CZ290079B6

CZ290079B6 - Způsob produkce inzulinu a meziprodukt pro tento způsob

Info

Publication number: CZ290079B6
Application number: CZ19972031A
Authority: CZ
Inventors: Jacob R. Hartman; Simona Mendelovitz; Marian Gorecki
Original assignee: Bio-Technology General Corp.
Priority date: 1994-12-29
Filing date: 1994-12-29
Publication date: 2002-05-15
Also published as: HU223718B1; DE95907193T1; EP0871474B2; CZ203197A3; ATE350053T1; NZ279002A; DE69434909T2; DK0871474T4; JP4624495B2; PT871474E; CA2208095A1; AU1550095A; JPH10511849A; DK0871474T3; PL180818B1; DE69434909D1; BR9408638A; CA2208095C; WO1996020724A1; PL321039A1

Abstract

Zp sob produkce inzulinu, kter² zahrnuje a) z sk n hybridn ho polypeptidu zahrnuj c ho proinzulin takov²m zpracov n m bakteri ln bu ky obsahuj c DNA k duj c hybridn polypeptid, e hybridn polypeptid je exprimov n a z sk n z bu ky; b) sbalen hybridn ho polypeptidu za podm nek umo uj c ch vytvo°en spr vn²ch disulfidov²ch vazeb, ani by byl hybridn polypeptid p°edem podroben sulfitol²ze nebo t pen bromkyanem; c) enzymatick t pen sbalen ho hybridn ho polypeptidu spojen ho disulfidov²mi vazbami za vzniku inzulinu; a d) purifikaci inzulinu. Hybridn polypeptid zahrnuj c proinzulin a sign ln polypeptid p°ipojen² k N-konci proinzulinu, kde polypeptid je sbalen a obsahuje spr vn disulfidick vazby, jako meziprodukt pro v²robu inzulinu v² e uveden²m zp sobem.\

Description

Oblast techniky

Vynález se týká způsobu produkce inzulínu a meziproduktu pro tento způsob.

Dosavadní stav techniky

V této přihlášce jsou odkazy k jednotlivým citacím uvedeny arabskými číslicemi v kulatých závorkách a celé citace mohou být nalezeny na konci přihlášky (před oddílem Patentové nároky).

Inzulín je polypeptidový hormon, který je nezbytný pro kontrolu metabolizmu glukózy. Je denně podáván pacientům trpícím cukrovkou (diabetes melitus), což je metabolická porucha charakterizovaná nedostatečným zásobováním organizmu inzulínem.

In vivo je hormon nejprve syntetizován jako dlouhá prekurzorová molekula, která je dále přeměňována na svou biologicky aktivní formu. Tato biologicky aktivní forma se skládá ze dvou řetězců, označovaných A a B. Podrobněji řečeno, gen pro preproinzulin se v β-buňkách slinivky přepisuje do prekurzorové mRNA. Tato mRNA je poté sestřižena a výsledkem tohoto sestřihu je vznik maturované mRNA, která je předkládána v preproinzulin. Preproinzulin, který je možno schematicky znázornit vzorcem (NH₂-pre-sekvence-řetězec B-peptid C-řetězec A-COOH), je následně přeměňován v proinzulin a nakonec v inzulín. Prvním krokem přeměny je proteolytické odstranění pre-sekvence, která slouží jako signální hydrofobní sekvence pro přenos nascentního řetězce hormonu přes mikrosomální membránu drsného endoplazmatického retikula. V lidském preproinzulinu je délka této pre-sekvence 24 aminokyselinových zbytků.

V proinzulinu jsou obě oblasti polypeptidového řetězce, které posléze vytvoří maturovaný inzulín, tedy řetězec A a B, navzájem spojeny peptidem C (nebo řetězcem C), který na svém N a C konci obsahuje dva páry bazických aminokyselin. U většiny peptidů C je tento bazický pár tvořen aminokyselinami Arg-Arg nebo Lys-Arg. Lidský peptid C se, včetně obou koncových párů bazických aminokyselin, skládá z 35 aminokyselin. Peptid C spojuje dvě oblasti polypeptidů tak, aby byl usnadněn vznik disulfidového můstku mezi segmenty A a B. Úloha peptidu C proto není příliš závislá na jeho struktuře. Ve skutečnosti nahrazení tohoto peptidu kratším syntetickým můstkem stále umožňuje vlastní „balení“ molekuly proinzulinu (1,2).

„Sbalení“ molekuly proinzulin je doprovázeno oxidací dvou disulfidových vazeb, které se nacházejí mezi jednotlivými řetězci a jedné disulfidové vazby uvnitř řetězce A. V posledním stadiu maturace uvolní proteolytické enzymy naštěpením v místě bazických aminokyselinových zbytků peptid C a vytvoří tak maturovaný inzulín (3). V lidském inzulínu obsahuje řetězec A 21 aminokyselin, zatímco řetězec B je dlouhý 30 aminokyselinových zbytků.

Světová poptávka po inzulínu dosahuje ročně několika tun, a tak nastává vážný nedostatek v jeho dodávkách. Tradičně se inzulín připravuje z omezených zvířecích zdrojů, což jsou hlavně hovězí a vepřové pankreatické preparáty, které se liší od lidského inzulínu a mohou tak vyvolat nepříznivou imunitní reakci.

Studie prováděné během šedesátých let prokázaly možnost přípravy inzulínu in vitro. Syntézy inzulínu bylo dosaženo kombinováním řetězců A a B v jejich S-sulfonované formě (4) nebo spontánní reoxidací redukovaného proinzulinu (5). Posledně jmenovaný způsob přípravy nebyl prakticky využitelný pro výrobu inzulínu ve velkém měřítku, protože v oxidační směsi byla velmi nízká koncentrace tohoto proteinu. Inzulín mohl být následně získán působením trypsinu a karboxypeptidázy B (6).

-1 CZ 290079 B6

V poslední době začíná být využíván semisyntetický a biosyntetický (rekombinantní) lidský inzulín. Semisyntetický lidský inzulín je připravován z prasečího inzulínu pomocí trypsinem katalyzované výměny treoninu za alanin v pozici 30 řetězce B (což je jediný rozdíl mezi lidským a prasečím inzulínem). Rekombinantní lidský inzulín připravovaný bud’ v bakteriích E. coli nebo v kvasinkách v budoucnosti nahradí všechny další cesty přípravy.

Biosyntetický rekombinantní lidský inzulín se běžně připravuje dvěma cestami, a to buď přípravou každého z řetězců A a B zvlášť v bakteriích E. coli a jejich následnou kombinací (7, 8) nebo enzymatickou konverzí proinzulinu exprimovaného ve formě polypeptidu buď v E. coli (1,8) nebo kvasinkách (2,9).)

Ve většině případů je proinzulin připravován ve formě hybridního proteinu, který je akumulován ve formě intracelulámího precipitátu. Tento hybridní protein je purifikován běžným způsobem a štěpen pomocí CNBr tak, aby byl uvolněn polypeptid proinzulinu. Tento polypeptid proinzulinu je dále modifikován oxidativní sulfitolýzou na proinzulin ve formě S-sulfonátu. Proinzulin S-sulfonát je poté purifikován a ta redukčních podmínek „sbalen“ na proinzulin (8). Konverze proinzulinu na inzulín je dosaženo kombinovaným působením trypsinu a karboxypeptidázy B (6).

Patent číslo EP 195691 Bl, udělený společností Novo Nordisk A/S popisuje proinzulin vzorce B-Lys-Arg-A a dále pak užití tohoto produktu pro přípravu inzulínu v kavasinkách.

Patent číslo EP 196056 Bl, udělený společností Chiron Corp., popisuje protein hSOD-proinzulin produkovaný kvasinkami. Před „sbalením“ je protein hSOD-proinzulin štěpen pomocí bromkyanu a podroben sulfitolýze.

V patentu EP číslo 379162 popisuje společnost Hoechst skutečnost, že „chybné rekombinanty (falše recombinants) prekurzorů inzulínu“ (to jest rekombinantních produktů inzulínu s nesprávnými nebo částečně nesprávnými intermolekulámími disulfidovými můstky) mohou být přeměřeny na „správné“ inzulínové produkty bez toho, aby byly podrobeny sulfitolýze. Tento postup využívá reakci „chybných“ rekombinantů ve vodném prostředí za použití nadbytku merkaptanu a za přítomnosti organického oxidačně-redukčního systému. Počáteční krok sulfitolýzy se používá, po odštěpení (chemicky nebo enzymaticky) aminokyselinových nebo peptidových zbytků z fuzních polypeptidů (což se uskutečňuje po lýze hostitelské buňky). Po tomto kroku je všech šest cysteinů nacházejících se v prekurzoru inzulínu přeměněno na S-sulfonáty. V následujícím renaturačním kroku se z tohoto preinzulinu ve formě S-sulfonátu vytváří preinzulin za vzniku tří „správných“ disulfidových můstků ve své přirozené formě.

V průběhu tohoto renaturačního kroku se vytvářejí takzvané „nepravé, chybné“ rekombinanty.

Hoechst dále v mezinárodní přihlášce PCT číslo WO 91/03550 uvádí způsob přípravy fuzních proteinů obsahujících požadovaný protein (to jest proinzulin) a „vedlejší složky“. Sulfitolýza se provádí před „sbalením“, zatímco „vedlejší složka“ se odštěpuje průběžně po „sbalení“ společně s C-řetězcem proinzulinu.

Hoechst dále v EP 347781 Bl popisuje takzvaný „mini proinzulin“ (B-Arg-A) a jeho využití pro přípravu mono-Arg inzulínu a inzulínu. Je zde rovněž popsána fuze proteinů zahrnujících B-Arg-A a „balastní složku“. „Balastní složka“ je odštěpena pomocí bromkyanu. Sulfitolýza probíhá ještě před „sbalením“ polypeptidu.

-2CZ 290079 B6

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu je způsob produkce inzulínu, jehož podstata spočívá v tom, že zahrnuje

a) získání hybridního polypeptidu zahrnujícího proinzulin takovým zpracováním bakteriální buňky obsahující DNA kódující hybridní polypeptid, že hybridní polypeptid je exprimován a získán z buňky;

b) sbalení hybridního polypeptidu za podmínek umožňujících vytvoření správných disulfídových vazeb, aniž by byl hybridní polypeptid předem podroben sulfitolýze nebo štěpení bromkyanem;

c) enzymatické štěpení sbaleného hybridního polypeptidu spojeného disulfidovými vazbami za vzniku inzulínu; a

d) purifikaci inzulínu.

Dále je předmětem vynálezu také hybridní polypeptid zahrnující proinzulin a signální polypeptid připojený k N-konci proinzulinu, kde polypeptid je sbalen a obsahuje správné disulfidické vazby, jako meziprodukt pro výrobu inzulínu výše uvedeným způsobem.

