CN102603888B

CN102603888B - 一种人松弛素2前体及其制备方法

Info

Publication number: CN102603888B
Application number: CN2012101042318A
Authority: CN
Inventors: 郭德军; 王淑慧; 厉保秋; 韩佳汕
Original assignee: Heilongjiang Bayi Agricultural University
Current assignee: Heilongjiang Bayi Agricultural University
Priority date: 2012-04-11
Filing date: 2012-04-11
Publication date: 2013-11-20
Anticipated expiration: 2032-04-11
Also published as: CN102603888A

Abstract

本发明涉及的是一种人松弛素2前体及其制备方法，这种人松弛素2前体使用AsnGlyPheAsnGly人工C肽将天然人松弛素2的B链和A链按B-C-A顺序连接，形成一种非天然人松弛素2前体结构，这种人松弛素2前体的氨基酸序列如序列表中的序列1表示，命名为rhR2。本发明提供的人松弛素2前体及其优化的基因，使得人松弛素2前体在毕赤酵母中的分泌表达量大幅度提高；该人松弛素2前体的C肽切除使用廉价的羟胺，而不使用昂贵的TPCK-胰蛋白酶，降低了C肽切除成本。

Description

一种人松弛素2前体及其制备方法

一、技术领域：

本发明涉及的是一种新结构的人松弛素2前体的基因工程制备，具体涉及的是一种人松弛素2前体及其制备方法。

二、背景技术：

松弛素属胰岛素家族，是由两条短肽链通过二硫键连接构成的短肽激素，具有软化生殖道组织、使趾骨联合分离以促进分娩、抑制子宫收缩、刺激乳腺生长与分化、调节卵泡发育、舒张血管、抗炎及促进伤口愈合、影响应激反应及食欲等生理作用。松弛素2可促进THP-1细胞中cAMP含量的增加。近几年发现，人松弛素被发现在临床上还具有治疗心衰的作用，从而引起人们进一步的关注。

目前发现，人的松弛素具有3种不同的氨基酸序列：H1、H2和H3，其中H2是最主要的活性存在形式。人松弛素2是有AB两条链组成，其中A链由24个氨基酸残基构成，B链29个氨基酸残基组成；A、B链之间有两对链间二硫键相连，A 链内有一对链内二硫键，见图1。在人体中，松弛素是以松弛素原的状态分泌，其氨基酸一级结构是按B链、C链、A链的顺序排列，其中C链由108个氨基酸残基组成，松弛素原产生后由组织中的转化酶将C链切除后，形成成熟的松弛素。

人体内松弛素主要是在妊娠期间由卵巢的黄体产生的，其组织来源很困难，临床上常常使用猪源的松弛素。人松弛素具有强烈地抗心衰作用的发现，极大地拓展了人松弛素的应用领域，并具有极大的市场需求，因此推动了人松弛素制备方法的研究。目前最为常见的制备方式是分别化学合成A和B肽链，然后再进行体外折叠，但因二硫键经常错配而造成产率较低，并且尚需二次纯化，使得化学合成人松弛素的成本较高。国内外也有用哺乳动物细胞、大肠杆菌、酵母等重组表达其前体的报道，但是表达量都较低。同时，多使用ArgArgGluPheLysArg氨基酸序列作为C肽连接AB链，在将人松弛素前体加工成活性的松弛素时需要使用昂贵的TPCK-胰蛋白酶进行切割，同时也容易在AB链的Lys或Arg羧基端发生切割，而使重组蛋白招到破坏。陈历明等利用大肠杆菌表达天然人松弛素2原，分离纯化后得率约为2～3 mg/ L，但没有进一步加工和生物活性的报道。Yang等利用酵母表达人松弛素2，经大鼠耻骨联合分析证明其具有生物活性，纯化后的重组蛋白最高可达40μg/L，产量并不理想。

