FI116965B - Entsyymipohjainen lisäaine, sitä sisältävä eläinrehu sekä menetelmä entsyymipohjaisen lisäaineen valmistamiseksi - Google Patents

Entsyymipohjainen lisäaine, sitä sisältävä eläinrehu sekä menetelmä entsyymipohjaisen lisäaineen valmistamiseksi Download PDF

Info

Publication number
FI116965B
FI116965B FI953867A FI953867A FI116965B FI 116965 B FI116965 B FI 116965B FI 953867 A FI953867 A FI 953867A FI 953867 A FI953867 A FI 953867A FI 116965 B FI116965 B FI 116965B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
ser
thr
gly
asn
enzyme
Prior art date
Application number
FI953867A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI953867A (fi
FI953867A0 (fi
Inventor
Michael Ward
Kathleen A Clarkson
Edmund Larenas
Andrew John Morgan
Timothy Fowler
Michael Richard Bedford
Katherine D Collier
Original Assignee
Genencor Int
Finnfeeds Int Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=22617873&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=FI116965(B) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Genencor Int, Finnfeeds Int Ltd filed Critical Genencor Int
Publication of FI953867A0 publication Critical patent/FI953867A0/fi
Publication of FI953867A publication Critical patent/FI953867A/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI116965B publication Critical patent/FI116965B/fi

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
    • A23K20/10—Organic substances
    • A23K20/189—Enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2437—Cellulases (3.2.1.4; 3.2.1.74; 3.2.1.91; 3.2.1.150)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01004—Cellulase (3.2.1.4), i.e. endo-1,4-beta-glucanase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01021—Beta-glucosidase (3.2.1.21)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01091—Cellulose 1,4-beta-cellobiosidase (3.2.1.91)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Fodder In General (AREA)
  • Detergent Compositions (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
  • Bakery Products And Manufacturing Methods Therefor (AREA)
  • Meat, Egg Or Seafood Products (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

