CN111378635B - 一种共表达溶菌酶和木聚糖酶的方法、及制备作为替代抗生素的饲料添加剂的方法 - Google Patents

一种共表达溶菌酶和木聚糖酶的方法、及制备作为替代抗生素的饲料添加剂的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及农业生物技术领域，具体地，具体涉及一种共表达溶菌酶和木聚糖酶的方法、及制备作为替代抗生素的饲料添加剂的方法。所述方法包括在毕赤酵母中同时表达核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的溶菌酶酶基因和核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的木聚糖酶基因的步骤。根据本发明，经诱导表达后同时分泌表达木聚糖酶和溶菌酶两个蛋白，通过重组木聚糖酶的活力大小来判断溶菌酶产量的高低，快速筛选高表达溶菌酶的重组菌，表达产物可以被应用于饲料添加剂。

Description

一种共表达溶菌酶和木聚糖酶的方法、及制备作为替代抗生 素的饲料添加剂的方法
技术领域
本发明涉及农业生物技术领域，具体地，具体涉及一种共表达溶菌酶和木聚糖酶的方法、及制备作为替代抗生素的饲料添加剂的方法。
背景技术
溶菌酶(Lysozyme ,EC 3 .2 .1 .17)是一种作用于微生物细胞壁的水解酶，又称胞壁质酶(muramidase)或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶(N-acetylmuramideglycanohydrlase)，它属于碱性酶，能有效地水解致病菌中不溶性黏多糖为可溶性糖肽，其机制主要是通过水解N-乙酰胞壁酸(N-acetylmuramic acid)和N-乙酰葡萄糖胺(N-acetylglucosamine)之间的β-1 ,4糖苷键，使肽聚糖骨架结构断裂后造成细胞壁破裂，最终导致细菌溶解。溶菌酶还可与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。因此，溶菌酶具有抗菌、消炎、抗病毒等重要作用。
溶菌酶在自然界中来源广泛，可分为微生物、噬菌体、植物和动物四种类型的溶菌酶，其中动物溶菌酶活性高，应用广泛。溶菌酶的化学本质为蛋白质，在人及动物的胃肠内可以被消化、吸收，因此不会在体内残留且安全性很高，在食品、药品和饲料等行业具有广泛的应用前景。它在食品工业中可当作天然防腐剂，可延长肉制品、水产品、乳制品、果蔬等的储存时间；在药品领域具有抗病毒、抗感染、调节肠道菌群、止血及凝血等作用；在动物饲料工业上能提高动物的生产性能、调整动物肠道菌群、减少并替代抗生素的使用，是新型的环保饲料添加剂，同时也可以作为饲料防腐剂和杀菌剂，具有安全无毒等优点。
利用基因工程技术构建溶菌酶表达系统，可对溶菌酶进行异源表达和微生物发酵生产，已成为溶菌酶生产技术研究的热点。
发明内容
本发明的目的是提供共表达的溶菌酶和木聚糖酶蛋白。
本发明的再一目的是提供一种在毕赤酵母中同时高效表达饲用溶菌酶和木聚糖酶的方法。
本发明的再一目的是提供在毕赤酵母中同时高效表达饲用溶菌酶和木聚糖酶的工程菌。
根据本发明的在毕赤酵母中高效的表达溶菌酶和木聚糖酶的方法，所述方法包括在毕赤酵母中同时表达核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的溶菌酶基因和核苷酸序列如SEQID NO:2所示的木聚糖酶基因的步骤。
根据本发明的在毕赤酵母中高效的表达溶菌酶和木聚糖酶的方法，所述方法包括在毕赤酵母中表达核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的基因序列。
根据本发明的在毕赤酵母中高效的表达溶菌酶和木聚糖酶的重组表达载体，所述重组表达载体包括核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的溶菌酶基因和核苷酸序列如SEQ IDNO:2所示的木聚糖酶基因。
根据本发明的在毕赤酵母中高效的表达溶菌酶和木聚糖酶的重组表达载体，所述重组表达载体包括核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的基因序列。