三、发明内容：

本发明的一个目的是提供一种人松弛素2前体，这种人松弛素2前体用于解决现有的人松弛素2前体在毕赤酵母中的分泌表达量低及其C肽切除费用昂贵的问题；本发明的另一个目的是提供这种人松弛素2前体的制备方法。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：这种人松弛素2前体使用AsnGlyPheAsnGly人工C肽将天然人松弛素2的B链和A链按B-C-A顺序连接，形成一种非天然人松弛素2前体结构，这种人松弛素2前体的氨基酸序列如序列表中的序列1表示，命名为rhR2。

上述方案中人松弛素2前体的基因序列如序列表中的序列2表示。

上述人松弛素2前体的制备方法利用基因重组技术，使用AsnGlyPheAsnGly人工C肽将天然人松弛素2的B链和A链按B-C-A顺序连接，形成一种非天然人松弛素2前体结构，再根据表达宿主密码子的偏爱性和该人松弛素2前体氨基酸一级序列，使用酵母偏爱密码子优化该蛋白基因，再通过人工合成该基因序列，然后插入到毕赤酵母表达载体，在毕赤酵母中实现该人松弛素2前体的高效、分泌表达，并保持其天然N端结构。

上述方案中人松弛素2前体的制备方法：

一、rhR2基因的合成和表达载体pGAPZα-rhR2的构建

为了便于构建酵母表达载体，在rhR2基因上加入了XhoI、XbaI限制性酶切位点、终止密码，并在XhoI后加入了Kex2 切割位点，然后人工化学合成图2所示的基因序列，将其连接到pUC-57克隆载体上，转化大肠杆菌DH5a感受态，经100μg/mL Amp+抗性LB平板筛选，获得阳性克隆；阳性克隆经100μg/mL Amp+抗性LB液体培养基过夜培养，然后使用质粒DNA小提试剂盒提取其重组质粒；重组质粒和pGAPZαA质粒分别经XhoⅠ和XbaⅠ双酶切，然后使用DNA凝胶回收试剂盒回收松弛素前体基因片段和pGAPZα载体片段，两个回收片段再经T4 DNA 连接酶于16℃连接10h；连接产物转化感受态大肠杆菌DH5a，经含25μg/mL Zeocin的低盐LB平板筛选阳性克隆，阳性克隆再经25μg/mL Zeocin低盐LB液体培养基培养，使用质粒DNA小提试剂盒提取重组表达质粒；将经测序正确的重组表达质粒命名为pGAPZα-rhR2；

二、转化筛选高表达的重组菌株

5-10μg重组表达质粒pGAPZα-rhR2经Avr II限制性内切酶线性化后，电转化SMD1168菌株，经100μg/mL Zeocin YPD抗性平板初步筛选重组酵母，获得的重组酵母再经400μg/mL Zeocin YPD抗性平板复筛，将获得的高抗性重组酵母菌株接种于YPD培养基中，在30℃、260rmp/min、72h震荡培养后，离心取上清，经进行Tricine-SDS-PAGE电泳分析表达量，筛选出高效表达菌株，经Western Blot 分析，表达产物可与兔子抗人Relaxin-2抗体发生特异性结合，在相对分子质量约6500处可见特异性反应条带；获得的最高表达量菌株命名为G-rhR2。

上述方案中人松弛素2前体制备人松弛素的方法：

一、种子液的准备

重组酵母G-rhR2在YPD平板上划线分离，30℃倒置培养48h；提取单菌落，接种于50ml YPD培养液的250ml摇瓶中，30℃、260rmp/min、20h震荡培养；镜检酵母细胞形态正常无杂菌，2000rmp/min离心10min收集沉淀，按200ml YPD培养基1L的摇瓶中，30℃、260rmp/min、20h震荡培养，OD600达到4-6时，镜检酵母细胞形态正常无杂菌，即可作为种子培养液；

二、增值及分泌表达

将上述种子液接按1：10接种于已经灭绝的5L YPD罐培养基中，进行30℃发酵表达，通过调节搅拌转速、罐压、空气流量，使溶氧量不低于20%，并保持该状态发酵48h；

