PL180818B1 - Sposób wytwarzania insuliny ludzkiej, oraz polipeptyd hybrydowy - Google Patents
Sposób wytwarzania insuliny ludzkiej, oraz polipeptyd hybrydowyInfo
- Publication number
- PL180818B1 PL180818B1 PL94321039A PL32103994A PL180818B1 PL 180818 B1 PL180818 B1 PL 180818B1 PL 94321039 A PL94321039 A PL 94321039A PL 32103994 A PL32103994 A PL 32103994A PL 180818 B1 PL180818 B1 PL 180818B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- insulin
- hybrid polypeptide
- proinsulin
- polypeptide
- hybrid
- Prior art date
Links
- PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N insulin (human) Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N 0.000 title claims abstract description 67
- 101000976075 Homo sapiens Insulin Proteins 0.000 title claims abstract description 66
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title description 20
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 174
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 166
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 165
- 108010076181 Proinsulin Proteins 0.000 claims abstract description 85
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 59
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 44
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 30
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims abstract description 21
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 200
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 claims description 108
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 claims description 105
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 claims description 105
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 80
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 28
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 27
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 26
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 24
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 23
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 claims description 22
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 claims description 22
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 claims description 22
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 21
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 21
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 claims description 20
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 18
- 102000003670 Carboxypeptidase B Human genes 0.000 claims description 16
- 108090000087 Carboxypeptidase B Proteins 0.000 claims description 16
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 16
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 11
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 11
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 claims description 11
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 claims description 10
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 claims description 10
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 claims description 10
- 229920002271 DEAE-Sepharose Polymers 0.000 claims description 9
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 claims description 9
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 claims description 7
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims description 7
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 6
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 6
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 claims description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 5
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims description 5
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims description 5
- NPBGTPKLVJEOBE-IUCAKERBSA-N Lys-Arg Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCNC(N)=N NPBGTPKLVJEOBE-IUCAKERBSA-N 0.000 claims description 4
- 238000006664 bond formation reaction Methods 0.000 claims description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 4
- 239000006166 lysate Substances 0.000 claims description 4
- 108010016626 Dipeptides Proteins 0.000 claims description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 claims description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 claims description 3
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 claims description 3
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 claims description 2
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 claims description 2
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 claims description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 claims 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 claims 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 abstract description 16
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 abstract description 16
- 230000007017 scission Effects 0.000 abstract description 16
- 230000034005 thiol-disulfide exchange Effects 0.000 abstract 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 30
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 19
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 16
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 15
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 11
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 11
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 10
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 9
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 9
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 9
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 9
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 8
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 8
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 7
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 7
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 7
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 6
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 6
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 5
- 101500021084 Locusta migratoria 5 kDa peptide Proteins 0.000 description 5
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 5
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 5
- 239000007986 glycine-NaOH buffer Substances 0.000 description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 5
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 108010075254 C-Peptide Proteins 0.000 description 4
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 4
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 4
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 4
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 4
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 4
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 4
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 4
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 4
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 4
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 4
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 4
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 4
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 4
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101000981883 Brevibacillus parabrevis ATP-dependent tryptophan/phenylalanine/tyrosine adenylase Proteins 0.000 description 3
- 101000981889 Brevibacillus parabrevis Linear gramicidin-PCP reductase Proteins 0.000 description 3
- 101000906861 Chondromyces crocatus ATP-dependent tyrosine adenylase Proteins 0.000 description 3
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 3
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 3
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 3
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 3
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 3
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 3
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 3
- 230000002608 insulinlike Effects 0.000 description 3
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 3
- 108010066381 preproinsulin Proteins 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- VOUAQYXWVJDEQY-QENPJCQMSA-N 33017-11-7 Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N1[C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O)CCC1 VOUAQYXWVJDEQY-QENPJCQMSA-N 0.000 description 2
- 101100228196 Caenorhabditis elegans gly-4 gene Proteins 0.000 description 2
- 101100512078 Caenorhabditis elegans lys-1 gene Proteins 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 2
- 101100205180 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) leu-6 gene Proteins 0.000 description 2
- 108010005991 Pork Regular Insulin Proteins 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 2
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001851 biosynthetic effect Effects 0.000 description 2
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 2
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 2
- 235000013351 cheese Nutrition 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 2
- 239000012595 freezing medium Substances 0.000 description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 108010005636 polypeptide C Proteins 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 239000013587 production medium Substances 0.000 description 2
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 2
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 2
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N sodium hypochlorite Chemical compound [Na+].Cl[O-] SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000008174 sterile solution Substances 0.000 description 2
- AJPPAKACCOFNEN-UHFFFAOYSA-K tetraethylazanium;phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O.CC[N+](CC)(CC)CC.CC[N+](CC)(CC)CC.CC[N+](CC)(CC)CC AJPPAKACCOFNEN-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 2
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OMLWNBVRVJYMBQ-YUMQZZPRSA-N Arg-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O OMLWNBVRVJYMBQ-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241001227713 Chiron Species 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 241001136239 Cymbidium hybrid cultivar Species 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 108010065920 Insulin Lispro Proteins 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 108091027974 Mature messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- -1 Met amino acid Chemical class 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 1
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000015731 Peptide Hormones Human genes 0.000 description 1
- 108010038988 Peptide Hormones Proteins 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 101710119418 Superoxide dismutase [Mn] Proteins 0.000 description 1
- 101710202572 Superoxide dismutase [Mn], mitochondrial Proteins 0.000 description 1
- 102100032891 Superoxide dismutase [Mn], mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 108010068380 arginylarginine Proteins 0.000 description 1
- 210000000227 basophil cell of anterior lobe of hypophysis Anatomy 0.000 description 1
- 238000010256 biochemical assay Methods 0.000 description 1
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000003610 charcoal Substances 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000006735 deficit Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 1
- 230000001079 digestive effect Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 210000002308 embryonic cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003372 endocrine gland Anatomy 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 230000004153 glucose metabolism Effects 0.000 description 1
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 239000007973 glycine-HCl buffer Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- WNRQPCUGRUFHED-DETKDSODSA-N humalog Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1.C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 WNRQPCUGRUFHED-DETKDSODSA-N 0.000 description 1
- 229940038661 humalog Drugs 0.000 description 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- JEPNOJXFZHBCTB-ZCUALFGZSA-N insulin c chain Chemical compound NC(=N)NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N1[C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)CCC1 JEPNOJXFZHBCTB-ZCUALFGZSA-N 0.000 description 1
- 239000004026 insulin derivative Substances 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 208000030159 metabolic disease Diseases 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 230000003228 microsomal effect Effects 0.000 description 1
- 108010013359 miniproinsulin Proteins 0.000 description 1
- AYOOGWWGECJQPI-NSHDSACASA-N n-[(1s)-1-(5-fluoropyrimidin-2-yl)ethyl]-3-(3-propan-2-yloxy-1h-pyrazol-5-yl)imidazo[4,5-b]pyridin-5-amine Chemical compound N1C(OC(C)C)=CC(N2C3=NC(N[C@@H](C)C=4N=CC(F)=CN=4)=CC=C3N=C2)=N1 AYOOGWWGECJQPI-NSHDSACASA-N 0.000 description 1
- 229920002113 octoxynol Polymers 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- 230000020477 pH reduction Effects 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 239000000813 peptide hormone Substances 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 1
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 210000003935 rough endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012868 site-directed mutagenesis technique Methods 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- CIJQGPVMMRXSQW-UHFFFAOYSA-M sodium;2-aminoacetic acid;hydroxide Chemical compound O.[Na+].NCC([O-])=O CIJQGPVMMRXSQW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000003381 solubilizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N tfa trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F.OC(=O)C(F)(F)F WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- 125000000341 threoninyl group Chemical group [H]OC([H])(C([H])([H])[H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
- C07K1/113—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure
- C07K1/1136—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure by reversible modification of the secondary, tertiary or quarternary structure, e.g. using denaturating or stabilising agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/62—Insulins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Emergency Medicine (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Obesity (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Hematology (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
1. Sposób wytwarzania insuliny ludzkiej obejmujacy mikrobiologiczna ekspresje rekombinowanego bialka zawierajacego insuline, znamienny tym, ze obejmuje: (a)otrzymywanie polipeptydu hybrydowego zawierajacego proinsuline poprzez eks- presje tego polipeptydu hybrydowego w komórce bakteryjnej zawierajacej DNA kodujacy polipeptyd hybrydowy, przy czym ten DNA jest obecny w plazmidzie; (b) odzyskiwanie polipeptydu hybrydowego; (c)ufaldowywanie i tworzenie wiazan dwusiarczkowych w polipeptydzie hybrydo- wym otrzymanym w (b), unikajac uprzedniego poddawania polipeptydu hybrydowego siar- czynolizie; (d)poddawanie uzyskanego w (c) ufaldowanego, z utworzonymi wiazaniami dwu- siarczkowymi polipeptydu hybrydowego trawieniu enzymatycznemu w celu otrzymania in- suliny; (e) oczyszczania tak wytworzonej insuliny. PL PL PL
Description
W opisie tym znajdująsię odniesienia do różnych publikacji poprzez liczby arabskie w nawiasach. Pełne informacje na temat tych odnośników można znaleźć przy końcu opisu. Ujawnienia tych publikacji, poprzez odnośniki literaturowe, włączono w ten sposób w całości do opisu w celu pełniejszego opisania stanu wiedzy, której dotyczy ten wynalazek.
Insulina jest hormonem polipeptydowym mającym zasadnicze znaczenie w kontrolowaniu metabolizmu glukozy i podaje się ją codziennie pacjentom cierpiącym na cukrzycę, zaburzenie metaboliczne charakteryzujące się niedostatecznym dostarczaniem insuliny.
In vivo hormon syntetyzowany jest najpierw w postaci długiej cząsteczki prekursorowej, następnie modyfikowany do jej postaci aktywnej biologicznie, składającej się z łańcucha A i łańcucha B. Bardziej szczegółowo, gen preproinsuliny ulega transkrypcji w komórkach beta gruczołu wydzielania wewnętrznego, trzustki, na prekursor mRNA, z którego wycinane sąnastępnie introny, z wytworzeniem dojrzałego mRNA. mRNA ten ulega translacji na preproinsulinę (NH2-preregion-łańcuch B-peptyd C-łańcuch A-COOH), która następnie ulega modyfikacjom z utworzeniem proinsuliny i ostatecznie insuliny. Pierwszym etapem modyfikacji jest proteolityczne usunięcie preregionu, który służy jako hydrofobowa sekwencja sygnałowa do przenoszenia powstającego łańcucha przez błony mikrosomalne szorstkiego retikulum endoplazmatycznego. W preproinsulinie ludzkiej długość preregionu wynosi 24 aminokwasy.
W proinsulinie dwa regiony łańcucha polipeptydowego, które staną się dojrzałą insuliną łańcuchy B i A, połączone są ze sobąpeptydem C (lub łańcuchem C), który zawiera w końcach N i C dwie pary aminokwasów zasadowych. W większości peptydów C parami tymi są Arg-Arg i Lys-Arg. Ludzki peptyd C, włącznie z dwiema flankującymi parami aminokwasów zasadowych, obejmuje 35 aminokwasów. Peptyd C łączy dwie części polipeptydu w celu wspomagania tworzenia właściwych mostków dwusiarczkowych pomiędzy odcinkami A i B. Dlatego też, rola peptydu C nie zależy w znacznej mierze od jego struktury. W rzeczywistości, jego zastąpienie przez krótszy syntetyczny mostek nadal umożliwia właściwe ufałdowanie cząsteczki proinsuliny (1,2).
Ufałdowywanie proinsuliny następuje z towarzyszącym utlenieniem dwóch międzyłańcuchowych wiązań dwusiarczkowych i jednego wiązania dwusiarczkowego w łańcuchu A. Na ostatnim etapie dojrzewania enzymy proteolityczne rozszczepiają przy aminokwasach zasadowych z uwolnieniem peptydu C i utworzeniem dojrzałej insuliny (3). W insulinie człowieka łańcuch A ma długość 21 aminokwasów, podczas gdy łańcuch B ma długość 30 aminokwasów.
Światowe zapotrzebowanie na insulinę przekracza kilka ton rocznie i istnieje silny deficyt podaży. Tradycyjnie, insulinę wytwarzano z ograniczonych źródeł zwierzęcych, głównie preparatów trzustkowych bydła i świni. Insulina ta różni się od insuliny ludzkiej i może wywoływać niekorzystną reakcję immunologiczną.
