JP2019523645A - プロテアーゼ変異体およびその使用 - Google Patents

プロテアーゼ変異体およびその使用 Download PDF

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Abstract

１種以上の参照サブチリシンと比較して安定性および／または汚れ除去性が改善された１種以上のスブチリシン変異体を含む、１種以上のサブチリシン変異体、それをコードする核酸、ならびにその製造および使用に関連する組成物および方法が本明細書で開示される。

Description

関連出願の相互参照
本願は２０１６年５月３１日に出願された米国仮特許出願第６２／３４３，６１８号明細書に関連し、かつその優先権の利益を主張するものであり、その出願は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
電子的に提出された配列表の参照
ＡＳＣＩＩテキストファイルとして申請書と共に電子的に提出された配列リスト（名称：ＮＢ４０７８５ＷＯＰＣＴ＿ＳＴ２５；サイズ：８８２ＫＢ；作成日：２０１７年５月２６日）の内容は出願の一部を構成し、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
１種以上の参照スブチリシンと比較して安定性および／または汚れ除去性が改善された１種以上のスブチリシン変異体を含む、１種以上のスブチリシン変異体、それをコードする核酸、ならびにその製造および使用に関連する組成物および方法が本明細書で開示される。
セリンプロテアーゼは、タンパク質のペプチド結合の加水分解を開始する活性部位セリンを有する酵素（ＥＣ Ｎｏ．３．４．２１）である。セリンプロテアーゼは、広範囲の特異性および生物学的機能を有する多様なクラスの酵素を含むが、その構造に基づきキモトリプシン様（トリプシン様）およびスブチリシン様にさらに分けられる。原型的なスブチリシン（ＥＣ Ｎｏ．３．４．２１．６２）は、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）から最初に得られた。スブチリシンおよびその同族体は、ＭＥＲＯＰＳ分類スキームのＳ８ペプチダーゼファミリーのメンバーである。Ｓ８ファミリーのメンバーは、アミノ酸配列中にＡｓｐ、ＨｉｓおよびＳｅｒの順に並ぶ触媒三残基を有する。洗浄用途のために多くの有用な変異体プロテアーゼが開発されてきたが、改善されたプロテアーゼ変異体が依然として必要とされている。
一実施形態は、配列番号２に対応する位置に、２つ、３つまたは４つ以上の変異を含む、アミノ酸配列を含む１種以上のスブチリシン変異体であって、前記位置は、前記２つ、３つまたは４つ以上の変異の１つ以上が人工的変異または置換であるという条件で、（ｉ）１、３、９、１０、１５、２２、２４、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３５、３７、４０、４３、４５、４８、５２、６８、７１、７６、７７、７８、８６、８７、９５、９６、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０５、１０８、１１１、１１４、１１５、１１７、１１９、１２３、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３６、１４３、１４６、１４７、１５１、１５５、１５８、１６０、１６１、１６５、１８４、１８７、１９３、２０２、２０３、２０４、２１０、２１１、２１６、２１７、２３４、２３８、２３９、２４２、２４３、２５０、２５５、２５８、２５９、２６０、２６４および２７４；（ｉｉ）１、３、９、１０、１５、２２、２４、２６、２８、２９、３０、３１、３５、３７、４０、４５、４８、５２、６８、７１、７６、７７、７８、８６、８７、９５、９６、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０５、１０８、１１１、１１４、１１５、１１７、１１９、１２３、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３６、１４３、１４６、１４７、１５１、１５５、１５８、１６０、１６１、１６５、１８４、１８７、１９３、２０２、２０３、２０４、２１０、２１１、２１６、２１７、２３４、２３８、２３９、２４２、２４３、２５０、２５５、２５８、２５９、２６０、２６４および２７４；（ｉｉｉ）１、３、９、１０、２４、２６、２９、３０、３１、３５、３７、４０、４５、４８、５２、６８、７１、７７、７８、８６、８７、９５、９６、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０５、１０８、１１１、１１５、１１７、１１９、１２３、１２７、１２８、１２９、１３０、１３６、１４３、１４６、１４７、１５１、１５５、１５８、１６０、１６１、１６５、１８４、１８７、１９３、２０２、２０３、２０４、２１０、２１１、２１６、２１７、２３４、２３８、２３９、２４２、２４３、２５０、２５８、２５９、２６０、２６４および２７４；（ｉｖ）３、９、１０、３５、６８、７７、７８、８６、８７、９９、１０１、１１５、１２３、１２７、１２８、１６５、１８４、１８７、２０２、２０３、２１０、２１７、２４２、２５０、２５８および２６４；または（ｖ）３、６８、７７、７８、１２３、１２７、１２８、１６５、１８４、２０２、２１０、２１７および２５８から選択され；前記変異体は、モチーフＡおよび／またはモチーフＢを含むＡｐｒＬ−Ｃｌａｄｅスブチリシン酵素に対して、少なくとも８５％で１００％未満のアミノ酸配列同一性を有し；モチーフＡは、モチーフ１、モチーフ２、モチーフ３およびモチーフ４から選択され；モチーフＢは、モチーフ５、モチーフ６、モチーフ７、モチーフ８、モチーフ９、モチーフ１０、モチーフ１１、モチーフ１２、モチーフ１３およびモチーフ１４から選択され；かつ変異体のアミノ酸位置は、配列番号２のアミノ酸配列に対応して番号付けされているスブチリシン変異体を提供する。
なお別の実施形態は、配列番号２に対応する２つ、３つまたは４つ以上の位置に、２つ、３つまたは４つ以上のアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を含む１種以上のスブチリシン変異体であって、前記置換は、前記２つ、３つまたは４つ以上の置換の１つ以上が人工的置換であるという条件で、（ｉ）１Ｑ、３Ｑ／Ｖ、９Ｅ、１０Ｍ、１５Ｉ、２２Ｙ、２４Ｎ／Ｑ、２６Ｑ、２７Ｒ、２８Ａ、２９Ｓ、３０Ｔ、３１Ｉ、３５Ａ、３７Ｔ、４０Ｅ、４３Ａ、４５Ｉ／Ｑ／Ｒ、４８Ｉ／Ｔ／Ｖ、５２Ｒ、６８Ｓ、７１Ａ、７６Ｋ、７７Ｄ／Ｅ／Ｈ／Ｎ／Ｑ／Ｓ、７８Ｉ、８６Ｈ／Ｎ／Ｒ、８７Ｓ／Ｔ、９５Ａ／Ｆ／Ｑ、９６Ｓ、９８Ｈ／Ｒ、９９Ａ／Ｅ／Ｑ／Ｓ、１００Ｎ、１０１Ａ、１０２Ｄ／Ｔ、１０３Ｉ、１０５Ｎ、１０８Ｈ／Ｋ、１１１Ｑ、１１４Ｎ、１１５Ｆ、１１７Ｓ、１１９Ｑ、１２３Ｉ、１２５Ｎ、１２６Ｑ、１２７Ｅ／Ｆ／Ｑ／Ｓ／Ｔ／Ｖ、１２８Ｐ／Ｒ／Ｓ、１２９Ｈ／Ｒ、１３０Ｓ、１３６Ｎ／Ｒ、１４３Ｑ／Ｖ、１４６Ａ／Ｓ、１４７Ｌ、１５１Ｇ、１５５Ｅ／Ｇ／Ｎ、１５８Ｄ／Ｎ／Ｑ、１６０Ｃ／Ｄ／Ｋ、１６１Ｄ／Ｑ、１６５Ａ／Ｅ／Ｑ／Ｓ、１８４Ｅ／Ｑ、１８７Ｅ／Ｐ、１９３Ｄ／Ｑ、２０２Ｖ、２０３Ｅ／Ｎ／Ｑ、２０４Ｉ、２１０Ｅ／Ｈ／Ｉ／Ｐ、２１１Ｓ、２１６Ｑ、２１７Ｓ、２３４Ｉ／Ｗ、２３８Ｑ／Ｒ、２３９Ｋ／Ｓ／Ｔ、２４２Ｇ／Ｎ、２４３Ｉ、２５０Ｇ、２５５Ｒ、２５８Ｄ／Ｅ／Ｐ、２５９Ｅ／Ｐ、２６０Ｗ、２６４Ｈ／Ｑ／Ｓおよび２７４Ａ；（ｉｉ）１Ｑ、３Ｑ／Ｖ、９Ｅ、１０Ｍ、１５Ｉ、２２Ｙ、２４Ｎ／Ｑ、２６Ｑ、２８Ａ、２９Ｓ、３０Ｔ、３１Ｉ、３５Ａ、３７Ｔ、４０Ｅ、４５Ｉ／Ｑ／Ｒ、４８Ｉ／Ｔ／Ｖ、５２Ｒ、６８Ｓ、７１Ａ、７６Ｋ、７７Ｄ／Ｅ／Ｈ／Ｎ／Ｓ、７８Ｉ、８６Ｈ／Ｎ／Ｒ、８７Ｓ／Ｔ、９５Ａ／Ｆ／Ｑ、９６Ｓ、９８Ｋ／Ｒ、９９Ａ／Ｅ／Ｑ／Ｓ、１００Ｎ、１０１Ａ、１０２Ｄ／Ｔ、１０５Ｎ、１０８Ｈ／Ｋ、１１１Ｑ、１１４Ｎ、１１５Ｆ、１１７Ｓ、１１９Ｑ、１２３Ｉ、１２５Ｎ、１２６Ｑ、１２７Ｅ／Ｆ／Ｑ／Ｓ／Ｔ／Ｖ、１２８Ｐ／Ｒ／Ｓ、１２９Ｈ／Ｒ、１３０Ｓ、１３６Ｎ、１４３Ｑ／Ｖ、１４６Ａ／Ｓ、１４７Ｌ、１５１Ｇ、１５５Ｅ／Ｇ／Ｎ、１５８Ｄ／Ｎ／Ｑ、１６０Ｄ／Ｋ、１６１Ｄ／Ｑ、１６５Ａ／Ｅ／Ｑ／Ｓ、１８４Ｅ／Ｑ、１８７Ｅ／Ｐ、１９３Ｄ／Ｑ、１９４Ｅ、２０２Ｖ、２０３Ｅ／Ｎ／Ｑ、２０４Ｉ、２１０Ｉ／Ｐ、２１１Ｓ、２１６Ｑ、２１７Ｓ、２３４Ｉ／Ｗ、２３８Ｑ／Ｒ、２３９Ｋ／Ｓ／Ｔ、２４２Ｇ／Ｎ、２４３Ｉ、２５０Ｇ、２５５Ｒ、２５８Ｄ／Ｐ、２５９Ｅ／Ｐ、２６０Ｗ、２６４Ｈ／Ｑ／Ｓおよび２７４Ａ；（ｉｉｉ）１Ｑ、３Ｖ、９Ｅ、１０Ｍ、２４Ｑ、２６Ｑ、２９Ｓ、３０Ｔ、３１Ｉ、３５Ａ、３７Ｔ、４０Ｅ、４５Ｉ／Ｑ／Ｒ、４８Ｔ／Ｖ、５２Ｒ、６８Ｓ、７１Ａ、７７Ｅ／Ｎ、７８Ｉ、８６Ｈ／Ｒ、８７Ｓ、９５Ａ／Ｆ、９６Ｓ、９８Ｒ、９９Ａ／Ｅ／Ｑ／Ｓ、１００Ｎ、１０１Ａ、１０２Ｄ／Ｔ、１０５Ｎ、１０８Ｈ、１１１Ｑ、１１５Ｆ、１１７Ｓ、１１９Ｑ、１２３Ｉ、１２７Ｅ／Ｑ／Ｓ／Ｔ／Ｖ、１２８Ｐ／Ｒ、１２９Ｈ／Ｒ、１３０Ｓ、１３６Ｎ、１４３Ｑ／Ｖ、１４６Ａ、１４７Ｌ、１５１Ｇ、１５５Ｇ／Ｎ、１５８Ｄ／Ｎ／Ｑ、１６０Ｄ／Ｋ、１６１Ｄ／Ｑ、１６５Ａ／Ｅ／Ｑ、１８４Ｅ／Ｑ、１８７Ｅ／Ｐ、１９３Ｑ、２０２Ｖ、２０３Ｅ／Ｎ／Ｑ、２０４Ｉ、２１０Ｉ／Ｐ、２１１Ｓ、２１６Ｑ、２１７Ｓ、２３４Ｗ、２３８Ｑ、２３９Ｓ、２４２Ｇ／Ｎ、２４３Ｉ、２５０Ｇ、２５８Ｄ／Ｐ、２５９Ｅ／Ｐ、２６０Ｗ、２６４Ｈ／Ｑ／Ｓおよび２７４Ａ；（ｉｖ）３Ｖ、９Ｅ、１０Ｍ、３５Ａ、６８Ｓ、７７Ｎ、７８Ｉ、８６Ｈ、８７Ｓ、９９Ｑ／Ｓ、１０１Ａ、１１５Ｆ、１２３Ｉ、１２７Ｓ／Ｔ、１２８Ｐ／Ｒ、１６５Ｅ／Ｑ、１８４Ｑ、１８７Ｅ、２０２Ｖ、２０３Ｅ、２１０Ｐ、２１７Ｓ、２４２Ｇ、２５０Ｇ、２５８Ｄ／Ｐおよび２６４Ｈ；または（ｖ）３Ｖ、６８Ｓ、７７Ｎ、７８Ｉ、１２３Ｉ、１２７Ｓ、１２８Ｐ、１６５Ｑ、１８４Ｑ、２０２Ｖ、２１０Ｐ、２１７Ｓおよび２５８Ｄ／Ｐから選択され；前記変異体は、モチーフＡおよび／またはモチーフＢを含むＡｐｒＬ−Ｃｌａｄｅスブチリシン酵素に対して、少なくとも８５％で１００％未満のアミノ酸配列同一性を有し；モチーフＡは、モチーフ１、モチーフ２、モチーフ３およびモチーフ４から選択され；モチーフＢは、モチーフ５、モチーフ６、モチーフ７、モチーフ８、モチーフ９、モチーフ１０、モチーフ１１、モチーフ１２、モチーフ１３およびモチーフ１４から選択され；かつ変異体のアミノ酸位置は、配列番号２のアミノ酸配列に対応して番号付けされているスブチリシン変異体を提供する。
一実施形態では、ＡｐｒＬ−ｃｌａｄｅ酵素はモチーフＡ、モチーフＢまたはこれらの組合せを含む。他の実施形態では、ＡｐｒＬ−ｃｌａｄｅ酵素はモチーフＡおよびモチーフＢを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体は、モチーフＡ、モチーフＢまたはこれらの組合せを含む。さらに他の実施形態では、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体は、モチーフＡおよびモチーフＢを含む。別の実施形態では、モチーフＡは、モチーフ１、モチーフ２、モチーフ３およびモチーフ４から選択される。またさらなる実施形態では、モチーフＢは、モチーフ５、モチーフ６、モチーフ７、モチーフ８、モチーフ９、モチーフ１０、モチーフ１１、モチーフ１２、モチーフ１３およびモチーフ１４から選択される。
いくつかの実施形態は、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体を含む組成物に関する。さらなる実施形態は、洗浄を必要とする表面または物品を、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体または本明細書に記載の１種以上の組成物と接触させる工程を含む洗浄方法に関する。
図１Ａ〜１Ｄは、ＡｐｒＬ、Ｂｌｉｄ０２３３９および他のＡｐｒＬ−ｃｌａｄｅ酵素のＣＬＵＳＴＡＬ Ｗ配列アラインメントを示す。 図２は、ＡｐｒＬ、Ｂｌｉｄ０２３３９、ＡｐｒＬ−ｃｌａｄｅの他のメンバー、および本明細書に記載の変異体を含む他のスブチリシンを含むスブチリシンの系統樹を示す。
本明細書において特に指示がない限り、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体は、分子生物学、微生物学、タンパク質精製、タンパク質工学、タンパク質およびＤＮＡシークエンシング、組換えＤＮＡ分野、ならびに工業用酵素の使用および開発において一般に使用される従来技術によって、作製し、使用することができる。定義されていない用語および略語は、当該技術分野において使用されるそれらの通常の意味を有するものとする。本明細書において他に特に定義しない限り、本明細書で使用する全ての技術用語および科学用語は、当業者が通常理解する意味と同一の意味を有する。本明細書において示されるいかなる定義も、明細書全体との関連で解釈されるべきである。本明細書で使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈上特に明記されない限り、複数形を含む。特に指示がない限り、核酸配列は５’から３’の方向に左から右へと記載され、アミノ酸配列はアミノからカルボキシの方向に左から右へと記載される。本明細書で示された数値範囲は全て、それより狭い数値範囲が全て本明細書に明示的に記載されているかのように、そのようなより広い数値範囲に入る全てのより狭い数値範囲を全て含む。
本明細書において数値と結び付けて使用する「約」という用語は、その用語がその状況において他に特に定義されていない限り、数値の±０．５の範囲を指す。例えば、語句「約６のｐＨ値」は、ｐＨ値が他に特に定義されていない限り、５．５〜６．５のｐＨ値を指す。
本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体のアミノ酸の置換または変異の命名は、次の１つ以上を使用する：位置；位置：アミノ酸の置換もしくは変異；または開始アミノ酸：位置：アミノ酸置換。「位置」（すなわち、５、８、１７、２２など）への言及は、そのような位置に存在し得る開始アミノ酸、およびそのような位置に存在し得る開始アミノ酸からの変異または置換を包含する。「位置：アミノ酸の置換および／または変異」（すなわち、１Ｓ／Ｔ／Ｇ、３Ｇ、１７Ｔなど）への言及は、そのような位置に存在し得る開始アミノ酸、ならびに開始アミノ酸から変化し得、かつ／またはそのような開始アミノ酸を置換し得る１種以上のアミノ酸を包含する。置換アミノ酸と開始アミノ酸が同じ場合の開始アミノ酸は、アミノ酸置換から除かれる。開始アミノ酸もしくはアミノ酸置換、またはアミノ酸変異への言及は、さらに、スラッシュ（「／」）によって区切られた数個の開始、置換または変異アミノ酸としても表わし得る。例えば、Ｄ２７５Ｓ／Ｋは、２７５位がセリン（Ｓ）またはリシン（Ｋ）で置換され、Ｐ／Ｓ１９７Ｋは、１９７位の開始アミノ酸プロリン（Ｐ）またはセリン（Ｓ）がリシン（Ｋ）で置換されていることを示す。
所与のアミノ酸配列のアミノ酸残基の位置は、配列番号２のアミノ酸配列に対応して番号付けされている。すなわち、配列番号２で示されるＡｐｒＬ−ｃｌａｄｅ酵素のアミノ酸配列は、参照配列として機能する。例えば、ＡｐｒＬ−ｃｌａｄｅスブチリシン酵素または本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体のアミノ酸配列は、本明細書に記載のアラインメントアルゴリズムを使用して配列番号２のアミノ酸配列とアラインされ、配列番号２のアミノ酸残基とアラインされる（好ましくは、最適にアラインされる）所与のアミノ酸配列中の各アミノ酸残基に、対応するアミノ酸残基の位置番号を参照して便宜的に番号を付す。例えば、本明細書に記載するような配列アラインメントアルゴリズムは、クエリー配列と比較して対象配列に挿入または欠失が生じている場所を特定する。
ポリペプチドアミノ酸配列に関する「変異体」という用語は、アミノ酸の１つ以上の人工的になされた置換、挿入、または欠失を含むことによって、特定の野生型、親、または参照ポリペプチドアミノ酸配列とは異なるポリペプチドアミノ酸配列を指す。同様に、ポリヌクレオチド核酸配列に関する「変異体」という用語は、核酸酸の１つ以上の人工的になされた置換、挿入、または欠失を含むことによって、特定の野生型、親、または参照ポリポリヌクレオチドとは異なるポリヌクレオチ核酸配列を指す。野生型、親、または参照ポリペプチドのアミノ酸配列またはポリヌクレオチド核酸配列の特定は、文脈から明かであろう。
「変異」という用語は、例えば、「配列番号２に対して２つ、３つまたは４つ以上のアミノ酸変異」または「配列番号２の対応する位置における２つ、３つ、または４つ以上の変異」という句で使用される場合、配列番号２の対応する位置に存在するアミノ酸とは異なる各アミノ酸を包含する。例えば、目的変異体の配列を配列番号２とアラインし、変異体の各位置を配列番号２と比較して、配列番号２の対応する位置に存在するアミノ酸と異なる各位置のアミノ酸を特定し、配列番号２の対応するアミノ酸と異なる各アミノ酸を変異とする。
「プロテアーゼ」および「プロテイナーゼ」という用語は、タンパク質およびペプチドを分解する能力を有する酵素を指す。プロテアーゼは、タンパク質を形成しているペプチドまたはポリペプチド鎖の中で、アミノ酸同士を結び付けるペプチド結合を加水分解することによって「タンパク質分解」を行う能力を有する。タンパク質消化酵素としてのプロテアーゼのこの活性は、「タンパク質分解活性」と呼ばれる。タンパク質分解活性の測定には、多くのよく知られた手順がある。例えば、タンパク質分解活性は、適切な基質を加水分解する各プロテアーゼの能力を分析する比較検定法によって特定し得る。プロテアーゼ活性またはタンパク質分解活性の分析において有用な基質の例としては、限定はされないが、ジメチルカゼイン（Ｓｉｇｍａ Ｃ−９８０１）、ウシのコラーゲン（Ｓｉｇｍａ Ｃ−９８７９）、ウシのエラスチン（Ｓｉｇｍａ Ｅ−１６２５）およびウシのケラチン（ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ ９０２１１１）が挙げられる。これらの基質を使用する比色アッセイは、当該技術分野でよく知られている（例えば、国際公開第９９／３４０１１号パンフレットおよび米国特許第６，３７６，４５０号明細書を参照されたい）。ｐＮＡペプチジルアッセイ（例えば、Ｄｅｌ Ｍａｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ，９９：３１６−３２０，１９７９を参照されたい）もまた、活性酵素濃度の決定に使用することができる。このアッセイは、酵素が可溶性合成基質、例えば、スクシニル−アラニン−アラニン−プロリン−フェニルアラニン−ｐ−ニトロアニリド（ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡ）を加水分解する際のｐ−ニトロアニリンの放出速度を測定する。加水分解反応からの黄色の生成速度を、分光光度計により４１０ｎｍで測定すると、生成速度は活性酵素濃度に比例する。さらに、２８０ナノメートル（ｎｍ）での吸光度の測定も、精製タンパク質試料における総タンパク質濃度の測定に使用することができる。基質に対する活性／タンパク質濃度は、酵素比活性を示す。
「ホウ素を実質的に含まない組成物」または「ホウ素を実質的に含まない洗剤」という句は、ホウ素を微量、例えば、おそらく他の組成物または洗剤成分の約１０００ｐｐｍ未満（１ｍｇ／ｋｇまたはリットルは１ｐｐｍに等しい）、約１００ｐｐｍ未満、約５０ｐｐｍ未満、約１０ｐｐｍ未満、または約５ｐｐｍ未満、または約１ｐｐｍ未満含有する組成物または洗剤をそれぞれ指す。
本明細書で使用する場合、「バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属」には、当業者に知られる「バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）」属内の全ての菌種が含まれ、例えば、限定はされないが、Ｂ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｂ．リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、Ｂ．レンツス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）、Ｂ．ブレビス（Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ）、Ｂ．ステアロサーモフィルス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｂ．アルカロフィルス（Ｂ．ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｂ．アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、Ｂ．クラウシイ（Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ）、Ｂ．ハロドゥランス（Ｂ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）、Ｂ．メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、Ｂ．コアグランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、Ｂ．サークランス（Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、Ｂ．ギブソニイ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉｉ）およびＢ．チューリンギエンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）が挙げられる。バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属は、分類学的に再編成され続けていることを理解されたい。したがって、この属には、再分類された菌種、例えば、限定はされないが、現在は「ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）」と称されているＢ．ステアロサーモフィルス（ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、または現在はパエニバチルス・ポリミキサ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｌｙｍｙｘａ）と称されているバチルス・ポリミキサ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｌｙｍｙｘａ）などの生物が含まれるものとする。ストレスに満ちた環境条件下での抵抗性内生胞子の生成は、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属の決定的な特徴であると考えられるが、この特徴はまた、最近命名されたアリシクロバチルス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、アンフィバチルス（Ａｍｐｈｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属、アネウリニバチルス（Ａｎｅｕｒｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属、アノキシバチルス（Ａｎｏｘｙｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ブレビバチルス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属、フィロバチルス（Ｆｉｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、グラシリバチルス（Ｇｒａｃｉｌｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ハロバチルス（Ｈａｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、パエニバチルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属、サリバチルス（Ｓａｌｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属、サーモバチルス（Ｔｈｅｒｍｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ウレイバチルス（Ｕｒｅｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属およびビルジバチルス（Ｖｉｒｇｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属にも当てはまる。
本明細書で使用する場合、「変異」という用語は、参照アミノ酸配列または参照核酸配列に対してなされた人工的な改変を指す。この用語は、人工的な、置換、挿入および欠失を包含するものとする。
本明細書で使用する場合、「ベクター」という用語は、核酸を標的細胞または組織に導入または移入させるために使用される核酸コンストラクトを指す。通常、ベクターは、外来ＤＮＡを細胞または組織に導入するために使用される。ベクターとしては、プラスミド、クローニングベクター、バクテリオファージ、ウイルス（例えば、ウイルスベクター）、コスミド、発現ベクター、シャトルベクターなどが挙げられる。通常、ベクターは、複製起点、マルチクローニングサイト、および選択マーカーを含む。標的細胞へのベクターの挿入プロセスは、一般に、形質転換と称される。いくつかの実施形態において、本発明は、好適な宿主中でＤＮＡ配列を発現させ、組換えポリペプチド鎖のフォールディングおよび転座を起こすことができる好適なプロ配列（例えば、分泌シグナルペプチド配列など）に作動可能に連結しているセリンプロテアーゼポリペプチド（例えば、前駆体または成熟セリンプロテアーゼポリペプチド）をコードするＤＮＡ配列を含むベクターを含む。
核酸配列を細胞中に導入することに関して本明細書で使用する場合、「導入（された）」という用語は、核酸配列を細胞中に移入するための好適な任意の方法を指す。そのような導入方法としては、限定はされないが、原形質融合、形質移入、形質転換、エレクトロポレーション、接合および形質導入が挙げられる。形質転換は、遺伝子材料（例えば、ＤＮＡ）の取り込み、任意選択的なゲノムへの組み込み、および発現によって生ずる細胞の遺伝子改変を指す。
「発現カセット」または「発現ベクター」は、標的細胞における目的の核酸（例えば、外来核酸または導入遺伝子）の発現のために、組換えにより、または合成により生成された核酸コンストラクトまたはベクターを指す。目的の核酸は、通常、目的のタンパク質を発現する。発現ベクターまたは発現カセットは、通常、外来核酸の発現を駆動または促進するプロモーターヌクレオチド配列を含む。発現ベクターまたは発現カセットはまた、通常、標的細胞中で特定の核酸の転写を許容する他の特定の核酸エレメントを含む。組換え発現カセットは、プラスミド、染色体、ミトコンドリアＤＮＡ、プラスチドＤＮＡ、ウイルスまたは核酸断片内に組み込むことができる。いくつかの発現ベクターは、宿主細胞または宿主細胞のゲノム中に異種ＤＮＡ断片を組み込み、発現する能力を有する。多くの原核細胞発現ベクターおよび真核細胞発現ベクターが商業的に入手可能である。発現ベクターに組み込まれた核酸配列からタンパク質を発現するための、適切な発現ベクターの選択は、当業者の知識の範囲内である。
本明細書で使用する場合、核酸が別の核酸配列と機能的な関係で配置されたとき、核酸は別の核酸配列と「作動可能に連結している」。例えば、プロモーターまたはエンハンサーは、プロモーターがコード配列の転写に作用する場合、ヌクレオチドコード配列に作動可能に連結している。リボソーム結合部位が、コード配列の転写を促進するような位置にある場合、それはコード配列に作動可能に連結し得る。通常、「作動可能に連結している」ＤＮＡ配列は、隣接している。しかしながら、エンハンサーは隣接している必要はない。連結は、適当な制限酵素認識部位でのライゲーションによって行われる。そのような部位が存在しない場合、従来の方法に従って合成ポリヌクレオチドアダプターまたはリンカーを使用することができる。
本明細書で使用する場合、「遺伝子」という用語は、ポリペプチドをコードし、かつコード領域の前後の領域を含むポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡセグメント）を指す。ある場合には、遺伝子は、個々のコードセグメント（エクソン）間に介在配列（イントロン）を含む。
本明細書で使用する場合、「組換え」は、細胞に関連して使用する場合、通常、細胞が外来核酸配列の導入によって改変されたか、または細胞がそのように改変された細胞に由来することを意味する。例えば、組換え細胞は、細胞の天然の（非組換え）形態内に同一の形態で存在しない遺伝子を含み得るか、または組換え細胞は、改変され、細胞に再導入された天然遺伝子（細胞の天然型に存在する）を含み得る。組換え細胞は、細胞から核酸を除かずに改変された細胞に内在する核酸を含み得る。そのような改変としては、遺伝子置換、部位特異的変異、および当業者に知られた関連技術によって得られるものが挙げられる。組換えＤＮＡ技術としては、インビトロで組換えＤＮＡを生成する技術、および組換えＤＮＡが発現または増殖し得る細胞に組換えＤＮＡを移入し、それによって組換えポリペプチドを産生する技術が挙げられる。ポリヌクレオチドまたは核酸の「組換え」および「組換える」は、一般に、２つ以上の核酸またはポリヌクレオチド鎖または断片を組み立てまたは結合して、新しいポリヌクレオチドまたは核酸を生成することを指す。
核酸またはポリヌクレオチドは、その天然の状態で、または当業者に知られた方法によって操作されたときに、転写および／または翻訳されてポリペプチドまたはその断片を産生できる場合に、ポリペプチドを「コードする」と言われる。そのような核酸のアンチセンス鎖もまた、配列をコードすると言われる。
「宿主株」および「宿主細胞」という用語は、目的のＤＮＡ配列を含む発現ベクターに好適な宿主を指す。
「タンパク質」もしくは「ポリペプチド」は、アミノ酸残基のポリマー配列を含む。「タンパク質」および「ポリペプチド」という用語は、本明細書では互換的に使用される。アミノ酸に対しては、本開示全体を通して生化学命名法に関するＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ連合委員会（ＪＣＢＮ）に準拠して定義された１文字また３文字コードを使用する。１文字のＸは、２０種のアミノ酸のいずれかを指す。ポリペプチドが遺伝子コードの縮重に起因して２つ以上のヌクレオチド配列によってコードされ得ることもまた理解されている。
「プロ配列」または「プロペプチド配列」は、シグナルペプチド配列と、プロテアーゼの適切なフォールディングおよび分泌に必要な成熟プロテアーゼ配列との間のアミノ酸配列を指し、これらは、時に分子内シャペロンと呼ばれる。プロ配列またはプロペプチド配列の開裂により、成熟活性プロテアーゼが生成される。細菌セリンプロテアーゼは、多くの場合、プロ酵素として表される。
「シグナル配列」および「シグナルペプチド」という用語は、タンパク質の成熟型もしくは前駆体型の分泌または直接輸送に関与し得るアミノ酸残基の配列を指す。シグナル配列は、通常、前駆体または成熟タンパク質配列のＮ末端に位置する。シグナル配列は、内因性であっても外因性であってもよい。シグナル配列は、通常、成熟タンパク質には存在しない。シグナル配列は、通常、タンパク質が輸送された後にシグナルペプチダーゼによってそのタンパク質から切除される。
タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドの「成熟」型という用語は、シグナルペプチド配列およびプロペプチド配列を含まないタンパク質、ポリペプチド、またはペプチドの機能形態を指す。
タンパク質またはペプチドの「前駆体」型という用語は、そのタンパク質のアミノ末端もしくはカルボニル末端に機能的に連結しているプロ配列を有するタンパク質の成熟型を指す。前駆体はまた、プロ配列のアミノ末端に機能的に連結している「シグナル」配列を有し得る。前駆体はまた、翻訳後活性に関連する追加のポリペプチド（例えば、それから開裂されてタンパク質またはペプチドの成熟型を残すポリペプチド）を有し得る。
アミノ酸配列または核酸配列に関連した「野生型」という用語は、そのアミノ酸配列または核酸配列が天然の配列または天然型配列であることを示す。本明細書で使用する場合、「天然型」という用語は、天然に見出されるもの（例えば、タンパク質またはポリヌクレオチド配列）を指す。これとは逆に、「非天然型」という用語は、天然には見出されないもの（例えば、実験室で生成された、または野生型配列の改変で生成した組換えポリヌクレオチドおよびタンパク質配列）を指す。
アミノ酸残基の位置に関連して本明細書で使用する場合、「〜に対応している」または「〜に対応する」または「対応する」は、タンパク質もしくはペプチド中の列挙された位置におけるアミノ酸残基、またはタンパク質もしくはペプチド中の列挙された残基と類似の、相同の、または均等なアミノ酸残基を指す。本明細書で使用する場合、「対応する領域」は、一般に、関連タンパク質もしくは参照タンパク質における類似の位置を指す。
「〜に由来する」および「〜から得られる」という用語は、論議されている生物の菌株によって生成された、または生成可能なタンパク質を指すだけではなく、そのような菌株から単離されたＤＮＡ配列によりコードされたタンパク質、およびそのようなＤＮＡ配列を含有する宿主生物中で生成されたタンパク質も指す。さらに、この用語は、合成および／またはｃＤＮＡ起源のＤＮＡ配列によってコードされ、論議されているタンパク質の識別特徴を有するタンパク質を指す。例を挙げると、「バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）に由来するプロテアーゼ」は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）によって天然に産生されるタンパク質分解活性を有する酵素、およびバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）源によって産生されるものなどのセリンプロテアーゼを指すが、このセリンプロテアーゼは、遺伝子工学技術の使用により、セリンプロテアーゼをコードする核酸で形質転換された他の宿主細胞によって産生される。
２つのポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列に関連した「同一の」という用語は、配列比較アルゴリズムまたは配列解析アルゴリズムによる測定で、対応が最大になるように２つの配列をアラインさせたときに同じとなる、配列中の核酸またはアミノ酸を指す。
「％同一性」またはパーセント同一性」または「ＰＩＤ」は、タンパク質配列の同一性を指す。パーセント同一性は、当該技術分野で知られる標準技術を使用して決定することができる。目的の配列が共有するパーセントアミノ酸同一性は、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＭＵＳＣＬＥまたはＣＬＵＳＴＡＬなどのプログラムを使用して、配列をアラインし、配列情報を直接比較することにより決定することができる。ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，２１５：４０３−４１０（１９９０）およびＫａｒｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，９０：５８７３−５７８７（１９９３）に記載されている。パーセント（％）アミノ酸配列同一性値は、マッチした同一残基の数を、最適／最大アラインメントのためのプログラムによって作製された任意のギャップを含む「参照」配列の総残基数で割ることによって決定される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、「参照」配列を「クエリー」配列と呼ぶ。
本明細書で使用する場合、「相同タンパク質」または「相同プロテアーゼ」は、一次、二次および／または三次構造において明確な類似性を有するタンパク質を指す。タンパク質相同性は、タンパク質がアラインされた場合の線状アミノ酸配列における類似性を指すことができる。相同性は、アミノ酸配列アラインメントによって、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＭＵＳＣＬＥまたはＣＬＵＳＴＡＬなどのプログラムを使用して決定することができる。タンパク質配列の相同性探索は、ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴのＢＬＡＳＴＰおよびＰＳＩ−ＢＬＡＳＴを使用して、０．００１の閾値（Ｅ値カットオフ）で実施することができる。（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，「Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ ａｎｄ ＰＳＩ ＢＬＡＳＴ ａ ｎｅｗ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａｂａｓｅ ｓｅａｒｃｈ ｐｒｏｇｒａｍｓ」，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，Ｓｅｔ １；２５（１７）：３３８９−４０２（１９９７））。ＢＬＡＳＴプログラムは、数種の探索パラメーターを使用するが、そのほとんどはデフォルト値に設定される。ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、生物学的類似性に関して最も関連する配列を見出すが、残基が２０個未満のクエリー配列に対しては推奨されない（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，２５：３３８９−３４０２，１９９７、およびＳｃｈａｆｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，２９：２９９４−３００５，２００１）。核酸配列を探索するためのデフォルトＢＬＡＳＴパラメーターの例としては、次のものが挙げられる：隣接ワード閾値（Ｎｅｉｇｈｂｏｒｉｎｇ ｗｏｒｄｓ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）＝１１；Ｅ値カットオフ＝１０；スコアリングマトリックス（Ｓｃｏｒｉｎｇ Ｍａｔｒｉｘ）＝ＮＵＣ．３．１（マッチ＝１、ミスマッチ＝−３）；ギャップオープニング（Ｇａｐ Ｏｐｅｎｉｎｇ）＝５；およびギャップエクステンション（Ｇａｐ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）＝２。アミノ酸配列を探索するためのデフォルトＢＬＡＳＴパラメーターの例としては、次のものが挙げられる：ワードサイズ（Ｗｏｒｄ ｓｉｚｅ）＝３；Ｅ値カットオフ＝１０；スコアリングマトリックス（Ｓｃｏｒｉｎｇ Ｍａｔｒｉｘ）＝ＢＬＯＳＵＭ６２；ギャップオープニング（Ｇａｐ Ｏｐｅｎｉｎｇ）＝１１；およびギャップエクステンション（Ｇａｐ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）＝１。この情報を用いて、タンパク質配列をグループ化し、かつ／またはそれから系統樹を構築することができる。アミノ酸配列は、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ Ａｄｖａｎｃｅ ｓｕｉｔｅなどのプログラムに入力することができ、ガイドツリーは、近隣結合（ＮＪ）法（齋藤および根井、Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｅｖｏｌ，４：４０６−４２５，１９８７）を使用して作成することができる。ツリーの構築は、木村の配列距離補正を使用し、ギャップを含む位置を無視して計算することができる。ＡｌｉｇｎＸなどのプログラムは、系統樹上に示された分子名に続く括弧内に、計算した距離の値を示すことができる。
分子間の相同性についての理解は、分子の進化史および分子の機能に関する情報を明らかにすることができ、新規に配列解析したタンパク質が既に特性解析されたタンパク質と相同であれば、新規なタンパク質の生化学的機能を強く示すことになる。２つの実体間の最も基本的な関係は相同性であり、２つの分子は、それらが共通の祖先に由来していれば、相同であると言われる。相同分子または同族体は、パラログとオルトログの２つのクラスに分類することができる。パラログは、１つの種内に存在する同族体である。パラログは、多くの場合、それらの詳細な生化学的機能が相違する。オルトログは、異なる種間に存在する同族体であり、極めて類似または同一の機能を有する。タンパク質スーパーファミリーは、それらの共通の祖先を推察できるタンパク質の最大分類（クレード）である。通常、この共通の先祖は、配列アラインメントと機構類似性に基づいている。スーパーファミリーは、通常、ファミリー内で配列類似性を示す数種のタンパク質ファミリーを含有している。「タンパク質クラン」という用語は、通常、ＭＥＲＯＰＳプロテアーゼ分類システムに基づき、プロテアーゼスーパーファミリーに対して使用される。
ＣＬＵＳＴＡＬ Ｗアルゴリズムは、配列アラインメントアルゴリズムのまた別の例である（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，２２：４６７３−４６８０，１９９４を参照されたい）。ＣＬＵＳＴＡＬ Ｗアルゴリズムのデフォルトパラメーターには、次のパラメーターが含まれる：ギャップオープニングペナルティ（Ｇａｐ ｏｐｅｎｉｎｇ ｐｅｎａｌｔｙ）＝１０．０；ギャップエクステンションペナルティ（Ｇａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｐｅｎａｌｔｙ）＝０．０５；タンパク質重量マトリックス（Ｐｒｏｔｅｉｎ ｗｅｉｇｈｔ ｍａｔｒｉｘ）＝ＢＬＯＳＵＭシリーズ；ＤＮＡ重量マトリックス（ＤＮＡ ｗｅｉｇｈｔ ｍａｔｒｉｘ）＝ＩＵＢ；ディレイ発散数列％（Ｄｅｌａｙ ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ％）＝４０；ギャップ分離距離（Ｇａｐ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｄｉｓｔａｎｃｅ）＝８；ＤＮＡトランジション重量（ＤＮＡ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎｓ ｗｅｉｇｈｔ）＝０．５０；親水性残基のリスト＝ＧＰＳＮＤＱＥＫＲ；負のマトリックスの使用（Ｕｓｅ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｍａｔｒｉｘ）＝ＯＦＦ；トグル残基特異的ペナルティ（Ｔｏｇｇｌｅ Ｒｅｓｉｄｕｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｅｎａｌｔｉｅｓ）＝ＯＮ；トグル親水性ペナルティ（Ｔｏｇｇｌｅ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ ｐｅｎａｌｔｉｅｓ＝ＯＮ；およびトグルエンドギャップ分離ペナルティ（Ｔｏｇｇｌｅ ｅｎｄ ｇａｐ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｐｅｎａｌｔｙ）＝ＯＦＦ。ＣＬＵＳＴＡＬアルゴリズムでは、いずれか一方の末端で発生する欠失が含まれる。例えば、５００個のアミノ酸からなるポリペプチドの一方の末端（またはポリペプチド内）で５個のアミノ酸が欠失した変異体は、「参照」ポリペプチドに対して、９９％（４９５／５００の同一残基×１００）のパーセント配列同一性を有する。そのような変異体は、ポリペプチドに対して「少なくとも９９％の配列同一性」を有する変異体に包含されるであろう。
核酸およびポリヌクレオチドは、少なくとも部分的または完全に他の成分、例えば、限定はされないが、他のタンパク質、核酸、細胞などから分離されている場合、「単離されて」いる。同様に、ポリペプチド、タンパク質またはペプチドは、少なくとも部分的または完全に他の成分、例えば、限定はされないが、他のタンパク質、核酸、細胞などから分離されている場合、「単離されて」いる。モル基準では、単離された種は、組成物中で他の種より豊富である。例えば、単離された種は、存在する全ての高分子種の少なくとも約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約１００％（モル基準で）を含み得る。目的の種は、実質的に均質に（すなわち、組成物中に従来の検出法で汚染種が検出されない）まで精製されていることが好ましい。純度および均質性は、核酸またはタンパク質の試料をそれぞれアガロースまたはポリアクリルアミドのゲル電気泳動にかけた後、染色によって可視化するなど、当該技術分野でよく知られた多くの手法で決定することができる。必要に応じて、高分解能技術、例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）または類似の手段を、材料の精製に使用することができる。
核酸もしくはポリペプチドに適用される「精製（された）」という用語は、一般に、当該技術分野においてよく知られた分析技術によって決定した他の成分を本質的に含まない核酸もしくはポリペプチドを示す（例えば、精製ポリペプチドもしくはポリヌクレオチドは、電気泳動ゲル、クロマトグラフィー溶出液および／または密度勾配遠心分離法に供された媒体において個別のバンドを形成する）。例えば、電気泳動ゲルにおいて本質的に１つのバンドを生じさせる核酸もしくはポリペプチドは「精製されて」いる。精製核酸もしくはポリペプチドは、少なくとも約５０％純粋であり、通常は、少なくとも約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．５％、約９９．６％、約９９．７％、約９９．８％（例えば、モル基準での重量％）以上純粋である。これに関連して、組成物は、精製または濃縮技術の適用後に分子濃度が実質的に増加している場合は、分子が濃縮されている。「濃縮（された）」という用語は、組成物中に化合物、ポリペプチド、細胞、核酸、または他の特定の材料もしくは成分が出発組成物より高い相対濃度もしくは絶対濃度で存在することを指す。
本明細書で使用する場合、「機能アッセイ」という用語は、タンパク質の活性の指標を提供するアッセイを指す。いくつかの実施形態では、この用語は、タンパク質が通常の能力で機能する能力について分析するアッセイシステムを指す。例えば、プロテアーゼの場合、機能アッセイは、タンパク質性基質を分解するプロテアーゼの効果を決定することを含む。
「洗浄活性」という用語は、タンパク質分解、加水分解、洗浄、または開示されている他のプロセスで使用されている条件下で、セリンプロテアーゼポリペプチドまたは参照スブチリシンによって達成される洗浄性能を指す。いくつかの実施形態では、セリンプロテアーゼまたは参照スブチリシンの洗浄性能は、１種以上の様々な酵素感受性の物品または表面の染み（例えば、食物、草、血液、インク、ミルク、油、および／または卵タンパク質から生じる染み）を洗浄に対する様々なアッセイを用いることによって決定することができる。本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体または参照スブチリシンの洗浄性能は、物品または表面上の染みを標準的な洗浄条件に置き、様々なクラマトグラフィ、分光光度法、または他の定量法を用いて染みが除去される程度を評価することによって測定することができる。洗浄アッセイおよび方法の例は、当技術分野で公知であり、限定されるものではないが、国際公開第９９／３４０１１号パンフレットおよび米国特許第６，６０５，４５８号明細書に記載されているもの、ならびに以下に示す実施例に含まれる洗浄アッセイおよび方法を含む。
本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体、または参照スブチリシンの「洗浄有効量」という用語は、特定の洗浄用組成物中で所望のレベルの酵素活性を達成するプロテアーゼの量を指す。そのような有効量は、当業者によって容易に確認され、使用する特定のプロテアーゼ、洗浄の適用、洗浄用組成物の具体的な組成、および液体または乾燥（例えば、粒状、タブレット状、棒状）組成物が要求されるか否かなどの多くの因子に基づく。
「洗浄補助材料」という用語は、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体、または組換えポリペプチドもしくはその活性断片以外の、洗浄用組成物に含まれる任意の液体、固体、または気体物質を指す。いくつかの実施形態では、本開示の洗浄用組成物は１種以上の洗浄補助材料を含む。各洗浄補助材料は、通常、洗浄用組成物の具体的なタイプおよび形態（例えば、液状、粒状、粉末状、棒状、ペースト状、スプレー状、タブレット状、ゲル状、泡状、またはその他の組成物）に応じて選択される。各洗浄補助材料は、組成物中で使用するプロテアーゼ酵素と親和性があることが好ましい。
洗浄用組成物および洗浄用調合物は、あらゆる物体、物品、および／または表面の洗浄、漂白、消毒および／または殺菌に適した任意の組成物を含む。このような組成物および調合物としては、限定されるものではないが、例えば、液体および／または固体組成物、例えば、洗浄用組成物または洗剤組成物（例えば、液状、タブレット状、ゲル状、棒状、粒状、および／または固形状の洗濯洗浄用組成物または洗剤組成物、および緻密に織られた布帛用洗剤組成物；ガラス、木材、セラミック、および金属のカウンタートップおよび窓などの硬質表面洗浄用組成物および調合物；カーペット洗浄剤；オーブン洗浄剤；布帛消臭剤；布帛柔軟剤；ならびに織物、洗濯促進洗浄用組成物または洗剤組成物、洗濯添加剤洗浄用組成物、および洗濯プレスポッター洗浄用組成物；手洗浄または手作業用の食器洗浄用組成物（例えば、「手洗浄」または「手作業」用の食器洗浄用洗剤）を含む食器洗浄用組成物、および自動食器洗浄用組成物（例えば、自動食器洗浄用洗剤）が挙げられる。本発明では、単一単位剤形、例えば、丸剤、タブレット、ゲルキャップ剤、または予め測定した粉末もしくは液体などのその他の単一単位剤形も使用される。
洗浄用組成物または洗浄用調合物は、本明細書で使用する場合、特に指示がない限り、粒状または粉末状の万能または強力洗剤、特に洗浄洗剤；液状、粒子状、ゲル状、固形状、タブレット状、ペースト状または単位剤形の万能洗剤、特に、いわゆる強力液体（ＨＤＬ）型洗剤または強力粉末（ＨＤＤ）型洗剤；緻密に織られた布帛用液体洗剤；手洗浄または手作業用食器用洗剤、例えば高起泡型洗剤；家庭用または業務用の、手洗浄または手作業用食器洗浄用、自動食器洗浄用、または食器もしくはテーブルウェア用洗剤（各種タブレット状、粉末状、固形状、粒状、液状、ゲル状および濯ぎ助剤型のものを含む）；ヒトおよび他の動物用の液体の洗浄剤および殺菌剤、例えば、抗菌性手洗浄型、洗浄バー、口腔洗浄液、義歯洗浄剤、車用洗浄剤、カーペット洗剤、浴室洗剤、ヘアシャンプーおよび／またはヘアリンス；シャワージェル、フォームバスおよび金属クリーナー；ならびに漂白付加剤、および「ステインスティック」または前処理剤などの洗浄補助材料を含む。いくつかの実施形態では、粒状組成物は、「コンパクト」形であり、いくつかの実施形態では、液体組成物は「濃縮」形である。