三、发酵液上清的获得及纯化

发酵结束后，4000rmp/min离新15分钟，收集上清液。上清液经0.22μm滤膜过滤后，经截流分子量30000的膜超滤收集滤过液，再经截流分子量3000的膜超滤回收浓缩液，采用50 mmol/L Tris-HCl pH7.6洗涤超滤浓缩液2次，超滤浓缩组份上DEAE-FF柱，柱直径1.6cm，柱高10cm，洗脱液：50mmol/L Tris-HCl，1mol/L NaCl，pH7.6，流速：5mL/min，收集穿透组分，真空低温浓缩；经直径为1.0cm，高度为30cm的 Sephadex G-50进一步分离，用浓度10 mmol/L，pH 7.6的PBS洗脱，流速：1mL/min，收集主洗脱峰，进行Tricine-SDS-PAGE检测；

四、松弛素2前体C肽的切除

采用2mol/L pH8.0盐酸羟胺盐切割人松弛素前体的C肽，42℃ 4h；然后使用截流分子量3000的透析袋在10 mmol/L PBS透析液中10℃搅拌透析12h，透析液的pH值为7.6，更换透析液4～5次；透析完成后，使用PEG20000包埋浓缩至一定体积，进行Tricine-SDS-PAGE检测，0.22μm膜过滤除菌，-20℃保存。

外源蛋白表达水平的高低和诸多因素有关，如外源基因密码子本身、启动子、信号肽、表达系统种类、基因的拷贝数、宿主菌及发酵条件等。各种生物对基因密码子的使用有其偏爱性；很多实验证明，宿主细胞密码子的偏爱性极大地影响了外源蛋白的表达量；Cregg等和Kliman等对外源蛋白在酵母中的表达和密码子的使用做了详细的阐述。如果按照宿主细胞对密码子的偏爱性改造目的基因，即使只改造基因上连续出现的稀有密码子，也将大幅度提高表达量。我们使用AsnGlyPheAsnGly这种人工C肽和经密码子优化后人工合成的基因，在毕赤酵母中实现了该松弛素2前体的高效分泌表达，表达量达到了480μg/mL，远远高于Yang等的40μg/L，完全优化的松弛素前体基因和C肽结构可能是主要原因。

松弛素属于胰岛素家族，其结构和胰岛素极其相似。研究发现C肽的长短可能对胰岛素A、B链的重组表达产生影响。Thim等利用酵母表达系统对不同长度C肽的胰岛素原进行比较，发现C肽缩短后胰岛素原的达量上升。Kjeldsen等发现缩短C肽能提高单链胰岛素原的分泌水平，在C肽中加入芳香族氨基酸可以使胰岛素原的表达量提高5倍；因此我们根据这些在胰岛素高效表达上的发现，参照人松弛素2的肽链一级结构，并结合酵母的偏爱密码子，设计含短C肽的人松弛素2前体的cDNA序列，将其命名为rhR2。由于使用ArgArgGluPheLysArg这种C肽所表达出的单链松弛素前体，需要使用胰蛋白酶酶切除去C肽才能形成具有生物活性的成熟松弛素。由于胰蛋白酶酶切是在Lys和Arg的羧基端进行的，而松弛素肽链上有3个Lys (A⁹、A¹⁷、B⁹)和4个Arg (A¹⁸、A²²、B¹³、B¹⁷)，并且从松弛素的空间结构 (ID:3341) 上来看，多在其亲水侧面；从理论上讲，胰蛋白酶极容易将这一重组肽链切碎，而无法获得所需结果；从Yang等的SDS-PAGE图中也可以看出，切除C肽后的重组蛋白呈弥散状，也证实了这一点。因此我们将C肽设计成AsnGlyPheAsnGly的目的是：利用廉价的羟氨切除C肽，既可降低成本，又可避免肽链的非特异性切割。

