CN101492675A - 用甲基营养酵母生产重组人表皮生长因子受体2胞内区的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及蛋白质的生产、纯化和鉴定方法，特别是涉及在巴斯德酵母中表达重组人her2/neu ICD，以及优化的大规模工业化发酵生产和纯化重组人her2/neu ICD的方法。

Description

用甲基营养酵母生产重组人表皮生长因子受体2胞内区的方法

发明领域

本发明涉及蛋白质的生产、纯化和鉴定方法，特别是涉及在巴斯德毕赤酵母中表达重组人表皮生长因子受体2胞内区(rhHER2/neu ICD)，以及优化的大规模工业化发酵生产重组人HER2/neu ICD的方法。

发明背景

Her2/neu基因编码分子量为185kDa的跨膜糖蛋白(P185)，P185是由1255个氨基酸组成的受体酪氨酸激酶，包括信号肽、胞外区、跨膜区和胞内区四个部分，信号肽位于氨基端，由21个氨基酸组成；胞外区是由632个氨基酸组成的富含半胱氨酸的配体结合功能区，它又由四个区域构成，包括采用β螺旋结构的L1、L2区和由富含L-半胱氨酸的EGF样折叠模式的S1、S2区，这些外功能区调节着HER2/neu与自身和EGF家族其他成员之间的二聚体化，启动HER2/neu信号转导和肿瘤发展；跨膜区是由22个氨基酸组成的强疏水区，使其能作为膜锚定区而使整个蛋白分子定位在胞膜上，胞内区为580个氨基酸组成的具有内在酪氨酸激酶活性的功能区，另外P185蛋白在羧基端还具有自身酪氨酸磷酸化位点。

HER2/neu在人体多种组织和器官有表达(Natali PG，et al.Expression ofthe p185 encoded by HER2 oncogene in normal and transformed human tissues.Int J Cancer，1990，45(3)：457-61.)，在接受生长因子的刺激后，HER2/neu介导细胞增殖的信号传导。许多种类人类肿瘤细胞表达高水平的HER2/neu(SlamonDJ，et al.Studies of the HER-2/neu proto-oncogene in human breast andovarian cancer.1989，244(4905)：707-12.)在大约20-30％的乳腺癌病人的乳腺癌细胞有HER2/neu的过度表达。在一些乳腺癌病人的血浆中可检出分泌型HER2/neu细胞外段(secretive HER2，sHER2)。乳腺癌细胞中的HER2/neu的过度表达和血浆中sHER2的检出均与乳腺癌的不良预后密切相关。这些乳腺癌病人有较短的无病生存期和存活期。研究发现，乳腺癌细胞中HER2/neu过度表达和肿瘤的恶性度正相关。过度表达HER2/neu的乳腺癌细胞可以获得不依赖于附着物的生长性质，这种性质使肿瘤细胞易发生转移。在动物模型中，过表达HER2/neu肿瘤细胞增强了致瘤性和转移的潜力，转染her2/neu基因小鼠能发生自发乳腺癌且形成的乳腺癌容易发生转移。

HER2/neu蛋白是肿瘤主动免疫治疗的理想靶点，因为HER2/neu蛋白与细胞恶性转化有关，是肿瘤病因学中一种生物相关蛋白。某些肿瘤病人存在HER2/neu特异性抗体或CTL，表明HER2/neu疫苗能诱导免疫反应。Manjili等人(ManjiliMH，et al.Development of a recombinant HSP110-HER-2/neu vaccine usingthe chaperoning properties of HSP110.Cancer Res.2002，62(6)：1737-1742.)已经利用热休克蛋白(heat shock protein，HSP)的分子佐剂性质发展了一个重组的HSP110-HER2疫苗。从肿瘤组织中纯化的HSPs有结合肿瘤特异性肽的优点，HSP能作为有效的疫苗来杀灭同一来源的肿瘤。这种疫苗的临床应用需要足够量的临床手术标本来纯化HSPs，因此限制了这种方法的应用。使用重组的HSP通过热休克和重组的肿瘤蛋白抗原结合制备类似肿瘤来源的HSPs可以克服这种缺陷。HSP110能有效地和大分子量蛋白结合，例如HER2通过热休克方法形成天然的HSP110和HER2胞内段的复合体。应用HSP110-ICD复合体免疫能激发ICD特异性的CD8+和CD4+T细胞反应。和单独应用ICD相比，HSP110-ICD显著地增强了ICD特异性的抗体反应，而且没有检测到抗HSP110的CD8+T细胞或抗体。使用HSP110制备大分子量蛋白的分子伴侣复合体的设计是以蛋白为靶点的肿瘤疫苗的新进展。