Způsob produkce inzulínu podle vynálezu vykazuje řadu výhod ve srovnání s postupy podle dosavadního stavu techniky. Rekombinantní hybridní polypeptidy proinzulinu zahrnující signální sekvenci jsou syntetizovány v bakteriích E. coli. Po částečné purifikaci jsou tyto rekombinantní polypeptidy „sbaleny“ se signálním polypeptidem, a to za takových podmínek, které dovolují správné funkční sbalení. Biologicky aktivní lidský inzulín je potom připraven kombinovaným působením trypsinu a karboxypeptidázy B. Působením těchto enzymů se souběžně odštěpuje signální peptid a řetězec C. Takto připravený a purifíkovaný lidský inzulín je totožný s přirozeně se vyskytujícím lidským inzulínem.

Nebezpečné a těžkopádné postupy zahrnující štěpení hybridních polypeptidů pomocí CNBr a sulfitolýzu, užívanou k ochraně četných SH skupin, se v novém způsobu podle vynálezu nepoužívají. Vlastní hybridní polypeptid proinzulinu se může účinně „sbalit“ do své vlastní přirozené struktury dokonce i v přítomnosti signálního peptidu a nechráněných cysteinových zbytků. Aktivní rekombinantní lidský inzulín se uvolňuje enzymetickým štěpením a je následně purifíkován.

Přehled obrázků na výkresech

V restrikčních mapách tří plazmidů zobrazených na obrázcích 3 až 5 nejsou uvedena všechna restrikční místa přítomná na těchto plazmidech. Jsou však zobrazena všechna restrikční místa nezbytná pro úplné porozumění vynálezu.

Obrázek 1: Příprava lidského inzulínu pomocí enzymatického štěpení „sbaleného“, disulfidovými vazbami propojeného hybridního polypeptidu proinzulinu, který byl připraven expresí z plazmidu pBAST-R. Na obrázku je uvedena pouze část signální sekvence SOD. Zkratka CPB užitá v popisu obrázku znamená označení pro karboxypeptidázu B.

Obrázek 2: Příprava lidského inzulínu pomocí enzymatického štěpení „sbaleného“, disulfidovými vazbami propojeného hybridního polypeptidu proinzulinu, který byl připraven expresí z plazmidu pDBAST-LAT nebo z plazmidu pXBAST-LAT. Na obrázku je uvedena pouze část signální sekvence SOD. Použitá zkratka CPB má stejný význam jako na obrázku 1.

-3CZ 290079 B6

Obrázek 3: Struktura plazmidu pBAST-R, expresivního plazmidu kódujícího hybridní polypeptid SOD-proinzulin, uloženého v ATCC pod přístupovým číslem 69362.

Obrázek 4: Struktura plazmidu pDBAST-LAT, expresivního plazmidu kódujícího hybridní polypeptid SOD-proinzulin. Tento plazmid je uložen v ATCC a bylo mu přiděleno přístupové číslo 69361.

Obrázek 5: Struktura plazmidu pXBAST-LAT, expresivního plazmidu kódujícího hybridní polypeptid SOD-proinzulin. Tento plazmid je uložen v ATCC a bylo mu přiděleno přístupové číslo 69363.

Obrázek 6: Aminokyselinová a odpovídající nukleotidová sekvence (DNA) hybridního polypeptidu SOD-proinzulin exprimovaného z plazmidu pBAST-R.

Obrázek 7: Aminokyselinová a odpovídající nukleotidová sekvence (DNA) hybridního polypeptidu SOD-proinzulin exprimovaného z plazmidů pDBAST-LAT a pXBAST-LAT.

Obrázek 8: Příprava lidského inzulínu z hybridního polypeptidů proinzulinu exprimovaného z plazmidu pBAST-R jako funkce hodnot pH směsi používané ke „sbalení“ proteinu.

Sbalení hybridního polypeptidů proinzulinu (připraveného tak, jak je popsáno v příkladu 2) bylo prováděno při různých hodnotách pH, tak jak je označeno na tomto obrázku a to v pufru obsahujícím 10 mM glycin, při 4 °C po dobu 16 hodin s koncentrací hybridního polypeptidů buď 1 mg/ml nebo 0,5 mg/ml. „Sbalený“ polypeptid byl vystaven působení trypsinu (1:500 w/w; Sigma) a karboxypeptidázy B (CPB, Sigma, 1:200 w/w) po dobu 30 minut při teplotě 37 °C a hodnotě pH 9. Vzniklý produkt byl analyzován na přítomnost imunoreaktivního inzulínu (IR) pomocí radioimunostanovení využívajícího inzulín značený izotopem ¹²⁵I (Amersham) a lidský rekombinantní inzulín (Calbiochem) jako standardy.

Obrázek 9: Příprava lidského inzulínu z hybridního polypeptidů proinzulinu exprimovaného z plazmidu pDBAST-LAT.

Pozn: w = hmotnost, v ^_ objem

Hybridní polypeptid proinzulinu (připravený tak, jak je popsáno v příkladu 2) byl rozpuštěn v pufru o složení 8M močovina, 5 mM HC1, v koncentraci přibližně okolo 30 mg/ml a poté byl nařazen na koncentraci 1 mg/ml v pufru o složení 100 mM glycerin-NaOH, pH 11,0. „Sbalení“ probíhalo při 22 °C (za pokojové teploty) po dobu 20 hodin. pH roztoku bylo následně pomocí HC1 upraveno na hodnotu 8,8. Do reakční směsi byla poté přidána karboxypeptidáza B (1:1 000 w/w, Sigma) a trypsin (1:2 000 w/w, Sigma). Reakční směs byla inkubována po dobu 60 minut při teplotě 37 °C. pH této směsi bylo před ředěním 10 mM HCÍ upraveno na hodnotu 3. Vzorky o objemu 150 μΐ byly dále analyzovány pomocí vysokotlaké kapalinové chromatografie na koloně s reverzní fází (RP-HOLC) o rozměrech 250x4 mm, obsahující 5μ Lichrosphere 100 RP-8 (Měrek). Kolona byla ekvilibrována pufrem o složení 50 mM fosforečnan trimethylamonia, 162 mM NaClO₄, pH3, obsahujícím 31,5 % (v/v) acetonitrilu. Vzorky byly z kolony vymývány lineárním gradientem acetonitrilu v rozsahu koncentrací 31,5 až 40,5% po dobu 75 minut a při průtokové rychlosti 1 ml za minutu. Proměřovala se absorbance při vlnové délce 220 nm.

Následující části obrázku označené písmeny odpovídají.

A: 5 μg standardního inzulínu (Boehringer - Mannheim),

B: připravený rekombinantní lidský inzulín vystavený enzymatickému působení,

-4CZ 290079 B6

C: „sbalený“ hybridní polypeptid SOD-proinzulin.

Obrázek 10: Příprava lidského inzulínu z hybridního polypeptidu proinzulinu exprimovaného z plazmidu pBAST-LAT jako funkce hodnot pH směsi používané ke „sbalení“ proteinu.

Hybridní polypeptid proinzulinu (připravený tak, jak je popsáno v příkladu 2) byl naředěn na koncentraci 1 mg/ml v pufru o složení 100 mM glycin-NaOH s hodnotami pH vyznačenými na ose x. „Sbalení“ probíhalo po dobu 16 hodin při 22 °C. Enzymatické zpracování polypeptidu a následná RP-HPLC analýza byla provedena tak, jak bylo propsáno v popisu k obrázku 9. Množství rekombinantního lidského inzulínu připraveného z hybridního polypeptidu bylo počítáno z velikosti plochy píku, který měl stejný retenční čas jako standardní inzulín.

Obrázek 11: Příprava lidského inzulínu z hybridního polypeptidu proinzulinu exprimovaného z plazmidu pDBAST-LAT jako funkce koncentrace kyseliny askorbové ve směsi používané ke „sbalení“ proteinu.

„Sbalení“ hybridního polypeptidu SOD-proinzulin (připraveného podle popisu v příkladu 2) bylo prováděno při koncentraci polypeptidu 1 mg/ml v pufru o složení 100 mM glycin-NaOH, pHll,2 při 22 °C a v přítomnosti různých koncentrací kyseliny askorbové vyznačených na obrázku. Vzorky byly vystaveny působení trypsinu a karboxypeptidázy B (tak jak je popsáno pro obrázek 9) po dobu 5 a 25 hodin, což jsou časové periody užité ke „sbalení“. Produkce rekombinantního lidského inzulínu byla analyzována pomocí RP-HPLC (tak jak je popsáno pro obrázek 9).

Křivka proložená symboly trojúhelníku značí 5 hodin působení směsi enzymů. Křivka proložená kolečky označuje 25 hodin inkubace se směsí enzymů.

Obrázek 12: Ověření autenticity („pravosti“) lidského inzulínu připraveného z hybridního polypeptidu proinzulinu exprimovaného z plazmidu pDBAST-LAT.

„Sbalení“ hybridního polypeptidu SOD-proinzulin (připraveného podle popisu v příkladu 2) bylo prováděno v koncentraci polypeptidu 1 mg/ml v pufru o složení 100 mM glycin-NaOH, pH 11,2 při teplotě 22 °C po dobu 16 hodin a v přítomnosti 1,2 mM kyseliny askorbové. Po provedení enzymatického štěpení (popsáno u obrázku 9) byla směs chromatograficky rozdělena na koloně DEAE-Sepharózy, která byla ekvilibrována pufrem o složení 20 mM Tris-HCl, pH 8. Rekombinantní lidský inzulín byl z kolony eluován pomocí lineárního gradientu v rozmezí koncentrací 0 až 0,4M NaCl v pufru o složení 20 mM Tris-HCl, pH 8.

Ve frakcích odpovídajících jednotlivým pikům eluovaných z kolony bylo kyselinou chlorovodíkovou upraveno pH na hodnotu 3. Rekombinantní lidský inzulín byl dále čištěn ze směsi podobných směsi podobných molekul pomocí RP-HPLC tak, jak je popsáno u obrázku 9. Hlavní odebraná frakce byla odsolena na koloně Sephadexu G-25 a byla převedena do roztoku 0,25M octové kyseliny a lyofilizována. Vzorky (5 pg rekombinantního lidského inzulínu) byly převedeny do 10 mM HC1 a analyzovány pomocí RP-HPLC za stejných podmínek.

Následující symbolické označení částí obrázku velkými písmeny znamená popis křivek odpovídajících:

A: standardní inzulín,

B: lidský rekombinantní inzulín purifikovaný pomocí HPLC,

C: kombinovaný vzorek obsahující rekombinantní lidský inzulín purifikovaný pomocí HPLC spolu se standardním inzulínem.