Badania przeprowadzone w latach 1960-tych zademonstrowały wytwarzanie insuliny in vitro. Syntezę insuliny uzyskano przez połączenie łańcuchów A i B w postaci S-sulfonowanej (4)
180 818 lub przez spontaniczne ponowne utlenianie zredukowanej proinsuliny (5).Ta ostatnia metoda nie była praktyczna do wytwarzania insuliny na dużąskalę z powodu bardzo niskiego stężenia białka w mieszaninie, w której zachodzi utlenianie. Insulinę można następnie odzyskać po traktowaniu trypsyną i karboksypeptydazą B (6).
Ostatnio dostępna stała się półsyntetyczna i biosyntetyczna insulina ludzka. Półsyntetyczną insulinę ludzką wytwarza się z insuliny świni przez katalizowaną trypsyną wymianę alaniny na treoninę w pozycji 30 łańcucha beta (jedyna różnica pomiędzy insuliną świni i człowieka). Zrekombinowana insulina ludzka wytwarzana albo w E. coli, albo drożdżach, przypuszczalnie zastąpi insuliny wytwarzane wszystkimi innymi drogami.
Biosyntetycznązrekombinowaną insulinę ludzką produkuje się obecnie dwiema drogami: albo przez wytwarzanie oddzielnie łańcuchów A i B w E. coli i następnie ich łączenie (7,8), albo przez enzymatyczne przekształcenie polipeptydów podobnych do proinsuliny, otrzymywanych przez ekspresję albo w E. coli (1,8), albo drożdżach (2,9).
W większości przypadków proinsulinę wytwarza się jako białko hybrydowe, które ulega akumulacji jako białko sprecypitowane wewnątrzkomórkowo. Hybrydę tę oczyszcza się normalnie i rozszczepia CNBr w celu uwolnienia polipeptydu proinsuliny. Ten ostatni modyfikuje się dalej przez oksydacyjną siarczynolizę do S-sulfonianu proinsuliny. Następnie S-sulfonian proinsuliny oczyszcza się i poddaje ufałdowaniu w warunkach redukujących z utworzeniem proinsuliny (8). Przekształcenie proinsuliny w insulinę uzyskuje się przez połączone działanie trypsyny i karboksypeptydazy B (6).
Publikacja europejskiego opisu patentowego numer 195691 BI, przyznanego Novo Nordisk A/S, opisuje proinsulinę o wzorze B-Lys-Arg-A i jej zastosowanie do przygotowywania insuliny w drożdżach.
Publikacja europejskiego opisu patentowego numer 196056 BI, przyznanego Chiron Corp., opisuje białko hSOD-proinsuliny wytwarzane przez drożdże. Białko hSOD-proinsuliny poddaje się przed ufałdowywaniem rozszczepieniu bromkiem cyjanu i siarczynolizie.
Hoechst uj awnia w publikacji europejskiego opisu patentowego numer 3 79162, że „błędne rekombinanty prekursorów insuliny” (tj. zrekombinowane produkty insuliny z niewłaściwymi lub częściowo niewłaściwymi międzycząsteczkowymi mostkami dwusiarczkowymi) można przekształcać we „właściwe” produkty insuliny bez siarczynolizy przez poddawanie błędnych rekombinantów reakcji z nadmiarem markaptanu w środowisku wodnym w obecności organicznego układu oksydoredukcyjnego. Pierwotny etap siarczynolizy występuje po odszczepieniu (chemicznym lub enzymatycznym) z polipeptydu fuzyjnego rodnika aminokwasowego lub peptydowego (co zachodzi po lizie komórki gospodarza), po tym sześć reszt cysteiny prekursora insuliny przekształca się w ich S-sulfoniany. W kolejnym etapie renaturacji z tego S-sulfonianu proinsuliny wytwarza się naturalną proinsulinę przez utworzenie trzech właściwych mostków dwusiarczkowych. Podczas tego etapu renaturacji wytwarzane sątak zwane „błędne rekombinanty”.
Hoechst ujawnia ponadto, w publikacji PCT międzynarodowego opisu patentowego numer WO 91/03550, sposób przygotowywania białek fuzyjnych obejmujących pożądane białko (np. proinsulinę) i „składnik balastowy”. Przed ufałdowywaniem przeprowadza się siarczynolizę, podczas gdy „składnik balastowy” odszczepia się jednocześnie z łańcuchem C proinsuliny, po ufałdowaniu. Ponadto, Hoechst opisuje w europejskim opisie patentowym numer 347781 BI „mini-proinsulinę” (B-Arg-A) i jej zastosowanie do przygotowywania mono-Arg insuliny i insuliny. Opisują oni dalej białka fuzyjne, które obejmują B-Arg-A i „składnik balastowy”. „Składnik balastowy” odszczepia się przez działanie bromkiem cyjanu i przeprowadza siarczynolizę przed ufałdowywaniem polipeptydu.
Wynalazek ten ujawnia wytwarzanie zrekombinowanej insuliny ludzkiej ulepszonym i wydajnym sposobem. Zrekombinowane polipeptydy hybrydowe proinsuliny, obejmujące sekwencję liderową, syntetyzuje się w E. coli. Po częściowym oczyszczeniu poddaje się je ufałdowaniu z wciąż przyłączonym peptydem liderowym w warunkach, które umożliwiają poprawne ufałdowanie. Aktywną biologicznie insulinę ludzką wytwarza się następnie przez łączne traktowanie trypsyną i karboksypeptydazą B, w wyniku czego enzymy te odszczepiąjąjednocześnie
180 818 peptyd liderowy i łańcuch C. Oczyszczona insulina ludzka jest zatem identyczna z naturalnie występującą insuliną ludzką.
Z tego nowego sposobu wyeliminowano niebezpieczne i niedogodne procedury związane z trawieniem polipeptydów hybrydowych CNBr i siarczynolizą stosowaną do blokowania licznych grup SH, ponieważ cały polipeptyd hybrydowy proinsuliny można efektywnie ufałdować w jego strukturę natywną nawet w obecności peptydu liderowego i nie zablokowanych reszt cysternowych. Aktywną zrekombinowaną insulinę ludzką uwalnia się przez trawienie proteolityczne i następnie oczyszcza.
Krótki opis figur
Mapy restrykcyjne trzech plazmidów przedstawionych na figurach 3-5 nie określają wszystkich miejsc restrykcyjnych obecnych w tych plazmidach. Jednakże, przedstawiono te miejsca restrykcyjne, które konieczne są do pełnego zrozumienia wynalazku.
Figura 1: Wytwarzanie insuliny ludzkiej przez enzymatyczne rozszczepienie ufałdowanego, zawierającego wiązania dwusiarczkowe, polipeptydu hybrydowego proinsuliny wytworzonego przez ekspresję plazmidu pBAST-R. Wskazano tylko część sekwencji liderowej SOD.
Figura 2: Wytwarzanie insuliny ludzkiej przez enzymatyczne rozszczepienie ufałdowanego, zawierającego wiązania dwusiarczkowe, polipeptydu hybrydowego proinsuliny wytworzonego przez ekspresję plazmidu pDBAST-LAT lub pZBAST-LAT. Wskazano tylko część sekwencji liderowej SOD.
Figura 3: Struktura plazmidu pBAST-R, plazmidu ekspresyjnego kodującego polipeptyd hybrydowy SOD-proinsulina, zdeponowanego w ATCC pod numerem dostępu ATCC 69362.
Figura 4: Struktura plazmidu pDBAST-LAT, plazmidu ekspresyjnego kodującego polipeptydhybrydowy SOD-proinsulina, zdeponowanego w ATCC pod numerem dostępu ATCC 69361.
Figura 5: Struktura plazmidu pXBAST-LAT, plazmidu ekspresyjnego kodującego polipeptyd hybrydowy SOD-proinsulina, zdeponowanego w ATCC pod numerem dostępu ATCC 69363.
Figura 6: Sekwencja aminokwasowa i odpowiadająca sekwencja nukleotydowa DNA polipeptydu hybrydowego SOD-proinsulina, ulegającego ekspresji by plazmid pBAST-R.
Figura 7: Sekwencja aminokwasowa i odpowiadająca sekwencja nukleotydowaDNA polipeptydu hybrydowego SOD-proinsulina, eksprymowanego przez plazmidy pDBAST-LAT i pXBAST-LAT.
Figura 8: Wytwarzanie insuliny ludzkiej z hybrydowego polipeptydu proinsuliny eksprymowanego przez plazmid pB AST w zależności od pH mieszaniny, w której prowadzi się ufałdowywanie.
Ufałdowywanie polipeptydu hybrydowego proinsuliny (wytworzonego jak opisano w przykładzie 2) prowadzono w różnych pH, jak wskazano, w 100 mM buforze glicynowym, w temperaturze 4°C w ciągu około 16 godzin, przy stężeniu albo 1 mg/ml, albo 0,5 mg/ml polipeptydu hybrydowego. Ufałdowany materiał traktowano trypsyną(l :500 w/w) w ciągu 30 minut w temperaturze 37° w pH 9 i oznaczano pod kątem immunoreaktywnej (IR) insuliny stosując oznaczenie radioimmunologiczne z wykorzystaniem 125J-insuliny (Amersham) i zrekombinowanej insuliny ludzkiej (Calbiochem) jako standardu.
Figura 9: Wytwarzanie insuliny ludzkiej z hybrydowego polipeptydu proinsuliny eksprymowanego przez plazmid pDBAST-LAT.
Hybrydowy polipeptyd proinsuliny (wytworzony jak opisano w przykładzie 2) rozpuszczono w 8 M moczniku, 5 mM HC1 w stężeniu około 30 mg/ml i rozcieńczono do stężenia 1 mg/ml 100 mM glicyną-NaOH, pH 11,0. Ufałdowywanie prowadzono w temperaturze 22°C (temperatura pokojowa) w ciągu 20 godzin. pH roztworu doprowadzono następnie HC1 do 8,8. Dodano karboksypeptydazę B (1:1000 w/w, Sigma) i trypsynę (1:2000 w/w, Sigma) i mieszaninę reakcyjną inkubowano w temperaturze 37°C w ciągu 60 minut. Mieszaniny, w których prowadzono trawienie zakwaszono do pH 3 przed rozcieńczeniem 10 mM HC1. Próbki o objętości 150 μΐ analizowano przez wysokociśnieniową chromatografię cieczową z odwróconymi fazami (RP-HPLC) na kolumnie 5 pLichrosphere 100 RP-8 (Merck) o wymiarach 250 x 4 mm, którą równoważono 50 mM fosforanem tetraetyloamonowym, 162 mM NaClO4, pH 3, zawierającym 31,5% (v/v)
180 818 acetonitryl. Kolumnę rozwijano liniowym gradientem 31,5-40,5% acetonitrylu podczas 75 minut przy szybkości przepływu 1 ml/minutę. Monitorowano absorbancję przy długości fali 220 nm.
A: 5 pg insuliny standardowej (Boehringer-Mannheim);
B: zrekombinowana insulina ludzka wytworzona w następstwie traktowania enzymatycznego;
C: ufałdowany polipeptyd hybrydowy SOD-proinsulina.
Figura 10: Wytwarzanie insuliny ludzkiej z hybrydowego polipeptydu proinsuliny eksprymowanego przez.plazmid pDB AST-L AT w zależności od pH mieszaniny, w której prowadzi się ufałdowywanie.
Hybrydowy polipeptyd proinsuliny (wytworzony jak opisano w przykładzie 2) rozcieńczono do stężenia 1 mg/ml w 100 mM buforze glicyna-NaOH posiadającym wskazane wartości pH i poddawano ufałdowaniu w temperaturze 22°C w ciągu 16 godzin. Traktowanie enzymami i analizę RP-HPLC przeprowadzono jak opisano dla figury 9. Ilość zrekombinowanej insuliny ludzkiej wytworzonej z polipeptydu hybrydowego obliczono na podstawie pola powierzchni piku, który posiadał ten sam czas retencji jak insulina standardowa.
Figura 11: Wytwarzanie insuliny ludzkiej z hybrydowego polipeptydu proinsuliny eksprymowanego przez.plazmid pDBAST-LAT w zależności od stężenia kwasu askorbinowego w mieszaninie, w której prowadzi się ufałdowywanie.
Ufałdowywanie polipeptydu hybrydowego SOD-proinsulina (wytworzonego jak opisano w przykładzie 2) prowadzono przy stężeniu 1 mg/ml w 100 mM buforze glicyna-NaOH w temperaturze 22°C w pH 11,2 w obecności wskazanych stężeń kwasu askorbinowego. Próbki traktowano trypsyną i karboksypeptydazą B (jak dla figury 9) po 5- i 25-godzinnych okresach ufałdowania. Wytwarzanie zrekombinowanej insuliny ludzkiej analizowano metodą RP-HPLC (jak dla figury 9).
Figura 12: Autentyczność insuliny ludzkiej wytwarzanej z hybrydowego polipeptydu proinsuliny eksprymowanego przez plazmid pDBAST-LAT.
