DE69434909T3

DE69434909T3 - Herstellung von humaninsulin

Info

Publication number: DE69434909T3
Application number: DE69434909T
Authority: DE
Inventors: Jacob HARTMAN; Simona Mendelovitz; Marian Gorecki
Original assignee: Ferring International Center SA
Current assignee: Ferring International Center SA
Priority date: 1994-12-29
Filing date: 1994-12-29
Publication date: 2012-02-09
Anticipated expiration: 2014-12-30
Also published as: DK0871474T3; DE69434909D1; ES2279510T3; PL321039A1; HUT78070A; DE95907193T1; EP0871474A4; CA2208095A1; CA2208095C; PT871474E; PL180818B1; DE69434909T2; DK0871474T4; EP0871474A1; EP0871474B1; HK1013594A1; BR9408638A; JPH10511849A; EP0871474B2; CZ203197A3

Description

Hintergrund der Erfindung
In der gesamten Beschreibung wird durch arabische Ziffern in Klammern auf verschiedene Veröffentlichungen verwiesen. Die vollständigen Zitierungen dieser Referenzen sind am Ende der Beschreibung unmittelbar vor den Ansprüchen zu finden.
Insulin ist ein Polypeptidhormon, das für die Steuerung des Glukosemetabolismus wesentlich ist, und wird Patienten, die an Diabetes mellitus, einer durch eine ungenügende Insulinzufuhr gekennzeichneten Stoffwechselstörung, leiden, täglich verabreicht.
Das Hormon wird in vivo zuerst als langes Vorläufermolekül synthetisiert und anschließend in seine biologisch aktive Form, die aus einer A- und einer B-Kette besteht, weiter verarbeitet. Genauer gesagt wird das Gen für Präproinsulin in den Betazellen des endokrinen Pankreas in einen mRNA-Vorläufer transcribiert, welcher dann gespleißt wird, um reife mRNA zu produzieren. Diese mRNA wird zu Präproinsulin (NH₂-Vorregion-B-Kette-C-Peptid-A-Kette-COOH) translatiert, welches sequentiell zu Proinsulin und schließlich zu Insulin verarbeitet wird. Der erste Verarbeitungsschritt ist die proteolytische Beseitigung der Vorregion, welche als hydrophobe Signalsequenz für den Transfer der entstehenden Kette durch die mikrosomalen Membrane des rauen endoplasmatischen Retikulums dient. Bei menschlichem Präproinsulin beträgt die Länge der Vorregion 24 Aminosäuren.
Bei Proinsulin sind die beiden Bereiche der Polypeptidkette, die zu dem reifen Insulin werden, nämlich die B- und die A-Kette, durch das C-Peptid (oder die C-Kette), das bzw. die am N- und C-Ende zwei Paare von basischen Aminosäuren umfasst, miteinander verbunden. Bei den meisten C-Peptiden sind diese Paare Arg-Arg und Lys-Arg. Das menschliche C-Peptid, einschließlich der beiden flankierenden Paare basischer Aminosäuren, enthält 35 Aminosäuren. Das C-Peptid verbindet die beiden Abschnitte des Polypeptids, um eine angemessene Bildung von Disulfidbrücken zwischen den B- und A-Segmenten zu fördern. Daher hängt die Funktion des C-Peptids nicht maßgeblich von seiner Struktur ab. Sein Austausch gegen eine kürzere synthetische Brücke erlaubt in der Tat immer noch die richtige Faltung des Proinsulinmoleküls (1, 2).
Das Proinsulin faltet sich mit der gleichzeitigen Oxidation zweier Interketten-Disulfidbrücken und einer Disulfidbrücke innerhalb der A-Kette. In der letzten Stufe der Reifung spalten proteolytische Enzyme an den basischen Aminosäuren, um das C-Peptid freizusetzen und das reife Insulin zu bilden (3). Bei menschlichem Insulin ist die A-Kette 21 Aminosäuren lang, während die B-Kette 30 Aminosäuren lang ist.
Der weltweite Bedarf an Insulin übersteigt mehrere Tonnen jährlich, und es besteht ein ernstes Versorgungsdefizit. Insulin wurde traditionellerweise aus begrenzten tierischen Quellen, hauptsächlich aus Rinder- und Schweine-Pankreaspräparaten, hergestellt, die sich von menschlichem Insulin unterscheiden und eine nachteilige Immunreaktion auslösen können.
Studien, die in den 60er-Jahren durchgeführt wurden, veranschaulichten die in vitro-Produktion von Insulin. Eine Insulinsynthese wurde erzielt, indem die A- und B-Ketten in ihren S-sulfonierten Formen kombiniert wurden (4), oder durch spontane Reoxidation des reduzierten Proinsulins (5). Die letztere Methode war aufgrund einer sehr geringen Proteinkonzentration im Oxidationsgemisch für die Insulinproduktion im großen Umfang ungeeignet. Insulin konnte danach, im Anschluss an eine Behandlung mit Trypsin und Carboxypeptidase B, gewonnen werden (6).
Halbsynthetisches und biosynthetisches (rekombinantes) menschliches Insulin wurde vor kurzem erhältlich. Halbsynthetisches menschliches Insulin wird aus Schweineinsulin hergestellt, und zwar durch den Trypsin-katalysierten Austausch von Alanin gegen Threonin an der Position 30 in der B-Kette (der einzige Unterschied zwischen Schweineinsulin und menschlichem Insulin). Das entweder in E. coli oder in Hefe produzierte rekombinante menschliche Insulin wird letztendlich alle anderen Herstellungswege ersetzen.
Biosynthetisches rekombinantes menschliches Insulin wird derzeit über zwei Wege hergestellt: entweder durch getrennte Herstellung der A- und B-Ketten in E. coli und deren anschließende Vereinigung (7, 8) oder durch enzymatische Umwandlung von Proinsulinartigen Polypeptiden, die entweder in E. coli (1, 8) oder in Hefe (2, 9) exprimiert wurden.
In den meisten Fallen wird Proinsulin als Hybridprotein produziert, das sich als intrazelluläres präzipitiertes Protein ansammelt. Dieser Hybrid wird normalerweise durch CNBr gereinigt und gespalten, um das Proinsulin-Polypeptid freizusetzen. Letzteres wird durch eine oxidative Sulfitolyse zum Proinsulin-S-Sulfonat weiter modifiziert. Das Proinsulin-S-Sulfonat wird danach gereinigt und unter reduzierenden Bedingungen zum Proinsulin gefaltet (8). Die Umwandlung des Proinsulins in Insulin wird durch die kombinierte Wirkung von Trypsin und Carboxypeptidase B erzielt (6).
Die auf Novo Nordisk A/S übertragene Patentveröffentlichung No. EP 195691 B1 beschreibt ein Proinsulin der Formel B-Lys-Arg-A und dessen Verwendung zur Herstellung von Insulin in Hefe.
Die auf Chiron Corp. übertragene Patentveröffentlichung Nr. EP 196056 B1 beschreibt ein durch Hefe produziertes hSOD-Proinsulinprotein. Das hSOD-Proinsulinprotein wird vor der Faltung einer Cyanbromidspaltung und Sulfitolyse unterzogen.
Hoechst offenbart in der EPO-Veröffentlichung Nr. 379162 , dass „falsche” Rekombinanten von Insulinvorläufern (d. h., rekombinante Insulinprodukte mit inkorrekten oder teilweise inkorrekten intermolekularen Disulfidbrücken) ohne Sulfitolyse in „korrekte” Insulinprodukte umgewandelt werden können, indem die falschen Rekombinanten in einem wässrigen Medium in Gegenwart eines organischen Redoxsystems mit einem Überschuss an Mercaptan umgesetzt werden. Der ursprüngliche Sulfitolyseschritt findet nach dem (chemischen oder enzymatischen) Abspalten der Aminosäure oder des Peptidrests vom Fusionspolypeptid statt (was nach der Lyse der Wirtszelle erfolgt), da die sechs Cysteine des Insulinvorläufers dann in ihre S-Sulfonate umgewandelt werden. In einem anschließenden Renaturierungsschritt wird durch Bildung der drei korrekten Disulfidbrücken aus diesem Proinsulin-S-Sulfonat natürliches Proinsulin hergestellt. In diesem Renaturierungsschritt werden die sogenannten „falschen Rekombinanten” produziert.
Hoechst offenbart in der internationalen PCT-Veröffentlichung Nr. WO 91/03550 weiters ein Verfahren zur Herstellung von Fusionsproteinen, die ein gewünschtes Protein (z. B. Proinsulin) und einen „Ballastbestandteil” enthalten. Die Sulfitolyse erfolgt vor der Faltung, während der „Ballastbestandteil” gleichzeitig mit der C-Kette des Proinsulins abgespalten wird, und zwar nach der Faltung.
Hoechst beschreibt in der EP 347781 B1 außerdem ein „Mini-Proinsulin” (B-Arg-A) und dessen Verwendung zur Herstellung von mono-Arg-Insulin und Insulin. Weiters beschreiben sie Fusionsproteine, die B-Arg-A und einen „Ballastbestandteil” umfassen. Der „Ballastbestandteil” wird durch Cyanbromid abgespalten, und die Sulfitolyse erfolgt vor der Faltung des Polypeptids.
Die gegenständliche Erfindung offenbart die Produktion von rekombinantem menschlichem Insulin durch ein verbessertes und effizientes Verfahren. Rekombinante hybride Proinsulin-Polypeptide, die eine wie in den Ansprüchen definierte Leader-Sequenz umfassen, werden in E. coli synthetisiert. Nach einer teilweisen Reinigung werden sie unter Bedingungen, die eine korrekte Faltung ermöglichen, gefaltet, wobei das Leader-Peptid nach wie vor befestigt ist. Biologisch aktives menschliches Insulin wird danach durch eine kombinierte Behandlung mit Trypsin und Carboxypeptidase B hergestellt, wobei diese Enzyme das Leader-Peptid und die C-Kette gleichzeitig abspalten. Das so hergestellte, gereinigte menschliche Insulin ist mit natürlich vorkommendem menschlichem Insulin identisch.
Die riskanten und umständlichen Arbeitsabläufe, die an der CNBr-Spaltung von hybriden Polypeptiden beteiligt sind, und die Sulfitolyse, die zum Schutz der reichlich vorhandenen SH-Gruppen eingesetzt wird, sind bei diesem neuartigen Verfahren ausgeschlossen, da das gesamte hybride Proinsulin-Polypeptid sich sogar in Gegenwart des Leader-Peptids und der ungeschützten Cysteinreste effizient in seine native Struktur falten kann. Das aktive rekombinante menschliche Insulin wird durch enzymatische Spaltung freigesetzt und danach gereinigt.
Kurze Beschreibung der Figuren
Die Restriktionskarten für die drei, in den 3–5 gezeigten Plasmide kennzeichnen nicht alle an diesen Plasmiden vorhandenen Restriktions-Schnittstellen. Diese für ein vollständiges Verständnis der Erfindung notwendigen Restriktions-Schnittstellen sind jedoch dargestellt.
1: Erzeugung von menschlichem Insulin durch enzymatische Spaltung des durch Expression des Plasmids pBAST-R hergestellten, gefalteten Disulfid-verbrückten hybriden Proinsulin-Polypeptids. Nur ein Teil der SOD-Leader-Sequenz ist angegeben.
2: Erzeugung von menschlichem Insulin durch enzymatische Spaltung des durch Expression des Plasmids pDBAST-LAT oder des Plasmids pλBAST-LAT hergestellten, gefalteten Disulfid-verbrückten hybriden Proinsulin-Polypeptids. Nur ein Teil der SOD-Leader-Sequenz ist angegeben.
3: Struktur des Plasmids pBAST-R, eines Expressionsplasmids, das ein hybrides SOD-Proinsulin-Polypeptid, hinterlegt bei der ATCC unter ATCC-Zugangsnummer 69362, codiert.
4: Struktur von pDBAST-LAT, eines Expressionsplasmids, das ein hybrides SOD-Proinsulin-Polypeptid, hinterlegt bei der ATCC unter ATCC-Zugangsnummer 69361, codiert.
5: Struktur von pλBAST-LAT, eines Expressionsplasmids, das ein hybrides SOD-Proinsulin-Polypeptid, hinterlegt bei der ATCC unter ATCC-Zugangsnummer 69363, codiert.
6: Aminosäure und korrespondierende DNA-Nucleotidsequenz des vom Plasmid pBAST-R exprimierten, hybriden SOD-Proinsulin-Polypeptids.
7: Aminosäure und korrespondierende DNA-Nucleotidsequenz des von den Plasmiden pDBAST-LAT und pλBAST-LAT exprimierten, hybriden SOD-Proinsulin-Polypeptids.
8: Produktion von menschlichem Insulin aus dem vom Plasmid pBAST-R exprimierten, hybriden Proinsulin-Polypeptid abhängig vom pH-Wert des Faltungsegemisches.
Die Faltung des hybriden Proinsulin-Polypeptids (hergestellt wie in Beispiel 2 beschrieben) wurde, wie angegeben, bei verschiedenen pH-Werten in 100 mM Glycinpuffer bei 4°C entweder mit 1 mg/ml oder mit 0,5 mg/ml des hybriden Polypeptids etwa 16 Stunden lang durchgeführt. Das gefaltete Material wurde bei 37°C und einem pH-Wert von 9 mit Trypsin (1:500 w/w) (Sigma) und Carboxypeptidase B (CPB, Sigma, 1:200 w/w) 30 Minuten lang behandelt und mittels Radioimmunassay auf immunreaktives (IR)-Insulin untersucht, wobei ¹²⁵I-Insulin (Amersham) und menschliches rekombinantes Insulin (Calbiochem) als Standard eingesetzt wurden.
9: Produktion von menschlichem Insulin aus dem vom Plasmid pDBAST-LAT exprimierten, hybriden Proinsulin-Polypeptid
Das hybride Proinsulin-Polypeptid (hergestellt wie in Beispiel 2 beschrieben) wurde in 8M Harnstoff, 5 mM HCl in einer Konzentration von etwa 30 mg/ml aufgelöst und in 100 mM Glycin-NaOH, pH 11,0, zu 1 mg/ml verdünnt. Die Faltung erfolgte bei 22°C (Raumtemperatur) für 20 Stunden. Die Lösung wurde dann mit HCl auf einen pH-Wert von 8,8 eingestellt. Carboxypeptidase B (1:1000 w/w, Sigma) und Trypsin (1:2000 w/w, Sigma) wurden hinzugefügt, und die Reaktionsmischung wurde bei 37°C 60 Minuten lang inkubiert. Die Aufschlussmischungen wurden bis zu einem pH-Wert von 3 angesäuert, bevor sie mit 10 mM HCl verdünnt wurden. 150 μl-Aliquote wurden durch Umkehrphasen-Hochdruckflüssigkeitschromatographie (RP-HPLC) auf einer 5 μ-Lichrosphere-100-RP-8-Säule (Merck) von 250×4 mm analysiert, die mit 50 mM Tetraethylammoniumphosphat, 162 mM NaClO₄, pH 3, enthaltend 31,5% (v/v) Acetonitril, äquilibriert war. Die Säule wurde innerhalb von 75 Minuten mit einem linearen Gradienten von 31,5–40,5% Acetonitril bei einer Durchflussgeschwindigkeit von 1 ml/Minute entwickelt. Die Extinktion wurde bei 220 nm überwacht.