-5CZ 290079 B6

Obrázek 13: Příprava lidského inzulínu z hybridního polypeptidů proinzulinu exprimovaného z plazmidu pDBAST-LAT jako funkce koncentrace proteinu ve směsi používané kjeho „sbalení“.

Polypeptidový hybrid SOD-proinzulin (připravený dle popisu v příkladu 2), jehož „sbalení“ bylo provedeno v pufru o složení 100 mM glycin-NaOH, pH 11,2, za použití koncentrací proteinu, které se měnily v rozsahu od 0,5 mg/ml až po 10 mg/ml, tak jak je vyznačeno na obrázku. Každá ze směsí použitých ke sbalení proteinu byla doplněna 2,5 mol kyseliny askorbové na 1 mol SH skupin. „Sbalování“ bylo prováděno při 24 °C (za pokojové teploty) po dobu 16 hodin. Enzymatické štěpení a RP-HPLC analýzy byly provedeny podle popisu uvedeného pro obrázek 9.

Obrázek 14: Příprava lidského inzulínu z hybridního polypeptidů proinzulinu exprimovaného z plazmidu pDBAST-LAT ze surového intracelulámího precipitátu jako funkce času používaného kjeho „sbalení“.

Intracelulámí precipitát byl rozpuštěn v pufru o složení 20 mM glycin-NaOH, 33 μΜ EDTA, pHll,2. koncentrace rozpouštěného precipitátu byla přibližně rovna hodnotě 2,6jednotek absorbance měřené při 280 nm na mililitr roztoku (2,6 A₂go/ml). pH bylo upraveno 10N hydroxidem sodným na hodnotu 12. Roztok byl míchán po dobu 10 minut. pH bylo následně upraveno titrací koncentrovanou kyselinou chlorovodíkovou na hodnotu 11,2. Bylo přidáno aktivní uhlí (Sigma), promyté kyselinou, a to na výslednou koncentraci 0,1 % w/v promyté kyselinou, a to na výslednou koncentraci 0,1 % w/v a směs byla míchána po dobu dalších 30 minut. Suspenze byla centrifugována (20 minut, 12 000 otáček/minuta) při teplotě 20 °C. Částečně vyčištěný supematant po certifugaci měl absorbanci při vlnové délce 280 nm (A₂go) přibližně 2,15. Do supemantantu byla přidána kyselina askorbová na výslednou koncentraci 3 mM. „Sbalení“ hybridního polypeptidů proinzulinu probíhalo při pokojové teplotě (22 až 23 °C) za intenzivního míchání, postupem popsaným výše.

V různých časových intervalech byly v průběhu experimentu odebírány vzorky směsi o objemu 10 ml, bylo u nich upraveno pH na hodnotu pH 8,8 a tyto vzorky byly po dobu jedné hodiny při teplotě 37 °C v přítomnosti 50 μΜ ZnCl₂ vystaveny působení karboxypeptidázy B (1:1 000 w/w) a trypsinu (1:2 000 w/w). Štěpení bylo ukončeno okyselením směsi. Obsah inzulínu v každém štěpeném vzorku byl určen pomocí RP-HPLC analýzy, tak jak je popsáno u obrázku 9. Průběh reakce „sbalování“ je zřejmý ze zvýšení hladiny inzulínu (po štěpení) a snížení hladiny volných thiolových skupin, jejichž množství je určeno pomocí Ellmanovy reakce (16).

Symbolem kolečka jsou označeny body křivky závislosti koncentrace inzulínu vyjádřené v % na čase „sbalování“, symboly kosočtverce prochází křivka závislosti koncentrace volných thiolových skupin vyjádřená v % na době trvání „sbalování“ peptidu.

Plazmidy pBAST-R, pDBAST-LAT a pXBAST-LAT byly 26. července 1993 uloženy v hostitelských buňkách E. coli v souladu s Budapešťskou smlouvou o ukládání mikroorganizmů pro účely patentového řízení v depozitní sbírce kultur ATCC, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 pod přístupovými čísly 69362 (pBAST-R), 69361 (pBAST-LAT) a 69363 (pZBAST-LAT).

Termín „hybridní polypeptid“, používaný v přihlášce zahrnuje signální peptid kovalentně připojený k požadovanému polypeptidů. Hybridní polypeptid podle vynálezu obsahuje proinzulin a ve výhodném provedení obsahuje rovněž signální peptid SOD.

Termín „sbalení“, používaný v přihlášce, zahrnuje „sbalení“ hybridního polypeptidů obsahujícího proinzulin, kteiý nebyl před „sbalením“ štěpen bromkyanem ani podroben sulfitolýze, přičemž „správné sbalení“ umožňuje vytvoření příslušných disulfidických vazeb v hybridním polypeptidu.

-6CZ 290079 B6

Slovní spojení „vytvoření „sprvných“ (příslušných) disulfidických vazeb v hybridním polypeptidu“, používané v popisu vynálezu, zahrnuje vznik tří disulfidických vazeb u inzulínu, a to mezi Cys®⁷ a Cys^A7, Cys®¹⁹ a Cys^A2° a mezi Cys^A6 a Cys^A11 (cysteinové zbytky jsou číslovány podle jejich číslování v maturovaném inzulínu).

Termín „proinzulin“, používaný v popisu, zahrnuje polypeptid, který obsahuje ve směru od N-konce k C-konci řetězce B, C a A inzulínu.

Slovní spojení „peptidový řetězec C inzulínu“, používané v popisu, zahrnuje přirozeně se vyskytující peptid C a každé jiné oligopeptidy, dipeptidy nebo jednotlivé aminokyseliny, které mohou být odštěpeny působením trypsinu a karboxypeptidázy B.

Slovní spojení „signální peptid“, používané v popisu zahrnuje každý peptid nebo polypeptid kovalentně připojený k řetězci B inzulínu, který umožňuje „správné sbalení“ a vznik příslušných („správných“) disulfidických vazeb a může být odštěpen působením trypsinu. Signálním peptidem je ve výhodném provedení peptid SOD.

Termín „SOD“, používaný v popisu, zahrnuje jakoukoliv podstatnou část aminokyselinové sekvence enzymů CuZnSOD nebo MnSOD. Výše zmíněná část nemusí nutně mít stejnou biologickou aktivitu jako peptid SOD, a rovněž nemusí mít, ve srovnání s aminokyselinovou sekvencí přirozeně se vyskytujícího peptidu SOD, identickou aminokyselinovou sekvenci. DNA kódující peptid SOD může být mutována způsoby, které jsou odborníkům známé, například Bauer a další, Gene 37: 73 až 81 (1985).

Slovní spojení „signální peptid“ může zahrnovat, namísto peptidu SOD, jakýkoliv další peptid, polypeptid nebo protein nebo každou podstatnou část aminokyselinové sekvence takového peptidu, polypeptidu nebo proteinu, kde výše zmíněná část nutně nemusí mít biologickou aktivitu výše zmíněného peptidu, polypeptidu nebo proteinu, a rovněž nemusí mít, ve srovnání s aminokyselinovou sekvencí přirozeně se vyskytujícího peptidu, polypeptidu nebo proteinu, identickou aminokyselinovou sekvenci; signální peptid musí nicméně umožnit „správné sbalení“ a vytvoření „správných“ disulfidických vazeb v hybridním polypeptidu.

Termín „inzulín“, používaný v popisu, může zahrnovat homolog přirozeně se vyskytujícího inzulínu.

Termín „proinzulin“, používaný v popisu, může zahrnovat homolog přirozeně se vyskytujícího proinzulinu.

Termín „homolog“, používaný v popisu, vztahující se k polypeptidu inzulínu produkovaného způsoby podle vynálezu, je polypeptid, který má v podstatě stejnou aminokyselinovou sekvenci a biologickou aktivitu jako inzulín. Čili homolog, vzniklý způsoby podle vynálezu, se může lišit od polypeptidu inzulínu přidáním, odstraněním nebo náhradou (substitucí) jednoho či více postradatelných aminokyselinových zbytků za předpokladu, že u vzniklého polypeptidu je zachována biologická aktivita inzulínu. Odborníci mohou snadno učinit, jaké aminokyselinové zbytky mají být přidány, odstraněny nebo nahrazeny (včetně toho pomocí jakých aminokyselin se takové náhrady mají provést) pomocí zavedených známých postupů. Takovými postupy jsou například postupy navržení a zhotovení sekvence DNA kódující gen pro bakteriální expresi polypeptidových homologů polypeptidu podle vynálezu, modifikace cDNA a genomových sekvencí pomocí místně specifických mutagenezí, konstrukce a rekombinantních proteinů a expresivních vektorů, bakteriální exprese polypeptidů a měření biochemické aktivity polypeptidů použitím obvyklých biochemických stanovení.

Shora uvedené definice homologů inzulínu platí stejně pro homology proinzulinu.

-7CZ 290079 B6

Příkladem homologů inzulínu, vytvořených způsoby podle vynálezu, jsou deleční homology neobsahující všechny aminokyselinové zbytky přirozeně se vyskytujícího inzulínu, substituční homology, kde je jeden nebo přesně stanovený počet zbytků nahrazen jinými zbytky a adiční homology, kde je přidán jeden nebo více aminokyselinových zbytků ke koncové nebo prostřední části polypeptidu inzulínu, přičemž všechny tyto homology mají biologickou aktivitu inzulínu.

Příklady homologů jsou analogy inzulínu popsané v Přihlášce EP 384472 a také analog inzulínu „Humalog“ od firmy Eli Lilly, jak byl popsán v „Eli Lilly and Company Report to Shareholders 1992“.

Slovní spojení „v podstatě stejné aminokyselinové sekvence“, definované v popisu, zahrnuje substituce a/nebo delece a/nebo přidání aminokyselinové sekvence a může zahrnovat až deset zbytků, které odpovídají homologickým nebo ekvivalentním skupinám, jak bylo popsáno například v publikacích Albert L. Lehninger, Biochemictry, druhé vydání, Worth Publishers lne. (1975), kapitola 4; Creighton, Protein Structure, a Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford, England (1989); Margaret O. Dayhoff, Atlas of Protein Sequence and Structure, Svazek 5, The National Biomedical Research Foundation (1972), kapitola 9. Takové substituce jsou odborníkům známé.

DNA kódující polypeptid inzulínu může být mutována odborníkům známými způsoby, popsanými například v publikaci Bauer a další, Gene 37: 73 až 81 (1985). Mutovaná sekvence může být vložena do vhodných expresivních vektorů (popsaných v popisu), které jsou zavedeny do buněk a zpracovány tak, že mutovaná DNA umožňuje expresi polypeptidového homologů.