在本发明的研究过程中发现，并非任意的木聚糖酶都能有效的带动溶菌酶的表达，使其免受宿主蛋白酶的攻击。因此，根据本发明的方法，为了提高融合蛋白的表达量，本发明最终确定将核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的溶菌酶基因与核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示木聚糖酶基因同时表达，该木聚糖酶带动溶菌酶的表达，使溶菌酶免受宿主蛋白酶的攻击，可以直接通过表达的重组木聚糖酶的活力大小来判断溶菌酶产量的高低，同时表达产物木聚糖酶和溶菌酶可以同时直接被应用于饲料。
在本发明的具体实施例中，所使用的溶菌酶为鸡蛋清来源的溶菌酶Lyz，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
根据本发明的方法，所述毕赤酵母表达载体可以是本领域公知公用或已知的，如载体pPIC9k。
在本发明的一具体实施例中，所使用的酸性木聚糖酶XylN，是从瘤胃真菌Neocallimastix patriciarum中克隆得到，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明提供的方法是将木聚糖酶和溶菌酶建成融合基因，使其属于同一个基因中。同时在融合蛋白之间引入酵母菌自身蛋白酶的酶切位点，在分泌表达融合基因时，将融合基因切割成单独的木聚糖酶和溶菌酶蛋白，表达上清中。本发明的优点主要有：第一、本发明将木聚糖酶与溶菌酶融合表达，可以提高溶菌酶的表达量；第二、本发明选择的木聚糖酶可以使溶菌酶免受宿主蛋白酶的攻击；第三、溶菌酶与木聚糖酶融合表达，也可以减少溶菌酶对宿主的毒害作用；第四、一分子的木聚糖酶就对应一分子的溶菌酶，这样就可以利用木聚糖酶的活性来指示溶菌酶的表达量，简化高表达菌株的筛选过程；第五、表达产物同时具有木聚糖酶的活性和抗菌活性，而这两种活性物质都可以直接用于饲料的添加。因此该方法一举多得，具有很好的应用前景。
附图说明
图1为根据本发明的具体实施方式的酸性木聚糖酶和溶菌酶融合基因的示意图。
图2为聚糖酶、溶菌酶融合表达载体示意图。
图3显示溶菌酶和木聚糖酶发酵酶活活性的测定结果。
图4显示发酵罐水平的SDS-PAGE电泳结果。
图5显示发酵液的抑菌圈实验结果
具体实施方式
溶菌酶酶活的测定方法，参考国家食品安全标准GB 1886 .257-2016。
酶活单位定义：将一个酶活单位(U)定义为25℃下，pH 6.2条件下，使溶壁微球菌悬浊液在450nm处每分钟引起吸光度变化为0 .001所需溶菌酶的量。
溶壁微球菌菌悬液的制备：取0.5g溶壁微球菌ATCC4698细胞用含0.372g/LEDTANa2的pH6.2、0 .1mol/L磷酸钠缓冲液制备50ml溶壁微球菌菌悬液，在使用前，将此菌悬液置于28℃恒温摇床中培养30min。此菌悬液在室温下可稳定2h，以含0.372g/L EDTANa2的pH6.2磷酸钠缓冲液调节分光光度计零点，测定溶壁微球菌菌悬液吸光值，450nm处的读数应为0.70±0 .1左右。
25℃室温下，将1cm比色皿放入分光光度计，用含0.372g/L EDTANa2的pH6.2磷酸盐缓冲液调整吸光度零点。吸取2.9mL溶壁微球菌菌悬液于比色皿，最初450nm处吸光度应为0.70±0.10，3min之内初始吸光度值变化应小于或等于0.003时，方可开始测定。吸取0.1mL待检测发酵液样品，加入溶壁微球菌菌悬液，充分混合制成试样溶液。记录3min吸光度值的变化，每15s记录一次吸光度值。每分钟吸光度值变化应在0.03-0.08，若不在要求范围需调整试样溶液的浓度。重复操作测定试样溶液。反应1min后稳定，计算时忽略最初1min的读数。
上述酶活力X结果的计算使用以下公式(1)进行计算：
X＝((A1-A2))/(2×v×0 .001) (1)式中：
A1——试样溶液在450nm处反应1min时的吸光度；
A2——试样溶液在450nm处反应3min时的吸光度；
v——用于分析的试样溶液中的试样体积，单位为毫升(mL)
2——获得1min和3min吸光度读数所用时间，单位为分钟(min)
0 .001——由单位溶菌酶每分钟所引起吸光度降低的值。
