DE69432704T2

DE69432704T2 - Verfahren zur Herstellung von humanen Relaxin

Info

Publication number: DE69432704T2
Application number: DE69432704T
Authority: DE
Inventors: Tim Breece; Kirk Hayenga; Ernst Rinderknecht; Richard Vandlen; Daniel Yansura
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1993-06-21
Filing date: 1994-06-20
Publication date: 2004-02-26
Anticipated expiration: 2014-06-21
Also published as: CA2165781C; JPH09501911A; WO1995000645A3; AU691189B2; JP2007014342A; ATE241012T1; AU7176594A; CA2165781A1; EP0707650B1; WO1995000645A2; EP0707650A1; DE69432704D1; JP3954091B2; US5759807A

Description

Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft nicht natürlich auftretende Formen von Prorelaxin und ein Verfahren zur Herstellung von Human-Relaxin aus einer solchen, nicht natürlich auftretenden Form von Prorelaxin.
Hintergrund der Erfindung
Reifes Human-Relaxin ist ein Eierstockhormon-Peptid mit einem Molekulargewicht von ungefähr 6.000 Dalton, das bekanntermaßen für die Umbildung des Fortpflanzungstrakts vor der Geburt verantwortlich ist und dadurch den Geburtsvorgang erleichtert. Das Protein moduliert offenbar die Restrukturierung der Bindegewebe in Zielorganen, um die erforderlichen Veränderungen der Organstruktur während der Schwangerschaft und Geburt zu erreichen. Einige der wichtigen Rollen für Relaxin als ein Schwangerschaftshormon umfasst die Hemmung vorzeitiger Entbindung, die Zervixreifung bei der Geburt und die Entwicklung der Brustdrüse (Reddy et al., Arch. Biochem. Biophys 294, 579 (1992)). Obwohl vorwiegend ein Schwangerschaftshormon, ist Relaxin auch in der nicht schwangeren Frau sowie im Mann (Samenflüssigkeit) detektiert worden.
Die Aminosäuresequenzen von Relaxin sind durch direkte Proteinsequenzierung oder Herleitung von den Nucleotidsequenzen der DNAs für eine Reihe von Spezies, einschließlich Schwein, Ratte (Hudson et al., Nature 291, 127 (1981)), Sandtiger-Hai, Stachel-Hundshai, Rochen, Wal, Affe und Mensch (Hudson et al., EMBO J. 3, 2333 (1984)) bestimmt worden.
Rekombinante Techniken wurden erstmals auf die Isolierung von cDNA-Klonen für Ratten- und Schweine-Relaxine angewendet (Hudson et al., Nature 291, 544 (1981); Haley et al., DNA 1, 155 (1982)). Zwei Human-Genformen sind durch Genom-Klonierung unter Verwendung von Sonden aus dem Schweine-Relaxin-Gen identifiziert worden (Hudson et al., Nature 301, 628 (1983); Hudson et al., EMBO J. 3, 2333 (1984); US-Patente Nr. 4.758.516 (erteilt am 19. Juli 1988) und 4.871.670 (erteilt am 3. Oktober 1989)), obgleich die Transkription von nur einer dieser Genformen (H2 genannt) im Gelbkörper nachgewiesen worden ist. Es ist unklar, ob das andere Gen an einer anderen Gewebestelle exprimiert wird oder ob es ein Pseudo-Gen darstellt. Die Tatsache, dass H2-Relaxin im Eierstock synthetisiert und exprimiert wird, weist darauf hin, dass dies die Sequenz ist, die direkt an der Physiologie der Schwangerschaft beteiligt ist.
Natürlich auftretendes Relaxin wird als einkettiges Präprorelaxin von 23 kDa synthetisiert, das die folgende allgemeine Struktur aufweist: Signalpeptid, B-Kette, verbindendes C-Peptid und A-Kette. Während der Biosynthese von Relaxin wird das Signalpeptid entfernt, während die frei werdende Kette quer durch das endoplasmatische Retikulum transportiert und das 19 kDa-Prorelaxin produziert wird (Reddy et al., supra). Die weitere Prozessierung des Prorelaxins zum Relaxin erfolgt in vivo durch die endoproteolytische Spaltung des C-Peptids an speziellen Paaren basischer Aminosäurereste, die an den B/C-Ketten- und A/C-Ketten-Verbindungen nach der Bildung von Disulfidbrücken zwischen den B- und A-Ketten (Marriott et al., Mol. Endo. 6(9) (1992)) in analoger Weise zum Insulin. Die Relaxin-Disulfidbrücken treten zwischen den Cysteinen an A9–B10 und A22–B22 mit einer Intraketten-Disulfidbrücke innerhalb der A-Kette zwischen A8 und A12 auf (US-Patent Nr. 4.656.249, erteilt am 7. April 1987).
Ein kurzer Überblick des Fachwissens über Relaxin ab 1988 wurde von D. Sherwood in The Physiology of Reproduction, Kap. 16, „Relaxin", E. Knobil und J. Neill et al. (Hrsg.), Raven Press Ltd., New York, S. 585–673 (1988), bereitgestellt. Relaxin ist durchwegs mit dem Zustand von Schwangerschaft in Zusammenhang gebracht worden und die meisten seiner Anwendungen sind mit diesem Zustand assoziiert.
H2-Relaxin ist dahingehend beschrieben worden, dass es den Fortpflanzungstrakt umbildet, um den Geburtsvorgang zu erleichtern; einschließlich der Zervixreifung, Verdickung der Uterusschleimhaut des schwangeren Uterus, sowie erhöhte Vaskularisierung in diesem Bereich und eine Wirkung auf die Collagensynthese. H2-Relaxin ist auch mit Laktation in Zusammenhang gebracht worden und einige Berichte weisen darauf hin, dass Relaxin eine wachstumsfördernde Wirkung auf das Brustgewebe aufweist (L. C. Wright und R. R. Anderson, Adv. Exp. Med. Biol. 341 (1982)). Angesichts der Wirkung von Relaxin auf das Bindegewebe ist vorgeschlagen worden, dass Relaxin die Hautelastizität verbessern könnte. US-Patent Nr. 5.166.191, erteilt am 21. Februar 1992, beschreibt die Verwendung von Relaxin in der Herz-Kreislauf-Therapie.
US-Patent Nr. 5.023.321, erteilt am 11. Juni 1991, offenbart die Herstellung von Human-Präprorelaxin und dessen Untereinheiten. US-Patent Nr. 4.871.670, erteilt am 3. Oktober 1989, offenbart Gene und DNA-Transfer-Vektoren für die Expression von Human-Präprorelaxin und dessen Untereinheiten.
Die europäischen Patente Nr. 101.309, veröffentlicht am 22. Februar 1984, bzw. 112.149, veröffentlicht am 27. Juni 1984, offenbaren die molekulare Klonierung und Charakterisierung einer Gensequenz, die für Human-Relaxin und Human-H2-Relaxin und deren Analoga kodieren.
US-Patent Nr. 4.565.249, erteilt am 7. April 1987, offenbart ein Verfahren für die Synthese von Schweine-Relaxin oder modifizierte Formen oder Analoga davon. Das australische Patent Nr. 561.670, erteilt am 26. August 1987, und Haley et al., DNA1, 155–162 (1982) offenbaren, wie Schweine-Relaxin hergestellt wird, und Stewart et al., NAR 11(19), 6597–6609 (1983), offenbaren die Expression von Schweine-Prorelaxin in E. coli. Reddy et al., supra, offenbaren ein Verfahren zur Reinigung eines in E. coli exprimierten, rekombinanten Schweine-Relaxins.
Gold et al. (Abstr. Pap. Chem. Soc. 203 Meet., Pt. 3, BTEC55 (1992)) offenbaren ein Verfahren für die Herstellung von Relaxin auf Basis der A-Ketten-B-Ketten-Kombinationsreaktion. Die A-Kette wurde in E. coli als modifiziertes Prorelaxin in Refraktilkörpern exprimiert; die A-Kette wurde aus dem modifizierten Prorelaxin durch chemische Spaltung gereinigt. Die B-Kette wurde in einer zweiten E. coli-Fermentation produziert, aus der sie sekretiert und anschließend gereinigt wurde. Die beiden gereinigten Ketten wurden dann in einer oxidativen Kombinations- und Faltungsreaktion zusammengefügt. Während der Reaktion wurden 1 Intraketten-Disulfid- und 2 Interketten-Disulfid-Bindungen gebildet. Der Zwei-Ketten-Kombinationsprozess erfordert zahlreiche Prozessschritte und die Anwendung von Doppel-Fermentationen zur Produktion der beiden Ketten.
Marriott et al. (Molecular Endocrinology 6, 1441 (1992)) offenbaren die Säugetier-Expression einer Prorelaxin-Variante mit nicht natürlich auftretenden Spaltungsstellen an den A-/C-Ketten- und B-/C-Ketten-Verbindungen.