本明細書で使用する場合、「布帛洗浄用組成物」は、洗濯添加剤組成物を含む手洗浄および機械洗濯用洗剤組成物、ならびに染みが付いた布帛（例えば、布、リネン、および他の織物材料）の浸漬および／または前処理で使用するのに適した組成物を含む。
本明細書で使用する場合、「非布帛洗浄用組成物」は、限定されるものではないが、例えば、手洗浄もしくは手作業または自動食器洗浄用洗剤組成物、口腔洗浄用組成物、義歯洗浄用組成物、コンタクトレンズ洗浄用組成物、創傷清拭組成物、およびパーソナル洗浄用組成物を含む、非織物（すなわち、非布帛）表面洗浄用組成物を含む。
本明細書で使用する場合、「洗剤組成物」または「洗剤調合物」という用語は、特定の布帛および／または非布帛物体または物品を含む、汚れたまたは汚れが付いた物体を洗浄する洗浄媒体で使用することを意図した組成物に関連して使用される。いくつかの実施形態では、本開示の洗剤は、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体を含み、さらに、１種以上の、界面活性剤、トランスフェラーゼ、加水分解酵素、酸化還元酵素、ビルダー（例えば、ビルダー塩）、漂白剤、漂白活性化剤、ブルーイング剤、蛍光色素、固結防止剤、マスキング剤、酵素活性化剤、抗酸化剤および／または可溶化剤を含む。場合によっては、ビルダー塩は、ケイ酸塩とリン酸塩との混合物であり、好ましくは、ケイ酸塩（例えば、メタケイ酸ナトリウム）がリン酸塩（例えば、トリポリリン酸ナトリウム）よりも多い。いくつかの実施形態は、いかなるリン酸塩（例えば、リン酸塩またはリン酸塩ビルダー）も含まない洗浄用組成物または洗剤組成物に関する。
本明細書で使用する場合、「漂白」という用語は、材料を明るくし（すなわち、白くし）、かつ／または洗浄するための、十分な期間の、ならびに／または適切なｐＨおよび／もしくは温度条件での、材料（例えば、布地、洗濯物、パルプなど）または表面の処理を指す。漂白に好適な化学物質の例としては、限定はされないが、例えば、ＣｌＯ２、Ｈ２Ｏ２、過酸、ＮＯ２などが挙げられる。
本明細書で使用する場合、プロテアーゼ（例えば、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体、または組換えポリペプチドもしくはその活性断片）の「洗浄性能」は、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体の洗浄に対する寄与を指し、これは、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体を組成物に添加していない洗剤と比較して、さらなる洗浄性能を洗剤に加えるものである。洗浄性能は、関連する洗浄条件下で比較される。いくつかの試験システムでは、洗剤組成物、泡濃度、水の硬度、洗浄者、時間、ｐＨおよび／または温度などの他の関連する因子を、特定の市場区分における家庭用途（例えば、手洗浄または手作業による食器洗浄、自動食器洗浄、食器の洗浄、テーブルウェアの洗浄、布帛の洗浄など）に典型的な条件を模擬するような方法で調節することができる。
「関連する洗浄条件」という用語は、本明細書では、手洗浄による食器洗浄用、自動食器洗浄用、または洗濯用洗剤の市場区分において、実際に家庭で使用される条件、特に、洗浄温度、時間、洗浄者、泡濃度、洗剤のタイプ、および水の硬度を示すために使用される。
本明細書で使用する場合、「殺菌」という用語は、汚染物質の表面からの除去、および物品表面の微生物の抑制または殺滅を指す。
本明細書中の洗浄用組成物の「コンパクトな」形態は、密度によって、そして組成に関しては無機フィラー塩の量によって、最も良く反映される。無機フィラー塩は、粉末形態の洗剤組成物の従来の成分である。従来の洗剤組成物では、フィラー塩は、相当量、通常、組成物全体の約１７〜約３５重量％含まれている。対照的に、コンパクト組成物では、フィラー塩は、組成物全体の約１５重量％を超えない量で含まれる。いくつかの実施形態では、フィラー塩は、組成物の約１０重量％を超えない量、より好ましくは、約５重量％を超えない量で含まれる。いくつかの実施形態では、無機フィラー塩は、アルカリ金属およびアルカリ土類金属の硫酸塩および塩化物から選択される。いくつかの実施形態では、フィラー塩は硫酸ナトリウムである。
洗浄用途、および洗浄方法、ならびに各種工業用途に有用な１種以上のスブチリシン変異体を本明細書で開示する。１種以上の単離された、組換えの、実質的に純粋な、または天然に存在しないスブチリシン変異体を本明細書で開示する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体は、洗浄用途に有用であり、洗浄を必要とする物品または表面を洗浄する方法に有用な洗浄用組成物に組み込むことができる。
一実施形態は、（ｉ）１、３、９、１０、１５、１７、１９、２２、２４、２５、２６、２７、２８、３０、３５、３７、３８、４３、４５、４８、６８、７１、７４、７６、７７、７８、８６、８７、９１、９５、９６、９８、９９、１００、１０２、１０３、１０８、１１１、１１４、１１５、１２０、１２３、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３６、１４３、１４６、１４７、１５１、１５５、１６０、１６５、１８３、１８４、１８７、１９３、２０２、２０３、２１０、２１７、２３４、２３８、２３９、２４０、２４２、２４７、２５０、２５１、２５５、２５８、２５９、２６０および２７４；（ｉｉ）１、３、９、１５、２２、２４、２８、３０、３５、３７、４５、４８、６８、７１、７４、７６、７７、７８、８６、８７、９５、９６、９８、９９、１００、１０８、１１４、１１５、１２０、１２３、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１４３、１４６、１４７、１５１、１５５、１６５、１８３、１８４、１８７、１９３、２０２、２０３、２１０、２１７、２３４、２３８、２３９、２４０、２４２、２４７、２５０、２５５、２５８、２５９、２６０および２７４；（ｉｉｉ）１、３、１５、３５、６８、７１、７７、８６、８７、９５、９９、１１５、１２３、１２７、１２８、１４７、１５５、１６５、１８４、２０２、２１０、２１７、２３４、２３９、２４２、２５０、２５８および２７４；または（ｉｖ）３、６８、７７、８６、９９、１１５、１２３、１２７、１２８、１６５、１８４、２０２、２１０、２１７および２５８から選択される位置に、配列番号２に対して２つ、３つまたは４つ以上の変異を含む、１種以上のスブチリシン変異体を提供し、前記２つ、３つまたは４つ以上の変異の１つ以上は、天然には存在しないアミノ酸であるという条件が付され、前記変異体は、モチーフＡおよび／またはモチーフＢを含むＡｐｒＬ−Ｃｌａｄｅスブチリシン酵素に対して８５％以上のアミノ酸配列同一性を有し、モチーフＡはモチーフ１、モチーフ２、モチーフ３およびモチーフ４から選択され、モチーフＢはモチーフ５、モチーフ６、モチーフ７、モチーフ８、モチーフ９、モチーフ１０、モチーフ１１、モチーフ１２、モチーフ１３およびモチーフ１４から選択され、変異体のアミノ酸位置は配列番号２のアミノ酸配列に対応して番号付けされている。別の実施形態は、配列番号２に対応する位置に、２つ、３つまたは４つ以上の変異を含む、アミノ酸配列を含む１種以上のスブチリシン変異体に関し、前記位置は、前記２つ、３つまたは４つ以上の変異の１つ以上が人工的変異または置換であるという条件で、（ｉ）１、３、９、１０、１５、２２、２４、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３５、３７、４０、４３、４５、４８、５２、６８、７１、７６、７７、７８、８６、８７、９５、９６、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０５、１０８、１１１、１１４、１１５、１１７、１１９、１２３、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３６、１４３、１４６、１４７、１５１、１５５、１５８、１６０、１６１、１６５、１８４、１８７、１９３、２０２、２０３、２０４、２１０、２１１、２１６、２１７、２３４、２３８、２３９、２４２、２４３、２５０、２５５、２５８、２５９、２６０、２６４および２７４；（ｉｉ）１、３、９、１０、１５、２２、２４、２６、２８、２９、３０、３１、３５、３７、４０、４５、４８、５２、６８、７１、７６、７７、７８、８６、８７、９５、９６、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０５、１０８、１１１、１１４、１１５、１１７、１１９、１２３、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３６、１４３、１４６、１４７、１５１、１５５、１５８、１６０、１６１、１６５、１８４、１８７、１９３、２０２、２０３、２０４、２１０、２１１、２１６、２１７、２３４、２３８、２３９、２４２、２４３、２５０、２５５、２５８、２５９、２６０、２６４および２７４；（ｉｉｉ）１、３、９、１０、２４、２６、２９、３０、３１、３５、３７、４０、４５、４８、５２、６８、７１、７７、７８、８６、８７、９５、９６、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０５、１０８、１１１、１１５、１１７、１１９、１２３、１２７、１２８、１２９、１３０、１３６、１４３、１４６、１４７、１５１、１５５、１５８、１６０、１６１、１６５、１８４、１８７、１９３、２０２、２０３、２０４、２１０、２１１、２１６、２１７、２３４、２３８、２３９、２４２、２４３、２５０、２５８、２５９、２６０、２６４および２７４；（ｉｖ）３、９、１０、３５、６８、７７、７８、８６、８７、９９、１０１、１１５、１２３、１２７、１２８、１６５、１８４、１８７、２０２、２０３、２１０、２１７、２４２、２５０、２５８および２６４；または（ｖ）３、６８、７７、７８、１２３、１２７、１２８、１６５、１８４、２０２、２１０、２１７および２５８から選択され、前記変異体は、モチーフＡおよび／またはモチーフＢを含むＡｐｒＬ−Ｃｌａｄｅスブチリシン酵素に対して少なくとも８５％で１００％未満のアミノ酸配列同一性を有し、モチーフＡはモチーフ１、モチーフ２、モチーフ３およびモチーフ４から選択され、モチーフＢはモチーフ５、モチーフ６、モチーフ７、モチーフ８、モチーフ９、モチーフ１０、モチーフ１１、モチーフ１２、モチーフ１３およびモチーフ１４から選択され、変異体のアミノ酸位置は配列番号２のアミノ酸配列に対応して番号付けされている。
さらに別の実施形態は、（ｉ）１Ｑ、３Ｑ／Ｖ、９Ｅ／Ｔ、１０Ｍ、１５Ｉ／Ｖ、１７Ｈ、１９Ｅ、２２Ｙ、２４Ｎ、２５Ｄ、２６Ｒ、２７Ｒ、２８Ａ、３０Ｔ、３５Ａ、３７Ｔ、３８Ｇ、４３Ａ、４５Ｉ／Ｒ、４８Ｉ、６８Ｓ、７１Ａ、７４Ｇ、７６Ｋ、７７Ｄ／Ｈ／Ｎ／Ｑ／Ｓ、７８Ｉ、８６Ｈ／Ｎ／Ｒ、８７Ｓ／Ｔ、９１Ｇ、９５Ａ／Ｑ、９６Ｓ、９８Ｈ／Ｋ／Ｒ、９９Ｌ／Ｓ、１００Ｎ／Ｒ、１０２Ｒ、１０３Ｉ、１０８Ｈ／Ｋ、１１１Ｑ、１１４Ｎ、１１５Ｆ、１２０Ａ、１２３Ｉ、１２５Ｎ、１２６Ｑ、１２７Ｆ／Ｔ、１２８Ｐ／Ｓ、１２９Ｔ、１３０Ｓ、１３６Ａ／Ｒ、１４３Ｖ、１４６Ａ／Ｓ、１４７Ｌ、１５１Ｇ、１５５Ａ／Ｅ／Ｇ、１６０Ｃ／Ｒ、１６５Ａ／Ｅ／Ｑ／Ｓ、１８３Ａ／Ｇ、１８４Ｑ、１８７Ｐ、１９３Ｄ、２０２Ｖ、２０３Ｅ／Ｎ、２１０Ｅ／Ｈ／Ｐ、２１７Ｓ、２３４Ｉ／Ｗ、２３８Ｒ／Ｔ、２３９Ｋ／Ｓ／Ｔ、２４０Ｎ、２４２Ｇ、２４７Ｗ、２５０Ｇ、２５１Ｅ、２５５Ｒ、２５８Ｅ／Ｈ／Ｐ、２５９Ｐ、２６０Ｗおよび２７４Ａ／Ｆ；（ｉｉ）１Ｑ、３Ｑ／Ｖ、９Ｅ、１５Ｉ、２２Ｙ、２４Ｎ、２８Ａ、３０Ｔ、３５Ａ、３７Ｔ、４５Ｉ、４８Ｉ、６８Ｓ、７１Ａ、７４Ｇ、７６Ｋ、７７Ｄ／Ｈ／Ｎ／Ｓ、７８Ｉ、８６Ｈ／Ｎ／Ｒ、８７Ｓ／Ｔ、９５Ａ／Ｑ、９６Ｓ、９８Ｋ、９９Ｌ／Ｓ、１００Ｎ、１０８Ｈ／Ｋ、１１４Ｎ、１１５Ｆ、１２０Ａ、１２３Ｉ、１２５Ｎ、１２６Ｑ、１２７Ｆ／Ｔ、１２８Ｐ／Ｓ、１２９Ｔ、１３０Ｓ、１４３Ｖ、１４６Ａ／Ｓ、１４７Ｌ、１５１Ｇ、１５５Ａ／Ｅ／Ｇ、１６５Ａ／Ｅ／Ｑ／Ｓ、１８３Ｇ、１８４Ｑ、１８７Ｐ、１９３Ｄ、２０２Ｖ、２０３Ｅ／Ｎ、２１０Ｐ、２１７Ｓ、２３４Ｉ／Ｗ、２３８Ｒ／Ｔ、２３９Ｋ／Ｓ／Ｔ、２４０Ｎ、２４２Ｇ、２４７Ｗ、２５０Ｇ、２５５Ｒ、２５８Ｐ、２５９Ｐ、２６０Ｗおよび２７４Ａ；（ｉｉｉ）１Ｑ、３Ｖ、１５Ｉ、３５Ａ、６８Ｓ、７１Ａ、７７Ｎ、８６Ｈ、８７Ｓ、９５Ａ、９９Ｓ、１１５Ｆ、１２３Ｉ、１２７Ｔ、１２８Ｐ／Ｓ、１４７Ｌ、１５５Ｇ、１６５Ｑ／Ｓ、１８４Ｑ、２０２Ｖ、２１０Ｐ、２１７Ｓ、２３４Ｗ、２３９Ｓ、２４２Ｇ、２５０Ｇ、２５８Ｐおよび２７４Ａ；または（ｉｖ）３Ｖ、６８Ｓ、７７Ｎ、８６Ｈ、９９Ｓ、１１５Ｆ、１２３Ｉ、１２７Ｔ、１２８Ｐ、１６５Ｑ、１８４Ｑ、２０２Ｖ、２１０Ｐ、２１７Ｓおよび２５８Ｐから選択される、配列番号２に対して２つ、３つまたは４つ以上の変異を含む、アミノ酸配列を含む１種以上のスブチリシン変異体を提供し、前記２つ、３つまたは４つ以上の変異の１つ以上は、天然には存在しないアミノ酸であるという条件が付され、前記変異体は、モチーフＡおよび／またはモチーフＢを含むＡｐｒＬ−Ｃｌａｄｅスブチリシン酵素に対して８５％以上のアミノ酸配列同一性を有し、モチーフＡはモチーフ１、モチーフ２、モチーフ３およびモチーフ４から選択され、モチーフＢはモチーフ５、モチーフ６、モチーフ７、モチーフ８、モチーフ９、モチーフ１０、モチーフ１１、モチーフ１２、モチーフ１３およびモチーフ１４から選択され、変異体のアミノ酸位置は配列番号２のアミノ酸配列に対応して番号付けされている。
なお別の実施形態は、（ｉ）Ａ／Ｇ１、Ｔ３、Ｐ９、Ｌ／Ｑ１０、Ｋ１５、Ｈ／Ｑ１７、Ｑ１９、Ｋ２２、Ａ２４、Ｎ２５、Ｖ２６、Ｋ２７、Ｇ／Ｖ２８、Ｉ／Ｖ３０、Ｉ３５、Ａ／Ｓ／Ｔ３７、Ｓ３８、Ｎ／Ｋ４３、Ｖ４５、Ａ４８、Ａ６８、Ｖ７１、Ｌ７４、Ｎ７６、Ｓ／Ｔ７７、Ｉ／Ｔ７８、Ｎ／Ｓ８６、Ｖ８７、Ａ／Ｉ９１、Ｌ９５、Ｎ９６、Ｓ９８、Ｇ９９、Ｓ１００、Ｓ／Ｔ１０２、Ｙ１０３、Ｓ１０８、Ｅ１１１、Ｔ１１４、Ａ／Ｑ／Ｔ１１５、Ｖ１２０、Ｍ１２３、Ｌ１２５、Ｇ１２６、Ｇ１２７、Ａ／Ｐ／Ｔ１２８、Ｓ１２９、Ｇ／Ｖ１３０、Ｑ１３６、Ａ／Ｓ１４３、Ａ／Ｉ／Ｖ１４６、Ｖ１４７、Ａ／Ｓ１５１、Ｓ１５５、Ｎ／Ｓ／Ｙ１６０、Ｇ１６５、Ｇ／Ｋ／Ｎ／Ｓ１８３、Ｎ／Ｑ１８４、Ｓ１８７、Ａ／Ｐ／Ｓ１９３、Ｋ１９４、Ａ／Ｓ／Ｖ２０２、Ｇ／Ｓ２０３、Ｓ／Ｔ２１０、Ｓ２１１、Ｎ２１７、Ｌ２３４、Ｐ２３８、Ａ／Ｎ／Ｔ２３９、Ａ２４２、Ｄ／Ｎ／Ｔ２４７、Ｓ２５０、Ｒ／Ｓ２５１、Ｎ／Ｙ２５５、Ｄ／Ｓ２５８、Ｓ２５９、Ｆ２６０およびＱ２７４；（ｉｉ）Ａ／Ｇ１、Ｔ３、Ｐ９、Ｋ１５、Ｋ２２、Ａ２４、Ｇ／Ｖ２８、Ｉ／Ｖ３０、Ｉ３５、Ａ／Ｓ／Ｔ３７、Ｖ４５、Ａ４８、Ａ６８、Ｖ７１、Ｌ７４、Ｎ７６、Ｓ／Ｔ７７、Ｉ／Ｔ７８、Ｎ／Ｓ８６、Ｖ８７、Ｌ９５、Ｎ９６、Ｓ９８、Ｇ９９、Ｓ１００、Ｓ１０８、Ｔ１１４、Ａ／Ｑ／Ｔ１１５、Ｖ１２０、Ｍ１２３、Ｌ１２５、Ｇ１２６、Ｇ１２７、Ａ／Ｐ／Ｔ１２８、Ｓ１２９、Ｇ／Ｖ１３０、Ａ／Ｓ１４３、Ａ／Ｉ／Ｖ１４６、Ｖ１４７、Ａ／Ｓ１５１、Ｓ１５５、Ｇ１６５、Ｋ／Ｓ１８３、Ｎ１８４、Ｓ１８７、Ａ／Ｐ／Ｓ１９３、Ｋ１９４、Ａ／Ｓ／Ｖ２０２、Ｇ／Ｓ２０３、Ｓ／Ｔ２１０、Ｓ２１１、Ｎ２１７、Ｌ２３４、Ｐ２３８、Ａ／Ｎ／Ｔ２３９、Ａ２４２、Ｄ／Ｎ／Ｔ２４７、Ｓ２５０、Ｎ／Ｙ２５５、Ｄ／Ｓ２５８、Ｓ２５９、Ｆ２６０およびＱ２７４；（ｉｉｉ）Ａ／Ｇ１、Ｔ３、Ｋ１５、Ｉ３５、Ａ６８、Ｖ７１、Ｓ／Ｔ７７、Ｎ／Ｓ８６、Ｖ８７、Ｌ９５、Ｇ９９、Ａ／Ｑ／Ｔ１１５、Ｍ１２３、Ｇ１２７、Ａ／Ｐ／Ｔ１２８、Ｖ１４７、Ｓ１５５、Ｇ１６５、Ｎ１８４、Ａ／Ｓ／Ｖ２０２、Ｓ／Ｔ２１０、Ｎ２１７、Ｌ２３４、Ａ／Ｎ／Ｔ２３９、Ａ２４２、Ｓ２５０、Ｄ／Ｓ２５８およびＱ２７４；または（ｉｖ）Ｔ３、Ａ６８、Ｓ／Ｔ７７、Ｎ／Ｓ８６、Ｇ９９、Ａ／Ｑ／Ｔ１１５、Ｍ１２３、Ｇ１２７、Ａ／Ｐ／Ｔ１２８、Ｇ１６５、Ｎ１８４、Ａ／Ｓ／Ｖ２０２、Ｓ／Ｔ２１０、Ｎ２１７およびＤ／Ｓ２５８から選択される、２つ、３つまたは４つ以上のアミノ酸置換を含む、アミノ酸配列を含む１種以上のスブチリシン変異体を提供し、前記２つ、３つまたは４つ以上の置換の１つ以上は、天然には存在しないアミノ酸であるという条件が付され、前記変異体は、モチーフＡおよび／またはモチーフＢを含むＡｐｒＬ−Ｃｌａｄｅスブチリシン酵素に対して８５％以上のアミノ酸配列同一性を有し、モチーフＡはモチーフ１、モチーフ２、モチーフ３およびモチーフ４から選択され、モチーフＢはモチーフ５、モチーフ６、モチーフ７、モチーフ８、モチーフ９、モチーフ１０、モチーフ１１、モチーフ１２、モチーフ１３およびモチーフ１４から選択され、変異体のアミノ酸位置は配列番号２のアミノ酸配列に対応して番号付けされている。なおさらに別の実施形態は、（ｉ）Ａ／Ｇ１、Ｔ３、Ｐ９、Ｌ１０、Ｋ１５、Ｈ／Ｑ１７、Ｑ１９、Ｋ２２、Ａ２４、Ｎ２５、Ｖ２６、Ｋ２７、Ｇ／Ｖ２８、Ｉ／Ｖ３０、Ｉ３５、Ａ／Ｓ／Ｔ３７、Ｓ３８、Ｎ／Ｋ４３、Ｖ４５、Ａ４８、Ａ６８、Ｖ７１、Ｌ７４、Ｎ７６、Ｔ７７、Ｔ７８、Ｎ／Ｓ８６、Ｖ８７、Ａ９１、Ｌ９５、Ｎ９６、Ｓ９８、Ｇ９９、Ｓ１００、Ｓ／Ｔ１０２、Ｙ１０３、Ｓ１０８、Ｅ１１１、Ｔ１１４、Ｑ／Ｔ１１５、Ｖ１２０、Ｍ１２３、Ｌ１２５、Ｇ１２６、Ｇ１２７、Ａ／Ｐ１２８、Ｓ１２９、Ｇ／Ｖ１３０、Ｑ１３６、Ａ１４３、Ａ／Ｉ／Ｖ１４６、Ｖ１４７、Ａ／Ｓ１５１、Ｓ１５５、Ｎ／Ｓ１６０、Ｇ１６５、Ｋ／Ｓ１８３、Ｎ１８４、Ｓ１８７、Ａ／Ｓ１９３、Ｋ１９４、Ａ／Ｖ２０２、Ｇ／Ｓ２０３、Ｓ／Ｔ２１０、Ｓ２１１、Ｎ２１７、Ｌ２３４、Ｐ２３８、Ｎ／Ｔ２３９、Ａ２４２、Ｎ／Ｔ２４７、Ｓ２５０、Ｒ／Ｓ２５１、Ｎ／Ｙ２５５、Ｄ／Ｓ２５８、Ｓ２５９、Ｆ２６０およびＱ２７４；（ｉｉ）Ａ／Ｇ１、Ｔ３、Ｐ９、Ｋ１５、Ｋ２２、Ａ２４、Ｇ／Ｖ２８、Ｉ／Ｖ３０、Ｉ３５、Ａ／Ｓ／Ｔ３７、Ｖ４５、Ａ４８、Ａ６８、Ｖ７１、Ｌ７４、Ｎ７６、Ｔ７７、Ｔ７８、Ｎ／Ｓ８６、Ｖ８７、Ｌ９５、Ｎ９６、Ｓ９８、Ｇ９９、Ｓ１００、Ｓ１０８、Ｔ１１４、Ｑ／Ｔ１１５、Ｖ１２０、Ｍ１２３、Ｌ１２５、Ｇ１２６、Ｇ１２７、Ａ／Ｐ１２８、Ｓ１２９、Ｇ／Ｖ１３０、Ａ１４３、Ａ／Ｉ／Ｖ１４６、Ｖ１４７、Ａ／Ｓ１５１、Ｓ１５５、Ｇ１６５、Ｋ／Ｓ１８３、Ｎ１８４、Ｓ１８７、Ａ／Ｓ１９３、Ｋ１９４、Ａ／Ｖ２０２、Ｇ／Ｓ２０３、Ｓ／Ｔ２１０、Ｓ２１１、Ｎ２１７、Ｌ２３４、Ｐ２３８、Ｎ／Ｔ２３９、Ａ２４２、Ｎ／Ｔ２４７、Ｓ２５０、Ｎ／Ｙ２５５、Ｄ／Ｓ２５８、Ｓ２５９、Ｆ２６０およびＱ２７４；（ｉｉｉ）Ａ／Ｇ１、Ｔ３、Ｋ１５、Ｉ３５、Ａ６８、Ｖ７１、Ｔ７７、Ｎ／Ｓ８６、Ｖ８７、Ｌ９５、Ｇ９９、Ｑ／Ｔ１１５、Ｍ１２３、Ｇ１２７、Ａ／Ｐ１２８、Ｖ１４７、Ｓ１５５、Ｇ１６５、Ｎ１８４、Ａ／Ｖ２０２、Ｓ／Ｔ２１０、Ｎ２１７、Ｌ２３４、Ｎ／Ｔ２３９、Ａ２４２、Ｓ２５０、Ｄ／Ｓ２５８およびＱ２７４；または（ｉｖ）Ｔ３、Ａ６８、Ｔ７７、Ｎ／Ｓ８６、Ｇ９９、Ｑ／Ｔ１１５、Ｍ１２３、Ｇ１２７、Ａ／Ｐ１２８、Ｇ１６５、Ｎ１８４、Ａ／Ｖ２０２、Ｓ／Ｔ２１０、Ｎ２１７およびＤ／Ｓ２５８から選択される、２つ、３つまたは４つ以上のアミノ酸置換を含む、アミノ酸配列を含む１種以上のスブチリシン変異体を提供し、前記２つ、３つまたは４つ以上の置換の１つ以上は、天然には存在しないアミノ酸であるという条件が付され、前記変異体は、モチーフＡおよび／またはモチーフＢを含むＡｐｒＬ−Ｃｌａｄｅスブチリシン酵素に対して８５％以上のアミノ酸配列同一性を有し、モチーフＡはモチーフ１、モチーフ２、モチーフ３およびモチーフ４から選択され、モチーフＢはモチーフ５、モチーフ６、モチーフ７、モチーフ８、モチーフ９、モチーフ１０、モチーフ１１、モチーフ１２、モチーフ１３およびモチーフ１４から選択され、変異体のアミノ酸位置は配列番号２のアミノ酸配列に対応して番号付けされている。
さらなる実施形態は、（ｉ）１Ｑ、３Ｑ／Ｖ、９Ｅ／Ｔ、１０Ｍ、１５Ｉ／Ｖ、１７Ｈ、１９Ｅ、２２Ｙ、２４Ｎ、２５Ｄ、２６Ｒ、２７Ｒ、２８Ａ、３０Ｔ、３５Ａ、３７Ｔ、３８Ｇ、４３Ａ、４５Ｉ／Ｒ、４８Ｉ、６８Ｓ、７１Ａ、７４Ｇ、７６Ｋ、７７Ｄ／Ｈ／Ｎ／Ｑ／Ｓ、７８Ｉ、８６Ｈ／Ｎ／Ｒ／Ｓ、８７Ｓ／Ｔ、９１Ｇ、９５Ａ／Ｑ、９６Ｓ、９８Ｈ／Ｋ／Ｒ、９９Ｌ／Ｓ、１００Ｎ／Ｒ、１０２Ｒ、１０３Ｉ、１０８Ｈ／Ｋ、１１１Ｑ、１１４Ｎ、１１５Ｆ、１２０Ａ、１２３Ｉ、１２５Ｎ、１２６Ｑ、１２７Ｆ／Ｔ、１２８Ｐ／Ｓ、１２９Ｔ、１３０Ｓ、１３６Ａ／Ｒ、１４３Ｖ、１４６Ａ／Ｓ、１４７Ｌ、１５１Ｇ、１５５Ａ／Ｅ／Ｇ、１６０Ｃ／Ｒ、１６５Ａ／Ｅ／Ｑ／Ｓ、１８３Ａ／Ｇ、１８４Ｑ、１８７Ｐ、１９３Ｄ、１９４Ｅ、２０２Ｖ、２０３Ｅ／Ｎ、２１０Ｅ／Ｈ／Ｐ、２１１Ｎ、２１７Ｓ、２３４Ｉ／Ｗ、２３８Ｒ／Ｔ、２３９Ｋ／Ｓ／Ｔ、２４２Ｇ、２４７Ｗ、２５０Ｇ、２５１Ｅ、２５５Ｒ、２５８Ｅ／Ｈ／Ｐ、２５９Ｐ、２６０Ｗおよび２７４Ａ／Ｆ；（ｉｉ）１Ｑ、３Ｑ／Ｖ、９Ｅ、１５Ｉ、２２Ｙ、２４Ｎ、２８Ａ、３０Ｔ、３５Ａ、３７Ｔ、４５Ｉ、４８Ｉ、６８Ｓ、７１Ａ、７４Ｇ、７６Ｋ、７７Ｄ／Ｈ／Ｎ／Ｓ、７８Ｉ、８６Ｈ／Ｎ／Ｒ／Ｓ、８７Ｓ／Ｔ、９５Ａ／Ｑ、９６Ｓ、９８Ｋ、９９Ｌ／Ｓ、１００Ｎ、１０８Ｈ／Ｋ、１１４Ｎ、１１５Ｆ、１２０Ａ、１２３Ｉ、１２５Ｎ、１２６Ｑ、１２７Ｆ／Ｔ、１２８Ｐ／Ｓ、１２９Ｔ、１３０Ｓ、１４３Ｖ、１４６Ａ／Ｓ、１４７Ｌ、１５１Ｇ、１５５Ａ／Ｅ／Ｇ、１６５Ａ／Ｅ／Ｑ／Ｓ、１８３Ｇ、１８４Ｑ、１８７Ｐ、１９３Ｄ、１９４Ｅ、２０２Ｖ、２０３Ｅ／Ｎ、２１０Ｐ、２１１Ｎ、２１７Ｓ、２３４Ｉ／Ｗ、２３８Ｒ／Ｔ、２３９Ｋ／Ｓ／Ｔ、２４２Ｇ、２４７Ｗ、２５０Ｇ、２５５Ｒ、２５８Ｐ、２５９Ｐ、２６０Ｗおよび２７４Ａ；（ｉｉｉ）１Ｑ、３Ｖ、１５Ｉ、３５Ａ、６８Ｓ、７１Ａ、７７Ｎ、８６Ｈ、８７Ｓ、９５Ａ、９９Ｓ、１１５Ｆ、１２３Ｉ、１２７Ｔ、１２８Ｐ／Ｓ、１４７Ｌ、１５５Ｇ、１６５Ｑ／Ｓ、１８４Ｑ、２０２Ｖ、２１０Ｐ、２１７Ｓ、２３４Ｗ、２３９Ｓ、２４２Ｇ、２５０Ｇ、２５８Ｐおよび２７４Ａ；または（ｉｖ）３Ｖ、６８Ｓ、７７Ｎ、８６Ｈ、９９Ｓ、１１５Ｆ、１２３Ｉ、１２７Ｔ、１２８Ｐ、１６５Ｑ、１８４Ｑ、２０２Ｖ、２１０Ｐ、２１７Ｓおよび２５８Ｐから選択される、２つ、３つまたは４つ以上のアミノ酸置換を含む、アミノ酸配列を含む１種以上のスブチリシン変異体を提供し、前記２つ、３つまたは４つ以上の置換の１つ以上は、天然には存在しないアミノ酸であるという条件が付され、前記変異体は、モチーフＡおよび／またはモチーフＢを含むＡｐｒＬ−Ｃｌａｄｅスブチリシン酵素に対して８５％以上のアミノ酸配列同一性を有し、モチーフＡはモチーフ１、モチーフ２、モチーフ３およびモチーフ４から選択され、モチーフＢはモチーフ５、モチーフ６、モチーフ７、モチーフ８、モチーフ９、モチーフ１０、モチーフ１１、モチーフ１２、モチーフ１３およびモチーフ１４から選択され、変異体のアミノ酸位置は配列番号２のアミノ酸配列に対応して番号付けされている。
なおさらなる実施形態は、配列番号２に対応する２つ、３つまたは４つ以上の位置に、２つ、３つまたは４つ以上のアミノ酸置換を含む、アミノ酸配列を含む１種以上のスブチリシン変異体に関し、前記置換は、前記２つ、３つまたは４つ以上の置換の１つ以上が人工的置換であるという条件で、（ｉ）１Ｑ、３Ｑ／Ｖ、９Ｅ、１０Ｍ、１５Ｉ、２２Ｙ、２４Ｎ／Ｑ、２６Ｑ、２７Ｒ、２８Ａ、２９Ｓ、３０Ｔ、３１Ｉ、３５Ａ、３７Ｔ、４０Ｅ、４３Ａ、４５Ｉ／Ｑ／Ｒ、４８Ｉ／Ｔ／Ｖ、５２Ｒ、６８Ｓ、７１Ａ、７６Ｋ、７７Ｄ／Ｅ／Ｈ／Ｎ／Ｑ／Ｓ、７８Ｉ、８６Ｈ／Ｎ／Ｒ、８７Ｓ／Ｔ、９５Ａ／Ｆ／Ｑ、９６Ｓ、９８Ｈ／Ｒ、９９Ａ／Ｅ／Ｑ／Ｓ、１００Ｎ、１０１Ａ、１０２Ｄ／Ｔ、１０３Ｉ、１０５Ｎ、１０８Ｈ／Ｋ、１１１Ｑ、１１４Ｎ、１１５Ｆ、１１７Ｓ、１１９Ｑ、１２３Ｉ、１２５Ｎ、１２６Ｑ、１２７Ｅ／Ｆ／Ｑ／Ｓ／Ｔ／Ｖ、１２８Ｐ／Ｒ／Ｓ、１２９Ｈ／Ｒ、１３０Ｓ、１３６Ｎ／Ｒ、１４３Ｑ／Ｖ、１４６Ａ／Ｓ、１４７Ｌ、１５１Ｇ、１５５Ｅ／Ｇ／Ｎ、１５８Ｄ／Ｎ／Ｑ、１６０Ｃ／Ｄ／Ｋ、１６１Ｄ／Ｑ、１６５Ａ／Ｅ／Ｑ／Ｓ、１８４Ｅ／Ｑ、１８７Ｅ／Ｐ、１９３Ｄ／Ｑ、２０２Ｖ、２０３Ｅ／Ｎ／Ｑ、２０４Ｉ、２１０Ｅ／Ｈ／Ｉ／Ｐ、２１１Ｓ、２１６Ｑ、２１７Ｓ、２３４Ｉ／Ｗ、２３８Ｑ／Ｒ、２３９Ｋ／Ｓ／Ｔ、２４２Ｇ／Ｎ、２４３Ｉ、２５０Ｇ、２５５Ｒ、２５８Ｄ／Ｅ／Ｐ、２５９Ｅ／Ｐ、２６０Ｗ、２６４Ｈ／Ｑ／Ｓおよび２７４Ａ；（ｉｉ）１Ｑ、３Ｑ／Ｖ、９Ｅ、１０Ｍ、１５Ｉ、２２Ｙ、２４Ｎ／Ｑ、２６Ｑ、２８Ａ、２９Ｓ、３０Ｔ、３１Ｉ、３５Ａ、３７Ｔ、４０Ｅ、４５Ｉ／Ｑ／Ｒ、４８Ｉ／Ｔ／Ｖ、５２Ｒ、６８Ｓ、７１Ａ、７６Ｋ、７７Ｄ／Ｅ／Ｈ／Ｎ／Ｓ、７８Ｉ、８６Ｈ／Ｎ／Ｒ、８７Ｓ／Ｔ、９５Ａ／Ｆ／Ｑ、９６Ｓ、９８Ｋ／Ｒ、９９Ａ／Ｅ／Ｑ／Ｓ、１００Ｎ、１０１Ａ、１０２Ｄ／Ｔ、１０５Ｎ、１０８Ｈ／Ｋ、１１１Ｑ、１１４Ｎ、１１５Ｆ、１１７Ｓ、１１９Ｑ、１２３Ｉ、１２５Ｎ、１２６Ｑ、１２７Ｅ／Ｆ／Ｑ／Ｓ／Ｔ／Ｖ、１２８Ｐ／Ｒ／Ｓ、１２９Ｈ／Ｒ、１３０Ｓ、１３６Ｎ、１４３Ｑ／Ｖ、１４６Ａ／Ｓ、１４７Ｌ、１５１Ｇ、１５５Ｅ／Ｇ／Ｎ、１５８Ｄ／Ｎ／Ｑ、１６０Ｄ／Ｋ、１６１Ｄ／Ｑ、１６５Ａ／Ｅ／Ｑ／Ｓ、１８４Ｅ／Ｑ、１８７Ｅ／Ｐ、１９３Ｄ／Ｑ、１９４Ｅ、２０２Ｖ、２０３Ｅ／Ｎ／Ｑ、２０４Ｉ、２１０Ｉ／Ｐ、２１１Ｓ、２１６Ｑ、２１７Ｓ、２３４Ｉ／Ｗ、２３８Ｑ／Ｒ、２３９Ｋ／Ｓ／Ｔ、２４２Ｇ／Ｎ、２４３Ｉ、２５０Ｇ、２５５Ｒ、２５８Ｄ／Ｐ、２５９Ｅ／Ｐ、２６０Ｗ、２６４Ｈ／Ｑ／Ｓおよび２７４Ａ；（ｉｉｉ）１Ｑ、３Ｖ、９Ｅ、１０Ｍ、２４Ｑ、２６Ｑ、２９Ｓ、３０Ｔ、３１Ｉ、３５Ａ、３７Ｔ、４０Ｅ、４５Ｉ／Ｑ／Ｒ、４８Ｔ／Ｖ、５２Ｒ、６８Ｓ、７１Ａ、７７Ｅ／Ｎ、７８Ｉ、８６Ｈ／Ｒ、８７Ｓ、９５Ａ／Ｆ、９６Ｓ、９８Ｒ、９９Ａ／Ｅ／Ｑ／Ｓ、１００Ｎ、１０１Ａ、１０２Ｄ／Ｔ、１０５Ｎ、１０８Ｈ、１１１Ｑ、１１５Ｆ、１１７Ｓ、１１９Ｑ、１２３Ｉ、１２７Ｅ／Ｑ／Ｓ／Ｔ／Ｖ、１２８Ｐ／Ｒ、１２９Ｈ／Ｒ、１３０Ｓ、１３６Ｎ、１４３Ｑ／Ｖ、１４６Ａ、１４７Ｌ、１５１Ｇ、１５５Ｇ／Ｎ、１５８Ｄ／Ｎ／Ｑ、１６０Ｄ／Ｋ、１６１Ｄ／Ｑ、１６５Ａ／Ｅ／Ｑ、１８４Ｅ／Ｑ、１８７Ｅ／Ｐ、１９３Ｑ、２０２Ｖ、２０３Ｅ／Ｎ／Ｑ、２０４Ｉ、２１０Ｉ／Ｐ、２１１Ｓ、２１６Ｑ、２１７Ｓ、２３４Ｗ、２３８Ｑ、２３９Ｓ、２４２Ｇ／Ｎ、２４３Ｉ、２５０Ｇ、２５８Ｄ／Ｐ、２５９Ｅ／Ｐ、２６０Ｗ、２６４Ｈ／Ｑ／Ｓおよび２７４Ａ；（ｉｖ）３Ｖ、９Ｅ、１０Ｍ、３５Ａ、６８Ｓ、７７Ｎ、７８Ｉ、８６Ｈ、８７Ｓ、９９Ｑ／Ｓ、１０１Ａ、１１５Ｆ、１２３Ｉ、１２７Ｓ／Ｔ、１２８Ｐ／Ｒ、１６５Ｅ／Ｑ、１８４Ｑ、１８７Ｅ、２０２Ｖ、２０３Ｅ、２１０Ｐ、２１７Ｓ、２４２Ｇ、２５０Ｇ、２５８Ｄ／Ｐおよび２６４Ｈ；または（ｖ）３Ｖ、６８Ｓ、７７Ｎ、７８Ｉ、１２３Ｉ、１２７Ｓ、１２８Ｐ、１６５Ｑ、１８４Ｑ、２０２Ｖ、２１０Ｐ、２１７Ｓおよび２５８Ｄ／Ｐから選択され、前記変異体は、モチーフＡおよび／またはモチーフＢを含むＡｐｒＬ−Ｃｌａｄｅスブチリシン酵素に対して、少なくとも８５％で１００％未満のアミノ酸配列同一性を有し、モチーフＡはモチーフ１、モチーフ２、モチーフ３およびモチーフ４から選択され、モチーフＢはモチーフ５、モチーフ６、モチーフ７、モチーフ８、モチーフ９、モチーフ１０、モチーフ１１、モチーフ１２、モチーフ１３およびモチーフ１４から選択され、変異体のアミノ酸位置は配列番号２のアミノ酸配列に対応して番号付けされている。
またさらなる実施形態は、（ｉ）Ａ／Ｇ１Ｑ、Ｔ３Ｑ／Ｖ、Ｐ９Ｅ／Ｔ、Ｌ／Ｑ１０Ｍ、Ｋ１５Ｉ／Ｖ、Ｑ１７Ｈ、Ｑ１９Ｅ、Ｋ２２Ｙ、Ａ２４Ｎ、Ｎ２５Ｄ、Ｖ２６Ｒ、Ｋ２７Ｒ、Ｇ／Ｖ２８Ａ、Ｉ／Ｖ３０Ｔ、Ｉ３５Ａ、Ａ／Ｓ３７Ｔ、Ｓ３８Ｇ、Ｎ／Ｋ４３Ａ、Ｖ４５Ｉ／Ｒ、Ａ４８Ｉ、Ａ６８Ｓ、Ｖ７１Ａ、Ｌ７４Ｇ、Ｎ７６Ｋ、Ｓ／Ｔ７７Ｄ／Ｈ／Ｎ／Ｑ／Ｓ、Ｔ７８Ｉ、Ｎ／Ｓ８６Ｈ／Ｎ／Ｒ／Ｓ、Ｖ８７Ｓ／Ｔ、Ａ／Ｉ９１Ｇ、Ｌ９５Ａ／Ｑ、Ｎ９６Ｓ、Ｓ９８Ｈ／Ｋ／Ｒ、Ｇ９９Ｌ／Ｓ、Ｓ１００Ｎ／Ｒ、Ｓ／Ｔ１０２Ｒ、Ｙ１０３Ｉ、Ｓ１０８Ｈ／Ｋ、Ｅ１１１Ｑ、Ｔ１１４Ｎ、Ａ／Ｑ／Ｔ１１５Ｆ、Ｖ１２０Ａ、Ｍ１２３Ｉ、Ｌ１２５Ｎ、Ｇ１２６Ｑ、Ｇ１２７Ｆ／Ｔ、Ａ／Ｐ／Ｔ１２８Ｐ／Ｓ、Ｓ１２９Ｔ、Ｇ／Ｖ１３０Ｓ、Ｑ１３６Ａ／Ｒ、Ａ／Ｓ１４３Ｖ、Ａ／Ｉ／Ｖ１４６Ａ／Ｓ、Ｖ１４７Ｌ、Ａ／Ｓ１５１Ｇ、Ｓ１５５Ａ／Ｅ／Ｇ、Ｎ／Ｓ／Ｙ１６０Ｃ／Ｒ、Ｇ１６５Ａ／Ｅ／Ｑ／Ｓ、Ｇ／Ｋ／Ｎ／Ｓ１８３Ａ／Ｇ、Ｎ１８４Ｑ、Ｓ１８７Ｐ、Ａ／Ｐ／Ｓ１９３Ｄ、Ｋ１９４Ｅ、Ａ／Ｓ２０２Ｖ、Ｇ／Ｓ２０３Ｅ／Ｎ、Ｓ／Ｔ２１０Ｅ／Ｈ／Ｐ、Ｓ２１１Ｎ、Ｎ２１７Ｓ、Ｌ２３４Ｉ／Ｗ、Ｐ２３８Ｒ／Ｔ、Ａ／Ｎ／Ｔ２３９Ｋ／Ｓ／Ｔ、Ａ２４２Ｇ、Ｄ／Ｎ／Ｔ２４７Ｗ、Ｓ２５０Ｇ、Ｒ／Ｓ２５１Ｅ、Ｎ／Ｙ２５５Ｒ、Ｄ／Ｓ２５８Ｅ／Ｈ／Ｐ、Ｓ２５９Ｐ、Ｆ２６０ＷおよびＱ２７４Ａ／Ｆ；（ｉｉ）Ａ／Ｇ１Ｑ、Ｔ３Ｑ／Ｖ、Ｐ９Ｅ、Ｋ１５Ｉ、Ｋ２２Ｙ、Ａ２４Ｎ、Ｇ／Ｖ２８Ａ、Ｉ／Ｖ３０Ｔ、Ｉ３５Ａ、Ａ／Ｓ３７Ｔ、Ｖ４５Ｉ、Ａ４８Ｉ、Ａ６８Ｓ、Ｖ７１Ａ、Ｌ７４Ｇ、Ｎ７６Ｋ、Ｓ／Ｔ７７Ｄ／Ｈ／Ｎ／Ｓ、Ｔ７８Ｉ、Ｎ／Ｓ８６Ｈ／Ｎ／Ｒ／Ｓ、Ｖ８７Ｓ／Ｔ、Ｌ９５Ａ／Ｑ、Ｎ９６Ｓ、Ｓ９８Ｋ、Ｇ９９Ｌ／Ｓ、Ｓ１００Ｎ、Ｓ１０８Ｈ／Ｋ、Ｔ１１４Ｎ、Ａ／Ｑ／Ｔ１１５Ｆ、Ｖ１２０Ａ、Ｍ１２３Ｉ、Ｌ１２５Ｎ、Ｇ１２６Ｑ、Ｇ１２７Ｆ／Ｔ、Ａ／Ｐ／Ｔ１２８Ｐ／Ｓ、Ｓ１２９Ｔ、Ｇ／Ｖ１３０Ｓ、Ａ／Ｓ１４３Ｖ、Ａ／Ｉ／Ｖ１４６Ａ／Ｓ、Ｖ１４７Ｌ、Ａ／Ｓ１５１Ｇ、Ｓ１５５Ａ／Ｅ／Ｇ、Ｇ１６５Ａ／Ｅ／Ｑ／Ｓ、Ｋ／Ｓ１８３Ｇ、Ｎ１８４Ｑ、Ｓ１８７Ｐ、Ａ／Ｐ／Ｓ１９３Ｄ、Ｋ１９４Ｅ、Ａ／Ｓ２０２Ｖ、Ｇ／Ｓ２０３Ｅ／Ｎ、Ｓ／Ｔ２１０Ｐ、Ｓ２１１Ｎ、Ｎ２１７Ｓ、Ｌ２３４Ｉ／Ｗ、Ｐ２３８Ｒ／Ｔ、Ａ／Ｎ／Ｔ２３９Ｋ／Ｓ／Ｔ、Ａ２４２Ｇ、Ｄ／Ｎ／Ｔ２４７Ｗ、Ｓ２５０Ｇ、Ｎ／Ｙ２５５Ｒ、Ｄ／Ｓ２５８Ｐ、Ｓ２５９Ｐ、Ｆ２６０ＷおよびＱ２７４Ａ；（ｉｉｉ）Ａ／Ｇ１Ｑ、Ｔ３Ｖ、Ｋ１５Ｉ、Ｉ３５Ａ、Ａ６８Ｓ、Ｖ７１Ａ、Ｓ／Ｔ７７Ｎ、Ｎ／Ｓ８６Ｈ、Ｖ８７Ｓ、Ｌ９５Ａ、Ｇ９９Ｓ、Ａ／Ｑ／Ｔ１１５Ｆ、Ｍ１２３Ｉ、Ｇ１２７Ｔ、Ａ／Ｐ／Ｔ１２８Ｐ／Ｓ、Ｖ１４７Ｌ、Ｓ１５５Ｇ、Ｇ１６５Ｑ／Ｓ、Ｎ１８４Ｑ、Ａ／Ｓ２０２Ｖ、Ｓ／Ｔ２１０Ｐ、Ｎ２１７Ｓ、Ｌ２３４Ｗ、Ａ／Ｎ／Ｔ２３９Ｓ、Ａ２４２Ｇ、Ｓ２５０Ｇ、Ｄ／Ｓ２５８ＰおよびＱ２７４Ａ；または（ｉｖ）Ｔ３Ｖ、Ａ６８Ｓ、Ｓ／Ｔ７７Ｎ、Ｎ／Ｓ８６Ｈ、Ｇ９９Ｓ、Ａ／Ｑ／Ｔ１１５Ｆ、Ｍ１２３Ｉ、Ｇ１２７Ｔ、Ａ／Ｔ１２８Ｐ、Ｇ１６５Ｑ、Ｎ１８４Ｑ、Ａ／Ｓ２０２Ｖ、Ｓ／Ｔ２１０Ｐ、Ｎ２１７ＳおよびＤ／Ｓ２５８Ｐから選択される、２つ、３つまたは４つ以上のアミノ酸置換を含む、アミノ酸配列を含む１種以上のスブチリシン変異体を提供し、前記２つ、３つまたは４つ以上の置換の１つ以上は、天然には存在しないアミノ酸であるという条件が付され、前記変異体は、モチーフＡおよび／またはモチーフＢを含むＡｐｒＬ−Ｃｌａｄｅスブチリシン酵素に対して８５％以上のアミノ酸配列同一性を有し、モチーフＡはモチーフ１、モチーフ２、モチーフ３およびモチーフ４から選択され、モチーフＢはモチーフ５、モチーフ６、モチーフ７、モチーフ８、モチーフ９、モチーフ１０、モチーフ１１、モチーフ１２、モチーフ１３およびモチーフ１４から選択され、変異体のアミノ酸位置は配列番号２のアミノ酸配列に対応して番号付けされている。なおまたさらなる実施形態は、（ｉ）Ａ／Ｇ１Ｑ、Ｔ３Ｑ／Ｖ、Ｐ９Ｅ／Ｔ、Ｌ１０Ｍ、Ｋ１５Ｉ／Ｖ、Ｑ１７Ｈ、Ｑ１９Ｅ、Ｋ２２Ｙ、Ａ２４Ｎ、Ｎ２５Ｄ、Ｖ２６Ｒ、Ｋ２７Ｒ、Ｇ／Ｖ２８Ａ、Ｉ／Ｖ３０Ｔ、Ｉ３５Ａ、Ａ／Ｓ３７Ｔ、Ｓ３８Ｇ、Ｎ／Ｋ４３Ａ、Ｖ４５Ｉ／Ｒ、Ａ４８Ｉ、Ａ６８Ｓ、Ｖ７１Ａ、Ｌ７４Ｇ、Ｎ７６Ｋ、Ｔ７７Ｄ／Ｈ／Ｎ／Ｑ／Ｓ、Ｔ７８Ｉ、Ｎ／Ｓ８６Ｈ／Ｎ／Ｒ／Ｓ、Ｖ８７Ｓ／Ｔ、Ａ９１Ｇ、Ｌ９５Ａ／Ｑ、Ｎ９６Ｓ、Ｓ９８Ｈ／Ｋ／Ｒ、Ｇ９９Ｌ／Ｓ、Ｓ１００Ｎ／Ｒ、Ｓ／Ｔ１０２Ｒ、Ｙ１０３Ｉ、Ｓ１０８Ｈ／Ｋ、Ｅ１１１Ｑ、Ｔ１１４Ｎ、Ｑ／Ｔ１１５Ｆ、Ｖ１２０Ａ、Ｍ１２３Ｉ、Ｌ１２５Ｎ、Ｇ１２６Ｑ、Ｇ１２７Ｆ／Ｔ、Ａ／Ｐ１２８Ｐ／Ｓ、Ｓ１２９Ｔ、Ｇ／Ｖ１３０Ｓ、Ｑ１３６Ａ／Ｒ、Ａ１４３Ｖ、Ａ／Ｉ／Ｖ１４６Ａ／Ｓ、Ｖ１４７Ｌ、Ａ／Ｓ１５１Ｇ、Ｓ１５５Ａ／Ｅ／Ｇ、Ｎ／Ｓ１６０Ｃ／Ｒ、Ｇ１６５Ａ／Ｅ／Ｑ／Ｓ、Ｋ／Ｓ１８３Ａ／Ｇ、Ｎ１８４Ｑ、Ｓ１８７Ｐ、Ａ／Ｓ１９３Ｄ、Ｋ１９４Ｅ、Ａ２０２Ｖ、Ｇ／Ｓ２０３Ｅ／Ｎ、Ｓ／Ｔ２１０Ｅ／Ｈ／Ｐ、Ｓ２１１Ｎ、Ｎ２１７Ｓ、Ｌ２３４Ｉ／Ｗ、Ｐ２３８Ｒ／Ｔ、Ｎ／Ｔ２３９Ｋ／Ｓ／Ｔ、Ａ２４２Ｇ、Ｎ／Ｔ２４７Ｗ、Ｓ２５０Ｇ、Ｒ／Ｓ２５１Ｅ、Ｎ／Ｙ２５５Ｒ、Ｄ／Ｓ２５８Ｅ／Ｈ／Ｐ、Ｓ２５９Ｐ、Ｆ２６０ＷおよびＱ２７４Ａ／Ｆ；（ｉｉ）Ａ／Ｇ１Ｑ、Ｔ３Ｑ／Ｖ、Ｐ９Ｅ、Ｋ１５Ｉ、Ｋ２２Ｙ、Ａ２４Ｎ、Ｇ／Ｖ２８Ａ、Ｉ／Ｖ３０Ｔ、Ｉ３５Ａ、Ａ／Ｓ３７Ｔ、Ｖ４５Ｉ、Ａ４８Ｉ、Ａ６８Ｓ、Ｖ７１Ａ、Ｌ７４Ｇ、Ｎ７６Ｋ、Ｔ７７Ｄ／Ｈ／Ｎ／Ｓ、Ｔ７８Ｉ、Ｎ／Ｓ８６Ｈ／Ｎ／Ｒ／Ｓ、Ｖ８７Ｓ／Ｔ、Ｌ９５Ａ／Ｑ、Ｎ９６Ｓ、Ｓ９８Ｋ、Ｇ９９Ｌ／Ｓ、Ｓ１００Ｎ、Ｓ１０８Ｈ／Ｋ、Ｔ１１４Ｎ、Ｑ／Ｔ１１５Ｆ、Ｖ１２０Ａ、Ｍ１２３Ｉ、Ｌ１２５Ｎ、Ｇ１２６Ｑ、Ｇ１２７Ｆ／Ｔ、Ａ／Ｐ１２８Ｐ／Ｓ、Ｓ１２９Ｔ、Ｇ／Ｖ１３０Ｓ、Ａ１４３Ｖ、Ａ／Ｉ／Ｖ１４６Ａ／Ｓ、Ｖ１４７Ｌ、Ａ／Ｓ１５１Ｇ、Ｓ１５５Ａ／Ｅ／Ｇ、Ｇ１６５Ａ／Ｅ／Ｑ／Ｓ、Ｋ／Ｓ１８３Ｇ、Ｎ１８４Ｑ、Ｓ１８７Ｐ、Ａ／Ｓ１９３Ｄ、Ｋ１９４Ｅ、Ａ２０２Ｖ、Ｇ／Ｓ２０３Ｅ／Ｎ、Ｓ／Ｔ２１０Ｐ、Ｓ２１１Ｎ、Ｎ２１７Ｓ、Ｌ２３４Ｉ／Ｗ、Ｐ２３８Ｒ／Ｔ、Ｎ／Ｔ２３９Ｋ／Ｓ／Ｔ、Ａ２４２Ｇ、Ｎ／Ｔ２４７Ｗ、Ｓ２５０Ｇ、Ｎ／Ｙ２５５Ｒ、Ｄ／Ｓ２５８Ｐ、Ｓ２５９Ｐ、Ｆ２６０ＷおよびＱ２７４Ａ；（ｉｉｉ）Ａ／Ｇ１Ｑ、Ｔ３Ｖ、Ｋ１５Ｉ、Ｉ３５Ａ、Ａ６８Ｓ、Ｖ７１Ａ、Ｔ７７Ｎ、Ｎ／Ｓ８６Ｈ、Ｖ８７Ｓ、Ｌ９５Ａ、Ｇ９９Ｓ、Ｑ／Ｔ１１５Ｆ、Ｍ１２３Ｉ、Ｇ１２７Ｔ、Ａ／Ｐ１２８Ｐ／Ｓ、Ｖ１４７Ｌ、Ｓ１５５Ｇ、Ｇ１６５Ｑ／Ｓ、Ｎ１８４Ｑ、Ａ２０２Ｖ、Ｓ／Ｔ２１０Ｐ、Ｎ２１７Ｓ、Ｌ２３４Ｗ、Ｎ／Ｔ２３９Ｓ、Ａ２４２Ｇ、Ｓ２５０Ｇ、Ｄ／Ｓ２５８ＰおよびＱ２７４Ａ；または（ｉｖ）Ｔ３Ｖ、Ａ６８Ｓ、Ｔ７７Ｎ、Ｎ／Ｓ８６Ｈ、Ｇ９９Ｓ、Ｑ／Ｔ１１５Ｆ、Ｍ１２３Ｉ、Ｇ１２７Ｔ、Ａ１２８Ｐ、Ｇ１６５Ｑ、Ｎ１８４Ｑ、Ａ２０２Ｖ、Ｓ／Ｔ２１０Ｐ、Ｎ２１７ＳおよびＤ／Ｓ２５８Ｐから選択される、２つ、３つまたは４つ以上のアミノ酸置換を含む、アミノ酸配列を含む１種以上のスブチリシン変異体を提供し、前記２つ、３つまたは４つ以上の置換の１つ以上は、天然には存在しないアミノ酸であるという条件が付され、前記変異体は、モチーフＡおよび／またはモチーフＢを含むＡｐｒＬ−Ｃｌａｄｅスブチリシン酵素に対して８５％以上のアミノ酸配列同一性を有し、モチーフＡはモチーフ１、モチーフ２、モチーフ３およびモチーフ４から選択され、モチーフＢはモチーフ５、モチーフ６、モチーフ７、モチーフ８、モチーフ９、モチーフ１０、モチーフ１１、モチーフ１２、モチーフ１３およびモチーフ１４から選択され、変異体のアミノ酸位置は配列番号２のアミノ酸配列に対応して番号付けされている。
なおさらなる実施形態は、（ｉ）Ａ／Ｇ１Ｑ、Ｔ３Ｑ／Ｖ、Ｐ／Ｓ９Ｅ、Ｌ／Ｑ１０Ｍ、Ｋ１５Ｉ、Ｋ２２Ｙ、Ａ２４Ｎ／Ｑ、Ｖ２６Ｑ、Ｋ２７Ｒ、Ｇ／Ｖ２８Ａ、Ａ／Ｇ２９Ｓ、Ｉ／Ｖ３０Ｔ、Ｉ／Ｌ３１Ｉ、Ｉ３５Ａ、Ａ／Ｓ３７Ｔ、Ｐ／Ｓ／Ｔ４０Ｅ、Ｎ／Ｋ４３Ａ、Ｓ／Ｖ４５Ｉ／Ｑ／Ｒ、Ａ４８Ｉ／Ｔ／Ｖ、Ａ／Ｓ５２Ｒ、Ａ６８Ｓ、Ｖ７１Ａ、Ｎ７６Ｋ、Ｓ／Ｔ７７Ｄ／Ｅ／Ｈ／Ｎ／Ｑ／Ｓ、Ｔ７８Ｉ、Ｎ／Ｓ８６Ｈ／Ｎ／Ｒ、Ｖ８７Ｓ／Ｔ、Ｌ９５Ａ／Ｆ／Ｑ、Ｎ９６Ｓ、Ｓ９８Ｈ／Ｒ、Ｇ９９Ａ／Ｅ／Ｑ／Ｓ、Ｓ１００Ｎ、Ｇ１０１Ａ、Ｓ／Ｔ１０２Ｄ／Ｔ、Ｙ１０３Ｉ、Ａ／Ｇ１０５Ｎ、Ｓ１０８Ｈ／Ｋ、Ｅ１１１Ｑ、Ｔ１１４Ｎ、Ａ／Ｑ／Ｓ／Ｔ１１５Ｆ、Ｇ／Ｎ１１７Ｓ、Ｄ１１９Ｑ、Ｍ１２３Ｉ、Ｌ１２５Ｎ、Ｇ１２６Ｑ、Ｇ１２７Ｅ／Ｆ／Ｑ／Ｓ／Ｔ／Ｖ、Ａ／Ｐ／Ｓ１２８Ｐ／Ｒ／Ｓ、Ｓ１２９Ｈ／Ｒ、Ｇ／Ｖ１３０Ｓ、Ｑ１３６Ｎ／Ｒ、Ａ／Ｓ１４３Ｑ／Ｖ、Ａ／Ｉ／Ｖ１４６Ａ／Ｓ、Ｖ１４７Ｌ、Ａ／Ｓ１５１Ｇ、Ｓ１５５Ｅ／Ｇ／Ｎ、Ｓ１５８Ｄ／Ｎ／Ｑ、Ｎ／Ｓ／Ｙ１６０Ｃ／Ｄ／Ｋ、Ａ／Ｓ／Ｑ／Ｔ１６１Ｄ／Ｑ、Ｇ１６５Ａ／Ｅ／Ｑ／Ｓ、Ｎ／Ｑ１８４Ｅ／Ｑ、Ｓ１８７Ｅ／Ｐ、Ａ／Ｐ／Ｓ１９３Ｄ／Ｑ、Ａ／Ｓ２０２Ｖ、Ａ／Ｇ／Ｓ２０３Ｅ／Ｎ／Ｑ、Ｖ２０４Ｉ、Ｓ／Ｔ２１０Ｅ／Ｈ／Ｉ／Ｐ、Ｎ２１１Ｓ、Ｌ２１６Ｑ、Ｎ２１７Ｓ、Ｌ２３４Ｉ／Ｗ、Ｐ２３８Ｑ／Ｒ、Ａ／Ｎ／Ｔ２３９Ｋ／Ｓ／Ｔ、Ａ２４２Ｇ／Ｎ、Ｓ２４３Ｉ、Ｓ２５０Ｇ、Ｎ／Ｙ２５５Ｒ、Ｄ／Ｓ２５８Ｄ／Ｅ／Ｐ、Ｓ２５９Ｅ／Ｐ、Ｆ２６０Ｗ、Ｋ／Ｎ／Ｒ２６４Ｈ／Ｑ／ＳおよびＱ２７４Ａ；（ｉｉ）Ａ１Ｑ、Ｔ３Ｑ／Ｖ、Ｐ９Ｅ、Ｌ１０Ｍ、Ｋ１５Ｉ、Ｋ２２Ｙ、Ａ２４Ｎ／Ｑ、Ｖ２６Ｑ、Ｋ２７Ｒ、Ｖ２８Ａ、Ａ２９Ｓ、Ｖ３０Ｔ、Ｌ３１Ｉ、Ｉ３５Ａ、Ａ３７Ｔ、Ｐ４０Ｅ、Ｎ４３Ａ、Ｖ４５Ｉ／Ｑ／Ｒ、Ａ４８Ｉ／Ｔ／Ｖ、Ａ５２Ｒ、Ａ６８Ｓ、Ｖ７１Ａ、Ｎ７６Ｋ、Ｓ７７Ｄ／Ｅ／Ｈ／Ｎ／Ｑ／Ｓ、Ｔ７８Ｉ、Ｓ８６Ｈ／Ｎ／Ｒ、Ｖ８７Ｓ／Ｔ、Ｌ９５Ａ／Ｆ／Ｑ、Ｎ９６Ｓ、Ｓ９８Ｈ／Ｒ、Ｇ９９Ａ／Ｅ／Ｑ／Ｓ、Ｓ１００Ｎ、Ｇ１０１Ａ、Ｓ１０２Ｄ／Ｔ、Ｙ１０３Ｉ、Ｇ１０５Ｎ、Ｓ１０８Ｈ／Ｋ、Ｅ１１１Ｑ、Ｔ１１４Ｎ、Ｔ１１５Ｆ、Ｇ１１７Ｓ、Ｄ１１９Ｑ、Ｍ１２３Ｉ、Ｌ１２５Ｎ、Ｇ１２６Ｑ、Ｇ１２７Ｅ／Ｆ／Ｑ／Ｓ／Ｔ／Ｖ、Ａ１２８Ｐ／Ｒ／Ｓ、Ｓ１２９Ｈ／Ｒ、Ｇ１３０Ｓ、Ｑ１３６Ｎ／Ｒ、Ａ１４３Ｑ／Ｖ、Ｖ１４６Ａ／Ｓ、Ｖ１４７Ｌ、Ａ１５１Ｇ、Ｓ１５５Ｅ／Ｇ／Ｎ、Ｓ１５８Ｄ／Ｎ／Ｑ、Ｎ１６０Ｃ／Ｄ／Ｋ、Ｔ１６１Ｄ／Ｑ、Ｇ１６５Ａ／Ｅ／Ｑ／Ｓ、Ｎ１８４Ｅ／Ｑ、Ｓ１８７Ｅ／Ｐ、Ａ１９３Ｄ／Ｑ、Ａ２０２Ｖ、Ｇ２０３Ｅ／Ｎ／Ｑ、Ｖ２０４Ｉ、Ｔ２１０Ｅ／Ｈ／Ｉ／Ｐ、Ｎ２１１Ｓ、Ｌ２１６Ｑ、Ｎ２１７Ｓ、Ｌ２３４Ｉ／Ｗ、Ｐ２３８Ｑ／Ｒ、Ｎ２３９Ｋ／Ｓ／Ｔ、Ａ２４２Ｇ／Ｎ、Ｓ２４３Ｉ、Ｓ２５０Ｇ、Ｙ２５５Ｒ、Ｓ２５８Ｄ／Ｅ／Ｐ、Ｓ２５９Ｅ／Ｐ、Ｆ２６０Ｗ、Ｋ２６４Ｈ／Ｑ／ＳおよびＱ２７４Ａ；（ｉｉｉ）Ａ／Ｇ１Ｑ、Ｔ３Ｑ／Ｖ、Ｐ／Ｓ９Ｅ、Ｌ／Ｑ１０Ｍ、Ｋ１５Ｉ、Ｋ２２Ｙ、Ａ２４Ｎ／Ｑ、Ｖ２６Ｑ、Ｇ／Ｖ２８Ａ、Ａ／Ｇ２９Ｓ、Ｉ／Ｖ３０Ｔ、Ｉ／Ｌ３１Ｉ、Ｉ３５Ａ、Ａ／Ｓ３７Ｔ、Ｐ／Ｓ／Ｔ４０Ｅ、Ｓ／Ｖ４５Ｉ／Ｑ／Ｒ、Ａ４８Ｉ／Ｔ／Ｖ、Ａ／Ｓ５２Ｒ、Ａ６８Ｓ、Ｖ７１Ａ、Ｎ７６Ｋ、Ｓ／Ｔ７７Ｄ／Ｅ／Ｈ／Ｎ／Ｓ、Ｔ７８Ｉ、Ｎ／Ｓ８６Ｈ／Ｎ／Ｒ、Ｖ８７Ｓ／Ｔ、Ｌ９５Ａ／Ｆ／Ｑ、Ｎ９６Ｓ、Ｓ９８Ｒ、Ｇ９９Ａ／Ｅ／Ｑ／Ｓ、Ｓ１００Ｎ、Ｇ１０１Ａ、Ｓ／Ｔ１０２Ｄ／Ｔ、Ａ／Ｇ１０５Ｎ、Ｓ１０８Ｈ／Ｋ、Ｅ１１１Ｑ、Ｔ１１４Ｎ、Ａ／Ｑ／Ｓ／Ｔ１１５Ｆ、Ｇ／Ｎ１１７Ｓ、Ｄ１１９Ｑ、Ｍ１２３Ｉ、Ｌ１２５Ｎ、Ｇ１２６Ｑ、Ｇ１２７Ｅ／Ｆ／Ｑ／Ｓ／Ｔ／Ｖ、Ａ／Ｐ／Ｓ１２８Ｐ／Ｒ／Ｓ、Ｓ１２９Ｈ／Ｒ、Ｇ／Ｖ１３０Ｓ、Ｑ１３６Ｎ、Ａ／Ｓ１４３Ｑ／Ｖ、Ａ／Ｉ／Ｖ１４６Ａ／Ｓ、Ｖ１４７Ｌ、Ａ／Ｓ１５１Ｇ、Ｓ１５５Ｅ／Ｇ／Ｎ、Ｓ１５８Ｄ／Ｎ／Ｑ、Ｎ／Ｓ／Ｙ１６０Ｄ／Ｋ、Ａ／Ｓ／Ｑ／Ｔ１６１Ｄ／Ｑ、Ｇ１６５Ａ／Ｅ／Ｑ／Ｓ、Ｎ／Ｑ１８４Ｅ／Ｑ、Ｓ１８７Ｅ／Ｐ、Ａ／Ｐ／Ｓ１９３Ｄ／Ｑ、Ａ／Ｓ２０２Ｖ、Ａ／Ｇ／Ｓ２０３Ｅ／Ｎ／Ｑ、Ｖ２０４Ｉ、Ｓ／Ｔ２１０Ｉ／Ｐ、Ｎ２１１Ｓ、Ｌ２１６Ｑ、Ｎ２１７Ｓ、Ｌ２３４Ｉ／Ｗ、Ｐ２３８Ｑ／Ｒ、Ａ／Ｎ／Ｔ２３９Ｋ／Ｓ／Ｔ、Ａ２４２Ｇ／Ｎ、Ｓ２４３Ｉ、Ｓ２５０Ｇ、Ｎ／Ｙ２５５Ｒ、Ｄ／Ｓ２５８Ｄ／Ｐ、Ｓ２５９Ｅ／Ｐ、Ｆ２６０Ｗ、Ｋ／Ｎ／Ｒ２６４Ｈ／Ｑ／ＳおよびＱ２７４Ａ；（ｉｖ）Ａ１Ｑ、Ｔ３Ｑ／Ｖ、Ｐ９Ｅ、Ｌ１０Ｍ、Ｋ１５Ｉ、Ｋ２２Ｙ、Ａ２４Ｎ／Ｑ、Ｖ２６Ｑ、Ｖ２８Ａ、Ａ２９Ｓ、Ｖ３０Ｔ、Ｌ３１Ｉ、Ｉ３５Ａ、Ａ３７Ｔ、Ｐ４０Ｅ、Ｖ４５Ｉ／Ｑ／Ｒ、Ａ４８Ｉ／Ｔ／Ｖ、Ａ５２Ｒ、Ａ６８Ｓ、Ｖ７１Ａ、Ｎ７６Ｋ、Ｔ７７Ｄ／Ｅ／Ｈ／Ｎ／Ｓ、Ｔ７８Ｉ、Ｓ８６Ｈ／Ｎ／Ｒ、Ｖ８７Ｓ／Ｔ、Ｌ９５Ａ／Ｆ／Ｑ、Ｎ９６Ｓ、Ｓ９８Ｒ、Ｇ９９Ａ／Ｅ／Ｑ／Ｓ、Ｓ１００Ｎ、Ｇ１０１Ａ、Ｓ１０２Ｄ／Ｔ、Ｇ１０５Ｎ、Ｓ１０８Ｈ／Ｋ、Ｅ１１１Ｑ、Ｔ１１４Ｎ、Ｔ１１５Ｆ、Ｇ１１７Ｓ、Ｄ１１９Ｑ、Ｍ１２３Ｉ、Ｌ１２５Ｎ、Ｇ１２６Ｑ、Ｇ１２７Ｅ／Ｆ／Ｑ／Ｓ／Ｔ／Ｖ、Ａ１２８Ｐ／Ｒ／Ｓ、Ｓ１２９Ｈ／Ｒ、Ｇ１３０Ｓ、Ｑ１３６Ｎ、Ａ１４３Ｑ／Ｖ、Ｖ１４６Ａ／Ｓ、Ｖ１４７Ｌ、Ａ１５１Ｇ、Ｓ１５５Ｅ／Ｇ／Ｎ、Ｓ１５８Ｄ／Ｎ／Ｑ、Ｎ１６０Ｄ／Ｋ、Ｔ１６１Ｄ／Ｑ、Ｇ１６５Ａ／Ｅ／Ｑ／Ｓ、Ｎ１８４Ｅ／Ｑ、Ｓ１８７Ｅ／Ｐ、Ａ１９３Ｄ／Ｑ、Ａ２０２Ｖ、Ｇ２０３Ｅ／Ｎ／Ｑ、Ｖ２０４Ｉ、Ｔ２１０Ｉ／Ｐ、Ｎ２１１Ｓ、Ｌ２１６Ｑ、Ｎ２１７Ｓ、Ｌ２３４Ｉ／Ｗ、Ｐ２３８Ｑ／Ｒ、Ｎ２３９Ｋ／Ｓ／Ｔ、Ａ２４２Ｇ／Ｎ、Ｓ２４３Ｉ、Ｓ２５０Ｇ、Ｙ２５５Ｒ、Ｓ２５８Ｄ／Ｐ、Ｓ２５９Ｅ／Ｐ、Ｆ２６０Ｗ、Ｋ２６４Ｈ／Ｑ／ＳおよびＱ２７４Ａ；（ｖ）Ａ／Ｇ１Ｑ、Ｔ３Ｖ、Ｐ／Ｓ９Ｅ、Ｌ／Ｑ１０Ｍ、Ａ２４Ｑ、Ｖ２６Ｑ、Ａ／Ｇ２９Ｓ、Ｉ／Ｖ３０Ｔ、Ｉ／Ｌ３１Ｉ、Ｉ３５Ａ、Ａ／Ｓ３７Ｔ、Ｐ／Ｓ／Ｔ４０Ｅ、Ｓ／Ｖ４５Ｉ／Ｑ／Ｒ、Ａ４８Ｔ／Ｖ、Ａ／Ｓ５２Ｒ、Ａ６８Ｓ、Ｖ７１Ａ、Ｓ／Ｔ７７Ｅ／Ｎ、Ｔ７８Ｉ、Ｎ／Ｓ８６Ｈ／Ｒ、Ｖ８７Ｓ、Ｌ９５Ａ／Ｆ、Ｎ９６Ｓ、Ｓ９８Ｒ、Ｇ９９Ａ／Ｅ／Ｑ／Ｓ、Ｓ１００Ｎ、Ｇ１０１Ａ、Ｓ／Ｔ１０２Ｄ／Ｔ、Ａ／Ｇ１０５Ｎ、Ｓ１０８Ｈ、Ｅ１１１Ｑ、Ａ／Ｑ／Ｓ／Ｔ１１５Ｆ、Ｇ／Ｎ１１７Ｓ、Ｄ１１９Ｑ、Ｍ１２３Ｉ、Ｇ１２７Ｅ／Ｑ／Ｓ／Ｔ／Ｖ、Ａ／Ｐ／Ｓ１２８Ｐ／Ｒ、Ｓ１２９Ｈ／Ｒ、Ｇ／Ｖ１３０Ｓ、Ｑ１３６Ｎ、Ａ／Ｓ１４３Ｑ／Ｖ、Ａ／Ｉ／Ｖ１４６Ａ、Ｖ１４７Ｌ、Ａ／Ｓ１５１Ｇ、Ｓ１５５Ｇ／Ｎ、Ｓ１５８Ｄ／Ｎ／Ｑ、Ｎ／Ｓ／Ｙ１６０Ｄ／Ｋ、Ａ／Ｓ／Ｑ／Ｔ１６１Ｄ／Ｑ、Ｇ１６５Ａ／Ｅ／Ｑ、Ｎ１８４Ｅ／Ｑ、Ｓ１８７Ｅ／Ｐ、Ａ／Ｐ／Ｓ１９３Ｑ、Ａ／Ｓ２０２Ｖ、Ａ／Ｇ／Ｓ２０３Ｅ／Ｎ／Ｑ、Ｖ２０４Ｉ、Ｓ／Ｔ２１０Ｉ／Ｐ、Ｎ２１１Ｓ、Ｌ２１６Ｑ、Ｎ２１７Ｓ、Ｌ２３４Ｗ、Ｐ２３８Ｑ、Ａ／Ｎ／Ｔ２３９Ｓ、Ａ２４２Ｇ／Ｎ、Ｓ２４３Ｉ、Ｓ２５０Ｇ、Ｄ／Ｓ２５８Ｄ／Ｐ、Ｓ２５９Ｅ／Ｐ、Ｆ２６０Ｗ、Ｋ／Ｎ／Ｒ２６４Ｈ／Ｑ／Ｓ、およびＱ２７４Ａ；（ｖｉ）Ａ１Ｑ、Ｔ３Ｖ、Ｐ９Ｅ、Ｌ１０Ｍ、Ａ２４Ｑ、Ｖ２６Ｑ、Ａ２９Ｓ、Ｖ３０Ｔ、Ｌ３１Ｉ、Ｉ３５Ａ、Ａ３７Ｔ、Ｐ４０Ｅ、Ｖ４５Ｉ／Ｑ／Ｒ、Ａ４８Ｔ／Ｖ、Ａ５２Ｒ、Ａ６８Ｓ、Ｖ７１Ａ、Ｔ７７Ｅ／Ｎ、Ｔ７８Ｉ、Ｓ８６Ｈ／Ｒ、Ｖ８７Ｓ、Ｌ９５Ａ／Ｆ、Ｎ９６Ｓ、Ｓ９８Ｒ、Ｇ９９Ａ／Ｅ／Ｑ／Ｓ、Ｓ１００Ｎ、Ｇ１０１Ａ、Ｓ１０２Ｄ／Ｔ、Ｇ１０５Ｎ、Ｓ１０８Ｈ、Ｅ１１１Ｑ、Ｔ１１５Ｆ、Ｇ１１７Ｓ、Ｄ１１９Ｑ、Ｍ１２３Ｉ、Ｇ１２７Ｅ／Ｑ／Ｓ／Ｔ／Ｖ、Ａ１２８Ｐ／Ｒ、Ｓ１２９Ｈ／Ｒ、Ｇ１３０Ｓ、Ｑ１３６Ｎ、Ａ１４３Ｑ／Ｖ、Ｖ１４６Ａ、Ｖ１４７Ｌ、Ａ１５１Ｇ、Ｓ１５５Ｇ／Ｎ、Ｓ１５８Ｄ／Ｎ／Ｑ、Ｎ１６０Ｄ／Ｋ、Ｔ１６１Ｄ／Ｑ、Ｇ１６５Ａ／Ｅ／Ｑ、Ｎ１８４Ｅ／Ｑ、Ｓ１８７Ｅ／Ｐ、Ａ１９３Ｑ、Ａ２０２Ｖ、Ｇ２０３Ｅ／Ｎ／Ｑ、Ｖ２０４Ｉ、Ｔ２１０Ｉ／Ｐ、Ｎ２１１Ｓ、Ｌ２１６Ｑ、Ｎ２１７Ｓ、Ｌ２３４Ｗ、Ｐ２３８Ｑ、Ｎ２３９Ｓ、Ａ２４２Ｇ／Ｎ、Ｓ２４３Ｉ、Ｓ２５０Ｇ、Ｓ２５８Ｄ／Ｐ、Ｓ２５９Ｅ／Ｐ、Ｆ２６０Ｗ、Ｋ２６４Ｈ／Ｑ／ＳおよびＱ２７４Ａ；（ｖｉｉ）Ｔ３Ｖ、Ｐ／Ｓ９Ｅ、Ｌ／Ｑ１０Ｍ、Ｉ３５Ａ、Ａ６８Ｓ、Ｓ／Ｔ７７Ｎ、Ｔ７８Ｉ、Ｎ／Ｓ８６Ｈ、Ｖ８７Ｓ、Ｇ９９Ｑ／Ｓ、Ｇ１０１Ａ、Ａ／Ｑ／Ｓ／Ｔ１１５Ｆ、Ｍ１２３Ｉ、Ｇ１２７Ｓ／Ｔ、Ａ／Ｐ／Ｓ１２８Ｐ／Ｒ、Ｇ１６５Ｅ／Ｑ、Ｎ１８４Ｑ、Ｓ１８７Ｅ、Ａ／Ｓ２０２Ｖ、Ａ／Ｇ／Ｓ２０３Ｅ、Ｓ／Ｔ２１０Ｐ、Ｎ２１７Ｓ、Ａ２４２Ｇ、Ｓ２５０Ｇ、Ｄ／Ｓ２５８Ｄ／ＰおよびＫ／Ｎ／Ｒ２６４Ｈ；（ｖｉｉｉ）Ｔ３Ｖ、Ｐ９Ｅ、Ｌ１０Ｍ、Ｉ３５Ａ、Ａ６８Ｓ、Ｔ７７Ｎ、Ｔ７８Ｉ、Ｓ８６Ｈ、Ｖ８７Ｓ、Ｇ９９Ｑ／Ｓ、Ｇ１０１Ａ、Ｔ１１５Ｆ、Ｍ１２３Ｉ、Ｇ１２７Ｓ／Ｔ、Ａ１２８Ｐ／Ｒ、Ｇ１６５Ｅ／Ｑ、Ｎ１８４Ｑ、Ｓ１８７Ｅ、Ａ２０２Ｖ、Ｇ２０３Ｅ、Ｔ２１０Ｐ、Ｎ２１７Ｓ、Ａ２４２Ｇ、Ｓ２５０Ｇ、Ｓ２５８Ｄ／ＰおよびＫ２６４Ｈ；（ｉｘ）Ｔ３Ｖ、Ａ６８Ｓ、Ｓ／Ｔ７７Ｎ、Ｔ７８Ｉ、Ｍ１２３Ｉ、Ｇ１２７Ｓ、Ａ／Ｓ１２８Ｐ、Ｇ１６５Ｑ、Ｎ１８４Ｑ、Ａ／Ｓ２０２Ｖ、Ｓ／Ｔ２１０Ｐ、Ｎ２１７ＳおよびＤ／Ｓ２５８Ｄ／Ｐ；または（ｘ）Ｔ３Ｖ、Ａ６８Ｓ、Ｔ７７Ｎ、Ｔ７８Ｉ、Ｍ１２３Ｉ、Ｇ１２７Ｓ、Ａ１２８Ｐ、Ｇ１６５Ｑ、Ｎ１８４Ｑ、Ａ２０２Ｖ、Ｔ２１０Ｐ、Ｎ２１７ＳおよびＳ２５８Ｄ／Ｐから選択される２つ、３つまたは４つ以上のアミノ酸置換を含む、アミノ酸配列を含む１種以上のスブチリシン変異体に関し、前記２つ、３つまたは４つ以上の置換の１つ以上は、人工の置換であるという条件が付され、前記変異体は、モチーフＡおよび／またはモチーフＢを含むＡｐｒＬ−Ｃｌａｄｅスブチリシン酵素に対して、少なくとも８５％で１００％未満のアミノ酸配列同一性を有し、モチーフＡはモチーフ１、モチーフ２、モチーフ３およびモチーフ４から選択され、モチーフＢはモチーフ５、モチーフ６、モチーフ７、モチーフ８、モチーフ９、モチーフ１０、モチーフ１１、モチーフ１２、モチーフ１３およびモチーフ１４から選択され、変異体のアミノ酸位置は配列番号２のアミノ酸配列に対応して番号付けされている。
さらなる実施形態は、（ｉ）Ｔ７７Ｎ−Ｇ１６５Ｑ，Ｔ７７Ｎ−Ｎ２１７Ｓ，Ｇ１６５Ｑ−Ｎ２１７Ｓ，Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ，Ｎ１８４Ｑ−Ｎ２１７Ｓ，Ａ６８Ｓ−Ｇ１６５Ｑ，Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ，Ｔ７７Ｎ−Ａ１２８Ｐ，Ｔ７７Ｎ−Ｎ１８４Ｑ，Ａ６８Ｓ−Ｎ２１７Ｓ，Ａ１２８Ｐ−Ｎ２１７Ｓ，Ａ１２８Ｐ−Ｇ１６５Ｑ，Ａ６８Ｓ−Ａ１２８Ｐ，Ａ６８Ｓ−Ｎ１８４Ｑ，Ａ１２８Ｐ−Ｎ１８４Ｑ，Ｔ３Ｖ−Ｎ２１７Ｓ，Ａ２０２Ｖ−Ｎ２１７Ｓ，Ｔ３Ｖ−Ｔ７７Ｎ，Ｔ３Ｖ−Ｎ１８４Ｑ，Ｎ１８４Ｑ−Ａ２０２Ｖ，Ｇ１６５Ｑ−Ａ２０２Ｖ，Ｍ１２３Ｉ−Ｇ１６５Ｑ，Ｔ３Ｖ−Ｇ１６５Ｑ，Ｔ３Ｖ−Ａ１２８Ｐ，Ｔ３Ｖ−Ａ６８Ｓ，Ｔ７７Ｎ−Ａ２０２Ｖ，Ｍ１２３Ｉ−Ｎ２１７Ｓ，Ａ６８Ｓ−Ａ２０２Ｖ，Ｍ１２３Ｉ−Ｎ１８４Ｑ，Ａ１２８Ｐ−Ａ２０２Ｖ，Ｔ７７Ｎ−Ｍ１２３Ｉ，Ｔ３Ｖ−Ａ２０２Ｖ，Ｎ２１７Ｓ−Ｓ２５８Ｐ，Ａ６８Ｓ−Ｍ１２３Ｉ，Ｎ１８４Ｑ−Ｓ２５８Ｐ，Ｇ１６５Ｑ−Ｓ２５８Ｐ，Ｍ１２３Ｉ−Ａ１２８Ｐ，Ｔ７７Ｎ−Ｓ２５８Ｐ，Ｔ３Ｖ−Ｍ１２３Ｉ，Ａ１２８Ｐ−Ｓ２５８Ｐ，Ａ２０２Ｖ−Ｓ２５８Ｐ，Ａ６８Ｓ−Ｓ２５８Ｐ，Ｔ３Ｖ−Ｓ２５８Ｐ，Ｍ１２３Ｉ−Ａ２０２Ｖ，Ｍ１２３Ｉ−Ｓ２５８Ｐ，Ａ６８Ｓ−Ｇ１２７Ｓ，Ｇ１２７Ｓ−Ａ１２８Ｐ，Ｔ７７Ｎ−Ｇ１２７Ｓ，Ｇ１２７Ｓ−Ａ２０２Ｖ，Ｇ１２７Ｓ−Ｎ１８４Ｑ，Ｇ１２７Ｓ−Ｎ２１７Ｓ，Ｇ１２７Ｓ−Ｇ１６５Ｑ，Ｔ３Ｖ−Ｇ１２７Ｓ，Ｇ１２７Ｓ−Ｓ２５８Ｐ，Ｍ１２３Ｉ−Ｇ１２７Ｓ，Ｔ７７Ｎ−Ｔ２１０Ｐ，Ｇ１６５Ｑ−Ｔ２１０Ｐ，Ｔ２１０Ｐ−Ｎ２１７Ｓ，Ａ１２８Ｐ−Ｔ２１０Ｐ，Ａ６８Ｓ−Ｔ２１０Ｐ，Ｎ１８４Ｑ−Ｔ２１０Ｐ，Ｔ２１０Ｐ−Ｓ２５８Ｐ，Ａ２０２Ｖ−Ｔ２１０Ｐ，Ｍ１２３Ｉ−Ｔ２１０Ｐ，Ｔ３Ｖ−Ｔ２１０Ｐ，Ｇ１２７Ｓ−Ｔ２１０Ｐ，Ｇ１２７Ｔ−Ｎ１８４Ｑ，Ｇ１２７Ｔ−Ｎ２１７Ｓ，Ｖ８７Ｓ−Ｇ１６５Ｑ，Ｍ１２３Ｉ−Ｑ１３６Ｒ，Ａ６８Ｓ−Ｇ１２７Ｔ，Ｇ１２７Ｔ−Ａ１２８Ｐ，Ｔ７７Ｎ−Ｖ８７
Ｓ，Ｇ１２７Ｔ−Ｇ１６５Ｑ，Ｔ７７Ｎ−Ｇ１２７Ｔ，Ｔ７８Ｉ−Ａ２０２Ｖ，Ａ６８Ｓ−Ｓ２５８Ｄ，Ｇ１６５Ｑ−Ｓ２５８Ｄ，Ｔ７７Ｎ−Ｓ２５８Ｄ，Ｔ７７Ｎ−Ｔ７８Ｉ，Ｔ７８Ｉ−Ｇ１６５Ｑ，Ｎ１８４Ｑ−Ｓ２５８Ｄ，Ｎ２１７Ｓ−Ｓ２５８Ｄ，Ｐ９Ｅ−Ｍ１２３Ｉ，Ａ１２８Ｐ−Ａ２４２Ｇ，Ａ２０２Ｖ−Ｓ２５８Ｄ，Ａ６８Ｓ−Ｔ７８Ｉ，Ｇ１６５Ｑ−Ａ２４２Ｇ，Ｔ７７Ｎ−Ａ２４２Ｇ，Ｔ７８Ｉ−Ａ１２８Ｐ，Ｔ７８Ｉ−Ｇ１２７Ｓ，Ｐ９Ｅ−Ｇ１６５Ｑ，Ｑ１３６Ｒ−Ｇ１６５Ｑ，Ｔ７８Ｉ−Ｎ１８４Ｑ，Ｖ８７Ｓ−Ａ１２８Ｐ，Ｖ８７Ｓ−Ｎ２１７Ｓ，Ａ６８Ｓ−Ｖ８７Ｓ，Ｇ１２７Ｔ−Ａ２０２Ｖ，Ｉ３５Ａ−Ｔ７７Ｎ，Ｔ３Ｖ−Ｔ７８Ｉ，Ｔ７８Ｉ−Ｎ２１７Ｓ，Ａ６８Ｓ−Ａ２４２Ｇ，Ａ６８Ｓ−Ｇ９９Ｓ，Ｇ９９Ｓ−Ａ１２８Ｐ，Ｇ９９Ｓ−Ｇ１６５Ｑ，Ｉ３５Ａ−Ｇ１６５Ｑ，Ｌ１０Ｍ−Ａ２０２Ｖ，Ｔ３Ｖ−Ｇ１２７Ｔ，Ｔ７７Ｎ−Ｇ９９Ｓ，Ｔ７８Ｉ−Ｓ２５８Ｐ，Ｖ４５Ｒ−Ｍ１２３Ｉ，Ｖ８７Ｓ−Ｍ１２３Ｉ，Ｍ１２３Ｉ−Ｎ２３９Ｓ，Ｐ９Ｅ−Ｎ１８４Ｑ，Ｓ１５５Ｇ−Ｇ１６５Ｑ，Ｔ７８Ｉ−Ｍ１２３Ｉ，Ｖ４５Ｒ−Ｑ１３６Ｒ，Ｖ８７Ｓ−Ａ２０２Ｖ，Ａ１２８Ｐ−Ｓ２５８Ｄ，Ｉ３５Ａ−Ａ２０２Ｖ，Ｍ１２３Ｉ−Ｇ１２７Ｔ，Ｍ１２３Ｉ−Ｓ２５８Ｄ，Ｎ１８４Ｑ−Ｎ２３９Ｓ，Ｐ９Ｅ−Ｎ２１７Ｓ，Ｑ１３６Ｒ−Ｓ２５８Ｅ，Ｓ８６Ｈ−Ｓ２５８Ｐ，Ｔ３Ｖ−Ａ２４２Ｇ，Ｔ３Ｖ−Ｓ２５８Ｄ，Ｇ９９Ｓ−Ｎ１８４Ｑ，Ｇ９９Ｓ−Ｎ２１７Ｓ，Ｉ３５Ａ−Ｖ８７Ｓ，Ｎ２１７Ｓ−Ａ２４２Ｇ，Ｐ９Ｅ−Ｑ１３６Ｒ，Ｇ１２７Ｔ−Ｓ２５８Ｐ，Ｉ３５Ａ−Ａ１２８Ｐ，Ｉ３５Ａ−Ａ６８Ｓ，Ｉ３５Ａ−Ｎ２１７Ｓ，Ｌ１０Ｍ−Ｍ１２３Ｉ，Ｐ９Ｅ−Ｓ２５８Ｐ，Ｐ９Ｅ−Ｔ２１０Ｐ，Ｐ９Ｅ−Ｔ７７Ｎ，Ｓ８６Ｈ−Ａ２０２Ｖ，Ｓ８６Ｈ−Ｇ１６５Ｑ，Ｓ８６Ｈ−Ｎ１８４Ｑ，Ｔ７７Ｎ−Ｓ１５５Ｇ，Ｔ７７Ｎ−Ｖ１４７Ｌ，Ｔ７８Ｉ−Ｔ２１０Ｐ，Ｖ８７Ｓ−Ｓ１５５Ｇ，Ａ２０２Ｖ−Ａ２４２Ｇ，Ａ２４２Ｇ−Ｓ２５８Ｐ，Ａ６８Ｓ−Ｇ１６５Ｅ，Ｇ１２７Ｓ−Ａ２４２Ｇ，Ｇ１６５Ｅ−Ｎ１８４Ｑ，Ｇ１６５Ｅ−Ｎ２１７Ｓ，Ｍ１２３Ｉ−Ｓ２５８Ｅ，Ｎ１８４Ｑ−Ａ２４２Ｇ，Ｓ８６Ｈ−Ｔ１１５Ｆ，Ｔ３Ｖ−Ｇ９９Ｓ，Ｖ１４７Ｌ−Ｇ１６５Ｑ，Ａ１２８Ｒ−Ｇ１６５Ｑ，Ａ１２８Ｒ−Ｓ２５８Ｄ，Ａ６８Ｓ−Ａ１２８Ｒ，Ａ６８Ｓ−Ｖ１４７Ｌ，Ｇ１２７Ｓ−Ｓ２５８Ｄ，Ｇ１６５Ｅ−Ａ２０２Ｖ，Ｇ１６５Ｑ−Ｓ２５８Ｅ，Ｇ１６５Ｓ−Ｔ２１０Ｐ，Ｇ２０３Ｅ−Ｔ２１０Ｐ，Ｇ９９Ｓ−Ｇ１２７Ｓ，Ｇ９９Ｓ−Ｍ１２３Ｉ，Ｇ９９Ｓ−Ｔ２１０Ｐ，Ｌ１０Ｍ−Ａ１２８Ｐ，Ｌ１０Ｍ−Ａ６８Ｓ，Ｌ１０Ｍ−Ｎ１８４Ｑ，Ｌ１０Ｍ−Ｎ２１７Ｓ，Ｌ１０Ｍ−Ｓ２５８Ｐ，Ｌ１０Ｍ−Ｔ７７Ｎ，Ｍ１２３Ｉ−Ａ２４２Ｇ，Ｍ１２３Ｉ−Ｇ１６５Ｅ，Ｍ１２３Ｉ−Ｓ１８７Ｐ，Ｎ２３９Ｓ−Ｓ２５８Ｐ，Ｐ９Ｅ−Ａ１２８Ｐ，Ｐ９Ｅ−Ａ２０２Ｖ，Ｐ９Ｅ−Ａ６８Ｓ，Ｐ９Ｅ−Ｖ４５Ｒ，Ｑ１３６Ｒ−Ｎ１８４Ｑ，Ｑ１３６Ｒ−Ｎ２３９Ｓ，Ｓ８６Ｈ−Ｎ２１７Ｓ，Ｔ１１５Ｆ−Ｓ２５８Ｐ，Ｔ２１０Ｐ−Ａ２４２Ｇ，Ｔ３Ｖ−Ｇ１６５Ｅ，Ｔ３Ｖ−Ｌ１０Ｍ，Ｔ３Ｖ−Ｐ９Ｅ，Ｔ７７Ｎ−Ａ１２８Ｒ，Ｔ７７Ｎ−Ｇ１６５Ｅ，Ｔ７８Ｉ−Ａ２４２Ｇ，Ｖ４５Ｒ−Ｇ１６５Ｑ，Ｖ８７Ｔ−Ｍ１２３Ｉ，Ｖ８７Ｔ−Ｎ１８４Ｑ，Ｖ８７Ｔ−Ｎ２３９Ｓ，Ｖ８７Ｔ−Ｑ１３６Ｒ，Ａ６８Ｓ−Ｇ１０１Ａ，Ａ６８Ｓ−Ｖ７１Ａ，Ｇ１０１Ａ−Ａ１２８Ｐ，Ｇ１０１Ａ−Ｇ１６５Ｑ，Ｇ１０１Ａ−Ｓ２５８Ｐ，Ｇ１６５Ａ−Ｎ１８４Ｑ，Ｇ１６５Ｅ−Ｓ２５８Ｐ，Ｇ９９Ｓ−Ｓ２５８Ｐ，Ｉ３５Ａ−Ｍ１２３Ｉ，Ｋ１５Ｉ−Ｇ１６５Ｓ，Ｋ１５Ｉ−Ｔ２１０Ｐ，Ｌ１０Ｍ−Ｇ１２７Ｓ，Ｌ１０Ｍ−Ｇ１６５Ｑ，Ｑ１３６Ｒ−Ｓ１８７Ｐ，Ｓ１８７Ｅ−Ａ２０２Ｖ，Ｓ１８７Ｐ−Ｓ２５８Ｐ，Ｓ２５０Ｇ−Ｓ２５８Ｐ，Ｔ１１５Ｆ−Ａ２０２Ｖ，Ｔ１１５Ｆ−Ｇ１６５Ｑ，Ｔ３Ｖ−Ｇ１０１Ａ，Ｔ３Ｖ−Ｉ３５Ａ，Ｔ３Ｖ−Ｖ８７Ｓ，Ｔ７７Ｎ−Ｇ１０１Ａ，Ｔ７７Ｎ−Ｇ２０３Ｅ，Ｔ７８Ｉ−Ｓ２５８Ｄ，Ｖ７１Ａ−Ｇ１６５Ｑ，Ｖ７１Ａ−Ｔ７７Ｎ，Ｖ８７Ｓ−Ｓ２５８Ｐ，Ｖ８７Ｓ−Ｖ１４７Ｌ，Ａ１２８Ｐ−Ｇ１６５Ｅ，Ａ１２８Ｐ−Ｓ１５５Ｇ，Ａ１２８Ｐ−Ｖ１４７Ｌ，Ａ１２８Ｒ−Ａ２０２Ｖ，Ａ１２８Ｒ−Ｎ１８４Ｑ，Ａ１２８Ｒ−Ｎ２１７Ｓ，Ａ１Ｑ−Ｓ８６Ｈ，Ａ６８Ｓ−Ｇ９９Ｑ，Ａ６８Ｓ−Ｓ１５５Ｇ，Ｇ１０１Ａ−Ａ２０２Ｖ，Ｇ１０１Ａ−Ｇ１２７Ｓ，Ｇ１０１Ａ−Ｎ１８４Ｑ，Ｇ１０１Ａ−Ｎ２１７Ｓ，Ｇ１６５Ｑ−Ｇ２０３Ｅ，Ｇ１６５Ｑ−Ｎ２３９Ｓ，Ｇ１６５Ｓ−Ｎ２３９Ｓ，Ｇ９９Ｑ−Ａ１２８Ｐ，Ｇ９９Ｑ−Ｇ１６５Ｑ，Ｇ９９Ｑ−Ｎ１８４Ｑ，Ｇ９９Ｑ−Ｎ２１７Ｓ，Ｇ９９Ｓ−Ａ２４２Ｇ，Ｉ３５Ａ−Ｎ１８４Ｑ，Ｉ３５Ａ−Ｔ７８Ｉ，Ｉ３
