HU223718B1

HU223718B1 - Eljárás humán inzulin előállítására, proinzulin-tartalmú hibridpolipeptid expressziójából kiindulva

Info

Publication number: HU223718B1
Application number: HU9800292A
Authority: HU
Inventors: Marian Gorecki; Jacob R. Hartman; Simona Mendelovitz
Original assignee: Savient Pharmaceuticals, Inc.
Priority date: 1994-12-29
Filing date: 1994-12-29
Publication date: 2004-12-28
Also published as: JP4624495B2; WO1996020724A1; HK1013594A1; EP0871474B2; BR9408638A; DK0871474T3; PL180818B1; DE69434909T3; DE69434909T2; HUT78070A; CZ290079B6; PL321039A1; CZ203197A3; AU1550095A; JPH10511849A; EP0871474A4; AU698872B2; NZ279002A; DE95907193T1; ATE350053T1

Abstract

A találmány tárgyát egy tökéletesített és hatékony eljárás képezi,rekombináns humán inzulin előállítására. A találmány szerinti eljárásvégrehajtásakor úgy járnak el, hogy egy proinzulintartalmúhibridpolipeptid térszerkezetét szulfitolízis végrehajtása nélkül,diszulfidhidak kialakulásának kedvező körülmények között kialakítják(„folding"), a kialakított térszerkezetű polipeptidet enzimatikushasításnak vetik alá, és az így előállított inzulint tisztítják. Atalálmány szerinti eljárással gazdaságosan állíthatók elő rekombinánsinzulint tartalmazó gyógyászati készítmények. ŕ

Description

A találmány tárgyát egy tökéletesített és hatékony eljárás képezi, rekombináns humán inzulin előállítására. A találmány szerinti eljárás végrehajtásakor úgy járunk el, hogy egy proinzulintartalmú hibridpolipeptid térszerkezetét szulfitolízis végrehajtása nélkül, diszulfidhidak kialakulásának kedvező körülmények között kialakítjuk („folding”), a kialakított térszerkezetű polipeptidet enzimatikus hasításnak vetjük alá, és az így előállított inzulint tisztítjuk.

A találmány szerinti eljárással a korábbiaknál gazdaságosabban állíthatók elő rekombináns inzulint tartalmazó gyógyászati készítmények.

A találmányi leírásban található hivatkozások arab számmal vannak megjelölve, és zárójelben találhatók. A hivatkozások részletesen a leírás végén, közvetlenül a szabadalmi igénypontok előtt találhatók. A hivatkozások teljes terjedelmükben a technika állását bemutató feltárás részét képezik.

Az inzulin egy polipeptidhormon, amely a glükózmetabolizmusban tölt be esszenciális szerepet. Naponta szedik a cukorbetegségben (diabetes mellitus) szenvedő páciensek, amely rendellenességet a szervezet inzulinnal való elégtelen ellátottsága jellemez.

A hormon in vivő egy hosszú prekurzormolekula formájában szintetizálódik, majd ezt követően alakul ki a biológiailag aktív formája, amely egy A- és egy B-láncból áll. Részletesebben, a preproinzulin génje a belső elválasztású hasnyálmirigy béta-sejtjeiben íródik át mRNS-prekurzorrá, amelyből azután hasítással alakul ki az érett mRNS. Ez az mRNS preproinzulinná (NH₂-prerégió - B-lánc - C-peptid - A-lánc-COOH) transzlálódik, majd fokozatosan alakul át proinzulinná és végül inzulinná. Az első lépés a prerégió proteolitikus eliminációja. A prerégió hidrofób szignálszekvenciaként arra szolgál, hogy a naszcens lánc az endoplazmatikus retikulum mikroszomális membránján átjusson. A humán preproinzulinban a prerégió hossza 24 aminosav.

A proinzulinban a polipeptidlánc két régiója, amelyből az érett inzulin kialakul, a B- és az A-lánc, a C-peptiden (vagy C-láncon) keresztül van összekötve, amely az N- és a C-terminálisnál két pár bázikus aminosavat tartalmaz. A C-peptidek többségében ez a pár Arg-Arg és Lys-Arg. A humán C-peptid, a két szegélyező bázikus aminosavat is beleértve, 35 aminosavból áll. A C-peptid a polipeptid két szakaszát köti össze azért, hogy megfelelő diszulfidhíd kialakulását segítse elő a B- és az A-szegmens között. így a C-peptid szerepe nem függ nagyon szerkezetétől. Tulajdonképpen helyettesítése egy rövidebb szintetikus híddal még lehetővé teszi a proinzulinmolekula megfelelő térszerkezetének kialakulását (1, 2).

A proinzulin térszerkezete a két, láncok közötti diszulfidhíd és egy A-láncban található diszulfidhíd oxidációjával alakul ki. Az érés utolsó fázisában a bázikus aminosavaknál történő proteolitikus hasítás felszabadítja a C-peptidet, és kialakítja az érett inzulint (3). A humán inzulinban az A-lánc 21 aminosav hosszúságú, míg a B-lánc 30 aminosav hosszúságú.

A világ éves inzulinigénye a tonnákat is meghaladja, és súlyos hiány van az ellátásban. Az inzulint hagyományosan korlátozott számú állati eredetű forrásból állították elő, főleg marha- és dísznóhasny álmirigy bői, amelyek különböznek a humán inzulintól, és káros immunreakciókat válthatnak ki.

Az 1960-as években végzett kísérletek demonstrálták az inzulin in vitro előállítását. Az inzulin szintézisét az A- és B-láncok S-szulfonált formáinak egyesítésével érték el (4) vagy a redukált proinzulin spontán reoxidációjával (5). Az utóbbi eljárás nem volt alkalmazható az inzulin nagy léptékű ipari előállítására az oxidációs keverék nagyon alacsony fehérjekoncentrációja miatt. Az inzulin ezt követően tripszinnel vagy karboxipeptidáz-B-vel történő kezeléssel volt kinyerhető.

A félszintetikus és a bioszintetikus (rekombináns) humán inzulin nemrégiben vált elérhetővé. A félszintetikus humán inzulint disznóinzulinból állítják elő a Blánc 30. pozíciójában lévő alanin treoninra történő tripszinkatalizált cseréjével (ez az egyetlen különbség a disznó- és a humán inzulin között). A rekombináns humán inzulin E. colival vagy élesztővel történő előállítása végül is minden más gyártási eljárást kiváltott.

A bioszintetikus rekombináns humán inzulint jelenleg két módon állítják elő: az A- és B-láncot E. coliban külön-külön állítják elő, majd egyesítik azokat (7, 8), vagy E. coliban (1, 8), vagy élesztőben (2, 9) proinzulinszerű polipeptideket expresszálnak, majd azokat enzimatikusan inzulinná alakítják.

Az esetek többségében a proinzulint hibridfehérjeként termelik, amely intracelluláris kicsapódott fehéreként akkumulálódik. Ezt a hibridet a szokásos módon tisztítják és CNBr-rel hasítják, hogy felszabaduljon a proinzulinpolipeptíd. Ez utóbbit a továbbiakban oxidatív szulfitolízissel módosítják proinzulin-S-szulfonáttá. A proinzulin-S-szulfonátot azután tisztítják, és redukálókörülmények között kialakul a proinzulin térszerkezete (8). A proinzulin inzulinná alakítását tripszin és karboxi-peptidáz-B együttes hatásával végzik el (6).

Az EP 195691 Bl számú, Novo Nordisk A/S cégnek megadott szabadalom leírása egy B-Lys-Arg-Aszerkezetű proinzulint tartalmaz, és alkalmazását inzulin élesztőben való előállítására.

Az EP 196056 Bl számú, Chiron Corp. cégnek megadott szabadalom egy élesztőben termelt hSODproinzulint ír le. A hSOD-proinzulin-fehérjét bróm-ciános hasításnak és szulfitolízisnek vetik alá a térszerkezet kialakításához.

Hoechst cég az EP 379162 számú közzétételi iratban azt írja, hogy „inzulinprekurzorok álrekombinánsai” (azaz olyan rekombináns inzulintermékek, amelyek nem korrekt vagy részlegesen nem korrekt intermolekuláris diszulfidhidakkal rendelkeznek) alakíthatók át „korrekt” inzulintermékekké szulfitolízissel, az álrekombinánsok feleslegben lévő merkaptánnal való reagáltatásával vizes közegben, szerves redoxrendszer jelenlétében. Az eredeti szulfitolízislépés akkor történik meg, miután az aminosav- vagy peptidgyök lehasad (kémiailag vagy enzimatikusan) a fúziós polipeptidről (amely a gazdasejt lízise után történik), mialatt az inzulinprekurzor hat ciszteinje S-szulfonáttá alakul. Az ezt követő renaturációs lépésben természetes proinzulin ke2

HU 223 718 Bl letkezik az így kapott S-szulfonát-proinzulinból a három korrekt diszulfidhíd kialakulásával. A renaturációs lépés alatt úgynevezett „álrekombinánsok” termelődnek.

A Hoechst cég továbbá közzétesz egy eljárást a WO 91/03550 számú nemzetközi közzétételi iratban olyan fúziós fehérjék előállítására, amely a kívánt fehérjéből (például proinzulin) és egy „ballaszt”-ból áll. Szulfitolizist hajtanak végre a térszerkezet kialakítása előtt, miközben a „ballaszt” lehasad a proinzulin C-láncával egyidejűleg a térszerkezet kialakulása után.

Ezenkívül a Hoechst cég az EP 347781 Bl leírásában ismertet egy „miniproinzulint” (B-Arg-A), és annak alkalmazását mono-Arg-inzulin és inzulin előállítására. A továbbiakban fúziós fehérjéket ismertetnek, amelyek B-Arg-A-részből és „ballasztrész”-ből állnak. A „ballasztrész”-t bróm-ciánnal hasítják le, és szulfitolízist végeznek a polipeptid térszerkezetének kialakítása előtt.

A találmány tárgyát egy tökéletesített és hatékony eljárás képezi, rekombináns humán inzulin termelésére, amely szerint a vezetőszekvenciát tartalmazó rekombináns proinzulin hibridpolipeptideket E. coliban szintetizáljuk. Részleges tisztítás után a vezetőpeptidet még tartalmazó polipeptid térszerkezetét alkalmas körülmények között kialakítjuk. A biológiailag aktív humán inzulint azután tripszint és karboxipeptidáz-B-t kombináltan alkalmazó kezeléssel alakítjuk ki, amely enzimek egyidejűleg hasítják le a vezetőpeptidet és a C-láncot. Az így előállított tisztított humán inzulin azonos a természetben előforduló humán inzulinnal.