Rekombinante Expression
Es besteht ein Bedarf an einem Prozess zur Herstellung von Relaxin aus Prorelaxin, der die Anwendung der Doppelfermentation und zahlreichen Prozessschritten, wie sie für den Zwei-Ketten-Kombinationsprozess angewendet werden, nicht erfordert. Es besteht ein Bedarf für einen Prorelaxin-Produktgewinnungsprozess, der ausreichend hohe Ausbeuten von biologisch aktivem Relaxin liefert, um wirtschaftlich zu sein. Es besteht ein Bedarf an isoliertem Prorelaxin, das in einem prokaryotischen System exprimiert und anschließend zu biologisch aktivem Relaxin prozessiert werden kann, das nicht mit den vom Wirt erzeugten Materialien kontaminiert ist und keine anderen rekombinanten Artefakte aufweist, welche die biologische Aktivität herabsetzen.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegenden Erfindung basiert auf der unerwarteten experimentellen Entdeckung, dass biologisch aktives Relaxin in wirtschaftlich brauchbaren/r Mengen und Reinheit über nicht natürlich auftretende Prorelaxin-Formen hergestellt werden kann. Die vorliegende Erfindung basiert auf der unerwarteten experimentellen Entdeckung, dass nicht natürlich auftretende Prorelaxin-Formen in rekombinanten Systemen in höheren Ausbeuten erfolgreich gefaltet und prozessiert wird, als sie unter Verwendung von natürlich auftretendem Prorelaxin verwirklicht werden können. Die vorliegenden Erfindung basiert auf der Bereitstellung eines Prozesses zur Herstellung von Human-Relaxin aus einem nicht natürlich auftretenden Prorelaxin, worin das besagte Prorelaxin in der Reihenfolge vom Aminoterminus zum Carboxylterminus ein Leaderpeptid, die B-Kette, eine nicht natürlich auftretende C-Kette, die eine aus der Gruppe KRKPTGYGSRKKR, DKKRTGYGSRRRK, DKKRTGYGSRKKR und KRKPTGYGSRRRK gewählte Aminosäuresequenz umfasst, und die A-Kette, und worin das besagte Leaderpeptid eine der B-Kette benachbarte Spaltungsstelle umfasst und worin die besagte nicht natürlich auftretende C-Kette den B- und A-Ketten benachbarte Spaltungsstellen umfasst, wobei das Verfahren die Entfernung des besagten Leaders und nicht natürlich auftretenden C-Peptids aus dem besagten Prorelaxin unter Verwendung eines Spaltungsmittels an den besagten Spaltungsstellen und die Gewinnung von biologisch aktivem Relaxin umfasst.
Die vorliegenden Erfindung durch Bereitstellen eines Prozesses zur Herstellung von Relaxin aus der Fermentation eines nicht natürlich auftretenden Prorelaxins bewerkstelligt, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: (a) Bereitstellen von Nucleinsäure, die für das nicht natürlich auftretende Prorelaxin kodiert, worin das Prorelaxin eine Leadersequenz, die B-Kette, die nicht natürlich auftretende C-Kette und die A-Kette umfasst und worin die besagte Leadersequenz eine der B-Ketten-Sequenz benachbarte erste Spaltungsstelle und worin die besagte nicht natürlich auftretende C-Kette einer der B-Kette und A-Kette benachbarte zweite bzw. dritte Spaltungsstelle umfasst; (b) Kultivieren prokaryotischer Zellen, welche die besagte Nucleinsäure enthalten, die für das besagte nicht natürlich auftretende Prorelaxin kodieren, wobei das Kultivieren die Expression der besagten Nucleinsäure bewirkt, um das besagte nicht natürlich auftretende Prorelaxin in der besagten prokaryotischen Zelle zu produzieren; (c) Isolieren und Solubilisieren des durch das besagte Kultivierungsverfahren produzierten Prorelaxins; (d) Neufalten des besagten solubilisierten Prorelaxins; (e) Herausschneiden der besagten Leadersequenz und des besagten nicht natürlich auftretenden C-Peptids aus dem besagten Prorelaxin, worin das Herausschneiden durch die Verwendung von Spaltungsmitteln erzielt wird, die für die besagten Spaltungsstellen spezifisch sind; und (f) Gewinnen des Relaxins. Der Prozess kann weiters die Zyklisierung des A-Ketten-N-terminalen Glutamins umfassen.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Relaxin Human-Relaxin der H2-Form.
In einer der Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung erfolgt das Herausschneiden der Leadersequenz und des nicht natürlich auftretenden C-Peptids durch enzymatische Spaltung.
In einer der Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung wird das Herausschneiden der Leadersequenz und des nicht natürlich auftretenden C-Peptids durch die Verwendung von Trypsin und Carboxypeptidase B (CPB) und in einer weiteren Ausführungsform durch Arg C und CPB erzielt. Das Herausschneiden der Leadersequenz wird vorzugsweise durch die Verwendung von Endoproteinase AspN und Trypsin erzielt. Das Herausschneiden des nicht natürlich auftretenden C-Peptids wird vorzugsweise durch die Verwendung von Arg C, Trypsin oder Lys C mit Carboxypeptidase B, oder mit Trypsin und Arg C erzielt. Siehe die 2A-2D.
In einer der Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung wird das solubilisierte Prorelaxin unter Bedingungen verdünnter Proteinkonzentration neu gefaltet. In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann das solubilisierte Prorelaxin unter kontrollierten Oxidationsbedingungen neu gefaltet werden.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegenden Erfindung ein nicht natürlich auftretendes Human-Prorelaxin bereit, das ein Leaderpeptid, die B-Kette, eine nicht natürlich auftretende C-Kette, die eine aus der Gruppe KRKPTGYGSRKKR, DKKRTGYGSRRRK, DKKRTGYGSRKKR und KRKPTGYGSRRRK gewählte Aminosäuresequenz umfasst, und die A-Kette umfasst, worin das besagte Leaderpeptid eine der B-Kette benachbarte Spal tungsstelle umfasst und worin die besagte nicht natürlich auftretende C-Kette der B-Kette und der A-Kette benachbarte Spaltungsstellen umfasst.
Kurzbeschreibung der Abbildungen
1 zeigt den Aufbau einer für ein Prorelaxin hierin kodierenden DNA, die einen nicht natürlich auftretenden Leader („STII") und C-Peptid („Mini-C") umfasst und Spaltungsstellen hinter dem Leader und zwischen dem C-Peptid und B- und A-Ketten wie bezeichnet aufweist.
2 und 2A bis 2D zeigen die Leadersequenz, das nicht natürlich auftretende C-Peptid und die enzymatischen Spaltungsstellen für vier Konstrukte der vorliegende Erfindung-
3 zeigt die Nucleinsäure- und Aminosäuresequenz für das Plasmid pRB250CTsc. Siehe auch 1.
4 erläutert die Herkunft des Plasmids pRB250CTsc, das ein Gen umfasst, das für ein nicht natürlich auftretendes Prorelaxin kodiert, wie in 3 dargestellt ist.
5 erläutert die Konstruktion von Plasmid pRB250C, ein intermediäres Plasmid bei der Konstruktion von pRB250CTsc.
6 erläutert die Konstruktion von Plasmid pRB250, einem intermediären Plasmid bei der Konstruktion von pRB250CTsc.
7 erläutert die Konstruktion von Plasmid pRB192, einem intermediären Plasmid bei der Konstruktion von pRB250.
8 erläutert die Konstruktion von Plasmid pRB151, einem intermediären Plasmid bei der Konstruktion von pRB192.
9 erläutert die Konstruktion von Plasmid pRB51, einem intermediären Plasmid bei der Konstruktion von pRB 192.
9A erläutert das Not-I-Bam-HI-Fragment aus pTR21.
10 stellt eine Teilsequenz von Plasmid pRB11 bereit.
10A erläutert die die Konstruktion von pRB11.
11 erläutert die Konstruktion von Plasmid pRB61, eines Zwischenprodukts bei der Konstruktion von pRB151.
12 erläutert die Konstruktion von Plasmid pRA1, eines Zwischenprodukts bei der Konstruktion von pRB61.
12A erläutert die Konstruktion von pTF161.
13 erläutert die Konstruktion von pTR591, eines Zwischenprodukts bei der Konstruktion von Plasmid pRA1.
14 erläutert die Konstruktion von pTR561, eines Zwischenprodukts bei der Konstruktion von pTR591.
15 erläutert die Konstruktion von pLS33lamB, eines Zwischenprodukts bei der Konstruktion von pRB61.
16 stellt eine Teilsequenz von pTF271 bereit, eines Zwischenprodukts bei der Konstruktion von pRB61.
16A erläutert die Konstruktion von pTF271.
17 erläutert die Konstruktion von pRB192C, eines Zwischenprodukts bei der Konstruktion von pRB250C.
18 erläutert die Konstruktion von pLS32, eines Zwischenprodukts bei der Konstruktion von pLS33lamB.
18A stellt die Sequenz des 291 bp-Hind III-Bam HI-Fragments aus pLS8 dar.
19 erläutert die Konstruktion von pAPlamB, eines Zwischenprodukts bei der Konstruktion von pLS33lamB.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Wie hierin verwendet ist „Relaxin" als ein Polypeptid definiert, das die in Hudson et al. (EMBO J. 3, 2333 (1984)) beschriebene Sequenz gemeinsam mit natürlich auftretenden Aminosäuresequenzvarianten, wie z. B. natürlich auftretenden Allelen davon aufweist, das die qualitative biologische Aktivität von Relaxin beibehält.
Ebenfalls im Schutzumfang der vorliegende Erfindung liegen nicht natürlich auftretende Relaxin-Aminosäuresubstitutionen, Insertionen und Deletionen, wie z. B. jene, die unter Anwendung rekombinanter DNA-Technologie eingeführt werden können, und kovalente und nicht kovalente Relaxin-Modifizierungen, beispielsweise Glykosylierungs-Modifizierungen, unter der Voraussetzung, dass das schlussendliche Relaxin die qualitative biologische Aktivität von natürlich auftretendem Relaxin besitzt.
Der Begriff Relaxin bezieht sich auf verschiedene Formen von Human-Relaxin, wie sie in anerkannten Relaxin-Tests, wie z. B. dem Symphysis-pubis In-vitro-Biotest (Steinetz et al., Endocrinology 67, 102 (1960)), dem Ratten-Uterus-Glattmuskel In-vitro-Test (St. Louis, J. Can. J. Physiol. Pharmacol. 59, 507 (1981)) und Messung von cAMP-Spiegeln nach hormonalem Reiz (S. A. Braddon, Endocrinology 102, 1292 (1978) und Judson et al. (J. Endocrinol. 87, 153 (1980)) als biologisch aktiv bekannt sind.