Ufałdowywanie polipeptydu hybrydowgo SOD-proinsulina (wytworzonego jak opisano w przykładzie 2) prowadzono przy stężeniu 1 mg/ml w 100 mM buforze glicyna-NaOH, pH 11,2, i w obecności 1,2 mM kwasu askorbinowego w temperaturze 22°C w ciągu 16 godzin. Po traktowaniu enzymatycznym (jak dla figury 9), mieszaninę poddano chromatografii na kolumnie z DEAE-Sepharose zrównoważonej 20 mM Tris-HCl, pH 8. Zrekombinowaną insulinę ludzką eluowano liniowym gradientem 0-0,4 M NaCl w 20 mM Tris-HCl, pH 8. Frakcje piku połączono i zakwaszono HC1 do pH 3. Zrekombinowaną insulinę ludzką oczyszczono dalej od cząsteczek insulinopodobnych przez RP-HPLC, jak opisano dla figury 9. Główny pik zebrano, odsolono na kolumnie z Sephadex G-25 w 0,25 M kwasie octowym i zliofilizowano. Przygotowano próbki (5 pg zrekombinowanej insuliny ludzkiej) w 10 mM HC1 i poddano analizie przez RP-HPLC w takich samych warunkach.
A: insulina standardowa;
B: zrekombinowana insulina ludzka oczyszczona przez HPLC;
C: połączona próbka zrekombinowanej insuliny ludzkiej oczyszczonej przez HPLC i insuliny standardowej.
Figura 13: Wytwarzanie insuliny ludzkiej z hybrydowego polipeptydu proinsuliny eksprymowanego przez plazmid pDBAST-LAT w zależności od stężenia białka w mieszaninie, w której prowadzi się ufałdowywanie.
Polipeptyd hybrydowy SOD-proinsulina (wytworzony jak opisano w przykładzie 2) poddawano ufałdowaniu w 100 mM buforze glicyna-NaOH, pH 11,2, przy końcowym stężeniu białka od 0,5 mg/ml do 10 mg/ml, jak wskazano. Każdą mieszaninę, w której prowadzono ufałdowywanie, wzbogacono o 2,5 mola kwasu askorbinowego na mol grup SH. Ufałdowywanie przeprowadzono w temperaturze 24°C (temperatura pokojowa) w ciągu 16 godzin. Traktowanie enzymatyczne i analizę przez RP-HPLC przeprowadzono jak opisano dla figury 9.
Figura 14: Wytwarzanie insuliny ludzkiej z hybrydowego polipeptydu proinsuliny eksprymowanego przez plazmid pDBAST-LAT z nieoczyszczonego precypitatu wewnątrzkomórkowego w zależności od czasu ufałdowywania.
180 818
Precypitat wewnątrzkomórkowy rozpuszczono w 20 mM buforze glicyna-NaOH, 33 μΜ EDTA, pH 11,2 w stężeniu około 2,6 A280 na ml. pH doprowadzono do 12 10 N wodorotlenkiem sodowym. Roztwór pozostawiono z mieszaniem na 10 minut. pH zmiareczkowano do 11,2 stężonym kwasem solnym. Dodano węgiel aktywowany (przemyty kwasem, Sigma) do 0,1 % w/v stężenia końcowego i mieszaninę mieszano w ciągu 30 minut. Zawiesinę odwirowano (20 minut, 12 000 obrotów na minutę) w temperaturze 20°C. A280 sklarowanego supematantu wynosiła około 2,15. Uzupełniono kwas askorbinowy do 3 mM stężenia końcowego. Ufałdowywanie hybrydowego polipeptydu proinsuliny przeprowadzono jak przedstawiono, z energicznym mieszaniem w temperaturze pokojowej (22-23°C). W różnych punktach czasowych eksperymentu (począwszy od rozpuszczenia) pobierano próbki o objętości 10 ml, miareczkowano je do pH 8,8 i trawiono karboksydaząB (1:1000 w/w) i trypsyną(l :2000 w/w) w ciągu 1 godziny w temperaturze 37°C w obecności 50 μΜ ZnCl2. Trawienie zakończono przez zakwaszenie. Zawartość insuliny w każdej poddanej trawieniu próbce określono przez analizę poprzez RP-HPLC, jak opisano dla figury 9. Postęp reakcji ufałdowania przejawia się zwiększeniem ilości insuliny (po strawieniu) i obniżeniem poziomu wolnych grup tiolowych, które oznaczano w reakcji Ellmana (16).
Wynalazek ten dostarcza metodę wytwarzania insuliny ludzkiej, która obejmuje ufałdowywanie hybrydowego polipeptydu zawierającego proinsulinę w warunkach, które umożliwiają tworzenie właściwych wiązań dwusiarczkowych, poddawanie ufałdowanego polipeptydu z utworzonymi wiązaniami dwusiarczkowymi rozszczepieniu enzymatycznemu w celu utworzenia aktywnej insuliny ludzkiej oraz oczyszczanie aktywnej insuliny ludzkiej.
Wynalazek ten dostarcza ponadto polipeptyd obejmujący proinsulinę oraz peptyd liderowy połączony z końcem N proinsuliny, przy czym polipeptyd jest ufałdowany i zawiera właściwe wiązania dwusiarczkowe.
Plazmidy pBAST-R, pDBAST-LAT i pXBAST-LAT zdeponowano 26 lipca 1993 r. w E. coli stosownie do, i zgodnie z wymaganiami Porozumienia Budapesztańskiego o Międzynarodowym Uznawaniu Depozytu Mikroorganizmów do Celów Procedury Patentowej w American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, pod numerami dostępu ATCC odpowiednio 69362, 69361 i 69363.
W znaczeniu tu stosowanym, polipeptyd hybrydowy obejmuje peptyd liderowy połączony kowalencyjnie z pożądanym polipeptydem. Polipeptyd hybrydowy według tego wynalazku obejmuje proinsulinę i korzystnie obejmuje SOD jako peptyd liderowy.
W znaczeniu tu stosowanym, ufałdowywanie obejmuje ufałdowywanie polipeptydu hybrydowego zawierającego proinsulinę bez rozszczepiania CNBr przed ufałdowywaniem i bez siarczynolizy dla zablokowania grup SH przed ufałdowywaniem, przy czym ufałdowywanie umożliwia tworzenie właściwych wiązań dwusiarczkowych polipeptydu hybrydowego.
W znaczeniu tu stosowanym, tworzenie właściwych wiązań dwusiarczkowych polipeptydu hybrydowego obejmuje tworzenie trzech wiązań dwusiarczkowych pomiędzy CysB7-CysA7, CysB19-CysA2° i CysA6-CysA11 insuliny (reszty cysteiny ponumerowano według ich numeracji w dojrzałej insulinie).
W znaczeniu tu stosowanym, proinsulina obejmuje polipeptyd obejmujący, kolejno od końca N do końca C, łańcuchy B, C i A insuliny.
W znaczeniu tu stosowanym, peptydłańcucha C insuliny obejmuje naturalnie występujący peptyd C oraz każdy inny oligopeptyd, dipeptyd lub pojedynczy aminokwas, który może zostać odszczepiony trypsynąi karboksypeptydaząB.
W znaczeniu tu stosowanym, peptyd liderowy obejmuje każdy peptyd lub polipeptyd kowalencyjnie połączony z łańcuchem B insuliny, który umożliwia ufałdowanie i utworzenie wiązań dwusiarczkowych, i który można odszczepić stosując trypsynę. Korzystnie, peptydem liderowym jest SOD.
W znaczeniu tu stosowanym, SOD obejmuje każdą zasadniczą część sekwencji aminokwasowej CuZnSOD lub MnSOD, i rzeczona część niekoniecznie posiada aktywność biologiczną SOD, ani niekoniecznie posiada identyczną sekwencję aminokwasową z sekwencją aminokwasową ta
180 818 kiej części w porównaniu z naturalnie występującą SOD. DNA kodujący SOD można poddawać mutacji metodami znanymi specjalistom w tej dziedzinie, np. Bauer i in. (1985), Gene 37:73-81.
Peptyd liderowy może obejmować, w miejsce SOD, każdy inny peptyd, polipeptyd lub białko, bądź każdą zasadniczą część sekwencji aminokwasowej takiego peptydu, polipeptydu lub białka, przy czym rzeczona część niekoniecznie posiada aktywność biologiczną rzeczonego peptydu, polipeptydu lub białka, ani niekoniecznie posiada identyczną sekwencję aminokwasową takiej części w porównaniu z sekwencją aminokwasowąnaturalnie występującego peptydu, polipeptydu lub białka; peptyd liderowy musi jednakże umożliwiać ufałdowanie i tworzenie właściwych wiązań dwusiarczkowych polipeptydu hybrydowego.
W znaczeniu tu stosowanym, insulina może obejmować homolog naturalnie występującej insuliny.
W znaczeniu tu stosowanym, proinsulina może obejmować homolog naturalnie występującej proinsuliny.
W znaczeniu tu stosowanym, termin ,,homolog” dotyczący polipeptydu insuliny wytworzonego metodami według tego wynalazku, oznacza polipeptyd, który posiada zasadniczo taką samą sekwencję aminokwasową i zasadniczo taką samą aktywność biologiczną jak insulina. A więc, homolog może różnić się od polipeptydu insuliny wytworzonego metodami według wynalazku przez dodanie, delecję lub podstawienie jednej lub więcej nie mających zasadniczego znaczenia reszt aminokwasowych, pod warunkiem, że otrzymany polipeptyd zachowuje aktywność biologiczną insuliny. Specjaliści w tej dziedzinie mogą łatwo określić, które reszty aminokwasowe można dodać, wydełetować lub podstawić (włącznie z tym, jakimi aminokwasami można dokonać podstawienia) stosując ustalone dobrze znane procedury, obejmujące na.przykład konwencjonalne metody projektowania i wytwarzania kodujących sekwencji DNA do bakteryjnej ekspresji homologów polipeptydowych tego polipeptydu, modyfikację sekwencji cDNA i genomowych technikami ukierunkowanej mutagenezy, konstruowanie zrekombinowanych białek i wektorów ekspresyjnych oraz pomiar aktywności biochemicznej polipeptydów z zastosowaniem konwencjonalnych oznaczeń biochemicznych.
Powyższa definicj a homologów insuliny w równym stopniu dotyczy homologów proinsuliny.
Przykłady homologów insuliny wytworzonych metodami według tego wynalazku są homologi delecyjne, zawierające mniej niż wszystkie reszty insuliny występującej naturalnie, homologi substytucyjne, w których jedną lub więcej określonych reszt zastępuje się innymi resztami, i homologi addycyjne, w których jedną lub więcej reszt dodaje się do końców lub w środkowej części polipeptydu insuliny, przy czym wszystkie homologi wykazują aktywność biologiczną insuliny.
Przykładami homologów są analogi insuliny ujawnione w europejskim zgłoszeniu patentowym numer 384472, a także analog insuliny „Humalog” Eli Lilly, jak ujawniono w „Eli Lilly and Company Report to Shareholders 1992”.
Zasadniczo taką samą sekwencję aminokwasową określono w niniejszym opisie jako obejmującą podstawienia i/lub delecje i/lub addycje aminokwasów w sekwencji aminokwasowej i może obejmować ona do dziesięciu (10) reszt zgodnie z grupami homologicznymi lub równoważnymi, jak opisali np. Albert L. Lehninger, Biochemistry, wydanie drugie, Worth Publishers Inc. (1975), rozdział 4; Creighton, Protein Structure, a Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford, Anglia (1989) oraz Margaret O. Dayhoff, Atlas of Protein Seąuence and Structure, tom 5, The National Biomedical Research Foundation (1972), rozdział 9. Podstawienia takie są znane specjalistom w tej dziedzinie.
DNA kodujący polipeptyd insuliny można poddawać mutacjom metodami znanymi specjalistom w tej dziedzinie, np. Bauera i in. (1985), Gene 37:73-81. Zmutowanąsekwencję można wstawiać do odpowiednich wektorów ekspresyjnych, jak opisano w niniejszym opisie, które wprowadza się do komórek, poddawanych następnie traktowaniu, w wyniku którego zmutowany DNA kieruje ekspresją homologu polipeptydu.
Plazmidy według tego wynalazku, zawierające sekwencję kodującąpolipeptyd hybrydowy obejmujący proinsulinę, mogą być przystosowane do ekspresji w bakteriach, drożdżach,
180 818 grzybach lub komórkach ssaków, takich jak CHO, zarodkowe komórki kurczęcia, fibroblasty, bądź inne znane linie komórkowe, i dodatkowo zawierają elementy regulacyjne konieczne do ekspresji sklonowanego genu w bakteriach, drożdżach, grzybach lub komórkach ssaków, w taki sposób zlokalizowane w stosunku do kwasu nukleinowego kodującego polipeptyd hybrydowy, aby umożliwiać jego ekspresję. Wymagane do ekspresji elementy regulujące obejmują sekwencje promotorowe wiążące polimerazę RNA oraz miejsce wiążące rybosom.