pPICZaA和pGAPZaA是常用的酵母分泌表达载体，pPICZaA是含有AOX1启动子的甲醇诱导型分泌表达载体，pGAPZaA含有GAP启动子的组成型分泌表达载体，它们仅启动子不同，这两个载体的信号肽后均含有Kex2和Ste13两个信号肽切除位点。pPICZaA和pGAPZaA两种载体相比较而言，pGAPZaA在培养基成本和操作简便上更具有优势。异源基因可插入到这两个载体羧肽酶B(Kex2)或二肽基氨肽酶(Ste13)的识别位点之后，在表达时使用Kex2或Ste13切除信号肽，但这两个位点在蛋白表达时有所不同；只使用Kex2位点切除信号肽时，表达产物N端均一；如果将目的基因插入Ste13酶切位点后，信号肽切除时会出现Glu、Ala氨基酸切除不完全的问题，造成表达产物N端不均一的现象。为了保持表达产物天然N端的均一性和天然的N端氨基酸，我们将rhR2核苷酸设计序列的5’端和3’端分别加入XhoⅠ和XbaⅠ位点，并在XhoⅠ后只使用Kex2的识别序列，并在XbaⅠ前加上终止密码子。

虽然毕赤酵母具有一定的糖基化能力，但从SDS-PAGE图中可以看出，我们表达的重组毒素以非糖基化形式存在，这与松弛素的氨基酸序列和空间结构有关。常规的SDS-PAGE分离分子量小于10 000的多肽效果较差，蛋白容易弥散不成带。Tricine-SDS-PAGE凝胶分离蛋白质范围是100-10 000，可有效分离分子量较小的蛋白。

我们根据人松弛素H2的氨基酸一级结构，设计带有人工C肽的松弛素2前体结构，并使用酵母菌的偏爱密码子，反向编码，人工合成松弛素2前体的基因，利用毕赤酵母具有较强的蛋白子后加工能力和分泌能力，在毕赤酵母中实现松弛素2前体的高效表达，再经表达产物的提取、人工C肽的切除，获得促进THP-1细胞cAMP含量增加的重组松弛素2。

有益效果：

本发明提供的人松弛素2前体及其优化的基因，使得人松弛素2前体在毕赤酵母中的分泌表达量大幅度提高；该人松弛素2前体的C肽切除使用廉价的羟胺，而不使用昂贵的TPCK-胰蛋白酶，降低了C肽切除成本；在毕赤酵母中分泌表达时，只使用Kex2信号肽切割位点，确保了人松弛素2前体 N端的均匀性，并保持其天然N端结构。在毕赤酵母中分泌表达时，使用组成型GAP1启动子的表达该人松弛素2前体，其表达量略高于使用甲醇诱导型AOX1启动子的表达量；与AOX1启动子相比，在毕赤酵母中使用GAP1启动子表达该人松弛素2前体还具有培养基成本低和操作简便的优势。

四、附图说明：

图1现有人松弛素2的一级氨基酸组成结构示意图；

图2本发明人松弛素2前体结构及合成基因序列示意图；

图3 表达产物的Tricine-SDS-PAGE分析；

图4 表达产物的Western Blot 鉴定；

图5纯化产物的Tricine-SDS-PAGE分析；

图6 松弛素前体的C肽切除的Tricine-SDS-PAGE分析；

图7 不同浓度重组松弛素对THP-1细胞的刺激活性。

五、具体实施方式：

这种人松弛素2前体使用AsnGlyPheAsnGly人工C肽将天然人松弛素2的B链和A链按B-C-A顺序连接，形成一种非天然人松弛素2前体结构，这种人松弛素2前体的氨基酸序列见序列1，命名为rhR2。

