CN101492674A - 用甲基营养酵母生产人淀粉样蛋白Aβ1-42的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及蛋白质的生产、纯化和鉴定方法，特别是涉及在巴斯德酵母中表达重组人Aβ_1－42，以及优化的大规模工业化发酵生产和纯化重组人Aβ_1－42的方法。

Description

用甲基营养酵母生产人淀粉样蛋白Aβ1-42的方法

发明领域

本发明涉及蛋白质的生产、纯化和鉴定方法，特别是涉及在巴斯德酵母中表达重组人淀粉样蛋白(β-amyloid protein，Aβ_1-42)，以及优化的大规模工业化发酵生产重组人淀粉样蛋白Aβ_1-42的方法。

发明背景

老年痴呆症(Alzheimer′s disease，AD)，由德国学者Alosi Alzheimer于1907年首次提出，现已受到人们越来越多的重视。AD的主要病理特征是细胞外老年斑的形成和细胞内神经纤维缠结的集聚。虽然AD的发病机制至今未明，但目前普遍认为，老年斑的主要组成成分Aβ_1-42具神经元毒性，是AD的主要致病原因。Aβ是由它的前体-淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein，APP)经裂解而产生的。APP是一种跨膜多肽，由770个氨基酸组成，半衰期很短(在多种细胞中仅存留45-60分钟)，在APP由内质网分泌并转运至细胞膜的过程中可经历多种裂解，裂解产物最终释放至细胞外。APP裂解的两种方式，多数情况下，APP首先进行α裂解，产生可溶性大片段α-APP，并释放至细胞外，残留含83个氨基酸的羧基端片段(C83)；少数情况下，APP先进行β裂解，产生一个略小于α-APP片段的β-APP，残留含99个氨基酸的羧基端片段(C99)，之后，两种裂解产物C83和C99再经γ裂解产生P3和Aβ(可因不同的裂解部位而产生Aβ_1-40和Aβ_1-42)。在病理状况下，β裂解或γ裂解增强，产生高于生理浓度的Aβ(主要是Aβ_1-42)，Aβ_1-42肽是构成老年斑的基本成分，并在细胞外沉积形成老年斑。Aβ_1-42C端的10个氨基酸残基33～42及17～21的5个氨基酸残基具有高度的疏水性，构成了Aβ_1-42的疏水区；28～42氨基酸残基形成β-折叠构象的可能性较大，而9～21的氨基酸残基也可能形成β-折叠的构象。β-折叠的构象有利于Aβ_1-42肽的聚集而沉积形成老年斑。

由于缺乏合适的研究模型，目前人们对Aβ肽的分解代谢和Aβ肽的清除机理认识得还很不清楚，因而阻碍了治疗该疾病的有效药物的研究与开发。最近科学家们报道了与上述完全不同的治疗AD的研究方法，即用PDAPP转基因鼠做Aβ_1-42肽的免疫实验。科学家们把人工合成的Aβ_1-42分别注射到还未有AD病变特征的幼鼠和已有AD病变特征的老龄鼠体内，结果发现注射Aβ_1-42的幼鼠几乎阻止了β-淀粉样斑块的进一步生成；老龄鼠则非常显著地减轻了AD的症状。这是一个很有意义的发现，不仅意味着这种方法有可能同样应用于人类，而且人们有可能通过基因工程在人体内产生Aβ的抗体，从而阻止AD病的发生。

目前虽然有人曾利用大肠杆菌系统，成功地表达了Aβ_1-42，但由于表达产物通常在宿主细胞内形成包涵体，所以致使产物的收率很低，或者纯化困难，易于污染内毒素，往往难于适应研究和临床应用的需要。虽然也有研究者构建了真核系统表达载体pcDNA3.1并在COS-7细胞中进行了瞬时表达，但不能用于Aβ_1-42的大量制备。因此，有必要建立大量制备Aβ_1-42的体系，以便为其应用于动物模型，制备抗体，研究清除老年斑的作用机理及预防和治疗AD奠定基础。

