CZ203197A3 - Způsob produkce rekombinantního humánního inzulinu - Google Patents
Způsob produkce rekombinantního humánního inzulinu Download PDFInfo
- Publication number
- CZ203197A3 CZ203197A3 CZ972031A CZ203197A CZ203197A3 CZ 203197 A3 CZ203197 A3 CZ 203197A3 CZ 972031 A CZ972031 A CZ 972031A CZ 203197 A CZ203197 A CZ 203197A CZ 203197 A3 CZ203197 A3 CZ 203197A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- insulin
- polypeptide
- proinsulin
- hybrid polypeptide
- plasmid
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 52
- PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N insulin (human) Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N 0.000 title abstract description 63
- 101000976075 Homo sapiens Insulin Proteins 0.000 title abstract description 62
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 194
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 177
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 174
- 108010076181 Proinsulin Proteins 0.000 claims abstract description 87
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims abstract description 21
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 207
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 claims description 108
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 claims description 108
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 claims description 103
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 93
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 31
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 28
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 claims description 24
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 claims description 24
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 24
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 claims description 24
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 21
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 claims description 20
- 102000003670 Carboxypeptidase B Human genes 0.000 claims description 19
- 108090000087 Carboxypeptidase B Proteins 0.000 claims description 19
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 18
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 18
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 17
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 claims description 17
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 12
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 12
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 11
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 claims description 10
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 claims description 10
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 claims description 10
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 claims description 10
- 229920002271 DEAE-Sepharose Polymers 0.000 claims description 8
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 8
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 8
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims description 7
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims description 6
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 6
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 claims description 6
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 6
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 6
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 5
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims description 4
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims description 4
- 239000006166 lysate Substances 0.000 claims description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 claims description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 claims description 3
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 claims description 3
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000004897 n-terminal region Anatomy 0.000 claims description 2
- 230000003381 solubilizing effect Effects 0.000 claims description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 53
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 33
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 abstract description 19
- 230000007017 scission Effects 0.000 abstract description 19
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 abstract description 18
- 230000034005 thiol-disulfide exchange Effects 0.000 abstract 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 31
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 30
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 25
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 23
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 23
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 21
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 20
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 20
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 15
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 14
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 13
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 13
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 12
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 9
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 9
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 9
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 9
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 9
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 9
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 9
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 8
- 125000000151 cysteine group Chemical class N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 8
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 8
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 8
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 7
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 7
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 7
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 7
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 6
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 6
- 108010005636 polypeptide C Proteins 0.000 description 6
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 6
- 101500021084 Locusta migratoria 5 kDa peptide Proteins 0.000 description 5
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 5
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 5
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 5
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 5
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 4
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 4
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 4
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 4
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 4
- 239000007986 glycine-NaOH buffer Substances 0.000 description 4
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 4
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 4
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 4
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 4
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 4
- 108010066381 preproinsulin Proteins 0.000 description 4
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 4
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101000981883 Brevibacillus parabrevis ATP-dependent tryptophan/phenylalanine/tyrosine adenylase Proteins 0.000 description 3
- 101000981889 Brevibacillus parabrevis Linear gramicidin-PCP reductase Proteins 0.000 description 3
- 101000906861 Chondromyces crocatus ATP-dependent tyrosine adenylase Proteins 0.000 description 3
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 3
- NPBGTPKLVJEOBE-IUCAKERBSA-N Lys-Arg Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCNC(N)=N NPBGTPKLVJEOBE-IUCAKERBSA-N 0.000 description 3
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 3
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 3
- 230000002608 insulinlike Effects 0.000 description 3
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 3
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 3
- 239000013587 production medium Substances 0.000 description 3
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 3
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 3
- 101100228196 Caenorhabditis elegans gly-4 gene Proteins 0.000 description 2
- 101100512078 Caenorhabditis elegans lys-1 gene Proteins 0.000 description 2
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010016626 Dipeptides Proteins 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 2
- -1 Humalog insulin analog Chemical class 0.000 description 2
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- 101100205180 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) leu-6 gene Proteins 0.000 description 2
- SCKXCAADGDQQCS-UHFFFAOYSA-N Performic acid Chemical compound OOC=O SCKXCAADGDQQCS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010005991 Pork Regular Insulin Proteins 0.000 description 2
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 2
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001851 biosynthetic effect Effects 0.000 description 2
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 2
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 2
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 2
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 2
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019797 dipotassium phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 230000006334 disulfide bridging Effects 0.000 description 2
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 description 2
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 239000012595 freezing medium Substances 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 2
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 239000002933 immunoreactive insulin Substances 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 2
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- CIJQGPVMMRXSQW-UHFFFAOYSA-M sodium;2-aminoacetic acid;hydroxide Chemical compound O.[Na+].NCC([O-])=O CIJQGPVMMRXSQW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000008174 sterile solution Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 2-aminoacetic acid;hydron;chloride Chemical compound Cl.NCC(O)=O IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VOUAQYXWVJDEQY-QENPJCQMSA-N 33017-11-7 Chemical group OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N1[C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O)CCC1 VOUAQYXWVJDEQY-QENPJCQMSA-N 0.000 description 1
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OMLWNBVRVJYMBQ-YUMQZZPRSA-N Arg-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O OMLWNBVRVJYMBQ-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- 210000002237 B-cell of pancreatic islet Anatomy 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241001227713 Chiron Species 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 241001136239 Cymbidium hybrid cultivar Species 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 230000007023 DNA restriction-modification system Effects 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 108010051815 Glutamyl endopeptidase Proteins 0.000 description 1
- 108010065920 Insulin Lispro Proteins 0.000 description 1
- 101710186630 Insulin-1 Proteins 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 108091027974 Mature messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- LSDPWZHWYPCBBB-UHFFFAOYSA-N Methanethiol Chemical compound SC LSDPWZHWYPCBBB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 229910004616 Na2MoO4.2H2 O Inorganic materials 0.000 description 1
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 1
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000015731 Peptide Hormones Human genes 0.000 description 1
- 108010038988 Peptide Hormones Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 101710119418 Superoxide dismutase [Mn] Proteins 0.000 description 1
- 101710202572 Superoxide dismutase [Mn], mitochondrial Proteins 0.000 description 1
- 102100032891 Superoxide dismutase [Mn], mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000001166 ammonium sulphate Substances 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- 108010068380 arginylarginine Proteins 0.000 description 1
- 210000000227 basophil cell of anterior lobe of hypophysis Anatomy 0.000 description 1
- 238000010256 biochemical assay Methods 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000003245 coal Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 1
- 229910003460 diamond Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010432 diamond Substances 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 230000004153 glucose metabolism Effects 0.000 description 1
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 1
- 229940038661 humalog Drugs 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 239000004026 insulin derivative Substances 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 230000001320 lysogenic effect Effects 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 208000030159 metabolic disease Diseases 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 230000003228 microsomal effect Effects 0.000 description 1
- 108010013359 miniproinsulin Proteins 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 230000033116 oxidation-reduction process Effects 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 239000000813 peptide hormone Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- OTYBMLCTZGSZBG-UHFFFAOYSA-L potassium sulfate Chemical compound [K+].[K+].[O-]S([O-])(=O)=O OTYBMLCTZGSZBG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910052939 potassium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 1
- 238000010405 reoxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 210000003935 rough endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N tfa trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F.OC(=O)C(F)(F)F WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XOYXELNNPALJIE-UHFFFAOYSA-N trimethylazanium phosphate Chemical compound C[NH+](C)C.C[NH+](C)C.C[NH+](C)C.[O-]P([O-])([O-])=O XOYXELNNPALJIE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
- C07K1/113—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure
- C07K1/1136—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure by reversible modification of the secondary, tertiary or quarternary structure, e.g. using denaturating or stabilising agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/62—Insulins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Emergency Medicine (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Obesity (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Hematology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Description
Oblast techniky
Předmětem vynálezu je způsob přípravy lidského insulinu, který zahrnuje sbalení hybridního polypeptidů obsahujícího proinsulin, a to za podmínek, které umožňují utvoření správných disulfidových vazeb, štěpení sbaleného polypeptidu se správně vytvořenými disulfidovými vazbami pomocí enzymů, přičemž výsledkem zmíněného enzymatického štěpení je vznik aktivního lidského insulinu, a dále purifikace tohoto aktivního lidského insulinu.
Předmětem vynálezu je dále polypeptid obsahující proinsulin a signální peptid připojený k N-konci proinsulinu, kde je tento polypeptid sbalený a obsahuje správné rozložení disulfidových vazeb.
Dosavadní stav techniky
V této přihlášce jsou odkazy k jednotlivým citacím uvedeny arabskými číslicemi v kulatých závorkách a celé citace mohou být nalezeny na konci přihlášky (před oddílem Patentové nároky).
Insulin je polypeptidový hormon, který je nezbytný pro kontrolu metabolizmu glukózy. Je denně podáván pacientům trpícím cukrovkou (diabetes melitus), což je metabolická porucha charakterizovaná nedostatečným zásobováním organizmu insulinem.
In vivo, je hormon nejprve syntetizován jako dlouhá prekurzorová molekula, která je dále přeměňována na svou biologicky aktivní formu. Tato biologicky aktivní forma se • · • ·
• · · · • · · • * · · · • · * · · • · · · • · · · skládá ze dvou řetězců, označovaných A a B. Podrobněji řečeno, gen pro preproinsulin se v β-buňkách slinivky přepisuje do prekurzorové mRNA. Tato mRNA je poté sestřižena a výsledkem tohoto sestřihu je vznik maturované mRNA, která je překládána v preproinsulin. Preproinsulin, který je možno schematicky znázornit vzorcem (NH2-pre-sekvence-řetězec B-peptid C-řetězec A-COOH), je následně přeměňován v proinsulin a nakonec v insulin. Prvním krokem přeměny je proteolytické odstranění pre-sekvence, která slouží jako signální hydřofobní sekvence pro přenos nascentního řetězce hormonu přes mikrosomální membránu drsného endoplasmatického retikula. V lidském preproinsulinu je délka této pre-sekvence 24 aminokyselinových zbytků.
V proinsulinu jsou obě oblasti polypeptidového řetězce, které posléze vytvoří maturovaný insulin, tedy řetězce A a B, navzájem spojeny peptidem C (nebo řetězcem C), který na svém N a C konci obsahuje dva páry bazických aminokyselin.
U většiny peptidů C je tento bazický pár tvořen aminokyselinami Arg-Arg nebo Lys-Arg. Lidský peptid C se, včetně obou koncových párů bazických aminokyselin, skládá z 35 aminokyselin. Peptid C spojuje dvě oblasti polypeptidů tak, aby byl usnadněn vznik disulfidového můstku mezi segmenty A a B. Úloha peptidu C proto není příliš závislá na jeho struktuře. Ve skutečnosti nahrazení tohoto peptidu kratším syntetickým můstkem stále umožňuje vlastní sbalení molekuly proinsulinu (1, 2).
Sbalení molekuly proinsulinu je doprovázeno oxidací dvou disulfidových vazeb, které se nacházejí mezi jednotlivými řetězci a jedné disulfidové vazby uvnitř řetězce A. V posledním stádiu maturace uvolní proteolytické enzymy naštěpením v místě bazických aminokyselinových zbytků peptid C a vytvoří tak maturovaný insulin (3). V lidském insulinu • · • · obsahuje řetězec A 21 aminokyselin, zatímco řetězec B je dlouhý 30 aminokyselinových zbytků.
Světová poptávka po insulinu dosahuje ročně několika tun, a tak nastává vážný nedostatek v jeho dodávkách. Tradičně se insulin připravuje z omezených zvířecích zdrojů, což jsou hlavně hovězí a vepřové pankreatické preparáty, které se liší od lidského insulinu a mohou tak vyvolat nepříznivou imunitní reakci.
Studie prováděné během šedesátých let prokázaly možnost přípravy insulinu in vitro. Syntézy insulinu bylo dosaženo kombinováním řetězců A a B v jejich S-sulfonované formě (4) nebo spontánní reoxidací redukovaného proinsulinu (5). Posledně jmenovaný způsob přípravy nebyl prakticky využitelný pro výrobu insulinu ve velkém měřítku, protože v oxidační směsi byla velmi nízká koncentrace tohoto proteinu. Insulin mohl být následně získán působením trypsinu a karboxypeptidázy B (6).
V poslední době začíná být využíván semisyntetický a biosyntetický (rekombinantní) lidský insulin. Semisyntetický lidský insulin je připravován z prasečího insulinu pomocí trypsinem katalyzované výměny treoninu za alanin v pozici 30 řetězce B (což je jediný rozdíl mezi lidským a prasečím insulinem). Rekombinantní lidský insulin připravovaný buď v bakteriích E. coli nebo v kvasinkách v budoucnosti nahradí všechny další cesty přípravy.
Biosyntetický rekombinantní lidský insulin se běžně připravuje dvěma cestami, a to buď přípravou každého z řetězců A a B zvlášť v bakteriích E. coli a jejich následnou kombinací (7, 8) nebo enzymatickou konverzí proinsulinu exprimovaného ve formě polypeptidů buď v E. coli (1, 8) nebo kvasinkách (2, 9).