A: 5 μg Standardinsulin (Boehringer-Mannheim);
B: rekombinantes menschliches Insulin, produziert im Anschluss an eine enzymatische Behandlung;
C: gefaltetes hybrides SOD-Proinsulin-Polypeptid.

10: Produktion von menschlichem Insulin aus dem vom Plasmid pDBAST-LAT exprimierten. hybriden Proinsulun-Polypeptid abhängig vom pH-Wert im Faltungsgemisch.
Das hybride Proinsulin-Polypeptid (hergestellt wie in Beispiel 2 beschrieben) wurde in 100 mM Glycin-NaOH-Puffer mit den angegebenen pH-Werten zu 1 mg/ml verdünnt und bei 22°C 16 Stunden lang gefaltet. Die Enzymbehandlung und die RP-HPLC-Analyse wurden durchgeführt wie bei 9 beschrieben, Die Menge an rekombinantem menschlichem Insulin, das aus dem hybriden Polypeptid hergestellt wurde, wurde gemäß dem Bereich des Peaks berechnet, der dieselbe Retentionszeit wie Standardinsulin aufwies.
11: Produktion von menschlichem Insulin aus dem vom Plasmid pDBAST-LAT exprimierten, hybriden Proinsulin-Polypeptid abhängig von der Ascorbinsäurekonzentration im Faltungsgemisch.
Die Faltung des hybriden SOD-Proinsulin-Polypeptids (hergestellt wie in Beispiel 2 beschrieben) erfolgte bei 1 mg/ml, bei 22°C und bei einem pH-Wert von 11,2 in 100 mM Glycin-NaOH in Gegenwart der angegebenen Ascorbinsäurekonzentrationen. Die Proben wurden nach Faltungszeiträumen von 5 und 25 Stunden mit Trypsin und Carboxypeptidase B behandelt (wie in 9). Die Produktion von rekombinantem menschlichem Insulin wurde mittels RP-HPLC analysiert (wie in 9).
12: Authentizität von menschlichem Insulin. das aus dem vom Plasmid pDBAST-LAT exprimierten. hybriden Proinsulin-Polypeptid hergestellt wurde
Die Faltung des hybriden SOD-Proinsulin-Polypeptids (hergestellt wie in Beispiel 2 beschrieben) wurde bei 1 mg/ml in 100 mM Glycin-NaOH, pH 11,2, und in 1,2 mM Ascorbinsäure bei 22°C 16 Stunden lang durchgeführt. Im Anschluss an die enzymatische Behandlung (wie in 9) wurde die Mischung an einer DEAE-Sepharosesäule, die in 20 mM Tris-HCl, pH 8, äquilibriert war, chromatographiert. Rekombinantes menschliches Insulin wurde mit einem linearen Gradienten von 0–0,4 M NaCl in 20 mM Tris-HCl, pH 8, eluiert. Die Peak-Fraktionen wurden gepoolt und mit HCl bis zu einem pH-Wert von 3 angesäuert. Das rekombinante menschliche Insulin wurde durch RP-HPLC weiters von insulinartigen Molekülen gereinigt, wie bei 9 beschrieben wurde. Der Haupt-Peak wurde gesammelt, an einer Sephadex-G-25-Säule in 0,25 M Essigsäure entsalzt und gefriergetrocknet. In 10 mM HCl wurden Proben (5 μg rekombinantes menschliches Insulin) vorbereitet und unter denselben Bedingungen durch RP-HPLC analysiert.

A: Standardinsulin;
B: HPLC-gereinigtes rekombinantes menschliches Insulin;
C: kombinierte Probe von HPLC-gereinigtem rekombinantem menschlichem Insulin und Standardinsulin.