甲基营养酵母，特别是巴斯德毕赤酵母是已被深入研究的真核表达系统，并已被用于表达许多有用的蛋白质。例如，美国专利5,324,639公开了在甲基营养酵母特别是巴斯德毕赤酵母细胞中生产胰岛素样生长因子1的方法；美国专利5,330,901公开了使用巴斯德毕赤酵母系统表达人血清白蛋白的方法；美国专利5,965,389提供了在甲基营养酵母中表达L-谷氨酸脱羧酶(GAD65)的DNA构建体以及由之制备纯的GAD65的方法；美国专利公开了在巴斯德毕赤酵母中表达血小板衍生的细胞因子(PDGF)的方法；美国专利6,780,615描述了使用重组巴斯德毕赤酵母生产应乐果甜蛋白的方法。然而，迄今尚未见关于使用巴斯德毕赤酵母生产人Aβ_1-42的报道。

发明目的

本发明的一个目的是提供一种使用甲基营养酵母生产重组人淀粉样蛋白(β-amyloid protein，Aβ_1-42)多肽的方法，该方法包括在以甲醇为碳源和能源的培养基中培养甲基营养酵母，其中所说的甲基营养酵母是用包括下列可操作地连接的元件的DNA构建体转化的：(1)甲基可诱导的转录启动子；(2)编码人淀粉样蛋白Aβ_1-42的DNA片段；(3)转录终止子和(4)可选择标志，从而以至少150mg/L培养基的浓度产生人Aβ_1-42多肽。

根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的甲基营养酵母是巴斯德毕赤酵母，并且所说的甲基可诱导的启动子和转录终止子均来自巴斯德毕赤酵母AOX1基因。

本发明的另一个目的是提供用于表达重组人淀粉样蛋白Aβ_1-42的甲基营养酵母，该酵母能够依靠作为碳源和能源的甲醇生长，并且是被包括甲基可诱导的转录启动子、编码人淀粉样蛋白Aβ_1-42的DNA片段、转录终止子和可选择标志的DNA构建体转化的。

根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的甲基营养酵母是巴斯德毕赤酵母，并且甲基可诱导的启动子和转录终止子均来自巴斯德毕赤酵母AOX1基因。

本发明的再一个目的是提供用于在巴斯德毕赤酵母中表达重组人淀粉样蛋白Aβ_1-42多肽的DNA构建体，该构建体包括可操作地连接的元件：甲基可诱导的转录启动子、编码人淀粉样蛋白Aβ_1-42的DNA片段、转录终止子和可选择标志。

根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的甲基营养酵母是巴斯德毕赤酵母，并且所说的甲基可诱导的启动子和转录终止子均来自巴斯德毕赤酵母AOX1基因。

本发明的再一个目的是提供使用巴斯德毕赤酵母大规模生产重组人淀粉样蛋白Aβ_1-42多肽的优化的发酵培养条件，特征在于其中发酵温度维持在28℃～30℃、所使用的pH值为3.5～5.0、发酵液的DO值(溶解氧)保持在20％～30％、并且培养基中添加有0.5％(W/V)的蛋白胨。

附图说明

图1显示合成的人Aβ_1-42DNA为模板的PCR电泳图谱。其中泳道1和2是PCR产物；泳道3是DNA分子量标志物。

图2显示重组质粒pPICZα/h Aβ_1-42转化酵母菌的PCR鉴定电泳图谱。其中泳道5和14是DNA分子量标志物；泳道20是空质粒载体转化的酵母菌基因组DNA的PCR产物；泳道1～4，6～13和15～19是不同酵母菌转化子基因组DNA的PCR扩增产物。

图3显示纯化的Aβ_1-42蛋白质的十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结果(考马斯亮蓝染色)。其中泳道1，2分别是纯化中分部收集的洗脱液；泳道3是空白对照；泳道4是6.5KDa分子量标准品。

图4显示纯化Aβ_1-42的Western印迹分析结果。其中泳道1是空白对照；泳道2～5是本发明制备并纯化的Aβ_1-42样品。

发明内容

本发明涉及蛋白质生产、纯化和鉴定方法，特别是涉及在巴斯德酵母中表达人淀粉样蛋白Aβ_1-42的方法。

巴斯德毕赤酵母(P.Pastoris)是20世纪80-90年代发展起来的极具潜力的酵母表达系统，由于其在蛋白质表达方面具有其它系统不可比拟的优点而得到越来越广泛的应用。