A számos SH-csoport védelmére alkalmazott, veszélyes és kényelmetlen folyamatokat tartalmazó hibridpolipeptidek bróm-ciános hasítását és szulfitolizisét mellőzzük a találmány szerinti eljárásban, miközben az egész proinzulin hibridpolipeptid térszerkezete hatékonyan kialakítható natív szerkezetűvé a vezetőpeptid és a védelem nélküli ciszteincsoportok jelenlétében is. Az aktív rekombináns humán inzulint enzimes hasítással szabadítjuk fel és azután tisztítjuk.

A 3-5. ábrákon látható három plazmid restrikciós térképén nincsen bejelölve minden restrikciós hasítóhely, amely a plazmidokon található. A találmány tökéletes megértéséhez szükséges restrikciós hasítóhelyek azonban be vannak mutatva.

1. ábra: Humán inzulin előállítása a pBAST-Rplazmiddal expresszált, térszerkezetet és diszulfidhidakat kialakított proinzulin hibridpolipepid enzimatikus hasításával. A SOD-vezetőszekvenciának csak egy részlete látható.

2. ábra: Humán inzulin előállítása a pDBASTLAT- vagy a pZBAST-LAT-plazmiddal expresszált, kialakított térszerkezetű és diszulfidhidakat tartalmazó proinzulin hibridpolipeptid enzimatikus hasításával. A SOD-vezetőszekvenciának csak egy részlete látható.

3. ábra: A pBAST-R-plazmid szerkezete, amely

SOD-proinzulin hibridpolipeptidet kódoló expressziós plazmid, és az ATCC-nél deponáltuk 69 362 ATCC nyilvántartási szám alatt.

4. ábra: A pDBAST-LAT-plazmid szerkezete, amely SOD-proinzulin hibridpolipeptidet kódoló expressziós plazmid, és az ATCCnél deponáltuk 69 361 ATCC nyilvántartási szám alatt.

5. ábra: A pXBAST-LAT-plazmid szerkezete, amely SOD-proinzulin hibridpolipeptidet kódoló expressziós plazmid, és az ATCCnél deponáltuk 69 363 ATCC nyilvántartási szám alatt.

6. ábra: A pBAST-R-plazmid által expresszált

SOD-proinzulin hibridpolipeptid aminosav és annak megfelelő DNS-nukleotidszekvenciája.

7. ábra: A pDBAST-LAT és ρλΒΑΞΤ-ΕΑΤ-ρΙηζmidok által expresszált SOD-proinzulin hibridpolipeptid aminosav és annak megfelelő DN S-nukleotidszekvenciája.

8. ábra: Humán inzulin termelése apBAST-R-plazmid által expresszált proinzulin hibridpolipeptidből, a térszerkezet kialakítására szolgáló reakciókeverék pH-jának függvényében

A proinzulin hibridpolipeptid térszerkezetét különböző pH-kon alakítottuk ki 100 mM glicinpufferben 4 °C-on, 16 óráig, vagy 1 mg/ml, vagy 0,5 mg/ml hibridpolipeptid-koncentráció alkalmazásával. A térszerkezetét felvett anyagot tripszinnel (1:500 w/w) (Sigma cégtől szereztük be) és karboxipeptidáz-B-vel (CPB, Sigma, 1:200 w/w) kezeltük 30 percig, 37 °C-on, pH 9,0-en, és radioaktív immunológiai mérési eljárással határoztuk meg az immunoreaktív (IR) inzulint, ¹²⁸I-inzulin (Amersham cégtől szereztük be) és humán rekombináns inzulin standardként történő alkalmazásával (Calbiochem cégtől szereztük be).

9. ábra: Humán inzulin termelése a pDBAST-LATplazmid által expresszált proinzulin hibridpolipeptidből

A proinzulin hibridpolipeptidet (a 2. példa szerint állítottuk elő) 8 M karbamidot és 5 mM HCl-ot tartalmazó oldatban oldottuk fel körülbelül 30 mg/ml-es koncentrációban, majd 1 mg/ml-re hígítottuk 100 mM glicin-NaOH, pH 11,0 pufferben. A térszerkezetet 22 °C-on (szobahőmérsékleten), 20 óráig alakítottuk ki. Az oldat pH-ját 8,8-re állítottuk HCl-dal. Karboxipeptidáz-B-t (1:1000 w/w, Sigma) és tripszint (1:2000 w/w, Sigma) adtunk hozzá, és a reakciókeveréket 37 °C-on inkubáltuk 60 percig. Azután az emésztési reakciókeveréket pH 3-ra savanyítottuk, és 10 mM HCl-dal hígítottuk. 150 μΐ aliquotokat analizáltunk fordított fázisú nagy hatékonyságú folyadékkromatográfiával (RPHPLC), 250x4 mm, 5 μ Lichrosphere 100 RP-8 oszlop (Merck cégtől szereztük be) alkalmazásával, amelyet 50 mM tetraetil-ammónium-foszfát, 162 mM NaC10₄, pH 3, 31,5% (v/v) acetonitrilt tartalmazó pufferrel ekvilibráltunk. Lineáris 31,5 -40,5% acetonitrilgradienst futtattunk 75 perc alatt, 1 ml/perc áramlási sebességgel. Az abszorbanciát 220 nm-en követtük.

HU 223 718 Β1

A: 5 pg standard inzulin (Boehringer Mannheim);

B: rekombináns humán inzulin az enzimes kezelés után;

C: térszerkezét felvett SOD-proinzulin polipeptid.

10. ábra: Humán inzulin termelése a pDBASTLAT-plazmid által expresszált proinzulin hibridpolipeptidből, a térszerkezet kialakítására szolgáló reakciókeverék pH-jának függvényében

A proinzulin hibridpolipeptidet (a 2. példa szerint állítottuk elő) 1 mg/ml-re hígítottuk 100 mM glicinNaOH pufferben, a megjelölt pH-k-ra, és a térszerkezetet 22 °C-on 16 óráig alakítottuk ki. Enzimes kezelést és RP-HPLC-analízist végeztünk a 9. ábra leírása szerint. A hibridpolipeptidből előállított rekombináns humán inzulin mennyiségét a csúcs alatti terület alapján számítottuk, a retenciós ideje megegyezett a standard inzulinéval.

11. ábra: Humán inzulin termelése a pDBASTLAT-plazmid által expresszált proinzulin hibridpolipeptidből, a térszerkezet kialakítására szolgáló reakciókeverékben lévő aszkorbinsavkoncentráció függvényében

A proinzulin hibridpolipeptid (a 2. példa szerint állítottuk elő) 1 mg/ml-es oldatának térszerkezetét 100 mM glicin-NaOH pH 11,2 pufferben alakítottuk ki, amely a megjelölt koncentrációban tartalmazott aszkorbinsavat. A mintákat tripszinnel és karboxipeptidáz-Bvel (9. ábra leírása szerint) kezeltük az 5 és 25 órás térszerkezetet kialakító folyamat után. A rekombináns humán inzulin termelését RP-HPLC-vel analizáltuk (a 9. ábra leírása szerint).

12. ábra: A pDBAST-LAT-plazmidáltal expresszált proinzulin hibridpolipeptidből előállított humán inzulin hitelessége

A proinzulin hibridpolipeptid (a 2. példa szerint állítottuk elő) 1 mg/ml-es oldatának térszerkezetét 100 mM glicin-NaOH pH 11,2 pufferben, amely 1,2 mM aszkorbinsavat tartalmazott, alakítottuk ki 22 °C-on 16 óráig. Az enzimes kezelést követően (9. ábra leírása szerint) a reakciókeveréket DEAE-Sepharose oszlopon kromatografáltuk, melyet 20 mM TRIS-HC1, pH 8,0 pufferrel ekvilibráltunk. A rekombináns humán inzulint 0-0,4 M NaCl-gradienssel eluáltuk 20 mM Tris-HCI, pH 8,0 pufferben. A csúcsokat tartalmazó frakciókat gyűjtöttük és HCl-dal pH 3-ra savanyítottuk. A rekombináns humán inzulinszerű molekulákat RP-HPLC-vel továbbtisztítottuk a 9. ábra leírása szerint. A legnagyobb csúcsot gyűjtöttük, és Sephadex G-25 oszlopon sótlanítottuk 0,25 M ecetsavban, majd liofilizáltuk. A mintákat (5 pg rekombináns humán inzulin) 10 mM HCl-ban vettük fel, és RP-HPLC-vel analizáltuk ugyanolyan körülmények között.

13. ábra: Humán inzulin termelése a pDBASTLAT-plazmid által expresszált proinzulin hibridpolipeptidből, a térszerkezet kialakítására szolgáló reakciókeverékben lévő fehérjekoncentráció függvényében

A SOD-proinzulin hibridpolipeptid (a 2. példa szerint termelt) térszerkezetét 100 mM glicin-NaOH, pH

11,2 pufferben alakítottuk ki, miközben a fehérje végkoncentrációja 0,5 mg/ml-től 10 mg/ml-es volt. A puffer, amelyben a térszerkezet kialakult, 2,5 mól aszkorbinsavat tartalmazott SH-csoportonként. A térszerkezet kialakítása 24 °C-on (szobahőmérsékleten), 16 óráig tartott. Az enzimes kezelés és az RP-HPLC-analízist a 9. ábrának megfelelően végeztük el.