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Ｐ，Ａ６８Ｓ−Ｔ７８Ｉ−Ａ２０２Ｖ，Ａ６８Ｓ−Ｔ７８Ｉ−Ｎ１８４Ｑ，Ａ６８Ｓ−Ｔ７８Ｉ−Ｎ２１７Ｓ，Ｇ１２７Ｔ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ，Ｇ１２７Ｔ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ２１７Ｓ，Ｔ３Ｖ−Ａ６８Ｓ−Ｔ７８Ｉ，Ｔ３Ｖ−Ｔ７８Ｉ−Ａ１２８Ｐ，Ｔ３Ｖ−Ｔ７８Ｉ−Ｇ１２７Ｓ，Ｔ７７Ｎ−Ｇ１２７Ｔ−Ｎ１８４Ｑ，Ｔ７７Ｎ−Ｇ１２７Ｔ−Ｎ２１７Ｓ，Ｔ７７Ｎ−Ｔ７８Ｉ−Ｓ２５８Ｐ，Ｔ７８Ｉ−Ａ１２８Ｐ−Ａ２０２Ｖ，Ｔ７８Ｉ−Ａ１２８Ｐ−Ｎ１８４Ｑ，Ｔ７８Ｉ−Ａ１２８Ｐ−Ｎ２１７Ｓ，Ｔ７８Ｉ−Ａ２０２Ｖ−Ｎ２１７Ｓ，Ｔ７８Ｉ−Ｇ１２７Ｓ−Ａ２０２Ｖ，Ｔ７８Ｉ−Ｇ１２７Ｓ−Ｎ１８４Ｑ，Ｔ７８Ｉ−Ｇ１２７Ｓ−Ｎ２１７Ｓ，Ｔ７８Ｉ−Ｇ１６５Ｑ−Ｓ２５８Ｐ，Ａ６８Ｓ−Ｇ１２７Ｔ−Ａ２０２Ｖ，Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ｇ１２７Ｔ，Ｇ１２７Ｔ−Ａ１２８Ｐ−Ｇ１６５Ｑ，Ｎ１８４Ｑ−Ａ２０２Ｖ−Ｓ２５８Ｄ，Ｔ３Ｖ−Ｇ１２７Ｔ−Ｎ１８４Ｑ，Ｔ３Ｖ−Ｇ１２７Ｔ−Ｎ２１７Ｓ，Ｔ７７Ｎ−Ｇ１２７Ｔ−Ａ１２８Ｐ，Ｔ７８Ｉ−Ｍ１２３Ｉ−Ａ２０２Ｖ，Ａ１２８Ｐ−Ｇ１６５Ｑ−Ａ２４２Ｇ，Ａ１２８Ｐ−Ｇ１６５Ｑ−Ｓ２５８Ｄ，Ａ１２８Ｐ−Ｎ１８４Ｑ−Ｓ２５８Ｄ，Ａ１２８Ｐ−Ｎ２１７Ｓ−Ｓ２５８Ｄ，Ａ６８Ｓ−Ａ１２８Ｐ−Ｓ２５８Ｄ，Ａ６８Ｓ−Ｇ１２７Ｔ−Ｇ１６５Ｑ，Ａ６８Ｓ−Ｔ７８Ｉ−Ｓ２５８Ｐ，Ｇ１２７Ｔ−Ａ１２８Ｐ−Ａ２０２Ｖ，Ｔ３Ｖ−Ａ１２８Ｐ−Ａ２４２Ｇ，Ｔ３Ｖ−Ａ６８Ｓ−Ｇ１２７Ｔ，Ｔ３Ｖ−Ａ６８Ｓ−Ｓ２５８Ｄ，Ｔ３Ｖ−Ｇ１２７Ｔ−Ａ２０２Ｖ，Ｔ３Ｖ−Ｇ１６５Ｑ−Ａ２４２Ｇ，Ｔ３Ｖ−Ｇ１６５Ｑ−Ｓ２５８Ｄ，Ｔ３Ｖ−Ｔ７７Ｎ−Ａ２４２Ｇ，Ｔ３Ｖ−Ｔ７７Ｎ−Ｓ２５８Ｄ，Ｔ３Ｖ−Ｔ７８Ｉ−Ｎ１８４Ｑ，Ｔ３Ｖ−Ｔ７８Ｉ−Ｎ２１７Ｓ，Ｔ３Ｖ−Ｔ７８Ｉ−Ｓ２５８Ｐ，Ｔ７７Ｎ−Ａ１２８Ｐ−Ａ２４２Ｇ，Ｔ７７Ｎ−Ａ１２８Ｐ−Ｓ２５８Ｄ，Ｔ７７Ｎ−Ｇ１２７Ｔ−Ｇ１６５Ｑ，Ｔ７７Ｎ−Ｇ１６５Ｑ−Ａ２４２Ｇ，Ｔ７８Ｉ−Ａ１２８Ｐ−Ｓ２５８Ｐ，Ｔ７８Ｉ−Ｇ１２７Ｓ−Ｓ２５８Ｐ，Ａ６８Ｓ−Ｍ１２３Ｉ−Ｓ２５８Ｄ，Ｇ１２７Ｔ−Ｇ１６５Ｑ−Ａ２０２Ｖ，Ｍ１２３Ｉ−Ｇ１６５Ｑ−Ｓ２５８Ｄ，Ｔ３Ｖ−Ｇ１２７Ｔ−Ａ１２８Ｐ，Ｔ３Ｖ−Ｎ２１７Ｓ−Ｓ２５８Ｄ，Ｔ３Ｖ−Ｔ７８Ｉ−Ａ２０２Ｖ，Ｔ７７Ｎ−Ｇ１２７Ｔ−Ａ２０２Ｖ，Ｔ７７Ｎ−Ｍ１２３Ｉ−Ｓ２５８Ｄ，Ｔ７７Ｎ−Ｔ７８Ｉ−Ｍ１２３Ｉ，Ｔ７８Ｉ−Ｍ１２３Ｉ−Ｇ１６５Ｑ，Ｔ７８Ｉ−Ｍ１２３Ｉ−Ｎ１８４Ｑ，Ｔ７８Ｉ−Ｎ１８４Ｑ−Ｓ２５８Ｐ，Ａ６８Ｓ−Ｔ７８Ｉ−Ｍ１２３Ｉ，Ａ６８Ｓ−Ｔ７８Ｉ−Ｔ２１０Ｐ，Ｇ１２７Ｔ−Ｎ１８４Ｑ−Ｓ２５８Ｐ，Ｇ１２７Ｔ−Ｎ２１７Ｓ−Ｓ２５８Ｐ，Ｍ１２３Ｉ−Ａ２０２Ｖ−Ｓ２５８Ｄ，Ｍ１２３Ｉ−Ｎ２１７Ｓ−Ｓ２５８Ｄ，Ｔ３Ｖ−Ａ２０２Ｖ−Ｓ２５８Ｄ，Ｔ３Ｖ−Ｍ１２３Ｉ−Ｓ２５８Ｄ，Ｔ３Ｖ−Ｎ１８４Ｑ−Ｓ２５８Ｄ，Ｔ３Ｖ−Ｔ７７Ｎ−Ｇ１２７Ｔ，Ｔ３Ｖ−Ｔ７８Ｉ−Ｔ２１０Ｐ，Ｔ７７Ｎ−Ｔ７８Ｉ−Ｔ２１０Ｐ，Ｔ７８Ｉ−Ａ１２８Ｐ−Ｔ２１０Ｐ，Ｔ７８Ｉ−Ａ２０２Ｖ−Ｓ２５８Ｐ，Ｔ７８Ｉ−Ｇ１２７Ｓ−Ｔ２１０Ｐ，Ｔ７８Ｉ−Ｇ１６５Ｑ−Ｔ２１０Ｐ，Ｔ７８Ｉ−Ｍ１２３Ｉ−Ａ１２８Ｐ，Ｔ７８Ｉ−Ｍ１２３Ｉ−Ｇ１２７Ｓ，Ｔ７８Ｉ−Ｍ１２３Ｉ−Ｎ２１７Ｓ，およびＴ７８Ｉ−Ｎ２１７Ｓ−Ｓ２５８Ｐから選択される１種以上のアミノ酸置換セットを含む、アミノ酸配列を含む１種以上のスブチリシン変異体に関し、前記２つ、３つまたは４つ以上の置換の１つ以上は、人工の置換であるという条件が付され、前記変異体は、モチーフＡおよび／またはモチーフＢを含むＡｐｒＬ−Ｃｌａｄｅスブチリシン酵素に対して、少なくとも８５％であるが、１００％未満のアミノ酸配列同一性を有し、モチーフＡはモチーフ１、モチーフ２、モチーフ３およびモチーフ４から選択され、モチーフＢはモチーフ５、モチーフ６、モチーフ７、モチーフ８、モチーフ９、モチーフ１０、モチーフ１１、モチーフ１２、モチーフ１３およびモチーフ１４から選択され、変異体のアミノ酸位置は配列番号２のアミノ酸配列に対応して番号付けされている。
別の実施形態は、Ｍ１２３Ｉ−Ｑ１３６Ｒ；Ｐ９Ｅ−Ｍ１２３Ｉ；Ｖ４５Ｒ−Ｍ１２３Ｉ；Ｇ１２７Ｔ−Ｇ１６５Ｓ−Ｔ２１０Ｅ；Ｍ１２３Ｉ−Ｇ１６５Ｓ−Ｎ２３９Ｓ；Ｍ１２３Ｉ−Ｑ１３６Ｒ−Ｇ１６５Ｑ；Ｍ１２３Ｉ−Ｑ１３６Ｒ−Ｓ２５８Ｅ；Ｍ１２３Ｉ−Ｖ１４６Ｓ−Ｔ２１０Ｅ；Ｐ９Ｅ−Ｖ４５Ｒ−Ｍ１２３Ｉ；Ｑ１３６Ｒ−Ｇ１６５Ｑ−Ｓ２５８Ｅ；Ｖ４５Ｒ−Ｍ１２３Ｉ−Ｑ１３６Ｒ；Ｇ１２７Ｔ−Ｖ１４６Ｓ−Ｇ１６５Ｓ−Ｎ２３９Ｓ；Ｌ１０Ｍ−Ｋ２７Ｒ−Ｓ９８Ｈ−Ｍ１２３Ｉ；Ｍ１２３Ｉ−Ｑ１３６Ｒ−Ｇ１６５Ｑ−Ｓ２５８Ｅ；Ｍ１２３Ｉ−Ｖ１４６Ｓ−Ｇ１６５Ｓ−Ｔ２１０Ｐ；Ｍ１２３Ｉ−Ｖ１４６Ｓ−Ｔ２１０Ｐ−Ｓ２５０Ｇ；Ｐ９Ｅ−Ｍ１２３Ｉ−Ｑ１３６Ｒ−Ｇ１６５Ｑ；Ｐ９Ｅ−Ｑ１３６Ｒ−Ｇ１６５Ｑ−Ｓ２５８Ｅ；Ｐ９Ｅ−Ｖ４５Ｒ−Ｍ１２３Ｉ−Ｑ１３６Ｒ；Ｖ４５Ｒ−Ｍ１２３Ｉ−Ｑ１３６Ｒ−Ｇ１６５Ｑ；Ｖ４５Ｒ−Ｍ１２３Ｉ−Ｑ１３６Ｒ−Ｓ２５８Ｅ；Ｖ４５Ｒ−Ｑ１３６Ｒ−Ｇ１６５Ｑ−Ｓ２５８Ｅ；Ｋ２７Ｒ−Ｎ４３Ａ−Ｓ９８Ｈ−Ｍ１２３Ｉ−Ｔ２１０Ｈ；Ｐ９Ｅ−Ｍ１２３Ｉ−Ｑ１３６Ｒ−Ｇ１６５Ｑ−Ｓ２５８Ｅ；Ｐ９Ｅ−Ｖ４５Ｒ−Ｍ１２３Ｉ−Ｑ１３６Ｒ−Ｇ１６５Ｑ；Ｐ９Ｅ−Ｖ４５Ｒ−Ｍ１２３Ｉ−Ｑ１３６Ｒ−Ｓ２５８Ｅ；Ｖ４５Ｒ−Ｍ１２３Ｉ−Ｑ１３６Ｒ−Ｇ１６５Ｑ−Ｓ２５８Ｅ；Ｙ１０３Ｉ−Ｇ１２７Ｔ−Ｖ１４６Ｓ−Ｇ１６５Ｓ−Ｎ２３９Ｓ；Ｔ７７Ｈ−Ｖ８７Ｔ−Ｍ１２３Ｉ−Ｑ１３６Ｒ−Ｎ１８４Ｑ−Ｎ２３９Ｓ；Ｖ２６Ｒ−Ｖ４５Ｒ−Ｓ９８Ｒ−Ｅ１１１Ｑ−Ｍ１２３Ｉ−Ｑ１３６Ｒ；Ｔ７７Ｈ−Ｖ８７Ｔ−Ｍ１２３Ｉ−Ｑ１３６Ｒ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ｎ２３９Ｓ；Ｔ７７Ｓ−Ｖ８７Ｓ−Ｍ１２３Ｉ−Ｑ１３６Ｒ−Ｇ１６５Ｑ−Ｓ１８７Ｐ−Ｓ２５８Ｐ；Ｔ７７Ｓ−Ｖ８７Ｓ−Ｍ１２３Ｉ−Ｑ１３６Ｒ−Ｎ１６０Ｃ−Ｓ１８７Ｐ−Ｓ２５８Ｐ；Ｔ７７Ｈ−Ｖ８７Ｔ−Ｍ１２３Ｉ−Ｑ１３６Ｒ−Ｎ１８４Ｑ−Ｓ１８７Ｐ−Ｎ２３９Ｓ−Ｓ２５８Ｐ；Ｔ３Ｑ−Ｋ２２Ｙ−Ａ２４Ｎ−Ｖ４５Ｉ−Ａ４８Ｉ−Ｔ７７Ｎ−Ｎ２１７Ｓ−Ｌ２３４Ｉ−Ｙ２５５Ｒ；Ｐ９Ｅ−Ｔ７７Ｑ−Ｖ８７Ｔ−Ｍ１２３Ｉ−Ｑ１３６Ｒ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ｎ２１７Ｓ−Ｎ２３９Ｓ−Ｓ２５８Ｅ；Ｎ４３Ａ−Ｖ４５Ｒ−Ｔ７７Ｈ−Ｖ８７Ｔ−Ｍ１２３Ｉ−Ｑ１３６Ｒ−Ｇ１６５Ａ−Ｎ１８４Ｑ−Ｓ１８７Ｐ−Ｎ２３９Ｓ−Ｓ２５８Ｐ；Ｐ９Ｅ−Ｎ４３Ａ−Ｖ４５Ｒ−Ｔ７７Ｓ−Ｖ８７Ｓ−Ｍ１２３Ｉ−Ｑ１３６Ｒ−Ｇ１６５Ｑ−Ｓ１８７Ｐ−Ｎ２１７Ｓ−Ｓ２５８Ｐ；Ｐ９Ｅ−Ｎ４３Ａ−Ｖ４５Ｒ−Ｔ７７Ｈ−Ｖ８７Ｔ−Ｍ１２３Ｉ−Ｑ１３６Ｒ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ｓ１８７Ｐ−Ｎ２３９Ｓ−Ｓ２５８Ｐ；Ｐ９Ｅ−Ｎ４３Ａ−Ｖ４５Ｒ−Ｔ７７Ｑ−Ｖ８７Ｔ−Ｍ１２３Ｉ−Ｑ１３６Ｒ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ｎ２１７Ｓ−Ｎ２３９Ｓ−Ｓ２５８Ｅ；Ｐ９Ｅ−Ｎ４３Ａ−Ｖ４５Ｒ−Ｔ７７Ｈ−Ｖ８７Ｔ−Ｍ１２３Ｉ−Ｑ１３６Ｒ−Ｇ１６５Ａ−Ｎ１８４Ｑ−Ｓ１８７Ｐ−Ｎ２１７Ｓ−Ｎ２３９Ｓ−Ｓ２５８Ｅ；Ｔ７７Ｎ−Ｎ２１７Ｓ−Ｌ２３４Ｗ；Ｔ７７Ｎ−Ｎ２１７Ｓ，Ｔ７７Ｎ−Ｇ１２６Ｑ−Ｇ１６５Ｑ−Ｔ２１０Ｐ−Ｎ２１７Ｓ−Ｌ２３４Ｗ−Ｓ２５８Ｐ，Ｔ７７Ｎ−Ｇ１２７Ｆ−Ｇ１６５Ｑ−Ａ２０２Ｖ−Ｔ２１０Ｐ−Ｎ２１７Ｓ−Ｌ２３４Ｗ−Ｓ２５８Ｐ；Ａ１Ｑ−Ｔ３Ｖ−Ｖ２８Ａ−Ｉ３５Ａ−Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ｓ８６Ｈ−Ｔ１１５Ｆ−Ｎ２１７Ｓ−Ｎ２３９Ｓ−Ｓ２５０Ｇ−Ｓ２５８Ｐ−Ｑ２７４Ａ；Ｔ７７Ｎ−Ｍ１２３Ｉ−Ｔ２１０Ｐ−Ｎ２３９Ｓ−Ｓ２５０Ｇ−Ｓ２５８Ｐ；Ｖ４５Ｉ−Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ｍ１２３Ｉ−Ｌ１２５Ｎ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ２１７Ｓ−Ｓ２５８Ｐ；Ａ６８Ｓ−Ｖ７１Ａ−Ｔ７７Ｎ−Ｌ９５Ａ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ｔ２１０Ｐ−Ｓ２５８Ｐ；Ｍ１２３Ｉ−Ｔ２１０Ｐ−Ｎ２１７Ｓ−Ｓ２５８Ｐ；Ｇ１２７Ｆ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ２１７Ｓ−Ｓ２５８Ｐ；Ｔ７７Ｎ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ２１７Ｓ−Ｓ２５８Ｐ；Ｔ７７Ｓ−Ｇ１６５Ａ−Ｎ１８４Ｑ−Ｔ２１０Ｐ−Ｎ２１７Ｓ；Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ａ１２８Ｐ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ｎ２１７Ｓ；Ｖ７１Ａ−Ｔ７７Ｓ−Ｎ１８４Ｑ−Ｓ２５８Ｐ；Ｔ７７Ｎ−Ｍ１２３Ｉ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ｎ２１７Ｓ；Ｖ７１Ａ−Ｌ９５Ａ−Ａ１２８Ｓ−Ｔ２１０Ｐ；Ｖ７１Ａ−Ｍ１２３Ｉ−Ａ１２８Ｓ−Ｔ２１０Ｐ；Ｖ７１Ａ−Ｍ１２３Ｉ−Ａ１２８Ｓ−Ｇ１６５Ｅ；Ｔ７７Ｓ−Ａ１２８Ｐ−Ｎ１８４Ｑ−Ｎ２１７Ｓ−Ｆ２６０Ｗ；Ｔ７７Ｈ−Ａ１２８Ｓ−Ｇ１６５Ｑ−Ｔ２１０Ｐ；Ｔ７７Ｄ−Ｓ８６Ｒ−Ｓ１５５Ｅ−Ｇ１６５Ａ−Ｎ１８４Ｑ；Ａ６８Ｓ−Ｖ７１Ａ−Ｔ７７Ｎ−Ａ１２８Ｓ−Ｇ１６５Ｑ−Ｔ２１０Ｐ−Ｎ２１７Ｓ；Ｖ２８Ａ−Ｉ３５Ａ−Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ａ１２８Ｓ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ｇ２０３Ｎ−Ｔ２１０Ｐ；Ａ１２８Ｐ−Ｔ２１０Ｐ；Ｔ２１０Ｐ−Ｓ２５８Ｐ；Ａ１２８Ｐ−Ｔ２１０Ｐ−Ｓ２５９Ｐ；Ａ１２８Ｐ−Ｓ１８７Ｐ−Ｔ２１０Ｐ；Ａ１２８Ｐ−Ｓ１８７Ｐ−Ｔ２１０Ｐ−Ｓ２５８Ｐ；Ｐ９Ｅ−Ｔ７７Ｓ−Ｖ８７Ｔ−Ｔ２１０Ｐ−Ｎ２３９Ｋ；Ｋ１５Ｉ−Ｌ９５Ｑ−Ｍ１２３Ｉ−Ｇ１６５Ｓ−Ｔ２１０Ｐ−Ｎ２１７Ｓ；Ｋ１５Ｉ−Ｍ１２３Ｉ−Ｖ１４６Ｓ−Ｇ１６５Ｓ−Ｔ２１０Ｐ−Ｎ２３９Ｓ；Ｋ１５Ｉ−Ｎ７６Ｋ−Ｍ１２３Ｉ−Ｖ１４６Ｓ−Ｇ１６５Ｓ
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８Ｐ−Ｇ１６５Ｑ−Ｔ２１０Ｐ−Ａ２４２Ｇ−Ｓ２５８Ｐ；Ｔ３Ｖ−Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ｔ７８Ｉ−Ｇ９９Ｓ−Ｍ１２３Ｉ−Ｇ１２７Ｓ−Ａ１２８Ｐ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ａ２０２Ｖ−Ｔ２１０Ｐ−Ｎ２１７Ｓ−Ａ２４２Ｇ−Ｓ２５８Ｄ；Ｉ３５Ａ−Ｍ１２３Ｉ−Ｇ１２７Ｔ−Ｔ２１０Ｐ−Ｓ２４３Ｉ；Ｔ３Ｖ−Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ｇ９９Ｓ−Ｍ１２３Ｉ−Ｇ１２７Ｓ−Ａ１２８Ｐ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ａ２０２Ｖ−Ｎ２１７Ｓ−Ｓ２５８Ｐ−Ｆ２６０Ｗ；Ｔ３Ｖ−Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ｔ７８Ｉ−Ｇ９９Ｓ−Ｇ１０１Ａ−Ｇ１２７Ｓ−Ａ１２８Ｐ−Ｇ１６５Ｑ−Ｔ２１０Ｐ−Ａ２４２Ｇ−Ｓ２５８Ｐ；Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ｇ９９Ｑ−Ａ１２８Ｐ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ｎ２１７Ｓ；Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ａ１２８Ｐ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ａ２０２Ｖ−Ｎ２１７Ｓ；Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ａ１２８Ｐ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ｎ２１７Ｓ−Ｓ２５８Ｄ；Ｔ３Ｖ−Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ｔ７８Ｉ−Ｇ９９Ｓ−Ｇ１０１Ａ−Ｍ１２３Ｉ−Ｇ１２７Ｓ−Ａ１２８Ｐ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ａ２０２Ｖ−Ｔ２１０Ｐ−Ｎ２１７Ｓ−Ａ２４２Ｇ−Ｓ２５８Ｐ；およびＶ４５Ｒ−Ｓ９８Ｒから選択される１種以上のアミノ酸置換セットを含む、アミノ酸配列を含む１種以上のスブチリシン変異体に関し、前記２つ、３つまたは４つ以上の置換の１つ以上は、人工の置換であるという条件が付され、前記変異体は、モチーフＡおよび／またはモチーフＢを含むＡｐｒＬ−Ｃｌａｄｅスブチリシン酵素に対して、少なくとも８５％であるが、１００％未満のアミノ酸配列同一性を有し、モチーフＡはモチーフ１、モチーフ２、モチーフ３およびモチーフ４から選択され、モチーフＢはモチーフ５、モチーフ６、モチーフ７、モチーフ８、モチーフ９、モチーフ１０、モチーフ１１、モチーフ１２、モチーフ１３およびモチーフ１４から選択され、変異体のアミノ酸位置は配列番号２のアミノ酸配列に対応して番号付けされている。
別の実施形態は、Ｍ１２３Ｉ−Ｑ１３６Ｒ；Ｐ９Ｅ−Ｍ１２３Ｉ；Ｖ４５Ｒ−Ｍ１２３Ｉ；Ｇ１２７Ｔ−Ｇ１６５Ｓ−Ｔ２１０Ｅ；Ｍ１２３Ｉ−Ｇ１６５Ｓ−Ｎ２３９Ｓ；Ｍ１２３Ｉ−Ｑ１３６Ｒ−Ｇ１６５Ｑ；Ｍ１２３Ｉ−Ｑ１３６Ｒ−Ｓ２５８Ｅ；Ｍ１２３Ｉ−Ｖ１４６Ｓ−Ｔ２１０Ｅ；Ｐ９Ｅ−Ｖ４５Ｒ−Ｍ１２３Ｉ；Ｑ１３６Ｒ−Ｇ１６５Ｑ−Ｓ２５８Ｅ；Ｖ４５Ｒ−Ｍ１２３Ｉ−Ｑ１３６Ｒ；Ｇ１２７Ｔ−Ｖ１４６Ｓ−Ｇ１６５Ｓ−Ｎ２３９Ｓ；Ｌ１０Ｍ−Ｋ２７Ｒ−Ｓ９８Ｈ−Ｍ１２３Ｉ；Ｍ１２３Ｉ−Ｑ１３６Ｒ−Ｇ１６５Ｑ−Ｓ２５８Ｅ；Ｍ１２３Ｉ−Ｖ１４６Ｓ−Ｇ１６５Ｓ−Ｔ２１０Ｐ；Ｍ１２３Ｉ−Ｖ１４６Ｓ−Ｔ２１０Ｐ−Ｓ２５０Ｇ；Ｐ９Ｅ−Ｍ１２３Ｉ−Ｑ１３６Ｒ−Ｇ１６５Ｑ；Ｐ９Ｅ−Ｑ１３６Ｒ−Ｇ１６５Ｑ−Ｓ２５８Ｅ；Ｐ９Ｅ−Ｖ４５Ｒ−Ｍ１２３Ｉ−Ｑ１３６Ｒ；Ｖ４５Ｒ−Ｍ１２３Ｉ−Ｑ１３６Ｒ−Ｇ１６５Ｑ；Ｖ４５Ｒ−Ｍ１２３Ｉ−Ｑ１３６Ｒ−Ｓ２５８Ｅ；Ｖ４５Ｒ−Ｑ１３６Ｒ−Ｇ１６５Ｑ−Ｓ２５８Ｅ；Ｋ２７Ｒ−Ｎ４３Ａ−Ｓ９８Ｈ−Ｍ１２３Ｉ−Ｔ２１０Ｈ；Ｐ９Ｅ−Ｍ１２３Ｉ−Ｑ１３６Ｒ−Ｇ１６５Ｑ−Ｓ２５８Ｅ；Ｐ９Ｅ−Ｖ４５Ｒ−Ｍ１２３Ｉ−Ｑ１３６Ｒ−Ｇ１６５Ｑ；Ｐ９Ｅ−Ｖ４５Ｒ−Ｍ１２３Ｉ−Ｑ１３６Ｒ−Ｓ２５８Ｅ；Ｖ４５Ｒ−Ｍ１２３Ｉ−Ｑ１３６Ｒ−Ｇ１６５Ｑ−Ｓ２５８Ｅ；Ｙ１０３Ｉ−Ｇ１２７Ｔ−Ｖ１４６Ｓ−Ｇ１６５Ｓ−Ｎ２３９Ｓ；Ｔ７７Ｈ−Ｖ８７Ｔ−Ｍ１２３Ｉ−Ｑ１３６Ｒ−Ｎ１８４Ｑ−Ｎ２３９Ｓ；Ｖ２６Ｒ−Ｖ４５Ｒ−Ｓ９８Ｒ−Ｅ１１１Ｑ−Ｍ１２３Ｉ−Ｑ１３６Ｒ；Ｔ７７Ｈ−Ｖ８７Ｔ−Ｍ１２３Ｉ−Ｑ１３６Ｒ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ｎ２３９Ｓ；Ｔ７７Ｓ−Ｖ８７Ｓ−Ｍ１２３Ｉ−Ｑ１３６Ｒ−Ｇ１６５Ｑ−Ｓ１８７Ｐ−Ｓ２５８Ｐ；Ｔ７７Ｓ−Ｖ８７Ｓ−Ｍ１２３Ｉ−Ｑ１３６Ｒ−Ｎ１６０Ｃ−Ｓ１８７Ｐ−Ｓ２５８Ｐ；Ｔ７７Ｈ−Ｖ８７Ｔ−Ｍ１２３Ｉ−Ｑ１３６Ｒ−Ｎ１８４Ｑ−Ｓ１８７Ｐ−Ｎ２３９Ｓ−Ｓ２５８Ｐ；Ｔ３Ｑ−Ｋ２２Ｙ−Ａ２４Ｎ−Ｖ４５Ｉ−Ａ４８Ｉ−Ｔ７７Ｎ−Ｎ２１７Ｓ−Ｌ２３４Ｉ−Ｙ２５５Ｒ；Ｐ９Ｅ−Ｔ７７Ｑ−Ｖ８７Ｔ−Ｍ１２３Ｉ−Ｑ１３６Ｒ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ｎ２１７Ｓ−Ｎ２３９Ｓ−Ｓ２５８Ｅ；Ｎ４３Ａ−Ｖ４５Ｒ−Ｔ７７Ｈ−Ｖ８７Ｔ−Ｍ１２３Ｉ−Ｑ１３６Ｒ−Ｇ１６５Ａ−Ｎ１８４Ｑ−Ｓ１８７Ｐ−Ｎ２３９Ｓ−Ｓ２５８Ｐ；Ｐ９Ｅ−Ｎ４３Ａ−Ｖ４５Ｒ−Ｔ７７Ｓ−Ｖ８７Ｓ−Ｍ１２３Ｉ−Ｑ１３６Ｒ−Ｇ１６５Ｑ−Ｓ１８７Ｐ−Ｎ２１７Ｓ−Ｓ２５８Ｐ；Ｐ９Ｅ−Ｎ４３Ａ−Ｖ４５Ｒ−Ｔ７７Ｈ−Ｖ８７Ｔ−Ｍ１２３Ｉ−Ｑ１３６Ｒ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ｓ１８７Ｐ−Ｎ２３９Ｓ−Ｓ
２５８Ｐ；Ｐ９Ｅ−Ｎ４３Ａ−Ｖ４５Ｒ−Ｔ７７Ｑ−Ｖ８７Ｔ−Ｍ１２３Ｉ−Ｑ１３６Ｒ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ｎ２１７Ｓ−Ｎ２３９Ｓ−Ｓ２５８Ｅ；Ｐ９Ｅ−Ｎ４３Ａ−Ｖ４５Ｒ−Ｔ７７Ｈ−Ｖ８７Ｔ−Ｍ１２３Ｉ−Ｑ１３６Ｒ−Ｇ１６５Ａ−Ｎ１８４Ｑ−Ｓ１８７Ｐ−Ｎ２１７Ｓ−Ｎ２３９Ｓ−Ｓ２５８Ｅ；Ｔ７７Ｎ−Ｎ２１７Ｓ−Ｌ２３４Ｗ；Ｔ７７Ｎ−Ｎ２１７Ｓ，Ｔ７７Ｎ−Ｇ１２６Ｑ−Ｇ１６５Ｑ−Ｔ２１０Ｐ−Ｎ２１７Ｓ−Ｌ２３４Ｗ−Ｓ２５８Ｐ，Ｔ７７Ｎ−Ｇ１２７Ｆ−Ｇ１６５Ｑ−Ａ２０２Ｖ−Ｔ２１０Ｐ−Ｎ２１７Ｓ−Ｌ２３４Ｗ−Ｓ２５８Ｐ；Ａ１Ｑ−Ｔ３Ｖ−Ｖ２８Ａ−Ｉ３５Ａ−Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ｓ８６Ｈ−Ｔ１１５Ｆ−Ｎ２１７Ｓ−Ｎ２３９Ｓ−Ｓ２５０Ｇ−Ｓ２５８Ｐ−Ｑ２７４Ａ；Ｔ７７Ｎ−Ｍ１２３Ｉ−Ｔ２１０Ｐ−Ｎ２３９Ｓ−Ｓ２５０Ｇ−Ｓ２５８Ｐ；Ｖ４５Ｉ−Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ｍ１２３Ｉ−Ｌ１２５Ｎ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ２１７Ｓ−Ｓ２５８Ｐ；Ａ６８Ｓ−Ｖ７１Ａ−Ｔ７７Ｎ−Ｌ９５Ａ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ｔ２１０Ｐ−Ｓ２５８Ｐ；Ｍ１２３Ｉ−Ｔ２１０Ｐ−Ｎ２１７Ｓ−Ｓ２５８Ｐ；Ｇ１２７Ｆ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ２１７Ｓ−Ｓ２５８Ｐ；Ｔ７７Ｎ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ２１７Ｓ−Ｓ２５８Ｐ；Ｔ７７Ｓ−Ｇ１６５Ａ−Ｎ１８４Ｑ−Ｔ２１０Ｐ−Ｎ２１７Ｓ；Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ａ１２８Ｐ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ｎ２１７Ｓ；Ｖ７１Ａ−Ｔ７７Ｓ−Ｎ１８４Ｑ−Ｓ２５８Ｐ；Ｔ７７Ｎ−Ｍ１２３Ｉ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ｎ２１７Ｓ；Ｖ７１Ａ−Ｌ９５Ａ−Ａ１２８Ｓ−Ｔ２１０Ｐ；Ｖ７１Ａ−Ｍ１２３Ｉ−Ａ１２８Ｓ−Ｔ２１０Ｐ；Ｖ７１Ａ−Ｍ１２３Ｉ−Ａ１２８Ｓ−Ｇ１６５Ｅ；Ｔ７７Ｓ−Ａ１２８Ｐ−Ｎ１８４Ｑ−Ｎ２１７Ｓ−Ｆ２６０Ｗ；Ｔ７７Ｈ−Ａ１２８Ｓ−Ｇ１６５Ｑ−Ｔ２１０Ｐ；Ｔ７７Ｄ−Ｓ８６Ｒ−Ｓ１５５Ｅ−Ｇ１６５Ａ−Ｎ１８４Ｑ；Ａ６８Ｓ−Ｖ７１Ａ−Ｔ７７Ｎ−Ａ１２８Ｓ−Ｇ１６５Ｑ−Ｔ２１０Ｐ−Ｎ２１７Ｓ；Ｖ２８Ａ−Ｉ３５Ａ−Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ａ１２８Ｓ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ｇ２０３Ｎ−Ｔ２１０Ｐ；Ａ１２８Ｐ−Ｔ２１０Ｐ；Ｔ２１０Ｐ−Ｓ２５８Ｐ；Ａ１２８Ｐ−Ｔ２１０Ｐ−Ｓ２５９Ｐ；Ａ１２８Ｐ−Ｓ１８７Ｐ−Ｔ２１０Ｐ；Ａ１２８Ｐ−Ｓ１８７Ｐ−Ｔ２１０Ｐ−Ｓ２５８Ｐ；Ｐ９Ｅ−Ｔ７７Ｓ−Ｖ８７Ｔ−Ｔ２１０Ｐ−Ｎ２３９Ｋ；Ｋ１５Ｉ−Ｌ９５Ｑ−Ｍ１２３Ｉ−Ｇ１６５Ｓ−Ｔ２１０Ｐ−Ｎ２１７Ｓ；Ｋ１５Ｉ−Ｍ１２３Ｉ−Ｖ１４６Ｓ−Ｇ１６５Ｓ−Ｔ２１０Ｐ−Ｎ２３９Ｓ；Ｋ１５Ｉ−Ｎ７６Ｋ−Ｍ１２３Ｉ−Ｖ１４６Ｓ−Ｇ１６５Ｓ−Ｔ２１０Ｐ−Ｎ２３９Ｓ；Ｋ１５Ｉ−Ｖ１４６Ｓ−Ｇ１６５Ｓ−Ｔ２１０Ｐ−Ｎ２３９Ｓ；Ｐ００９Ｅ−Ｖ１４６Ｓ−Ｎ１８４Ｑ−Ｇ２０３Ｅ−Ｔ２１０Ｐ−Ｐ２３８Ｒ−Ｎ２３９Ｓ；Ｍ１２３Ｉ−Ｇ１６５Ｓ−Ｎ２１７Ｓ；Ｋ１５Ｉ−Ｌ９５Ｑ−Ｓ１０８Ｋ−Ｇ１６５Ｓ−Ｇ２０３Ｅ−Ｔ２１０Ｐ−Ｎ２１７Ｓ；Ｋ１５Ｉ−Ｌ９５Ｑ−Ｓ１０８Ｋ−Ｇ１６５Ｓ−Ｇ２０３Ｅ−Ｔ２１０Ｐ；Ｐ９Ｅ−Ｋ１５Ｉ−Ｇ１６５Ｓ−Ａ１９３Ｄ−Ｇ２０３Ｅ−Ｔ２１０Ｐ；Ｔ７７Ｎ−Ｍ１２３Ｉ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ２１７Ｓ；Ｔ７７Ｈ−Ｇ１６５Ｑ；Ｔ７７Ｎ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ２１７Ｓ；Ａ６８Ｓ−Ｖ７１Ａ−Ｔ７７Ｎ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ２１７Ｓ；Ｔ７７Ｎ−Ｖ８７Ｓ−Ｍ１２３Ｉ−Ｓ１５５Ｇ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ２１７Ｓ；Ｔ７７Ｈ−Ｖ８７Ｓ−Ｓ１５５Ｇ−Ｇ１６５Ｑ；Ｔ７７Ｎ−Ｖ８７Ｓ−Ｓ１５５Ｇ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ２１７Ｓ；Ｔ７７Ｎ−Ｍ１２３Ｉ−Ｇ１６５Ｑ；Ｔ７７Ｎ−Ｇ１６５Ｑ；Ａ６８Ｓ−Ｖ７１Ａ−Ｔ７７Ｎ−Ｇ１６５Ｑ；Ｔ７７Ｎ−Ｖ８７Ｓ−Ｍ１２３Ｉ−Ｓ１５５Ｇ−Ｇ１６５Ｑ；Ｉ３５Ａ−Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ｖ８７Ｓ−Ｖ１４７Ｌ−Ｇ１６５Ｑ；Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ｖ８７Ｓ−Ｖ１４７Ｌ−Ｓ１５５Ｅ−Ｇ１６５Ｑ；Ｔ７７Ｎ−Ｖ８７Ｓ−Ｍ１２３Ｉ−Ｖ１４７Ｌ−Ｓ１５５Ｇ−Ｇ１６５Ｑ；Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ｍ１２３Ｉ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ｎ２１７Ｓ；Ｔ７７Ｎ−Ｍ１２３Ｉ−Ａ１２８Ｐ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ｎ２１７Ｓ；Ａ６８Ｓ−Ｖ７１Ａ−Ｔ７７Ｎ−Ｓ１００Ｎ−Ａ１２８Ｐ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ｔ２１０Ｐ−Ｎ２１７Ｓ−Ｎ２３９Ｔ；Ｔ７７Ｎ−Ａ１２８Ｐ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ｎ２１７Ｓ；Ａ６８Ｓ−Ａ１２８Ｐ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ｎ２１７Ｓ；Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ｎ２１７Ｓ；Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ａ１２８Ｐ−Ｎ１８４Ｑ−Ｎ２１７Ｓ；Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ａ１２８Ｐ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ２１７Ｓ；Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ａ１２８Ｐ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ；Ｍ１２３Ｉ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ｎ２１７Ｓ；Ｔ７７Ｎ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ｎ２１７Ｓ；Ｔ７７Ｎ−Ｍ１２３Ｉ−Ｎ１８４Ｑ−Ｎ２１７Ｓ；Ｔ７７Ｎ−Ｍ１
２３Ｉ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ；Ｔ３Ｖ−Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ａ１２８Ｐ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ｎ２１７Ｓ；Ｔ３Ｖ−Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ｍ１２３Ｉ−Ａ１２８Ｐ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ｎ２１７Ｓ；Ｔ３Ｖ−Ｔ７７Ｎ−Ｍ１２３Ｉ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ｎ２１７Ｓ；Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ｓ１０８Ｈ−Ａ１２８Ｐ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ｎ２１７Ｓ；Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ｇ９９Ｓ−Ａ１２８Ｐ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ｎ２１７Ｓ；Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ｔ１１４Ｎ−Ａ１２８Ｐ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ｎ２１７Ｓ；Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ｍ１２３Ｉ−Ａ１２８Ｐ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ｎ２１７Ｓ；Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ｇ１２７Ｔ−Ａ１２８Ｐ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ｎ２１７Ｓ；Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ａ１２８Ｐ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ｔ２１０Ｐ−Ｎ２１７Ｓ；Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ｇ９９Ｓ−Ｍ１２３Ｉ−Ａ１２８Ｐ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ｎ２１７Ｓ；Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ｇ９９Ｓ−Ｇ１２７Ｔ−Ａ１２８Ｐ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ｎ２１７Ｓ；Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ｇ９９Ｓ−Ａ１２８Ｐ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ｔ２１０Ｐ−Ｎ２１７Ｓ；Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ｔ１１４Ｎ−Ｍ１２３Ｉ−Ａ１２８Ｐ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ｎ２１７Ｓ；Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ｔ１１４Ｎ−Ｇ１２７Ｔ−Ａ１２８Ｐ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ｎ２１７Ｓ；Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ｔ１１４Ｎ−Ａ１２８Ｐ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ｔ２１０Ｐ−Ｎ２１７Ｓ；Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ｍ１２３Ｉ−Ｇ１２７Ｔ−Ａ１２８Ｐ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ｎ２１７Ｓ；Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ｍ１２３Ｉ−Ａ１２８Ｐ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ｔ２１０Ｐ−Ｎ２１７Ｓ；Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ｇ１２７Ｔ−Ａ１２８Ｐ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ｔ２１０Ｐ−Ｎ２１７Ｓ；Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ｇ９９Ｓ−Ｍ１２３Ｉ−Ａ１２８Ｐ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ｔ２１０Ｐ−Ｎ２１７Ｓ；Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ｍ１２３Ｉ−Ｇ１２７Ｔ−Ａ１２８Ｐ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ｔ２１０Ｐ−Ｎ２１７Ｓ；Ｔ３Ｖ−Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ｇ９９Ｓ−Ｍ１２３Ｉ−Ａ１２８Ｐ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ｎ２１７Ｓ；Ｔ３Ｖ−Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ｔ１１４Ｎ−Ｍ１２３Ｉ−Ａ１２８Ｐ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ｎ２１７Ｓ；Ｔ３Ｖ−Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ｍ１２３Ｉ−Ｇ１２７Ｔ−Ａ１２８Ｐ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ｎ２１７Ｓ；Ｔ３Ｖ−Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ｍ１２３Ｉ−Ａ１２８Ｐ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ｔ２１０Ｐ−Ｎ２１７Ｓ；Ｓ８６Ｈ−Ｔ１１５Ｆ−Ａ１４３Ｖ−Ｇ１６５Ｑ−Ａ２０２Ｖ−Ｓ２５８Ｐ；Ｓ８６Ｈ−Ｌ９５Ａ−Ｎ１８４Ｑ−Ａ２０２Ｖ−Ｔ２１０Ｐ−Ｎ２１７Ｓ−Ｌ２３４Ｗ−Ｓ２５０Ｇ−Ｓ２５８Ｐ；Ｖ３０Ｔ−Ｉ３５Ａ−Ｔ７７Ｎ−Ｇ１６５Ｑ−Ａ２０２Ｖ−Ｔ２１０Ｐ−Ｓ２５０Ｇ−Ｓ２５８Ｐ；Ａ１Ｑ−Ｔ３Ｖ−Ｉ３５Ａ−Ｔ７７Ｎ−Ｔ７８Ｉ−Ｓ８６Ｈ−Ｔ１１５Ｆ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ｎ２１７Ｓ−Ｌ２３４Ｗ−Ｓ２５８Ｐ；Ａ１Ｑ−Ａ３７Ｔ−Ｔ７７Ｎ−Ｔ７８Ｉ−Ｓ８６Ｈ−Ｍ１２３Ｉ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ａ２０２Ｖ−Ｎ２３９Ｓ−Ｓ２５０Ｇ−Ｓ２５８Ｐ−Ｑ２７４Ａ；Ｐ９Ｅ−Ｔ７７Ｎ−Ｎ９６Ｓ−Ｇ１６５Ｑ−Ｇ２０３Ｅ−Ｓ２５０Ｇ；Ｐ９Ｅ−Ｔ７７Ｎ−Ｎ９６Ｓ−Ｇ１６５Ｅ−Ｇ２０３Ｅ−Ｔ２１０Ｐ−Ｓ２５０Ｇ；Ａ１Ｑ−Ｔ３Ｖ−Ｓ８６Ｈ−Ｇ１３０Ｓ−Ｓ１５５Ｇ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ａ２０２Ｖ−Ｇ２０３Ｎ−Ｔ２１０Ｐ−Ｑ２７４Ａ；Ａ１Ｑ−Ｔ３Ｖ−Ｓ８６Ｈ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ｎ２３９Ｓ−Ｓ２５０Ｇ−Ｓ２５８Ｐ；Ａ１Ｑ−Ｔ７７Ｎ−Ｓ８６Ｈ−Ｖ１４７Ｌ−Ａ１５１Ｇ−Ｎ１８４Ｑ−Ｎ２１７Ｓ−Ｓ２５８Ｐ；Ｓ８６Ｈ−Ｔ１１５Ｆ−Ｓ１５５Ｇ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ａ２０２Ｖ−Ｑ２７４Ａ；Ａ６８Ｓ−Ｓ８６Ｈ−Ｔ１１５Ｆ−Ｎ１８４Ｑ−Ａ２０２Ｖ−Ｇ２０３Ｎ−Ｎ２３９Ｓ−Ｓ２５０Ｇ−Ｓ２５８Ｐ−Ｑ２７４Ａ；Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ｖ８７Ｓ−Ａ１２８Ｐ−Ｓ１５５Ｇ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ２１７Ｓ；Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ａ１２８Ｐ−Ｇ１６５Ｑ；Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ｖ８７Ｓ−Ａ１２８Ｐ−Ｓ１５５Ｇ−Ｇ１６５Ｑ；Ｉ３５Ａ−Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ｖ８７Ｓ−Ａ１２８Ｐ−Ｖ１４７Ｌ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ２１７Ｓ；Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ｖ８７Ｓ−Ａ１２８Ｐ−Ｓ１５５Ｇ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ２１７Ｓ−Ａ２４２Ｇ；Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ｖ８７Ｓ−Ａ１２８Ｐ−Ｖ１４７Ｌ−Ｓ１５５Ｅ−Ｇ１６５Ｑ；Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ｖ８７Ｓ−Ａ１２８Ｐ−Ｓ１５５Ｅ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ２１７Ｓ；Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ｓ８６Ｎ−Ｖ８７Ｓ−Ａ１２８Ｐ−Ｓ１５５Ｇ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ２１７Ｓ−Ａ２４２Ｇ；Ｉ３５Ａ−Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ａ１２８Ｐ−
Ｖ１４７Ｌ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ２１７Ｓ；Ｉ３５Ａ−Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ａ１２８Ｐ−Ｓ１５５Ｇ−Ｇ１６５Ｑ−Ａ２４２Ｇ；Ｉ３５Ａ−Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ａ１２８Ｐ−Ｖ１４７Ｌ−Ｇ１６５Ｑ−Ａ２４２Ｇ；Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ｖ８７Ｓ−Ａ１２８Ｐ−Ｓ１５５Ｇ−Ｇ１６５Ｑ−Ａ２４２Ｇ；Ａ０６８Ｓ−Ｔ０７７Ｎ−Ｎ０８６Ｓ−Ｇ１６５Ｑ−Ｋ１９４Ｅ−Ｓ２１１Ｎ−Ｎ２１７Ｓ；Ａ０６８Ｓ−Ｔ０７７Ｎ−Ｎ０８６Ｓ−Ｖ０８７Ｓ−Ｓ１５５Ｇ−Ｇ１６５Ｑ−Ｋ１９４Ｅ−Ｓ２１１Ｎ−Ｎ２１７Ｓ；Ａ０６８Ｓ−Ｔ０７７Ｎ−Ｎ０８６Ｓ−Ｇ１６５Ｑ−Ｋ１９４Ｅ−Ｓ２１１Ｎ；Ａ０６８Ｓ−Ｔ０７７Ｎ−Ｎ０８６Ｓ−Ｖ０８７Ｓ−Ｓ１５５Ｇ−Ｇ１６５Ｑ−Ｋ１９４Ｅ−Ｓ２１１Ｎ；Ｉ０３５Ａ−Ａ０６８Ｓ−Ｔ０７７Ｎ−Ｎ０８６Ｓ−Ｖ０８７Ｓ−Ｖ１４７Ｌ−Ｇ１６５Ｑ−Ｋ１９４Ｅ−Ｓ２１１Ｎ−Ｎ２１７Ｓ；Ａ０６８Ｓ−Ｔ０７７Ｎ−Ｎ０８６Ｓ−Ｖ０８７Ｓ−Ｓ１５５Ｇ−Ｇ１６５Ｑ−Ｋ１９４Ｅ−Ｓ２１１Ｎ−Ｎ２１７Ｓ−Ａ２４２Ｇ；Ａ０６８Ｓ−Ｔ０７７Ｎ−Ｎ０８６Ｓ−Ｖ０８７Ｓ−Ｖ１４７Ｌ−Ｓ１５５Ｅ−Ｇ１６５Ｑ−Ｋ１９４Ｅ−Ｓ２１１Ｎ；Ａ０６８Ｓ−Ｔ０７７Ｎ−Ｎ０８６Ｓ−Ｖ０８７Ｓ−Ｓ１５５Ｅ−Ｇ１６５Ｑ−Ｋ１９４Ｅ−Ｓ２１１Ｎ−Ｎ２１７Ｓ；Ａ０６８Ｓ−Ｔ０７７Ｎ−Ｖ０８７Ｓ−Ｓ１５５Ｇ−Ｇ１６５Ｑ−Ｋ１９４Ｅ−Ｓ２１１Ｎ−Ｎ２１７Ｓ−Ａ２４２Ｇ；Ｉ０３５Ａ−Ａ０６８Ｓ−Ｔ０７７Ｎ−Ｎ０８６Ｓ−Ｖ１４７Ｌ−Ｇ１６５Ｑ−Ｋ１９４Ｅ−Ｓ２１１Ｎ−Ｎ２１７Ｓ；Ｉ０３５Ａ−Ａ０６８Ｓ−Ｔ０７７Ｎ−Ｎ０８６Ｓ−Ｓ１５５Ｇ−Ｇ１６５Ｑ−Ｋ１９４Ｅ−Ｓ２１１Ｎ−Ａ２４２Ｇ；０Ｉ３５Ａ−Ａ０６８Ｓ−Ｔ０７７Ｎ−Ｎ０８６Ｓ−Ｖ１４７Ｌ−Ｇ１６５Ｑ−Ｋ１９４Ｅ−Ｓ２１１Ｎ−Ａ２４２Ｇ；およびＡ０６８Ｓ−Ｔ０７７Ｎ−Ｎ０８６Ｓ−Ｖ０８７Ｓ−Ｓ１５５Ｇ−Ｇ１６５Ｑ−Ｋ１９４Ｅ−Ｓ２１１Ｎ−Ａ２４２Ｇから選択される１種以上のアミノ酸置換セットを含む、アミノ酸配列を含む１種以上のスブチリシン変異体を提供し、前記２つ、３つまたは４つ以上の変異の１つ以上は、天然には存在しないアミノ酸であるという条件が付され、前記変異体は、モチーフＡおよび／またはモチーフＢを含むＡｐｒＬ−Ｃｌａｄｅスブチリシン酵素に対して、少なくとも８５％以上のアミノ酸配列同一性を有し、モチーフＡはモチーフ１、モチーフ２、モチーフ３およびモチーフ４から選択され、モチーフＢはモチーフ５、モチーフ６、モチーフ７、モチーフ８、モチーフ９、モチーフ１０、モチーフ１１、モチーフ１２、モチーフ１３およびモチーフ１４から選択され、変異体のアミノ酸位置は配列番号２のアミノ酸配列に対応して番号付けされている。
なおまたさらなる実施形態は、Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ｇ１２７Ｔ−Ａ１２８Ｐ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ａ２０２Ｖ−Ｎ２１７Ｓ；Ｔ３Ｖ−Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ｍ１２３Ｉ−Ａ１２８Ｐ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ａ２０２Ｖ−Ｎ２１７Ｓ；Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ｇ１２７Ｔ−Ａ１２８Ｐ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ｎ２１７Ｓ−Ｓ２５８Ｐ；Ｔ３Ｖ−Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ｍ１２３Ｉ−Ａ１２８Ｐ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ｎ２１７Ｓ−Ｓ２５８Ｐ；Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ｇ１２７Ｔ−Ａ１２８Ｐ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ｇ２０３Ｑ−Ｎ２１７Ｓ；Ｔ３Ｖ−Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ｍ１２３Ｉ−Ａ１２８Ｐ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ｇ２０３Ｑ−Ｎ２１７Ｓ；Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ａ１２８Ｐ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ａ２０２Ｖ−Ｎ２１７Ｓ−Ｓ２５８Ｐ；Ｔ３Ｖ−Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ｍ１２３Ｉ−Ａ１２８Ｐ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ａ２０２Ｖ−Ｎ２１７Ｓ−Ｓ２５８Ｐ；Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ａ１２８Ｐ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ｇ２０３Ｑ−Ｎ２１７Ｓ−Ｓ２５８Ｐ；Ｔ３Ｖ−Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ｍ１２３Ｉ−Ａ１２８Ｐ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ｇ２０３Ｑ−Ｎ２１７Ｓ−Ｓ２５８Ｐ；Ｓ８６Ｈ−Ｔ１１５Ｆ−Ｇ１２７Ｔ−Ａ１４３Ｖ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ａ２０２Ｖ−Ｎ２１７Ｓ−Ｓ２５８Ｐ；Ｔ３Ｖ−Ｓ８６Ｈ−Ｔ１１５Ｆ−Ｍ１２３Ｉ−Ａ１４３Ｖ−Ｇ１６５Ｑ−Ａ２０２Ｖ−Ｎ２１７Ｓ−Ｓ２５８Ｐ；Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ａ１２８Ｐ−Ｓ１２９Ｈ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ａ２０２Ｖ−Ｎ２１７Ｓ；Ｔ３Ｖ−Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ｍ１２３Ｉ−Ａ１２８Ｐ−Ｓ１２９Ｈ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ａ２０２Ｖ−Ｎ２１７Ｓ；Ｓ８６Ｈ−Ｔ１１５Ｆ−Ｓ１２９Ｈ−Ａ１４３Ｖ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ａ２０２Ｖ−Ｎ２１７Ｓ−Ｓ２５８Ｐ；Ｔ３Ｖ−Ｓ８６Ｈ−Ｔ１１５Ｆ−Ｍ１２３Ｉ−Ｓ１２９Ｈ−Ａ１４３Ｖ−Ｇ１６５Ｑ−Ａ２０２Ｖ−Ｎ２１７Ｓ−Ｓ２５８Ｐ；Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ａ１２８Ｐ−Ｓ１５５Ｎ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ａ２０２Ｖ−Ｎ２１７Ｓ；Ｔ３Ｖ−Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ｍ１２３Ｉ−Ａ１２８Ｐ−Ｓ１５５Ｎ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ａ２０２Ｖ−Ｎ２１７Ｓ；Ｉ３５Ａ−Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ｖ８７Ｓ−Ａ１２８Ｐ−Ｖ１４７Ｌ−Ｇ１６５Ｑ−Ａ２０２Ｖ−Ｎ２１７Ｓ；Ｔ３Ｖ−Ｉ３５Ａ−Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ｖ８７Ｓ−Ｍ１２３Ｉ−Ａ１２８Ｐ−Ｖ１４７Ｌ−Ｇ１６５Ｑ−Ａ２０２Ｖ−Ｎ２１７Ｓ；Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ａ１２８Ｐ−Ｑ１３６Ｎ−Ｓ１５５Ｎ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ｎ２１７Ｓ−Ａ２４２Ｎ；Ｔ３Ｖ−Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ｍ１２３Ｉ−Ａ１２８Ｐ−Ｑ１３６Ｎ−Ｓ１５５Ｎ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ｎ２１７Ｓ−Ａ２４２Ｎ；Ａ６８Ｓ−Ｖ７１Ａ−Ｔ７７Ｎ−Ａ１２８Ｐ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ａ２０２Ｖ−Ｎ２１７Ｓ；Ｔ３Ｖ−Ａ６８Ｓ−Ｖ７１Ａ−Ｔ７７Ｎ−Ｍ１２３Ｉ−Ａ１２８Ｐ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ａ２０２Ｖ−Ｎ２１７Ｓ；Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ａ１２８Ｐ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ｓ１８７Ｐ−Ａ２０２Ｖ−Ｎ２１７Ｓ；Ｔ３Ｖ−Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ｍ１２３Ｉ−Ａ１２８Ｐ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ｓ１８７Ｐ−Ａ２０２Ｖ−Ｎ２１７Ｓ；Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ａ１２８Ｒ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ａ２０２Ｖ−Ｎ２１７Ｓ−Ｓ２５８Ｄ；Ｔ３Ｖ−Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ｍ１２３Ｉ−Ａ１２８Ｒ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ａ２０２Ｖ−Ｎ２１７Ｓ−Ｓ２５８Ｄ；Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ａ１２８Ｐ−Ｓ１２９Ｒ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ｎ２１７Ｓ−Ｓ２５８Ｄ；Ｔ３Ｖ−Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ｍ１２３Ｉ−Ａ１２８Ｐ−Ｓ１２９Ｒ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ｎ２１７Ｓ−Ｓ２５８Ｄ；Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ａ１２８Ｒ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ａ２０２Ｖ−Ｎ２１７Ｓ−Ｓ２５８Ｄ−Ｋ２６４Ｈ；Ｔ３Ｖ−Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ｍ１２３Ｉ−Ａ１２８Ｒ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ａ２０２Ｖ−Ｎ２１７Ｓ−Ｓ２５８Ｄ−Ｋ２６４Ｈ；Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ａ１２８Ｒ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ｇ２０３Ｅ−Ｓ２５８Ｄ；Ｔ３Ｖ−Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ｍ１２３Ｉ−Ａ１２８Ｒ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ｇ２０３Ｅ−Ｓ２５８Ｄ；Ｔ３Ｖ−Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ｍ１２３Ｉ−Ａ１２８Ｒ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｅ−Ａ２０２Ｖ−Ｎ２１７Ｓ−Ｓ２５８Ｄ；Ｔ３Ｖ−Ａ５２Ｒ−Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ｍ１２３Ｉ−Ａ１２８Ｒ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｅ−Ａ２０２Ｖ−Ｎ２１７Ｓ−Ｓ２５８Ｄ；Ｔ３Ｖ−Ｔ７７Ｎ−Ｓ１００Ｎ−Ｇ１０５Ｎ−Ｄ１１９Ｑ−Ａ１２８Ｐ−Ｓ１５８Ｎ−Ｎ１６０Ｄ−Ｔ１６１Ｑ−Ｇ１６５Ａ−Ｎ１８４Ｑ−Ｎ２１７Ｓ−Ｓ２５８Ｐ−Ｋ２６４Ｓ；Ｔ３Ｖ−Ｔ７７Ｎ−Ｓ１００Ｎ−Ｇ１０５Ｎ−Ａ１２８Ｐ−Ｓ１５８Ｄ−Ｔ１６１Ｑ−Ｇ１６５Ａ−Ｎ１８４Ｑ−Ｎ２１７Ｓ−Ｓ２５８Ｐ；Ｔ３Ｖ−Ｔ７７Ｎ−Ｓ１００Ｎ−Ｇ１０５Ｎ−Ａ１２８Ｐ−Ｓ１５８Ｎ−Ｎ１６０Ｄ−Ｔ１６１Ｑ−Ｇ１６５Ａ−Ｎ１８４Ｑ−Ｎ２１７Ｓ−Ｓ２５８Ｐ；Ａ２４Ｑ−Ｖ４５Ｉ−Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ｓ９８Ｒ−Ｅ１１１Ｑ−Ｍ１２３Ｉ−Ｓ１５８Ｑ−Ｇ１６５Ｅ−Ｎ１８４Ｑ−Ｓ１８７Ｅ−Ｖ２０４Ｉ−Ｔ２１０Ｉ−Ｎ２１７Ｓ−Ｓ２５９Ｅ；Ｐ９Ｅ−Ａ５２Ｒ−Ｓ８６Ｒ−Ｅ１１１Ｑ−Ｓ１２９Ｒ−Ｓ１５８Ｑ−Ｇ１６５Ｅ−Ｖ２０４Ｉ−Ｔ２１０Ｉ−Ｓ２５８Ｄ−Ｓ２５９Ｅ−Ｋ２６４Ｑ；Ｔ３Ｖ−Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ｇ１２７Ｔ−Ａ１２８Ｐ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ａ２０２Ｖ−Ｎ２１７Ｓ；Ｔ３Ｖ−Ｉ３５Ａ−Ｔ７７Ｎ−Ｖ８７Ｓ−Ｍ１２３Ｉ−Ａ１２８Ｐ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ａ２０２Ｖ−Ｎ２１７Ｓ−Ａ２４２Ｇ；Ｔ３Ｖ−Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ｇ１２７Ｅ−Ａ１２８Ｐ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ａ２０２Ｖ−Ｎ２１７Ｓ；Ｔ３Ｖ−Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ｍ１２３Ｉ−Ｇ１２７Ｖ−Ａ１２８Ｐ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ｎ２１７Ｓ；Ｔ３Ｖ−Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ｍ１２３Ｉ−Ａ１２８Ｐ−Ａ１５１Ｇ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ｎ２１７Ｓ；Ｔ３Ｖ−Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ｇ１２７Ｔ−Ａ１２８Ｐ−Ａ１５１Ｇ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ｎ２１７Ｓ；Ｔ３Ｖ−Ｔ７７Ｎ−Ｍ１２３Ｉ−Ａ１２８Ｐ−Ａ１５１Ｇ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ａ２０２Ｖ−Ｎ２１７Ｓ；Ｔ３Ｖ−Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ｌ９５Ｆ−Ａ１２８Ｐ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ａ２０２Ｖ−Ｎ２１７Ｓ；Ｔ３Ｖ−Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ｌ９５Ａ−Ｍ１２３Ｉ−Ａ１２８Ｐ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ｎ２１７Ｓ；Ｔ３Ｖ−Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ｌ９５Ｆ−Ｍ１２３Ｉ−Ａ１２８Ｐ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ｎ２１７Ｓ；Ｔ３Ｖ−Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ｇ９９Ａ−Ａ１２８Ｐ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ａ２０２Ｖ−Ｎ２１７Ｓ；