作为真核表达系统，巴斯德毕赤酵母具有许多其它蛋白表达系统所不具备的优点：①属于单细胞生物，故保留了易于操作和生长速度快的特点(可高密度发酵培养，在发酵罐中细胞干重可达130g/L以上)；②营养要求低，培养基成分简单，生产成本低，特别适用于工业化大规模生产；③通过同源重组，可将表达载体稳定地整合到宿主染色体中，连续传代中不易丢失；.④具有强有力的乙醇氧化酶基因(AOX)启动子，可严格调控外源基因的表达；⑤表达量高，许多蛋白的产率可达到每升克以上水平；⑥表达的蛋白质既可存在于胞内又可分泌至胞外，巴斯德毕赤酵母自身蛋白质的分泌量很低，十分有利于目的产物纯化；⑦作为真核表达系统，可对表达的蛋白进行翻译后的正确加工和修饰；⑧糖基化程度低。

毕赤酵母表达系统由一个外源基因表达框和AOX1启动子、多克隆位点(MCS)和一个从AOX1基因上拷贝下来的终止序列(TT)组成。同时，大多数载体都包含作为筛选标记的HIS4基因和为拷贝增殖而存在的序列(如ColEI复制起始点和抗氨苄青霉素基因)。另外，还含有使外源基因能以替代或插入方式整合到染色体的AOX1部位的AOX13’非编码区序列。本发明所使用的载体是由启动子、终止子、选择标记、报告基因、复制起点等元件构成。另外分泌型载体还需要有信号序列。

最常用的启动子是AOX1启动子，它的甲醇诱导性很强，因而它控制下的外源基因能得到较高的表达。细胞中绝大多数乙醇氧化酶活力是由AOX1提供的。当在以葡萄糖或甘油为碳源的培养基上生长时，AOX1转录受到抑制；而在以甲醇为唯一生长碳源时，则可诱导AOX1基因的转录和蛋白质表达。选择标记(HIS4)一般是对应于营养缺陷型受体的野生型基因。

巴斯德毕赤酵母自身分泌的蛋白质很少，所以分泌表达是一种理想的表达方式。同时，胞外表达更有利于蛋白质的提取和纯化。本发明优选的信号肽是α因子(αMF)。α因子信号序列由87个氨基酸组成，来自于啤酒酵母(S.cerevsia)的α性成熟因子前导序列，并且已将这段序列编码的信号肽插人到巴斯德毕赤酵母的表达载体中。

本发明的巴斯德毕赤酵母表达载体可以是胞内表达的，也可以是分泌表达的。这些载体都包括一个由0.9kb的5′AOX1序列片段和约0.3kb的转录终止基因的3′序列组成的表达盒。分泌型表达载体可以是pPIC9，pPIC9k、pHIL-Sl、pPICZα、pYAM75P6E6等；胞内表达的载体可以是pHIL-D2、pA0815、pPIC3K，pPICZ，pHWOl0E121，pGAPZ、pGAPZ α等。本发明优选的是pPICZ α。

一般用于外源基因表达的巴斯德毕赤酵母菌株包括Y-11430、M-6100-3、GS115、KM71、SMD1168等，本发明优选的是巴斯德毕赤酵母X-33菌株。

得到携带人Aβ_1-42基因的重组表达载体后，可使用锂盐法、PEG法、原生质球法和电穿孔法等方法转化巴斯德毕赤酵母宿主细胞。其中，本发明优选的转化方法是电穿孔法(如参见Sambrook，ed.Molecular Cloning：A Laboratory Manul(2nd.ed.)，Vols.1-3，Cold Spring Harbor Laboratory，1998)。

导入酵母体内的重组表达载体只有与酵母染色体上的同源区发生重组，整合到染色体上，外源基因才能够稳定存在并得以表达。本发明中，为了稳定地表达目的基因，可以在His或5′AOX1的单酶切位点将质粒载体线性化(Sac I)，使之通过单交换整合到酵母细胞染色体中，从而得到表型为Mut⁺并具有高甲醇利用能力的转化子。

用于本发明的巴斯德毕赤酵母含有典型高等真核生物的许多翻译后修饰功能。这些功能包括信号肽的加工、蛋白质折叠、二硫键的形成、O-及N-型糖基化和酰化等。其中，最重要和研究最多的是糖基化作用。蛋白质的糖基化链参与细胞识别、激素受体结合、蛋白质定位及宿主-微生物间相互作用。糖基化过程是经一系列剪接并产生由Mans-6-GluNAC2(高甘露糖型)组成的寡核糖的反应。巴斯德毕赤酵母能够将碳水化合物连接到分泌表达的外源蛋白质上。巴斯德毕赤酵母修饰糖链的平均长度为8～14甘露糖，而且外链不含α-1，3甘露糖，所以其表达的糖蛋白特别适于治疗应用。