14. ábra: Humán inzulin előállítása a pDBASTLAT-plazmid által expresszált proinzulin hibridpolipeptid nyers intracelluláris csapadékából a térszerkezet kialakulásának ideje függvényében

Az intarcelluláris csapadékot 20 mM glicin-NaOH, 33 μΜ EDTA, pH 11,2 pufferben oldottuk fel úgy, hogy a koncentráció A₂₈₀ = 2,6/ml volt. A pH-t 12-re állítottuk 10 N nátrium-hidroxiddal. A oldatot 10 percig kevertettük. Majd a pH-t 11,2-re állítottuk koncentrált sósavval. Aktivált aktív szenet („acid washed”, Sigma cégtől szereztük be) adtunk hozzá 0,1% végkoncentrációban és a keveréket 30 percig kevertettük. A szuszpenziót 20 °C-on, 20 percig centrifugáltuk 12 000 rpmen. A kitisztult felülúszó A₂₈₀-értéke körülbelül 2,15 volt. Aszkorbinsavat adagoltunk 3 mM végkoncentrációban. A proinzulin hibridpolipeptid térszerkezetének kialakítását az előzőek szerint, intenzív keverés közben, szobahőmérsékleten (22-23 °C) hajtottuk végre. A kísérlet közben különböző időpontokban (a feloldás elkezdésétől számítva) 10 ml-es aliquotokat vettünk, melyek pH-ját 8,8-re állítottuk és karboxipeptidáz-B-vel (1:1000 w/w) és tripszinnel (1:2000 w/w) emésztettük 1 óráig, 37 °C-on, 50 μΜ ZnCl₂ jelenlétében. Az emésztést savanyítással állítottuk le. Az emésztett minták inzulintartalmát RP-HPLC-analízissel határoztuk meg, a 9. ábra leírásának megfelelően. A térszerkezet kialakulásának előrehaladása az inzulintartalom növekedésében (emésztés után) és a szabad tiolcsoportok számának csökkenésében nyilvánul meg, ez utóbbit Ellman-reakcióval mértük meg (16).

A találmány tárgyát eljárás képezi humán inzulin előállítására, amely egy proinzulint tartalmazó hibridpolipeptid térszerkezetnek kialakítását foglalja magában, olyan körülmények között, amely lehetővé teszi a diszulfidhidak helyes kialakulását, és amely eljárás a kialakult térszerkezetű és diszulfidhidakat tartalmazó hibridpolipeptid enzimatikus hasítását tartalmazza aktív humán inzulin előállítására, és amely az aktív humán inzulin tisztítását tartalmazza.

A találmány tárgyát képezi továbbá proinzulint és a proinzulin N-terminálisához kapcsolt vezetőpeptidet tartalmazó polipeptid, amelynek kialakult térszerkezete van, és korrekt diszulfidkötéseket tartalmaz.

A pBAST-R-, pDBAST-LAT- és a pkBAST-LATplazmidokat E. coliban deponáltuk 1993. július 26-án, a Budapesti Szerződés értelmében, és követelményei szerint szabadalmaztatási eljárás céljából az „American Type Culture Collection”-ban (ATCC), 12 301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20 852; a nyilvántartási számok 69 362, 69 361 és 69 363 voltak, sorrendben.

A találmányi leírás szerinti hibridpolipeptid a kívánt polipeptidhez kovalensen kapcsolt vezetőpeptidet

HU 223 718 Β1 tartalmaz. A találmány szerinti hibridpolipeptid proinzulint tartalmaz, és vezetőpeptidként előnyösen SODot tartalmaz.

A leírás szerint térszerkezet kialakulásán proinzulint tartalmazó hibridpolipeptid térszerkezének kialakulását értjük, az SH-csoportok védelmére szolgáló CNBr-os hasítás és szulfitolízis nélkül, amelynek során a térszerkezet kialakulása lehetővé teszi a diszulfidkötések korrekt képződését a hibridpolipeptidben.

A hibridpolipeptid diszulfidkötéseinek korrekt képződésén a leírásban a három diszulfidkötés kialakulását értjük az inzulinban található Cys^B7-Cys^A7, Cys^B19-Cys^A2° és Cys^A6-Cys^A11 között (a Cys számozása az érett inzulin számozásának felel meg).

A leírás szerinti proinzulin egy polipeptidet tartalmaz, az N-terminálistól a C-terminális felé haladva, az inzulin B-, C- és A-láncát.

A leírásban az inzulin C-láncát alkotó peptid a természetesen előforduló C-peptidet és bármilyen más oligopeptidet, dipeptidet, vagy olyan egyedüli aminosavcsoportot tartalmaz, amely tripszinnel és karboxipeptidáz-B-vel lehasítható.

A leírásban a vezetőpeptiden bármilyen olyan, az inzulin B-láncához kovalensen kapcsolt peptidet vagy polipeptidet értünk, amely lehetővé teszi a térszerkezet és a diszulfidkötések megfelelő kialakulását, és az tripszinnel lehasítható. A vezetőpeptid előnyösen SÓD.

A leírás szerinti SÓD a CuZnSOD vagy a MnSOD aminosavszekvenciájának szubsztanciális részét tartalmazza, nem szükséges, hogy rendelkezzen a SÓD biológiai aktivitásával, és az sem szükséges, hogy aminosavszekvenciája azonos legyen a természetesen előforduló SÓD aminosavszekvenciájával. A SOD-ot kódoló DNS lehet szakember által ismert eljárással előállított mutáns is, lásd például Bauer és munkatársai eljárását, Gene 37, 73-81 (1985).

A vezetőpeptid SÓD helyett lehet bármilyen más peptid, polipeptid vagy fehérje, vagy ilyen peptid, polipeptid vagy fehérje aminosavszekvenciájának szubsztanciális része, amely rész nem szükséges hogy rendelkezzen a peptid, polipeptid vagy fehérje biológiai aktivitásával, és az sem szükséges, hogy aminosavszekvenciája azonos legyen a természetben előforduló peptid, polipeptid vagy fehérje aminosavszekvenciájával; azonban a vezetőpeptidnek lehetővé kell tennie a hibridpolipeptid térszerkezetének kialakulását, és a megfelelő diszulfidkötések képződését.

A leírás szerinti inzulin tartalmazhatja a természetben előforduló inzulin homológját.

A leírás szerinti proinzulin tartalmazhatja a természetben előforduló proinzulin homológját.

A leírás szerinti „homológ” kifejezésen azt az inzulinpolipeptidet értjük, amelyet a találmány szerinti eljárással állítottunk elő, és amely olyan polipeptid, amelynek lényegében ugyanolyan aminosavszekvenciája és ugyanolyan biológiai aktivitása van, mint az inzulinnak. így tehát egy homológ egy vagy több nem esszenciális aminosavcsoport addíciójával, deléciójával vagy szubsztitúciójával különbözhet a találmány szerinti eljárással termeltetett inzulinpolipeptidtől, feltéve, ha az így kapott polipeptid megőrzi az inzulin biológiai aktivitását. Szakember képes felismerni, milyen aminosavcsoport addícionálható, deletálható vagy szubsztituálható (beleértve azokat az aminosavakat is, amelyekkel a szubsztitúciót végezzük), általánosan ismert eljárásokat alkalmazva, beleértve például a találmány szerinti polipeptidhomológok bakteriális expresszálását kódoló DNS-szekvenciák tervezésére és készítésére alkalmazott hagyományos eljárásokat, cDNS módosítását és genomi eredetű szekvenciák helyspecifíkus mutagenezisére alkalmazott eljárásokat, rekombináns fehérjék és expressziós vektorok előállítását, polipeptidek bakteriális expresszióját, és polipeptidek biokémiai aktivitásának mérésére alkalmazott hagyományos biokémiai mérési eljárásokat.

Az inzulinhomológok fenti meghatározása ugyanúgy alkalmazható a proinzulinhomológok esetében is.

A találmány szerinti eljárással termelt inzulinhomológok például olyan deléciós homológok, amelyek kevesebb csoportot tartalmaznak, mint a természetesen előforduló inzulin; szubsztitúciós homológok, amelyekben egy vagy több csoport helyettesítve van más csoporttal; és addíciós homológok, amelyekben egy vagy több aminosavcsoport van építve az inzulinpolipeptid terminális vagy középső szakaszához; mindezek rendelkeznek az inzulin biológiai aktivitásával.

A homológokra példák az „EP 384472” által közölt inzulinhomológok vagy Eli Lilly által „Eli Lilly and Company Report to Shareholders 1992”-ben közölt „Humalog” nevű inzulinanalóg.

Lényegében ugyanazt az aminosavszekvenciát határozza meg az aminosavszekvenciában végrehajtott legfeljebb tíz (10) aminosav szubsztitúciója és/vagy deléciója és/vagy addíciója, homológ vagy ekvivalens csoportok esetén, ahogyan azt leírják a következő könyvek: például Albert L. Lehninger, „Biochemistry, second edition”, Worth Publishers Inc. (1975), 4. rész; Creighton, „Protein Structure, a Practical Approach”, IRL Press at Oxford University Press, Oxford, England (1989); és Margaret O. Dayhoff, „Atlas of Protein Sequence and Structure, Volume 5”, The National Biomedical Research Foundation (1972), 9. rész. Ilyen helyettesítések szakember számára nyilvánvalóak.

Az inzulinpolipeptidet kódoló DNS-t, mutánsait előállíthatjuk szakember által ismert eljárásokkal, például Bauer és munkatársai szerint [Gene 37, 73-81 (1985)]. A mutáns szekvenciát alkalmas expressziós vektorba inszertálhatjuk a leírás szerint, amelyet sejtekbe juttatva úgy alakíthatunk ki, hogy a mutáns DNS a polipetidhomológ expresszióját irányítsa.

A találmány szerinti plazmidok olyan proinzulint tartalmazó hibridpolipeptidet kódoló szekvenciát tartalmaznak, amely baktériumokban, élesztőben, gombában vagy emlőssejtekben (például CHO-, csirkeembrió-, fibroblaszt- vagy más ismert sejtvonal) való expresszióra adaptálható, amelyek azonfelül a klónozott gén expressziójához baktériumokban, élesztőben, gombában vagy emlőssejtekben a szükséges szabályozóelemeket is tartalmazzák, amelyek a hibridpolipeptidet kódoló nukleinsav közelében találhatók, hogy lehetővé tegyék

HU 223 718 Bl azok expresszióját. Az expresszióhoz szükséges szabályozóelemek lehetnek RNS-polimerázt kötő promoterszekvenciák és riboszóma kötésére alkalmas riboszómakötő helyek.

A találmány szerinti plazmidok proinzulint tartalmazó hibridpolipeptideket expresszálnak.

Szakember számára nyilvánvaló, hogy a szabadalmi bejelentéssel kapcsolatban deponált plazmidok könnyedén megváltoztathatók ismert eljárásokkal (például helyspecifikus mutagenezissel vagy linkerek inszertálásával) homológ polipeptidek expressziójának kódolására. Ilyen eljárásokat találhatunk például a következő könyvben: J., Fritsch, E. F. és Maniatis, T. (1989) „Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^ndedition”, Cold Spring Harbor Laboratory Press.