Plazmidy podle vynálezu, které obsahují sekvenci kódující hybridní polypeptid obsahující proinzulin, mohou být upraveny pro expresi v bakteriích, kvasinkách, houbách nebo živočišných buňkách jako jsou CHO (buňky křeččích ovárií), embryo kuřat, fibroblasty nebo další známé buněčné linie. Tyto plazmidy navíc obsahují regulační prvky nutné pro expresi introdukovaného genu v bakteriích, kvasinkách, houbách nebo v savčích buňkách, které jsou tak vzájemně umístěny vzhledem ke genu hybridního polypeptidu takovým způsobem, aby byla umožněna jeho exprese. Regulační prvky nutné pro expresi zahrnují promotorovou sekvenci pro navázání RNA polymerázy a ribozomální vazebné místo pro navázání na ribozom.

Z plazmidů podle vynálezu je exprimováno hybridní polypeptid obsahující proinzulin.

Odborníci porozumí, že plazmidy uložené ve spojitosti s tímto vynálezem mohou být snadno pozměněny známými postupy (například místně specifickou mutagenezí nebo vložením linkerů) tak, aby byl kódován gen pro expresi homogeních polypeptidů. Takové postupy jsou popsány například v publikaci Sambrook, J., Fritsch, E. F. a Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. vydání, Cold Spring Harbor Laboratoiy Press.

V plazmidu jsou vhodné regulační prvky umístěny vzhledem k DNA kódující hybridní polypeptid zahrnující proinzulin tak, aby řídily expresi hybridního polypeptidu ve vhodné hostitelské buňce. Ve výhodném provedení vynálezu jsou tyto regulační prvky umístěny v protisměru transkripce v blízkosti DNA kódující hybridní polypeptid.

Různá ribozomální vazebná místa (ribosomal binding sites-RBS), například deo RBS, umožňují mRNA kódující hybridní polypeptid obsahující proinzulin (přepsané z DNA) vázat se v hostitelské buňce na ribozomy, a jsou rovněž předmětem vynálezu.

Plazmidy podle vynálezu také obsahují iniciační kodon ATG. DNA kódující hybridní polypeptid zahrnující proinzulin je ve stejném čtecím rámci s iniciačním kodonem ATG.

Plazmidy podle vynálezu také zahrnují sekvenci DNA obsahující počátek replikace z takového bakteriálního plazmidu, který je schopen autonomní replikace v hostitelské buňce. Vhodné

-8CZ 290079 B6 počátky replikace mohou být získány z různých zdrojů, například z plazmidu pBR322 (v ATCC pod přístupovým číslem 37017).

Plazmidy podle vynálezu také zahrnují sekvenci DNA obsahující gen, který je spojený se selektivním nebo fenotypovým znakem, který se projeví tehdy, je-li plazmid přítomen v hostitelské buňce, jako například gen pro rezistenci vůči nějakému antibiotiku, například vůči ampicilinu, chloramfenikolu nebo tetracyklinu.

Příkladem vektorů, které mohou být použity pro expresi DNA kódující hybridní polypeptidy (obsahující proinzulin) jsou viry, příkladem jsou bakteriální viry, například bakteriofágy (například bakteriofág lambda), kosmidy, plazmidy a jiné vektory. Do vhodných vektorů jsou, postupy v současnosti dobře známými, vloženy geny kódující hybridní polypeptidy zahrnující proinzulin. Například využitím konvenčních míst pro restrikční endonukleázy může být vektor a inzert štěpen za vzniku komplementárních konců párujících se navzájem a pomocí DNA ligázy jsou tyto fragmenty spojeny dohromady. Další možností je využití syntetických linkerů obsahujících sekvenci bází komplementární k restrikčnímu místu na vektorovém DNA. Tyto linkery mohou být připojeny k inzertu DNA a následně štěpeny restrikčním enzymem štěpícím v tomto místě. Jsou rovněž použitelné další způsoby.

Z bakteriálních hostitelských buněk jsou upřednostňovány buňky E. coli. příkladem vhodných buněk E. coli jsou kmeny S®733 (cytRstrA) nebo 4300, avšak jako hostitelé pro plazmidy mohou být použity i další kmeny E. coli nebo jiné bakterie.

Jako hostitelé mohou být použity jakékoliv bakterie, včetně auxotrofních (například AI645), fototrofních (například A4255) a lyzogenních kmenů; kmenů F⁺ a F~; kmenů obsahující sekvenci represoru cI857 zprofágaX (například AI645 a A4255) a kmenů postrádajících represory deo a/nebo gen deo (viz Přihláška EP č. 0303972, publikovaná 22. února 1989). Kmeny E. coli 8Φ733 a 4300 byly uloženy v ATCC pod přístupovým číslem 69361 resp. 69363.

Všechny hostitelské kmeny E. coli popsané výše mohou být „zbaveny“ plazmidů, které obsahují, postupy v současnosti dobře známými, například metodou s využitím ethidiumbromidu popsanou v publikaci R. P. Novick: Bacteriol. Review 33, 210 (1969).

Vynález popisuje způsob produkce inzulínu, což zahrnuje „správné sbalení“ hybridního polypeptidu obsahující proinzulin v podmínkách, které umožňují vytvoření příslušných disulfidických vazeb, vystavení sbaleného hybridního polypeptidu obsahujícího tyto disulfidové vazby působení enzymů, jejichž činností dojde ke vzniku inzulínu a purifikaci inzulínu. Takto získaný inzulín má stejnou aktivitu a vlastnosti jako komerčně dostupný lidský inzulín.

Ve výhodném provedení vynálezu krok „sbalení“ zahrnuje inkubaci hybridního polypeptidu při přibližně 4 až 37 °C po dobu 1 až 30 hodin v roztoku o pH přibližně 8,5 až 12,0.

V jiném výhodném provedení vynálezu krok „sbalení“ zahrnuje inkubaci hybridního polypeptidu při přibližně 4 až 37 °C po dobu 1 až 30 hodin v roztoku o pH přibližně 8,5 až 12,0 za přítomnosti kyseliny askorbové.

Ve zvláště výhodném provedení vynálezu je během kroku „sbalení“ pH v rozmezí 11,0 až 11,25.

V jiném zvláště výhodném provedení vynálezu je koncentrace kyseliny askorbové přibližně 2 mol najeden mol skupin SH přítomných ve směsi, ve které dochází ke „sbalení“ polypeptidu.

V ještě jiném výhodném provedení vynálezu je doba inkubace přibližně 5 hodin.

-9CZ 290079 B6

V jiném provedení vynálezu zahrnuje proces přípravy inzulínu upravení pH roztoku na hodnotu přibližně 8,8 až 9,0 a štěpení hybridního polypeptidu působením trypsinu a karboxypeptidázy B při teplotě 16 až 37 °C po dobu v rozmezí 30 minut až 16 hodin.

V jiném provedení vynálezu zahrnuje proces čištění chromatografii na DEAE-Sepharóze a metodu RP-HPLC.

V ještě jiném provedení vynálezu zahrnuje proces čištění dále ultrafiltraci a chromatografii na CM-Sepharóze.

V jiném zvláště výhodném provedení vynálezu je hybridní polypeptid proinzulinu exprimován z plazmidu pDBAST-LAT uloženého v ATCC pod přístupovým číslem 69361.

V jiném zvláště výhodném provedení vynálezu je hybridní polypeptid proinzulinu exprimován z plazmidu pXBAST-LAT uloženého v ATCC pod přístupovým číslem 69363.

V jiném provedení vynálezu je hybridní polypeptid proinzulinu exprimován z plazmidu pBAST-R uloženého v ATCC pod přístupovým číslem 69362

Ve výhodném provedení vynálezu je hybridní polypeptid získán působením na bakteriální buňky obsahující DNA kódující hybridní polypeptid, přičemž toto působení vede k expresi zmíněné DNA. Dalším krokem je získání hybridního polypeptidu z těchto buněk.

Zmíněné působení zahrnuje fermentací v přítomnosti glukózy, glycerolu nebo galaktózy.

Dále se počítá stím, že proces získání hybridního polypeptidu z buněk zahrnuje rozrušení buněčné stěny bakteriálních buněk nebo jejich částí za vzniku lyzátu, oddělení intracelulámího precipitátu od lyzátu pomocí centrifugace, solubilizaci precipitátu a možnost čištění hybridního polypeptidu chromatografií nebo ultrafiltraci.

Vynález dále popisuje polypeptid obsahující proinzulin a signální peptid připojený kN-konci proinzulinu, kde je zmíněný polypeptid správně „sbalen“ a obsahuje odpovídající („správné“) disulfidické vazby.

Ve výhodném provedení vynálezu je signální peptid odvozen od N-koncové oblasti CuZnSOD.

Ve zvláště výhodném provedení vynálezu obsahuje signální peptid sekvenci 62 aminokyselin, kterým předchází methionin a po nichž následuje arginin.

Ve výhodném provedení vynálezu obsahuje proinzulin řetězec B inzulínu spojený s řetězcem A inzulínu pomocí jediného argininového zbytku.

V jiném provedení vynálezu obsahuje proinzulin řetězec B inzulínu spojený s řetězcem A inzulínu pomocí dipeptidu Lys-Arg.

Výše zmíněné dvě molekuly proinzulinu musí být produkovány ve formě hybridních proteinů, jinak jsou hladiny exprese extrémně nízké a komerčně nevýznamné.

Ve všech výhodných provedeních vynálezu byly cysteinové zbytky v signálním peptidu nahrazeny serinovými zbytky.

-10CZ 290079 B6

Příklady provedení vynálezu

Následující příklady provedení vynálezu jsou uvedeny za účelem snazšího porozumění vynálezu, a nejsou zamýšleny a ani by neměly být interpretovány jako nějaká omezení vynálezu. V příkladech provedení vynálezu nejsou uvedeny detailní popisy konvenčních způsobů využívaných při konstrukci vektorů, vkládání genů kódujících polypeptidy do takových vektorů nebo vnášení takto vzniklých plazmidů do hostitelských buněk. V příkladech provedení vynálezu nejsou rovněž uvedeny detailní popisy konvenčních způsobů využívaných při analýze polypeptidů produkovaných z těchto vektorů umístěných v hostitelských buňkách. Tyto způsoby jsou odborníkům dobře známy a jsou popsány v řadě publikací včetně například následující publikace:

Sambrook J., Fritsch E. F. a Maniatis T. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual,

2. vydání, Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Příklad 1

Konstrukce expresivních plazmidů pBAST-R, pDBAST-LAT a pXBAST-LAT exprimujících hybridní polypeptidy SOD-proinzulin

Byly vytvořeny bakteriální expresivní vektory, které v nadměrné míře v buňkách E. coli produkují hybridní proteiny, přičemž exprese je řízena promotory PiP₂ nebo XPl- Jelikož bylo zjištěno, že bakterie nesoucí expresivní vektor kódující „řetězec B inzulinu-Lys-Arg-řetězec A inzulínu“ neprodukují tento polypeptid v detekovatelném množství, byl proinzulin produkován jako hybridní protein. Tyto hybridní proteiny obsahují signální peptid o délce 62 aminokyselin je odvozen od N-konce sekvence CuZnSOD (11), přičemž tomuto signálnímu peptidu předchází methioninový aminokyselinový zbytek a na C-konci je následován argininovým aminokyselinovým zbytkem, který jej připojuje k řetězci B inzulínu. Řetězec B je k řetězci A inzulínu připojen krátkým peptidem řetězce C, který obsahuje Lys-Arg nebo Arg. Dva cysteiny původně přítomné v oblasti SOD byly nahrazeny serinovými zbytky.