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１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ａ２０２Ｖ−Ｎ２１７Ｓ−Ｓ２５８Ｐ；Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ｍ１２３Ｉ−Ｇ１２７Ｓ−Ａ１２８Ｐ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ａ２０２Ｖ−Ｎ２１７Ｓ；Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ｍ１２３Ｉ−Ａ１２８Ｐ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ａ２０２Ｖ−Ｎ２１７Ｓ−Ｓ２５８Ｐ；Ｔ３Ｖ−Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ｇ９９Ｑ−Ｇ１２７Ｓ−Ａ１２８Ｐ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ａ２０２Ｖ−Ｎ２１７Ｓ−Ｓ２５８Ｐ；Ｔ３Ｖ−Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ｔ７８Ｉ−Ｖ８７Ｓ−Ｍ１２３Ｉ−Ｇ１２７Ｓ−Ａ１２８Ｐ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ａ２０２Ｖ−Ｔ２１０Ｐ−Ｎ２１７Ｓ−Ｓ２５８Ｐ；Ｔ３Ｖ−Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ｔ７８Ｉ−Ｍ１２３Ｉ−Ｇ１２７Ｓ−Ａ１２８Ｐ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ａ２０２Ｖ−Ｔ２１０Ｐ−Ｎ２１７Ｓ−Ａ２４２Ｇ−Ｓ２５８Ｐ；Ｔ３Ｖ−Ｖ２６Ｑ−Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ｍ１２３Ｉ−Ｇ１２７Ｓ−Ａ１２８Ｐ−Ｇ１６５Ｅ−Ｎ１８４Ｑ−Ａ２０２Ｖ−Ｔ２１０Ｐ−Ｎ２１７Ｓ−Ｓ２５８Ｐ；Ｔ３Ｖ−Ｐ９Ｅ−Ｌ１０Ｍ−Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ｍ１２３Ｉ−Ｇ１２７Ｓ−Ａ１２８Ｐ−Ｇ１６５Ｅ−Ｎ１８４Ｑ−Ａ２０２Ｖ−Ｔ２１０Ｐ−Ｎ２１７Ｓ−Ｓ２５８Ｐ；Ｔ３Ｖ−Ｐ９Ｅ−Ｌ１０Ｍ−Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ｇ１０１Ａ−Ｍ１２３Ｉ−Ｇ１２７Ｓ−Ａ１２８Ｐ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ａ２０２Ｖ−Ｎ２１７Ｓ−Ｓ２５８Ｐ；Ｔ３Ｖ−Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ｔ７８Ｉ−Ｍ１２３Ｉ−Ｇ１２７Ｓ−Ａ１２８Ｐ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ａ２０２Ｖ−Ｔ２１０Ｐ−Ｎ２１７Ｓ−Ｓ２５８Ｐ；Ｔ３Ｖ−Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ｔ７８Ｉ−Ｍ１２３Ｉ−Ｇ１２７Ｓ−Ａ１２８Ｐ−Ｎ１６０Ｋ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ａ２０２Ｖ−Ｔ２１０Ｐ−Ｎ２１７Ｓ−Ａ２４２Ｇ−Ｓ２５８Ｐ；Ｔ３Ｖ−Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ｖ８７Ｓ−Ｍ１２３Ｉ−Ｇ１２７Ｓ−Ａ１２８Ｐ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ａ２０２Ｖ−Ｔ２１０Ｐ−Ｎ２１７Ｓ−Ｓ２５８Ｐ；Ｔ３Ｖ−Ｐ４０Ｅ−Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ｍ１２３Ｉ−Ｇ１２７Ｓ−Ａ１２８Ｐ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ａ２０２Ｖ−Ｎ２１７Ｓ−Ｓ２５８Ｐ；Ｔ３Ｖ−Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｅ−Ｍ１２３Ｉ−Ｇ１２７Ｔ−Ａ１２８Ｐ−Ｇ１６５Ｅ−Ｎ１８４Ｑ−Ａ２０２Ｖ−Ｎ２１７Ｓ−Ｐ２３８Ｑ−Ｓ２５８Ｐ；Ｔ３Ｖ−Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ｇ９９Ｓ−Ｍ１２３Ｉ−Ｇ１２７Ｓ−Ａ１２８Ｐ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ａ２０２Ｖ−Ｎ２１７Ｓ−Ｓ２５８Ｐ；Ｔ３Ｖ−Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｅ−Ｍ１２３Ｉ−Ｇ１２７Ｔ−Ｇ１６５Ｅ−Ｎ１８４Ｑ−Ａ２０２Ｖ−Ｎ２１７Ｓ−Ｓ２５８Ｐ；Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ａ１２８Ｐ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ｎ２１７Ｓ−Ｓ２５８Ｐ；Ｔ３Ｖ−Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ｇ１０１Ａ−Ｓ１０２Ｔ−Ｍ１２３Ｉ−Ｇ１２７Ｓ−Ａ１２８Ｐ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ａ２０２Ｖ−Ｎ２１７Ｓ−Ｓ２５８Ｐ；Ｔ３Ｖ−Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ｍ１２３Ｉ−Ｇ１２７Ｓ−Ａ１２８Ｐ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ａ２０２Ｖ−Ｎ２１７Ｓ；Ｔ３Ｖ−Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ｔ７８Ｉ−Ｇ９９Ｓ−Ｇ１２７Ｓ−Ａ１２８Ｐ−Ｇ１６５Ｑ−Ｔ２１０Ｐ−Ａ２４２Ｇ−Ｓ２５８Ｐ−Ｋ２６４Ｈ；Ｔ３Ｖ−Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ｔ７８Ｉ−Ｇ９９Ｓ−Ｍ１２３Ｉ−Ｇ１２７Ｓ−Ａ１２８Ｐ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ａ２０２Ｖ−Ｔ２１０Ｐ−Ｎ２１７Ｓ−Ａ２４２Ｇ−Ｓ２５８Ｐ；Ｔ３Ｖ−Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ｍ１２３Ｉ−Ｇ１２７Ｔ−Ｇ１６５Ｅ−Ｎ１８４Ｑ−Ａ２０２Ｖ−Ｎ２１７Ｓ−Ｐ２３８Ｑ−Ｓ２５８Ｐ；Ｔ３Ｖ−Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ｔ７８Ｉ−Ｇ９９Ｓ−Ｇ１２７Ｓ−Ａ１２８Ｐ−Ｇ１６５Ｑ−Ｔ２１０Ｐ−Ａ２４２Ｇ−Ｓ２５８Ｐ；Ｔ３Ｖ−Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ｔ７８Ｉ−Ｇ９９Ｓ−Ｍ１２３Ｉ−Ｇ１２７Ｓ−Ａ１２８Ｐ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ａ２０２Ｖ−Ｔ２１０Ｐ−Ｎ２１７Ｓ−Ａ２４２Ｇ−Ｓ２５８Ｄ；Ｉ３５Ａ−Ｍ１２３Ｉ−Ｇ１２７Ｔ−Ｔ２１０Ｐ−Ｓ２４３Ｉ；Ｔ３Ｖ−Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ｇ９９Ｓ−Ｍ１２３Ｉ−Ｇ１２７Ｓ−Ａ１２８Ｐ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ａ２０２Ｖ−Ｎ２１７Ｓ−Ｓ２５８Ｐ−Ｆ２６０Ｗ；Ｔ３Ｖ−Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ｔ７８Ｉ−Ｇ９９Ｓ−Ｇ１０１Ａ−Ｇ１２７Ｓ−Ａ１２８Ｐ−Ｇ１６５Ｑ−Ｔ２１０Ｐ−Ａ２４２Ｇ−Ｓ２５８Ｐ；Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ｇ９９Ｑ−Ａ１２８Ｐ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ｎ２１７Ｓ；Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ａ１２８Ｐ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ａ２０２Ｖ−Ｎ２１７Ｓ；Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ａ１２８Ｐ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ｎ２１７Ｓ−Ｓ２５８Ｄ；Ｔ３Ｖ−Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ｔ７８Ｉ−Ｇ９９Ｓ−Ｇ１０１Ａ−Ｍ１２３Ｉ−Ｇ１２７Ｓ−Ａ１２８Ｐ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ａ２０２Ｖ−Ｔ２１０Ｐ−Ｎ２１７Ｓ−Ａ２４２Ｇ−Ｓ２５８Ｐ；およびＶ４５Ｒ−Ｓ９８Ｒから選択される１種以上のアミノ酸置換セットを含む、アミノ酸配列を含む１種以上のスブチリシン変異体に関し、前記２つ、３つまたは４つ以上の置換の１つ以上は、人工の置換であるという条件が付され、前記変異体は、モチーフＡおよび／またはモチーフＢを含むＡｐｒＬ−Ｃｌａｄｅスブチリシン酵素に対して、少なくとも８５％であるが、１００％未満のアミノ酸配列同一性を有し、モチーフＡはモチーフ１、モチーフ２、モチーフ３およびモチーフ４から選択され、モチーフＢはモチーフ５、モチーフ６、モチーフ７、モチーフ８、モチーフ９、モチーフ１０、モチーフ１１、モチーフ１２、モチーフ１３およびモチーフ１４から選択され、変異体のアミノ酸位置は、配列番号２のアミノ酸配列に対応して番号付けされている。
さらなる実施形態では、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体は、３Ｔ、４Ｉ、９Ｒ、１５Ｔ、６７Ａ、７５Ｄ、８６Ｓ、９７Ｓ、９８Ａ／Ｄ／Ｇ、１００Ｇ／Ｍ／Ｒ、１０２Ａ、１０３Ｎ／Ｙ、１０５Ａ、１１７Ｒ／Ｖ、１１９Ｄ／Ｎ、１２２Ｓ、１２７Ｌ、１２８Ｑ、１２９Ａ、１５９Ｄ、１６６Ａ、１６９Ｓ、１９３Ｐ、１９４Ｅ、１９８Ｍ、２１６Ｄ、２１７Ｄ、２２１Ｓ、２３１Ｖ、２３４Ｌ、２３５Ｈ、２４４Ｒ、２５１Ｋ、および２７３Ａから選択される１つ以上の置換、および／または３６位に挿入されるＤ、９６位に挿入されるＥ、および９８位と９９位との間に挿入されるＤから選択される１つ以上の挿入をさらに含み、変異体のアミノ酸位置は、配列番号２のアミノ酸配列に対応して番号付けされている。
一実施形態では、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体は、モチーフＡ、モチーフＢまたはそれらの組み合わせを含むＡｐｒＬ−Ｃｌａｄｅスブチリシン酵素と７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有する親由来である。別の実施形態では、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体は、モチーフＡ、モチーフＢまたはそれらの組み合わせを含むＡｐｒＬ−Ｃｌａｄｅスブチリシン酵素と８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有する親由来である。なおさらに別の実施形態では、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体は、モチーフＡおよびモチーフＢを含むＡｐｒＬ−Ｃｌａｄｅスブチリシン酵素と７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有する親由来である。さらに別の実施形態では、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体は、モチーフＡおよびモチーフＢを含むＡｐｒＬ−Ｃｌａｄｅスブチリシン酵素と８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有する親由来である。スブチリシン酵素のＡｐｒＬ−ｃｌａｄｅについては、２０１６年５月１３日出願のＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１６／３２５１４号明細書により詳しく記載されている。いくつかの実施形態では、ＡｐｒＬ−Ｃｌａｄｅスブチリシン酵素は、図１に示す酵素の１つから選択される。別の実施形態では、ＡｐｒＬ−Ｃｌａｄｅスブチリシン酵素は、配列番号２、９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４または２０５のアミノ酸配列を含む。さらに別の実施形態では、ＡｐｒＬ−Ｃｌａｄｅスブチリシン酵素は、配列番号２、９、１８９、１９８、２０２、２０３または２０５のアミノ酸配列を含む。さらに別の実施形態では、ＡｐｒＬ−Ｃｌａｄｅスブチリシン酵素は、配列番号２または９のアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、ＡｐｒＬ−ｃｌａｄｅ酵素はモチーフＡ、モチーフＢまたはこれらの組合せを含む。他の実施形態では、ＡｐｒＬ−ｃｌａｄｅ酵素はモチーフＡおよびモチーフＢを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体は、モチーフＡ、モチーフＢまたはこれらの組合せを含む。さらに他の実施形態では、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体は、モチーフＡおよびモチーフＢを含む。別の実施形態では、モチーフＡはモチーフ１、モチーフ２、モチーフ３、およびモチーフ４から選択される。またさらなる実施形態では、モチーフＢは、モチーフ５、モチーフ６、モチーフ７、モチーフ８、モチーフ９、モチーフ１０、モチーフ１１、モチーフ１２、モチーフ１３、およびモチーフ１４から選択される。さらに他の実施形態では、ＡｐｒＬ−ｃｌａｄｅ酵素は、Ａｓｐ３２とＨｉｓ６３との間にモチーフ１を含む。ただし、このアミノ酸位置は配列番号２のアミノ酸配列に対応して番号付けされている。なおさらに他の実施形態では、ＡｐｒＬ−ｃｌａｄｅ酵素は、Ｌｙｓ２３６とＡｒｇ２４６との間にモチーフ６またはモチーフ７を含む。ただし、このアミノ酸位置は配列番号２のアミノ酸配列に対応して番号付けされている。なおまたさらなる実施形態では、ＡｐｒＬ−ｃｌａｄｅ酵素は、（ｉ）Ａｓｐ３２とＨｉｓ６３との間にモチーフ１を、（ｉｉ）Ｌｙｓ２３６とＡｒｇ２４６との間にモチーフ６を含む。ただし、このアミノ酸位置は配列番号２のアミノ酸配列に対応して番号付けされている。さらに他の実施形態では、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体は、Ａｓｐ３２とＨｉｓ６３との間にモチーフ１を含む。ただし、このアミノ酸位置は配列番号２のアミノ酸配列に対応して番号付けされている。なおまたさらなる実施形態では、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体は、Ｌｙｓ２３６とＡｒｇ２４６との間にモチーフ６またはモチーフ７を含む。ただし、このアミノ酸位置は配列番号２のアミノ酸配列に対応して番号付けされている。なお別の実施形態では、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体は、（ｉ）Ａｓｐ３２とＨｉｓ６３との間にモチーフ１を、（ｉｉ）Ｌｙｓ２３６とＡｒｇ２４６との間にモチーフ６またはモチーフ７を含む。ただし、このアミノ酸位置は配列番号２のアミノ酸配列に対応して番号付けされている。
いくつかの実施形態では、ＡｐｒＬ−ｃｌａｄｅ酵素は、ＹＮＴ（配列番号１６６）モチーフ（「モチーフ１」）を含む。他の実施形態では、ＡｐｒＬ−ｃｌａｄｅ酵素は、Ｙ５６Ｎ５７Ｔ５８（配列番号１６７）モチーフを含む（「モチーフ２」）。ただし、このアミノ酸位置は配列番号２のアミノ酸配列に対応して番号付けされている。さらなる実施形態では、ＡｐｒＬ−ｃｌａｄｅ酵素は、ＦＶＸ１ＧＥＸ２Ｘ３ＹＮＴ（配列番号１６８）モチーフを含む（「モチーフ３」）。ただし、Ｘ１はＡまたはＳであり、Ｘ２は該当なしであるか、または任意のアミノ酸であり、Ｘ３はＡまたはＳである。またさらなる実施形態では、ＡｐｒＬ−ｃｌａｄｅ酵素はＦ５０Ｖ５１Ｘ１５２Ｇ５３Ｅ５４Ｘ３５５Ｙ５６Ｎ５７Ｔ５８（配列番号１６９）モチーフを含む（「モチーフ４」）。ただし、Ｘ１はＡまたはＳであり、Ｘ３はＡまたはＳであり、またこのアミノ酸位置は、配列番号２のアミノ酸配列に対応して番号付けされている。いくつかの実施形態では、ＡｐｒＬ−ｃｌａｄｅ酵素は、残基５２〜６０の間にループ領域を含む。ただし、このアミノ酸位置は配列番号２のアミノ酸配列に対応して番号付けされている。
他の実施形態では、ＡｐｒＬ−ｃｌａｄｅ酵素は、ＬＳＸ４Ｓ（配列番号１７０）モチーフを含む（「モチーフ５」）。ただし、Ｘ４はＡまたはＧである。さらに他の実施形態では、ＡｐｒＬ−ｃｌａｄｅ酵素は、ＬＳＡＳ（配列番号１７１）モチーフを含む（「モチーフ６」）。別の実施形態では、ＡｐｒＬ−ｃｌａｄｅ酵素がＬＳＧＳ（配列番号１７２）モチーフ（「モチーフ７」）を含む。いくつかの実施形態では、ＡｐｒＬ−ｃｌａｄｅ酵素は、Ｌ２４０Ｓ２４１Ａ２４２Ｓ２４３（配列番号１７３）モチーフを含む（「モチーフ８」）。ただし、このアミノ酸位置は配列番号２のアミノ酸配列に対応して番号付けされている。さらなる実施形態では、ＡｐｒＬ−ｃｌａｄｅ酵素はＬ２４０Ｓ２４１Ｇ２４２Ｓ２４３（配列番号１７４）モチーフを含む（「モチーフ９」）。ただし、このアミノ酸位置は配列番号２のアミノ酸配列に対応して番号付けされている。またさらなる実施形態では、ＡｐｒＬ−ｃｌａｄｅ酵素は、ＫＸＸＸＬＳＸ４ＳＱＸ５Ｒ（配列番号１７５）モチーフを含む（「モチーフ１０」）。ただし、Ｘは任意のアミノ酸であり、Ｘ４はＡまたはＧであり、Ｘ５はＩまたはＶである。なおさらなる実施形態では、ＡｐｒＬ−ｃｌａｄｅ酵素は、ＫＸＸＸＬＳＡＳＱＸ５Ｒ（配列番号１７６）モチーフを含む（「モチーフ１１」）。ただし、Ｘは任意のアミノ酸であり、Ｘ５はＩまたはＶである。なおまたさらなる実施形態では、ＡｐｒＬ−ｃｌａｄｅ酵素は、ＫＸＸＸＬＳＧＳＱＸ５Ｒ（配列番号１７７）モチーフを含む（「モチーフ１２」）。ただし、Ｘは任意のアミノ酸であり、Ｘ５はＩまたはＶである。またさらなる実施形態では、ＡｐｒＬ−ｃｌａｄｅ酵素はＫ２３６ＸＸＸＬＳＡＳＱＸ５Ｒ２４６（配列番号１７８）モチーフを含む（「モチーフ１３」）。ただし、Ｘは任意のアミノ酸であり、Ｘ５はＩまたはＶであり、またこのアミノ酸位置は、配列番号２のアミノ酸配列に対応して番号付けされている。なおまたさらなる実施形態では、ＡｐｒＬ−ｃｌａｄｅ酵素はＫ２３６ＸＸＸＬＳＧＳＱＸ５Ｒ２４６（配列番号１７９）モチーフを含む（「モチーフ１４」）。ただし、Ｘは任意のアミノ酸であり、Ｘ５はＩまたはＶであり、またこのアミノ酸位置は、配列番号２のアミノ酸配列に対応して番号付けされている。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体は、ＹＮＴ（配列番号１６６）モチーフ（「モチーフ１」）を含む。他の実施形態では、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体は、Ｙ５６Ｎ５７Ｔ５８（配列番号１６７）モチーフを含む（「モチーフ２」）。ただし、このアミノ酸位置は配列番号２のアミノ酸配列に対応して番号付けされている。さらなる実施形態では、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体は、ＦＶＸ１ＧＥＸ２Ｘ３ＹＮＴ（配列番号１６８）モチーフを含む（「モチーフ３」）。ただし、Ｘ１はＡまたはＳであり、Ｘ２は該当なしであるか、または任意のアミノ酸であり、Ｘ３はＡまたはＳである。またさらなる実施形態では、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体は、Ｆ５０Ｖ５１Ｘ１５２Ｇ５３Ｅ５４Ｘ３５５Ｙ５６Ｎ５７Ｔ５８（配列番号１６９）モチーフを含む（「モチーフ４」）。ただし、Ｘ１はＡまたはＳであり、Ｘ３はＡまたはＳであり、またこのアミノ酸位置は、配列番号２のアミノ酸配列に対応して番号付けされている。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体は、残基５２〜６０の間にループ領域を含む。ただし、このアミノ酸位置は配列番号２のアミノ酸配列に対応して番号付けされている。
他の実施形態では、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体は、ＬＳＸ４Ｓ（配列番号１７０）モチーフを含む（「モチーフ５」）。ただし、Ｘ４はＡまたはＧである。さらに他の実施形態では、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体は、ＬＳＡＳ（配列番号１７１）モチーフを含む（「モチーフ６」）。別の実施形態では、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体は、ＬＳＧＳ（配列番号１７２）モチーフを含む（「モチーフ７」）。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体は、Ｌ２４０Ｓ２４１Ａ２４２Ｓ２４３（配列番号１７３）モチーフを含む（「モチーフ８」）。ただし、このアミノ酸位置は、配列番号２のアミノ酸配列に対応して番号付けされている。さらなる実施形態では、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体は、Ｌ２４０Ｓ２４１Ｇ２４２Ｓ２４３（配列番号１７４）モチーフを含む（「モチーフ９」）。ただし、このアミノ酸位置は、配列番号２のアミノ酸配列に対応して番号付けされている。またさらなる実施形態では、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体は、ＫＸＸＸＬＳＸ４ＳＱＸ５Ｒ（配列番号１７５）モチーフを含む（「モチーフ１０」）。ただし、Ｘは任意のアミノ酸であり、Ｘ４はＡまたはＧ、Ｘ５はＩまたはＶである。なおさらなる実施形態では、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体は、ＫＸＸＸＬＳＡＳＱＸ５Ｒ（配列番号１７６）モチーフを含む（「モチーフ１１」）。ただし、Ｘは任意のアミノ酸であり、Ｘ５はＩまたはＶである。なおまたさらなる実施形態では、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体は、ＫＸＸＸＬＳＧＳＱＸ５Ｒ（配列番号１７７）モチーフを含む（「モチーフ１２」）。ただし、Ｘは任意のアミノ酸であり、Ｘ５はＩまたはＶである。なおさらなる実施形態では、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体は、Ｋ２３６ＸＸＸＬＳＡＳＱＸ５Ｒ２４６（配列番号１７８）モチーフを含む（「モチーフ１３」）。ただし、Ｘは任意のアミノ酸であり、Ｘ５はＩまたはＶであり、またこのアミノ酸位置は、配列番号２のアミノ酸配列に対応して番号付けされている。なおまたさらなる実施形態では、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体は、Ｋ２３６ＸＸＸＬＳＧＳＱＸ５Ｒ２４６（配列番号１７９）モチーフを含む（「モチーフ１４」）。ただし、Ｘは任意のアミノ酸であり、Ｘ５はＩまたはＶであり、またこのアミノ酸位置は、配列番号２のアミノ酸配列に対応して番号付けされている。
別の実施形態では、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体は、配列番号２に対して本明細書に記載の２つ、３つまたは４つ以上の変異を含むが、これには（ｉ）配列番号２に対する前記変異は挿入または欠失ではない、（ｉｉ）前記変異体のアミノ酸配列が３７、１８７、１９３および２５８位のうちの１つ以上で配列番号２に対する変異を含む場合、その変異はプロリンではない、（ｉｉｉ）前記変異体のアミノ酸配列が２６、３８、２３４および２５０位のうちの２つ以上で、配列番号２に対する変異を含む場合、前記変異は２６Ｒ、３８Ｓ、２３４Ｒまたは２５０Ｅ／Ｎではない、かつ／または（ｉｖ）前記変異体のアミノ酸配列が１２８位に変異を含む場合、配列番号２に対する前記変異は１３０位または１９３位にはない、という条件が付される。ただし、このアミノ酸位置は、配列番号２のアミノ酸配列に対応して番号付けされている。
なお別の実施形態では、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体は、配列番号２に対応する位置に本明細書に記載の２つ、３つまたは４つ以上の変異を含むが、これには（ｉ）配列番号２に対応する位置の前記変異は挿入または欠失ではない、（ｉｉ）前記変異体のアミノ酸配列が３７、１８７、１９３および２５８位から選択されるもののうち、配列番号２に対応する１つ以上の位置に変異を含む場合、その変異はプロリンではない、（ｉｉｉ）前記変異体のアミノ酸配列が２６、３８、２３４および２５０位から選択されたもののうち、配列番号２に対応する２つ以上の位置に変異を含む場合、前記変異は２６Ｒ、３８Ｓ、２３４Ｒまたは２５０Ｅ／Ｎではない、（ｉｖ）前記変異体のアミノ酸配列が１２８位に変異を含む場合、配列番号２に対応する位置での前記変異は１３０位または１９３位にはない、かつ／または（ｖ）前記変異体は、国際公開第２０１６０７４９２５号パンフレットの配列番号５または特開第２０１３−００７１４号公報の配列番号１１０として記載のアミノ酸配列から構成されるものではないという条件が付される。
さらに別の実施形態では、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体は、本明細書に記載の２つ、３つまたは４つ以上の変異を含むが、これには（ｉ）前記変異体のアミノ酸配列が３７、１８７、１９３および２５８位のうちの１つ以上に置換を含む場合、前記置換はプロリンではない、（ｉｉ）前記変異体のアミノ酸配列が２６、３８、２３４、および２５０位のうちの２つ以上に置換を含む場合、前記置換は２６Ｒ、３８Ｓ、２３４Ｒまたは２５０Ｅ／Ｎではない、かつ／または（ｉｉｉ）前記変異体のアミノ酸配列が１２８位に置換を含む場合、前記置換は１３０または１９３位にはない、という条件が付される。ただし、このアミノ酸位置は、配列番号２のアミノ酸配列に対応して番号付けされている。
なお別の実施形態では、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体は、本明細書に記載の２つ、３つまたは４つ以上の変異を含むが、これには（ｉ）前記変異体のアミノ酸配列が３７、１８７、１９３および２５８位のうちの１つ以上に置換を含む場合、前記置換はプロリンではない、（ｉｉ）前記変異体のアミノ酸配列が２６、３８、２３４、および２５０位のうちの２つ以上に置換を含む場合、前記置換は２６Ｒ、３８Ｓ、２３４Ｒまたは２５０Ｅ／Ｎではない、（ｉｉｉ）前記変異体のアミノ酸配列が１２８位に置換を含む場合、前記置換は１３０位または１９３位にはない、かつ／または（ｉｖ）前記変異体は、国際公開第２０１６０７４９２５号パンフレットの配列番号５または特開第２０１３−００７１４号公報の配列番号１１０として記載のアミノ酸配列から構成されるものではないという条件が付される。
一実施形態では、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体は、図１で同定されたＡｐｒＬ−Ｃｌａｄｅスブチリシン酵素のアミノ酸配列と、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％で１００％未満のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体は、配列番号２または９のアミノ酸配列と、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％で１００％未満のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体は、（ｉ）図１で同定されたＡｐｒＬ−Ｃｌａｄｅスブチリシン酵素または（ｉｉ）配列番号２または９のアミノ酸配列と、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％で１００％未満のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体は、図１で同定されたＡｐｒＬ−Ｃｌａｄｅスブチリシン酵素のアミノ酸配列と少なくとも８９％で１００％未満のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体は、配列番号２または９のアミノ酸配列と、少なくとも８９％で１００％未満のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。さらなる実施形態では、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体は、図１で同定されたＡｐｒＬ−Ｃｌａｄｅスブチリシン酵素のアミノ酸配列と、少なくとも９０％で１００％未満のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体は、配列番号２または９のアミノ酸配列と、少なくとも９０％で１００％未満のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。さらに他の実施形態では、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体は、図１で同定されたＡｐｒＬ−Ｃｌａｄｅスブチリシン酵素のアミノ酸配列と、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％で１００％未満のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。なおさらに他の実施形態では、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体は、配列番号２または９のアミノ酸配列と、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％で１００％未満のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。またさらに他の実施形態では、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体は、スブチリシン活性またはカゼイン加水分解活性（例えば、ジメチルカゼイン加水分解活性）を有する、単離された、組換えの、実質的に純粋な、または天然に存在しないスブチリシンである。
一実施形態では、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体は酵素活性（例えば、プロテアーゼ活性）を有し、したがって、洗浄用途、例えば、限定はされないが、食器製品、テーブルウェア製品、布帛、および硬質表面（テーブル、テーブルトップ、壁、家具製品、床、天井などの硬質表面）を有する物品の洗浄方法において有用である。本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体を含む洗浄用組成物の例は、以下に記載される。本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体の酵素活性（例えば、プロテアーゼ酵素活性）は、当業者によく知られた手順によって容易に測定することができる。以下に示す実施例は、酵素活性および洗浄性能の評価方法を記載する。染み（例えば、血液／ミルク／インク、色素／ミルク／インクまたは卵黄などのタンパク質の染み）の除去、硬質表面の洗浄、または洗濯物、食器またはテーブルウェア製品の洗浄における本発明のポリペプチド酵素の性能は、当該分野でよく知られた手順を使用して、かつ／または実施例に記載の手順を使用して容易に決定することができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体は、参照スブチリシンと比較して１つ以上の改善された特性を有し、その改善された特性は、改善されたプロテアーゼ活性、改善された洗剤中の洗浄性能、および改善された洗剤中の熱安定性および改善された洗剤中の劣化洗濯洗浄性から選択される。ただし、この洗剤は、任意選択によりホウ素を含まない洗剤である。他の実施形態では、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体は、参照スブチリシンと比較して１つ以上の改善された特性を有し、その改善された特性は、改善されたプロテアーゼ活性、洗剤中での改善された洗浄性能、改善された洗剤中の熱安定性、および改善された洗剤中の劣化洗濯洗浄性から選択される。ただし、この洗剤は、任意選択によりホウ素を含まない洗剤であり、また参照スブチリシンは、配列番号２、９または６３のアミノ酸配列を含む。さらに他の実施形態では、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体は、参照スブチリシンと比較して１つ以上の改善された特性を有し、その改善された特性は、改善されたプロテアーゼ活性、改善された洗剤中の洗浄性能、改善された洗剤中の熱安定性、および改善された洗剤中の劣化洗濯洗浄性から選択される。ただし、この洗剤は、任意選択によりホウ素を含まない洗剤であり、また参照スブチリシンは、配列番号２または９のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体は、参照スブチリシンと比較して、より長い洗浄時間を通してより安定である。別の実施形態では、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体は、参照スブチリシンと比較して、短時間低温洗浄サイクルまたは長時間高温洗浄サイクルを通してより安定である。なおまたさらなる実施形態では、１つ以上の改善された特性は（ｉ）改善されたプロテアーゼ活性であり、前記変異体はＮ−ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡまたはジメチルカゼイン基質に対してＰＩ＞１を有し、（ｉｉ）改善された洗剤中の洗浄性能であり、前記変異体はＢＭＩ、ＰＯＭ、卵、および／または卵黄の洗浄でＰＩ＞１を有し、（ｉｉｉ）改善された洗剤中の熱安定性であり、前記変異体は安定性ＰＩ＞１を有し、かつ／または（ｉｖ）改善された洗剤中の劣化洗濯洗浄性であり、前記変異体は劣化洗濯洗浄性ＰＩ＞１を有する。ただし、この洗剤は任意選択によりホウ素を含まない組成物である。なおさらなる実施形態では、１つ以上の改善された特性は、（ｉ）改善されたプロテアーゼ活性であり、前記変異体はＮ−ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡまたはジメチルカゼイン基質に対してＰＩ＞１を有し、（ｉｉ）改善された洗剤中の洗浄性能であり、前記変異体はＢＭＩ、ＰＯＭ、卵、および／または卵黄の洗浄でＰＩ＞１を有し、（ｉｉｉ）改善された洗剤中の熱安定性であり、前記変異体は安定性ＰＩ＞１を有するか、または６０℃、６１℃、６２℃、６３℃、６４℃、６５℃、６６℃、６７℃、６８℃、６９℃もしくはそれより高いストレス温度で１５〜２０分後に、％残留活性≧５％、１０％ ２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％またはそれ以上であり、かつ／または（ｉｖ）改善された洗剤中の劣化洗濯洗浄性であって、前記変異体は、（ａ）劣化洗濯洗浄性ＰＩ＞１、（ｂ）５５℃で２４時間後に、残留洗浄活性＞１０％、２０％ ３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％またはそれ以上であり、かつ／または（ｃ）３７℃で３日後または３週間後に、残留洗浄活性＞１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％またはそれ以上である。ただし、この洗剤は任意選択によりホウ素を含まない組成物である。なおさらなる実施形態では、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体は、改善されたプロテアーゼ活性を有し、前記変異体は、Ｎ−ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡまたはジメチルカゼイン基質に対してＰＩ＞１を有する。なおまたさらなる実施形態では、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体は、改善された洗剤中の洗浄性能を有し、前記変異体はＢＭＩ、ＰＯＭおよび／または卵黄の洗浄でＰＩ＞１を有する。ただし、この洗剤は任意選択によりホウ素を含まない組成物である。別の実施形態では、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体は、改善された洗剤中の熱安定性を有し、前記変異体は安定性ＰＩ＞１を有する。ただし、この洗剤は任意選択によりホウ素を含まない組成物である。さらに別の実施形態では、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体は、改善された洗剤中の熱安定性を有し、前記変異体は、安定性ＰＩ＞１を有するか、または６０℃、６１℃、６２℃、６３℃、６４℃、６５℃、６６℃、６７℃、６８℃、６９℃もしくはそれ以上のストレス温度で１５〜２０分後に、％残留活性≧５％、１０％ ２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％またはそれ以上である。ただし、この洗剤は任意選択によりホウ素を含まない組成物である。別の実施形態では、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体は、改善された洗剤中の劣化洗濯洗浄性を有し、前記変異体は（ａ）劣化洗濯洗浄性ＰＩ＞１、（ｂ）５５℃で２４時間後に残留洗浄活性＞１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％またはそれ以上であり、かつ／または（ｃ）３７℃で３日または３週間後に残留洗浄活性＞１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％またはそれ以上である。ただし、この洗剤は任意選択によりホウ素を含まない組成物である。別の実施形態では、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体は、改善された洗剤中の劣化洗濯洗浄性を有し、前記変異体は劣化洗濯洗浄性ＰＩ＞１を有する。ただし、この洗剤は任意選択によりホウ素を含まない組成物である。別の実施形態では、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体は、改善されたプロテアーゼ活性を有し、前記変異体は、Ｎ−ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡまたはジメチルカゼイン基質に対してＰＩ＞１を有し、前記ＰＩは実施例１のプロテアーゼ活性アッセイにより測定される。さらなる実施形態では、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体は、改善された洗剤中の洗浄性能を有し、前記変異体はＢＭＩ、ＰＯＭ、卵、および／または卵黄の洗浄でＰＩ＞１を有し、前記ＰＩは、実施例１の洗濯用（ＨＤＬもしくはＨＤＤ）洗剤およびＡＤＷ用洗剤アッセイにおける洗浄性能に従って測定される。なおさらなる実施形態では、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体は、改善された洗剤中の熱安定性を有し、前記変異体は安定性ＰＩ＞１を有し、前記ＰＩは、実施例１の安定性アッセイのための一般的な試料のセットアップに従って測定される。なおまたさらなる実施形態では、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体は、改善された洗剤中の熱安定性を有し、前記変異体は、６０℃、６１℃、６２℃、６３℃、６４℃、６５℃、６６℃、６７℃、６８℃、６９℃またはそれ以上のストレス温度で１５〜２０分後に、％残留活性≧５％、１０％ ２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％またはそれ以上であり、前記残留活性は、実施例１の安定性アッセイのための一般的な試料のセットアップに従って測定される。またさらなる実施形態では、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体は、改善された洗剤中の劣化洗濯洗浄性を有し、前記変異体は劣化洗濯洗浄性ＰＩ＞１を有し、前記ＰＩは、実施例１の劣化洗濯洗浄アッセイに従って測定される。なおまたさらなる実施形態では、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体は、改善された洗剤中の劣化洗濯洗浄性を有し、前記変異体は、５５℃で２４時間後に残留洗浄活性＞１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％またはそれ以上であり、かつ／または３７℃で３日または３週間後に残留洗浄活性＞１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％またはそれ以上であり、前記残留洗浄活性は、実施例１の劣化洗濯洗浄アッセイに従って測定される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体は、洗浄用組成物中で洗浄性能を示す。洗浄用組成物は、酵素の安定性および性能に有害な成分を含むことが多く、洗浄用組成物は、酵素、例えば、セリンプロテアーゼが機能を保持するのに過酷な環境となっている。したがって、酵素を洗浄用組成物に入れて、酵素機能（例えば、洗浄性能によって示されるようなセリンプロテアーゼ活性）を期待することはささいなことではない。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体は、自動食器洗浄機（ＡＤＷ）用洗剤組成物中で洗浄性能を示す。いくつかの実施形態では、自動食器洗浄機（ＡＤＷ）用洗剤組成物における洗浄性能には、卵黄による染みの洗浄が含まれる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体は、洗濯用洗剤組成物中で洗浄性能を示す。いくつかの実施形態では、洗濯用洗剤組成物の洗浄性能には、血液／ミルク／インク、卵、卵黄および／またはＰＯＭの染みが含まれる。洗浄用組成物のそれぞれの中で、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体は、漂白成分の有無にかかわらず洗浄性能を示す。なおまたさらなる実施形態では、本明細書に記載の１種以上のＡＤＷ用または洗濯用洗剤組成物は、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体を含み、前記変異体は１種以上の補助材料および／または１種以上の追加酵素の存在下で安定であり、かつ／または、前記変異体は、自己タンパク質分解に対して安定である。
本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体には、１種以上の保存的または非保存的なアミノ酸の挿入、欠失および／または置換などの様々な変化を加えることができる（そのような変化が変異体の酵素活性を実質的に変えない場合を含む）。同様に、本発明の核酸も、特定のコドンが同じまたは異なるアミノ酸をコードし、サイレント変異（例えば、ヌクレオチドの変異によってコードされるアミノ酸が変わらない場合など）または非サイレント変異をもたらすような、１種以上のコドンにおける１種以上のヌクレオチドの１つ以上の置換、配列中の１つ以上の核酸（またはコドン）の１つ以上の欠失、配列中の１種以上の核酸（またはコドン）の１つ以上の付加または挿入、ならびに／あるいは配列中の１種以上の核酸（またはコドン）の開裂、または１つ以上の切断などの様々な変化を加えることができる。核酸配列における多くのそのような変化は、元の核酸配列によってコードされたポリペプチド酵素と比べて、得られるコードされたポリペプチド酵素の酵素活性を実質的に変えないであろう。本明細書に記載の核酸配列はまた、発現系（例えば、細菌発現系）で最適発現を提供する１種以上のコドンを含むように修飾することができ、一方、必要に応じて、前記１種以上のコドンは依然として同じアミノ酸をコードする。
本明細書では、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体、または組換えポリペプチドもしくはその活性断片をコードする核酸配列を含む、１種以上の単離された、天然に存在しない、または組換えポリヌクレオチドについて記載する。本明細書に記載の１種以上の核酸は、通常、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体またはその断片をコードする配列を含むプラスミド発現ベクターの発現によって、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体を組換え産生（例えば、発現）するのに有用である。一実施形態は、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体をコードする核酸を提供し、この変異体は、タンパク質分解活性を有する成熟形態である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体は、組換え技術により、相同のプロペプチド配列を用いて発現される。他の実施形態では、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体は、組換え技術により、非相同のプロペプチド配列（例えば、ＧＧ３６プロペプチド配列）を用いて発現される。
本明細書に記載の１種以上の核酸配列は、任意の適切な合成、操作、および／もしくは単離技術、またはそれらの組み合わせを使用して作製することができる。例えば、本明細書に記載の１種以上のポリヌクレオチドは、当業者によく知られている固相合成技術などの標準的な核酸合成技術によって生成することができる。そうした技術では、通常、最大５０個以上の核酸塩基からなる断片を合成し、その後、連結して（例えば、酵素または化学的ライゲーションにより）、実質的に必要な連続核酸配列を形成する。本明細書に記載の、１種以上のポリヌクレオチドの合成はまた、当該技術分野で知られている好適な方法によって促進することができる。そのような方法としては、限定はされないが、古典的なホスホラミダイト法（例えば、Ｂｅａｕｃａｇｅ ｅｔ ａｌ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２２：１８５９−６９（１９８１）を参照されたい）、または自動合成法で一般的に実施されている、Ｍａｔｔｈｅｓ ｅｔ ａｌ、ＥＭＢＯ Ｊ．３：８０１−８０５（１９８４）に記載の方法が挙げられる。本明細書に記載の１種以上のポリヌクレオチドはまた、自動ＤＮＡ合成装置を使用することによって生成することができる。特注の核酸を、様々な商業的供給源（例えば、Ｍｉｄｌａｎｄ Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｇｒｅａｔ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｇｅｎｅ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｏｐｅｒｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．、およびＤＮＡ２．０）に注文することができる。核酸を合成するための他の技術および関連する原理は例えば、Ｉｔａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３：３２３（１９８４）および Ｉｔａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８：１０５６（１９８４）に記載されている。
核酸の修飾に有用な組換えＤＮＡ技術、例えば、制限エンドヌクレアーゼ消化、ライゲーション、逆転写およびｃＤＮＡ産生、ならびにポリメラーゼ連鎖反応（例えば、ＰＣＲ）は、当該技術分野で周知である。本明細書に記載の１種以上のポリヌクレオチドはまた、１種以上のハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより、あるいは本明細書に記載の１種以上のＡｐｒＬ−ｃｌａｄｅ変異体または組換えポリペプチドもしくはその活性断片をコードするＰＣＲ増幅ポリヌクレオチドを使用して、ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより得ることができる。ｃＤＮＡクローンをスクリーニングし単離する手順、およびＰＣＲ増幅の手順は当業者によく知られており、また当業者に知られた標準的な文献に記載されている。本明細書に記載の１種以上のポリヌクレオチドは、例えば、既知の突然変異誘発手順（例えば、部位特異的突然変異誘発、部位飽和突然変異誘発、およびインビトロ組換え）によって、天然に存在するポリヌクレオチド骨格（例えば、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体または参照スブチリシンをコードする）を改変することによって得ることができる。本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体をコードする、本明細書に記載の修飾ポリヌクレオチドを生成するのに好適な様々な方法が、当該技術分野において知られており、例えば、限定はされないが、部位飽和変異誘発法、系統的変異導入法、挿入変異誘発法、欠失変異誘発法、ランダム変異誘発法、部位特異的変異誘発法および指向性進化法、ならびに各種の他の組換え方法が挙げられる。
さらなる実施形態は、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体を含む１種以上のベクター（例えば、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体をコードするポリヌクレオチド）；本明細書に記載の１種以上の核酸またはポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターまたは発現カセット；本明細書に記載の１種以上の核酸またはポリヌクレオチド配列を含む単離された、実質的に純粋な、または組換えＤＮＡコンストラクト；本明細書に記載の１種以上のポリヌクレオチド配列を含む単離されたまたは組換え細胞；ならびに１種以上のそのようなベクター、核酸、発現ベクター、発現カセット、ＤＮＡコンストラクト、細胞、細胞培養物、またはそれらの任意の組み合わせもしくは混合物を含む組成物に関する。