13: Produktion von menschlichem Insulin aus dem vom Plasmid pDBAST-LAT exprimierten. hybriden Proinsulin-Polypeptid abhängig von der Proteinkonzentration im Faltungsgemisch.
Hybrides SOD-Proinsulin-Polypeptid (hergestellt wie in Beispiel 2 beschrieben) wurde in 100 mM Glycin-NaOH, pH 11,2, gefaltet, und zwar, wie angegeben, bei einer endgültigen Proteinkonzentration von 0,5 mg/ml bis 10 mg/ml. Jedes Faltungsgemisch wurde mit 2,5 Mol Ascorbinsäure pro Mol SH-Gruppe ergänzt. Die Faltung erfolgte bei 24°C (Raumtemperatur) für 16 Stunden. Die enzymatische Behandlung und die RP-HPLC-Analyse wurden durchgeführt wie bei 9 beschrieben.
14: Produktion von menschlichem Insulin aus dem hybriden Proinsulin-Polypeptid. das vom Plasmid pDBAST-LAT aus einem rohen intrazellulären Präzipitat exprimiert wird, und zwar abhängig von der Faltungsdauer
Ein intrazelluläres Präzipitat wurde in 20 mM Glycin-NaOH, 33 μM EDTA, pH 11,2, bei einer Konzentration von etwa 2,6 A₂₈₀ pro ml aufgelöst. Der pH-Wert wurde mit 10 N Natriumhydroxid auf 12 eingestellt. Die Lösung wurde 10 Minuten lang in Bewegung gelassen. Der pH-Wert wurde mit konzentrierter Salzsäure auf 11,2 titriert. Aktivkohle (gewaschene Säure, Sigma) wurde bis zu einer Endkonzentration von 0,1% w/v hinzugefügt, und die Mischung wurde 30 Minuten lang gerührt. Die Suspension wurde bei 20°C zentrifugiert (20 min, 12000 U/min). Der geklärte Überstand hatte eine A₂₈₀ von etwa 2,15. Ascorbinsäure wurde bis zu einer Endkonzentration von 3 mM hinzu ergänzt. Die Faltung des hybriden Proinsulin-Polypeptids wurde wie gezeigt durchgeführt, und zwar unter kräftigem Rühren bei Raumtemperatur (22–23°C). Zu verschiedenen Zeitpunkten während des Versuchs (beginnend mit der Auflösung) wurden 10 ml-Aliquote entnommen, auf einen pH-Wert von 8,8 titriert und bei 37°C mit Carboxypeptidase B (1:1000 w/w) und Trypsin (1:2000 w/w) in Gegenwart von 50 μM ZnCl₂ 1 Stunde lang aufgeschlossen. Das Aufschließen wurde durch Ansäuerung beendet. Der Insulingehalt in jeder aufgeschlossenen Probe wurde, wie bei 9 beschrieben, durch eine RP-HPLC-Analyse bestimmt. Der Fortschritt der Faltungsreaktion manifestiert sich im Insulinanstieg (nach dem Aufschluss) und in der Abnahme des Pegels von freien Thiolgruppen, wobei letzterer durch die Ellman-Reaktion analysiert wird (16).
Kurzfassung der Erfindung
Die gegenständliche Erfindung stellt ein Verfahren zum Herstellen von menschlichem Insulin bereit, wie in den Ansprüchen beschrieben, welches Verfahren das Falten eines Proinsulin umfassenden hybriden Polypeptids unter Bedingungen, die eine korrekte Bildung von Disulfidbrücken erlauben, das Unterziehen des gefalteten Disulfidverbrückten hybriden Polypeptids einer enzymatischen Spaltung zur Produktion von aktivem menschlichem Insulin und das Reinigen des aktiven menschlichen Insulins umfasst.
Ein Polypeptid, das Proinsulin und ein am N-Ende des Proinsulins befestigtes Leader-Peptid umfasst, wobei das Polypeptid gefaltet ist und korrekte Disulfidbrücken enthält, wird hier ebenfalls beschrieben.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die Plasmide pBAST-R, pDBAST-LAT und pλBAST-LAT wurden gemäß den und in Erfüllung der Anforderungen des Budapester Vertrags hinsichtlich der internationalen Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen zum Zwecke eines Patentverfahrens am 26. Juli 1993 bei der American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawen Drive, Rockville, Maryland 20852, unter den ATCC-Zugangsnummern 69362, 69361 bzw. 69363 in E. coli hinterlegt.
Wie hier verwendet, umfasst ein hybrides Polypeptid ein an einem gewünschten Polypeptid kovalent angebrachtes Leader-Peptid. Das hybride Polypeptid der gegenständlichen Erfindung umfasst Proinsulin und SOD als Leader-Peptid und ist in den Ansprüchen definiert.
Wie hier verwendet, umfasst die Faltung das Falten eines Proinsulin umfassenden hybriden Polypeptids ohne CNBr-Spaltung vor der Faltung und ohne Sulfitolyse vor dem Falten zum Schutz der SH-Gruppen, wobei die Faltung eine korrekte Bildung von Disulfidbrücken im hybriden Polypeptid ermöglicht.
Wie hier verwendet, umfasst die korrekte Bildung von Disulfidbrücken beim hybriden Polypeptid die Bildung dreier Disulfidbrücken zwischen Cys^B7-Cys^A7, Cys^B19-Cys^A20 und Cys^A6-Cys^A11 des Insulins (Cys-Reste sind entsprechend ihrer Nummerierung in reifem Insulin nummeriert).
Wie hier verwendet, umfasst Proinsulin ein Polypeptid, das die B-, C- und A-Ketten von Insulin umfasst, und zwar in der Reihenfolge vom N-terminalen zum C-terminalen Ende.
Wie hier verwendet, umfasst das C-Ketten-Peptid von Insulin das natürlich vorkommende C-Peptid und irgendein anderes Oligopeptid, Dipeptid oder irgendeine andere einzelne Aminosäure, die durch Trypsin und Carboxypeptidase B abgespalten werden können.
Wie hier verwendet, umfasst ein Leader-Peptid ein an der B-Kette von Insulin kovalent angebrachtes Peptid oder Polypeptid, das eine Faltung und Disulfidbrückenbildung ermöglicht und mittels Trypsin abgespalten werden kann. Das Leader-Peptid ist SOD, wie in den Ansprüchen definiert.
Die den SOD codierende DNA kann durch dem Fachmann bekannte Verfahren mutiert werden, z. B. Bauer et al. (1985), Gene 37: 73–81.
Das Leader-Peptid muss eine Faltung und korrekte Bildung von Disulfidbrücken beim hybriden Polypeptid ermöglichen.
Wie hier verwendet, kann Insulin ein Homolog von natürlichen vorkommendem Insulin umfassen.
Wie hier verwendet, kann Proinsulin ein Homolog von natürlichen vorkommendem Proinsulin umfassen.
Wie hier verwendet, bezeichnet der Begriff „Homolog” in Zusammenhang mit dem durch die Verfahren der gegenständlichen Erfindung produzierten Insulin-Polypeptid ein Polypeptid, das im Wesentlichen dieselbe Aminosäuresequenz und im Wesentlichen dieselbe biologische Aktivität wie Insulin aufweist. Ein Homolog kann sich somit von dem durch die erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Insulin-Polypeptid durch Addition, Deletion oder Substitution eines oder mehrerer nicht wesentlicher Aminosäurereste unterscheiden, vorausgesetzt, dass das resultierende Polypeptid die biologische Aktivität von Insulin bewahrt. Der Fachmann kann leicht bestimmen, welche Aminosäurereste hinzugefügt, gelöscht oder substituiert werden können (einschließlich der Frage, mit welchen Aminosäuren solche Substitutionen durchgeführt werden können), wobei bewährte und wohlbekannte Methoden zur Anwendung kommen, einschließlich z. B. herkömmlicher Verfahren für das Design und die Herstellung von DNA-Sequenzen, welche für die bakterielle Expression von Polypeptid-Homologen des gegenständlichen Polypeptids codieren, die Modifikation von cDNA und genomischen Sequenzen durch sequenzgerichtete Mutagenesetechniken, die Konstruktion rekombinanter Proteine und Expressionsvektoren, die bakterielle Expression der Polypeptide und die Messung der biochemischen Aktivität der Polypeptide unter Anwendung herkömmlicher biochemischer Analysen.
Die obenstehende Definition der Homologe von Insulin gilt ebenso für die Homologe von Proinsulin.
Beispiele für Homologe von Insulin, die durch die Verfahren der gegenständlichen Erfindung hergestellt werden, sind Deletionshomologe, die weniger als all die Reste von natürlich vorkommendem Insulin enthalten, Substitutionshomologe, bei denen ein oder mehrere spezifizierte Reste durch andere Reste ersetzt sind, und Additionshomologe, bei denen ein oder mehrere Aminosäurereste zu einem End- oder Mittelabschnitt des Insulin-Polypeptids hinzugefügt sind, wobei alle dieselbe biologische Aktivität von Insulin teilen.
Beispiele für Homologe sind die in der EPO-Patentanmeldung EP 384472 geoffenbarten Insulin-Analoga und ebenso das Insulin-Analogon „Humalog” von Eli Lilly, das im „Eli Lilly and Company Report to Shareholders 1992” geoffenbart ist.
Im Wesentlichen dieselbe Aminosäuresequenz ist hier als Substitionen und/oder Deletionen und/oder Additionen von Aminosäuren in der Aminosäuresequenz umfassend definiert und kann bis zu zehn (10) Reste umfassen, und zwar entsprechend den homologen Gruppen oder Äquivalenzgruppen, die z. B. von Albert L. Lehninger, Biochemistry, zweite Auflage, Worth Publishers Inc. (1975), Kapitel 4; Creighton, Protein Structure, a Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford, England (1989); und Margaret O. Dayhoff, Atlas of Protein Sequence and Structure, Band 5, The National Biomedical Research Foundation (1972), Kapitel 9, beschrieben wurden. Derartige Substitutionen sind dem Fachmann bekannt.
Die das Insulin-Polypeptid codierende DNA kann durch dem Fachmann bekannte Verfahren mutiert werden, z. B. Bauer et al. (1985), Gene 37: 73–81. Die mutierte Sequenz kann, wie hier beschrieben, in geeignete Expressionsvektoren eingefügt werden, die in Zellen eingebracht werden, welche dann dahingehend behandelt werden, so dass die mutierte DNA die Expression des Polypeptid-Homologs regelt.
Die Plasmide der gegenständlichen Erfindung, umfassend eine Sequenz, die ein Proinsulin umfassendes hybrides Polypeptid codiert, können für eine Expression in Bakterien, welche zusätzlich die zur Expression des klonierten Gens in den Bakterien erforderlichen Regulationselemente umfassen, angepasst werden, wobei diese im Verhältnis zur Nucleinsäure, die das hybride Polypeptid codiert, solcherart lokalisiert sind, um dessen Expression zu ermöglichen. Regulationselemente, die zur Expression erforderlich sind, umfassen Promotorsequenzen zum Binden von RNA-Polymerase und eine ribosomale Bindungsstelle für die Ribosomen-bindung.
Die Plasmide der gegenständlichen Erfindung exprimieren ein Proinsulin umfassendes hybrides Polypeptid.
Der Fachmann versteht, dass die in Zusammenhang mit dieser Anmeldung hinterlegten Plasmide durch bekannte Techniken (z. B. durch eine sequenzgerichtete Mutagenese oder durch Insertion von Linkern) leicht zu verändern sind, um die Expression homologer Polypeptide zu codieren. Derartige Techniken sind z. B. in Sambrook, J., Fritsch, E.F. und Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, beschrieben.
Die geeigneten Regulationselemente sind innerhalb des Plasmids abhängig von der DNA, die das Proinsulin umfassende hybride Polypeptid codiert, positioniert, um die Expression des hybriden Polypeptids in einer geeigneten Wirtszelle zu bewirken. Bei bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung sind die Regulationselemente nahe dem und stromaufwärts von der DNA, die das hybride Polypeptid codiert, positioniert.
Verschiedene ribosomale Bindungsstellen (RBS's), um mRNA, die aus ein Proinsulin umfassendes hybrides Polypeptid codierender DNA transcribiert wurde, fähig zu machen, an Ribosomen innerhalb der Wirtszelle zu binden, sind in der gegenständlichen Erfindung ebenfalls inkludiert, wie z. B. die deo-RBS.
Die erfindungsgemäßen Plasmide enthalten auch ein ATG-Start-Codon. Die DNA, die das Proinsulin umfassende hybride Polypeptid codiert, ist mit dem ATG-Start-Codon gleichphasig.
Die erfindungsgemäßen Plasmide inkludieren auch eine DNA-Sequenz, die den Startpunkt einer Replikation aus einem bakteriellen Plasmid, das zur autonomen Replikation in der Wirtszelle fähig ist, umfasst. Geeignete Replikationsstartpunkte können aus zahlreichen Quellen, wie z. B. vom Plasmid pBR322 (ATCC-Zugangsnummer 37017) erhalten werden.
Die Plasmide der gegenständlichen Erfindung inkludieren ebenso eine DNA-Sequenz, die ein Gen enthält, das einer auswählbaren oder identifizierbaren phänotypischen Eigenschaft zugeordnet ist, die sich manifestiert, wenn das Plasmid in der Wirtszelle vorhanden ist, wie z. B. ein Gen für eine Arzneimittelresistenz, z. B. eine Resistenz gegenüber Ampicillin, Chloramphenicol oder Tetracyclin.
Beispiele für Vektoren, die verwendet werden können, um die Nucleinsäure, welche die hybriden Polypeptide (umfassend Proinsulin) codiert, zu exprimieren, sind Viren wie z. B. bakterielle Viren, z. B. Bakteriophagen (wie z. B. Phage Lambda), Cosmide, Plasmide und andere Vektoren. Gene, die Proinsulin umfassende hybride Polypeptide codieren, werden durch im Stand der Technik wohlbekannte Verfahren in passenden Vektoren eingefügt. Mittels herkömmlicher Restriktionsendonuclease-Enzymstellen können zum Beispiel sowohl Inserts als auch Vektor-DNA gespalten werden, um komplementäre Enden zu schaffen, die miteinander Basenpaare bilden und dann zusammen mit einer DNA-Ligase ligasiert werden. Alternativ können synthetische Linker, die Basensequenzen beherbergen, welche zu einer Restriktion-Schnittstelle in der Vektor-DNA komplementär sind, zur Insert-DNA ligasiert werden, die dann mit dem an dieser Stelle schneidenden Restriktionsenzym aufgeschlossen wird. Andere Mittel sind ebenfalls verfügbar.
E. coli-Zellen sind bevorzugte bakterielle Wirtszellen. Beispiele für geeignete E. coli-Zellen sind die Stämme S∅733 (cytRstrA) oder 4300, andere E. coli-Stämme und andere Bakterien können jedoch ebenfalls als Wirte für die Plasmide verwendet werden.
Die als Wirte verwendeten Bakterien können von jeglichem Stamm sein, einschließlich auxotropher (wie z. B. A1645), prototropher (wie z. B. A4255) und lytischer Stämme; F⁺- und F^--Stämme; Stämme, welche die cI857-Repressorsequenz des λ-Prophagen beherbergen (wie z. B. A1645 und A4255), und Stämme, die keine deo-Regressoren und/oder kein deo-Gen aufweisen (siehe Veröffentlichung der europäischen Patentanmeldung Nr. 0303972 , veröffentlicht am 22. Februar 1989). Der E. coli-Stamm S∅733 und der E. coli-Stamm 4300 wurden unter ATCC-Zugangsnummer 69361 bzw. 69363 hinterlegt.
Alle obenstehend beschriebenen E. coli-Wirtsstämme können durch im Stand der Technik wohlbekannte Verfahren von den Plasmiden, die sie beherbergen, „geheilt” werden, zum Beispiel durch das von R.P. Novick in Bacteriol. Review 33, 210 (1969) beschriebene Ethidiumbromidverfahren.
Die gegenständliche Erfindung stellt ein Verfahren zum Herstellen von Insulin bereit, welches (a) das Behandeln einer bakteriellen Zelle, enthaltend DNA, die ein Proinsulin umfassendes, wie in den Ansprüchen definiertes hybrides Polypeptid codiert, so dass die DNA dessen Expression regelt, und das Gewinnen des hybriden Polypeptids aus der Zelle; (b) das Falten des Proinsulin umfassenden hybriden Polypeptids, ohne zunächst das hybride Polypeptid einer Sulfitolyse zu unterziehen, unter Bedingungen, die eine korrekte Bildung von Disulfidbrücken erlauben, wobei diese Bedingungen einen pH-Wert von etwa 8,5 bis 12,0 umfassen; (c) das Unter-ziehen des resultierenden gefalteten Disulfid-verbrückten hybriden Polypeptids einer enzymatischen Spaltung, um Insulin herzustellen; (d) das Reinigen des so hergestellten Insulins umfasst. Das Insulin hat die Wirksamkeit und die Eigenschaften von handels-üblichem menschlichem Insulin.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Falten das Inkubieren des hybriden Polypeptids bei etwa 4–37°C für eine Dauer von etwa 1 bis 30 Stunden.
Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst das Falten das Inkubieren des hybriden Polypeptids bei etwa 4-37°C für eine Dauer von etwa 1 bis 30 Stunden bei einem pH-Wert von etwa 8,5–12,0 in Gegenwart von Ascorbinsäure.
Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform beträgt der pH-Wert während der Faltung 11,0–11,25.
Bei einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform beträgt die Konzentration von Ascorbinsäure ungefähr 2 Mol pro Mol im Faltungsgemisch anwesende SH-Gruppe.
Bei wiederum einer weiteren Ausführungsform beträgt die Inkubationsdauer etwa 5 Stunden.
Bei einer weiteren Ausführungsform umfasst das Unterziehen das Einstellen des pH-Werts auf etwa 8,8–9,0 und das Spalten des hybriden Polypeptids mit Trypsin und Carboxypeptidase B bei 16–37°C für etwa 30 Minuten bis 16 Stunden.
Bei einer weiteren Ausführungsform umfasst das Reinigen eine DEAE-Sepharose-Chromatographie und RP-HPLC.
Bei wiederum einer weiteren Ausführungsform umfasst das Reinigen weiters eine Ultrafiltration und CM-Sepharose-Chromatographie.
Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst das Reinigen weiters eine DEAE-Sepharose-Chromatographie und Phenyl-Sepharose-Chromatographie.
Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird das hybride Polypeptid vom Plasmid pDBAST-LAT, hinterlegt unter ATCC-Zugangsnummer 69361, exprimiert.
Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird das hybride Polypeptid vom Plasmid pλBAST-LAT, hinterlegt unter ATCC-Zugangsnummer 69363, exprimiert.
Bei einer weiteren Ausführungsform wird das hybride Polypeptid vom Plasmid pBAST-R, hinterlegt unter ATCC-Zugangsnummer 69362, exprimiert.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird das hybride. Polypeptid erhalten, indem eine bakterielle Zelle, enthaltend DNA, die das hybride Polypeptid codiert, behandelt wird, so dass die DNA dessen Expression regelt, und das hybride Polypeptid aus der Zelle gewonnen wird.
Es ist vorgesehen, dass die Behandlung eine Fermentation in Gegenwart von Glucose, Glycerin oder Galactose umfasst.
Weiters ist vorgesehen, dass das Gewinnen des hybriden Polypeptids aus der Zelle das Aufbrechen der Zellwand der bakteriellen Zelle oder von Fragmenten hiervon, um ein Lysat herzustellen, das Isolieren des intrazellulären Präzipitats aus dem Lysat mittels Zentrifugation, das Solubilisieren des Präzipitats und gegebenenfalls das Reinigen des hybriden Polypeptids durch Chromatographie oder Ultrafiltration umfasst.
Ein Polypeptid, das Proinsulin und ein am N-Ende des Proinsulins befestigtes, wie in den Ansprüchen definiertes Leader-Peptid umfasst, wobei das Polypeptid gefaltet ist und korrekte Disulfidbrücken enthält, wird hier ebenfalls beschrieben.
Das Leader-Peptid ist vom N-Ende von CuZnSOD abgeleitet. Das Leader-Peptid umfasst 62 Aminosäuren, wobei ihm die Aminosäure Met vorausgeht und ein Arg-Rest nachfolgt.
Das Proinsulin kann die Insulin-B-Kette umfassen, die durch einen einzelnen Arg-Rest mit der Insulin-A-Kette verknüpft ist.
Alternativ kann das Proinsulin die Insulin-B-Kette umfassen, die durch das Dipeptid Lys-Arg mit der Insulin-A-Kette verknüpft ist.
Die beiden obenstehenden Proinsulinmoleküle müssen als Hybridproteine produziert werden, andernfalls sind die Expressionsstärken extrem gering und haben keine kommerzielle Bedeutung.
Die Cysteinreste des Leader-Peptids werden durch Serinreste ersetzt.
Beispiele
Die nachfolgenden Beispiele sind dargelegt, um das Verständnis der Erfindung zu fördern, sie sind jedoch nicht dazu bestimmt, deren Umfang in irgendeiner Art und Weise einzuschränken, und sollten nicht dahingehend gedeutet werden. Die Beispiele enthalten keine detaillierten Beschreibungen herkömmlicher Verfahren, die bei der Konstruktion von Vektoren, bei der Einfügung von Polypeptide codierenden Genen in solchen Vektoren oder beim Einbringen der resultierenden Plasmide in Wirte eingesetzt werden. Die Beispiele enthalten auch keine detaillierte Beschreibung herkömmlicher Verfahren, die beim Analysieren der durch solche Wirtsvektorsysteme produzierten Polypeptide eingesetzt werden. Derartige Verfahren sind dem durchschnittlichen Fachmann wohlbekannt und in zahlreichen Publikationen beschrieben, einschließlich z. B. der folgenden:
Sambrook, J., Fritsch, E.F. und Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laborstory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laborstory Press.
Beispiel 1.
Konstruktion der hybride SOD-Proinsulin-Polypeptide exprimierenden Produktionsplasmide pBAST-R, pDBAST-LAT und pλBAST-LAT
Bakterielle Expressionsvektoren, die entweder unter der Kontrolle des deo-P₁P₂- oder des λP_L-Promotors Hybridproteine in E. coli überproduzieren, wurden konstruiert. Proinsulin wurde als Hybridprotein produziert, da festgestellt wurde, dass Bakterien, die einen die Insulin-B-Kette-Lys-Arg-Insulin-A-Kette codierenden Expressionsvektor beherbergen, kein nachweisbares Polypeptid produzierten. Die Hybridproteine umfassen ein Leader-Peptid, das 62 Aminosäuren lang ist, das vom N-Ende von CuZnSOD abgeleitet ist (11) und dem am N-Ende ein Met-Rest vorausgeht und am C-Ende ein Arg-Rest nachfolgt, der es mit der Insulin-B-Kette verknüpft. Die Insulin-B-Kette ist durch ein kurzes, aus Lys-Arg oder Arg bestehendes C-Ketten-Peptid mit der Insulin-A-Kette verknüpft. Die beiden Cysteine, die im SOD-Abschnitt ursprünglich vorhanden waren, wurden durch Serinreste ersetzt.
A. Plasmid pBAST-R
Eine Serie von Plasmiden wurde konstruiert, was im pBAST-R gipfelte, das nach der Transformation der richtigen E. coli-Wirtszellen fähig war, die effiziente Expression eines für die Produktion von menschlichem Insulin nützlichen, hybriden Proinsulin-Polypeptids zu regeln.
Die Struktur des Plasmids pBAST-R, welches das SOD-Insulin-B-Ketten-Lys-Arg-Insulin-A-Ketten-Hybridpolypeptid codiert, wird in 3 gezeigt; die DNA-Sequenz und die korrespondierende Aminosäuresequenz des hybriden Polypeptids werden in 6 gezeigt.
Das Plasmid pBAST-R ist etwa 4380 bp lang und umfasst die folgenden Elemente (entgegen der Uhrzeigerrichtung):