Ve většině případů je proinsulin připravován ve formě hybridního proteinu, který je akumulován ve formě intrace3 • ·
lulárního precipitátu. Tento hybridní protein je purifikován běžným způsobem a štěpen pomocí CNBr tak, aby byl uvolněn polypeptid proinsulinu. Tento polypeptid proinsulinu je dále modifikován oxidativní sulfitolýzou na proinsulin ve formě S-sulfonátu. Proinsulin S-sulfonát je poté purifikován a za redukčních podmínek sbalen na proinsulin (8). Konverze proinsulinu na insulin je dosaženo kombinovaným působením trypsinu a karboxypeptidázy B (6).
Patent číslo EP 1111195691 Bl, udělený společnosti Novo Nordisk A/S popisuje proinsulin vzorce B-Lys-Arg-A a dále pak užití tohoto produktu pro přípravu insulinu v kvasinkách.
Patent číslo EP 196056 Bl, udělený společnosti Chiron Corp., popisuje protein hSOD-proinsulin produkovaný kvasinkami. Před sbalením je protein hSOD-proinsulin štěpen pomocí bromkyanu a podroben sulfitolýze.
V patentu EPO číslo 379162 popisuje společnost Hoechst skutečnost, že chybné rekombinanty (falše recombinants) prekurzoru insulinu (to jest rekombinantních produktů insulinu s nesprávnými nebo částečně nesprávnými intermolekulárními disulfidovými můstky) mohou být přeměněny na správné insulinové produkty bez toho, aby byly podrobeny sulfitolýze. Tento postup využívá reakci chybných rekombinantů ve vodném prostředí za použití nadbytku merkaptanu a za přítomnosti organického oxidačně-redukčního systému. Počáteční krok sulfitolýzy se používá, po odštěpení (chemicky nebo enzymaticky) aminokyselinových nebo peptidových zbytky z fúzních polypeptidů (což se uskutečňuje po lýze hostitelské buňky). Po tomto kroku je všech šest cysteinů nacházejících se v prekurzoru insulinu přeměněno na S-sulfonáty. V následujícím renaturačním kroku se z tohoto preinsulinu ve formě S-sulfonátu vytváří preinsulin za vzniku tří správných disulfidových můstků ve své přiroze4 • · né formě. V průběhu tohoto renaturačního kroku se vytvářejí takzvané nepravé, chybné rekombinanty.
Hoechst dále v Mezinárodním patentu PCT číslo WO 91/03550 uvádí způsob přípravy fúzních proteinů obsahujících požadovaný protein (to jest proinsulin) a vedlejší složky. Sulfitolýza se provádí před sbalením, zatímco vedlejší složka se odštěpuje průběžně po sbalení společně s C-řetězcem proinsulinu.
Hoechst dále v EP 347781 Bl popisuje, takzvaný mini proinsulin (B-Arg-A) a jeho využití pro přípravu mono-Arg insulinu a insulinu. Je zde rovněž popsán fúze proteinů zahrnujících B-Arg-A a balastní složku. Balastní složka je odštěpena pomocí bromkyanu. Sulfitolýza probíhá ještě před sbalením polypeptidu.
Předmětem vynálezu je příprava rekombinatního lidského insulinu, a to pomocí vylepšeného a účinnějšího postupu. Rekombinantní hybridní polypeptidy proinsulinu zahrnující signální sekvenci jsou syntetizovány v bakteriích E. coli. Po částečné purifikaci jsou tyto rekombinantní polypeptidy sbaleny se signálním polypeptidem, a to za takových podmínek, které dovolují správné funkční sbalení. Biologicky aktivní lidský insulin je potom připraven kombinovaným působením trypsinu a karboxypeptidázy B. Působením těchto enzymů se souběžně odštěpuje signální peptid a řetězec C. Takto připravený a purifikovaný lidský insulin je totožný s přirozeně se vyskytujícím lidským insulinem.
Nebezpečné a těžkopádné postupy zahrnující štěpení hybridních polypeptidů pomocí CNBr a sulfitolýzu, užívanou k ochraně četných SH skupin, se v novém způsobu podle vynálezu nepoužívají. Vlastní hybridní polypeptid proinsulinu se může účinně sbalit do své vlastní přirozené struktury dokonce i v přítomnosti signálního peptidu a nechráněných cysteinových zbytků. Aktivní rekombinantní lidský insulin • ·
se uvolňuje enzymatickým štěpením a je následně purifikován.
Přehled Obrázků na výkresech
V restrikčních mapách tří plazmidů zobrazených na Obrázcích 3 až 5 nejsou uvedena všechna restrikční místa přítomná na těchto plazmidech. Jsou však zobrazena všechna restrikční místa nezbytná pro úplné porozumění vynálezu.
Obrázek 1: Příprava lidského insulinu pomocí enzymatického štěpení sbaleného, disulfidovými vazbami propojeného hybridního polypeptidu proinsulinu, který byl připraven expresí z plazmidu pBAST-R. Na obrázku je uvedena pouze část signální sekvence SOD. Zkratka CPB užitá v popisu obrázku znamená označení pro karboxypeptidázu B.
Obrázek 2: Příprava lidského insulinu pomocí enzymatického štěpení sbaleného, disulfidovými vazbami propojeného hybridního polypeptidu proinsulinu, který byl připraven expresí z plazmidu pDBAST-LAT nebo z plazmidu pXBAST-LAT. Na Obrázku je uvedena pouze část signální sekvence SOD. Použitá zkratka CPB má stejný význam jako v Obrázku 1.
Obrázek 3: Struktura plazmidu pBAST-R, expresívního plazmidu kódujícího hybridní polypeptid SOD-proinsulin, uloženého v ATCC pod přístupovým číslem 69362.
Obrázek 4: Struktura plazmidu pDBAST-LAT, expresívního plazmidu kódujícího hybridní polypeptid SOD-proinsulin. Tento plazmid je uložen v ATCC a bylo mu přiděleno přístupové číslo 69361.
• · · · • · « , » « · « · · · » · · » · · 9 · » · · · · • · · · • · · ·
Obrázek 5: Struktura plazmidu pZBAST-LAT, expresivního plazmidu kódujícího hybridní polypeptid SOD-proinsulin. Tento plazmid je uložen v ATCC a bylo mu přiděleno přístupové číslo 69363.
Obrázek 6: Aminokyselinová a odpovídající nukleotidové sekvence (DNA) hybridního polypeptidu SOD-proinsulin exprimovaného z plazmidu pBAST-R.
Obrázek 7: Aminokyselinová a odpovídající nukleotidové sekvence (DNA) hybridního polypeptidu SOD-proinsulin exprimovaného z plazmidu pDBAST-LAT a pXBAST-LAT.
Obrázek 8: Příprava lidského insulinu z hybridního polypeptidu proinsulinu exprimovaného z plazmidu pBAST-R jako funkce hodnot pH směsi používané ke sbalení proteinu.
Sbalení hybridního polypeptidu proinsulinu (připraveného tak, jak je popsáno v Příkladu 2) bylo prováděno při různých hodnotách pH, tak jak je označeno na tomto obrázku a to v pufru obsahujícím 100 mM glycin, při 4°C po dobu 16 hodin s koncentrací hybridního polypeptidu buď 1 mg/ml nebo 0,5 mg/ml. Sbalený polypeptid byl vystaven působení trypsinu (1:500 w/w; Sigma) a karboxypeptidázy B (CPB, Sigma, 1:200 w/w) po dobu 30 minut při teplotě 37°C a hodnotě pH 9. Vzniklý produkt byl analyzován na přítomnost imunoreaktivního insulinu (IR) pomocí radioimunostanovení využívajícího insulin značený izotopem 125I (Amersham) a lidský rekombinantní insulin (Calbiochem) jako standardy.
Obrázek 9: Příprava lidského insulinu z hybridního polypeptidu proinsulinu exprimovaného z plazmidu pDBAST-LAT.
• ·
Hybridní polypeptid proinsulinu (připravený tak, jak je popsáno v Příkladu 2) byl rozpuštěn v pufru o složení 8M močovina, 5 mM HCI, v koncentraci přibližně okolo 30 mg/ml a poté byl naředěn na koncentraci 1 mg/ml v pufru o složení 100 mM glycin-NaOH, pH 11,0. Sbalení probíhalo při 22°C (za pokojové teploty) po dobu 20 hodin. pH roztoku bylo následně pomocí HCI upraveno na hodnotu 8,8. Do reakční směsi byla poté přidána karboxypeptidáza B (1:1000 w/w, Sigma) a trypsin (1:2000 w/w, Sigma). Reakční směs byla inkubována po dobu 60 minut při teplotě 37°C. pH této směsi bylo před ředěním 10 mM HCI upraveno na hodnotu 3. Vzorky o objemu 150 μΐ byly dále analyzovány pomocí vysokotlaké kapalinové chromatografie na koloně s reverzní fází (RP -HPLC) o rozměrech 250 x 4 mm, obsahujícím 5μ Lichrosphere 100 RP-8 (Merck). Kolona byla ekvilibrována pufrem o složení 50 mM fosforečnan trimethylamonia, 162 mM NaC104, pH 3, obsahujícím 31,5 % (v/v) acetonitrilu. Vzorky byly z kolony vymývány lineárním gradientem acetonitrilu v rozsahu koncentrací 31,5 až 40,5 % po dobu 75 minut a při průtokové rychlosti 1 ml za minutu. Proměřovala se absorbance při vlnové délce 220 nm.
Následující části Obrázku označené písmeny odpovídají.
A: 5 pg standardního insulinu (Boehringer - Mannheim)
B: připravený rekombinantní lidský insulin vystavený enzymatickému působením
C: sbalený hybridní polypeptid SOD-proinsulin
Obrázek 10: Příprava lidského insulinu z hybridního polypeptidu proinsulinu exprimovaného z plazmidu pDBAST-LAT jako funkce hodnot pH směsi používané ke sbalení proteinu
Hybridní polypeptid proinsulinu (připravený tak, jak je popsáno v Příkladu 2) byl naředěn na koncentraci 1 mg/ml v pufru o složení 100 mM glycin-NaOH s hodnotami pH vyznače8 • · nými na ose x. Sbalení probíhalo po dobu 16 hodin při 22°C. Enzymatické zpracování polypeptidu a následná RP-HPLC analýza byla provedena tak, jak bylo popsáno v popisu k obrázku 9. Množství rekombinantního lidského insulinu připraveného z hybridního polypeptidu bylo počítáno z velikosti plochy píku, který měl stejný retenční čas jako standardní insulin.
Obrázek 11: Příprava lidského insulinu z hybridního polypeptidu proinsulinu exprimovaného z plazmidu pDBAST-LAT jako funkce koncentrace kyseliny askorbové ve směsi používané ke sbalení proteinu
Sbalení hybridního polypeptidu SOD-proinsulin (připraveného podle popisu v Příkladu 2) bylo prováděno při koncentraci polypeptidu 1 mg/ml v pufru o složení 100 mM glycin-NaOH, pH 11,2 při 22°C a v přítomnosti různých koncentrací kyseliny askorbové vyznačených na obrázku. Vzorky byly vystaveny působení trypsinu a karboxypeptidázy B (tak jak je popsáno pro Obrázek 9) po dobu 5 a 25 hodin, což jsou časové periody užité ke sbalení. Produkce rekombinantního lidského insulinu byla analyzována pomocí RP-HPLC (tak jak je popsáno pro Obrázek 9).
Křivka proložená symboly trojúhelníku značí 5 hodin působení směsi enzymů. Křivka proložená kolečky označuje 25 hodin inkubace se směsí enzymů.
Obrázek 12: Ověření autenticity (pravosti) lidského insulinu připraveného z hybridního polypeptidu proinsulinu exprimovaného z plazmidu pDBAST-LAT
Sbalení hybridního polypeptidu SOD-proinsulin (připraveného podle popisu v Příkladu 2) bylo prováděno v koncentraci polypeptidu 1 mg/ml v pufru o složení 100 mM glycin-NaOH, pH 11,2 při teplotě 22°C po dobu 16 hodin a v
přítomnosti 1,2 mM kyseliny askorbové. Po provedení enzymatického štěpení (popsáno u Obrázku 9) byla směs chromatograficky rozdělena na koloně DEAE-Sepharózy, která byla ekvilibrována pufrem o složení 20 mM Tris-HCl, pH 8. Rekombinantní lidský insulin byl z kolony eluován pomocí lineárního gradientu v rozmezí koncentrací 0 až 0,4M NaCI v pufru o složení 20 mM Tris-HCl, pH 8.