Entsyymipohjäinen lisäaine, sitä sisältävä eläin» menetelmä enteyymipohjaieen lisäaineen valmistamien
Keksintö koskee entsyymipohjaista rehun li; 5 ta ja erityisesti sellaista lisäainetta, joka voi tää viljapohjaisen rehun rehuhyötysuhdetta ja/tad sen sulavuutta.
Eläinrehuihin pyritään jatkuvasti saamaan parannuksia, joiden ansiosta eläimet kykenevät sul< 10 niitä entistä tehokkaammin. Yksi tärkeimmistä kysyi on rehun rehuhyötysuhteen (FCR, feed conversion ra· rantaminen lisäämättä rehun hintaa painoyksikköä FCR on syödyn rehumäärän suhde eläimen painonlis,
Pieni FCR tarkoittaa sitä, että kasvavalle eläime 15 nettu tietty rehumäärä tuottaa sitä suuremman pai: yksen mitä pienempi FCR on. Tämä tarkoittaa sit eläin kykenee käyttämään rehua hyväkseen tehokkaarra suuren FCR: n kyseessä ollessa. Sulavuuden lisääir yksi tapa, jolla rehun FCR:ää voidaan parantaa.
20 Rehun ravintoainekomponenttien, kuten sen ; män tärkkelyksen, rasvan, proteiinin ja aminohappo; lavuutta vähentävät useat erilaiset rajoittavat - ; Näitä rajoittavia tekijöitä ovat: ··* .V, (i) eläimen suolistossa olevien materiaali • ^ · · :ve 25 kositeetti. Tämä viskositeetti johtuu ainakin osal * * l l koisista ei-tärkkelyspolysakkarideista, kuten t< • · » liittyneistä seka-p-glukaaneista ja arabinoksylaane « * * (ii) ravinteiden pidättyminen rehun solunse erityisesti viljojen aleuronikerrosten solujen se: \:.5 30 Tämän pidättymisen syynä ovat suuret ei-tärkke! ··· ♦ Ψ __T_ 7 J · f - - * j_ · T » T * -I .
2 (iii) endogeenisen entsyymiaktiivisuuden joka koskee sekä eläintä että suoliston mikrobipoj ota varsinkin nuoressa eläimessä.
Edellä olevat sulavuuteen vaikuttavat ongeli 5 erityisesti havaittavissa viljapohjäiSten eläinra^ lioiden kyseessä ollessa ja erityisesti runsaast sisältävien eläinravintovalioiden kyseessä ollessa.
Rehusta peräisin olevien ravinteiden huone vuuden muodostaman ongelman takia on rehut eläinter 10 tovaatimusten täyttämiseksi tavallisesti tarpeelli; muloida melko runsaasti energiaa tuottavia mate] sisältäviksi rehuiksi. Tällaisia energiaa tuottavi riaaleja ovat tavanomaisesti tärkkelys, rasva, £ kuitu ja niin edelleen. Koska rehuun on tarpeellisl 15 tä näitä energiaa tuottavia materiaaleja tai näid teenä olevia materiaaleja, niin tästä aiheutuu huor suuri ylimääräinen kustannus, joka on taloudelliset naita epäedullinen piirre.
On tunnettua, että viljapohjaisten rehujer 20 sulavuuden ongelmaa on yritetty ratkaista li; eläinrehuihin entsyymilisäaineita, kuten β-gluke : tai ksylanaaseja. Esimerkiksi julkaisussa WO 91/04 • :1· kuvattu rehun lisäaine, joka on tarkoitettu siipi! ·** •V. esiintyvän ruoansulatuksen heikentymistä aihe * · 25 imeytymishäiriöoireyhtymän lievittämiseen. Lisäaine • Λ • tää yhtä sellulaasia ja yhtä ksylanaasia. JP-jull • · · 6 075 238 on kuvattu kotieläinrehu, jossa on käytet • · · • · 4 * teaasi-, sellulaasi-, amylaasi- ja lipaasiaktiivj sisältävää entsyymiseosta. Tässä kirjallisuusviite • · m *.:·1 30 spekuloitu, että nämä useat erilaiset entsyymiäkö i Hot· 1 -i -F a rmont r\i iri nn ττ\ λ UvaKi λλ Ira βττηη - 3 (esimerkiksi fosforihapolla turvotetun selluloosan; lysoimiseksi ja joista primäärisinä tuotteina syr disteitä, kuten glukoosia, sellobioosia ja oligosakkarideja. Kokosellulaasi koostuu useista 5 sista entsyymiryhmistä, joihin kuuluu eksosellob: laasiaktiivisuutta, endoglukanaasiaktiivisuutta glukosidaasiaktiivisuutta sisältäviä entsyymejä.
Esimerkiksi Trichoderma longibrachiatumin 1 kokosellulaasi sisältää kahta eksosellobiohydrt 10 CBHIrtä ja CBHIIitä, ainakin kolmea endogluk; EGI:tä, EGII:ta ja EGIII:a, ja yhtä β-glukosidaasii tava T. longibrachiatumista saatu fermentaatios< tuottaa kokosellulaasia, johon sisältyy 45 - 55 CBHIrtä, 13 - 15 paino-% CBHIIitä, 11 - 13 paino-% 15 8-10 paino-% EGIIrtä, 1-4 paino-% EGIIIrtä j 1 paino-% BG:tä proteiinien painon mukaan ilmoitetl kuitenkin huomattava, että tietyn spesifisen sei: komponentin todelliset konsentraatiot vaihtelevat tekijöiden, kuten fermentaatio-olosuhteiden, subsl 20 konsentraatioiden ja kantatyypin, mukaan. Siten edi sa fermentaatiossa Trichoderma longibrachiatum tuol • * • ··. kosellulaasia, jossa on 58 - 70 % sellobiohydrolaas : Kullakin T. longibrachiatumin endoglukane ·*·*· on omat toisista poikkeavat ominaisuutensa. Site • * 25 tiedetään sellulaasiaktiivisuutensa lisäksi hydro! • ; ksylaania. Tähän verrattuna ei EGII:ssa ja E( * * * esiinny merkittävää ksylanaasiaktiivisuutta ainaka • * 4 laisten tulosten mukaan, jotka on saatu käyttäen i PAGE:n päällä atsoksylaanikerrosta. EGI:n, EGII;n ; *···* 30 tiedetään lisäksi sisältävän rakenteellisesti ej * « *
·_ * Qöl 1 nl q i f mri s rlnmöanai ^ f rR-Hranöonö-i ITI
4
Julkaisussa WO 92/06 209 on kuvattu menete] choderma reesei -rihmasienen (tästä käytetään nimitystä "T. longibrachiatum") transformoimiseks menetelmät sisältävät vaiheita, joissa T, reesei 5 käsitellään olennaisesti homologisella lineaaris distelmä-DNA:11a homologisen transformaation mahc miseksi, minkä jälkeen tulokseksi saadut T. reesed formantit selektoidaan. On esimerkiksi kuvattu t mänttejä, joissa tietyt kohteeksi valitut geenit 10 toitu genomista tai niitä on vaurioitettu, ja tä taan on homologisen rekombinaation avulla liitett] jen natiivien geenien, kuten EGl:tä tai EGII:ta ke geenien, ylimääräisiä kopioita. Tässä kirjallis teessä on pantu merkille, että CBHI- ja CBHII-komf 15 en suhteen vaillinaisista kannoista saadut sellule tumukset ovat käyttökelpoisia detergenttipuhdis koostumuksen komponentteina. Nämä sellulaasikoos ovat luonnollisesti suhteellisen rikastettuja, kanaasien ja sellobiohydrolaasien katsotaan in vd 20 suhteissa käytettynä vaikuttavan synergistisesti s san hydrolyysissä pieniksi sello-oligosakkarideih asiassa sellobioosiksi), jotka hydrolysoituvat n .* .·. glukoosiksi β-glukosidaasin vaikutuksesta. Sen että endo-l,4-p-glukanaasi (EC 3.2.1.4) hydrolyse ' 25 loosan β-1-4-sidoksia, se hydrolysoi myös 1,3- • « * j ·* sisältävien β-glukaanien 1,4-sidoksia. Endogli • · · ί·ϊ ί vaikuttavat sisäisiin sidoksiin ja muodostavat se » · » V : siä, glukoosia ja sello-oligosakkarideja. Sellot laasit vaikuttavat selluloosapolymeerien ketj uj e 5,:i: 30 ja päätuotteena muodostuu sellobioosia.
·***· T. lonrfihr'ar'hia'hnmistta saa+rua knknssel 1 ui j 11 5 sellulaasit lisäävät ravintovalion useiden erilais ponenttien, mukaan lukien proteiinin ja aminoh sulavuutta. Tämä saa aikaan sen, että käyttökust voidaan vähentää rehujen tehokkuuden pienenemättä 5 erittymistä lantaan voidaan merkittävästi vähent vähentää tehokarjatalouden ympäristövaikutusta.
Ohran endospermin soluseinämät sisältäväl määrän suurimoolimassaisia vesiliukoisia ja t liittyneitä seka-β-(1,3)(1,4)-glukaaneja. Nämä po 10 ridit voivat solubilisoituneina lisätä liuoksen teettia. Jos esimerkiksi broilerikananpojille ohraa, niin viskositeetti niiden maha-suolikanavar la tulee suhteellisen suureksi, mikä johtaa sulam kuuden vähenemiseen ja kasvun pienenemiseen.
15 Sellulaasientsyymikomplekseja tuottavat ta tävät organismit ilmentävät myös usein ksylanaasi suutta. On esimerkiksi tunnistettu T. longibrac tuottamat kaksi erilaista ksylanaasientsyymiä. Jul sa WO 92/06 209 ja W0 93/24 621 on kuvattu yksityi 20 sesti näiden kahden eri ksylanaasin puhdistus, joi sesta käytetään nimitystä suuren pl-arvon ksylana män pl on noin 9,0) ja toista kutsutaan pienen . .·. ksylanaasiksi (tämän pl on noin 5,2), sekä näiden *·ϊ " ,V( kin ksylanaasigeenin kloonaus ja sekvensointi.
• · * ,1 l 25 dokumentin kuviossa 16 on esitetty sekä pientä ; * että suurta pl-arvoa vastaavan geenituotteen i · · : aminohapposekvenssi. Esimerkissä 22 on myös esite V * laisten T. longibrachiatum -kantojen kehi-ttäraine; ilmentävät normaalia voimakkaammin pienen pl-ari 30 lanaasin ja suuren pl-arvon ksylanaasin geenejä. i t Kuten edellä mainittiin, on sellulaasier 6 mainittu, voivat luonnossa esiintyvissä T. longibi -kannoissa esiintyvät CBH-molekyylit muodostaa paino-% sellulaasiproteiineista.
Tämä keksintö perustuu tutkimukseen, joss 5 tiin tunnistamaan ne sellulaasiproteiinien komj jotka kykenevät parantamaan viljapohjaisten rehujt ohraa sisältävien rehujen, hyödyllisiä ravitsemus ominaisuuksia. Erityistä huomiota kiinnitettiin ke laasin sisältämien yksittäisten entsyymien vaikut* 10 erityisesti niihin endoglukanaasien vaikutuksii: pienentävät ohran liukoisten toisiinsa liittyvier (1,3)(1,4)-glukaanien viskositeettia. Perusteena että tämän tiedetään olevan yksi kokosellulaasin mistä vaikutustavoista. Tämä keksintö on tulos 15 tutkimuksesta, jonka tarkoituksena oli tunnistaa i fiset seilulaasientsyymijärjestelmän komponenti saavat aikaan viljapohjaisen rehun rehuhyötysuhte paranemisen ja/tai rehun sulavuuden lisääntymisen vät hyödylliset ominaisuudet, sekä näiden kompc 20 suhteelliset määrät.
Seuraavaksi on määritelty joitakin sei patenttiselityksessä ja patenttivaatimuksessa käj • ·· teknisistä termeistä.
• · · • · » 1*1' "Sienten sellulaasi" tarkoittaa entsyymike ,1 ‘ 25 ta, joka on peräisin sienilähtömateriaaleista ta * * * j ·" organismeista, joita on muokattu geneettisesti sil ··· · ne sisältävät ja ilmentävät kaikkia sienilähtömate • · · V : ta saaduista sellulaasigeeneistä tai osaa näistä.
Termi "Trichoderma" tarkoittaa mitä tahans ίβ|βϊ 30 kantaa, joka on luokiteltu tai joka on aikaisemmi :’**· teltu Trichodermaksi tai ioka nvkvisin luofc 7 tai EGV:tä, tai mitä tahansa tällaisen endoglu johdannaista, jossa on endoglukanaasiaktilvisuutt EG-" johdannaiseen" kuuluu esimerkiksi Trich ta peräisin olevaa sellainen EGI, EGII, EGI11 5 jossa EG:n jompaan kumpaan tai molempaan C- ja N-t lisistä päistä on lisätty yksi tai useampi ami jossa EG-molekyylissä on tämän yhdessä tai useamme dassa korvattu yksi tai useampi aminohappo, jo; jommasta kummassa tai molemmista päistä on poiste 10 tai useampi aminohappo tai jossa yhteen tai u EG:ssa olevaan kohtaan on liitetty yksi tai useana happo siten, että valmistetussa EG-johdannaisess endoglukanaasiaktiivisuus säilynyt. Termi EG"-jc nen" sisältää myös sellaiset endoglukanaasier 15 ydindomeenit, joihin on liittynyt yksi tai kytkijäalueelta peräisin oleva aminohappo.
Termi "typistetty sellulaasi" tarkoittaa ti sinnössä proteiinia, joka sisältää eksosellobiohyd tai endoglukanaasin, esimerkiksi EGI:n, EGII:n 20 CBHI:n tai CBHll:n tai minkä tahansa näiden johde typistetyn sellulaasiytimen, EGV on kuvattu j Molecular Microbiology 13(2) ¢1994) sivuilla 21 • «* | <.i Kuten edellä mainittiin, monien sellulaasientsyyir * * * ten EGI:n, EGII:n ja EGV:n, arvellaan olevan bifur • » » ,* * 25 lisiä siinä mielessä, että ne sisältävät alueita • · · | ·* meeneja, jotka tuottavat sekä selluloosasubst • · 2*2 2 hydrolyyttisesti eli katalyyttisesti vaikuttavan I·· V: suuden että myöskin selluloosaa sitovan ei-katal aktiivisuuden. Siten typistetty sellulaasi on sei 30 josta puuttuu sitovan domeenin selluloosaa sitova ·**'« suus.
8 tehokkaasti. Lisäksi sellulaasin katalyyttisen akt den ja selluloosaa sitovan aktiivisuuden voidaan vastaavan spesifisiä erillisiä rakennealueita tai vat sijaita samalla rakennealueella. Kuten edellä 5 tiin, useiden sellulaasientsyymien, joita ovat longibrachiatumista peräisin olevat entsyymit, t sisältävän esimerkiksi katalyyttisen ydindomeeni kön, joka liittyy kytkijäalueen välityksellä sei sitovan domeenin muodostamaan alayksikköön. Muide 10 laasientsyymien arvellaan kuitenkin sisältävän ra lisesti selluloosaa sitovaan domeeniin kuuluvan ttisen ydindomeenin ja nämä kaksi aluetta eivät merkiksi kytkijäjakson erottamia eivätkä edusta e rakenteellisia kokonaisuuksia. Tällaisessa sellul 15 syymissä olevan selluloosaa sitovan aktiivisuude laan johtuvan spesifisestä peptidistä tai Jouko
laista peptidiä muistuttavia aminohapporyhmiä. T
kaisesti tämän keksinnön suojapiiriin kuuluu, e laista sitovaa domeenia kyettäisiin muuttamaan esi 20 geneettistä muokkausta tai kemiallista modifi käyttäen sellaiseksi, että se vähentää sellulaasi :*, loosaa sitovaa aktiivisuutta.
! * * , .·. "Typistetty sellulaasi johdannainen" sisält I · * keksinnössä määritellyn typistetyn sellulaasin y • ► ; 25 jossa voi olla yhden tai useamman aminohapon li • · · j \ poisto, joka on tehty typistetyn sellulaasin jomp * · · paan tai molempaan C- ja N-terminaalisista päi: V · yhden tai useamman aminohapon korvaus, lisääm: poisto, joka on tehty yhteen tai useampaan kohtas !#*βϊ 30 tetyssä sellulaasissa. Johdannaisia tulkitaan ole\ !***; toituneet muodot* 1otka ovat ovsvneet luonteeltaar 9 meenit, joihin on liittynyt yksi tai useampi kyt eilta peräisin oleva aminohappo.
Typistetty sellulaasijohdannainen tarkoitta si proteiinia, joka rakenteeltaan ja biologiselta 5 suudeltaan muistuttaa huomattavassa määrin typ sellulaasiydindomeeniproteiinia mutta jota on geneettisesti aminohapposekvenssiltään muokatuk teiiniksi. Edellyttäen, että näiden kahden protei tiivisuudet ovat samanlaiset, niiden katsotaan si 10 van "johdannaisia" siinä merkityksessä kuin tätä t käytetty tässä keksinnössä vaikka toisen proteii maarirakenteen aminohapposekvenssi ei olisikaan id toisessa proteiinissa esiintyvän sekvenssin suhte
Typistetyn sellulaasijohdannaisen ajatella* 15 olla peräisin DNA-fragmentista, joka koodaa sella pistettyä katalyyttistä ydinosadomeenia, joka lis sältää DNA-fragmentin sisälle sijoittuvan tai 5?- puoleiseen päähän liitetyn yhden tai useamman nuk suuruisen lisäyksen, DNA-fragmentin sisälle tai 20 3'-päähän sijoittuvan yhden tai useamman nukleoti ruisen poiston, tai DNA-fragmentin sisälle tai 5'- :\>e päähän sijoittuvan yhden tai useamman nukleotidin . .·. sen korvauksen, jossa katalyyttisen ydinosadomee * · VI ^ pistetyn sellulaasijohdannaisen) toiminnallinen V.l* 25 suus on säilynyt. Tällainen DNA-fragmentti ("DNA-• · l ·* tin variantti"), joka käsittää sellulaasin katal *··β· ydinosan, voi lisäksi sisältää kytkijäsekvenssin t V : na-DNA-sekvenssin tai tämän osan, joka on kiin ydinosan tai sitovan domeenin DNA-sekvenssin joko 30 3'-päähän, jossa sekvenssin koodaaman typistetyn s sin ydinosadomeenin (typistetyn sellulaasi johda
1G
glukanaasin, esimerkiksi EGI:n, EGII;n tai EGIJ tämän johdannaisen, katalyyttisen ydinosadomee alueen, joka kykenee pilkkomaan entsymaattisesti loosapolymeereja, joita ovat mainittuihin kuitenj 5 joittumatta selluloosamassa tai fosforihapolla tu selluloosa. Typistetyssä sellulaasin ydinosassa kuitenkaan selluloosaa sitovaa aktiivisuutta, j katsottava johtuvan selluloosaa sitovasta domeen. alueesta. Typistetty sellulaasiydinosa on erote 10 typistämättömästä sellulaasista sen perusteella, e sä ei kokonaisena ole mitään selluloosaa sisältävä nia eikä aluetta. Typistetty sellulaasiydinosa vo tää muita kokonaisuuksia, jotka eivät sisällä sei sitovasta domeenista tai alueesta johtuvaa sei 15 sitovaa aktiivisuutta. Tässä ajatellaan erityises kyylissä olevaa kytkijä- tai sarana-aluetta. Sam voin ajatellaan toisen entsymaattisen kokonaisuude liitetty kovalenttisesti typistettyyn sellulaasiyd Typistetyn katalyyttisen ydinosan tai tämän 20 naisen sisältävän proteiinin tehokkuus (tai akti voidaan määrittää tällä alalla tunnetuilla menet :·. (Tätä on käsitelty julkaisussa Wood, T.M., et ai . ,·. sessa Methods in Enzymology 160, toim. : Wood, # · t
Kellogg, S.T., Academic Press, pp. 87 - 116, 198 • · .
* 25 aktiivisuudet voidaan määrittää esimerkiksi hydrol • * · ; ·* la fosforihapolla turvotettua selluloosaa ja/tai 1 i * * ··· · oligosakkarideja ja kvantitoimalla vapautuneet pel • · * : sokerit. Tässä tapauksessa sellobiohydrolaasin ti glukanaasin sellulaasiydinosadomeenien tai näiden 30 naisten vaikutuksesta vapautuneet liukoiset sokeri voidaan havaita HPLC-analyysilla tai käyttämällä p 4 11 loin kuin nämä kummatkin on määritetty samanlaisi suhteissa ja käytetty samanlaisia annoksia perus manlaisiin katalyyttisen domeenin proteiinin määr
Termi "selluloosaa sitova domeeni" tarkoitt 5 glukanaasin aminohapposekvenssiä, joka sisältää kanaasin, esimerkiksi EGl:n tai EGII:n, sitovan <3 joka sitoutuu ei-kovalenttisesti polysakkaridiii
selluloosaan. Selluloosaa sitovien domeenien (CE
it), arvellaan toimivan endoglukanaasientsyymin k 10 tisestä ydinosasta riippumattomasti ja kiinnittä teiinin selluloosaan. Tässä keksinnössä käytetyist tetyistä endoglukanaaseista puuttuu CBD, mutta n tävät ainakin ytimen eli katalyyttisen domeenin.
Termi "kytkijäalue" tai "sarana-alue" ta 15 lyhyttä peptidialuetta, joka liittää yhteen sient glukanaasien kaksi erillistä toiminnallista domeer sin sanoen ydinosadomeenin ja sitovan domeenin. Ί brachiatumin sellulaaseissa nämä domeenit liittyvä dillä, jossa esiintyy runsaasti Ser:ää, Thr:ää ja 20 "Signaalisekvenssi” tarkoittaa mitä tahai teiinin N-terminaaliseen osaan liittyvää aminot venssiä, joka edistää proteiinin kypsän muodon eri . ,·. solun ulkopuolelle. Tämä signaali sekvenssin määri ♦ · · toiminnollinen määritelmä. Solunulkoisen proteii • · · AI 25 sästä muodosta puuttuu signaali sekvenssi, joka pi S s * * pois erittymisen aikana.
• I t ··/"· Termi " isäntäsolu" tarkoittaa sekä Trie '·* * soluista valmistettuja soluja että näistä valmi protoplastej a.
30 Termi "DNA-konstruktio tai -vektori" (näitS
:***: on käytetty toisiaan vastaavasti tässä keksinnös 12
Termi "toiminnallisesti liittynyt” tarkoitt että säätelyalue, kuten promoottori, terminaattoi tyssignaali tai enhancer-alue, on liittynyt rakenn ja ohjaa tämän geenin ilmentymistä.
5 Termi "kokosellulaasi" tarkoittaa täyc sellulaasisysteemiä sellaisena kuin tämä esiintyy sa esiintyvän mikro-organismin tuottamana.
Edellä olevien näkökohtien perusteella tär sinnön tavoitteena on saattaa käyttöön entsyymip· 10 rehujen lisäaineita, jotka parantavat FCRrää ja/ta vät viljapohjaisen rehun sulavuutta.
Yhden kohteen mukaisesti tämä keksintö kos syymipohjäistä rehun lisäainetta, jolle on tunnus· että se sisältää 15 (i) yhtä tai useampaa seuraavista: (a) endog si EGI, josta puuttuu selluloosaa sitova domeeni, ( glukanaasi EGII, josta puuttuu selluloosaa sitova ja (c) kohdan (a) tai (b) mukaisen endoglukanaasin nen sellulaasiydin, jolloin EGI viittaa endogluka 20 joka on peräisin Trichoderma -lajista, jonka pH-oj noin 4,0 - 6,0, isoelektrinen piste (pl) on noin 4, ja molekyylipaino on noin 47 - 49 kilodaltonia; l viittaa endoglukanaasiin, joka on peräisin Trichc lajista, jonka pH-optimi on noin 4,0 - 6,0, jonka pl 25 5,5 ja jonka molekyylipaino on noin 35 kilodaltonia; • · l l (ii) 0-20 paino-% sellobiohydrolaasia * · · neessa olevien sellulaasiproteiinien määrän peri « * « *·* * laskettuna.
Kuten edellä mainittiin, sisältää T. longibr 30 mistä (toisin sanoen luonnossa esiintyvistä kannoij * · .. ' _ _ 1 « 11 1 _ * r Λ __· ^ n J_ » I - j_ ..
13 glukanaasien pitoisuutta puhdistamalla, lisäämällä tettua endoglukanaasia tai liittämällä lisägeenejä kanaasin tuottamiseksi normaalia runsaammin. Lisä vaihtoehtoisesti voidaan mikro-organismin tuottamiej 5 biohydrolaasien suhteellista pitoisuutta kokosell verrattuna pienentää käyttämällä puhdistusmenetelmiä difroimalla tai deletoimalla sellobiohydrolaasia k geenejä. On erityisen edullista, että rehun lisäain olisi sellobiohydrolaaseja, jotta niiden pitoisuudek 10 aineessa saataisiin 0 paino-%.
Tällaisessa lisäaineessa voi viljapohjainei ja-aine olla jauhettu vehnä, maissi tai jauhettu Lisäksi kantaja-aine voi olla minkä tahansa näiden aalien sivutuote. Niinpä tämän keksinnön kohteena 15 viljapohjäinen eläinrehu, jolle on tunnusomaista, sisältää ainakin yhtä viljaa, joka valitaan ohrasi nästä, ruisvehnästä, rukiista ja maissista, ja täs; lä määriteltyä entsyymipohjäistä rehun lisäainett keksintö koskee lisäksi menetelmää edellä kuvatun 20 mipohjäisen lisäaineen valmistamiseksi, jolloin i mälle on tunnusomaista, että se sisältää vaiheer *♦ l muodostetaan geeniteknisesti Trichoderma-sienestä : tisesti modifioitu kanta, joka tuottaa haluttuja e: • * · ;Y; jä sopivia suhteellisia määriä, kasvatetaan genee • « 25 modifioitua kantaa ja otetaan lisäaine talteen vilj< 9 * : .·, Tällaisten rakenteeltaan modifioitujen < *ΓΓ/ kanaasien valmistusta geneettisillä muokkausmenei * « on kuvattu yksityiskohdittain tuonnempana.
Tässä keksinnössä käytettäväksi soveltuvi • * * * *··* 30 glukanaaseja ovat endoglukanaasit sienilähtömateri; • · · • · ^ m m Π7«« ^ a i — _ . _ 1 ^ I t_J - λ m ! 14 kimuksia, kuten komponentin kykyä (a) hydrolysoide siä selluloosa johdannaisia, kuten karboksimetyylis saa (CMC), minkä vaikutuksesta CMC:tä sisältävien viskositeetti pienenee, (b) hydrolysoida helpost 5 toituja selluloosamuotoja, kuten fosforihapolla t tua selluloosaa (esimerkiksi Walseth-selluloosa) j lysoida melko epätehokkaasti hyvin kiteisiä sellui to ja (esimerkiksi Avicel, Solkafloc ja niin ed Toisaalta arvellaan, etteivät kaikki tällaisten 10 suustutkimusten avulla määritellyt endoglukanaasil rehujen ravintoarvoa. Tämän mukaisesti on tarkemp keksinnön tarkoituksia varten määritellä endoglu "tyyppiset komponentit niiksi entsyymeiksi, joissa sellaisia ravinnon hyväksikäyttöä edistäviä ominai 15 jotka ovat verrattavissa Trichoderma longibrac endoglukanaasin komponenttien ravinnon hyväks edistäviin ominaisuuksiin.
Sienten sellulaasit voivat sisältää useam yhtä endoglukanaasityyppistä komponenttia. Eri k 20 teillä on tavallisesti erilaiset isoelektriset erilaiset suhteelliset moolimassat, erilaiset gly :\i# tumisasteet, erilaiset substraattispesifisyydet, € . .·, entsyymien vaikutustavat ja niin edelleen. Kosk * · · “'1' nenttien isoelektriset pisteet ovat erilaiset, n • * * .! * 25 on mahdollista erottaa ioninvaihtokromotografi j ** muilla näillä vastaavilla menetelmillä. Itse asia * * · :;j/ ponenttien eristäminen erilaisista materiaaliläht tällä alalla tunnettua. Tätä on käsitelty esimerkj kaisuissa Björk, et ai., US-patenttijulkai 30 5 120 463; Schulein, et ai., kansainvälinen p hakemus julkaisu W0 89/092 59; Wood, et ai., Bioc 15
Kunkin näiden kirjallisuusviitteen sisältö on tähän keksintöön siihen oikeuttavien säännösten n Termi "EGI-sellulaasi" tarkoittaa Tri longibrachiatum spp:sta peräisin olevaa endogli 5 komponenttia, jolle on luonteenomaista, että sen % on noin 4,0 - 6,0, isoelektrinen piste (pl) noin < ja suhteellinen moolimassa noin 47 - 49 kilodaltoi sellulaasi on edullisesti peräisin Trichoderme brachiatumista tai Trichoderma viridestä. Tri 10 longibrachiatumista peräisin olevan EGI-sellula optimi on noin 5,0, isoelektrinen piste (pl) noi suhteellinen moolimassa noin 47 - 49 kilodaltonia, derma viridestä peräisin olevan EGI-sellulaasin i on noin 5,0, isoelektrinen piste (pl) noin 5,3 ja 15 linen moolimassa noin 50 kilodaltonia.
