CN1093379C - 一种酶饲料添加剂和包含它的动物饲料 - Google Patents

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Abstract

提供了一种作为饲料添加剂的组合物的用途，该组合物含有一种或多种内葡聚糖酶，以及按重量计占所述组合物中纤维素酶蛋白含量0～20%的一种纤维素生物水解酶。内葡聚糖酶可以是一种或多种EGI，EGII，EGIII及任何功能具有活性的它们的衍生物。该内葡聚糖酶可以自遗传上变异的木霉属真菌获得。还提供了一种基于酶的饲料添加剂，该添加剂含有缺乏纤维素结合区域的EGI和/或EGII和按重量计占所述添加剂中纤维素酶蛋白含量0～20%的一种纤维素生物水解酶。还提供了另一种基于酶的饲料添加剂，该添加剂含有一基于谷类的载体，一种或多种内葡聚糖酶和按重量计占添加剂中纤维素酶蛋白0～20%的一种纤维素生物水解酶，这种基于酶的饲料添加剂可以掺入的谷类基饲料中，该饲料包括一种或多种大麦、小麦、黑小麦、黑麦和玉米。这种饲料添加剂的优点在于提高了饲料转化比率和/或增加了谷类基饲料的消化率。

Description

一种酶饲料添加剂和包含它的动物饲料
本发明涉及一种酶饲料添加剂，特别是可以降低谷类基饲料的饲料转化比和/或增加它的消化率的这类添加剂。
人们一直寻求改进动物饲料以使动物能更有效的对其消化。关心的要点之一是改进饲料的饲料转化比(FCR)而不增加它的每单位重量的费用。FCR是消耗的饲料数量与动物增重的比值。低FCR表明给定数量的饲料导致生长动物有成比例更多的增重。这意味着动物能够更有效地利用饲料。对饲料的FCR可进行改进的一种途径是增加它的消化率。
饲料的营养组分如它的淀粉、脂肪、蛋白质和氨基酸成分的消化率有各种限制。这些限制包括：
(I)动物肠中存在物质的粘性。这种粘性至少部分是起因于可溶性非淀粉类多糖如混合交联的β-葡聚糖和阿拉伯糖基木聚糖；
(II)饲料细胞壁内营养物的截留，特别是谷类糊粉层的那些。这种截留是谷类细胞壁中高含量非淀粉类多糖引起的，这些非淀粉类多糖对动物消化系统的降解有相当的抵抗力。这阻止了细胞内截留的营养物被动物营养利用；以及
(III)动物的及特别是幼龄动物肠微生物群体内源酶活性不足。
在谷类基日粮、特别是那些大麦含量高的情况下，影响消化率的上述问题尤为显著。
由于从饲料中营养物消化率不良的问题，一般配制的饲料中必须含有更多提供能量的物质，以满足动物的营养需要。这类提供能量的物质通常包括淀粉、脂肪、糖、纤维等。在饲料中包含这些提供能量的物质或这类物质来源的要求，增加了可观的额外费用，从经济观点来看这是不利的。
做为解决谷类基饲料不良消化率问题的一种尝试，公知为在动物饲料中添加酶添加剂例如β-葡聚糖酶或木聚糖酶。例如，WO 91/04673公开了一种用于减轻家禽吸收不良综合症的饲料添加剂，该病症使消化力减弱。该添加剂包含纤维素酶和木聚糖酶。JP-A-60-75238公开了一种家畜饲料，其中含有包括蛋白酶-纤维素酶-、淀粉酶一和脂肪酶活性的混合酶。该文献推测，这些各种酶活性能促进发酵微生物生长，而这些微生物则变成饲料可利用营养组分。
全纤维素酶是不同酶的一种混合物，这些酶共同作用来水解纤维素(β-1，4-D-葡聚糖)和/或其衍生物(如磷酸溶胀纤维素)生成初级产物化合物例如葡萄糖、纤维二糖、和纤维素低聚糖。全纤维素酶由一些不同酶类别组成，包括具有外纤维素生物水解酶活性、内葡聚糖酶活性和β-葡萄糖甙酶活性的酶。
例如，由真菌Trichoderma longibrachiatum制得的全纤维素酶包含两种外-纤维素生物水解酶，CBHI和CBHI I，至少三种内葡聚糖酶，EGI，EGII和EGIII，以及至少一种β-葡萄糖甙酶。由T.longibrachiatum代表性的发酵可生成一种全纤维素，它包括以蛋白质重量计45-55％CBHI、13-15％CBHII、11-13％EGI、8-10％EGII、1-4％EGIII和0.5-1％BG。然而，应指出的是具体纤维素酶组分的实际浓度随许多因素而改变，包括发酵条件、底物浓度和菌株类型。因而，在一种代表性发酵中，Trichoderma longibrachiatum生成的全纤维素具有58-70％的纤维素生物水解酶。
T.longibrachiatum的各种内葡聚糖酶都具有其独特的特性。除纤维素酶活性之外EGI公知可水解木聚糖。对比而言EGII和EGIII没有表现出显著的木聚糖酶活性，至少根据偶氮一木聚糖天然PAGE覆层(overlay)。再有，公知EGI、EGII和EGV含有结构上独特的纤维素结合区(CBD′S)。另一方面，EGIII看起来不含结构上独特的结合区，与EGI或EGII相比表现出与结晶纤维素的亲和性较低。
WO 92/06209公开了转化丝状真菌Trichoclerma reesei(现称为“T.longibrachiatum”)的方法，该方法的步骤包括用基本上同源线性重组体DNA处理T.reesei菌株以进行同源转化，然后选择得到T.reesei转化株。例如，转化株叙述为其中基因组内一些目标基因(targeted gene)被删掉或破坏，而且一些天然基因如那些编码EGI和EGII的额外拷贝同源重组进菌株。在该文献中提到由缺乏CBHI和CBHII组分的菌株得到的纤维素酶组合物可用作洗涤剂洗涤组合物的组分。这类纤维素酶组合物当然是较浓缩的。
当在体内使用时，内葡聚糖酶和纤维素生物水解酶被认为协同作用将纤维素水解成小的纤维素-低聚糖(主要为纤维二糖)，它们随后经β-葡萄糖甙酶作用水解成葡萄糖。除水解纤维素β-1，4键之外，内(endo)-1，4-β-葡聚糖酶(EC 3.2 1. 4)还水解也含有1.3-键的β-葡聚糖的1，4键。内葡聚糖酶作用于内键生成纤维二糖、葡萄糖纤维素-低聚糖。纤维素生物水解酶作用于纤维素聚合物的链端生成做为主要产物的纤维二糖。
由T.longibrachiatum得到的全纤维素酶在酿造和动物营养领域与大麦组合使用已有许多年了。在家畜大麦基日粮中添加纤维素酶的一个益处是增加了在日粮中存在的各种组分的消化率，这些组分包括蛋白质和氨基酸。结果，可以减少日粮投入费用而性能没有损失，且可显著降低粪便中氮的排泄。这减轻了家畜集中饲养的环境影响。
大麦和胚乳细胞壁含有高比例高分子量、可溶于水的混合交联β-(1，3)(1，4)-葡聚糖。当溶解时，这些多糖引起溶液粘度的增加。例如，如果对焙烤用鸡饲喂大麦，这会在它们的胃肠道区域导致相当高的粘度，其结果是消化效率降低且生长受到抑制。
产生或表达纤维素酶复合物的生物常常还表达木聚糖酶活性。例如，已经鉴定了由T.longibrachiatum产生的两种不同的木聚糖酶。在WO 92/06209和WO 93/24621中详细叙述了这两种不同木聚糖酶的提纯以及每种木聚糖酶基因的克隆和测序。这两种木聚糖酶中的一种称为高PI木聚糖酶(PI为约9.0)，另一种称为低PI木聚糖酶(PI为约5.2)。该文献的图16列出了低PI和高PI基因产物的推导出的氨基致序列。实施22还教导了如何产生过表达低PI和高PI木聚糖酶基因的T.longibrachiatum株。
如上所述，在动物饲料中使用纤维素酶作为添加剂在所属领域已是公知的了。当然这类纤维素酶在它们的纤维素生物水解酶和内葡聚糖酶成分之间有一自然的平衡。上面还指出，在自然存在的T.longibrachiatum株中，CBHs占纤维素蛋白质重量的58-70％。
本发明是依据研究鉴别何种纤维素酶蛋白质组分能够改进如那些包括大麦的谷类基饲料的营养效益。特别留心了构成全纤维素酶的各种酶、特别是内葡聚糖酶对降低大麦的可溶性混合交联β-(1，3)(1，4)-葡聚糖粘度的效应。因为这公知是全纤维素作用的主要模式之一。本发明是根据如下的研究结果做出的。即鉴定能有利地改进谷类基饲料的饲料转化比(FCR)和/或增加它的消化率的纤维素酶系统中的那些具体组分、及它们的相对数量。
以下是在后面说明部分及权利要求书中采用的一些技术用语的定义。
“真菌纤维素酶”意义是由真菌源或微生物衍生的酶组合物，所述微生物是进行基因修饰的以使得包含或表达由真菌源得到的全部或部分的纤维素酶基因。
“木霉属Trichoderma”一词是指分类为或先前已分类为木霉属Trichoderma或目前分类为木霉属Trichoderma的任何真菌株。这样的种包括Trichoderma longibrachiatum、Trichoderma reesei和绿色木霉。
“EG”一词是指任何内葡聚糖酶，例如由T.longibrachiatum产生的EGI、EGII、EGIII或EGV，或具有内葡聚糖酶活性的任何这类内葡聚糖的任何衍生物。
EG“衍生物”包括例如来自木霉属Trichoderma的EGI、EGII、EGIII和EGV，其中在EG的C-和N-末端之一或两者上添加有一个或多个氨基酸，在EG各处一个或多个部位上有一个或多个氨基酸被取代，在EG之内或任意一端或两端上缺失一个或多个氨基酸，或者在EG的一个或多个部位上插入一个或多个氨基酸，使得在衍生的EG中保留内葡聚糖酶活性。EG“衍生物”一词还包括内葡聚糖酶的核心区域，它与来自连接区的一个或多个氨基酸相连。
在这里使用的词“短平头纤维素酶”是指含有外纤维素生物水解酶或内葡聚糖酶的截短的纤维素酶核心的蛋白质，所述外纤维素生物水解酶或内葡聚糖酶例如EGI、EGII、EGV、CBHI、和CBHII、或该两种酶的衍生物。在MolecularMicrobiology(分子微生物学)。在Molecular Microbiology(分子微生微学)，Vol.13，NO.2(1994)219-228页上叙述了EGV。如上面陈述的，许多纤维素酶如EGI、EGII和EGV被认为是双功能的，即它们含有相对于纤维素底物呈催化或水解活性的区或区域，也含有呈非催化纤维素结合活性的区或区域。因而，截短纤维素酶是缺乏结合区纤维素结合活性的纤维素酶。
纤维素酶的催化核心和纤维素结合区被认为是以协同方式共同作用来实现含纤维素饲料中纤维素纤维有效水解的。人们还确信纤维素酶催化活性和纤维素结合活性可确认是不同结构区域上特有的，或可以存在于同一结构区域上。例如，如上面指明的，包括一些来自T.longibrachiatum的许多纤维素酶公知包含亚单元，它通过连接区与纤维素结合区亚单元相连。然而，其它纤维素酶被认为其催化核心区与纤维素结合区在结构上是一体的，例如，该两区域不被连接区隔离并且不代表独特的结构单位。在这类纤维素酶中，认为是特殊的肽或相关的氨基酸残基的组可能在承担纤维素结合活性。对应的，本发明的范围包括通过例如基因工程或化学改性改变这类结合区以使得纤维素酶的纤维素结合活性得以降低。
“平头纤维素酶衍生物”按本文的定义包括一个平头的纤维素酶核心，其中在平头的纤维素酶的C-和N-末端的任一个或两者上可能添加或缺少一个或多个氨基酸，基者在平头纤维素酶各处的一个或多个部位上取代、插入或缺少一个或多个氨基酸。如下面所限定的，所述衍生物解释为包括保留平头的纤维素核心特性的突变体。“平头的纤维素酶衍生物”一词还意欲包括与来自连接区的一个或多个氨基酸相连的外葡聚糖酶或内葡聚糖酶的核心区域。
平头的纤维素酶衍生物进一步是指在结构和生物活性上与平头的纤维素酶核心区蛋白质基本相似的蛋白质，但它通过基因工程作用已含有一个改性氨基酸序列。因而，假定两种蛋白质具有相似的活性，它们被认为是这里使用的词语“衍生物”，尽管一种蛋白质的一级结构不具有与另一种蛋白质中所见的相同的氨基酸序列。
平头的纤维素酶衍生物预计可衍生自编码平头的催化核心区域的DNA片段，所述核心区进一步在内部或在DNA片段5′或3′端含有附加的一个或多个核苷酸，其中保留了催化核心区(平头纤维素酶衍生物)的官能活性。含有纤维素酶催化核心的这种DNA片段(“变种DNA片段”)可进一步包括连接或铰链DNA序列或其部分，它们在5′或3′端与所述核心或结合区DNA序列相连，其中保留了编码的平头纤维素酶核心区(平头纤维素酶衍生物)的官能活性。
在这里“平头纤维素酶核心”或“平头纤维素酶区”词语是指含有外-纤维素生物水解酶或内葡聚糖酶的催化核心区域或区的肽，所述的两种酶例如EGI、EGII或EGIII或它们的能够酶解纤维素聚合物的衍生物，所述纤维素聚合物包括但不仅限于纸浆或磷酸溶胀纤维素。然而，平头的纤维素酶核心不具有纤维素结合区域或区导致的纤维素结合活性。平头的纤维素酶核心与未平头的纤维素酶有区别，前者完整的形式不具有纤维素结合区域或区。平头的纤维素酶核心还包含不具有的纤维素结合区域或区引起的纤维素结合活性的其它单位。例如，连接或铰链区是特别期待的。另一种酶单位与平头的纤维素核心的共价连接也是特别期待的。
含有平头的催化核心或其衍生物的蛋白质的性能(或活性)可以通过本领域公知方法来确定。(参见Wood，T.M.等。Methods in Enzymology，Vol.160，编者：Wood，W.A.和Kellogg，S.T.，Academic Press，PP.87-116，1988)。例如，可以通过水解磷酸溶胀纤维素和/或可溶性低聚糖接着对释放出的还原糖定量来确定这类活性。在这种情况下，由纤维素生物水解酶或内葡聚糖酶纤维素酶核心区或其衍生物的作用释出的可溶性糖产物，可以通过HPLC分析或通过使用测量还原糖的比色分析来测定。当在相似条件下测定并根据相近数量催化区蛋白质配量时，预期这些催化区或其衍生物将保持完整酶表现出的活性的至少10％。