A megfelelő szabályozóelemeket a proinzulint tartalmazó hibridpolipeptidet kódoló DNS mellé helyezzük el a plazmidban, így hatással van a hibridpolipeptid expressziójára az alkalmas gazdasejtben. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint a szabályozóelemeket a hibridpolipeptidet kódoló DNS-hez közel és attól 5’-irányban (szintézissel ellentétes irányban) helyezzük el.

Különböző riboszómakötő helyek (RBS) is a találmány tárgyát képezik, amelyek a proinzulint tartalmazó hibridpolipeptidet kódoló DNS-ről átírt mRNS-t képessé teszik a riboszómához való kötődésre a gazdasejtben; ilyen a deo-RBS.

A találmány szerinti plazmidok ATG iniciációs kodont is tartalmaznak. A proinzulint tartalmazó hibridpolipeptidet kódoló DNS azonos leolvasási fázisban van az ATG iniciációs kodonnal.

A találmány szerinti plazmidok olyan DNS-szekvenciát is tartalmaznak, amelyben bakteriális plazmidból származó replikációs origó van, amely képessé teszi azt autonóm replikációra a gazdasejtben. Megfelelő replikációs origót számos forrásból beszerezhetünk, ilyen a pBR322-plazmid (ATCC nyilvántartási száma 37 017).

A találmány szerinti plazmidok olyan DNS-szekvenciát is tartalmaznak, amely szelektálható vagy azonosítható fenotípusos jellemzővel asszociálódó gént tartalmaz, amely jellemvonás akkor manifesztálódik, amikor a plazmid jelen van a gazdasejtben, ilyen a drogrezisztencia-gén, például ampicillin-, klór-amfenikol- vagy tetraciklinrezisztencia.

A (proinzulint tartalmazó) hibridpolipeptideket kódoló nukleinsav expresszálására alkalmazható vektorok például vírusok, ilyenek a bakteriális vírusok, például a bakteriofágok (ilyen a lambda-fág), kozmidok, plazmidok és más vektorok. A proinzulint tartalmazó hibridpolipeptideket kódoló géneket szakember által jól ismert eljárásokkal inszertáljuk a megfelelő vektorba. Például hagyományos restrikciós endonukleáz enzim-hasítóhelyeket alkalmazva inszert és vektor-DNS-ek egyaránt hasíthatok úgy, hogy komplementer végeik keletkezzenek, amelyek egymásnak megfelelő bázispárok, azután DNS-ligázzal egymáshoz ligálhatók. Ezzel párhuzamosan, a vektor-DNS-ben lévő restrikciós hasítóhely alapszekvenciájával komplementer szintetikus linkereket ligálhatunk az inszert-DNS-hez, amelyeket azután restrikciós enzimmel emésztve ezeknél a helyeknél hasadnak. Más lehetőségek is rendelkezésre állnak.

Előnyös bakteriális gazdasejtek az E. coli-sefick.. Megfelelő E. co/z-sejtek például az S<j>733- (cytRstrA) vagy az S<j>4300-törzsek, de más E. coli-törzs is alkalmazható a plazmidok gazdasejtjeiként.

A gazdasejtként alkalmazott baktérium lehet bármilyen auxotróf (például az A1645), prototróf (például az A4255) és Etikus törzs; F⁺ és F~ törzsek; λ-profág (például A1645 és A4255) cI857-represszorszekvenciáját tartalmazó törzs és deo-represszorok és/vagy deo-gén nélküli törzsek (lásd „European Patent Application Publication No. 0303972”, 1989. február 22-én közölték). Az S<j>733- és S<j)4300-jelű E. coli törzseket az ATCC-nél deponáltuk 69 361 és 69 363 nyilvántartási szám alatt, sorrendben.

Az összes fent leírt E. coli gazdatörzsből eltávolítható az általa hordozott plazmid, jól ismert módszerek alkalmazásával, például R. P. Novick által leírt etidium-bromidos eljárással [Bacteriol. Review 33, 210 (1969)].

A találmány szerinti eljárás inzulin termelésére tartalmazza a proinzulint tartalmazó hibridpolipeptid térszerkezetének kialakítását olyan körülmények között, amely biztosítja a korrekt diszulfidkötés kialakulását, majd a kialakított térszerkezettel és diszulfidkötésekkel rendelkező hibridpolipeptid enzimatikus hasítását inzulin előállítására, és az inzulin tisztítását. Az inzulin rendelkezik a kereskedelemben rendelkezésre álló humán inzulin aktivitásával és tulajdonságaival.

A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint a térszerkezet kialakításához a hibridpolipeptidet 4-37 °C-on inkubáljuk körülbelül 1 -30 óráig, körülbelül 8,5-12,0 pH-n.

A találmány egy másik előnyös megvalósítási módja szerint a térszerkezet kialakításához a hibridpolipeptidet 4-37 °C-on inkubáljuk körülbelül 1-30 óráig, körülbelül 8,5-12,0 pH-η aszkorbinsav jelenlétében.

A találmány egy különösen előnyös megvalósítási módja szerint a térszerkezet kialakítása pH 11,0-11,25-on történik.

A találmány egy másik különösen előnyös megvalósítási módja szerint az aszkorbinsav koncentrációja 2 mól per mól SH-csoport, amely a térszerkezetet kialakító reakciókeverékben jelen van.

A találmány még egy előnyös megvalósítási módja szerint az inkubációs idő körülbelül 5 óra.

A találmány egy másik előnyös megvalósítási módja szerint az eljárás tartalmaz pH-állítást 8,8-9,0-re, és a hibridpolipeptid hasítását tripszinnel és karboxipeptidáz-B-vel 16-37 °C-on körülbelül 30 perctől 16 óráig.

A találmány egy másik előnyös megvalósítási módja szerint a tisztítás DEAE-Sepharose-kromatográfiát és RP-HPLC-t tartalmaz.

A találmány még egy másik előnyös megvalósítási módja szerint a tisztítás a továbbiakban ultraszűrést és CM-Sepharose-kromatográfiát tartalmaz.

A találmány egy különösen előnyös megvalósítási módja szerint a tisztítás a továbbiakban DEAE-Sepha6

HU 223 718 Bl rose-kromatográfiát és Phenyl-Sepharose-kromatográfiát tartalmaz.

A találmány egy különösen előnyös megvalósítási módja szerint a hibridpolipeptidet a pDBAST-LATplazmiddal expresszáljuk, melyet ATCC 69 361 nyilvántartási szám alatt deponáltunk.

A találmány egy másik előnyös megvalósítási módja szerint a hibridpolipeptidet a pkBAST-LAT-plazmiddal expresszáljuk, melyet ATCC 69 363 nyilvántartási szám alatt deponáltunk.

A találmány egy másik megvalósítási módja szerint a hibridpolipeptidet a pBAST-R-plazmiddal expresszáljuk, melyet ATCC 69 362 nyilvántartási szám alatt deponáltunk.

A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint a hibridpolipeptidet a hibridpolipeptidet kódoló DNS-t tartalmazó baktériumsejt kezelésével kaptuk, így a DNS irányítja annak expresszióját, és a hibridpolipeptid sejtből való kinyerését.

Előre látható, hogy a kezelés glükóz, glicerin vagy galaktóz jelenlétében végzett fermentáció.

Továbbá előre látható, hogy a hibridpolipeptid sejtből való kinyerése tartalmazza a baktériumsejt vagy annak fragmensei sejtfalának szétroncsolását, ezzel lizátum előállítását, az intracelluláris csapadék izolálását a lizátumból centrifugálással, a csapadék szolubilizálását, és adott esetben a hibridpolipeptid tisztítását kromatográfiával és ultraszűréssel.

A találmány tárgyát képezi továbbá egy proinzulint és a proinzulin N-terminálisához kapcsolt vezetőpeptidet tartalmazó polipeptid, amely polipeptidnek megfelelően kialakult térszerkezete és diszulfidkötései vannak.

A találmány előnyös megvalósítási módja szerint a vezetőpeptid a CuZnSOD N-terminálisából származik.

A találmány egy különösen előnyös megvalósítási módja szerint a vezetőpeptid 62 aminosavból áll, egy Met-aminosav-csoport előzi meg és egy Arg-csoport követi.

A találmány előnyös megvalósítási módja szerint a proinzulin tartalmazza az inzulin B-láncát az inzulin Aláncához egy egyedüli Arg-csoporttal kapcsolódva.

A találmány egy másik megvalósítási módja szerint a proinzulin tartalmazza az inzulin B-láncát az inzulin A-láncához egy Lys-Arg-dipeptiddel kapcsolódva.

A fenti két proinzulinmolekulát hibridfehérjeként kell előállítani, máskülönben az expressziós szint rendkívül alacsony és nincs gazdasági jelentősége.

A találmány mindegyik előnyös megvalósítási módja szerint a vezetőpeptid ciszteincsoportjai szerincsoporttal voltak helyettesítve.

Az alábbi példákkal a találmány szerinti megoldás megértését kívánjuk elősegíteni, anélkül azonban, hogy igényünket bármilyen módon az ismertetettekre korlátoznánk. A példák nem tartalmazzák az általánosan használt eljárások részletes leírását, melyeket a vektorok előállításánál, polipeptideket kódoló gének ezen vektorokba történő inszerciójánál, vagy a kapott plazmidok gazdasejtekbe való juttatásánál alkalmaztunk. A példák nem tartalmazzák azokat az általánosan használt eljárások részletes leírását sem, melyeket az ilyen gazdasejt/vektorrendszerrel által termelt polipeptidek mérési eljárásánál alkalmaztunk. Ezek a mérési eljárások szakember számára nyilvánvalóak, és számos közleményben le vannak írva, például a következőben: Sambrook, J., Fritsch, E. F. és Maniatis, T. (1989) „Molecular Cloning: A Laboratoiy Manual, 2^nd edition”, Cold Spring Harbor Laboratory Press.