1. Ein DNA-Fragment, das 1521 bp lang ist und dabei die AatII-MscI-Stellen am pBR322 umfasst, welches das Tetracyclin-Resistenzgen inkludiert.
2. Ein DNA-Fragment, das 1497 bp lang ist und dabei die ScaI-HaeII-Stellen am pBR322 umfasst, welches ein verkürztes Ampicillin-Resistenzgen und den Startpunkt einer DNA-Replikation inkludiert.
3. Ein DNA-Fragment, das 930 bp lang ist und dabei die AvaII-NdeI-Stellen an der E. coli-DNA umfasst, welche die deo-P₁P₂-Promotoren und ribosomale Bindungsstellen (RBS) inkludiert (13).
4. Ein DNA-Fragment, das 188 bp lang ist und dabei die NdeI-PpuMI-Stellen von menschlicher CuZnSOD-cDNA umfasst. Die Cysteine an den Positionen 6 und 57 des reifen SOD wurden durch eine auf die Oligonucleotidstelle gerichtete Mutagenese durch Serinreste ersetzt (12).
5. Ein 172 bp langes, synthetisches DNA-Fragment mit PpuMI- und BamHI-Enden. Dieser Bereich codiert die Arg-Insulin-B-Kette-Lys-Arg-Insulin-A-Kette.
6. Ein synthetischer multipler 36 bp-Klonierungsstellen-Polylinker mit BamHI- und HindIII-Enden.
7. Ein synthetisches 44 bp-Oligonucleotid, enthaltend den TrpA-Transcriptionsterminator mit HindIII- und AatII-Enden (10).