Plazmidy według tego wynalazku eksprymująpolipeptyd hybrydowy obejmujący proinsulinę.
Dla specjalistów w tej dziedzinie będzie zrozumiałe, że plazmidy zdeponowane w związku z tym zgłoszeniem można łatwo zmienić znanymi technikami (np. przez ukierunkowaną mutagenezę lub wstawianie łączników), aby kodowały ekspresję homologicznych polipeptydów. Techniki takie opisano np. w Sambrook, J., Fritsch, E.F. i Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manuał, wydanie drugie, Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Odpowiednie elementy regulujące są położone w plazmidzie, w stosunku do DNA kodującego polipeptyd hybrydowy obejmujący proinsulinę, w taki sposób, że powodują ekspresję polipeptydu hybrydowego w odpowiedniej komórce gospodarza. W korzystnych rozwiązaniach wynalazku elementy regulujące umiejscowione sąblisko przed DNA kodującym polipeptyd hybrydowy.
W wynalazek ten włączone są także różne miejsca wiążące rybosomy (RBS) dla nadania mRNA ulegającemu transkrypcji z DNA kodującego obejmujący proinsulinę polipeptyd hybrydowy zdolności wiązania z rybosomami w komórce gospodarza, takie jak RBS deo.
Plazmidy według wynalazku zawierają także kodon inicjacji ATG. DNA kodujący polipeptyd hybrydowy obejmujący proinsulinę znajduje się wjednej ramce odczytu z kodonem inicjacji ATG.
Plazmidy według wynalazku zawierają także sekwencję DNA obejmującą miejsce początku replikacji z plazmidu bakteryjnego zdolnego do autonomicznej replikacji w komórce gospodarza. Odpowiednie miejsca początku replikacji można otrzymać z licznych źródeł, takich jak plazmid pBR322 (numer dostępu ATCC 37017).
Plazmidy według tego wynalazku zawierają także sekwencję DNA, która zawiera gen odpowiedzialny za cechę fenotypową umożliwiającą selekcję lub identyfikację, która przejawia się, gdy plazmid obecny jest w komórce gospodarza, taki jak gen oporności, np. oporności na ampicylinę, chloramfenikol lub tetracyklinę.
Przykładami wektorów, które można stosować do ekspresji kwasów nukleinowych kodujących polipeptydy hybrydowe (obejmujące proinsulinę) są wirusy, takie jak wirusy bakteryjne, np. bakteriofagi (takie jak fag lambda), kosmidy, plazmidy i inne wektory. Geny kodujące polipeptydy hybrydowe obejmujące proinsulinę wstawia się do odpowiednich wektorów metodami dobrze znanymi w tej dziedzinie. Na przykład, wykorzystując konwencjonalne miejsca rozpoznawane przez enzym endonukleazę restrykcyjną można strawić zarówno wstawki, jak i wektor z utworzeniem końców z wzajemnie komplementarnymi parami zasad, które liguje się następnie stosując ligazę DNA. Alternatywnie, z DNA wstawki można zligować syntetyczne łączniki zawierające sekwencje zasad komplementarne do miejsca restrykcyjnego w DNA wektora, który następnie trawi się enzymem restrykcyjnym przecinającym w tym miejscu. Dostępne są również inne sposoby.
Korzystnymi komórkami gospodarza bakteryjnego są komórki E. coli. Przykładami odpowiednich komórek E. coli są szczepy 8Φ733 (cytRstrA) lub 4300, ale inne szczepy E. coli i inne bakterie również można stosować jako gospodarzy plazmidów.
Bakterie stosowane jako gospodarze mogą należeć do jakiegokolwiek szczepu, włącznie ze szczepami auksotroficznymi (takimi jak Al 645), prototroficznymi (takimi jak A4255) i litycznymi; szczepami F+ i F'; szczepami zawierającymi sekwencję represorowącI857 profagaX (takimi jak A1645 i A4255) oraz szczepami pozbawionymi represorów deo i/lub genu deo (patrz publikacja europejskiego zgłoszenia patentowego numer 0303972, opublikowana 22 lutego 1989 r). Szczep E. coli SO733 i szczep E. coli 4300 zdeponowano odpowiednio pod numerami dostępu ATCC 69361 i 69363.
180 818
Wszystkie opisane powyżej szczepy gospodarzy#, coli można „wyleczyć” z zawartych w nich plazmidów metodami dobrze znanymi w nauce, np. opisanąprzez R.P. Novicka w Bacteriol. Review 33,210 (1969) metodą z zastosowaniem bromku etydyny.
Wynalazek ten dostarcza metodę wytwarzania insuliny, która obejmuje ufałdowywanie hybrydowego polipeptydu obejmującego proinsulinę w warunkach umożliwiających tworzenie właściwego wiązania dwusiarczkowego, poddawanie ufałdowanego, zawierającego wiązania dwusiarczkowe polipeptydu hybrydowego rozszczepieniu enzymatycznemu z wytworzeniem insuliny oraz oczyszczanie insuliny. Insulina posiada aktywność i właściwości komercjalnie dostępnej insuliny ludzkiej.
W korzystnym rozwiązaniu, ufałdowywanie obejmuje inkubację polipeptydu hybrydowego w temperaturze około 4-37°C w ciągu okresu około 1-30 godzin w pH około 8,5-12,0.
W innym korzystnym rozwiązaniu, ufałdowywanie obejmuje inkubację polipeptydu hybrydowego w temperaturze około 4-37°C w ciągu okresu około 1-30 godzin w pH około 8,5-12,0 w obecności kwasu askorbinowego.
W szczególnie korzystnym rozwiązaniu, pH podczas ufałdowywania wynosi 11,0-11,25.
W innym szczególnie korzystnym rozwiązaniu, stężenie kwasu askorbinowego wynosi około 2 moli na mol grup SH obecnych w mieszaninie, w której zachodzi ufałdowywanie.
W jeszcze innym rozwiązaniu, okres inkubacji wynosi około 5 godzin.
W innym rozwiązaniu, poddawanie ufałdowywaniu obejmuje doprowadzanie pH do około 8,8-9,0 i rozszczepianie polipeptydu hybrydowego trypsynąi karboksypeptydaząB w temperaturze około 16-37°C w ciągu około 30 minut do 16 godzin.
W innym rozwiązaniu, oczyszczanie obejmuje chromatografię na DEAE-Sepharose i RP-HPLC.
W jeszcze innym rozwiązaniu, oczyszczanie obejmuje ponadto ultrafiltrację i chromatografię na CM-Sepharose.
W szczególnie korzystnym rozwiązaniu, oczyszczanie obejmuje ponadto chromatografię na DEAE-Sepharose i chromatografię na Phenyl-Sepharose.
W szczególnie korzystnym rozwiązaniu, polipeptyd hybrydowy jest eksprymowany przez plazmid pDBAST-LAT zdeponowany pod numerem dostępu ATCC 69361.
W innym korzystnym rozwiązaniu, polipeptyd hybrydowy jest eksprymowany przez plazmid ρλΒΑ8Τ-ΕΑΤ zdeponowany pod numerem dostępu ATCC 693363.
W innym korzystnym rozwiązaniu, polipeptyd hybrydowy jest eksprymowany przez plazmid pBAST-R zdeponowany pod numerem dostępu ATCC 69362.
W korzystnym rozwiązaniu, polipeptyd hybrydowy otrzymuje się przez traktowanie komórki bakteryjnej zawierającym DNA kodujący polipeptyd hybrydowy, w taki sposób, aby DNA kierował jego ekspresją i odzyskiwanie polipeptydu hybrydowego z komórki.
Uznaje się, że traktowanie obejmuje fermentację w obecności glukozy, glicerolu lub galaktozy.
Uznaje się ponadto, że odzyskiwanie polipeptydu hybrydowego z komórki obejmuje zniszczenie ściany komórkowej komórki bakteryjnej lub jej fragmentów w celu utworzenia lizatu, izolowanie precypitatu wewnątrzkomórkowego z lizatu przez wirowanie, solubilizację precypitatu i ewentualnie oczyszczanie polipeptydu hybrydowego przez chromatografię lub ultrafiltrację.
Wynalazek ten dostarcza ponadto polipeptyd obejmujący proinsulinę i peptyd liderowy połączony z końcem N proinsuliny, który to polipeptyd jest ufałdowany i zawiera właściwe wiązania dwusiarczkowe.
W korzystnym rozwiązaniu, peptyd liderowy pochodzi z końca N CuZnSOD.
W szczególnie korzystnym rozwiązaniu, peptyd liderowy obejmuje 62 aminokwasy poprzedzone aminokwasem Met i zakończone resztą Arg.
W korzystnym rozwiązaniu, proinsulina obejmuje łańcuch B insuliny połączony z łańcuchem A insuliny pojedynczą resztą Arg.
W innym rozwiązaniu, proinsulina obejmuje łańcuch B insuliny połączony z łańcuchem A insuliny dipeptydem Lys-Arg.
180 818
Powyższe dwie cząsteczki proinsuliny muszą zostać wytworzone jako białka hybrydowe, w innym przypadku poziomy ekspresji są skrajnie niskie i nie mająznaczenia komercjalnego.
We wszystkich korzystnych rozwiązaniach reszty cysteiny peptydu liderowego zastąpiono resztami seryny.
Poniższe przykłady podano, aby pomóc w zrozumieniu wynalazku, ale nie są zamierzone, i nie powinno się ich interpretować jako ograniczające w jakikolwiek sposób jego zakres. Przykłady nie obejmują szczegółowych opisów konwencjonalnych metod wykorzystanych podczas konstruowania wektorów, wstawiania genów kodujących polipeptydy do takich wektorów, oraz wprowadzania otrzymanych plazmidów do gospodarzy. Przykłady nie obejmują również opisu konwencjonalnych metod wykorzystanych do oznaczania polipeptydów wytworzonych przez takie układy gospodarz-wektor. Metody takie są dobrze znane specjalistom w tej dziedzinie i opisane zostały w licznych publikacjach, włącznie z podaną poniżej dla przykładu:
Sambrook, J., Fritsch. E.F. i Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manuał, wydanie drugie, Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Przykład 1. Konstruowanie plazmidów wytwarzających pBAST-R, pDBAST-LAT i pXBAST-LAT eksprymujących polipeptydy hybrydowe SOD-proinsulina
Skonstruowano bakteryjne wektory ekspresyjne, które wytwarzają duże ilości białek hybrydowych w W.coli pod kontrolą albo promotora deo P]P2, albo XPL. Proinsulinę wytwarzano w postaci białka hybrydowego, ponieważ stwierdzono, że bakterie zawierające wektor ekspresyjny kodujący łańcuch B insuliny-Lys-Arg-łańcuch A insuliny nie wytwarzały wykrywalnego polipeptydu. Białka hybrydowe obejmują peptyd liderowy, o długości 62 aminokwasów, pochodzący z końca N CuZnSOD, poprzedzany od strony końca N resztą Met i zakończony od strony końca C resztą Arg łączącągo z łańcuchem B insuliny. Łańcuch B insuliny połączony jest z łańcuchem A insuliny krótkim peptydem łańcucha C, składającym się z Lys-Arg lub Arg. Dwie cysteiny oryginalnie występujące w części SOD zastąpiono resztami seryny.
A. Plazmid pBAST-R
Skonstruowano szereg plazmidów zakończony pBAST-R, który po transformacji właściwych komórek gospodarza £. coli był zdolny do kierowania wydajnąekspresjąhybrydowego polipeptydu proinsuliny użytecznego do wytwarzania insuliny ludzkiej.
Strukturę plazmidu pBAST-R, kodującego hybrydowy polipeptyd SOD-łańcuch B insuliny-Lys-Arg-łańcuch A insuliny przedstawiono na figurze 3; sekwencję DNA i odpowiadającą jej sekwencję aminokwasową polipeptydu hybrydowego przedstawiono na figurze 6.
Plazmid pBAST-R ma długość około 4380 bp i obejmuje następujące elementy (w kierunku odwrotnym do kierunku wskazówek zegara):
1. Fragment DNA o długości 1521 bp, rozciągający się pomiędzy miejscami AatH-MscI w pBR322, który zawiera gen oporności na tetracyklinę.
2. Fragment DNA o długości 1497 bp, rozciągający się pomiędzy miejscami Scal-Haell w pBR322, który zawiera skrócony gen oporności na ampicylinę i miejsce początku replikacji DNA.