On pantava merkille, että jotkin tutki, aikaisemmin käyttäneet EGII:stä nimitystä "EGII termi EGII on nykyisen nimityskäytännön mukain tapauksessa EGII-proteiini poikkeaa huomattavast 20 proteiinista suhteellisen moolimassansa, pl:nsä j timinsa puolesta. Termi "EGII-sellulaasi" te Trichoderma spp:sta peräisin olevaa endoglukanae , .·. nenttia, jolle on luonteenomaista, että sen pH-c 9 9 9 ΪΙψ noin 4,0 - 6,0 ja isoelektrinen piste (pl) noi] .11 25 suhteellinen moolimassa noin 35 kilodaltonia * » a \ l sellulaasi on edullisesti peräisin joko Trichoderr ...
··· · brachiatumista tai Trichoderma viridestä.
··· · Termi "EGIIl-sellulaasi" tarkoittaa Trd spp:stä peräisin olevaa endoglukanaasikomponenttj ·,$.ί 30 on luonteenomaista, että sen pH-optimi on noin 5, :***: isoelektrinen oiste (dI^ noin 7.2 - 8.0 ia snhi 16 6,0, isoelektrinen piste (pi) noin 7,4 ja suht moolimassa noin 25-28 kilodaltöniä. Trichoderma tä peräisin olevan EGIII-sellulaasin pH-optimi 5,5, isoelektrinen piste (pl) noin 7,7 ja suht 5 moolimassa noin 23,5 kilodaltonia.
"Eksosellobiohydrolaasityyppiset komp (”CBH-tyyppiset komponentit") tarkoittaa kaikki seilulaasikomponentteja, jotka rehuihin kohdi aktilvisuusominaisuuksiltaan muistuttavat Tri 10 longibrachiatumin CBHI: tä ja CBHII: tä. Tässä suhteei ja CBHII-tyyppiset komponentit (edellä olevan k mukaiset komponentit) pienentävät EG-tyyppisten ke tien yhteydessä käytettynä eläinrehun sei lul aasi li tehokkuutta rehuhyötysuhteen ja/tai rehun sulavu 15 seessä ollessa.
Käytettäessä aktiivisuustutkimuksia, kutei derma longibrachiatumista peräisin olevien CE CBHII:n luonnehtimiseen tarkoitettuja tutkimuks tällaisten eksosellobiohydrolaasityyppisten kompc 20 ulkopuolelle jäädä perinteisesti eksosellobiohydrc si luokiteltuja komponentteja. Esimerkiksi tällai • ponentit (a) inhiboituvat kompetitiivisesti sellot . .·. (K, 1 mM); (b) eivät kykene hydrolysoimaan mitenk • · · .·,·. kittävässä määrin substituoituja selluloosia .11' 25 karboksimetyyliselluloosaa ja niin edelleen, ja (c • * lysoivat fosforihapolla turvotettua selluloosaa jc • · t ··· * mässä määrin erittäin kiteistä selluloosaa. Joider «ei • » · V * laisten aktiivisuustutkimusten avulla CBH-kompor luonnehdittujen sellulaasikomponenttien arvellaan » 30 ta parantavan rehujen ravintoarvoa. Tämän mukais vellaan tämän keksinnön tarkoituksia varten olevar 17 doissa ovat samanlaiset kuin Trichoderma longibrac endoglukanaasikomponenttien toiminnalliset ominai "β-glukosidaasi (BG) -komponentit" tarkoi aktiivisuutta sisältäviä sellulaasikomponenttej 5 merkitsee sitä, että nämä komponentit vaikuttava bioosin ja muiden liukoisten sello-oligosakkaridic lobioosi") pelkistämättömästä päästä käsin ja muc ainoana tuotteena glukoosia. BG-komponentit eivä boidu selluloosapolymeereihin tai eivät reagod 10 kanssa. Lisäksi glukoosi inhiboi näitä BG-kompc kompetitiivisesti (Kt on noin 1 mM). Vaikkakaan ponentit eivät tarkkaan ottaen ole kirjaimellisesl laaseja, koska ne eivät voi pilkkoa selluloosaa, r BG-komponentit sisältyvät sellulaasijärjestelmän ir 15 mään, koska nämä entsyymit edistävät selluloosan b ta kokonaisuudessaan pilkkomalla edelleen inhit selluloosan pilkkoutumistuotteita (erityisesti se
siä), jota on muodostunut CBH-komponenttien ja E
nenttien yhteisvaikutuksesta. Ilman BG-komponent 20 teinen selluloosa hydrolysoituisi vain kohtalais vähän. BG-komponenttej a luonnehditaan usein :\e aryylisubstraatteja, kuten p-nitrofenoli-p-D-gl [ .·, (PNPG), ja niitä kutsutaan siten usein aryyliglu * 1 2 3 1 VIa seiksi. On pantava merkille, että kaikki aryyliglu 25 sit eivät ole BG-komponentteja siinä mielessä, ett 2 * 1 1 j ·’ näistä eivät hydrolysoi sellobioosia.
* 1 1 3 ί Tässä keksinnössä on ajateltu voitavan sään • 1! 1 V 1 minkä tahansa koostumuksessa olevan CBH-komponenti visuutta käyttämällä sellulaasikoostumuksessa E 5ei]i 30 nentteja tai jättämällä nämä siitä pois. Tämä ta yksityiskohtaisesti sitä, että koska sellobioosia 18 BGH-komponenttlen puuttuminen sellulaasikoostu "ehkäisee" CBH-aktiivisuutta sellobioosikonsen saavuttaessa inhibitoriset tasot. Tässä keksini sellulaasikoostumukseen ajateltu voitavan lisätä 5 useampaa lisäainetta (esimerkiksi sellobioosia, g ja niin edelleen) joiden suorasta tai epäsuorast tuksesta CBHI-tyyppinen aktiivisuus tai muunlaii aktiivisuus "estyy" joko osittain tai kokonaan. N van koostumuksen katsotaan näitä lisäaineita käyt 10 soveltuvan tässä keksinnössä käytettäväksi koostuin jos lisäaineen määrä on riittävän suuri alentam tyyppisen aktiivisuuden tasoille, jotka vastaavat pienempiä kuin tässä keksinnössä kuvattuja sei koostumuksia käyttäen saavutetut CBH-tyyppiset 15 suustasot.
Sellulaasikoostumus, jonka BG-komponenttie on lisätty, voi toisaalta lisätä selluloosan täy hydrolysoitumista, jos CBH-komponenttien muodosta lobioosin pitoisuus tulee tällaista täydellistä 20 soitumista rajoittavaksi silloin, kun koostumukset lisätty BG-komponentteja.
Menetelmiä sellulaasikoostumuksessa olevier . .·. ponenttien määrän surentamiseksi tai pienentämii • * * kuvattu julkaisuissa US 07/807 028, joka on jätett 25 1991, joka on jatkohakemus julkaisulle US 07/625 1 l ; on jätetty 10.12.1990 (tämä vastaa EP-hakemusj * * * 0 562 003), jotka kaikki julkaisut on liitetty kok *·* * dessaan tähän keksintöön siihen oikeuttavien sä nojalla.
30 Sienten sellulaasit voivat sisältää useam :***: yhtä BG-komponenttia. Eri komponenttien isoelektri 19 Tässä keksinnössä käytettäväksi soveltu doglukanaasikomponentit ovat edullisessa sovelli dossa komponentteja, jotka muistuttavat ominaif taan Trichoderma longibrachiatumista saatavissa 5 komponentteja, toisin sanoen EGI:tä, EGII EGIII:tä. Tässä suhteessa saavat Trichoderma brachiatumin endoglukanaasikomponenteilla käsil viljalla syötetyt eläimet ominaisuuksia, kuten rehuhyötysuhde, pienempi viskositeetti suolessa 10 non lisäyksen paraneminen, käsittelemättömään tai kokosellulaasilla käsiteltyyn rehuun veri Menetelmiä EGI:n, EGII:n ja EGIII:n valmistamis kuvattu yksityiskohdittain julkaisussa WO 92/062 On mahdollista, että kokosellulaasiko< 15 sessa esiintyvät muut kuin CBH-tyyppiset kom{ voivat saada aikaan suolistossa esiintyvää hait viskositeettia, rehuhyötysuhteen suurentumista ^ men painonnousun hidastumista. Tästä syystä rik< ja endoglukanaaseja, kuten EGI:tä tai EGII:ta, 20 maila ajatellaan voitavan poistaa jotkin näist sellulaasia käytettäessä esiintyvistä ongelmi; • **. kaikki nämä ongelmat.
: Eläinten on havaittu kykenevän sulattam *»* ;*·*· vintonsa tehokkaammin, kun viljapohjaiseen eläir 25 vintovalioon on lisätty endoglukanaasin suhteen * · * • tettua rehun lisäainetta. Näin on erityisesti a; • · * ta sellaisten viljapohjaisten rehujen kyseessä c « * f * joita ovat ohra, joilla edellä olevan rehun He käyttö parantaa viljapohjaisen rehun rehuhyötys * · · ***** 30 ja/tai lisää sulavuutta. Viljapohjaisten rehujer *«· • · VN Ί 4“ λ 4 ι^πη ö Λ TN +* TT 'I 1 1 -1 n A Λ+* t t -I lr -i « O C a -i ^ λ Q. -ΐ -v 20 Tästä keksinnöstä käyttöön saaduilla € kanaasin suhteen rikastetuilla rehun lisäaine: myös mahdollista modifioida tavanomaista viljapc rehua vähentämällä sen energiasisältöä ja/tai 5 iinipitoisuutta ja/tai aminohappopitoisuutta säj kuitenkin samalla eläimen käytettävissä olevien an, proteiinin ja aminohappojen ravitsemuksella toisuudet ennallaan. Tämä tarkoittaa sitä, että rehuun tavanomaisesti lisättyjen kalliiden ener 10 proteiinitäydennysravinteiden määriä voidaan pj verrattuna siihen, mitä nämä ovat tavanomaisi huissa. Energiatäydennysravinteita ovat rasva, iinitäydennysravinteita ovat kalajauhe, vehnä soijajauhe, rypsirouhe tai 0-0-rypsi (canola) 15 Tämä saa aikaan sen, että eläinrehun kustannuks noyksikköä kohti pienenevät huomattavasti ravir vähentymättä. Vaihtoehtoisesti tai vieläpä kaike lisäksi voidaan aminohappotäydennysravinteiden pienentää siitä, mitä nämä ovat tavanomaisissa 20 sa, mistä voidaan myös saada huomattavia kustanr tö j ä.
·» ! *·. Tämän keksinnön mukainen rehun entsyymi] ί voidaan valmistaa useilla eri tavoilla. Se voida ·«« :V: merkiksi valmistaa yksinkertaisesti yhdistämä^ " · * :v. 25 aankuuluvia aktiivisuuksia sisältävät eri er : .·. keskenään entsyymiseoksen aikaansaamiseksi. Täi ··* s syymiseos voidaan yhdistää joko suoraan rehuun • · ϊ vanomaisemmin imeyttää viljapohjäiseen kantajama . liin, kuten jauhettuun vehnään, maissin tai se ! * * 30 hoon. Voidaan myös käyttää minkä tahansa näide 21
Vaihtoehtona voidaan esimerkiksi jäi vehnästä tai maissista valmistettuun viljapol: kantajaaineeseen imeyttää joko samanaikaisesti rakkain entsyymejä, joiden aktiivisuudet ovat 5 kuuluvia. Esimerkiksi jauhetusta vehnästä valmis kantaja-aineeseen voidaan sumuttaa yhtä tai i endoglukanaasia. Voidaan myös lisätä muita ent siiloin kun näin on asiaankuuluvaa menetellä, ϊ aine, johon näitä entsyymejä on imeytetty, m; 10 myös tämän keksinnön erään kohteen mukaisen reb syymilisäaineen.
Tästä keksinnöstä saatava rehun lisäai daan lopullisen rehun aikaansaamiseksi yhdist raan eläinrehuun, kuten ohrapitoiseen rehuun 15 lisäaine voidaan vaihtoehtoisesti yhdistää yht useampaan muuhun rehun lisäaineeseen, kuten re tamiinilisäaineeseen, rehun kivennäislisäainee rehun aminohappolisäaineeseen. Tulokseksi s useita erityppisiä komponentteja sisältävää re 20 säainetta voidaan sitten lisätä rehuun asiaar määrä.
·» * *·· Tuloksena olevassa viljapohjaisessa 2^;’; käytetään endoglukanaaseja edullisesti } •V: 0,000001 - 0,1 g/kg ja edullisemmin 0,00001 - 0, 2V. 25 ja edullisimmin 0,0001 - 0,001 g/kg.
• · • Tämän keksinnön mukaisessa rehun lisäc *·· * e·.·* käytettäväksi soveltuvia endoglukanaaseja voidaa * ♦ * konstruoimalla geneettistä muokkausta käyttäen mikro-organismi, kuten Trichoderma-sieni, joka • **· •j·* 30 haluttuja entsyymejä asianmukaisina suhteellisi * \ , , , , .
* « ^ J « .T J « « M ^ aU Ju ^ _ J___I. - 1 _ _ i. ^ 11 22 endoglukanaasin eteen sijoitettua sopivaa voi promoottoria. Vaihtoehtoisesti tai kaiken tämän voidaan isäntäkannasta deletoida tiettyjä laasigeenejä (esimerkiksi CBHI:tä ja/tai CBHII:1 5 daavia geenejä). Nämä menetelmät on selitetty tä sesti X. reesein transformaatiota koskevassa jul sa W0 92/062 09.
Tästä keksinnöstä käyttöön saatava rehi syymilisäaine voi myös sisältää muita entsyyme; 10 ten ksylanaasia, proteaasia, a-amylaasia, gl laasia, lipaasia, pektinaasia, mannanaasia, a-g sidaasia, α-arabinofuranosidaasia tai fytaasia. tut aktiivisuudet sisältäviä entsyymejä voidaa merkiksi yhdistää tässä keksinnössä käytettyihi: 15 glukanaaseihin joko ennen endoglukanaasien imey tä viljapohjaiseen kantaja-aineeseen tai voidaa] toehtoisesti menetellä siten, että kyseiset en imeytetään tällaiseen viljapohjaiseen kantaja seen endoglukanaasien kanssa samanaikaisesti t 20 räkkäisinä toimenpiteinä. Tämän jälkeen kanta puolestaan yhdistetään viljapohjaiseen rehuun i lisen rehun aikaansaamiseksi. On myös mahdi : formuloida rehun entsyymilisäaine yksittäiste *« · •V. syymiaktiivisuuksien liuoksena ja yhdistää tänu * * 25 etukäteen rakeistettuun tai jauhettuun rehuma liin.
< · '!!.* Rehun entsyymilisäaine on myös mahdollista • · a * eläimen ruokavalioon yhdistämällä se toiseen (ja seen) rehuun tai juomaveteen, jotka myös on asetett **2·* 30 men saataville. Tämän mukaisesti ei ole välttämätö * * * ·...· distää tämän keksinnön mukaista entsvumi sensta uar 1 11 23 seen viljapohjaiseen ravintoon, vaikkakin tämän l· yhtenä erityisen edullisena kohteena on lisätä tällä tavoin.
Yhdessä edullisessa sovellutusmuodosse 5 entsyymiksi lisätty ksylanaasi on T. longibrachd saatavissa oleva korkean pl-arvon ksylanaasi ja/t lan pl-arvon ksylanaasi, jotka ovat saatavissa julkaisun W0 92/06 209 esimerkin 22 mukaisella mer lä. On erityisen edullista, että ksylanaasi on koi 10 arvon ksylanaasi.
Vielä yhden edullisen sovellutusmuodon muki entsyymiksi lisätty proteaasi on Bacillus-suvusta oleva subtilisiini tai tämän mutatoitunut muoto. Bacillus-kantoja ovat mainittuihin kuitenkin rajod 15 B. amyloliquefaciens, B. lentus, B. lichenifo: subtilis tai B. alcalophilus.
Subtilisiini voi myös olla mutatoitu subtd jonka aminohapposekvenssi on sellainen, ettei sit< luonnossa mutta joka on peräisin subtilisiinin f 20 rista, joka on valmistettu subtilisiiniprekursor tai useamman eri aminohapporyhmän lisäyksellä, f J·.^ tai korvauksella. Sopivia mutatoituja subtilisi . ,·. kuvattu EP-hakemkusjulkaisussa 0 130 756, joka ve • · patenttijulkaisua Re 34 686 (mukaan lukien asemis '.Il 25 +104, +222, +166, +133, +169, +189, +217, +156 « « · * ;* olevat mutaatiot); EP-hakemusjulkaisu 0 251 · 91/06 637 ja niin edelleen. Edullisin subtilisiir ··· V : tatoitu subtilisiini, joka sisältää sellaisessa e poryhmäkohdassa olevan korvauksen, joka vastaa B. 30 quefaciensin subtilisiinin tyr+217:n korvaamista :***: nilla.
24
Viljapohjäiset eläinrehut, jotka sisältäv keksinnön mukaista lisäainetta, soveltuvat eläimi ten sioille, märehtijöille, kuten lampaille ja 1 ja siipikarjalle, kuten kanoille, kalkkunoille, 5 ja ankoille. Nämä rehut soveltuvat kuitenkin e hyvin siipikarjalle ja sioille ja erityisesti b kananpojille.
Kuten aiemmin mainittiin, tämän keksinnön rehun entsyymilisäaine saadaan edullisesti kasva 10 geneettisesti modifioitua Trichoderma-sienikante johtuu sen tunnetusta kyvystä erittää suuria määr sellulaaseja. Tämä modifioitu kanta voi olla per longibrachiatumista, T. reeseistä tai T. virides laisten kantojen genomia voidaan modifioida sell 15 että se ilmentää normaalia suurempia määriä kokos siä, tai sellaiseksi, että siitä on poistettu ; useampi kokosellulaasin muodostavista entsyymik teista.
Mikro-organismiviljelmiä kasvatetaan stat 20 vaiheeseen asti, suodatetaan solujen poistamiseksi jelle jäävä supernatantti konsentroidaan ultrasuod la endoglukanaasin tai tämän johdannaisen aikaans ; .·. si.
• · I
1*1' Edellä olevan menetelmän yhdessä nimene • · ♦ I 25 kohteessa voi transformoitujen isäntäsolujen v l ; käytetty medium olla mikä tahansa medium, joka • * .
···· endoglukanaasin valmistamiseen Trichodermalla. En * * # *·* * naasi tai sen johdannainen otetaan talteen medium vanomaisin menetelmin, joita ovat solujen erottani 30 diumista sentrifugoimalla tai suodattamalla, pre
saostus supernatantista tai suodoksesta suolalJ
25 1
Lopullinen proteiinituote voidaan vaihtoeh eristää ja puhdistaa sitomalla se polysakkaridi tai vasta-ainematriksiin. Vasta-aineita (polyklc tai monoklonaalisia) voidaan valmistaa endoglu 5 ydindomeenipeptidejä vastaan tai voidaan valmist osadomeenista peräisin olevia synteettisiä pept käyttää näitä polyklonaalisten vasta-aineiden vai seen.
Tässä keksinnössä ajatellaan lisäksi, et 10 glukanaasia tai johdannaista koodaava DNA-fragme DNA-fragmentin variantti voidaan liittää toiminna sienen promoottorisekvenssiin, esimerkiksi cbhl- i geenin promoottoriin. Tässä keksinnössä ajatelli Trichoderma-kantaa manipuloitavaksi transformoi! 15 siten, että endoglukanaasia koodaava DNA-fragment tyy genomiin. Kantaan voidaan rekombinaation avu telia liitettäväksi endoglukanaasi-DNA-fragmen -DNA-fragmentin variantti useampana kuin yhtenä yh nä kappaleena .
20 Jotta transformoitu sieni kyettäisiin havai on ensin valittava selektiomarkkeri. Tässä keh voidaan käyttää mitä tahansa sellaista Trichodern * ·· ] .·. mentyvää selektoitavissa olevaa markkerigeeniä * * * */1' esiintyminen transformanteissa ei vaikuta olen .11 25 näiden tämän ominaisuuksiin. Selektiomarkkeri i * * * ; ;* geeni, joka koodaa määritettävissä olevaa tuotettc : tiomarkkeri voi olla kokonainen toiminnallinen Tr # ** V : ma-geeni, jonka puuttuminen isäntäkannasta johtaa piltään auksotrofisen isäntäkannan syntymiseen, 30 Käytetyt isäntäkannat voisivat olla Trie ;***: johdannaisia, joista puuttuu valittua selektion 26 11
Muita esimerkkejä selektiomarkkereista, joita käyttää tässä keksinnössä, ovat Trichoderma-geeni vastaavat Aspergillus nidulansin argB-geeniä, trpC niaD-geeniä ja muita näitä vastaavia geenejä. \ 5 resipienttikannan on tästä syystä oltava johdanna kuten argB’, trpC" tai niaD'-kanta tai muu vastaav Kanta on peräisin lähtö!säntäkannasta, joki tahansa Trichoderma-kanta. On kuitenkin edullista T. longibrachiatumin sellulaasia normaalia suuren 10 rän tuottavaa kantaa, kuten Sheir-Neiss, et ai.
kaisussa Appi. Microbiol. Biotechnology 20 (1984) kuvaamaa RL-P37-kantaa, koska tämä kanta erittä määriä sellulaasientsyymiä. Tätä kantaa käytetää transformaatiomenetelmässä käytettävien johdannais 15 valmistamiseen.
Trichoderma-johdannaiskanta voidaan \ useilla tällä alalla tunnetuilla menetelmillä. Esi on pyr4-johdannaiskantojen valmistaminen käsitt kantoja fluoriorotihapolla (FOA). pyr4-geeni koo 20 tidiini-5'-monofosfaattidekarboksylaasia, joka or nin biosynteesiin tarvittava entsyymi. Vaurioitu ί\β pyr4-geenin sisältävät kannat kasvavat mediumiss . ,·. puuttuu uridiini, mutta ne ovat herkkiä fluoriorc β ·! * β·β·β le. Kun selektio suoritetaan FOA-resistenssin * · · AI 25 niin on mahdollista selektoida sellaisia pyr4-jot • · 1 ; kantoja, joista puuttuu toiminnallinen oroditi • « · fosfaattidekarboksylaasientsyymi ja jotka vaati’ ...
'·* * vaakseen uridiinia. FOA - se lek työmenetelmää käy1 myös mahdollista saada uridiinia vaativia kantoja « 30 puuttuu toimintakykyinen orotaattipyrofosfori : : transferääsi. Näitä soluja on mahdollista trans 27 11 resistenssimenetelmällä, niin on edullista käyl lektiomarkkerina pyr4-geeniä.
Yhdessä tämän keksinnön edullisessa sov muodossa Trichoderma-isäntäsolukannoista poistet 5 tai useampi sellobiohydrolaasigeeni ennen kuin
tuodaan tutkittavaa endoglukanaasia koodaavaa E
menttia sisältävä DNA-konstruktio tai plasmidd glukanaasia, tämän johdannaista tai kovalenttises tynyttä endoglukanaasidomeenijohdannaista on tunni 10 ja myöhempien puhdistustoimenpiteiden yksinkertais si edullista ilmentää isännässä, jolta puuttuu useampi sellobiohydrolaasigeeni. Trichodermasta poistaa mikä tahansa kloonattu geeni, kuten cbhl t
Haluttu geeni, joka on määrä poistaa trar 15 tista, liitetään plasmidiin tällä alalla tunnetuin telmillä. Plasmidi on valittu siten, että siinä or set ainutkertaisena esiintyvät restriktioentsyyn joiden avulla tämä Trichoderma-DNA-fragmentti kye1 hemmässä vaiheessa poistamaan yhtenä lineaarisen 20 leena. Poistettavaa tai vaurioitettavaa geeniä s plasmidi pilkotaan tämän jälkeen koodaavan alueen sijaitsevan(vien) asiaankuuluvat ien) restriktioe ] .·. kohdan(tien) kohdalta, plasmidista voidaan poista * · · l"' koodaava sekvenssi tai tämän osa ja plasmidiin I 25 liittää selektiomarkkeri (esimerkiksi pyr 4). Sei • · · | ·* vissa olevan markkerigeenin kummallekin puolelle j • · · ϊ.ί ί tettavan tai vaurioitettavan geenin lokuksen viere ·· · : via DNA-sekvenssejä edullisesti noin 0,5 - 2,0 k ran.
30 Tämän jälkeen plasmidista eristetään yksi d konstruktion sisältävä DNA-fraqmentti ia tätä k 28 tulokseksi saaduille transformanteille suoritetaa hern-blottianalyysi sellaisen kaksinkertaisen over -integraatiotapahtuman tunnistamiseksi ja var] seksi, jolla pyr4-selektiomarkkerit korvaavat pois 5 geenin koko koodaavan alueen tai tämän osan.
Vaikka edellä on kuvattu tiettyjä nime plasmidivektoreita, niin tämä keksintö ei rajoiti vektorien muodostamiseen. Edellä olevia menetelmiä en voidaan Trichoderma-kannasta poistaa useita e 10 geenejä ja niiden tilalla voidaan käyttää muita . Edellä olevan tarkastelun mukaan voidaan käyttää i hansa saatavilla olevaa selektiomarkkeria. Genomij daan deletoida edellä kuvattua strategiaa käyttäei tiaalisesti mikä tahansa Trichoderma-geeni, joka < 15 nattu ja siten tunnistettu.
Tässä keksinnössä käytetty ilmentämisvekto: sisältää siihen liitetyn tämän keksinnön mukaist glukanaasia tai tämän johdannaista koodaavan DNA-tin tai DNA-fragmentin variantin, voi olla mikä 20 vektori, tyypillisesti plasmidi, joka kykenee rep. maan itsenäisesti tietyssä isäntäorganismissa. Eri • » • *·* sovellutusmuodoissa ajatellaan geenien tai näider tettyjen muotojen ilmentämiseen käytettävän kahden
;V: siä ilmentämi s vektoreita. Ensimmäinen näistä sisäH
* · 25 sekvenssejä, joissa promoottori, geenin koodaava • r : terminaattorisekvenssi ovat kukin peräisin ilmenne • · · geenistä. Geeni typistetään tarvittaessa poistama] ♦ · ί * sekvenssit, joiden ei haluta tulevan mukaan (nämä , vat domeenia, joiden ei haluta käyttää tuotteessö * · « *···’ 30 loin jäljelle jää ilmennettäväksi tuleva domeen * · » t A » h«J ^ ^^1^ 7 -L. J ” J 7 * 1 - ί 29
Esimerkiksi DNA-konstrukstio, josta voidaar nimitystä pEGID3'pyr, sisältää EGI-sellulaasin yd nin, jonka ilmentymistä ohjaavat EGI:n promoottori naattori ja signaalisekvenssi. Konstruktiosta on p 5 selluloosaa sitovan domeenin sisältävä EGI:n k alueen 3’-pää. Plasmidi sisältää selektiotarkc myös pyr4-geenin.
Toisentyyppinen vektori kootaan etukätee sisältää voimakkaaseen transkriptioon tarvittavia 10 sejä ja selektoitavissa olevan markkerin. Tässä ke sä aj atellaan, että geenin koodaava alue tai t voidaan liittää tähän yleisilmentämisvektoriin sit sen transkriptio tapahtuu ilmentämiskasetin proir ja terminaattorisekvenssien ohjaamana.
15 Tällainen yleisilmentämisvektori on esi pTEX. Geenejä tai näiden osia voidaan liittää my nassa voimakkaaseen CBHX-promoottoriin nähden.
Endoglukanaasia koodaavan DNA-sekvenssin c vektorissa liitettynä toiminnallisesti transkri] 20 translaatiosekvensseihin, toisin sanoen rakennegee teen samassa lukukehyksessä olevaan sopivaan proir :*.e< sekvenssiin ja signaalisekvenssiin. Promoottori , mikä tahansa DNA-sekvenssi, jolla on transkriptic • · ♦ ··« suutta isäntäsolussa ja se voi olla peräisin pre • * * ^ 25 koodaavista geeneistä, jotka ovat isäntäsolun suht l ;* homologisia tai heterologisia. Signaalipeptidi ma * * * taa endoglukanaasin tai tämän johdannaisten ilme • φ * solujen ulkopuolella. DNA-signaalisekvenssi on edu ilmennettävään typistettyyn geeniin luonnollisesti 30 vä signaalisekvenssi, mutta tässä keksinnössä aj :***: käytettäväksi mistä tahansa endoglukanaasista 30 sopiviin vektoreihin, jotka sisältävät tarpeellise: maation isäntäsolussa tapahtuvaa replikaatiota ovat tällä alalla tunnettuja*
Edellä kuvattu DNA-vektori tai -konstruktio 5 tuoda isäntäsoluun tunnettujen menetelmien, kuter formaation, transfektion, mikroinjektion, mikropo biolistisen pommituksen ja muiden näitä vastaavia telmien avulla.
Tämän keksinnön edullisessa sovellutusn 10 modifioitu kanta Trichoderma sp:stä peräisin ole ta, joka sisältää CBHI:tä ja/tai CBHII:tä vs poistettuja tai vaurioitettuja geenejä, minkä j tämä kanta ei kykene tuottamaan katalyyttisesti vista sellobiohydrolaasia. Tällaisen organismin 15 mat sellulaasientsyymit ovat rikastuneet enc naasien suhteen eivätkä ne sisällä enempää ku sellobiohydrolaaseja tuottamiensa sellulaasiprot kokonaispainon perusteella ilmoitettuna. On ei edullista, että modifioitu kanta ei kykene tue 20 katalyyttisesti aktiivista CBII:tä, koska tämä e muodostaa suurimman osan Trichoderma sp:stä f olevan kokosellulaasin kaikista komponenteista.