Das Plasmid pBAST-R, das Tetracyclin-Resistenz verleiht und das SOD-Insulin-B-Ketten-Lys-Arg-Insulin-A-Ketten-Hybridpolypeptid codiert, wurde in den E. coli-Stamm S∅733 (cytRstrA) eingebracht und am 26. Juli 1993 bei der ATCC unter ATCC-Zugangsnummer 69362 hinterlegt.
B. Plasmid pDBAST-LAT
Eine weitere Serie von Plasmiden wurde konstruiert, was im Plasmid pDBAST-LAT gipfelte, das nach der Transformation der richtigen E. coli-Wirtszellen fähig war, die effiziente High-Level-Expression eines für die Produktion von menschlichem Insulin nützlichen, hybriden Proinsulin-Polypeptids zu regeln.
Die Struktur des Plasmids pDBAST-LAT, welches das SOD-Insulin-B-Ketten-Arg-Insulin-A-Ketten-Hybridpolypeptid codiert, wird in 4 gezeigt; die DNA-Sequenz und die korrespondierende Aminosäuresequenz des hybriden Polypeptids werden in 7 gezeigt.
Das Plasmid pDBAST-LAT ist etwa 4377 bp lang und umfasst die folgenden Elemente (entgegen der Uhrzeigerrichtung):

1. Ein DNA-Fragment, das 1521 bp lang ist und dabei die AatII-MscI-Stellen am pBR322 umfasst, welches das Tetracyclin-Resistenzgen inkludiert.
2. Ein DNA-Fragment, das 1497 bp lang ist und dabei die ScaI-HaeII-Stellen am pBR322 umfasst, welches ein verkürztes Ampicillin-Resistenzgen und den Startpunkt einer DNA-Replikation inkludiert.
3. Ein DNA-Fragment, das 930 bp lang ist und dabei die AvaII-NdeI-Stellen an der E. coli-DNA umfasst, welche die deo-P₁P₂-Promotoren und RBS inkludiert (13).
4. Ein DNA-Fragment, das 188 bp lang ist und dabei die NdeI-PpuMI-Stellen von menschlicher CuZnSOD-cDNA umfasst. Durch eine auf die Oligonucleotidstelle gerichtete Mutagenese wurden die Cysteine an den Positionen 6 und 57 des reifen SOD durch Serinreste ersetzt und der GC-Gehalt dieses Fragments auf 38% verringert (12).
5. Ein 169 bp langes, synthetisches DNA-Fragment mit PpuMI- und BamHI-Enden. Dieser Bereich codiert die Arg-Insulin-B-Kette-Arg-Insulin-A-Kette.
6. Ein synthetischer multipler 36 bp-Klonierungsstellen-Polylinker mit BamHI- und HindIII-Enden.
7. Ein synthetisches 44 bp-Oligonucleotid, enthaltend den TrpA-Transcriptionsterminator mit HindIII- und AatII-Enden (10).

Das Plasmid pDBAST-LAT, das Tetracyclin-Resistenz verleiht und das SOD-Insulin-B-Ketten-Arg-Insulin-A-Ketten-Hybridpolypeptid codiert, wurde in den E. coli-Stamm S∅733 (cytRstrA) eingebracht und am 26. Juli 1993 bei der ATCC unter ATCC-Zugangsnummer 69361 hinterlegt.
C. Plasmid pλBAST-LAT
Eine weitere Serie von Plasmiden wurde konstruiert, was im Plasmid pλBAST-LAT gipfelte, das nach der Transformation von gentechnisch veränderten (den cI857-Repressor beherbergenden) E. coli-Wirtszellen fähig war, die effiziente Expression eines für die Produktion von menschlichem Insulin nützlichen, hybriden Proinsulin-Polypeptids zu regeln.
Die Struktur des Plasmids pλBAST-LAT, welches das SOD-Insulin-B-Ketten-Arg-Insulin-A-Ketten-Hybridpolypeptid codiert, wird in 5 gezeigt; die DNA-Sequenz und die korrespondierende Aminosäuresequenz des hybriden Polypeptids werden in 7 gezeigt.
Das Plasmid pλBAST-LAT ist etwa 3777 bp lang und umfasst die folgenden Elemente (entgegen der Uhrzeigerrichtung):

1. Ein DNA-Fragment, das 1521 bp lang ist und dabei die AatII-MscI-Stellen am pBR322 umfasst, welches das Tetracyclin-Resistenzgen inkludiert.
2. Ein DNA-Fragment, das 1497 bp lang ist und dabei die ScaI-HaeII-Stellen am pBR322 umfasst, welches ein verkürztes Ampicillin-Resistenzgen und den Startpunkt einer DNA-Replikation inkludiert.
3. Ein DNA-Fragment, das 330 bp lang ist und dabei die BamHI-EcoRI-Stellen am Plasmid pSODα13 umfasst (14), welches den λP_L-Promotor und eine 30 Basenpaare lange, ribosomale AvrII-NdeI-deo-Bindungsstelle umfasst.
4. Ein DNA-Fragment, das 188 bp lang ist und dabei die NdeI-PpuMI-Stellen von menschlicher CuZnSOD-cDNA umfasst. Durch eine auf die Oligonucleotidstelle gerichtete Mutagenese wurden die Cysteine an den Positionen 6 und 57 des reifen SOD durch Serinreste ersetzt und der GC-Gehalt dieses Fragments auf 38% verringert (12).
5. Ein 169 bp langes, synthetisches DNA-Fragment mit PpuMI- und BamHI-Enden. Dieser Bereich codiert die Arg-Insulin-B-Kette-Arg-Insulin-A-Kette.
6. Ein synthetischer multipler 36 bp-Klonierungsstellen-Polylinker mit BamHI- und HindIII-Enden.
7. Ein synthetisches 44 bp-Oligonucleotid, enthaltend den TrpA-Transcriptionsterminator mit HindIII- und AatII-Enden (10).

