NO172646B

NO172646B - Dna-sekvens, repliserbart ekspresjonsplasmid, samt fremstilling av insulin og human-insulin-forloepere

Info

Publication number: NO172646B
Application number: NO861120A
Authority: NO
Inventors: Lars Thim; Kjeld Norris; Mogens Trier Hansen
Original assignee: Novo Nordisk As
Priority date: 1985-03-22
Filing date: 1986-03-21
Publication date: 1993-05-10
Also published as: FI87801B; JPH0823985A; EP0195691A1; PT82241B; NO861120L; FI87801C; FI861198A0; IE860737L; PT82241A; ES553231A0; ES8708251A1; MX163837B; JPH088871B2; ES557227A0; FI861198A; IE58842B1; NO172646C; CA1340823C; AU586855B2; DK129385D0

Description

Oppfinnelsen vedrører en DNA-sekvens, som angitt i krav 1;

et repliserbart ekspresjonsplasmid som angitt i krav 2; en fremgangsmåte for fremstilling av human-insulin-forløpere med formel

som angitt i krav 3; samt en fremgangsmåte for fremstilling av human-insulin, som angitt i krav 4.

Human-insulin består av to peptidkjeder, hvor A-kjeden inneholder 21 aminosyrerester og B-kjeden inneholder 30 aminosyrerester. A- og B-kjeden blir forenet ved hjelp av to disuldfid-broer som forbinder cysteinylresten ved A7 til B7 og A20 til B19, henholdsvis. En tredje disulfidbro blir dannet mellom cysteinyl-restene A6 og All.

Human-insulin blir produsert in vivo i pankreas i form av preproinsulin. Preproinsulin består av et prepeptid av 24 aminosyrerester fulgt av proinsulin som inneholder 86 aminosyrerester i konfigurasjonen: prepeptid-B-Arg-Arg-C-Lys-Arg-A, hvor C er C-peptidet med 31 aminosyrerester.

Under utskillelse fra celleøyene blir prepeptidet spaltet

fra, og proinsulin folder seg så til en struktur hvor disulfid-broene blir dannet. C-peptidet blir så fjernet proteolytisk for å gi modent humant-insulin.

Flere forsøk er blitt gjort for å produsere insulin, og spesielt human-insulin ved hjelp av rekombinant DNA-teknologi.

I europeisk patentsøknad, publ. nr. 55 945, er fremstilling av proinsulin eller miniproinsuliner fra E. coli beskrevet. Fremgangsmåten inkluderer ekspresjon av et chimerisk polypeptid, in vitro-spalting av det chimeriske polypeptid og in vitro-dannelse av disulfidbindinger mellom A- og B-kjeden og fjerning av bro-kjeden mellom A- og B-kjeden for å gi human-insulin. I europeisk patentsøknad, publ. nr. 68 701, er fremstillingen av modifiserte proinsuliner med et mer eller mindre forkortet C-peptid ved transformasjon av E. coli foreslått.

Metodene ovenfor lider av flere ulemper som hovedsakelig stammer fra det faktum at E. coli brukes som transformant-organisme. De uttrykte produktene utskilles ikke fra cellene,

men akkumulerer intracellulært i E. coli-vertsorganismen. Akkumulering av det uttrykte polypeptidproduktet av preproinsulin eller modifisert preproinsulin-type øker imidlertid risikoen for enzymatisk nedbrytning av det uttrykte produkt.

Videre må fremstilling, sammenfolding og opprettelse av disulfidbroer tilsynelatende gjøres in vitro.

Et mer egnet system for uttrykking av pattedyrpolypeptider synes å være eukaryot-celler, og flere forsøk er blitt gjort for å uttrykke fremmede gener i eukaryoter, spesielt i gjærceller. Uttrykking av interferon i gjærceller er beskrevet i europeisk patentsøknad, publ. nr. 60 057, og ekspresjon og sekresjon i gjærceller av proteiner som er heterologe med gjærceller, er beskrevet i europeiske patentsøknader, publ. nr. 88 632, 166 201 og 1 23 544.

En metode for å uttrykke "pre"-proinsulin i gjærceller og fremstilling og sekresjon av det uttrykte "pre"-proinsulin er beskrevet i europeisk patentsøknad, publ. nr. 1 21 884. Det er imidlertid blitt vist av oss at insulin-forløpere av proinsulintypen er sensitive overfor enzymatisk nedbryting i gjærceller, hvilket resulterer i svært lave utbytter, hvis noen, av utskilt proinsulin eller modent insulin. I gjærceller er det blitt vist at human-proinsulin og proinsulin-analoger med et mer eller mindre forkortet C-peptid er spesielt sensitive overfor enzymatisk spalting ved de to dibasiske sekvenser som flankerer C-peptidområdet. Tilsynelatende forekommer disse spaltingene før opprettelsen av S-S-broene, hvilken resulterer i dannelse av C-peptid, A-kjede og B-kjede.

Målet for den foreliggende oppfinnelse er å gi insulin-forløpere som blir dannet med høye utbytter i gjærceller med korrekt plasserte disulfidbroer mellom A- og B-halvdelene, og som lett kan omdannes til human-insulin.

Flere insulinforløpere av proinsulintypen, inkludert proinsulin, er blitt undersøkt (se den følgende tabell 1). DNA-sekvenser som koder for de gjeldende forløpere, ble innført til et gjærcelle-vektorsystem og transformert til gjærceller i henhold til teknikken beskrevet ovenfor, og i den følgende detaljer-te beskrivelse. Genet som kodet for insulinforløperen, var utstyrt med en DNA-sekvens som kodet for gjærcelle-gjenkjennbar-sekresjon og reproduksjonssignaler smeltet sammen i oppstrøms-retning for genet for forløperen. I det foreliggende studium ble en modifisert MFal-lederfrekvens brukt, hvor segmentet som koder for de fire siste restene (Glu-Ala-Glu-Ala) av lederen, var fjernet. Den modifiserte MFal-leder inneholder som reproduksjonssignaler en dibasisk sekvens Lys-Arg, som så blir sammensmeltet med 5<1->terminus av forløper-kodegenet. Det ble funnet at ledersekvensen ble spaltet av i alle konstruksjonene, dvs. spalting forekom ved den dibasiske sekvens Lys-Arg ved opp-strøms-retning for alle insulinforløpergenene. Imidlertid ble det i alle insulinforløperne observert konstruksjoner som inneholdt to dibasiske sekvenser, som flankerte C-peptidet eller et modifisert C-peptid som reproduserte begge dibasiske steder før opprettelse av korrekt stilte disulfidbroer, og ikke noe en-keltkjedet ureprodusert forløpermolekyl kunne isoleres fra fer-menter ingsbulj ongen.

Følgelig kan gjærceller ikke brukes som ekspresjonssystem for produksjon av insulinforløpere av proinsulintypen.

Overraskende nok er det nå blitt funnet at når A- og B-kjedene av human-insulin er bundet sammen med bare én dibasisk sekvens (konstruksjoner 7-10 i tabell 1), forekommer ingen spalting ved den dibasiske sekvens i gjærcelle, og enkeltkjedete in-sulinf orløpere med korrekt plasserte disulfidbroer fåes i høye utbytter i fermenteringsbuljongen fra en gjærcellestamme transformert med en DNA-sekvens som koder for den gjeldende insulin-forløper. Den foreliggende oppfinnelse synes desto mer overraskende, idet fullstendig spalting ved Lys-Arg ble observert i ledersekvensen som er plassert i oppstrøms-retning i forhold til forløperkodegenet.