. Modifioitu kanta voi sisältää vaiht • « * ,V. sesti lisäksi yhdistelmä-DNA:ta, jonka avu i · «
5V# 25 mahdollista ilmentää ja erittää joko EGI
J ^ EGII:n typistettyjä katalyyttisiä ytimiä. Mi teoriaan rajoittumatta arvellaan, että siilo: * ψ » * sellulaasissa on selluloosaa sitova domeeni, ni voi saada aikaan tiettyjä haitallisia omin.
» 30 siä, jotka havaitaan syötettäessä eläimille m
* · 1 1 «S fa! av λ *"V AV I· ^ V* Λ Vv 11 Λ -m Av 1 1 «V ^ M Av «v L· «v 4 i. « A
31 merkiksi viskositeetin lisääntyminen suolistossa olevan perusteella näitä ominaisuuksia on mahdol] joittaa tai ne on mahdollista poistaa poistaman laasista selluloosaa sitova domeeni ja säilyttän 5 kokonainen ydinosa·
Ennen kuin näiden typistettyjen endoglul· valmistusmenetelmiä ryhdytään kuvaamaan esitetään yksityiskohtainen kuvaus piirroksesta, mikä on tai ta näiden valmistusmenetelmien ymmärtämiseksi.
10 Kuvio 1 esittää EGI:n genomista DNA-sekve aminohapposekvenssiä. Signaalisekvenssi alkaa em£ 113 ja päättyy emäspariin 178 (SEKVENSSI ID N0:i: lyyttinen ydindomeeni alkaa emäsparista 179 ja eksonin 1 asemaan 882 ja jatkuu toisen eksonin emi 15 963 päättyen tämän eksonin emäspariin 1379 (SEK\ N0:5). Kytkijäalue alkaa emäsparista 1380 ja pääti pariin 1460 (SEKVENSSI ID N0:9). Selluloosaa sitoi ni alkaa emäsparista 1461 ja päättyy emäspar; (SEKVENSSI ID N0:1). SEKVENSSI ID NO:14, 6, 10 jc 20 tavat EGI:n signaalisekvenssin, katalyyttisen yc nin, kytkijäalueen ja sitovan domeenin aminohappo :#.e< sejä, vastaavassa järjestyksessä ilmoitettuna.
. .·. Kuvio 2 esittää EGII:n genomista DNA-sekvo * * * aminohapposekvenssiä. Signaalisekvenssi alkaa emi !:Y 25 262 ja päättyy emäspariin 324 (SEKVENSSI ID NO: 15 | l loosaa sitova domeeni alkaa emäsparista 325 ja
emäspariin 432 (SEKVENSSI ID N0:3). Kytkijäal *’ * emäsparista 433 ja päättyy emäspariin 534 (SEKV
NO:11). Katalyyttinen ydindomeeni alkaa emäsparis * 30 j atkuu emäspariin 590 eksonissa 1 j a j atkuu eks ***** Am^enarifit-a 7emaensriin 1 f flElfVEMCCT Tl 32
Kuvio 3 esittää EGIII:n genomisen DNA:n se ja aminohapposekvenssiä. Signaalisekvenssi alkaa rista 151 ja päättyy emäspariin 198 {SEKVENSSI ID Katalyyttinen ydindomeeni alkaa emäsparista 199 ja 5 eksonissa 1 emäspariin 557, jatkuu eksonissa 2 emä 613 ja päättyy emäspariin 833 ja jatkuu eksonissa parista 900 päättyen emäspariin 973 (SEKVENSSI ID SEKVENSSI ID NO:20 ja 18 edustavat EGIIIin sig: kvenssin ja katalyyttisen ydindomeenin aminohappo 10 siä, mainitussa järjestyksessä ilmoitettuna.
Kuvio 4 esittää EGI-ydindomeenin ilmentäm rin (SEKVENSSI ID NO:21) konstruktiota.
Kuvio 5 on kaavio, joka esittää kokosellul, useiden erilaisten rikastettujen endoglukanaasipr 15 tien viskositeettia vähentävää lähtöaktiivisuutta arvoissa.
Kuten edellä mainittiin, tämän keksinnön m sa rehun entsyymilisäaineessa olevat yksi tai use; doglukanaasi ovat typistettyjä EG-johdannaisia, ku 20 josta puuttuu selluloosaa sitova domeeni (tästä käyttää nimitystä EGX-ydin) ja/tai EGII, josta myi {*·.. tuu selluloosaa sitova domeeni. Näitä johdannaisia : ;'· tetaan yhdistelmä-DNA-menetelmillä transformoiman #* * •V. täsoluun DNA-konstruktio, joka sisältää ainakin yh< • * · * :v. 25 fragmentin, joka koodaa endoglukanaasien, esi] ί / • EGI:n tai EGII:n, osittaista tai kokonaista ydinal • · · joka on liitetty toiminnallisesti promoottoriin, • J 9 * * vattamalla isäntäsolua tutkittavan typistetyn < kanaasin, typistetyn endoglukanaasin johdannaisen \ί.: 30 valenttisesti liitetyn typistetyn endoglukai ·*** t λ mr*\ Λ n ι λ r\ /4 -¾ in »n .n - e λ ·»% i 7 m«n + '{«h - λ λ η -ί « 7 /¾ h n Tr n -ί a ^ 33 tämän johdannainen lisäksi puhdistaa huomattava geeniseksi ennen käyttöä.
Seuraavat vertailuesimerkit 1 ja 2 on esite den menetelmien kuvaamiseksi, joita käytetään er 5 naasin suhteen rikastettujen entsyymikoostumuster tamiseen transformoimalla geneettisesti modifioit ro-organismeja ja kasvattamalla näitä.
Vertailuesimerkki 1 EGl:n ydindomeenin kloonaus ja ilmentämin 10 täen sen omaa promoottoria, terminaattoria ja s sekvenssiä.
Osa 1 Kloonaus EG1:n ydindomeeni-ilmentämispla pEGlD3'pyr:n, konstruktiossa käytetty täydellin 15 geeni saatiin plasmidista pUC218::EGl. (Ks. k egll:n 3’-puoleinen terminaattorialue lie pUC218:aan (Korman, D., et ai., Curr. Genet. 1 203 -212) 300 ep:n suuruisena BsmI-EcoRI-frac (Bsml-kohta on 46 ep 3’-suuntaan egll:n lopetuske 20 yhdessä synteettisen kytkijäjakson kanssa, joka e niteltu korvaamaan egll:n selluloosaa sitovan :·. lopetuskodonilla ja jatkumaan egll:n terminaattord , sin ensimmäisellä 46 ep:lla. Tulokseksi saatu % • * *
1*1' pEGlT, pilkottiin HindIII:lla ja Bsml:11a ja egJ
I I » ,11 25 naattorin sisältämä vektorifragmentti eristettiir [ ·* misseoksesta agaroosigeelielektroforeesin ja tämäi * · * *·· s suoritetun elektroeluution avulla, egll-geenin pi *·" ' risekvenssi ja egll:n yd indomeeni eristettiin EGl:stä 2,3 ke:n suuruisena HindiII-SstI-fragmen ϊ.ί,ί 30 se liga toit iin saman synteettisen kytkijäfragnu • **· HindIII:n ia Bsml;n spnkspl 1» ηί 1 kotiin nEf31T?n 34 tovan domeenin. Näiden toimenpiteiden tuloksena Ί tuskodoni sijoittuu seriinin 415 jälkeen ja sekver kuu egll-terminaattorilla BsmI-kohtaan asti.
Seuraavaksi hankittiin käyttöön aikad 5 p219M~kloonista (Smith, et ai., 1991) peräisin longibrachiatumin selektiomarkkeri, pyr4, joka o tetty 1,6 kein suuruisena EcoRI-Hindlll-fragmentti liitettiin lopulliseen ilmentämisplasmidiin, pyriään, kolmen osapuolen ligaatiossa, jossa muin* 10 Iina käytettiin EcoRIilla pilkottua ja vasikasta olevalla alkalisella fosfataasilla defosforyloiti plasmidia sekä pEGlD3':sta saatua egllin ydindomc sältävää HindiII-EcoRI-fragmenttia.
Osa 2. Transformaatio ja ilmentäminen 15 PEGlD3'pyr:sta valmistettiin suurimittal- DNA-preparaatti ja tästä eristettiin preparatd geelielektroforeesilla EcoRI-fragmentti, joka egll:n ydindomeenin ja pyr4-geenin. Eristetty fi transformoitiin kantaan (lA52pyrl3), josta cbhl- 20 egll- ja egl2-geenit oli poistettu ja joka oli py on kuvattu julkaisussa W0 92/06 209), minkä jälk nistettiin pysyviä transformantteja.
.,· egll-ydindomeenia ilmentävien transformant » · · lektoimiseksi transformantteja kasvatettiin ravis • i · ,1 * 25 loissa olosuhteissa, jotka olivat suotuisat sellu] • · · | ·" nien induktiolle (Vogel'in medium + 1 % laktoos • * · · soluja oli kasvatettu 4-5 päivää, konsentroit V: teiini supernatanteista ja tälle suoritettiin 1) polyakryyliamidigeeleissä, jonka jälkeen EGI-ydd 30 havaittiin Western-analyysillä käyttäen EGIitä !***: suunnattuia Dolvklonaalisia vasta-aineita tai 2) 35
Tunnistettiin ne transformantit, jotka voisiva ehdolla typistettyä EGl:n ydindomeeniproteiinia ti transformantteina. Kun kantoja oli kasvatettu 1 3 siä sisältävässä Vogel'in mediumissa, niistä erj 5 genomin DNA ja kokonais-mRNA ja suoritettiin Soul Northern-blottikokeita käyttäen ainoastaan egll domeenin sisältävää eristettyä DNA-fragmenttia, keet osoittivat, että kyettiin eristämään transfc ja, joilla egll:n ydindomeeni-ilmentämiskasetti c 10 groituneena yhtenä yhtenäisenä kappaleena lA52:n ja että nämä samat transformantit tuottivat egll domeenin mRNA:ta.
Tämän jälkeen yhtä transformanttia kas\ 14 l:n vetoisessa fermentorissa käyttäen mediumeja 15 tiedetään tällä alalla soveltuvan sellulaasin ti Trichodermalla ja joita oli täydennetty lal· [Warzymoda, M., et ai. (1984), FR-patenttijulk 2 555 603]. Tulokseksi saatu kasvatusliuos konser ja tämän sisältämät proteiinit erotettiin komponer 20 sa SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla j ydindomeenin proteiini tunnistettiin Western-anaJ Fermentaatiosupernatantin proteiinikonsentraatior * *# ] tiin myöhemmin olleen noin 5-6 g/1, josta no
4,4 g/1 oli CMCaasiaktiivisuuden perusteella EGI
• p * .·*· 25 domeenia. Tämä arvo perustuu suoritetuista usei • · · • ·' ytimien fermentaatioista saatuun keskiarvoon.
• * M : Samalla tavoin voidaan edellä tarkasteltu V : telmiä muistuttavilla menetelmillä tuottaa mitä muuta endoglukanaasia tai tämän johdannaista ke : 30 siihen, onko se typistetty vai ei. Siten EGI:tä ***** tuottaa samanlaisten menetelmien avulla lukunnr 36 sellaisen EGIl:n tuottamiseen, josta selluloosa domeeni on jätetty pois.
Vertailuesimerkki 2 EG1:n ja EGII:n katalyyttisten ydinosien i 5 Osa 1. EGl:n katalyyttinen ydinosa EGI:n ydinosa puhdistettiin seuraavasti, roitu (UF) kasvatusliuos laimennettiin konsenl 14 mg/ml 23 mM Na-asetaatissa, jonka pH oli 5,0. nettuun EGI-ydinosaa sisältävään kasvatusliuoksee 10 tiin 200 grammaa avicel-selluloosageeliä (FMC Bioj tyyppi PH-101) ja seosta sekoitettiin huoneer 45 minuuttia. Avicel poistettiin kasvatusli sentrifugoimalla, mistä saatiin tulokseksi rikasti ydinosaliuos. Tämän jälkeen tämän liuoksen puski. 15 dettiin 10 mM TES-puskuriin, joka pH oli 7,5, sei valla kammiolla varustetulla Amiconin konsei laitteella käyttäen PM 10 -membraania (diafl filtration membranes, Amicon’in tuoteluette! 13132MEM 5468A). Tämän jälkeen EGl-ydinosanäyte 20 tiin anioninvaihtokolonniin (Q-sepharose fas
Pharmacia, tuoteluettelon nro 17-0510-01) ja eluoitiin 0 - 0,5 M NaCl-suolagradientilla, joka . .·. mistettu 10 mM TES'iin, jonka pH oli 7,5. EGI- * 9 · sisältävät fraktiot yhdistettiin ja konsentroitu * * » .1 l 25 mainitun sekoituskammion sisältävää Amiconin kon: • # · | l tilaitetta käyttäen.
* * ·
Osa 2. EGII:n katalyyttinen ydinosa V * Tässä keksinnössä ajatellaan EGXI:n kata] ydinosan puhdistuksen muistuttavan EGII-sellulaas ϊ.Ι,ϊ 30 osan puhdistusta, koska sen biokemialliset omii ovat samanlaiset. EGII-vdinosan teoreettinen nl 37 UF:lla konsentroitu kasvatusliuos suodatetaan piii ja siihen lisätään (NH4)2S04:ää, jolla liuoksen (Ϊ konsentraatio kohotetaan 1 M:ksi. Tämä liuos voit ten imeyttää hydrofobiseen kolonniin (suurivirta; 5 sinen fenyyli-sepharose-kolonni, Pharmacia, tuote] nro 17-0965-02) ja EGII voidaan eluoida yhdessä \ 0,15 M (NH4)2S04:ää käyttäen. EGII-ydinosaa sis fraktioiden puskuri voidaan sitten vaihtaa sitra* faattipuskuriin, jonka pH on 7 ja jonka sähkönjohl 10 0,18 mOhm. Tämä materiaali voidaan sitten imeytt ninvaihtokolonniin (suurivirtausnopeuksinen Q-s« Pharmacia, tuoteluettelon nro 17-0510-01), joka painotettu edellä olevalla sitraatti-fosfaattipus EGII-ydinosan odotetaan jäävän sitoutumatta kolc 15 saatavan siten talteen kolonnin läpi tulleessa pui Tätä keksintöä selitetään yksityiskohl käyttäen vielä seuraavaksi esitettyjä vertailuesii ja esimerkkiä 1. Esimerkissä 1 käytetään β-gluki tiivisuusyksikköjä. Tämä aktiivisuus määritetään £ 20 määrityksen avulla.
Yksi β-glukanaasiaktiivisuusyksikkö on se ί määrä, joka kuvatuissa olosuhteissa vapauttaa sub£ . .·. ta yhden mikromoolin pelkistäviä sokereita (ilme * * » glukoosiekvivalentteina) yhdessä minuutissa.
* φ » .1 ! 25 Reagenssit • · ·
Il 1. 1/0 % (w/v) β-glukaanisubstraatti 1,0 g yhteen liittynyttä seka^-( 1,3) (1,4; • · · V · nia (Biocon Biochemicals Ltd.) kostutetaan ] etanolia. Seokseen lisätään noin 80 ml tislattua 30 se kuumennetaan kiehuvaksi. Kiehuttamista jatke ··· • · Ιτλι ·Η4“ΛθΤ\ οαοοΉα Tyni Vimnao ft-rrl nl/aani r 38 mällä seokseen tislattua vettä. Seos suodatetaan tusuodatinpaperin läpi.
Substraattia voidaan käyttää välittömästi raatti on käyttökelpoinen kahden päivän ajan, jo 5 rastoidaan kylmähuoneessa.
2. 0,1 M natriumasetaattipuskuri, pH 5,0 A. Tislattuun veteen liuotetaan 8,2 g \ natriumasetaattia ja tilavuus säädetään 1 000 ml: latulla vedellä.
10 B. Tislattuun veteen liuotetaan 6,0 g jääel tilavuus säädetään 1 000 ml:ksi tislatulla vedell Liuoksen A pH säädetään arvoon 5,0 liuokse 3. Dinitrosalisyylihappo (DNS) -reagenssi Suspendoidaan 20,0 g 3,5-dinitrosalisyi 15 noin 800 ml;aan tislattua vettä. Seokseen lisätä telien 300 ml natriumhydroksidiliuosta (32,0 g 300 ml:ssa tislattua vettä) seosta jatkuvasti seh
Suspensiota lämmitetään vesihauteessa (sen lämp saa nousta yli +48 °C:een) seosta samalla sekoitl 20 nes siitä tulee selvästi läpinäkyvä. Seokseen vähitellen 600 g kaliumnatriumtartraattia. Liuost tetään tarvittaessa (lämpötila ei saa ylittää +48 . kauan, että siitä saadaan läpinäkyvä.
• 1 · '1· Seoksen tilavuus säädetään 2 000 ml:ksi ti • t 1 • · · /. I 25 vedellä ja se suodatetaan karkean lasisintterin 1 • 1 · :***: Seokseen lisätään 1 ml B-alukaanisubstraattia, si1 ; Liuos varastoidaan tummassa pullossa huonee * 1 ••j · sä. Reagenssi on pysyvä korkeintaan 6 kuukautta.
* Menetelmä 1. Entsyyminäyte
Tasapainotetaan 1 ml entsyymilaimennoste :.1.ί 30 natriumasetaattipuskurissa, jonka pH on 5,0) +3C
39 banssi 540 nm:n kohdalta määritetään tislattua vs taan.
2. Entsyyminollakoe
Inkuboidaan 1 ml β-glukaanisubstraattia +2 5 10 minuuttia. Seokseen lisätään 3 ml DNS-liuosta sekoitetaan. Seokseen lisätään 1 ml entsyymilad (0,1 M natriumasetaattipuskurissa, jonka pH on sitä sekoitetaan. Seosta kiehutetaan tasan 5 md Keaktioseos jäähdytetään kyImävesihauteessä huonec 10 ja absorbanssi määritetään 540 nm:n kohdalta 1 vettä vastaan.
Entsyyminäytteen ja entsyyminollakokeen absorbanssieron on oltava 0,3 - 0,5.
3. Standardikäyrä 15 Vedettömästä glukoosista valmistetaan s1 liuoksia tislattuun veteen. Standardeissa olevan c konsentraation on oltava alueella 0,1- 0,6 mg/ putkeen pipetoidaan 1 ml glukoosistandardiliuos tislattua vettä ja 3 ml DNS-reagenssia. Seosta sei 20 ja sitä pidetään kiehuvana tasan 5 minuuttia. Seoi tetään kyImävesihauteessä huoneenlämpöön ja abs 540 nm:n kohdalta määritetään standardinollakoe • ·« . .·. taan. Standardinollakokeessa käytetään glukoosi • · 1 tilalla 1 ml tislattua vettä. Muilla tavoin s1 • · · • · 9 .! I 25 nollakoetta käsitellään glukoosistandardin tavoir • · · ·1 Tehdään kuvaaja glukoosikonsentraatiosta at • » i : sin funktiona. Uusi standardikäyrä valmistetaan *·' ’ uudelle DNS-reagenssille.
Laskutoimitukset :.·.Σ 30 Näytteen β-glukanaasiaktiivisuus lasketaar «•t • · -ha · 1' 40 A(X) = entsyyminäytteen absorbanssi A(0) = entsyyminollakokeen absorbanssi k = standardikäyrän kaltevuus C1 = glukoosistandardikäyrän leikkauskohta 5 1 000 = kerroin, mmol -> μπιοί
Df s laimennuskerroin (ml/g) MWglu « glukoosin suhteellinen mc (180,16 mg/mmol) t = reaktioaika (10 minuuttia).
10 Vertailuesimerkissä 3 käytetään β-glukanaa kositeettia pienentävän aktiivisuuden määritys1 aktiivisuus määritetään käyttäen seuraavaa määrit Periaate β-glukanaasi katalysoi β-glukaanin hydroly^ 15 ka johtaa β-glukaaniliuoksen viskositeetin pienen
Ominaisviskositeetin käänteisluku ajan funktiona tion alkuvaiheessa lineaarinen funktio. Käyttäei lineaarisen osan kulmakerrointa voidaan määri glukanaasiaktiivisuus. Ominaisviskositeetin kään 20 määritetään kapillaariviskosimetriä käyttäen.
Laitteisto
Ostwald-kapillaariviskosimetri (Brand, nro 100 s) • ♦ 2 111' Vesihaude, joka on säädetty 30 °C:een .I I 25 Magneettisekoittaja * 2 1 ;2 Ajanottokello 2 • · 1 41 täen 2,5 g NaOH:ta (Merck 6498). Tilavuus s 1 000 ml:ksi tislatulla vedellä.
2. 0,05 M asetaattipuskuri, pH 4,0 Laimennetaan 100 ml 0,5 M asetaattipuski 5 4,0, 800 ml:aan tislattua vettä. pH säädetään tar\ arvoon 4,0 1 M NaOH:lla tai jääetikalla. Tilavuv tään 1 000 ml:ksi tislatulla vedellä. Suodateta sintterillä numero 4.
3. β-glukaaniliuos 10 Punnitaan 1,0 g toisiinsa liittynyttä (1,3)(1,4)-glukaania (Biocon Biochemicals) taarat kantterilasiin. Seokseen lisätään noin 6 ml eta sitä sekoitetaan metallisella sekoitussauvalla
toisiinsa liittynyt seka-p-glukaani on kokonaan J
15 Seokseen lisätään noin 80 ml tislattua vettä, sei magneettisekoittajalla ja liuos lämmitetään kii
Liuos pidetään kiehuvana siihen asti, kunnes 1 liittynyt seka-p-glukaani on kokonaan liuennut. \ taan, ettei dekantterilasin seinämiin ole jäänyt i 20 lia. Liuos jäähdytetään huoneenlämpöön sitä samali vasti sekoittaen. Seokseen lisätään 10 ml 0,5 M ai •\e puskuria, jonka pH on 4,0. pH säädetään tarvittc . voon 4,0 1 M NaOH: 11a tai jääetikalla. Seokseen .%·. tislattua vettä, kunnes substraattiliuoksen kokoi • * ••lm 25 on 100 g. Seos suodatetaan lasisintterillä nro c • * I ; raattiliuos varastoidaan korkeintaan 2 päivi • » · 1 ’ +4 °C:ssa.
* · * * · *·* * Suoritusvaiheet 1. Ominaisviskositeetin käänteisluvun määi 30 Ennen aktiivisuuden määritystä varu * * * S : viakosimetrin hinih-t-Aloinal 1 a cc ί-ΐ el ai 42
Kaikki näytteet, substraattiliuos ja visk on tasapainotettava 30 eC:ssa ainakin 15 minuul ennen määritystä.
Omina isvi skosi teet in käänteisluku saadaan y 5 1 V1» dT^ (Yhtäle 11 jossa 1/μ8ρ - ominaisviskositeetin käänteisluku 10 dT0 = asetaattipuskurin laskeutumisaika (sek dT8 = näyteliuoksen laskeutumisaika (sekun Liuosten laskeutumisaika noudattaa yhtälöä dTA - T2 - Tt - h (Yhtälö 2 15 jossa dT1 = liuosten laskeutumisaika T2 - = aika, joka menee liuoksen laskeu ylä- ja alamerkkien välillä kapillaarissa (sekunt h Hagenbachin kerroin • \e 20 Hagenbach'in kertoimet . Laskeutumisaika (dTt) • · · 1 , ·· s h • · . .
< 54,2 1,0 i 9 9 \ V1 25 54,3 - 57,3 0,9 57,4 - 60,5 0,8 ! 60,6 - 65,5 0,7 65,6 - 70,8 0,6 70,9 - 78,5 0,5 ··1 in 7ö a _ fiö o r\ a 1 · 43
Laskeutumisajan määritys aloitetaan puht kuivalla viskosimetrillä pumppaamalla 7,5 ml kapillaariputkeen niin, että liuoksen pinta tul€ laarin ylämerkin yläpuolelle. Ajanottokellolla mä1 5 se aika, joka liuokselta kuluu laskeutumiseen kai ylämerkistä alamerkkiin.
2. Asetaattipuskurin laskeutumisajan määri
Aina β-glukaanisaktiivisuutta määritettäesi tetään 0,05 M asetaattipuskurin, pH 4,0, laskeul 10 (dT0) edellä kuvatulla tavalla.
3. β-glukaaniliuoksen säätö β-glukaanin hydrolyysissä on ominaisviskc käänteisluvun lähtöarvon oltava 0,13. β-glukaand viskositeetti vaihtelee valmistuserästä toiseen j« 15 kompensoitava muuttamalla β-glukaaniliuoksen ja suhde sellaiseksi, että lähtöviskositeetti saadaai si.
Valmistetaan 5 erilaista β-glukaanin j< asetaattipuskurin, pH on 4,0, seosta pipetoimall 20 kaania (A) 5,0- 6,5 ml ja sellaiset vastaava 1,0 ml:n määrät 0,05 M asetaattipuskuria, jonka pl joilla kunkin seoksen kokonaistilavuudeksi tulee . Näiden liuosten viskositeetit määritetään ja omd » 2 1 121 kositeettien käänteisluvut lasketaan.
• 9 » • · 9 ,1 ; 25 Valmistetaan kuvaaja, joka esittää • · 9 ;1 viskositeetin käänteislukua β-glukaanipitoisuudi 2 • 2 44 4. β-glukanaasiaktiivisuuden määritys
Koeputkeen pipetoidaan edellä kuvatulla määritetty β-glukaanitilavuus (A) ja sitä tasapai 30 °C:ssa ainakin 15 minuuttia. Koeputkeen lisät 5 (V 7,5 ml - A) entsyyminäytettä, joka on lai 0,05 M asetaattipuskuriin, jonka pH on 4,0, ji tasapainotetaan 30 °C:ssa ainakin 15 minuuttia. Ä kello käynnistetään. Liuosta sekoitetaan huolelli se siirretään viskosimetriin. Laskeutumisajat dTs 10 tään 4-5 kertaa 20 - 30 minuutin aikana liuoster tamisesta.
Määritykset on tehtävä ainakin kahdesta eri noksesta ja käyttäen ainakin kolmea kustakin li tehtyä rinnakkaismääritystä. Näytteen varsinainen 15 nus on riippuvainen entsyymiseostuotteesta ja mää västä lopullisesta rehusta. Laimennokset esitetä seen. Entsyymiseosten kyseessä ollessa kokonaisia kerroin on tyypillisesti 1/2 000 - 1/15 000 ja le teenä olevien rehujen kyseessä ollessa 1/5 - 1/20 20 Laskutoimitukset
Ominaisviskositeettien käänteisluvut laske :*.a' tälön 1 mukaan. Valmistetaan kuvaaja, joka esit , .·, naisviskositeetin käänteislukua hydrolyysiajan f • · (sekunneissa ilmoitettuna).
# * » ,1 l 25 β-glukanaasiaktiivisuus määritetään * * viskositeetin käänteisluvun (IRV) suurentumisena n :l\} sa, yhtälö 3.
• · · ♦ · # , β-glukanaasiaktiivisuus = (iRVU/g) = k x Dx 60 (yhtäi
« · · V
··♦ • ·
• I
45 60 = muuntokerroin, s -* min V » näytteen tilavuus Kirjallisuusviite
The Institute of Brewing (1979) J. Inst. 5 92 - 94.
Analyse av β-glukanaseaktivitet ved viskos metode, Norges Veterinaerhogskole.
Vertailuesimerkki 3
Suoritetussa ensimmäisessä kokeessa oli te 10 sena oli tutkia endoglukanaasipitoisuuksiltaan r±V
jen useiden erilaisten sellulaasien tehokkuutta -olosuhteissa kokosellulaasiin verrattuna. Valmi siten 7 erilaista entsyymipreparaattia, joista ens oli peräisin luonnossa esiintyvästä T. longibrachi 15 ja preparaatit 2. - 7. tämän geneettisesti modifi kannoista seuraavan taulukon 1 mukaisesti: Taulukko 1
Entsyymipreparaatti_Kannan g^niyfcyyppi_
Kokosellulaasi EGI+ EGII+ EGIII* CBHI+ CHBI
20 Rikastettu EGI:n suh- EGI+++ EGII+ EGIII+ CBHI' CHE teen j\. Rikastettu EGI.Acbd:n EGI.Äcbd* EGI" EGXI" EGIII+ suhteen CBHII" • * · • · ·
Rikastettu EGII:n suh-EGI+ EGII*” EGIII* CBHI" CBE
*.·.· 25 teen ·· «
: V Rikastettu EGIII:n EGI" EGII’ EGIII* CBHI" CBHI
ϊ **. suhteen • * ♦ ·♦· ·
Puhdistettu EGIII EGI" EGII" EGIII* CBHI" CBHI
• · ♦ 30 Edellä olevassa taulukossa 1 sisältää rifc EGI: tä tuottava kanta useita EGI:tä koodaavia * · · S : Samalla tavoin sisältävät rikastettua EGII:tä ia 11 46
Rikastettu EGI-entsyymipreparaatti, ri EGII-entsyymipreparaatti, rikastettu EGIII-entsyy raatti ja puhdistettu EGIII-entsyymipreparaatti noudattaen julkaisussa PCT WO 92/06 209 kuvattuja 5 miä. Puhdistettu EG111 oli sama kuin rikastetta lukuunottamatta sitä, että eritettyä EGlII:tä s supernatantti puhdistettiin ksylanaasiaktiivisuud tamiseksi PEG-menetelmällä, joka on kuvattu US-p julkaisussa nro 5 328 841. Typistetty EGl:n ydin 10 niistettiin vertai lues inter ki s sä 1 kuvatuilla mene ja puhdistettiin vertailuesimerkin 2 mukaisesti.
Kustakin edellä olevasta entsyymi pr eparaatd ritettiin viskositeettia pienentävä aktiivisuus li la ohran toisiinsa liittyneillä seka-p-glukaanill 15 kuvatun määrityksen mukaan.
Tämän tutkimuksen tulokset on esitetty kuvd kaisessa kaaviossa. Koska T. longibrachiatumin β-g siä annostellaan rehun lisäaineeksi sen aktiivisu rusteella, joka on määritetty pelkistävien soker 20 määritysmenetelmällä, niin viskositeettia pie aktiivisuuden määritykseen lisättävän entsyymi standardoitiin tätä menetelmää käyttäen.
( Kuviossa 5 esitetyt tulokset osoittavat, et ***** .·.·. sellulaasin viskositeettia pienentävä aktiivisuu! * * * •llm 25 arvoon katsomatta suurempi kuin minkään rikastet • * I ; glukanaasipreparaatin aktiivisuus.
• * *
Esimerkki 1 * * *
Broilerikananpojista kootuille kolmelletoi mälle, joissa kussakin oli kokeeen alussa vähintäc
B
30 nanpoikaa, syötettiin taulukossa 2 esitettyä ohrap 5 · rehua näiden kasvaessa 8 päivän ikäisistä 21 päiv 47
Taulukko 2 ftinftgnsat_1-määrä_Paino_
Ohra 58,56 % 585,63
Soijajauho ml 48 31,63 % 316,26 5 Soijaöljy 6,07 % 60,65
Suola 0,29 % 2,90 DL-metioniini 0,28 % 2,76
Lysiini-HCl 0,04 % 0,44
Kalkkikivi 1,41 % 14,06 10 Dikalsiumfosf. 1,23 % 12,31
Vitamiinit 0,50 % 5,00
Yhteensä 100,00 % 1000,00