Ve frakcích odpovídajících jednotlivým pikům eluovaných z kolony bylo kyselinou chlorovodíkovou upraveno pH na hodnotu 3. Rekombinantní lidský insulin byl dále čištěn ze směsi podobých molekul pomocí RP-HPLC, tak, jak je popsáno u obrázku 9. Hlavní odebraná frakce byla odsolena na koloně Sephadexu G-25 a byla převedena do roztoku 0,25 M octové kyseliny a lyofilizována. Vzorky (5 pg rekombinantního lidského insulinu) byly převedeny do 10 mM HCl a analyzovány pomocí RP-HPLC za stejných podmínek.
Následující symbolické označení částí obrázku velkými písmeny znamená popis křivek odpovídajících:
A: standardní insulin
B: lidský rekombinantní insulin purifikovaný pomocí
HPLC
C: kombinovaný vzorek obsahující rekombinantní lidský insulin purifikovaný pomocí HPLC spolu se standardním insulinem
Obrázek 13: Příprava lidského insulinu z hybridního polypeptidu proinsulinu exprimovaného z plazmidu pDBAST-LAT jako funkce koncentrace proteinu ve směsi používané k jeho sbalení.
Polypeptidový hybrid SOD-proinsulin (připravený dle popisu v Příkladu 2), jehož sbalení bylo provedeno v pufru o složení 100 mM glycin-NaOH, pH 11,2, za použití koncentrací proteinu, které se měnily v rozsahu od 0,5 mg/ml až po • · • ·
• #····*· • · · · ♦ · ···*··· ·· ·· mg/ml, tak jak je vyznačeno na obrázku. Každá ze směsí použitých ke sbalení proteinu byla doplněna 2,5 moly kyseliny askorbové na 1 mol SH skupin. Sbalování bylo prováděno při 24 °C (za pokojové teploty) po dobu 16 hodin. Enzymatické štěpení a RP-HPLC analýzy byly provedeny podle popisu uvedeného pro Obrázek 9.
Obrázek 14: Příprava lidského insulinu z hybridního polypeptidu proinsulinu exprimovaného z plazmidu pDBAST-LAT ze surového intracelulárního precipitátu jako funkce času používaného k jeho sbalení.
Intracelulární precipitát byl rozpuštěn v pufru o složení 20 mM glycin-NaOH, 33 μΜ EDTA, pH 11,2. Koncentrace rozpuštěného precipitátu byla přibližně rovna hodnotě 2,6 jednotek absorbance měřené při 280 nm na mililitr roztoku (2,6 A28o /ml) . pH bylo upraveno 10 N hydroxidem sodným na hodnotu 12. Roztok byl míchán po dobu 10 minut. pH bylo následně upraveno titrací koncentrovanou kyselinou chlorovodíkovou na hodnotu 11,2. Bylo přidáno aktivní uhlí (Sigma), promyté kyselinou, a to na výslednou koncentraci 0,1 % w/v a směs byla míchána po dobu dalších 30 minut. Suspenze byla centrifugována (20 minut, 12000 otáček/minuta) při teplotě 20°C. Částečně vyčištěný supernatant po centrifugací měl absorbanci při vlnové délce 280 nm (A2so) přibližně 2,15.
Do supernatantu byla přidána kyselina askorbová na výslednou koncentraci 3 mM. Sbalení hybridního polypeptidů proinsulinu probíhalo při pokojové teplotě (22 až 23°C) za intenzivního míchání, postupem popsaným výše.
V různých časových intervalech byly v průběhu experimentu odebírány vzorky směsi o objemu 10 ml, bylo u nich upraveno pH na hodnotu pH 8,8 a tyto vzorky byly po dobu jedné hodiny při teplotě 37°C v přítomnosti 50 μΜ ZnCl2 vystaveny působení karboxypeptidázy B (1:1000 w/w) a trypsinu (1:2000 w/w). Štěpení bylo ukončeno okyselením směsi. Obsah insulinu v každém štěpeném vzorku byl určen pomocí RP-HPLC analýzy, tak jak je popsáno u obrázku 9. Průběh reakce sbalování je zřejmý ze zvýšení hladiny insulinu (po štěpení) a snížení hladiny volných thiolových skupin, jejichž množství je určeno pomocí Ellmanovy reakce (16).
Symbolem kolečka jsou označeny body křivky závislosti koncentrace insulinu vyjádřené v % na čase sbalování, symboly kosočtverce prochází křivka závislosti koncentrace volných thiolových skupin vyjádřená v % na době trvání sbalování peptidu.
Podstata vynálezu
Plazmidy pBAST-R, pDBAST-LAT a p/BAST-LAT byly 26. července 1993 uloženy v hostitelských buňkách E. coli v souladu s Budapešťskou smlouvou o ukládání mikroorganizmů pro účely patentového řízení v depozitní sbírce kultur ATCC, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 pod přístupovými čísly 69362 (pBAST-R), 69361 (pDBAST-LAT) a 69363 (pXBAST-LAT)
Termín hybridní polypeptid, používaný v přihlášce, zahrnuje signální peptid kovalentně připojený k požadovanému polypeptidu. Hybridní polypeptid podle vynálezu obsahuje proinsulin a ve výhodném provedení obsahuje rovněž signální peptid SOD.
Termín sbalení, používaný v přihlášce, zahrnuje sbalení hybridního polypeptidu obsahujícího proinsulin, který nebyl před sbalením štěpen bromkyanem ani podroben sulfitolýze, přičemž správné sbalení umožňuje vytvoření příslušných disulfidických vazeb v hybridním polypeptidu.
Slovní spojení vytvoření správných (příslušných) disulfidických vazeb v hybridním polypeptidů , používané v přihlášce, zahrnuje vznik tří disulfidických vazeb u insulinu, a to mezi CysB7 a CysA7, CysB19 a CysA2° a mezi CysA6 a CysA11 (cysteinové zbytky jsou číslovány podle jejich číslování v maturovaném insulinu).
Termín proinsulin, používaný v přihlášce, zahrnuje polypeptid, který obsahuje ve směru od N-konce k C-konci řetězce B, C a A insulinu.
Slovní spojení peptidový řetězec C insulinu, používané v přihlášce, zahrnuje přirozeně se vyskytující peptid C a každé jiné oligopeptidy, dipeptidy nebo jednotlivé aminokyseliny, které mohou být odštěpeny působením trypsinu a karboxypeptidázy B.
Slovní spojení signální peptid, používané v přihlášce, zahrnuje každý peptid nebo polypeptid kovalentně připojený k řetězci B insulinu, který umožňuje správné sbalení a vznik příslušných (správných) disulfidických vazeb a může být odštěpen působením trypsinu. Signálním peptidem je ve výhodném provedení peptid SOD.
Termín SOD, používaný v přihlášce, zahrnuje jakoukoliv podstatnou část aminokyselinové sekvence enzymů CuZnSOD nebo MnSOD. Výše zmíněná část nemusí nutně mít stejnou biologickou aktivitu jako peptid SOD, a rovněž nemusí mít, ve srovnání s aminokyselinovou sekvencí přirozeně se vyskytujícího peptidů SOD, identickou aminokyselinovou sekvenci. DNA kódující peptid SOD může být mutována způsoby, které jsou odborníkům známé, například Bauer a další, Gene 37: 73 až 81 (1985).
Slovní spojení signální peptid může zahrnovat, namísto peptidů SOD, jakýkoliv další peptid, polypeptid nebo protein nebo každou podstatnou část aminokyselinové sekvence takového peptidů, polypeptidů nebo proteinu, kde výše
zmíněná část nutně nemusí mít biologickou aktivitu výše zmíněného peptidu, polypeptidu nebo proteinu, a rovněž nemusí mít, ve srovnání s aminokyselinovou sekvencí přirozeně se vyskytujícího peptidu, polypeptidu nebo proteinu, identickou aminokyselinovou sekvenci; signální peptid musí nicméně umožnit správné sbalení a vytvoření správných disulf idických vazeb v hybridním polypeptidu.
Termín insulin, používaný v přihlášce, může zahrnovat homolog přirozeně se vyskytujícího insulinu.
Termín proinsulin, používaný v přihlášce, může zahrnovat homolog přirozeně se vyskytujícího proinsulinu.
Termín homolog, používaný v přihlášce, vztahující se k polypeptidu insulinu produkovaného způsoby podle vynálezu, je polypeptid, který má v podstatě stejnou aminokyselinovou sekvenci a biologickou aktivitu jako insulin. Čili homolog, vzniklý způsoby podle vynálezu, se může lišit od polypeptidu insulinu přidáním, odstraněním nebo náhradou (substitucí) jednoho či více postradatelných aminokyselinových zbytků za předpokladu, že u vzniklého polypeptidu je zachována biologická aktivita insulinu. Odborníci mohou snadno určit, jaké aminokyselinové zbytky mají být přidány, odstraněny nebo nahrazeny (včetně toho pomocí jakých aminokyselin se takové náhrady mají provést) pomocí zavedených známých postupů. Takovými postupy jsou například postupy navržení a zhotovení sekvence DNA kódující gen pro bakteriální expresi polypeptidových homolog polypeptidu podle vynálezu, modifikace cDNA a genomových sekvencí pomocí místně specifických mutagenezí, konstrukce rekombinantních proteinů a expresívních vektorů, bakteriální exprese polypeptidů a měření biochemické aktivity polypeptidů použitím obvyklých biochemických stanovení.
Shora uvedené definice homolog insulinu platí stejně pro homologa proinsulinu.
• ·
Příkladem homolog insulinu, vytvořených způsoby podle vynálezu, jsou deleční homologa neobsahující všechny aminokyselinové zbytky přirozeně se vyskytujícího insulinu, substituční homologa, kde je jeden nebo přesně stanovený počet zbytků nahrazen jinými zbytky a adiční homologa, kde je přidán jeden nebo více aminokyselinových zbytků ke koncové nebo prostřední části polypeptidu insulinu, přičemž všechna tato homologa mají biologickou aktivitu insulinu.
Příklady homolog jsou analoga insulinu popsaná v Přihlášce EP 384472 a také analog insulinu Humalog od firmy Eli Lilly, jak byl popsán v Eli Lilly and Company Report to Shareholders 1992.
Slovní spojení v podstatě stejné aminokyselinové sekvence, definované v přihlášce, zahrnuje substituce a/nebo delece a/nebo přidání aminokyselin do aminokyselinové sekvence a může zahrnovat až deset zbytků, které odpovídají homologickým nebo ekvivalentním skupinám, jak bylo popsáno například v publikacích Albert L. Lehninger, Biochemistry, druhé vydání, Worth Publishers lne. (1975), kapitola 4; Creighton, Protein Structure, a Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford, England (1989); Margaret O. Dayhoff, Atlas of Protein Sequence and Structure, Svazek 5, The National Biomedical Research Foundation (1972), kapitola 9. Takové substituce jsou odborníkům známé .
DNA kódující polypeptid insulinu může být mutována odborníkům známými způsoby, popsanými například v publikaci Bauer a další, Gene 37: 73 až 81 (1985). Mutovaná sekvence může být vložena do vhodných expresívních vektorů (popsaných v přihlášce), které jsou zavedeny do buněk a zpracovány tak, že mutovaná DNA umožňuje expresi polypeptidového homologu.
• · • · · · · · ······· ·· ··
Plazmidy podle vynálezu, které obsahují sekvenci kódující hybridní polypeptid obsahující proinsulin, mohou být upraveny pro expresi v bakteriích, kvasinkách, houbách nebo živočišných buňkách jako jsou CHO (buňky křeččích ovárií), embryo kuřat, fibroblasty nebo další známé buněčné linie. Tyto plazmidy navíc obsahují regulační prvky nutné pro expresi introdukovaného genu v baktériích, kvasinkách, houbách nebo v savčích buňkách, které jsou tak vzájemně umístěny vzhledem ke genu hybridního polypeptidu takovým způsobem, aby byla umožněna jeho exprese. Regulační prvky nutné pro expresi zahrnují promotorovou sekvenci pro navázání RNA polymerázy a ribozomální vazebné místo pro navázání na ribozom.
Z plazmidů podle vynálezu je exprimován hybridní polypeptid obsahující proinsulin.
Odborníci porozumí, že plazmidy uložené ve spojitosti s touto přihláškou mohou být snadno pozměněny známými postupy (například místně specifickou mutagenezí nebo vložením linkerů) tak, aby byl kódován gen pro expresi homologních polypeptidů. Takové postupy jsou popsány například v publikaci Sambrook, J., Fritsch, E. F. a Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. vydání, Cold Spring Harbor Laboratory Press.
V plazmidu jsou vhodné regulační prvky umístěny, vzhledem k DNA kódující hybridní polypeptid zahrnující proinsulin tak, aby řídily expresi hybridního polypeptidu ve vhodné hostitelské buňce. Ve výhodném provedení vynálezu jsou tyto regulační prvky umístěny v protisměru transkripce v blízkosti DNA kódující hybridní polypeptid.
Různá ribozomální vazebná místa (ribosomal binding sites-RBS), například deo RBS, umožňují mRNA kódující hybridní polypeptid obsahující proinsulin (přepsané z DNA) vázat se v hostitelské buňce na ribozómy, a jsou rovněž předmětem vynálezu.