Idet insulinforløpere av den foreliggende type som inneholder en enkelt dibasisk sekvens mellom A- og B-kjeden lett kan omdannes til human-insulin ved in vitro-digestion som forklart mer i detalj senere, sørger foreliggende oppfinnelse for en økonomisk attraktiv fremgangsmåte for fremstilling av human-insulin.

Følgelig tilveiebringer foreliggende oppfinnelse nye insulinforløpere med den generelle formel

hvor B og A er B- og A-kjedene av human-insulin tverrbundet som i human-insulin og hvor X og Y hver er lysin eller arginin-rester.

Insulinforløpere med formelen (I) ovenfor er B-Lys-Lys-A, B-Lys-Arg-A, B-Arg-Lys-A og B-Arg-Arg-A, idet de to førstnevnte er mest foretrukne.

Fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen for fremstilling av de ovennevnte human-insulinforløpere erkarakterisert vedat en gjærcellestamme transformert med et ekspresjonsplasmid i henhold til foreliggende oppfinnelse dyrkes i et passende kulturmedium, og insulinforløperen utvinnes fra kulturmediet.

Når man dyrker slike transformerte gjærcellestammer, blir høye utbytter av alle de fire insulinforløpere som er nevnt ovenfor, isolert fra kulturbuljongen, idet B-Lys-Lys-A og B-Lys-Arg-A ble uttrykt i de høyeste utbytter. Følgelig ville fra et ekspre-sjonsnivå-synspunkt disse to forløpere være de foretrukne.

Ekspresjonsproduktene ble isolert og insulin-immunoreaktivt materiale (IRI-peptider) ble renset ogkarakterisert vedmikro-sekvensanalyse. Det ble funnet at forløperne med formel (I) ovenfor er enkeltkjede-molekyler hvor tre sulfidbroer sammenknytter de følgende halvcysteinrester: A6-A11, A7-B7 og A20-B19, dvs. forløperne uttrykkes i gjærceller med korrekt plasserte disulfidbroer sammenlignet med human-insulin. Strukturen av de nye in-sulinforløpere er vist i fig. 1.

Det repliserbare ekspresjonsplasmid i henhold til foreliggende oppfinnelse erkarakterisert vedat det har evne til å uttrykke en DNA-sekvens som koder for de ovenfor beskrevne human-insulinforløpere, i gjærceller. Ekspresjonsplasmidene innbefatter således et replikasjonssystem for stabil opprettholdelse i en gjærcellevert, en DNA-sekvens som koder for insulinforløperne med formel (I) ovenfor, og promoter- og terminatorsekvenser.

Ekspresjonsplasmidet kan i oppstrømsretning for DNA-sekvensen som koder for det ønskede produkt, inneholde et pre-område som sikrer at det uttrykte produkt blir rettet inn i gjær-cellens sekresjonsvei og sekresjon av det uttrykte produkt inn i vekst-mediet. Denne preregion som kunne være et naturlig fore-kommende signal eller leder-peptid eller en syntetisk sekvens som gir sekresjon, blir generelt spaltet fra det ønskede produkt i løpet av sekresjonen som etterlater det modne produkt klart for isolering fra kulturbuljongen.

En vel egnet ledersekvens for gjærceller er gjærcelle MFal-ledersekvensen (J. Kurjan og I. Herskowitz, Cell 30, (1982), 933-943) .

Ekspresjonsplasmidet kan være et plasmid som er i stand til å replisere i vertsmikroorganismen eller i stand til å integrere inn i kromosomet av vertsorganismen. Det anvendte plasmid kan kode for eksepresjon av gjentatte sekvenser av den ønskede DNA-sekvens, hver adskilt ved selektive spaltningssteder.

Ekspresjonen av den ønskede DNA-sekvens vil være under kontroll av en promotersekvens korrekt plassert i forhold til DNA-sekvensen som koder for det ønskede produkt, slik at det resulterer i ekspresjon av det ønskede produkt i vertsorganismen. Fortrinnsvis brukes en promoter fra et gen som er kjent for den anvendte gjærcelleverten, for eksempel promoteren av TPI (triosefosfat-isomerase)-genet eller MFal-promoteren.

DNA-sekvensen for det ønskede produkt vil være fulgt av en transkripsjonsterminatorsekvens, fortrinnsvis en terminatorsekvens fra et gen som er kjent for gjærcelleverten, for eksempel terminatoren av TPI-genet eller MFal-genet.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også nye syntetiske DNA-sekvenser som koder for insulinforløperne med formel (I) ovenfor. (Se også krav 1). De nye DNA-sekvenser ble konstruert ved in vitro loop outmutagenese av det humane proinsulin-gen ved å bruke kjemisk syntetiserte 3 0-mer oligonukleotider for å deletere de opprinnelige C-peptid-kodefrekvenser.

Den foreliggende type av insulinforløpere kan omdannes til human-insulin ved å fjerne X og Y-aminosyrerestene ved in vitro-digestion med trypsin og karboksypeptidase B ved hjelp av en metode analog til in vitro-omdannelsen av proinsulin til insulin beskrevet av Kemmler (Kemmler et al., The Journal of Biological Chemistry, 246 (1971), 6786-6791).

Fremgangsmåten i henhold til foreliggende oppfinnelse for fremstilling av human-insulin erkarakterisert vedat en gjærcellestamme transformert med et ekspresjonsplasmid i henhold til oppfinnelsen dyrkes i et egnet kulturmedium, og insulinforløperen utvinnes fra kulturmediet og omdannes til human-insulin ved enzymatisk behandling. Fortrinnsvis blir en vandig løsning av insulinforløperen behandlet med trypsin og karboksypeptidase B, og human-insulin deretter utvunnet fra løsningen.

Den enzymatiske omdannelse kan bli utført som en ett-trinns-fremgangsmåte hvorved trypsin og karboksypeptidase B er til stede samtidig i reaksjonsblandingen. Ett-trinns-reaksjonen blir for-trinnsvis utført ved omtrent nøytral pH og svakt for-høyete tempe-raturer. Utbyttet av human-insulin var omtrent 50%. Bedre utbytter ble oppnådd ved en to-trinns-omdannelse av insulin- forløpere av typen B-X-Arg-A. I en slik totrinns-omdannelse brukes trypsin i det første trinnet, det digererte produkt ble isolert og blir så videre-digerert med karboksypeptidase B.

Ved å utføre trypsindigestionen ved høy pH, for eksempel i området 11-12, og ved lav temperatur (omtrent 4°C), var det totale utbyttet av humaninsulin omtrent 8 %. For å få et høyt utbytte i den tryptiske digestionen ved høy pH, må aminosyreresten plassert i posisjon B32 (se fig. 1), være arginin (Y = Arg i formel I) idet denne resten fortsatt hovedsakelig er positivt ladet og tilgjengelig for tryptisk spaltning. Følgelig kan forløperen B-Lys-Arg-A være den mest foretrukne forløper, idet den uttrykker i høye nivåer i gjærceller og kan omdannes til human-insulin i meget høye utbytter.