由于本发明中充分优化了溶解氧水平、通气量、发酵pH值，搅拌速率、营养补给等培养条件，所以可使酵母菌高密度生长，从而导致产物的高效表达。例如，在发酵罐培养条件下，本发明的重组人淀粉样蛋白Aβ_1-42表达产率可达到300mg/L。

绝大多数情况下，巴斯德毕赤酵母(P.Pastoris)中整合多拷贝外源基因会提高重组蛋白表达产量，所以本发明优先选择分泌型、高拷贝标记和易操作的穿梭载体，特别是pPICZ α作为人淀粉样蛋白Aβ_1-42的表达载体。

另外，由于在His位点整合时，染色体突变的His位点可与表达盒的HIS4基因位点之间发生基因交换会导致表达盒的丢失，故一般优先选择AOX1位点。

本发明中，发酵培养所使用的培养基可以是BMGY/BMMY，BMG/BMM，MGY/MM等培养基，但优选的是成分中含有缓冲液的BMGY/BMMY或BMG/BMM培养基。

作为唯一的碳源和能源，甲醇的加入量一般为培养体积的0.5-1.0％(V/V)。

发酵培养过程中，可使用已知的方法检测由被转化细胞分离物所产生的人淀粉样蛋白Aβ_1-42含量，并从中选择有高产率的细胞分离物，用于放大生产。

可使用离子交换层析、疏水层析等方法分离并纯化所需的人淀粉样蛋白Aβ_1-42。

本发明首次在酵母(毕赤酵母X-33)中高效分泌表达了人淀粉样蛋白Aβ_1-42，建立了稳定的人淀粉样蛋白Aβ_1-42毕赤酵母高效表达体系。与在大肠杆菌中的表达相比，本发明的方法具有如下特点：①表达体系稳定，含目的基因的表达盒通过同源重组整合进入酵母的染色体中，菌种稳定，不存在质粒丢失的问题；②有效的分泌表达，目的蛋白质的表达受醇氧化酶启动子的严格控制，可在甲醇诱导下启动表达并将表达产物分泌到培养基中，而且毕赤酵母本身的蛋白很少分泌到培养基中，使目的蛋白更易于纯化；③表达产量高，人淀粉样蛋白Aβ_1-42在毕赤酵母中的摇瓶规模表达量可达200mg/L，在发酵罐中大规模高密度发酵培养时可达到300mg/L；④不存在内毒素污染问题；⑤大规模发酵生产成本低。

在人淀粉样蛋白Aβ_1-42纯化方面，本发明建立了联合使用阳离子交换层析和反相疏水层析技术纯化人淀粉样蛋白Aβ_1-42产物的方法。使用SDS-PAGE、Western印迹分析，证实按照本发明方法生产的人淀粉样蛋白Aβ_1-42具有与天然人淀粉样蛋白Aβ_1-42相同的分子质量和免疫反应性，从而为进一步检测其体内外生物学活性提供了必要条件。

在以上研究的基础上，本发明进一步探讨了毕赤酵母工程菌大规模发酵(80L发酵罐)方法，优化了利用酵母菌大规模发酵产生人淀粉样蛋白Aβ_1-42的条件，以及适合大规模生产的产物纯化方法。其中所使用的优化条件包括：发酵温度维持在28℃～30℃、所使用的pH值为3.5～5.0、发酵液的DO值(溶解氧)保持在20％～30％、并且培养基中添加有0.5％(W/V)的蛋白胨。

结果显示，本发明建立的毕赤酵母工程菌大规模发酵生产重组人淀粉样蛋白Aβ_1-42的表达率约为300mg/L发酵液、产物回收率约为60％、产物的纯度高达约95％。本发明的这些研究结果无疑将为重组人淀粉样蛋白Aβ_1-42的工业化生产和临床应用提供必要的基础。

具体实施方式

以下借助实施例描述本发明的最佳实施方式。这些实施例旨在进一步举例阐明本发明，而不是以任何方式限制本发明待批权利要求的范围。

实施例1：人淀粉样蛋白Aβ_1-42基因的获得和扩增

(1)人淀粉样蛋白Aβ_1-42DNA的制备：

人工合成的方法将编码人Aβ_1-42氨基酸的遗传密码子全部换成了酵母偏爱的密码子，具体序列如下：5’-GATGCTGAATTTAGACATGATTCTGGTTACGAAGTTCATCATCAGAAGTTGGTCTTCTTTGCTGAAGATGTTGGTTCTAACAAGGGTGCTATTATTGGTTTGATGGTTGGTGGTGTTGTTATTGCT-3’(SEQ ID NO.1)。