いくつかの実施形態は、本明細書に記載の１種以上のベクター（例えば、発現ベクターもしくはＤＮＡコンストラクト）を含む１種以上の組換え細胞に関し、そのベクターは、本明細書に記載の１種以上の核酸もしくはポリヌクレオチドを含む。いくつかのそのような組換え細胞は、そのような１種以上のベクターで形質転換または形質移入されるが、他の方法も利用可能であり、当該技術分野では知られている。そのような細胞は、通常、宿主細胞と呼ばれる。いくつかのそのような細胞は、細菌細胞、例えば、限定はされないが、Ｂ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞などのバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の菌種の細胞を含む。他の実施形態は、本明細書に記載の１種以上のスブチリシンを含む組換え細胞（例えば、組換え宿主細胞）に関する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１種以上のベクターは、効率の良い遺伝子発現に必要な１種以上の追加の核酸セグメント（例えば、本明細書に記載の１種以上のポリヌクレオチド配列に作動可能に結合したプロモーター）に作動可能に結合している、本明細書に記載の１種以上のポリヌクレオチド配列を含む、発現ベクターまたは発現カセットである。ベクターは、転写ターミネーターおよび／または選択遺伝子（例えば、抗生物質抵抗性遺伝子）を含み得、それは、抗菌剤含有培地での増殖によってプラスミド感染宿主細胞の連続的な培養維持を可能にする。
発現ベクターは、プラスミドまたはウイルスＤＮＡに由来してもよいし、あるいは代替の実施形態では、両方の要素を含む。ベクターの例としては、限定はされないが、ｐＣ１９４、ｐＪＨ１０１、ｐＥ１９４、ｐＨＰ１３が挙げられる（Ｈａｒｗｏｏｄ ａｎｄ Ｃｕｔｔｉｎｇ［ｅｄｓ．］，Ｃｈａｐｔｅｒ ３，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｂａｃｉｌｌｕｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９９０）を参照されたい；Ｂ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）用の適切な複製プラスミドとしては９２ページに示されたプラスミドが挙げられる）。（また、Ｐｅｒｅｇｏ、“Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ”；Ｓｏｎｅｎｓｈｅｉｎ ｅｔａｌ．，［ｅｄｓ．］；“Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ａｎｄ ＯｔｈｅｒＧｒａｍ−Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｂａｃｔｅｒｉａ：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ”，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９９３），ｐｐ．６１５−６２４およびｐ２ＪＭ１０３ＢＢＩも参照されたい）。
細胞中での目的のタンパク質（例えば、本明細書中に記載の１種以上のスブチリシン変異体）の発現および産生のために、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体をコードするポリヌクレオチドの１つ以上のコピーを含む（場合によっては、複数のコピーを含む）、１種以上の発現ベクターは、変異体の発現に適切な条件下で細胞に形質転換される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体をコードするポリヌクレオチド配列（およびベクターに含まれる他の配列）は、宿主細胞のゲノムに組み込まれ、一方、他の実施形態では、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体をコードするポリヌクレオチド配列を含むプラスミドベクターは、自立染色体外要素として細胞中に残留する。いくつかの実施形態は、染色体外核酸因子および宿主細胞ゲノムに組み込まれた入来ヌクレオチド配列のいずれをも提供する。本明細書に記載のベクターは、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体の産生に有用である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体をコードするポリヌクレオチドコンストラクトは、組み込みを可能にし、任意選択により宿主染色体に変異体をコードするポリヌクレオチドの増幅を可能にする組み込みベクター上に存在する。組み込み部位の例は、当業者にはよく知られている。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体をコードするポリヌクレオチドの転写は、親スブチリシンの野生型プロモーターであるプロモーターによって達成される。いくつかの他の実施形態では、プロモーターは、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体に対して異種であるが、宿主細胞内で機能的である。細菌宿主細胞で使用するなプロモーターの例としては、限定はされないが、ａｍｙＥ、ａｍｙＱ、ａｍｙＬ、ｐｓｔＳ、ｓａｃＢ、ｐＳＰＡＣ、ｐＡｐｒＥ、ｐＶｅｇ、ｐＨｐａＩＩプロモーター；Ｂ．ステアロテルモフィルス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）マルトジェニックアミラーゼ遺伝子のプロモーター、Ｂ．アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）（ＢＡＮ）アミラーゼ遺伝子；Ｂ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）アルカリプロテアーゼ遺伝子；Ｂ．クラウシイ（Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ）アルカリプロテアーゼ遺伝子、Ｂ．プミルス（Ｂ．ｐｕｍｉｌｉｓ）キシロシダーゼ遺伝子；Ｂ．チューリンギエンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）ｃｒｙＩＩＩＡ；およびＢ．リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）アルファ−アミラーゼ遺伝子が挙げられる。さらなるプロモーターとしては、限定はされないが、Ａ４プロモーター、ならびにファージラムダのＰＲまたはＰＬプロモーター、およびＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）のｌａｃ、ｔｒｐまたはｔａｃプロモーターが挙げられる。
本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体は、細菌および真菌などの適切な微生物の宿主細胞で産生することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体は、グラム陽性菌によって産生することができる。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の菌種、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）の菌種、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）の菌種、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）の菌種、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）の菌種、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）の菌種、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の菌種、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）の菌種またはピチア属（Ｐｉｃｈｉａ）の菌種である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の菌種の宿主細胞によって産生される。本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体の生成に利用されるバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の菌種の宿主細胞の例としては、限定はされないが、Ｂ．リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、Ｂ．レンツス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）、Ｂ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｂ．アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、Ｂ．レンツス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）、Ｂ．ブレビス（Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ）、Ｂ．ステアロサーモフィルス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｂ．アルカロフィルス（Ｂ．ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｂ．コアグランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、Ｂ．サーキュランス（Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、Ｂ．プミリス（Ｂ．ｐｕｍｉｌｉｓ）、Ｂ．チューリンゲンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）、Ｂ．クラウシイ（Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ）およびＢ．メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）ならびにバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属の他の生体が挙げられる。いくつかの実施形態では、Ｂ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）宿主細胞は、本明細書に記載の変異体を産生するために使用される。米国特許第５，２６４，３６６号明細書および同４，７６０，０２５号（再発行特許第３４，６０６号）明細書には、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体の産生に使用することができる種々のバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主株が記載されているが、他の好適な株も使用することができる。
本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体の産生に使用することができるいくつかの細菌株を挙げると、非組換え（すなわち、野生型）バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の菌株、ならびに種々の天然に存在する菌株の変種および／または組換え株がある。いくつかの実施形態では、宿主株は組換え株であり、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体をコードするポリヌクレオチドが宿主に導入されている。いくつかの実施形態では、宿主菌株は、Ｂ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）宿主菌株、特に組換えＢ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）宿主菌株である。多くのＢ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）菌株が知られており、限定はされないが、例えば、１Ａ６（ＡＴＣＣ ３９０８５）、１６８（１Ａ０１）、ＳＢ１９、Ｗ２３、Ｔｓ８５、Ｂ６３７、ＰＢ１７５３〜ＰＢ１７５８、ＰＢ３３６０、ＪＨ６４２、１Ａ２４３（ＡＴＣＣ ３９，０８７）、ＡＴＣＣ ２１３３２、ＡＴＣＣ ６０５１、ＭＩ１１３、ＤＥ１００（ＡＴＣＣ ３９，０９４）、ＧＸ４９３１、ＰＢＴ １１０、およびＰＥＰ ２１１株が挙げられる（例えば、Ｈｏｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ７３：２１５−２２８（１９７３）を参照されたい；また米国特許第４，４５０，２３５号明細書、同４，３０２，５４４号明細書、および欧州特許第０１３４０４８号明細書を参照されたい）。Ｂ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の発現宿主細胞としての使用は、当該技術分野でよく知られている（例えば、Ｐａｌｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ １９：８１−８７（１９８２）；Ｆａｈｎｅｓｔｏｃｋ ａｎｄ Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６５：７９６−８０４（１９８６）；およびＷａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ６９：３９−４７（１９８８）を参照されたい）。
いくつかの実施形態では、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞は、次の遺伝子、ｄｅｇＵ、ｄｅｇＳ、ｄｅｇＲ、およびｄｅｇＱの少なくとも１つに変異または欠失を含むバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の菌種である。いくつかの実施形態では、変異はｄｅｇＵ遺伝子にあり、いくつかの実施形態では、変異はｄｅｇＵ（Ｈｙ）３２である（例えば、Ｍｓａｄｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２：８２４−８３４（１９９０）；およびＯｌｍｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２５３：５６２−５６７（１９９７）を参照されたい）。いくつかの実施形態では、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主は、ｓｃｏＣ４（例えば、Ｃａｌｄｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８３：７３２９−７３４０，２００１を参照されたい）；ｓｐｏＩＩＥ（例えば、Ａｒｉｇｏｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３１：１４０７−１４１５，１９９９を参照されたい）；および／またはｏｐｐＡもしくはｏｐｐオペロンの他の遺伝子（例えば、Ｐｅｒｅｇｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５：１７３−１８５，１９９１を参照されたい）に変異もしくは欠失を含む。実際、ｏｐｐＡ遺伝子の変異と同じ表現型を生じさせるｏｐｐオペロンの変異はいずれも、本明細書に記載の変異バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）菌株のいくつかの実施形態で使用されると考えられる。いくつかの実施形態では、これらの変異は単独で発生するが、他の実施形態では、変異の組み合わせが存在する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体を産生させるために使用することができる変異バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞菌株は、上記遺伝子の１つ以上に既に変異を含むバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主菌株である。さらに、内因性プロテアーゼ遺伝子の変異および／または欠失を含むバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の菌種の宿主細胞も使用される。いくつかの実施形態では、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞は、ａｐｒＥおよびｎｐｒＥ遺伝子の欠失を含む。他の実施形態では、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の菌種の宿主細胞は、５つのプロテアーゼ遺伝子の欠失を含む一方、他の実施形態では、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の菌種の宿主細胞は、９つのプロテアーゼ遺伝子の欠失を含む（例えば、米国特許出願公開第２００５／０２０２５３５号明細書を参照されたい）。
宿主細胞は、当該分野で公知の任意の適切な方法を使用して、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体をコードする１種以上の核酸配列により形質転換される。プラスミドＤＮＡコンストラクトまたはベクターを用いて核酸（例えば、ＤＮＡ）をバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞またはＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞に導入し、そのようなプラスミドＤＮＡコンストラクトまたはベクターをそのような細胞に形質転換する方法はよく知られている。いくつかの実施形態では、プラスミドは、その後、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞から単離され、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞へ形質転換される。しかしながら、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの介在微生物を使用することは必須ではなく、いくつかの実施形態では、ＤＮＡコンストラクトまたはベクターはバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主に直接導入される。
本明細書に記載の１種以上の核酸配列をバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞に導入するための方法の例は、例えば、Ｆｅｒｒａｒｉ ｅｔ ａｌ．，”Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，”ｉｎ Ｈａｒｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．［ｅｄｓ．］，Ｂａｃｉｌｌｕｓ，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｒｐ．（１９８９）、ｐｐ．５７−７２；Ｓａｕｎｄｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５７：７１８−７２６（１９８４）；Ｈｏｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．９３：１９２５−１９３７（１９６７）；Ｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３：１３１−１３５（１９８６）；Ｈｏｌｕｂｏｖａ，Ｆｏｌｉａ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３０：９７（１９８５）；Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１６８：１１−１１５（１９７９）；Ｖｏｒｏｂｊｅｖａ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．７：２６１−２６３（１９８０）；Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５１：６３４（１９８６）；Ｆｉｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３９：２１３−２１７（１９８１）；およびＭｃＤｏｎａｌｄ，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３０：２０３（１９８４））に記載されている。実際、プロトプラスト形質転換および形質移入、形質導入、ならびにプロトプラスト融合を含む形質転換の方法はよく知られており、本明細書で使用するのに適している。当該技術分野で知られているバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞の形質転換方法としては、プラスミドマーカーレスキュー形質転換などの方法があり、これは、部分的に相同の内在プラスミドを運ぶコンピテントセルによってドナープラスミドを取り込むことを含む（Ｃｏｎｔｅｎｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｓｍｉｄ ２：５５５−５７１（１９７９）；Ｈａｉｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２２３：１８５−１９１（１９９０）；Ｗｅｉｎｒａｕｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５４：１０７７−１０８７（１９８３）；およびＷｅｉｎｒａｕｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９：１２０５−１２１１（１９８７）を参照されたい）。この方法では、入来ドナープラスミドが、染色体の形質転換に類似した方法で、内在する「ヘルパー」プラスミドの相同領域に再結合する。
一般的に使用される方法に加えて、いくつかの実施形態では、宿主細胞は、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体プをコードする核酸を含むＤＮＡコンストラクトまたはベクターで直接形質転換される（すなわち、宿主細胞に導入する前にＤＮＡコンストラクトまたはベクターを増幅するため、または他の処理をするために中間細胞が使用されない）。本明細書に記載のＤＮＡコンストラクトまたはベクターの宿主細胞への導入には、核酸配列（例えば、ＤＮＡ配列）を宿主ゲノムに挿入せずに宿主細胞に導入するための、当該技術分野で知られた物理的および化学的方法が含まれる。そのような方法としては、限定はされないが、塩化カルシウム沈澱法、エレクトロポレーション法、裸ＤＮＡ法、リポソーム法などが挙げられる。さらなる実施形態では、ＤＮＡコンストラクトまたはベクターをプラスミドに挿入せずに、プラスミドと共に同時形質転換する。さらなる実施形態では、選択的マーカーは、当該技術分野において公知の方法によって、改変バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）菌株から欠失させられる（例えば、Ｓｔａｈｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５８：４１１−４１８（１９８４）およびＰａｌｍｅｒｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ２４７：２５５−２６４（２０００）を参照されたい）。
いくつかの実施形態では、形質転換細胞は、従来の栄養培地中で培養される。温度、ｐＨなどの、好適な具体的培養条件は、当業者に知られており、また科学文献に十分に記載されている。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体または核酸配列を含む培養物（例えば、細胞培養物）が提供される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体をコードする１種以上のポリヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞は、変異体の発現を可能にする条件下で、適切な栄養培地中で培養され、その後、得られた変異体は培養物から回収される。いくつかの実施形態では、細胞によって産生された変異体を培地から従来の手順で回収する。手順としては、限定はされないが、例えば、遠心分離またはろ過によって宿主細胞を培地から分離し、上清または濾液のタンパク質成分を塩（例えば、硫酸アンモニウム）で沈澱させ、クロマトグラフィーによる精製（例えばイオン交換、ゲルろ過、アフィニティなど）を行うことが挙げられる。
いくつかの実施形態では、組換え宿主細胞によって産生される１種以上のスブチリシン変異体は、培養培地中に分泌される。精製促進ドメインをコードする核酸配列を変異体の精製促進に使用することができる。本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体をコードする、ポリヌクレオチド配列を含むベクターまたはＤＮＡコンストラクトは、変異体の精製を容易にするために精製促進ドメインをコードする核酸配列を更に含み得る（例えば、Ｋｒｏｌｌ ｅｔ ａｌ．，ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１２：４４１−５３（１９９３）を参照されたい）。そのような精製促進ドメインとしては、限定はされないが、例えば、固定化金属上での精製を可能にするヒスチジン−トリプトファンモジュールなどの金属キレートペプチド（Ｐｏｒａｔｈ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．３：２６３−２８１（１９９２）を参照されたい）、固定化免疫グロブリン上での精製を可能にするタンパク質Ａドメイン、ＦＬＡＧＳエクステンション／アフィニティ精製システムで使用されるドメインが挙げられる。精製ドメインと異種タンパク質間への、ＸＡ因子またはエンテロキナーゼなどの開裂可能なリンカー配列（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡから入手可能な配列）の組込みも精製の促進に使用される。
本明細書に記載の、１種以上の成熟スブチリシン変異体の産生レベルを測定するには、様々な方法を使用することができる。そのような方法としては、限定はされないが、例えばプロテアーゼに特異的な、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれかを使用する方法が挙げられる。方法の例としては、限定はされないが、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、および蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）が挙げられる。これらおよびその他のアッセイは、当該技術分野でよく知られている（例えば、Ｍａｄｄｏｘ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５８：１２１１（１９８３））を参照されたい）。
いくつかの他の実施形態は、本明細書に記載の１種以上の成熟スブチリシン変異体の生成または産生方法を提供する。成熟スブチリシン変異体は、シグナルペプチドまたはプロペプチド配列を含まない。いくつかの方法は、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体を、例えば、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の菌種の細胞（例えば、Ｂ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞）などの組換え細菌宿主細胞中で生成または産生することを含む。他の実施形態は、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体をコードする核酸配列を含む組換え発現ベクターを含む組換え宿主細胞を、変異体の産生を促す条件下で培養することを含む、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体を産生する方法を提供する。いくつかのそのような方法は、培養物から変異体を回収することをさらに含む。
さらなる実施形態は、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体を産生する方法を提供し、その方法は（ａ）変異体をコードする核酸を含む組換え発現ベクターを、細胞（例えば、Ｂ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞などの細菌細胞）の集団に導入する工程；および（ｂ）発現ベクターによってコードされた変異体の産生を促す条件下で、培地中の細胞を培養する工程を含む。いくつかのそのような方法は、（ｃ）細胞または培養培地から変異体を単離する工程をさらに含む。
特段の記載がない限り、本明細書で提供される全ての成分または組成物のレベルは、その成分または組成物の活性レベルを基準に調整され、市販の供給源に存在し得る不純物、例えば、残存溶媒または副産物を含まない。酵素成分の重量は、全活性タンパク質量を基準とする。特に指示がない限り、パーセンテージおよび比率の全ては重量によって計算する。特に指示がない限り、パーセンテージおよび比率の全ては、全組成物に基づいて計算される。本明細書に記載の組成物は、洗剤組成物などの洗浄用組成物を含む。例示した洗剤組成物では、酵素レベルは全組成物の重量によって純粋な酵素を表わし、別段の規定がなければ、洗剤成分は全組成物の重量によって表される。
一実施形態では、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体は、限定はされないが、例えば、食器またはテーブルウェア製品、布帛、医療器具および硬質表面を有する物品（例えば、テーブル、テーブルトップ、壁、家具製品、床および天井の硬質表面）の洗浄などの洗浄用途に有用である。他の実施形態では、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体は、限定はされないが、例えば、自動食器洗浄機または洗濯機の消毒などの消毒用途に有用である。
他の実施形態は、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体を含む組成物に関する。いくつかの実施形態では、組成物は洗浄用組成物である。他の実施形態では、組成物は洗剤組成物である。さらに他の実施形態では、組成物は、洗濯用洗剤組成物、自動食器洗浄機（ＡＤＷ）用組成物、手洗浄（手作業）による食器洗浄洗剤組成物、硬質表面洗浄用組成物、眼鏡洗浄用組成物、医療機器洗浄用組成物、殺菌（例えば、悪臭または微生物）用組成物、およびパーソナルケア洗浄用組成物から選択される。さらに他の実施形態では、組成物は、洗濯用洗剤組成物、ＡＤＷ用組成物、または手洗浄（手作業）による食器洗浄用洗剤組成物である。なおまたさらなる実施形態は、布帛洗浄用組成物に関し、他の実施形態は布帛以外の洗浄用組成物に関する。いくつかの実施形態では、洗浄用組成物はホウ素を含まない。他の実施形態では、洗浄用組成物はリン酸塩を含まない。さらに他の実施形態では、組成物は、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体と、賦形剤、補助材料および／または追加の酵素のうちの１つ以上を含む。
なおまたさらなる実施形態では、本明細書に記載の組成物は、リン酸塩を含有するか、リン酸塩を含まないか、ホウ素を含むか、ホウ素を含まないか、またはこれらの組み合わせである。他の実施形態では、組成物はホウ素を含有しない組成物である。いくつかの実施形態では、ホウ素非含有組成物は、ホウ酸塩安定化剤が添加されていない組成物である。他の実施形態では、ホウ素非含有組成物は、ホウ素含有量が５．５％未満の組成物である。またさらなる実施形態では、ホウ素非含有組成物は、ホウ素含有量が４．５％未満の組成物である。なおさらに別の実施形態では、ホウ素非含有組成物は、ホウ素含有量が３．５％未満の組成物である。なおまたさらなる実施形態では、ホウ素非含有組成物は、ホウ素含有量が２．５％未満の組成物である。なおさらなる実施形態では、ホウ素非含有組成物は、ホウ素含有量が１．５％未満の組成物である。別の実施形態では、ホウ素非含有組成物は、ホウ素含有量が１．０％未満の組成物である。またさらなる実施形態では、ホウ素非含有組成物は、ホウ素含有量が０．５％未満の組成物である。またさらなる実施形態では、ホウ素非含有組成物は、ホウ素を実質的に含有しない組成物である。
別の実施形態では、本明細書に記載の１種以上の組成物は、ゲル、タブレット状、粉末、粒状、固体、液体、単位用量、およびこれらの組み合わせの形態を有する。なお別の実施形態では、本明細書に記載の１種以上の組成物は、低水量コンパクト製剤、低水量ＨＤＬもしくはＵＤ、または高水量製剤もしくはＨＤＬから選択される形態を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の洗浄用組成物は、単位用量形態を有する。他の実施形態では、単位用量形態は、丸剤、タブレット、カプセル、ゲルカプセル、小袋、袋、多区画袋、および予め計量した粉末または液体から選択される。いくつかの実施形態では、単位用量形態は多区画袋（または他の単位用量形態）内の成分の放出が制御されるように設計されている。好適な単位用量形態および放出制御製剤は、例えば、欧州特許第２１００９４９号明細書；国際公開第０２／１０２９５５号パンフレット；米国特許第４，７６５，９１６号明細書；米国特許第４，９７２，０１７号明細書および国際公開第０４／１１１１７８号パンフレットに記載されている。いくつかの実施形態では、単位用量形態は、水溶性のフィルムまたは袋に含有されたタブレットまたは粉末である。
洗濯用洗剤組成物の例としては、限定はされないが、例えば、液体および粉末洗濯用洗剤組成物が挙げられる。硬質表面洗浄用組成物の例としては、限定はされないが、例えば、非食器製品、非テーブルウェア製品、テーブル、テーブルトップ、家具製品、壁、床、および天井の硬質表面を洗浄するために使用される組成物が挙げられる。硬質表面洗浄用組成物の例としては、例えば、米国特許第６，６１０，６４２号明細書、同第６，３７６，４５０号明細書、および同第６，３７６，４５０号明細書に記載されている。パーソナルケア組成物の例としては、限定はされないが、義歯、歯、毛髪、コンタクトレンズ、および皮膚を洗浄するために使用される組成物が挙げられる。そのような口腔ケア組成物の成分の例としては、例えば、米国特許第６，３７６，４５０号明細書に記載されているものが挙げられる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体は、低温で清浄にする。他の実施形態では、本明細書に記載の１種以上の組成物は、低温で清浄にする。他の実施形態では、本明細書に記載の１種以上の組成物は、タンパク質性の染みの除去が必要な表面の洗浄に有用または有効なものとして、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体の有効量を含む。
いくつかの実施形態では、補助材料は、例えば、洗浄性能を補助または増大させるため、洗浄する基材の処理のため、あるいは香水、着色剤、染料などと同様に洗浄用組成物の美観を変えるために組み込まれる。ある実施形態は、１種以上の補助材料と、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体とを含む組成物に関する。別の実施形態は、１種以上の補助材料と、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体とを含む組成物であって、補助材料が漂白触媒、追加の酵素、酵素安定剤（例えば、酵素安定化システムを含む）、キレート剤、蛍光増白剤、汚れ放出ポリマー、染料移動剤、分散剤、泡抑制剤、染料、香料、着色剤、充填剤、光活性化剤、蛍光剤、布帛コンディショナー、加水分解性界面活性剤、保存剤、酸化防止剤、収縮防止剤、皺防止剤、殺菌剤、防カビ剤、着色スペックル、銀ケア剤、変色防止剤、腐食防止剤、アルカリ度源、可溶化剤、担体、加工助剤、色素、ｐＨ制御剤、界面活性剤、ビルダー、キレート剤、染料移行抑止剤、沈着助剤、分散剤、触媒物質、漂白活性化剤、漂白ブースター、過酸化水素、過酸化水素源、予形成過酸、ポリマー分散剤、泥汚れ除去／再付着防止剤、構造弾性化剤、布帛柔軟剤、担体、ヒドロトロープ、加工助剤、顔料およびこれらの組み合わせから選択される組成物に関する。補助材料および使用濃度の例は、米国特許第５，５７６，２８２号明細書、同第６，３０６，８１２号明細書；同第６，３２６，３４８号明細書、同第６，６１０，６４２号明細書、同第６，６０５，４５８号明細書、同第５，７０５，４６４号明細書、同第５，７１０，１１５号明細書、同第５，６９８，５０４号明細書、同第５，６９５，６７９号明細書、同第５，６８６，０１４号明細書および同第５，６４６，１０１号明細書に記載されている。１種以上の洗浄補助材料と本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体との混合性が悪い実施形態では、それらの２つの成分の混合が適切になるまで、補助材料と変異体を分離させておく（すなわち、互いに接触させないでおく）方法を使用することができる。そのような分離方法として、当該技術分野において知られているあらゆる適切な方法（例えば、ゲルキャップ、カプセル化、タブレット、物理的分離その他）が挙げられる。
いくつかの実施形態は、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体を含む洗浄添加剤に関する。いくつかの実施形態では、添加剤は、洗浄プロセスに添加するために、用量形態にパッケージングされている。いくつかの実施形態では、添加剤は、ペルオキシジン源が利用され、高い漂白効果が望まれる洗浄プロセスへの添加のために用量形態にパッケージングされる。
粒状組成物用の充填剤またはキャリアの例としては、限定はされないが、例えば各種の、硫酸塩、炭酸塩およびケイ酸塩；タルクならびにクレーが挙げられる。液体組成物用の充填剤またはキャリアの例としては、限定はされないが、例えば、水またはポリオールおよびジオールを含む低分子量の第１級および第２級アルコール（例えば、メタノール、エタノール、プロパノールおよびイソプロパノール）が挙げられる。いくつかの実施形態では、組成物は、そのような充填剤またはキャリアを約５％〜約９０％含有する。そのような組成物に酸性充填剤を含有させ、洗浄方法または洗浄用途で生じる溶液のｐＨを低下させることができる。
一実施形態では、本明細書に記載の１種以上の洗浄用組成物は、本明細書に記載の１種以上の、有効量のスブチリシン変異体を、単独で、または１種以上の追加の酵素と組み合わされて含む。典型的には、洗浄用組成物は、少なくとも約０．０００１〜約２０重量％、約０．０００１〜約１０重量％、約０．０００１〜約１重量％、約０．００１〜約１重量％または約０．０１〜約０．１重量％の１種以上のプロテアーゼを含む。別の実施形態では、本明細書に記載の１種以上の洗浄用組成物は、１種以上のプロテアーゼを、組成物１グラム当たり、約０．０１〜約１０ｍｇ、約０．０１〜約５ｍｇ、約０．０１〜約２ｍｇ、約０．０１〜約１ｍｇ、約０．０５〜約１ｍｇ、約０．５〜約１０ｍｇ、約０．５〜約５ｍｇ、約０．５〜約４ｍｇ、約０．５〜約４ｍｇ、約０．５〜約３ｍｇ、約０．５〜約２ｍｇ、約０．５〜約１ｍｇ、約０．１〜約１０ｍｇ、約０．１〜約５ｍｇ、約０．１〜約４ｍｇ、約０．１〜約３ｍｇ、約０．１〜約２ｍｇ、約０．１〜約２ｍｇ、約０．１〜約１ｍｇまたは約０．１〜約０．５ｍｇ含む。
本明細書に記載の洗浄用組成物は、典型的には、水性洗浄作業で使用中に、洗浄水のｐＨが約４．０〜約１１．５、さらには約５．０〜約１１．５、さらには約５．０〜約８．０、さらには約７．５〜約１０．５となるように調合される。液体製品調合物は、通常、約３．０〜約９．０または約３〜約５のｐＨを有するように調合される。粒状の洗濯用製品は、通常、約９〜約１１のｐＨを有するように調合される。いくつかの実施形態では、本発明の洗浄用組成物は、洗い条件下でアルカリｐＨ、例えば、約８．０〜約１２．０、または約８．５〜約１１．０、または約９．０〜約１１．０のｐＨを有するように調合することができる。いくつかの実施形態では、本発明の洗浄用組成物は、洗い条件下で中性ｐＨ、例えば、約５．０〜約８．０、または約５．５〜約８．０、または約６．０〜約８．０、または約６．０〜約７．５のｐＨを有するように調合することができる。いくつかの実施形態では、中性ｐＨ条件は、洗浄用組成物を２０℃で、脱イオン水に１：１００（重量：重量）で溶解させ、従来のｐＨ計を使用して測定した場合に測定され得る。推奨される使用濃度でのｐＨの調整手法としては、緩衝液、アルカリ、酸などの使用が挙げられるが、手法は当業者にはよく知られている。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体は、保存時に組成物中の他の成分からそれを保護するために、かつ／または洗浄時に変異体の利用を制御するためにカプセル化される。いくつかの実施形態では、カプセル化は、変異体および／または追加酵素の性能を増大させる。いくつかの実施形態では、カプセル化材は、通常、本明細書に記載の変異体の少なくとも一部をカプセル化する。通常、カプセル化材は水溶性および／または水分散性である。いくつかの実施形態では、カプセル化材は、ガラス転移温度（Ｔｇ）が０℃以上である。カプセル化材料の例としては、限定はされないが、炭水化物、天然または合成ガム、キチン、キトサン、セルロースおよびセルロース誘導体、ケイ酸塩、リン酸塩、ホウ酸塩、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、パラフィンワックス、およびこれらの組み合わせが挙げられる。カプセル化材が炭水化物である場合、通常、単糖類、オリゴ糖類、多糖類、およびこれらの組み合わせから選択される。いくつかの実施形態では、カプセル化材はデンプンである（例えば、欧州特許第０９２２４９９号明細書、米国特許第４，９７７，２５２号明細書、米国特許第５，３５４，５５９号明細書および米国特許第５，９３５，８２６号明細書を参照されたい）。いくつかの実施形態では、カプセル化材は熱可塑性プラスチック、アクリロニトリル、メタクリロニトリル、ポリアクリロニトリル、ポリメタクリロニトリル、およびそれらの混合物などのプラスチックから作製されるマイクロスフィアである。市販のマイクロスフィアの例としては、限定はされないが、ＥＸＰＡＮＣＥＬ（登録商標）（Ａｋｚｏ Ｎｏｂｅｌ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｂ．Ｖ．）；ＰＭ６５４５、ＰＭ６５５０、ＰＭ７２２０、ＰＭ７２２８、およびＥＸＴＥＮＤＯＳＰＨＥＲＥＳ（登録商標）（Ｓｐｈｅｒｅ Ｏｎｅ Ｉｎｃ．）；ならびにＬＵＸＳＩＬ（登録商標）、Ｑ−ＣＥＬ（登録商標）、およびＳＰＨＥＲＩＣＥＬ（登録商標）（Ｐｏｔｔｅｒｓ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ ＬＬＣ）が挙げられる。
様々な洗剤調合物、洗浄水量、洗浄水温度、および本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体が曝露される洗浄時間の長さを含む、様々な洗浄条件が存在する。低洗剤濃度のシステムは、約８００ｐｐｍ未満の洗剤成分を含有する洗浄水に関する。中程度の洗剤濃度システムは、約８００ｐｐｍ〜２０００ｐｐｍの洗剤成分を含有する洗浄に関する。高洗剤濃度のシステムは、約２０００ｐｐｍ超の洗剤成分を含有する洗浄水に関する。いくつかの実施形態では、本発明の「冷水洗浄」は、約１０℃〜約４０℃、約２０℃〜約３０℃、または約１５℃〜約２５℃および約１５℃〜約３５℃または１０℃〜４０℃の範囲内の他の全てを組み合わせた温度での洗浄に好適な「冷水洗剤」を使用する。
異なる地理は、異なる水硬度を有する。硬度は、水中のカルシウム（Ｃａ２＋）とマグネシウム（Ｍｇ２＋）の量の計測値である。水の硬度は、通常、Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋を混合した、１ガロン当たりのグレインを単位として記載される。米国における水の殆どは硬質であるが、硬度は異なっている。中度硬水（６０〜１２０ｐｐｍ）〜硬水（１２１〜１８１ｐｐｍ）の水は、６０〜１８１ｐｐｍ（ｐｐｍを１７．１で割ることによってｐｐｍを米国ガロン当たりのグレインに変換することができる）の硬度のミネラルを有する。
Figure 2019523645
他の実施形態は、組成物の約０．００００１重量％〜約１０重量％の本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体と、組成物の約９９．９９９重量％〜約９０．０重量％の１種以上の補助材料とを含む１種以上の洗浄用組成物に関する。別の実施形態では、洗浄用組成物は、組成物の約０．０００１重量％〜約１０重量％、約０．００１重量％〜約５重量％、約０．００１重量％〜約２重量％、約０．００５重量％〜約０．５重量％の１種以上のスブチリシン変異体と、組成物の約９９．９９９９重量％〜約９０．０重量％、約９９．９９９重量％〜約９８重量％、約９９．９９５重量％〜約９９．５重量％の１種以上の補助材料とを含む。
他の実施形態では、本明細書に記載の組成物は、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体、および１種以上の追加の酵素を含む。１種または複数の付加的酵素は、アシルトランスフェラーゼ、アルファ−アミラーゼ、ベータ−アミラーゼ、アルファ−ガラクトシダーゼ、アラビノシダーゼ、アリールエステラーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、カラギナーゼ、カタラーゼ、セロビオヒドラーゼ、セルラーゼ、コンドロイチナーゼ、クチナーゼ、ＤＮａｓｅまたはヌクレアーゼ、エンド−ベータ−１，４−グルカナーゼ、エンド−ベータ−マンナナーゼ、エステラーゼ、エキソ−マンナナーゼ、ガラクタナーゼ、グルコアミラーゼ、ヘミセルラーゼ、ヒアルロニダーゼ、ケラチナーゼ、ラッカーゼ、ラクターゼ、リグニナーゼ、リパーゼ、リポキシゲナーゼ、リゾチーム、マンナナーゼ、メタロプロテアーゼ、オキシダーゼ、ペクチン酸リアーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ペクチナーゼ、ペントサナーゼ、ペルオキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、ホスファターゼ、ホスフォリパーゼ、フィターゼ、ポリガラクツロナーゼ、追加プロテアーゼ、プルラナーゼ、リダクターゼ、ラムノガラクツロナーゼ、ベータ−グルカナーゼ、タンナーゼ、トランスグルタミナーゼ、キシランアセチルエステラーゼ、キシラナーゼ、キシログルカナーゼ、キシロシダーゼ、およびそれらのあらゆる組合せまたは混合物から選択される。いくつかの実施形態は、アミラーゼ、リパーゼ、クチナーゼおよび／またはセルラーゼなどの従来の酵素を、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体、および／または１種以上の追加プロテアーゼと共に含む酵素の組み合わせ（すなわち、「カクテル」）に関する。