这里的“纤维素结合区”词语是指含有内葡聚糖酶如EGI或EGII的结合区的内葡聚糖酶的氨基酸序列，它与多糖如纤维素非共价连接。确信纤维素结合区(CBDs)独立于内葡聚糖酶催化核心的功能为使蛋白质与纤维素相连。在本发明中使用的截短的内葡聚糖酶缺少CBD但至少包括所述核心或催化区。
“连接区”或“铰链区”词语是指将真菌内葡聚糖酶的两个不同的官能区、即所述核心区和结合区连接在一起的短肽区，在下longibrachiatum纤维素酶中这些区由富含Ser.Thr和Pro的肽连接。
“信号序列”是指连接于一种蛋白质的N-端部分上的任何氨基酸序列，所述蛋白质促进细胞外蛋白质的成熟形态的分泌。信号序列的这个定义是一种官能性的。细胞外蛋白质的成熟形态缺少信号序列，在分泌过程中该序列被裂解掉了。
“宿主细胞”意义是指由木霉属Trichoderma细胞产生的细胞和原生质体。
“DNA构造物或媒介物”(本文中替换使用)是指一种媒介物，它含有编码上述任何一种截短的内葡聚糖酶或衍生物的一个或多个DNA片段或DNA变体片段。
“官能性连接于”意义是调节区如启动子、终止子(terminator)、分泌信号或强化区连接于结构基因上并控制该基因的表达。
“全纤维素酶”意义是由自然存在的微生物产生的完整的纤维素酶体系。
基于上述考虑，本发明的目的之一是提供酶基饲料添加剂，它改进FCR和/或增加谷类基饲料的消化率。
本发明一方面提供酶基饲料添加剂，其包括：
(i)一种或多种(a)缺少纤维素结合区的EGI，(b)缺少纤维素结合区的EGII，以及(c)(a)或(b)的活性纤维素芯，其中：
EGI是指由Trichoderma，SPP.衍生出的内葡聚糖酶，其具有优化pH值约4.0-6.0，等电点(pI)为约4.5-4.7以及分子量为约47-49K道尔顿；以及
EGII为衍生自Trichoderma SPP.的内葡聚糖酶，其具有优化pH值为约4.0-6.0，pI值为约5.5以及分子量为约35K道尔顿；以及
(ii)及以该组合物中纤维素酶蛋白质成份重量计0-20％的纤维素生物水解酶。
如上所述，由T.longibrachiatum(即自然存在的菌株)产生的全纤维素酶以具有纤维素酶活性的酶的总重量计通常含有58-70％(重量)或更多的纤维素生物水解酶。本发明提供的用作饲料添加剂的组合物可通过如下手段得到，即通过提纯添加纯化的内葡聚糖酶来浓缩由适当微生物产生的内葡聚糖酶的含量，或添加附加基因以过量生产内葡聚糖酶。此外，或者还可以通过纯化步骤或者修饰或删除编码纤维素生物水解酶的那些基因来降低与全纤维素酶相比由微生物产生的纤维素生物水解酶的相对含量。特别优选的是饲料添加剂应不含纤维素生物水解酶，使它们在添加剂中的含量为0％(重量)。
在这类添加剂中，谷类基载体可以是磨碎的小麦、玉米或磨碎的大豆。再有，所述载体可以是任何这些物质的付产物。
本发明的第二个方面是提供一种酶基饲料添加剂，它含有至少一种谷类基，其选自大麦、小麦、黑小麦、黑麦和玉米，以及如上所述的酶基饲料添加剂。
本发明的第三方面是提供一种如上述酶基饲料添加剂的制备方法，它包含步骤：通过基因操作构建基因修饰的木霉属真菌株，其将产生适当相对量的所需酶，培养所述基因修饰菌株，并从所述培养基收集该添加剂。
下面将详细叙述通过基因工程技术生产这类结构改性的内葡聚糖酶。
本发明的适用内葡聚糖酶衍生自Trichodermalongibrachiatum，绿色木霉或康氏木霉。
内葡聚糖酶型组分可不包括使用活性测试传统上分类为内葡聚糖酶的组分，所述活性测试例如组分(a)水解可溶性纤维素衍生物如羟甲基纤维素(CMC)，从而减小含CMC溶液的粘度，(b)容易地水解纤维素水合物形态如磷酸溶胀纤维素(例如Walseth纤维素)和较不容易地水解更高结晶形态纤维素(例如，Avicel，Solkafloc，等)的能力。另一方面，确信并非如这类活性测试所定义的所有内葡聚糖酶都强化饲料的营养价值。因而，对于本文的目的更精确地是将内葡聚糖酶型组分定义为与Trichoderma longibrachiatum的内葡聚糖酶具有的饲料营养强化性能相当的那些酶。
真菌纤维素酶可含有多于一种的内葡聚糖酶型组分。不同的组分通常具有不同的等电离点，不同的分子量，不同程序的glycosylation，不同的底物特异性，不同的酶作用方式等。所述组分的不同等电离点使得可通过离子交换色谱法及类似方法对它们进行分离。事实上，对不同源的组分的分离是本领域所公知的。例如参见Bjork等的U.S专利NO.5，120，463；Schulein等的国际申请WO 89/09259；Wood等，Biochemistry and Genetics of Cellulose Degradation(纤维素降解的生物化学和遗传学)，pp.31-52(1988)；Wood等，Carbohydrate Research(碳水化合物研究)，Vol.190，pp.279-297(1989)；和Schulein，Methods in Enzymology(酶学中的方法)，Vol.160，pp.234-242(1988)。通过引用将这些参考文献的每一个全部公开内容在这里引入。
“EGI纤维素酶”是指由Trichoderma longibrachiatum spp.衍生的内葡聚糖酶组分，特征为pH最佳值为约4.0至6.0，等电离点(PI)为约4.5至4.7，分子量为约47至49K道尔顿。优选，EGI纤维素酶是由Trichoderma longibrachiatum或绿色木霉中的任一种衍生的。由Trichoderma longibrachiatum衍生的EGI纤维素酶pH最佳值为约5.0，等电离子(PI)为约4.7，分子量为约47至49K道尔顿。由绿色木霉衍生的EGI纤维素酶pH最佳值为约5.0，等电离点(PI)为约5.3，分子量为约50K道尔顿。
应注意EGII先前被一些作者称为“EGIII”但目前的命名法使用词语EGII。在任何情况下EGII蛋白质与EGIII蛋白质在其分子量、PI和pH最佳值方面都显著不同。“EGII纤维素酶”词语是指由木霉属衍生的内葡聚糖酶组分，特征为pH最佳值为约4.0至6.0，等电离点(PI)为约5.5，分子量为约35K道尔顿。优选，EGII纤维素酶是由Trichodermalongibrachiatum或绿色木霉中任一种衍生的。
“EGIII纤维素酶”是指由木霉属衍生的内葡聚糖酶组分，特征为pH最佳值为约5.0至7.0，等电离点(PI)为约7.2至8.0，分子量为约23至28K道尔顿。优选，EGIII纤维素酶是由Trichoderma longibrachiatum或绿色木霉中的任一种衍生的。由Trichoderma longibrachiatum衍生的EGIII纤维素酶的pH最佳值为约5.5至6.0，等电离点(PI)为约7.4，分子量为约25至28K道尔顿。由绿色木霉衍生的EGIII纤维素霉pH最佳值为约5.5，等电离点(PI)为约7.7，分子量为约23.5K道尔顿。由绿色木霉衍生的EGIII纤维素pH最佳值为约5.5，等电离点(PI)为约7.7，分子量为约23.5K道尔顿。
“外纤维素生物水解酶型组分”(“CBH型组分”)是指表现出与Trichoderma longibrachiatum的CBHI和CBHII相似的饲料活性特性的所有那些纤维素酶组分。在这点上，当与EG型组分组合使用时，CBHI和CBHII型组分(如上定义)就饲料转化比/或饲料消化率而言降低动物饲料纤维素酶辅加物的有效性。
这类外-纤维素生物水解酶型组分可不包括使用活性测试传统分类为外-纤维素生物水解酶的组分，所述活性测试例如用于表征由Trichoderma longibrachiatum衍生的CBHI和CBHII的那些。例如，这类组分(a)被纤维二糖竞争性抑制(K1近于1mM)；(b)不能水解成任何显著程度的取代纤维素，如羟甲基纤维素，等，且(c)水解磷酸溶胀纤维素并且达到较低程度的高结晶态纤维素。另一方面，确信通过这类活性测试确定为CBH组分的一些纤维素酶组分能强化饲料的营养价值。因而认为，按照本文的目的更精确的是将这类外-纤维素生物水解酶定义EG型组分，因为这些组分应用于动物具有相当于Trichoderma longibrachiatum的那些内葡聚糖酶组分的相似的官能性能。
“β-糖苷酶(BG)组分”是指表现出BG活性的那些纤维素酶组分；也就是说这类组分从纤维二糖和其它可溶性纤维素低聚糖(“纤维二糖”)的非还原端进行作用并得到葡萄糖作为唯一产物。BG组分不在纤维素聚合物上吸附或与之反应。再有，这类BG组分被葡萄糖竞争性抑制(Ki约为1mM)。从严格的意义上讲，BG组分并非实际的纤维素酶，因为它们不能降解纤维素，将这类BG组分包括在纤维素酶体系的定义中是因为这些酶通过进一步降解抑制性纤维素降解产物(特别纤维二糖)能促进纤维素的总降解，所述抑制性降解产物是由CBH组分和EG组分混合作用产生的。不存在BG组分，结晶态纤维素将缓和地或几乎不水解。BG组分常常有使用芳基底物的特征，所述芳基底物如对-硝基苯酚-β-D-葡糖苷(PNPG)，因而BG组分常常被称为芳基-糖苷酶。应注意并非所有的芳基-糖苷酶都是BG组分，因为其中的一些不水解纤维二糖。
认为可以使用存在或缺少BG组分的纤维素酶组合物来调节该组合物中任何CBH组分的活性。具体地说，由于在纤维素降解过程中CBH组分产生纤维二糖，且因为公知高浓度的纤维二糖可抑制CBH活性，还因为这些纤维二糖被BG组分水解成葡萄糖，则在纤维素酶组合物中缺少BG组分当纤维二糖的浓度达到抑制量时会“关掉”CBH活性。还可以向纤维素酶组合物中添加一种或多种添加剂(如纤维二糖、葡萄糖等)以直接或间接地有效“关掉”一些或全部CBHI型活性以及其它CBH活性。当采用这类添加剂时，如果添加剂的量足以将CBH型活性降低到等于或少于使用本文所述纤维素酶组合物所达到的值，则认为有添加剂的组合物是适用于本发明的组合物。
另一方面，如果由CBH组分产生的纤维二糖的量在缺少添加的BG组分的条件下开始限制纤维素的总体水解，则含有添加量的BG组分的纤维素酶组合物可增加这种纤维素总体水解。
在纤维素酶组合物中增加或降低BG组分的数量的方法公开于申请日为1991年12月10日申请号No.07/807，028的U.S.专利申请中，它是申请日为1990年12月10日申请号No.07/625，140的U.S.专利申请(对应于EP-A-0562003)的部分后续申请，这里通过引用将它们全部以全文引入。
真菌纤维素酶可含有多于一种的BG组分。不同的组分通常具有不同的等电离点，这使得可以通过离子交换色谱法及类似方法将它们分离。可以采用单一的BG组分或BG组分的组合。
在优选的实施例中，适用于本发明的内葡聚糖酶组分是具有与Trichoderma longibrachiatum得到的那些、即EGI和EGII相似性能的那些。它们的制备方法详细叙述于WO 92/06209。
在全纤维素酶组合物中存在除CBH型组分外的其它组分可引起不良的肠粘度、饲料转化比增加和动物增重降低。因而，认为使用富集的内葡聚糖酶如EGI或EGII可消除当使用全纤维素酶时出现的问题中的一些或其全部。
已发现在动物的谷类基饲料日粮中包含富集内葡聚糖酶的饲料添加剂能使动物更有效的消化日粮。在包含大麦和谷类基饲料中特别如此，其中存在的上述饲料添加剂改进了饲料转化比和/或增加了谷类基饲料的消化率。谷类基饲料通常包含至少25％(重量)的谷类，优选至少35％(重量)。在大麦之外或作为其替换物，谷类可包含一种或多种小麦、黑小麦、黑麦和玉米。本发明提供的富集内葡聚糖酶的饲料添加剂还能够使通用的谷类基饲料修变为减少其能量、和/或蛋白质、和/或氨基酸含量而同时保持其对动物可利用的能量、蛋白质、和氨基酸的相同的营养水平。这意味着与通用的饲料相比，可以降低在动物饲料中通常包含的昂贵的能量和蛋白质添加物的数量。能量添加物包括脂肪。蛋白质添加物包括鱼粉、小麦粉、大豆、油菜子、或canola。这导致显著降低了单位重量动物饲料的费用，而不降低其营养价值。替代之的是，或者甚至附加地，与通用饲料相比可降低氨基酸添加物的数量，这也可导致费用的显著降低。
可以用多种途径来制备本发明的酶饲料添加剂。例如，可简单地通过混合具有适当活性的不同酶得到一种酶混合物来制备。这种酶混合物可以直接与饲料混合，或者更通常是混入谷类基载体物体中例如磨碎的小麦、玉米或大豆粉。还可以使用任何这些产物的副产物。这种混入酶混合物的载体构成了本发明第三方面的酶饲料添加剂。
作为一种供选择的方案，由例如磨碎的小麦或玉米形成的谷类基载体可以同时或连续混入具有适当活性的酶。例如，磨碎的小麦载体可以喷入一种或多种内葡聚糖酶。混入了这些酶的载体物质也构成了本发明第三方面的酶饲料添加剂。
本发明提供的饲料添加剂可以直接与动物饲料混合来制备最终的饲料，所述饲料例如是含有大麦的。该饲料添加剂还可以与一种或多种其它饲料添加剂如维生素饲料添加剂、矿物质饲料添加剂和氨基酸饲料添加剂相混合。所得到的包含数种不同类型组分的饲料添加剂然后可以适当的数量与饲料混合。
所得到的谷类基饲料优选包含0.000001-0.1g/kg的总内葡聚糖酶，更优选0.00001-0.01g/kg，最优选0.0001-0.001g/kg。