A. Plazmid pBAST-R

Byla vytvořena série plazmidů na jejímž konci je plazmid pBAST-R, který byl poté, co jím byly transformovány vhodné hostitelské buňky E. coli, schopný řídit expresi hybridního polypeptidu proinzulinu použitelného k produkci lidského inzulínu.

Struktura plazmidu pBAST-R, který kóduje hybridní polypeptid „SOD-řetězec B inzulinu-LysArg-řetězec A inzulínu“, je zobrazena na obrázku 3; sekvence DNA a odpovídající aminokyselinová sekvence jsou zobrazeny na obrázku 6.

Plazmid pBAST-R má velikost přibližně 4 380 bp a obsahuje následující části (proti směru hodinových ručiček):

1. Fragment DNA o velikosti 1521 párů bází zahrnující oblast plazmidu pBR322 ohraničenou restrikčními místy AatlI-MscI, která obsahuje gen pro rezistenci vůči tetracyklinu.

2. Fragment DNA o velikosti 1497 párů bází zahrnující oblast plazmidu pBR322 ohraničenou restrikčními místy Scal-Haell, která obsahuje zkrácený gen pro rezistenci vůči ampicilinu a počátek replikace DNA.

3. Fragment DNA o velikosti 930 párů bází zahrnující oblast DNA bakterií E. coli ohraničenou restrikčními místy AvaH-Ndel, která obsahuje promotory deo PiP₂ a ribozomální vazebné místo (RBS) (13).

-11 CZ 290079 B6

4. Fragment DNA o velikosti 188 párů bází zahrnující oblast lidské cDNA kódující CuZnSOD ohraničenou restrikčními místy Ndel-PpuML Cysteiny v pozicích 6 a 57 v maturovaném SOD nahrazeny, s využitím místně specifické mutageneze oligonukleotidů (12), serinovými zbytky.

5. Uměle připravený fragment DNA o velikosti 172 párů bází ohraničený restrikčními místy PpuMI-BamHI. Tato oblast kóduje „Arg-řetězec B inzulinu-Lys-Arg-řetězec A inzulínu“.

6. Uměle připravený polylinker o velikosti 36 párů bází obsahující množství klonovacích míst a ohraničený restrikčními místy BamHI a HindHI.

7. Uměle připravený oligonukleotid o velikosti 44 párů bází obsahující terminátor transkripce TrpA a ohraničený restrikčními místy HindUI a AaťU (10).

Plazmid pBAST-R, který nese gen pro rezistenci vůči tetracyklinu, a který kóduje hybridní polypeptid „SOD-řetězec B inzulinu-Lys-Arg-řetězec A inzulínu“, byl vnesen do buněk E. coli kmene SO733 (cytRstrA) a 26. července 1993 uložen v ATCC pod přístupovým číslem 69362.

B. Plazmid pBAST-LAT

Byla vytvořena jiná série plazmidů na jejímž konci je plazmid pDBAST-LAT, který byl poté, co jím byly transformovány vhodné hostitelské buňky E. coli, schopný řídit vysokou hladinu exprese hybridního polypeptidu proinzulinu použitelného k produkci lidského inzulínu.

Struktura plazmidů pDBAST-LAT, který kóduje hybridní polypeptid „SOD-řetězec B inzulinuArg-řetězec A inzulínu“, je zobrazena na obrázku 4; sekvence DNA a odpovídající aminokyselinová sekvence jsou zobrazeny na obrázku 7.

Plazmid pBAST-R má velikost přibližně 4377 bp a obsahuje následující části (proti směru hodinových ručiček):

1. Fragment DNA o velikosti 1521 párů bází zahrnující oblast plazmidů pBR322 ohraničenou restrikčními místy AatH-MscI, která obsahuje gen pro rezistenci vůči tetracyklinu.

2. Fragment DNA o velikosti 1497 párů bází zahrnující oblast plazmidů pBR322 ohraničenou restrikčními místy Scal-Haell, která obsahuje zkrácený gen pro rezistenci vůči ampicilinu a počátek replikace DNA.

3. Fragment DNA o velikosti 930 párů bází zahrnující oblast DNA bakterií E. coli ohraničenou restrikčními místy Avall-Ndel, která obsahuje promotory deo P1P2 a ribozomální vazebné místo (RBS) (13).

4. Fragment DNA o velikosti 188 párů bází zahrnující oblast lidské cDNA kódující CuZnSOD ohraničenou restrikčními místy Ndel-PpuMI. Cysteiny v pozicích 6 a 57 v maturovaném SOD byly nahrazeny, s využitím místně specifické mutageneze oligonukleotidů (12), serinovými zbytky a obsah párů CG v tomto fragmentu byl, rovněž s využitím místně specifické mutageneze oligonukleotidů (12), snížen na 38 %.

5. Uměle připravený fragment DNA o velikosti 169 párů bází ohraničený restrikčními místy PpuMI-BamHI. Tato oblast kóduje „Arg-řetězec B inzulinu-Arg-řetězec A inzulínu“.

6. Uměle připravený polylinker o velikosti 36 párů bází obsahující množství klonovacích míst a ohraničený restrikčními místy BamHI a HindlII.

- 12CZ 290079 B6

7. Uměle připravený oligonukleotid o velikosti 44 párů bází obsahující terminátor transkripce TrpA a ohraničený restrikčními místy HindlU a Aatn (10).

Plazmid pDBAST-LAT, kteiý nese gen pro rezistenci vůči tetracyklinu, a který kóduje hybridní polypeptid „SOD-řetězec B inzulinu-Arg-řetězec A inzulínu“, byl vnesen do buněk E. coli kmene S<I>733 (cytRstrA) a 26. července 1993 uložen v ATCC pod přístupovým číslem 69361.

C. Plazmid pXBAST-LAT

Byla vytvořena jiná série plazmidů na jejímž konci je plazmid pXBAST-LAT, který byl poté, co jím byly transformovány geneticky upravené hostitelské buňky E. coli (nesoucí represor cI857), schopný řídit vysokou hladinu exprese hybridního polypeptidu proinzulinu použitelného k produkci lidského inzulínu.

Struktura plazmidů pXBAST-LAT, který kóduje hybridní polypeptid „SOD-řetězec B inzulinuArg-řetězec A inzulínu“, je zobrazena na obrázku 5; sekvence DNA a odpovídající aminokyselinová sekvence jsou zobrazeny na obrázku 7.

Plazmid pXBAST-LAT má velikost přibližně 3777 bp a obsahuje následující části (proti směru hodinových ručiček):

1. Fragment DNA o velikosti 1521 párů bází zahrnující oblast plazmidů pBR322 ohraničenou restrikčními místy AatlI-MscI, která obsahuje gen pro rezistenci vůči tetracyklinu.

3. Fragment DNA o velikosti 330 párů bází zahrnující oblast plazmidů pSODal3 (14) ohraničenou restrikčními místy BamHI-EcoRI, která obsahuje promotor XP_L a fragment o velikosti 30 párů bází obsahující ribozomální vazebné místo (RBS) ohraničený restrikčními místy AvrlI-Ndel.

4. Fragment DNA o velikosti 188 párů bází zahrnující oblast lidské kódující CuZnSOD ohraničenou restrikčními místy Ndel-PpuMI. Cysteiny v pozicích 6 a 57 v maturovaném SOD byly nahrazeny, s využitím místně specifické mutageneze oligonukleotidů (12), serinovými zbytky a obsah CG v tomto fragmentu byl, rovněž s využitím místně specifické mutageneze oligonukleotidů (12), snížen na 38 %.

7. Uměle připravený oligonukleotid o velikosti 44 párů bází obsahující terminátor transkripce TrpA a ohraničený restrikčními místy HindlII a Aatn (10).

Plazmid pXBAST-LAT, který nese gen pro rezistenci vůči tetracyklinu, a který kóduje hybridní polypeptid „SOD-řetězec B inzulinu-Arg-řetězec A inzulínu“ pod kontrolou promotoru XP_L, byl vnesen do buněk E. coli kmene 4300 (F~, bio, cl⁸⁵⁷) a 26. července 1993 uložen v ATCC pod přístupovým číslem 69363.

CZ 290079 B6

Bakteriální buňky byly množeny při 30 °C. Produkce hybridních polypeptidů byla indukována zvýšením teploty na 42 °C.

Příklad 2

Fermentace, podmínky růstu a purifíkace hybridních polypeptidů proinzulinu

I. Zásobník kultury

Zásobní kultura buněk E. coli kmene SO733 nesoucí plazmid pDBAST-LAT (nebo pBAST-R) byla pěstována v kaseinovém médiu (20 g/litr hydrolyzátu kaseinu, 10 g/litr kvasničného hydrolyzátu a 5 g/litr NaCl) doplněném tetracyklinem (lOmg/litr). Buněčné kultury byly následně dvakrát zředěny zamražovacím médiem a skladovány při -80 °C.

Zamražovací médium:

K₂HPO₄kh₂po₄citronan sodný MgSO₄.7H₂O (NHi)₂SO₄glycerol celkový objem

6,3 gramů 1,8 gramů 0,45 gramů 0,09 gramů 0,9 gramů 44 gramů 500 ml

Π. Inokulum (kultura pro zaočkování)

Kultura pro zaočkování byla pomnožena v médiu pro produkci peptidů (viz dále). Sterilní médium umístěné v kultivačních lahvích bylo zaočkováno ze zásobní kultuiy a inkubováno po dobu 15 hodin na třepačce při 37 °C a rychlosti třepání přibližně 200 ot./min. Bylo-li to zapotřebí, byly následující fáze kultivace buněk prováděny za stálého třepání ve v provzdušněných fermentorech. Pomocí 2 až 10% kultury z kultivačních lahví bylo inokulováno sterilní médium a takto inokulované médium bylo za stálého třepání a přívodu vzduchu (aby byla udržována hladina rozpuštěného kyslíku nad 20 % nasycení vzduchem) inkubováno po dobu 15 hodin při 37 °C při pH 7±0,5.