木聚糖酶酶活力测定采用DNS法。具体方法如下：在pH 5.5，50℃条件下，向试管中加入900μL 1%燕麦木聚糖底物，置于60℃水浴预先保温5min，加入100μL适当稀释的酶液，于60℃水浴准确保温10min，加入1.5mL DNS终止反应，沸水煮5min。冷却到室温后540nm测定OD值。1个酶活单位(U)定义为在给定的条件下每分钟释放出1 μmol还原糖的酶量。
DNS试剂：50g 3,5-二硝基水杨酸溶于4L水中，不断搅拌，缓缓加入80g NaOH，使之完全溶解，继续搅拌，将1500g酒石酸钾钠分数次少量加入，并小心加热，溶液最高温度不超高45℃。冷却至室温后定容至5L。如果溶液不澄清，用Whatman 1号滤纸过滤，然后棕色瓶室温贮藏。
根据本发明的具体实施方式，所使用的溶菌酶为鸡蛋清来源的溶菌酶LYZ，根据鸡蛋清来源的溶菌酶LYZ的前体序列，在溶菌酶成熟多肽氨基端添加酵母中Kex2的畏怯位点，KR序列和GGGGS五个氨基酸的Linker连接序列以及酸性木聚糖酶XylN的活性结构域序列，以所得到的新的氨基酸序列为模板，根据毕赤酵母密码子的偏爱性设计含有Kex2酶切位点和连接序列以及木聚糖酶XylN和LYZ的重组蛋白的基因序列，如SEQ ID NO.3所示，并送公司合成。
以pPIC9k为受体将木聚糖酶XylN-linker-KR-溶菌酶LYZ基因，通过EcoR I和NotI连接上去，得到融合表达载体pPIC9k-xyl-lyz，又因为在融合蛋白之间引入酵母菌自身蛋白酶的酶切位点Kex2，在分泌表达融合基因时，可以将融合蛋白切割成木聚糖酶和溶菌酶两种单独的酶。
融合表达载体pPIC9k-xyl-lyz用限制性内切酶Bgl II进行线性化后，利用电击法转化毕赤酵母，通过组氨酸营养缺陷型筛选转化子，进一步通过高浓度的G418筛选拷贝的转化。高拷贝转化子被接种到BMGY培养基培养48小时，再转移到诱导培养基BMMY进行诱导表达。通过木聚糖酶活性检测筛选高产木聚糖酶的转化子，并对高活性的转化子进行溶菌酶活性的测定。对挑选的高酶活的转化子15L发酵罐上进行高密度发酵，诱导7天后重组菌产溶菌酶的活性达到8万U/mL，木聚糖酶也有7万U/mL发酵液，同时表达的产物木聚糖酶和溶菌酶都可以直接被应用于饲料行业，能有效的减少抗生素的使用，提高动物生产性能。
实施例1:融合基因的合成
所使用的溶菌酶为鸡蛋清来源的溶菌酶LYZ，根据鸡蛋清来源的溶菌酶LYZ的序列，在溶菌酶成熟多肽氨基端添加酵母中Kex2的酶切位点（KR序列）和GGGGS五个氨基酸的Linker连接序列以及木聚糖酶XylN的活性结构域序列，以所得到的新的氨基酸序列为模板，设计含有Kex2酶切位点和连接序列以及木聚糖酶XylN和LYZ的重组蛋白的基因序列，如SEQ ID NO.3所示，并送公司合成。
并在融合基因两端设计添加限制性酶切位点EcoR I和Not I，用于连接pPIC9k载体。毕赤酵母的重组表达载体如图1所示。
实施例2: 融合基因xyl-lyz表达质粒载体的构建
以pPIC9k为受体将木聚糖酶XylN-linker-KR-溶菌酶LYZ基因，通过EcoR I和NotI连接上去，得到融合表达载体pPIC9k-xyl-lyz，又因为在融合蛋白之间引入酵母菌自身蛋白酶的酶切位点Kex2，在分泌表达融合基因时，可以将融合蛋白切割成木聚糖酶和溶菌酶两种单独的酶。并利用酶切验证的方法挑选出pPIC9k-xyl-lyz阳性克隆子，载体构建图谱如图2所示，进一步通过测序验证序列的正确性，用于下一步的转化。
实施例3:融合基因表达菌株的筛选
将实施例2构建的融合表达载体pPIC9k-xyl-lyz线性化，转化毕赤酵母感受态细胞，筛选转化子并诱导表达。
刮取MD平板上的菌落，采用无菌水进行10倍梯度稀释；将100μL不同稀释梯度的菌悬液，涂布到含有3.5g/L遗传霉素G418的YPD平板上，30℃培养48-72h，直至菌落出现，并对高G418抗性的单克隆，利用高浓度的G418液体培养基进行确认，最终筛选出能在3.5g/L遗传霉素G418的YPD培养基上快速生长的克隆子。
共筛选了20株能在3.5g/L遗传霉素G418的YPD培养基中快速生长的转化子，选取木聚糖酶酶活力最高的三个酵母菌6#、10#、和18#进行50 ml摇瓶水平的诱导表达，其木聚糖酶活性分别为503 U/ml，587 U/ml，和579 U/ml，将木聚糖酶最高的10#克隆子，进行高密度发酵研究。