制备本发明酶饲料添加剂通过基因操作构建一宿主微生物来制备，例如真菌木霉属，它产生适当相对数量的所需的酶。这可以通过例如下述手段实现，即增加编码内葡聚糖酶的基因的拷贝数量和/或在任何上述内葡聚糖酶基因之前使用适当强的启动子。做为替代手段或附加手段对一些纤维素酶基因(例如编码CBHI和/或CBHII的那些)可以删除宿主菌株。在WO 92/06209转化T.reesei的例子中完整地解释了这些步骤。
本发明提供的酶饲料添加剂还可包括其它的酶例如木聚糖酶、蛋白酶、α-淀粉酶、葡糖淀粉酶、脂肪酶、果胶酶(pectinase)、甘露聚糖酶、α-半乳糖苷酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶(arabinofuranosidase)或肌醇木磷酸酶。具有所需性能的酶与本发明使用的内葡聚糖酶的混合可在例如将这些内葡聚糖酶混入谷类基载体之前进行，或者这些酶还可以同时或连续地混入这类谷类基载体中。然后接着将所述载体与谷类基饲料混合以制备最终的饲料。还可以将酶饲料添加剂配制成各种酶活性的溶液，然后将这种溶液与预成形为颗粒或浆状的饲料物质混合。
还可以通过将酶饲料添加剂加入到动物也接近的第二种(且是不同的)饲料或饮水中使其包含于动物日粮中，对应地，本发明提供的酶混合物不是必须添加到谷类基食物本身中，虽然这种添加方式是本发明特别优选的方面。
在一个优选的实施例中，作为附加的酶添加的木聚糖酶是高PI木聚糖酶和/或低PI木聚糖酶，它们可通过WO 92/06209实施例22的方法中得到的T.longibrachiatum来获得。特别优选木聚糖酶是高PI木聚糖酶。
按照进一步优选的实施例，作为附加酶添加的蛋白酶是由杆菌属衍生的枯草菌溶素(subtilisin)或其变体。适用的杆菌属菌株包括但非仅限于B.amyloliquefaciens、B.lentus、B.licheniformis、枯草杆菌、或B.alcalophilus。
枯草菌溶素还可以是具有一种氨基酸序列的变体枯草菌溶素，所述氨基酸序列未见于自然中但通过在前体枯草菌溶素中插入、删除、或取代一个或多个不同氨基酸残基可以由前体枯草菌溶素来衍生。适用的变体枯草菌溶素叙述于以下文献中：对应于US-Re-34686的EP-A-0130756(包括在+155、+104、+222、+166、+133、+169、+189、+217、+156、+152位突变)；EP-A-0251446；WO 91/06637等。最优选的枯草菌溶素是一种变体枯草菌溶素，它在等价于B.amyloliquefaciens枯草菌溶素的tyr+217氨基酸残基位置上被氨酸取代。
制备这类变体枯草菌溶素的方法详细叙述于文献US-Re-34606和EP-A-0251446中。
包含本发明所述添加剂的谷类基动物饲料适于应用的动物例和猪、反刍动物如羊如牛，家禽如鸡、火鸡、鹅和鸭。所述饲料特别适用于家禽和猪，特别是焙烤用鸡。
如先前提到的，本发明的酶饲料添加剂优选通过培养木霉属的遗传改性菌株来获得。这是因为其公知的大量分泌纤维素酶的能力。这种改性菌株可由T.longibrachiatum、T.reesei或绿色木霉来衍生。这类菌株的基因组可以改性为过表达或删除构成全纤维素酶的一种或多种酶组分。
微生物培养基生长至一团定相，过滤除去细胞，通过超滤浓缩残余的上清液以得到内葡糖酶或其衍生物。
在上述方法的一个具体方面中，用于培养转化的宿主细胞的介质可以是适合于以木霉属生产内葡聚糖酶的任何介质。可以通过通用技术从介质中回收内葡聚糖酶或其衍生物，所述技术包括通过离心从介质中分离细胞，过滤，在上清液中沉淀蛋白质或用盐例如硫酸铵过滤，接着进行色谱法步骤例如离子交换色谱法、亲合色谱法及类似方法。
作为替代方案，可通过结合于多糖底物或抗体基质上来分离和纯化最终的蛋白质产物。可以培育抗体(多克隆或单克隆)以针对内葡聚糖酶核心区的肽，或者从部分核心区制备合成肽并用于培育多克隆抗体。
本发明进一步的技术方案是，编码内葡聚糖酶或衍生物的DNA片段或变体DNA片段可以官能性连接于真菌启动子序列如cbh1或egl1基因上。本发明还包括，通过转化调节木霉属菌株使得编码内葡聚糖酶或其衍生物的DNA片段在基因组中插入。再有，多于一个的拷贝的内葡聚糖酶DNA片段或DNA变体片段可以重组入菌株中。
必须首先选定可选择的标记物使得能够检测转化的真菌。在木霉属中表达的任何可选择的标记物基因都可在本发明中使用，从而它在转化物中的存在不会对其性能有实质影响。可选择的标记物可以是木霉属基因的官能性拷贝，所述基因如在宿主菌株中缺少会导致宿主菌株显示营养缺陷性表现型。
所使用的宿主菌株可以是缺少或具有对应于选定的可选择的标记物的非官能性基因的木霉属衍生物。例如，如果选定Pyr4可选择的标记物，则在转化步骤中以具体的Pyr衍生物菌株用作受体。可以在本发明中使用的可选择的标记物的其它实例包括等价于Aspergillus nidulans基因argB、trpC、niaD及类似物的木霉属基因。因而对应的受体菌株必须是衍生物菌株例如argB-、trpC-、niaD-及类似物。
所述菌株由起始宿主菌株衍生，该宿主菌株是任何木霉属菌株。然而，优选的是使用T.longibrachiatum纤维素酶过量生产的菌株如RL-P37，它叙述于Sheir-Neiss等的Appl.Microbiol.Biotechnology，20(1984)pp.46-53中，因为这一菌株分泌提高数量的纤维素酶。然后使用这一菌株来生产用于转化过程的衍生物菌株。
可以通过许多本领域公知的技术来制备木霉属的衍生物菌株。一个实例是通过使菌株经受fluoroorotic acid(FOA)作用生产Pyr4-衍生物菌株。Pyr4基因编码乳清酸核苷-5′-单磷酸盐脱羧酶，后者是尿苷生物合成所需的一种酶。有完整Pyr4基因的菌株在缺少尿苷但对fluoroorotic acid敏感的介质中生长。可以通过选择对FOA的耐抗性来选择Pyr4-衍生物菌性，它缺少官能性乳清酸核苷单磷酸盐脱羧酶，且生成需要尿苷。使用FOA选择技术，还可以获得缺少官能性乳清酸盐转磷酸核糖基酶、需要尿苷的菌株。可以用编码这种酶的基因的官能性拷贝来转化这些细胞(Berges和Barreau，1991，Curr.Genet.19 pp359-365)。因为在本发明中使用抗FOA技术可以容易地选择衍生物菌株，优选使用Pyr4基因作为可选择的标记物。
在本发明的优选实施例中，在引入DNA构建或含有编码感兴趣的内葡聚糖酶的DNA片段的质粒之前，删除木霉属宿主细胞菌株的一个或多个纤维素生物水解酶基因。优选在缺少一个或多个纤维素生物水解酶基因的宿主中表达内葡聚糖酶、其衍生物或共价连接的内葡聚糖酶区衍生物，从而简化鉴别和随后的提纯步骤。可以删除已经克隆了的来自木霉属的任何基因，例如Cbh1或Cbh2。
通过本领域公知方法将要从转化体中删除的所需的基因插入质粒。选择这种质粒使在其中存在独特的限制酶位点，以使木霉属DNA片段随后能够作为单一线性片被移出。要含有所述被删除或破坏的基因的质粒然后在编码区内部适当的限制酶部位切断，从中移出基因编码序列或其部分，并插入可选择的标记物(例如Pry4)。从要被删除或破坏的基因座位侧翼DNA序列，优选约0.5至2.0Kb，保留在可选择的标记物基因的两侧上。
接着含有缺失结构的单链DNA片断从质粒中分离出来并用于转化适宜的木霉菌宿主。根据它们表达Pyr4基因产物的能力将转化体选择出来以补充宿主菌株中的尿苷营养缺陷型。将得到的转化体通过进行Southern印迹法实验从而识别，证实所进行的双交换整合过程，该过程能部分或全部代替将要被删除的Pyr4选择性标记基因的密码区。
虽然上面已描述了特殊的质粒载体，但本发明不仅限于这些载体的产物。在木霉菌菌株中用上述技术可将各种基因删除和取代。如上所讨论的，任何现有的选择性标记都能使用。已克隆和识别的任何可能的木霉菌基因都能用上述方法从基因组中删除。
本发明中含有编码内葡聚糖酶及其衍生物的插入DNA片断或变异DNA片断的表达载体可以是能在给定宿主器官自发复制的任何载体，典型的是质粒。更具体地，人们正考虑获得基因或其平头的表达的两种表达载体。第一种包含一段DNA序列，在此序列中启动子，基因编码区，终止区序列都由要表达的基因产生。如需要基因平头通过删除不需要的DNA序列(编码非目的区域)而留下要表达的区域，这个过程在它本身的转录和翻译调控序列的控制下进行。在允许对将新的基因序列的多拷贝整合到宿主中的整合作用进行选择时，一个载体的选择性标记还可从获得。
例如，可定义为PEGID3′Pyr的一段DNA包含了在EGI启动子，终止区和信号序列控制下的EGI纤维素酶的核心区域。包含纤维素结合区域的EGI编码区域的3′末端被删除。这个质粒由于选择的目的还包含Pyr4基因。
第二种表达载体是预先制备的，它含有高水平转录和一个选择性标记所需的序列。人们考虑到基因或其片断的编码区域能插入到这个具有普遍效果的表达载体，在此情况下它是受表达盒的启动子和终止区序列的转录控制。
例如，PTEX就是这样一种具有普遍效果的表达载体。基因或其片断能在CBHI强启子下面插入。
在这个载体中，编码内葡聚糖酶的DNA序列应与转录和翻译序列衔接，即在结构基因解读框架中的一个适宜的启动子序列和信息序列信号这个启动子可以是显示宿主细胞转录活性的任何DNA序列，它可从编码宿主细胞的同种或异种蛋白的基因中衍生而来。信号肽提供了内葡聚糖酶或其衍生物的细胞外表达。DNA信号序列最好是与要表达的平头基因自然联系的信号序列，尽管如此，本发明将考虑任何内葡聚糖酶的信号序列。
对于将编码平头的内葡聚糖酶或其衍生物的DNA序列与启动子连结的步骤以及将其插入含有宿主细胞复制所必需的信息的适宜载体中过程，在现有技术中都非常清楚。
根据已知的如转化，感染，显微注射，微孔技术以及biolistic路子轰击以及类似的技术，上出DNA载体或结构可以在宿主细胞中介绍。
本发明更具体地表现在，变异的菌株是由木霉菌衍生而来，它包含被删除或断裂的CBHI和或CBHII的基因，这样变异的菌株就不能产生具有催化活性的纤维素生物水解酶。由这种生物产生的纤维素酶将富集内葡聚糖酶，并且根据它所产生的纤维素酶蛋白的混合重量，含有不超过20％的纤维素生物水解酶，更好的是，此变异菌株不能产生具有催化活性的CBHI，而这种酶占由木霉菌得到的全部纤维素酶的任何一种组分的最大部分。
变异的菌株另外包含重组DNA，该重组DNA能表达和释放平头的具有催化核心的EGI或EGII。不愿被理论所束缚，人们认为纤维素酶中的纤维素结合区域的出现可能产生当给动物喂以添加纤维素酶的饲料，即增加肠的粘性时所出现的一些不愿出现的特性。由此，去除纤维素的结合区域，保留完整的纤维素酶的核心，可以减少或消除这些特性。
在描述制备这种平头丙葡聚糖酶的方法之前，下面提供了理解制备技术所必需的有关附图的详细说明。
图1：叙述了EGI的基因DNA和氨基酸序列。这个信号序列从第113碱基对开始，至第117碱基对结束(Seq IDNO.13)。催化核心区域从第一个外显子的第179碱基对开始，至第一个外显子的第882碱基对以及第二个外显子的第963碱基对(Seq ID NO.5)。至第1379碱基对衔接物区域从第1380碱基对开始至第1460碱基对(Seq ID NO.9)结束。纤维素结合区域从第1461碱基对开始至第1616碱基对结束(Seq ID NO.1)Seq ID NOS.14，6，10和2分别表示EGI的信号序列，催化核心区域，衔接物区域和结合区域的氨基酸序列。
图2：叙述了EGII的基因DNA和氨基酸序列。信号肽从第262碱基对开始至第324碱基对结束(Seq ID NO.15)。纤维素结合区域从第325碱基对开始至第432碱基对结束(Seq ID NO.3)。衔接物区域从第433碱基对开始至第534碱基对结束(Seq ID NO.11)。催化核心区域从外显子1的第535碱基对开始至第5％碱基对。以及外显子2的第765碱基对开始至第1689碱基对(Seq ID NO.7)。Seq ID NOS.16，4，12和8分别表示EGII信号肽，结合区域，衔接物区域和催化核心区域的氨基酸序列。
图3：叙述了EGIII的基因DNA和氨基酸序列。信息序列从第151碱基对开始至第198碱基对(Seq ID NO.19)。催化核心区域从外显子1的第199碱基对开始至第557碱基对，从外显子2的第613碱基对开始至第833碱基对以及从外显子3的第900碱基对开始至第973碱基对(Seq ID NO.17)。Seq ID NOS 20和18分别表示EGIII信号序列和催化核心区域的氨基酸序列。
图4：显示EGI核心区域表达载体的结构(Seq ID NO.21)。
图5：不同pH值下的全部纤素酶和各种富集的内葡聚糖酶制备物的初始粘度降低活性示意图。
如上所述，本发明中的酶饲料添加剂中的一种或多种内葡聚糖酶是平头的EG的衔生物缺乏纤维素结合区域(它可定义为EGI核心)的EGI和/或同样缺乏纤维素结合区域的EGII。这些衍生物可以通过将一段包含至少编码部分或全部内葡聚糖酶的核心区域如与启动子在功能上相联的EGI或EGII的DNA片断转化到一宿主细胞，并培育宿主细胞使其表达平头的内葡聚糖酶，平头的内葡聚糖酶的衍生物或想要的共价连接的平头的内葡聚糖酶区域衍生物的重组方法而得到。由此获得的平截内葡聚糖酶一旦从作为饲料添加剂的微生物细胞中分离得到就能被使用。更好的，平截的内葡聚糖酶或其衍生物在使用之前可以另外纯化成大量同质性的物质。