1. példa

SOD-proinzulin hibridpolipeptidet expresszáló pBAST-R-, pDBAST-LATéspTBAST-LAT-jelű termelöplazmidok előállítása

Bakteriális expressziós vektorokat állítottunk elő, amelyek hibridfehéijéket túl termelnek E. coliban a deoP,P₂- vagy k-P_L-promoterek vezérlése alatt. A proinzulint hibridfehéijeként termeltük, miközben azt találtuk, hogy az a baktérium, amely az inzulin-B-lánc-Lys-Arginzulin-A-láncot kódoló expressziós vektort tartalmazta, nem termelt detektálható mennyiségű polipeptidet. A hibridfehérjék egy 62 aminosavból álló vezetőpeptidet tartalmaztak, amely a CuZnSOD N-terminálisából származott (11), az N-terminálisnál egy Met-csoport előzte meg, és a C-terminálisnál egy Arg-csoporton keresztül kapcsolódott az inzulin-B-lánchoz. Az inzulin-B-lánc egy Lys-Arg-t vagy Arg-t tartalmazó rövid C-lánccal kapcsolódott az inzulin-A-lánchoz. A SOD-ban eredetileg lévő két ciszteint szerincsoportokkal helyettesítettük.

A) pBAST-R-plazmid

Számos plazmidot készítettünk, míg eljutottunk a pBAST-R-plazmidhoz, mellyel megfelelő E. coli-gazdasejteket transzformálva azokat képes volt a humán inzulin előállítására alkalmas proinzulin hibridpolipeptid termelésére késztetni.

A SOD-inzulin-B-lánc-Lys-Arg-inzulin-A-lánc hibridpolipeptidet kódoló pBAST-R-plazmid szerkezete a 3. ábrán található; a hibridpolipeptid DNS-szekvenciája és az annak megfelelő aminosavszekvencia a

6. ábrán található.

A pBAST-R-plazmid körülbelül 4380 bp hosszúságú, és a következő elemekből áll (óramutató járásával ellentétes irányban):

1. 1521 bp hosszúságú DNS-fragmens, a pBR322plazmid Aatll/Mscl hasítóhelyei közötti része, amely tetraciklinrezisztencia-gént tartalmaz.

2. 1497 bp hosszúságú DNS-fragmens, a pBR322plazmid Scal/Haell hasítóhelyei közötti része, amely megcsonkított ampicillinrezisztencia-gént és DNS-replikációs origót tartalmaz.

3. 930 bp hosszúságú DNS-fragmens, E. eoli-eredetű DNS Avall/Ndel hasítóhelyei közötti része, amely deo-P^-promotereket és riboszómakötő helyet (RBS) tartalmaz (13).

4. 188 bp hosszúságú DNS-fragmens, a humán CuZnSOD cDNS Ndel/PpuMI hasítóhelyei közötti része. Az érett SÓD 6. és 57. pozíciójában lévő ciszteineket szerincsoportokkal helyettesítettük oligonukleotid helyspecifikus mutagenezissel (12).

5. Szintetikus 176 bp hosszúságú DNS-fragmens, PpMI- és BAmHI-végekkel. Ez a szakasz az Arg-inzulin-B-lánc-Lys-Arg-inzulin-A-láncot kódolja.

HU 223 718 Bl

6. Szintetikus, 36 bp hosszúságú többszörös klónozó polilinker, BamHI- és HindlII-végekkel.

7. Szintetikus 44 bp hosszúságú oligonukleotid, amely Trp A transzkripciós terminátort tartalmaz Hindui- és AatlI-végekkel (10).

A pBAST-R-plazmidot, amelyet tetraciklinrezisztenciával ruháztunk fel, és kódolja a SOD-inzulin-Blánc-Lys-Arg-inzulin-A-lánc hibridpolipeptidet, S<T>733-jelű E. coli törzsbe (cytRstrA) juttattuk, és az ATCC-nél deponáltuk ATCC 69 362 nyilvántartási szám alatt 1993. július 26-án.

B) pDBAST-LAT-plazmid

Újabb sorozat plazmidot készítettünk, míg eljutottunk a pDBAST-LAT-plazmidhoz, mellyel megfelelő E. coú'-gazdasejteket transzformálva azokat képes volt a humán inzulin előállítására alkalmas proinzulin hibridpolipeptid termelésére késztetni.

A SOD-inzulin-B-lánc-Arg-inzulin-A-lánc hibridpolipeptidet kódoló pDBAST-LAT-plazmid szerkezete a 4. ábrán található; a hibridpolipeptid DNS-szekvenciája és az annak megfelelő aminosavszekvencia a

7. ábrán található.

A pDBAST-LAT-plazmid körülbelül 4377 bp hosszúságú, és a következő elemekből áll (óramutató járásával ellentétes irányban):

3. 930 bp hosszúságú DNS-fragmens, E. coli-eredetű DNS Avall/Ndel hasítóhelyei közötti része, amely deo-P₁P₂-promotereket és riboszómakötő helyet (RBS) tartalmaz (13).

4. 188 bp hosszúságú DNS-fragmens, a humán CuZnSOD cDNS Ndel/PpuMI hasítóhelyei közötti része. Az érett SÓD 6. és 57. pozíciójában lévő ciszteineket szerincsoportokkal helyettesítettük, és a fragmens GC-tartalmát 38%-ra csökkentettük oligonukleotid helyspecifikus mutagenezissel (12).

5. Szintetikus 169 bp hosszúságú DNS-fragmens, PpMI- és BAmHI-végekkel. Ez a szakasz az Arg-inzulin-B-lánc-Arg-inzulin-A-láncot kódolja.

7. Szintetikus 44 bp hosszúságú oligonukleotid, amely TrpA-transzkripciós terminátort tartalmaz HindlII- és AatlI-végekkel (10).

A pDBAST-LAT-plazmidot, amelyet tetraciklinrezisztenciával ruháztunk fel, és kódolja a SOD-inzulinB-lánc-Arg-inzulin-A-lánc hibridpolipeptidet, S<t>733jelű E. coli törzsbe (cytRstrA) juttattuk, és az ATCCnél deponáltuk ATCC 69 361 nyilvántartási szám alatt 1993. július 26-án.

C) pkBAST-LAT-plazmid

Másik sorozat plazmidot készítettünk, míg eljutottunk a pkBAST-LAT-plazmidhoz, mellyel megfelelő E. coó-gazdasejteket (cI857-represszort tartalmazó) transzformálva azokat képes volt a humán inzulin előállítására alkalmas proinzulin hibridpolipeptid termelésére késztetni.

A SOD-inzulin-B-lánc-Arg-inzulin-A-lánc hibridpolipeptidet kódoló p/.BAST-LAT-plazmid szerkezete az 5. ábrán található; a hibridpolipeptid DNS-szekvenciája és az annak megfelelő aminosavszekvencia a 7. ábrán található.

A pkBAST-LAT-plazmid körülbelül 3777 bp hosszúságú, és a következő elemekből áll (óramutató járásával ellentétes irányban):

3. 330 bp hosszúságú DNS-fragmens, a pSODal3plazmid (14) BamHI/EcoRI hasítóhelyei közötti része, amely a aP_L-promotert és egy 30 bázispár hosszúságú AvrII/Ndel deo-riboszóma-kötő helyet tartalmaz.

4. 188 bp hosszúságú DNS-fragmens, a humán CuZnSOD cDNS Ndel/PpuMI hasítóhelyei közötti része. Az érett SÓD 6. és 57. pozíciójában lévő ciszteineket szerincsoportokkal helyettesítettük, és a fragmens GC-tartalmát 38%-ra csökkentettük oligonukleotid hely specifikus mutagenezissel (12).

7. Szintetikus 44 bp hosszúságú oligonukleotid, amely TrpA transzkripciós terminátort tartalmaz HindlII- és AatlI-végekkel (10).

A pkBAST-LAT-plazmidot, amelyet tetraciklinrezisztenciával ruháztunk fel, és kódolja a SOD-inzulin-B-lánc-Arg-inzulin-A-lánc hibridpolipeptidet a XP_L-promoter vezérlése alatt, E. coli 4300 törzsbe (F-, bio, cl⁸⁵⁷) juttattuk, és az ATCC-nél deponáltuk ATCC 69 363 nyilvántartási szám alatt 1993. július 26-án.

A baktériumsejteket 30 °C-on tenyésztettük. A hibridpolipeptidet termelését a hőmérséklet 42 °C-ra való eltolásával indukáltuk.

2. példa

Fermentáció, növesztési körülmények és a SODproinzulin hibridpolipeptidek tisztítása

I. Törzskultúrák

A pDBAST-LAT (vagy a pBAST-R-)plazmidot tartalmazó E. coli S<Ú733-törzs törzskultúráját tetraciklinnel kiegészített (10 mg/1) kazeines tápközegben tenyésztettük (20 g/1 kazeinhidrolizátum, 10 g/1 élesztőkivonat és 5 g/1 NaCl). A tenyészeteket ezután kétszeresére hígítottuk fagyasztó tápközeggel és -80 °Con tároltuk.

HU 223 718 Bl

Fagyasztótápközeg:

K₂HPO₄	6,3 gr
kh₂po₄	1,8 gr
Na-citrát	0,45 gr
MgSO₄.7H₂O	0,09 gr
(NH₄)₂SO₄	0,9 gr
Glicerin	44 gr
500 ml-ben
II. Inokulum
Az inokulumot a termelőtápközegben tenyésztettük

(lásd lent). Steril tápközeget tartalmazó rázóedénybe oltottunk a törzskultúrából, és 15 óráig inokuláltuk rázógépen 37 °C-on és körülbelül 200 rpm-en. Ha szükséges volt, még egy inokulálási lépést is végeztünk kevertetett, levegőztetett fermentorban. A steril tápközeget 2-10% rázott tenyészettel oltottuk be, és 15 óráig inkubáltuk 37 °C-on, pH 7±0,5-en kevertetéssel és levegőztetéssel, hogy az oldott oxigén szintjét 20% légte-

lítettség fölött tartsuk. III. Termelés
Termelőtápközeg:
K₂HPO₄	8 g/1
kh₂po₄	2 g/1
Na-citrát	2 g/1
NH₄C1	3 g/1
K₂SO₄	0,6 g/1
FeSO₄.7H₂O	0,04 g/1
MgSO₄.7H₂O	0,4 g/1
CaCl₂.2H₂O	0,02 g/1
Nyomelemoldat	3 ml/1
Tetraciklin	0,01 g/1
Glükóz	2 g/1
Glicerin	1 ml/1
Nyomelemoldat:
MnSO₄.H₂O	1 g/1
ZnSO₄.7H₂O	2,78 g/1
CoC1₂.7H₂O	2 g/1
Na₂MoO₄.2H₂O	2 g/1
CaCl₂.2H₂O	3 g/1
CuSO₄. 5H₂O	1,85 g/1
h₃bo₃	0,5 g/1
HC1 (32%)	100 ml/1

A termelőtápközeget 0,5-10% inokulumkultúrával oltottuk és 37 °C-on inkubáltuk. A kevertetési és levegőztetési paraméterek úgy voltak beállítva, hogy az oldott oxigén szintjét 20% légtelítettség fölött tartsuk. A pH-t 7±0,2-en tartottuk NH₃-mal.