Prorelaxin bezieht sich wie hierin verwendet auf den Vorläufer von Relaxin, der die B-, A- und C-Ketten umfasst, wobei „Relaxin" der obigen Definition entspricht. Eine Eigenschaft der Prorelaxine hierin ist, dass sie eine nicht natürlich auftretende, wie weiter unten definierte C-Kette enthalten.
Der Prorelaxin-Vorläufer der vorliegende Erfindung umfasst Prorelaxin. Das aus einer natürlichen Quelle erlangt, chemisch synthetisiert oder durch Techniken der rekombinanten DNA-Technologie hergestellt wird. Bestimmte der nicht natürlich auftretenden Prorelaxine der vorliegende Erfindung besitzen nicht natürlich auftretende C-Ketten, die natürlich auftretende A- und B-Ketten verbinden. Einige der nicht natürlich auftretenden Prorelaxine der vorliegende Erfindung besitzen nicht natürlich auftretende C-Ketten, die natürlich auftretende Enzymspaltungsstellen enthalten, wogegen andere nicht natürlich auftretende Prorelaxine nicht natürlich auftretende Enzymspaltungsstellen enthalten.
Der Begriff „C-Kette" bezieht sich wie hierin verwendet auf das Peptid, das die A- und B-Ketten von Prorelaxin verbindet. Ein Schwerpunkt der vorliegende Erfindung ist die Verwendung der hierin definierten „nicht natürlich auftretenden C-Kette" als ein die Aund B-Ketten von Prorelaxin verbindendes Peptid, das im natürlichen Protein nicht vorkommt. Die bevorzugte nicht natürlich auftretende C-Kette der vorliegende Erfindung ist ein Peptid, das die A- und B-Kette von Prorelaxin verbindet und Aminosäuren umfasst, die für Spaltungsstellen an der B-/C-Ketten-Verbindung und A-/C-Ketten-Verbindung kodiert.
Die Ausdrücke Prorelaxin-„Leader", „Leaderpeptid", „Leadersequenz" oder „Signalsequenz" beziehen sich wie hierin- verwendet auf die kurze Aminosäuresequenz, die sich am N-Terminus des Prorelaxins hiervon findet. Die bevorzugte Leadersequenz hierin ist beim Dirigieren von Prorelaxin zum Periplasma der prokaryotischen Wirtszelle nicht oder teilweise funktionsfähig. Prorelaxin, das von den Wirtszellen der vorliegende Erfindung produziert wird, findet sich typischerweise in so genannten Refraktilkörpern und wird aus diesen gereinigt. Eine insbesondere bevorzugte Leadersequenz der vorliegenden Erfindung ist eine trunkierte STII-Leadersequenz, die eher dazu verwendet wird, eine hohe Expression des Prorelaxins anzutreiben, als notwendigerweise die Sekretion von Prorelaxin in das Periplasma der Wirtszelle zu erzielen. Typischerweise sind Lys und Arg in der „Leadersequenz" der vorliegenden Erfindung umfasst, um die Abspaltung der Leadersequenz vom Relaxin zu ermöglichen.
Ein typischer, hierin als Modell dargestellter Leader ist definiert als MKKNIAFLLKR. Äquivalente davon würden MKKNIAFLLRK, MKKNIAFLLRR und MKKNIAFLLKK umfassen. Eine begleitende Eigenschaft für einen verwendbaren Leader ist, dass er eine proteolytische Enzymspaltungsstelle für die Abspaltung von der B-Kette enthält.
Die Phrase „Prozess für die Herstellung von Relaxin aus Prorelaxin" oder „Produktgewinnungsprozess für die Produktion von Relaxin" bezieht sich wie hierin verwendet auf den Entwurf und die Konstruktion von nicht natürlich auftretendem Prorelaxin, sowie den Fermentationsprozess für das Kultivieren von Prorelaxin und auf alle nachfolgenden Schritte für das Reinigen von Relaxin. Die Schritte für das Reinigen von Relaxin aus Prorelaxin, das in einer Wirtskultur exprimiert wird, umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf das Isolieren von Prorelaxin-Refraktilkörpern, wie z. B. durch Zentrifugieren, Solubilisieren des Prorelaxins, Neufalten des solubilisierten Prorelaxins, Abspalten von Prorelaxin-Leadersequenz und C-Peptid, Entfernen der Verunreinigungen vom Relaxin und Bereitstellen des Relaxins in einer Form für die endgültige Formulierung. Diese Reinigungsschritte dienen der Erläuterung und sind nicht einschränkend.
Der Ausdruck „wirtschaftlich oder effiziente Ausbeuten oder Mengen" bezieht sich auf Relaxin-Endausbeuten, die au der prokaryotischen Fermentation eines Prorelaxins hierin erlangt werden und sind dahingehend definiert, dass sie zumindest ungefähr 10 bis 100 mg/l und vorzugsweise höher als ungefähr 100 mg/l sind.
Die Ausdrücke „biologische Aktivität" und grammatikalische Entsprechungen beziehen sich auf jegliche biologische Aktivitäten, die Human-Relaxin der Wildform aufweist. Die biologische Aktivität von Relaxin kann beispielsweise in anerkannten Relaxin-Tests bestimmt werden, wie z. B. dem Symphysis-pubis In-vitro-Biotest (Steinetz et al., Endocrinology 67, 102 (1960)), dem Ratten-Uterus-Glattmuskel In-vitro-Test (St. Louis, J. Can. J. Physiol. Pharmacol. 59, 507 (1981)) und der Messung von cAMP-Spiegeln nach hormonalem Reiz (S. A. Braddon, Endocrinology 102, 1292 (1978) und Judson et al. (J. Endocrinol. 87, 153 (1980)).
Der Begriff „Spaltungsmittel" bezieht sich wie hierin verwendet auf ein Mittel, dass zur spezifischen Spaltung des Prorelaxins hierin verwendet wird, so dass bestimmte Komponenten, wie z. B. die Leadersequenz oder das C-Peptid, wie gewünscht freigesetzt oder herausgeschnitten werden. Geeignete Spaltungsmittel hierin umfassen Enzyme, wie z. B. Endoproteasen, z. B. Endoproteinase Lys C, Endoproteinase Arg C, Endoproteinase Asp N; Trypsin; Carboxypeptidase B; Prohormon-Convertase (PC), z. B. Furin, PC1, PC2, KEX2; Subtilisin, oder deren Mutanten; und chemische Mittel, wie z. B. organische oder anorganische Säuren, Hydroxylamin, N-Bromsuccinimid und Bromcyan.
Die Hydrolyse von Peptidbindungen durch eine einer Vielzahl proteolytischer Enzyme wird in The Enzymes, 3. Aufl., Boyer (Hrsg.), Bd. III, Academic Press (1971); Meth. Enzymol., Bd. XIX, Perlman und Lorand (Hrsg.), Academic Press, New York (1970); Enzymol., Bd. XLV, Lorand (Hrsg.), Academic Press, New York (1976); Drapeau, J. Biol. Chem. 253, 5899 (1978) und Drapeau, Meth. Enzymol. 47, 89 (1977) gelehrt. Für eine umfassende Auflistung chemischer Mittel siehe Witcop in Advances in Protein Chemistry, Anfinsen et al. (Hrsg.), Bd. 16, Academic Press, New York, S. 221–321 (1961), einschließlich Tabelle III auf Seite 226.
Andere hierin geeignete Spaltungsmittel gelten als von Fachkundigen wohlverstanden, wobei die gewünschte Verbindungsstelle für die Spaltung zu berücksichtigen ist und ob das Reagens an reduzierten und oxidierten Prorelaxin-Formen wirken kann. Bedingun gen, die für die Spaltung des nicht natürlich auftretenden Prorelaxins verwendet werden, hängen für gewöhnlich von eingesetzten Spaltungsmittel ab und die Bedingungen sind dem Fachkundigen angesichts des eingesetzten Spaltungsmittels ohne weiteres offensichtlich.
In der vorliegenden Erfindung wird das nicht natürlich auftretende Prorelaxin dahingehend entworfen und konstruiert, dass es das/die notwendigen Codon(s) umfasst, um die Spaltung durch das gewünschte Spaltungsmittel an der/den gewünschten Positionen) zu erzielen, d. h. hinter einer Leadersequenz oder um ein C-Peptid herauszuschneiden. Es kann erforderlich sein, die geeigneten Codons entweder stromauf und vorzugsweise dem 5'-terminalen Codon derjenigen Sequenz benachbart, die für die gewünschten Polypeptidkomponenten, in diesem Fall die Relaxin-A- oder B-Kette kodiert, oder stromab und vorzugsweise dem carboxyterminalen Codon der gewünschten Komponenten des Polypeptids benachbart zu insertieren, oder beides, wenn die zu isolierende gewünschte Komponente eine interne Aminosäuresequenz des erwarteten Translationsprodukts ist.
In der vorliegenden Erfindung ist es eefizient, die Prorelaxin-Leadersequenz und das C-Peptid durch dasselbe Spaltungsverfahren herauszuschneiden. Es kann jedes) Enzym oder Chemikalie, welches) die an der Leadersequenz/B-Ketten-Verbindung, B-/C-Ketten-Verbindung und A-/C-Kettenverbindung verfügbaren Spaltungsstellen spalten kann, verwendet werden, solange das gewünschte Hormon, Relaxin, erzeugt werden kann.
Die Oligonucleotide können unter Anwendung fachbekannter Techniken, wie z. B. jenen, die von Crea et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 5765 (1978) oder Kunkel et al., Methods in Enzymol. 154, 367 (1987) beschrieben werden, leicht synthetisiert werden.