ΙΠ. Produkce peptidů (exprese)

Médium pro produkci peptidů:

K₂HPO₄ kh₂po₄citronan sodný NFfiCl K₂SO₄ FeSO₄.7H₂O MgSO₄.7H₂O CaCl₂.2H₂O	8 g/litr 2 g/litr 2 g/litr 3 g/litr 0,6 g/litr 0,04 g/litr 0,4 gramů 0,02 g/litr
roztok stopových prvků tetracyklin glukóza glycerol	3 ml/litr 0,01 g/litr 2 g/litr 1 ml/litr

Roztok stopových prvků:

MnSO₄.H₂O

ZnSO₄.7H₂O

CoC1₂.7H₂O g/litr

2,78 g/litr

Na₂MoO₄.2H₂O

CaCl₂.2H₂O

CuSO₄.5H₂O

H3BO3 g/litr g/litr g/litr

Hel (32 %)

1,85 g/litr

0,5 g/litr 100 ml/litr

Médium pro produkci polypeptidů bylo zaočkováno pomocí 0,5 až 10 % kultury pro inokulaci a inkubováno při 37 °C. Rychlost třepání a rychlost přísunu vzduchu byly nastaveny tak, aby byla udržována hladina rozpouštěného kyslíku na hodnotě 20 % nasycení vzduchem. pH bylo udržováno pomocí NH3 na hodnotě 7±0,2.

K médiu byly, za účelem dodání energetického zdroje a zdroje uhlíku, přidány sterilní roztoky glukózy (50 % roztok) a glycerolu (30 % roztok). Jakmile dosáhla koncentrace buněk hodnoty OD₆6o=25, byly do média přidány sterilní roztoky glukózy (10 % roztok) a glycerolu (30 % roztok) a růst pokračoval dalších přibližně 5 hodin, až koncentrace buněk dosáhla přibližně hodnoty OD₆6o⁼60. Kultura byla následně ochlazena a buňky byly odděleny centrifugách Fermentace buněk E. coli za přítomnosti buď glykózy, glycerolu nebo galaktózy nebo jejich směsí jako zdroje uhlíku, usnadňovala expresi hybridních polypeptidů SOD-proinzulin.

IV. Purifikace

Hybridní polypeptidy SOD-proinzulin exprimované z plazmidů pBAST-R a pDBAST-LAT se hromadily v intracelulámím precipitátu (sraženině), dokud byly izolovány následujícím postupem: bakteriální peleta o hmotnosti 1 gram (hmotnost před vysušením) byla rozsuspendována v 10 ml pufru obsahujícího 50 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA, pH 8, a vzniklá suspenze byla na 2 hodiny při 37 °C vystavena působení lysozymu (Měrek, 2500 jednotek/ml). Následně byla směs sonikována a byl do ní přidán Nonidet-P-40 (Sigma) nebo Triton-X100 na výslednou koncentraci 2 % a směs byla míchána při pokojové teplotě po dobu 2 hodin. Precipitát byl izolován centrifugací a promyt vodou.

Hybridní polypeptidy byly, s využitím chromatografie na anexu, purifikovány téměř do homogenity následovně. Precipitát byl rozpuštěn v pufru o složení 8 M močovina, 20 mM TrisHCl, 200 mM β-merkaptoethanol, pH 8,2. Vzniklý roztok byl vyčeřen centrifugací a nanesen na kolonu Fast-Flow s DEAE-Sepharózou (Pharmacia LKB) předem ekvilibrovanou v pufru o složení 8M močovina, 20 mM Tris-HCl, 20 mM β-merkaptoethanol, pH 8,2. Materiál proteklý kolonou byl zachycen a hybridní protein byl vysrážen pomocí (NEL^SCU při 40 % saturaci (nasycení) nebo zakoncentrován ultrafiltrací na membráně 10K. Poté následovala diafíltrace proti roztoku 100 mM glycin-HCl, pH 3,1.

V jiném postupu byl hybridní polypeptid SOD-proinzulin exprimovaný z plazmidů pBAST-R purifikován téměř do homogenity rozpuštěním v pufru o složení 8M močovina, 20mM dithiothreitol, 50 mM octan sodný, pH 5 a následnou ultrafiltrací přes membrány 100 kD a 50 kD (Filtron). Tento hybridní polypeptid byl zakoncentrován na membráně 10 kD a vysrážen pomocí (ΝΗ4)₂8Ο₄ při 40 % saturaci.

-15CZ 290079 B6

Příklad 3 „Sbalení“ a enzymatické štěpení hybridních polypeptidů SOD-proinzulin

Hybridní polypeptidy proinzulinu, získané vysrážením pomocí (NHjXSOí nebo ultrafiltraci (příklad 2), byly rozpuštěny v pufru o složení 8M močovina, 5 mM HC1 a zředěny do pufru obsahujícího 100 mM glycin, pH8,5 až 12,0 tak, aby výsledná koncentrace polypeptidů byla přibližně 1 mg/ml.

A. Aby bylo umožněno vytvoření „správných“ disulfídových vazeb, probíhalo „sbalení“ hybridního polypeptidu SOD-proinzulinu, exprimovaného z plazmidů pBAST-R, při teplotě přibližně 4 až 37 °C po dobu 1 až 24 hodin. pH roztoku obsahujícího „sbalený“ hybridní polypeptid se správně vytvořenými disulfidovými vazbami bylo pomocí HC1 upraveno na hodnotu přibližně 8,8 až 9,0a protein byl při 16 až 37 °C po dobu 30 až 120 minut vystaven působení trypsinu a karboxypeptidázy B. Po provedení velkého množství exprimentů bylo zjištěno, že optimální podmínky jsou následující: hybridní polypeptid exprimovaný z plazmidů pBAST-R byl rozpuštěn v pufru o složení 8M močovina, 5 mM HC1 a zředěn do pufru obsahujícího 100 mM glycin o pH 11 (obrázek 8) tak, aby výsledná koncentrace polypeptidů byla přibližně 1 mg/ml. Následovalo „sbalování“ hybridního polypeptidu při 25 °C po dobu 6 až 16 hodin a poté byl „sbalený“ hybridní polypeptid se správně vytvořenými disulfidovými vazbami při 37 °C po dobu 30 až 60 minut štěpen trypsinem (1:500 w/w) a karboxypeptidázou B (1:200 w/w). Vznik inzulínu ze „sbaleného“ hybridního polypeptidu, se správně vytvořenými disulfidovými vazbami, exprimovaného z plazmidů pBAST-R enzymatickým štěpením je schematicky znázorněn na obrázku 1.

B. Aby bylo umožněno vytvoření „správných“ disulfídových vazeb, probíhalo „sbalení“ hybridního polypeptidu SOD-proinzulin, exprimovaného z plazmidů pDBAST-LAT, při teplotě přibližně 7 až 31 °C po dobu 5 až 30 hodin. pH roztoku obsahujícího „sbalený“ hybridní polypeptid se správně vytvořenými disulfidovými vazbami bylo pomocí HC1 upraveno na hodnotu přibližně 8,8 až 9,0 a protein byl přibližně při 22 až 37 °C po dobu 30 minut až 16 hodin vystaven působení trypsinu a karboxypeptidázy B. Po provedení velkého množství experimentů bylo zjištěno, že optimální podmínky jsou následující: hybridní polypeptid exprimovaný z plazmidů pBAST-R byl rozpuštěn v pufru o složení 8M močovina, 5 mM HC1 a zředěn do pufru obsahujícího 100 mM glycin o pH 11,0 až 11,25 (obrázek 8) tak, aby výsledná koncentrace polypeptidů byla přibližně 1 mg/ml. Následovalo „sbalování“ hybridního polypeptidu při 25 °C po dobu 5 hodin a poté byl „sbalený“ hybridní polypeptid se správně vytvořenými disulfidovými vazbami při 25 °C po dobu 16 hodin štěpen trypsinem (1:15 000 w/w) a karboxypeptidázou B (1:10 000 w/w). Vznik inzulínu ze „sbaleného“ hybridního polypeptidu, se správně vytvořenými disulfidovými vazbami, exprimovaného z plazmidů pDBAST-LAT enzymatickým štěpením je schematicky znázorněn na obrázku 2.

Příklady specifických podmínek pro výše zmíněné postupy A. a B. jsou detailně popsány v popisu obrázků na výkresech, obrázky 8 až 14.

Příklad 4

Proteinová analýza a purifikace lidského inzulínu produkovaného z hybridního polypeptidu SOD-proinzulin exprimovaného z plazmidů pBAST-R.

Tvorba lidského inzulínu z hybridního polypeptidu SOD-proinzulin exprimovaného z plazmidů pBAST-R byla analyzována radioimunostanovením (RIA) a HPLC na obrácené fázi (RP-HPLC) za použití komerčně dodávaného lidského inzulínu jako standardu (Calbiochem). Teoretický výtěžek rekombinantního lidského inzulínu, jak byl vypočítán z aminokyselinové

-16CZ 290079 B6 sekvence hybridního polypeptidů proinzulinu, je 45,6 %. Z obrázku 8 je zřejmé, že optimální pH pro správné „sbalení“ je 11. Při této hodnotě pH odpovídá množství vytvořeného inzulínu přibližně 80 % teoretického výtěžku (který odpovídá přibližně 40 % hybridního polypeptidů na počátku). Lidský inzulín produkovaný z hybridního polypeptidů proinzulinu exprimovaného z plazmidu pBAST-R byl detekován pomocí RP-HPLC. Byla použita kolona Vydac 218TP54 o rozměrech 250 x 4,6 mm (vnitřní průměr, separační kolona), 5 pm, velikost pórů 30 nm a měření probíhalo při pokojové teplotě při průtoku 1 ml/min. Jako eluent A byla použita 0,1 % kyselina trifluoroctová (TFA) v H₂O a jako eluent B byla použita 0,08 % kyselina trifluoroctová v acetonitrilu. Kolona byla po dobu 5 minut promývána ekvilibračním pufrem (25 % eluent B) a poté, v intervalu 37,5 minut, následovalo promývání gradientem eluentu B v rozmezí 25 až 50 % objemu. Absorbance byla sledována při vhodných délkách 220 nm a 280 nm. Analýza lidského inzulínu, která byla pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografíe s kolonou s obrácenou fází prováděna po enzymatickém štěpení „sbaleného“ hybridního polypeptidů se správně vytvořenými disulfídovými vazbami, odhalila hlavní pík s retenčním časem odpovídajícím retenčnímu času standardního lidského inzulínu.

Byly připraveny dvě malé šarže lidského inzulínu s výtěžky 13 mg. Lidský inzulín byl purifikován z roztoku vystaveného působení enzymů (pH 9) s využitím ultrafiltrace přes membrány 3K nebo 5K (Filtron) následované chromatografií na sloupci CM-Sepharózy (citrátový pufr, pH3). Hlavní frakce byly odsoleny, lyofilizovány a byla v nich určena aminokyselinová analýza a N-koncová aminokyselinová sekvence. Aminokyselinové složení obou vzorků rekombinantního lidského inzulínu bylo v podstatě identické s přirozeně se vyskytujícím lidským inzulínem (tabulka 1, vzorek 1). Sekvence 5 aminokyselin na N-konci vzorků inzulínu byla stanovena Edmanovým odbouráváním. Tyto sekvence se ukázaly být identické s N-konci jak řetězec A, tak řetězec B lidského inzulínu, což potvrdilo autenticitu produktu připraveného in vitro.