Oppfinnelsen er videre illustrert med referanser til de føl-gende tegninger, hvor: figur 1 illustrerer strukturen av insulinforløpere med formel (I),

figur 2 illustrerer fremstilling av plasmid pMT579,

figur 3 illustrerer fremstilling av plasmid pMT585,

figur 4 illustrerer fremstilling av plasmid pMT644,

figur 5 illustrerer fremstilling av plasmid pMT611,

figur 6 illustrerer fremstilling av plasmid pMT650,

figur 7 illustrerer fremstilling av plasmid pMT658, og

figur 8 illustrerer in vitro omdannelse av B-Lys-Arg-A

til human-insulin.

1. Fremstillin<g>av et gen som koder for human- proinsulin B- C- A

Total renset RNA (J.M.Chirgwin, A.E.Przbybyla, R.J.McDonald,&W. J. Rutter, Biochemistry 18 (1979) 5294-5299) fra human-pankreas ble revers-transkribert (E. Boel, J. Vuust, F. Norris, K. Norris, A. Wind, J.F. Rehfeld&K.A. Marcker; Proe.Nati. Acad.Sci. USA 80 (1983) 2866-2869) med AMV revers-transkriptase og d(GCTTTATTCCATCTCTC) som 1. streng primer. Etter forbereden-de urea-polyakrylamidgel-rensing av det humane proinsulin cDNA, ble den andre streng syntetisert på denne templat med DNA-polymerase stort fragment og d(CAGATCACTGTCC) som 2. streng primer. Etter Sl nuklease-digestion ble den humane proinsulin ds. cDNA renset ved polyakrylamidgel-elektroforese, avsluttet med terminal transferase og klonet i Pstl situs på pBR327 (Sorberon et al., Gene _9 (1980), 287-305) i E. coli. En korrekt klon som inneholdt plasmidet, ble identifisert fra rekombinantene ved re-striksjons-endonuklease-analyse og bekreftet ved nukleotid-sekvensdannelse (A. Maxam & W. Gilbert; Methods in Enzymology, 65 (1980), 499-560. F. Sanger, S. Nicklen & A.R. Coulson; Proe.Natl.Acad.Sei., USA, 74 (1977), 5463-5467). 1. og 2. streng-primerene, GCTTTATTCCATCTCTC og CAGATCACTGTCC, anvendt til isolering av en human-proinsulin cDNA klon, ble syntetisert ved hjelp av semiautomatisk kolonne-synte-se ved å bruke fosfotriester-tilnærming på en polystyrenbærer

(H. Ito, Y. Ike, S. Ikata og K. Itakura; Nucleic Acids Research 10 (1982) 1755-769).

2. Fremstilling av gener som koder for B- X- Y- A

Gener som koder for de fire insulinforløpere B-Lys-Lys-A, B-Lys-Arg-A, B-Arg-Lys-A og B-Arg-Arg-A ble laget ved å innføre et fragment som koder for. den lineære humane proinsulin-sekvens B-C-A i sirkulær enkeltstrenget M-13 bakteriofagvektor og situs spesifikk mutagenese av den humane proinsulinsekvens med kjemisk syntetiserte 30-mer-delesjonsprimere, KFN41, KFN4, KFN42 og KFN18, henholdsvis, og en "universal" 15-mer M13 dideoksy-sek-vensdannende primer (K. Norris et al., Nucl.Acids.Res., 11

(1983), 5103-5112). Et dobbeltstrenget restriksjonsfragment (Xbal-EcoRl) ble kuttet ut av den delvis dobbeltstrengete sirku-lære DNA og ligert til pUC13 eller pT5. Ved transformering og retransformering av E. coli, ble transformanter som inneholdt plasmider som inneholdt det ønskede gen, identifisert.

De fire mutagene delesjonsprimerer KFN4, KFN18, KFN41 og KFN42 ble syntetisert på en automatisk DNA-syntesizer (Applied

Biosystems Model 380 A) under anvendelse av fosforamiditt-kjemi og kommersielt tilgjengelige reagenser. (S. L. Beaucage og M. H. Caruthers 1981) Tetrahedron Letters 22, 1859-1869). Oligonukleotidene ble renset ved hjelp av polyakrylamidgel-elektroforese under denaturerende betingelser. De fire delesjonsprimerer er som følger:

3. Plasmidkonstruksjoner

Gener som koder for human-insulinforløpere ble kombinert med fragmenter som koder for TPI-promoteren (TPI ir ) (T.Alber og G. Kawasaki; Nucleotide Sequence of the Triose Phosphate Isomerase Gene of Saccharomyces cerevisiae; J.Moi.Applied Genet. 1 (1982) 419-434), MFocl-ledersekvensen (J. Kurjan og I. Herskowitz; Structure of a Yeast Pheromone Gene (MFcc) : A Putative a-Factor Precursor Contains four Tandem Copies of Mature a-Factor. Cell 30 (1982) 933-943) og transkripsjons-avslutningssekvensen fra TPI av S. cerevisiae TPIT«Disse fragmenter (TPIT) gir sekvenser for å sikre en høy transkripsjons-hastighet for insulinforløperen som koder for genet og sørger også for en presekvens som kan påvirke lokaliseringen av insul-inforløperen til sekresjonsveien og dens eventuelle sekresjon inn i vekstmediet.

Ekspresjonsplasmidene innbefatter videre gjærcelle 2n ut-gangspunktet for replisering og en valgfri markør LEU2.

I løpet av in vivo-modning av cc-faktoren i gjærcellen blir de siste (C-terminale) seks aminosyrer av MFcc-lederpeptidet (Lys-Arg-Glu-Ala-Glu-Ala) fjernet fra a-faktorforløperen ved hjelp av den sekvensielle virkning av en endopeptidase som gjen-kjenner Lys-Arg-sekvensen og en aminodipeptidase som fjerner Glu-Ala-restene (D. Julius et al., Cell 32 (1983) 839-852).

For å eliminere behovet for gjærcelle-aminodipeptidasen ble sekvensen som koder for C-terminal Glu-Ala-Glu-Ala av MFal-lederen fjernet via in vitro-mutagenese.

I en foretrukket konstruksjon ble de modifiserte ekspre-sjonsenheter overført til et stabilt, høykopitall gjærcelleplasmid CPOT (ATCC nr. 39685), som kan selekteres bare i nærvær av glukose i vekstmediet. Plasmid CPOT er basert på vektoren Cl/l som er blitt modifisert ved å substituere det opprinnelige pBR322Bgll - BamHl-fragment med det tilsvarende Bgll-BamHl-fragment fra pUC13 og videre innføring av S.pombe TPI-genet (POT) som et BamHl. - Sall-fragment for å gi CPOT. Cl/l fåes fra pJDB 248, Beggs et al.; Nature 275, 104-109 (1978) som beskrevet i europeisk patentsøknad, publ. nr. 103 409.

4.Transformasjon

Plasmider fremstilt som beskrevet ovenfor ble transformert til S. cerevisiae-stammer som bar delesjoner i TPI-genet ved å selektere for vekst på glukose. Slike stammer er normalt ikke i stand til å vokse på glukose som den eneste karbonkilde og vokser meget langsomt på galaktose-laktatmedium. Denne defekten er forårsaket av en mutasjon i triosefosfat-isomerasegenet, fått ved delesjon og erstatning av en hoveddel av dette genet med S. cerevisiae LET 2-genet. På grunn av vekstmangelen er det en sterk seleksjon for et plasmid som inneholder et gen som koder for

TPI.