3. Fragment DNA o długości 930 bp, rozciągający się pomiędzy miejscami AvaII-NdeI w DNA E. coli, który zawierapromotory deo PjP2 i miejsce wiążące rybosom (RBS) (13).
4. Fragment DNA o długości 188 bp, rozciągający się pomiędzy miejscami Ndel-PpuMI w cDNA CuZnSOD człowieka. Cysteiny w pozycjach 6 i 57 dojrzałej SOD podstawiono resztami seryny przez mutagenezę ukierunkowaną wobec oligonukleotydu (12).
5. Syntetyczny fragment DNA o długości 172 bp, z końcami PpuMI i BamHI. Region ten koduje Arg-łańcuch B insuliny-Lys-Arg-łańcuch A insuliny.
6. Syntetyczny poliłącznik o długości 36 bp, zawierający miejsce wielokrotnego klonowania, z końcami BamHI i Hindlll.
7. Syntetyczny oligonukleotyd o długości 44 bp, zawierający terminator transkrypcji TrpA, z końcami Hindlll i Aatll (10).
180 818
Plazmid pBAST-R, który nadaje oporność na tetracyklinę i który koduje hybrydowy polipeptyd SOD-łańcuch B insuliny-Lys-Arg-łańcuch A insuliny, wprowadzono do szczepuE. coli 8Φ733 (cytRstrA) i zdeponowano 26 lipca 1993 r. w ATCC pod numerem dostępu ATCC 69362.
B. Plazmid pDBAST-LAT
Skonstruowano inny szereg plazmidów zakończony pDBAST-LAT, który po transformacji właściwych komórek gospodarza E. coli był zdolny do kierowania wydajną ekspresją hybrydowego polipeptydu proinsuliny użytecznego do wytwarzania insuliny ludzkiej.
Strukturę plazmidu pDBAST-LAT, kodującego hybrydowy polipeptyd SOD-łańcuch B insuliny-Arg-łańcuch A insuliny przedstawiono na figurze 4; sekwencję DNA i odpowiadającąjej sekwencję aminokwasową polipeptydu hybrydowego przedstawiono na figurze 7.
Plazmid pDBAST-LAT ma długość około 4377 bp i obejmuje następujące elementy (w kierunku odwrotnym do kierunku wskazówek zegara):
1. Fragment DNA o długości 1521 bp, rozciągający się pomiędzy miejscami Aatll-Mscl w pBR322, który zawiera gen oporności na tetracyklinę.
2. Fragment DNA o długości 1497 bp, rozciągający się pomiędzy miejscami Scal-Haell w pBR322, który zawiera skrócony gen oporności na ampicylinę i miejsce początku replikacji DNA.
3. Fragment DNA o długości 930 bp, rozciągający się pomiędzy miejscami AvaII-NdeI w DNA E. coli, który zawiera promotory deo P]P2 i RBS (13).
4. Fragment DNA o długości 188 bp, rozciągający się pomiędzy miejscami Ndel-PpuMI w cDNA CuZnSOD człowieka. Cysteiny w pozycjach 6 i 57 dojrzałej SOD podstawiono resztami seryny i zawartość par GC w tym fragmencie obniżono do 38% przez mutagenezę ukierunkowaną wobec oligonukleotydu (12).
5. Syntetyczny fragment DNA o długości 169 bp, z końcami PpuMI i BamHL Region ten koduje Arg-łańcuch B insuliny-Arg-łańcuch A insuliny.
6. Syntetyczny poliłącznik o długości 36 bp, zawierający miejsce wielokrotnego klonowania, z końcami BamHI i HindlH.
7. Syntetyczny oligonukleotyd o długości 44 bp, zawierający terminator transkrypcji TrpA, z końcami HindlH i Aatll (10).
Plazmid pDB AST-LAT, który nadaj e oporność na tetracyklinę i który koduj e hybrydowy polipeptyd SOD-łańcuch B insuliny-Arg-łańcuch A insuliny, wprowadzono do szczepu E. coli 8Φ733 (cytRstrA) i zdeponowano 26 lipca 1993 r. w ATCC pod numerem dostępu ATCC 69361.
C. Plazmid pXBAST-LAT
Skonstruowano inny szereg plazmidów zakończony pXBAST-LAT, który po transformacji zmienionych metodami inżynierii genetycznej komórek gospodarza E. coli (zawierających represor cI857) był zdolny do kierowania wydajną ekspresją hybrydowego polipeptydu proinsuliny użytecznego do wytwarzania insuliny ludzkiej.
Strukturę plazmidu pXBAST-R, kodującego hybrydowy polipeptyd SOD-łańcuch B insuliny-Arg-łańcuch A insuliny przedstawiono na figurze 5; sekwencj ę DNA i odpowiadaj ącąj ej sekwencję aminokwasową polipeptydu hybrydowego przedstawiono na figurze 7.
Plazmid pZBAST-LAT ma długość około 3777 bp i obejmuje następujące elementy (w kierunku odwrotnym do kierunku wskazówek zegara):
1. Fragment DNA o długości 1521 bp, rozciągający się pomiędzy miejscami Aatll-Mscl w pBR322, który zawiera gen oporności na tetracyklinę.
2. Fragment DNA o długości 1497 bp, rozciągający się pomiędzy miejscami Scal-Haell w pBR322, który zawiera skrócony gen oporności na ampicylinę i miejsce początku replikacji DNA.
3. Fragment DNA o długości 330 bp, rozciągający się pomiędzy miejscami BamHI-EcoRI w plazmidzie pSODal3 (14), który zawiera promotor XPL i fragment AvrII-NdeI o długości 30 bp zawierający miejsce wiążące rybosom deo.
180 818
4. Fragment DNA o długości 188 bp, rozciągający się pomiędzy miejscami Ndel-PpuMI w cDNA CuZnSOD człowieka. Cysteiny w pozycjach 6 i 57 dojrzałej SOD podstawiono resztami seryny i zawartość par GC w tym fragmencie obniżono do 38% przez mutagenezę ukierunkowaną wobec oligonukleotydu (12).
5. Syntetyczny fragment DNA o długości 169 bp, z końcami PpuMI i BamHI. Region ten koduje Arg-łańcuch B insuliny-Arg-łańcuch A insuliny.
6. Syntetyczny poliłącznik o długości 36 bp, zawierający miejsce wielokrotnego klonowania, z końcami BamHI i Hindlll.
7. Syntetyczny oligonukleotyd o długości 44 bp, zawierający terminator transkrypcji TrpA, z końcami Hindlll i AatH (10).
Plazmid pXBAST-LAT, który nadaje oporność na tetracyklinę i który koduje hybrydowy polipeptyd SOD-łańcuch B insuliny-Arg-łańcuch A insuliny pod kontrolą promotora aPL, wprowadzono do szczepu E. coli 4300 (F-, bio, cl857) i zdeponowano 26 lipca 1993 r. w ATCC pod numerem dostępu ATCC 69363.
Komórki bakteryjne namnażano w temperaturze 30°C. Wytwarzanie polipeptydu hybrydowego indukowano po zmianie temperatury na 42°C.
Przykład 2. Fermentacja, warunki wzrostu i oczyszczanie polipeptydów hybrydowych SOD-proinsulina
I. Hodowle podstawowe
Podstawową hodowlę szczepu E. coli 8Φ733, zawierającego plazmid pDBLAST-LAT (lub pB AST-R) namnażano na podłożu kazeinowym (29 g/litr hydrolizatu kazeinowego, 10 g/litr ekstraktu drożdżowego i 5 g/litr NaCl) wzbogaconego o tetracyklinę (10 mg/litr). Następnie hodowle rozcieńczano dwukrotnie podłożem do zamrażania i przechowywano w temperaturze -80°C.
Podłoże do zamrażania:
K2HPO46,3 g
KH2PO4 1,8g cytrynian sodowy 0,45 g
MgSO4 -7H2O 0,09 g (NH4)2SO40,9 g
Glicerol44 g
Na 500 ml
II. Inokulum
Inokulum namnażano w podłożu do wytwarzania (patrz poniżej). Jałowe podłoże w kolbie do wytrząsania zaszczepiano hodowlą podstawową i inkubowano w ciągu 15 godzin na wytrząsarce w temperaturze 37°C i przy około 200 obrotach na minutę. Jeśli zachodziła potrzeba, przeprowadzano kolejne etapy namnażania inokulum w napowietrzanych fermentorach z mieszaniem. Jałowe podłoże zaszczepiano 2-10% hodowlą z kolby i inkubowano w ciągu 15 godzin w temperaturze 37°C w pH 7±0,5 z wytrząsaniem i napowietrzaniem dla utrzymania poziomu rozpuszczonego tlenu powyżej 20% nasycenia powietrzem.
III. Wytwarzanie Podłoże do wytwarzania:
| K2HPO4 kh2po4 cytrynian sodowy NH4C1 K2SO4 FeSO4-7H2O MgSO4-7H2O | 8 g/litr 2 g/litr 2 g/litr 3 g/litr 0,6 g/litr 0,04 g/litr 0,4 g/litr |
180 818
CaCl2 0,02 g/litr roztwór pierwiastków śladowych 3 ml/litr tetracyklina 0,01 g/litr glukoza 2 g/litr glicerol 1 ml/litr
| Roztwór pierwiastków śladowych: | |
| MnSO4 · H2O | 1 g/litr |
| ZnSO4 · 7H2O | 2,78 g/litr |
| CoC12 · 7H2O | 2 g/litr |
| Na2MoO4 · 2H2O | 2 g/litr |
| CaCl2 · 2H2O | 3 g/litr |
| CuSO4 5H2O | 1,85 g/litr |
| H3BO3 | 0,5 g/litr |
| HC1 (32%) | 100 ml/litr |
| MnSO4 · H2O | 1 g/litr |
| MnSO4 · H2O | 1 g/litr |
| MnSO4 · H2O | 1 g/litr |
| MnSO4 · H2O | 1 g/litr |
Podłoże do wytwarzania zaszczepiano 0,5-10% hodowlą inokulum i inkubowano w temperaturze 37°C. Szybkości wytrząsania - napowietrzania ustawiono dla utrzymania poziomu tlenu powyżej 20% nasycenia powietrzem. pH utrzymywano na poziomie 7±0,2 stosując NH3.
Dla dostarczenia źródeł energii i węgla wstrzykiwano jałowe roztwory 50% glukozy i 30% glicerolu. Po osiągnięciu stężenia komórek OD660 = 25, wstrzykiwano jałowe roztwory 10% glukozy i 30% glicerolu i namnażanie kontynuowano w ciągu około 5godzin, do uzyskania stężenia komórek około OD660 = 60. Następnie hodowlę schładzano i komórki odzyskiwano przez wirowanie. Fermentacja E. coli w obecności każdego związku spośród glukozy, glicerolu, galaktozy lub ich kombinacji jako źródła węgla ułatwiała ekspresję polipeptydów hybrydowych SOD-proinsulina.
IV. Oczyszczanie
Polipeptydy hybrydowe SOD-proinsulina eksprymowane przez plazmidy pBAST-R i pDBAST-LAT ulegały akumulacji w precypitacie wewnątrzkomórkowym, który izolowano zgodnie z następującąprocedurą: 1 g (mokrej masy) osadu bakteryjnego zawieszano w 10 ml buforu zawierającego 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10 mM EDTA i traktowano lizozymem (Merck, 2500 u/ml) w temperaturze 37°C w ciągu 2 godzin. Następnie mieszaninę sonifikowano i dodawano Nonidet-P-40 (Sigma) lub Triton X 100 do 2% stężenia końcowego i mieszano w ciągu 2 godzin w temperaturze pokojowej. Precypitat osadzano przez wirowanie i przemywano wodą.
Polipeptyd hybrydowy oczyszczano prawie do homogenności przez chromatografię anionowymienną w następujący sposób. Precypitat rozpuszczono w 8 M moczniku, 20 mM Tris-HCl, 200 mM β-merkaptoetanolu, pH 8,2. Roztwór klarowano przez wirowanie i poddawano chromatografii na kolumnie z DEAE-Sepharose Fast-Flow (Pharmacia LKB), uprzednio zrównoważonej 8 M mocznikiem, 20 mM Tris-HCl, 20 rnM β-merkaptoetanolem, pH 8,2. Zbierano materiał nie ulegający związaniu i białko hybrydowe wytrącano albo (NH4)2SO4 przy 40% nasycenia, lub zatężano przez ultrafiltrację przez membranę o przepuszczalności do 10 Kd, a następnie diafiltrację wobec 100 mM buforu glicyna-HCl, pH 3,1.