我们设计的肿瘤疫苗目的是通过特异性细胞毒效应(CTL)来治疗乳腺肿瘤。这种免疫治疗制剂是将人HSP110与HER2/neu ICD非共价偶联在一起，HER2/neu胞内区蛋白的相对分子量大，所含的抗原表位多，比抗原肽分子的免疫原性明显增强。因此HER2/neu胞内区蛋白经过抗原递呈细胞(APC)加工后，会提供更多的T细胞作用靶点，是一种有潜力的肿瘤蛋白疫苗。

虽然有人曾利用大肠杆菌系统成功地表达了HER2/neu ICD，但由于表达产物通常在宿主细胞内形成包涵体，所以致使产物的收率很低，或者纯化困难，易于污染内毒素，往往难于适应研究的需要。因此，有必要建立和发展重组表达和纯化HER2/neu ICD的方法，以便满足实验室研究的需求，并为肿瘤的治疗与预防大量提供这类免疫治疗制剂。

甲基营养酵母，特别是巴斯德毕赤酵母是已被深入研究的真核表达系统，并已被用于表达许多有用的蛋白质。例如，美国专利5,324,639公开了在甲基营养酵母特别是巴斯德毕赤酵母细胞中生产胰岛素样生长因子1的方法；美国专利5,330,901公开了使用巴斯德毕赤酵母系统表达人血清白蛋白的方法；美国专利5,965,389提供了在甲基营养酵母中表达L-谷氨酸脱羧酶(GAD65)的DNA构建体以及由之制备纯的GAD65的方法；美国专利公开了在巴斯德毕赤酵母中表达血小板衍生的细胞因子(PDGF)的方法；美国专利6,780,615描述了使用重组巴斯德毕赤酵母生产应乐果甜蛋白的方法。然而，迄今尚未见关于使用巴斯德毕赤酵母生产人HER2/neu ICD的报道。

发明目的

本发明的一个目的是提供一种使用甲基营养酵母生产重组人HER2/neu ICD多肽的方法，该方法包括在以甲醇为碳源和能源的培养基中培养甲基营养酵母，其中所说的甲基营养酵母是用包括下列可操作地连接的元件的DNA构建体转化的：(1)甲基可诱导的转录启动子；(2)编码her2/neu ICD的DNA片段；(3)转录终止子和(4)可选择标志，从而以至少100mg/L培养基的浓度生产HER2/neuICD多肽。

本发明的另一个目的是提供用于表达重组人HER2/neu ICD的甲基营养酵母，该酵母能够依靠甲醇作为碳源和能源生长，并且是被包括甲基可诱导的转录启动子、编码HER2/neu ICD的DNA片段、转录终止子和可选择标志的DNA构建体转化的。

本发明的再一个目的是提供用于在巴斯德毕赤酵母中表达重组人HER2/neuICD多肽的DNA构建体，该构建体包括可操作地连接的元件：甲基可诱导的转录启动子、编码her2/neu ICD的DNA片段、转录终止子和可选择标志。

本发明的再一个目的是提供使用巴斯德毕赤酵母大规模生产重组人HER2/neu ICD多肽的优化的发酵培养条件，特征在于其中发酵温度维持在28℃～30℃、所使用的pH值为4.4、发酵液的DO值(溶解氧)保持在25％～30％、并且培养基中添加有0.5％(W/V)的蛋白胨。

附图说明

图1以质粒PCMV(该质粒为包含人HER2/neu全长cDNA的真核表达质粒)为模板，PCR克隆人her2/neu ICD基因，产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳图。其中泳道1、2为her2/neu ICD PCR扩增产物，泳道3为DNA分子量标志物。

图2显示重组质粒pPICZα/her2/neu ICD转化酵母菌的PCR鉴定电泳图谱。其中泳道1是DNA分子量标志物；泳道2是空质粒载体转化的酵母菌基因组DNA的PCR产物；泳道3～8是不同酵母菌转化子基因组DNA的PCR扩增产物。