Mutanten mit mehr als einer substituierten Aminosäure können auf eine von mehreren Arten erzeugt werden. Wenn die Aminosäuren in der Polypeptidkette nahe beieinander liegen, können sie gleichzeitig unter Verwendung eines Oligonucleotids mutiert wer den, das für alle der gewünschten Aminosäuresubstitutionen kodiert. Wenn sich jedoch die Aminosäuren in einigem Abstand voneinander befinden (beispielsweise durch mehr als zehn Aminosäuren getrennt sind), ist es schwieriger, ein einziges Oligonucleotid zu erzeugen, dass für alle der gewünschten Änderungen kodiert. Stattdessen kann eines von zwei alternativen Verfahren eingesetzt werden. Im ersten Verfahren wird für jede zu substituierende Aminosäure ein gesondertes Oligonucleotid erzeugt. Die Oligonucleotide werden dann gleichzeitig an die einzelsträngige Templat-DNA anneliert und der zweite, aus dem Templat synthetisierte DNA-Strang wird für alle der gewünschten Aminosäuresubstitutionen kodieren. Das alternative Verfahren umfasst zwei oder mehrere Mutagenese-Runden, um die gewünschte Mutante zu produzieren.
Ein weiteres Verfahren zum Herstellen von Mutationen in der Nucleinsäuresequenz, die für Prorelaxin der Wildform oder eine fachbekannte Molekülvariante kodiert, umfasst das Spalten der für das Anfangs-Prorelaxin-Molekül kodierenden Nucleinsäuresequenz an der geeigneten Position durch Verdau mit Restriktionsenzymen, wobei die richtig gespaltene Nucleinsäure gewonnen, ein für die gewünschte Aminosäuresequenz und flankierende Regionen, wie z. B. Polylinker mit glatten Enden (oder, anstelle von Polylinkern, Verdauen des synthetischen Oligonucleotids mit den Restriktionsenzymen, die auch zur Spaltung der für Prorelaxin kodierenden Nucleinsäure verwendet werden, wodurch kohäsive Termini erzeugt werden) kodierendes Oligonucleotid synthetisiert und die synthetische Nucleinsäure in den Rest des für Prorelaxin kodierenden Strukturgens ligiert wird.
PCR-Mutagenese ist zur Herstellung der Prorelaxin-Varianten der vorliegenden Erfindung ebenfalls geeignet und wird beispielsweise in US-Patent Nr. 4.683.195, erteilt am 28. Juli 1987, und in Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al. (Hrsg.), Bd. 2, Kapitel 15, Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience (1991) beschrieben. Während die folgende Diskussion sich auf DNA bezieht, versteht es sich, dass die Technik auch mit RNA Anwendung findet. Mutationen an gesonderten Positionen können gleichzeitig entweder durch Verwenden eines mutierten zweiten Primers oder Durch führen einer zweiten PCR mit anderen mutierten Primern und gleichzeitiges Ligieren der beiden erhaltenen PCR-Fragmente an das Vektorfragment in einer Drei- oder Mehrfach-Ligation eingeführt werden.
Die von RNA, cDNA, genomischer DNA, synthetischer DNA oder einer DNA-Kombination hergeleitete Relaxin-Nucleinsäure wird in einen replizierbaren Vektor für weitere Klonierung (Amplifikation der Nucleinsäure) oder Expression insertiert. Die Konstruktion geeigneter Vektoren, die die gewünschten kodierenden und kontrollierenden Sequenzen enthalten, setzt standardmäßige rekombinante Techniken ein. Isolierte Plasmide oder Nucleinsäurefragmente werden gespalten, zurechtgeschnitten und religiert, um das gewünschte Plasmid zu bilden.
Es sind viele Vektoren verfügbar und die Auswahl des geeigneten Vektors hängt für gewöhnlich ab: 1) davon, ob es für Nucleinsäure-Amplifikation oder für Nucleinsäure-Expression verwendet wird, 2) von der Größe der in den Vektor zu insertierenden Nucleinsäure und 3) von der mit dem Vektor zu transformierenden Wirtszelle. Jeder Vektor enthält verschiedene Komponenten in Abhängigkeit von seiner Funktion (Amplifikation von Nucleinsäure oder Expression von Nucleinsäure) und der Wirtszelle, für die er kompatibel ist. Die Vektorkomponenten umfassen im Allgemeinen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf eines oder mehrere von Folgendem: eine Signalsequenz, einen Replikationsstartpunkt, ein oder mehrere Markergene, ein Enhancer-Element, einen Promotor und eine Transkriptionsterminationssequenz.
Der bevorzugte replizierbare Vektor der vorliegenden Erfindung ist einer, der eine Leadersequenz enthält, welche die Expression des nicht natürlich auftretenden Prorelaxins und die korrekte N-terminale Prozessierung der Prorelaxin-B-Kette, des Tryptophan(Trp-) Promotors, der Lambda_to Terminationssequenz, eines PBR322-Replikationsstartpunkts, eines Antibiotikaresistenzgens und der durch ein nicht natürlich auftretendes C-Peptid verbundenen Relaxin-A- und B-Ketten ermöglicht, worin das besagte C-Peptid enzymatische Spaltungsstellen an der B-/C-Ketten- und A/C-Ketten-Verbindung umfasst.
Prokaryoten sind bevorzugte Wirtszellen für die anfänglichen Klonierungsschritte des Prorelaxins. Sie sind besonders zweckdienlich für die rasche Produktion großer Nucleinsäuremengen, für die Produktion der für ortsgerichtete Mutagenese verwendeten einzelsträngigen Nucleinsäuretemplate, für gleichzeitiges Screening vieler Mutanten und für die Nucleinsäuresequenzierung der erzeugten Mutanten. Beispiele von Prokaryoten, z. B. E. coli, und Expressionsvektoren, die beim Herstellen von Prorelaxin zweckdienlich sind, sind beispielsweise jene in WO 90/02798 (veröffentlicht am 22. März 1990) offenbarten. Für die Klonierung von Prorelaxin-DNA-Sequenzen verwendeten Prokaryoten umfassen ferner beispielsweise E. coli K12, Stamm 294 (ATCC-Nr. 31446), E. coli B und E. coli X1776 (ATCC-Nr. 31537).
Prokaryoten werden auch für die Expression verwendet. Geeignete Wirtszellen zur Klonierung oder Expression der Vektoren hierin sind die E. coli-Zellen. E. coli-Stamm W3110 (F^-, 1^-, prototroph, ATCC-Nr. 27325) ist ein besonders bevorzugter Ausgangswirt, da er ein gebräuchlicher Wirtsstamm für Fermentationen rekombinanter DNA-Produkte ist. Vorzugsweise sollte die Wirtszelle minimale Mengen proteolytischer Enzyme ausscheiden. Stamm W3110 kann modifiziert werden, um eine genetische Mutation in den für Proteine kodierenden Genen zu bewirken, wobei Beispiele solcher Wirte E. coli W3110, Stamm 1A2, der den vollständigen Genotyp tonAΔ aufweist; E. coli W3110, Stamm 9E4, der den vollständigen Genotyp tonAΔ ptr3 aufweist; E. coli W3110, Stamm 27C7 (ATCC 55,244), der den vollständigen Genotyp tonAΔ ptr3 phoAΔE15 Δ(argF-lac)-169 ompTΔ degP41kan^r aufweist; E. coli W3110, Stamm 37D6, der den vollständigen Genotyp TonAΔ ptr3 phoAΔE15 Δ(argF-lac)169 ompTΔ degP41kan^rrbs7ΔilvG aufweist; E. coli W3110, Stamm 40B4m, der Stamm 37D6 mit einer Nicht-Kanamycin-resistenten degP-Deletionsmutation ist; und ein E. coli-Stamm mit mutierten periplasmatischer Protease, offenbart in US-Patent Nr. 4.946.783, erteilt am 7. August 1990.
Klonierungs- und Expressionsverfahren sind im Fach wohlbekannt und sind beispielsweise in der vorangehenden veröffentlichten PCT-Patentanmeldung (WO 90/02798) offenbart.
Die Fermentation von Prorelaxin wird durch im Fach wohlbekannte Verfahren durchgeführt und sind beispielsweise in Elander (Genetic Engineering Technology in Industrial Pharmacy, herausgegeben von John M. Tabor, veröffentlicht von Marcel Dekker Inc., S. 115–129 (1989)) offenbart, wobei jedoch viele Fermentationsvariablen existieren, die noch für jeden Fermentationsprozess zu optimieren wären. Die Hauptziele der Fermentationsentwicklung sind das Optimieren der Zellmasse und das Maximieren der Produktanreicherung. Fermentation im Großmaßstab bezieht sich auf die Fermentation in einem Fermenter, der eine volumetrische Kapazität, d. h. ein Arbeitsvolumen von zumindest ungefähr 1000 Litern aufweist, wobei ausreichend Platz für den Gasraum verbleibt. Fermentation im Kleinmaßstab bezieht sich allgemein auf die Fermentation in einem Fermenten, der eine volumetrische Kapazität von nicht mehr als ungefähr 100 Litern, vorzugsweise nicht mehr als ungefähr 10 Litern aufweist.
Die Isolierung des Rohprodukts aus der Fermentationsbrühe kann durch Anwendung von Filtration, Zentrifugation und/oder Absetzen, Sedimentation und Dekantieren oder einer Kombination von Techniken erreicht werden. Die Isolierung des Rohprodukts in Form von Refraktilkörpern erfordert einen ersten Zellaufschluss-Schritt, um den Refraktilkörper aus der Zelle freizusetzen. Zellaufschlussverfahren umfassen Ultraschallbehandlung, Passage durch Homogenisatoren und die durch Verwendung von Lysozym, Detergens oder andere Mittel erzielte Zelllyse.