Edellä olevan rehun ravintoarvo voidaan ar 15 tietokoneella käyttäen esimerkiksi Format Inte1 -yhtiöstä saatavilla olevaa ohjelmaa "Format". Tär ma analysoi rehun ravintosisällön mukaan lukien es si eri metaboliittien odotetut ravintopitoisuudet kon 2 mukaisen rehun tällaisen analyysin tuloksel 20 tetty seuraavassa taulukossa 3.
i · • · • t» • · ♦ * « t ν·ν • · • · 1 • · t 4 4 »· » • · » • 1 • · • Φ ♦ · « 4 1 m • · 1 · i«· • · · • · « • 1 1 • « · • · 1 ♦ Λ m.
48
OhrapohJainen ruokavalio
Taulukko 3 - ________ lm-—·-
Raakaprotelini. * 22,00 22,00 5 HS (netabolizable energy, metabolöitaviAse oleva ener-3000,00 3000,00 gia) siipikarjalla, kcal/kg DB (digestible energy, sulava energia) sioilla, kcal 3363,16
Kalsiua 0.90 0,90
Fosfori, * 0,66 Käytettävissä oleva fosfori, * 0,40 0,40
Rasva. % 7,28
Kuitu, S 4,00
Het, % 0.58
Cys, % 0,37 ^5 Het + Cys. * 0.95 0.95
Lys, * 1,25 1.25
Hls. % 0.52
Thr, * 0,24 0,30
Tre, * 0,80 0,82 20 Arg % 1.40 1.44
Iso, * 1,01
Leu. * 1.59
Phe, X 1,11
Vai, * 1.10 25 oiy, % 0,99 ·· • *·♦ Fhe + Tyr * 1,89 • Ha X 0,15 0,15 *ϊ·* ,·β· Cl X 0,29 .* *' K K 0,96
• *** O
• *· ^ Linoleenihappo % 1,00 3,00 J · • ; · Na + K + HC1 2,29 ·*· : Näitä kahdelletoista kananpo ikäryhmä lie S] ohrapohjaisia rehuja täydennettiin vaihtelevilla . .·. kutakin edellä olevassa taulukossa 1 esitettyä i preparaattia. Kukin entsyymipreparaatti tutkitti
^ ^ M ΑΆ 1 1 A e M ^ Λ ö M 1 m .1« m -m. m a J J 1 _ _ A A A ^ J
49 ryhmän ruokavaliota ei täydennetty millään entsyy raatilla.
Näiden useiden eri tutkimusten tulokset on seuraavissa taulukoissa 4 ja 5. Taulukossa 4 esit 5 lokset vastaavat ruokavalioita, joita on täydenn yksiköllä β-glukanaasiaktilvisuutta rehukiloa ko taas taulukossa 5 esitetyt tulokset ovat rehuill on täydennetty 240 yksiköllä β-glukanaasiaktii rehukiloa kohti. Taulukoissa 4 ja 5 esitetyistä tu 10 käyvät ilmi ruumiinpainon lisäys, rehuhyötysuhde rointestinaalialueen viskositeetti eri broilerikan ryhmissä. Tuloksissa on huomioitu esiintynyt kuol
Taulukko 4
Painon- Rehu- lisäys hyöty- Viskositeetti Pi 15 (g)_suhde (cps)_
Kontrolli 329 1,72 15,3 x 10’3 (15,;
Rikastettu EGI 358 1,60 12,6 x 10-3 (12, i
Rikastettu 437 1,42 10,5 x 10'3 (10,! EGI.Acbd .. 20 Rikastettu EGII 396 1,50 13,6 x 10-3 <13,i : " Rikastettu EGIII 356 1,66 6,0 x 10"3 (6,1 * · ·
Puhdistettu EGIII 332 1,85 7,9 x 10-3 (7/ * 1 2 3 1 lii Täydellinen sellu-381 1,62 10,3 x 10'3 (10,; : 1 : laasi ;25 • · m ··« « ««· * · » « · » · ♦ 2 • I · *«« 3 • ♦ • 1 1 50
Taulukko 5
Painon- Rehu- lisäys hyöty- Viskositeetti P< (g)_suhde (cps)_
Kontrolli 329 1,72 15,3 x 10’3 (15,1
Rikastettu EGI 376 1,60 14,5 x 10"3 (14,! 5 Rikastettu 395 1,57 5,6 x 10-3 (5,' EGI.Äcbd
Rikastettu EGII 377 1,70 11,6 x 10“3 (11,
Rikastettu EGIII 423 1,54 8,1 x 10‘3 (8,
Puhdistettu EGIII 401 1,56 7,7 x ΙΟ’3 (7,1 10 Täydellinen sellu-404 1,66 6,4 x 10"3 (6,4 laasi
Edellä olevista tuloksista voidaan nähdä, e trolliryhmän ruumiinpainon lisäys, rehuhyötysuhde 15 kositeetti ilman entsyymitäydennystä olivat suht heikot. Kokosellulaasituloksiin verrattuna on ri EGI FCR:n suhteen tehokkaampaa, kun annoksena h 240 yksikköä rehukiloa kohti. Samoin on myös as rikastetun EGIIIrn ja puhdistetun EGIlI:n suhte 20 saalta rikastetulla EGII:11a saadaan ylivoimaise set, kun konsentraationa käytetään 120 yksikköä i • » * " kohti. Lopuksi edullisimmasta entsyymipreparaatis « on rikastettu EGI.Äcbd, saadaan ylivoimaiset :V: käyttäen sekä 120 että 240 yksikköä rehukiloa koh1 j"·*; 25 entsyymipreparaatis ta, josta selluloosaa sitova dc
: poistettu, saadaan ylivoimaiset tulokset molemmilJ
·«· · ····. tuilla konsentraatloilla verrattuna rikastettuun 1 peräisin EGI-tyyppiin. Nämä tulokset viittaavat m . .·. vasti siihen, että optimaalinen annos eri entsyj • # « IV. 30 rasteilla on erilainen tarkasteltaessa niiden vai • « 4 51 vitro -tutkimuksessa oli kokosellulaasilla suure kositeettia pienentävä aktiivisuus kuin EGl:n, EGIII:n ja EGI.Acbdin rikastetuilla preparaatein Tästä poiketen esimerkin 1 mukaiset in vi 5 suhteissa saadut tutkimustulokset viittaavat siih kussakin tutkitussa entsyymipreparaatissa oli aine edullinen ominaisuus niiden ominaisuuksien Joukosi ovat ruumiinpainon lisäyksen parantuminen, rehuh? ja/tai gastrointestinaalialueella havaittavan vis 10 tin pienentyminen, verrattaessa näitä kokosell molemmilla tutkituilla konsentraatioilla. Edulli syymipreparaatit ovat EGI.Äcbd ja EGIII.
Näitä vaikutuksia, jotka ovat rehuhyötysuht nentyminen ja/tai gastrointestinaalisten viskosi 15 pienentyminen ja jollaisia on edellä osoitettu aikaan, voidaan myös saada aikaan ruokittaessa kuten kalkkunoita, hanhia, ankkoja, sikoja, lam; karjaa sekä kanoja, tämän keksinnön mukaisesti v tuilla rehuilla, jotka puolestaan perustuvat mui 20 joihin, kuten vehnään, ruisvehnään, rukiiseen ja ir • « • · * * • « · • · * «M » m · · • · ♦ • * • · · ♦ · • · • · • · * • · · ··· » * · « * · + • · * • · I • * · M· • « « · 52
Sekvenssi lista (1) GENERAL INFORMATION: (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:l: .. (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS; i · • ·· , {A) LENGTH: 159 base pairs * · t ··· <B) TYPE; nucleic acid I * · I ** * * (C) STRANDEDNESS: single I * · * * * I ··· : (D) TOPOLOGY: linear • ·* J » f I · (ii> MOLECULE TYPE: DNA (genomic) . /. (ix) FEATURE: • » « ··· Λ 53 A CG TCG GGC ACT ACG TGC CAG TAT AGC AAC GAC 7 GT7CG7ATCC Thr Ser Gly Thr Thr Cys Gin Tyr Ser Asn Asp 20 25
CCATGCCTGA CGGGAGTGAT TTTGAGATGC TAACCGCTAA AATACAG AC TAC TCG
Tyr Tyr Ser 30 CAA TGC OTT TA | Gin Cys Leu (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:2: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 33 amino acids (B) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY: linear ··. (ii) MOLECULE TYPE: protein * I» ; fxi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 2: ··· ft ft t ft 1 * · ft ft · ft1 ft * · 1 • His Trp Gly Gin Cys Gly Gly lie Gly Tyr Ser Gly Cys Lys Thr Cys I ft is 10 15 ft 1 · ft ft ft ·1· Thr Ser Gly Thr Thr Cys Gin Tyr Ser Asn Asp Tyr Tyr Ser Gin Cys • ft ft « 1 ft ft 54 (C) STRANDEDNESS: Single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic) (ix) FEATURE:
(A) NAME/KEY: CDS
(B) LOCATION: 1..108
Ui) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 3:
CAG CAG ACT GTC TGG GGC CAG TGT GGA GGT ATT GGT TGG AGC GGA CCT
Gin Gin Thr Val Trp Gly Gin Cys Gly Gly lie Gly Trp Ser Gly Pro 15 10 15
ACG AAT TGT GCT CCT GGC TCA GCT TGT TCG ACC CTC AAT CCT TAT TAT
Thr Asn Cys Ala Pro Gly Ser Ala Cys Ser Thr Leu Asn Pro Tyr Tyr 20 25 30
GCG CAA TGT ATT
» · • ΨΨ * t #·ρ Ala Gin Cys He • t I • · « • V. 35 • ♦ * • ♦ *· · :1: • « : .\ Ϊ.Ϊ · (2) INFORMATION FOR SEQ ID N0:4: > * * * (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: . (A) LENGTH: 36 amino acids * * * *'*'· iB) TYPE: amino acid 55
Thr Asn Cys Ala Pro Gly Ser Ala Cys Ser Thr Leu Asn Pro Ί 20 25 30
Ala Gin Cys lie 35 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:5; (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 1201 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic) (ix) FEATURE:
(A) NAME/KEY: CDS
(B) LOCATION: join(l..704, 775.,1201) (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:5: I» • » » ·· : cag caa ccg ggt acc agc acc ccc gag gtc cat ccc aag ttg ai • · · 4 4 ·.·.* Gin Gin Pro Gly Thr Ser Thr Pro Glu Val His Pro Lys Leu T] *4 ♦ • ♦ · : ·* 1 S 10 4 ·
«44 * · I
«4« * 44·
» > I
» ft ft ft TAC AAG TGT ACA AAG TCC GGG GGG TGC GTG CCC CAG GAC ACC TC Tyr Lys Cys Thr Lys Ser Gly Gly Cys Vai Ala Gin Asp Thr Se * 56
Cys Thr Vai Asn Gly Gly Val Asn Thr Thr Leu Cys Pro Asp Glu A 50 55 60
ACC TGT GGC AAG AAC TGC TTC ATC GAG GGC GTC GAC TAG GCC GCC T
Thr Cys Gly Lys Asn Cys Phe Ile Glu Gly Vai Asp Tyr Ala Ala s 65 70 75
GGC GTC ACG ACC TCG GGC AGC AGC CTC ACC ATG AAC CAG TAC ATG C
Gly Val Thr Thr Ser Gly Ser Ser Leu Thr Met Asn Gin Tyr Met P
85 90 95 AGC AGC TCT GGC GGC TAC AGC AGC GTC TCT CCT CGG CTG TAT CTC C’
Ser Ser Ser Gly Gly Tyr Ser Ser Val Ser Pro Arg Leu Tyr Leu L< 100 105 110 GAC TCT GAC GGT GAG TAC GTG ATG CTG AAG CTC AAC GGC CAG GAG Cl Γ. Asp Ser Asp Gly Glu Tyr Val Met Leu Lys Leu Asn Gly Gin Glu Li : ns 120 125 a · • · · « « « * ft • ft · * · ·
• ** AGC TTC GAC GTC GAC CTC TCT GCT CTG CCG TGT GGA GAG AAC GGC TC
• ft ft ft · ft ft ft *ΓΓ/ Ser Phe Asp Val Asp Leu Ser Ala Leu Pro Cys Gly Glu Asn Gly Se ft · ft 130 135 140 ft ft ft ft ft * ft • ft ft ft ft ft 57
GTC CAG ACA TGG AGG AAC GGC ACC CTC AAC ACT AGC CAC CAG GGC TTC
Val Gin Thr Trp Arg Asn Gly Thr Leu Asn Thr Ser His Gin Gly Phe 180 185 190
TGC TGC AAC GAG ATG GAT ATC CTG GAG GGC AAC TCG AGG GCG AAT GCC
Cys Cys Asn Glu Met Asp lie Leu Glu Gly Asn Ser Arg Ala Asn Ala 195 200 205
TTG ACC CCT CAC TCT TGC ACG GCC ACG GCC TGC GAC TCT GCC GGT TGC
Leu Thr Pro His Ser Cys Thr Ala Thr Ala Cys Asp Ser Ala Gly Cys I 210 215 220 GGC TTC AAC CCC TAT GGC AGC GGC TAC AAA AG GTGAGCCTGA Gly Phe Asn Pro Tyr Gly Ser Gly Tyr Lys Ser 225 230 235 ;*·<β TGCCACTACT ACCCCTTTCC TGGCGCTCTC GCGGTTTTCC ATGCTGACAT GGTTTTCCAG * * « * · • · · ··· • * » i » ***** C TAC TAC GGC CCC GGA GAT ACC GTT GAC ACC TCC AAG ACC TTC ACC • ♦ » • » ft * * • * Tyr rpyT Pro ^ τhr Val Asp Thr Ser Lys Thr Phe Thr • * a i ft i «ift i 240 245 250 • · · a
ATC ATC ACC CAG TTC AAC ACG GAC AAC GGC TCG CCC TCG GGC AAC CTT
• «ft • » Λ * 5β
GCC CAG CCC GGC GGC GAC ACC ATC TCG TCC TGC CCG TCC GCC TCA GCC Ala Gin Pro Gly Gly Asp Thr He Ser Ser Cys Pro Ser Ala Ser Ala 285 290 29S
TAC GGC GGC CTC GCC ACC ATG GGC AAG GCC CTG AGC AGC GGC ATG GTG Tyr Gly Gly Leu Ala Thr Met Gly Lys Ala Leu Ser Ser Gly Met Val 300 305 310 CTC GTG TTC AGC ATT TGG AAC GAC AAC AGC CAG TAC ATG AAC TGG CTC Leu Vai Phe Ser He Trp Asn Asp Asn Ser Gin Tyr Met Asn Trp Leu 315 320 325 330
GAC AGC GGC AAC GCC GGC CCC TGC AGC AGC ACC GAG GGC AAC CCA TCC Asp Ser Gly Asn Ala Gly Pro Cys Ser Ser Thr Glu Gly Asn Pro Ser 335 340 34S
·· : *·· AAC ATC CTG GCC AAC AAC CCC AAC ACG CAC GTC GTC TTC TCC AAC ATC • * ♦ I *···* Asn He Leu Ala Asn Asn Pro Asn Thr His Val Val Phe Ser Asn He * · 1 * * · • · « .1 l 350 355 360 • ♦ · • » • • « • · « • ♦ * *·· ·
:V: CGC TGG GGA GAC ATT GGG TCT ACT ACG AAC TCG ACT GCG CCC CCG
Arg Trp Gly Asp He Gly Ser Thr Thr Asn Ser Thr Ala Pro Pro * 4 * · ’"·* 365 370 375 • · 59 (ii) MOLECULE TYPE: procein (xi) SEQUENCE DESCRIPTION; SEQ ID NO; 6;
Gin Gin Pro Gly Thr Ser Thr Pro Glu Val His Pro Lys Leu T1 1 S 10 3
Tyr Lys Cys Thr Lys Ser Gly Gly Cys Vai Ala Gin Asp Thr Se 20 25 30
Val Leu Asp Trp Asn Tyr Arg Trp Met His Asp Ala Asn Tyr As 35 40 45
Cys Thr Val Asn Gly Gly Val Asn Thr Thr Leu Cys Pro Asp G1 50 55 60
Thr Cys Gly Lys Asn Cys Phe Ile Glu Gly Vai Asp Tyr Ala A1 65 70 75
Gly Val Thr Thr Ser Gly Ser Ser Leu Thr Met Asn Gin Tyr Me • 85 90 9 + J * t
Ser Ser Ser Gly Gly Tyr Ser Ser Val Ser Pro Arg Leu Tyr Le • * • ii .;Y 100 105 110 • · · • · • » * Asp Ser Asp Gly Glu Tyr Val Met Leu Lys Leu Asn Gly Gin Gli • · »** * I*;*; 115 120 125
Ser Phe Asp Val Asp Leu Ser Ala Leu Pro Cys Gly Glu Asn Gl; * a a “·!·’ 130 135 140 : : 60 195 200 205
Leu Thr Pro His Ser Cys Thr Ala Thr Ala Cys Asp Ser Ala G 210 215 220
Gly Phe Asn Pro Tyr Gly Ser Gly Tyr Lys Ser Tyr Tyr Giy p 225 230 235
Asp Thr Val Asp Thr Ser Lys Thr Phe Thr lie lie Thr Gin P; 245 250 2
Thr Asp Asn Gly Ser Pro Ser Gly Asn Leu Val Ser He Thr A: 260 265 270
Tyr Gin Gin Asn Gly Vai Asp He Pro Ser Ala Gin Pro Gly G 275 280 285 ^ Thr He Ser Ser Cys Pro Ser Ala Ser Ala Tyr Gly Gly Leu a: ^ 290 295 300 I Met Gly Lys Ala Leu Ser Ser Gly Met Val Leu Val Phe Ser Ij 305 310 315
Asn Asp Asn Ser Gin Tyr Met Asn Trp Leu Asp Ser Gly Asn A] • * * '*· 325 330 3; * • I » *···* Pro Cys Ser Ser Thr Glu Gly Asn Pro Ser Asn He Leu Ala As • 9 ♦ ♦ ♦ • · · .1 l 340 345 350 • · · • 9 ♦ · : Pro Asn Thr His Vai Vai Phe Ser Asn Ile Arg Trp Gly Asp 11 ί :T: 355 360 365 9
Ser Thr Thr Asn Ser Thr Ala Pro Pro 370 375 * » 9 61 (ii) MOLECULE ΤΥΡΕ: DNA (genomic) (ix) FEATURE:
(A) NAME/KEY: CDS
(B) LOCATION: join(1. .56, 231. .1158) (xi> SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 7 :
GGG GTC CGA TTT GCC GGC GTT AAC ATC GCG GGT TTT GAC TTT GGC 1 Gly Vai Arg Phe Ala Gly Vai Asn Ile Ala Gly Phe Asp Phe Gly C IS 10 IS
ACC ACA GA GTGAGTACCC TTGTTTCCTG GTGTTGCTGG CTGGTTGGGC Thr Thr Asp
GGGTATACAG CGAAGCGGAC GCAAGAACAC CGCCGGTCCG CCACCATCAA GATGTG GTAAGCGGCG GTGTTTTGTA CAACTACCTG ACAGCTCACT CAGGAAATGA GAATTA
·« • · « «· »
\5.: AAGTCTTGTT ACAG T GGC ACT TGC GTT ACC TCG AAG GTT TAT CCT CCG
• ·
III
,1 ·" Gly Thr Cys Vai Thr Ser Lys Val Tyr Pro Pro I : : ,ίφ 20 25 30 I · 1 1 · · • · 1 I 1 TTG AAG AAC TTC ACC GGC TCA AAC AAC TAC CCC GAT GGC ATC GGC C; * 1 ♦ ·!1' Leu Lys Asn Phe Thr Gly Ser Asn Asn Tyr Pro Asp Gly Ile Gly G] • M » « 62
Vai Gly Trp Gin Tyr Leu Vai Asn Asn Asn Leu Gly Gly Asn Leu As; 65 70 75 TCC ACG AGC ATT TCC AAG TAT GAT CAG OTT GTT CAG GGG TGC CTG TC'
Ser Thr Ser Ile Ser Lys Tyr Asp Gin Leu Vai Gin Gly Cys Leu Se: 80 S5 90
CTG GGC GCA TAC TGC ATC GTC GAC ATC CAC AAT TAT GCT CG A TGG AAC
Leu Gly Ala Tyr Cys Ile Vai Asp Ile His Asn Tyr Ala Arg Trp Asr
95 100 105 11C
GGT GGG ATC ATT GGT CAG GGC GGC CCT ACT AAT GCT CAA TTC ACG AGC
Gly Gly Ile Ile Gly Gin Gly Gly Pro Thr Asn Ala Gin Phe Thr Ser 115 120 125 CTT TGG TCG CAG TTG GCA TCA AAG TAC GCA TCT CAG TCG AGG GTG TGG ·*·., Leu Trp Ser Gin Leu Ala Ser Lys Tyr Ala Ser Gin Ser Arg Vai Trp e 130 135 140 • · • · « » * · • · ·· ·
i V
. . TTC GGC ATC ATG AAT GAG CCC CAC GAC GTG AAC ATC AAC ACC TGG GCT
* · · * · · *·· *
Phe Gly Ile Met Asn Glu Pro His Asp Vai Asn Ile Asn Thr Trp Ala e * 145 150 155 * ; * · • · · • »k 1 * · • « 63 7TC ΑΤΑ TCC GAT GGC AGT GCA GCC GCC CTG TCT CAA GTC ACG AAC CCG ?he lie Ser Asp Gly Ser Ala Ala Ala Leu Ser Gin Val Thr Asn Pro 195 200 205 GAT GGG TCA ACA ACG AAT CTG ATT TTT GAC GTG CAC AAA TAC TTG GAC Asp Gly Ser Thr Thr Asn Leu lie Phe Asp Val His Lys Tyr Leu Asp 210 215 220 TCA GAC AAC TCC GGT ACT CAC GCC GAA TGT ACT ACA AAT AAC ATT GAC Ser Asp Asn Ser Gly Thr His Ala Glu Cys Thr Thr Asn Asn lie Asp 225 230 235 GGC GCC TTT TCT CCG CTT GCC ACT TGG CTC CGA CAG AAC AAT CGC CAG Gly Ala Phe Ser Pro Leu Ala Thr Trp Leu Arg Gin Asn Asn Arg Gin 240 245 250
GCT ATC CTG ACA GAA ACC GGT GGT GGC AAC GTT CAG TCC TGC ATA CAA
# «
Ala lie Leu Thr Glu Thr Gly Gly Gly Asn Val Gin Ser Cys lie Gin V.: 255 260 265 270 «· * I ft « » » * * • 4
• · I
• 44 1 *#* «
GAC ATG TGC CAG CAA ATC CAA TAT CTC AAC CAG AAC TCA GAT GTC TAT
• · · «
Asp Met Cys Gin Gin lie Gin Tyr Leu Asn Gin Asn Ser Asp Val Tyr * 275 280 285 • 4 9 • 9 • · 64
Leu Thr Glu Thr Pro Thr Ser Ser Gly Asn Ser Trp Thr Asp Th 305 310 315 TTG GTC AGC TCG TGT CTC GCA AGA AÄG TA Leu Vai Ser Ser Cys Leu Ala Arg Lys 320 325 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:8: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS; (A) LENGTH: 327 amino acids <B) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY; linear (ii) MOLECULE TYPE: protein (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:B:
Gly Vai Arg Phe Ala Gly Val Asn lie Ala Gly Phe Asp Phe Gl} #* : ’·* 1 5 10 15 Ψ • · · * · » • « i « · • « « ·· . Thr Thr Asp Gly Thr Cys Val Thr Ser Lys Val Tyr Pro Pro Leu • * ! • ♦ ί 20 25 30 • · · ··* · ··« • * · • · ·
Asn Phe Thr Gly Ser Asn Asn Tyr Pro Asp Gly lie Gly Gin Met : 35 40 45 • » • 9 65 11 i
Ser Ile Ser Lys Tyr Asp Gin Leu Val Gin Gly Cys Leu Ser Leu 65 90 95
Ala Tyr Cys Ile Vai Asp He His Asn Tyr Ala Arg Trp Asn Gly 100 105 110
Ile He Gly Gin Gly Gly Pro Thr Asn Ala Gin Phe Thr Ser Leu 115 120 125
Ser Gin Leu Ala Ser Lys Tyr Ala Ser Gin Ser Arg Val Trp Phe 130 135 140
He Met Asn Glu Pro His Asp Val Asn He Asn Thr Trp Ala Ala 145 ISO 155
Vai Gin Glu Vai Vai Thr Ala He Arg Asn Ala Gly Ala Thr Ser Γ\, 165 170 175 • • » t ft · ft • ♦ft • ft ft ft ft I**·* Phe He Ser Leu Pro Gly Asn Asp Trp Gin Ser Ala Gly Ala Phe ft ft • ft ! I 180 185 190 • * * • « · *·« · • · · • · *
Ser Asp Gly Ser Ala Ala Ala Leu Ser Gin Val Thr Asn Pro Asp ft 195 200 205 ft ft ft ft ft ft ft 66
Phe Ser Pro Leu Ala Thr Trp Leu Arg Gin Asn Asn Arg Gin Ala 245 250 255
Leu Thr Glu Thr Gly Gly Gly Asn Vai Gin Ser Cys Ile Gin Asp I 260 265 270
Cys Gin Gin lie Gin Tyr Leu Asn Gin Asn Ser Asp Val Tyr Leu C 275 280 2B5
Tyr Val Gly Trp Gly Ala Gly Ser Phe Asp Ser Thr Tyr Val Leu Ί 290 295 300
Glu Thr Pro Thr Ser Ser Gly Asn Ser Trp Thr Asp Thr Ser Leu V 305 310 315 3
Ser Ser Cys Leu Ala Arg Lys *» » « : ·* 325 • I > · I I · 999 • 9 • 99 • 99 2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:9: • · * * ; (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: • 99 9 5*5*: (A) LENGTH: 81 base pairs (B) TYPE: nucleic acid • · · * · · (C) STRANDEDNESS: single 67 11ι
CCC CCG CCT GCG TCC AGC ACG ACG TTT TCG ACT ACA CCG AGG
Pro Pro Pro Ala Ser Ser Thr Thr Phe Ser Thr Thr Pro Arg 15 10
ACG ACT TCG AGC AGC CCG AGC TGC ACG CAG ACT
Thr Thr Ser Ser Ser Pro Ser Cys Thr Gin Thr 20 25 (2) INFORMAT I ON FOR SEQ ID NO:10: U) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 27 amino acids (B) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: protein (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:10: ·1 Pro Pro Pro Ala Ser Ser Thr Thr Phe Ser Thr Thr Pro Arg • I» . 1 5 10 • « « 4 · ♦ 1 1 • · 1 « • · ♦ t .1 Thr Thr Ser Ser Ser Pro Ser Cys Thr Gin Thr \\V 20 25 « » « • · « a ·’· (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 11: * » · • is • 9 ... _________ _____________ ___ 116 68
(Λ) ΗΑΜΕ/KEY: CDS
(3) LOCATION: 1..102 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:11: CCG GGA GCC ACT ACT ATC ACC ACT TCG ACC CGG CCA CCA TCC GGT C(
Pro Gly Ala Thr Thr He Thr Thr Ser Thr Arg Pro Pro Ser Gly Pi
15 10 IS
ACC ACC ACC ACC AGG GCT ACC TCA ACA AGC TCA TCA ACT CCA CCC AC
Thr Thr Thr Thr Arg Ala Thr Ser Thr Ser Ser Ser Thr Pro Pro Th 20 25 30
AGC TCT
Ser Ser (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:12: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS : (A} LENGTH: 34 amino acids • ♦ *·1·1 (B) TYPE: amino acid · · • · · • · I ; (D) TOPOLOGY: linear • 1 * « · «94 1 (ii) MOLECULE TYPE: protein • · 1 « (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:12; • · · • · · • 94 ··
• V
• · ...
69 11 { : . IH FORMAT I ON’ FOR SEQ ID NO: 13 : (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 66 base pairs (3) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic) (ix) FEATURE:
(A) NAME/KEY: CDS
(B) LOCATION: 1..66 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:13: ATG GCG CCC TCA GTT ACA CTG CCG TTG ACC ACG GCC ATC CTG GCC A' Met Ala Pro Ser Val Thr Leu Pro Leu Thr Thr Ala lie Leu Ala i: 15 10 15
GCC CGG CTC GTC GCC GCC
• 9 ft #· • · ϊ Ala Arg Leu Val Ala Ala • · * 9 9 9 9 9 • · 20 99 9 9 9 9 9 9 9 9 « * • Φ * • · · • · · 9 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:14: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS; ♦ (A) LENGTH: 22 amino acids ··· • · • · 70
Ala Arg Leu Vai Ala Ala 20 (2) INFORMATION FOR SEQ ID N0:1S: { i ) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 63 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear iii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic) ( ix) FEATURE :
(A) NAME/KEY: CDS
(B) LOCATION: 1..63 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:15:
ATG AAC AAG TCC GTG GCT CCA TTG CTG CTT GCA GCG TCC ATA CTA
• '·· Met Asn Lys Ser Val Ala Pro Leu Leu Leu Ala Ala Ser He Leu ft • · a IS 10 15 ft ft ft ft ft ft ft ft ft ft ft ft ft ft ft ft ft ft
: GGC GGC GCC GTC GCA
ft ft ft • *ft ft ; ; ; Gly Gly Ala Val Ala ft 20 ft ft ft ft • ft ft ft ft* ft ft ft & 71 (i J SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: IS:
Mec Asn Lys Ser Val Ala Pro Leu Leu Leu Ala Ala Ser lie Leu T 15 10 15
Gly Gly Ala Val Ala 20 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:17: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 777 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear <ii> MOLECULE TYPE: DNA (genomic) (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:17: • 4 • a e a . AAACCAGCTG TGACCAGTGG GCAACCTTCA CTGGCAACGG CTACACAGTC AGCAACi • a a «a» a a a * a • a * • # »I ·
: .* TTTGGGGAGC ATCAGCCGGC TCTGGATTTG GCTGCGTGAC GGCGGTATCG CTCAGCC
• « ♦ ♦ * • a * IH a • a· a a a • · a GGGCCTCCTG GCACGCAGAC TGGCAGTGGT CCGGCGGCCA GAACAACGTC AAGTCGl • a e a a a a ·* a
: AGAACTCTCA GATTGCCATT CCCCAGAAGA GGACCGTCAA CAGCATCAGC AGCATGC
72
AAATACGGCG ATATTGGGCC GATTGGGTCC TCACAGGGAA CAGTCAACGT CGGTG
AGCTGGACGC TCTACTATGG CTACAACGGA GCCATGCAAG TCTATTCCTT TGTGG' ACCAACACTA CCAACTACAG CGGAGATGTC AAGAACTTCT TCAATTATCT CCGAGi AAAG GAT AC A ACGCTG CAGG CCAATATGTT CTTAGTAAGT CACCCTCACT GTGAC:
TGAGTTTGTT GCAACGTTTG CTAACAAAAC CTTCGTATAG GCTACCAATT TGGTAC
CCCTTCACGG GCAGTGGAAC TCTGAACGTC GCATCCTGGA CCGCATCTAT CAACT/ 2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:IB: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 21Θ amino acids ,, ΐB > TYPE: amino acid » ft ft ** , iC) STRANDEDNESS: single • · ί ««« :Y; (D) TOPOLOGY: linear * · ·· 1 : V (ii) MOLECULE TYPE: protein • ft * ft 1 · (Xl) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 18: ♦ 1 · • # · . Gin Thr Ser Cys Asp Gin Trp Ala Thr Phe Thr Gly Asn Gly ‘ • · 1 ft» : : l s ίο 73
Gin Trp Ser Gly Gly Gin Asn Asn Vai Lys Ser Tyr Gin Asn i SO 55 60
Ile Ala Ile Pro Gin Lys Arg Thr Vai Asn Ser Ile Ser Ser i* 65 70 75
Thr Thr Ala Ser Trp Ser Tyr Ser Gly Ser Asn Ile Arg Ala A 85 90 9
Ala Tyr Asp Leu Phe Thr Ala Ala Asn Pro Asn His Vai Thr T 100 105 110
Gly Asp Tyr Glu Leu Met Ile Trp Leu Gly Lys Tyr Gly Asp I 115 120 125
Pro Ile Gly Ser Ser Gin Gly Thr Vai Asn Vai Gly Gly Gin S< • * ί *'* 130 135 140 I f I • · * i · · • · » • · »
Thr Leu Tyr Tyr Gly Tyr Asn Gly Ala Met Gin Vai Tyr Ser Pl • * • · : 145 150 155 * « « ··· · « # » * » « *
Ala Gin Thr Asn Thr Thr Asn Tyr Ser Gly Asp Vai Lys Asn Pl • · ies i?o n • · 74
Asn Vai Ala Ser Trp Thr Ala Ser Ile Asn 210 215 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO; 19: ίί) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 46 base pairs (B) TYPE; nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear tii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic) (Xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO; 19:
ATGAAGTTCC TTCAAGTCCT CCCTGCCCTC ATACCGGCCG CCCTGGCCC
¢2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 20; (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: ·· • · ; ·· . (A) LENGTH: 16 amino acids • · * * · * *· V. (B) TYPE: amino acid • · · • » j**]: (C) STRANDEDNESS; single * * i.i I (D) TOPOLOGY: linear I *·· I (ii) MOLECULE TYPE; peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID N0;20: • I ϊ • · 75 (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: double {Di TOPOLOGY: linear (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID N0;21:
AGCTCGTAGA GCGTTGACTT GCCTGTGGTC TGTCCAGACG GGGGACGATA GAATGC
• 4 • t 4 44 • • • 4 4 • 4 i • 1 • « • · · • « · • 1 • 4 4 • · · * « • · • · ♦ · 4 * · 4 444 4 • « 4 * 4 4 « · ft • 4 4 • 4 4 • 4 4 44« • 4 4 4