下面的参考例1和2说明利用转化培养基因被修饰了的微生物制得内葡聚糖酶的富集酶的组合物的技术。
参考例1。
利用自身启动子，终止区和信号肽进行EGI核心区域的克隆和表达。
第1部分克隆
在EGI核心区域表达质粒的结构中用到的全部egu基因，PEGID3′Pyr，可通过质粒PUC218∷EGI得到(见图4)。egl的3′终止区作为一个具300个碱基对的BSmI-ECORI酶片断(BSMI位点位于距egll终止密码子3′端46个碱基对的位置)与一个用于取代具终止密码子的egll的纤维素结合区域并连有egll终止区序列的第一个46个碱基对的一个合成衔接物一起连接到PUC218上(Korman，D，et alCurr.Genet.17：203-212，1990)得到的质粒PEGIT用HundIII酶和BSmI酶消化，具egll终止区的载体片断通过琼脂糖凝胶电泳和随后的电洗脱从消化液中分离出来，egll基因的启动子序列和egll核心区域以一个2.3kb Hind III-SstI片断的形式从PVC218∷EGI中分离出来，并与相同的合成衔接物片断和用Hind III-BsmI酶消化的PEGIT连接起来形成PEGID3′。
实验的净结果是用合成的53和55nt的寡核苷酸代替了3′内显子和egll的纤维素结合区域。它们代替了丝氨酸415之后的TAG终止密码子，此后即连有egll的终止区直到BsmI位点。
接着，T.longibrachiatum选择性标记Pyr4，作为一个分离的1.6kb ECORI-Hind III片断从前面P219M克隆中获得(Smith et al 1991)它被掺入到最终表达质粒PEGID3′Pyr中，此过程通过分别与用ECORI酶消化，用牛碱性磷酸酶脱磷酸的PUC18质粒，以及含有从PEGID3′开始的egll核心区域的Hind III-ECORI酶片段相连结的三种方式进行第2部分。
转化和表达。
大量的DNA制备物由PEGID3′Pyr组成。从中含有egll核心区域的ECORI片断和Pyr4基因可通过制备凝胶电泳得以分离将分离的片断转化到一个菌株中(1A52Pyr13)。此菌株中的cbh1，cbh2，egllt egl2基因已被删除，其中Pyr4的位置(descr.bed in Wo 92106209)和稳定的转化体都已确定。
为了选择表达egu核心区域的转化体，在适于纤维素酶基因感染的条件下于震荡的烧瓶中培养转化体(Vogels介质+1％乳糖)。生长4-5天后，浓缩上清液的蛋白质，或用方法1)在用抗-EGI的多克隆抗体进行Western印迹分析检测EGI核心区域之前进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳或用方法2)运用Remazol Brilliant Blue(RBB)羧基甲基纤维素作为内葡聚糖酶的特异性底物，将其结果与对照的亲代菌株(1A52)进行比较来直接分析浓缩的上清液。转化体的选择通过可能产生的一个平头EGI核心区域蛋白来确定在Vogels十1％乳糖培养以及用仅含有egll核心区域的分离的DNA片断进行Southern和Northern印迹实验之后，基因DNA和全部mRNA.可从这些菌株中分离得到这些实验表明：转化体能被分离出来，并具有整合到1A52基因中的egll核心区域表达盒的一个复制片断，并且这些相同转化体产生egll核心区域的mRNA.接着将一个转化体放在装有现有技术已知的加有乳糖(Warzymoda，M.et al 1984 French PatentNO.2555603)适宜于木霉菌产生纤维素酶的介质的14升发酵罐中培养。浓缩得到的液体培养基并用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳对其中所含蛋白质进行分离，EGI核心区域蛋白质通过Western印迹实验鉴定，随后计算发酵上清液的蛋白质浓度大约为5-6g/l，其中EGI核心区域浓度根据CMC酶活性大约为1.7-4.4g/l。这个值是根据所进行的多个EGI核心发酵作用的平均值而得到。
用同样方法，任何别的内葡聚糖酶，不论平头与否或其衍生物都可通过与上面讨论的类似的过程而制得。因此EGI的产物可以通过类似的技术而得到，除开纤维素结合区域的删除可以省略的情况之外，相应的技术可用来产生完整的EGII，EGIII和其中省去了纤维素结合区域的EGII。
参照例2
EGI和EGII催化核心的纯化
第一部分：EGI催化核心
EGI核心通过下面方法纯化，浓缩的(UF)的液体培养基在23mM，pH5.0的乙酸钠中稀释至14毫克/毫升。将200克微晶纤维素溶胶(FMC Bioproducts，Type pH一101)加入到稀释了的EGI核心液体培养基中并在室温下混合45分钟。通过离心沉淀将微晶纤维素从液体培养基中除去，得到一个富集的EGI核心溶液，接着用带有一个PM10膜的Amicon搅拌细胞浓缩器将此浴液缓冲交换到10mMpH7.5的TES中(diaflo超滤膜Amicon Cat# 13132MEM5468A)。接着将EGI核心样品放置到一个阴离子交换柱上(Q-琼脂糖快速流动pharmacia Cat#17-0510-01)，用其中Nacl的浓度梯度为0至0.5M的10mMpH7.5的TES进行洗脱。将含有EGI核心的部分混合并用上述Amicon搅拌细胞浓缩器将其浓缩。
第二部分：EGII催化核心
我们考虑认为EGII催化核心的纯化与EGII纤维素酶的纯化类似，因为它们具有类似的系列化特性。EGII核心的理论PI值比EGII低半个pH单位。而且EGII核心分子量约为EGII分子量的80％，下面纯化方案基于EGII的纯化基础上而进行。该方案可包括将OF的浓缩液体培养基通过硅藻土过滤，并加入(NH4)2SO4使浴液使其成为1M(NH4)2SI4的溶液，接着可将此溶液放置到-疏水柱上(苯基-琼脂糖快速柱Pharmacia，Cat#17-0965-02)并用0.15M(NH4)2SO4逐步洗脱。随后含有EGII核心的部分可被缓冲交换到pH7，0.18M的棕檬酸盐-磷酸盐的缓冲溶液中将此物质放置到一个用上述柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液平衡的阴离子交换柱上(Q-琼脂糖快速柱Pharmacis，Cat.#17-0510-01)。EGII核心将不与该交换柱结合因而随着液体流下而被收集。
本发明将通过下面参照例3和参照1进行一步详细说明。在参照例1中，以β-葡聚糖酶活性单位作为标准，它的活性通过下面试验测得。
1个β-葡聚糖酶活性单位即在上述条件下1分钟释放1μmol还原性糖类(表示为葡萄糖的当量数)所需的酶量。
试剂11.0％(w/v)β-葡聚糖底物
用10ml乙醇湿润1.0克混合连结β-(1，3)(1，4)-葡聚糖混合物(Biocon Biochemicals Ltd.)。加入约80ml蒸馏水加热至沸腾，继续加热并用力搅拌直至β-葡聚糖溶液得到一个混浊溶液。连续搅拌冷却该混浊溶液至室温，通过加入蒸馏水调节β-葡聚糖浓度至1.0％(w/w)。通过玻璃纤维过滤纸过滤。
此底物能立即使用。如在冷的空间内贮藏二天仍可使用。
2.0.1M乙酸钠缓冲溶液，pH5.0
A.将8.2克无水乙酸钠溶于蒸馏水中，并加蒸馏水至1000毫升。
B.将6.0克冰乙酸溶于蒸馏水中，并加蒸馏水至1000毫升，用溶液B调节溶液A的pH值至5.0。
3.二硝基水杨酸(DNS)试剂。
将20.0克3.5-二硝基水杨酸悬浮于约800毫升蒸馏水中，在连续搅拌中逐渐加入300毫升氢氧化钠溶液(32.0克NaOH浴于300毫升蒸馏水)，用水溶(温度不能超过48℃)加热悬浮液并搅拌，直至溶液变为清亮，逐渐加入600g酒石酸钾钠，如需要，加热(温度不能超过48℃)溶液直至清亮。
用蒸馏水加至2000ml，用粗糙烧结玻璃滤器过滤。
在室温下贮藏在棕色瓶中，该试剂保持稳定最长时间为六个月。
步骤1酶样品
30℃时平衡1毫升酶稀释溶液(0.1M乙酸钠缓冲溶液，pH5.0)。加入1毫升β-葡聚糖底物，搅拌并在30℃条件孵育近10分钟。加入3毫升DNS试剂，搅拌反应混合物至加热沸腾5分，在冷水浴中冷却反应混合物至室温，测量在540nm时对蒸馏水的吸光率。
2.酶空白
将1毫升β-葡聚糖底物于30℃孵育10分钟，加入3毫升DNS溶液并搅拌，加入1毫升酶稀释液并搅拌(0.1M乙酸钠缓冲液，pH5.0)，沸腾该混合物约5分钟，在冷水浴中冷却反应混合物至室温，测量其在540mm时对蒸馏水的吸光率。
酶样品和酶空白吸收光率的差别为0.3-0.5。
3.标准曲线
在蒸馏水中用无水葡萄糖制备标准溶液。标准溶液中葡萄糖的浓度为0.1-0.6克/毫升。用移液管移取1毫升葡萄糖标准溶液，1毫升蒸馏水和3毫升DNS-试剂置于试管中，搅拌加热至沸腾5分钟，用冷水浴冷却至室温，测量其在540mm时对标准空白的吸光率。在标准空白中。葡萄糖溶液被1毫升蒸馏水代替，否则标准空白就象葡萄糖标准溶液一样对待。
把葡萄糖浓度作为吸光率的函数，对每一个新DNS-试剂绘制新的标准曲线。
计算根据下面方程式可计算样品的β-葡萄糖酶活性：其中：
A(z)＝酶样品的吸光率
A(O)＝酶空白的吸光率
K＝标准曲线的斜率
C.＝葡萄糖标准曲线的截距
1000＝因子，mmol->μmol
Df＝稀释因子(毫升/克)
MWglu＝葡萄糖的分子量(180.16毫克/mmol)
t＝反应时间(10分钟)
参考例3涉及到β-葡聚糖酶的粘度减小活性的测定，这个活性可通过下面试验测定。
原理，β-葡聚糖酶催化β-葡聚糖的水解，此过程使β-葡聚糖溶液的粘度减小，作为时间函数的比粘度倒数与反应的初始时间为线性函数。利用线性曲线的斜率，β-葡聚糖酶的活性能得以确定。通过使用毛细管粘度计可确定比粘度倒数。
设备。奥氏毛细管粘度计(Brand，No 11，75-100Sec)
控制在30℃的水浴加热器
磁性搅拌器
计时器
3号和4号中间为玻璃的滤器
带电炉的磁性搅拌器
试剂1.  0.5M乙酸缓冲液，pH4.0
将30克冰乙酸(BDH AnalaR 10001)加入到9000毫升蒸馏水中稀释。用2.5克NaOH(Merck 6498)调节它的pH值到4.0，加蒸馏水至1000毫升。
2. 0.05M乙酸缓冲液，pH4.0
将100毫升0.5M乙酸缓冲液(pH4.0)加入到800毫升蒸馏水中稀释。如需要，用1MNaOH或冰乙酸调节其pH至4.0。加蒸馏水至100毫升，用4号中间为玻璃的滤器过滤。
3.β-葡聚糖溶液
在一校准烧杯中称取混合键连接的β-(1，3)(1，4)-葡聚糖(Biocon Biochemicals)1.0克，加入约6毫升乙醇并用金属混合棒混镁，直至该混合键连接的β-葡聚糖完全湿润。加入约80毫升蒸馏水，用磁性搅拌器混合，加热至沸腾。保持沸腾直至混合键连接的β-葡聚糖完全溶解。保证没有物质遗留在烧杯壁上。连续搅拌冷却溶液至室温，加入10毫升pH4.0的0.5M乙酸缓冲溶液，如需要，用1MNaOH或冰乙酸调节其pH值至4.0。加入蒸馏水直至底物溶液的总重量为100克。用3号中间为玻璃的滤器过滤。在4℃保持底物溶液最长时间为2天。
步骤  1.比粘度倒数的测定
在确定活性之前需通过用蒸馏水和丙酮(按此顺序)漂洗确保粘度计的干净。用压缩空气或真空方法除去丙酮使粘度计干燥。
所有的样品，底物溶液和粘度计在测定之前需在30℃条件下平衡至少15分钟。
比粘度倒数按照方程式1计算。
Figure C9419121600381
其中
1/Usp＝比粘度例数
dTo＝乙酸缓冲溶液的降落时间(以秒单位)
dTs＝样品溶液的降落时间(以秒为单位
    溶液的降落时间按照方程式2计算
dTi＝T2-T1-h(方程式2)
其中
dTi＝溶液的降落时间
T2-T1＝溶液在毛细管最高标记和最低标记之间降落所用时间(以秒为单位)
h＝Hagenbach因子
Hagenbach因子：降落时间(dTi)  h
        s
        ＜  54.2          1.054.3        -   57.3          0.957.4        -   60.5          0.860.6        -   65.5          0.765.6        -   70.8          0.670.9        -   78.5          0.578.6        -   88.9          0.489.0        -   105           0.3105         -   135           0.2135         -   240           0.1
        ＞  240           0
用一个干净干燥的粘度计测定降落时间时，将7.5ml溶液泵入毛细管中，这样溶液的表面就超过了毛细管的最高标记，用计时器测定溶液从毛细管的最高标记降落到最低标记所用时间。