本发明人松弛素2前体的基因序列见序列2。

本发明人工C肽的氨基酸序列见序列表3。

实施例1：

在毕赤酵母中利用GAP1启动子表达人松弛素2前体（rhR2）及其C肽切除。

一、rhR2基因的合成和表达载体pGAPZα-rhR2的构建。

为了便于构建酵母表达载体，我们在rhR2基因上加入了XhoI、XbaI限制性酶切位点、终止密码，并在XhoI后加入了Kex2 切割位点，然后人工化学合成图2所示的基因序列，，将其连接到pUC-57克隆载体上，转化大肠杆菌DH5a感受态，经100μg/mL Amp+抗性LB平板筛选，获得阳性克隆；阳性克隆经100μg/mL Amp+抗性LB液体培养基过夜培养，然后使用质粒DNA小提试剂盒提取其重组质粒；重组质粒和pGAPZαA质粒分别经XhoⅠ和XbaⅠ双酶切，然后使用DNA凝胶回收试剂盒回收松弛素前体基因片段和pGAPZα载体片段，两个回收片段再经T4 DNA 连接酶于16℃连接10h；连接产物转化感受态大肠杆菌DH5a，经含25μg/mL Zeocin的低盐LB平板筛选阳性克隆，阳性克隆再经25μg/mL Zeocin低盐LB液体培养基培养，使用质粒DNA小提试剂盒提取重组表达质粒；我们将经测序正确的重组表达质粒命名为pGAPZα-rhR2。本发明中人工化学合成图2所示的基因序列的技术为公知技术。

二、转化筛选高表达的重组菌株。

5-10μg重组表达质粒pGAPZα-rhR2经Avr II限制性内切酶线性化后，电转化SMD1168菌株，经100μg/mL Zeocin YPD抗性平板初步筛选重组酵母，获得的重组酵母再经400μg/mL Zeocin YPD抗性平板复筛，将获得的高抗性重组酵母菌株接种于YPD培养基中，在30℃、260rmp/min、72h震荡培养后，离心取上清，经进行Tricine-SDS-PAGE电泳分析表达量，筛选出高效表达菌株，见图3，经Western Blot 分析，表达产物可与兔子抗人Relaxin-2抗体发生特异性结合，在相对分子质量约6500处可见特异性反应条带，见图4；我们将获得的最高表达量菌株命名为S-rhR2。表达量经测定达480μg/mL。

三、重组人人松弛素2前体的发酵、纯化及C肽切除。

1．种子液的准备。

重组酵母S-rhR2在YPD平板上划线分离，30℃倒置培养48h；提取单菌落，接种于50ml YPD培养液的250ml摇瓶中，30℃、260rmp/min、20h震荡培养；镜检酵母细胞形态正常无杂菌，2000rmp/min离心10min收集沉淀，按200ml YPD培养基1L的摇瓶中，30℃、260rmp/min、20h震荡培养，OD₆₀₀达到4-6时，镜检酵母细胞形态正常无杂菌，即可作为种子培养液。

2．增值及分泌表达。

将上述种子液接按1：10接种于已经灭绝的5L YPD罐培养基中，进行30℃发酵表达，通过调节搅拌转速、罐压、空气流量，使溶氧量不低于20%，并保持该状态发酵48h。

3．发酵液上清的获得及纯化。

发酵结束后，4000rmp/min离新15分钟，收集上清液。上清液经0.22μm滤膜过滤后，经截流分子量30000的膜超滤收集滤过液，再经截流分子量3000的膜超滤回收浓缩液，采用50 mmol/L Tris-HCl pH7.6洗涤超滤浓缩液2次，超滤浓缩组份上DEAE-FF柱，柱直径1.6cm，柱高10cm，洗脱液：50mmol/L Tris-HCl，1mol/L NaCl，pH7.6，流速：5mL/min，收集穿透组分，真空低温浓缩；经直径为1.0cm，高度为30cm的 Sephadex G-50进一步分离，用浓度10 mmol/L，pH7.6的PBS洗脱，流速：1mL/min，收集主洗脱峰，进行Tricine-SDS-PAGE检测，见图5。