5. Ekspresjon av insulinforløperne i gjærceller

Gjærcellestammene som inneholder plasmidet som koder for forskjellige insulinforløpere, ble dyrket på YPD-medium (F. Sherman et al.; Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory 1981). For hver stamme ble to kulturer på 1 liter hver i en platekolbe på 2 liter rystet ved 30°C inntil de nådde en OD ved 600 nm på omtrent 15 (omtrent 48 h). Etter sentrifugering ble supernatanten fjernet for videre analyse. Immunoreaktiv insulin (IRI) ble målt ved radioimmunoassay (L. Heding; Diabetologia 8 (1972) , 260-266) ved anvendelse av semisyntetisk human-insulin (NOVO Industri A/S) som standard for konstruksjoner 1-6. Semisyntetisk human-insulin eller den gjeldende insulin-forløper anvendt til konstruksjoner 7-10. For insulinforløperen, B-Arg-Arg-C-peptid-Lys-Arg-A (human-proinsulin) ble ekspresjons-nivået for immunoreaktiv C-peptid (IRC) målt ved anvendelse av en human C-peptid-radioimmunoessay (L.G. Heding; Diabetologia,

11 (1975) 541-548. I denne essay ble<1>25I-Tyr-human-C-peptid

brukt som markør( og et marsvin-anti-human-C-peptid-serum,

M1228 (0. K. Faber et al.; Hoppe-Seylers Z. Physiol.Chem.,

357 (1976) 751-757, som reagerer like godt med human-C-peptid

og human-proinsulin, ble brukt som antistoff. Human-proinsulin ble brukt som standard (V. Kruse et al.; Diabetologia 27,

(1984) 414-415). Ekspresjonsnivåene for immunoreaktiv insulin og immunoreaktivt C-peptid i fermenteringsbuljongen for de transformerte gjærcellestammene er oppsummert i tabell 1.

Det fremgår av tabell 1 at det er en slående forskjell i ekspresjonsnivåene for de forløpere som her er beskrevet og forløpere av proinsulintypen, dvs. som inneholder et par dibasiske aminosyrer som flankerer C-peptidet eller et modifisert C-peptid. 6. Omdannelse av insulinforløperne til human- insulin Omdannelsen av insulinforløperne til human-insulin kan ut-føres enten ved en totrinns enzymatisk prosess:

eller en kombinert ett-trinns-prosess hvor trypsin og karboksypeptidase B er til stede på samme tid i reaksjonsblandingen. I formlene ovenfor og en del av den følgende tekst er di-sulfidbroen mellom A- og B-kjeden illustrert ved hjelp av en klamme 1") for bedre illustrasjon av den enzymatiske spaltningsprosess. I formlene ovenfor er

den énkjedede insulinforløper (fig. 1);

er det tokjedede insulin-

forløperintermediat hvor peptidbindingen mellom rest nr. 32 (Lys eller Arg) og rest nr. 33 (Al = Gly) er blitt hydrolysert; B A er human-insulin. I de gjenværende formler av typen B-X-Y-A er det forstått at A- og B-kjedene er forbundet ved di-sulf idbroer som i naturlig insulin.

Den enzymatiske omdannelse blir utført i en vandig løsning av insulinforløperne. Trypsintypen er ikke materiale for praktisering av denne oppfinnelse. Trypsin er et velkarakterisertenzym tilgjengelig i høy renhet, spesielt fra okse-

og svinepankreas. Enzymer med trypsinlignende spesifisitet, for eksempel plasmin, klostripain og Achromobacter lyticus pro-tease kan også anvendes.

For å få et høyt omdannelsesutbytte er det viktig å bruke godt renset karboksypeptidase B som ikke inneholder karboksypeptidase A aktivitet. Dette kan oppnås ved rensing av kommersielt tilgjengelig karboksypeptidase B, for eksempel ved affini-tetkromatografi eller ione-utvekslingskromatografi. Alternativt kan karboksypeptidase A-inhibitorer slik som e-amino-n-kapron-syre eller karbobenzoksyglycin bli tilsatt til digestionsblandingen.

Éntrinns-omdannelsen blir fortrinnsvis utført ved svakt for-høyete temperaturer (fra 35-40°C) og ved en pH-verdi på fra 7-8. Trypsin og karboksypeptidase Bokonsentrasjonen er fortrinnsvis omtrent 5 ug/ml og substratkonsentrasjonen er omtrent 1 mg/ml.

I totrinns-omdannelsesprosessen blir trypsin-digestionen fortrinnsvis utført ved høy pH. Ved høy pH (i området 11-12)

er lysinaminosyrerestene i insulinforløpermolekylet (f.eks. B29-Lys og B31-Lys i B-Lys-Arg-A, fig. 1) nesten uforandret

(pKa for lysinresten er omtrent 9,0) og spalting med trypsin fo-

rekommer ikke. Imidlertid, i for eksempel

er B32-argininresten (pKa=12) fremdeles hovedsakelig positivt ladet og således tilgjengelig for tryptisk spalting. Spalting ved B22-argininresten forekommer bare ved veldig lav hastighet, sannsyn-ligvis på grunn av sterisk hindring. En stabil pH-verdi i løpet av den tryptiske digestion av er kritisk for et høyt utbytte av

Flere forskjellige buffersystemer er

blitt prøvet med det formål å stabilisere pH ved 11,8-11,9. Buffersystemet HPO^ /p0^ som normalt brukes ved høye pH-ver-dier, har en god bufferkapasitet ved pH 11,8. Imidlertid lider dette buffersystem av tre hovedulemper. For det første: pH av en løsning av HPO^ ~/P0^ ~ er veldig følsom overfor temperatur-variasjoner, og en forandring fra for eksempel 25°C til 4 C kan minke pH-verdien med 0,7 pH-enhet, For det andre: Ca<++>(som kan være til stede for å stabilisere trypsin) vil bli utfelt fordi løselighetsproduktet av Ca3(P04)2og CaHP04er relativt lav. For det tredje: det er ikke mulig å surgjøre digestion-

blandingen (for å stoppe reaksjonen) momoTtantpå grunn av virk-ningen av buffersystemene HP04 /H2P04 og H2P04 /H3P04. Dette systemet vil i løpet av surgjøringen resultere i nøytral pH

for en tidsperiode hvor trypsin øyeblikkelig vil danne det uønskede produkt des(B30)insulin. Som et resultat av disse ulempene er det nokså uvanlige buffersystem r^O/OH blitt brukt. Dette system lider ikke av de ovenfor nevnte ulemper. Optimale beting-

elser for den tryptiske digestion av

ble funnet å være omtrent 20 mg/ml av Bi -X-Arg A1, 200 ug/ml trypsin; bufferløsning: 37,5 mM NaOH (resulterende pH som målt ved 25°C var 11,86); temperatur omtrent 4°C og inkubasjonstid omtrent 180 minutter. Utbyttet var 90,5 % for Det tryptiske konversjonsprodukt kan renses ved en rekke konvensjonelle metoder for eksempel preparativ HPLC, absorpsjonskromatografi og ione-utvekslingskromatografi. kan bli nesten kvantitativt omdannet til (human-insulin) ved digestion med karboksypeptidase B. Optimale betingelser for denne omdannelse ble funnet å være omtrent 5 mg/ml av og omtrent 5 ug/ml av karboksypeptidase B; bufferløs-ning: 50 mM TRIS HCl, pH = 9,3, temperatur omtrent 37°C og inkubasjonstid omtrent 30 min. Utbyttet var omtrent 99,5 % for omdannelsen av Omdannelsen av insulinforløperen til human-insulin ble fulgt kvantitativt ved revers-fase-høytrykksvæske-kromatografi (HPLC) og er illustrert i figur 8. Idet det refereres til figur 8, ble