2.乙酸缓冲溶液的降落时间的测定
只要确定了β-葡聚糖酶活性，如上所述的0.05MpH4.0的乙酸缓冲溶液的降落时间(dTo)就可测定。
3.β-葡聚糖溶液的调节
β-葡聚糖水解作用的初始比粘度倒数为0.13。一批与另一批的β-葡聚糖溶液的粘度是变化的。这就需通过β-葡聚糖溶液与样品的比率的变化来补正以保证初始粘度的正确。
制备五份不同的β-葡聚糖/0.05M乙酸缓冲溶液(pH4.0)混合物，该混合物通过移取β-葡聚糖(A)5.0-6.0毫升，并相应地移取2.5-1.0毫升的0.05M乙酸缓冲溶液(pH4.0)，使每份混合物的总体积为7.5毫升。测定这些溶液的粘度，计算它的比粘度倒数。
以比粘度倒数作为β-葡聚糖的函数。从图上确定对应于比粘度倒数值为0.13的β-葡聚糖的量。此β-葡聚糖的量将在后来用于β-葡聚糖溶液中的所有β-葡聚糖酶活性的测定。
只要β-葡聚糖酶的活性已测定，β-葡聚糖溶液的初始粘度即可测定。
4.β-葡聚糖酶活性的测定
用移液管移取如上所述的体积为(A)的β-葡聚糖于试管中，在30℃条件下平衡至少15分钟。加入在pH4.0的0.05M乙酸缓冲溶液中稀释的体积为Vml(V＝7.5ml-A)的酶样品，在30℃条件平衡至少15分钟，开始计时，适当地混合此溶液并将其转移到粘度计中，从溶液混合时起的20-30分钟时间内测定混合溶液的降落时间dTs4至5次。
测定必须在至少两个不同的稀溶液中进行。且每一个稀释溶液至少有三个平行的测定样品合适的稀释溶液依赖于酶混合物产物和要分析的最终饲料量稀释溶液分别给予说明。对于酶混合物，总稀释因了最典型的为1/2000-1/5000，最终供应量为1/5-1/20。
计算，根据方程式1计算比粘度倒数，以比粘度倒数作为水解时间的函数(以秒为单位)。
β-葡聚糖酶活性以每分钟比粘度倒数(IRV)的增加来进行测定，如方程式3。
β-葡聚糖酶活性
Figure C9419121600421
其中
K＝曲线的斜率
D＝全部稀释因子
60＝换算因子，秒→分
V＝样品体积
参考文献The Institute of Brewing(1979)J.Inst.Brew，85，92-94。
Analyse av β-gluekanaseaktivitet ved viskosimetriskmetode，Norges Veterinaerhogskole.
参考例3
首先进行的试验是比较玻璃试管内具高富集含量内葡聚糖酶的一些不同的纤维素酶与总的纤维素酶的效能。因此，首先制备了七种不同的自然发生的T.longibrachiatum而得到的酶制备物并从与下表1一致的基因被修饰的菌株中获得了另七种制备物。
                     表1
    酶制备物     Canotype菌株
    全部纤维素酶     EGI+EGII+EGIII+CBHI+CHBII+
    富集EGI     EGI+++EGII+EGIII+CBHI-CHBII-
    富集EGI.Δcbd     EGI.Δcbd+EGI-EGII-EGIII+CBHI-CBHII-
    富集EGII     EGI+EGII+++EGIII+CBHI-CBHII-
    富集EGIII     EGI-EGII-EGII+CBHI-CBHII-
    纯化的EGIII     EGI-EGII-EGIII+CBHI-CBHII-
在上面表1中，产生富集EGI的菌株含有多个EGI编码基因，同样，产生富集EGII和EGIII的菌株分别含有EGII和EGIII编码基因的多个拷贝。
富集EGI，富集EGII，富集EGIII和纯化的EGIII酶的制备物通过PCT WO 92/06209中描述的下面的步骤可以得到。除含有分泌EGIII的上清液须经如U.S.Patent NO.5，328，841所述PEG纯化步骤除去木聚糖酶活性之外，纯化的EGIII与富集EGIII步骤相同，平头EGI核心根据参照例1所述的技术制得。根据参照例2加以纯化。
根据上述分析，对于每个上述酶制备物，其可溶性混合键相连的大麦β-葡聚糖的粘度降低活性可以测出。
试验结果如图5所示，因为T.longibrachiatum的β-葡聚糖酶根据DNS还原糖分析方法测得的活性来进行配料作为饲料添加剂，所以粘度降低活性的分析中的酶的添加通过这一步骤得以统一。
图5显高的结果表明不考虑pH全部纤维酶的粘度降低活性明显示于每一种富集内葡聚糖酶制备物。
实施例1
十三组用培养箱培养的小鸡，每组最初包含至少49只小鸡，在年龄为8至12天时用以大麦为基本原料的饲料喂养如表2，在8至12天之间测定饲料摄入量和体重增加量
                     表2
    成分     百分比     重量
    大麦     58.56％     585.63
    大豆ml48     31.63％     316.26
    大豆油     6.06％     60.65
    盐     0.29％     2.90
    DL甲硫氨酸     0.28％     2.76
    赖氨酸HCL     0.04％     0.44
    石灰岩     1.41％     14.06
    磷酸二钙     1.23％     12.31
    VIT/MIN     0.50％     5.00
    总计     100.00％     1000.00
上述饲料的营养值能运用国际数据控制程序中的数据控制程序进行计算机分析。它能提供一个饲料营养含量的分析，其中包括各种代谢物的预期的营养水平。表2中饲料的此类分析结果在下面表3中列出。
                        表3
    营养     目标     数值
    粗蛋白质     22.00     22.00
    幼禽ME kcal/kg     3000.00     3000.00
    猪DE kcal     3363.16
    钙     0.90     0.90
    磷酸     0.66
    有效磷酸     0.40     0.40
    脂肪     7.28
    纤维     4.00
    蛋氮酸     0.58
    半胱氨酸     0.37
    蛋氨酸+半胱氨酸     0.95     0.95
    赖氨酸     1.25     1.25
    组氨酸     0.52
    色氨酸     0.24     0.30
    苏氨酸     0.80     0.82
    精氨酸     1.40     1.44
    异壳氨酸     1.01
    亮氨酸     1.59
    苯丙氨酸     1.1
    缬氨酸     1.10
    甘氨酸     0.99
    苯丙氨酸+酪氨酸     1.89
    钠     0.15     1.15
    氯     0.29
    钾     0.96
    亚油酸     1.00     3.00
    钠+钾+盐酸     2.29
喂给十二组小鸡的以大麦为基本原料的饲料通过如上面表1所示的每一种酶的制备物含量的变化加以补充。在饲料的β-葡聚糖酶活性浓度为120单位/kg和240单位/kg时测定每一种酶的制备物。β-葡聚糖酶活性用上述β-葡聚糖酶活性分析方法加以测定。第十三组的食谱作为对照，不加任何一种酶的制备物。
各种试验结果如下表4和5所示，表4所示结果是食谱中以每公斤饲料添加120单位β-葡聚糖酶活性的情况，同时表5所示结果是食谱中以每公斤饲料添加240单位β-葡聚糖酶活性的情况，表4和5提供了各组培育的小鸡的体重增加量，饲料的转化比率以及它们胃肠的粘度。此结果对死亡率进行了校正。
                    表4
    BWG(g)     FCR     粘度(cps)
  对照     329     1.72     15.3
  浓缩的EGI     358     1.60     12.6
  浓缩的EGI.Δcbd(本发明) 437 1.42 10.5
  浓缩的EGII     396     1.50     13.6
  浓缩的EGIII     356     1.566     6.0
  纯化的EGIII     332     1.85     7.9
  全部纤维素酶     381     1.62     10.3
                              表5
    BWG(g)     FCR     粘度(cps)
    对照     329     1.72     15.3
    浓缩的EGI     376     1.60     14.5
    浓缩的EGI.Δcbd(本发明) 395 1.57 5.6
    浓缩的EGII     377     1.70     11.6
    浓缩的EGIII     423     1.54     8.1
    纯化的EGIII     401     1.56     7.7
    全部纤维素酶     404     1.66     6.4
从上面结果可以看出没有补充酶的对照组的体重增加量，饲料转化比率和粘度相对要低。与其它试验结果相比，酶的制备物为富集EGI.Δcbd，它在每公斤饲料补充120单位和240单位时都有最好结果。与富集自然类型的EGI相比的试验，删除了纤维素结合区域的酶的制备物在两种浓度下都有最好结果。这些结果有力地显示了不同酶的制备物根据它们对体重增加最及饲料转化比率的影响有不同的最佳剂量。
通过比较参照例3和实施例1的结果可以看出在体外和体内试验中得出了不同结果。因此参考例3中的体外试验中，全部纤维素酶的粘度降低活性高于EGI，EGII，EGIII，和EGIΔcbd的富集制备物的粘度降低活性。
上面显示的降低饲料转化比率和/或降低胃肠道粘度的效果还能在根据本发明制备的饲料但以其他谷类如小麦、黑小麦黑麦，玉米，为基本原饲料喂除小鸡以外的其他动物如火鸡，鹅，鸭，猪，羊和牛的情况下取得。
                        序列表(1)总信息：(2)序列信息ID NO：1(i)序列特征：
(A)长度：159碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单一
(D)构象：线性(ii)分子类型：DNA(基因组)(ix)特征：
(A)名称/键：CDS
(B)位置：连接(1..92，140..159)(xi)序列说明：序列ID NO：1：CAC TGG GGG CAG TGC GGT GGC ATT GGG TAC AGC GGG TGC AAG ACG TGC          48His Trp Gly Gln Cys Gly Gly Ile Gly Tyr Ser Gly Cys Lys Thr Cys1               5                  10                 15ACG TCG GGC ACT ACG TGC CAG TAT AGC AAC GAC T GTTCGTATCC              92Thr Ser Gly Thr Thr Cys Gln Tyr Ser Asn Asp
         20                  25CCATGCCTGA CGGGAGTGAT TTTGAGATGC TAACCGCTAA AATACAG AC TAC TCG        147
                                               Tyr Tyr Ser
                                                        30
CAA TGC CTT TA                                                        159Gln Cys Leu(2)序列信息(i)序列特征：
(A)长度：33氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)构象：线性(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列说明：序列His Trp Gly Gln Cys Gly Gly Ile Gly Tyr Ser Gly Cys Lys Thr Cys1               5                  10                  15Thr Ser Gly Thr Thr Cys Gln Tyr Ser Asn Asp Tyr Tyr Ser Gln Cys
         20                  25                  30Leu(2)序列信息(i)序列特征：
(A)长度：108碱基对