取如上DNA，按如下比例建立PCR反应体系50μl：

取上述合成的人Aβ_1-42DNA为模板1μl(2pmol/μl)；含Mg²⁺的10×PCR缓冲液5μl；dNTPs 2.5μl(各2.5mmol/L)；在5’端引入酵母α因子信号肽的部分序列，上游引物：5’-CGCCTCGAGAAGAGAGATGCTGAATTTAG-3’(SEQ ID NO.2)1μl(20pmol/μl)含XhoI酶切位点；下游引物：5’-CCACAACAATAACGAATTCTTAAGCGCGC-3’(SEQ ID NO.3)1μl(20pmol/μl)含EcoRI酶切位点；Pfu Taq酶0.3μl(5U/μl)；灭菌超纯水至终体积50μl。PCR反应条件是：94℃4分钟；94℃30秒，55℃30秒，72℃30秒，共30个循环，然后72℃5分钟。对扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳分析，观察片段大小，确定是否得到正确目的基因。如附图1所示。

(2)Aβ_1-42毕赤酵母分泌型表达载体pPICZα-hAβ_1-42的构建

回收PCR扩增的人淀粉样蛋白Aβ_1-42基因片段并进行1％琼脂糖凝胶电泳分析。而后，PCR扩增产物用XhoI和EcoRI酶切后，16℃连接过夜于用同样酶切的载体pPICZα上。连接反应体系包括：Aβ_1-42PCR产物0.1～0.3pmol；pPICZα载体0.03pmol；T4连接酶1μl；T4连接酶缓冲液1μl；灭菌超纯水至终体积10μl。

按照常规方法，从37℃培养16小时的XL₁-Blue阴性培养板上(不含抗生素的LB琼脂平板)挑取单个菌落(直径2～3mm)，接种于含有100ml LB培养基的1L培养瓶中，以制备感受态大肠杆菌细胞，并于-80℃冻存备用。

取一份冻存的感受态细胞融化后，加入上述连接产物，进行常规转化。然后取200μl已转化的感受态细胞涂布于含Zeocin(25μg/ml)的低盐LB琼脂平板上，37℃培养箱中培养12～16小时。

(3)重组载体的鉴定

随机挑取转化后的单菌落，接种于LB培养基中，37℃强烈震荡培养过夜，然后常规提取质粒DNA。取10μl溶解的DNA沉淀物进行琼脂糖凝胶电泳定量分析和酶切鉴定。37℃Afl II消化3小时，1％琼脂糖凝胶电泳后根据内切酶谱鉴定正确克隆。挑选酶切鉴定正确的克隆，提取质粒，用于DNA序列测定分析。

实施例2：pPICZα-hAβ_1-42转化毕赤酵母X-33

取测序正确的培养菌液，按质粒提取试剂盒说明书提取质粒DNA并用琼脂糖凝胶电泳法进行定量分析。取20～25μg pPICZα-hAβ_1-42，重组质粒经SacI酶消化(线性化)后，用酚/氯仿抽提并用乙醇沉淀。线性化的质粒用10μl超纯水溶解后置冰上备用。

从毕赤酵母X-33的YPD阴性培养板上(不含抗生素的YPD琼脂平板)挑取单个菌落，接种于5ml YPD培养基中，250rpm，30℃震荡培养8小时，以常规制备酵母电转化感受态细胞。

然后取80μl上述感受态菌，与20～25μg线性化的重组表达质粒混合，移入0.2cm电转化杯内进行电转化，而后加入1ml冰上预冷的1M无菌山梨醇，混匀后，30℃孵育1小时。取150μl转化后的菌液涂布于含Zeocin(100μg/ml)的YPD平板上，30℃培养箱培养2～3天，观察转化子的生长状况，并挑取17个克隆于YPD或BMGY培养液中，30℃震荡培养过夜。

取0.5ml培养物，离心回收菌体后，以玻璃珠法提取酵母基因组DNA并进行PCR鉴定筛选转化的酵母菌。所使用引物和反应条件同上，鉴定结果如附图2所示。

实施例3：重组人淀粉样蛋白Aβ_1-42的表达

取上述鉴定结果阳性的克隆接种于10ml BMGY(pH6.0)培养基中，30℃震荡培养24小时，至OD₆₀₀达到2.0～6.0时收集细胞。用等体积(10ml)BMMY(pH6.0)重悬细胞沉淀，30℃震荡培养，诱导表达。诱导过程中，每24小时补充一次甲醇至终浓度0.5％，同时补充灭菌超纯水，使发酵液总体积保持不变。在培养的第0、24、48、72、96、120、144和168小时等时间点各取0.5ml发酵液，离心取上清用于蛋白质分析(SDS-PAGE，Western Blot)。