oppløst til

en konsentrasjon på 5 mg/ml i 50 mM TRIS-HCl buffer, pH = 9,3

og digestrert med 5Mg/ml karboksypeptidase B (Boehringer) ved 37°C. Alikvote mengder ble fjernet fra digestionsblandingen ved t = 0(A), t = 2 min. (B) , t = 5 min. (C) og t = 30 min. (D), surgjort til pH = 1,5 med 4 N HCl og analysert ved hjelp av HPLC på en 5 p Nucleosil<®>RP C-18 kolonne (4 x 200 mm) ekvilibrert og isokratisk eluert med 33 mM (NH4)2S04, 1,5 mM H2S04som inneholdt 29,4 % (v/v) acetonitril ved 30°C ved en strømhastig-het på 1 ml/min. Peptider ble påvist ved UV-absorpsjon ved 214 nm. Omdannelsen var fullført etter 30 min-! og etanol ble tilsatt til digestionsblandingen til 60 % (v/v). B A ble renset ved anionisk utvekslingskromatografi pa e en QAE-Sephadex ®-kolonne som beskrevet av J. Schlichtkrull et al.; (1974)

Horm.Metab.Res.Suppl., Ser. 5, s.134-143. B:l B-kjede, A: A-kjede, K: Lys, R: Arg. Det fremgår av figur 8 at produktet fra trypsin-digestionen

b.le nesten kvantitativt

omdannet til B A ved digestion med karboksypeptidase B.

Omdannelsen av insulinforløperne til human-insulin er gitt

i eksemplene 10, 11 og 12, og karakteriseringen av den humane insulin i eksempel 13.

EKSPERIMENTELL DEL

Eksempel 1

Konstruksjon av et gjærcelleplasmid pMT585 for ekspresjon

av B- Lys- Arg- A

Et 4,3 kb EcoRV-Xbal og et 3,3 kbEcoRl-Eco-RV fragment fra pMT342 ble ligert til et 0,6 kb EcoRl-Xbal fragment av pM215. Plasmid pMT342 er gjærcellevektoren pMT212 med en innført TPI P-MFccl-leder-BCA-TPIT-sekvens. Konstruksjonen av pMT342 og

pMT212 er beskrevet i europeisk patentsøknad, publ. nr. 68 701.Plasmid pM215 ble konstruert ved subkloning av EcoRl-Xbal-fragmentet som inneholdt proinsulin-kodesekvens B-C-A fra p285 (ATCC

nr. 20681) til pUC13 (konstruert som beskrevet for pUC8 og pUC9 av Vieira et al., Gene 19; 259-268 (1982)) og videre in vitro loop-out-fjerning av de 12 basene som koder for Glu-Ala-Glu-Ala ved forbindelsen mellom MFal-leder og proinsulin B-C-A.P285 inneholder det innfelte stykke TPIp-MFal-leder-B-C-A-TPITog er blitt deponert i gjærcellestamme Z33 (ATCC nr. 20681). Dens konstruksjon er beskrevet i US-patentsøknad nr. 547 748 av 1. novem-ber 1983.

Ligering av fragmentene ovenfor fra pMT342 og pM215 gir plasmid pMT462 som inneholder det innfelte stykke MFal-leder (minus Glu-Ala-Glu-Ala)-B-C-A. For omdannelse av B-C-A-kodefragmentet til et B-Lys-Arg-A-kodefragment ble den modifiserte situs-spesifikke mutageneseprosedyre (K. Norris et al., ibid.), anvendt. Et 0,6 kb EcoRl-Xbal-fragment fra pMT462 som kodet for MFal-leder- (minus Glu-Ala-Glu-Ala)-B-C-A ble innført i fag M13 mplO RF (J. Messing og J. Vieria (1983) upubliserte resultater) DNA-kuttet med Xbal-EcoRI. Enkelt-strenget Ml3-fag som inneholdt det ovenfor nevnte innfelte stykke EcoRI-Xbal ble inkubert med 30-mer delesjonsprimer KFN4 og den "universelle" 15-mer Ml3-pri mer d(TCCCAGTCACGACGT) (New England Biolabs), oppvarmet til 90°C i 5 minutter og langsomt avkjølt til romtemperatur for å tillate herding. Den delvis dobbelt-strengete DNA ble laget ved tilsetning av en d-NTP-blanding, Klenow Polymerase og T4 ligase. Etter fenolekstraksjon, etanolpresipitering og resuspen-dering, ble DNA kuttet med restriksjonsenzymer Apal, Xbal og EcoRl. Etter enda en fenolekstraksjon, etanolpresipitering og resuspensjon ble DNA ligert til EcoRl-Xbal-kuttet pUC13. Ligeringsblandingen ble transformert til en E. coli (i?~m+) -stamme og plasmider ble fremstilt fra en rekke transformanter. Plasmid-preparater ble kuttet med EcoRl og Xbal, og disse preparater som viste bånd ved både 0,5 og 0,6 kb, ble retransformert til E. coli. Fra retransformeringen ble en transformant som inneholdt bare pUCl3 med et 0,5 kb innfelt stykke valgt. Sekvensen av det EcoRl-Xbal-innfelte stykke av dette plasmid, pMT579, ble så bekreftet ved hjelp av Maxam-Gilbert-metoden for å kode MFal-leder-(minus Glu-Ala-Glu-Ala)-B-Lys-Arg-A. Konstruksjonen av pMT579 er vist

i figur 2. Det Xbal-EcoRl-innfelte stykke fra pMT579 ble gitt med TPI-promoteren og TPI-terminatoren ved ligering av et 0,5 kb Xbal-EcoRl-fragment av pMT579 med et 5,5 kb Xbal-EcoRl-fragment av pT5. Konstruksjonen av pT5 som inneholder det innfelte stykke TPI tf -MFal-leder-B-C-A-TPI Xer illustrert i figur 3. Det resulterende plasmid pMT583 som inneholder det innfelte stykke TPI Lr -MFal-leder-(minus Glu-Ala-Glu-Ala)-B-Lys-Arg-A-TPI^ J- ble så kuttet med BamHl og delvis med Sphl, og 2,1 kb-fragmentet ble innført..i CPOT kuttet med BamHl og Sphl. Det resulterende plasmid pMT585 ble brukt til transformasjon av gjærceller. Konstruksjonen av pMT583 og pMT585 er vist i figur 3.