图3显示纯化的rhHER2/neu ICD的Western印迹分析结果。其中泳道1、2是本发明制备并纯化的rhHER2/neu ICD样品。

图4显示在不同pH值的培养基中诱导表达外源蛋白时的电泳图。泳道1、2、3、4分别为pH4.0、pH4.4、pH4.8、pH5.2时的表达上清。

图5显示纯化的rhHER2/neu ICD蛋白质的十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果。其中泳道1为纯化的rhHER2/neu ICD蛋白，泳道2为分子量为66KDa的蛋白标志物。

发明内容

本发明涉及蛋白质生产、纯化和鉴定方法，特别是涉及在巴斯德酵母中表达HER2/neu ICD的方法。

毕赤酵母表达宿主菌，于20世纪80年代初开发获得，大多数应用宿主菌是通过对野生型石油酵母Y-11430进行突变改造而来，也就是在组氨酸脱氢酶基因处有一突变，用于转化后的筛选。一般用于外源基因表达的巴斯德毕赤酵母菌株包括Y-11430、M-6100-3、GS115、KM71、SMD1168、X-33等。毕赤酵母中有两个基因编码乙醇氧化酶，即AOX1和AOX2。细胞中大多数的乙醇氧化酶是由AOX1编码的。甲醇高度调控和诱导AOX1基因的表达，在甲醇培养的细胞中，AOX1表达产物占可溶性蛋白总量的30％。而AOX2基因尽管与AOX 1基因同源性达97％，但表达量远低于AOX1基因。当AOX1基因缺失只存在AOX2基因时，大部分的乙醇氧化酶无法表达，细胞在甲醇培养基上生长缓慢，这种菌株表型为Muts(Methanol utilization slow)；相反地AOX1基因存在时，细胞利用甲醇能力强，在甲醇培养基上生长快，表型为Mut⁺(Methanol utilization plus)。本发明优选的是巴斯德毕赤酵母X-33菌株。X-33表达宿主菌由一个外源基因表达框和AOX1启动子、多克隆位点(MCS)和一个从AOX1基因上拷贝下来的终止序列(TT)组成。另外，本宿主菌还含有使外源基因能以替代或插入方式整合到染色体的AOX1部位的AOX13’非编码区序列。

用于本发明的巴斯德毕赤酵母X-33菌株含有典型高等真核生物的许多翻译后修饰功能。这些功能包括信号肽的加工、蛋白质折叠、二硫键的形成、O-及N-型糖基化和乙酰化等。其中，最重要和研究最多的是糖基化作用。蛋白质的糖基化链参与细胞识别、激素受体结合、蛋白质定位及宿主与微生物间相互作用。糖基化过程是经一系列剪接并产生由Mans-6-GluNAC2(高甘露糖型)组成的寡核糖的反应。巴斯德毕赤酵母能够将碳水化合物连接到分泌表达的外源蛋白质上。巴斯德毕赤酵母修饰糖链的平均长度为8～14个甘露糖，而且外链不含α-1，3甘露糖，所以其表达的糖蛋白特别适于治疗应用。

由于巴斯德毕赤酵母自身分泌的蛋白非常少，并且培养基中不含其他的蛋白质，这样分泌的外源蛋白占了培养液中总蛋白的绝大部分，因此十分有利于外源蛋白的分离和纯化。因此分泌表达外源蛋白是一种理想的方式。为了达到此目的，本发明优选的信号肽是α因子信号肽。α因子信号序列由87个氨基酸组成，来自于啤酒酵母(S.cerevsia)的α性成熟因子前导序列，并且已将这段序列编码的信号肽插入到巴斯德毕赤酵母的表达载体中。

巴斯德毕赤酵母表达载体可以是胞内表达的，也可以是分泌表达的。这些载体都包括一个由0.9kb的5’AOX1序列片段和约0.3kb的转录终止基因的3’序列组成的表达盒。分泌型表达载体可以是pPIC9、pPIC9k、pHIL-Sl、pPICZα、pYAM75P6E6等；胞内表达的载体可以是pHIL-D2、pA0815、pPIC3K、pPICZ、pHWOl0E121、pGAPZ、pGAPZα等。因此我们所以本发明优先选择分泌型、高拷贝标记和易操作的穿梭载体，特别是pPICZα作为HER2/neu ICD多肽的表达载体。本发明所使用的载体是由启动子、终止子、选择标记、报告基因、复制起点等元件构成。