Plazmidy podle vynálezu také obsahují iniciační kodon ATG. DNA kódující hybridní polypeptid zahrnující proinsulin je ve stejném čtecím rámci s iniciačním kodonem ATG.
Plazmidy podle vynálezu také zahrnují sekvenci DNA obsahující počátek replikace z takového bakteriálního plazmidu, který je schopen autonomní replikace v hostitelské buňce. Vhodné počátky replikace mohou být získány z různých zdrojů, například z plazmidu pBR322 (v ATCC pod přístupovým číslem 37017).
Plazmidy podle vynálezu také zahrnují sekvenci DNA obsahující gen, který je spojený se selektivním nebo fenotypovým znakem, který se projeví tehdy, je-li plazmid přítomen v hostitelské buňce, jako například gen pro rezistenci vůči nějakému antibiotiku, například vůči ampicilinu, chloramfenikolu nebo tetracyklinu.
Příkladem vektorů, které mohou být použity pro expresi DNA kódující hybridní polypeptidy (obsahující proinsulin) jsou viry, příkladem jsou bakteriální viry, například bakteriofágy (například bakteriofág lambda), kosmidy, plazmidy a jiné vektory. Do vhodných vektorů jsou, postupy v současnosti dobře známými, vloženy geny kódující hybridní polypeptidy zahrnující proinsulin. Například využitím konvenčních míst pro restrikční endonukleázy může být vektor a inzert štěpen za vzniku komplementárních konců párujících se navzájem a pomocí DNA ligázy jsou tyto fragmenty spojeny dohromady. Další možností je využití syntetických linkerů obsahujících sekvenci bází komplementární k restrikčnímu místu na vektorové DNA. Tyto linkery mohou být připojeny k inzertu DNA a následně štěpeny restrikčním enzymem štěpícím v tomto místě. Jsou rovněž použitelné další způsoby.
• · · · • ·
Z bakteriálních hostitelských buněk jsou upřednostňovány buňky E. coli. Příkladem vhodných buňek E. coli jsou kmeny ΞΦ733 (cytRstrA) nebo 4300, avšak jako hostitelé pro plazmidy mohou být použity i další kmeny E. coli nebo jiné baktérie.
Jako hostitelé mohou být použity jakékoliv baktérie, včetně auxotrofních (například A1645), fototrofních (například A4255) a lyzogenních kmenů; kmenů F+ a F; kmenů obsahující sekvenci represoru cl857 z profága λ (například A1645 a A4255) a kmenů postrádajících represory deo a/nebo gen deo (viz Přihláška EP č. 0303972, publikovaná 22. února 1989) . Kmeny E. coli ΞΦ733 a 4300 byly uloženy v ATCC pod přístupovým číslem 69361 resp. 69363.
Všechny hostitelské kmeny E. coli popsané výše mohou být zbaveny plazmidů, které obsahují, postupy v současnosti dobře známými, například metodou s využitím ethidiumbromidu popsanou v publikaci R. P. Novick: Bacteriol. Review 33, 210 (1969).
Vynález popisuje způsob produkce insulinu, což zahrnuje správné sbalení hybridního polypeptidu obsahující proinsulin v podmínkách, které umožňují vytvoření příslušných disulfidických vazeb, vystavení sbaleného hybridního polypeptidu obsahujícího tyto disulfidové vazby působení enzymů, jejichž činností dojde ke vzniku insulinu a purifikaci insulinu. Takto získaný insulin má stejnou aktivitu a vlastnosti jako komerčně dostupný lidský insulin.
Ve výhodném provedení vynálezu krok sbalení zahrnuje inkubaci hybridního polypeptidu při přibližně 4 až 37°C po dobu 1 až 30 hodin v roztoku o pH přibližně 8,5 až 12,0.
V jiném výhodném provedení vynálezu krok sbalení zahrnuje inkubaci hybridního polypeptidu při přibližně 4 až • * • · • · · · · · ······· ·· · ♦
37°C po dobu 1 až 30 hodin v roztoku o pH přibližně 8,5 až 12,0 za přítomnosti kyseliny askorbové.
Ve zvláště výhodném provedení vynálezu je během kroku sbalení pH v rozmezí 11,0 až 11,25.
V jiném zvláště výhodném provedení vynálezu je koncentrace kyseliny askorbové přibližně 2 moly na jeden mol skupin SH přítomných ve směsi, ve které dochází ke sbalení polypeptidu.
V ještě jiném výhodném provedení vynálezu je doba inkubace přibližně 5 hodin.
V jiném provedení vynálezu zahrnuje proces přípravy insulinu upravení pH roztoku na hodnotu přibližně 8,8 až 9,0 a štěpení hybridního polypeptidu působením trypsinu a karboxypeptidázy B při teplotě 16 až 37°C po dobu v rozmezí 30 minut až 16 hodin.
V jiném provedení vynálezu zahrnuje proces čištění chromatografií na DEAE-Sepharóze a metodu RP-HPLC.
V ještě jiném provedení vynálezu zahrnuje proces čištění dále ultrafiltraci a chromatografií na CM-Sepharóze.
V jiném zvláště výhodném provedení vynálezu je hybridní polypeptid proinsulinu exprimován z plazmidu pDBAST-LAT uloženého v ATCC pod přístupovým číslem 69361.
V jiném zvláště výhodném provedení vynálezu je hybridní polypeptid proinsulinu exprimován z plazmidu pÁBAST-LAT uloženého v ATCC pod přístupovým číslem 69363.
V jiném provedení vynálezu je hybridní polypeptid proinsulinu exprimován z plazmidu pBAST-R uloženého v ATCC pod přístupovým číslem 69362
Ve výhodném provedení vynálezu je hybridní polypeptid získán působením na bakteriální buňky obsahující DNA kódující hybridní polypeptid, přičemž toto působení vede k ex19 • * * presi zmíněné DNA. Dalším krokem je získání hybridního polypeptidu z těchto buněk.
Zmíněné působení zahrnuje fermentaci v přítomnosti glukózy, glycerolu nebo galaktózy.
Dále se počítá s tím, že proces získání hybridního polypeptidu z buněk zahrnuje rozrušení buněčné stěny bakteriálních buněk nebo jejich částí za vzniku lyzátů, oddělení intracelulárního precipitátu od lyzátů pomocí centrifugace, solubilizaci precipitátu a možnost čištění hybridního polypeptidu chromatografií nebo ultrafiltrací.
Vynález dále popisuje polypeptid obsahující proinsulin a signální peptid připojený k N-konci proinsulinu, kde je zmíněný polypeptid správně sbalen a obsahuje odpovídající (správné) disulfidické vazby.
Ve výhodném provedení vynálezu je signální peptid odvozen od N-koncové oblasti CuZnSOD.
Ve zvláště výhodném provedení vynálezu obsahuje signální peptid sekvenci 62 aminokyselin, kterým předchází methionin a po nichž následuje arginin.
Ve výhodném provedení vynálezu obsahuje proinsulin řetězec B insulinu spojený s řetězcem A insulinu pomocí jediného argininového zbytku.
V jiném provedení vynálezu obsahuje proinsulin řetězec B insulinu spojený s řetězcem A insulinu pomocí dipeptidu Lys-Arg.
Výše zmíněné dvě molekuly proinsulinu musí být produkovány ve formě hybridních proteinů, jinak jsou hladiny exprese extrémně nízké a komerčně nevýznamné.
Ve všech výhodných provedeních vynálezu byly cysteinové zbytky v signálním peptidu nahrazeny serinovými zbytky.
·· · ·
Příklady provedení vynálezu
Následující Příklady provedení vynálezu jsou uvedeny za účelem snazšího porozumění vynálezu, a nejsou zamýšleny a ani by neměly být interpretovány, jako nějaká omezení vynálezu. V Příkladech provedení vynálezu nejsou uvedeny detailní popisy konvenčních způsobů využívaných při konstrukci vektorů, vkládání genů kódujících polypeptidy do takových vektorů nebo vnášení takto vzniklých plazmidů do hostitelských buněk. V Příkladech provedení vynálezu nejsou rovněž uvedeny detailní popisy konvenčních způsobů využívaných při analýze polypeptidů produkovaných z těchto vektorů umístěných v hostitelských buňkách. Tyto způsoby jsou odborníkům dobře známy a jsou popsány v řadě publikací včetně například následující publikace:
Sambrook J., Fritsch E. F. a Maniatis T. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. vydání, Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Příklad 1
Konstrukce expresívních plazmidů pBAST-R, pDBAST-LAT a pÁBAST-LAT exprimujících hybridní polypeptidy SODproinsulin .
Byly vytvořeny bakteriální expresívní vektory, které v nadměrné míře v buňkách E. coli produkují hybridní proteiny, přičemž exprese je řízena promotory PiP2 nebo ÁPL. Jelikož bylo zjištěno, že baktérie nesoucí expresívní vektor kódující řetězec B insulinu-Lys-Arg-řetězec A insulinu neprodukují tento polypeptid v detekovatelném množství, byl proinsulin produkován jako hybridní protein. Tyto hybridní proteiny obsahují signální peptid o délce 62 aminokyselin je odvozen od N-konce sekvence CuZnSOD (11), přičemž tomuto signálnímu peptidu předchází methioninový aminokyselinový zbytek a na C-konci je následován argininovým aminokyselinovým zbytkem, který jej připojuje k řetězci B insulinu. Řetězec B je k řetězci A insulinu připojen krátkým peptidem řetězce C, který obsahuje Lys-Arg nebo Arg. Dva cysteiny původně přítomné v oblasti SOD byly nahrazeny serinovými zbytky.
A. Plazmid pBAST-R
Byla vytvořena série plazmidů na jejímž konci je plazmid pBAST-R, který byl poté, co jím byly transformovány vhodné hostitelské buňky E. coli, schopný řídit expresi hybridního polypeptidu proinsulinu použitelného k produkci lidského insulinu.
Struktura plazmidu pBAST-R, který kóduje hybridní polypeptid SOD-řetězec B insulinu-Lys-Arg-řetezec A insulinu, je zobrazena na Obrázku 3; sekvence DNA a odpovídající aminokyselinová sekvence jsou zobrazeny na Obrázku 6.
Plazmid pBAST-R má velikost přibližně 4380 bp a obsahuje následující části (proti směru hodinových ručiček):
1. Fragment DNA o velikosti 1521 párů bází zahrnující oblast plazmidu pBR322 ohraničenou restrikčními místy AatlI-MscI, která obsahuje gen pro rezistenci vůči tetracyklinu.
2. Fragment DNA o velikosti 1497 párů bází zahrnující oblast plazmidu pBR322 ohraničenou restrikčními místy Scal-Haell, která obsahuje zkrácený gen pro rezistenci vůči ampicilinu a počátek replikace DNA.
• 9 • ·
3. Fragment DNA o velikosti 930 párů bází zahrnující oblast DNA bakterií E. coli ohraničenou restrikčními místy Avall-Ndel, která obsahuje promotory deo ΡχΡ2 a ribozomální vazebné místo (RBS) (13).
Fragment DNA o velikosti 188 lidské cDNA kódující CuZnSOD místy Ndel-PpuMI. Cysteiny v ném SOD byly nahrazeny, s vyu tageneze oligonukleotidů (12) párů bází zahrnující oblast ohraničenou restrikčními pozicích 6 a 57 v maturovažitím místně specifické mu, serinovými zbytky.
5. Uměle připravený fragment DNA o velikosti 172 párů bází ohraničený restrikčními místy PpuMI-BamHI. Tato oblast kóduje Arg-řetězec B insulinu-Lys-Arg-řetězec A insulinu.
6. Uměle připravený polylinker o velikosti 36 párů bází obsahující množství klonovacích míst a ohraničený restrikčními místy BamHI a HindlII.
7. Uměle připravený oligonukleotid o velikosti 44 párů bází obsahující terminátor transkripce TrpA a ohraničený restrikčními místy HindlII a AatlI (10).
Plazmid pBAST-R, který nese gen pro rezistenci vůči tetracyklinu, a který kóduje hybridní polypeptid SOD-řetězec B insulinu-Lys-Arg-řetězec A insulinu, byl vnesen do buněk E. coli kmene βΦ733 (cytRstrA) a 26. července 1993 uložen v ATTC pod přístupovým číslem 69362.
···· ··♦ • · ····· · * · ·· ·» ·· ···· • · ...» · · .«· ........ ··
B. Plamid pDBAST-LAT
Byla vytvořena jiná série plazmidu na jejímž konci je plazmid pDBAST-LAT, který byl poté, co jím byly transformovány vhodné hostitelské buňky E. coli, schopný řídit vysokou hladinu exprese hybridního polypeptidu proinsulinu použitelného k produkci lidského insulinu.
Struktura plazmidu pDBAST-LAT, který kóduje hybridní polypeptid SOD-řetězec B insulinu-Arg-řetezec A insulinu, je zobrazena na Obrázku 4; sekvence DNA a odpovídající aminokyselinová sekvence jsou zobrazeny na Obrázku 7.