Sobald die Refraktilkörper aus der Zelle freigesetzt sind, können die Körper auf Basis von Unterschieden der physikalischen Eigenschaften, wie z. B. Größe und Löslichkeit, von der verbleibenden Fermentationslösung getrennt werden. Sedimentation bezieht sich auf Absetzen in einem einfachen Gravitationsfeld, wogegen die Zentrifugation die Herstellung erhöhter Absetzgeschwindigkeiten durch Zentrifugalkräfte erfordert. In der vorliegenden Erfindung umfasst die bevorzugte Art der Isolierung von rohem Prorelaxin aus der Fermentationsbrühe eine Form des mechanischen Zellaufschlusses, um den Prorelaxin-Refraktilkörper aus der Zelle freizusetzen, gefolgt von einer beliebigen Zentrifugationstechnik, die eine Trennung der Refraktilkörper von leichten festen Abfallproduk ten und Flüssigkeiten erlaubt. In der vorliegenden Erfindung erfolgt die bevorzugte Form des mechanischen Zellaufschlusses durch Homogenisierung, während die bevorzugte Zentrifugationstechnik eine kontinuierliche Hochvolumen-Vollmantelzentrifugation ist.
Im Falle, wo Proteine in Form von intrazellulären Refraktilkörpern exprimiert werden, umfasst der Produktgewinnungsprozess Schritte für die Solubilisierung der Refraktilkörper, Renaturieren des solubilisierten Proteins und, wo angebracht, einen kontrollierten Oxidationsschritt, um brauchbares Produkt zu erhalten. Nach Isolierung von rohen Prorelaxin-Refraktilkörpern aus der Fermentationsbrühe werden die Prorelaxin-Refraktilkörper solublisiert und neu gefaltet.
Zur Solubilisierung des Proteins in Refraktilkörpern verwendete Lösungsmittel umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf Guanidin-HCl (GuHCl) (bis zu 8 M), Harnstoff (bis zu 8 M), SDS, alkalischen pH ( >8,0), sauren pH ( <3,0) und Acetonitril/Propanol. Der bevorzugte Solubilisierungspuffer für die Prorelaxin-Refraktilkörper der vorliegenden Erfindung ist GuHCl, 3,5–4,0 M oder Harnstoff, 2–8 M. In der vorliegenden Erfindung wird PEI (Polyethylenimin) verwendet, um Prorelaxin in löslicher Form zu erhalten, während Kontaminanten präzipitiert werden.
Die Neufaltung des solubilisierten Proteins kann durch Verringern oder Entfernen des Solubilisierungsmittels (z. B. durch Dialyse oder Verdünnung) mit Oxidation des reduzierten Proteins vor oder gleichzeitig mit der Neufaltung bei Disulfidbrücken-enthaltenden Proteinen erzielt werden. In der vorliegenden Erfindung ist bevorzugt, das der Faltungsschritt in einer oxidativen Umgebung unter Verwendung eines Redoxo-Puffers stattfindet. In der vorliegenden Erfindung ist bevorzugt, dass die Neufaltung bei der niedrigstmöglichen Konzentration durchgeführt wird, wobei praktikable Lösungsvolumina und mögliche Verluste wegen der hohen Verdünnung für nachfolgende Reinigungsschritte berücksichtigt werden. Es ist insbesondere bevorzugt, Verdünnungen im Bereich des 60- bis 100fachen des Refraktilkörper-Gewichts in Gramm zu verwenden. Während dem Solubilisierungs- und Neufaltungsprozess wird ferner bevorzugt, dass die Exposi tion bei Bedingungen zu minimieren, die eine Derivatisierung der Prorelaxin-Aminosäureseitenketten (z. B. ausgedehnte Exposition bei pH-Werten größer als 9,0) bewirken. Für die Neufaltung von Proteinen, wie z. B. Prorelaxin, die Cysteinreste und in der natürlich auftretenden Form Disulfidbrücken enthalten, sind die in den Solubilisierungs- und Neufaltungsschritten vorliegenden Reduktions-/Oxidationsbedingungen entscheidend und proteinspezifisch. In der vorliegenden Erfindung ist bevorzugt, dass die Solubilisierungs- und Neufaltungsschritte bei 2–8°C stattfinden.
Nach der Neufaltung sind Reinigungsschritte erforderlich, um andere Proteine, die die im Einschlusskörper enthaltene, kontaminierende Nucleinsäuren und Faltungszwischenprodukte zu entfernen, und um das Prorelaxin zu isolieren und zu konzentrieren. Die folgenden Beispiele sind für geeignete Reinigungsverfahren beispielgebend: Fraktionierung an Immunaffinitäts- oder lonentauschersäulen; Ethanolpräzipitation, Umkehrphasen-HPLC; Chromatographie an Kieselgelsäulen; Elektrophorese, Ammoniumsulfatpräzipitation; Gelfiltration; Ultrafiltration/Diafiltration; Metallchelatchromatographie; und Hydrophob-Chromatographie. Chromatographische Matrices sind im Handel zur Verwendung bei der Reinigung des gewünschten Produkts von Kontaminanten erhältlich; ein Überblick chromatographischer Matrices findet sich in Marston et al., supra und Abschnitt VII aus Guide to Protein Purification, herausgegeben von Deutscher, veröffentlicht von Academic Press Inc., 309 (1990).
In der vorliegenden Erfindung ist bevorzugt, das die Spaltung von Prorelaxin zu Relaxin nach Prorelaxin-Neufaltung und Entfernung solubilisierender Mittel stattfindet. Spaltungsverfahren umfassen die hierin diskutierte chemische Spaltung und enzymatische Spaltung.
In der vorliegenden Erfindung umfasst der bevorzugte Prozess einen Prozessschritt für die Zyklisierung des N-terminalen Glutamins der Relaxin-A-Kette. Jeder Prozess für die Zyklisierung des N-terminalen Glutamins der A-Kette kann angewendet werden. Beispiele eines solchen Prozesses sind Hitzebehandlung, vorzugsweise unter leicht sauren Bedingungen, und Behandlung mit nukleophilen Reagenzien, wie z. B. Imidazol bei neutralem pH. Jegliche Prozessschritte, die zur Zyklisierung der N-terminalen A-Kette angewendet werden, können zusätzliche Reinigungsschritte erfordern, um jegliche Kontaminanten zu entfernen, die durch den Zyklisierungsprozess selbst hervorgerufen werden, und können Zentrifugation, Säulenchromatographie oder Präzipitationstechniken umfassen.
Die Endproduktendreinigung kann die Schritte der Chromatographie, Entfernung organischer Lösungsmittel, Ultrafiltration/Diafiltration umfassen, die Relaxin in einer Form für die endgültige Formulierung bereitstellen.
Typischerweise wird das im Verfahren dieser Erfindung verwendete Relaxin durch Vermischen desselben bei Raumtemperatur beim geeigneten pH-Wert und im gewünschten Reinheitsgrad mit pharmazeutisch annehmbaren Trägern, d. h. Trägern, die für Empfänger bei den eingesetzten Dosierungen und Konzentrationen nicht toxisch sind, formuliert. Geeignete Träger und ihre Formulierungen sind in Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. Aufl., Oslo et al. (Hrsg.), Mack Publishing Co. (1980) beschrieben. Diese Zusammensetzungen enthalten typischerweise eine wirksame Menge Relaxin, beispielsweise in der Größenordnung von ungefähr 0,0003 hinauf bis ungefähr 8 oder mehr mg/ ml, gemeinsam mit einer geeigneten Menge Träger, um pharmazeutisch annehmbare Zusammensetzungen herzustellen, die für eine wirksame Verabreichung an den Patienten geeignet sind.
Der pH der Formulierung liegt vorzugsweise irgendwo im Bereich von ungefähr 3 bis ungefähr B. Formulierung in einem Acetatpuffer bei pH 5,0 ist eine geeignete Ausführungsform. Die bevorzugte Formulierung für Relaxin ist eine gepufferte oder ungepufferte Lösung und ist vorzugsweise 20 mM Natriumacetat, pH 5,0.
Zusammensetzungen, die für die klinische Verabreichung von Relaxin besonders geeignet sind, umfassen sterile wässrige Lösungen oder sterile hydratisierbare Pulver, wie z. B. lyophilisiertes Protein. Typischerweise wird eine geeignete Menge eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes ebenfalls in der Formulierung verwendet, um die Formulierung isotonisch zu machen.
Sterilität wird leicht durch Sterilfiltration durch (0,2 Mikrometer-) Membranen erzielt. Relaxin wird für gewöhnlich als wässrige Lösung gelagert, obgleich lyophilisierte Formulierungen für die Rekonstitution annehmbar sind.
Die Relaxin-Zusammensetzungen werden in eine Weise formuliert, dosiert und verabreicht, die mit guter medizinischer Praxis vereinbar ist. In diesem Zusammenhang zu berücksichtigende Faktoren umfassen die jeweilig behandelte Erkrankung, das jeweilig behandelte Säugetier, die klinische Kondition des einzelnen Patienten, die Ursache der Erkrankung, die Zufuhrstelle für das Mittel, das Verabreichungsverfahren, die Verabreichungsschema und andere Faktoren, die den praktischen Ärzten bekannt sind. Die „therapeutisch wirksame Menge" von zu verabreichendem Relaxin wird von solchen Erwägungen bestimmt und ist die minimal notwendige Menge, um die Störung zu verhindern, zu lindern oder zu behandeln.
Als allgemeiner Vorschlag wird die pharmazeutisch wirksame Menge des verabreichten Relaxins im Bereich von ungefähr 0,001 bis 100 mg/kg Körpergewicht des Patienten pro Tag liegen, wobei der typische Bereich des verwendeten Relaxins 0,05 bis 50 mg/kg/ Tag beträgt.
Die Erfindung kann durch Bezugnahme auf die folgenden Beispiele besser verstanden werden. Die Beispiele sollten jedoch nicht dahingehend ausgelegt werden, dass sie den Schutzumfang der Erfindung einschränken.