表达载体均不含酵母复制原点，导入酵母内的重组表达载体只有和酵母染色体上的同源区发生重组，整合到染色体上，外源基因才能够稳定存在。本发明中，为了稳定地表达目的基因，可以在His或5’AOX1的单酶切位点将质粒载体线性化(SacI)，使之通过单交换整合到酵母细胞染色体中，从而得到表型为Mut⁺并具有高甲醇利用能力的转化子。另外由于在His位点整合时，染色体突变的His位点可与表达盒的HIS4基因位点之间发生基因交换会导致表达盒的丢失，故一般优先选择AOX1位点。

得到携带her2/neu ICD基因的重组表达载体后，可使用锂盐法、PEG法、原生质球法和电穿孔法等方法转化巴斯德毕赤酵母宿主细胞。其中，本发明优选的转化方法是电转移法(参见Sambrook，ed.Molecular Cloning：A LaboratoryManul(2nd.ed.)，Vols.1-3，Cold Spring Harbor Laboratory(1998))，因为其相对于其他转化方法最为方便、快捷，需要几个微克的质粒即可。

由于本发明中充分优化了溶解氧水平、通气量、发酵pH值、搅拌速率、营养补给等培养条件，所以可使酵母菌高密度生长，从而导致产物的高效表达。例如，在发酵罐培养条件下，本发明的重组HER2/neu ICD蛋白表达产量可达到500mg/L。

绝大多数情况下，巴斯德毕赤酵母(P.Pastoris)中整合多拷贝外源基因会提高重组蛋白表达产量，所以本发明优先选择分泌型、高拷贝标记和易操作的穿梭载体，特别是pPICZ α作为HER2/neu ICD蛋白的表达载体。

另外，由于在His位点整合时，染色体突变的His位点可与表达盒的HIS4基因位点之间发生基因交换会导致表达盒的丢失，故一般优先选择AOX1位点。

本发明中，发酵培养所使用的培养基可以是BMGY/BMMY、BMG/BMM、MGY/MMY等培养基，但优选的是成分中含有缓冲液的BMGY/BMMY或BMG/BMM培养基。

作为唯一的碳源和能源，甲醇的加入量一般为培养体积的0.5-1.0％(V/V)。

发酵培养过程中，可使用已知的方法检测由被转化细胞分离物所产生的HER2/neu ICD多肽含量，并从中选择有高产率的细胞分离物，用于放大生产。

本发明首次在酵母(毕赤酵母X-33)中高效分泌表达了HER2/neu ICD，建立了稳定的rhHER2/neu ICD毕赤酵母高效表达体系。与在大肠杆菌中的表达相比，本发明的方法具有如下特点：①表达体系稳定，含目的基因的表达盒通过同源重组整合进入酵母的染色体中，菌种稳定，不存在质粒丢失的问题；②有效的分泌表达，目的蛋白质的表达受醇氧化酶启动子的严格控制，可在甲醇诱导下启动表达并将表达产物分泌到培养基中，而且毕赤酵母本身的蛋白很少分泌到培养基中，使目的蛋白更易于纯化；③表达产量高，rhHER2/neu ICD在毕赤酵母中的摇瓶规模表达量可高达100mg/L，在发酵罐中大规模高密度发酵培养时可达到500mg/L；④不存在内毒素污染问题；⑤大规模发酵生产成本低。

在HER2/neu ICD纯化方面，目前大多采用DEAE阴离子交换层析或者亲和层析。众所周知，内毒素是由脂蛋白和多糖组成的，通常带有负电荷，而核酸也带负电荷，因此使用阴离子交换层析方法容易造成内毒素和核酸等杂质的污染。因为HER2/neu ICD的等电点约为5.3，所以本发明采用pH3.8条件下进行阳离子交换层析可很好的避免核酸和内毒素的污染。