別の実施形態では、本明細書に記載の１種以上の組成物は、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体、および１種以上の追加のプロテアーゼを含む。一実施形態では、追加のプロテアーゼはセリンプロテアーゼである。別の実施形態では、追加のプロテアーゼは、アルカリ微生物プロテアーゼまたはトリプシン様プロテアーゼである。好適な追加のプロテアーゼとしては、動物、野菜または微生物起源のものが挙げられる。いくつかの実施形態では、追加のプロテアーゼは、微生物プロテアーゼである。他の実施形態では、追加のプロテアーゼは、化学的に、または遺伝子的に改変された変異体である。別の実施形態では、追加のプロテアーゼは、アルカリ微生物プロテアーゼまたはトリプシン様プロテアーゼである。アルカリプロテアーゼの例としては、例えば、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）に由来するスブチリシン（例えば、スブチリシン、レンツス（ｌｅｎｔｕｓ）、アミロリケファシエンス（ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、ギブソニイ（ｇｉｂｓｏｎｉｉ）、スブチリシンカールスバーグ、スブチリシン３０９、スブチリシン１４７、およびスブチリシン１６８）が挙げられる。メタロプロテアーゼの例としては、Ｂ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）で発現される中性メタロプロテアーゼの組換え形態（例えば、国際公開０７／０４４９９３号パンフレットを参照されたい）であるｎｐｒＥ、およびＢ．アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｔｓ）由来の精製された中性メタロプロテアーゼであるＰＭＮが挙げられる。さらなるプロテアーゼの例としては、限定はされないが、国際公開第９２／２１７６０号パンフレット、同第９５／２３２２１号パンフレット、同第２００８０１０９２５号パンフレット、同第０９１４９２００号パンフレット、同第０９１４９１４４号パンフレット、同第０９１４９１４５号パンフレット、同第１００５６６４０号パンフレット、同第１００５６６５３号パンフレット、同第２０１００５６６３５６号パンフレット、同第２０１１０７２０９９号パンフレット、同第２０１１１３０２２号パンフレット、同第１１１４０３６４号パンフレット、同第２０１２１５１５３４号パンフレット、同第２０１５０３８７９２号パンフレット、同第２０１５／０８９４４１号パンフレット、同第２０１５０８９４４７号パンフレット、同第２０１５１４３３６０号パンフレット、同第２０１６００１４４９号パンフレット、同第２０１６００１４５０号パンフレット、同第２０１６０６１４３８号パンフレット、同第２０１６０６９５４４、同第２０１６０６９５４８号パンフレット、同第２０１６０６９５５２号パンフレット、同第２０１６０６９５５７号パンフレット、同第２０１６０６９５６３号パンフレット、同第２０１６０６９５６９号パンフレット、同第２０１６０８７６１７号パンフレット、同第２０１６０８７６１９号パンフレット、同第２０１６１４５４２８号パンフレット、同第２０１６１７４２３４号パンフレット、同第２０１６１８３５０９号パンフレット、同第２０１６２０２８３５号パンフレット、同第２０１６２０５７５５号パンフレット、米国特許出願公開第２００８／００９０７４７号明細書、米国特許第５，８０１，０３９号明細書、米国特許第５，３４０，７３５号明細書、米国特許第５，５００，３６４号明細書、米国特許第５，８５５，６２５号明細書、再発行特許第３４，６０６号明細書、米国特許第５，９５５，３４０号明細書、米国特許第５，７００，６７６号明細書、米国特許第６，３１２，９３６号明細書、米国特許第６，４８２，６２８号明細書、米国特許第８，５３０，２１９号明細書、米国仮特許出願第６２／３３１２８２号明細書、同第６２／３５１６４９号明細書、同第６２／４３７１７１号明細書、同第６２／４３７１７４号明細書および同第６２／４３７５０９号明細書ならびにＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＣＮ２０１７／０７６７４９号明細書および同第ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０２９３０７号明細書に記載されているもの、また国際公開第１９９９０１４３４１号パンフレット、同第１９９９０３３９６０号パンフレット、同第１９９９０１４３４２号パンフレット、同第１９９９０３４００３号パンフレット、同第２００７０４４９９３号パンフレット、同第２００９０５８３０３号パンフレット、同第２００９０５８６６１号パンフレット、同第２０１４０７１４１０号パンフレット、同第２０１４１９４０３２号パンフレット、同第２０１４１９４０３４号パンフレット、同第２０１４１９４０５４号パンフレットおよび同第２０１４１９４１１７号パンフレットに記載されているメタロプロテアーゼが挙げられる。さらなるプロテアーゼの例としてはまた、限定はされないが、トリプシン（例えば、ブタもしくはウシ起源）および国際公開第８９／０６２７０号パンフレットに記載のフザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）プロテアーゼが挙げられる。市販のプロテアーゼの例としては、限定はされないが、ＭＡＸＡＴＡＳＥ、ＭＡＸＡＣＡＬ、ＭＡＸＡＰＥＭ、ＯＰＴＩＣＬＥＡＮ（登録商標）、ＯＰＴＩＭＡＳＥ（登録商標）、ＰＲＯＰＥＲＡＳＥ（登録商標）、ＰＵＲＡＦＥＣＴ（登録商標）、ＰＵＲＡＦＥＣＴ（登録商標）ＯＸＰ、ＰＵＲＡＭＡＸ（登録商標）、ＥＸＣＥＬＬＡＳＥ（登録商標）、ＰＲＥＦＥＲＥＮＺ（商標）プロテアーゼ（例えば、Ｐ１００、Ｐ１１０、Ｐ２８０）、ＥＦＦＥＣＴＥＮＺ（商標）プロテアーゼ（例えば、Ｐ１０００、Ｐ１０５０、Ｐ２０００）、ＥＸＣＥＬＬＥＮＺ（商標）プロテアーゼ（例えばＰ１０００）、ＵＬＴＩＭＡＳＥ（登録商標）およびＰＵＲＡＦＡＳＴ（Ｄａｎｉｓｃｏ ＵＳ）；ＡＬＣＡＬＡＳＥ（登録商標）、ＡＬＣＡＬＡＳＥ（登録商標）ＵＬＴＲＡ、ＢＬＡＺＥ（登録商標）、ＢＬＡＺＥ（登録商標）ＥＶＩＴＹ（登録商標）、ＢＬＡＺＥ（登録商標）ＥＶＩＴＹ（登録商標）１６Ｌ、ＣＯＲＯＮＡＳＥ（登録商標）、ＳＡＶＩＮＡＳＥ（登録商標）、ＳＡＶＩＮＡＳＥ（登録商標）ＵＬＴＲＡ、ＳＡＶＩＮＡＳＥ（登録商標）ＥＶＩＴＹ（登録商標）、ＳＡＶＩＮＡＳＥ（登録商標）ＥＶＥＲＩＳ（登録商標）、ＰＲＩＭＡＳＥ、ＤＵＲＡＺＹＭ、ＰＯＬＡＲＺＹＭＥ（登録商標）、ＯＶＯＺＹＭＥ（登録商標）、ＫＡＮＮＡＳＥ（登録商標）、ＬＩＱＵＡＮＡＳＥ（登録商標）、ＥＶＥＲＩＳ（登録商標）、ＮＥＵＴＲＡＳＥ（登録商標）、ＰＲＯＧＲＥＳＳ ＵＮＯ（登録商標）、ＲＥＬＡＳＥ（登録商標）およびＥＳＰＥＲＡＳＥ（登録商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）；ＢＬＡＰ（商標）およびＢＬＡＰ（商標）変異体（Ｈｅｎｋｅｌ）；ＬＡＶＥＲＧＹ（商標）ＰＲＯ １０４Ｌ（ＢＡＳＦ）、ならびにＫＡＰ（登録商標）（Ｂ．アルカロフィルス（Ｂ．ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）スブチリシン）（花王株式会社）が挙げられる。
他の実施形態は、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体と、１種以上のリパーゼとを含む組成物に関する。いくつかの実施形態では、組成物は、組成物の約０．００００１重量％〜約１０重量％、約０．０００１重量％〜約１０重量％、約０．００１重量％〜約５重量％、約０．００１重量％〜約２重量％、または約０．００５重量％〜約０．５重量％のリパーゼを含む。リパーゼの一例は、化学的にまたは遺伝子操作により改変された変異体であり得る。リパーゼの例としては、限定はされないが、例えば、細菌または真菌起源のもの、例えば、Ｈ．ラヌギノーサ（Ｈ．ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）リパーゼ（例えば、欧州特許第２５８０６８号明細書および欧州特許第３０５２１６号明細書を参照されたい）、Ｔ．ラヌギノサス（Ｔ．ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）リパーゼ（例えば、国際公開第２０１４／０５９３６０号パンフレットおよび国際公開第２０１５／０１０００９号パンフレットを参照されたい）、リゾムコール・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）リパーゼ（例えば、欧州特許第２３８０２３号明細書を参照されたい）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）リパーゼ、例えばＣ．アンタークティカ（Ｃ．ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）リパーゼ（例えば、Ｃ．アンタークティカ（Ｃ．ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）リパーゼＡまたはＢ）（例えば、欧州特許第２１４７６１号明細書を参照されたい）、Ｐ．アルカリゲネス（Ｐ．ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）およびＰ．シュードアルカリゲネス（Ｐ．ｐｓｅｕｄｏａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）などのシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）リパーゼ（例えば、欧州特許第２１８２７２号明細書を参照されたい）、Ｐ．セパシア（Ｐ．ｃｅｐａｃｉａ）リパーゼ（例えば、欧州特許第３３１３７６号明細書を参照されたい）、Ｐ．スタッツェリ（Ｐ．ｓｔｕｔｚｅｒｉ）リパーゼ（例えば、英国特許第１，３７２，０３４号明細書を参照されたい）、Ｐ．フルオレセンス（Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）リパーゼ、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）リパーゼ（例えば、Ｂ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）リパーゼ）（例えば、Ｄａｒｔｏｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １１３１：２５３−２６０（１９９３））、Ｂ．ステアロサーモフィルス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）リパーゼ（例えば、特開昭６４−７４４９９２号公報を参照のこと）、およびＢ．プミルス（Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ）リパーゼ（例えば、国際公開第９１／１６４２２号パンフレットを参照されたい））が挙げられる。クローニングされたリパーゼの例としては、限定はされないが、ペニシリウム・カマンベルティ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃａｍｅｍｂｅｒｔｉｉ）リパーゼ（Ｙａｍａｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ １０３：６１−６７（１９９１）を参照されたい）、ゲオトリカム・カンディダム（Ｇｅｏｔｒｉｃｕｍ ｃａｎｄｉｄｕｍ）リパーゼ（Ｓｃｈｉｍａｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０６：３８３−３８８（１９８９）を参照されたい）、および種々のリゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属リパーゼ、例えば、Ｒ．デレマー（Ｒ．ｄｅｌｅｍａｒ）リパーゼ（Ｈａｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ １０９：１１７−１１３（１９９１）を参照されたい）、Ｒ．ニベアス（Ｒ．ｎｉｖｅｕｓ）リパーゼ（Ｋｕｇｉｍｉｙａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５６：７１６−７１９（１９９２））、およびＲ．オリザエ（Ｒ．ｏｒｙｚａｅ）リパーゼが挙げられる。他の脂肪分解酵素、例えばクチナーゼもまた、本明細書に記載の１種以上の組成物に用いることができ、以下に限定はされないが、例えば、シュードモナス・メンドシナ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍｅｎｄｏｃｉｎａ）に由来するクチナーゼ（国際公開第８８／０９３６７号パンフレットを参照されたい）および／またはフザリウム・ソラニピシ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉｐｉｓｉ）に由来するクチナーゼ（国際公開第９０／０９４４６号パンフレットを参照されたい）が挙げられる。市販のリパーゼの例としては、限定はされないが、Ｍ１ ＬＩＰＡＳＥ、ＬＵＭＡ ＦＡＳＴおよびＬＩＰＯＭＡＸＴＭ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）；ＬＩＰＥＸ（登録商標）、ＬＩＰＯＣＬＥＡＮ（登録商標）、ＬＩＰＯＬＡＳＥ（登録商標）およびＬＩＰＯＬＡＳＥ（登録商標）ＵＬＴＲＡ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）；ならびにＬＩＰＡＳＥ Ｐ（Ａｍａｎｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏ．Ｌｔｄ）が挙げられる。
またさらなる一実施形態は、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体と、１種以上のアミラーゼとを含む組成物に関する。一実施形態では、組成物は、組成物の約０．００００１重量％〜約１０重量％、約０．０００１重量％〜約１０重量％、約０．００１重量％〜約５重量％、約０．００１重量％〜約２重量％、または約０．００５重量％〜約０．５重量％のアミラーゼを含む。アルカリ性溶液中での使用に好適なアミラーゼ（例えば、アルファおよび／またはベータ）は、そうした組成物に含めるのに有用であり得る。アミラーゼの一例は、化学的にまたは遺伝子操作により改変された変異体であり得る。アミラーゼの例としては、限定はされないが、細菌または真菌起源のもの、例えば、英国特許第１，２９６，８３９号明細書、国際公開第９１／００３５３号パンフレット、国際公開第９４／０２５９７号パンフレット、国際公開第９４／１８３３１４号パンフレット、国際公開第９５／１０６０３号パンフレット、国際公開第９５／２６３９７号パンフレット、国際公開第９５／３５３８２号パンフレット、国際公開第９６／０５２９５号パンフレット、国際公開第９６／２３８７３号パンフレット、国際公開第９６／２３８７４号パンフレット、国際公開第９６／３０４８１号パンフレット、国際公開第９７／１０３４２号パンフレット、国際公開第９７／４１２１３号パンフレット、国際公開第９７／４３４２４号パンフレット、国際公開第９８／１３４８１号パンフレット、国際公開第９８／２６０７８号パンフレット、国際公開第９９／０２７０２号パンフレット、国際公開第９９／０９１８３号パンフレット、国際公開第９９／１９４６７号パンフレット、国際公開第９９／２３２１１号パンフレット、国際公開第９９／２９８７６号パンフレット、国際公開第９９／４２５６７号パンフレット、国際公開第９９／４３７９３号パンフレット、国際公開第９９／４３７９４号パンフレット、国際公開第９９／４６３９９号パンフレット、国際公開第００／２９５６０号パンフレット、国際公開第００／６００５８号パンフレット、国際公開第００／６００５９号パンフレット、国際公開第００／６００６０号パンフレット、国際公開第０１／１４５３２号パンフレット、国際公開第０１／３４７８４号パンフレット、国際公開第０１／６４８５２号パンフレット、国際公開第０１／６６７１２号パンフレット、国際公開第０１／８８１０７号パンフレット、国際公開第０１／９６５３７号パンフレット、国際公開第０２／０９２７９７号パンフレット、国際公開第０２／１０３５５号パンフレット、国際公開第０２／３１１２４号パンフレット、国際公開第２００４０５５１７８号パンフレット、国際公開第２００４１１３５５１号パンフレット、国際公開第２００５００１０６４号パンフレット、国際公開第２００５００３３１１号パンフレット、国際公開第２００５０１８３３６号パンフレット、国際公開第２００５０１９４４３号パンフレット、国際公開第２００５０６６３３８号パンフレット、国際公開第２００６００２６４３号パンフレット、国際公開第２００６０１２８９９号パンフレット、国際公開第２００６０１２９０２号パンフレット、国際公開第２００６０３１５５４号パンフレット、国際公開第２００６０６３５９４号パンフレット、国際公開第２００６０６６５９４号パンフレット、国際公開第２００６０６６５９６号パンフレット、国際公開第２００６１３６１６１号パンフレット、国際公開第２００８０００８２５号パンフレット、国際公開第２００８０８８４９３号パンフレット、国際公開第２００８０９２９１９号パンフレット、国際公開第２００８１０１８９４号パンフレット、国際公開第２００８１１２４５９号パンフレット、国際公開第２００９０６１３８０号パンフレット、国際公開第２００９０６１３８１号パンフレット、国際公開第２００９１００１０２号パンフレット、国際公開第２００９１４０５０４号パンフレット、国際公開第２００９１４９４１９号パンフレット、国際公開第２０１００５９４１３号パンフレット、国際公開第２０１００８８４４７号パンフレット、国際公開第２０１００９１２２１号パンフレット、国際公開第２０１０１０４６７５号パンフレット、国際公開第２０１０１１５０２１号パンフレット、国際公開第２０１０１１５０２８号パンフレット、国際公開第２０１０１１７５１１号パンフレット、国際公開第２０１１０７６１２３号パンフレット、国際公開第２０１１０７６８９７号パンフレット、国際公開第２０１１０８０３５２号パンフレット、国際公開第２０１１０８０３５３号パンフレット、国際公開第２０１１０８０３５４号パンフレット、国際公開第２０１１０８２４２５号パンフレット、国際公開第２０１１０８２４２９号パンフレット、国際公開第２０１１０８７８３６号パンフレット、国際公開第２０１１０９８５３１号パンフレット、国際公開第２０１３０６３４６０号パンフレット、国際公開第２０１３１８４５７７号パンフレット、国際公開第２０１４０９９５２３号パンフレット、国際公開第２０１４１６４７７７号パンフレットおよび国際公開第２０１５０７７１２６号パンフレットに記載されるアミラーゼが挙げられる。市販アミラーゼの例としては、限定はされないが、ＡＭＰＬＩＦＹ（登録商標）、ＡＭＰＬＩＦＹ ＰＲＩＭＥ（登録商標）、ＢＡＮ ＤＵＲＡＭＹＬ（登録商標）、ＴＥＲＭＡＭＹＬ（登録商標）、ＴＥＲＭＡＭＹＬ（登録商標）ＵＬＴＲＡ、ＦＵＮＧＡＭＹＬ（登録商標）、ＳＴＡＩＮＺＹＭＥ（登録商標）、ＳＴＡＩＮＺＹＭＥ（登録商標）ＰＬＵＳ、ＳＴＡＩＮＺＹＭＥ（登録商標）ＵＬＴＲＡ、およびＳＴＡＩＮＺＹＭＥ（登録商標）ＥＶＩＴＹ（登録商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）；ＥＦＦＥＣＥＮＺ（商標）Ｓ１０００、ＰＯＷＥＲＡＳＥ（登録商標）、ＰＲＥＦＥＲＥＮＺ（商標）Ｓ１００、ＰＲＥＦＥＲＥＮＺ（商標）Ｓ１１０、ＥＸＣＥＬＬＥＮＺ（商標）Ｓ２０００、ＲＡＰＩＤＡＳＥ（登録商標）およびＭＡＸＡＭＹＬ（登録商標）Ｐ（Ｄａｎｉｓｃｏ ＵＳ）が挙げられる。
なおまたさらなる実施形態は、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体と、１種以上のセルラーゼとを含む組成物に関する。一実施形態では、組成物は、組成物の約０．００００１重量％〜約１０重量％、０．０００１重量％〜約１０重量％、約０．００１重量％〜約５重量％、約０．００１重量％〜約２重量％、または約０．００５重量％〜約０．５重量％のセルラーゼを含む。好適なセルラーゼは、本明細書に記載の組成物に使用し得る。セルラーゼの一例は、化学的にまたは遺伝子操作により改変された変異体であり得る。セルラーゼの例としては、限定はされないが、細菌または真菌起源のもの、例えば、国際公開第２００５０５４４７５号パンフレット、国際公開第２００５０５６７８７号パンフレット、米国特許第７，４４９，３１８号明細書、米国特許第７，８３３，７７３号明細書、米国特許第４，４３５，３０７号明細書；欧州特許第０４９５２５７号明細書および米国仮特許出願第６２／２９６，６７８号明細書および同第６２／４３５３４０号明細書に記載されているものなどが挙げられる。市販セルラーゼの例としては、限定はされないが、ＣＥＬＬＵＣＬＥＡＮ（登録商標）、ＣＥＬＬＵＺＹＭＥ（登録商標）、ＣＡＲＥＺＹＭＥ（登録商標）、ＣＡＲＥＺＹＭＥ（登録商標）ＰＲＥＭＩＵＭ、ＥＮＤＯＬＡＳＥ（登録商標）およびＲＥＮＯＺＹＭＥ（登録商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）；ＲＥＶＩＴＡＬＥＮＺ（登録商標）１００、ＲＥＶＩＴＡＬＥＮＺ（登録商標）２００／２２０およびＲＥＶＩＴＡＬＥＮＺ（登録商標）２０００（Ｄａｎｉｓｃｏ ＵＳ）；ならびにＫＡＣ−５００（Ｂ）（花王株式会社）が挙げられる。いくつかの実施形態では、セルラーゼは、成熟野生型または変異体セルラーゼの一部または断片として含まれ、Ｎ末端の一部が除去されている（例えば、米国特許第５，８７４，２７６号を参照されたい）。
なおまたさらなる実施形態は、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体と、１種以上のマンナナーゼとを含む組成物に関する。一実施形態では、組成物は、組成物の約０．００００１重量％〜約１０重量％、約０．０００１重量％〜約１０重量％、約０．００１重量％〜約５重量％、約０．００１重量％〜約２重量％、または約０．００５重量％〜約０．５重量％のマンナナーゼを含む。マンナナーゼの一例は、化学的にまたは遺伝子操作により改変された変異体であり得る。マンナナーゼの例としては、限定はされないが、細菌または真菌起源のもの、例えば、国際公開第２０１６００７９２９号パンフレット、国際公開第２０１７／０７９７５６号パンフレットおよび国際公開第２０１７／０７９７５１号パンフレット；ならびに米国特許第６５６６１１４号明細書、同第６６０２８４２号明細書および同第６４４０９９１号明細書に記載されているものなどが挙げられる。市販のマンナナーゼの例としては、限定はされないが、ＭＡＮＮＡＷＡＹ（登録商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）、ならびにＥＦＦＥＣＴＥＮＺ（商標）Ｍ１０００、ＰＲＥＦＥＲＥＮＺ（登録商標）Ｍ１００、ＭＡＮＮＡＳＴＡＲ（登録商標）およびＰＵＲＡＢＲＩＴＥＴＭ（Ｄａｎｉｓｃｏ ＵＳ）が挙げられる。
なおまたさらなる実施形態は、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体と、１種以上のペルオキシダーゼおよび／またはオキシダーゼ酵素を含む組成物に関する。一実施形態では、組成物は、組成物の約０．００００１重量％〜約１０重量％、約０．０００１重量％〜約１０重量％、約０．００１重量％〜約５重量％、約０．００１重量％〜約２重量％、または約０．００５重量％〜約０．５重量％のペルオキシダーゼまたはオキシダーゼを含む。ペルオキシダーゼは、過酸化水素またはその供給源（例えば、過炭酸塩、過ホウ酸塩または過硫酸塩）と組み合わせて使用してもよく、またオキシダーゼは、酸素と組み合わせて使用してもよい。ペルオキシダーゼおよびオキシダーゼは、「漂白液」用に（すなわち、洗浄液中で布帛を一緒に洗った際に、１つの染色した布帛から別の布帛に織物染料が移行するのを防止するために）、単独で、または増強剤と共に使用される（例えば、国際公開第９４／１２６２１号パンフレットおよび国際公開第９５／０１４２６号パンフレットを参照されたい）。ペルオキシダーゼおよび／またはオキシダーゼの一例は、化学的にまたは遺伝子操作により改変された変異体であり得る。ペルオキシダーゼ／オキシダーゼの例としては、限定はされないが、植物、細菌または真菌起源のものが挙げられる。
別の実施形態は、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体と、例えば、国際公開第２００５／０５６７８２号パンフレット、国際公開第２００７／１０６２９３号パンフレット、国際公開第２００８／０６３４００号パンフレット、国際公開第２００８／１０６２１４号パンフレットおよび国際公開第２００８／１０６２１５号パンフレットに記載されているような、１種以上のペルヒドロラーゼとを含む組成物に関する。
なお別の実施形態では、本明細書に記載の１種以上の組成物に含有される、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体、および１種以上の追加の酵素は、それぞれ独立して、約１０％までの範囲で変化することができ、洗浄用組成物の残りは、１種以上の補助材料である。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１種以上の組成物は、洗剤添加剤として使用され、前記添加剤は、固体または液体形態である。このような添加製品は、従来の洗剤組成物の性能を補い、かつ／または増進することを目的としており、洗浄工程の任意の段階で添加することができる。いくつかの実施形態では、洗濯用洗剤組成物の密度は、約４００〜約１２００ｇ／リットルの範囲であり、一方、他の実施形態では、２０℃の測定で、約５００〜約９５０ｇ／リットルの範囲である。
いくつかの実施形態は、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体と、界面活性剤、酵素安定剤、ビルダー化合物、ポリマー化合物、漂白剤、追加の酵素、泡抑制剤、分散剤、石灰石けん分散剤、汚れ懸濁剤、再付着防止剤、腐食防止剤、およびそれらの組み合わせから選択される１種以上の補助材料とを含む洗濯用洗剤組成物に関する。いくつかの実施形態では、洗濯組成物は柔軟剤も含む。
さらなる実施形態は、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体と、界面活性剤、有機ポリマー化合物、泡増強剤、ＩＩ族金属イオン、溶媒、ヒドロトロープ、および追加の酵素から選択される１種以上の補助材料とを含む、手洗浄用の食器洗浄用組成物に関する。
他の実施形態は、本明細書に記載の１種以上の組成物に関し、前記組成物は、着色布帛の洗濯に使用されるか、または洗浄能力を通じて柔軟性を提供する、コンパクトな粒状布帛洗浄用組成物であるか、または強力液体（ＨＤＬ）布帛洗浄用組成物である。布帛洗浄用組成物および／または製造方法の例は、米国特許第６，６１０，６４２号明細書および同第６，３７６，４５０号明細書に記載されている。洗浄用組成物の他の例は、例えば、米国特許第６，６０５，４５８号明細書；同第６，２９４，５１４号明細書；同第５，９２９，０２２号明細書；同第５，８７９，５８４号明細書；同第５，６９１，２９７号明細書；同第５，５６５，１４５号明細書；同第５，５７４，００５号明細書；同第５，５６９，６４５号明細書；同第５，５６５，４２２号明細書；同第５，５１６，４４８号明細書；同第５，４８９，３９２号明細書；および同第５，４８６，３０３号明細書；同第４，９６８，４５１号明細書；同第４，５９７，８９８号明細書；同第４，５６１，９９８号明細書；同第４，５５０，８６２号明細書；同第４，５３７，７０６号明細書；同第４，５１５，７０７号明細書；および同第４，５１５，７０５号明細書に記載されている。
いくつかの実施形態では、洗浄用組成物は酸性化粒子またはアミノカルボン酸ビルダーを含む。アミノカルボン酸ビルダーの例としては、アミノカルボン酸、その塩および誘導体が挙げられる。ある実施形態では、アミノカルボン酸ビルダーは、グリシン−Ｎ、Ｎ−二酢酸、または一般式ＭＯＯＣ−ＣＨＲ−Ｎ（ＣＨ２ＣＯＯＭ）２（式中、ＲはＣ１〜１２アルキル基であり、Ｍはアルカリ金属である）で表される誘導体などのアミノポリカルボン酸ビルダーである。いくつかの実施形態では、アミノカルボン酸ビルダーは、メチルグリシン二酢酸（ＭＧＤＡ）、ＧＬＤＡ（グルタミン酸−Ｎ，Ｎ−二酢酸）、イミノジコハク酸（ＩＤＳ）、カルボキシルメチルイヌリンおよびその塩と誘導体、アスパラギン酸−Ｎ−一酢酸（ＡＳＭＡ）、アスパラギン酸−Ｎ，Ｎ−二酢酸（ＡＳＤＡ）、アスパラギン酸−Ｎ−一プロピオン酸（ＡＳＭＰ）、イミノジコハク酸（ＩＤＡ）、Ｎ−（２−スルホメチル）アスパラギン酸（ＳＭＡＳ）、Ｎ−（２−スルホエチル）アスパラギン酸（ＳＥＡＳ）、Ｎ−（２−スルホメチル）グルタミン酸（ＳＭＧＬ）、Ｎ−（２−スルホエチル）グルタミン酸（ＳＥＧＬ）、ＩＤＳ（イミノ二酢酸）およびその塩と誘導体（Ｎ−メチルイミノ二酢酸（ＭＩＤＡ）など）、アルファ−アラニン−Ｎ，Ｎ−二酢酸（アルファ−ＡＬＤＡ）、セリン−Ｎ，Ｎ−二酢酸（ＳＥＤＡ）、イソセリン−Ｎ，Ｎ二酢酸（ＩＳＤＡ）、フェニルアラニン−Ｎ、Ｎ−二酢酸（ＰＨＤＡ）、アントラニル酸−Ｎ，Ｎ−二酢酸（ＡＮＤＡ）、スルファニル酸−Ｎ，Ｎ−二酢酸（ＳＬＤＡ）、タウリン−Ｎ，Ｎ−二酢酸（ＴＵＤＡ）、ならびにスルホメチル−Ｎ，Ｎ−二酢酸（ＳＭＤＡ）およびそのアルカリ金属塩と誘導体であり得る。いくつかの実施形態では、酸性化粒子は、約４００μｍ〜約１２００μｍの重量幾何平均粒径および少なくとも５５０ｇ／Ｌのかさ密度を有する。いくつかの実施形態では、酸性化粒子は、少なくとも約５％のビルダーを含む。
いくつかの実施形態では、酸性化粒子は、有機酸および鉱酸を含む任意の酸を含み得る。有機酸は、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、カプリン酸、シュウ酸、コハク酸、アジピン酸、マレイン酸、フマル酸、セバシン酸、リンゴ酸、乳酸、グリコール酸、酒石酸およびグリオキシル酸など、１または２個のカルボキシル基を有し、場合により、最大１５個の炭素原子、特には最大１０個の炭素原子を有する。いくつかの実施形態では、この酸は、クエン酸である。鉱酸としては、塩酸および硫酸が挙げられる。場合により、酸性化粒子は、アミノカルボン酸ビルダーを高濃度で含む高活性粒子である。硫酸は、さらに、最終粒子の安定性に寄与することが分かっている。
さらなる実施形態は、１種以上のスブチリシン変異体ならびに１種以上の界面活性剤および／または界面活性剤系を含む洗浄用組成物に関し、界面活性剤は、非イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、両性イオン性界面活性剤、半極性非イオン性界面活性剤、およびこれらの混合物から選択される。いくつかの実施形態では、界面活性剤は、洗浄用組成物の約０．１重量％〜約６０重量％の濃度で存在するが、また別の実施形態では濃度は約１重量％〜約５０重量％であり、またさらなる実施形態では、濃度は約５重量％〜約４０重量％である。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１種以上の組成物は、１種以上の洗剤ビルダーまたはビルダー系を含む。一実施形態では、組成物は、組成物の約１重量％から、約０．１重量％〜約８０重量％、約３重量％〜約６０重量％、約５重量％〜約４０重量％または約１０重量％〜約５０重量％のビルダーを含む。ビルダーの例としては、限定はされないが、アルカリ金属、ポリリン酸のアンモニウム塩およびアルカノールアンモニウム塩、アルカリ金属ケイ酸塩、アルカリ土類およびアルカリ金属炭酸塩、アルミノケイ酸塩、ポリカルボキシレート化合物、エーテルヒドロキシポリカルボキシレート、マレイン酸無水物とエチレンもしくはビニルメチルエーテルとのコポリマー、１，３，５−トリヒドロキシベンゼン−２，４，６−トリスルホン酸およびカルボキシメチルオキシコハク酸、ポリ酢酸のアンモニウムおよび置換アンモニウム塩、例えばエチレンジアミン四酢酸およびニトリロ三酢酸、ポリカルボキシレート、例えばメリット酸、コハク酸、クエン酸、オキシジコハク酸、ポリマレイン酸、ベンゼン１，３，５−トリカルボン酸、カルボキシメチルオキシコハク酸、ならびにこれらの可溶塩が挙げられる。いくつかのそのような組成物では、ビルダーは、水溶性硬度イオン錯体（例えば、封鎖性ビルダー）、例えば、シトレートおよびポリホスフェート（例えば、トリポリリン酸ナトリウムおよびトリポリリン酸ナトリウム六水和物、トリポリリン酸カリウム、ならびにトリポリリン酸ナトリウムとトリポリリン酸カリウムとの混合物）を形成する。ビルダーの例は、例えば、欧州特許第２１００９４９号明細書に記載されている。いくつかの実施形態では、ビルダーとして、リン酸塩ビルダーおよび非リン酸塩ビルダーが挙げられる。いくつかの実施形態では、ビルダーはリン酸塩ビルダーである。いくつかの実施形態では、ビルダーは、非リン酸塩ビルダーである。いくつかの実施形態では、ビルダーは、リン酸塩ビルダーと非リン酸塩ビルダーの混合物を含む。リン酸塩ビルダーの例としては、限定はされないが、一リン酸塩、二リン酸塩、トリポリリン酸塩またはオリゴマーポリリン酸塩が挙げられ、これらの化合物のナトリウム塩を含むアルカリ金属塩が含まれる。いくつかの実施形態では、ビルダーは、トリポリリン酸ナトリウム（ＳＴＰＰ）であってよい。さらに、組成物は、炭酸塩および／またはクエン酸塩を含むことができる。他の好適な非リン酸塩ビルダーとしては、ポリカルボン酸のホモポリマーおよびコポリマー、ならびにそれらを部分的に、または完全に中和した塩、ポリカルボン酸モノマーおよびヒドロキシカルボン酸、ならびにそれらの塩が挙げられる。いくつかの実施形態では、上記の化合物の塩には、アンモニウムおよび／またはアルカリ金属塩、すなわち、ナトリウム塩を含むリチウム、ナトリウムおよびカリウム塩が含まれる。好適なポリカルボン酸には、非環式、脂環式、複素環式および芳香族カルボン酸が含まれるが、このときいくつかの実施形態では、それらは、少なくとも２つのカルボキシル基を含有することができ、少なくとも２つのカルボキシル基は、それぞれの場合に、一部の例では２個以下の炭素原子によって互いに分離される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１種以上の組成物は、１種以上のキレート剤を含む。一実施形態では、組成物は、組成物の約０．１重量％〜約１５重量％または約３重量％〜約１０重量％のキレート剤を含む。キレート剤の例としては、限定はされないが、例えば、銅、鉄、マンガン、およびこれらの混合物が挙げられる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１種以上の組成物は、１種以上の沈殿助剤を含む。沈澱助剤の例としては、限定はされないが、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリカルボキシレート、例えばポリテレフタル酸などの汚れ放出ポリマー、例えばカオリナイト、モンモリロナイト、アタパルジャイト、イライト、ベントナイトおよびハロイサイトなどのクレー、ならびにこれらの混合物が挙げられる。
他の実施形態では、本明細書に記載の１種以上の組成物は１種以上の再付着防止剤または非イオン性界面活性剤を含む（これらは、汚れの再付着を防止することができる）（例えば、欧州特許第２１００９４９号明細書を参照されたい）。例えば、ＡＤＷ用組成物では、表面を改質する目的で、特に、シーティングの目的で、膜および染みの形成を避け、光沢をよくするため、非イオン性界面活性剤が使用される。これらのノニオン界面活性剤はまた、汚れの再付着防止に使用される。いくつかの実施形態では、ノニオン界面活性剤は、エトキシ化非イオン性界面活性剤、エポキシキャップポリ（オキシアルキル化）アルコール、およびアミンオキシド界面活性剤であり得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１種以上の組成物は、１種以上の染料移行抑止剤を含む。ポリマー性染料移行抑止剤の例としては、限定はされないが、ポリビニルピロリドンポリマー、ポリアミンＮ−オキシドポリマー、Ｎ−ビニルピロリドンとＮ−ビニルイミダゾールとのコポリマー、ポリビニルオキサゾリドン、ポリビニルイミダゾール、およびこれらの混合物が挙げられる。一実施形態では、組成物は、組成物の約０．０００１重量％〜約１０重量％、約０．０１重量％〜約５重量％、約０．１重量％〜約３重量％の染料移行抑止剤を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１種以上の組成物は、１種以上のケイ酸塩を含む。ケイ酸塩の例としては、限定はされないが、ケイ酸ナトリウム、例えば、二ケイ酸ナトリウム、メタケイ酸ナトリウム、および結晶性フィロケイ酸塩が挙げられる。いくつかの実施形態では、ケイ酸塩は、組成物の約１重量％〜約２０重量％、または約５重量％〜約１５重量％の濃度で存在する。
なおいくつかのさらなる実施形態では、本明細書に記載の１種以上の組成物は、１種以上の分散剤を含む。水溶性有機物質の例としては、限定はされないが、例えば、ポリカルボン酸が２個以下の炭素原子で互いに分離された少なくとも２つのカルボキシル基を含む、ホモポリマー酸もしくはコポリマー酸またはそれらの塩が挙げられる。
いくつかのさらなる実施形態では、本明細書に記載の１種以上の組成物は、１種以上の酵素安定剤を含む。いくつかの実施形態では、酵素安定剤はカルシウムおよび／またはマグネシウムイオンの水溶性の供給源である。一部の実施形態では、酵素安定剤としては、オリゴ糖、多糖、および無機二価金属塩が挙げられ、この無機二価金属塩は、アルカリ土類金属塩、例えば、カルシウム塩を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で使用される酵素は、最終組成物中に亜鉛（ＩＩ）、カルシウム（ＩＩ）および／またはマグネシウム（ＩＩ）イオン、ならびに他の金属イオン（例えば、バリウム（ＩＩ）、スカンジウム（ＩＩ）、鉄（ＩＩ）、マンガン（ＩＩ）、アルミニウム（ＩＩＩ）、スズ（ＩＩ）、コバルト（ＩＩ）、銅（ＩＩ）、ニッケル（ＩＩ）およびオキソバナジウム（ＩＶ））の水溶性イオン源（これらが酵素にそうしたイオンを与える）が存在することによって安定化される。塩化物および硫酸塩も、一部の実施形態で使用される。オリゴ糖および多糖（例えば、デキストリン）の例は、例えば、国際公開第０７／１４５９６４号パンフレットに記載されている。いくつかの実施形態では、可逆的プロテアーゼ阻害剤、例えば、ホウ素含有化合物（例えば、ホウ酸塩、４−ホルミルフェニルボロン酸およびフェニルボロン酸誘導体（例えば、国際公開第９６／４１８５９号パンフレットに記載のもの）ならびに／またはペプチドアルデヒド、例えば国際公開第２００９／１１８３７５号パンフレットおよび国際公開第２０１３００４６３６号パンフレットにさらに記載されているものも使用される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１種以上の組成物は、１種以上の漂白剤、漂白活性化剤、および／または漂白触媒を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１種以上の組成物は、１種以上の無機および／または有機漂白化合物を含む。無機漂白剤の例としては、限定はされないが、過水和物塩（例えば、過ホウ酸塩、過炭酸塩、過リン酸塩、過硫酸塩、および過ケイ酸塩）が挙げられる。いくつかの実施形態では、無機過水和物塩は、アルカリ金属塩である。いくつかの実施形態では、無機過水和物塩は、追加の保護なしに結晶性の固体として含まれるが、他のいくつかの実施形態では、塩は被覆される。漂白活性化剤は、典型的には、６０℃以下の温度の洗浄過程で漂白作用を増大させる有機過酸前駆体である。漂白活性化剤の例としては、過加水分解条件下で、約１〜約１０個の炭素原子または約２〜約４個の炭素原子を有する脂肪族ペルオキシカルボン酸、および／または任意選択により置換された過安息香酸を与える化合物が挙げられる。漂白活性化剤の例は、例えば、欧州特許第２１００９４９号明細書に記載されている。漂白触媒の例としては、限定はされないが、マンガントリアザシクロノナンおよび関連錯体、ならびにコバルト、銅、マンガン、および鉄錯体が挙げられる。漂白触媒のさらなる例は、例えば、米国特許第４，２４６，６１２号明細書；米国特許第５，２２７，０８４号明細書；米国特許第４，８１０，４１０号明細書；国際公開第９９／０６５２１号パンフレット；および欧州特許第２１００９４９号明細書に記載されている。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１種以上の組成物は、１種以上の触媒金属錯体を含む。いくつかの実施形態では、金属含有漂白触媒が使用される。一部の実施形態では、金属漂白触媒は、指定された漂白触媒活性の遷移金属陽イオン（例えば、銅、鉄、チタン、ルテニウム、タングステン、モリブデン、またはマンガンの陽イオン）、漂白触媒活性を殆どまたは全く有しない補助金属陽イオン（例えば、亜鉛またはアルミニウム陽イオン）、触媒および補助金属陽イオンに対して指定された安定性定数を有する封鎖剤、特にエチレンジアミン四酢酸、エチレンジアミン四（メチレンホスホン酸）、およびこれらの水溶性塩を含む触媒系を含む（例えば、米国特許第４，４３０，２４３号明細書を参照されたい）。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１種以上の組成物は、マンガン化合物によって触媒される。そうした化合物および使用濃度については、例えば、米国特許第５，５７６，２８２号明細書に記載されている。さらなる実施形態では、コバルト漂白触媒が使用され、本明細書に記載の１種以上の組成物に含まれる。種々のコバルト漂白触媒が、例えば、米国特許第５，５９７，９３６号明細書および同第５，５９５，９６７号明細書に記載されている。
いくつかのさらなる実施形態では、本明細書に記載の１種以上の組成物は、マクロポリサイクリックリジッドリガンド（ｍａｃｒｏｐｏｌｙｃｙｃｌｉｃ ｒｉｇｉｄ ｌｉｇａｎｄ）（ＭＲＬ）の遷移金属錯体を含む。実際問題として、限定としてではなく、いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物および洗浄プロセスは、洗浄液中に少なくとも１億分の１のオーダーで、約０．００５ｐｐｍ〜約２５ｐｐｍ、約０．０５ｐｐｍ〜約１０ｐｐｍ、または約０．１ｐｐｍ〜約５ｐｐｍの活性ＭＲＬを提供するように調整される。ＭＲＬの例としては、限定はされないが、架橋した特殊な超剛性リガンド、例えば、５，１２−ジエチル−１，５，８，１２−テトラアザビシクロ（６．６．２）ヘキサデカンが挙げられる。金属ＭＲＬの例は、例えば、国際公開第２０００／３２６０１号パンフレットおよび米国特許第６，２２５，４６４号明細書に記載されている。
別の実施形態では、本明細書に記載の１種以上の組成物は１種以上の金属ケア剤を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、組成物の約０．１重量％〜約５重量％の金属ケア剤を含む。金属ケア剤の例としては、例えば、アルミニウム、ステンレス鋼、および非鉄金属（例えば、銀および銅）が挙げられる。さらなる金属ケア剤の例は、例えば、欧州特許第２１００９４９号明細書、国際公開第９４／２６８６０号パンフレット、および国際公開第９４／２６８５９号パンフレットに記載されている。いくつかの組成物では、金属ケア剤は亜鉛塩である。
いくつかの実施形態では、洗浄用組成物は、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体を含む高密度液体（ＨＤＬ）組成物である。ＨＤＬ液体洗濯用洗剤は、洗浄用界面活性剤（１０％〜４０％）を含むことができ、この洗浄用界面活性剤は、陰イオン性洗浄用界面活性剤（直鎖または分岐鎖またはランダム鎖の置換されたまたは置換されていないアルキル硫酸塩、アルキルスルホン酸塩、アルキルアルコキシル化硫酸塩、アルキルリン酸塩、アルキルホスホン酸塩、アルキルカルボン酸塩、および／またはこれらの混合物の群から選択される）；および任意選択のノニオン界面活性剤（直鎖または分岐鎖またはランダム鎖の置換されたまたは置換されていないアルキルアルコキシル化アルコール、例えば、Ｃ８〜Ｃ１８アルキルエトキシ化アルコールおよび／またはＣ６〜Ｃ１２アルキルフェノールアルコキシレートの群から選択される）を含み、任意選択により、陰イオン性洗浄用界面活性剤（６．０〜９の親水性指数（ＨＩｃ）を有する）のノニオン洗浄用界面活性剤に対する重量比は１：１よりも大きい。好適な洗浄用界面活性剤としては、陽イオン性洗浄用界面活性剤（アルキルピリジニウム化合物、アルキル第４級アンモニウム化合物、アルキル第４級ホスホニウム化合物、アルキル第３級スルホニウム化合物および／またはそれらの混合物から選択される）；両性イオン性および／または両性洗浄用界面活性剤（アルカノールアミンスルホベタインから選択される）；両性界面活性剤；半極性非イオン性界面活性剤ならびにそれらの混合物も挙げられる。
別の実施形態では、洗浄用組成物は単位用量ではない液体またはゲル洗剤であり、水性であってよく、典型的には少なくとも２０重量％〜９５重量％までの水、例えば、約７０重量％までの水、約６５重量％までの水、約５５重量％までの水、約４５重量％までの水、または約３５重量％までの水を含む。限定はされないが、アルカノール、アミン、ジオール、エーテルおよびポリオールを含む他の種類の液体を、水性液体またはゲルに含めることができる。水性液体またはゲル洗剤は、０〜３０％の有機溶媒を含み得る。液体またはゲル洗剤は、非水性でもよい。
組成物は、任意選択的に、両親媒性アルコキシル化グリース洗浄ポリマー（分岐親水性および疎水性を有するアルコキシル化ポリマー、例えば０．０５重量％〜１０重量％の範囲のアルコキシル化ポリアルキレンイミンの群から選択される）、および／またはランダムグラフトポリマー（典型的には、不飽和Ｃ１〜Ｃ６カルボン酸、エーテル、アルコール、アルデヒド、ケトン、エステル、糖単位、アルコキシ単位、無水マレイン酸、グリセロールなどの飽和ポリアルコール、ならびにそれらの混合物からなる群から選択されるモノマーを含む親水性骨格と、Ｃ４〜Ｃ２５アルキル基、ポリプロピレン、ポリブチレン、飽和Ｃ２〜Ｃ６モノカルボン酸のビニルエステル、アクリルもしくはメタクリル酸のＣ１〜Ｃ６アルキルエステル、およびこれらの混合物からなる群から選択される疎水性側鎖からなる）からなる界面活性強化ポリマーを含むことができる。
本組成物は、汚れ放出ポリマー（例えば、陰イオン末端キャップ化ポリエステル、例えばＳＲＰ１；ランダムもしくはブロック構造にある糖、ジカルボン酸、ポリオールおよびそれらの組み合わせから選択される少なくとも１つのモノマー単位を含むポリマー；ランダムまたはブロック構造にあるエチレンテレフタレート系ポリマーおよびそれらのコポリマー、例えばＲｅｐｅｌ−ｏ−ｔｅｘ ＳＦ、ＳＦ−２およびＳＲＰ６、Ｔｅｘｃａｒｅ ＳＲＡ１００、ＳＲＡ３００、ＳＲＮ１００、ＳＲＮ１７０、ＳＲＮ２４０、ＳＲＮ３００およびＳＲＮ３２５、Ｍａｒｌｏｑｕｅｓｔ ＳＬを含む）、再付着防止ポリマー（０．１重量％〜１０重量％、例えば、カルボン酸ポリマー、例えばアクリル酸、マレイン酸（またはマレイン酸無水物）、フマル酸、イタコン酸、アコニット酸、メサコン酸、シトラコン酸、メチレンマロン酸およびそれらの任意の混合物から選択される少なくとも１つのモノマーを含むポリマー；ビニルピロリドンホモポリマーおよび／または５００〜１００，０００Ｄａの範囲内の分子量を有するポリエチレングリコール；セルロースポリマー（例えば、アルキルセルロース、アルキルアルコキシアルキルセルロース、カルボキシアルキルセルロース、アルキルカルボキシアルキルセルロース、（その例にはカルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、メチルヒドロキシエチルセルロース、メチルカルボキシメチルセルロースおよびそれらの混合物が含まれる）を含む）ならびにポリマーカルボキシレート（例えば、マレイン酸／アクリル酸ランダムコポリマーまたはポリアクリレートホモポリマーなど））などの追加のポリマーを含むことができる。
本組成物は、飽和または不飽和脂肪酸、好ましくは飽和または不飽和Ｃ１２〜Ｃ２４脂肪酸（０重量％〜１０重量％）；沈着助剤（例えば、多糖、セルロースポリマー、ポリジアリルジメチルハロゲン化アンモニウム（ＤＡＤＭＡＣ）、およびＤＡＤＭＡＣとランダムまたはブロック構成のビニルピロリドン、アクリルアミド、イミダゾール、ハロゲン化イミダゾリニウム、およびこれらの混合物とのコポリマー；陽イオン性グァーガム；陽イオンセルロース、例えば、陽イオンヒドロキシエチルセルロース；陽イオンデンプン；陽イオンポリアクリルアミド；およびこれらの混合物を更に含むことができる。
本組成物は、染料移行抑止剤を更に含むことができ、その例としては、マンガンフタロシアニン、ペルオキシダーゼ、ポリビニルピロリドンポリマー、ポリアミンＮ−オキシドポリマー、Ｎ−ビニルピロリドンとＮ−ビニルイミダゾール、ポリビニルオキサゾリドン、およびポリビニルイミダゾール、ならびに／またはこれらの混合物とのコポリマー、；例としてエチレン−ジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含むキレート剤；ジエチレントリアミンペンタメチレンホスホン酸（ＤＴＰＭＰ）；ヒドロキシ−エタンジホスホン酸（ＨＥＤＰ）；エチレンジアミンＮ，Ｎ’−ジコハク酸（ＥＤＤＳ）；メチルグリシン二酢酸（ＭＧＤＡ）；ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）；プロピレンジアミン四酢酸（ＰＤＴ Ａ）；２−ヒドロキシピリジン−Ｎ−オキシド（ＨＰＮＯ）；またはメチルグリシン二酢酸（ＭＧＤＡ）；グルタミン酸Ｎ、Ｎ−二酢酸（Ｎ，Ｎ−ジカルボキシメチルグルタミン酸四ナトリウム塩（ＧＬＤＡ）；ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）；４，５−ジヒドロキシ−ｍ−ベンゼンジスルホン酸；クエン酸およびその任意の塩；Ｎ−ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸（ＨＥＤＴＡ）、トリエチレンテトラアミン六酢酸（ＴＴＨＡ）、Ｎ−ヒドロキシエチルイミノ二酢酸（ＨＥＩＤＡ）、ジヒドロキシエチルグリシン（ＤＨＥＧ）、エチレンジアミンテトラプロピオン酸（ＥＤＴＰ）、およびこれらの誘導体が挙げられる。
本組成物は、シリコーンまたは脂肪酸系の泡抑制剤；酵素安定剤；着色染料、カルシウムおよびマグネシウム陽イオン、視覚信号成分、消泡剤（０．００１重量％〜約４．０重量％）、および／または構造化剤／増粘剤（０．０１重量％〜５重量％で、ジグリセリド、トリグリセリド、エチレングリコールジステアレート、微結晶セルロース、セルロース系材料、マイクロファイバーセルロース、バイオポリマー、キサンタンガム、ジェランガム、およびこれらの混合物からなる群から選択される）を更に含むことができる。
いくつかの実施形態では、洗浄用組成物は、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体を含む高密度粉末（ＨＤＤ）組成物である。ＨＤＤ粉末洗濯用洗剤は、陰イオン性洗濯用界面活性剤（直鎖、分岐鎖もしくはランダム鎖の、置換または非置換の、アルキル硫酸塩、アルキルスルホン酸塩、アルキルアルコキシル化硫酸塩、アルキルリン酸塩、アルキルホスホン酸塩、アルキルカルボン酸塩および／またはそれらの混合物から選択される）、非イオン性洗濯用界面活性剤（直鎖、分岐鎖またはランダム鎖の、置換もしくは非置換の、Ｃ８〜Ｃ１８アルキルエトキシレートおよび／またはＣ６〜Ｃ１２アルキルフェノールアルコキシレートから選択される）、陽イオン性洗濯用界面活性剤（アルキルピリジニウム化合物、アルキル第四級アンモニウム化合物、アルキル第四級ホスホニウム化合物、アルキル第三級スルホニウム化合物およびそれらの混合物から選択される）；両性イオン性および／もしくは両性の洗濯用界面活性剤（アルカノールアミンスルホベタインから選択される）；両性界面活性剤；半極性非イオン性界面活性剤およびそれらの混合物を含む洗濯用界面活性剤；ビルダー（リン酸塩非含有ビルダー（例えば、ゼオライトビルダー［その例として、ゼオライトＡ、ゼオライトＸ、ゼオライトＰおよびゼオライトＭＡＰが挙げられる（０重量％から１０重量％未満の範囲）］；リン酸塩ビルダー（例えば０重量％から１０重量％未満の範囲のトリポリリン酸ナトリウム）；１５重量％未満の範囲のクエン酸、クエン酸塩およびニトリロ三酢酸またはその塩；ケイ酸塩（０重量％から１０重量％未満の範囲のケイ酸ナトリウムもしくはケイ酸カリウムまたはメタケイ酸ナトリウム、あるいは層状ケイ酸塩（ＳＫＳ−６））；炭酸塩（０重量％から１０重量％未満の範囲の炭酸ナトリウムおよび／または重炭酸ナトリウム；ならびに漂白剤（フォトブリーチ、例えば、スルホン化亜鉛フタロシアニン、スルホン化アルミニウムフタロシアニン、キサンテン染料、およびそれらの混合物）；疎水性もしくは親水性漂白活性化剤（例えば、ドデカノイルオキシベンゼンスルホン酸塩、デカノイルオキシベンゼンスルホン酸塩、デカノイルオキシ安息香酸もしくはその塩、３，５，５−トリメチルヘキサノイルオキシベンゼンスルホン酸塩、テトラアセチルエチレンジアミン−ＴＡＥＤ、およびノナノイルオキシベンゼンスルホン酸塩−ＮＯＢＳ、ニトリル第四級物、およびそれらの混合物）；過酸化水素；過酸化水素源（無機過酸化水素塩、例えば、過ホウ酸、過炭酸、過硫酸、過リン酸または過ケイ酸のナトリウム塩のモノもしくはテトラ水和物）；疎水性および／もしくは親水性プリフォーム過酸（過カルボン酸およびその塩、過炭酸およびその塩、過イミド酸およびその塩、過硫酸およびその塩、およびそれらの混合物から選択される）ならびに／または漂白触媒（例えば、イミン漂白促進剤、例えば、イミニウム陽イオンおよびポリイオンなど；イミニウム両性イオン；変性アミン；変性アミンオキシド；Ｎ−スルホニルイミン；Ｎ−ホスホニルイミン；Ｎ−アシルイミン；チアジアゾールジオキシド；ペルフオロイミン；環状糖ケトンおよびそれらの混合物）、金属含有漂白触媒（例えば、銅、鉄、チタン、ルテニウム、タングステン、モリブデンまたはマンガン陽イオンと、亜鉛またはアルミニウムなどの補助的金属陽イオン、およびエチレンジアミン四酢酸、エチレンジアミンテトラ（メチレンホスホン酸）およびそれらの水溶性の塩などの封鎖剤との併用）を含むことができる。
組成物はさらに、追加の洗剤成分、例えば、香料マイクロカプセル、デンプンカプセル化香料アコード、酵素安定剤、着色剤、布帛の完全性および陽イオンポリマーを含む追加のポリマー、ダイロック成分、布帛柔軟剤、増白剤（例えば、Ｃ．Ｉ．蛍光増白剤）、凝集剤、キレート剤、アルコキシル化ポリアミン、布帛用沈澱助剤および／またはシクロデキストリンを含むことができる。