50% glükóz és 30% glicerin steril oldatait juttattuk be energia- és szénforrásként. Ha a sejtkoncentráció elérte az OD₆₆₀-on mért 25-t, 10% glükóz és 30% glicerin steril oldatait juttattuk be, és növesztést további 5 óráig folytattuk, amíg a sejtkoncentráció megközelítőleg elérte az OD₆₆₀-on mért 60-t. A tenyészetet azután lehűtöttük és a sejteket centrifügálással nyertük ki. Az E. coli fermentálása glükóz, glicerin, galaktóz, vagy ezek kombinációinak jelenlétében, mint szénforrás, elősegíti a SOD-proinzulin hibridpolipeptidek expresszióját.

IV. Tisztítás

A pBAST-R- és a pDBAST-LAT-plazmidok által expresszált SOD-proinzulin hibridpolipeptidek intracelluláris csapadék formájában akkumulálódtak, amiket a következő eljárás szerint izoláltunk: 1 g (nedves tömeg) baktériumsejtet 10 ml pufferben szuszpendáltunk fel, melynek összetétele 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10 mM EDTA volt, és lizozimmal (Merck, 2500 U/ml) kezeltük 37 °C-on 2 óráig. A keveréket azután szonikáltuk és Nonidet-P-40-et (Sigma) vagy Triton X- 100-at adtunk hozzá 2% végkoncentrációban, és 2 óráig kevertettük szobahőmérsékleten. A csapadékot centrifügálással ülepítettük és vízzel mostuk.

A hibridpolipeptidet közel homogenitásig tisztítottuk anioncserés kromatográfiával a következők szerint. A csapadékot 8 M karbamid, 20 mM Tris-HCl, 200 mM β-merkapto-etanol, pH 8,2 pufferben oldottuk fel. Az oldatot centrifügálással tisztítottuk és DEAESepharose Fást Flow oszlopon (Pharmacia LKB) kromatografáltuk, amelyet előzőleg 8 M karbamid, 20 mM Tris-HCl, 20 mM β-merkapto-etanol, pH 8,2 pufferrel ekvilibráltunk. Az átfolyt anyagot gyűjtöttük, és a hibridpolipeptidet vagy kicsaptuk 40% telítettségű ammónium-szulfáttal, vagy koncentráltuk 10K-membránon, amit diafiltrálás követett 100 mM glicin-HCl, pH 3,1 pufferrel szemben.

Másik megoldás volt a pBAST-R-plazmid által expresszált SOD-proinzulin hibridpolipeptid közel homogenitásig való tisztítására, ha feloldottuk 8 M karbamid, 20 mM ditiotreitol, 50 mM Na-acetát, pH 5,0 pufferben, és ultraszűrtük 100 kD és 50 kD membránokon (Filtron). A hibridpolipeptidet 10 kD membránon koncentráltuk és 40% telítettségű ammónium-szulfáttal kicsaptuk.

3. példa

SOD-proinzulin hibridpolipeptidek térszerkezének kialakítása és enzimatikus hasítása Az ammónium-szulfáttal kicsapott vagy az ultraszűrt (2. példa) proinzulin hibridpolipeptidet 8 M karbamidban és 5 mM HCl-ban oldottuk fel, és ezt 100 mM glicinpufferrel hígítottuk, melynek pH-ja 8,5-12,0 volt 1 mg/ml-es végkoncentrációig.

A) A pBAST-R-plazmiddal expresszált SOD-proinzulin hibridpolipeptid térszerkezetének kialakítása 4-37 °C-on történt 1-24 óráig, hogy kialakuljanak a korrekt diszulfidkötések.

A kialakult térszerkezetet és diszulfidhidakat tartalmazó hibridpolipeptid oldatának pH-ját kb. 8,8-9,0-re állítottuk HCl-dal, és a fehérjét tripszinnel és karboxipeptidáz-B-vel kezeltük 16-37 °C-on 30-120 percig.

A kísérletsorozat eredményeként azt találtuk, hogy az optimális körülmények a következők voltak: a pBAST-R-plazmiddal expresszált hibridpolipeptidet 8 M karbamidban és 5 mM HCl-ban oldottuk fel, és ezt 100 mM glicinpufferrel hígítottuk, melynek pH-ja 11,0 volt (8. ábra) 1 mg/ml-es végkoncentrációig, ez után a térszerkezet kialakítása 25 °C-on történt 6-16 óráig, miután a korrekt térszerkezetű és diszulfidhidakat tartalmazó hibridpolipeptidet tripszinnel (1:500 w/w) és karboxipeptidáz-B-vel (1:200 w/w) hasítottuk 37 °C-on 30-60 percig.

Az inzulin előállítását, amelyet a kialakult térszerkezetű és diszulfidhidakat tartalmazó, pBAST-R-plaz9

HU 223 718 BI middal expresszált proinzulin hibridpolipeptid enzimatikus hasításával végeztünk, az 1. ábrán látható diagramon mutatjuk be.

B) A pDBAST-LAT-plazmiddal expresszált SODproinzulin hibridpolipeptid térszerkezetének kialakítása 7-31 °C-on történt 5-30 óráig, hogy kialakuljanak a korrekt diszulfidkötések.

A kialakult térszerkezetet és diszulfidhidakat tartalmazó hibridpolipeptid oldatának pH-ját kb. 8,8-9,0-re állítottuk HCl-dal, és a fehérjét tripszinnel és karboxipeptidáz-B-vel kezeltük 22-37 °C-on 30 perctől 16 óráig.

A kísérletsorozat eredményeként azt találtuk, hogy az optimális körülmények a következők voltak: a pDBAST-LAT-plazmid alkalmazásával expresszált hibridpolipeptidet 8 M karbamidban és 5 mM HCl-ban oldottuk fel, és ezt 100 mM glicinpufferrel hígítottuk, melynek pH-ja 11,0-11,25 volt (8. ábra) 1 mg/ml-es végkoncentrációig, ez után a térszerkezet kialakítása 25 °C-on történt 5 óráig, miután a korrekt térszerkezetű és diszulfidhidakat tartalmazó hibridpolipeptidet tripszinnel (1:15 000 w/w) és karboxipeptidáz-B-vel (1:10 000 w/w) hasítottuk 25 °C-on 16 óráig.

Az inzulin előállítását, amelyet a kialakult térszerkezetű és diszulfidhidakat tartalmazó, pDBAST-LATplazmiddal expresszált proinzulin hibridpolipeptid enzimatikus hasításával végeztünk, az 2. ábrán látható diagramon mutatjuk be.

Részletesen ismertetett speciális példák találhatók mind az A, mind B esetre a 8 -14. ábrák jelmagyarázataiban.

4. példa

A pBAST-R-plazmiddal expresszált, SOD-proinzulin hibridpolipeptidből származó humán inzulin fehérjeanalízise és tisztítása

A pBAST-R-plazmiddal expresszált, SOD-proinzulin hibridpolipeptidből származó humán inzulinokat radioimmunológiai mérési eljárással és RP-HPLC-vel (fordított fázisú HPLC) határoztuk meg, standardként kereskedelemben kapható humán inzulint használtunk (Calbiochem cégtől szereztük be). A rekombináns humán inzulin elméleti kitermelése 45,6%, a proinzulin hibridpolipeptid aminosavszekvenciája szerint számolva. A 8. ábra alapján nyilvánvaló, hogy a térszerkezet kialakulása optimálisan pH 11-en következik be. Ezen a pH-η az inzulintermelés mennyisége 80%-a az elméleti kitermelésnek (ami a kiindulási hibridpolipeptid 40%-os kitermelésének felel meg). A pBAST-R-plazmiddal expresszált, SOD-proinzulin hibridpolipeptidből származó humán inzulint RPHPLC-vel detektáltuk. Vydac 218TP54, 250x4,6 mm I. D., 5 pm, 300 Á pórusméretű oszlopot (Separation Group cégtől szereztük be) használtunk szobahőmérsékleten, 1 ml/perc áramlási sebességgel. 0,1% trifluorecetsav (TFA) vizes oldatát használtuk A-eluensként és 0,08% TFA acetonitriles oldatát B-eluensként. Az oszlopot 5 percig mostuk ekvilibrációs pufferrel (25% B-eluens), amit a B-eluens 25-50%-os, 37,5 perc alatt lefuttatott lineáris gradiense követett. Az abszorbanciát 220 nm-en és 280 nm-en detektáltuk. A térszerkezetet felvett és a diszulfidhidakat kialakított hibridpolipeptid enzimatikus emésztését követően a humán inzulin analízisét fordított fázisú nagy hatékonyságú folyadékkromatográfia alkalmazásával végezve, a főcsúcs retenciós ideje megegyezett a standard humán inzulinéval.

Két kis adagot készítettünk, 26 mg és 13 mg humán inzulint állítottunk elő, sorrendben. A humán inzulint az enzimkezelt oldatból (pH 9,0) tisztítottuk ultraszűréssel 3K- vagy 5K-membrán (Filtron cégtől szereztük be) alkalmazásával, amit CM-Sepharose-kromatográfia követett (citrátpuffer, pH 3,0). A csúcsokat tartalmazó frakciókat sótlanítottuk, liofilizáltuk, majd N-terminálisszekvenálásnak és aminosavanalízisnek vetettük alá. Mindkét adag rekombináns humán inzulin aminosavösszetétele lényegében azonos volt a természetesen előforduló humán inzulinéval (lásd az 1. táblázatot, 1. preparátumot). Az inzulinkészítmények aminoterminálisában lévő 5 aminosav szekvenciáját Edman-lebontással határoztuk meg. Azt találtuk, hogy azonos volt a humán inzulin mind az A-, mind a B-láncának aminoterminálisával, amely igazolta az in vitro termék hitelességét.