Eksempel 2

Konstruksjon av et gjærcelleplasmid pMT611 for ekspresjon

av B- Arg- Arg- A

B-C-A-kodefragmentet fra pMT462 (se eksempel 1) ble omdannet til B-Arg-Arg-A ved hjelp av en fremgangsmåte analog med fremgangsmåten beskrevet i eksempel 1 ved situs-spesifikk mutagenese med en blanding av 30-mer-delesjonsprimer KFN18 og den "universelle" 15-mer Ml3-primer som illustrert i figur 5. Sekvensen av det EcoRl-Xbal-innfelte stykke av plasmid pMT599 ble bekreftet ved hjelp av Maxam-Gilbert-metoden til å kode MFal-leder-(minus Glu-Ala-Glu-Ala)-B-Arg-Arg-A. Det Xbal-EcoRl-innfelte stykke fra pMT599 ble utstyrt med TPI-promoteren og TPI terminator ved ligering av et 0,5 kb Xbal-EcoRl-fragment av pMT599 med et 5,5 kb Xbal-EcoRl fragment av pT5. Det resulterende plasmid pMT602 som inneholdt det innfelte stykke TPI Lr-MFal-leder-(minus Glu-Ala-Glu-Ala)-B-Arg-Arg-A-TPITble så kuttet med BamHl og delvis med Sphl, og 2,1 kb fragmentet ble innført i CPOT kuttet med BamHl og Sphl. Det resulterende plasmid pMT611 ble anvendt til transformering av gjærceller. Konstruksjonen av plasmid pMT611 er vist i figur 5.

Eksempel 3

Konstruksjon av et gjærcelleplasmid pMT650 for ekspresjon av B- Lys- Lys- A

Det B-C-A-kodende fragment fra pMT462 (se eksempel 1) ble omdannet til B-Lys-Lys-A ved en fremgangsmåte som var lik fremgangsmåten beskrevet i eksempel 1 ved hjelp av situs-spesifikk mutagenese med en blanding av 30-mer-delesjonsprimer KFN41 og den "universelle" 15-mer Ml3-primer som illustrert i figur 6.

Etter påfylling med Klenow polymerase og ligering med T4 ligase ble det delvis dobbeltstrengete DNA digestrert med Apal, EcoRl og Xbal og ligert med 5,5 kb Xbal-EcoRl fragmentet fra plasmid pT5 (se eksempel 1). Etter transformering og retransformering til E. coli ble et plasmid pMT652 som inneholdt det innfelte stykke MFal-leder-(minus Glu-Ala-Glu-Ala)-B-Lys-Lys-A isolert, og sekvensen av det innfelte stykke bekreftet, som beskrevet ovenfor.

Plasmid pMT652 ble spaltet med Xbal-EcoRl, og 0,5 kb fragmentet ble ligert med et 7,8 kb Xbal-Kpnl og et 4,3 kb Kpnl-EcoRl fragment av pMT 644. Det resulterende plasmid pMT650 inneholder det innfelte TPIp-MFal-leder (minus Glu-Ala-Glu-Ala)-B-Lys-Lys-A-TPIT og inneholder videre det TPI-kodende gen (POT) fra. CPOT. Konstruksjonen av plasmid pMT650 er illustrert i figur 6, og konstruksjonen av pMT644 er vist i figur 4. Plasmidet pUCl2 og pUCl8 anvendt for konstruksjonen av pMT644 ble konstruert som beskrevet for pUC13 (Vieira et al., ibid.). Plasmid p60l (se figur 4) inneholder det innfelte stykke TPI hr-MFal-leder -B'A-TPITmed flankerende Bgl2 og BamHl-situs. B'A står for B(1-29)-A(l-21), hvor B(l-29) er en forkortet B-kjede av human-insulin fra Phe Bl til Lys B2 9 og A(l-21) er A-kjeden av human-insulin. Konstruksjonen av en DNA-sekvens som koder for B'A er beskrevet i europeisk patentsøknad, publ. nr. 68 701. pMT650 ble anvendt til transformasjon av gjærceller.

Eksempel 4

Konstruksjon av plasmid pMT658 for ekspresjon av

B- Arg- Lys- A

Plasmid pMT658 ble konstruert som beskrevet for pMT650 i eksempel 3, med unntak av at 30-mer" delesjonsprimeren KFN42 ble anvendt istedenfor KFN41. En mer direkte konstruksjon av pMT644 derivatet ble også valgt: etter in vitro mutagenese, dvs. etter påfylling med Klenow polymerase og ligering med T4 ligase, ble det delvis dobbeltstrengede DNA digerert med Apal, EcoRl og Xbal og ligert til et 7,8 kb Xbal-Kpnl og et 4,3 kb Kpnl-EcoRl-fragment av pMT644. Ligeringsblandingen ble transformert til E. coli (r m<+>) og plasmid fremstilt fra en rekke transformanter. Et plasmid som viser Xbal-EcoRl-fragmenter ved både 0,6 og 0,5 kb, ble retransformert til E. coli, for å gi en stamme som inneholdt plasmid pMT658 som inneholdt 0,5 kb, men ikke 0,6 kb EcoRl-Xbal-fragmentet. pMT658 inneholder det innfelte stykke TPI hr -MFal-leder-(minus Glu-Ala-Glu-Ala)-B-Arg-Lys-A-TPI •*■. Sekvensen av det B-Arg-Lys-A-kodende segment ble verifisert ved Maxam-Gilbert DNA-sekvensdannelse. Konstruksjonen av pMT658 er illustrert i figur 7. pMT658 ble anvendt til transformasjon av gjærcelle.

Eksempel 5

Transformasjon

S. cerevisiae-stamme MT501 (E2-7B X E11-3C a/a, Atpi/tpi, Apep 4-3/pep 4-3) ble dyrket på YPGaL (1 % Bacto-gjærekstrakt, 2 % Bacto-pepton, 2 % galaktose, 1 % laktat) til en ODgQonm^ 0,6.

100 ml kultur ble høstet ved sentrifugering, vasket med

10 ml vann, resentrifugert og resuspendert i 10 ml 1,2 M sorbitol, 25 mM Na2EDTA, pH = 8,0, 6,7 mg/ml ditiotreitol. Suspensjonen ble inkubert ved 30°C i 15 minutter, sentrifugert og cellene resuspendert i 10 ml 1,2 M sorbitol, 10 mM Na2EDTA, 0,1 M natriumcitrat pH = 5,8, 2 mg Novozym ®234. Suspensjonen ble inkubert ved 30°C i 30 minutter, cellene oppsamlet ved sentrifugering, vasket i 10 ml av 1,2 M sorbitol og i 10 ml CAS (1,2 M sorbitol, 10 mM CaCl2, 10 mM Tris (Tris = Tris(hydroksy-metyl)-aminometan) pH = 7,5) og resuspendert i 2 ml CAS. For transformasjon ble 0,1 ml CAS-resuspenderte celler blandet med omtrent 1 ug plasmid pMT585 og satt ved romtemperatur i 15 min. 1 ml 20 % polyetylenglykol 4000, 10 mM CaCl2, 10 mM Tris pH = 7,5 ble tilsatt og blandingen satt i videre 30 minutter ved romtemperatur. Blandingen ble sentrifugert, og pelleten resuspendert i 0,1 ml av SOS (1,2 M sorbitol, 33 % v/v YPGaL, 6,7 mM CaCl2, 14 ng/nil leucin) og inkubert ved 30°C i 2 timer. Suspensjonen ble så sentrifugert og pelleten resuspendert i 0,5 ml 1,2 M sorbitol. 6 ml av topp-agaren (SC-mediet i Sherman et al.,

(Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, 1981)

med leucin utelatt og som inneholdt 1,2 M sorbitol pluss 2,5 % agar) ved 52°C ble tilsatt og suspensjonen helt ut på toppen av plater som inneholdt det samme agar-stivnete, sorbitol-inneholdende medium. Transformant-kolonier ble plugget etter 3 dager ved 30°C, reisolert og brukt til å starte væskeku1turer. En slik transformant MT593 (=MT50l/pMT585) ble valgt for videre karakterisering .