Claims (7)

  1. 76
  2. 1. Entsyymipohjäinen rehun lisäaine, t u n t u siitä, että se sisältää 5 (x) yhtä tai useampaa seuraavista: (a) < kanaasi EGI, josta puuttuu selluloosaa sitova dome< endoglukanaasi EGII, josta puuttuu selluloosaa sit meeni, ja (c) kohdan (a) tai <b) mukaisen endoglu] aktiivinen sellulaasiydin, jolloin EGI viittaa < 10 kanaasiin, joka on peräisin Trichoderma -lajista pH-optimi on noin 4,0 - 6,0, isoelektrinen piste noin 4,5 - 4,7 ja molekyylipaino on noin 47 - 49 ] töniä; ja EGII viittaa endoglukanaasiin, joka on ] Trichoderma -lajista, jonka pH-optimi on noin 4,0 15 jonka pl on noin 5,5 ja jonka molekyylipaino on kilodaltonia; ja (ii) 0-20 paino-% sellobiohydrolaasia neessa olevien sellulaasiproteiinien määrän peri laskettuna.
  3. 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen entsyym: nen rehun lisäaine, tunnettu siitä, että s Ϊ ole ollenkaan sellobiohydrolaasia. : 3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen ei ··* ·*;*· pohjainen rehun lisäaine, tunnettu siitä, e • · :v. 25 hun lisäaine lisäksi sisältää ainakin yhtä tai i • muuta entsyymiä, joka valitaan ksylanaasista, pro1 *"!.* ta, a-amylaasista, glukoamylaasista, lipaasista, pe • · ! • sista, mannanaasista, α-galaktosidaasista, a-arab: nosidaasista ja fytaasista. ♦ · · **!»* 30 4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen entsyym: ·_ · nan rahiin 1 i no +* n π n o f- + n c i i f- W ,7 1 proteaasi on Bacillus-suvusta peräisin oleva subt tai tämän mutatoitunut muoto.
  4. 6. Viljapohjäinen eläinrehu, t u n n e t t tär että se sisältää ainakin yhtä viljaar joka 5 ohrasta, vehnästä, ruisvehnästä, rukiista ja maiss minkä tahansa edeltävän patenttivaatimuksen mukai; syymipohjäistä rehun lisäainetta.
  5. 7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen viljap eläinrehu, tunnettu siitä, että vilja on 10 ohra.
  6. 8. Menetelmä minkä tahansa patenttivaat 1-5 mukaisen entsyymipohjaisen rehun lisäaineen tamiseksi tunnettu siitä, että se sisält heen, jossa muodostetaan geeniteknisesti Trie 15 sienestä geneettisesti modifioitu kanta, joka tuoi luttuja entsyymejä sopivia suhteellisia määriä, taan geneettisesti modifioitua kantaa ja otetaan talteen viljelmästä.
  7. 9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen me 20 tunnettu siitä, että geneettisesti modifio ta on peräisin Γ. longibrachiatumista, Γ. reeseist «» ! ·*. viridestä, jonka genomia on modifioitu siten, : tuottaa rikastetusti yhtä tai useampaa endoglu «V· ja/tai se on kykenemätön tuottamaan yhtä tai useam] • · :v. 25 minnallisesti aktiivista sellobiohydrolaasia. • · * : * 10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen me *·» * tunnettu siitä, että geneettisesti mod * kannan genomi on kykenemätön muodostamaan toiminna aktiivista EGI:tä ja/tai EGII:tä. i » » • * * • M »»· 78
FI953867A 1993-12-17 1995-08-16 Entsyymipohjainen lisäaine, sitä sisältävä eläinrehu sekä menetelmä entsyymipohjaisen lisäaineen valmistamiseksi FI116965B (fi)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US16994893 1993-12-17
US08/169,948 US5861271A (en) 1993-12-17 1993-12-17 Cellulase enzymes and systems for their expressions
EP9404212 1994-12-19
PCT/EP1994/004212 WO1995016360A1 (en) 1993-12-17 1994-12-19 An enzyme feed additive and animal feed including it