实施例4：Aβ_1-42多肽的理化性质鉴定

(1)SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)

用SDS-PAGE法进行蛋白质分子量测定和初步定量分析。方法如下：

配制18％分离胶5％浓缩胶。分别取第48小时培养物上清按4∶1比例加入5×SDS样品缓冲液，混匀后，煮沸3～5分钟。取上述样品，冷却至室温后，离心(10000rpm)30秒，取上清每孔加样48μl。60V电泳至浓缩胶与分离胶交界处，调整电压到90V，继续恒压电泳分离。考马斯亮蓝染色并脱色后，观察分析结果。

(2)表达产物的Western印迹分析

按照常规方法将发酵液上清经SDS-PAGE后，转印到硝酸纤维素(NC)膜上，室温干燥30～60分钟。将上述NC膜置于平皿中，加入20ml封闭液(含0.2％BSA的TTBS)，室温轻轻振荡2～3小时或4℃封闭过夜。封闭结束后，将NC膜放入杂交袋中按0.1ml抗体溶液/cm²膜加入兔抗人Aβ_1-42抗体，室温振荡1～4小时。膜用TTBS漂洗3～5次后，用抗体稀释液稀释辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体至1∶200～1∶1000，加入杂交袋中，与NC膜一起室温振荡2～4小时。加入1ml 0.3％(W/V)NiCl或CoCl₂及10μl 30％H₂O₂溶液。洗膜后，将膜移入显色液中，室温下轻轻摇动并观察显色反应。结果如附图3所示。

实施例5：Aβ_1-42的大规模发酵制备及纯化

(1)最佳pH值的确定

选取表达量较高的Aβ_1-42毕赤酵母工程菌，在10ml YPD培养基中30℃、250rpm震荡培养约24～36小时。分别取上述未加缓冲液的BMGY 8ml，按下示的量加入不同的缓冲液，以配制成不同pH值的BMGY。混匀后各加入1ml毕赤酵母工程菌，30℃、250rpm震荡培养约30小时，使其OD₆₀₀≈5。

pH值              1mol·L^-1Na₂HPO₄(μl)      0.5mol·L^-1柠檬酸(μl)

2.8               158.5                      841.5

3.4               285                        715

4.0               385.5                      614.5

4.6               467.5                      532.5

5.2               536                        464

pH值              1mol·L^-1 Na₂HPO₄(μl)     1mol·L^-1NaH₂PO₄(μl)

5.8               79                         921

6.4               255                        745

7.0               577                        423

室温离心(3000rpm)5分钟，弃去上清，并在菌体沉淀物中加入不含缓冲液的BMMY 8ml。然后按如上所示的量加入不同的上述缓冲液，以配制成不同pH值的BMMY，30℃、250rpm震荡培养。诱导表达过程中，每24小时补充一次甲醇至终浓度0.5％，同时补充灭菌去离子水，使发酵液总体积保持不变。在培养的第0、24、48、72、96、120、144、168小时等时间点各取0.5ml发酵液，离心收集上清进行蛋白质定量分析(SDS-PAGE法)。

(2)其他发酵条件的优化

A)将冻存的工程菌在YPD琼脂(含Zeocin 100μg/ml)板上30℃划线培养。至菌落直径达到2mm左右，挑取单克隆菌落加入到10ml YPD培养液(种子培养基)中，30℃、250rpm震荡培养16～24小时。然后将上述培养物加入到YPD培养液(2L)中，30℃、250rpm震荡培养约24小时，OD₆₀₀达到10左右。