(B)类型：核酸  (C)链型：单一(D)构象：线性(ii)分子类型：DNA(基因组)(ix)特征：(A)名称/键：CDS(B)位置(xi)序列说明：序列ID NO：3：CAG CAG ACT GTC TGG GGC CAG TGT GGA GGT ATT GGT TGG AGC GGA CCT        48Gln Gln Thr Val Trp Gly Gln Cys Gly Gly Ile Gly Trp Ser Gly Pro1               5                  10                  15ACG AAT TGT GCT CCT GGC TCA GCT TGT TCG ACC CTC AAT CCT TAT TAT        96Thr Asn Cys Ala Pro Gly Ser Ala Cys Ser Thr Leu Asn Pro Tyr Tyr
         20                  25                  30GCG CAA TGT ATT                                                        108Ala Gln Cys Ile
     35(2)序列信息 ID NO：4：(i)序列特征：
(A)长度：36氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)构象：线性(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列说明：序列ID NO：4：Gln Gln Thr Val Trp Gly Gln Cys Gly Gly Ile Gly Trp Ser Gly Pro1               5                  10                  15Thr Asn Cys Ala  Pro Gly Ser Ala Cys Ser Thr Leu Asn Pro Tyr Tyr
         20                   25                  30Ala Gln Cys Ile
     35(2)序列信息ID NO：5：(i)序列特征：
(A)长度：1201碱基对
(B)类型：核酸(C)链型：单一
(D)构象：线性(ii)分子类型：DNA(基因组)(ix)特征：
(A)名称/键：CDS
(B)位置：连接(1..704，775..1201)
(xi)序列说明：序列ID NO：5：CAG CAA CCG GGT ACC AGC ACC CCC GAG GTC CAT CCC AAG TTG ACA ACC          48Gln Gln Pro Gly Thr Ser Thr Pro Glu Val His Pro Lys Leu Thr Thr1               5                  10                  15TAC AAG TGT ACA AAG TCC GGG GGG TGC GTG GCC CAG GAC ACC TCG GTG          96Tyr Lys Cys Thr Lys Ser Gly Gly Cys Val Ala Gln Asp Thr Ser Val
         20                  25                  30GTC CTT GAC TGG AAC TAC CGC TGG ATG CAC GAC GCA AAC TAC AAC TCG         144Val Leu Asp Trp Asn Tyr Arg Trp Met His Asp Ala Asn Tyr Asn Ser
     35                  40                  45TGC ACC GTC AAC GGC GGC GTC AAC ACC ACG CTC TGC CCT GAC GAG GCG         192Cys Thr Val Asn Gly Gly Val Asn Thr Thr Leu Cys Pro Asp Glu Ala
 50                  55                  60ACC TGT GGC AAG AAC TGC TTC ATC GAG GGC GTC GAC TAC GCC GCC TCG         240Thr Cys Gly Lys Asn Cys Phe Ile Glu Gly Val Asp Tyr Ala Ala Ser65                  70                  75                  80GGC GTC ACG ACC TCG GGC AGC AGC CTC ACC ATG AAC CAG TAC ATG CCC         288Gly Val Thr Thr Ser Gly Ser Ser Leu Thr Met Asn Gln Tyr Met Pro
             85                  90                  95AGC AGC TCT GGC GGC TAC AGC AGC GTC TCT CCT CGG CTG TAT CTC CTG         336Ser Ser Ser Gly Gly Tyr Ser Ser Val Ser Pro Arg Leu Tyr Leu Leu
        100                 105                 110GAC TCT GAC GGT GAG TAC GTG ATG CTG AAG CTC AAC GGC CAG GAG CTG         384Asp Ser Asp Gly Glu Tyr Val Met Leu Lys Leu Asn Gly Gln Glu Leu
    115                 120                 125AGC TTC GAC GTC GAC CTC TCT GCT CTG CCG TGT GGA GAG AAC GGC TCG         432Ser Phe Asp Val Asp Leu Ser Ala Leu Pro Cys Gly Glu Asn Gly Ser
130                 135                 140CTC TAC CTG TCT CAG ATG GAC GAG AAC GGG GGC GCC AAC CAG TAT AAC         480Leu Tyr Leu Ser Gln Met Asp Glu Asn Gly Gly Ala Asn Gln Tyr Asn145                 150                 155                 160ACG GCC GGT GCC AAC TAC GGG AGC GGC TAC TGC GAT GCT CAG TGC CCC         528Thr Ala Gly Ala Asn Tyr Gly Ser Gly Tyr Cys Asp Ala Gln Cys Pro
            165                 170                 175GTC CAG ACA TGG AGG AAC GGC ACC CTC AAC ACT AGC CAC CAG GGC TTC           576Val Gln Thr Trp Arg Asn Gly Thr Leu Asn Thr Ser His Gln Gly Phe
        180                 185                 190TGC TGC AAC GAG ATG GAT ATC CTG GAG GGC AAC TCG AGG GCG AAT GCC           624Cys Cys Asn Glu Met Asp Ile Leu Glu Gly Asn Ser Arg Ala Asn Ala
    195                 200                 205TTG ACC CCT CAC TCT TGC ACG GCC ACG GCC TGC GAC TCT GCC GGT TGC           672Leu Thr Pro His Ser Cys Thr Ala Thr Ala Cys Asp Ser Ala Gly Cys
210                 215                 220GGC TTC AAC CCC TAT GGC AGC GGC TAC AAA AG GTGAGCCTGA                     714Gly Phe Asn Pro Tyr Gly Ser Gly Tyr Lys Ser225                 230                 235TGCCACTACT ACCCCTTTCC TGGCGCTCTC GCGGTTTTCC ATGCTGACAT GGTTTTCCAG         774C TAC TAC GGC CCC GGA GAT ACC GTT GAC ACC TCC AAG ACC TTC ACC             820Tyr Tyr Gly Pro Gly Asp Thr Val Asp Thr Ser Lys Thr Phe Thr
              240                 245                 250ATC ATC ACC CAG TTC AAC ACG GAC AAC GGC TCG CCC TCG GGC AAC CTT           868Ile Ile Thr Gln Phe Asn Thr Asp Asn Gly Ser Pro Ser Gly Asn Leu
            255                 260                 265GTG AGC ATC ACC CGC AAG TAC CAG CAA AAC GGC GTC GAC ATC CCC AGC           916Val Ser Ile Thr Arg Lys Tyr Gln Gln Asn Gly Val Asp Ile Pro Ser
        270                 275                 280GCC CAG CCC GGC GGC GAC ACC ATC TCG TCC TGC CCG TCC GCC TCA GCC           964Ala Gln Pro Gly Gly Asp Thr Ile Ser Ser Cys Pro Ser Ala Ser Ala
    185                 290                 295TAC GGC GGC CTC GCC ACC ATG GGC AAG GCC CTG AGC AGC GGC ATG GTG           1012Tyr Gly Gly Leu Ala Thr Met Gly Lys Ala Leu Ser Ser Gly Met Val
300                 305                 310CTC GTG TTC AGC ATT TGG AAC GAC AAC AGC CAG TAC ATG AAC TGG CTC           1060Leu Val Phe Ser Ile Trp Asn Asp Asn Ser Gln Tyr Met Asn Trp Leu315                 320                 325                 330GAC AGC GGC AAC GCC GGC CCC TGC AGC AGC ACC GAG GGC AAC CCA TCC           1108Asp Ser Gly Asn Ala Gly Pro Cys Ser Ser Thr Glu Gly Asn Pro Ser
            335                 340                 345AAC ATC CTG GCC AAC AAC CCC AAC ACG CAC GTC GTC TTC TCC AAC ATC           1156Asn Ile Leu Ala Asn Asn Pro Asn Thr His Val Val Phe Ser Asn Ile
        350                 355                 360CGC TGG GGA GAC ATT GGG TCT ACT ACG AAC TCG ACT GCG CCC CCG               1201Arg Trp Gly Asp Ile Gly Ser Thr Thr Asn Ser Thr Ala Pro Pro