Das Plasmid pλBAST-LAT, das Tetracyclin-Resistenz verleiht und das SOD-Insulin-B-Ketten-Arg-Insulin-A-Ketten-Hybridpolypeptid unter der Kontrolle des λP_L-Promotors codiert, wurde in den E. coli-Stamm 4300 (F-, bio, cI⁸⁵⁷) eingebracht und am 26. Juli 1993 bei der ATCC unter ATCC-Zugangsnummer 69363 hinterlegt.
Bakterielle Zellen wurden bei 30°C vermehrt. Die Produktion des hybriden Polypeptids wurde bei einer Temperaturveränderung zu 42°C induziert.
Beispiel 2.
Fermentation. Wachstumsbedingungen und Reinigung hybrider SOD-Proinsulin-Polypeptide
I. Stammkulturen
Eine Stammkultur des E. coli-Stamms S∅733, der das Plasmid pDBAST-LAT (oder pBAST-R) beherbergt, wurde auf einem mit Tetracyclin (10 mg/l) ergänzten Caseinmedium (20 g/l Caseinhydrolysat, 10 g/l Hefeextrakt und 5 g/l NaCl) gezüchtet. Die Kulturen wurden danach mit einem Gefriermedium zweifach verdünnt und bei –80°C gelagert. Gefriermedium:

K₂HPO₄ 6,3 g

KH₂PO₄ 1,8 g

Na-Citrat 0,45 g

MgSO₄·7H₂O 0,09 g

(NH₄)₂SO₄ 0,9 g

Glycerin 44 g

pro 500 ml
II. Inokulum
Das Inokulum wurde in einem Produktionsmedium vermehrt (siehe unten). Ein steriles Medium in einem Schüttelkolben wurde aus einer Stmmkultur okuliert und in einem Schüttelapparat bei 37°C mit etwa 200 U/min 15 Stunden lang inkubiert. Die nachfolgenden Stadien der Inokulumvermehrung erfolgten nötigenfalls in belüfteten Rührfermentern. Das sterile Medium wurde mit 2–10% Kolbenkultur beimpft und bei 37°C und einem pH-Wert von 7 ± 0,5 unter Rühren und Belüftung 15 Stunden lang inkubiert, um den Pegel an gelöstem Sauerstoff über einer Luftsättigung von 20% zu halten.
III. Produktion

Produktionsmedium:

K₂HPO₄	8 g/l
KH₂PO₄	2 g/l
Na-Citrat	2 g/l
NH₄Cl	3 g/l
K₂SO₄	0,5 g/l
FeSO₄·7H₂O	0,04 g/l
MgSO₄·7H₂O	0,4 g/l
CaCl₂·2H₂O	0,02 g/l
Spurenelemente
Lösung	3 ml/l
Tetracyclin	0,01 g/l
Glucose	2 g/l
Glycerin	1 ml/l

Spurenelementelösung:

MnSO₄·H₂O	1 g/l
ZnSO₄·7H₂O	2,78 g/l
CoCl₂·7H₂O	2 g/l
Na₂MoO₄·2H₂O	2 g/l
CaCl₂·2H₂O	3 g/l
CuSO₄·5H₂O	1,85 g/l
H₃BO₃	0,5 g/l
HCl (32%)	100 ml/l

Das Produktionsmedium wurde mit 0,5–10% Impfkultur beimpft und bei 37°C inkubiert. Die Geschwindigkeiten der Bewegung und Belüftung wurden so eingestellt, um den Pegel an gelöstem Sauerstoff über einer Luftsättigung von 20% zu halten. Der pH-Wert wurde mit NH₃ bei 7 ± 0,2 gehalten.
Sterile Lösungen von 50%iger Glucose und 30%igem Glycerin wurden eingegossen, um Energie- und Kohlenstoffquellen zuzuführen. Sobald die Zellkonzentration eine OD₆₆₀ von 25 erreichte, wurden sterile Lösungen von 10%iger Glucose und 30%igem Glycerin eingegossen, und das Wachstum ging etwa 5 Stunden lang weiter, bis die Zellkonzentration eine ungefähre OD₆₆₀ von 60 erreichte. Die Kultur wurde daraufhin abgekühlt, und die Zellen wurden durch Zentrifugation rückgewonnen. Die Fermentation von E. coli in Gegenwart entweder von Glucose, Glycerin, Galactose oder einer Kombination davon als Kohlenstoffquelle ermöglichte die Expression der hybriden SOD-Proinsulin-Polypeptide.
IV. Reinigung
Die von den Plasmiden pBAST-R und pDBAST-LAT exprimierten hybriden SOD-Proinsulin-Polypeptide sammelten sich in einem intrazellulären Präzipitat an, das durch die folgende Vorgehensweise isoliert wurde: 1 g (Feuchtgewicht) bakterieller Kuchen wurde in 10 ml Puffer, enthaltend 50 mM Tris-HCl, pH 8, 10 mM EDTA, suspendiert und bei 37°C 2 Stunden lang mit Lysozym (Merck, 2500 u/ml) behandelt. Die Mischung wurde dann beschallt und Nonidet-P-40 (Sigma) oder Triton X 100 wurde bis zu einer Endkonzentration von 2% hinzugefügt, und dies wurde 2 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Das Präzipitat wurde durch Zentrifugation pelletiert und mit Wasser gewaschen.
Das hybride Polypeptid wurde durch Anionenaustauschchromatographie folgendermaßen beinahe bis zur Homogenität gereinigt. Das Präzipitat wurde in 8M Harnstoff, 20 mM Tris-HCl, 200 mM β-Mercaptoethanol, pH 8,2, aufgelöst. Die Lösung wurde durch Zentrifugation geklärt und an einer DEAE-Sepharose-Fast-Flow-Säule (Pharmacia LKB), die in 8 M Harnstoff, 20 mM Tris-HCl, 20 mM β-Mercaptoethanol, pH 8,2, voräquilibriert wurde, chromatographiert. Durchflussmaterial wurde gesammelt, und das Hybridprotein wurde entweder mit (NH₄)₂SO₄ bei einer Sättigung von 40% präzipitiert oder durch Ultrafiltration auf einer 10K-Membran konzentriert, gefolgt von einer Diafiltration gegen 100 mM Glycin-HCl, pH 3,1.
Alternativ wurde das vom Plasmid pBAST-R exprimierte hybride SOD-Proinsulin-Polypeptid durch Auflösung in 8 M Harnstoff, 20 mM Dithiothreitol, 50 mM Na-Acetat, pH 5, und durch Ultrafiltration durch eine Reihe von 100kD- und 50kD-Membranen (Filtron) beinahe bis zur Homogenität gereinigt. Das hybride Polypeptid wurde auf einer 10kD-Membran konzentriert und mit (NH₄)₂SO₄ bei einer Sättigung von 40% präzipitiert.
Beispiel 3.
Faltung und enzymatische Spaltung der hybriden SOD-Proinsulin-Polypeptide
Hybride Proinsulin-Polypeptide, die durch (NH₄)₂SO₄-Präzipitation oder durch Ultrafiltration erhalten wurden (Beispiel 2), wurden in 8 M Harnstoff, 5 mM HCl aufgelöst und bei einer Endkonzentration von etwa 1 mg/ml in 100 mM Glycinpuffer, pH 8,5–12,0, verdünnt.

A. Die Faltung des vom Plasmid pBAST-R expimierten hybriden SOD-Proinsulin-Polypeptids erfolgte bei etwa 4–37°C für eine Dauer von etwa 1–24 Stunden, um eine korrekte Bildung von Disulfidbrücken zu ermöglichen. Der pH-Wert der Lösung, enthaltend das gefaltete Disulfid-verbrückte hybride Polypeptid, wurde mit HCl auf etwa 8,8–9,0 eingestellt, und das Protein wurde bei 16–37°C für 30–120 Minuten mit Trypsin und Carboxypeptidase B behandelt. Nach umfangreichem Experimentieren wurde festgestellt, dass die optimalen Bedingungen die folgenden waren: Das vom Plasmid pBAST-R exprimierte hybride Polypeptid wurde in 8 M Harnstoff, 5 mM HCl aufgelöst und bei einer Endkonzentration von etwa 1 mg/ml in 100 mM Glycinpuffer, pH 11,0, verdünnt (8), woraufhin die Faltung des hybriden Polypeptids bei 25°C 6–16 Stunden lang stattfand, wonach das gefaltete Disulfid-verbrückte hybride Polypeptid bei 37°C für 30–60 Minuten mit Trypsin (1:500 w/w) und Carboxypeptidase B (1:200 w/w) gespalten wurde. Die Insulinbildung durch enzymatische Spaltung des vom Plasmid pBAST-R exprimierten, gefalteten Disulfid-verbrückten hybriden Proinsulin-Polypeptids ist in 1 schematisch dargestellt.
B. Die Faltung des vom Plasmid pDBAST-LAT exprimierten hybriden SOD-Proinsulin-Polypeptids erfolgte bei etwa 7–31°C für eine Dauer von etwa 5–30 Stunden, um eine korrekte Bildung von Disulfidbrücken zu ermöglichen. Der pH-Wert der Lösung, enthaltend das gefaltete Disulfid-verbrückte hybride Polypeptid, wurde mit HCl auf etwa 8,8–9,0 eingestellt, und das Protein wurde bei 22–37°C für 30 Minuten bis 16 Stunden mit Trypsin und Carboxypeptidase B behandelt. Nach umfangreichem Experimentieren wurde festgestellt, dass die optimalen Bedingungen die folgenden waren: Das vom Plasmid pBAST-R exprimierte hybride Polypeptid wurde in 8 M Harnstoff, 5 mM HCl aufgelöst und bei einer Endkonzentration von etwa 1 mg/ml in 100 mM Glycinpuffer, pH 11,0–11,25, verdünnt (8), woraufhin die Faltung des hybriden Polypeptids bei 25°C 5 Stunden lang stattfand, wonach das gefaltete Disulfid-verbrückte hybride Polypeptid bei 25°C für 16 Stunden mit Trypsin (1:15.000 w/w) und Carboxypeptidase B (1:10.000 w/w) gespalten wurde. Die Insulinbildung durch enzymatische Spaltung des vorn Plasmid pDBAST-LAT exprimierten, gefalteten Disulfid-verbrückten hybriden Proinsulin-Polypeptids ist in 2 schematisch dargestellt. Beispiele spezifischer Bedingungen hinsichtlich der beiden obenstehenden Punkte A und B sind in den Zeichenerklärungen zu den 8-14 detailliert beschrieben.