Publications (3)

Publication Number Publication Date
FI953867A0 FI953867A0 (fi) 1995-08-16
FI953867A FI953867A (fi) 1995-10-03
FI116965B true FI116965B (fi) 2006-04-28

Family

ID=22617873

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI953867A FI116965B (fi) 1993-12-17 1995-08-16 Entsyymipohjainen lisäaine, sitä sisältävä eläinrehu sekä menetelmä entsyymipohjaisen lisäaineen valmistamiseksi
FI962444A FI119695B (fi) 1993-12-17 1996-06-12 Uusia sellulaasientsyymejä ja systeemejä niiden ilmentämiseksi

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI962444A FI119695B (fi) 1993-12-17 1996-06-12 Uusia sellulaasientsyymejä ja systeemejä niiden ilmentämiseksi

Country Status (16)

Country Link
US (3) US5861271A (fi)
EP (3) EP0684770B1 (fi)
JP (1) JPH09506514A (fi)
CN (1) CN1093379C (fi)
AT (3) ATE329039T1 (fi)
AU (1) AU685210B2 (fi)
CA (2) CA2178636A1 (fi)
DE (3) DE69427812T2 (fi)
DK (2) DK0684770T3 (fi)
ES (1) ES2160694T3 (fi)
FI (2) FI116965B (fi)
HK (1) HK1097163A1 (fi)
NO (1) NO314562B1 (fi)
NZ (1) NZ278373A (fi)
PT (1) PT684770E (fi)
WO (2) WO1995016782A1 (fi)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8715647B2 (en) 1993-12-17 2014-05-06 Danisco Us Inc. Enzyme feed additive and animal feed including it

Families Citing this family (249)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5861271A (en) * 1993-12-17 1999-01-19 Fowler; Timothy Cellulase enzymes and systems for their expressions
US6268196B1 (en) * 1993-12-17 2001-07-31 Genencor International, Inc. Method and compositions for treating cellulose containing fabrics using truncated cellulase enzyme compositions
FR2715802B1 (fr) * 1994-02-04 1996-03-15 Rhone Poulenc Nutrition Animal Utilisation d'enzymes dans l'alimentation des animaux pour réduire les rejets azotés.
GB9424661D0 (en) * 1994-12-07 1995-02-01 Biotal Ltd Enzymes, microorganisms and their use
CN101955921A (zh) 1995-03-17 2011-01-26 诺沃奇梅兹有限公司 新的内切葡聚糖酶
US5700686A (en) * 1995-06-06 1997-12-23 Iogen Corporation Protease-treated and purified cellulase compositions and methods for reducing backstaining during enzymatic stonewashing
US5958083A (en) * 1995-09-08 1999-09-28 Novo Nordisk A/A Prevention of back-staining in stone washing
PL183149B1 (pl) 1995-09-08 2002-05-31 Novozymes As Sposób wytwarzania zlokalizowanych zmian gęstości barwy na powierzchni wybarwionej tkaniny celulozowej i środek celulozowy
US6723549B2 (en) 1995-10-17 2004-04-20 Ab Enzymes Oy Cellulases, the genes encoding them and uses thereof
US6184019B1 (en) 1995-10-17 2001-02-06 Röhm Enzyme Finland OY Cellulases, the genes encoding them and uses thereof
US6190898B1 (en) * 1995-10-23 2001-02-20 Genencor International, Inc. Crystalline cellulase and method for producing same
AR005601A1 (es) * 1996-01-29 1999-06-23 Novozymes As Proceso para la remocion o blanqueo de suciedad o manchas presentes en telas celulosicas y proceso para el lavado de telas celulosicas manchadas o sucias y composicion detergente
WO1997028256A1 (en) * 1996-01-29 1997-08-07 Novo Nordisk A/S Process for desizing cellulosic fabric
EP0952223B1 (en) * 1996-09-13 2006-11-29 Meiji Seika Kaisha Ltd. REGULATORY SEQUENCE OF CELLULASE cbh1 GENES ORIGINATING IN TRICHODERMA VIRIDE AND SYSTEM FOR MASS-PRODUCING PROTEINS OR PEPTIDES THEREWITH
US6451063B1 (en) * 1996-09-25 2002-09-17 Genencor International, Inc. Cellulase for use in industrial processes
US6017870A (en) * 1996-10-09 2000-01-25 Genencor International, Inc. Purified cellulase and method of producing
JP4463878B2 (ja) * 1996-10-28 2010-05-19 ノボザイムス アクティーゼルスカブ バチルス菌を用いたセルロース結合ドメインの細胞外発現
FI964692A0 (fi) * 1996-11-25 1996-11-25 Primalco Ltd Foerbaettrad cellulassammansaettning foer bioefterbehandling av textilmaterial som innehaoller cellulosa
US5866407A (en) * 1997-03-18 1999-02-02 Iogen Corporation Method and enzyme mixture for improved depilling of cotton goods
TW409035B (en) 1997-06-04 2000-10-21 Gist Brocades Bv Starch-based enzyme granulates
DE69827712T3 (de) * 1997-07-31 2009-07-09 Dsm Ip Assets B.V. Zusammensetzung für Brotverbesserung
US6294366B1 (en) * 1997-09-19 2001-09-25 Clariant Finance (Bvi) Limited Compositions and methods for treating cellulose containing fabrics using truncated cellulase enzyme compositions
US6287839B1 (en) 1997-11-19 2001-09-11 Genencor International, Inc. Cellulase producing actinomycetes, cellulase produced therefrom and method of producing same
GB9724629D0 (en) * 1997-11-20 1998-01-21 Genencor Int Bv Alpha/beta hydrolase-fold enzymes
CA2315017C (en) * 1997-12-16 2011-10-11 Genencor International, Inc. Novel egiii-like enzymes, dna encoding such enzymes and methods for producing such enzymes
EP2287318B1 (en) 1998-06-10 2014-01-22 Novozymes A/S Mannanases
US6407046B1 (en) 1998-09-03 2002-06-18 Genencor International, Inc. Mutant EGIII cellulase, DNA encoding such EGIII compositions and methods for obtaining same
US6268328B1 (en) * 1998-12-18 2001-07-31 Genencor International, Inc. Variant EGIII-like cellulase compositions
US6579841B1 (en) 1998-12-18 2003-06-17 Genencor International, Inc. Variant EGIII-like cellulase compositions
US7977051B2 (en) 1999-04-10 2011-07-12 Danisco Us Inc. EGIII-like enzymes, DNA encoding such enzymes and methods for producing such enzymes
US8637293B2 (en) * 1999-07-13 2014-01-28 Alliance For Sustainable Energy, Llc Cellobiohydrolase I enzymes
US7375197B2 (en) * 2002-01-14 2008-05-20 Midwest Research Institute Cellobiohydrolase I gene and improved variants
JP4658433B2 (ja) * 1999-12-23 2011-03-23 ジェネンコア インターナショナル インコーポレーテッド 改良された機能特性を有するタンパク質を得る方法
EP1266018B1 (en) * 2000-03-24 2008-05-07 Genencor International, Inc. Production of secreted proteins by recombinant eukaryotic cells
GB0011439D0 (en) * 2000-05-12 2000-06-28 Novartis Res Found Cancer diagnosis and assays for screening
US6623949B1 (en) 2000-08-04 2003-09-23 Genencor International, Inc. Variant EGIII-like cellulase compositions
JP4557108B2 (ja) * 2000-08-11 2010-10-06 ライオン株式会社 キメラ酵素及び洗浄剤組成物
CA2422558C (en) 2000-09-25 2012-02-14 Iogen Energy Corporation Method for glucose production with a modified cellulase mixture
ES2521615T3 (es) 2001-06-06 2014-11-13 Novozymes A/S Endo-beta-1,4-glucanasa
DK1441599T3 (da) * 2001-10-26 2007-11-12 Novozymes As Fremstilling af spiselige produkter
AU2003208215A1 (en) * 2002-03-15 2003-09-29 Iogen Energy Corporation Method for glucose production using endoglucanase core protein for improved recovery and reuse of enzyme
GB2389584A (en) * 2002-06-14 2003-12-17 Norsk Hydro As A fusion protein
CA2865180A1 (en) 2002-08-16 2004-02-26 Genencor International, Inc. Novel variant hyprocrea jecorina cbh1 cellulases
US7459299B2 (en) * 2003-04-01 2008-12-02 Danisco A/S, Genencor Division Variant Humicola grisea CBH1.1
CN101410520B (zh) 2003-04-29 2012-05-30 金克克国际有限公司 新颖的杆菌029cel纤维素酶
WO2004099369A2 (en) 2003-04-30 2004-11-18 Genencor International, Inc. Novel bacillus bagcel cellulase
US7449318B2 (en) * 2003-04-30 2008-11-11 Danisco A/S, Genencor Division Bacillus mHKcel cellulase
CN1836038B (zh) 2003-05-02 2011-04-06 诺维信股份有限公司 制备分泌型多肽的方法
EP1862540B1 (en) 2003-05-29 2011-09-14 Genencor International, Inc. Novel trichoderma genes
WO2005003311A2 (en) 2003-06-25 2005-01-13 Novozymes A/S Enzymes for starch processing
US7883883B2 (en) 2003-06-25 2011-02-08 Novozymes A/S Enzymes for starch processing
MXPA06004463A (es) 2003-10-28 2006-06-27 Novozymes North America Inc Enzimas hibridas.
WO2005042735A1 (en) 2003-10-30 2005-05-12 Novozymes A/S Carbohydrate-binding modules of a new family
US8535927B1 (en) 2003-11-19 2013-09-17 Danisco Us Inc. Micrococcineae serine protease polypeptides and compositions thereof
US7985569B2 (en) * 2003-11-19 2011-07-26 Danisco Us Inc. Cellulomonas 69B4 serine protease variants
AU2004293789B2 (en) 2003-11-21 2009-07-23 Genencor International, Inc. Expression of granular starch hydrolyzing enzymes in trichoderma and process for producing glucose from granular starch substrates
BRPI0417686B1 (pt) 2003-12-19 2019-12-10 Novozymes As processos para a produção de uma infusão tendo filtrabilidade realçada e/ou rendimento melhorado do extrato depois da filtração
US8097445B2 (en) 2004-03-25 2012-01-17 Danisco Us Inc. Exo-endo cellulase fusion protein
EP1735447A2 (en) * 2004-03-25 2006-12-27 Genencor International, Inc. Cellulase fusion protein and heterologous cellulase fusion construct encoding the same
US7348172B2 (en) * 2004-04-16 2008-03-25 Ab Enzymes Oy Method and DNA constructs for increasing the production level of carbohydrate degrading enzymes in filamentous fungi
WO2005100557A1 (en) * 2004-04-16 2005-10-27 Ab Enzymes Oy Method and dna constructs for increasing the production level of carbohydrate degrading enzymes in filamentous fungi
AU2004320371B2 (en) * 2004-05-27 2011-09-22 Genencor International, Inc. Heterologous expression of an aspergillus kawachi acid-stable alpha amylase and applications in granular starch hydrolysis
KR101545424B1 (ko) * 2004-05-27 2015-08-18 다니스코 유에스 인크. 입상 전분 가수분해 활성을 가진 산-안정성 알파 아밀라아제 및 효소 조성물
US7332319B2 (en) * 2004-05-27 2008-02-19 Genencor International, Inc. Heterologous alpha amylase expression in Aspergillus
EP1831384B1 (en) 2004-12-22 2015-08-12 Novozymes A/S Polypeptides having glucoamylase activity and polynucleotides encoding same
CA2592083C (en) 2004-12-22 2017-02-21 Novozymes A/S Hybrid enzymes consisting of an endo-amylase first amino acid sequence and a carbohydrate-binding module as second amino acid sequence
DK2292747T3 (en) * 2004-12-30 2017-04-24 Danisco Us Inc CBH2 CELLULASE VARIETIES OF HYPOCREA JECORINA
US7429476B2 (en) 2004-12-30 2008-09-30 Genencor International, Inc. Acid fungal proteases
CN101146907B (zh) 2005-04-12 2015-04-08 金克克国际有限公司 蛋白质生产被改变的基因失活突变体
SI1973561T1 (sl) * 2005-12-15 2011-07-29 Chemgen Corp Encimi, ki zmanjĺ ujejo imunski stres
WO2007115201A2 (en) * 2006-03-30 2007-10-11 Novozymes, Inc. Polypeptides having endoglucanase activity and polynucleotides encoding same
BRPI0713389A2 (pt) 2006-06-21 2012-04-17 Novozymes North America, Inc. e Novozymes A/S processo para desengomagem e lavagem combinadas de um tecido engomado, e, composição
CA2663711C (en) * 2006-09-22 2017-02-28 Danisco Us Inc. Acetolactate synthase (als) selectable marker from trichoderma reesei
MX2009003472A (es) 2006-10-10 2009-06-02 Danisco Us Inc Genencor Div Variantes de glucoamilasa con propiedades alteradas.
WO2009048488A1 (en) 2007-10-09 2009-04-16 Danisco Us, Inc., Genencor Division Glucoamylase variants with altered properties
ES2386991T3 (es) * 2006-12-18 2012-09-10 Danisco Us Inc. Nuevas composiciones de laccasas y sus procedimientos de utilización
US20080220498A1 (en) * 2007-03-06 2008-09-11 Cervin Marguerite A Variant Buttiauxella sp. phytases having altered properties
US8143046B2 (en) 2007-02-07 2012-03-27 Danisco Us Inc., Genencor Division Variant Buttiauxella sp. phytases having altered properties
CA2680794A1 (en) 2007-03-14 2008-09-18 Danisco Us Inc. Trichoderma reesei .alpha.-amylase enhances saccharification of corn starch
US8093016B2 (en) * 2007-05-21 2012-01-10 Danisco Us Inc. Use of an aspartic protease (NS24) signal sequence for heterologous protein expression
WO2008153712A2 (en) * 2007-05-21 2008-12-18 Danisco Us, Inc., Genencor Division Method for introducing nucleic acids into fungal cells
CN101730479A (zh) * 2007-06-29 2010-06-09 凯敏工业公司 用于反刍动物的酶产品
US8592194B2 (en) 2007-10-09 2013-11-26 Danisco Us Inc. Glucoamylase variants with altered properties
US7618801B2 (en) * 2007-10-30 2009-11-17 Danison US Inc. Streptomyces protease
WO2009058956A1 (en) * 2007-11-01 2009-05-07 Danisco Us, Inc. Signal sequences and co-expressed chaperones for improving protein production in a host cell
CA2705941C (en) 2007-11-20 2018-05-22 Danisco Us Inc. Glucoamylase variants with altered properties
CN102027124B (zh) 2007-12-13 2015-11-25 丹尼斯科美国公司 用于生产异戊二烯的组合物和方法
CN102943098A (zh) * 2008-01-02 2013-02-27 丹尼斯科美国公司 应用嗜糖假单胞菌g4-淀粉酶和其变体获得乙醇的无葡糖淀粉酶的方法
JP6047273B2 (ja) 2008-02-08 2016-12-21 プロセラ インコーポレイテッド 胃腸のバイオフィルムの抑制および治療
DK2268806T3 (da) * 2008-02-11 2013-07-15 Danisco Us Inc Enzym med mikrobiel lyseaktivitet fra Trichoderma reesei
CN105274077A (zh) 2008-02-19 2016-01-27 诺维信公司 使用纤维素酶石洗织物的方法
MX2010009490A (es) * 2008-03-07 2010-09-24 Danisco Us Inc Expresion de catalasa en trichoderma.
US20090253173A1 (en) * 2008-04-08 2009-10-08 Danisco Us Inc., Genencor Division Filamentous fungi with inactivated protease genes for altered protein production
US8673609B2 (en) 2008-04-18 2014-03-18 Danisco Us Inc. Buttiauxella sp. phytase variants
EP2279251A2 (en) * 2008-04-23 2011-02-02 Danisco US Inc. Isoprene synthase variants for improved microbial production of isoprene
AU2009256169A1 (en) 2008-06-06 2009-12-10 Danisco Us Inc. Compositions and methods comprising variant microbial proteases
AU2009256171B2 (en) 2008-06-06 2013-11-07 Danisco Us Inc. Compositions and methods comprising cellulase variants with reduced affinity to non-cellulosic materials
ES2716231T3 (es) 2008-07-02 2019-06-11 Danisco Us Inc Procedimientos para producir isopreno
EP2337844A1 (en) * 2008-09-15 2011-06-29 Danisco US Inc. Reduction of carbon dioxide emission during isoprene production by fermentation
MY156562A (en) 2008-09-15 2016-02-26 Danisco Us Inc Increased isoprene production using the archaeal lower mevalonate pathway
ZA201102109B (en) * 2008-09-15 2013-10-30 Goodyear Tire & Rubber Conversion of prenyl derivatives to isoprene
MY156588A (en) 2008-09-15 2016-03-15 Danisco Us Inc Systems using cell culture for production of isoprene
US20100184178A1 (en) * 2008-09-15 2010-07-22 Zachary Quinn Beck Increased isoprene production using mevalonate kinase and isoprene synthase
BRPI0921827A2 (pt) 2008-11-11 2016-09-27 Danisco Us Inc composições e métodos compreendendo uma variante de subtilisina
EP2650354A3 (en) 2008-11-11 2014-02-12 The Procter and Gamble Company Bacillus subtilisin comprising one or more combinable mutations
KR20110091671A (ko) 2008-11-11 2011-08-12 다니스코 유에스 인크. 세린 프로테아제 변이체를 포함하는 조성물 및 방법
CA2743060C (en) 2008-11-11 2017-03-07 Danisco Us Inc. Compositions and methods comprising a subtilisin variant
EP2626421B1 (en) 2008-12-10 2014-03-19 Direvo Industrial Biotechnology GmbH Improved enzymes for biomass conversion
EP2358873B2 (en) 2008-12-15 2018-02-21 Danisco US Inc. Hybrid alpha-amylases
MX2011006779A (es) 2008-12-24 2011-08-03 Danisco Us Inc Lacasas y metodos de uso de las mismas a temperatura baja.
EP2382312A2 (en) 2008-12-30 2011-11-02 Danisco US Inc. Methods of producing isoprene and a co-product
KR20110139206A (ko) 2009-03-03 2011-12-28 다니스코 유에스 인크. 효소적으로 생성된 과산을 사용한 염료의 산화 탈색 - 방법, 조성물 및 파트들의 키트
US8518686B2 (en) * 2009-04-23 2013-08-27 Danisco Us Inc. Three-dimensional structure of isoprene synthase and its use thereof for generating variants
EP3412771B1 (en) 2009-05-19 2020-12-02 DuPont Nutrition Biosciences ApS Amylase polypeptides
WO2010141779A1 (en) 2009-06-03 2010-12-09 Danisco Us Inc. Cellulase variants with improved expression, activity and/or stability, and use thereof
TWI434921B (zh) 2009-06-17 2014-04-21 Danisco Us Inc 從生物異戊二烯組合物製造燃料成分之方法及系統
TW201120213A (en) 2009-06-17 2011-06-16 Danisco Us Inc Polymerization of isoprene from renewable resources
TWI427149B (zh) * 2009-06-17 2014-02-21 Danisco Us Inc 使用ｄｘｐ及ｍｖａ途徑之改良之異戊二烯製造
CN102712915B (zh) 2009-08-19 2014-12-10 丹尼斯科美国公司 具有改良比活和/或热稳定性的葡糖淀粉酶的组合变体
PE20121504A1 (es) 2009-08-19 2012-11-05 Dupont Nutrition Biosci Aps Variantes de glucoamilasa
AR077978A1 (es) 2009-08-27 2011-10-05 Danisco Us Inc Desgaste de textiles y modificaciones del color combinados
WO2011072099A2 (en) 2009-12-09 2011-06-16 Danisco Us Inc. Compositions and methods comprising protease variants
WO2011084412A1 (en) 2009-12-21 2011-07-14 Danisco Us Inc. Detergent compositions containing thermobifida fusca lipase and methods of use thereof
CN102712880A (zh) 2009-12-21 2012-10-03 丹尼斯科美国公司 含有嗜热脂肪地芽孢杆菌脂肪酶的洗涤剂组合物及其使用方法
EP2516612A1 (en) 2009-12-21 2012-10-31 Danisco US Inc. Detergent compositions containing bacillus subtilis lipase and methods of use thereof
DK2552945T3 (en) 2010-03-29 2018-07-16 Dupont Nutrition Biosci Aps POLYPEPTIDES WITH TRANSGALACTOSYLATION ACTIVITY
PL2558573T3 (pl) 2010-04-15 2017-08-31 Danisco Us Inc. Kompozycje i sposoby obejmujące warianty proteazy
CN105925556B (zh) 2010-05-06 2020-11-13 丹尼斯科美国公司 包含枯草杆菌蛋白酶变体的组合物和方法
WO2011150157A2 (en) 2010-05-28 2011-12-01 Danisco Us Inc. Detergent compositions containing streptomyces griseus lipase and methods of use thereof
US8933282B2 (en) 2010-06-17 2015-01-13 Danisco Us Inc. Fuel compositions comprising isoprene derivatives
EP2561083B1 (en) 2010-08-06 2017-01-11 Danisco US Inc. Use of Humicola grisea glucoamylase in an SSF process at neutral pH
WO2012019169A1 (en) 2010-08-06 2012-02-09 Danisco Us Inc. Production of isoprene under neutral ph conditions
JP5810489B2 (ja) * 2010-08-20 2015-11-11 株式会社豊田中央研究所 セルラーゼ活性を有するタンパク質及びその利用
JP2013535983A (ja) 2010-08-24 2013-09-19 ダニスコ・ユーエス・インク 低温コメタンパク質濃縮物を含有する食品
BR112013004419A2 (pt) * 2010-08-25 2016-05-31 Danisco Us Inc fungos filamentosos que têm um fenótipo de viscosidade alterada.
US20130269118A1 (en) 2010-10-18 2013-10-17 Danisco Us Inc. Local color modification of dyed fabrics using a laccase system
CN103443271A (zh) 2010-10-27 2013-12-11 丹尼斯科美国公司 用于增加异戊二烯产量的异戊二烯合酶变体
BR112013016264A2 (pt) 2010-12-22 2018-06-19 Danisco Us Inc produção biológica de açúcares de pentose com o uso de células recombinantes
SG191235A1 (en) 2010-12-22 2013-07-31 Danisco Us Inc Compositions and methods for improved isoprene production using two types of ispg enzymes
EP2658968A4 (en) 2010-12-30 2017-05-03 Novozymes A/S Method for treating textile with endoglucanase
GB201102865D0 (en) * 2011-02-18 2011-04-06 Danisco Feed additive composition
GB201102857D0 (en) * 2011-02-18 2011-04-06 Danisco Feed additive composition
CN103459594A (zh) 2011-04-06 2013-12-18 丹尼斯科美国公司 具有提高的表达和/或活性的漆酶变体
US9926547B2 (en) * 2011-04-28 2018-03-27 Novozymes, Inc. Polypeptides having endoglucanase activity and polynucleotides encoding same
EP2712363A1 (en) 2011-04-29 2014-04-02 Danisco US Inc. Detergent compositions containing geobacillus tepidamans mannanase and methods of use thereof
WO2012149333A1 (en) 2011-04-29 2012-11-01 Danisco Us Inc. Detergent compositions containing bacillus sp. mannanase and methods of use thereof
JP2014512829A (ja) 2011-04-29 2014-05-29 ダニスコ・ユーエス・インク デンプンを液化及び糖化して高密度グルコースシロップを調製するための単一ｐＨプロセス
US8802388B2 (en) 2011-04-29 2014-08-12 Danisco Us Inc. Detergent compositions containing Bacillus agaradhaerens mannanase and methods of use thereof
CN106065381B (zh) 2011-05-05 2019-07-26 宝洁公司 包含丝氨酸蛋白酶变体的组合物和方法
BR112013027963A2 (pt) 2011-05-05 2016-11-29 Danisco Us Inc "variante de subtilisina com atividade proteolítica, ácido nucleico, vetor de expressão, célula hospedeira, composição e método de limpeza".
WO2013022799A1 (en) 2011-08-05 2013-02-14 Danisco Us Inc. PRODUCTION OF ISOPRENOIDS UNDER NEUTRAL pH CONDITIONS
WO2013033318A1 (en) 2011-08-31 2013-03-07 Danisco Us Inc. Compositions and methods comprising a lipolytic enzyme variant
US20130109055A1 (en) 2011-10-31 2013-05-02 Bp Corporation North America Inc. Use of mammalian promoters in filamentous fungi
CA2851855A1 (en) 2011-10-31 2013-05-10 Bp Corporation North America Inc. Use of plant promoters in filamentous fungi
BR112014014410A2 (pt) 2011-12-22 2019-09-24 Danisco Us Inc composições e métodos que compreendem uma variante de enzima lipolítica
US9163263B2 (en) 2012-05-02 2015-10-20 The Goodyear Tire & Rubber Company Identification of isoprene synthase variants with improved properties for the production of isoprene
EA201492221A1 (ru) 2012-06-08 2015-04-30 ДюПон НЬЮТРИШН БАЙОСАЙЕНСИЗ АпС Полипептиды, имеющие активность трансгалактозилирования
MX2015002099A (es) 2012-08-22 2015-05-11 Dupont Nutrition Biosci Aps Variantes que tienen actividad glucoamilasa.
US10005988B2 (en) 2012-10-05 2018-06-26 Novozymes A/S Reducing adhesion of bacteria to a surface or releasing bacteria from a surface to which they adhere using endo-beta-A,4-glucanases
JP2016506237A (ja) 2012-10-12 2016-03-03 ダニスコ・ユーエス・インク 脂肪分解酵素変異体を含む組成物及び方法
EP2914720B1 (en) 2012-11-05 2022-08-31 Danisco US Inc. Compositions and methods comprising thermolysin protease variants
EP2931887A1 (en) 2012-12-12 2015-10-21 Danisco US Inc. Variants of cellobiohydrolases
WO2014100018A1 (en) 2012-12-19 2014-06-26 Danisco Us Inc. Novel mannanase, compositions and methods of use thereof
WO2014145768A2 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Bp Corporation North America Inc. Use of non-fungal 5' utrs in filamentous fungi
US9850512B2 (en) 2013-03-15 2017-12-26 The Research Foundation For The State University Of New York Hydrolysis of cellulosic fines in primary clarified sludge of paper mills and the addition of a surfactant to increase the yield
EP3004342B1 (en) 2013-05-29 2023-01-11 Danisco US Inc. Novel metalloproteases
EP3110833B1 (en) 2013-05-29 2020-01-08 Danisco US Inc. Novel metalloproteases
US20160108388A1 (en) 2013-05-29 2016-04-21 Danisco Us Inc. Novel metalloproteases
US20160160202A1 (en) 2013-05-29 2016-06-09 Danisco Us Inc. Novel metalloproteases
US20160160197A1 (en) 2013-07-19 2016-06-09 Danisco Us Inc. Compositions and Methods Comprising a Lipolytic Enzyme Variant
JP2016533741A (ja) 2013-07-29 2016-11-04 ダニスコ・ユーエス・インク 酵素の変異体
EP3653707A1 (en) 2013-09-12 2020-05-20 Danisco US Inc. Compositions and methods comprising lg12-clade protease variants
WO2015049370A1 (en) 2013-10-03 2015-04-09 Novozymes A/S Detergent composition and use of detergent composition
CN103529024B (zh) * 2013-10-16 2015-12-23 天津博菲德科技有限公司 果胶酶在饲料原料中的最适添加量配方
EP4165999A1 (en) 2013-12-11 2023-04-19 DuPont Nutrition Biosciences ApS A method for preparing a dairy product having a stable content of galacto-oligosaccharide(s)
WO2015089441A1 (en) 2013-12-13 2015-06-18 Danisco Us Inc. Serine proteases of bacillus species
WO2015089447A1 (en) 2013-12-13 2015-06-18 Danisco Us Inc. Serine proteases of the bacillus gibsonii-clade
RU2546889C1 (ru) * 2013-12-16 2015-04-10 Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт птицеводства Россельхозакадемии Способ кормления цыплят-бройлеров и кур-несушек
US9951363B2 (en) 2014-03-14 2018-04-24 The Research Foundation for the State University of New York College of Environmental Science and Forestry Enzymatic hydrolysis of old corrugated cardboard (OCC) fines from recycled linerboard mill waste rejects
MX2016012044A (es) 2014-03-21 2017-06-29 Danisco Us Inc Serina proteasas de especies de bacillus.
WO2016061438A1 (en) 2014-10-17 2016-04-21 Danisco Us Inc. Serine proteases of bacillus species
EP3212662B1 (en) 2014-10-27 2020-04-08 Danisco US Inc. Serine proteases
DK3212781T3 (da) 2014-10-27 2019-12-16 Danisco Us Inc Serinproteaser
WO2016069557A1 (en) 2014-10-27 2016-05-06 Danisco Us Inc. Serine proteases of bacillus species
EP3212783A1 (en) 2014-10-27 2017-09-06 Danisco US Inc. Serine proteases
EP3212782B1 (en) 2014-10-27 2019-04-17 Danisco US Inc. Serine proteases
EP3214942B1 (en) 2014-11-07 2021-02-24 DuPont Nutrition Biosciences ApS Recombinant host cell expressing beta-galactosidase and/or transgalactosylating activity deficient in mannanase, cellulase and pectinase.
DK3234143T3 (da) 2014-12-19 2023-09-04 Novozymes As Sammensætninger omfattende polypeptider med xylanaseaktivitet og polypeptider med arabinofuranosidaseaktivitet
RU2580154C1 (ru) * 2014-12-30 2016-04-10 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Северо-Кавказский научно-исследовательский институт животноводства" Способ выращивания молодняка свиней и мясной птицы
CN107454914B (zh) 2015-03-12 2021-09-21 丹尼斯科美国公司 包含lg12进化枝蛋白酶变体的组合物和方法
RU2733987C2 (ru) 2015-05-13 2020-10-09 ДАНИСКО ЮЭс ИНК. Варианты протеазы клады aprl и их применения
EP3805384A1 (en) 2015-05-22 2021-04-14 DuPont Nutrition Biosciences ApS Aldc production methods
PT3298138T (pt) 2015-05-22 2022-11-02 Dupont Nutrition Biosci Aps Acetolactato descarboxilase
WO2016201069A1 (en) 2015-06-09 2016-12-15 Danisco Us Inc Low-density enzyme-containing particles
WO2016201040A1 (en) 2015-06-09 2016-12-15 Danisco Us Inc. Water-triggered enzyme suspension
WO2016201044A1 (en) 2015-06-09 2016-12-15 Danisco Us Inc Osmotic burst encapsulates
EP3310911B1 (en) 2015-06-17 2023-03-15 Danisco US Inc. Bacillus gibsonii-clade serine proteases
KR20180043365A (ko) 2015-09-02 2018-04-27 듀폰 뉴트리션 바이오사이언시즈 에이피에스 글리코시드 하이돌라제 및 동물에서의 병원성 감염의 예방 및/또는 치료에서 이의 용도
BR112018008946A2 (pt) 2015-11-05 2020-11-03 Danisco Us Inc. mananases de paenibacillus sp.
EP3371307A1 (en) 2015-11-05 2018-09-12 Danisco US Inc. Paenibacillus and bacillus spp. mannanases
BR112018010770A8 (pt) 2015-11-26 2019-02-26 Novozymes As processo de moagem
EP3390625B1 (en) 2015-12-18 2023-09-06 Danisco US Inc. Polypeptides with endoglucanase activity and uses thereof
TWI553121B (zh) * 2015-12-23 2016-10-11 基酵生物科技股份有限公司 提升耐溫性的纖維素酶
EP3452585A1 (en) 2016-05-03 2019-03-13 Danisco US Inc. Protease variants and uses thereof
EP3452584B1 (en) 2016-05-05 2021-01-06 Danisco US Inc. Protease variants and uses thereof
EP3464599A1 (en) 2016-05-31 2019-04-10 Danisco US Inc. Protease variants and uses thereof
BR112018075933A2 (pt) 2016-06-17 2019-10-01 Danisco Us Inc variantes de protease e usos das mesmas
CN109642226A (zh) 2016-06-30 2019-04-16 丹尼斯科美国公司 天冬氨酸蛋白酶
BR112019004988A2 (pt) 2016-09-16 2019-06-04 Dupont Nutrition Biosci Aps variantes de decarboxilase de acetolactato que tem atividade específica aprimorada
RU2763378C2 (ru) 2016-09-23 2021-12-28 ДюПон НЬЮТРИШН БАЙОСАЙЕНСИЗ АпС ПРИМЕНЕНИЕ АКТИВНЫХ ПРИ НИЗКОМ ЗНАЧЕНИИ pH АЛЬФА-1,4/1,6-ГЛИКОЗИДГИДРОЛАЗ В КАЧЕСТВЕ КОРМОВОЙ ДОБАВКИ ДЛЯ ЖВАЧНЫХ ЖИВОТНЫХ ДЛЯ УЛУЧШЕНИЯ ПЕРЕВАРИВАНИЯ КРАХМАЛА
US20190264138A1 (en) 2016-11-07 2019-08-29 Danisco Us Inc. Laundry detergent composition
WO2018093752A1 (en) 2016-11-15 2018-05-24 Danisco Us Inc. Filamentous fungi with improved protein production
WO2018095408A1 (en) 2016-11-25 2018-05-31 Novozymes A/S Gh10 xylanase, gh62 arabinofuranosidase, milling process and other application
US11946081B2 (en) 2016-12-21 2024-04-02 Danisco Us Inc. Bacillus gibsonii-clade serine proteases
WO2018118917A1 (en) 2016-12-21 2018-06-28 Danisco Us Inc. Protease variants and uses thereof
EP3592429A1 (en) 2017-03-06 2020-01-15 DuPont Nutrition Biosciences ApS Novel fungal fucosidases and their use in preventing and/or treating a pathogenic infection in an animal
WO2018169750A1 (en) 2017-03-15 2018-09-20 Danisco Us Inc Trypsin-like serine proteases and uses thereof
WO2018183662A1 (en) 2017-03-31 2018-10-04 Danisco Us Inc Delayed release enzyme formulations for bleach-containing detergents
JP2020527339A (ja) 2017-06-30 2020-09-10 ダニスコ・ユーエス・インク 低凝集の酵素含有粒子
CN111373039A (zh) 2017-11-29 2020-07-03 丹尼斯科美国公司 具有改善的稳定性的枯草杆菌蛋白酶变体
EP3728543A1 (en) 2017-12-21 2020-10-28 Danisco US Inc. Enzyme-containing, hot-melt granules comprising a thermotolerant desiccant
BR112020016068A2 (pt) 2018-02-08 2020-12-08 Danisco Us Inc. Partículas cera termicamente resistente matriz para encapsulamento de enzima
CA3096900A1 (en) 2018-04-09 2019-10-17 Novozymes A/S Polypeptides having alpha-amylase activity and polynucleotides encoding same
WO2019245704A1 (en) 2018-06-19 2019-12-26 Danisco Us Inc Subtilisin variants
EP3799601A1 (en) 2018-06-19 2021-04-07 Danisco US Inc. Subtilisin variants
WO2020046613A1 (en) 2018-08-30 2020-03-05 Danisco Us Inc Compositions comprising a lipolytic enzyme variant and methods of use thereof
US20210189295A1 (en) 2018-08-30 2021-06-24 Danisco Us Inc Enzyme-containing granules
US11339516B2 (en) * 2018-09-27 2022-05-24 Sanko Tekstil Isletmeleri San. Ve Tic. A.S. Dyed fabric finishing process
EP3856882A1 (en) 2018-09-27 2021-08-04 Danisco US Inc. Compositions for medical instrument cleaning
WO2020112599A1 (en) 2018-11-28 2020-06-04 Danisco Us Inc Subtilisin variants having improved stability
EP3976776A1 (en) 2019-05-24 2022-04-06 Danisco US Inc. Subtilisin variants and methods of use
US20220306968A1 (en) 2019-06-06 2022-09-29 Danisco Us Inc Methods and compositions for cleaning
EP4090727A1 (en) 2020-01-13 2022-11-23 Danisco US Inc. Compositions comprising a lipolytic enzyme variant and methods of use thereof
CN113123144A (zh) 2020-01-14 2021-07-16 尚科纺织企业工业及贸易公司 对纺织品进行染色的方法及用于其中的酶
US20240034960A1 (en) 2020-08-27 2024-02-01 Danisco Us Inc Enzymes and enzyme compositions for cleaning
EP4284906A1 (en) 2021-01-29 2023-12-06 Danisco US Inc. Compositions for cleaning and methods related thereto
CN117616120A (zh) 2021-06-30 2024-02-27 丹尼斯科美国公司 变体脂肪酶及其用途
CN117916354A (zh) 2021-09-03 2024-04-19 丹尼斯科美国公司 用于清洁的衣物洗涤组合物
CN117957318A (zh) 2021-09-13 2024-04-30 丹尼斯科美国公司 含有生物活性物质的颗粒
WO2023114932A2 (en) 2021-12-16 2023-06-22 Danisco Us Inc. Subtilisin variants and methods of use
WO2023114939A2 (en) 2021-12-16 2023-06-22 Danisco Us Inc. Subtilisin variants and methods of use
WO2023114936A2 (en) 2021-12-16 2023-06-22 Danisco Us Inc. Subtilisin variants and methods of use
WO2023168234A1 (en) 2022-03-01 2023-09-07 Danisco Us Inc. Enzymes and enzyme compositions for cleaning
WO2023250301A1 (en) 2022-06-21 2023-12-28 Danisco Us Inc. Methods and compositions for cleaning comprising a polypeptide having thermolysin activity
WO2024050339A1 (en) 2022-09-02 2024-03-07 Danisco Us Inc. Mannanase variants and methods of use
WO2024050343A1 (en) 2022-09-02 2024-03-07 Danisco Us Inc. Subtilisin variants and methods related thereto
WO2024050346A1 (en) 2022-09-02 2024-03-07 Danisco Us Inc. Detergent compositions and methods related thereto
WO2024064653A1 (en) 2022-09-20 2024-03-28 Dupont Nutrition Biosciences Aps Variant anti-viral polypeptides
WO2024102698A1 (en) 2022-11-09 2024-05-16 Danisco Us Inc. Subtilisin variants and methods of use