Beispiel 1
Konstruktion eines Expressionsvehikels für ein Modell von nicht natürlich auftretendem Prorelaxin
Das Plasmid pRB250CTsc besteht aus Prorelaxin (die Relaxin-A- und B-Ketten leiten sich von der in Hudson et al., EMBO J. 3, 2333 (1984), offenbarten Sequenz her) mit einer nicht natürlich auftretenden Leadersequenz und einem nicht natürlich auftretenden C-Peptid, das Trypsin- und Trypsin/Carboxypeptidase-Enzymspaltungsstellen an der A/C-Kettenverbindung und an der B/C-Kettenverbindung enthält, wie in 1 und 3 gezeigt ist. Die Transkriptions- und Translationssequenzen, die für die Expression des Prorelaxin-Gens in E. coli erforderlich sind, werden vom Tryptophan- (Trp-) Promotor bereitgestellt, der sich von pHCH207-1 herleitet (deBoer et al., aus Promotors: Structure and Function, Rodriguez und Chamberlain (Hrsg.), Verlag M. J. Praeger, New York, 462 (1982)). Der Lambda_to-Transkriptionsterminator (Scholtisses et al., NAR 15, 3185 (1987)) befindet sich neben dem Prorelaxin-Terminationscodon. Plasmid pRB250CTsc verleiht dem transformierten Wirt Tetracyclin-Resistenz. Plasmid pRB250CTsc besitzt einen Replikationsstartpunkt aus einem pRB322-Vektor (Sutcliff et al., Cold Spring Harbor Symposium on Quantitative Biology 43, 77 (1978)).
Plasmid pRB250CTsc weist ferner 9 Aminosäuren aus dem hitzestabilen Enterotoxin II(STII-) Gen von E. coli auf (Picken et al., Infect. Immun. 42, 269 (1983)), gefolgt von den Aminosäuren Lys und Arg 3'.
Die 9 STII-Aminosäuren plus Lys und Arg befinden sich 3' des Trp-Promotors und erlauben einen hohen Expressionsspiegel des nicht natürlich auftretenden Prorelaxins mit einer bereitgestellten, zweckdienlichen Spaltungsstelle, wodurch die Hervorbringung der korrekten N-terminalen Prozessierung der Prorelaxin-B-Kette durch enzymatische Spaltung ermöglicht wird. Die 9 STII-Aminosäuren kodieren nicht für eine funktionstüchtige Leadersequenz.
Plasmid pRB250CTsc:
Das Plasmid pRB250CTsc wurde in mehreren Schritten konstruiert, wie in 4 gezeigt ist, wobei als intermediäre Plasmide pRB250, das den Trp-Promotor enthält, pRB250C, das die für nicht natürlich auftretendes Prorelaxin kodierenden Sequenzen an einem Xba I-nach-Rind III-Fragment von 250 Basenpaaren enthält, und pdh108, das den Lambda-t_o Transkriptionsterminator an einem Stu I-nach-Bam HI-Fragment von 412 Besenpaaren enthält.
Plasmid pRB250:
Das Plasmid pRB250 resultiert aus der Ligation des Trp-Promotors/ Operators an 9 Aminosäuren der Leadersequenz (MKKNIAFLL) des hitzestabilen Enterotoxins II (STII), beschrieben in Picken et al., Infect. Immun. 42, 269 (1983), plus Codons für Lys und Arg. pRB150 wurde durch Ligieren von drei DNA-Fragmenten wie in 7 gezeigt hergestellt. Das erste davon war der in 7 gezeigte Vektor pRB192, aus dem das kleine Fragment von BssHII nach Xbal entfernt worden ist. Das zweite Fragment ist eine synthetische Doppelhelix, Rel 60, die für die 9 STII-Aminosäuren plus Lys und Arg kodiert:
Das dritte Fragment ist das Hinfl-nach-BssHII-Fragment aus Plasmid pRB51, dessen Konstruktion in 9 beschrieben ist.
Plasmid pRB250C:
Das Plasmid pRB250C resultiert aus der Ligation des Trp-Promotors an die 9 STII-Leader-Aminosäuren plus Aminosäuren Lys und Arg und enthält ferner das nicht natürlich auftretende Prorelaxin sowie ein Tetracyclin-Resistenzgen minus dem natürlich auftretenden Tetracyclin-Resistenz-Genpromotors.
pRB250C wurde durch Ligieren von drei Fragmenten wie in 6 gezeigt hergestellt. Das erste davon war der Vektor pRB192, aus dem das kleine Xba I-nach-Bam HI-Frag ment entfernt worden ist. Das zweite Fragment war ein Not I-nach-Bam HI-Fragment aus pRB192C, welches das C-Peptid aus dem nicht natürlich auftretenden Prorelaxin umfasste. Das dritte Fragment war ein Not I-nach-Xba I-Fragment von ungefähr 75 Basenpaaren aus pRB250.
Plasmid pdh108:
Plasmid pdh108 enthält den in Scholtissek et al., supra, beschriebenen Lambda-Transkriptionsterminator.
Plasmid pRB192:
Das Plasmid pRB192 enthält den Trp-Promotor, der an Aminosäure Methionin ligiert ist, gefolgt von 9 Aminosäuren von Schweine-Wachstumshormon plus Lys und Arg und enthält ferner natürlich auftretendes Prorelaxin. pRB192 wurde durch Ligieren von drei Fragmenten wie in 7 gezeigt hergestellt. Das erste dieser Fragmente war der Vektor pRB151 aus dem das kleine Xba I-nach-Bss HII-Fragment entfernt worden ist. Das zweite Fragment war die synthetische Doppelhelix Rel 52 mit der Sequenz:
bei der es sich um Methionin plus 9 Aminosäuren des Schweine-Wachstumshormons plus Lys und Arg handelt. Das dritte Fragment war ein Hinf I-nach-Bss HII-Fragment von 46 Basenpaaren aus dem Vektor pRB51.
Plasmid pRB192C:
Plasmid pRB192C resultiert aus der Ligation des Trp-Promotors an Methionin, gefolgt von 9 Aminosäuren von Schweine-Wachstumshormon plus Lys und Arg, und enthält ferner nicht natürlich auftretendes Prorelaxin. Plasmid pRB192C enthält ein promotorfreies Tetracyclin-Resistenzgen. pRB192C wurde durch Ligieren von drei Fragmenten wie in 18 gezeigt hergestellt. Das erste Fragment war das große Vektorfragment von BssHII nach EcoRV aus dem Plasmid pRB192. Das zweite Fragment war ein synthetisches Fragment, Rel 58, welches das nicht natürlich auftretende Prorelaxin der folgenden Sequenz enthält:
Das dritte Fragment war das Taq I-nach-Ec RV-Fragment mit 200 Basenpaaren aus pRB192, das die Relaxin-A-Kette und das 5'-Ende des Tetracyclin-Resistenzgens enthält.
Plasmid pRB151:
Plasmid pRB151 resultiert aus der Ligation des Trp-Promotors an die für Präprorelaxin kodierende Sequenz und wurde durch Ligieren von zwei Fragmenten wie in 8 gezeigt hergestellt. Das erste davon ist ein Pst I-nach-Xba I-Vektorfragment aus Plasmid pHGH207-1, wie beschrieben in deBoer et al. (aus Promotors: Structure and Function, Rodriguez und Chamberlain (Hrsg.), Verlag M.). Praeger, New York, 462 (1982)).
Plasmid pRB51:
Plasmid pRB51 resultiert aus der Ligation des Alkalische-Phosphatase-Promotors an die vollständige STII-Leadersequenz und enthält ferner die natürlich auftretende Prorelaxin-Sequenz. pRB51 wurde durch Ligieren von zwei Fragmenten wie in 9 gezeigt hergestellt. das erste Fragment war das große Vektorfragment von Not 1 nach Bam HI aus Plasmid pRB11; das zweite Fragment war das kleine Not I-nach-Bam HI-Fragment aus pTR21, das für die Prorelaxin-Aminosäuren 12 bis 161 kodiert und dessen Sequenz in 9A gezeigt ist. pRB11 ist ein Expressionsplasmid, das zur Expression der Relaxin-B-Kette in E. coli mithilfe der STII-Signalsequenz konstruiert ist. Die zur Expression erforderlichen Transkriptions- und Translationssequenzen werden vom AP-Promotor und den Tryptophan- (Trp-) und STII-Shine-Dalgarno-Sequenzen bereitgestellt.
Der Plasmid-Startpunkt und das Tetracyclin-Resistenzgen von pRB11 waren von einem veränderten pBR322-Plasmid hergeleitet, in dem die Nucleotidsequenz zwischen den Aval- und Pvull-Endonuclease-Restriktionsstellen deletiert worden sind, wodurch eine höhere Plasmid-Kopiezahl je Zelle resultierte. Die kodierende Sequenz für die Relaxin-B-Kette wurde aus einem Präprorelaxin-N2-cDNA-Klon erhalten (Hudson et al., EMBO J. 3, 2333 (1984)). Der Alkalische-Phosphatase- (AP-) Promotor und die hitzestabile Enterotoxin II- (STII-) Signalsequenz wird in Chang et al., Gene 55, 189 (1987) beschrieben. Die Sequenz von pRB11 ist in 10 gezeigt.