Beispiel 4.
Proteinanalyse und Reinigung von menschlichem Insulin aus dem vom Plasmid pBAST-R exprimierten hybriden SOD-Proinsulin-Polypeptid
Die Bildung von menschlichem Insulin aus dem vom Plasmid pBAST-R exprimierten hybriden SOD-Proinsulin-Polypeptid wurde mittels Radioimmunassay und RP-HPLC festgestellt, wobei handelsübliches menschliches Insulin (Calbiochem) als Standard eingesetzt wurde. Die theoretische Ausbeute an rekombinantem menschlichem Insulin, die gemäß der Aminosäuresequenz des hybriden Proinsulin-Polypeptids berechnet wird, beträgt 45,6%. Aus 8 ist ersichtlich, dass die optimale Faltung bei einem pH-Wert von 11 stattfindet. Bei diesem pH-Wert macht die Insulinproduktion etwa 80% der theoretischen Ausbeute aus (was etwa 40% der Einsatzmenge an hybridem Polypeptid entspricht). Menschliches Insulin, das aus dem vom Plasmid pBAST-R exprimierten hybriden Proinsulin-Polypeptid hergestellt wurde, wurde durch RP-HPLC nachgewiesen. Eine Vydac-218TP54-Säule von 250 × 4,6 mm I.D. (Trenngruppe), 5 μm und einer Porengröße von 300 Å wurde bei Raumtemperatur mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 1 ml/min verwendet. 0,1%ige Trifluoressigsäure (TFA) in H₂O wurde als Elutionsmittel A und 0,08%ige TFA in Acetonitril als Elutionsmittel B verwendet. Die Säule wurde in einem Äquilibrierungspuffer (25% Elutionsmittel B) 5 Minuten lang gewaschen, gefolgt von einem linearen Gradienten von 25–50% Elutionsmittel B innerhalb von 37,5 Minuten. Die Extinktion wurde bei 220 nm oder bei 280 nm überwacht. Eine Analyse des menschlichen Insulins im Anschluss an den enzymatischen Aufschluss des gefalteten Disulfid-verbrückten hybriden Polypeptids mittels Umkehrphasen-Hochdruckflüssigkeitschromatographie zeigte einen Haupt-Peak mit derselben Retentionszeit wie bei standardmäßigem menschlichem Insulin.
Zwei kleinformatige Chargen wurden hergestellt, die 26 mg bzw. 13 mg menschliches Insulin erbrachten. Das menschliche Insulin wurde durch Ultrafiltration entweder auf 3K- oder auf 5K-Membranen (Filtron), gefolgt von einer CM-Sepharose-Chromatographie (Citratpuffer, pH 3), von der enzymbehandelten Lösung (pH 9) gereinigt. Peak-Fraktionen wurden entsalzt, gefriergetrocknet und einer N-terminalen Sequenzierung und Aminosäureanalyse unterzogen. Die Aminosäurezusammensetzung beider Chargen von rekombinantem menschlichem Insulin war mit jener von natürlich vorkommendem menschlichem Insulin im Wesentlichen identisch (siehe Tabelle 1, Präparat 1). Die Sequenz von 5 Aminosäuren am Aminoende der Insulinpräparate wurde durch den Edman-Abbau bestimmt. Es wurde festgestellt, dass sie mit dem NH₂-Terminus sowohl der A- als auch der B-Kette von menschlichem Insulin identisch war, was die Authentizität des in vitro-Produkts bestätigt.
Die Sequenzierungsergebnisse wiesen jedoch bei etwa 25% der Moleküle auf dag Vorhandensein eines zusätzlichen Arg-Rests in der ersten Position hin. Dieses Resultat entspricht einer Trypsinspaltung zwischen Lys und Arg innerhalb der Linker-Sequenz Lys-Arg, wodurch am Aminoende der A-Kette ein zusätzlicher Arg-Rest verbleibt.

Es wurde festgestellt, dass eine spezifische Hydrolyse am C-Ende von Arg durch Trypsin erzielt werden kann, indem die Reaktion bei einem pH-Wert von 11 durchgeführt wird. Bei diesem erhöhten pH-Wert sind die meisten ε-Aminogruppen von Lys nicht geladen (pK = 10,3), wodurch eine selektive Spaltung ermöglicht wird. Zwei Chargen, die 1 mg und 6,5 mg gereinigtes Insulin erbrachten, wurden erhalten, indem der Trypsinschritt bei einem pH-Wert von 11 durchgeführt wurde (siehe Tabelle 1, Präparat 2), gefolgt von einem Carboxypeptidase B-Aufschluss bei einem pH-Wert von 8,5. Eine N-terminale Sequenzierung zeigte, dass die Menge an Insulin mit einem zusätzlichen Arg auf etwa 5% reduziert war. TABELLE Aminasäurezusammensetzung von rekombinantem menschlichem Insulin

Aminosäure	Anzahl von Resten
Aminosäure	theoretisch	Standardinsulin	Präparat 1	Präparat 2
Asx	3	3,20	3,38	3,26
Thr	3	2,98	2,83	2,68
Ser	3	2,84	2,53	2,77
Glx	7	7,15	7,73	7,23
Pro	1	1,28	1,13	1,09
Gly	4	4,24	4,39	4,25
Ala	1	1,00	1,28	1,04
Cys	6	5,88	5,11	5,79
Val	4	3,82	4,58	3,88
Ile	2	2,04	1,96	1,96
Leu	6	5,87	6,10	5,99
Tyr	4	3,80	3,80	3,87
Phe	3	3,15	3,56	3,03
His	2	2,04	2,05	2,08
Lys	1	1,01	1,05	1,02
Arg	1	0,96	1,30	1,18

Die Präparate 1 und 2 zeigen die Aminosäurezusammensetzung von rekombinantem menschlichem Insulin, das aus dem vom Plasmid pBAST-R exprimierten hybriden Proinsulin-Polypeptid hergestellt wurde. Die Trypsinspaltung erfolgte entweder bei einem pH-Wert von 9 (Präparat 1) oder bei einem pH-Wert von 11 (Präparat 2).
Nach eurer Perameisensäureoxidation und Gasphasenhydrolyse der gereinigten Insulinpräparate wurde eine Aminosäureanalyse durchgeführt.
Beispiel 5.
Peptidanalyse von Gereinigtem menschlichem Insulin, das aus dem vom Plasmid pBAST-R exprimierten hybriden SOD-Proinsulin-Polypeptid hergestellt wurde
Gereinigtes menschliches Insulin, das wie in den obenstehenden Beispielen beschrieben hergestellt wurde, wurde einer Peptidanalyse unterzogen, wobei Endoproteinase Glu-C (Sigma) verwendet wurde, die an der Carboxylseite von Glutamylresten Peptidbindungen hydrolysiert.
Genauer gesagt wurden Insulinproben (100 μg), die durch Spaltung des vom Plasmid pBAST-R exprimierten, gefalteten Disulfid-verbrückten hybriden Proinsulin-Polypeptids hergestellt wurden, mit 5 μg Glu-C bei 37°C in 100 μl von 0,1 M Tris-HCl, pH 7,8, 6 Stunden lang aufgeschlossen. Eine HPLC-Analyse wurde durchgeführt: Proben von handelsüblichem (Kontroll)-Insulin und Insulin, das durch Spaltung des vom Plasmid pBAST-R exprimierten, gefalteten Disulfid-verbrückten hybriden Proinsulin-Polypeptids hergestellt wurde, wurden bis zu einem pH-Wert von etwa 3 angesäuert und durch RP-HPLC getrennt. Eine Vydac-218TP54-Säule von 250 × 4,6 mm I.D., 5 μm und einer Porengröße von 300 Å wurde verwendet. Die Säule wurde mit 50 mM Tetraethylammoniumphosphat, 162 mM NaClO₄, pH 3, enthaltend 31,5% (v/v) Acetonitril, äquilibriert und innerhalb von 75 Minuten mit einem linearen Gradienten von 35–45% Acetonitril bei einer Durchflussgeschwindigkeit von 1 ml/Minute entwickelt. Die Extinktion wurde bei 220 nm überwacht.
Alle erwarteten Peptide wurden übereinstimmend mit der Kontrollreaktion erzeugt, obwohl eine kleine Schulter nach dem Peak, die einem der Fragmente entspricht, wahrscheinlich mit dem insulinartigen des-Thr(B₃₀)-Molekül in Beziehung steht (15).
Die Beispiele 4 und 5 zeigen, dass das vom Plasmid pBAST-R exprimierte rekombinante Polypeptid die Sequenz des natürlich vorkommenden menschlichen Insulins umfasst. Ein kleiner Teil des rekombinanten Proteins, das produziert wurde, umfasste Formen wie z. B. insulinartige Arg(Ao)-, Desamido- oder des-Thr(B₃₀)-Moleküle.
Diese unerwünschten Nebenprodukte können durch obenstehend beschriebene chromatographische Verfahren, wie z. B. RP-HPLC, beseitigt werden.
Beispiel 6.
Proteinanalyse und Reinigung von menschlichem Insulin. das aus dem vom Plasmid pDBAST-LAT exprimierten hybriden Proinsulin-Polypeptid hergestellt wurde
Um die Bildung des Arg(Ao)-Insulin-Nebenprodukts zu verhindern (Beispiele 4 und 5), wurde das Expressionsplasmid pBAST-R dahingehend modifiziert, um eine DNA zu umfassen, die nur für einen Arg-Rest zwischen der A- und der B-Kette des hybriden Proinsulin-Polypeptids codiert, im Gegensatz zu einer DNA, die für Lys-Arg zwischen der A- und der B-Kette des vom Plasmid pBAST-R exprimierten hybriden Proinsulin-Polypeptids codiert. Dies führte zu den Expressionsplasmiden pDBAST-LAT (Beispiel 1B) und pDBAST-LAT (Beispiel 1C).
Eine effiziente Produktion von Insulin erfolgte im Anschluss an die Faltung und enzymatische Behandlung des vom neuen Expressionsplasmid pDBAST-LAT exprimierten, gefalteten Disulfid-verbrückten hybriden Proinsulin-Polypeptids mit Trypsin und CPB. Das Vorkommen von insulinartigen Kontaminanten war gering (9). Die Faltung war bei einem pH-Wert von 11,25 optimal (10) und wurde in Gegenwart von etwa 2 Mol Ascorbinsäure pro Mol SH-Gruppe in der Reaktionsmischung erheblich verstärkt (11),
Die Wirkung der Proteinkonzentration auf die Ausbeute an Insulin, das aus hybridem Proinsulin-Polypeptid hergestellt wurde, wurde in einer Reihe von Reaktionen unter ansonsten optimalen Faltungsbedingungen bestimmt. Optimale Ausbeuten wurden erzielt, wenn die Proteinkonzentration 1,5 mg/ml nicht überschritt (13).
Das Insulin wurde durch DEAE-Sepharose-Chromatographie, gefolgt von RP-HPLC, gereinigt (wie in 9 beschrieben). Wie aus 12 ersichtlich, hatte das rekombinante menschliche Insulin, das produziert wurde, dieselbe Retentionszeit wie standardmäßiges (handelsübliches) menschliches Insulin. Die Aminosäurezusammensetzung des gereinigten rekombinanten menschlichen Insulinpräparats ist mit jener von Standardinsulin identisch (siehe Tabelle 2, rekombinantes Insulin).