本发明建立了在酵母中高效分泌表达rhHER2/neu ICD的方法，同时建立了阳离子交换层析技术纯化rhHER2/neu ICD产物的方法。使用SDS-PAGE、Western印迹分析证实按照本发明方法生产的rhHER2/neu ICD与天然HER2/neu ICD具有相同的理化性质，从而为进一步检测其体内外生物学活性提供了必要条件。

在以上研究的基础上，本发明进一步探讨了毕赤酵母工程菌大规模发酵(80L发酵罐)方法，优化了利用酵母菌大规模发酵产生rhHER2/neu ICD的条件，以及适合大规模生产的产物纯化方法。其中所使用的优化条件包括：发酵温度维持在28℃～30℃、所使用的pH值为4.4、发酵液的DO值(溶解氧)保持在25％～30％、并且培养基中添加有0.5％(W/V)的蛋白胨。

结果显示，本发明建立的毕赤酵母工程菌大规模发酵生产rhHER2/neu ICD的表达率约为500mg/L发酵液、产物回收率约为75％、产物的纯度达约85％。本发明的这些研究结果无疑将为重组人HER2/neu ICD的工业化生产和临床应用提供必要的基础。

具体实施方式

以下借助实施例描述本发明的最佳实施方式。这些实施例旨在进一步举例阐明本发明，而不是以任何方式限制本发明待批权利要求的范围。

实施例1：rhHER2/neu ICD毕赤酵母分泌型表达载体pPICZ α/her2/neu ICD的构建和宿主细胞转化

以质粒PCMV(包含人HER2/neu全长cDNA的真核表达质粒)为模板，采用PCR法克隆her2/neu ICD。上游引物：5’-TTACTCGAGAAGAGAAAGCGACGGCAGCAG-3’(SEQ ID NO：1)引入酵母α因子信号肽的部分序列和XhoI位点，并利用下游引物：5’-CTATCTAGATCACACTGGCACGTCCAGACC-3’(SEQ ID NO：2)引入XbaI位点。PCR条件为：94℃变性4min；94℃变性30s、58℃退火30s、72℃延伸2.5min 30个循环；72℃再延伸10min。对扩增产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳分析，观察片段大小，确定是否得到正确目的基因。PCR引入上述序列和酶切位点后，回收目的片段。用相应酶切后，连入用同样酶切后的质粒pPICZ α，构建毕赤酵母表达载体pPICZα/her2/neu ICD，然后转化大肠杆菌，提取质粒并进行酶切鉴定和DNA序列测定分析。核酸测序结果显示her2/neu ICD的第1483个碱基由g突变为c，氨基酸由丙氨酸Ala(gcc)突变为脯氨酸Pro(ccc)。

设计一对引物(SEQ ID NO：3)CACTCTGGAAAGGGCCAAGACTCTCTCCCC，(SEQ ID NO：4)GGGGAGAGAGTCTTGGCCCTTTCCAGAGTG将突变位点设计在引物上，按照两步PCR体外定点突变重叠延伸法进行.设计携带突变碱基的中间引物(NO：3，NO：4)分别与端引物(NO：1，NO：2)进行扩增第一步.取第一步扩增产物I，II做琼脂糖凝胶电泳分别进行回收，各取2μL互相作为模板，用端引物(NO：1，NO：2)在相同条件下再次进行PCR扩增。扩增片段上含有所需要的突变位点，最后经0.8％琼脂糖凝胶电泳回收的PCR产物与质粒pPICZ α分别经XhoI和XbaI酶消化，pPICZα的酶消化产物去磷酸化并经0.8％琼脂糖凝胶电泳回收特异片段，用T4DNA连接酶连接。

取测序正确的培养菌液，按质粒提取试剂盒说明书提取质粒DNA并用琼脂糖凝胶电泳法进行定量分析。取20～25μg pPICZα/her2/neu ICD重组质粒经SacI酶消化(线性化)后，用酚/氯仿抽提并用乙醇沉淀。线性化的质粒用10μl超纯水溶解后置冰上备用。

从毕赤酵母X-33的YPD阴性培养板上(不含抗生素的YPD琼脂平板)挑取单个菌落，接种于5ml YPD培养基中，250r/min，30℃震荡培养8小时，以常规制备酵母感受态细胞。