Plasmid pRB61:
Plasmid pRB61 resultiert aus der Ligation des Alkalische-Phosphatase-Promotors an die für natürlich auftretendes Präprorelaxin kodierende Sequenz. pRB61 wurde durch Ligieren von vier Fragmenten wie in 11 gezeigt hergestellt. Das erste Fragment war ein Eco RI-nach-Hind III-Vektorfragment aus Vektor pLS33lamB, wie in 15 gezeigt ist. Das zweite Fragment war ein Eco RI-nach-Xba I-Fragment von 412 Basenpaaren aus Plasmid pTF271, wie in 16 gezeigt ist. Das Plasmid pTF271 ist zur Expression der ersten 243 Aminosäuren von reifem Human-Gewebefaktor in das Periplasma von E. coli mithilfe der STII-Signalsequenz entworfen. Die zur Expression erforderlichen Transkriptions- und Translationssequenzen werden von Alkalische-Phosphatase-Promotor und den Trp- und STII-Shine-Dalgarno-Sequenzen bereitgestellt. Die kodierende Sequenz für Human-Gewebefaktor wird von Fisher et al., Throm. Res. 48, 89 (1987), beschrieben. Der Alkalische-Phosphatase-Promotor, die Tryptophan- (Trp-) und hitzestabilen Enterotoxin II- (STII-) Shine-Dalgarno-Sequenzen und die STII-Signalsequenz waren von phGH-1 hergeleitet (Chang et al., Gene 55, 189 (1987)). Der Plasmid-Startpunkt und das Tetracyclin-Resistenzgen waren von pBR322 hergeleitet (Sutcliffe, Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology, Bd. 43, 77 (1978)).
Das dritte Fragment ist das kleine Xba I-nach-Bgl II-Fragment aus Plasmid pPreProReIH2-Trp207. pPreProReIH2Trp207 ist ein Abkömmling von pHGH207 (wie beschrieben in US-Patent 4.663.283, erteilt am 5. Mai 1987), in dem die für HGH kodierende Sequenz mit der von Präprorelaxin ersetzt worden ist. Das vierte Fragment ist ein Bgl II-nach-Hind III-Fragment von 24 Basenpaaren aus dem Vektor pRAI.
Plasmid pLS33lamB:
pLS33lamB wurde wie in 15 gezeigt durch Ligieren von drei DNA-Fragmenten konstruiert. Das erste davon war der unten beschriebene Vektor pLS32, in dem das kleine Xbal-nach-BstEll-Fragment entfernt worden ist. Das zweite war ein Xbal-nach-Eael-Fragment von 75 Basenpaaren aus dem unten beschriebenen pAPlamB, das für die lamB-Signalsequenz kodiert. Das dritte war eine synthetische DNA-Doppelhelix von 46 Basenpaaren mit der folgenden Sequenz:
Die obige Sequenz kodiert für die Aminosäuren 4–18 des reifen IGF-I.
pLS32 resultiert aus der Fusion der für IGF-I kodierenden Sequenz an die der hitzestabilen Enterotoxin II- (STII-) Signalsequenz und wurde durch Ligieren von vier DNA-Fragmenten wie in 18 gezeigt hergestellt. Das erste davon war der Vektor pTF2A12 (Paborsky et al., Biochemistry 28, 8072 (1989)), aus dem das kleine Nsil-BamHI-Fragment, welches das Gewebefaktor-Gen enthält, entfernt worden ist. Die STII-Signalsequenz wird von Picken et al., Infect. Immun. 42, 269 (1983), beschrieben. Das zweite Fragment war eine synthetische Doppelhelix von 55 Basenpaaren, die für die ersten 18 Aminosäuren des reifen IGF-I kodiert. Diese Doppelhelix weist die folgende Sequenz auf:
Das dritte Stück in der Ligation war ein BstEll-nach-Hindlll-Fragment von 154 Basenpaaren aus pK1ZZ, das für die verbleibenden Aminosäuren 19–70 des IGF-I kodiert. pK1ZZ-IGF-I ist ein Kanamycin-resistentes Plasmid, das einen Lac-Promotor enthält, der an einen Protein A-Promotor angefügt ist, der an ein Protein A-Signal angefügt ist, das an zwei Consensus-z-Regionen aus Protein A angefügt ist, die IgGs binden und Proteine sekretieren, die unter Verwendung von zwei Codons fusioniert sind, die für eine Asn-Gly-Schnittstelle zu einem synthetischen IGF-I-Gen kodieren und ferner eine F-Region für hohe Kopienanzahlen enthalten. Dieses Plasmid ist ähnlich dem pZZ-IGF-I, das in EP-A-230.869, veröffentlicht am 5. August 1987, beschrieben wird, wo das Ampicillin-Gen durch ein Kanamycin-Gen ersetzt ist. Das letzte in 18B gezeigte Fragment bei der Konstruktion von pLS32 war ein Hindlll-BamHI-Fragment von 291 Basenpaaren aus Plasmid pLS8. Dieses letzte Fragment ist einfach die kodierende Sequenz für den Start des Tetracyclin-Gens von pBR322 (Sutcliffe, Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology 43, 77 (1978)), in dem eine Hindlll-Restriktionsstelle unmittelbar stromauf des Methionin-Startcodons gentechnisch eingebaut wurde.
Plasmid pAPlamB:
Das Plasmid pAPlamB wurde wie in 19 gezeigt konstruiert, indem zwei DNA-Fragmente miteinander ligiert wurden, und resultiert in der Einfügung der für das lamB-Signal kodierenden Sequenz stromab des AP-Promotors und der Trp-Shine-Dalgarno-Sequenz. Die Ligation umfasste den Vektor pRA1, in dem das kleine Xbal-Bglll-Fragment entfernt worden ist. Dieses Plasmid ist ein Derivat von pHGHI (Chang et al., Gene 55, 189 (1987)), wobei das letztere Plasmid den AP-Promotor, das STII-Signal und für HGH kodierende DNA enthält. pRAI unterscheidet sich von pHGHI dahingehend, als dass es für die Relaxin-A-Kette und nicht die für hGH kodierende DNA (deren Sequenz in US-Patent Nr. 4.785.516 beschrieben ist) und eine geeignete Bglll-Restriktionsstelle stromab des Promotors und der Ribosom-Bindungsstelle enthält. Das zweite Stück in der Ligation war eine synthetische DNA-Doppelhelix von 80 Basenpaaren mit der folgenden Sequenz, die für die labB-Signalsequenz kodiert, die von Clement und Hofnung, Cell 27, 507 (1981), beschrieben worden ist:
Plasmid pRA1:
Plasmid pRAI resultiert aus der Fusion des Alkalische-Phosphatase-Promotors an die STII-Leadersequenz und enthält ferner die kodierende Sequenz der Relaxin-A-Kette. pRA1 wurde durch Ligieren von drei Fragmenten wie in 12 gezeigt hergestellt. Das erste war ein großes Nsi I-nach-Nhe I-Vektorfragment aus Plasmid pTF161, ein Abkömmling von pGH1 (Chang et al., Gene 55, 189 (1987)) und pTF111 (Paborsky et al., Biochemistry 28, 807 (1989)), wie in 12A beschreiben wird. Das zweite Fragment ist die synthetische Doppelhelix Rel 36 mit der Sequenz:
Das dritte Fragment war ein Bgl II-nach-Nhe I-Fragment aus Plasmid pTR591.
Plasmid pTR591:
Plasmid pTR591 resultierte aus der Ligation des Trp-Promotors an Human-Prorelaxin. pTR591 wurde durch Ligieren von drei Fragmenten wie in 13 gezeigt hergestellt. Das erste Fragment war das große Bgl II-nach-Bam HI-Vektorfragment aus dem Plasmid pTR561, wie in 14 gezeigt und in WO 90/13659 beschrieben ist. Das zweite Fragment war das Alu I-nach-Bgl II-Fragment von 26 Basenpaaren aus pTR561, während das dritte Fragment ein Alu I-nach-Bam HI-Fragment aus PBR322 war.
Zusätzlich zum Plasmid pRB250CTsc wurden andere-Plasmide-konstruiert, die Prorelaxin mit nicht natürlich auftretenden Leadern und C-Peptiden umfassten, wie in 2 gezeigt ist.
Beispiele 2 bis 4
Die Prorelaxin-Expressionsvektoren pRELCIII, pRELCAspN und pRELCLysC, die aus nicht natürlich auftretenden C-Peptiden mit enzymatischen Spaltungsstellen bestehen, werden wie oben für pRB250CTsc mit geeigneter Substitution der für synthetisches C-Peptid kodierenden Sequenzen konstruiert.
Beispiel 5
Verfahren zur Herstellung von Relaxin aus einem nicht natürlich auftretenden Prorelaxin unter Verwendung von Trypsin und CPB
Fermentation und anfängliche Isolierung der Refraktilkörper: W3110tonA, transfiziert mit pRB250CTsc, wird in der Fermentation verwendet. Ein bei 37°C für ungefähr 8 Stunden kultivierter LB-Schüttelkolben wird verwendet, um einen 60 I-Impffermenten zu inokulieren. Die 60 I-Kultur wird bei 37°C auf eine OD550 von 45 +/- 5 (ungefähr 8–9 Stunden) gezüchtet und dann verwendet, um eine 1000 I-Produktionsfermentation zu inokulieren. Die 1000 I-Kultur wird bei 37°C gezüchtet und 8 Stunden nach der Zugabe von Indolessigsäure (IAA) geerntet, für gewöhnlich 12–16 Stunden nach dem Zeitpunkt der Inokulierung. Das eingesetzte Medium ist LB-Kolben-Luria-Bouillon + 5 Mikrogramm Tetracyclin/ml.
Die geernteten Zellen werden dann mit den oben dargelegten Prozessschritten behandelt.
Zur Erntezeit werden die Zellen durch Passieren der Brühe durch ein Nitzeabtötungsgerät abgetötet. Das Gemisch wird auf 2–8°C abgekühlt, EDTA auf eine Endkonzentration von 5 mM wird zugesetzt und der pH auf 5,5 gestellt. Die Zellen werden aufgebrochen (z. B. in einem Homogenisator) und die Refraktilkörper durch Zentrifugation (z. B. Alfa Laval AX213) gesammelt. Die pelletierten Refraktilkörper werden eingefroren und bei ungefähr –70°C gelagert.