いくつかの実施形態では、洗浄用組成物は、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体を含むＡＤＷ用洗剤組成物である。ＡＤＷ用洗剤組成物は、０〜１０重量％の量で含まれる、エトキシル化ノニオン界面活性剤、アルコールアルコキシル化界面活性剤、エポキシキャップポリ（オキシアルキル化）アルコールまたはアミンオキシド界面活性剤の群から選択される２つ以上のノニオン界面活性剤；リン酸塩（モノリン酸塩、ジリン酸塩、トリポリリン酸塩、もしくはオリゴマーポリリン酸塩）、トリポリリン酸ナトリウム−ＳＴＰＰか、またはリン酸非含有ビルダー（アミノ酸をベースとした化合物、例えば、ＭＧＤＡ（メチル−グリシン−二酢酸）、およびその塩と誘導体、ＧＬＤＡ（グルタミン酸−Ｎ、Ｎ二酢酸）およびその塩と誘導体、ＩＤＳ（イミノジコハク酸）およびその塩と誘導体、カルボキシメチルイヌリンおよびその塩と誘導体ならびにそれらの混合物、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、ならびにＢ−アラニン二酢酸（Ｂ−ＡＤＡ）およびその塩）、ポリカルボン酸のホモポリマーおよびコポリマー、ならびにそれらを部分的に、または完全に中和した塩、ポリカルボン酸モノマーおよびヒドロキシカルボン酸モノマーおよびそれらの塩（０．５重量％〜５０重量％の範囲で）を含む５〜６０％の範囲のビルダー；約０．１重量％〜約５０重量％の範囲のスルホン化／カルボキシル化ポリマー（製品に寸法安定性を付与する）；約０．１重量％〜約１０重量％の範囲の乾燥助剤ポリエステル、特に、陰イオンポリエステル（任意選択により、縮重合に資する３〜６個の官能基を有するモノマー、特に酸、アルコールまたはエステル官能基と併用する）、ポリカーボネート−、ポリウレタン−および／またはポリウレア−ポリオルガノシロキサン化合物もしくは反応性環状炭酸塩およびウレア型のその前駆体化合物から選択される）；約１重量％〜約２０重量％の範囲のケイ酸塩（ケイ酸ナトリウムまたはケイ酸カリウム、例えば、二ケイ酸ナトリウム、メタケイ酸ナトリウムおよび結晶性フィロケイ酸塩）；無機漂白剤（例えば、過酸化水素化物の塩、例えば、過ホウ酸塩、過炭酸塩、過リン酸塩、過硫酸塩および過ケイ酸塩）、および有機漂白剤（例えば、有機ペルオキシ酸、例えば、ジアシルおよびテトラアシルペルオキシド、特に、ジペルオキシドデカン二酸、ジペルオキシテトラデカン二酸およびジペルオキシヘキサデカン二酸）；漂白活性化剤−約０．１重量％〜約１０重量％の範囲の有機過酸前駆体；漂白触媒（マンガントリアザシクロノナンおよび関連錯体、Ｃｏ、Ｃｕ、ＭｎおよびＦｅビスピリジルアミンおよび関連錯体、ならびにペンタアミンアセテートコバルト（ＩＩＩ）および関連錯体から選択される）；約０．１重量％〜５重量％の範囲の金属ケア剤（ベンゾトリアゾール、金属塩および錯体、ならびに／またはケイ酸塩から選択される）；ＡＤＷ用洗剤組成物１ｇ当たりの活性酵素が約０．０１〜５．０ｍｇの範囲の酵素（アシルトランスフェラーゼ、アルファ−アミラーゼ、ベータ−アミラーゼ、アルファ−ガラクトシダーゼ、アラビノシダーゼ、アリールエステラーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、カラギナーゼ、カタラーゼ、セロビオヒドロラーゼ、セルラーゼ、コンドロイチナーゼ、クチナーゼ、エンド−ベータ−１、４−グルカナーゼ、エンド−ベータ−マンナナーゼ、エステラーゼ、エキソ−マンナナーゼ、ガラクタナーゼ、グルコアミラーゼ、ヘミセルラーゼ、ヒアルロニダーゼ、ケラチナーゼ、ラッカーゼ、ラクターゼ、リグニナーゼ、リパーゼ、リポキシゲナーゼ、マンナナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン酸リアーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ペクチナーゼ、ペントサナーゼ、ペルオキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、ホスファターゼ、ホスフォリパーゼ、フィターゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテアーゼ、プルラナーゼ、リダクターゼ、ラムノガラクツロナーゼ、ベータ−グルカナーゼ、タンナーゼ、トランスグルタミナーゼ、キシランアセチル−エステラーゼ、キシラナーゼ、キシログルカナーゼ、キシロシダーゼおよびこれらの混合物）；ならびに酵素安定化成分（オリゴ糖類、多糖類、および無機の二価金属塩から選択される）を含むことができる。
さらなる実施形態は、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体を用いて、布帛を処理する（例えば、織布の糊抜きをするため）組成物および方法に関する。布帛処理方法は、当技術分野で周知である（例えば、米国特許第６，０７７，３１６号明細書を参照されたい）。例えば、布帛の感触および外観は、溶液中で布帛と本明細書に記載の変異体とを接触させる工程を含む方法によって改善することができる。布帛は、加圧下で溶液を用いて処理することができる。
本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体は、布帛を織っている間、もしくは織りあげた後、糊抜き段階、または１工程以上の追加の布帛加工工程で適用することができる。織布の機織り中、糸は、相当に強い機械的歪みに曝される。織機で織る前に、縦糸は、それらの引張強度を増加させるため、および破壊を防止するために糊付けデンプンまたはデンプン誘導体でコーティングされることが多い。本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体は、機織りの間、または機織り後に、糊付けデンプンまたはデンプン誘導体を除去するために適用することができる。機織り後、均質で抗洗濯性の結果を保証するために、布帛のさらなる加工処理前に、糊付けコーティングを除去するために変異体を使用することができる。本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体は、綿含有布帛を含む布帛の糊抜きのために、単独で、または他の糊抜き用薬剤および／または糊抜き用酵素と共に、例えば、水性組成物中に洗剤添加剤として使用することができる。アミラーゼは、インジゴ染色デニム布帛および衣服にストーンウォッシュ外観を作り出すための組成物および方法に使用することもできる。衣類を製造するために、布帛を裁断して衣類または衣服に縫製することができ、それらは後に仕上げ処理される。特にデニムのジーンズを製造するために、様々な酵素による仕上げ法が開発されている。デニム衣服の仕上げは、通常、酵素による糊抜きで始まり、その間、衣服はタンパク質分解酵素の作用を受け、布に軟らかさが付与され、コットンは、その後の酵素による仕上げ工程がより受けやすくなる。本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体は、デニムの衣服の仕上げ（例えば、「バイオストーン加工」）、酵素による糊抜きおよび布帛への柔らかさの付与および／または仕上げプロセスの方法に使用することができる。
さらなる実施形態では、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体は、例えば、工業または企業の製品洗浄システム、機械、またはプロセス；工業または企業の業務用洗濯システム、機械、またはプロセス；および工業または企業の洗濯システム、機械、またはプロセスなどの、工業および企業の洗浄用途に使用することができる。
本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体を使用して、動物および、それらのその後の解体物または処理物、例えば、羽毛、皮膚、毛、および皮などからタンパク質を除去することができる。ある場合には、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体を含む溶液に動物の死骸を浸漬することにより、伝統的な熱湯への浸漬または羽毛の除去プロセスと比べて皮膚の損傷を防止することができる。一実施形態では、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体を、羽毛の消化または羽毛の分解開始に適した条件下で羽毛に噴霧することができる。いくつかの実施形態では、この変異体は、酸化剤と組み合わせて使用することができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体は、生の羽毛に関連する油または脂肪の除去を手助けできる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体は、羽毛を洗浄するための、また繊維を消毒し、部分的に脱水するための組成物中で使用される。さらに他の実施形態では、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体は、羽毛からのタンパク質の回収に使用される。いくつかの他の実施形態では、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体は、約０．５％（体積／体積）で、９５％のエタノールまたは他の極性有機溶媒と組み合わせて、界面活性剤を含むか、または含まない洗浄液に適用される。他の実施形態では、国際出願第ＰＣＴ／ＥＰ２０１３／０６５３６２号明細書、国際出願第ＰＣＴ／ＥＰ２０１３／０６５３６３号明細書、および国際出願第ＰＣＴ／ＥＰ２０１３／０６５３６４号明細書に開示されているものなどの、適切な羽毛処理およびタンパク質分解方法において、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体を、単独で使用しても、組み合わせて使用してもよい。いくつかの実施形態では、回収したタンパク質は、その後動物または魚の飼料に使用することができる。
さらに別の実施形態では、１種以上の動物飼料組成物、動物飼料添加物および／またはペットフードは、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体を含む。他の実施形態は、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体と、１種以上の動物用飼料成分および／または動物用飼料添加物成分および／またはペットフード成分とを混合することを含む、そのような動物飼料組成物、動物飼料添加物組成物および／またはペットフードの調製方法に関する。
「動物」という用語には、全ての非反芻動物および反芻動物が含まれる。特定の実施形態では、動物は、例えばウマおよび単胃動物などの非反芻動物である。単胃動物の例としては、限定はされないが、子ブタ、成長ブタ、雌ブタなどのブタ；ダチョウ、アヒル、ニワトリ、ブロイラー、産卵ニワトリなどの家禽類；サケ、マス、テラピア、ナマズ、コイなどの魚類；ならびにエビおよびクルマエビなどの甲殻類が挙げられる。さらなる実施形態では、動物は、限定はされないが、ウシ、幼ウシ、ヤギ、ヒツジ、キリン、バイソン、アメリカヘラジカ、エルク、ヤク、水牛、シカ、ラクダ、アルパカ、ラマ、アンテロープ、プロングホーンおよびニルガイを含む反芻動物である。
本明細書に関連して、「ペットフード」という用語は、限定はされないが、イヌ、ネコ、スナネズミ、ハムスター、チンチラ、ファンシーラット、モルモット；カナリア、インコおよびオウムなどの鳥類ペット；カメ、トカゲおよびヘビなどの爬虫類ペット；ならびに、熱帯魚およびカエルなどの水生動物などの家庭用動物の食品を意味すると理解されることが意図されている。
「動物飼料組成物」、「飼料」および「飼い葉」という用語は、互換的に使用され、ａ）穀草類、例えば小穀物（例えば、小麦、大麦、ライ麦、カラス麦およびそれらの組み合わせ）および／または大穀物、例えばトウモロコシもしくはソルガム；ｂ）穀草類からの副産物、例えばコーングルテンミール、穀類蒸留粕（ＤＤＧＳ）（特にトウモロコシをベースとした穀類蒸留粕（ｃＤＤＧＳ）、ふすま、小麦ミドリングス、小麦ショーツ（ｗｈｅａｔ ｓｈｏｒｔｓ）、米ヌカ、籾殻、カラス麦の殻、パーム核、およびシトラスパルプ；ｃ）大豆、ヒマワリ、ピーナッツ、ハウチワマメ、エンドウマメ、ソラマメ、綿、キャノーラ、魚粉、乾燥血漿タンパク、肉骨粉、ジャガイモタンパク、ホエイ、コプラ、ゴマなどの供給源から得られたタンパク質；ｄ）植物起源および動物起源から得られた油脂類；ｅ）ミネラル類およびビタミン類から選択される１種以上の食餌材料を含むことができる。
本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体は、化学パルプ、セミケミカルパルプ、クラフトパルプ、メカニカルパルプ、亜硫酸塩法により製造されたパルプなどの紙パルプの酵素支援漂白にさらに使用される。一般的には、紙パルプは、紙パルプの漂白に好適な条件下で、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体とインキュベートされる。
いくつかの実施形態では、パルプは、酸素、オゾン、過酸化物またはペルオキシ酸で漂白された、塩素を含まないパルプである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体は、改良または連続蒸解法によって製造された、低リグニン量を示すパルプの酵素支援漂白に使用される。いくつかの他の実施形態では、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体は、単独で、あるいは好ましくはキシラナーゼ酵素および／またはエンドグルカナーゼ酵素および／またはアルファ−ガラクトシダーゼ酵素および／またはセロビオヒドロラーゼ酵素と組み合わせて使用される。
他の実施形態では、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体は、さらに、組織の酵素支援創傷清拭に使用される。これは、壊死または損傷した組織の除去、例えば、回復を促進するための創傷からの除去を含む。
なおさらなる実施形態では、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体は、さらに組織培養に使用される。特に、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体は、細胞を採集する工程などで、細胞培養壁に付着した細胞を懸濁または再懸濁させるために使用することができる。別の実施形態では、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体は、培養細胞と皿との間のタンパク質結合を切断して、細胞を溶液中へ懸濁させるために使用することができる。
なお別の実施形態では、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体は、さらに、食品添加剤、消化剤および／または食品加工助剤として使用される。
なおさらに別の実施形態では、本明細書に記載の１種以上のスブチリシン変異体は、さらに、動物の皮からの毛の除去、浸漬、脱脂、または脱灰による皮革加工（これは皮革作製中に、非構造タンパク質の分解を伴うプロセスである）に使用される。
実施例１
アッセイ
以下のアッセイを以下の実施例で使用した。本明細書の以下に記載したアッセイからのいかなる逸脱も、そのような逸脱が生じた実施例において対処されるであろう。
性能指数
酵素の性能指数（ＰＩ）は、変異体の性能（測定値）を、ＡｐｒＬ野生型（ＷＴ）（配列番号２）（以下「ＡｐｒＬ親」という）、ＢｌｉＤ０２３３９ＷＴ（配列番号９）（以下「ＢｌｉＤ親」という）、またはＳＱＣＢＶ３５変異体（配列番号６３）（以下、ＳＱＣＢＶ３５親という）から選択される親酵素と、同じタンパク質濃度で比較する（理論値または測定値）。親酵素の理論濃度は、親酵素の標準曲線のラングミュアフィットから抽出されたパラメーターを用いて計算することができる。１よりも大きいＰＩ（ＰＩ＞１）は、親と比較して、変異体によって改善された性能を示し、１のＰＩ（ＰＩ＝１）は、親と同じ性能の変異体を示し、１未満のＰＩ（ＰＩ＜１）は、親よりも劣る性能の変異体を示す。
タンパク質定量アッセイ
培養上清からのＡｐｒＬまたはＢｌｉＤ変異体のタンパク質測定は、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｕ−ＨＰＬＣまたはＨＰＬＣシステムにより行った。Ｕ−ＨＰＬＣ法のために、精製親タンパク質の検量線（０〜５００ｐｐｍ）を作製し、標準曲線を生成するために使用した。清澄化された培養上清由来のＡｐｒＬまたはＢｌｉＤ変異体を、希釈緩衝液（トリス２５ｍＭ、ｐＨ７．４、５ｍＭ ＣａＣｌ２）で１０倍に希釈し、次いで、アセトニトリル緩衝液（２２．５ｍＭトリス、ｐＨ７．４、４．５ｍＭ ＣａＣｌ２、９％アセトニトリル）と１：１の比で混合した。その後、試料を４５μｍフィルタープレートを用いてろ過し、オートサンプラーを通して逆相カラム（Ｚｏｒｂａｘ ３００ ＳＢ−Ｃ３カラム、２．１×１００ｍｍおよび２．１×５０ｍｍ、両方とも１．８μｍビーズサイズ）に供給した。緩衝液Ａ（０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ））と緩衝液Ｂ（０．０７％アセトニトリル）の勾配を有するカラムにより、試料を溶離させた。流量は１ｍＬ／分であり、４分間の運転および１分間の運転後のカラム平衡化を行った。２２０ｎｍで吸光度を測定し、ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎソフトウェア（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてピークを積分した。精製親酵素の標準曲線に基づき、試料のタンパク質濃度を計算した。場合によっては、ＨＰＬＣとともに、タンパク質測定のためのブラッドフォード法を使用した。ブラッドフォード試薬（Ｂｒａｄｆｏｒｄ Ｑｕｉｃｋｓｔａｒｔ １Ｘ色素試薬、ＢｉｏＲａｄ）を使用し、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘプレートリーダーで５９５／４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。
あるいは、培養上清由来のＡｐｒＬ変異体のタンパク質決定は、Ａｇｉｌｅｎｔ １１００／１２００システムを使用して、ＨＰＬＣにより行った。精製親タンパク質を用いた検量線（０〜１５００ｐｐｍ）を作製し、標準曲線を生成するために使用した。清澄化した培養上清由来のＡｐｒＬ変異体は、２つの方法のうちの１つによって分析した。場合によっては、培養上清を希釈緩衝液（トリス１００ｍＭ、ｐＨ８．６、０．００５％Ｔｗｅｅｎ ８０）で２倍に希釈し、オートサンプラーを通して、６９〜７０℃で予め平衡化したＡｇｉｌｅｎｔ Ｃ８カラム（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｐｏｒｏｓｈｅｌｌ ５μｍ ３００ＳＢ−Ｃ８ ２．１×７５ｍｍ）に供給した。緩衝液Ａ（０．１％ＴＦＡ）と緩衝液Ｂ（１００％アセトニトリルおよび０．１％ＴＦＡ）の勾配を有するカラムから試料を溶離させた。流量は、２分間の運転で２ｍＬ／分であった。他の場合には、ＡｐｒＬ変異体を含む清澄化した培養上清を、酸／ＳＤＳ溶液中で前処理した。７５μＬの試料を６．４μＬの４ＮＨＣｌと混合し、氷上で１０分間混合した。ウェルあたり２０．４μＬの１０％ＳＤＳ溶液を加え、混合し、試料をろ過し、その後、室温に設定したＨＰＬＣ ＨＩＰ−ＡＬＳ Ａｑｕｉｔｙ １２５Ａ ＵＳＥＣカラムに供給した。２５ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．５、１００ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％ＳＤＳの溶液で、流量０．３５ｍＬ／分で８分間の運転により試料を溶離させた。２２０または２３０ｎｍで吸光度を測定し、ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）ソフトウェアを用いてピークを積分した。
３種のタンパク質決定法の全てで、精製親酵素の標準曲線に基づき、各試料のタンパク質濃度を計算した。
プロテアーゼ活性
親酵素およびその変異体のプロテアーゼ活性を、Ｎ−ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡまたはジメチルカゼイン（ＤＭＣ）基質の加水分解の測定によって試験した。
ＡＡＰＦアッセイのために使用した試薬溶液は、１００ｍＭトリスｐＨ８．６、１０ｍＭ ＣａｌＣｌ２、０．００５％ Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−８０（トリス／Ｃａ緩衝液）および１６０ｍＭ ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡ／ＤＭＳＯ（ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡストック溶液）（Ｓｉｇｍａ：Ｓ−７３８８）であった。希釈標準溶液を調製するために、１ｍＬのｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡストック溶液を１００ｍＬのトリス／Ｃａ緩衝液に添加して混合した。酵素試料を、１ｍｇ／ｍＬのｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡ希釈標準溶液を含有するマイクロタイタープレート（ＭＴＰ）に加え、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘプレートリーダーを用いて、動的モード、ＲＴで３〜５分間に亘って４０５ｎｍで活性をアッセイした。プロテアーゼ活性はｍＯＤ／ｍｉｎで表した。
ＤＭＣアッセイのために使用した試薬溶液は、ｐＨ９．５ １００ｍＭ炭酸ナトリウム中に２．５％ＤＭＣ（Ｓｉｇｍａ）、試薬Ａ中に０．０７５％ＴＮＢＳＡ（２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）であった。試薬Ａ：１５ｍＬの４Ｎ ＮａＯＨ中に４５．４ｇのＮａ２Ｂ４Ｏ７．１０Ｈ２Ｏ（Ｍｅｒｃｋ）を加え、ＭＱ水で最終容量を１０００ｍＬにしたもの、希釈溶液：１０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＣａＣｌ２、０．００５％Ｔｗｅｅｎ−８０、０．０２％アジ化ナトリウム。２０ｐｐｍのプロテアーゼ上清２．５μＬを添加後、４７．５μＬのＤＭＣ基質でＭＴＰを満たした。次いで、試薬Ａ中のＴＮＢＳＡ５０μＬを、ゆっくりと混合しながら添加した。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘプレートリーダーを動力学モードで使用して、４０５ｎｍで５分間、室温で活性を測定した。ＡＡＰＦアッセイで上述したように、活性は、ｍＯＤ／分として表した。
評価した洗剤組成物
これらの研究で使用した洗剤調合物を表１に示すが、これは、強力液体洗濯用（ＨＤＬ）、強力強化洗濯用（ＨＤＤ）、および自動食器洗浄用（ＡＤＷ）の処方を含む。市販の洗剤を熱で不活化して酵素活性をなくし、表１に記載されている用量にした。酵素不活化のための洗剤処理は以下の通りである。９５℃で１６時間、生の液体を水浴中で加熱することによって、酵素を含むＨＤＬ洗濯用洗剤（試験ＨＤＬ１、試験ＨＤＬ２、およびＰｅｒｓｉｌ Ｎｏｎ−Ｂｉｏ ＨＤＬ洗剤を除く）を不活化した。ＨＤＤ洗剤中の酵素は、最終洗浄アッセイで使用される溶液に対して１０倍の濃度の溶液を調製して、９５℃で１６時間加熱することによって不活化した。市販のＡＤＷ洗剤調合物は、以下のように６５℃で３０〜４５分間の加熱により不活性化した。ＡＤＷ洗剤タブレットを７００ｍＬの２１ＧＨ水に溶解し、この溶液を６５℃で３０〜４５分間インキュベートすることにより酵素活性を不活化した。酵素不活化溶液を、アッセイで使用する前に２１ＧＨ水で１０倍に希釈した。不活化後、完全な不活化を確認するために、ＡＡＰＦ基質を用いてプロテアーゼ活性をアッセイした。ＨＤＤ、ＡＤＷおよびＨＤＬ洗剤を熱処理した後は、プロテアーゼ活性は検出できなかった。ＨＤＬ洗剤：Ｐｅｒｓｉｌ Ｎｏｎ−Ｂｉｏ、Ｔｅｓｔ ＨＤＬ１およびＴｅｓｔ ＨＤＬ２は、ホウ素元素含量について試験すると、≦５ｍｇ／Ｋｇのホウ素含有量であるので、ホウ素を含まないとみなされる。ＧＳＭ−Ｂ粉末調合物は、使用のために３ｇ／Ｌで溶解し、ｐＨは調整しなかった。
Figure 2019523645
洗剤出所：ＡＬＬ、Ｋｉｒｋｌａｎｄ ＵｌｔｒａおよびＫｉｒｋｌａｎｄ Ｕｌｔｒａｃｌｅａｎ（Ｓｕｎ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）、ＯＭＯ Ｃｏｌｏｒ、ＯＭＯ Ｋｌｅｉｎ＆Ｋｒａｃｈｔｉｇ、Ｓｕｒｆ Ｅｘｃｅｌ、およびＳＵＮ Ａｌｌ ｉｎ Ｏｎｅ洗剤タブレット（Ｕｎｉｌｅｖｅｒ）、Ｆｉｎｉｓｈ Ａｌｌ ｉｎ ＯｎｅおよびＦｉｎｉｓｈ Ｑｕａｎｔｕｍ洗剤タブレット（Ｒｅｃｋｉｔｔ Ｂｅｎｃｋｉｓｅｒ）、およびＢｌｕｅ Ｍｏｏｎ（Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ Ｂｌｕｅ Ｍｏｏｎ）。上記の洗剤は、２０１２年に現地のスーパーマーケットから購入した。Ｐｅｒｓｉｌ Ｓｍａｌｌ ＆ Ｍｉｇｈｔｙ Ｎｏｎ−Ｂｉｏ Ｌｉｑｕｉｄ Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔである「Ｐｅｒｓｉｌ Ｎｏｎ−Ｂｉｏ」（Ｕｎｉｌｅｖｅｒ）は、２０１４年に購入した。Ｌｉｂｙ（Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ Ｌｉｂｙ Ｅｎｔｅｒｐｒｉｓｅ）は２０１６年に購入した。試験ＨＤＬ１および試験ＨＤＬ２洗剤は、自社のカスタムメイドであり、各組成をそれぞれ表１．２および１．３に記載する。表１．４に、ＧＳＭ−Ｂリン酸塩非含有ＡＤＷ洗剤（ＷＦＫ Ｔｅｓｔｇｅｗｅｂｅ ＧｍｂＨ，Ｂｒｕｅｇｇｅｎ，Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ，ｗｗｗ．ｔｅｓｔｇｅｗｅｂｅ．ｄｅから酵素なしで購入）の組成を示す。ＧＳＭ−Ｂ９調合物は、購入したＧＳＭ−Ｂリン酸塩非含有洗剤のｐＨをｐＨ９へと下方に調節することによって調製した。表１．５に、試験用ｐＨ７およびｐＨ９に調整した、カスタム液体ＡＤＷ洗剤調合物の組成を示す。
Figure 2019523645
Figure 2019523645
Figure 2019523645
Figure 2019523645
洗濯（ＨＤＬおよびＨＤＤ）およびＡＤＷ洗剤の洗浄性能
様々な技術汚れについて、親酵素に対する変異体の洗浄性能を試験した：ＢＭＩ（ＥＭＰＡ−１１６、コットンへの血液／ミルク／インク）、卵（ＣＳ−３８、熱により色素をエージングした卵黄）、およびＰＯＭ（ＣＦＴ−Ｃ１０、色素／油／ミルク）は洗濯ベースで使用、卵黄（ＰＡＳ−３８、ポリアクリル布帛上の卵黄であり、エージングされ、カーボンブラック染料で着色）は、食器ベースで使用。ＥＭＰＡ−１１６、ＣＳ−３８、およびＣＦＴ−Ｃ１０スワッチを脱イオン水で２０分間予備リンスし、室温で一晩乾燥させた。ＰＡＳ−３８布帛を、１０ｍＭ ＣＡＰＳ緩衝液（ｐＨ１１）で６０℃で３０分間、ｉＥＭＳシェーカー中９００ｒｐｍで予備リンスし、２ｍｌの脱イオン水でリンスして一晩乾燥させた。全ての染みについて、ＭＴＰプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ ３６４１）中に予めパンチしたスワッチを入れるという調製は、Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｔｅｓｔｍａｔｅｒｉａｌｓ ＢＶ、Ｖｌａａｒｄｉｎｇｅｎ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓにより行われた。これらのマイクロスワッチ含有プレートに洗剤を満たし、その後、酵素を添加した。
安定性アッセイのための一般的な試料のセットアップ
変異体を高温でインキュベーションした後に残留活性を測定することによって、様々なストレス条件下（下記表２に示す緩衝液および洗剤）における変異体の安定性について試験した。この高温は、ストレスを受けていない試料と比較してストレスを受けた試料で約３０％の残留活性が得られるように設定した。希釈酵素試料をストレッサーで混合し、ストレスを受けていないプロテアーゼ活性を測定した。ストレッサー中の希釈試料を高温で、表２に示した時間インキュベートし、続いてＡＡＰＦまたはＤＭＣ加水分解のいずれかにより、ストレスを受けたプロテアーゼの活性を測定した。洗剤酵素は、安定性アッセイで使用する前に、上記のように熱により不活化した。
Figure 2019523645
ストレスを受けない条件では、ＡＡＰＦまたはＤＭＣに対する活性について、直ちに酵素をアッセイした（上記参照）。ストレスを受けた条件では、ＰＣＲプレートを密封し、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ３８５ ＭａｓｔｅｒＣｙｃｌｅｒ Ｐｒｏ ＴｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒまたはＰＴＣ−２００ Ｐｅｌｔｉｅｒ ｔｈｅｒｍａｌ ｃｙｃｌｅｒを用いて高温で５分間インキュベートし、次いで活性についてアッセイした。ストレスを受けた活性およびストレスを受けていない活性を、上記のように、合成基質の加水分解またはＤＭＣ法のいずれかによって測定した。ストレスを受けていない活性に対するストレスを受けた活性の比を取り、１００を乗じることにより％残留活性を計算した。変異体の残留活性を親酵素のそれで除して、安定性ＰＩを得た。
洗濯アッセイでは、マイクロスワッチを含有する、洗剤を満たしたＭＴＰに酵素のアリコートを加え、最終量が２００μＬ、最終酵素濃度が０．５〜５ｐｐｍとなるようにした。ＨＤＬまたはＨＤＤ調合物を用いた洗濯洗浄アッセイは、２５℃で１５〜３０分間実施し、ＡＤＷアッセイは４０℃で３０分間実施した。インキュベーション後、１００〜１５０μＬの上清を新鮮なＭＴＰに移し、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘプレートリーダーを使用して、ＥＭＰＡ−１１６スワッチについては６００ｎｍで、またはＣＳ−１０、ＣＳ−３８、およびＰＡＳ−３８スワッチについては４０５ｎｍで吸光度を読み取った。各試料の値からブランク対照（酵素なし）の値を減算して吸光度の結果を得た。所与の変異体の吸光度を、同じ濃度での親酵素の予測吸光度で除し、各アッセイ条件での洗浄ＰＩを得た。親酵素の値は、精製親酵素試料の標準曲線をラングミュアフィットにフィッティングさせることによって決定した。
劣化洗濯洗浄アッセイ
（Ａ）ＭＴＰアッセイ： ９６ウェルＭＴＰの各ウェルにミニ撹拌ディスクを入れ、続いて２７０μＬの１００％Ｐｅｒｓｉｌ Ｎｏｎ−Ｂｉｏ洗剤を添加した。洗剤を満たしたＭＴＰに、約５００ｐｐｍに希釈した酵素上清１８．１μＬを加え、磁気回転撹拌装置（Ｖ＆Ｐ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＶＰ７１０シリーズ）を用いて５分間混合した。初期時点（Ｔ＝０）用として、２５ｕＬの酵素含有洗剤を、１２５μＬの緩衝液（５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、Ｃａ：Ｍｇが３：１で２５０ｐｐｍの水硬度、ｐＨ８）で満たしたＭＴＰに移した。次いで、ＥＭＰＡ−１１６ＢＭＩマイクロウォッチを含むＭＴＰに予め添加してあった１８５μＬ緩衝液（５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２５０ｐｐｍ硬度、ｐＨ８）に、洗剤で希釈した酵素の５μＬアリコートを添加した。時点０（Ｔ＝０）において、新鮮洗浄について上で述べた方法と同様に、洗浄アッセイを実施した。残りの時点については、洗剤−酵素プレートを３７℃で３日間もしくは３週間、または５５℃で１．５時間、５時間または２４時間インキュベートした；それぞれの時点の終わりにアリコートを取り出し、新鮮洗浄について上で述べた方法と同様に、洗浄アッセイを実施した。様々な残り時点での洗浄を、Ｔ＝０での初期洗浄と比較することによって残留洗浄値を得た。
（Ｂ）コニカルチューブアッセイ：最終量が１．１ｍＬで、洗剤中の最終酵素濃度が８８ｐｐｍとなるよう、清澄化酵素培養上清と１００％の試験ＨＤＬ１洗剤とを１５ｍＬのポリスチレン遠心管に加えた。各変異体について、５μＬの試料を直ちにチューブから取り出し、初期時点（Ｔ＝０）として後でアッセイするために凍結した。飼料は、３７℃で３日間インキュベートした。インキュベーション後、５μＬの試料を取り出し、凍結した。洗浄アッセイ用の試料を調製するために、全ての試料を解凍し、６６０μＬの緩衝液（５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、Ｃａ：Ｍｇが３：１で２５０ｐｐｍの水硬度、ｐＨ８）を試料に加えた。希釈試料の２００μＬアリコートを、ＥＭＰＡ−１１６ＢＭＩマイクロスワッチを含むＭＴＰに加えた。１４００ｒｐｍで振盪させたｉＥＭＳインキュベーター中、２５℃で６０分間、洗濯洗浄アッセイを行った。インキュベーション後、１２０μＬの上清を新鮮なＭＴＰに移し、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘプレートリーダーを用いて６００ｎｍでの吸光度を読み取った。各試料の値からブランク対照（酵素なし）の値を減算して吸光度の結果を得た。各変異体の残留洗浄性を、Ｔ＝０での洗浄性に対する３日後の残留洗浄性の比として計算し、パーセント残留洗浄性として報告した。
実施例２
ＡｐｒＬ−ｃｌａｄｅプロテアーゼ変異体のコンビナトリアル設計および発現
両者ともにＡｐｒＬ−ｃｌａｄｅのメンバーであるバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種ＡｐｒＬスブチリシンおよびＢ．リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）Ｂｒａ７ ＢｌｉＤ０２３３９スブチリシンを改変して、洗浄性能および洗剤安定性が改善されたＡｐｒＬ−ｃｌａｄｅプロテアーゼ変異体を作製した。ＡｐｒＬ−ｃｌａｄｅについては、２０１６年５月１３日に出願され、国際公開第２０１６１８３５０９号パンフレットとして刊行された、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１６／３２５１４号明細書により詳しく記載されている。
熟成ＡｐｒＬ親酵素のアミノ酸配列は、配列番号２として記載される。ＧｅｎｅＡｒｔ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社により、ＡｐｒＬ親プロテアーゼをコードする合成遺伝子（配列番号１）が合成され、従来の分子生物学的技術を利用して変異体配列を作製するためにこれを使用した（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ，「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓを参照されたい）。ＡｐｒＬ変異体をコードする遺伝子も合成した。次いで、種々のＡｐｒＬ遺伝子をｐＨＹＴ発現ベクター（ｐＨＹ３００ＰＬＫ（Ｔａｋａｒａ−Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）由来）にクローニングした。発現ベクターは、ａｐｒＥプロモーター（配列番号３）、ａｐｒＥシグナルペプチド（配列番号４）、ＡｐｒＬプロペプチド（配列番号５）、およびＢＰＮ’ターミネーター配列（配列番号６）を含んだ。当該分野で公知の技術を使用して、目的の種々の成熟プロテアーゼ配列（野生型および変異体）をコードするＤＮＡ断片を導入した。適切なＢ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）宿主株を、ＡｐｒＬ親およびプロテアーゼ変異体遺伝子配列を含む発現プラスミドで形質転換した。細胞は、９６ウェルＭＴＰ中の培養培地（主要な窒素源として尿素、主要な炭素源としてグルコースを有し、頑強な細胞増殖のために１％ソイトンを補充し、抗生物質選択を含むＭＯＰ緩衝液ベースの補強半合成培地）中、湿度８０％、３２℃、３００ｒｐｍの振盪インキュベーター中で２日間増殖させた。遠心分離およびろ過後、目的のプロテアーゼを含む清澄化培養上清をアッセイに使用した。ＢｌｉＤ０２３３９野生型および変異体発現カセットの構築、その後のＢ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）宿主株の形質転換および培養に同じプロセスを使用した。
いくつかの場合では、ＡｐｒＬ変異体は、Ｂ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ａｐｒＥ遺伝子座を標的とする組込カセットから生成した。目的の遺伝子をコードするＤＮＡのプールを、発現カセットに導入し、その後それを、当該分野で公知の方法を使用して、適切なＢ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株の染色体に組み込んだ。以下の構成要素を含むＤＮＡ断片：ＢＰＮ’ターミネーター（配列番号６）、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）由来のクロラムフェニコール耐性マーカー（配列番号１６５）、Ｂ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ａｐｒＥプロモーター（配列番号３）、Ｂ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ａｐｒＥシグナルペプチド配列（配列番号４）、およびＡｐｒＬプロペプチド（配列番号５）は、発現カセットの一部であった。形質転換細胞を上記のように培養し、目的のタンパク質を同様に単離した。
実施例３
洗濯用途でのＡｐｒＬ変異体の性能評価
実施例２に記載され、表３に示すように調製したＡｐｒＬ親プロテアーゼ（配列番号２）の変異体（以下「ＡｐｒＬ変異体」）を、実施例３〜７に記載したようにして、洗浄性能および安定性について評価した。
ＥＭＰＡ−１１６ＢＭＩ汚れと以下の洗濯用洗剤を用いて、実施例１に記載の洗濯洗浄性能アッセイで、表３に記載のＡｐｒＬ変異体を試験した：Ｋｉｒｋｌａｎｄ Ｕｌｔｒａ ＨＤＤ、ＯＭＯ Ｃｏｌｏｒ ＨＤＤ、Ｓｕｒｆ Ｅｘｃｅｌ、Ｋｉｒｋｌａｎｄ Ｕｌｔｒａｃｌｅａｎ ＨＤＬ、ＯＭＯ Ｋｌｅｉｎ＆Ｋｒａｃｈｔｉｇ ＨＤＬおよびＢｌｕｅ Ｍｏｏｎ ＨＤＬ。ＡｐｒＬ親酵素に対して、ＰＩ＞１．１を有する表３のＡｐｒＬ変異体を表４に示す。
Figure 2019523645
Figure 2019523645
実施例４
食器洗浄用途におけるＡｐｒＬ変異体の性能評価
ＰＡＳ−３８卵黄汚れと以下のＡＤＷ洗剤を用いて、実施例１に記載のＡＤＷ洗浄性能アッセイで、表３に記載のＡｐｒＬ変異体を試験した：ＧＳＭ−Ｂ ｐＨ１０、ＧＳＭ−Ｂ ｐＨ９、ＳＵＮ（登録商標）Ａｌｌ ｉｎ Ｏｎｅ、Ｆｉｎｉｓｈ（登録商標）ＱｕａｎｔｕｍおよびＦｉｎｉｓｈ（登録商標）Ａｌｌ ｉｎ Ｏｎｅ。ＡｐｒＬ親酵素に対して、これらのＡＤＷ洗剤の少なくとも１つでＰＩ＞１．０１を有するＡｐｒＬ変異体（表３に示す）を表５に示す。ＡｐｒＬ親酵素に対して、これらのＡＤＷ洗剤の全てでＰＩ＞１．０１を有する表３のＡｐｒＬ変異体を表６に示す。
Figure 2019523645
Figure 2019523645
実施例５
安定性が改善されたＡｐｒＬ変異体
実施例１に記載の安定性アッセイで、表３に記載のＡｐｒＬ変異体を以下の洗剤および緩衝液中で試験した：５３．５℃のＬＡＳ−ＥＤＴＡ緩衝液、５６℃の１０％ Ｋｉｒｋｌａｎｄ Ｕｌｔｒａ ＨＤＬ ｐＨ８．２、５１℃のＯＭＯ Ｋｌｅｉｎ＆Ｋｒａｃｈｔｉｇ ＨＤＬ ｐＨ８．２。（ｉ）実施例１に記載の安定性アッセイの少なくとも１つで、ＡｐｒＬ親酵素に対する安定性ＰＩ＞１．１であり、かつ（ｉｉ）実施例１に記載の洗濯およびＡＤＷ洗浄性能アッセイの両方で洗浄ＰＩ＞１．０１を有する表３のＡｐｒＬ変異体を表７に示す。実施例１に記載された洗濯（ＨＤＬまたはＨＤＤ）、ＡＤＷ、または安定性アッセイの少なくとも１つで、ＡｐｒＬ親酵素に対してＰＩ＞１．１を有する表３のＡｐｒＬ変異体を表８に示す。
Figure 2019523645
Figure 2019523645
実施例６
追加のＡｐｒＬ変異体の性能評価
表３に記載のＡｐｒＬ変異体を、実施例１に記載のプロテアーゼ活性アッセイ（ＡＡＰＦまたはＤＭＣアッセイ）、ＥＭＰＡ−１１６ ＢＭＩ汚れおよびＡｌｌ ＨＤＬ洗剤とＯＭＯ Ｋｌｅｉｎ＆Ｋｒａｃｈｔｉｇ ＨＤＬ洗剤を用いた、実施例１に記載の洗濯洗浄性能アッセイ、ＰＡＳ−３８卵黄汚れおよびＧＳＭ−Ｂ ｐＨ１０とＦｉｎｉｓｈ（登録商標）Ｑｕａｎｔｕｍ食器洗剤を用いた実施例１に記載のＡＤＷ洗浄性能アッセイ、ならびに以下の緩衝液中において実施例１に記載の安定性アッセイで試験した：５３．５℃のＬＡＳ−ＥＤＴＡ緩衝液および５１℃のトリス−ＥＤＴＡ緩衝液。ＡｐｒＬ親酵素に対する洗濯洗浄ＰＩ＞１．０１有する、表３のＡｐｒＬ変異体を表９に示す。ＡｐｒＬ親酵素に対してＡＤＷ洗浄ＰＩ＞１．０１を有する、表３のＡｐｒＬ変異体を表１０に示す。ＡｐｒＬ親酵素に対して安定性ＰＩ＞１．０１を有する、表３のＡｐｒＬ変異体を表１１に示す。少なくとも１種の洗剤で、ＡｐｒＬ親酵素に対する洗濯洗浄、ＡＤＷ洗浄および安定性ＰＩ＞１．０１を有する表３のＡｐｒＬ変異体を表１２に示す。
Figure 2019523645
Figure 2019523645
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実施例７
ホウ素非含有洗剤中のＡｐｒＬ変異体の洗浄性能
精製ＡｐｒＬ変異体、Ｍ１２３Ｉ−Ｑ１３６Ｒ、Ｍ１２３Ｉ−Ｑ１３６Ｒ−Ｇ１６５Ｑ、Ｖ０４５Ｒ−Ｑ１３６Ｒ−Ｇ１６５Ｑ−Ｓ２５８Ｅ、Ｖ０４５Ｒ−Ｍ１２３Ｉ−Ｑ１３６Ｒ−Ｇ１６５Ｑ−Ｓ２５８ＥおよびＶ０４５Ｒ−Ｍ１２３Ｉ−Ｑ１３６Ｒの洗浄性能を、検出可能量のホウ素またはホウ素含有化合物を含まない以下の洗剤、Ａｌｌ ３Ｘ、Ｐｕｒｅｘ（登録商標）Ｄｉｒｔ ＬｉｆｔおよびＰｅｒｓｉｌ Ｎｏｎ Ｂｉｏ中で試験した。これらのＡｐｒＬ変異体を、実施例１に記載の洗濯洗浄性能アッセイで試験した。結果を、ＡｐｒＬ親酵素に対するＰＩの計算値として、表１３に示す。プロテアーゼは、２．５ｐｐｍの用量で試験した。この実施例の、ホウ素を含まない洗剤中に存在するホウ素の量を、元素分析によって定量したところ、全ての場合において、洗剤１ｋｇあたりトレース量（５ｍｇ未満）のホウ素しか検出されなかった。
Figure 2019523645
実施例８
ＡｐｒＬおよびＢｌｉＤ０２３３９プロテアーゼ変異体の洗浄性能および洗剤安定性
表１４に示したＡｐｒＬ変異体は、実施例２に記載したようにして作製した。表１４の変異体の洗浄性能および安定性を、実施例１に記載の１つ以上の洗浄性能アッセイおよび安定性アッセイで試験した。
表１４に示したＡｐｒＬ変異体の洗濯洗浄性能は、試験ＨＤＬ１洗剤およびＰｅｒｓｉｌ Ｎｏｎ−Ｂｉｏ洗剤中で、ＥＭＰＡ−１１６マイクロスワッチについて試験した（表１．１、アッセイ条件８および１０）。１０％の試験ＨＤＬ１洗剤中、５２．５℃および／または５４℃で酵素安定性を試験した（表２、アッセイ条件５）。表１５に、ＡｐｒＬ親酵素と比較したＰＩ値として結果を示す。ただし、ＮＤは、測定されなかったことを意味する。
表１７に、実施例１に記載の洗濯洗浄性能アッセイおよび安定性アッセイで試験した、ＡｐｒＬ変異体の性能を示す：（ｉ）Ｐｅｒｓｉｌ Ｎｏｎ−Ｂｉｏ、試験ＨＤＬ１および試験ＨＤＬ２洗剤中でのＥＭＰＡ−１１６、ＣＦＴ ＣＳ−３８およびＣＦＴ−Ｃ１０マイクロスワッチに対する洗浄性能、および（ｉｉ）６３℃、１５〜２０分間の１０％ＰＮＢ中での安定性、および／または６０℃、１５〜２０分間の１０％試験ＨＤＬ１中での安定性。洗浄性能の結果は、ＳＱＣＢＶ３５変異体（配列番号６３）に対するＰＩ値として報告し、安定性の結果は、非ストレス条件に対するストレス後の試料の％残留活性として報告する。ＮＤは、値が測定されなかったことを意味する。
Figure 2019523645
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表１８に記載のＢｌｉＤ０２３３９ 親プロテアーゼ（配列番号９）の変異体（以下、「ＢｌｉＤ変異体」）を、実施例２に記載したように作製し、実施例１に記載したように、洗浄性能および安定性について試験した。
Ｐｅｒｓｉｌ Ｎｏｎ−Ｂｉｏおよび試験 ＨＤＬ２洗濯用洗剤で試験したときに、３種の技術汚れのマイクロウォッチ、すなわち、ＥＭＰＡ−１１６、ＣＦＴ ＣＳ−３８、およびＣＦＴ−Ｃ１０に対する洗浄性能で、ＢｌｉＤ親酵素に優る改善を示し、また、１０％のＰｅｒｓｉｌ Ｎｏｎ−Ｂｉｏ（ＰＮＢ）洗濯用洗剤（６３℃で１５〜２０分間ストレスを加えた）で試験したときに、改善された安定性をも示したＢｌｉＤ変異体を表１８に示す。洗浄性能および安定性の結果を表１９に示す。洗浄性能の結果は、ＢｌｉＤ親酵素（配列番号９）に対するＰＩ値として報告し、安定性の結果は、非ストレス条件に対するストレス後の試料の％残留活性として報告する。ＮＤは、値が測定されなかったことを意味する。
Figure 2019523645
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実施例９
ＡｐｒＬプロテアーゼの関連分子に対する比較
相同プロテアーゼの同定
ＡｐｒＬプロテアーゼ（配列番号２）に関連するタンパク質を、非冗長ＮＣＢＩタンパク質データベースに対するＢＬＡＳＴ検索（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，２５：３３８９−４０２，１９９７）によって同定し、サブセットを表２０に示す。同様の検索を、デフォルト値に設定された検索パラメーターを用いてＧｅｎｏｍｅ Ｑｕｅｓｔ Ｐａｔｅｎｔ ｄａｔａｂａｓｅに対して実行し、サブセットを表２１に示す。ＡｐｒＬプロテアーゼ（配列番号２）の成熟アミノ酸配列（２７４アミノ酸）を両方の検索のクエリー配列として用いた。同一残基の数を、ペアワイズアラインメントにおいてアラインした残基の数で割ることによって、双方の検索セットについてのパーセント同一性（ＰＩＤ）を定義する。名前が「配列長」のカラムは、名前が「アクセッション番号」のカラム中のアクセッション番号によって同定されたタンパク質の長さ（アミノ酸単位）に相当し、「アラインメント長」は、アラインメントおよびＰＩＤ計算のために使用した配列の長さ（アミノ酸単位）を指す。
Figure 2019523645
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スブチリシン配列とＡｐｒＬとのアラインメント
デフォルトのパラメーターでＣＬＵＳＴＡＬＷソフトウェア（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２：４６７３−４６８０，１９９４）を使用し、成熟ＡｐｒＬ（配列番号２）およびＢｌｉＤ０２３３９（配列番号９）タンパク質のアミノ酸配列を、表２０および２１の複数のスブチリシンの成熟配列とアラインさせた。このアラインメントを、配列番号１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８および１７９から選択された、１つ以上のアミノ酸モチーフの周囲に描かれたボックスと共に図１に示す。
実施例１０
ＡｐｒＬおよびＢｌｉＤ０２３３９を含むスブチリシンの系統樹
ＡｐｒＬタンパク質（配列番号２）、ＢｌｉＤ０２３３９タンパク質（配列番号９）、ＡｐｒＬプロテアーゼ変異体：すなわち、ＳＱＭ−３０（配列番号３６）、ＳＱＣＢＶ２０（配列番号５７）、ＳＱＣＢＶ３５（配列番号６３）、ＳＱＣＢＶ３７（配列番号６５）、ＳＱＣＢＶ１８８（配列番号１０５）、ＳＱＣＢＶ２６９（配列番号１４０）、ＳＱＢＬＶ１３４（配列番号１６０）、ＳＱＣＢＶ３２８（配列番号２６８）、ＳＱＣＢＶ４１９（配列番号３０２）、ＳＱＣＢＶ５５５（配列番号３５８）、ＳＱＣＢＶ５６７（配列番号３７０）およびＳＱＣＢＶ５８２（配列番号３８４）の成熟配列についての系統樹を、表２０および２１に示したスブチリシン配列のサブセットを用いて構築した。配列を、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ Ａｄｖａｎｃｅ ｓｕｉｔｅに入力し、樹形図を、近隣結合法（ＮＪ）を用いて作成した（Ｓａｉｔｏｕ，Ｎ．；ａｎｄ Ｎｅｉ，Ｍ．（１９８７）Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｅｖｏｌ ４，４０６−４２５）。ＮＪ法は分析する全ての配列ペア間の距離マトリックスを使って動作する。これらの距離は、配列間の相違度に関係する。樹形図は配列アラインメントが済んでから計算される。樹の構築は次のパラメーターを使って計算した。木村の配列距離補正およびギャップを含む部位を無視した。図２に示す系統樹の表示には、ＭＥＧＡ ６プログラムを使用した。系統樹分布に基づいて、特定のスブチリシンを、図２に示されているようにグループ分けしてＡｐｒＬ−ｃｌａｄｅを形成した。
実施例１１
追加のＡｐｒＬ変異体
実施例２に記載したようにして、表２２に示したＡｐｒＬ変異体を作製した。
Figure 2019523645
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実施例１２
追加のＡｐｒＬ変異体の洗濯洗浄性能および洗剤安定性
洗濯物洗浄性能および安定性について、表２２に示したＡｐｒＬ変異体およびＳＱＣＢＶ３５を実施例１に記載のようにして試験した。ＢＭＩ（ＥＭＰＡ−１１６）マイクロスワッチをＰｅｒｓｉｌ Ｎｏｎ−Ｂｉｏ、Ｂｌｕｅ ＭｏｏｎおよびＬｉｂｙ洗剤中（表２、アッセイ条件６、１０、および１６）で使用した。１０％のＰｅｒｓｉｌ Ｎｏｎ−Ｂｉｏ、Ｂｌｕｅ ＭｏｏｎおよびＬｉｂｙ洗剤中、６２〜６５℃で酵素安定性を試験した（表２）。
表２３に、ＳＱＣＢＶ３５変異体（配列番号６３）と比較したＰＩ値として、Ｐｅｒｓｉｌ Ｎｏｎ−Ｂｉｏ中での洗浄性能の結果を示す。表２３はまた、１０％ＰＮＢ中、６２℃で１５分間、１０％Ｂｌｕｅ Ｍｏｏｎ中、６４℃で１５分間、および１０％Ｌｉｂｙ中、６５℃で１５分間の安定性についての結果も示し、非ストレス条件に対するストレス後の試料の％残留活性として報告する。表２４に、ＳＱＣＢＶ３５変異体（配列番号６３）と比較した性能指数（ＰＩ）値として、Ｐｅｒｓｉｌ Ｎｏｎ−Ｂｉｏ（ＰＮＢ）、Ｂｌｕｅ ＭｏｏｎおよびＬｉｂｙ洗剤中での洗浄性能の結果を示す。表２４はまた、１０％ＰＮＢ洗剤中、６２℃で１５分間、１０％Ｂｌｕｅ Ｍｏｏｎ洗剤中、６４℃で１５分間、および１０％Ｌｉｂｙ洗剤中、６５℃で１５分間の安定性についての結果も示し、非ストレス条件に対するストレス後の試料の％残留活性として報告する。表２５に、ＥＭＰＡ−１１６、ＣＳ−３８およびＣＦＴ−１０の染みを用いた、Ｐｅｒｓｉｌ Ｎｏｎ−Ｂｉｏ洗剤中での洗浄性能の結果を、ＳＱＣＢＶ３５変異体（配列番号６３）と比較したＰＩ値として示す。表２５はまた、１０％ＰＮＢ中、６６℃で２０分間、１０％Ｂｌｕｅ Ｍｏｏｎ中、６８℃で２０分間、および１０％Ｌｉｂｙ中、６９℃で２０分間の安定性についての結果も示し、非ストレス条件に対するストレス後の試料の％残留活性として報告する。表２６に、種々のＡｐｒＬ変異体の、Ｌｉｂｙ、Ｂｌｕｅ ＭｏｏｎおよびＰＮＢ洗剤中での洗濯洗浄性能および安定性についての結果を示す。安定性条件は、実施例１の表２に記載した。表２７は、劣化洗濯洗浄アッセイ（実施例１：劣化洗濯洗浄アッセイ（Ａ）に記載のように実施した）における種々のＡｐｒＬ変異体の性能を示す。劣化洗浄性能は、１００％のＢｌｕｅ Ｍｏｏｎ洗剤中の試料を３７℃で３週間インキュベートした後に残留する％洗浄活性として報告される。