Plazmid pBAST-R má velikost přibližně 4377 bp a obsahuje následující části (proti směru hodinových ručiček):
1. Fragment DNA o velikosti 1521 párů bází zahrnující oblast plazmidu pBR322 ohraničenou restrikčními místy AatlI-MscI, která obsahuje gen pro rezistenci vůči tetracyklinu.
2. Fragment DNA o velikosti 1497 párů bází zahrnující oblast plazmidu pBR322 ohraničenou restrikčními místy Scal-Haell, která obsahuje zkrácený gen pro rezistenci vůči ampicilinu a počátek replikace DNA.
3. Fragment DNA o velikosti 930 párů bází zahrnující oblast DNA baktérií E. coli ohraničenou restrikčními místy Avall-Ndel, která obsahuje promotory deo ΡχΡ2 a ribozomální vazebné místo (RBS) (13).
4. Fragment DNA o velikosti 188 párů bází zahrnující oblast lidské cDNA kódující CuZnSOD ohraničenou restrikčními místy Ndel-PpuMI. Cysteiny v pozicích 6 a 57 v maturovaném SOD byly nahrazeny, s využitím místně specifické mu24 • · · · « » « • · ' tageneze oligonukleotidů (12), serinovými zbytky a obsah párů CG v tomto fragmentu byl, rovněž s využitím místně specifické mutageneze oligonukleotidů (12), snížen na 38%.
5. Uměle připravený fragment DNA o velikosti 169 párů bází ohraničený restrikčními místy PpuMI-BamHI. Tato oblast kóduje Arg-řetězec B insulinu-Arg-řetězec A insulinu.
6. Uměle připravený polylinker o velikosti 36 párů bází obsahující množství klonovacích míst a ohraničený restrikčními místy BamHI a HindlII.
7. Uměle připravený oligonukleotid o velikosti 44 párů bází obsahující terminátor transkripce TrpA a ohraničený restrikčními místy HindlII a AatlI (10).
Plazmid pDBAST-LAT, který nese gen pro rezistenci vůči tetracyklinu, a který kóduje hybridní polypeptid SODřetězec B insulinu-Arg-řetězec A insulinu, byl vnesen do buněk E. coli kmene ΞΦ733 (cytRstrA) a 26. července 1993 uložen v ATTC pod přístupovým číslem 69361.
C. Plazmid pXBAST-LAT
Byla vytvořena jiná série plazmidů na jejímž konci je plazmid ρλΒΑδΤ-LAT, který byl poté, co jím byly transformovány geneticky upravené hostitelské buňky E. coli (nesoucí represor cl857), schopný řídit vysokou hladinu exprese hybridního polypeptidů proinsulinu použitelného k produkci lidského insulinu.
• · • · • · • · · · • * « • · ’
Struktura plazmidu pÁBAST-LAT, který kóduje hybridní polypeptid SOD-řetězec B insulinu-Arg-řetezec A insulinu, je zobrazena na Obrázku 5; sekvence DNA a odpovídající aminokyselinová sekvence jsou zobrazeny na Obrázku 7.
Plazmid pXBAST-LAT má velikost přibližně 3777 bp a obsahuje následující části (proti směru hodinových ručiček):
1. Fragment DNA o velikosti 1521 párů bází zahrnující oblast plazmidu pBR322 ohraničenou restrikčními místy AatlI-MscI, která obsahuje gen pro rezistenci vůči tetracyklinu.
2. Fragment DNA o velikosti 1497 párů bází zahrnující oblast plazmidu pBR322 ohraničenou restrikčními místy Scal-Haell, která obsahuje zkrácený gen pro rezistenci vůči ampicilinu a počátek replikace DNA.
3. Fragment DNA o velikosti 330 párů bází zahrnující oblast plazmidu pSODal3 (14) ohraničenou restrikčními místy BamHI-EcoRI, která obsahuje promotor XPL a fragment o velikosti 30 párů bází obsahující ribozomální vazebné místo (RBS) ohraničený restrikčními místy AvrlI-Ndel.
4. Fragment DNA o velikosti 188 párů bází zahrnující oblast lidské cDNA kódující CuZnSOD ohraničenou restrikčními místy Ndel-PpuMI. Cysteiny v pozicích 6 a 57 v maturovaném SOD byly nahrazeny, s využitím místně specifické mutageneze oligonukleotidů (12), serinovými zbytky a obsah párů CG v tomto fragmentu byl, rovněž s využitím místně specifické mutageneze oligonukleotidů (12), snížen na 38%.
• · · · · * ··«· · * · ·
5. Uměle připravený fragment DNA o velikosti 169 párů bází ohraničený restrikčními místy PpuMI-BamHI. Tato oblast kóduje Arg-řetězec B insulinu-Arg-řetězec A insulinu.
6. Uměle připravený polylinker o velikosti 36 párů bází obsahující množství klonovacích míst a ohraničený restrikčními místy BamHI a Hindlll.
7. Uměle připravený oligonukleotid o velikosti 44 párů bází obsahující terminátor transkripce TrpA a ohraničený restrikčními místy Hindlll a AatlI (10).
Plazmid pkBAST-LAT, který nese gen pro rezistenci vůči tetracyklinu, a který kóduje hybridní polypeptid SODřetězec B insulinu-Arg-řetězec A insulinu pod kontrolou promotoru ÁPL, byl vnesen do buněk E. coli kmene 4300 (F-, bio, cl857) a 26. července 1993 uložen v ATTC pod přístupovým číslem 69363.
Bakteriální buňky byly množeny při 30°C. Produkce hybridních polypeptidů byla indukována zvýšením teploty na 42°C.
Příklad 2
Fermentace, podmínky růstu a purifikace hybridních polypeptidů proinsulinu.
i. Zásobní kultury
Zásobní kultura buněk E. coli kmene S<í>733 nesoucí plazmid pDBAST-LAT (nebo pBAST-R) byla pěstována v kaseinovém médiu (20 g/litr hydrolyzátu kaseinu, 10 g/litr kvasničného hydrolyzátu a 5 g/litr NaCl) doplněném tetracykli27 • · nem (10 mg/litr). Buněčné kultury byly následně dvakrát zředěny zamražovacím médiem a skladovány při -80°C.
Zamražovací médium:
K2HPO4
KH2PO4 citronan sodný MgSO4.7H2O (NH4)2SO4 glycerol celkový objem
6,3 gramů 1,8 gramů 0,45 gramů 0,09 gramů 0,9 gramů 44 gramů 500 ml
11. Inokulum (kultura pro zaočkování)
Kultura pro zaočkování byla pomnožena v médiu pro produkci peptidů (viz. dále). Sterilní médium umístěné v kultivačních lahvích bylo zaočkováno ze zásobní kultury a inkubováno po dobu 15 hodin na třepačce při 37°C a rychlosti třepání přibližně 200 ot./min. Bylo-li to zapotřebí, byly následující fáze kultivace buněk prováděny za stálého třepání ve provzdušněných fermentorech. Pomocí 2 až 10% kultury z kultivačních lahví bylo inokulováno sterilní médium a takto inokulované médium bylo za stálého třepání a přívodu vzduchu (aby byla udržována hladina rozpuštěného kyslíku nad 20% nasycení vzduchem) inkubováno po dobu 15 hodin při 37°C při pH 7±0,5.
ni. Produkce peptidů (exprese)
Médium pro produkci peptidů:
K2HPO4 8 g/litr ······· ··
| KH2PO4 | 2 g/litr |
| citronan sodný | 2 g/litr |
| NH4CI | 3 g/litr |
| K2SO4 | 0,6 g/litr |
| FeSO4.7H2O | 0,04 g/litr |
| MgSO4.7H2O | 0,4 gramů |
| CaCl2.2H2O | 0,02 g/litr |
| roztok stopových | prvků 3 ml/litr |
| tetracyklin | 0,01 g/litr |
| glukóza | 2 g/litr |
| glycerol | 1 ml/litr |
| Roztok stopových | prvků: |
| MnSO4.H2O | 1 g/litr |
| ZnSO4.7H2O | 2,78 g/litr |
| CoC12.7H20 | 2 g/litr |
| Na2Mo04.2H2O | 2 g/litr |
| CaCl2.2H2O | 3 g/litr |
| CuSO4.5H2O | 1,85 g/litr |
| H3BO3 | 0,5 g/litr |
| HCl (32%) | 100 ml/litr |
Médium pro produkci polypeptidů bylo zaočkováno pomocí 0,5 až 10% kultury pro inokulaci a inkubováno při 37°C. Rychlost třepání a rychlost přísunu vzduchu byly nastaveny tak, aby byla udržována hladina rozpuštěného kyslíku na hodnotě 20% nasycení vzduchem. pH bylo udržováno pomocí NH3 na hodnotě 7±0,2.
K médiu byly, za účelem dodání energetického zdroje a zdroje uhlíku, přidány sterilní roztoky glukózy (50% roztok) a glycerolu (30% roztok). Jakmile dosáhla koncentrace • · buněk hodnoty OD66o=25, byly do média přidány sterilní roztoky glukózy (10% roztok) a glycerolu (30% roztok) a růst pokračoval dalších přibližně 5 hodin, až koncentrace buněk dosáhla přibližně hodnoty OD660=60 . Kultura byla následně ochlazena a buňky byly odděleny centrifugaci. Fermentace buněk E. coli za přítomnosti buď glukózy, glycerolu nebo galaktózy nebo jejich směsí jako zdroje uhlíku, usnadňovala expresi hybridních polypeptidů SOD-proinsulin.
iv. Purifikace
Hybridní polypeptidy SOD-proinsulin exprimované z plazmidů pBAST-R a pDBAST-LAT se hromadily v intracelulárním precipitátů (sraženině), odkud byly izolovány následujícím postupem: bakteriální peleta o hmotnosti 1 gram (hmotnost před vysušením) byla rozsuspendována v 10 ml pufru obsahujícím 50 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA, pH 8, a vzniklá suspenze byla na 2 hodiny při 37°C vystavena působení lysozymu (Merck, 2500 jednotek/ml). Následně byla směs sonikována a byl do ní přidán Nonidet-P-40 (Sigma) nebo Triton-X100 na výslednou koncentraci 2% a směs byla míchána při pokojové teplotě po dobu 2 hodin. Precipitát byl izolován centrifugací a promyt vodou.
Hybridní polypeptidy byly, s využitím chromatografie na anexu, purifikovány téměř do homogenity následovně. Precipitát byl rozpuštěn v pufru o složení 8M močovina, 20 mM Tris-HCl, 200 mM β-merkaptoethanol, pH 8,2. Vzniklý roztok byl vyčeřen centrifugaci a nanesen na kolonu Fast-Flow s DEAE-Sepharózou (Pharmacia LKB) předem ekvilibrovanou v pufru o složení 8M močovina, 20 mM Tris-HCl, 20 mM βmerkaptoethanol, pH 8,2. Materiál proteklý kolonou byl zachycen a hybridní protein byl vysrážen pomocí (NH4)2SO4 při 40% saturaci (nasycení) nebo zakoncentrován ultrafiltrací na membráně 10K, Poté následovala diafiltrace proti roztoku 100 mM glycin-HCl, pH 3,1.
V jiném postupu byl hybridní polypeptid SOD-proinsulin exprimovaný z plazmidu pBAST-R purifikován téměř do homogenity rozpuštěním v pufru o složení 8M močovina, 20 mM dithiothreitol, 50 mM octan sodný, pH 5 a následnou ultrafiltrací přes membrány 100 kD a 50 kD (Filtron). Tento hybridní polypeptid byl zakoncentrován na membráně 10 kD a vysrážen pomocí (NH4)2SO4 při 40% saturaci.
Příklad 3
Sbalení a enzymatické štěpení hybridních polypeptidů SOD-proinsulin
Hybridní polypeptidy proinsulinu, získané vysrážením pomocí (NH4)2SO4 nebo ultrafiltrací (Příklad 2), byly rozpuštěny v pufru o složení 8M močovina, 5 mM HCI a zředěny do pufru obsahujícího 100 mM glycin, pH 8,5 až 12,0 tak, aby výsledná koncentrace polypeptidů byla přibližně 1 mg/ml.
A. Aby bylo umožněno vytvoření správných disulfidových vazeb, probíhalo sbalení hybridního polypeptidu SODproinsulin, exprimovaného z plazmidu pBAST-R, při teplotě přibližně 4 až 37°C po dobu 1 až 24 hodin.
pH roztoku obsahujícího sbalený hybridní polypeptid se správně vytvořenými disulfidovými vazbami bylo pomocí HCI upraveno na hodnotu přibližně 8,8 až 9,0 a protein byl při 16 až 37°C po dobu 30 až 120 minut vystaven působení trypsinu a karboxypeptidázy B.