Extraktion, Faltung und Reinigung von Mini-C-Prorelaxin:
Die gefrorenen Refraktilkörper werden in 14 lbis 20 l Extraktionspuffer (3,5 M Guanidin-Hydrochlorid/50 mM Tris/0,2% EDTA, pH 8,5) je kg Refraktilkörper solubilisiert.
Die Neufaltung des Prorelaxins erfolgt durch Verdünnen des obigen Extrakts mit 50 mM Tris/=,2% EDTA, pH 8,5, auf ein Endvolumen von 60 1 je kg Refraktilkörper. Cystamin (0,113 g/l) und Cystein (0,606 g/l) werden dem Gemisch zugesetzt und für ungefähr eine Stunde gerührt, um die Neufaltung des Prorelaxins zu erlauben. Nach vollständiger Neufaltung wird Polyethylenimin auf eine Endkonzentration von ungefähr 0,05 bis 0,1 zugesetzt. Die erhaltene Suspension wird für ungefähr eine Stunde sanft gerührt. Nach einer zusätzlichen Verdünnung auf 120 l/kg mit 50 mM Tris/0,2% EDTA, pH 8,5, wird die Suspension für eine zusätzliche Stunde sanft gerührt.
Die Feststoffe werden durch Zentrifugation entfernt (z. B. CEPA Z101 oder Alfa Laval AX 213) und der erhaltene Überstand durch ein Tiefenfilter (z. B. CUNO) filtriert. Die klare Lösung wird auf eine in 3,5 M Harnstoff/50 mM Tris/0,2% EDTA, pH 8,5, äquilibrierte Kieselgelsäule geladen. Nach dem Waschen der Säule mit 5 M Harnstoff/50 mM Tris/ 0,2% EDTA, pH 8,5, wird das gefaltete Prorelaxin mit 5 M Harnstoff/50 mM Tris/0,2% EDTA/0,5 M TMAMC, pH 8,5, eluiert.
Der erhaltene Pool wird durch Kationentauscherchromatographie (z. B. S-Sepharose Fast Flow) weiter gereinigt. Die Lösung wird direkt auf die in 3,5 M Harnstoff/50 mM Tris/ 0,2% EDTA, pH 8,5, äquilibrierte Säule aufgegeben. Die Säule wird mit demselben Puffer gewaschen. Das Prorelaxin wird mit demselben Puffer, der 0,5 M NaCl enthält, eluiert.
Enzymatische Spaltung von Mini-C-Prorelaxin:
Der Pool aus der lonentauschersäule wird auf ungefähr 5–10 mg/ml konzentriert und in 50 mM Tris/5 mM CaCl₂, pH 8,5, an einer Membran mit einem Cut-Off von 5K (z. B. Filtron PES Omega) diafiltriert.
Der Lösung wird Trypsin in einem Verhältnis von 1 : 100 (w/w) zugegeben (z. B. 1 mg Trypsin je 100 mg Prorelaxin). Nach 30 Minuten wird dem Gemisch Carboxypeptidase B zugegeben (0,2 rEU CPB je mg Prorelaxin). Der Fortschritt der Spaltungsreaktion wird durch analytische Umkehrphasenchromatographie an einer C4- oder C18-Säule verfolgt. Nach vollständiger Reaktion wird diese durch Zugabe von Eisessig (30 ml je Liter Reaktionsgemisch) gestoppt.
Zyklisierung des N-terminalen Glutamins der A-Kette:
Die angesäuerte Lösung wird auf ungefähr 85°C erhitzt, für ungefähr eine Stunde auf dieser Temperatur gehalten und dann auf ungefähr 10°C abgekühlt. Die gebildete Suspension wird durch Zugabe eines gleichen Volumens 0,5 M Essigsäure verdünnt und zentrifugiert. Das Pellet kann mit 0,5 M Essigsäure gewaschen und nochmals zentrifugiert werden. Die erhaltenen Überstände werden vereinigt und filtriert.
Reinigung von Relaxin:
Die klaren Überstände werden auf eine in 0,5 M Essigsäure/50 mM Tris/5 mM CaCl₂, pH 3,5, äquilibrierte Kationentauschersäule (z. B. S-Sepharose High Performance) geladen. Nach vollständiger Beladung wird die Säule zunächst mit dem Äquilibrierungspuffer, dann mit 50 mM MES, pH 7,0, und 50 mM MES/125 mM NaCl, pH 7,0, gewaschen. Das Relaxin wird mit einem NaCl-Gradienten von 125 mM bis 140 mM in 50 mM MES bei pH 7,0 eluiert.
Umkehrphasenchromatographie wird an einer mit 0,1% Phosphorsäure äquilibrierten C4- oder C18-Kieselgelsäule durchgeführt. Relaxin wird mit einem Gradienten des Äquilibrierungspuffers und 0,1% Phosphorsäure/80% Acetonitril eluiert.
Der erhaltene Pool wird direkt auf eine in 20 mM MES/5% Ethanol, pH 6,0, äquilibrierte Hochleistungs-Kationentauschersäule (z. B. MONO S) geladen. Relaxin wird mit einem NaCl-Gradienten von 10 mM bis 32 mM in 20 mM MES/5% Ethanol, pH 6,0, eluiert.
Das Relaxin wird dann durch Größenausschlusschromatographie (z. B. Sephadex G-15) oder durch Ultra- und Diafiltration an einer Membran mit einem Cut-Off von 5K (z. B. Amicon YM-5, Filtron Omega) entweder mit 10 mM Citrat/isotonische Kochsalzlösung, pH 5,0, oder mit 20 mM Natriumacetat, pH 5,0, fraktioniert.

Claims

Verfahren zur Herstellung von menschlichem Relaxin aus einem nicht natürlich vorkommenden Prorelaxin, worin das Prorelaxin – von der Amino-Endgruppe zur Carboxyl-Endgruppe in dieser Reihenfolge – ein Leader-Peptid, die B-Kette, eine nicht natürlich vorkommende C-Kette und die A-Kette umfasst, und worin das Leader-Peptid eine Spaltungsstelle benachbart zur B-Kette umfasst und worin die nicht natürlich vorkommende C-Kette Spaltungsstellen angrenzend an die B-Kette und die A-Kette umfasst, wobei das Verfahren das Entfernen des Leader- und des nicht natürlich vorkommenden C-Peptids vom Prorelaxin unter Einsatz eines Spaltungsmittels an der Spaltungsstelle und das Gewinnen von biologisch aktivem Relaxin umfasst, und worin die nicht natürlich vorkommende C-Kette eine Aminosäuresequenz umfasst, die aus folgender Gruppe ausgewählt ist:
Verfahren nach Anspruch 1, worin das Relaxin H2-Human-Relaxin ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin das Spaltungsmittel in einem oder mehreren Enzymen besteht.
Verfahren nach Anspruch 3, worin die Enzyme aus der aus Endoproteinase Asp N, Trypsin, Endoproteinase Lys C, Endoproteinase Arg C und Carboxypeptidase B bestehenden Gruppe ausgewählt sind.
Verfahren nach Anspruch-4, worin die Enzyme Trypsin oder Endoproteinase Arg C in Kombination mit Carboxypeptidase B; oder Lys C in Kombination mit Carboxypeptidase B; oder Asp N in Kombination mit Lys C sind.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das Prorelaxin rekombinant durch Bereitstellen von DNA, die für das Prorelaxin kodiert, in einem operativen Expressionsvektor, der in Wirtszellen transfiziert wird, Kultivieren der transfizierten Zellen und Isolieren des Prorelaxins hergestellt wird.
Verfahren nach Anspruch 6, worin das Isolieren das Solubilisieren und Neufalten des Prorelaxins umfasst.
Verfahren nach Anspruch 7, worin das Prorelaxin mit einer Lösung solubilisiert wird, die Guanidin-hydrochlorid umfasst.
Verfahren nach Anspruch 7, worin das Prorelaxin unter Bedingungen verdünnter Protein-Konzentrationen oder unter Verwendung eines Redox-Puffers neugefaltet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 9, worin die Wirtszellen E. coli sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, worin die A-Kette ein N-terminales Glutamin umfasst und das Verfahren weiters das Zyklisieren des N-terminalen Glutamins der A-Kette umfasst.
Verfahren nach Anspruch 11, worin das N-terminale Glutamin der Relaxin-A-Kette durch einen Wärmeschritt zyklisiert wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, worin das Relaxin durch ein Verfahren gewonnen wird, das einen Schritt umfasst, der aus der aus Adsorptionschromatographie, Ionenaustausch-Chromatographie, Umkehrphasen-Chromatographie, Größenausschluss-Chromatographie und Ultrafiltration bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, das gegebenenfalls das Formulieren des Relaxins in Formulierungspuffer umfasst.
Nicht natürlich vorkommendes Prorelaxin, umfassend ein Leader-Peptid, die B-Kette, eine nicht natürlich vorkommende C-Kette und die A-Kette, worin das Leader-Peptid eine zur B-Kette benachbarte Spaltungsstelle umfasst und worin die nicht natürlich vorkommende C-Kette zur B-Kette und zur A-Kette benachbarte Spaltungsstellen umfasst, und worin die nicht natürlich vorkommende C-Kette eine aus KRKPTGYGSRKKR, DKKRTGYGSRRRK, DKKRTGYGSRKKR, und KRKPTGYGSRRRK. ausgewählte Aminosäuresequenz umfasst.
Prorelaxin nach Anspruch 15, worin die Spaltungsstellen enzymatisch spaltbar sind.
Isolierte DNA, die für ein Prorelaxin nach Anspruch 15 oder Anspruch 16 kodiert.
Expressionsvektor, der DNA nach Anspruch 17 operativ enthält.
Mit einem Vektor nach Anspruch 18 transfizierte Wirtszelle.