Výsledky sekvence nicméně rovněž ukázaly přítomnost argininového zbytku na první pozici a tento se vyskytoval u přibližně 25 % molekul (nevyskytuje se u „standardního“ lidského inzulínu). Tento výsledek odpovídá štěpení trypsinem mezi argininem a lysinem uvnitř spojovací sekvence Lys-Arg, které zanechá argininový zbytek na N-konci řetězce A.

Bylo zjištěno, že specifické hydrolýzy za argininem (tzn. na straně blíže kC-konci molekuly) pomocí trypsinu může být dosaženo prováděním hydrolyzační reakce v roztoku o pH 11. Při takto zvýšeném pH je většina ε-aminových skupin lysinu nenabitá (pK= 10,3), a tudíž je umožněno selektivní štěpení. Po štěpení trypsinem při pH 11 (tabulka 1, vzorek 2), následovaném štěpením karboxypeptidázou B v roztoku o pH 8,5, byly získány dvě šarže purifikovaného inzulínu s výtěžky 1 mg a 6,5 mg. Sekvenování N-konce polypeptidů odhalilo, že množství inzulínu obsahující nadbytečný arginin bylo sníženo na přibližně 5 % z celkového množství.

Tabulka 1

Aminokyselinové složení rekombinantního lidského inzulínu

	Počet aminokyselinových z	jytků
Aminokyseliny	Teoretický	Standardní inzulín	Vzorek 1	Vzorek 2
Asx	3	3,20	3,38	3,26
Thr	3	2,98	2,83	2,68
Ser	3	2,84	2,53	2,77
Glx	7	7,15	7,73	7,23
Pro	1	1,28	1,13	1,09
Gly	4	4,24	4,39	4,25

- 17CZ 290079 B6

Tabulka 1 - pokračování

	Počet aminokyselinových z	jytků
Aminokyseliny	Teoretický	Standardní inzulín	Vzorek 1	Vzorek 2
Ala	1	1,00	1,28	1,04
Cys	6	5,88	5,11	5,79
Val	4	3,82	4,58	3,88
Ile	2	2,04	1,96	1,96
Leu	6	5,87	6,10	5,99
Tyr	4	3,80	3,80	3,87
Phe	3	3,15	3,56	3,03
His	2	2,04	2,05	2,08
Lys	1	1,01	1,05	1,02
_	1	0,96	1,30	1,18

Data ve sloupcích Vzorek 1 a Vzorek 2 znázorňují aminokyselinové složení rekombinantního lidského inzulínu získaného z hybridního polypeptidu proinzulinu exprimovaného z plazmidů pBAST-R. Štěpení trypsinem probíhalo buď v pH 9 (vzorek 1) nebo v pH 11 (vzorek 2).

Aminokyselinová analýza byla provedena po oxidaci (prováděna kyselinou peroxomravenčí) a hydrolýze purifikovaných vzorků inzulínu prováděné v plynné fázi.

Příklad 5

Peptidová analýza purifíkovaného lidského inzulínu získaného z hybridního polypeptidu SOD-proinzulinu exprimovaného z plazmidů pBAST-R

U purifíkovaného inzulínu získaného postupem popsaným v předchozích příkladech byla provedena peptidová analýza s využitím endoproteinázy Glu-C (Sigma), která hydrolyzuje peptidové vazby za (tj. k C-konci) glutamátovými aminokyselinovými zbytky.

Podrobnější popis: vzorky inzulínu (100 pg) získané štěpením „sbaleného“ hybridního polypeptidu proinzulinu, exprimovaného z plazmidů pBAST-R, byly po dobu 6 hodin při teplotě 37 °C štěpeny působením 5 pg Glu-C v roztoku o objemu 100 pl o štěpení 0,lM Tris-HCl, pH7,8. Analýza pomocí HPLC byla provedena tak, že vzorky komerčně dostupného (kontrolního) inzulínu získaného štěpením „sbaleného“ hybridního polypeptidu proinzulinu, exprimovaného z plazmidů pBAST-R, byly okyseleny na hodnotu pH přibližně 3 a rozděleny pomocí RP-HPLC. Byla použita kolona Vydac 218TP54 o rozměrech 250x4,6 mm (vnitřní průměr, separační kolona), 5 pm, velikost pórů 30 nm. Kolona byla ekvilibrována pufrem o složení 50 mM fosforečnanu tetramethylamonia, 162 mM NaC10₄, pH3 obsahujícím 31,5 % (v/v) acetonitrilu, Při eluci byl použit lineární gradient 35 až 45 % acetonitrilu po dobu 75 minut při průtoku lml/minuta. Absorbance byla sledována při vlnové délce 220 nm.

V souladu s kontrolní reakcí vznikly očekávané peptidy, i když za pikem odpovídajícím jednomu z fragmentů byla pozorována oblast, která pravděpodobně odpovídá molekule des-Thr(B₃o) podobné inzulínu (15).

Příklady 4 a 5 naznačují, že rekombinantní polypeptid exprimovaný z plazmidů pBAST-R obsahuje sekvenci přirozeně se vyskytujícího lidského inzulínu. Menší část produkce exprimovaných proteinů zahrnuje formy molekul podobných inzulínu jako například Arg (Ao), desamino- nebo des-Thr (B₃o). Tyto nežádoucí vedlejší produkty mohou být odstraněny chromatografíckými postupy, jako například RP-HPLC, jak jsou popsány výše.

-18CZ 290079 B6

Příklad 6

Proteinová analýza a purifikace lidského inzulínu produkovaného z hybridního polypeptidu SOD-proinzulin exprimovaného z plazmidu pDBAST-LAT

Aby bylo možné vyhnout se vzniku vedlejšího produktu Arg (Ao) inzulínu (příklady 4 a 5), byl expresivní plazmid pBAST-R modifikován tak, aby obsahoval DNA kódující v hybridním polypeptidu proinzulinu mezi řetězci A a B pouze pro argininový zbytek a ne dvojici Lys-Arg, nacházející se mezi řetězci A a B v hybridním polypeptidu proinzulinu exprimovaném z plazmidu pBAST-R. Výsledkem jsou expresivní plazmidy pDBAST-LAT (příklad 1B) a pÁBAST-LAT (příklad 1C).

Po „sbalení“ a enzymatickém působení trypsinem a CPB na „sbalený“ hybridní polypeptid proinzulinu se správně vytvořenými disulfidovými můstky, exprimovaný z nového expresivního plazmidu pDBAST-LAT, bylo dosaženo účinné tvorby inzulínu. Přítomnost kontaminujících látek podobných inzulínu byla nevýznamná (obrázek 9). K optimálnímu „sbalení“ došlo při pH 11,25 (obrázek 10) a správné „sbalení“ bylo podstatně urychleno přítomností přibližně 2 mol kyseliny askorbové najeden mol SH skupin v reakční směsi (obrázek 11).

V sérii reakcí, za jinak optimálních podmínek pro správné „sbalení“, byl stanovován vliv koncentrace proteinů na výtěžek inzulínu získaného z hybridního polypeptidu proinzulinu. Optimální výtěžky byly získány v podmínkách, kdy koncentrace proteinu nepřesáhla 1,5 mg/ml (obrázek 13).

Inzulín byl purifikován chromatografii na koloně DEAE-Sepharózy a následnou RP-HPLC (jak je popsáno na obrázku 9). Jak je zřejmé z obrázku 12, získaný rekombinantní lidský inzulín byl eluován ve stejném retenčním čase jako standardní (komerčně dostupný) lidský inzulín. Aminokyselinové složení vzorku purifikovaného rekombinantního lidského inzulínu je totožné s aminokyselinovým složením standardního inzulínu (tabulka 2, rekombinantní inzulín).

Všimněte si, že tabulka 2 ukazuje, že inzulín získaný z hybridního polypeptidu proinzulinu exprimovaného z plazmidu pDBAST-LAT neobsahuje přebytečný argininový zbytek připojený k řetězci A inzulínu (Arg(Ao)inzulin) popsaný v příkladu 4. Plazmid pDBAST-LAT je tedy výhodnější pro produkci inzulínu a upřednostňovaná sekvence kódující hybridní polypeptid proinzulinu je sekvence zobrazená na obrázku 7.

Tabulka 2

Aminokyselinové složení rekombinantního lidského inzulínu

	Počet aminokyselinových zbytků
Aminokyseliny	Teoretický	Standardní inzulín	Rekombinantní inzulín
Asx	3	3,20	3,32
Thr	3	2,98	2,73
Ser	3	2,84	2,71
Glx	7	7,15	7,41
Pro	1	1,28	1,02
Gly	4	4,24	4,46
Ala	1	1,00	1,09
Cys	6	5,88	5,28
Val	4	3,82	4,00

-19CZ 290079 B6

Tabulka 2 - pokračování

	Počet aminokyselinových zbytků
Aminokyseliny	Teoretický	Standardní inzulín	Rekombinantní inzulín
Ile	2	2,04	1,91
Leu	6	5,87	6,34
Tyr	4	3,80	3,64
Phe	3	3,15	3,06
His	2	2,04	2,18
Lys	1	1,01	1,02
Δτβ	1	0,96	1,07

V tabulce je zobrazeno aminokyselinové složení standardního lidského inzulínu arekombinantního inzulínu získaného z hybridního polypeptidu proinzulinu exprimovaného z plazmidu pDBAST-LAT.

Příklad 7

Produkce lidského inzulínu z hybridního polypeptidu proinzulinu exprimovaného z plazmidu pDBAST-LAT ze surového intracelulámího precipitátu

S využitím surového intracelulámího precipitátu byl uskutečněn vylepšený způsob „sbalení“ a enzymatické přeměny hybridního polypeptidu proinzulinu na inzulín. Při tomto postupu byl vypuštěn počáteční krok purifikace popsaný v příkladu 2, oddíl IV. Výsledkem enzymatického štěpení „sbaleného“ hybridního polypeptidu proinzulinu (s vytvořenými disulfidickými vazbami) pomocí trypsinu a karboxypeptidázy B (obrázek 14 a tabulka 3) byl vznik inzulínu. Výtěžky inzulínu byly spočítány jako procento z počáteční koncentrace proteinu (A₂₈₀), která byla stanovena při rozpouštění precipitátu v roztoku o pH 12 (obrázek 14). Bylo prokázáno, že „sbalení“ hybridního polypeptidu SOD-proinzulin ze surového intracelulámího precipitátu je optimální v čase přibližně 4,5 hodin od počátku experimentu (obrázek 14).