Po provedení velkého množství experimentů bylo zjištěno, že optimální podmínky jsou následující: hybridní polypeptid exprimovaný z plazmidu pBAST-R byl rozpuštěn v ·: · : » · · « · · · · * • · · » » * ««·««·« ·· · · pufru o složení 8M močovina, 5 mM HCl a zředěn do pufru obsahujícího 100 mM glycin o pH 11 (Obrázek 8) tak, aby výsledná koncentrace polypeptidů byla přibližně 1 mg/ml. Následovalo sbalování hybridního polypeptidu při 25°C po dobu 6 až 16 hodin a poté byl sbalený hybridní polypeptid se správně vytvořenými disulfidovými vazbami při 37°C po dobu 30 až 60 minut štěpen trypsinem (1:500 w/w) a karboxypeptidázou B (1:200 w/w).
Vznik insulinu ze sbaleného hybridního polypeptidu, se správně vytvořenými disulfidovými vazbami, exprimovaného z plazmidu pBAST-R enzymatickým štěpením je schematicky znázorněn na Obrázku 1.
B. Aby bylo umožněno vytvoření správných disulfidových vazeb, probíhalo sbalení hybridního polypeptidu SODproinsulin, exprimovaného z plazmidu pDBAST-LAT, při teplotě přibližně 7 až 31°C po dobu 5 až 30 hodin. pH roztoku obsahujícího sbalený hybridní polypeptid se správně vytvořenými disulfidovými vazbami bylo pomocí HCl upraveno na hodnotu přibližně 8,8 až 9,0 a protein byl při 22 až 37°C po dobu 30 minut až 16 hodin vystaven působení trypsinu a karboxypeptidázy B.
Po provedení velkého množství experimentů bylo zjištěno, že optimální podmínky jsou následující: hybridní polypeptid exprimovaný z plazmidu pBAST-R byl rozpuštěn v pufru o složení 8M močovina, 5 mM HCl a zředěn do pufru obsahujícího 100 mM glycin o pH 11,0 až 11,25 (Obrázek 8) tak, aby výsledná koncentrace polypeptidů byla přibližně 1 mg/ml. Následovalo sbalování hybridního polypeptidu při 25°C po dobu 5 hodin a poté byl sbalený hybridní polypeptid se správně vytvořenými disulfidovými vazbami při 25°C po dobu 16 hodin štěpen trypsinem (1:15000 w/w) a karboxypeptidázou B (1:10000 w/w).
• · • ·
Vznik insulinu ze sbaleného hybridního polypeptidu, se správně vytvořenými disulfidovými vazbami, exprimovaného z plazmidu pDBAST-LAT enzymatickým štěpením je schematicky znázorněn na Obrázku 2.
Příklady specifických podmínek pro výše zmíněné postupy A. a B. jsou detailně popsány v Popisu obrázků na Výkresech, Obrázky 8 až 14.
Příklad 4
Proteinová analýza a purifikace lidského insulinu produkovaného z hybridního polypeptidu SOD-proinsulin exprimovaného z plazmidu pBAST-R
Tvorba lidského insulinu z hybridního polypeptidu SODproinsulin exprimovaného z plazmidu pBAST-R byla analyzována radioimunostanovením (RIA) a HPLC na obrácené fázi (RPHPLC) za použití komerčně dodávaného lidského insulinu jako standardu (Calbiochem). Teoretický výtěžek rekombinatního lidského insulinu, jak byl vypočítán z aminokyselinové sekvence hybridního polypeptidu proinsulinu, je 45,6%. Z Obrázku 8 je zřejmé, že optimální pH pro správné sbalení je 11. Při této hodnotě pH odpovídá množství vytvořeného insulinu přibližně 80% teoretického výtěžku (který odpovídá přibližně 40% hybridního polypeptidu na počátku). Lidský insulin produkovaný z hybridního polypeptidu proinsulinu exprimovaného z plazmidu pBAST-R byl detekován pomocí RPHPLC. Byla použita kolona Vydac 218TP54 o rozměrech 250 x 4,6 mm (vnitřní průměr, separační kolona), 5 pm, velikost pórů 30 nm a měření probíhalo při pokojové teplotě při průtoku 1 ml/min. Jako eluant A byla použita 0,1% kyselina trifluoroctová (TFA) v H20 a jako eluant B byla použita 0,08% kyselina trifluoroctová v acetonitrilu. Kolona byla • «I
po dobu 5 minut promývána ekvilibračním pufrem (25% eluant B) a poté, v intervalu 37,5 minut, následovalo promývání gradientem eluantu B v rozmezí 25 až 50% objemu. Absorbance byla sledována při vlnových délkách 220 nm a 280 nm. Analýza lidského insulinu, která byla pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie s kolonou s obrácenou fází prováděna po enzymatickém štěpení sbaleného hybridního polypeptidu se správně vytvořenými disulfidovými vazbami, odhalila hlavní pík s retenčním časem odpovídajícím retenčnímu času standardního lidského insulinu.
Byly připraveny dvě malé šarže lidského insulinu s výtěžky 13 mg. Lidský insulin byl purifikován z roztoku vystaveného působení enzymů (pH 9) s využitím ultrafiltrace přes membrány 3K nebo 5K (Filtron) následované chromatografií na sloupci CM-Sepharózy (citrátový pufr, pH 3). Hlavní frakce byly odsoleny, lyofilizovány a byla v nich určena aminokyselinová analýza a N-koncová aminokyselinová sekvence. Aminokyselinové složení obou vzorků rekombinantního lidského insulinu bylo v podstatě identické s přirozeně se vyskytujícím lidským insulinem (Tabulka 1, vzorek 1). Sekvence 5 aminokyselin na N-konci vzorků insulinu byla stanovena Edmanovým odbouráváním. Tyto sekvence se ukázaly být identické s N-konci jak řetězce A, tak řetězce B lidského insulinu, což potvrdilo autenticitu produktu připraveného in vitro.
Výsledky sekvenace nicméně rovněž ukázaly přítomnost argininového zbytku na první pozici a tento se vyskytoval u přibližně 25% molekul (nevyskytuje se u standardního lidského insulinu). Tento výsledek odpovídá štěpení trypsinem mezi argininem a lysinem uvnitř spojovací sekvence Lys-Arg, které zanechá argininový zbytek na N-konci řetězce A.
Bylo zjištěno, že specifické hydrolýzy za argininem (tzn. na straně blíže k C-konci molekuly) pomocí trypsinu • · · · • · může být dosaženo prováděním hydrolyzační reakce v roztoku o pH 11. Při takto zvýšeném pH je většina ε-aminových skupin lysinu nenabitá (pK = 10,3), a tudíž je umožněno selektivní štěpení. Po štěpení trypsinem při pH 11 (Tabulka 1, vzorek 2), následovaném štěpením karboxypeptidázou B v roztoku o pH 8,5, byly získány dvě šarže purifikovaného insulinu s výtěžky 1 mg a 6,5 mg. Sekvenování N-konce polypeptidu odhalilo, že množství insulinu obsahující nadbytečný arginin bylo sníženo na přibližně 5% z celkového množství.
Tabulka 1
Aminokyselinové složení rekombinantního lidského insulinu
| Počet aminokyselinových zbytků | ||||
| Aminokyseli | Teoretický | Standardní | Vzorek | Vzorek |
| ny | insulin | 1 | 2 | |
| Asx | 3 | 3,20 | 3,38 | 3,26 |
| Thr | 3 | 2,98 | 2,83 | 2,68 |
| Ser | 3 | 2,84 | 2,53 | 2,77 |
| Glx | 7 | 7,15 | 7,73 | 7,23 |
| Pro | 1 | 1,28 | 1,13 | 1,09 |
| Gly | 4 | 4,24 | 4,39 | 4,25 |
| Ala | 1 | 1,00 | 1,28 | 1,04 |
| Cys | 6 | 5,88 | 5,11 | 5,79 |
| Val | 4 | 3,82 | 4,58 | 3,88 |
| Ile | 2 | 2,04 | 1, 96 | 1, 96 |
| Leu | 6 | 5,87 | 6,10 | 5, 99 |
| Tyr | 4 | 3, 80 | 3,80 | 3, 87 |
| Phe | 3 | 3,15 | 3,56 | 3,03 |
| His | 2 | 2,04 | 2,05 | 2,08 |
| Lys | 1 | 1,01 | 1,05 | 1,02 |
| Arg | 1 | 0,96 | 1,30 | 1,18 |
Data ve sloupcích Vzorek 1 a Vzorek 2 znázorňují aminokyselinové složení rekombinantního lidského insulinu získaného z hybridního polypeptidu proinsulinu exprimovaného z plazmidu pBAST-R. Štěpení trypsinem probíhalo buď v pH 9 (vzorek 1) nebo v pH 11 (vzorek 2).
Aminokyselinová analýza byla provedena po oxidaci (prováděná kyselinou peroxomravenčí) a hydrolýze purifikovaných vzorků insulinu prováděné v plynné fázi.
Příklad 5
Peptidová analýza purifikovaného lidského insulinu získaného z hybridního polypeptidu SOD-proinsulin exprimovaného z plazmidu pBAST-R
U purifikovaného insulinu získaného postupem popsaným v předchozích Příkladech byla provedena peptidová analýza s využitím endoproteinázy Glu-C (Sigma), která hydrolyzuje peptidové vazby za (tj. směrem k C-konci) glutamátovými aminokyselinovými zbytky.
Podrobnější popis: vzorky insulinu (100 pg) získané štěpením sbaleného hybridního polypeptidu proinsulinu, exprimovaného z plazmidu pBAST-R, byly po dobu 6 hodin při teplotě 37°C štěpeny působením 5 pg Glu-C v roztoku o objemu 100 pl o složení O,1M Tris-HCI, pH 7,8. Analýza pomocí HPLC byla provedena tak, že vzorky komerčně dostupného (kontrolního) insulinu a insulinu získaného štěpením sbaleného hybridního polypeptidu proinsulinu, exprimovaného z plazmidu pBAST-R, byly okyseleny na hodnotu pH přibližně 3 a rozděleny pomocí RP-HPLC. Byla použita kolona Vydac 218TP54 o rozměrech 250 x 4,6 mm (vnitřní průměr, separační kolona), 5 pm, velikost pórů 30 nm. Kolona byla ekvilibrována pufrem o složení 50 mM fosforečnan tetrame36 • * · · ·
thylamonia, 162 mM NaC104, pH 3 obsahujícím 31,5% (v/v) acetonitrilu. Při eluci byl použit lineární gradient 35 až 45% acetonitrilu po dobu 75 minut při průtoku 1 ml/minuta. Absorbance byla sledována při vlnové délce 220 nm.
V souladu s kontrolní reakcí vznikly všechny očekávané peptidy, i když za pikem odpovídajícím jednomu z fragmentů byla pozorována oblast, která pravděpodobně odpovídá molekule des-Thr (B30) podobné insulinu (15) .
Příklady 4 a 5 naznačují, že rekombinantní polypeptid exprimovaný z plazmidu pBAST-R obsahuje sekvenci přirozeně se vyskytujícího lidského insulinu. Menší část produkce exprimovaných proteinů zahrnuje formy molekul podobných insulinu jako například Arg (Ao) , desamino- nebo des-Thr (B30) . Tyto nežádoucí vedlejší produkty mohou být odstraněny chromatografickými postupy, jako například RP-HPLC, jak jsou popsány výše.
Příklad 6
Proteinová analýza a purifikace lidského insulinu produkovaného z hybridního polypeptidu SOD-proinsulin exprimovaného z plazmidu pDBAST-LAT
Aby bylo možné vyhnout se vzniku vedlejšího produktu Arg (Ao) insulinu (Příklady 4 a 5), byl expresívní plazmid pBAST-R modifikován tak, aby obsahoval DNA kódující v hybridním polypeptidu proinsulinu mezi řetězci A a B pouze pro argininový zbytek a ne dvojici Lys-Arg, nacházející se mezi řetězci A a B v hybridním polypeptidu proinsulinu exprimovaném z plazmidu pBAST-R. Výsledkem jsou expresívní plazmidy pDBAST-LAT (Příklad 1B) a pÁBAST-LAT (Příklad IC).
Po sbalení a enzymatickém působení trypsinem a CPB na sbalený hybridní polypeptid proinsulinu se správně vytvořenými disulfidovými můstky, exprimovaný z nového expresív37
ního plazmidu pDBAST-LAT, bylo dosaženo účinné tvorby insulinu. Přítomnost kontaminujících látek podobných insulinu byla nevýznamná (Obrázek 9). K optimálnímu sbalení došlo při pH 11,25 (Obrázek 10) a správné sbalení bylo podstatně urychleno přítomností přibližně 2 molů kyseliny askorbové na jeden mol SH skupin v reakční směsi (Obrázek 11).
V sérii reakcí, za jinak optimálních podmínek pro správné sbalení, byl stanovován vliv koncentrace proteinů na výtěžek insulinu získaného z hybridního polypeptidu proinsulinu. Optimální výtěžky byly získány v podmínkách, kdy koncentrace proteinu nepřesáhla 1,5 mg/ml (Obrázek 13).