实施例4、高密度发酵生产溶菌酶和木聚糖酶
通过摇瓶水平筛选得到的木聚糖酶活性高的10#克隆子，进行高密度发酵。高密度小试发酵是在实验室15L罐上进行的，具体流程如下：
高密度发酵过程分四个阶段：菌体培养阶段、碳源饲喂阶段、甘油-甲醇混合饲喂阶段、甲醇诱导表达阶段。在菌体生长阶段：种子液接种发酵培养基，利用初始碳源进行生长繁殖，当碳源消耗殆尽时；进入碳源饲喂阶段：再流加一定量的新鲜碳源(甘油)，使毕赤酵母进一步提高细胞密度；甘油-甲醇混合饲喂阶段：使用甲醇和甘油同时补料，让菌体慢慢适应甲醇，缓慢进行过度，减少甲醇对宿主的毒副作用；进入甲醇诱导培养阶段：甲醇流加速率随着诱导阶段以及罐中溶氧进行调整。在整个实验流程中不同时间点进行取样，测定菌体湿重以及检测溶菌酶酶活。
1. 菌体培养阶段
所述发酵培养基质量终浓度组成：26.7ml/L的85％磷酸，0.93g/L的硫酸钙，18.2g/L的硫酸钾，14.9g/L的MgSO 4·7H2O，4.13g/L的氢氧化钾，40g/L的甘油，4.35ml/LPTM1缓冲液，溶剂为去离子水，pH5.0；所述的甘油补料培养基组成：质量浓度25％甘油，12ml/L PTM1缓冲液；
按配方配置发酵培养基，充分溶解后定容7.5升移入15L发酵罐中，饱和蒸汽121℃灭菌20min后降温至30℃, 并按每升培养基加入4.37mL PTM1后接入种子液600ml, 种后料位约9.0 L，30℃通气搅拌培养18-22 h,培养过程中用氨水维持pH值5.0。
2. 碳源饲喂阶段
确认上一步糖耗完后， 开始此步骤。连续流加25%甘油(每升中含12mL PTM1), 流加量为36mL/h/L, 30℃培养3-5h,流加过程中pH用氨水维持在5.0, 溶氧维持在20%以上。此步结束时菌体湿重达到160-170g/L。
3. 甘油-甲醇混合饲喂阶段
流加25％甘油（质量体积比）:甲醇(8:1,v/v), 其中每升含12mL PTM1, 流加量为9mL/h/L, 30℃培养4h, pH用氨水维持在5.0。
4.甲醇诱导表达阶段
上步进行完毕进入甲醇诱导表达阶段,前2小时流加量为1.6 mL/h/L（诱导剂甲醇每升含12mL PTM1）, 后调整为3.2 mL/h/L在诱导过程中每24h取样一次测定表达的酶的积累量。在甲醇补料阶段完毕后，收取含溶菌酶和木聚糖酶的发酵液，整个发酵过程大概持续约160h，如图3所示，最终发酵液溶菌酶的活性达到8万U/mL，木聚糖酶的活性达到7万U/mL左右。如图4所示，发酵罐水平的SDS-PAGE电泳结果显示发酵液中包含溶菌酶蛋白和木聚糖酶蛋白。
实施例5、发酵液溶菌圈平板分析
采用溶菌圈平板法进一步检测溶菌酶的活性。将溶壁微球菌(Micrococcus muralolyticus) CICC10680接种在50 ml LB液体培养基中，37℃培养18h后，3000×g离心10min，弃去上清，收集细胞。将收集到的微球菌细胞进行一定比率的稀释，涂布于LB平板，并通过牛津杯添加不同诱导时间的发酵液上清，如图5所示，诱导表达的发酵液上清具有明显的抑菌活性，随着诱导时间的延长，抑菌圈也越大，结果表明重组表达的溶菌酶能够有效的抑制溶壁微球菌的生长，展现了与抗生素类似的效果。该结果与测定的溶菌酶活性也具有线性关系，同时发酵液上清含有木聚糖酶活性，木聚糖酶也是饲料中最常用的酶制剂之一，因此该溶菌酶在饲料工业的减抗和替抗中具有较好的应用前景。
实施例6、木聚糖酶XylN和溶菌酶Lyz单独在毕赤酵母中表达
将本发明使用的木聚糖酶XylN基因（SEQ ID NO.2），以及溶菌酶Lyz基因（SEQ IDNO.1）分别连接进入毕赤酵母表达载体pPIC9k中，转化毕赤酵母GS115宿主，并分别通过涂布到含有3.5g/L遗传霉素G418的YPD平板上进行高拷贝重组菌株的筛选。阳性克隆子在摇瓶水平进行筛选活性最高的克隆子，并分别对活性最高的克隆子在15L发酵罐中进行高密度发酵。发酵流程按照实施例4所描述的进行，高密度发酵诱导结束后，检测酶活，木聚糖酶XylN的酶活与融合蛋白发酵液中的木聚糖酶酶活基本相当，变化不显著，但单独表达时，溶菌酶Lyz的活性仅为2万U/mL发酵液，显著低于融合表达时发酵液中溶菌酶的活性。由此可见，融合表达时，溶菌酶的表达量由于木聚糖酶的带动作用，从2万U/mL，提升到8万U/mL，是单独表达活性的4倍，得到了显著的提升。因此融合表达更有利于溶菌酶Lyz的表达，具有显著的效果。