Plasmider pMT611, pMT650 og pMT6 58 ble transformert til

S. cerevisiae-stamme MT501 ved den samme fremgangsmåte som ovenfor, og transformantene MT616 (= MT50l/pMT611), MT655 (=MT501/ pMT650) og MT660 (=MT50l/pMT658) ble isolert.

De transformerte mikroorganismer MT 593, MT 616, MT 655 og MT 600 ble deponert av oss i Deutsche Sammlung von Mikro-organismen (DSM), Griesebachstrasse 8, D-3400 Gottingen, den 16. januar 1985 og gitt referansenumrene henholdsvis DSM 3194, DSM 3195, DSM 3198 og DSM 3199. DSM, som er en godkjent inter-nasjonal deponeringsmyndighet under Budapest-konvensjonen av 1977, gir permanens av deponeringen overfor og tilgang til disse for publikum i samsvar med henholdsvis reglene 9 og 11, i konvensjonen ovenfor.

Eksempel 6

Rensing av B- Lys- Arg- A fra aiærcellestamme MT593 fDSM 3194)

Gjærcellestamme MT 593 (DSM 3194) ble dyrket på YPD-medium. En 1-liters kultur i en 2-liters platekolbe ble rystet ved

30°C til en 0Dg00nm^ ^* Etter sentrifugering ble ekspresjonsprodukter fra 816 ml supernatant isolert som følger:

En kolonne (1,5 x 9 cm) av LiChroprep<®>RP-18 (Merck, art. 9303) ble vasket med 30 ml 50 mM NH4HC03som inneholdt 60 % (v/v) etanol. Kolonnen ble ekvilibrert med 50 ml 50 mM NH^HCO^. 95 ml 96 % etanol ble tilsatt til 815 ml av gjærcellecupernatan-ten, og blandingen ble pumpet gjennom kolonnen over natten, (strøm

45 ml/h).

Kolonnen ble vasket med 15 ml 0,1 M NaCl og så med 15 ml H20 og peptidmaterialet ble eluert med 50 mM NH^HCO^som inneholdt 60 % (v/v) etanol. Eluatet (4,5 ml) ble konsentrert til 1,1 ml ved vakuumsentrifugering (Savant vakuumsentrifuge) for å fjerne etanolen og volumet ble justert til 10 ml med 25 mM

HEPES buffer ved pH = 7,4. Prøven ble tilført til en anti-insulin-sefarosekolonne (2,5 x 4,5 cm) som før tilførselen var blitt vasket med 20 ml NaFAM buffer (L. Heding, Diabetologia 8 (1972) , 260-66), og med 10 ml 25 mM HEPES buffer pH = 7,4. Etter til-førselen ble kolonnen tillatt å stå i 30 minutter ved romtemperatur og deretter vasket med 40 ml 25 mM HEPES buffer, pH = 7,4. Peptidmaterialet ble eluert med 20 % eddiksyre, og pH av eluatet ble justert til 7,0 med NH^OH.

Eluatet fra det foregående trinn ble konsentrert til 250 ul ved vakuumrotasjon, og peptider ble videre renset ved revers fase HPLC på en 5n Waters Novapak C-18 kolonne (3,9 x 150 mm).

A- og B-bufferne var henholdsvis 0,1 % TPA i H20 og 0,07 % TPA

i acetonitril. Kolonnen ble ekvilibrert med 25 % B ved en strøm-hastighet på 0,75 ml/min. og peptidene ble eluert med en lineær gradient (1 % acetonitril pr. min.) og påvist ved 276 nm. Hovedtoppen eluerte med en retensjonstid på 13,15 minutter, og peptidmateriale fra denne toppen ble isolert ved lyofilisering av eluatet. Peptidmaterialet blekarakterisertsom beskrevet i eksempel 8. Utbyttet i hver trinn av rensingen ble bestemt ved raidoimmunoassay som tidligere beskrevet, og tabell 2 oppsummerer rensingen. Det totale utbytte var 39%.

Eksempel 7

Rensing av B- Lys- Lys- A, B- Arg- Lys- A og B- Arg- Arg- A fra henholdsvis gjærcellestamme MT 655 ( DSM 3198), MT 660 ( DSM 3199) og MT 616 ( DSM 3195)

De ovenfor nevnte gjærcellestammer ble dyrket som tidligere beskrevet i eksempel 6, og ekspresjonsprodukter ble renset fra de forskjellige supernatanter hovedsakelig som beskrevet i eksempel 6. Tabell 3 oppsummerer de totale utbytter.

Eksempel 8

Karakterisering av B- Lys- Arg- A renset fra gjærcellestamme MT 593

( DSM 3194)

B-Lys-Arg-A ble renset som beskrevet i eksempel 6. Aminosyresammensetningen av peptidet ble bestemt som følger:

139,6 ug (19 nmol) ble hydrolysert i 100 ul 6 N HCl i 24 timer ved 110°C. Hydrolysatet ble analysert på en Beckman Model 121 M aminosyre-analysator. Den følgende aminosyresammensetning ble funnet:

Omtrent 5nmol peptidmateriale ble underlagt aminosyresekvensanalyse. Sekvensanalysen ble utført med en Gas Phase Sequencer (Applied Biosystem Model 470 A) som beskrevet av A.J. Moody, L. Thim og I. Valverde (February Lett., 172 (1984), 142-148). Følgende resultater ble funnet:

Det gjennomsnittlige utbytte ved gjentatte forsøk var 92,1 %

Eksempel 9

Karakterisering av B- Lys- Lys- A, B- Arg- Lys- A og B- Arg- Arg- A renset fra henholdsvise gjærcellestammer MT 655 ( DSM 3198),

MT 660 ( DSM 3199) og MT 616 ( DSM 3195)

Peptidmateriale ble renset fra de ovenfor nevnte gjærcellestammer som beskrevet i eksempel 6. Peptidene ble underlagt aminosyresekvensanalyse som beskrevet i eksempel 8. Fra sekvens-resultåtene (ikke vist) kunne det konkluderes at de dibasiske sekvenser som sammenknytter B- og A-kjeden, var henholdsvis Lys-Lys (MT 655), Arg-Lys (MT 660) og Arg-Arg (MT 616). Rense-de peptider ble underlagt aminosyreanalyse som beskrevet i eksempel 7. Aminosyresammensetningene ble funnet i samsvar med teorien (resultater vist bare for B-Lys-Lys-A).