    365                 370                 375(2)序列信息ID NO：6：(i)序列特征：
(A)长度：377氨基酸
(B)类型：氨基酸
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         20                  25                  30Val Leu Asp Trp Asn Tyr Arg Trp Met His Asp Ala Asn Tyr Asn Ser
     35                  40                  45Cys Thr Val Asn Gly Gly Val Asn Thr Thr Leu Cys Pro Asp Glu Ala
 50                  55                  60Thr Cys Gly Lys Asn Cys Phe Ile Glu Gly Val Asp Tyr Ala Ala Ser65                  70                  75                  80Gly Val Thr Thr Ser Gly Ser Ser Leu Thr Met Asn Gln Tyr Met Pro
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130                 135                140Leu Tyr Leu Ser Gln Met Asp Glu Asn Gly Gly Ala Asn Gln Tyr Asn145                 150                 155                 160Thr Ala Gly Ala Asn Tyr Gly Ser Gly Tyr Cys Asp Ala Gln Cys Pro
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    195                 200                 205Leu Thr Pro His Ser Cys Thr Ala Thr Ala Cys Asp Ser Ala Gly Cys
210                 215                 220Gly Phe Asn Pro Tyr Gly Ser Gly Tyr Lys Ser Tyr Tyr Gly Pro Gly225                 230                 235                 240Asp Thr Val Asp Thr Ser Lys Thr Phe Thr Ile Ile Thr Gln Phe Asn
            245                 250                 255Thr Asp Asn Gly Ser Pro Ser Gly Asn Leu Val Ser Ile Thr Arg Lys
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290                 295                 300Met Gly Lys Ala Leu Ser Ser Gly Met Val Leu Val Phe Ser Ile Trp305                 310                 315                 320Asn Asp Asn Ser Gln Tyr Met Asn Trp Leu Asp Ser Gly Asn Ala Gly
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370                 375(2)序列信息ID NO：7：(i)序列特征：
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(B)类型：核酸
(C)链型：单一
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              Gly Thr Cys Val Thr Ser Lys Val Tyr Pro Pro
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             35                  40                  45ATG CAG CAC TTC GTC AAC GAG GAC GGG ATG ACT ATT TTC CGC TTA CCT                      360Met Gln His Phe Val Asn Glu Asp Gly Met Thr Ile Phe Arg Leu Pro
         50                  55                  60GTC GGA TGG CAG TAC CTC GTC AAC AAC AAT TTG GGC GGC AAT CTT GAT                      408Val Gly Trp Gln Tyr Leu Val Asn Asn Asn Leu Gly Gly Asn Leu Asp
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 80                  85                  90CTG GGC GCA TAC TGC ATC GTC GAC ATC CAC AAT TAT GCT CGA TGG AAC         504Leu Gly Ala Tyr Cys Ile Val Asp Ile His Asn Tyr Ala Arg Trp Asn95                 100                 105                 110GGT GGG ATC ATT GGT CAG GGC GGC CCT ACT AAT GCT CAA TTC ACG AGC         552Gly Gly Ile Ile Gly Gln Gly Gly Pro Thr Asn Ala Gln Phe Thr Ser
            115                 120                 125CTT TGG TCG CAG TTG GCA TCA AAG TAC GCA TCT CAG TCG AGG GTG TGG         600Leu Trp Ser Gln Leu Ala Ser Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Arg Val Trp
        130                 135                 140TTC GGC ATC ATG AAT GAG CCC CAC GAC GTG AAC ATC AAC ACC TGG GCT         648Phe Gly Ile Met Asn Glu Pro His Asp Val Asn Ile Asn Thr Trp Ala
    145                 150                 155GCC ACG GTC CAA GAG GTT GTA ACC GCA ATC CGC AAC GCT GGT GCT ACG         696Ala Thr Val Gln Glu Val Val Thr Ala Ile Arg Asn Ala Gly Ala Thr
160                 165                 170TCG CAA TTC ATC TCT TTG CCT GGA AAT GAT TGG CAA TCT GCT GGG GCT         744Ser Gln Phe Ile Ser Leu Pro Gly Asn Asp Trp Gln Ser Ala Gly Ala175                 180                 185                 190TTC ATA TCC GAT GGC AGT GCA GCC GCC CTG TCT CAA GTC ACG AAC CCG       792Phe Ile Ser Asp Gly Ser Ala Ala Ala Leu Ser Gln Val Thr Asn Pro
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        210                 215                 220TCA GAC AAC TCC GGT ACT CAC GCC GAA TGT ACT ACA AAT AAC ATT GAC       888Ser Asp Asn Ser Gly Thr His Ala Glu Cys Thr Thr Asn Asn Ile Asp
    225                 230                 235GGC GCC TTT TCT CCG CTT GCC ACT TGG CTC CGA CAG AAC AAT CGC CAG       936Gly Ala Phe Ser Pro Leu Ala Thr Trp Leu Arg Gln Asn Asn Arg Gln
240                 245                 250GCT ATC CTG ACA GAA ACC GGT GGT GGC AAC GTT CAG TCC TGC ATA CAA       984Ala Ile Leu Thr Glu Thr Gly Gly Gly Asn Val Gln Ser Cys Ile Gln255                 260                 265                 270GAC ATG TGC CAG CAA ATC CAA TAT CTC AAC CAG AAC TCA GAT GTC TAT       1032Asp Met Cys Gln Gln Ile Gln Tyr Leu Asn Gln Asn Ser Asp Val Tyr
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320                 325(2)序列信息ID NO：8：(i)序列特征：
(A)长度：327氨基酸
(B)类型：氨基酸
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 50                  55                  60Trp Gln Tyr Leu Val Asn Asn Asn Leu Gly Gly Asn Leu Asp Ser Thr65                  70                  75                  80Ser Ile Ser Lys Tyr Asp Gln Leu Val Gln Gly Cys Leu Ser Leu Gly
             85                  90                  95Ala Tyr Cys Ile Val Asp Ile His Asn Tyr Ala Arg Trp Asn Gly Gly
        100                 105                 110Ile Ile Gly Gln Gly Gly Pro Thr Asn Ala Gln Phe Thr Ser Leu Trp
    115                 120                 125Ser Gln Leu Ala Ser Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Arg Val Trp Phe Gly
130                 135                 140Ile Met Asn Glu Pro His Asp Val Asn Ile Asn Thr Trp Ala Ala Thr145                 150                 155                 160Val Gln Glu Val Val Thr Ala Ile Arg Asn Ala Gly Ala Thr Ser Gln