4．松弛素2前体C肽的切除。

采用2mol/L pH8.0盐酸羟胺盐切割松弛素前体的C肽，42℃ 4h；然后使用截流分子量3000的透析袋在10 mmol/L PBS透析液中10℃搅拌透析12h，透析液的pH值为7.6，更换透析液4～5次。透析完成后，使用PEG20000包埋浓缩至一定体积，进行Tricine-SDS-PAGE检测，见图5，0.22μm膜过滤除菌，-20℃保存。图6中1为切除C肽的重组松弛素 2为重组松弛素2前体 3为Marker。

5．重组松弛素细胞活性的检测。

使用改良型RPMI1640培养基培养THP-1细胞，接种于96孔细胞培养板，每孔150μl （1×10⁵ cells/well），培养12h后，分别加入经培养基稀释切除C肽的重组松弛素（hR2），每孔20μl，PBS为空白对照，再分别加入50μmol/L IBMS和1μmol/L Forskolin，37℃ CO₂培养箱培养30min，离心移去培养基上清，经0.1mol/L HCl 裂解细胞，37℃ 30min，使用0.1mol/L NaOH进行中和后，经酶联免疫cAMP检测试剂盒检测各孔cAMP含量。切除C肽的重组松弛素具使THP-1细胞cAMP含量增加的有生物活性，未切除C肽的重组松弛素前体活性较低，见图7。图7中1 为空白对照，2为0.5 ng/mL的hR2， 3是1ng/mL hR2，4是5ng/mL的hR2, 5是5ng/mL hR2前体。

序列表1

<110> 郭德军

<120> 一种人松弛素2前体及其制备方法

<160> 3

<210> 1

<211> 58

<212> 氨基酸序列

<213> 人工序列

<400> 1

1 Asp Ser Trp MET Glu Glu Val Ile Lys Leu Cys Gly Arg Glu Leu

16 Val Arg Ala Gln Ile Ala Ile Cys Gly Met Ser Thr Trp Ser Asn

31 Gly Phe Asn Gly Gln Leu Tyr Ser Ala Leu Ala Asn Lys Cys Cys

46 His Val Gly Cys Thr Lys Arg Ser Leu Ala Arg Phe Cys

序列表2

<110> 郭德军

<120> 一种人松弛素2前体及其制备方法

<160> 3

<210> 2

<211> 174

<212> DNA序列

<213> 人工序列

<400> 2

1 GACTCTTGGA TGGAAGAAGT TATCAAGTTG TGTGGTAGAG AATTGGTTAG

51 AGCGCAAATC GCTATCTGTG GTATGTCTAC TTGGTCTAAC GGTTTCAACG

101 GTCAATTGTA CTCTGCTTTG GCTAACAAGT GTTGTCACGT TGGTTGTACT

151 AAGAGATCTT TGGCTAGATT CTGT

序列表3

<110> 郭德军

<120> 一种人松弛素2前体及其制备方法

<160> 3

<210> 3

<211> 5

<212> 氨基酸序列

<213> 人工序列

<400> 3

1 Asn Gly Phe Asn Gly

Claims

1.一种人松弛素2前体，其特征在于：这种人松弛素2前体使用AsnGlyPheAsnGly人工C肽将天然人松弛素2的B链和A链按B-C-A顺序连接，形成一种非天然人松弛素2前体结构，这种人松弛素2前体的氨基酸序列如序列表中的序列1表示，命名为rhR2。

2.根据权利要求1所述的人松弛素2前体，其特征在于：所述的人松弛素2前体的基因序列如序列表中的序列2表示。

3.一种权利要求1或2所述的人松弛素2前体的制备方法，其特征在于：利用基因重组技术，使用AsnGlyPheAsnGly人工C肽将天然人松弛素2的B链和A链按B-C-A顺序连接，形成一种非天然人松弛素2前体结构，再根据表达宿主密码子的偏爱性和该人松弛素2前体氨基酸一级序列，使用酵母偏爱密码子优化该蛋白基因，再通过人工合成该基因序列，然后插入到毕赤酵母表达载体，在毕赤酵母中实现该人松弛素2前体的分泌表达，并保持其天然N端结构。