Insulin byl purifikován chromatografií na koloně DEAESepharózy a následnou RP-HPLC (jak je popsáno na Obrázku 9). Jak je zřejmé z Obrázku 12, získaný rekombinantní lidský insulin byl eluován ve stejném retenčním čase jako standardní (komerčně dostupný) lidský insulin. Aminokyselinové složení vzorku purifikovaného rekombinantního lidského insulinu je totožné s aminokyselinovým složením standardního insulinu (Tabulka 2, rekombinantní insulin).
Všimněte si, že Tabulka 2 ukazuje, že insulin získaný z hybridního polypeptidu proinsulinu exprimovaného z plazmidu pDBAST-LAT neobsahuje přebytečný argininový zbytek připojený k řetězci A insulinu (Arg(Ao)insulin) popsaný v Příkladu 4. Plazmid pDBAST-LAT je tedy výhodnější pro produkci insulinu a upřednostňovaná sekvence kódující hybridní polypeptid proinsulinu je sekvence zobrazená na Obrázku 7.
Tabulka 2
Aminokyselinové složení rekombinantního lidského insulinu
| Počet aminokyselinových | zbytků | ||
| Aminokyseliny | Teoretický | Standardní insulin | Rekombinantní insulin |
| Asx | 3 | 3,20 | 3,32 |
| Thr | 3 | 2,98 | 2,73 |
| Ser | 3 | 2,84 | 2,71 |
| Glx | 7 | 7,15 | 7,41 |
| Pro | 1 | 1,28 | 1,02 |
| Gly | 4 | 4,24 | 4,46 |
| Ala | 1 | 1,00 | 1,09 |
| Cys | 6 | 5,88 | 5,28 |
| Val | 4 | 3,82 | 4,00 |
| Ile | 2 | 2,04 | 1, 91 |
| Leu | 6 | 5,87 | 6,34 |
| Tyr | 4 | 3,80 | 3,64 |
| Phe | 3 | 3,15 | 3,06 |
| His | 2 | 2,04 | 2,18 |
| Lys | 1 | 1,01 | 1,02 |
| Arg | 1 | 0,96 | 1,07 |
V tabulce je zobrazeno aminokyselinové složení standarního lidského insulinu a rekombinantního insulinu získaného z hybridního polypeptidů proinsulinu exprimovaného z piazmidu pDBAST-LAT.
Aminokyselinová analýza byla provedena po oxidaci (prováděná kyselinou peroxomravenčí) a hydrolýze purifikovaných vzorků insulinu prováděné v plynné fázi.
• ·
Příklad 7
Produkce lidského insulinu z hybridního polypeptidů proinsulinu exprimovaného z plazmidu pDBAST-LAT ze surového intracelulárního precipitátu
S využitím surového intracelulárního precipitátu byl uskutečněn vylepšený způsob sbalení a enzymatické přeměny hybridního polypeptidů proinsulinu na insulin. Při tomto postupu byl vypuštěn počáteční krok purifikace popsaný v Příkladu 2, oddíl IV. Výsledkem enzymatického štěpení sbaleného hybridního polypeptidů proinsulinu (s vytvořenými disulfidickými vazbami) pomocí trypsinu a karboxypeptidázy B (Obrázek 14 a Tabulka 3) byl vznik insulinu. Výtěžky insulinu byly spočítány jako procento z počáteční koncentrace proteinu (A28o) < která byla stanovena při rozpouštění precipitátu v roztoku o pH 12 (Obrázek 14). Bylo prokázáno, že sbalení hybridního polypeptidů SODproinsulin ze surového intracelulárního precipitátu je optimální v čase přibližně 4,5 hodin od počátku experimentu (Obrázek 14).
V Tabulce 3 je shrnuta částečná purifikace insulinu z hybridního polypeptidů proinsulinu, exprimovaného z plazmidu pBAST-LAT, z intracelulárního precipitátu připraveného z jednoho litru buněčné kultury s 0066ο = 45. Rozpuštění a sbalování bylo prováděno postupem popsaným pro Obrázek 14. V čase 4,5 hodin po rozpuštění bylo pH roztoku obsahujícího sbalený hybridní polypeptid proinsulinu s vytvořenými disulfidickými vazbami upraveno pomocí koncentrované kyseliny chlorovodíkové na hodnotu 8,8. K tomuto roztoku byl přidán ZnCl2 (na výslednou koncentraci 50 μΜ), karboxypeptidáza B (1:4000 w/w) a trypsin (1:6000 w/w). Štěpení probíhalo při 37°C po dobu 3 hodin a bylo ukončeno přídav40 • *>
kem fenylmethylsulfonyl fluoridu (PMSF) na výslednou koncentraci 0,5 mM. Analýza prováděná metodou HPLC (popsanou v popisu pro Obrázek 9) ukázala, že výtěžek insulinu je 169 mg. Insulin byl purifikován chromatografií na anexu a následnou chromatografií na hydrofobním nosiči. Roztok s insulinem (získaný enzymatickým štěpením hybridního polypeptidu proinsulinu) byl aplikován na kolonu (Fast-Flow) DEAESepharózy (Pharmacia) předem ekvilibrovanou v pufru o složení 20 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, pH 8, v množství 50 jednotek A28o na jeden mililitr nosiče. Navázaný materiál byl promyt pufrem o složení 20 mM Tris-HCl, 10 mM NaCl, pH 8 a insulin byl eluován pufrem o stejném složení, který ale obsahoval NaCl o koncentraci 250 mM. Spojené frakce obsahující insulin reprezentovaly 20% z celkového množství nanesených proteinů a jejich čistota byla 37,1%. Ke spojeným frakcím po chromatografií na DEAE-Sepharóze byl přidán síran amonný (na výslenou koncentraci 410 mM) a tento roztok byl aplikován na kolonu (Fast-Flow) Phenyl-Sepharózy (Pharmacia) předem ekvilibrovanou v pufru o složení 20 mM Tris-HCl, 540 mM síran amonný, v množství přibližně 12 jednotek A28o na jeden mililitr nosiče. Navázaný materiál byl promyt ekvilibračním pufrem a insulin byl eluován pufrem o složení 20 mM Tris-HCl, 540 mM síran amonný, pH 8. Frakce obsahující insulin reprezentovaly 42,3% z celkového množství naneseného proteinu a jejich čistota byla 74,1%. Výsledkem zmíněné částečné purifikace bylo 120 mg insulinu (totožného se standardním insulinem), což odpovídá výtěžku insulinu 5,16%. Může být rovněž provedena další purifikace s využitím metod v současnosti známých, jakými jsou například gelová filtrace, RP-HPLC a krystalizace (17).
Tabulka 3
Purifikace rekombinantního lidského insulinu, získaného z hybridního polypeptidu proinsulinu, exprimovaného z plazmidu pDBAST-LAT, rozpuštěním surového intracelulárního precipitátu, sbalením a enzymatickým štěpením trypsinem a karboxypeptidázou B.
| Purifikační krok | A280 | minimální množství insulinu (v mg) stanovované pomocí HPLC | čistota (v %) |
| Rozpuštění preci- pitátu | 2326 | - | - |
| Přídavek dřevěného uhlí | 1915 | - | - |
| Sbalení a enzymatické štěpení | 1915 | 169 | 8,8 |
| Spojené frakce po chromatografií na DEAE-Sepharóze | 383 | 142 | 37,1 |
| Spojené frakce po chromatografií na Phenyl-Sepharóze | 162 | 120 | 74,1 |
Sloupec A28o reprezentuje celkovou absorbancí při vlnové délce 280 nm při každém purifikačním kroku. Přítomnost insulinu byla stanovována analýzou pomocí HPLC (s využitím standardního insulinu) popsanou v popisu Obrázku 9 a odpovídá hlavnímu píku standardního insulinu.
Cousens L. S., Shuster J. R., Gallegos C., Ku L., Stempien Μ. M., Urdea M. S., Sanchez-Pescador R., Taylor A. a TeKamp-Olson P., Gene 61: 265 až 275, 1987.
Davidson H. W., Rhodes C. J. a Hutton J. C., Nátuře 333: 93 až 96, 1988.
Ellman G. L., Arch. Biochem. Biophys. 82:70 až 77, 1959.
Fischer M., Fytlovitch S., Amit B., Wortzel A. a Beck Y., Appl. Microbiol. Biotechnol. 33: 424 až 428, 1990.
Frank Β. H. a Chance R. E. (1985), The preparation and characterization of human insulin of recombinant DNA origin, in Therapeutic agents produced by genetic engineering, Quo Vadis symposium, Sanofi Group, 29. až 30. květen 1985, Toulouse-Labege, Francie, strany 137 až 146.
Goeddel D. V
Yansura D. G K. a Riggs A 1979.
Kleid D. Crea R.,
D., Proč.
G., Bolivar F., Heyneker H. L., Hirose T., Kraszewski A., Itakura Nati. Acad. Sci. 76: 106 až 110,
Grau U., Diabetes 34: 1174 až 1180, 1985.
Hartman a další, Patentová přihláška US číslo 5143836,
1. září, 1992.
Kemmler W., Peterson J. D. a Steiner D. F., J. Biol. Chem. 246: 6786 až 6791, 1971.
Morinaga Y., Franceschini T., Inouye S. a Inouye M., Biotechnology 2: 636 až 639, 1984.
• ·
Panayotis G., Katsoyannis G. a Tometsko A., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 55: 1554 až 1561, 1966.
Schlichtkrull J., Acta Chem. Scand. 10: 1459 až 1464, 1956.
Sherman L., Dafni L., Liehman-Hurwitz J. a Groner Y., Proč. Nati. Acad. Sci. 80: 5465 až 5469, 1983.
Steiner D. F. a Clark J. L., Proč. Nati. Acad. Sci. 60: 622 až 629, 1968.
Thim L., Hansen Μ. T., Norris K., Hoegh I., Boel E., Forstrom J., Ammerer G. a Fiil N. P., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 83: 6766 až 6770, 1986.
Wetzel R., Kleid D. G., Crea R., Heyneker H. L., Yansura D. G., Hirose T., Kraszewski A., Riggs A. D., Itakura K. a Goeddel D. V., Gene 16: 63 až 71, 1981.
Yanofsky C., Platt T., Crawford I. P., Nichols Β. P., Christie G. E., Horowitz H., Van Cleemput M. a Wu A. M., Nucleic Acids Res. 9: 6647 až 6668, 1981.
Claims (22)
- PATENTOVÉ1. Způsob produkce insulinu, který zahrnuje:a) správné sbalení (folding) hybridního polypeptidu obsahujícího proinsulin v podmínkách, které umožňují vytvoření příslušných (správných) disulfidických vazeb;b) vystavení sbaleného hybridního polypeptidu obsahujícího správné disulfidové vazby působení enzymů jejichž působením dojde k vytvoření insulinu;c) purifikací insulinu.
- 2. Způsob podle nároku 1 vyznačující se tím, že krok (a) dále zahrnuje inkubaci hybridního polypeptidu při přibližně 4 až 37°C po dobu 1 až 30 hodin v roztoku o pH přibližně 8,5 až 12,0.
- 3. Způsob podle nároku 2 vyznačující se tím, že inkubace probíhá za přítomnosti kyseliny askorbové .
- 4. Způsob podle nároku 2 vyznačující se t í m, ž e pH je v rozmezí 11,0 až 11,25.
- 5. Způsob podle nároku 3 vyznačující se t í m, ž e pH je v rozmezí 11,0 až 11,25.
- 6. Způsob podle nároku 3 vyznačující se tím, že koncentrace kyseliny askorbové je přibližně 2 moly na jeden mol skupin SH přítomných ve směsi, ve které dochází ke sbalení polypeptidu.
- 7. Způsob podle nároku 2 vyznačující se tím, že doba inkubace je přibližně 5 hodin.
- 8. Způsob podle nároku 3 vyznačující se tím, že doba inkubace je přibližně 5 hodin.
- 9. Způsob podle nároku 1 vyznačující se tím, že krok (b) dále zahrnuje:(i) upravení pH roztoku na hodnotu přibližně 8,8 až 9,0; a (ii) štěpení hybridního polypeptidu působením trypsinu a karboxypeptidázy B při teplotě 16 až 37°C po dobu v rozmezí 30 minut až 16 hodin.
- 10. Způsob podle nároku 1 vyznačující se tím, že krok (c) dále zahrnuje purifikaci s využitím chromatografie na DEAE-Sepharóze a RP-HPLC (HPLC s využitím kolony s reverzní fází).
- 11. Způsob podle nároku 1 vyznačující se tím, že krok (c) dále zahrnuje purifikaci s využitím ultrafiltrace a chromatografie na CM-Sepharóze.
- 12. Způsob podle nároku 1 vyznačující se tím, že krok (c) dále zahrnuje purifikaci s využitím chromatografie na DEAE-Sepharóze a chromatografie na Phenyl-Sepharóze.• · • »
- 13. Způsob podle nároku 1 vyznačující se tím, že hybridní polypeptid proinsulinu je exprimován z plazmidu pDBAST-LAT uloženého v ATCC pod přístupovým číslem 69361.