            165                 170                 175Phe Ile Ser Leu Pro Gly Asn Asp Trp Gln Ser Ala Gly Ala Phe Ile
        180                 185                 190Ser Asp Gly Ser Ala Ala Ala Leu Ser Gln Val Thr Asn Pro Asp Gly
    195                 200                 205Ser Thr Thr Asn Leu Ile Phe Asp Val His Lys Tyr Leu Asp Ser Asp
210                 215                 220Asn Ser Gly Thr His Ala Glu Cys Thr Thr Asn Asn Ile Asp Gly Ala225                 230                 235                 240Phe Ser Pro Leu Ala Thr Trp Leu Arg Gln Asn Asn Arg Gln Ala Ile
            245                 250                 255Leu Thr Glu Thr Gly Gly Gly Asn Val Gln Ser Cys Ile Gln Asp Met
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290                 295                 300Glu Thr Pro Thr Ser Ser Gly Asn Ser Trp Thr Asp Thr Ser Leu Val305                 310                 315                 320Ser Ser Cys Leu Ala Arg Lys
            325(2)序列信息ID NO：9：(i)序列特征：
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(D)构象：线性(ii)分子类型：DNA(基因组)(ix)特征：
(A)名称/键：CDS
(B)位置：1..81(xi)序列说明：序列ID NO：9：CCC CCG CCT GCG TCC AGC ACG ACG TTT TCG ACT ACA CCG AGG AGC TCG        48Pro Pro Pro Ala Ser Ser Thr Thr Phe Ser Thr Thr Pro Arg Ser Ser1           5                      10                  15ACG ACT TCG AGC AGC CCG AGC TGC ACG CAG ACT                            81Thr Thr Ser Ser Ser Pro Ser Cys Thr Gln Thr
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         20                  25                  30Ser Ser(2)序列信息ID NO：13：(i)序列特征：
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(D)构象：线性(ii)分子类型：DNA(基因组)(ix)特征：(A)名称/键：CDS(B)位置：1..66(xi)序列说明：序列ID NO：13：ATG GCG CCC TCA GTT ACA CTG CCG TTG ACC ACG GCC ATC CTG GCC ATT          48Met Ala Pro Ser Val Thr Leu Pro Leu Thr Thr Ala Ile Leu Ala Ile1               5                  10                  15GCC CGG CTC GTC GCC GCC                                                  66Ala Arg Leu Val Ala Ala
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(i)序列特征：
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(A)长度：218氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单一
(D)构象：线性(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列说明：序列ID NO：18：Gln Thr Ser Cys Asp Gln Trp Ala Thr Phe Thr Gly Asn Gly Tyr Thr1               5                   10                  15Val Ser Asn Asn Leu Trp Gly Ala Ser Ala Gly Ser Gly Phe Gly Cys
        20                  25                  30Val Thr Ala Val Ser Leu Ser Gly Gly Ala Ser Trp His Ala Asp Trp
    35                  40                  45Gln Trp Ser Gly Gly Gln Asn Asn Val Lys Ser Tyr Gln Asn Ser Gln
50                  55                  60Ile Ala Ile Pro Gln Lys Arg Thr Val Asn Ser Ile Ser Ser Met Pro65                  70                  75                  80Thr Thr Ala Ser Trp Ser Tyr Ser Gly Ser Asn Ile Arg Ala Asn Val
            85                  90                  95Ala Tyr Asp Leu Phe Thr Ala Ala Asn Pro Asn His Val Thr Tyr Ser
        100                 105                 110Gly Asp Tyr Glu Leu Met Ile Trp Leu Gly Lys Tyr Gly Asp Ile Gly
    115                 120                 125Pro Ile Gly Ser Ser Gln Gly Thr Val Asn Val Gly Gly Gln Ser Trp
130                 135                 140Thr Leu Tyr Tyr Gly Tyr Asn Gly Ala Met Gln Val Tyr Ser Phe Val145                 150                 155                 160Ala Gln Thr Asn Thr Thr Asn Tyr Ser Gly Asp Val Lys Asn Phe Phe
            165                 170                 175Asn Tyr Leu Arg Asp Asn Lys Gly Tyr Asn Ala Ala Gly Gln Tyr Val
        180                 185                 190Leu Ser Tyr Gln Phe Gly Thr Glu Pro Phe Thr Gly Ser Gly Thr Leu
    195                 200                 205Asn Val Ala Ser Trp Thr Ala Ser Ile Asn
210                 215(2)序列信息ID NO：19：(i)序列特征：
(A)长度：46碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单一
(D)构象：线性(ii)分子类型：DNA(基因组)(xi)序列说明：序列ID NO：19：ATGAAGTTCC TTCAAGTCCT CCCTGCCCTC ATACCGGCCG CCCTGGCCC                  49(2)序列信息ID NO：20：(i)序列特征：
(A)长度：16氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单一
(D)构象：线性(ii)分子类型：肽(xi)序列说明：序列ID NO：20：Met Lys Phe Leu Gln Val Leu Pro Ala Leu Ile Pro Ala Ala Leu Ala1               5                   10                  15(2)序列信息ID NO：21：
(i)序列特征：
  (A)长度：57碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：双个
  (D)构象：线性
(xi)序列说明：序列ID NO：21：AGCTCGTAGA GCGTTGACTT GCCTGTGGTC TGTCCAGACG GGGGACGATA GAATGCG     57

Claims (10)

1.一种酶基饲料添加剂，其包括：
(i)一种或多种(a)缺少纤维素结合区的EGI，
(b)缺少纤维素结合区的EGII，以及
(c)(a)或(b)的活性纤维素芯，其中：
EGI是指由Trichoderma，SPP.衍生出的内葡聚糖酶，其具有优化pH值约4.0-6.0，等电点(pI)为约4.5-4.7以及分子量为约47-49K道尔顿；以及
EGII为衍生自Trichoderma SPP.的内葡聚糖酶，其具有优化pH值为约4.0-6.0，pI值为约5.5以及分子量为约35K道尔顿；以及
(ii)按重量计算占所述组合物中纤维素酶蛋白含量的0-20％的一种纤维素生物水解酶。
2.根据权利要求1所述的酶基饲料添加剂，其特征在于所述组合物没有任何纤维素生物水解酶。
3.根据权利要求1或2中所述的一种酶基饲料添加剂，基特征在于该添加剂进一步包含以木聚糖酶，蛋白酶，α-淀粉酶，葡糖淀粉酶，脂酶，果胶酶，聚甘露糖酶，α-半乳糖苷糖，α-阿拉伯呋喃糖酶，和肌醇六磷酸酶中选择出来的一种或多种添加酶。
4.根据权利要求3所述的一种酶基饲料添加剂，其特征在于木聚糖酶是具高pI值的木聚糖酶和/或T.longibrachiatum的具低pI值的木聚糖酶。
5.根据权利要求3或4所述的一种酶基饲料添加剂，其特征在于其中蛋白酶是一种从芽孢杆菌属衍生的枯草杆菌蛋白酶或其突变体。
6.以谷类为基本原料的一种动物饲料，包含从大麦、小麦、黑小麦、黑麦、玉米中选择出来的至少一种谷类及根据前述权利要求中任一项权利要求所述的一种酶基饲料添加剂。
7.根据权利要求6所述的一种以谷类为基本原料的饲料，其中谷类至少为大麦。
8.前述任一项权利要求中的酶基饲料添加剂的制备方法，包括步骤：通过基因操作构建基因修饰的木霉属真菌株，其将产生适当相对量的所需酶，培养所述基因修饰菌株，并从所述培养基收集该添加剂。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于基因修饰的菌株由T.longibrachiatum，T.reesi或绿色木霉衍生而来，该菌株的基因组被修饰，这样它能富集一种或多种内葡聚糖酶产物，和/或不能产生一种或多种功能上具有活性的纤维素生物水解酶。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于基因修饰的菌株的基因组也不能产生功能上具有活性的EGI和/或EGII。
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