Family Cites Families (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA1338400C (en) * 1983-08-31 1996-06-18 David H. Gelfand Recombinant fungal cellulases
FR2555603B1 (fr) * 1983-11-29 1986-10-03 Inst Francais Du Petrole Procede de production d'enzymes cellulolytiques
FI841500A0 (fi) * 1984-04-13 1984-04-13 Valtion Teknillinen Foerfarande foer uppbygnande av cellulolytiska jaeststammar.
US5298405A (en) * 1986-04-30 1994-03-29 Alko Limited Enzyme preparations with recombinantly-altered cellulose profiles and methods for their production
US5340731A (en) * 1988-07-08 1994-08-23 University Of British Columbia Method of preparing a B-1,4 glycan matrix containing a bound fusion protein
US5137819A (en) * 1988-07-08 1992-08-11 University Of British Columbia Cellulose binding fusion proteins for immobilization and purification of polypeptides
US5223409A (en) * 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
PT93181A (pt) * 1989-02-16 1990-08-31 Carlsberg As Processo para a preparacao de (1,3-1,4)-beta-glucanase e a aperfeicoamentos relativos a enzimas
US5536655A (en) * 1989-09-26 1996-07-16 Midwest Research Institute Gene coding for the E1 endoglucanase
DK494089D0 (fi) * 1989-10-06 1989-10-06 Novo Nordisk As
DK16490D0 (da) * 1990-01-19 1990-01-19 Novo Nordisk As Enzym
DK115890D0 (da) * 1990-05-09 1990-05-09 Novo Nordisk As Enzym
US5290474A (en) * 1990-10-05 1994-03-01 Genencor International, Inc. Detergent composition for treating cotton-containing fabrics containing a surfactant and a cellulase composition containing endolucanase III from trichoderma ssp
EP1416045A1 (en) * 1990-10-05 2004-05-06 Genencor International, Inc. Composition containing a fungal cellulase for the treatment of cotton-containing fabrics
US5650322A (en) * 1990-10-05 1997-07-22 Genencor International, Inc. Methods for stonewashing fabrics using endoglucanases
US5475101A (en) * 1990-10-05 1995-12-12 Genencor International, Inc. DNA sequence encoding endoglucanase III cellulase
WO1993005226A1 (en) * 1991-08-29 1993-03-18 University Of British Columbia Method for modification of polysaccharide fibres
DE69228665T2 (de) * 1991-12-23 1999-07-22 Dsm Nv Eukaryotisches Expressionssystem
LT3208B (en) * 1992-04-10 1995-03-27 Ssv Dev Oy Enzyme products for use in the improvement of feed value and conservation of fibrous crops
US5861271A (en) * 1993-12-17 1999-01-19 Fowler; Timothy Cellulase enzymes and systems for their expressions

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8715647B2 (en) 1993-12-17 2014-05-06 Danisco Us Inc. Enzyme feed additive and animal feed including it

Also Published As

Publication number Publication date
NZ278373A (en) 1997-10-24
DK0684770T3 (da) 2001-09-17
US5861271A (en) 1999-01-19
US5874276A (en) 1999-02-23
FI962444A0 (fi) 1996-06-12
WO1995016360A1 (en) 1995-06-22
NO953218D0 (no) 1995-08-16
ATE387104T1 (de) 2008-03-15
ES2160694T3 (es) 2001-11-16
DE69427812D1 (de) 2001-08-30
EP1700524B1 (en) 2008-02-27
DE69435078D1 (de) 2008-04-10
NO314562B1 (no) 2003-04-14
JPH09506514A (ja) 1997-06-30
DE69434759T2 (de) 2007-05-16
FI953867A (fi) 1995-10-03
NO953218L (no) 1995-10-16
EP0684770A1 (en) 1995-12-06
ATE329039T1 (de) 2006-06-15
CN1118131A (zh) 1996-03-06
CA2156066C (en) 2005-07-12
CA2178636A1 (en) 1995-06-22
DK0733115T3 (da) 2006-10-09
WO1995016782A1 (en) 1995-06-22
DE69434759D1 (de) 2006-07-20
CA2156066A1 (en) 1995-06-22
HK1097163A1 (en) 2007-06-22
FI119695B (fi) 2009-02-13
AU1383695A (en) 1995-07-03
EP0733115A1 (en) 1996-09-25
PT684770E (pt) 2001-11-30
EP1700524A1 (en) 2006-09-13
US6562340B1 (en) 2003-05-13
DE69435078T2 (de) 2009-03-26
ATE203373T1 (de) 2001-08-15
FI953867A0 (fi) 1995-08-16
EP0733115B1 (en) 2006-06-07
CN1093379C (zh) 2002-10-30
FI962444A (fi) 1996-06-12
EP0684770B1 (en) 2001-07-25
AU685210B2 (en) 1998-01-15
DE69427812T2 (de) 2002-06-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI116965B (fi) Entsyymipohjainen lisäaine, sitä sisältävä eläinrehu sekä menetelmä entsyymipohjaisen lisäaineen valmistamiseksi
US8715647B2 (en) Enzyme feed additive and animal feed including it
AU692596B2 (en) An enzyme feed additive and animal feed including it
RU2261910C2 (ru) ШТАММ Penicillium funiculosum, ПРОДУЦИРУЮЩИИЙ КОМПЛЕКС ФЕРМЕНТОВ - ЦЕЛЛЮЛАЗУ, ЭНДО-1,4-β-КСИЛАНАЗУ, ЦЕЛЛОБИОГИДРОЛАЗУ, β-ГЛЮКОЗИДАЗУ, ЭНДО-1,3(4)- β-ГЛЮКАНАЗУ, ФЕРУЛОИЛ-ЭСТЕРАЗУ, ЖИДКАЯ КОРМОВАЯ ДОБАВКА И СУХОЙ КОРМ ДЛЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ
DE69738483T2 (de) Polypeptide mit phytase-aktivität und sie kodierende nukleinsäuren
AU710547B2 (en) Animal feed additives comprising xylanase
EP2197893B1 (en) Novel fungal enzymes
AU765477B2 (en) Phytase variants
Paloheimo et al. Xylanases and cellulases as feed additives.
MERIVUORI et al. Regulation of cellulase biosynthesis and secretion in fungi
KR20030046570A (ko) 트리코데르마 속 미생물로부터 유래한 베타-글루코시다제유전자 및 상기 유전자가 도입된 효모 형질전환체
JPWO2003028476A1 (ja) 新規の家禽用酵素組成物
EP4019629A1 (en) Xylanase variants
KR20130068006A (ko) 흑염소 반추위 미생물 유래의 베타 글루코시다아제 ｃｅｌ３－ＫＧ３９ 유전자 및 이의 용도
MXPA00000279A (en) Enzymes mixture

Legal Events

Date Code Title Description
FG Patent granted

Ref document number: 116965

Country of ref document: FI

MA Patent expired