B)生物量的积累

配制40L FM21培养基，加入80L发酵罐中，高压灭菌(121℃，30分钟)。待发酵罐内培养基冷却到室温时，用氨水调节FM21培养基的pH至所需数值，而后加入173.6ml PTM1微量元素混合物和16ml生物素贮备液。在发酵罐中加入2升上述培养的菌液，开始进行第一阶段发酵罐培养(即甘油培养扩增菌体阶段)。此阶段培养温度为30℃、搅拌速度500rpm，罐内压力10psi，DO值(溶解氧)维持在20％以上，必要时通入纯氧。在此阶段，每6小时取样1次，测OD₆₀₀和细胞湿重，分析酵母菌生长状态，肉眼和镜下观察菌液。排除杂菌污染，并留取上清用于蛋白分析。约24小时后DO值上升至接近100％，表明培养基中甘油已消耗殆尽。此时即转入补充甘油阶段，以进一步增加菌体密度。按照每升12mlPTM1微量元素的比例在高压灭菌后的50％甘油中加入PTM1微量元素。混匀后，将此混合物以18.15ml/h/L初始发酵液(即726ml/h)的速率加入到发酵罐中，至菌体湿重达到180～220g/L。DO值上升至接近100％后，继续维持“甘油饥饿”状态30分钟，然后进入甲醇诱导表达阶段。

C)甲醇诱导Aβ_1-42的合成

按照12ml/L的比例，在甲醇中加入PTM1微量元素，混匀后，以3.6ml/h/L初始发酵液(即144ml/小时)的速率加入到发酵罐中诱导表达。维持此低速率2～3小时，以使酵母逐渐适应以甲醇为唯一碳源的成长环境。DO值由波动较大变为相对稳定后，继续维持此低速率并补加甲醇1小时。

然后加大补充甲醇的速率(7.2ml/h/L)，并将此速率维持2小时后将速率继续增加至11ml/h/L。同时，监测DO值和发酵液温度并判断甲醇是否过量。若停止补充甲醇后的DO值在1分钟内上升幅度大于10％，说明碳源受限，反之说明甲醇过量。在碳源受限的情况下，须加快补充甲醇的速率；如果甲醇过量则应调慢补甲醇的速率。

开始诱导表达后，每隔6小时取样，检测OD₆₀₀和细胞湿重，借以分析酵母菌的生长状态。此期间留取培养物上清，用于蛋白定量分析。连续诱导发酵48小时后，结束发酵。取各时间点的发酵液上清，进行SDS-PAGE分析。

实验结果：

1)发酵液pH值对Aβ_1-42发酵产量的影响：

为了选择发酵过程中最适pH，通过小试比较了不同pH对酵母生长以及Aβ_1-42表达的影响。分别在pH3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，6.5，7.0的条件下进行甲醇诱导表达。SDS-PAGE表明在pH4.0时，甲醇诱导48h表达量最高为150mg·L^-1，再延长发酵时间，上清液目的蛋白量不仅未增加反而减低，虽然小试时发现pH值4.5，5.0时表达量也较高，但其他杂蛋白量也高，而且Aβ_1-42的等电点为5.4。pH值3.0，3.5时，pH值太低不适合菌体扩增，因此，我们选择把pH4.0作为发酵液表达的pH，即可最大限度地保持Aβ_1-42分泌，同时又有利于控制杂菌污染和抑制蛋白水解酶的活性。

2)溶解氧对Aβ_1-42发酵表达产量的影响：

在发酵过程中，氧的供应是发酵的重要限制因素之一，发酵液的DO值(溶解氧)应保持在20％～30％之间。溶解氧过高对Aβ_1-42的表达没有任何有利的影响，反而会增加生产成本。

3)培养基成分对Aβ_1-42发酵表达产量的影响：

本实验比较了BSM培养基和FM21培养基，结果发现FM21比BSM培养基更适于发酵生产Aβ_1-42。而且，培养基中添加0.5％(W/V)的蛋白胨可使Aβ_1-42的表达量略有增加，特别是可使表达峰提前至甲醇诱导表达后的第30～36小时，且杂蛋白含量减少。

4)温度对Aβ_1-42发酵表达产量的影响：

毕赤酵母的最佳生长温度为30℃，温度升高达到32℃对毕赤酵母是致命的。有时降低发酵温度可增加目的蛋白的产量。有报道称在甲醇诱导阶段，温度从30℃降至25℃，可使克隆到巴氏毕赤酵母中的半乳糖氧化酶的产量增加4倍。对于Aβ_1-42，在28℃～30℃的温度下发酵取得了很好的效果。