然后取80μl上述感受态菌，与20～25μg线性化的重组表达质粒混合，移入0.2cm电转化杯内进行电转化。取50～100μl转化后的菌液涂布于含Zeocin(100μg/ml)的YPD平板上，30℃培养箱培养2～3天，观察转化子的生长状况。然后用PCR方法(所使用引物和反应条件同上)筛选转化酵母菌。离心回收菌体后，以玻璃珠法提取酵母基因组DNA并进行PCR鉴定，鉴定结果如附图2所示。

实施例2：HER2/neu ICD蛋白的表达

取上述鉴定结果阳性的克隆接种于10ml BMGY(pH6.0)培养基中，30℃震荡培养24小时，至OD₆₀₀达到2.0～6.0时收集细胞。用等体积(10ml)BMMY(pH6.0)重悬细胞沉淀，30℃震荡培养，诱导表达。诱导过程中，每24小时补充一次甲醇至终浓度0.5％，同时补充灭菌超纯水，使发酵液总体积保持不变。在培养的第0、24、48、72、96和120小时等时间点各取0.5ml发酵液，离心取上清用于蛋白质分析(SDS-PAGE，Western Blot分析等)。

实施例3：HER2/neu ICD蛋白的理化性质鉴定

(1)SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)

用SDS-PAGE法进行蛋白质分子量测定和初步定量分析。方法如下：

配制10％分离胶5％浓缩胶。分别取第48小时培养物上清按4∶1比例加入5×SDS样品缓冲液，混匀后，煮沸3～5分钟。取上述样品，冷却至室温后，离心(10000r/min)30秒，取上清每孔加样20μl。40V电泳至浓缩胶与分离胶交界处，调整电压到100V，继续恒压电泳分离。考马斯亮蓝染色并脱色后，观察分析结果。

(2)表达产物的Western印迹分析

按照常规方法将发酵液上清经SDS-PAGE后，转印到硝酸纤维素(NC)膜上，室温干燥30～60分钟。将上述NC膜置于平皿中，加入20ml封闭液(含0.2％牛血清白蛋白(BSA)的TTBS(100mMTris 0.9％Nacl 0.1％Tween20))，室温轻轻振荡2～3小时或4℃封闭过夜。封闭结束后，将NC膜放入杂交袋中按0.1ml抗体溶液/cm²膜加入兔抗人HER2/neu ICD抗体，室温振荡1～4小时。膜用TTBS漂洗3～5次后，用抗体稀释液稀释辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体至1∶200～1∶1000，加入杂交袋中，与NC膜一起室温振荡2～4小时。加入1ml 0.3％(W/V)NiCl或CoCl₂及10μl 30％H₂O₂溶液。洗膜后，将膜移入显色液中，室温下轻轻摇动并观察显色反应。结果如附图3所示。

实施例4：HER2/neu ICD的大规模发酵制备及纯化

(1)最佳pH值的确定

选取表达量较高的rhHER2/neu ICD毕赤酵母工程菌，在10ml YPD培养基中30℃、250r/min震荡培养约24～36小时。分别取上述未加缓冲液的BMGY 8ml，按下示的量加入1mol/L Na₂HPO₄和0.5mol/L柠檬酸，以配制成不同pH值的BMGY。混匀后各加入1ml毕赤酵母工程菌，30℃、250r/min震荡培养约30小时，使其OD₆₀₀≈5。

pH值              1mol·L^-1Na₂HPO₄(μl)         0.5mol·L^-1柠檬酸(μl)

2.2               20                            980

2.4               62                            938

2.6               109                           891

2.8               158.5                         841.5

3.0               205.5                         794.5

3.2               247                           753

3.4               285                           715

3.6               322                           678

3.8               355                           645

4.0               385.5                         614.5

4.2               414                           586

4.4               441                           559

4.6               467.5                         532.5

4.8               493                           507

5.0               515                           485

5.2               536                           464

室温离心(3000r/min)5分钟，弃去上清，并在菌体沉淀物中加入不含缓冲液的BMMY 8ml。然后按如上所示的量加入1mol/L Na₂HPO₄和0.5mol/L柠檬酸，以配制成不同pH值的BMMY，30℃、250r/min震荡培养。诱导表达过程中，每24小时补充一次甲醇至终浓度0.5％，同时补充灭菌去离子水，使发酵液总体积保持不变。在培养的第0、24、48、72、96和120小时等时间点各取0.5ml发酵液，离心收集上清进行蛋白质定量分析(SDS-PAGE法)，结果如附图4所示。