- 14. Způsob podle nároku 1 vyznačující se tím, že hybridní polypeptid proinsulinu je exprimován z plazmidu pÁBAST-LAT uloženého v ATCC pod přístupovým číslem 69363.
- 15. Způsob podle nároku 1 vyznačující se tím, že hybridní polypeptid proinsulinu je exprimován z plazmidu pBAST-R uloženého v ATCC pod přístupovým číslem 69362.
- 16. Způsob podle nároku 1 vyznačující se tím, že hybridní polypeptid v kroku (a) je získán působením na bakteriální buňky obsahující DNA kódující hybridní polypeptid, přičemž toto působení vede k expresi zmíněné DNA.
- 17. Způsob podle nároku 16 vyznačující se tím, že hybridní polypeptid je získán ze zmíněných buněk.
- 18. Způsob podle nároku 16 vyznačující se tím, že působení zahrnuje fermentací v přítomnosti glukózy, glycerolu nebo galaktózy.
- 19. Způsob podle nároku 17 vyznačující se tím, že proces získání hybridního polypeptidu zahrnuj e:• · (i) rozrušení buněčné stěny bakteriálních buněk nebo jejich částí, jehož výsledkem je vznik lyzátů;(ii) oddělení intracelulárního precipitátu od lyzátů pomocí centrifugace; a (iii) solubilizaci precipitátu.
- 20. Polypeptid zahrnující proinsulin a signální polypeptid připojení k N-konci proinsulinu, kde zmíněný polypeptid je správně sbalen a obsahuje odpovídající (správné) disulfidické vazby.
- 21. Polypeptid podle nároku 20, kde signální peptid je odvozen od N-koncové oblasti CuZnSOD.
- 22. Polypeptid podle nároku 21, kde signální peptid zahrnuje 62 aminokyselin, kterým předchází aminokyselina raethionin, a po kterých následuje argininový aminokyselinový zbytek.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PCT/US1994/013268 WO1996020724A1 (en) | 1994-12-29 | 1994-12-29 | Generation of human insulin |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ203197A3 true CZ203197A3 (cs) | 1998-09-16 |
| CZ290079B6 CZ290079B6 (cs) | 2002-05-15 |
Family
ID=22243290
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ19972031A CZ290079B6 (cs) | 1994-12-29 | 1994-12-29 | Způsob produkce inzulinu a meziprodukt pro tento způsob |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0871474B2 (cs) |
| JP (1) | JP4624495B2 (cs) |
| AT (1) | ATE350053T1 (cs) |
| AU (1) | AU698872B2 (cs) |
| BR (1) | BR9408638A (cs) |
| CA (1) | CA2208095C (cs) |
| CZ (1) | CZ290079B6 (cs) |
| DE (2) | DE95907193T1 (cs) |
| DK (1) | DK0871474T4 (cs) |
| ES (1) | ES2279510T5 (cs) |
| HU (1) | HU223718B1 (cs) |
| NZ (1) | NZ279002A (cs) |
| PL (1) | PL180818B1 (cs) |
| PT (1) | PT871474E (cs) |
| WO (1) | WO1996020724A1 (cs) |
Families Citing this family (22)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE19735711C2 (de) * | 1997-08-18 | 2001-04-26 | Aventis Pharma Gmbh | Verfahren zur Herstellung eines Vorläufers von Insulin oder Insulinderivaten mit korrekt verbundenen Cystinbrücken |
| DK1066328T3 (da) | 1998-03-31 | 2009-02-09 | Tonghua Gantech Biotechnology | Kimært protein, der indeholder en intramolekylær chaperon-lignende sekvens, og dets anvendelse til insulinproduktion |
| JP3406244B2 (ja) | 1999-04-30 | 2003-05-12 | 伊藤ハム株式会社 | 新規な融合蛋白質からの組み換えインスリンの製造方法 |
| ATE328605T1 (de) | 2000-03-24 | 2006-06-15 | Genentech Inc | Verwendung von insulin zur behandlung von knorpelkrankheiten |
| ATE429925T1 (de) | 2000-07-31 | 2009-05-15 | Univ Bar Ilan | Methoden und pharmazeutische zusammensetzungen zur wundheilung |
| US20040037828A1 (en) | 2002-07-09 | 2004-02-26 | Bar-Ilan University | Methods and pharmaceutical compositions for healing wounds |
| US7312192B2 (en) * | 2001-09-07 | 2007-12-25 | Biocon Limited | Insulin polypeptide-oligomer conjugates, proinsulin polypeptide-oligomer conjugates and methods of synthesizing same |
| CN100395263C (zh) | 2003-01-31 | 2008-06-18 | 欧加农股份有限公司 | 缺氧条件下的蛋白质分离方法 |
| DK1651161T3 (da) | 2003-08-07 | 2012-01-30 | Healor Ltd | Farmaceutiske præparater og fremgangsmåder til at fremme sårheling |
| JP2013535467A (ja) * | 2010-07-28 | 2013-09-12 | スマートセルズ・インコーポレイテツド | 組換えにより発現されたインスリンポリペプチドおよびその使用 |
| WO2012048856A1 (en) | 2010-10-12 | 2012-04-19 | Glucometrix Pvs Gmbh | Proinsulin with helper sequence |
| WO2012098009A1 (en) | 2011-01-21 | 2012-07-26 | Glucometrix Ag | Chimeric polypeptide comprising a membrane protein and an insulin precursor |
| EP2867250A2 (en) | 2012-04-04 | 2015-05-06 | GlucoMetrix AG | Proinsulin with enhanced helper sequence |
| CA2866491A1 (en) * | 2014-10-02 | 2016-04-02 | Clay Purdy | Synthetic acid compositions and uses thereof |
| JP2018531007A (ja) * | 2015-09-24 | 2018-10-25 | ハンミ ファーマシューティカル カンパニー リミテッド | インスリンの製造方法 |
| PL239062B1 (pl) * | 2016-01-22 | 2021-11-02 | Inst Biotechnologii I Antybiotykow | Sposób wytwarzania insuliny i jej pochodnych |
| EP3509625A1 (en) | 2016-09-06 | 2019-07-17 | Chemical & Biopharmaceutical Laboratories of Patras S.A. | Proinsulin derivatives |
| WO2018056764A1 (ko) * | 2016-09-23 | 2018-03-29 | 한미약품 주식회사 | 인슐린 수용체와의 결합력이 감소된, 인슐린 아날로그 및 이의 용도 |
| CN112105635A (zh) * | 2018-06-18 | 2020-12-18 | 联合化学实验室有限公司 | 用于重组蛋白的更高表达的前导序列 |
| CN112584853B (zh) * | 2018-09-12 | 2021-12-10 | 美药星（南京）制药有限公司 | 一种新型门冬胰岛素原的结构和制备门冬胰岛素的方法 |
| WO2020069040A1 (en) | 2018-09-25 | 2020-04-02 | Amphastar Pharmaceuticals, Inc. | Highly purified recombinant human insulin (rhi) api and methods of producing the same |
| CN113527505A (zh) * | 2020-04-15 | 2021-10-22 | 博锐生物科技有限公司 | 一种多肽和包含该多肽的药物组合物以及它们的应用 |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4430266A (en) * | 1980-11-28 | 1984-02-07 | Eli Lilly And Company | Process for producing an insulin precursor |
| DK129385A (da) * | 1985-03-22 | 1986-09-23 | Novo Industri As | Peptider og fremstilling deraf |
| DE3679343D1 (de) † | 1985-03-28 | 1991-06-27 | Chiron Corp | Expression durch verwendung von fusionsgenen fuer proteinproduktion. |
| US5342921A (en) * | 1985-03-28 | 1994-08-30 | Chiron Corporation | Superoxide dismutase fusion polypeptides for expression of mammalian proteins |
| DE3901718A1 (de) * | 1989-01-21 | 1990-07-26 | Hoechst Ag | Verfahren zur renaturierung falscher rekombinanten von insulinvorlaeufern |
| DE3901719A1 (de) * | 1989-01-21 | 1990-07-26 | Hoechst Ag | Verfahren zur herstellung eines insulinvorlaeufers |
| US5126249A (en) * | 1989-05-09 | 1992-06-30 | Eli Lilly And Company | Enzymatic removal of a protein amino-terminal sequence |
| US5227293A (en) * | 1989-08-29 | 1993-07-13 | The General Hospital Corporation | Fusion proteins, their preparation and use |
| IL104727A (en) * | 1992-02-18 | 1997-01-10 | Lilly Co Eli | Selective removal of n-terminal extensions from folded insulin precursors using dipeptidyl-aminopeptidase-1 |
| DE19701167A1 (de) * | 1997-01-15 | 1998-07-23 | Siemens Ag | Chipkarte |
-
1994
- 1994-12-29 CZ CZ19972031A patent/CZ290079B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1994-12-29 DE DE95907193T patent/DE95907193T1/de active Pending
- 1994-12-29 ES ES95907193T patent/ES2279510T5/es not_active Expired - Lifetime
- 1994-12-29 EP EP95907193A patent/EP0871474B2/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-12-29 PL PL94321039A patent/PL180818B1/pl unknown
- 1994-12-29 HU HU9800292A patent/HU223718B1/hu active IP Right Grant
- 1994-12-29 WO PCT/US1994/013268 patent/WO1996020724A1/en not_active Ceased
- 1994-12-29 DE DE69434909T patent/DE69434909T3/de not_active Expired - Lifetime
- 1994-12-29 AT AT95907193T patent/ATE350053T1/de active
- 1994-12-29 AU AU15500/95A patent/AU698872B2/en not_active Expired
- 1994-12-29 JP JP52090996A patent/JP4624495B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1994-12-29 NZ NZ279002A patent/NZ279002A/xx not_active IP Right Cessation
- 1994-12-29 PT PT95907193T patent/PT871474E/pt unknown
- 1994-12-29 BR BR9408638-9A patent/BR9408638A/pt not_active Application Discontinuation
- 1994-12-29 CA CA002208095A patent/CA2208095C/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-12-29 DK DK95907193.7T patent/DK0871474T4/da active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP4624495B2 (ja) | 2011-02-02 |
| CA2208095A1 (en) | 1996-07-11 |
| CA2208095C (en) | 2006-11-28 |
| DE69434909T3 (de) | 2012-02-09 |
| NZ279002A (en) | 1999-02-25 |
| EP0871474B1 (en) | 2007-01-03 |
| EP0871474A1 (en) | 1998-10-21 |
| BR9408638A (pt) | 2004-09-21 |
| ES2279510T3 (es) | 2007-08-16 |
| DE69434909D1 (de) | 2007-02-15 |
| ES2279510T5 (es) | 2012-01-19 |
| DK0871474T3 (da) | 2007-05-07 |
| EP0871474B2 (en) | 2011-09-21 |
| AU698872B2 (en) | 1998-11-12 |
| HK1013594A1 (en) | 1999-09-03 |
| DE95907193T1 (de) | 2005-02-10 |
| PL321039A1 (en) | 1997-11-24 |
| HU223718B1 (hu) | 2004-12-28 |
| WO1996020724A1 (en) | 1996-07-11 |
| CZ290079B6 (cs) | 2002-05-15 |
| PL180818B1 (pl) | 2001-04-30 |
| PT871474E (pt) | 2007-02-28 |
| JPH10511849A (ja) | 1998-11-17 |
| HUT78070A (hu) | 1999-08-30 |
| DK0871474T4 (da) | 2012-01-09 |
| ATE350053T1 (de) | 2007-01-15 |
| DE69434909T2 (de) | 2007-08-09 |
| AU1550095A (en) | 1996-07-24 |
| EP0871474A4 (en) | 2004-08-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CZ203197A3 (cs) | Způsob produkce rekombinantního humánního inzulinu | |
| AU648670B2 (en) | A-C-B Proinsulin, method of manufacturing and using same, and intermediates in insulin production | |
| JP5695909B2 (ja) | 極度に遅延した時間作用プロファイルを有する新規なインスリン誘導体 | |
| US5268453A (en) | Tissue-selective insulin analogs | |
| US6001604A (en) | Refolding of proinsulins without addition of reducing agents | |
| JPH02225498A (ja) | 新規インスリン誘導体 | |
| IL132030A (en) | Process for producing peptide with the use of accessory peptide | |
| EP3845240B1 (en) | Pro-insulin aspart structure and method for preparing insulin aspart | |
| JP5331685B2 (ja) | 二塩基性ｂ鎖末端を有するインスリン類似体の生産方法 | |
| EP3950719A1 (en) | Fusion protein containing fluorescent protein fragments and uses thereof | |
| KR100381494B1 (ko) | 인간인슐린의제조방법 | |
| JP2025506146A (ja) | 哺乳動物細胞におけるヒトアナログインスリン及びその誘導体の製造方法 | |
| HK1130815B (en) | Method for producing insulin analogs having a dibasic b chain terminus | |
| HK1013594B (en) | Generation of human insulin |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MK4A | Patent expired |
Effective date: 20141229 |