Eksempel 10

Omdannelse av B- Lys- Arg- A til human- insulin ( ett- trinnsprosess)

10 mg B-Lys-Arg-A ble oppløst i 10 ml 0,23 M TRIS-HCl buffer pH = 7,5. Løsningen ble oppvarmet til 37°C og 50 Mg trypsin (NOVO Industri A/S) og 50 ug karboksypeptidase B (Boehringer), begge løst i 100 ul vann, ble tilsatt ved tid null. Alikvote mengder av reaksjonsblandingen ble fjernet ved tid 0 minutter, 2 min., 10 min., 40 min. og 80 min. Enzymreaksjonen ble stoppet ved surgjøring av prøvene tilpH =2,5 med 1 M HCl. Omdannelsen av B-Lys-Arg-A til human-insulin ble fulgt av revers fase HPLC på en 5n RP C-18 kolonne (4 x 200 mm) av Nucleosil (Macherey Nagel). A-bufferen bestod av 25 % acetonitril justert til pH = 3,5 med H2S04, og B-bufferen var 45 % acetonitril, 0,15 M (NH4)2S04, 1,5 mM H2S04. Elueringen ble utført i et isokratisk system ved å bruke en blanding av 80 % A-buffer/ 20 % B-buffer ved en strøm på 1 ml/min. Temperaturen av.løsnings-midlene og kolonnen var 30°C og peptidene ble påvist ved 214 nm.

Det optimale utbytte i ett-trinnsprosessen ovenfor ble oppnådd etter 10 minutters inkubering. Ved denne tiden bestod reaksjonsblandingen av 45 % human-insulin, 10 % Des-B30-insulin og 45 % Arg-Ao-insulin. For å øke utbyttet av omdannelsen ble en totrinnsprosess utformet (eksempel 11).

Eksempel 11

Omdannelse av B- Lys- Arg- A til human- insulin ( to- trinnsprosess).

i -t

26,4 ml H20 ble tilsatt til 471 mg B-Lys-Arg-A. Blandingen ble avkjølt til 4°C og 3,0 ml 0,25 M NaOH ble tilsatt hvorved insulinforløperen ble oppløst. 6 mg trypsin (NOVO Industri A/S)

i 200 ul vann ble tilsatt. Reaksjonen ble utført ved 4°C i 5 h og stoppet ved tilsetning av 600 ul 4 N HCl. Utbyttet som bestemt ved HPLC (metode gitt i eksempel 10) var 91,5 % av B-Lys-Arg A, og mesteparten av den g jenværende 8,5 % av udigest-

I i i

rert B-Lys-Arg-A. Produktet (B-Lys-Arg A) ble renset ved preparativ HPLC på en kolonne (5 x 25 cm) av oktadecyldimetylsilyl-substituert silisiumdioksyd (gjennomsnittlig partikkelstørrelse: 15 4*, porestørrelse: 100 Å) . Kolonnen ble ekvilibrert og eluert (isokratisk) med 0,185 M KCl/0,6 mM HCl (pH = 3,15) som inneholdt 37 % (v/v) etanol ved en strømhastighet på 2 l/h. B-Lys-Arg-A eluerte ved 4,3 kolonnevolumer og ble isolert fra alkoholdelen med en tidligere beskrevet krystalliseringsprosedyre for krystallisering av human-insulin-B-30-estere (J. Markussen (1984) i "Diabetes Research Vol. I, Laboratory Methods Part B", s. 403-411, eds. Larner and Pohl).

Krystallene ble lyofilisert og løst i 50 mM TRIS-HC1-

buffer (pH =9,3) i en konsentrasjon på 10 mg/ml. Insulin-forløperintermediatet ble omdannet til human-insulin ved

digestion med karboksypeptidase B (40 ug/ml) ved 37°C i 40 h. Til digestionsblandingen ble det så tilsatt etanol til en slutt-konsentrasjon på 60 % (v/v), og human-insulin ble renset fra blandingen ved anionisk utvekslings-kromatografi på en QAE-Sephadex (Pharmacia)-kolonne som beskrevet av Schlichtkrull

et al. (Horm.Metab.Res.Suppl., Ser. 5 (1974) 134-145).

Utbyttene ved de forskjellige trinnene av omdannelsen inkludert rensingsprosessene er gitt i tabell 7.

Eksempel 12

Omdannelse av B- Lys- Lys- A til human- insulin ( ett- trinnsprosess) 10 mg av B-Lys-Lys-A ble omdannet til human-insulin som beskrevet i eksempel 10. Det totale utbytte av human-insulin som bedømt fra HPLC var 48 %. De andre produktene ble identifisert som Lys-Ao-insulin (42 %), Des-B30-insulin (9 %) og små mengder uidentifiserte komponenter (1 %).

Eksempel 13

Karakterisering av human- insulin fremstilt fra B- Lys- Arg- A

Human-insulin ble fremstilt som beskrevet i eksempel 11 ogkarakteriserti den følgende analyse: a) Human-insulinet viser bare ett bånd på basisk plate-elektroforese i urea-inneholdende polyakrylamidgeler (metode beskrevet av Schlichtkrull et al., Horm.Metabol.Res., Suppl. Ser. 5 (1974) 134-143). Båndet migrerte som pankreatisk human-insulin. b) Man fikk regelmessig formete rhombiske krystaller ved krystallisering av den humane insulin i nærvær av Zn<++>(metode beskrevet av Schlichtkrull, Acta Chem. Scand. 10 (1956) 1459-1464). c) Den biologiske aktivitet av den humane insulin ble bestemt i en museblodsukker-deplesjonstest. Den estimerte potens var 28,1 I.U./mg (p 0,05 konfidens-grenser: 25,7-30,7 I.U./mg) idet man brukte den 4. internasjonale standard for insulin. å) Aminosyresammensetningen av den humane insulin ble bestemt etter hydrolyse ved 110°C i 24 h, 48 h og 96 h i 6N HCl, og verdiene for Thr, Ser, Pro og NH^ble bestemt ved lineær regre-sjon (t = 0). Verdiene for Val og Ile ble ekstrapolert til ube-stemt hydrolysetid. Verdien for 1/2 Cys ble bestemt etter hydrolyse i 24 timer i 4 M metansulfonsyre. Aminosyresammensetningen er gitt i tabell 8.

Claims

1. DNA-sekvens,karakterisert vedat den koder for en human-insulinforløper med formelen

hvor B og A er B- og A-kjeden av human-insulin tverrbundet som i human-insulin, og hvor X og Y hver er lysin eller arginin, idet X og Y ikke samtidig kan være arginin.

2.Repliserbart ekspresjonsplasmid, karakterisert vedat det er i stand til å uttrykke en DNA-sekvens som koder for en human-insulinforløper med formelen hvor B og A er B- og A-kjeden av human-insulin tverrbundet som i human-insulin, og X og Y hver er lysin eller arginin, i gjærceller.

3. Fremgangsmåte for fremstilling av human-insulinforløpere med formelen

hvor B og A er B- og A-kjeden av human-insulin tverrbundet som i human-insulin, og X og Y hver er lysin eller arginin,karakterisert vedat en gjærcellestamme transformert med et ekspresjonsplasmid ifølge krav 2 dyrkes i et passende kulturmedium, og insulinforløperen utvinnes fra kulturmediet.

4. Fremgangsmåte for fremstilling av human-insulin,karakterisert vedat en gjærcellestamme transformert med et ekspresjonsplasmid ifølge krav 2 dyrkes i et egnet kulturmedium, og insulinforløperen utvinnes fra kulturmediet og omdannes til human-insulin ved enzymatisk behandling.

5.Fremgangsmåte i henhold til krav 4, karakterisert vedat den videre innbefatter behandling av insulinforløperen med trypsin og deretter behandling av reaksjonsproduktet med karboksypeptidase B.

6. Fremgangsmåte i henhold til krav 5, karakterisert vedat trypsinbehandlingen gjennomføres ved en pH-verdi i området 11-12.