5)甲醇流加速度对Aβ_1-42发酵表达的影响：

毕赤酵母虽然可以以甲醇为唯一碳源生长增殖，但甲醇对毕赤酵母菌而言仍是一种有毒物质，其在培养基中的浓度不可高于2％，否则对酵母菌将是致命的。甲醇可严格控制AOX1启动子，从而调控Aβ_1-42的表达。本研究发现在流加甲醇进行诱导时，尽管目的蛋白的表达量在一定范围内与消耗甲醇的量呈正相关，但是甲醇的流加速度并非欲快欲好，对发酵表达Aβ_1-42而言，甲醇最终的流加速度在8.5～9mL·h^-1·L^-1初始发酵液体积较为合适，过低会出现达到表达高峰所需诱导时间延长，杂蛋白增加；过高也会出现表达量下降杂蛋白增加。

(3)大规模纯化系统及纯化方法

将60L的发酵液离心，上清用1mol·L^-1NaOH调pH4.0。添加200mmol·L^-1的NaAc-HAc(pH4.0)缓冲液和去离子水将发酵液上清稀释3倍，NaAc-HAc终浓度为20mmol·L^-1。采用SP Sepharose XL阳离子交换柱，用5倍于柱床体积的缓冲液A(20mmol·L^-1NaAc-HAc，pH4.0)平衡。然后连续加样，待树脂饱和后用3倍于柱体积的缓冲液A洗柱。以缓冲液B(20mmol·L^-1 NaAc-HAc，1mol·L^-1NaCl pH4.0)洗脱，收集洗脱液。将洗脱液用Source^TM30RPC反相疏水层析柱除盐和浓缩。

SDS-PAGE分析确定纯化后的蛋白质的纯度和浓度，并用Bradford法精确定量。结果表明，经反相疏水层析和阳离子交换层析纯化后，Aβ_1-42蛋白质的收率约为60％，纯度可达95％以上。结果如附图4所示。

序列表

<110>吉林圣元科技有限公司

<120>用甲基营养酵母生产人淀粉样蛋白Aβ_1-42的方法

<140>

<141>

<160>3

<210>1

<211>126

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据特定氨基酸序列设计的编码核苷酸序列。

<400>1

GATGCTGAAT TTAGACATGA TTCTGGTTAC GAAGTTCATC ATCAGAAGTT

GGTCTTCTTT GCTGAAGATG TTGGTTCTAA CAAGGGTGCT ATTATTGGTT

TGATGGTTGG TGGTGTTGTT ATTGCT

<210>2

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据特定核苷酸序列设计的用作构建表达载体的PCR扩增引物。

<400>2

CGCCTCGAGA AGAGAGATGC TGAATTTAG

<210>3

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据特定核苷酸序列设计的用作构建表达载体的PCR扩增引物。

<400>3

CCACAACAAT AACGAATTCT TAAGCGCGC

Claims (7)

1.一种使用甲基营养酵母生产重组人Aβ_1-42蛋白的方法，该方法包括：在以甲醇为碳源和能源的培养基中培养甲基营养酵母，其中所说的甲基营养酵母是用包括下列可操作地连接的元件的DNA构建体转化的：(1)甲基可诱导的转录启动子；(2)编码人Aβ_1-42的DNA片段；(3)转录终止子和(4)可选择标志，从而以至少150mg/L培养基的浓度得到重组人Aβ_1-42蛋白。

2.根据权利要求1的方法，其中所说的甲基营养酵母是巴斯德毕赤酵母，并且所说的甲基可诱导的启动子和转录终止子均来自巴斯德毕赤酵母AOX1基因。

3.用于表达重组人Aβ_1-42的甲基营养酵母培养物，该酵母能够依靠作为碳源和能源的甲醇生长，并且该酵母是被包括甲基可诱导的转录启动子、编码人Aβ_1-42的DNA片段、转录终止子和可选择标志的DNA构建体转化的。

4.用于在巴斯德毕赤酵母中表达重组人Aβ_1-42蛋白的DNA构建体，该构建体包括可操作地连接的元件：甲基可诱导的转录启动子、编码人Aβ_1-42的DNA片段、转录终止子和可选择标志。

5.根据权利要求4的构建体，其中所说的甲基营养酵母是巴斯德毕赤酵母，并且甲基可诱导的启动子和转录终止子均来自巴斯德毕赤酵母AOX1基因。

6.使用巴斯德毕赤酵母大规模生产重组人Aβ_1-42蛋白的优化的发酵培养条件，特征在于其中发酵温度维持在28℃～30℃、所使用的pH值为4.0、发酵液的DO值(溶解氧)保持在20％～30％、并且培养基中添加有0.5％(W/V)的蛋白胨。

7.纯化Aβ_1-42的方法，特征在于使用阳离子交换和反相疏水层析技术分离。

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