Alternatywnie, polipeptyd hybrydowy SOD-proinsulina eksprymowany przez plazmid pBAST-R oczyszczono prawie do homogenności przez rozpuszczenie w 8 M moczniku i przez ultrafiltrację kolejno przez membrany o przepuszczalności do 100 kD i 50 kD (Filtron). Polipeptyd hybrydowy zatężono na membranie o przepuszczalności do 10 kD i wytrącono (NH4)2SO4 przy 40% nasycenia.
180 818
Przykład 3. Ufałdowywanie i enzymatyczne rozszczepianie polipeptydów hybrydowych SOD-proinsulina
Hybrydowe polipeptydy proinsuliny, otrzymane przez wytrącenie (NH4)2SO4 lub ultrafiltrację (przykład 2) rozpuszczano w 8 M moczniku, 5 mM HC1 i rozcieńczano 100 mM buforem glicynowym, pH 8,5-12,0 do stężenia końcowego około 1 mg/ml.
A. Ufałdowywanie polipeptydu hybrydowego SOD-proinsulina eksprymowanego przez plazmid pBAST-R odbywało się w temperaturze około 4-37°C w ciągu okresu około 1 -24 godzin w celu umożliwienia utworzenia właściwych wiązań dwusiarczkowych.
pH roztworu zawierającego ufałdowany polipeptyd hybrydowy z utworzonymi wiązaniami dwusiarczkowymi doprowadzano HC1 do około 8,8-9,0 i białko traktowano trypsynąi karboksypeptydazą B w temperaturze 16-37°C w ciągu 30-120 minut.
Po wielu eksperymentach stwierdzono, że optymalne warunki były następujące: polipeptyd hybrydowy eksprymowany przez plazmid pBAST-R rozpuszczano w 8 M moczniku, 5 mM HC1 i rozcieńczano 100 mM buforem glicynowym, pH 11,0 (figura 8) do stężenia końcowego około 1 mg/ml, po czym ufałdowywanie polipeptydu hybrydowego odbywało się w ciągu 6-16 godzin w temperaturze 25°C, a następnie ufałdowany polipeptyd hybrydowy z utworzonymi mostkami dwusiarczkowymi rozszczepiano trypsyną (1:500 w/w) i karboksypeptydazą B (1:200 w/w) w temperaturze 37°C w ciągu 30-60 minut.
Tworzenie insuliny przez enzymatyczne rozszczepienie ufałdowanego polipeptydu hybrydowego proinsuliny z utworzonymi wiązaniami dwusiarczkowymi eksprymowanego przez plazmid pBAST-R przedstawiono schematycznie na figurze 1.
B. Ufałdowywanie polipeptydu hybrydowego SOD-proinsulina eksprymowanego przez plazmid pDBAST-LAT odbywało się w temperaturze około 7-31°C w ciągu okresu około 5-30 godzin w celu umożliwienia utworzenia właściwych wiązań dwusiarczkowych.
pH roztworu zawierającego ufałdowany polipeptyd hybrydowy z utworzonymi wiązaniami dwusiarczkowymi doprowadzano HC1 do około 8,8-9,0 i białko traktowano trypsynąi karboksypeptydazą B w temperaturze 22-37°C w ciągu 30 minut do 16 godzin.
Po wielu eksperymentach stwierdzono, że optymalne warunki były następujące: polipeptyd hybrydowy eksprymowany przez plazmid pDBAST-LAT rozpuszczano w 8 M moczniku, 5 mM HC1 i rozcieńczano 100 mM buforem glicynowym, pH 11,0-11,25 (figura 8) do stężenia końcowego około 1 mg/ml, po czym ufałdowywanie polipeptydu hybrydowego odbywało się w ciągu 5 godzin w temperaturze 25 °C, a następnie ufałdowany polipeptyd hybrydowy z utworzonymi mostkami dwusiarczkowymi rozszczepiano trypsyną (1:15 000 w/w) i karboksypeptydazą B (1:10 000 w/w) w temperaturze 25°C w ciągu 16 godzin.
Tworzenie insuliny przez enzymatyczne rozszczepienie ufałdowanego polipeptydu hybrydowego proinsuliny z utworzonymi wiązaniami dwusiarczkowymi eksprymowanego przez plazmid pDBAST-LAT przedstawiono schematycznie na figurze 2.
Przykłady warunków specyficznych dla obu powyższych both A i B podano szczegółowo w legendach do figur 8-14.
Przykład 4. Analiza białkowa i oczyszczanie insuliny ludzkiej z polipeptydu hybrydowego SOD-proinsulina eksprymowanego przez plazmid pBAST-R
Tworzenie insuliny ludzkiej z polipeptydu hybrydowego SOD-proinsulina eksprymowanego przez plazmid pBAST/R określano przez oznaczenie radioimmunologiczne i RP-HPLC, jako standard stosując komercjalną insulinę ludzką (Calbiochem). Teoretyczna wydajność zrekombinowanej insuliny ludzkiej, obliczona na podstawie sekwencji aminokwasowej polipeptydu hybrydowego proinsuliny, wynosi 45,6%. Na podstawie figury 8 jest oczywiste, że optymalne ufałdowywanie zachodzi w pH 11. Przy tej wartości pH wytwarzanie insuliny stanowi około 80% wydajności teoretycznej (co odpowiada około 40% wyjściowej ilości polipeptydu hybrydowego). Insulinę ludzką wytwarzaną z polipeptydu hybrydowego proinsuliny eksprymowanego przez plazmid pBAST-R wykrywano przez RP-HPLC. Stosowano kolumnę Vydac 218TP54 o wymiarach 250 x 4,6 mm (średnica wewnętrzna) (Separation Group), 5 μ, wielkość porów 300 A w temperaturze pokojowej przy szybkości przepływu 1 ml/min. Jako eluent A stosowano 0,1%
180 818 kwas trifluorooctowy (TFA) w H2O, a jako eluent B 0,08% TFA w acetonitrylu. Kolumnę przemywano w ciągu 5 minut buforem równoważącym (25% eluent B), a następnie, w ciągu 37,5 minut, liniowym gradientem 25-50% eluentu B. Absorbancję monitorowano przy długości fali 220 nm lub 280 nm. Analiza insuliny ludzkiej po trawieniu enzymatycznym ufałdowanego polipeptydu hybrydowego z utworzonymi wiązaniami dwusiarczkowymi z zastosowaniem wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej z odwróconymi fazami ujawniła główny pik o takim samym czasie retencji, jak standardowa insulina ludzka.
Przygotowano dwie szarże na małą skalę, otrzymując odpowiednio 26 mg i 13 mg insuliny ludzkiej. Insulinę ludzką oczyszczono z roztworu poddanemu traktowaniu enzymatycznemu (pH 9) przez ultrafiltrację przez membranę o przepuszczalności do 3 Kd lub 5 Kd (Filtron), a następnie chromatografię na CM-Sepharose (bufor cytrynianowy, pH 3). Frakcje piku odsolono, zliofilizowano i poddano sekwencjonowaniu końca N i analizie składu aminokwasowego. Skład aminokwasowy obu szarży zrekombinowanej insuliny ludzkiej był zasadniczo identyczny z naturalnie występującą insuliną ludzką (patrz tabela 1, preparat 1). Sekwencję 5 aminokwasów końca aminowego preparatów insuliny określono przez degradację Edmana. Stwierdzono, że jest ona identyczna z końcem NH2 zarówno łańcucha A, jak i B insuliny ludzkiej, co potwierdza autentyczność produktu otrzymanego in vitro.
Jednakże, wyniki sekwencjonowania wskazująna obecność dodatkowej reszty Arg w pierwszej pozycji w około 25% cząsteczek. Wynik ten odpowiada rozszczepieniu przez trypsynę pomiędzy Lys i Arg, wewnątrz sekwencji łącznikowej, z pozostawieniem zatem dodatkowej reszty Arg na końcu aminowym łańcucha A.
Stwierdzono, że specyficzną hydrolizę przez trypsynę po C-końcowej stronie Arg można uzyskać przez przeprowadzenie reakcji w pH 11. W tym podwyższonym pH większość grup ε-aminowych Lys nie jest obdarzona ładunkiem (pK = 10,3), umożliwiając zatem selektywne rozszczepienie. Przez przeprowadzenie etapu trawienia trypsyną w pH 11 (patrz Tabela 1, preparat 2), po którym przeprowadzono trawienie karboksypeptydazą B w pH 8,5, uzyskano dwa preparaty 1 mg i 6,5 mg oczyszczonej insuliny. Sekwencjonowanie N-końców ujawniło, że ilość insuliny zawierającej dodatkową Arg została obniżona do około 5%.
Tabela 1
Skład aminokwasowy zrekombinowanej insuliny ludzkiej
| Aminokwas | Liczba reszt | |||
| Teoretyczna | Insulina standardowa | Preparat 1 | Preparat 2 | |
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| Asx | 3 | 3,20 | 3,38 | 3,26 |
| Thr | 3 | 2,98 | 2,83 | 2,68 |
| Ser | 3 | 2,84 | 2,53 | 2,77 |
| Glx | 7 | 7,15 | 7,73 | 7,23 |
| Pro | 1 | 1,28 | 1,13 | 1,09 |
| Gly | 4 | 4,24 | 4,39 | 4,25 |
| Ala | 1 | 1,00 | 1,28 | 1,04 |
| Cys | 6 | 5,88 | 5,11 | 5,79 |
| Val | 4 | 3,82 | 4,58 | 3,88 |
| Ile | 2 | 2,04 | 1,96 | 1,96 |
180 818
c.d. tabeli 1
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| Leu | 6 | 5,87 | 6,10 | 5,99 |
| Tyr | 4 | 3,80 | 3,80 | 3,87 |
| Phe | 3 | 3,15 | 3,56 | 3,03 |
| His | 2 | 2,04 | 2,05 | 2,08 |
| Lys | 1 | 1,01 | 1,05 | 1,02 |
| Arg | 1 | 0,96 | 1,30 | 1,18 |
Preparat 1 i 2 przedstawiają skład aminokwasowy zrekombinowanej insuliny ludzkiej wytworzonej z polipeptydu hybrydowego proinsuliny eksprymowanego przez plazmid pBAST-R. Rozszczepienie trypsyną przeprowadzono w pH 9 (preparat 1) lub w pH 11 (preparat 2).
Analizę składu aminokwasowego prowadzono po przeprowadzeniu utleniania reszt kwaśnych i hydrolizy w fazie gazowej oczyszczonych preparatów insuliny.
Przykład 5. Analiza peptydowa oczyszczonej insuliny ludzkiej wytworzonej z polipeptydu hybrydowego SOD-proinsulina eksprymowanego przez plazmid pBAST-R
Oczyszczoną insuliną ludzką, wytworzoną jak opisano w powyższych przykładach, poddano analizie peptydowej wykorzystując endoproteinazę Glu-C (Sigma), która hydrolizuje wiązania polipeptydowego karboksylowej stronie reszt glutamylowych.
Bardziej szczegółowo, próbki insuliny (100 pg), wytworzonej przez rozszczepienie ufałdowanego hybrydowego polipeptydu proinsuliny eksprymowanego przez plazmid pBAST-R, trawiono 5 pg Glu-C w ciągu 6 godzin w temperaturze 37°C w objętości 100 pl 0,1 M Tris-HCl, pH 7,8. Przeprowadzono analizę HPLC: próbki komercjalnie dostępnej (kontrolnej) insuliny i insuliny wytworzonej przez rozszczepienie ufałdowanego polipeptydu hybrydowego proinsuliny z utworzonymi wiązaniami dwusiarczkowymi, eksprymowanej przez plazmid pBAST-R zakwaszono do pH około 3 i rozdzielono przez RP-HPLC. Zastosowano kolumnę Vydac 218TP54, o wymiarach 250 x 4,6 mm (średnica wewnętrzna), 5 p, wielkość porów 300 A. Kolumnę zrównoważono 50 mM fosforanem tetraetyloamonowym, 162 mM NaClO4, pH 3, zawierającym 31,5% (v/v) acetonitryl, i rozwijano liniowym gradientem 35-45% acetonitrylu w ciągu 75 minut z szybkością przepływu 1 ml/minutę. Absorbancję monitorowano przy długości fali 220 nm.
Wszystkie peptydy oczekiwane na podstawie reakcji kontrolnej zostały utworzone, chociaż niewielki pik po piku odpowiadającym jednemu z fragmentów pochodzi prawdopodobnie z cząsteczki insulinopodobnej dez-Thr(B30) (15).
Przykłady 4 i 5 wskazują, że zrekombinowany polipeptyd eksprymowany przez plazmid pBAST-R posiada sekwencję naturalnie występującej insuliny ludzkiej. Mała część wytwarzanego zrekombinowanego białka obejmowała takie formy, jak cząsteczki insulinopodobne Arg(Ao), dezamino- lub dez-Thr(B30). Te niepożądane produkty uboczne można wyeliminować stosując procedury chromatograficzne, takie jak RP-HPLC, jak opisano powyżej.