溶菌酶与木聚糖酶融合表达还具有更多的优点，如：可以利用木聚糖酶的活性来指示溶菌酶的表达量，简化高表达菌株的筛选过程；表达产物同时具有木聚糖酶的活性和抗菌活性，而这两种活性物质都可以直接用于饲料的添加；溶菌酶含有多个二硫键，木聚糖酶的快速分泌可以减少溶菌酶在内质网的停留，减少二硫键的错配。因此该方法一举多得，具有很好的应用前景。
以相同的方法将来源于橄榄绿链霉菌的高比活木聚糖酶基因 xynB 、编码枯草芽孢杆菌木聚糖酶 XYN 的基因分别与本申请所使用的溶菌酶基因融合，转化到毕赤酵母GS115 进行表达，在15L发酵罐中进行高密度发酵，检测发酵液酶活，溶菌酶Lyz的活性均低于单独表达时的活性，因此本申请的木聚糖酶XylN基因与溶菌酶Lyz基因协调表达，显著增加了溶菌酶的活性，进而实现以溶菌酶替代抗生素的目的。
序列表
<110> 中国农业科学院饲料研究所
<120> 一种共表达溶菌酶和木聚糖酶的方法、及制备作为替代抗生素的饲料添加剂的方法
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 387
<212> DNA
<213> 鸡蛋清(egg)
<400> 1
aaggtcttcg gtagatgtga gttggctgct gctatgaaga gacacggttt ggacaactac 60
agaggttact ccttgggtaa ctgggtttgt gctgctaagt tcgagtccaa cttcaacact 120
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gttggtaacg gtatgaacgc ttgggttgct tggagaaaca gatgtaaggg tactgacgtt 360
caggcttgga tcagaggttg tagattg 387
<210> 2
<211> 675
<212> DNA
<213> 瘤胃真菌(Neocallimastix patriciarum)
<400> 2
caaagtttct gtagttcagc ttctcactct ggacaaagtg taaaggtaac cggcaacaag 60
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ccaccaggtg attgggttgg taacaagaag catggttctt tcactattga tggtgctcaa 420
tacactgttt atgaaaacac tcgtactggt ccatctattg atggtgatac caccttcaat 480
caatacttta gtattcgtca acaagctcgt gattgtggta ccattgatat ttctgctcac 540
tttgatcaat gggaaaagct tggtatgact atgggtaaat tacatgaagc caaggtttta 600
ggtgaagccg gtaacgttaa cggtggtgcc agtggtaccg ctgatttccc atacgcaaag 660
gtttacattg gtgat 675
<210> 3
<211> 1118
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gaattccaaa gtttctgtag ttcagcttct cactctggac aaagtgtaaa ggtaaccggc 60
aacaaggttg gaactattgg tggtgttggt tacgaattat gggctgatag tggtaataac 120
agtgctactt tctattctga tggttccttc tcatgtactt tccaaaatgc tggggattac 180
ttatgtcgta gtggtctttc tttcgatagt actaagaccc catctcaaat tggtcgtatg 240
aaggctgatt tcaaacttgt caaacaaaat agttccaatg ttggttattc ctatgttggt 300
