６１１の調製を示す模
式図である。
【図６】図６はプラスミドｐＭＴ６５０の調製を示す模
式図である。
【図７】図７はプラスミドｐＭＴ６５８の調製を示す模
式図である。
【図８】図８はB-Lys-Arg-A のヒトインシュリンへのイ
ンビトロ転化を逆相高圧液体クロマトグラフィーにより
測定した結果を示すグラフである。
フロントページの続き (72)発明者 モイェンス トリエル ハンセン デンマーク国，デーコー−3650 エルステ ュケ ビンケルバイ 21 (56)参考文献 特開 昭57−163352（ＪＰ，Ａ)

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 次式： Ｂ−Ｘ−Ｙ−Ａ （Ｉ） （式中、ＢおよびＡはヒトインシュリンのＢ鎖およびＡ
    鎖であり、ＸおよびＹはそれぞれリジンまたはアルギニ
    ンである。）で表されるヒトインシュリン前駆体をコー
    ドするＤＮＡ配列を含む発現ベクターにより形質転換さ
    れた酵母を適当な培養基で培養し、インシュリン前駆体
    を培養基から回収することを特徴とする前記式Ｉで表さ
    れるヒトインシュリン前駆体の製法。
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