Przykład6. Analiza białkowa i oczyszczanie insuliny ludzkiej wytworzonej z hybrydowego polipeptydu proinsuliny eksprymowanego przez plazmid pDBAST-LAT
W celu uniknięcia tworzenia produktu ubocznego, Arg(Ao) insuliny (przykład 4 i 5), plazmid ekspresyjny pBAST-R zmodyfikowano, tak aby zawierał DNA kodujący tylko resztę Arg pomiędzy łańcuchami A i B polipeptydu hybrydowego proinsuliny, w przeciwieństwie do DNA kodującego Lys-Arg pomiędzy łańcuchami A i B polipeptydu hybrydowego proinsuliny eksprymowanego przez plazmid pBAST-R. W wyniku tego otrzymano plazmidy ekspresyjne pDBAST-LAT (przykład IB) i pZBAST-LAT (przykład IC).
180 818
W następstwie ufałdowywania i traktowania enzymatycznego trypsyną i karboksypeptydazą B ufałdowanego polipeptydu hybrydowego proinsuliny z utworzonymi wiązaniami dwusiarczkowymi, eksprymowanego przez nowy plazmid ekspresyjny pDBAST-LAT zachodziło wydajne wytwarzanie insuliny. Występowanie zanieczyszczeń insulinopodobnych było niskie (figura 9). Ufałdowywanie było optymalne w pH 11,25 (figura 10) i było znacząco wzmacniane w obecności około 2 moli kwasu askorbinowego na mol grup SH w mieszaninie reakcyjnej (figura 11).
Wpływ stężenia białka na wydajność insuliny wytwarzanej z hybrydowego polipeptydu proinsuliny określono w szeregu reakcji uwzględniających optymalne warunki ufałdowywania. Optymalną wydajność uzyskiwano, gdy stężenie białka nie przekraczało 1,5 mg/ml (figura 13).
Insulinę oczyszczano przez chromatografię na DEAE-Sepharose, po której następowała RP-HPLC (jak opisano na figurze 9). Jak wynika z figury 12, wytworzona zrekombinowana insulina ludzka miała taki sam czas retencji, jak standardowa (dostępna komercjalnie) insulina ludzka. Skład aminokwasowy preparatu oczyszczonej zrekombinowanej insuliny ludzkiej jest identyczny, jak dla insuliny standardowej (patrz tabela 2, insulina zrekombinowana).
Należy zauważyć, że tabela 2 wskazuje, iż insulina wytworzona z hybrydowego polipeptydu proinsuliny eksprymowana przez plazmid pDBAST-LAT nie posiada dodatkowej reszty Arg połączonej z łańcuchem A insuliny (Arg(Ao) insulina), jak opisano w przykładzie 4. A zatem, preferowanym plazmidem do wytwarzania insuliny jest plazmid pDBAST-LAT, a preferowaną sekwencją hybrydowego polipeptydu proinsuliny jest ta przedstawiona na figurze 7.
T ab e1 a 2
Skład aminokwasowy zrekombinowanej insuliny ludzkiej
| Aminokwas | Liczba reszt | ||
| Teoretyczna | Insulina standardowa | Insulina rekombinowana | |
| Asx | 3 | 3,20 | 3,32 |
| Thr | 3 | 2,98 | 2,73 |
| Ser | 3 | 2,84 | 2,71 |
| Glx | 7 | 7,15 | 7,41 |
| Pro | 1 | 1,28 | 1,02 |
| Gly | 4 | 4,24 | 4,46 |
| Ala | 1 | 1,00 | 1,09 |
| Cys | 6 | 5,88 | 5,28 |
| Val | 4 | 3,82 | 4,00 |
| Ile | 2 | 2,04 | 1,91 |
| Leu | 6 | 5,87 | 6,34 |
| Tyr | 4 | 3,80 | 3,64 |
| Phe | 3 | 3,15 | 3,06 |
| His | 2 | 2,04 | 2,18 |
| Lys | 1 | 1,01 | 1,02 |
| Arg | 1 | 0,96 | 1,07 |
180 818
Przedstawiono skład aminokwasowy standardowej insuliny ludzkiej i zrekombinowanej insuliny ludzkiej wytworzonej z hybrydowego polipeptydu proinsuliny eksprymowanego przez plazmid pDBAST-LAT.
Analizę składu aminokwasowego prowadzono po przeprowadzeniu utleniania reszt kwaśnych i hydrolizy w fazie gazowej preparatów oczyszczonej insuliny.
Przykład 7. Wytwarzanie insuliny ludzkiej z hybrydowego polipeptydu proinsuliny eksprymowanego przez plazmid pDBAST-LAT z nieoczyszczonego precypitatu wewnątrzkomórkowego
Stosując nieoczyszczony precypitat wewnątrzkomórkowy, przeprowadzono ulepszoną metodę ufałdowywania i enzymatycznego przekształcania hybrydowego polipeptydu proinsuliny w insulinę, pozwalającą na ominięcie potrzeby wstępnego etapu oczyszczania, opisanego w przykładzie 2, część IV. Wydajne wytwarzanie insuliny zachodziło po enzymatycznym rozszczepieniu ufałdowanego polipeptydu hybrydowego proinsuliny z utworzonymi wiązaniami dwusiarczkowymi trypsyną i karboksypeptydazą B (figura 4 i tabela 3). Wydajności insuliny obliczano jako procent początkowego stężenia białka (A280) oznaczonego na etapie rozpuszczania precypitatu w pH 12 (figura 14). Wykazano, że ufałdowywanie hybrydowego polipeptydu SOD-proinsulina z nieoczyszczonego precypitatu wewnątrzkomórkowego jest optymalne po około 4,5 godzinach od początku doświadczenia (figura 14).
Tabela 3 podsumowuje częściowe oczyszczanie insuliny z hybrydowego polipeptydu proinsuliny eksprymowanego przez plazmid pBAST-LAT z nieoczyszczonego precypitatu wewnątrzkomórkowego przygotowanego z hodowli fermentacyjnej o objętości jednego litra i o O.D.660 wynoszącej 45. Rozpuszczanie i ufałdowywanie przeprowadzono jak opisano dla figury 14. Po 4,5 godzinach od rozpuszczenia, cały roztwór zawierający ufałdowany hybrydowy polipeptyd proinsuliny z utworzonymi wiązaniami dwusiarczkowymi, zmiareczkowano stężonym kwasem solnym do pH 8,8. Dodano ZnCl2 (do 50 μΜ stężenia końcowego), karboksydazę B (1:4000 w/w) i trypsynę (1:6000 w/w). Trawienie prowadzono w ciągu 3 godzin w temperaturze 37°C i zakończono przez dodanie fenylometylosulfonylofluorku (PMSF) do 0,5 mM stężenia końcowego. Analiza przez HPLC (jak opisano na figurze 9) wykazała, że wydajność insuliny wynosiła 169 mg. Insulinę oczyszczono przez kolejne etapy chromatografii anionowymiennej i oddziaływań hydrofobowych. Poddaną trawieniu mieszaninę po ufałdowywaniu nałożono na kolumnę DEAE-Sepharose Fast Flow (Pharmacia) zrównoważoną uprzednio buforem zawierającym 20 mM Tris-HCl, 10 mM NaCl, pH 8, w ilości około 50 jednostek A2g0na ml złoża. Związany materiał przemyto buforem zawierającym 20 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, pH 8, i insulinę wyeluowano 250 mM NaCl w tym samym buforze. Połączone frakcje zawierające insulinę odpowiadały 20% nałożonego białka i posiadały czystość 37,1%. Do połączonych frakcji wyeluowanych z DEAE dodano siarczanu amonowego do stężenia 410 mM i nałożono na kolumnę Phenyl-Sepharose Fast Flow uprzednio zrównoważoną buforem zawierającym 20 mM Tris HC1,540 mM siarczan amonowy w ilości około 12 jednostek A2g0 na ml złoża. Związany materiał przemyto buforem do równoważenia i insulinę wyeluowano buforem zawierającym 20 mM Tris HC1, 220 mM siarczan amonowy, pH 8. Frakcje zawierające insulinę odpowiadały 42,3% nałożonego białka i posiadały czystość 74,1%. W wyniku tego procesu częściowego oczyszczania wytworzono 120 mg insuliny, identycznej z insuliną standardową, co odpowiada wydajności insuliny 5,16%. Dalsze oczyszczanie insuliny można przeprowadzić stosując metody znane w tej dziedzinie, np. sączenie molekularne, RP-HPLC i krystalizację (17).
180 818
Tabela 3
Oczyszczanie zrekombinowanej insuliny ludzkiej, wytworzonej z hybrydowego polipeptydu proinsuliny eksprymowanego przez plazmid pDBAST-LAZ, po rozpuszczeniu nieoczyszczonego precypitatu wewnątrzkomórkowego, ufałdowywaniu i traktowaniu enzymatycznym trypsyną i karboksypeptydazą B
| Etap oczyszczania | A 280 | Minimalna ilość insuliny wg. HPLC - w mg | % czystości |
| Rozpuszczanie precypitatu | 2326 | - | - |
| Traktowanie węglem drzewnym | 1915 | - | - |
| Ufałdowywanie i traktowanie enzymatyczne | 1915 | 169 | 8,8 |
| Połączone frakcje po DEAE-Sepharose | 383 | 142 | 37,1 |
| Połączone frakcje po Phenyl-Sepharose | 162 | 120 | 74,1 |
A280 przedstawia całkowitą absorbancję przy długości fali 280 nm na każdym etapie oczyszczania. Obecność insuliny oznaczano przez analizę HPLC w stosunku do insuliny standardowej, jak opisano dla figury 9, i odpowiada ona głównemu pikowi insuliny standardowej.
Claims (21)
1. Sposób wytwarzania insuliny ludzkiej obejmujący mikrobiologiczną ekspresję rekombinowanego białka zawierającego insulinę, znamienny tym, że obejmuje:
(a) otrzymywanie polipeptydu hybrydowego zawierającego proinsulinę poprzez ekspresję tego polipeptydu hybrydowego w komórce bakteryjnej zawierającej DNA kodujący polipeptyd hybrydowy, przy czym ten DNA jest obecny w plazmidzie;
(b) odzyskiwanie polipeptydu hybrydowego;
(c) ufałdowywanie i tworzenie wiązań dwusiarczkowych w polipeptydzie hybrydowym otrzymanym w (b), unikając uprzedniego poddawania polipeptydu hybrydowego siarczynolizie;
(d) poddawanie uzyskanego w (c) ufałdowanego, z utworzonymi wiązaniami dwusiarczkowymi polipeptydu hybrydowego trawieniu enzymatycznemu w celu otrzymania insuliny;
(e) oczyszczania tak wytworzonej insuliny.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że plazmid został wybrany z grupy składającej się z pDBAST-LAT zdeponowanego pod numerem dostępu ATCC 69361, pZBAST-LAT zdeponowanego pod numerem dostępu ATCC 69363, pBAST-R zdeponowanego pod numerem dostępu ATCC 69362.
3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że ekspresjonowanie z etapu (a) obejmuje fermentację w obecności glukozy, glicerolu lub galaktozy.
4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że odzyskiwanie w etapie (b) obejmuje:
(i) niszczenie ściany komórkowej komórki bakteryjnej lub jej fragmentów w celu utworzenia lizatu;
(ii) izolowanie wewnątrzkomórkowego precypitatu z lizatu przez wirowanie; i (iii) rozpuszczanie precypitatu.
5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że ufałdowywanie i tworzenie wiązań dwusiarczkowych w etapie (c) obejmuje inkubację polipeptydu hybrydowego w temperaturze około 4-37°C w ciągu około 1-30 godzin w pH około 8,5-12,0.
6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że pH wynosi 11,0-11,25.
7. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że inkubacja zachodzi w obecności kwasu askorbinowego.
8. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że pH wynosi 11,0-11,25.
9. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że stężenie kwasu askorbinowego wynosi około 2 moli na mol grup SH obecnych w mieszaninie, w której zachodzi ufałdowywanie.
10. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że czas inkubacji wynosi około 5 godzin.
11. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że czas inkubacji wynosi około 5 godzin.
12. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że etap (d) obejmuje ponadto:
(i) doprowadzanie pH do około 8,8-9,0; i (ii) trawienie polipeptydu hybrydowego trypsyną i karboksypeptydaząB w temperaturze 16-37°C w ciągu 30 minut do 16 godzin.
13. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że etap (e) obejmuje ponadto oczyszczanie przez chromatografię na DEAE-Sepharose i RP-HPLC.
14. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że etap (e) obejmuje ponadto oczyszczanie przez ultrafiltrację i chromatografię na CM-Sepharose.
15. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że etap (e) obejmuje ponadto oczyszczanie przez chromatografię na DEAE-Sepharose i chromatografię na Phenyl-Sepharose.
180 818
16. Polipeptyd hybrydowy zawierający proinsulinę i peptyd liderowy połączony z N końcem proinsuliny, przy czym polipeptyd ten jest ufałdowany i posiada właściwe wiązania dwusiarczkowe.
17. Polipeptyd hybrydowy według zastrz. 16, znamienny tym, że peptyd liderowy pochodzi z N końca CuZnSOD.
18. Polipeptyd hybrydowy według zastrz. 17, znamienny tym, że peptyd liderowy obejmuje poprzedzone przez aminokwas Met, 62 aminokwasy, po których następuje reszta Arg.
19. Polipeptyd hybrydowy według zastrz. 16, znamienny tym, że proinsulina zawiera łańcuch B insuliny kowalencyjnie związany z łańcuchem A insuliny pojedynczą resztą Arg.
20. Polipeptyd hybrydowy według zastrz. 16, znamienny tym, że proinsulina zawiera łańcuch B insuliny kowalencyjnie związany z łańcuchem A insuliny dwupeptydem Lys-Arg.
21. Polipeptyd hybrydowy według zastrz. 16, znamienny tym, że reszty cysteiny peptydu liderowego zostały zastąpione resztami seryny.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL94321039A PL180818B1 (pl) | 1994-12-29 | 1994-12-29 | Sposób wytwarzania insuliny ludzkiej, oraz polipeptyd hybrydowy |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL94321039A PL180818B1 (pl) | 1994-12-29 | 1994-12-29 | Sposób wytwarzania insuliny ludzkiej, oraz polipeptyd hybrydowy |
| PCT/US1994/013268 WO1996020724A1 (en) | 1994-12-29 | 1994-12-29 | Generation of human insulin |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL321039A1 PL321039A1 (en) | 1997-11-24 |
| PL180818B1 true PL180818B1 (pl) | 2001-04-30 |
Family
ID=22243290
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL94321039A PL180818B1 (pl) | 1994-12-29 | 1994-12-29 | Sposób wytwarzania insuliny ludzkiej, oraz polipeptyd hybrydowy |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0871474B2 (pl) |
| JP (1) | JP4624495B2 (pl) |
| AT (1) | ATE350053T1 (pl) |
| AU (1) | AU698872B2 (pl) |
| BR (1) | BR9408638A (pl) |
| CA (1) | CA2208095C (pl) |
| CZ (1) | CZ290079B6 (pl) |
| DE (2) | DE69434909T3 (pl) |
| DK (1) | DK0871474T4 (pl) |
| ES (1) | ES2279510T5 (pl) |
| HU (1) | HU223718B1 (pl) |
| NZ (1) | NZ279002A (pl) |
| PL (1) | PL180818B1 (pl) |
| PT (1) | PT871474E (pl) |
| WO (1) | WO1996020724A1 (pl) |
Families Citing this family (22)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE19735711C2 (de) | 1997-08-18 | 2001-04-26 | Aventis Pharma Gmbh | Verfahren zur Herstellung eines Vorläufers von Insulin oder Insulinderivaten mit korrekt verbundenen Cystinbrücken |
| IL138658A0 (en) * | 1998-03-31 | 2001-10-31 | Tonghua Gantech Biotechnology | Chimeric protein |
| JP3406244B2 (ja) | 1999-04-30 | 2003-05-12 | 伊藤ハム株式会社 | 新規な融合蛋白質からの組み換えインスリンの製造方法 |
| EP1265630B1 (en) | 2000-03-24 | 2006-06-07 | Genentech, Inc. | Use of insulin for the treatment of cartilagenous disorders |
| US20040037828A1 (en) | 2002-07-09 | 2004-02-26 | Bar-Ilan University | Methods and pharmaceutical compositions for healing wounds |
| CA2416788A1 (en) | 2000-07-31 | 2002-02-07 | Tamar Tennenbaum | Methods and pharmaceutical compositions comprising protein kinase c isoforms for healing wounds |
| US7312192B2 (en) * | 2001-09-07 | 2007-12-25 | Biocon Limited | Insulin polypeptide-oligomer conjugates, proinsulin polypeptide-oligomer conjugates and methods of synthesizing same |
| ATE397619T1 (de) | 2003-01-31 | 2008-06-15 | Organon Nv | Verfahren zur proteinisolierung unteranoxischen bedingungen |
| RU2358753C2 (ru) | 2003-08-07 | 2009-06-20 | Хилор Лтд. | Фармацевтические композиции и способы для ускорения заживления ран |
| CA2806399A1 (en) * | 2010-07-28 | 2012-02-02 | Smartcells, Inc. | Recombinantly expressed insulin polypeptides and uses thereof |
| WO2012048856A1 (en) | 2010-10-12 | 2012-04-19 | Glucometrix Pvs Gmbh | Proinsulin with helper sequence |
| WO2012098009A1 (en) | 2011-01-21 | 2012-07-26 | Glucometrix Ag | Chimeric polypeptide comprising a membrane protein and an insulin precursor |
| EP2867250A2 (en) | 2012-04-04 | 2015-05-06 | GlucoMetrix AG | Proinsulin with enhanced helper sequence |
| CA2866491A1 (en) * | 2014-10-02 | 2016-04-02 | Clay Purdy | Synthetic acid compositions and uses thereof |
| WO2017052305A1 (en) * | 2015-09-24 | 2017-03-30 | Hanmi Pharm. Co., Ltd. | Method of insulin production |
| PL239062B1 (pl) * | 2016-01-22 | 2021-11-02 | Inst Biotechnologii I Antybiotykow | Sposób wytwarzania insuliny i jej pochodnych |
| JP2019530473A (ja) * | 2016-09-06 | 2019-10-24 | ケミカル アンド バイオファーマスーティカル ラボラトリーズ オブ パトラ エス．エー．Ｃｈｅｍｉｃａｌ ＆ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｏｆ Ｐａｔｒａｓ Ｓ．Ａ． | プロインスリン誘導体 |
| JP7158378B2 (ja) * | 2016-09-23 | 2022-10-21 | ハンミ ファーマシューティカル カンパニー リミテッド | インスリン受容体との結合力が減少された、インスリンアナログ及びその用途 |
| CN112105635A (zh) * | 2018-06-18 | 2020-12-18 | 联合化学实验室有限公司 | 用于重组蛋白的更高表达的前导序列 |
| WO2020051812A1 (zh) * | 2018-09-12 | 2020-03-19 | 美药星（南京）制药有限公司 | 一种新型门冬胰岛素原的结构和制备门冬胰岛素的方法 |
| WO2020069040A1 (en) | 2018-09-25 | 2020-04-02 | Amphastar Pharmaceuticals, Inc. | Highly purified recombinant human insulin (rhi) api and methods of producing the same |
| CN113527505A (zh) * | 2020-04-15 | 2021-10-22 | 博锐生物科技有限公司 | 一种多肽和包含该多肽的药物组合物以及它们的应用 |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4430266A (en) * | 1980-11-28 | 1984-02-07 | Eli Lilly And Company | Process for producing an insulin precursor |
| DK129385A (da) * | 1985-03-22 | 1986-09-23 | Novo Industri As | Peptider og fremstilling deraf |
| DE3679343D1 (de) † | 1985-03-28 | 1991-06-27 | Chiron Corp | Expression durch verwendung von fusionsgenen fuer proteinproduktion. |
| US5342921A (en) * | 1985-03-28 | 1994-08-30 | Chiron Corporation | Superoxide dismutase fusion polypeptides for expression of mammalian proteins |
| DE3901719A1 (de) * | 1989-01-21 | 1990-07-26 | Hoechst Ag | Verfahren zur herstellung eines insulinvorlaeufers |
| DE3901718A1 (de) † | 1989-01-21 | 1990-07-26 | Hoechst Ag | Verfahren zur renaturierung falscher rekombinanten von insulinvorlaeufern |
| US5126249A (en) * | 1989-05-09 | 1992-06-30 | Eli Lilly And Company | Enzymatic removal of a protein amino-terminal sequence |
| US5227293A (en) * | 1989-08-29 | 1993-07-13 | The General Hospital Corporation | Fusion proteins, their preparation and use |
| IL104727A (en) * | 1992-02-18 | 1997-01-10 | Lilly Co Eli | Selective removal of n-terminal extensions from folded insulin precursors using dipeptidyl-aminopeptidase-1 |
| DE19701167A1 (de) * | 1997-01-15 | 1998-07-23 | Siemens Ag | Chipkarte |
-
1994
- 1994-12-29 DE DE69434909T patent/DE69434909T3/de not_active Expired - Lifetime
- 1994-12-29 CZ CZ19972031A patent/CZ290079B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1994-12-29 BR BR9408638-9A patent/BR9408638A/pt not_active Application Discontinuation
- 1994-12-29 EP EP95907193A patent/EP0871474B2/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-12-29 ES ES95907193T patent/ES2279510T5/es not_active Expired - Lifetime
- 1994-12-29 PL PL94321039A patent/PL180818B1/pl unknown
- 1994-12-29 DK DK95907193.7T patent/DK0871474T4/da active
- 1994-12-29 JP JP52090996A patent/JP4624495B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1994-12-29 NZ NZ279002A patent/NZ279002A/xx not_active IP Right Cessation
- 1994-12-29 DE DE95907193T patent/DE95907193T1/de active Pending
- 1994-12-29 HU HU9800292A patent/HU223718B1/hu active IP Right Grant
- 1994-12-29 AT AT95907193T patent/ATE350053T1/de active
- 1994-12-29 AU AU15500/95A patent/AU698872B2/en not_active Expired
- 1994-12-29 CA CA002208095A patent/CA2208095C/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-12-29 WO PCT/US1994/013268 patent/WO1996020724A1/en not_active Ceased
- 1994-12-29 PT PT95907193T patent/PT871474E/pt unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CZ203197A3 (cs) | 1998-09-16 |
| DK0871474T3 (da) | 2007-05-07 |
| WO1996020724A1 (en) | 1996-07-11 |
| HU223718B1 (hu) | 2004-12-28 |
| DK0871474T4 (da) | 2012-01-09 |
| CA2208095C (en) | 2006-11-28 |
| BR9408638A (pt) | 2004-09-21 |
| DE95907193T1 (de) | 2005-02-10 |
| JP4624495B2 (ja) | 2011-02-02 |
| JPH10511849A (ja) | 1998-11-17 |
| DE69434909T2 (de) | 2007-08-09 |
| ES2279510T5 (es) | 2012-01-19 |
| CA2208095A1 (en) | 1996-07-11 |
| EP0871474A4 (en) | 2004-08-18 |
| PT871474E (pt) | 2007-02-28 |
| NZ279002A (en) | 1999-02-25 |
| CZ290079B6 (cs) | 2002-05-15 |
| ES2279510T3 (es) | 2007-08-16 |
| EP0871474A1 (en) | 1998-10-21 |
| DE69434909T3 (de) | 2012-02-09 |
| PL321039A1 (en) | 1997-11-24 |
| AU1550095A (en) | 1996-07-24 |
| HK1013594A1 (en) | 1999-09-03 |
| DE69434909D1 (de) | 2007-02-15 |
| AU698872B2 (en) | 1998-11-12 |
| EP0871474B2 (en) | 2011-09-21 |
| HUT78070A (hu) | 1999-08-30 |
| EP0871474B1 (en) | 2007-01-03 |
| ATE350053T1 (de) | 2007-01-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| PL180818B1 (pl) | Sposób wytwarzania insuliny ludzkiej, oraz polipeptyd hybrydowy | |
| CA2033176C (en) | Growth hormone fusion proteins | |
| US6001604A (en) | Refolding of proinsulins without addition of reducing agents | |
| WO1996034882A1 (en) | Single chain insulin with high bioactivity | |
| HU209878B (en) | Method for producing polipeptids in a new escherichia coli expression | |
| AU623518B2 (en) | Processes and compositions for the isolation of human relaxin | |
| AU2007272057B2 (en) | Method for producing insulin analogs having a dibasic B chain terminus | |
| KR100659671B1 (ko) | 신규한 융합단백질로부터 재조합 인슐린을 제조하는 방법 | |
| KR100381494B1 (ko) | 인간인슐린의제조방법 | |
| AU633099C (en) | Growth hormone fusion proteins | |
| AU633099B2 (en) | Growth hormone fusion proteins | |
| KR19990016368A (ko) | 융합단백질을 이용한 인성장호르몬의 제조방법 | |
| HK1130815B (en) | Method for producing insulin analogs having a dibasic b chain terminus |