gtttacggtt ggactagaag tccacttgtc gaatactaca ttgtcgataa ttggcttagt 360
ccattcccac caggtgattg ggttggtaac aagaagcatg gttctttcac tattgatggt 420
gctcaataca ctgtttatga aaacactcgt actggtccat ctattgatgg tgataccacc 480
ttcaatcaat actttagtat tcgtcaacaa gctcgtgatt gtggtaccat tgatatttct 540
gctcactttg atcaatggga aaagcttggt atgactatgg gtaaattaca tgaagccaag 600
gttttaggtg aagccggtaa cgttaacggt ggtgccagtg gtaccgctga tttcccatac 660
gcaaaggttt acattggtga tggtggaggt ggttctctgg agaagagaga agctgaggct 720
aaggtcttcg gtagatgtga gttggctgct gctatgaaga gacacggttt ggacaactac 780
agaggttact ccttgggtaa ctgggtttgt gctgctaagt tcgagtccaa cttcaacact 840
caggctacaa acagaaacac tgacggttcc actgactacg gtatcttgca gatcaactcc 900
agatggtggt gtaacgacgg tagaactcca ggttccagaa acttgtgtaa catcccatgt 960
tccgctttgt tgtcctccga catcactgct tccgttaact gtgctaagaa gatcgtttcc 1020
gttggtaacg gtatgaacgc ttgggttgct tggagaaaca gatgtaaggg tactgacgtt 1080
caggcttgga tcagaggttg tagattgtaa gcggccgc 1118

Claims (5)

1.在毕赤酵母中表达溶菌酶和木聚糖酶的方法，其特征在于，所述方法包括在毕赤酵母中同时表达核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的溶菌酶基因和核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的木聚糖酶基因的步骤。
2.在毕赤酵母中表达溶菌酶和木聚糖酶的方法，其特征在于，所述方法包括在毕赤酵母中同时表达核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的木聚糖基因和溶菌酶基因融合序列的步骤。
3.在毕赤酵母中表达溶菌酶和木聚糖酶的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包括核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的溶菌酶基因和核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的木聚糖酶基因。
4.根据权利要求3所述的在毕赤酵母中表达溶菌酶和木聚糖酶的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包括核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的基因序列。
5.一种生物发酵制备溶菌酶的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
（1）在毕赤酵母中同时表达核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的木聚糖基因和溶菌酶基因融合序列；
（2）分离纯化溶菌酶。
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