(2)其他发酵条件的优化

1)将冻存的工程菌在YPD琼脂(含Zeocin 100μg/ml)板上30℃划线培养。至菌落直径达到2mm左右，挑取单克隆菌落加入到10ml YPD培养液(种子培养基)中，30℃、250r/min震荡培养16～24小时。然后将上述培养物加入到YPD培养液(2L)中，30℃、250r/min震荡培养约24小时，OD₆₀₀达到10左右。

2)生物量的积累

配制30L FM21培养基，加入80L发酵罐中，高压灭菌(121℃，30分钟)。待发酵罐内培养基冷却到室温时，用氨水调节FM21培养基的pH至所需数值，而后加入36.75ml PTM1微量元素混合物和13.5ml生物素贮备液。在发酵罐中加入2升上述培养的菌液，开始进行第一阶段发酵罐培养(即甘油培养扩增菌体阶段)。此阶段培养温度为30℃、搅拌速度500r/min，罐内压力10psi，DO值(溶解氧)维持在20％以上，必要时通入纯氧。在此阶段，每天至少取样2次，测OD₆₀₀和细胞湿重，分析酵母菌生长状态，肉眼和镜下观察菌液。排除杂菌污染，并留取上清用于蛋白分析。约24小时后DO值上升至接近100％，表明培养基中甘油已消耗殆尽。此时即转入补充甘油阶段，以进一步增加菌体密度。按照每升12ml PTM1微量元素的比例在高压灭菌后的50％甘油中加入PTM1微量元素。混匀后，将此混合物以18.2ml/h/L初始发酵液(即546ml/h)的速率加入到发酵罐中，至菌体湿重达到180～220g/L。DO值上升至接近100％后，继续维持“甘油饥饿”状态30分钟，然后进入甲醇诱导表达阶段。

3)甲醇诱导rhHER2/neu ICD的合成

按照12ml/L的比例，在甲醇中加入PTM1微量元素，混匀后，以3.6ml/h/L初始发酵液(即108ml/小时)的速率加入到发酵罐中诱导表达。维持此低速率2～3小时，以使酵母逐渐适应以甲醇为唯一碳源的成长环境。DO值由波动较大变为相对稳定后，继续维持此低速率并补加甲醇1小时。

然后加大补充甲醇的速率(7.2ml/h/L)，并将此速率维持2小时后将速率继续增加至10.9ml/h/L。同时，监测DO值和发酵液温度并判断甲醇是否过量。若停止补充甲醇后的DO值在1分钟内上升幅度大于10％，说明碳源受限，反之说明甲醇过量。在碳源受限的情况下，须加快补充甲醇的速率；如果甲醇过量则应调慢补甲醇的速率。

开始诱导表达后，每隔6小时取样，检测OD₆₀₀和细胞湿重，借以分析酵母菌的生长状态。此期间留取培养物上清，用于蛋白定量分析。连续诱导发酵72小时后，结束发酵。

(3)rhHER2/neu ICD的纯化

70L发酵液离心取上清，用冰醋酸调pH至3.8，添加NaAc-HAc缓冲液(终浓度为20mmol/L)和去离子水稀释后，通过预先用缓冲液A(20mmol/L NaAc-HAc，pH 3.8)平衡过的Sepharose SP阳离子交换柱。然后连续加样，加样后用3倍于柱体积的缓冲液A洗柱。用缓冲液B(20mmol/L NaAc-HAc加0.5mol/L NaCl，pH3.8)洗脱。洗脱液用3000(3K)中空纤维柱除盐和浓缩。

SDS-PAGE分析结果显示，如此纯化的rhher2/neu ICD至少达到电泳纯，且产物的的收率和纯度分别达到约75％和85％(参见附图5)。

(4)实验结果：

1)发酵液pH值对rhHER2/neu ICD发酵产量的影响：

观察了在大规模条件下pH值对rhHER2/neu ICD产率的影响，发现在pH值4.4条件下，发酵的第54小时表达量即达到最高峰。继续延长发酵时间，目的蛋白的表达量逐渐减少，杂蛋白条带增加。