V tabulce 3 je shrnuta částečná purifikace inzulínu hybridního polypeptidu proinzulinu, exprimovaného z plazmidu pBAST-LAT, z intracelulámího precipitátu připraveného z jednoho litru buněčné kultury s OD₆₀o= 45. Rozpuštění a „sbalování“ bylo prováděno postupem popsaným pro obrázek 14. V čase 4,5 hodin po rozpuštění bylo pH roztoku obsahujícího „sbalený“ hybridní polypeptid proinzulinu s vytvořenými disulfidickými vazbami upraveno pomocí koncentrované kyseliny chlorovodíkové na hodnotu 8,8. K tomuto roztoku byl přidán ZnCl₂ (na výslednou koncentraci 50 μΜ), karboxypeptidáza B (1:400 w/w) a trypsin (1:6000 w/w). Štěpení probíhalo při 37 °C po dobu 3 hodin a bylo ukončeno přídavkem fenylmethylsulfonyl fluoridu (PMSF) na výslednou koncentraci 0,5 mM. Analýza prováděná metodou HPLC (popsanou v popisu pro obrázek 9) ukázala, že výtěžek inzulínu je 169 mg. Inzulín byl purifikován chromatografií na anexu a následnou chromatografií na hydrofobním nosiči. Roztok s inzulínem (získaný enzymatickým štěpením hybridního polypeptidu proinzulinu) byl aplikován na kolonu (Fast-Flow) DEAE-Sepharózy (Pharmacia) předem ekvilibrovanou v pufru o složení 20 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, pH 8, v množství 50 jednotek A₂₈o najeden mililitr nosiče. Navázaný materiál byl promyt pufrem o složení 20 mM Tris-HCl, 10 mM NaCl, pH 8 a inzulín byl eluován pufrem o stejném složení, který ale obsahoval NaCl o koncentraci 250 mM. Spojené frakce obsahující inzulín reprezentovaly 20 % z celkového množství nanesených proteinů a jejich čistota byla 37,1 %. Ke spojeným frakcím po chromatografií na DEAE-Sepharóze byl přidán síran amonný (na výslednou koncentraci 410 mM) a tento roztok byl aplikován na kolonu

-20CZ 290079 B6 (Fast-Flow) Phenyl-Sepharózy (Phamacia) předem ekvilibrovanou v pufru o složení 20 mM Tris-HCl, 540 mM síran amonný, v množství přibližně 12 jednotek A₂8o najeden mililitr nosiče. Navázaný materiál byl promyt ekvilibračním pufrem a inzulín byl eluován pufrem o složení 20 mM Tris-HCl, 540 mM síran amonný, pH 8. Frakce obsahující inzulín reprezentovaly 42,3 % z celkového množství naneseného proteinu a jejich čistota byla 74,1 %. Výsledkem zmíněné částečné purifíkace bylo 120 mg inzulínu (totožného se standardním inzulínem), což odpovídá výtěžku inzulínu 5,16%. Může být rovněž provedena další purifíkace s využitím metod v současnosti známých, jakými jsou například gelová filtrace, RP-HPLC a krystalizace (17).

Tabulka 3

Purifíkace rekombinantního lidského inzulínu, získaného z hybridního polypeptidů proinzulinu, exprimovaného z plazmidu pDBAST-LAT, rozpuštěním surového intracelulámího precipitátu, „sbalením“ a enzymatickým štěpením trypsinem a karboxypeptidázou B.

Purifikační krok	A₂80	minimální množství inzulínu (v mg) stanovované pomocí HPLC	čistota (v%)
Rozpuštění precipitátu	2326	—	-
Přídavek dřevěného uhlí	1915
„Sbalení“ a enzymatické štěpení	1915	169	8,8
Spojené frakce po chromatografii na DEAE-Sepharóze	383	142	37,1
Spojené frakce po chromatografii na Phenyl-Sepharóze	162	120	74,1

Sloupec A₂8o reprezentuje celkovou absorbanci při vlnové délce 280 nm při každém purifíkačním kroku. Přítomnost inzulínu byla stanovována analýzou pomocí HPLC (s využitím standardního inzulínu) popsanou v popisu obrázku 9 a odpovídá hlavnímu píku standardního inzulínu.

Cousens L. S., Shuster J. R., Gallegos C., Ku L., Stempien Μ. M., Urdea M. S., SanchezPescador R., Taylor A. a TeKamo-Olson P., Gene 61: 265 až 275, 1987.

Davidson H. W., Rhodes C. J. a Hutton J. C., Nátuře 333: 93 až 96, 1988.

Ellman G. L., Arch. Biochem. Biophys. 82:70 až 77, 1959.

Fischer M., Fytlovitch S., Amit B., Wortzel A. a BeckY., Appl. Microbiol Biotechnol. 33: 424 až 428,1990.

Frank B. H. a Chance R. E. (1985), The preparation and characterization of human inzulín of recombinant DNA origin, in Therapeutic agents produced by genetic engineering, Quo Vadis symposium, Sanofí Group, 29. až 30. květen 1985, Toulouse-Labege, Francie, strany 137 až 146.

Goeddel D. V., Kleid D. G., Bolivar F., Heyneker H. L., Yansura D. G., Crea R., Hirose T., Kraszewski A., Itakura K. a Riggs A. D., Proč. Nati. Acad. Sci. 76: 106 až 110,1979.

Grau U., Diabetes 34:1174 až 1180,1985.

Hartman a další, Patentová přihláška US číslo 5143836,1. září, 1992.

Kemmler W., Peterson J. D. a Steiner D. F., J. Biol. Chem. 246: 6786 až 6791,1971.

Morinaga Y., Franceschini T., Inouye S. a Inouye M., Biotechnology 2: 636 až 639, 1984.

-21 CZ 290079 B6

Panayotis G., Katsoyannis G. a Tometsko A., Proč. Nati. Acad. Sci USA 55: 1554 až 1561, 1966.

Schlichtkrull J., Acta Chem. Scand. 10: 1459 až 1464,1956.

Sherman L., Dafni L., Liehman-Hurwitz J. a Groner Y., Proč. Nati. Acad. Sci. 80: 5465 až 5469, 1983.

Steiner D. F. a Clark J. L., Proč. Nati. Acad. Sci. 60: 622 až 629, 1968.

Thim L., Hansen Μ. T., Norris K., Hoegh I., Boel E., Forstrom J., Ammerer G. a Fiil N. P., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 83: 6766 až 6770, 1986.

Wetzel R., Kleid D. G., Crea R., Heyneker H. L., Yansura D. G., Hirose T., Kraszewski A., Riggs A. D., Uitakura K a Goeddel D. V., Gene 16: 63 až 71,1981.

Yanofsky C., Platt T., Crawford I. P., Nichols Β. P., Christie G. E., Horowitz H., Van Cleemput M. a Wu A. M., Nucleic Acids Res. 9: 6647 až 6668, 1981.

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims

1. Způsob produkce inzulínu, vyznačující se tím, že zahrnuje

b) sbalení hybridního polypeptidu za podmínek umožňujících vytvoření správných disulfidových vazeb, aniž by byl hybridní polypeptid předem podroben sulfitolýze nebo štěpení bromkyanem;

c) enzymatické štěpení sbaleného hybridního polypeptidu spojeného disulfídovými vazbami za vzniku inzulínu; a

d) purifikaci inzulínu.

2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že krok b zahrnuje inkubaci hybridního polypeptidu při 4 až 37 °C po dobu 1 až 30 hodin při pH 8,5 až 12,0.

3. Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím, že inkubace probíhá za přítomnosti kyseliny askorbové.

4. Způsob podle nároku 2, v y z n a č u j í c í se t í m, že pH je v rozmezí 11,0 až 11,25.

5. Způsob podle nároku 3, v y z n a č u j í c í se tím , žepH je v rozmezí 11,0 až 11,25.

6. Způsob podle nároku 3, v y z n a č u j í c í se tí m , že koncentrace kyseliny askorbové je

1.5 až 3,0 mol na jeden mol skupin SH přítomných ve směsi, ve které dochází ke sbalení polypeptidu.

7. Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím, že doba inkubace je 4,0 až

5.5 hodiny.

-22CZ 290079 B6

8. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, že doba inkubace je 4,0 až

5,5 hodiny.

9. Způsob podle nároku 1,vyznačující se tím, že krok c) zahrnuje:

(i) upravení pH na hodnotu 8,8 až 9,0; a (ii) štěpení hybridního polypeptidu působením trypsinu a karboxypeptidázy B při teplotě 16 až 37 °C po dobu v rozmezí 30 minut až 16 hodin.

10. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že krok d) zahrnuje purifikaci s využitím chromatografie na DEAE-Sepharóze a RP-HPLC.

11. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že krok d) zahrnuje purifikaci s využitím ultrafiltrace a chromatografie na CM-Sepharóze.

12. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že krok d) zahrnuje purifikaci s využitím chromatografie na DEAE-Sepharóze a chromatogarafie na Phenyl-Sepharóze.

13. Způsob podle nároku 1,vyznačující se tím, že hybridní polypeptid proinzulinu je exprimován z plazmidu pDBAST-LAT ATCC 69361.

14. Způsob podle nároku 1,vyznačující se tím, že hybridní polypeptid proinzulinu je exprimován z plazmidu ρΖα/wWaBAST-LAT ATCC 69363.

15. Způsob podle nároku 1,vyznačující se tím, že hybridní polypeptid proinzulinu je exprimován z plazmidu pBAST-R ATCC 69362.

16. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že zpracování v kroku a zahrnuje fermentaci v přítomnosti glukózy, glycerolu nebo galaktózy.

17. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že proces získání vybraného polypeptidu z buňky v kroku a zahrnuje (i) rozrušení buněčné stěny bakteriální buňky nebo jejích částí, jehož výsledkem je vznik lyzátu;

(ii) oddělení intracelulámího precipitátu od lyzátu pomocí centrifugace; a (iii) solubilizaci precipitátu.

18. Hybridní polypeptid zahrnující proinzulin a signální polypeptid připojený kN-konci proinzulinu, kde polypeptid je sbalen a obsahuje správné disulfidické vazby, jako meziprodukt pro výrobu inzulínu způsobem podle nároku 1.

19. Polypeptid podle nároku 18, kde signální peptid je odvozen od N-koncové oblasti CuZnSOD, jako meziprodukt pro výrobu inzulínu způsobem podle nároku 1.

20. Polypeptid podle nároku 19, kde signální peptid zahrnuje 62 aminokyselin, kterým předchází aminokyselina methionin, a po kterých následuje argininový zbytek, jako meziprodukt pro výrobu inzulínu způsobem podle nároku 1.