Azonban a szekvenálás eredményei azt mutatták, hogy egy extra-Arg-csoport van a molekulák 25%-ának első pozíciójában. Ez az eredmény megfelel a Lys és az Arg közötti tripszines hasításnak a Lys-Arg-linkerszekvenciában, egy plusz Arg-csoportot hagyva az A-lánc aminoterminálisán.

Azt találtuk, hogy az Arg C-terminálisánál történő specifikus tripszines hidrolízisét pH 11-en lehet elérni. Ezen a megemelt pH-η a lizinek ε-aminocsoportjainak többsége nem töltött (pK= 10,3), így lehetséges a szelektív hasítás. Két adag, 1 mg és 6,5 mg tisztított inzulint kaptunk a tripszines lépés pH 11-en (lásd 1. táblázat, 2. preparátum) való végrehajtása, és az azt követő karboxipeptidáz-B-vel pH 8,5-en való emésztés után. Az N-terminális-szekvenálás azt mutatta, hogy az extra-Arg-t tartalmazó inzulin mennyisége 5%-ra csökkent.

1. táblázat

A rekombináns humán inzulin aminosav-összetétele

Aminosav	Csoportok száma
Elméleti	Standard inzulin	1. preparátum	2. preparátum
Asx	3	3,2	3,38	3,26
Thr	3	2,98	2, 83	2,68
Ser	3	2,84	2,53	2,77
Glx	7	7,15	7,73	7,23
Pro	1	1,28	1,13	1,09
Gly	4	4,24	4,39	4,25
Ala	1	1	1,28	1,04
Cys	6	5,88	5,11	5,79
Val	4	3,82	4,58	3,88
He	2	2,04	1,96	1,96
Leu	6	5,87	6,1	5,99
Tyr	4	3,8	3,8	3,87
Phe	3	3,15	3,56	3,03
His	2	2,04	2,05	2,08
Lys	1	1,01	1,05	1,02
Arg	1	0,96	1,3	1,18

HU 223 718 Β1

Az 1. és 2. preparátum mutatja a pBAST-R-plazmiddal expresszált proinzulin hibridpolipeptidből származó rekombináns humán inzulin aminosavösszetételét. A tripszines hasítást vagy pH 9,0-en (1. preparátum), vagy pH 11-en (2. preparátum) hajtottuk végre.

Az aminosavanalízist a tisztított inzulinpreparátumok perhangyasavas oxidációja és gázfázisú hidrolízise után végeztük el.

5. példa

A pBAST-R-plazmiddal expresszált, SOD-proinzulin hibridpolipeptidből származó tisztított humán inzulin peptidanalízise

A fenti példák leírásai szerint termelt tisztított humán inzulint peptidanalízisnek vetettük alá Glu-C-endoproteináz (Sigma cégtől szereztük be) alkalmazásával, amely a glutamilcsoportok karboxiloldalánál hidrolizálja a peptidkötéseket.

Részletesebben, a térszerkezetét és diszulfidkötéseit kialakított, pBAST-R-plazmiddal expresszált proinzulin hibridpolipeptid hasításával előállított inzulinmintákat (100 pg) 5 pg Glu-C-vel emésztettük 6 óráig 37 °Con 100 pl 0,1 M TRIS-HC1, pH 7,8 pufferben. HPLCanalízist végeztünk, kereskedelemben elérhető inzulinmintákat (kontroll) és térszerkezetét és diszulfidkötéseit kialakított, pBAST-R-plazmiddal expresszált proinzulin hibridpolipeptid hasításával előállított inzulint kb. pH 3,0-re savanyítottuk és RP-HPLC-vel választottuk el. Vydac 218TP54, 250x4,6 mm I. D., 5 pm, 300 Á pórusméretű oszlopot használtunk. Az oszlopot 50 mM tetraetil-ammónium-foszfát, 162 mM NaC10₄, pH 3,0 pufferrel ekvilibráltuk, amely 31,5% (v/v) acetonitrilt tartalmazott és 35-45% lineáris acetonitrilgradienst futtattunk 75 percig, 1 ml/perc áramlási sebességgel. Az abszorbanciát 220 nm-en detektáltuk.

Mindegyik várt peptidet a kontrollreakcióval egyezően állítottunk elő, bár az egyik fragmensnek megfelelő csúcsot követő kisebb váll valószínűleg a desThr(B₃₀) inzulinszerű molekulával kapcsolatos (15).

A 4. és 5. példa azt mutatja, hogy a pBAST-R-plazmid által expresszált rekombináns polipeptid tartalmazza a természetesen előforduló humán inzulin szekvenciáját. A rekombináns fehéqe egy kisebb része tartalmazott Arg(Ao), dezamino- vagy des-Thr(B₃₀) inzulinszerű molekulákat.

Ezek a nemkívánatos melléktermékek kromatográfiás módszerekkel eliminálhatók, például a fent leírt RP-HPLC-eljárással.

6. példa

A pDBAST-LAT-plazmiddal expresszált, SOD-proinzulin hibridpolipeptidből származó humán inzulin fehérjeanalizise és tisztítása

Az Arg(Ao)-inzulin melléktermék keletkezésének (4. és 5. példa) megszüntetése céljából a pBAST-R-jelű expressziós plazmidot úgy módosítottuk, hogy csak Arg-csoportot kódoló DNS-t tartalmazott a proinzulin hibridpolipeptid A- és B-lánca között, a Lys-Arg-csoportot kódoló DNS-sel szemben. Ez a pDBAST-LAT(1. B) példa) és a pXBAST-LAT (1. C) példa) expressziós plazmidokat eredményezte.

Hatékony inzulintermelést értünk el a térszerkezet kialakítása és a kialakult térszerkezetet és diszulfidhidakat tartalmazó, a pDBAST-LAT-jelű új expressziós plazmiddal expresszált proinzulin hibridpolipeptid tripszines és a CPB-emésztése után. Az inzulinszerű szennyezők szintje alacsony volt (9. ábra). A térszerkezet optimális kialakítása pH 11,25-on volt (10. ábra), és szignifikánsan megjavult, amikor kb. 2 mól aszkorbinsav volt jelen a reakciókeverékben 1 mól SH-csoportra vonatkoztatva (11. ábra).

A fehérjekoncentráció hatását a proinzulin hibridpolipeptidből előállított inzulin kitermelésére egy reakciósorozattal határoztuk meg, amelyben egyébként a térszerkezet kialakulásához optimális körülmények voltak. Optimális hozamot akkor kaptunk, amikor a fehéijekoncentráció nem haladta meg a 1,5 mg/ml-t (13. ábra).

Az inzulint DEAE-Sepharose-kromatográfiával és azt követően RP-HPLC-vel tisztítottuk (9. ábra leírása szerint). A 12. ábrából nyilvánvaló, hogy a termelt rekombináns humán inzulin retenciós ideje megegyezik a standard (kereskedelemben kapható) humán inzulinnal. A tisztított rekombináns humán Inzulinkészítmény aminosav-összetétele azonos volt a standard rekombináns inzulinnal (lásd 2. táblázat).

Meg kell jegyeznünk a 2. táblázat adatai alapján, hogy a pDBAST-LAT-plazmiddal expresszált proinzulin hibridpolipeptidből származó inzulin nem tartalmazott extra-Arg-csoportot az inzulin-A-lánchoz kapcsolódva (Arg(Ao)- inzulin), ahogyan azt a 4. példában leírtuk. így a pDBAST-LAT-plazmid inzulintermelésre előnyös plazmid, és a proinzulin hibridpolipeptid előnyös szekvenciája a 7. ábrán látható.

2. táblázat

Rekombináns humán inzulin aminosav-összetétele

Aminosav	Csoportok száma
Elméleti	Standard inzulin	Rekombináns inzulin
Asx	3	3,2	3,32
Thr	3	2,98	2,73
Ser	3	2,84	2,71
Glx	7	7,15	7,41
Pro	1	1,28	1,02
Gly	4	4,24	4,46
Alá	1	1	1,09
Cys	6	5,88	5,28
Val	4	3,82	4
Ile	2	2,04	1,91
Leu	6	5,87	6,34
Tyr	4	3,8	3,64
Phe	3	3,15	3,06
His	2	2,04	2,18
Lys	1	1,01	1,02
Arg	1	0,96	1,07

HU 223 718 Bl

A táblázatban a standard humán inzulin és a pDBAST-LAT-plazmiddal termelt rekombináns humán inzulin aminosav-összetétele látható.

7. példa

Humán inzulin előállításapDBAST-LAT-plazmiddal expresszáltproinzulin hibridpolipeptid nyers intracelluláris csapadékából

Egy továbbfejlesztett eljárást hajtottunk végre inzulin előállítására a proinzulin hibridpolipeptid térszerkezetének kialakításával és enzimatikus konverziójával úgy, hogy kihagytuk a 2. példa IV. részében lévő kezdő tisztítási lépést. Hatékonyan inzulintermelést értünk el a térszerkezetet és diszulfidhidakat kialakított proinzulin hibridpolipeptid tripszinnel és karboxipeptidáz-Bvel végzett hasításával (14. ábra és 3. táblázat). Az inzulin kitermelését a kiindulási fehérjekoncentráció (A₂₈₀) százalékában számoltuk ki, amit a csapadék pH 12-n végzett feloldási lépésénél határoztunk meg (14. ábra). A SOD-proinzulin hibridpolipeptid térszerkezetének kialakulása a nyers intracelluláris csapadékból optimálisan körülbelül 4,5 órával a kísérlet elindítása után következett be (14. ábra).