2)溶解氧对rhHER2/neu ICD发酵表达产量的影响：

在发酵过程中，发酵液的DO值(溶解氧)应保持在25％～30％之间。溶解氧过高对rhHER2/neu ICD的表达没有任何有利的影响，反而会增加生产成本。

3)温度对rhHER2/neu ICD发酵表达产量的影响：

毕赤酵母的最佳生长温度为30℃，温度升高达到32℃对毕赤酵母是致命的。有时降低发酵温度可增加目的蛋白的产量。有报道称在甲醇诱导阶段，温度从30℃降至25℃，可使克隆到巴氏毕赤酵母中的半乳糖氧化酶的产量增加4倍。对于rhHER2/neu ICD，在28℃的温度下发酵取得了很好的效果。

4)甲醇流加速度对rhHER2/neu ICD发酵表达的影响：

虽然毕赤酵母可以以甲醇为唯一碳源生长增殖，但甲醇对毕赤酵母菌而言仍是一种有毒物质，因此其在培养基中的浓度一般不得高于2％。本研究发现，在流加甲醇进行诱导时，尽管在一定范围内目的蛋白质的表达量与甲醇消耗量呈正相关，但是甲醇的流加速度并非越快越好。就发酵表达rhHER2/neu ICD而言，以甲醇的最终流加速度为10.9ml/h/L初始发酵液体积为宜，甲醇流加速度过低会延长诱导时间，增加杂蛋白的污染；甲醇流加速度过高也会导致表达量下降和杂蛋白增加。

序列表

<110>吉林圣元科技有限责任公司

<120>用甲基营养酵母生产重组人表皮生长因子受体2胞内区的方法

<140>

<141>

<160>4

<210>1

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据特定核苷酸序列设计的用作构建表达载体的PCR扩增引物。

<400>1

TTACTCGAGA AGAGAAAGCG ACGGCAGCAG

<210>2

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据特定核苷酸序列设计的用作构建表达载体的PCR扩增引物。

<400>2

CTATCTAGAT CACACTGGCA CGTCCAGACC

<210>3

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据特定核苷酸序列设计的用作定点突变的PCR扩增引物。

<400>3

CACTCTGGAA AGGGCCAAGA CTCTCTCCCC

<210>4

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据特定核苷酸序列设计的用作定点突变的PCR扩增引物。

<400>4

GGGGAGAGAG TCTTGGCCCT TTCCAGAGTG

Claims (7)

1、一种使用甲基营养酵母生产重组人her2/neu ICD蛋白的方法，该方法包括：在以甲醇为碳源和能源的培养基中培养甲基营养酵母，其中所说的甲基营养酵母是用包括下列可操作地连接的元件的DNA构建体转化的：(1)甲基可诱导的转录启动子；(2)编码人her2/neu ICD的DNA片段；(3)转录终止子和(4)可选择标志，从而以至少100mg/L培养基的浓度得到重组人her2/neu ICD蛋白。

2、根据权利要求1的方法，其中所说的甲基营养酵母是巴斯德毕赤酵母，并且所说的甲基可诱导的启动子和转录终止子均来自巴斯德毕赤酵母AOX1基因。

3、用于表达重组人her2/neu ICD的甲基营养酵母培养物，该酵母能够依靠作为碳源和能源的甲醇生长，并且该酵母是被包括甲基可诱导的转录启动子、编码人her2/neu ICD的DNA片段、转录终止子和可选择标志的DNA构建体转化的。

4、用于在巴斯德毕赤酵母中表达重组人her2/neu ICD蛋白的DNA构建体，该构建体包括可操作地连接的元件：甲基可诱导的转录启动子、编码人her2/neuICD的DNA片段、转录终止子和可选择标志。

5、根据权利要求4的构建体，其中所说的甲基营养酵母是巴斯德毕赤酵母，并且甲基可诱导的启动子和转录终止子均来自巴斯德毕赤酵母AOX1基因。

6、使用巴斯德毕赤酵母大规模生产重组人her2/neu ICD蛋白的优化的发酵培养条件，特征在于其中发酵温度维持在28℃～30℃、所使用的pH值为4.4、发酵液的DO值(溶解氧)保持在25％～30％、并且培养基中添加有0.5％(W/V)的蛋白胨。

7、纯化her2/neu ICD的方法，特征在于使用阳离子交换层析技术分离。

Images