Es ist zu beachten, dass Tabelle 2 zeigt, dass das Insulin, das aus dem vom Plasmid pDBAST-LAT exprimierten hybriden Proinsulin-Polypeptid hergestellt wurde, den zusätzlichen, an der Insulin-A-Kette befestigten Arg-Rest (Arg(Ao)-Insulin), der in Beispiel 4 beschrieben wurde, nicht aufwies. Das für die Herstellung von Insulin bevorzugte Plasmid ist somit das Plasmid pDBAST-LAT, und die bevorzugte Sequenz für das hybride Proinsulin-Polypeptid ist jene, die in 7 dargestellt ist. Tabelle 2 Aminosäurezusammensetzung von rekombinantem menschlichem Insulin

Aminosäure	Anzahl von Resten
Aminosäure	theoretisch	Standardinsulin	rekombinantes Insulin
Asx	3	3,20	3,32
Thr	3	2,98	2,73
Ser	3	2,84	2,71
Glx	7	7,15	7,41
Pro	1	1,28	1,02
Gly	4	4,24	4,46
Ala	1	1,00	1,09
Cys	6	5,88	5,28
Val	4	3,82	4,00
Ile	2	2,04	1,91
Leu	6	5,87	6,34
Tyr	4	3,80	3,64
Phe	3	3,15	3,06
His	2	2,04	2,18
Lys	1	1,01	1,02
Arg	1	0,96	1,07

Die Aminosäurezusammensetzungen vom standardmäßigem menschlichem Insulin und rekombinantem menschlichem Insulin, das aus dem vom Plasmid pDBAST-LAT exprimierten hybriden Proinsulin-Polypeptid hergestellt wurde, werden gezeigt.
Nach einer Perameisensäureoxidation und Gasphasenhydrolyse der gereinigten Insulinpräparate wurde eine Aminosäureanalyse durchgeführt.
Beispiel 7.
Produktion von menschlichem Insulin aus dem hybriden Proinsulin-Polypeptid, das vom Plasmid pDBAST-LAT aus einem rohen intrazellulären Präzipitat exprimiert wurde
Ein verbessertes Verfahren zur Faltung und enzymatischen Umwandlung des hybriden Proinsulin-Polypeptids in Insulin wurde unter Verwendung eines rohen intrazellulären Präzipitats durchgeführt, wobei der Bedarf an dem in Beispiel 2, Teil IV, beschriebenen anfänglichen Reinigungsschritt wegfiel. Die effiziente Produktion von Insulin erfolgte im Anschluss an die enzymatische Spaltung des gefalteten Disulfid-verbrückten hybriden Proinsulin-Polypeptids mit Trypsin und Carboxypeptidase B (14 und Tabelle 3). Die Insulinausbeuten wurden als der Prozentanteil der anfänglichen Proteinkonzentration (A₂₈₀) berechnet, der im Präzipitatauflösungsschritt bei einem pH-Wert von 12 festgestellt wurde (14). Es zeigte sich, dass die Faltung des hybriden SOD-Proinsulin-Polypeptids aus einem rohen intrazellulären Präzipitat etwa 4,5 Stunden nach Beginn des Versuchs optimal war (14).
Tabelle 3 fasst die teilweise Reinigung von Insulin aus dem hybriden Proinsulin-Polypeptid zusammen, das vom Plasmid pBAST-LAT aus einem rohen intrazellulären Präzipitat exprimiert wurde, welches aus einem Liter Fermentationskultur bei einer O.D.₆₆₀ von 45 hergestellt wurde. Die Auflösung und die Faltung wurden durcbgeführt wie bei 14 beschrieben. 4,5 Stunden nach der Auflösung wurde die gefaltete Massenlösung, einschließlich des gefalteten Disulfid-verbrückten hybriden Proinsulin-Polypeptids, mit konzentrierter Salzsäure auf einen pH-Wert von 8,8 titriert. ZnCl₂ (bis zu einer Endkonzentration von 50 μM), Carboxypeptidase B (1:4000 w/w) und Trypsin (1:6000 w/w) wurden hinzugefügt. Das Aufschließen wurde bei 37°C 3 Stunden lang durchgeführt und durch Hinzufügung von Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) bis zu einer Endkonzentration von 0,5 mM beendet. Eine Analyse durch HPLC (wie in 9 beschrieben) zeigte eine Insulinausbeute von 169 mg. Das Insulin wurde durch eine Abfolge von Anionenaustausch- und hydrophoben chromatographischen Schritten gereinigt. Das aufgeschlossene Faltungsgemisch wurde auf eine DEAE-Sepharose-Fast-Flow(Pharmacia)-Säule geladen, die bei etwa 50 A₂₈₀-Einheiten pro ml Harz in einem Puffer aus 20 mM Tris-HCl, 10 mM NaCl, pH 8, voräquilibriert wurde. Das gebundene Material wurde mit einem Puffer aus 20 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, pH 8, gewaschen und das Insulin wurde in demselben Puffer mit 250 mM NaCl eluiert. Insulin enthaltende Poolfraktionen machten 20% des geladenen Proteins aus und hatten eine Reinheit von 37,1%. Ammoniumsulfat wurde bis zu einer Konzentration von 410 mM zum DEAE-Elutionspool hinzugefügt und auf eine Phenyl-Sepharose-Fast-Flow-Säule geladen, die bei etwa 12 A₂₈₀-Einheiten pro ml Harz in 20 mM Tris-HCl, 540 mM Ammoniumsulfat voräquilibriert wurde. Das gebundene Material wurde mit einem Äquilibrierungspuffer gewaschen und das Insulin wurde mit einem Puffer aus 20 mM Tris-HCl, 220 mM Ammoniumsulfat, pH 8, eluiert. Insulin enthaltende Fraktionen machten 42,3% des geladenen Proteins aus und hatten eine Reinheit von 74,1%. Als Ergebnis dieses teilweisen Reinigungsverfahrens wurden 120 mg Insulin, das mit Standardinsulin identisch war, produziert, was einer Insulinausbeute von 5,16% entspricht. Eine weitere Reinigung von Insulin kann mittels Verfahren, die im Stand der Technik bekannt sind, z. B. Gelfiltration, RP-HPLC und Kristallisation, durchgeführt werden (17).
TABELLE 3

Reinigung von rekombinantem menschlichem Insulin, das aus dem vom Plasmid pDBAST-LAT exprimierten hybriden Proinsulin-Polypeptid hergestellt wurde, und zwar im Anschluss an die Auflösung eines rohen intrazellulären Präzipitats, eine Faltung und enzymatische Behandlung mit Trypsin und Carboxypeptidase B.

Reinigungsschritt	A₂₈₀	Mindestmenge an Insulin durch HPLC – in mg	% Reinheit
Präzipitatauflösung	2326		-
Aktivkohlebehandlung	1915		-
Faltung und enzymatische Behandlung	1915	169	8,8
DEAE-Sepharose-Pool	383	142	37,1
Phenyl-1-Sepharose-Pool	162	120	74,1

A₂₈₀ stellt die Gesamtextinktion bei 280 nm in jedem Reinigungsschritt dar. Das Vorhandensein von Insulin wurde durch eine HPLC-Analyse bezüglich Standardinsulin bestimmt, wie bei 9 beschrieben wurde, und entspricht dem Haupt-Insulin-Peak von Standardinsulin.
Literaturhinweise

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SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zur Herstellung von Insulin, umfassend (a) Behandlung einer bakteriellen Zelle, enthaltend DNA, die ein Hybrid-Polypeptid, umfassend ein kovalent an Proinsulin geknüpftes Leader-Peptid, kodiert, wobei das Leader-Peptid SOD ist, die vom N-Terminus von CuZn SOD abgeleitet ist und 62 Aminosäuren umfasst, denen die Aminosäure Methionin vorangestellt ist und auf die ein Argininrest folgt, wobei die Cysteinreste des Leader-Peptids durch Serinreste ersetzt sind, so dass die DNA die Expression davon steuert, und Gewinnung des Hybrid-Polypeptids aus der Zelle; (b) Falten des Hybrid-Polypeptids, umfassend Proinsulin, ohne das Hybrid-Polypeptid zuerst Sulfitolyse auszusetzen, unter Bedingungen die eine korrekte Ausbildung von Disulfidbindungen erlauben, wobei diese Bedingungen einen pH von 8,5 bis 12,0 bei 37°C für einen Zeitraum von 1 bis 30 Stunden umfassen; (c) enzymatische Spaltung des resultierenden gefalteten, Disulfid-gebundenen Hybrid-Polypeptids, um Insulin zu produzieren; (d) Aufreinigung des so produzierten Insulins.
Verfahren gemalt Anspruch 1, wobei die Inkubation in der Anwesenheit von Askorbinsäure stattfindet.
Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei der pH 11,0 bis 11,25 ist.
Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei die Konzentration der Ascorbinsäure etwa 2 mol pro mol SH-Gruppe, die in der Faltungsmischung vorliegt, ist.
Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei die Inkubationszeit 5 Stunden ist
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei Schritt (c) weiterhin umfasst: (i) Einstellen des pH auf 8,8 bis 9,0 und (ii) Spalten des Hybrid-Polypeptids mit Trypsin und Carboxypeptidase B bei 16 bis 37°C für 30 Minuten bis 16 Stunden.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei Schritt (d) weiterhin eine Reinigung mittels: (i) DEAE-Sepharose-Chromatografie und RP-HPLC; (ii) Ultrafiltration und CM-Sepharose-Chromatografie oder (iii) DEAE-Sepharose-Chromatografie und Phenyl-Sepharose-Chromatografie umfasst.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das Proinsulin-Hybrid-Polypeptid exprimiert wird durch: (i) Plasmid pDBAST-LAT, hinterlegt unter ATCC-Hinterlegungsur. 69361; (ii) Plasmid pλBAST-LAT, hinterlegt unter ATCC-Hinterlegungsnr. 69363; (iii) Plasmid pBAST-R, hinterlegt unter ATCC-Hinterlegungsar. 69362.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die Behandlung in Schritt (a) eine Fermentationen in Anwesenheit von Glucose, Glycerin oder Galaktose umfasst.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die Gewinnung umfasst: (i) Aufbrechen der Zellwand der bakteriellen Zelle oder von Fragmenten davon, um ein Lysat herzustellen; (ii) Abtrennen von intrazellulärem Präzipitat von dem Lysat durch Zentrifugation und (iii) Solubilisieren des Präzipitats.