A 3. táblázat összegzi a pBAST-LAT-plazmiddal expresszált proinzulin hibridpolipeptidből származó inzulin részleges tisztítását a nyers intracelluláris csapadékból, egy liter fermentléből kiindulva, melynek O. D.₆₆₀-ja 45 volt. A feloldást és a térszerkezet kialakítását a 14. ábrán ismertetjük. 4,5 órával a feloldás után, a térszerkezetet felvett, diszulfidhidakat kialakított proinzulin hibridpolipeptid oldatának pH-ját 8,8-re állítottuk tömény HCl-dal. ZnCl₂-karboxipeptidáz-B-t (1:4000 w/w) és tripszint (1:6000 w/w) adtunk hozzá. Az emésztést 3 óráig végeztük 37 °C-on és fenil-metilszulfonil-fluoriddal (PMSF) állítottuk le, melyet 0,5 mM végkoncentrációban adagoltunk. A HPLC-analízis 169 mg inzulinhozamot mutatott ki (leírás a 9. ábrán). Az inzulint anioncserén és hidrofób kölcsönhatáson alapuló kromatográfiával tisztítottuk. Az emésztett és térszerkezetét felvett fehérjét tartalmazó oldatot DEAE-Sepharose Fást Flow oszlopra vittük (Pharmacia), melyet előzőleg 20 mM TRIS-HC1, 10 mM NaCl pH 8,0 pufferrel ekvilibráltunk, a felvitt mennyiség körülbelül 50 A_28o egység volt 1 ml gélre. A megkötött anyagot 20 mM TRIS-HC1, 100 mM NaCl pH 8,0 pufferrel mostuk, és az inzulint 250 mM NaCl-dal eluáltuk ugyanebben a pufferben. Az összegyűjtött frakciók inzulintartalma a felvitt fehérje 20%-át tartalmazták, és tisztasága 37,1%-os volt. A DEAE-elúció összegyűjtött frakcióihoz 410 mM ammónium-szulfátot adagoltunk, és Phenyl-Sepharose Fást Flow oszlopra vittük, amit előzőleg 20 mM Tris-HCl, 540 mM ammónium-szulfátot tartalmazó pufferrel ekvilibráltunk, a felvitt anyag mennyisége körülbelül 12 A₂₈₀ egység volt 1 ml gélre számolva. A megkötött anyagot ekvilibrációs pufferrel mostuk, és az inzulint 20 mM Tris-HCl, 220 mM ammónium-szulfát pH 8,0 pufferrel eluáltuk. Az inzulint tartalmazó frakciókban a felvitt fehérje 42,3%-a volt, és tisztasága 74,1%-os volt. A részleges tisztítási eljárás eredményeképpen 120 mg inzulint kaptunk, amely azonos volt a standard inzulinnal, és 5,16%-os inzulinkitermelésnek felel meg. Az inzulin további tisztítását szakember által ismert eljárásokkal lehet elvégezni, például gélszűréssel, RP-HPLC-vel és kristályosítással (17).

3. táblázat

Tisztítási lépés	^A28O	Inzulin minimális mennyisége HPLCvel meghatározva (mg)	Tisztaság (%)
Visszaoldott csapadék	232 6	-	-
Aktív szenes kezelés	191 5	-	-
T érszerkezet-kialaki- tás és enzimatikus kezelés	191 5	169	8,8
DEAE-Sepharose- frakciók	383	142	37,1
Phenyl-Sepharose- frakciók	162	120	74,1

Az A₂₈₀ a 280 nm-en mért teljes abszorbanciát jelenti mindegyik tisztítási lépés után. Az inzulint HPLCanalízissel határoztuk meg, a standard inzulinhoz hasonlítva, a 9. ábra leírásának megfelelően, a standard inzulinban található főcsúcshoz hasonlítva.

Hivatkozások j egyzéke

Cousens, L. S., Shuster, J. R., Gallegos, C., Ku, L.,

Stempien, Μ. M., Urdea, M. S., Sanchez-Pescador,

R., Taylor, A. and TeKamp-Olson, P., Gene

61: 265-275, 1987.

Davidson, H. W., Rhodes, C. J. and Hutton, J. C., Natúré 333: 93-96, 1988.

Ellman, G. L., Arch. Biochem. Biophys. 82: 70-77,

1959.

Fischer, M., Fytlovitch, S., Amit, B., Wortzel, A. and

Beck, Y., Appl. Microbiol. Biotechnoi.

33: 424-428, 1990.

Frank, Β. H. and Chance, R. E. (1985), The preparation and characterization of humán insulin of recombinant DNA origin, in Therapeutic agents produced by genetic engineering, Quo Vadis Symposium, Sanofi Group, May 29-30, 1985, Toulouse-Labege, Francé, pp: 137-146.

Goeddel, D. V., Kleid, D. G., Bolivár, F., Heyneker, H. L., Yansura, D. G., Crea, R., Hírőse, T., Kraszewski, A., Itakura, K. and Riggs, A. D., Proc. Natl. Acad. Sci. 76: 106-110, 1979.

Grau, U., Diabetes34: 1174-1180, 1985.

Hartman, et al., U. S. Patent No. 5,143,836, September

1, 1992.

Kemmler, W., Peterson, J. D. and Steiner, D. F., J. Bioi. Chem. 246: 6786-6791, 1971.

HU 223 718 Bl

Morinaga, Y., Franceschini, T., Inouye, S. and Inouye, M., Biotechnology 2: 636-639, 1984.

Panayotis, G., Katsoyannis, G. and Tometsko, A., Proc.

Natl. Acad. Sci. U.S.A., 55: 1554-1561, 1966. Schlichtkrull, J., Acta Chem. Scand. 10: 1459-1464,

1956.

Sherman, L., Dafni, L., Liehman-Hurwitz, J. and Groner, Y., Proc. Natl. Acad. Sci. 80: 5465-5469, 1983.

Steiner, D. F. and Clark, J. L., Proc. Natl. Acad. Sci. 60: 622-629, 1968.

Thim, L., Hansen, Μ. T., Norris, K., Hoegh, I., Boel, E., Forstrom, J., Ammerer, G. and Fiil, N. P., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 83: 6766-6770, 1986.

Wetzel, R., Kleid, D. G., Crea; R., Heyneker, H. L., Yansura, D. G., Hírőse, T., Kraszewski, A., Riggs, A. D., Itakura, K. and Goeddel, D. V., Gene 16: 63-71, 1981.

Yanofsky, C., Platt, T., Crawford, I. P., Nichols, Β. P., Christie, G. E., Horowitz, H., Van Cleemput, M. and Wu, A. M., Nucleic Acids Rés. 9: 6647-6668, 1981.

Claims

1. Eljárás inzulin előállítására, azzal jellemezve, hogy

a) proinzulintartalmú hibridpolipeptidet állítunk elő oly módon, hogy a hibridpolipeptidet kódoló DNS-t tartalmazó baktériumsejteket a hibridpolipeptidnek a DNS-ről történő expresszióját elősegítő módon kezeljük, majd a hibridpolipeptidet a sejtből kinyerjük;

b) a proinzulintartalmú hibridpolipeptid térszerkezetét előzetes szulfitolizis végrehajtása nélkül, a proinzulinra jellemző korrekt diszulfidhidak kialakulásának kedvező körülmények között kialakítjuk;

c) a kialakított térszerkezetű, diszulfidhidakat tartalmazó hibridpolipeptidet enzimatikus hasításnak vetjük alá, és így inzulint állítunk elő; és

d) az előállított inzulint tisztítjuk.

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a b) lépésben a hibridpolipeptidet mintegy 4-37 °C-on, mintegy 1-30 óráig, mintegy 8,5-12,0 pH-értékek között inkubáljuk.

3. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az inkubálást aszkorbinsav jelenlétében végezzük.

4. A 2. vagy 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a pH-értéket 11,0 és 11,25 közé állítjuk.

5. A 3. vagy 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az aszkorbinsavat mintegy 2-szeres moláris koncentrációban alkalmazzuk a térszerkezet-kialakító reakcióelegyben jelen lévő SH-csoportok moláris koncentrációjához viszonyítva.

6. A 2-5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az inkubálást mintegy 5 órán át végezzük.

7. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a c) lépés végrehajtása során

i) a pH-t mintegy 8,8 és mintegy 9,0 közötti értékre állítjuk; és ii) a hibridpolipeptidet tripszin és karboxipeptidázB alkalmazásával, 16-37 °C-on, 30 perc és 18 óra közötti hosszúságú időintervallumon át hasítjuk.

8. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a d) lépésben az inzulint

i) DEAE-Sepharose-kromatográfia és RP-HPLC alkalmazásával;

ii) ultraszűrés és CM-Sepharose-kromatográfia alkalmazásával; vagy iii) DEAE-Sepharose-kromatográfia és Phenyl-Sepharose-kromatográfia alkalmazásával tisztítjuk.

9. Az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a proinzulin hibridpolipeptid expresszálására

a) ATCC 69 361 nyilvántartási számon deponált pDB AST-LAT-plazmidot;

b) ATCC 69 363 nyilvántartási számon deponált ρλΒ AST-LAT-plazmidot; vagy

c) ATCC 69 362 nyilvántartási számon deponált pBAST-R-plazmidot alkalmazunk.

10. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy sejteket az a) lépésben glükóz, glicerin vagy galaktóz jelenlétében végzett fermentációval kezeljük.

11. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a sejtekből az a) lépésben alábbiak szerint nyerjük ki a hibridpolipeptidet:

i) a baktériumsejt vagy fragmense sejtfalát szétroncsoljuk, és így lizátumot állítunk elő;

ii) az intracelluláris csapadékot a lizátumból centrifugálással izoláljuk; és iii) a csapadékot szolubilizáljuk.

12. Hibridpolipeptid, amely proinzulint és a proinzulin N-terminálisához kapcsolt vezetőpeptidet tartalmaz, melynek kialakult térszerkezete és a proinzulinra jellemző korrekt diszulfidhídjai vannak.

13. A 12. igénypont szerinti hibridpolipeptid, amely a CuZnSOD N-terminálisából származó vezetőpeptidet tartalmaz.

14. A 12. vagy a 13. igénypont szerinti hibridpolipeptid, amely 62 aminosavat tartalmazó vezetőpeptidet tartalmaz, amit Met-aminosavgyök előz meg és Argaminosavgyök követ.

15. A 12-14. igénypontok bármelyike szerinti hibridpolipeptid, amely a cisztein-aminosavgyökök helyett szerin-aminosavgyököket tartalmazó vezetőpeptidet tartalmaz.

16. A 12-15. igénypontok bármelyike szerinti hibridpolipeptid, amely az inzulin-B-láncot az inzulin-Alánchoz kovalensen kapcsolva tartalmazó proinzulint tartalmaz, amely kapcsolat

i) kizárólag egy Arg-gyökön; vagy ii) egy Lys-Arg-dipeptiden keresztül van kialakítva.