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実施例１３
追加のＡｐｒＬ変異体のＡＤＷ洗浄性能および洗剤安定性
表１．１に示した種々の洗剤調合物、およびアッセイ前に予めリンスしたまたはリンスしない、予めパンチした卵黄マイクロスワッチ（ＰＡＳ−３８）を使用して、表２２に示したＡｐｒＬプロテアーゼ変異体、ＡｐｒＬ ｗｔおよびＳＱＣＢＶ３５の洗浄性能を食器ベースの使用（ＡＤＷ）で測定した。予めリンスしたＰＡＳ−３８スワッチを調製するために、１８０μｌの１０ｍＭ ＣＡＰＳ緩衝液（ｐＨ１１）を、マイクロスワッチを含むＭＴＰに加え、プレートを密封し、ｉＥＭＳインキュベーター中、６０℃および１１００ｒｐｍで３０分間インキュベートした。次いで、緩衝液を除去し、スワッチを脱イオン水でリンスし、風乾した。ＡＤＷ調合物中での酵素洗浄性を測定するために、１７５μＬの洗剤溶液（３７４ｐｐｍの水硬度で調製した３ｇ／Ｌの洗剤）をＭＴＰの各ウェルに加え、続いて５μＬの酵素を加えた。ＭＴＰに封をし、ｉＥＭＳインキュベーター中、４０℃、振盪速度１１００ｒｐｍで３０分間インキュベートした。インキュベーション後、各ウェルの１００μＬの洗浄液を新しいＭＴＰに移し、この上清の４０５ｎｍでの吸光度をＳｐｅｃｔｒａＭａｘプレートリーダーで測定した。ＧＳＭ−Ｂ ｐＨ １０．５調合物中の各試料の値から、ブランク対照（酵素なし）の値を減算して正味の吸光度を得た。カスタム液体ＡＤＷ洗剤調合物を使用する（ｐＨ７と９で）場合、酵素インキュベーション後にＭＴＰウェルから全ての上清を除去し、別のＭＴＰに移して４０５ｎｍでの吸光度を決定した。ＭＴＰ中のスワッチを脱イオン水で濯ぎ、次いで、ウェル当たり１８０μＬの１０ｍＭ ＣＡＰＳ緩衝液（ｐＨ１１）を加え、ｉＥＭＳインキュベーター中、４０℃、１１００ｒｐｍでさらに１０分間、プレートをインキュベートした。この最後のインキュベーション後、得られた１００μＬの洗浄液を新しいＭＴＰに移し、４０５ｎｍで吸光度を測定した。カスタム液体ＡＤＷ洗剤調合物における総洗浄性能を（ｐＨ７および９で）決定するために、得られた２つの吸光度測定値を加え、この合計値を使用して、各酵素の性能指数（ＰＩ）を計算した。
全ての場合に、ブランクを減算した総吸光度を親プロテアーゼ（同じ濃度で試験した）のそれで除すことによって、各条件および各プロテアーゼ変異体についてのＰＩを計算した。この試験に含められ、かつ、ラングミュアフィットにフィッティングした親プロテアーゼの標準曲線から、親プロテアーゼの値を決定した。ＧＳＭ−Ｂ ｐＨ１０．５またはカスタム液体ＡＤＷ洗剤調合物（ｐＨ７およびｐＨ９に調整）のいずれかで試験した、ＡｐｒＬ変異体（リンスしたまたはリンスしていないスワッチのいずれかを使用する）のＡＤＷ性能結果を表２８に示す。結果は、ＡｐｒＬ野生型プロテアーゼ（「ＡｐｒＬ ｗｔ」）と比較したＰＩ値として報告する。
Figure 2019523645

Claims (29)

  1. 配列番号２に対応する位置に、２つ、３つまたは４つ以上の変異を含む、アミノ酸配列を含むスブチリシン変異体であって、前記位置は、前記２つ、３つまたは４つ以上の変異の１つ以上が人工的変異または置換であるという条件で、
    （ｉ）１、３、９、１０、１５、２２、２４、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３５、３７、４０、４３、４５、４８、５２、６８、７１、７６、７７、７８、８６、８７、９５、９６、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０５、１０８、１１１、１１４、１１５、１１７、１１９、１２３、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３６、１４３、１４６、１４７、１５１、１５５、１５８、１６０、１６１、１６５、１８４、１８７、１９３、２０２、２０３、２０４、２１０、２１１、２１６、２１７、２３４、２３８、２３９、２４２、２４３、２５０、２５５、２５８、２５９、２６０、２６４および２７４；
    （ｉｉ）１、３、９、１０、１５、２２、２４、２６、２８、２９、３０、３１、３５、３７、４０、４５、４８、５２、６８、７１、７６、７７、７８、８６、８７、９５、９６、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０５、１０８、１１１、１１４、１１５、１１７、１１９、１２３、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３６、１４３、１４６、１４７、１５１、１５５、１５８、１６０、１６１、１６５、１８４、１８７、１９３、２０２、２０３、２０４、２１０、２１１、２１６、２１７、２３４、２３８、２３９、２４２、２４３、２５０、２５５、２５８、２５９、２６０、２６４および２７４；
    （ｉｉｉ）１、３、９、１０、２４、２６、２９、３０、３１、３５、３７、４０、４５、４８、５２、６８、７１、７７、７８、８６、８７、９５、９６、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０５、１０８、１１１、１１５、１１７、１１９、１２３、１２７、１２８、１２９、１３０、１３６、１４３、１４６、１４７、１５１、１５５、１５８、１６０、１６１、１６５、１８４、１８７、１９３、２０２、２０３、２０４、２１０、２１１、２１６、２１７、２３４、２３８、２３９、２４２、２４３、２５０、２５８、２５９、２６０、２６４および２７４；
    （ｉｖ）３、９、１０、３５、６８、７７、７８、８６、８７、９９、１０１、１１５、１２３、１２７、１２８、１６５、１８４、１８７、２０２、２０３、２１０、２１７、２４２、２５０、２５８および２６４；または
    （ｖ）３、６８、７７、７８、１２３、１２７、１２８、１６５、１８４、２０２、２１０、２１７、および２５８
    から選択され；
    前記変異体は、モチーフＡおよび／またはモチーフＢを含むＡｐｒＬ−Ｃｌａｄｅスブチリシン酵素に対して、少なくとも８５％で１００％未満のアミノ酸配列同一性を有し；
    モチーフＡは、モチーフ１、モチーフ２、モチーフ３およびモチーフ４から選択され；
    モチーフＢは、モチーフ５、モチーフ６、モチーフ７、モチーフ８、モチーフ９、モチーフ１０、モチーフ１１、モチーフ１２、モチーフ１３およびモチーフ１４から選択され；かつ
    前記変異体のアミノ酸位置は、配列番号２のアミノ酸配列に対応して番号付けされているスブチリシン変異体。
  2. 前記変異体は、配列番号２に対応する２つ、３つまたは４つ以上の位置に、２つ、３つまたは４つ以上のアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を含み、前記置換は、
    （ｉ）１Ｑ、３Ｑ／Ｖ、９Ｅ、１０Ｍ、１５Ｉ、２２Ｙ、２４Ｎ／Ｑ、２６Ｑ、２７Ｒ、２８Ａ、２９Ｓ、３０Ｔ、３１Ｉ、３５Ａ、３７Ｔ、４０Ｅ、４３Ａ、４５Ｉ／Ｑ／Ｒ、４８Ｉ／Ｔ／Ｖ、５２Ｒ、６８Ｓ、７１Ａ、７６Ｋ、７７Ｄ／Ｅ／Ｈ／Ｎ／Ｑ／Ｓ、７８Ｉ、８６Ｈ／Ｎ／Ｒ、８７Ｓ／Ｔ、９５Ａ／Ｆ／Ｑ、９６Ｓ、９８Ｈ／Ｒ、９９Ａ／Ｅ／Ｑ／Ｓ、１００Ｎ、１０１Ａ、１０２Ｄ／Ｔ、１０３Ｉ、１０５Ｎ、１０８Ｈ／Ｋ、１１１Ｑ、１１４Ｎ、１１５Ｆ、１１７Ｓ、１１９Ｑ、１２３Ｉ、１２５Ｎ、１２６Ｑ、１２７Ｅ／Ｆ／Ｑ／Ｓ／Ｔ／Ｖ、１２８Ｐ／Ｒ／Ｓ、１２９Ｈ／Ｒ、１３０Ｓ、１３６Ｎ／Ｒ、１４３Ｑ／Ｖ、１４６Ａ／Ｓ、１４７Ｌ、１５１Ｇ、１５５Ｅ／Ｇ／Ｎ、１５８Ｄ／Ｎ／Ｑ、１６０Ｃ／Ｄ／Ｋ、１６１Ｄ／Ｑ、１６５Ａ／Ｅ／Ｑ／Ｓ、１８４Ｅ／Ｑ、１８７Ｅ／Ｐ、１９３Ｄ／Ｑ、２０２Ｖ、２０３Ｅ／Ｎ／Ｑ、２０４Ｉ、２１０Ｅ／Ｈ／Ｉ／Ｐ、２１１Ｓ、２１６Ｑ、２１７Ｓ、２３４Ｉ／Ｗ、２３８Ｑ／Ｒ、２３９Ｋ／Ｓ／Ｔ、２４２Ｇ／Ｎ、２４３Ｉ、２５０Ｇ、２５５Ｒ、２５８Ｄ／Ｅ／Ｐ、２５９Ｅ／Ｐ、２６０Ｗ、２６４Ｈ／Ｑ／Ｓおよび２７４Ａ；
    （ｉｉ）１Ｑ、３Ｑ／Ｖ、９Ｅ、１０Ｍ、１５Ｉ、２２Ｙ、２４Ｎ／Ｑ、２６Ｑ、２８Ａ、２９Ｓ、３０Ｔ、３１Ｉ、３５Ａ、３７Ｔ、４０Ｅ、４５Ｉ／Ｑ／Ｒ、４８Ｉ／Ｔ／Ｖ、５２Ｒ、６８Ｓ、７１Ａ、７６Ｋ、７７Ｄ／Ｅ／Ｈ／Ｎ／Ｓ、７８Ｉ、８６Ｈ／Ｎ／Ｒ、８７Ｓ／Ｔ、９５Ａ／Ｆ／Ｑ、９６Ｓ、９８Ｋ／Ｒ、９９Ａ／Ｅ／Ｑ／Ｓ、１００Ｎ、１０１Ａ、１０２Ｄ／Ｔ、１０５Ｎ、１０８Ｈ／Ｋ、１１１Ｑ、１１４Ｎ、１１５Ｆ、１１７Ｓ、１１９Ｑ、１２３Ｉ、１２５Ｎ、１２６Ｑ、１２７Ｅ／Ｆ／Ｑ／Ｓ／Ｔ／Ｖ、１２８Ｐ／Ｒ／Ｓ、１２９Ｈ／Ｒ、１３０Ｓ、１３６Ｎ、１４３Ｑ／Ｖ、１４６Ａ／Ｓ、１４７Ｌ、１５１Ｇ、１５５Ｅ／Ｇ／Ｎ、１５８Ｄ／Ｎ／Ｑ、１６０Ｄ／Ｋ、１６１Ｄ／Ｑ、１６５Ａ／Ｅ／Ｑ／Ｓ、１８４Ｅ／Ｑ、１８７Ｅ／Ｐ、１９３Ｄ／Ｑ、１９４Ｅ、２０２Ｖ、２０３Ｅ／Ｎ／Ｑ、２０４Ｉ、２１０Ｉ／Ｐ、２１１Ｓ、２１６Ｑ、２１７Ｓ、２３４Ｉ／Ｗ、２３８Ｑ／Ｒ、２３９Ｋ／Ｓ／Ｔ、２４２Ｇ／Ｎ、２４３Ｉ、２５０Ｇ、２５５Ｒ、２５８Ｄ／Ｐ、２５９Ｅ／Ｐ、２６０Ｗ、２６４Ｈ／Ｑ／Ｓおよび２７４Ａ；
    （ｉｉｉ）１Ｑ、３Ｖ、９Ｅ、１０Ｍ、２４Ｑ、２６Ｑ、２９Ｓ、３０Ｔ、３１Ｉ、３５Ａ、３７Ｔ、４０Ｅ、４５Ｉ／Ｑ／Ｒ、４８Ｔ／Ｖ、５２Ｒ、６８Ｓ、７１Ａ、７７Ｅ／Ｎ、７８Ｉ、８６Ｈ／Ｒ、８７Ｓ、９５Ａ／Ｆ、９６Ｓ、９８Ｒ、９９Ａ／Ｅ／Ｑ／Ｓ、１００Ｎ、１０１Ａ、１０２Ｄ／Ｔ、１０５Ｎ、１０８Ｈ、１１１Ｑ、１１５Ｆ、１１７Ｓ、１１９Ｑ、１２３Ｉ、１２７Ｅ／Ｑ／Ｓ／Ｔ／Ｖ、１２８Ｐ／Ｒ、１２９Ｈ／Ｒ、１３０Ｓ、１３６Ｎ、１４３Ｑ／Ｖ、１４６Ａ、１４７Ｌ、１５１Ｇ、１５５Ｇ／Ｎ、１５８Ｄ／Ｎ／Ｑ、１６０Ｄ／Ｋ、１６１Ｄ／Ｑ、１６５Ａ／Ｅ／Ｑ、１８４Ｅ／Ｑ、１８７Ｅ／Ｐ、１９３Ｑ、２０２Ｖ、２０３Ｅ／Ｎ／Ｑ、２０４Ｉ、２１０Ｉ／Ｐ、２１１Ｓ、２１６Ｑ、２１７Ｓ、２３４Ｗ、２３８Ｑ、２３９Ｓ、２４２Ｇ／Ｎ、２４３Ｉ、２５０Ｇ、２５８Ｄ／Ｐ、２５９Ｅ／Ｐ、２６０Ｗ、２６４Ｈ／Ｑ／Ｓおよび２７４Ａ；
    （ｉｖ）３Ｖ、９Ｅ、１０Ｍ、３５Ａ、６８Ｓ、７７Ｎ、７８Ｉ、８６Ｈ、８７Ｓ、９９Ｑ／Ｓ、１０１Ａ、１１５Ｆ、１２３Ｉ、１２７Ｓ／Ｔ、１２８Ｐ／Ｒ、１６５Ｅ／Ｑ、１８４Ｑ、１８７Ｅ、２０２Ｖ、２０３Ｅ、２１０Ｐ、２１７Ｓ、２４２Ｇ、２５０Ｇ、２５８Ｄ／Ｐおよび２６４Ｈ；または
    （ｖ）３Ｖ、６８Ｓ、７７Ｎ、７８Ｉ、１２３Ｉ、１２７Ｓ、１２８Ｐ、１６５Ｑ、１８４Ｑ、２０２Ｖ、２１０Ｐ、２１７Ｓおよび２５８Ｄ／Ｐ
    から選択される、請求項１に記載のスブチリシン変異体。
  3. 前記変異体は、
    （ｉ）Ａ／Ｇ１Ｑ、Ｔ３Ｑ／Ｖ、Ｐ／Ｓ９Ｅ、Ｌ／Ｑ１０Ｍ、Ｋ１５Ｉ、Ｋ２２Ｙ、Ａ２４Ｎ／Ｑ、Ｖ２６Ｑ、Ｋ２７Ｒ、Ｇ／Ｖ２８Ａ、Ａ／Ｇ２９Ｓ、Ｉ／Ｖ３０Ｔ、Ｉ／Ｌ３１Ｉ、Ｉ３５Ａ、Ａ／Ｓ３７Ｔ、Ｐ／Ｓ／Ｔ４０Ｅ、Ｎ／Ｋ４３Ａ、Ｓ／Ｖ４５Ｉ／Ｑ／Ｒ、Ａ４８Ｉ／Ｔ／Ｖ、Ａ／Ｓ５２Ｒ、Ａ６８Ｓ、Ｖ７１Ａ、Ｎ７６Ｋ、Ｓ／Ｔ７７Ｄ／Ｅ／Ｈ／Ｎ／Ｑ／Ｓ、Ｔ７８Ｉ、Ｎ／Ｓ８６Ｈ／Ｎ／Ｒ、Ｖ８７Ｓ／Ｔ、Ｌ９５Ａ／Ｆ／Ｑ、Ｎ９６Ｓ、Ｓ９８Ｈ／Ｒ、Ｇ９９Ａ／Ｅ／Ｑ／Ｓ、Ｓ１００Ｎ、Ｇ１０１Ａ、Ｓ／Ｔ１０２Ｄ／Ｔ、Ｙ１０３Ｉ、Ａ／Ｇ１０５Ｎ、Ｓ１０８Ｈ／Ｋ、Ｅ１１１Ｑ、Ｔ１１４Ｎ、Ａ／Ｑ／Ｓ／Ｔ１１５Ｆ、Ｇ／Ｎ１１７Ｓ、Ｄ１１９Ｑ、Ｍ１２３Ｉ、Ｌ１２５Ｎ、Ｇ１２６Ｑ、Ｇ１２７Ｅ／Ｆ／Ｑ／Ｓ／Ｔ／Ｖ、Ａ／Ｐ／Ｓ１２８Ｐ／Ｒ／Ｓ、Ｓ１２９Ｈ／Ｒ、Ｇ／Ｖ１３０Ｓ、Ｑ１３６Ｎ／Ｒ、Ａ／Ｓ１４３Ｑ／Ｖ、Ａ／Ｉ／Ｖ１４６Ａ／Ｓ、Ｖ１４７Ｌ、Ａ／Ｓ１５１Ｇ、Ｓ１５５Ｅ／Ｇ／Ｎ、Ｓ１５８Ｄ／Ｎ／Ｑ、Ｎ／Ｓ／Ｙ１６０Ｃ／Ｄ／Ｋ、Ａ／Ｓ／Ｑ／Ｔ１６１Ｄ／Ｑ、Ｇ１６５Ａ／Ｅ／Ｑ／Ｓ、Ｎ／Ｑ１８４Ｅ／Ｑ、Ｓ１８７Ｅ／Ｐ、Ａ／Ｐ／Ｓ１９３Ｄ／Ｑ、Ａ／Ｓ２０２Ｖ、Ａ／Ｇ／Ｓ２０３Ｅ／Ｎ／Ｑ、Ｖ２０４Ｉ、Ｓ／Ｔ２１０Ｅ／Ｈ／Ｉ／Ｐ、Ｎ２１１Ｓ、Ｌ２１６Ｑ、Ｎ２１７Ｓ、Ｌ２３４Ｉ／Ｗ、Ｐ２３８Ｑ／Ｒ、Ａ／Ｎ／Ｔ２３９Ｋ／Ｓ／Ｔ、Ａ２４２Ｇ／Ｎ、Ｓ２４３Ｉ、Ｓ２５０Ｇ、Ｎ／Ｙ２５５Ｒ、Ｄ／Ｓ２５８Ｄ／Ｅ／Ｐ、Ｓ２５９Ｅ／Ｐ、Ｆ２６０Ｗ、Ｋ／Ｎ／Ｒ２６４Ｈ／Ｑ／ＳおよびＱ２７４Ａ；
    （ｉｉ）Ａ１Ｑ、Ｔ３Ｑ／Ｖ、Ｐ９Ｅ、Ｌ１０Ｍ、Ｋ１５Ｉ、Ｋ２２Ｙ、Ａ２４Ｎ／Ｑ、Ｖ２６Ｑ、Ｋ２７Ｒ、Ｖ２８Ａ、Ａ２９Ｓ、Ｖ３０Ｔ、Ｌ３１Ｉ、Ｉ３５Ａ、Ａ３７Ｔ、Ｐ４０Ｅ、Ｎ４３Ａ、Ｖ４５Ｉ／Ｑ／Ｒ、Ａ４８Ｉ／Ｔ／Ｖ、Ａ５２Ｒ、Ａ６８Ｓ、Ｖ７１Ａ、Ｎ７６Ｋ、Ｓ７７Ｄ／Ｅ／Ｈ／Ｎ／Ｑ／Ｓ、Ｔ７８Ｉ、Ｓ８６Ｈ／Ｎ／Ｒ、Ｖ８７Ｓ／Ｔ、Ｌ９５Ａ／Ｆ／Ｑ、Ｎ９６Ｓ、Ｓ９８Ｈ／Ｒ、Ｇ９９Ａ／Ｅ／Ｑ／Ｓ、Ｓ１００Ｎ、Ｇ１０１Ａ、Ｓ１０２Ｄ／Ｔ、Ｙ１０３Ｉ、Ｇ１０５Ｎ、Ｓ１０８Ｈ／Ｋ、Ｅ１１１Ｑ、Ｔ１１４Ｎ、Ｔ１１５Ｆ、Ｇ１１７Ｓ、Ｄ１１９Ｑ、Ｍ１２３Ｉ、Ｌ１２５Ｎ、Ｇ１２６Ｑ、Ｇ１２７Ｅ／Ｆ／Ｑ／Ｓ／Ｔ／Ｖ、Ａ１２８Ｐ／Ｒ／Ｓ、Ｓ１２９Ｈ／Ｒ、Ｇ１３０Ｓ、Ｑ１３６Ｎ／Ｒ、Ａ１４３Ｑ／Ｖ、Ｖ１４６Ａ／Ｓ、Ｖ１４７Ｌ、Ａ１５１Ｇ、Ｓ１５５Ｅ／Ｇ／Ｎ、Ｓ１５８Ｄ／Ｎ／Ｑ、Ｎ１６０Ｃ／Ｄ／Ｋ、Ｔ１６１Ｄ／Ｑ、Ｇ１６５Ａ／Ｅ／Ｑ／Ｓ、Ｎ１８４Ｅ／Ｑ、Ｓ１８７Ｅ／Ｐ、Ａ１９３Ｄ／Ｑ、Ａ２０２Ｖ、Ｇ２０３Ｅ／Ｎ／Ｑ、Ｖ２０４Ｉ、Ｔ２１０Ｅ／Ｈ／Ｉ／Ｐ、Ｎ２１１Ｓ、Ｌ２１６Ｑ、Ｎ２１７Ｓ、Ｌ２３４Ｉ／Ｗ、Ｐ２３８Ｑ／Ｒ、Ｎ２３９Ｋ／Ｓ／Ｔ、Ａ２４２Ｇ／Ｎ、Ｓ２４３Ｉ、Ｓ２５０Ｇ、Ｙ２５５Ｒ、Ｓ２５８Ｄ／Ｅ／Ｐ、Ｓ２５９Ｅ／Ｐ、Ｆ２６０Ｗ、Ｋ２６４Ｈ／Ｑ／ＳおよびＱ２７４Ａ；
    （ｉｉｉ）Ａ／Ｇ１Ｑ、Ｔ３Ｑ／Ｖ、Ｐ／Ｓ９Ｅ、Ｌ／Ｑ１０Ｍ、Ｋ１５Ｉ、Ｋ２２Ｙ、Ａ２４Ｎ／Ｑ、Ｖ２６Ｑ、Ｇ／Ｖ２８Ａ、Ａ／Ｇ２９Ｓ、Ｉ／Ｖ３０Ｔ、Ｉ／Ｌ３１Ｉ、Ｉ３５Ａ、Ａ／Ｓ３７Ｔ、Ｐ／Ｓ／Ｔ４０Ｅ、Ｓ／Ｖ４５Ｉ／Ｑ／Ｒ、Ａ４８Ｉ／Ｔ／Ｖ、Ａ／Ｓ５２Ｒ、Ａ６８Ｓ、Ｖ７１Ａ、Ｎ７６Ｋ、Ｓ／Ｔ７７Ｄ／Ｅ／Ｈ／Ｎ／Ｓ、Ｔ７８Ｉ、Ｎ／Ｓ８６Ｈ／Ｎ／Ｒ、Ｖ８７Ｓ／Ｔ、Ｌ９５Ａ／Ｆ／Ｑ、Ｎ９６Ｓ、Ｓ９８Ｒ、Ｇ９９Ａ／Ｅ／Ｑ／Ｓ、Ｓ１００Ｎ、Ｇ１０１Ａ、Ｓ／Ｔ１０２Ｄ／Ｔ、Ａ／Ｇ１０５Ｎ、Ｓ１０８Ｈ／Ｋ、Ｅ１１１Ｑ、Ｔ１１４Ｎ、Ａ／Ｑ／Ｓ／Ｔ１１５Ｆ、Ｇ／Ｎ１１７Ｓ、Ｄ１１９Ｑ、Ｍ１２３Ｉ、Ｌ１２５Ｎ、Ｇ１２６Ｑ、Ｇ１２７Ｅ／Ｆ／Ｑ／Ｓ／Ｔ／Ｖ、Ａ／Ｐ／Ｓ１２８Ｐ／Ｒ／Ｓ、Ｓ１２９Ｈ／Ｒ、Ｇ／Ｖ１３０Ｓ、Ｑ１３６Ｎ、Ａ／Ｓ１４３Ｑ／Ｖ、Ａ／Ｉ／Ｖ１４６Ａ／Ｓ、Ｖ１４７Ｌ、Ａ／Ｓ１５１Ｇ、Ｓ１５５Ｅ／Ｇ／Ｎ、Ｓ１５８Ｄ／Ｎ／Ｑ、Ｎ／Ｓ／Ｙ１６０Ｄ／Ｋ、Ａ／Ｓ／Ｑ／Ｔ１６１Ｄ／Ｑ、Ｇ１６５Ａ／Ｅ／Ｑ／Ｓ、Ｎ／Ｑ１８４Ｅ／Ｑ、Ｓ１８７Ｅ／Ｐ、Ａ／Ｐ／Ｓ１９３Ｄ／Ｑ、Ａ／Ｓ２０２Ｖ、Ａ／Ｇ／Ｓ２０３Ｅ／Ｎ／Ｑ、Ｖ２０４Ｉ、Ｓ／Ｔ２１０Ｉ／Ｐ、Ｎ２１１Ｓ、Ｌ２１６Ｑ、Ｎ２１７Ｓ、Ｌ２３４Ｉ／Ｗ、Ｐ２３８Ｑ／Ｒ、Ａ／Ｎ／Ｔ２３９Ｋ／Ｓ／Ｔ、Ａ２４２Ｇ／Ｎ、Ｓ２４３Ｉ、Ｓ２５０Ｇ、Ｎ／Ｙ２５５Ｒ、Ｄ／Ｓ２５８Ｄ／Ｐ、Ｓ２５９Ｅ／Ｐ、Ｆ２６０Ｗ、Ｋ／Ｎ／Ｒ２６４Ｈ／Ｑ／ＳおよびＱ２７４Ａ；
    （ｉｖ）Ａ１Ｑ、Ｔ３Ｑ／Ｖ、Ｐ９Ｅ、Ｌ１０Ｍ、Ｋ１５Ｉ、Ｋ２２Ｙ、Ａ２４Ｎ／Ｑ、Ｖ２６Ｑ、Ｖ２８Ａ、Ａ２９Ｓ、Ｖ３０Ｔ、Ｌ３１Ｉ、Ｉ３５Ａ、Ａ３７Ｔ、Ｐ４０Ｅ、Ｖ４５Ｉ／Ｑ／Ｒ、Ａ４８Ｉ／Ｔ／Ｖ、Ａ５２Ｒ、Ａ６８Ｓ、Ｖ７１Ａ、Ｎ７６Ｋ、Ｔ７７Ｄ／Ｅ／Ｈ／Ｎ／Ｓ、Ｔ７８Ｉ、Ｓ８６Ｈ／Ｎ／Ｒ、Ｖ８７Ｓ／Ｔ、Ｌ９５Ａ／Ｆ／Ｑ、Ｎ９６Ｓ、Ｓ９８Ｒ、Ｇ９９Ａ／Ｅ／Ｑ／Ｓ、Ｓ１００Ｎ、Ｇ１０１Ａ、Ｓ１０２Ｄ／Ｔ、Ｇ１０５Ｎ、Ｓ１０８Ｈ／Ｋ、Ｅ１１１Ｑ、Ｔ１１４Ｎ、Ｔ１１５Ｆ、Ｇ１１７Ｓ、Ｄ１１９Ｑ、Ｍ１２３Ｉ、Ｌ１２５Ｎ、Ｇ１２６Ｑ、Ｇ１２７Ｅ／Ｆ／Ｑ／Ｓ／Ｔ／Ｖ、Ａ１２８Ｐ／Ｒ／Ｓ、Ｓ１２９Ｈ／Ｒ、Ｇ１３０Ｓ、Ｑ１３６Ｎ、Ａ１４３Ｑ／Ｖ、Ｖ１４６Ａ／Ｓ、Ｖ１４７Ｌ、Ａ１５１Ｇ、Ｓ１５５Ｅ／Ｇ／Ｎ、Ｓ１５８Ｄ／Ｎ／Ｑ、Ｎ１６０Ｄ／Ｋ、Ｔ１６１Ｄ／Ｑ、Ｇ１６５Ａ／Ｅ／Ｑ／Ｓ、Ｎ１８４Ｅ／Ｑ、Ｓ１８７Ｅ／Ｐ、Ａ１９３Ｄ／Ｑ、Ａ２０２Ｖ、Ｇ２０３Ｅ／Ｎ／Ｑ、Ｖ２０４Ｉ、Ｔ２１０Ｉ／Ｐ、Ｎ２１１Ｓ、Ｌ２１６Ｑ、Ｎ２１７Ｓ、Ｌ２３４Ｉ／Ｗ、Ｐ２３８Ｑ／Ｒ、Ｎ２３９Ｋ／Ｓ／Ｔ、Ａ２４２Ｇ／Ｎ、Ｓ２４３Ｉ、Ｓ２５０Ｇ、Ｙ２５５Ｒ、Ｓ２５８Ｄ／Ｐ、Ｓ２５９Ｅ／Ｐ、Ｆ２６０Ｗ、Ｋ２６４Ｈ／Ｑ／ＳおよびＱ２７４Ａ；
    （ｖ）Ａ／Ｇ１Ｑ、Ｔ３Ｖ、Ｐ／Ｓ９Ｅ、Ｌ／Ｑ１０Ｍ、Ａ２４Ｑ、Ｖ２６Ｑ、Ａ／Ｇ２９Ｓ、Ｉ／Ｖ３０Ｔ、Ｉ／Ｌ３１Ｉ、Ｉ３５Ａ、Ａ／Ｓ３７Ｔ、Ｐ／Ｓ／Ｔ４０Ｅ、Ｓ／Ｖ４５Ｉ／Ｑ／Ｒ、Ａ４８Ｔ／Ｖ、Ａ／Ｓ５２Ｒ、Ａ６８Ｓ、Ｖ７１Ａ、Ｓ／Ｔ７７Ｅ／Ｎ、Ｔ７８Ｉ、Ｎ／Ｓ８６Ｈ／Ｒ、Ｖ８７Ｓ、Ｌ９５Ａ／Ｆ、Ｎ９６Ｓ、Ｓ９８Ｒ、Ｇ９９Ａ／Ｅ／Ｑ／Ｓ、Ｓ１００Ｎ、Ｇ１０１Ａ、Ｓ／Ｔ１０２Ｄ／Ｔ、Ａ／Ｇ１０５Ｎ、Ｓ１０８Ｈ、Ｅ１１１Ｑ、Ａ／Ｑ／Ｓ／Ｔ１１５Ｆ、Ｇ／Ｎ１１７Ｓ、Ｄ１１９Ｑ、Ｍ１２３Ｉ、Ｇ１２７Ｅ／Ｑ／Ｓ／Ｔ／Ｖ、Ａ／Ｐ／Ｓ１２８Ｐ／Ｒ、Ｓ１２９Ｈ／Ｒ、Ｇ／Ｖ１３０Ｓ、Ｑ１３６Ｎ、Ａ／Ｓ１４３Ｑ／Ｖ、Ａ／Ｉ／Ｖ１４６Ａ、Ｖ１４７Ｌ、Ａ／Ｓ１５１Ｇ、Ｓ１５５Ｇ／Ｎ、Ｓ１５８Ｄ／Ｎ／Ｑ、Ｎ／Ｓ／Ｙ１６０Ｄ／Ｋ、Ａ／Ｓ／Ｑ／Ｔ１６１Ｄ／Ｑ、Ｇ１６５Ａ／Ｅ／Ｑ、Ｎ１８４Ｅ／Ｑ、Ｓ１８７Ｅ／Ｐ、Ａ／Ｐ／Ｓ１９３Ｑ、Ａ／Ｓ２０２Ｖ、Ａ／Ｇ／Ｓ２０３Ｅ／Ｎ／Ｑ、Ｖ２０４Ｉ、Ｓ／Ｔ２１０Ｉ／Ｐ、Ｎ２１１Ｓ、Ｌ２１６Ｑ、Ｎ２１７Ｓ、Ｌ２３４Ｗ、Ｐ２３８Ｑ、Ａ／Ｎ／Ｔ２３９Ｓ、Ａ２４２Ｇ／Ｎ、Ｓ２４３Ｉ、Ｓ２５０Ｇ、Ｄ／Ｓ２５８Ｄ／Ｐ、Ｓ２５９Ｅ／Ｐ、Ｆ２６０Ｗ、Ｋ／Ｎ／Ｒ２６４Ｈ／Ｑ／ＳおよびＱ２７４Ａ；
    （ｖｉ）Ａ１Ｑ、Ｔ３Ｖ、Ｐ９Ｅ、Ｌ１０Ｍ、Ａ２４Ｑ、Ｖ２６Ｑ、Ａ２９Ｓ、Ｖ３０Ｔ、Ｌ３１Ｉ、Ｉ３５Ａ、Ａ３７Ｔ、Ｐ４０Ｅ、Ｖ４５Ｉ／Ｑ／Ｒ、Ａ４８Ｔ／Ｖ、Ａ５２Ｒ、Ａ６８Ｓ、Ｖ７１Ａ、Ｔ７７Ｅ／Ｎ、Ｔ７８Ｉ、Ｓ８６Ｈ／Ｒ、Ｖ８７Ｓ、Ｌ９５Ａ／Ｆ、Ｎ９６Ｓ、Ｓ９８Ｒ、Ｇ９９Ａ／Ｅ／Ｑ／Ｓ、Ｓ１００Ｎ、Ｇ１０１Ａ、Ｓ１０２Ｄ／Ｔ、Ｇ１０５Ｎ、Ｓ１０８Ｈ、Ｅ１１１Ｑ、Ｔ１１５Ｆ、Ｇ１１７Ｓ、Ｄ１１９Ｑ、Ｍ１２３Ｉ、Ｇ１２７Ｅ／Ｑ／Ｓ／Ｔ／Ｖ、Ａ１２８Ｐ／Ｒ、Ｓ１２９Ｈ／Ｒ、Ｇ１３０Ｓ、Ｑ１３６Ｎ、Ａ１４３Ｑ／Ｖ、Ｖ１４６Ａ、Ｖ１４７Ｌ、Ａ１５１Ｇ、Ｓ１５５Ｇ／Ｎ、Ｓ１５８Ｄ／Ｎ／Ｑ、Ｎ１６０Ｄ／Ｋ、Ｔ１６１Ｄ／Ｑ、Ｇ１６５Ａ／Ｅ／Ｑ、Ｎ１８４Ｅ／Ｑ、Ｓ１８７Ｅ／Ｐ、Ａ１９３Ｑ、Ａ２０２Ｖ、Ｇ２０３Ｅ／Ｎ／Ｑ、Ｖ２０４Ｉ、Ｔ２１０Ｉ／Ｐ、Ｎ２１１Ｓ、Ｌ２１６Ｑ、Ｎ２１７Ｓ、Ｌ２３４Ｗ、Ｐ２３８Ｑ、Ｎ２３９Ｓ、Ａ２４２Ｇ／Ｎ、Ｓ２４３Ｉ、Ｓ２５０Ｇ、Ｓ２５８Ｄ／Ｐ、Ｓ２５９Ｅ／Ｐ、Ｆ２６０Ｗ、Ｋ２６４Ｈ／Ｑ／ＳおよびＱ２７４Ａ；
    （ｖｉｉ）Ｔ３Ｖ、Ｐ／Ｓ９Ｅ、Ｌ／Ｑ１０Ｍ、Ｉ３５Ａ、Ａ６８Ｓ、Ｓ／Ｔ７７Ｎ、Ｔ７８Ｉ、Ｎ／Ｓ８６Ｈ、Ｖ８７Ｓ、Ｇ９９Ｑ／Ｓ、Ｇ１０１Ａ、Ａ／Ｑ／Ｓ／Ｔ１１５Ｆ、Ｍ１２３Ｉ、Ｇ１２７Ｓ／Ｔ、Ａ／Ｐ／Ｓ１２８Ｐ／Ｒ、Ｇ１６５Ｅ／Ｑ、Ｎ１８４Ｑ、Ｓ１８７Ｅ、Ａ／Ｓ２０２Ｖ、Ａ／Ｇ／Ｓ２０３Ｅ、Ｓ／Ｔ２１０Ｐ、Ｎ２１７Ｓ、Ａ２４２Ｇ、Ｓ２５０Ｇ、Ｄ／Ｓ２５８Ｄ／ＰおよびＫ／Ｎ／Ｒ２６４Ｈ；
    （ｖｉｉｉ）Ｔ３Ｖ、Ｐ９Ｅ、Ｌ１０Ｍ、Ｉ３５Ａ、Ａ６８Ｓ、Ｔ７７Ｎ、Ｔ７８Ｉ、Ｓ８６Ｈ、Ｖ８７Ｓ、Ｇ９９Ｑ／Ｓ、Ｇ１０１Ａ、Ｔ１１５Ｆ、Ｍ１２３Ｉ、Ｇ１２７Ｓ／Ｔ、Ａ１２８Ｐ／Ｒ、Ｇ１６５Ｅ／Ｑ、Ｎ１８４Ｑ、Ｓ１８７Ｅ、Ａ２０２Ｖ、Ｇ２０３Ｅ、Ｔ２１０Ｐ、Ｎ２１７Ｓ、Ａ２４２Ｇ、Ｓ２５０Ｇ、Ｓ２５８Ｄ／ＰおよびＫ２６４Ｈ；
    （ｉｘ）Ｔ３Ｖ、Ａ６８Ｓ、Ｓ／Ｔ７７Ｎ、Ｔ７８Ｉ、Ｍ１２３Ｉ、Ｇ１２７Ｓ、Ａ／Ｓ１２８Ｐ、Ｇ１６５Ｑ、Ｎ１８４Ｑ、Ａ／Ｓ２０２Ｖ、Ｓ／Ｔ２１０Ｐ、Ｎ２１７ＳおよびＤ／Ｓ２５８Ｄ／Ｐ；または
    （ｘ）Ｔ３Ｖ、Ａ６８Ｓ、Ｔ７７Ｎ、Ｔ７８Ｉ、Ｍ１２３Ｉ、Ｇ１２７Ｓ、Ａ１２８Ｐ、Ｇ１６５Ｑ、Ｎ１８４Ｑ、Ａ２０２Ｖ、Ｔ２１０Ｐ、Ｎ２１７ＳおよびＳ２５８Ｄ／Ｐ
    から選択される２つ、３つまたは４つ以上のアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を含む、請求項１または２に記載のスブチリシン変異体。
  4. （ｉ）配列番号２に対応する位置の前記変異は、挿入または欠失ではない；
    （ｉｉ）前記変異体のアミノ酸配列が、３７、１８７、１９３および２５８位から選択される、１つ以上の対応する配列番号２の位置に変異を含む場合、前記変異はプロリンではない；
    （ｉｉｉ）前記変異体のアミノ酸配列が、２６、３８、２３４および２５０位から選択される、２つ以上の対応する配列番号２の位置に変異を含む場合、前記変異は２６Ｒ、３８Ｓ、２３４Ｒまたは２５０Ｅ／Ｎではない；
    （ｉｖ）前記変異体のアミノ酸配列が１２８位に変異を含む場合、配列番号２に対応する位置の前記変異は１３０位または１９３位ではない；および／または
    （ｖ）前記変異体は、国際公開第２０１６０７４９２５号パンフレットの配列番号５または特開第２０１３００７１４号公報の配列番号１１０として記載のアミノ酸配列からなるものではない
    という条件が付される、請求項１に記載のスブチリシン変異体。
  5. （ｉ）前記変異体のアミノ酸配列が、３７、１８７、１９３および２５８位の１つ以上で置換を含む場合、前記置換はプロリンではない；
    （ｉｉ）前記変異体のアミノ酸配列が、２６、３８、２３４および２５０位の２つ以上で置換を含む場合、前記置換は２６Ｒ、３８Ｓ、２３４Ｒまたは２５０Ｅ／Ｎではない；
    （ｉｉｉ）前記変異体のアミノ酸配列が１２８位に置換を含む場合、前記置換は１３０位または１９３位ではない；および／または
    （ｉｖ）前記変異体は、国際公開第２０１６０７４９２５号パンフレットの配列番号５または特開第２０１３００７１４号公報の配列番号１１０として記載のアミノ酸配列からなるものではない
    という条件が付される、請求項１〜４のいずれか一項に記載のスブチリシン変異体。
  6. 前記変異体は、
    （ｉ）Ｔ７７Ｎ−Ｇ１６５Ｑ、Ｔ７７Ｎ−Ｎ２１７Ｓ、Ｇ１６５Ｑ−Ｎ２１７Ｓ、Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ、Ｎ１８４Ｑ−Ｎ２１７Ｓ、Ａ６８Ｓ−Ｇ１６５Ｑ、Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ、Ｔ７７Ｎ−Ａ１２８Ｐ、Ｔ７７Ｎ−Ｎ１８４Ｑ、Ａ６８Ｓ−Ｎ２１７Ｓ、Ａ１２８Ｐ−Ｎ２１７Ｓ、Ａ１２８Ｐ−Ｇ１６５Ｑ、Ａ６８Ｓ−Ａ１２８Ｐ、Ａ６８Ｓ−Ｎ１８４Ｑ、Ａ１２８Ｐ−Ｎ１８４Ｑ、Ｔ３Ｖ−Ｎ２１７Ｓ、Ａ２０２Ｖ−Ｎ２１７Ｓ、Ｔ３Ｖ−Ｔ７７Ｎ、Ｔ３Ｖ−Ｎ１８４Ｑ、Ｎ１８４Ｑ−Ａ２０２Ｖ、Ｇ１６５Ｑ−Ａ２０２Ｖ、Ｍ１２３Ｉ−Ｇ１６５Ｑ、Ｔ３Ｖ−Ｇ１６５Ｑ、Ｔ３Ｖ−Ａ１２８Ｐ、Ｔ３Ｖ−Ａ６８Ｓ、Ｔ７７Ｎ−Ａ２０２Ｖ、Ｍ１２３Ｉ−Ｎ２１７Ｓ、Ａ６８Ｓ−Ａ２０２Ｖ、Ｍ１２３Ｉ−Ｎ１８４Ｑ、Ａ１２８Ｐ−Ａ２０２Ｖ、Ｔ７７Ｎ−Ｍ１２３Ｉ、Ｔ３Ｖ−Ａ２０２Ｖ、Ｎ２１７Ｓ−Ｓ２５８Ｐ、Ａ６８Ｓ−Ｍ１２３Ｉ、Ｎ１８４Ｑ−Ｓ２５８Ｐ、Ｇ１６５Ｑ−Ｓ２５８Ｐ、Ｍ１２３Ｉ−Ａ１２８Ｐ、Ｔ７７Ｎ−Ｓ２５８Ｐ、Ｔ３Ｖ−Ｍ１２３Ｉ、Ａ１２８Ｐ−Ｓ２５８Ｐ、Ａ２０２Ｖ−Ｓ２５８Ｐ、Ａ６８Ｓ−Ｓ２５８Ｐ、Ｔ３Ｖ−Ｓ２５８Ｐ、Ｍ１２３Ｉ−Ａ２０２Ｖ、Ｍ１２３Ｉ−Ｓ２５８Ｐ、Ａ６８Ｓ−Ｇ１２７Ｓ、Ｇ１２７Ｓ−Ａ１２８Ｐ、Ｔ７７Ｎ−Ｇ１２７Ｓ、Ｇ１２７Ｓ−Ａ２０２Ｖ、Ｇ１２７Ｓ−Ｎ１８４Ｑ、Ｇ１２７Ｓ−Ｎ２１７Ｓ、Ｇ１２７Ｓ−Ｇ１６５Ｑ、Ｔ３Ｖ−Ｇ１２７Ｓ、Ｇ１２７Ｓ−Ｓ２５８Ｐ、Ｍ１２３Ｉ−Ｇ１２７Ｓ、Ｔ７７Ｎ−Ｔ２１０Ｐ、Ｇ１６５Ｑ−Ｔ２１０Ｐ、Ｔ２１０Ｐ−Ｎ２１７Ｓ、Ａ１２８Ｐ−Ｔ２１０Ｐ、Ａ６８Ｓ−Ｔ２１０Ｐ、Ｎ１８４Ｑ−Ｔ２１０Ｐ、Ｔ２１０Ｐ−Ｓ２５８Ｐ、Ａ２０２Ｖ−Ｔ２１０Ｐ、Ｍ１２３Ｉ−Ｔ２１０Ｐ、Ｔ３Ｖ−Ｔ２１０Ｐ、Ｇ１２７Ｓ−Ｔ２１０Ｐ、Ｇ１２７Ｔ−Ｎ１８４Ｑ、Ｇ１２７Ｔ−Ｎ２１７Ｓ、Ｖ８７Ｓ−Ｇ１６５Ｑ、Ｍ１２３Ｉ−Ｑ１３６Ｒ、Ａ６８Ｓ−Ｇ１２７Ｔ、Ｇ１２７Ｔ−Ａ１２８Ｐ、Ｔ７７Ｎ−Ｖ８７Ｓ、Ｇ１２７Ｔ−Ｇ１６５Ｑ、Ｔ７７Ｎ−Ｇ１２７Ｔ、Ｔ７８Ｉ−Ａ２０２Ｖ、Ａ６８Ｓ−Ｓ２５８Ｄ、Ｇ１６５Ｑ−Ｓ２５８Ｄ、Ｔ７７Ｎ−Ｓ２５８Ｄ、Ｔ７７Ｎ−Ｔ７８Ｉ、Ｔ７８Ｉ−Ｇ１６５Ｑ、Ｎ１８４Ｑ−Ｓ２５８Ｄ、Ｎ２１７Ｓ−Ｓ２５８Ｄ、Ｐ９Ｅ−Ｍ１２３Ｉ、Ａ１２８Ｐ−Ａ２４２Ｇ、Ａ２０２Ｖ−Ｓ２５８Ｄ、Ａ６８Ｓ−Ｔ７８Ｉ、Ｇ１６５Ｑ−Ａ２４２Ｇ、Ｔ７７Ｎ−Ａ２４２Ｇ、Ｔ７８Ｉ−Ａ１２８Ｐ、Ｔ７８Ｉ−Ｇ１２７Ｓ、Ｐ９Ｅ−Ｇ１６５Ｑ、Ｑ１３６Ｒ−Ｇ１６５Ｑ、Ｔ７８Ｉ−Ｎ１８４Ｑ、Ｖ８７Ｓ−Ａ１２８Ｐ、Ｖ８７Ｓ−Ｎ２１７Ｓ、Ａ６８Ｓ−Ｖ８７Ｓ、Ｇ１２７Ｔ−Ａ２０２Ｖ、Ｉ３５Ａ−Ｔ７７Ｎ、Ｔ３Ｖ−Ｔ７８Ｉ、Ｔ７８Ｉ−Ｎ２１７Ｓ、Ａ６８Ｓ−Ａ２４２Ｇ、Ａ６８Ｓ−Ｇ９９Ｓ、Ｇ９９Ｓ−Ａ１２８Ｐ、Ｇ９９Ｓ−Ｇ１６５Ｑ、Ｉ３５Ａ−Ｇ１６５Ｑ、Ｌ１０Ｍ−Ａ２０２Ｖ、Ｔ３Ｖ−Ｇ１２７Ｔ、Ｔ７７Ｎ−Ｇ９９Ｓ、Ｔ７８Ｉ−Ｓ２５８Ｐ、Ｖ４５Ｒ−Ｍ１２３Ｉ、Ｖ８７Ｓ−Ｍ１２３Ｉ、Ｍ１２３Ｉ−Ｎ２３９Ｓ、Ｐ９Ｅ−Ｎ１８４Ｑ、Ｓ１５５Ｇ−Ｇ１６５Ｑ、Ｔ７８Ｉ−Ｍ１２３Ｉ、Ｖ４５Ｒ−Ｑ１３６Ｒ、Ｖ８７Ｓ−Ａ２０２Ｖ、Ａ１２８Ｐ−Ｓ２５８Ｄ、Ｉ３５Ａ−Ａ２０２Ｖ、Ｍ１２３Ｉ−Ｇ１２７Ｔ、Ｍ１２３Ｉ−Ｓ２５８Ｄ、Ｎ１８４Ｑ−Ｎ２３９Ｓ、Ｐ９Ｅ−Ｎ２１７Ｓ、Ｑ１３６Ｒ−Ｓ２５８Ｅ、Ｓ８６Ｈ−Ｓ２５８Ｐ、Ｔ３Ｖ−Ａ２４２Ｇ、Ｔ３Ｖ−Ｓ２５８Ｄ、Ｇ９９Ｓ−Ｎ１８４Ｑ、Ｇ９９Ｓ−Ｎ２１７Ｓ、Ｉ３５Ａ−Ｖ８７Ｓ、Ｎ２１７Ｓ−Ａ２４２Ｇ、Ｐ９Ｅ−Ｑ１３６Ｒ、Ｇ１２７Ｔ−Ｓ２５８Ｐ、Ｉ３５Ａ−Ａ１２８Ｐ、Ｉ３５Ａ−Ａ６８Ｓ、Ｉ３５Ａ−Ｎ２１７Ｓ、Ｌ１０Ｍ−Ｍ１２３Ｉ、Ｐ９Ｅ−Ｓ２５８Ｐ、Ｐ９Ｅ−Ｔ２１０Ｐ、Ｐ９Ｅ−Ｔ７７Ｎ、Ｓ８６Ｈ−Ａ２０２Ｖ、Ｓ８６Ｈ−Ｇ１６５Ｑ、Ｓ８６Ｈ−Ｎ１８４Ｑ、Ｔ７７Ｎ−Ｓ１５５Ｇ、Ｔ７７Ｎ−Ｖ１４７Ｌ、Ｔ７８Ｉ−Ｔ２１０Ｐ、Ｖ８７Ｓ−Ｓ１５５Ｇ、Ａ２０２Ｖ−Ａ２４２Ｇ、Ａ２４２Ｇ−Ｓ２５８Ｐ、Ａ６８Ｓ−Ｇ１６５Ｅ、Ｇ１２７Ｓ−Ａ２４２Ｇ、Ｇ１６５Ｅ−Ｎ１８４Ｑ、Ｇ１６５Ｅ−Ｎ２１７Ｓ、Ｍ１２３Ｉ−Ｓ２５８Ｅ、Ｎ１８４Ｑ−Ａ２４２Ｇ、Ｓ８６Ｈ−Ｔ１１５Ｆ、Ｔ３Ｖ−Ｇ９９Ｓ、Ｖ１４７Ｌ−Ｇ１６５Ｑ、Ａ１２８Ｒ−Ｇ１６５Ｑ、Ａ１２８Ｒ−Ｓ２５８Ｄ、Ａ６８Ｓ−Ａ１２８Ｒ、Ａ６８Ｓ−Ｖ１４７Ｌ、Ｇ１２７Ｓ−Ｓ２５８Ｄ、Ｇ１６５Ｅ−Ａ２０２Ｖ、Ｇ１６５Ｑ−Ｓ２５８Ｅ、Ｇ１６５Ｓ−Ｔ２１０Ｐ、Ｇ２０３Ｅ−Ｔ２１０Ｐ、Ｇ９９Ｓ−Ｇ１２７Ｓ、Ｇ９９Ｓ−Ｍ１２３Ｉ、Ｇ９９Ｓ−Ｔ２１０Ｐ、Ｌ１０Ｍ−Ａ１２８Ｐ、Ｌ１０Ｍ−Ａ６８Ｓ、Ｌ１０Ｍ−Ｎ１８４Ｑ、Ｌ１０Ｍ−Ｎ２１７Ｓ、Ｌ１０Ｍ−Ｓ２５８Ｐ、Ｌ１０Ｍ−Ｔ７７Ｎ、Ｍ１２３Ｉ−Ａ２４２Ｇ、Ｍ１２３Ｉ−Ｇ１６５Ｅ、Ｍ１２３Ｉ−Ｓ１８７Ｐ、Ｎ２３９Ｓ−Ｓ２５８Ｐ、Ｐ９Ｅ−Ａ１２８Ｐ、Ｐ９Ｅ−Ａ２０２Ｖ、Ｐ９Ｅ−Ａ６８Ｓ、Ｐ９Ｅ−Ｖ４５Ｒ、Ｑ１３６Ｒ−Ｎ１８４Ｑ、Ｑ１３６Ｒ−Ｎ２３９Ｓ、Ｓ８６Ｈ−Ｎ２１７Ｓ、Ｔ１１５Ｆ−Ｓ２５８Ｐ、Ｔ２１０Ｐ−Ａ２４２Ｇ、Ｔ３Ｖ−Ｇ１６５Ｅ、Ｔ３Ｖ−Ｌ１０Ｍ、Ｔ３Ｖ−Ｐ９Ｅ、Ｔ７７Ｎ−Ａ１２８Ｒ、Ｔ７７Ｎ−Ｇ１６５Ｅ、Ｔ７８Ｉ−Ａ２４２Ｇ、Ｖ４５Ｒ−Ｇ１６５Ｑ、Ｖ８７Ｔ−Ｍ１２３Ｉ、Ｖ８７Ｔ−Ｎ１８４Ｑ、Ｖ８７Ｔ−Ｎ２３９Ｓ、Ｖ８７Ｔ−Ｑ１３６Ｒ、Ａ６８Ｓ−Ｇ１０１Ａ、Ａ６８Ｓ−Ｖ７１Ａ、Ｇ１０１Ａ−Ａ１２８Ｐ、Ｇ１０１Ａ−Ｇ１６５Ｑ、Ｇ１０１Ａ−Ｓ２５８Ｐ、Ｇ１６５Ａ−Ｎ１８４Ｑ、Ｇ１６５Ｅ−Ｓ２５８Ｐ、Ｇ９９Ｓ−Ｓ２５８Ｐ、Ｉ３５Ａ−Ｍ１２３Ｉ、Ｋ１５Ｉ−Ｇ１６５Ｓ、Ｋ１５Ｉ−Ｔ２１０Ｐ、Ｌ１０Ｍ−Ｇ１２７Ｓ、Ｌ１０Ｍ−Ｇ１６５Ｑ、Ｑ１３６Ｒ−Ｓ１８７Ｐ、Ｓ１８７Ｅ−Ａ２０２Ｖ、Ｓ１８７Ｐ−Ｓ２５８Ｐ、Ｓ２５０Ｇ−Ｓ２５８Ｐ、Ｔ１１５Ｆ−Ａ２０２Ｖ、Ｔ１１５Ｆ−Ｇ１６５Ｑ、Ｔ３Ｖ−Ｇ１０１Ａ、Ｔ３Ｖ−Ｉ３５Ａ、Ｔ３Ｖ−Ｖ８７Ｓ、Ｔ７７Ｎ−Ｇ１０１Ａ、Ｔ７７Ｎ−Ｇ２０３Ｅ、Ｔ７８Ｉ−Ｓ２５８Ｄ、Ｖ７１Ａ−Ｇ１６５Ｑ、Ｖ７１Ａ−Ｔ７７Ｎ、Ｖ８７Ｓ−Ｓ２５８Ｐ、Ｖ８７Ｓ−Ｖ１４７Ｌ、Ａ１２８Ｐ−Ｇ１６５Ｅ、Ａ１２８Ｐ−Ｓ１５５Ｇ、Ａ１２８Ｐ−Ｖ１４７Ｌ、Ａ１２８Ｒ−Ａ２０２Ｖ、Ａ１２８Ｒ−Ｎ１８４Ｑ、Ａ１２８Ｒ−Ｎ２１７Ｓ、Ａ１Ｑ−Ｓ８６Ｈ、Ａ６８Ｓ−Ｇ９９Ｑ、Ａ６８Ｓ−Ｓ１５５Ｇ、Ｇ１０１Ａ−Ａ２０２Ｖ、Ｇ１０１Ａ−Ｇ１２７Ｓ、Ｇ１０１Ａ−Ｎ１８４Ｑ、Ｇ１０１Ａ−Ｎ２１７Ｓ、Ｇ１６５Ｑ−Ｇ２０３Ｅ、Ｇ１６５Ｑ−Ｎ２３９Ｓ、Ｇ１６５Ｓ−Ｎ２３９Ｓ、Ｇ９９Ｑ−Ａ１２８Ｐ、Ｇ９９Ｑ−Ｇ１６５Ｑ、Ｇ９９Ｑ−Ｎ１８４Ｑ、Ｇ９９Ｑ−Ｎ２１７Ｓ、Ｇ９９Ｓ−Ａ２４２Ｇ、Ｉ３５Ａ−Ｎ１８４Ｑ、Ｉ３５Ａ−Ｔ７８Ｉ、Ｉ３５Ａ−Ｖ１４７Ｌ、Ｌ１０Ｍ−Ｔ２１０Ｐ、Ｌ１０Ｍ−Ｔ７８Ｉ、Ｍ１２３Ｉ−Ｇ１６５Ｓ、Ｎ１８４Ｑ−Ｇ２０３Ｅ、Ｎ１８４Ｑ−Ｓ１８７Ｐ、Ｎ４３Ａ−Ｍ１２３Ｉ、Ｐ９Ｅ−Ｇ１２７Ｓ、Ｐ９Ｅ−Ｓ２５８Ｅ、Ｑ１３６Ｒ−Ｓ２５８Ｐ、Ｔ１１５Ｆ−Ｎ２１７Ｓ、Ｔ３Ｖ−Ｓ８６Ｈ、Ｔ７７Ｈ−Ｍ１２３Ｉ、Ｔ７７Ｈ−Ｎ１８４Ｑ、Ｔ７７Ｈ−Ｎ２３９Ｓ、Ｔ７７Ｈ−Ｑ１３６Ｒ、Ｔ７７Ｈ−Ｖ８７Ｔ、Ｔ７７Ｎ−Ｇ９９Ｑ、Ｔ７７Ｎ−Ｓ２５０Ｇ、Ｔ７８Ｉ−Ｇ９９Ｓ、Ｔ７８Ｉ−Ｖ８７Ｓ、Ｖ１４６Ｓ−Ｇ１６５Ｓ、Ｖ１４６Ｓ−Ｎ２３９Ｓ、Ｖ１４６Ｓ−Ｔ２１０Ｐ、Ｖ４５Ｒ−Ｓ２５８Ｅ、Ｖ８７Ｓ−Ａ２４２Ｇ、Ｖ８７Ｓ−Ｎ１８４Ｑ、Ａ１２８Ｓ−Ｔ２１０Ｐ、Ａ１４３Ｖ−Ａ２０２Ｖ、Ａ１４３Ｖ−Ｇ１６５Ｑ、Ａ１４３Ｖ−Ｓ２５８Ｐ、Ａ１Ｑ−Ｎ１８４Ｑ、Ａ１Ｑ−Ｓ２５８Ｐ、Ａ６８Ｓ−Ｇ２０３Ｅ、Ａ６８Ｓ−Ｓ１８７Ｅ、Ａ６８Ｓ−Ｔ１１４Ｎ、Ｇ１０１Ａ−Ｍ１２３Ｉ、Ｇ１０１Ａ−Ｔ２１０Ｐ、Ｇ１６５Ａ−Ｎ２１７Ｓ、Ｇ１６５Ｑ−Ｓ１８７Ｐ、Ｇ９９Ｑ−Ａ２０２Ｖ、Ｇ９９Ｓ−Ａ２０２Ｖ、Ｉ３５Ａ−Ａ２４２Ｇ、Ｉ３５Ａ−Ｓ２５８Ｐ、Ｌ１０Ｍ−Ｉ３５Ａ、Ｌ１０Ｍ−Ｖ８７Ｓ、Ｍ１２３Ｉ−Ａ１２８Ｒ、Ｍ１２３Ｉ−Ｖ１４６Ｓ、Ｎ１８４Ｑ−Ｓ１８７Ｅ、Ｎ２１７Ｓ−Ｌ２３４Ｗ、Ｎ２３９Ｓ−Ｓ２５０Ｇ、Ｎ４３Ａ−Ｑ１３６Ｒ、Ｎ４３Ａ−Ｖ４５Ｒ、Ｐ９Ｅ−Ｎ２３９Ｓ、Ｐ９Ｅ−Ｖ８７Ｔ、Ｓ１５５Ｇ−Ｎ２１７Ｓ、Ｓ１８７Ｅ−Ｎ２１７Ｓ、Ｓ８６Ｈ−Ａ１４３Ｖ、Ｓ８６Ｈ−Ｑ２７４Ａ、Ｓ８６Ｈ−Ｓ２５０Ｇ、Ｔ１１４Ｎ−Ａ１２８Ｐ、Ｔ１１４Ｎ−Ｇ１６５Ｑ、Ｔ１１４Ｎ−Ｎ１８４Ｑ、Ｔ１１４Ｎ−Ｎ２１７Ｓ、Ｔ１１５Ｆ−Ａ１４３Ｖ、Ｔ１１５Ｆ−Ｎ１８４Ｑ、Ｔ２１０Ｐ−Ｎ２３９Ｓ、Ｔ２１０Ｐ−Ｓ２５０Ｇ、Ｔ３Ｖ−Ａ１２８Ｒ、Ｔ３Ｖ−Ｇ９９Ｑ、Ｔ７７Ｈ−Ｇ１６５Ｑ、Ｔ７７Ｎ−Ｓ１８７Ｅ、Ｔ７７Ｎ−Ｔ１１４Ｎ、Ｖ１４７Ｌ−Ｎ２１７Ｓ、Ｖ４５Ｒ−Ｎ１８４Ｑ、Ｖ７１Ａ−Ｎ１８４Ｑ、Ｖ７１Ａ−Ｎ２１７Ｓ、Ｖ７１Ａ−Ｔ２１０Ｐ、Ｔ７７Ｎ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ２１７Ｓ、Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ｇ１６５Ｑ、Ｔ７７Ｎ−Ｎ１８４Ｑ−Ｎ２１７Ｓ、Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ｎ２１７Ｓ、Ｔ７７Ｎ−Ａ１２８Ｐ−Ｇ１６５Ｑ、Ｔ７７Ｎ−Ａ１２８Ｐ−Ｎ２１７Ｓ、Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ａ１２８Ｐ、Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ｎ２１７Ｓ、Ｔ７７Ｎ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ、Ａ６８Ｓ−Ａ１２８Ｐ−Ｇ１６５Ｑ、Ａ６８Ｓ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ２１７Ｓ、Ａ１２８Ｐ−Ｎ１８４Ｑ−Ｎ２１７Ｓ、Ａ１２８Ｐ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ２１７Ｓ、Ａ６８Ｓ−Ａ１２８Ｐ−Ｎ２１７Ｓ、Ａ６８Ｓ−Ｎ１８４Ｑ−Ｎ２１７Ｓ、Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ｎ１８４Ｑ、Ｔ７７Ｎ−Ａ１２８Ｐ−Ｎ１８４Ｑ、Ａ６８Ｓ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ、Ａ１２８Ｐ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ、Ａ６８Ｓ−Ａ１２８Ｐ−Ｎ１８４Ｑ、Ｔ３Ｖ−Ｎ１８４Ｑ−Ｎ２１７Ｓ、Ｔ３Ｖ−Ｔ７７Ｎ−Ｎ２１７Ｓ、Ｎ１８４Ｑ−Ａ２０２Ｖ−Ｎ２１７Ｓ、Ｔ３Ｖ−Ｔ７７Ｎ−Ｎ１８４Ｑ、Ｔ３Ｖ−Ａ１２８Ｐ−Ｎ２１７Ｓ、Ｔ３Ｖ−Ｔ７７Ｎ−Ａ１２８Ｐ、Ｇ１６５Ｑ−Ａ２０２Ｖ−Ｎ２１７Ｓ、Ｔ３Ｖ−Ａ１２８Ｐ−Ｎ１８４Ｑ、Ｔ７７Ｎ−Ａ２０２Ｖ−Ｎ２１７Ｓ、Ｔ３Ｖ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ２１７Ｓ、Ｔ３Ｖ−Ｔ７７Ｎ−Ｇ１６５Ｑ、Ｔ３Ｖ−Ａ６８Ｓ−Ｎ２１７Ｓ、Ｔ３Ｖ−Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ、Ａ６８Ｓ−Ａ２０２Ｖ−Ｎ２１７Ｓ、Ｔ３Ｖ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ、Ａ１２８Ｐ−Ａ２０２Ｖ−Ｎ２１７Ｓ、Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ａ２０２Ｖ、Ｔ７７Ｎ−Ｇ１６５Ｑ−Ａ２０２Ｖ、Ｔ７７Ｎ−Ｎ１８４Ｑ−Ａ２０２Ｖ、Ｔ３Ｖ−Ａ１２８Ｐ−Ｇ１６５Ｑ、Ｔ３Ｖ−Ａ６８Ｓ−Ａ１２８Ｐ、Ｔ３Ｖ−Ａ６８Ｓ−Ｎ１８４Ｑ、Ａ１２８Ｐ−Ｎ１８４Ｑ−Ａ２０２Ｖ、Ａ６８Ｓ−Ｎ１８４Ｑ−Ａ２０２Ｖ、Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ａ２０２Ｖ、Ｔ３Ｖ−Ａ６８Ｓ−Ｇ１６５Ｑ、Ｔ７７Ｎ−Ａ１２８Ｐ−Ａ２０２Ｖ、Ａ１２８Ｐ−Ｇ１６５Ｑ−Ａ２０２Ｖ、Ａ６８Ｓ−Ａ１２８Ｐ−Ａ２０２Ｖ、Ａ６８Ｓ−Ｇ１６５Ｑ−Ａ２０２Ｖ、Ｍ１２３Ｉ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ２１７Ｓ、Ｍ１２３Ｉ−Ｎ１８４Ｑ−Ｎ２１７Ｓ、Ｔ７７Ｎ−Ｍ１２３Ｉ−Ｇ１６５Ｑ、Ｔ７７Ｎ−Ｍ１２３Ｉ−Ｎ２１７Ｓ、Ｔ３Ｖ−Ａ２０２Ｖ−Ｎ２１７Ｓ、Ｍ１２３Ｉ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ、Ｔ７７Ｎ−Ｍ１２３Ｉ−Ｎ１８４Ｑ、Ｔ３Ｖ−Ｎ１８４Ｑ−Ａ２０２Ｖ、Ａ６８Ｓ−Ｍ１２３Ｉ−Ｎ２１７Ｓ、Ｔ３Ｖ−Ｔ７７Ｎ−Ａ２０２Ｖ、Ｔ３Ｖ−Ａ１２８Ｐ−Ａ２０２Ｖ、Ｔ３Ｖ−Ｇ１６５Ｑ−Ａ２０２Ｖ、Ｍ１２３Ｉ−Ａ１２８Ｐ−Ｎ２１７Ｓ、Ｔ３Ｖ−Ａ６８Ｓ−Ａ２０２Ｖ、Ａ６８Ｓ−Ｍ１２３Ｉ−Ｎ１８４Ｑ、Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ｍ１２３Ｉ、Ｍ１２３Ｉ−Ａ１２８Ｐ−Ｎ１８４Ｑ、Ｔ３Ｖ−Ｍ１２３Ｉ−Ｎ２１７Ｓ、Ｔ７７Ｎ−Ｍ１２３Ｉ−Ａ１２８Ｐ、Ａ６８Ｓ−Ｍ１２３Ｉ−Ｇ１６５Ｑ、Ｍ１２３Ｉ−Ａ１２８Ｐ−Ｇ１６５Ｑ、Ａ６８Ｓ−Ｍ１２３Ｉ−Ａ１２８Ｐ、Ｎ１８４Ｑ−Ｎ２１７Ｓ−Ｓ２５８Ｐ、Ｔ３Ｖ−Ｍ１２３Ｉ−Ｎ１８４Ｑ、Ｔ３Ｖ−Ｍ１２３Ｉ−Ｇ１６５Ｑ、Ｔ３Ｖ−Ｔ７７Ｎ−Ｍ１２３Ｉ、Ｔ７７Ｎ−Ｎ２１７Ｓ−Ｓ２５８Ｐ、Ｇ１６５Ｑ−Ｎ２１７Ｓ−Ｓ２５８Ｐ、Ｔ３Ｖ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    から選択される１つ以上のアミノ酸置換セットを含むアミノ酸配列を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載のスブチリシン変異体。
  7. 前記変異体は、Ｍ１２３Ｉ−Ｑ１３６Ｒ；Ｐ９Ｅ−Ｍ１２３Ｉ；Ｖ４５Ｒ−Ｍ１２３Ｉ；Ｇ１２７Ｔ−Ｇ１６５Ｓ−Ｔ２１０Ｅ；Ｍ１２３Ｉ−Ｇ１６５Ｓ−Ｎ２３９Ｓ；Ｍ１２３Ｉ−Ｑ１３６Ｒ−Ｇ１６５Ｑ；Ｍ１２３Ｉ−Ｑ１３６Ｒ−Ｓ２５８Ｅ；Ｍ１２３Ｉ−Ｖ１４６Ｓ−Ｔ２１０Ｅ；Ｐ９Ｅ−Ｖ４５Ｒ−Ｍ１２３Ｉ；Ｑ１３６Ｒ−Ｇ１６５Ｑ−Ｓ２５８Ｅ；Ｖ４５Ｒ−Ｍ１２３Ｉ−Ｑ１３６Ｒ；Ｇ１２７Ｔ−Ｖ１４６Ｓ−Ｇ１６５Ｓ−Ｎ２３９Ｓ；Ｌ１０Ｍ−Ｋ２７Ｒ−Ｓ９８Ｈ−Ｍ１２３Ｉ；Ｍ１２３Ｉ−Ｑ１３６Ｒ−Ｇ１６５Ｑ−Ｓ２５８Ｅ；Ｍ１２３Ｉ−Ｖ１４６Ｓ−Ｇ１６５Ｓ−Ｔ２１０Ｐ；Ｍ１２３Ｉ−Ｖ１４６Ｓ−Ｔ２１０Ｐ−Ｓ２５０Ｇ；Ｐ９Ｅ−Ｍ１２３Ｉ−Ｑ１３６Ｒ−Ｇ１６５Ｑ；Ｐ９Ｅ−Ｑ１３６Ｒ−Ｇ１６５Ｑ−Ｓ２５８Ｅ；Ｐ９Ｅ−Ｖ４５Ｒ−Ｍ１２３Ｉ−Ｑ１３６Ｒ；Ｖ４５Ｒ−Ｍ１２３Ｉ−Ｑ１３６Ｒ−Ｇ１６５Ｑ；Ｖ４５Ｒ−Ｍ１２３Ｉ−Ｑ１３６Ｒ−Ｓ２５８Ｅ；Ｖ４５Ｒ−Ｑ１３６Ｒ−Ｇ１６５Ｑ−Ｓ２５８Ｅ；Ｋ２７Ｒ−Ｎ４３Ａ−Ｓ９８Ｈ−Ｍ１２３Ｉ−Ｔ２１０Ｈ；Ｐ９Ｅ−Ｍ１２３Ｉ−Ｑ１３６Ｒ−Ｇ１６５Ｑ−Ｓ２５８Ｅ；Ｐ９Ｅ−Ｖ４５Ｒ−Ｍ１２３Ｉ−Ｑ１３６Ｒ−Ｇ１６５Ｑ；Ｐ９Ｅ−Ｖ４５Ｒ−Ｍ１２３Ｉ−Ｑ１３６Ｒ−Ｓ２５８Ｅ；Ｖ４５Ｒ−Ｍ１２３Ｉ−Ｑ１３６Ｒ−Ｇ１６５Ｑ−Ｓ２５８Ｅ；Ｙ１０３Ｉ−Ｇ１２７Ｔ−Ｖ１４６Ｓ−Ｇ１６５Ｓ−Ｎ２３９Ｓ；Ｔ７７Ｈ−Ｖ８７Ｔ−Ｍ１２３Ｉ−Ｑ１３６Ｒ−Ｎ１８４Ｑ−Ｎ２３９Ｓ；Ｖ２６Ｒ−Ｖ４５Ｒ−Ｓ９８Ｒ−Ｅ１１１Ｑ−Ｍ１２３Ｉ−Ｑ１３６Ｒ；Ｔ７７Ｈ−Ｖ８７Ｔ−Ｍ１２３Ｉ−Ｑ１３６Ｒ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ｎ２３９Ｓ；Ｔ７７Ｓ−Ｖ８７Ｓ−Ｍ１２３Ｉ−Ｑ１３６Ｒ−Ｇ１６５Ｑ−Ｓ１８７Ｐ−Ｓ２５８Ｐ；Ｔ７７Ｓ−Ｖ８７Ｓ−Ｍ１２
    ３Ｉ−Ｑ１３６Ｒ−Ｎ１６０Ｃ−Ｓ１８７Ｐ−Ｓ２５８Ｐ；Ｔ７７Ｈ−Ｖ８７Ｔ−Ｍ１２３Ｉ−Ｑ１３６Ｒ−Ｎ１８４Ｑ−Ｓ１８７Ｐ−Ｎ２３９Ｓ−Ｓ２５８Ｐ；Ｔ３Ｑ−Ｋ２２Ｙ−Ａ２４Ｎ−Ｖ４５Ｉ−Ａ４８Ｉ−Ｔ７７Ｎ−Ｎ２１７Ｓ−Ｌ２３４Ｉ−Ｙ２５５Ｒ；Ｐ９Ｅ−Ｔ７７Ｑ−Ｖ８７Ｔ−Ｍ１２３Ｉ−Ｑ１３６Ｒ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ｎ２１７Ｓ−Ｎ２３９Ｓ−Ｓ２５８Ｅ；Ｎ４３Ａ−Ｖ４５Ｒ−Ｔ７７Ｈ−Ｖ８７Ｔ−Ｍ１２３Ｉ−Ｑ１３６Ｒ−Ｇ１６５Ａ−Ｎ１８４Ｑ−Ｓ１８７Ｐ−Ｎ２３９Ｓ−Ｓ２５８Ｐ；Ｐ９Ｅ−Ｎ４３Ａ−Ｖ４５Ｒ−Ｔ７７Ｓ−Ｖ８７Ｓ−Ｍ１２３Ｉ−Ｑ１３６Ｒ−Ｇ１６５Ｑ−Ｓ１８７Ｐ−Ｎ２１７Ｓ−Ｓ２５８Ｐ；Ｐ９Ｅ−Ｎ４３Ａ−Ｖ４５Ｒ−Ｔ７７Ｈ−Ｖ８７Ｔ−Ｍ１２３Ｉ−Ｑ１３６Ｒ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ｓ１８７Ｐ−Ｎ２３９Ｓ−Ｓ２５８Ｐ；Ｐ９Ｅ−Ｎ４３Ａ−Ｖ４５Ｒ−Ｔ７７Ｑ−Ｖ８７Ｔ−Ｍ１２３Ｉ−Ｑ１３６Ｒ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ｎ２１７Ｓ−Ｎ２３９Ｓ−Ｓ２５８Ｅ；Ｐ９Ｅ−Ｎ４３Ａ−Ｖ４５Ｒ−Ｔ７７Ｈ−Ｖ８７Ｔ−Ｍ１２３Ｉ−Ｑ１３６Ｒ−Ｇ１６５Ａ−Ｎ１８４Ｑ−Ｓ１８７Ｐ−Ｎ２１７Ｓ−Ｎ２３９Ｓ−Ｓ２５８Ｅ；Ｔ７７Ｎ−Ｎ２１７Ｓ−Ｌ２３４Ｗ；Ｔ７７Ｎ−Ｎ２１７Ｓ、Ｔ７７Ｎ−Ｇ１２６Ｑ−Ｇ１６５Ｑ−Ｔ２１０Ｐ−Ｎ２１７Ｓ−Ｌ２３４Ｗ−Ｓ２５８Ｐ、Ｔ７７Ｎ−Ｇ１２７Ｆ−Ｇ１６５Ｑ−Ａ２０２Ｖ−Ｔ２１０Ｐ−Ｎ２１７Ｓ−Ｌ２３４Ｗ−Ｓ２５８Ｐ；Ａ１Ｑ−Ｔ３Ｖ−Ｖ２８Ａ−Ｉ３５Ａ−Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ｓ８６Ｈ−Ｔ１１５Ｆ−Ｎ２１７Ｓ−Ｎ２３９Ｓ−Ｓ２５０Ｇ−Ｓ２５８Ｐ−Ｑ２７４Ａ；Ｔ７７Ｎ−Ｍ１２３Ｉ−Ｔ２１０Ｐ−Ｎ２３９Ｓ−Ｓ２５０Ｇ−Ｓ２５８Ｐ；Ｖ４５Ｉ−Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ｍ１２３Ｉ−Ｌ１２５Ｎ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ２１７Ｓ−Ｓ２５８Ｐ；Ａ６８Ｓ−Ｖ７１Ａ−Ｔ７７Ｎ−Ｌ９５Ａ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ｔ２１０Ｐ−Ｓ２５８Ｐ；Ｍ１２３Ｉ−Ｔ２１０Ｐ−Ｎ２１７Ｓ−Ｓ２５８Ｐ；Ｇ１２７Ｆ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ２１７Ｓ−Ｓ２５８Ｐ；Ｔ７７Ｎ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ２１７Ｓ−Ｓ２５８Ｐ；Ｔ７７Ｓ−Ｇ１６５Ａ−Ｎ１８４Ｑ−Ｔ２１０Ｐ−Ｎ２１７Ｓ；Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ａ１２８Ｐ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ｎ２１７Ｓ；Ｖ７１Ａ−Ｔ７７Ｓ−Ｎ１８４Ｑ−Ｓ２５８Ｐ；Ｔ７７Ｎ−Ｍ１２３Ｉ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ｎ２１７Ｓ；Ｖ７１Ａ−Ｌ９５Ａ−Ａ１２８Ｓ−Ｔ２１０Ｐ；Ｖ７１Ａ−Ｍ１２３Ｉ−Ａ１２８Ｓ−Ｔ２１０Ｐ；Ｖ７１Ａ−Ｍ１２３Ｉ−Ａ１２８Ｓ−Ｇ１６５Ｅ；Ｔ７７Ｓ−Ａ１２８Ｐ−Ｎ１８４Ｑ−Ｎ２１７Ｓ−Ｆ２６０Ｗ；Ｔ７７Ｈ−Ａ１２８Ｓ−Ｇ１６５Ｑ−Ｔ２１０Ｐ；Ｔ７７Ｄ−Ｓ８６Ｒ−Ｓ１５５Ｅ−Ｇ１６５Ａ−Ｎ１８４Ｑ；Ａ６８Ｓ−Ｖ７１Ａ−Ｔ７７Ｎ−Ａ１２８Ｓ−Ｇ１６５Ｑ−Ｔ２１０Ｐ−Ｎ２１７Ｓ；Ｖ２８Ａ−Ｉ３５Ａ−Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ａ１２８Ｓ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ｇ２０３Ｎ−Ｔ２１０Ｐ；Ａ１２８Ｐ−Ｔ２１０Ｐ；Ｔ２１０Ｐ−Ｓ２５８Ｐ；Ａ１２８Ｐ−Ｔ２１０Ｐ−Ｓ２５９Ｐ；Ａ１２８Ｐ−Ｓ１８７Ｐ−Ｔ２１０Ｐ；Ａ１２８Ｐ−Ｓ１８７Ｐ−Ｔ２１０Ｐ−Ｓ２５８Ｐ；Ｐ９Ｅ−Ｔ７７Ｓ−Ｖ８７Ｔ−Ｔ２１０Ｐ−Ｎ２３９Ｋ；Ｋ１５Ｉ−Ｌ９５Ｑ−Ｍ１２３Ｉ−Ｇ１６５Ｓ−Ｔ２１０Ｐ−Ｎ２１７Ｓ；Ｋ１５Ｉ−Ｍ１２３Ｉ−Ｖ１４６Ｓ−Ｇ１６５Ｓ−Ｔ２１０Ｐ−Ｎ２３９Ｓ；Ｋ１５Ｉ−Ｎ７６Ｋ−Ｍ１２３Ｉ−Ｖ１４６Ｓ−Ｇ１６５Ｓ−Ｔ２１０Ｐ−Ｎ２３９Ｓ；Ｋ１５Ｉ−Ｖ１４６Ｓ−Ｇ１６５Ｓ−Ｔ２１０Ｐ−Ｎ２３９Ｓ；Ｐ００９Ｅ−Ｖ１４６Ｓ−Ｎ１８４Ｑ−Ｇ２０３Ｅ−Ｔ２１０Ｐ−Ｐ２３８Ｒ−Ｎ２３９Ｓ；Ｍ１２３Ｉ−Ｇ１６５Ｓ−Ｎ２１７Ｓ；Ｋ１５Ｉ−Ｌ９５Ｑ−Ｓ１０８Ｋ−Ｇ１６５Ｓ−Ｇ２０３Ｅ−Ｔ２１０Ｐ−Ｎ２１７Ｓ；Ｋ１５Ｉ−Ｌ９５Ｑ−Ｓ１０８Ｋ−Ｇ１６５Ｓ−Ｇ２０３Ｅ−Ｔ２１０Ｐ；Ｐ９Ｅ−Ｋ１５Ｉ−Ｇ１６５Ｓ−Ａ１９３Ｄ−Ｇ２０３Ｅ−Ｔ２１０Ｐ；Ｔ７７Ｎ−Ｍ１２３Ｉ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ２１７Ｓ；Ｔ７７Ｈ−Ｇ１６５Ｑ；Ｔ７７Ｎ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ２１７Ｓ；Ａ６８Ｓ−Ｖ７１Ａ−Ｔ７７Ｎ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ２１７Ｓ；Ｔ７７Ｎ−Ｖ８７Ｓ−Ｍ１２３Ｉ−Ｓ１５５Ｇ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ２１７Ｓ；Ｔ７７Ｈ−Ｖ８７Ｓ−Ｓ１５５Ｇ−Ｇ１６５Ｑ；Ｔ７７Ｎ−Ｖ８７Ｓ−Ｓ１５５Ｇ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ２１７Ｓ；Ｔ７７Ｎ−Ｍ１２３Ｉ−Ｇ１６５Ｑ；Ｔ７７Ｎ−Ｇ１６５Ｑ；Ａ６８Ｓ−Ｖ７１Ａ−Ｔ７７Ｎ−Ｇ１６５Ｑ；Ｔ７７Ｎ−Ｖ８７Ｓ−Ｍ１２３Ｉ−Ｓ１５５Ｇ−Ｇ１６５Ｑ；Ｉ３５Ａ−Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ｖ８７Ｓ−Ｖ１４７Ｌ−Ｇ１６５Ｑ；Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ｖ８７Ｓ−Ｖ１４７Ｌ−Ｓ１５５Ｅ−Ｇ１６５Ｑ；Ｔ７７Ｎ−Ｖ８７Ｓ−Ｍ１２３Ｉ−Ｖ１４７Ｌ−Ｓ１５５Ｇ−Ｇ１６５Ｑ；Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ｍ１２３
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    ７Ｎ−Ｍ１２３Ｉ−Ａ１２８Ｐ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ａ２０２Ｖ−Ｎ２１７Ｓ−Ｓ２５８Ｐ；Ｔ３Ｖ−Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ｇ９９Ｑ−Ｇ１２７Ｓ−Ａ１２８Ｐ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ａ２０２Ｖ−Ｎ２１７Ｓ−Ｓ２５８Ｐ；Ｔ３Ｖ−Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ｔ７８Ｉ−Ｖ８７Ｓ−Ｍ１２３Ｉ−Ｇ１２７Ｓ−Ａ１２８Ｐ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ａ２０２Ｖ−Ｔ２１０Ｐ−Ｎ２１７Ｓ−Ｓ２５８Ｐ；Ｔ３Ｖ−Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ｔ７８Ｉ−Ｍ１２３Ｉ−Ｇ１２７Ｓ−Ａ１２８Ｐ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ａ２０２Ｖ−Ｔ２１０Ｐ−Ｎ２１７Ｓ−Ａ２４２Ｇ−Ｓ２５８Ｐ；Ｔ３Ｖ−Ｖ２６Ｑ−Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ｍ１２３Ｉ−Ｇ１２７Ｓ−Ａ１２８Ｐ−Ｇ１６５Ｅ−Ｎ１８４Ｑ−Ａ２０２Ｖ−Ｔ２１０Ｐ−Ｎ２１７Ｓ−Ｓ２５８Ｐ；Ｔ３Ｖ−Ｐ９Ｅ−Ｌ１０Ｍ−Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ｍ１２３Ｉ−Ｇ１２７Ｓ−Ａ１２８Ｐ−Ｇ１６５Ｅ−Ｎ１８４Ｑ−Ａ２０２Ｖ−Ｔ２１０Ｐ−Ｎ２１７Ｓ−Ｓ２５８Ｐ；Ｔ３Ｖ−Ｐ９Ｅ−Ｌ１０Ｍ−Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ｇ１０１Ａ−Ｍ１２３Ｉ−Ｇ１２７Ｓ−Ａ１２８Ｐ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ａ２０２Ｖ−Ｎ２１７Ｓ−Ｓ２５８Ｐ；Ｔ３Ｖ−Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ｔ７８Ｉ−Ｍ１２３Ｉ−Ｇ１２７Ｓ−Ａ１２８Ｐ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ａ２０２Ｖ−Ｔ２１０Ｐ−Ｎ２１７Ｓ−Ｓ２５８Ｐ；Ｔ３Ｖ−Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ｔ７８Ｉ−Ｍ１２３Ｉ−Ｇ１２７Ｓ−Ａ１２８Ｐ−Ｎ１６０Ｋ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ａ２０２Ｖ−Ｔ２１０Ｐ−Ｎ２１７Ｓ−Ａ２４２Ｇ−Ｓ２５８Ｐ；Ｔ３Ｖ−Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ｖ８７Ｓ−Ｍ１２３Ｉ−Ｇ１２７Ｓ−Ａ１２８Ｐ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ａ２０２Ｖ−Ｔ２１０Ｐ−Ｎ２１７Ｓ−Ｓ２５８Ｐ；Ｔ３Ｖ−Ｐ４０Ｅ−Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ｍ１２３Ｉ−Ｇ１２７Ｓ−Ａ１２８Ｐ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ａ２０２Ｖ−Ｎ２１７Ｓ−Ｓ２５８Ｐ；Ｔ３Ｖ−Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｅ−Ｍ１２３Ｉ−Ｇ１２７Ｔ−Ａ１２８Ｐ−Ｇ１６５Ｅ−Ｎ１８４Ｑ−Ａ２０２Ｖ−Ｎ２１７Ｓ−Ｐ２３８Ｑ−Ｓ２５８Ｐ；Ｔ３Ｖ−Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ｇ９９Ｓ−Ｍ１２３Ｉ−Ｇ１２７Ｓ−Ａ１２８Ｐ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ａ２０２Ｖ−Ｎ２１７Ｓ−Ｓ２５８Ｐ；Ｔ３Ｖ−Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｅ−Ｍ１２３Ｉ−Ｇ１２７Ｔ−Ｇ１６５Ｅ−Ｎ１８４Ｑ−Ａ２０２Ｖ−Ｎ２１７Ｓ−Ｓ２５８Ｐ；Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ａ１２８Ｐ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ｎ２１７Ｓ−Ｓ２５８Ｐ；Ｔ３Ｖ−Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ｇ１０１Ａ−Ｓ１０２Ｔ−Ｍ１２３Ｉ−Ｇ１２７Ｓ−Ａ１２８Ｐ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ａ２０２Ｖ−Ｎ２１７Ｓ−Ｓ２５８Ｐ；Ｔ３Ｖ−Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ｍ１２３Ｉ−Ｇ１２７Ｓ−Ａ１２８Ｐ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ａ２０２Ｖ−Ｎ２１７Ｓ；Ｔ３Ｖ−Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ｔ７８Ｉ−Ｇ９９Ｓ−Ｇ１２７Ｓ−Ａ１２８Ｐ−Ｇ１６５Ｑ−Ｔ２１０Ｐ−Ａ２４２Ｇ−Ｓ２５８Ｐ−Ｋ２６４Ｈ；Ｔ３Ｖ−Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ｔ７８Ｉ−Ｇ９９Ｓ−Ｍ１２３Ｉ−Ｇ１２７Ｓ−Ａ１２８Ｐ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ａ２０２Ｖ−Ｔ２１０Ｐ−Ｎ２１７Ｓ−Ａ２４２Ｇ−Ｓ２５８Ｐ；Ｔ３Ｖ−Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ｍ１２３Ｉ−Ｇ１２７Ｔ−Ｇ１６５Ｅ−Ｎ１８４Ｑ−Ａ２０２Ｖ−Ｎ２１７Ｓ−Ｐ２３８Ｑ−Ｓ２５８Ｐ；Ｔ３Ｖ−Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ｔ７８Ｉ−Ｇ９９Ｓ−Ｇ１２７Ｓ−Ａ１２８Ｐ−Ｇ１６５Ｑ−Ｔ２１０Ｐ−Ａ２４２Ｇ−Ｓ２５８Ｐ；Ｔ３Ｖ−Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ｔ７８Ｉ−Ｇ９９Ｓ−Ｍ１２３Ｉ−Ｇ１２７Ｓ−Ａ１２８Ｐ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ａ２０２Ｖ−Ｔ２１０Ｐ−Ｎ２１７Ｓ−Ａ２４２Ｇ−Ｓ２５８Ｄ；Ｉ３５Ａ−Ｍ１２３Ｉ−Ｇ１２７Ｔ−Ｔ２１０Ｐ−Ｓ２４３Ｉ；Ｔ３Ｖ−Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ｇ９９Ｓ−Ｍ１２３Ｉ−Ｇ１２７Ｓ−Ａ１２８Ｐ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ａ２０２Ｖ−Ｎ２１７Ｓ−Ｓ２５８Ｐ−Ｆ２６０Ｗ；Ｔ３Ｖ−Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ｔ７８Ｉ−Ｇ９９Ｓ−Ｇ１０１Ａ−Ｇ１２７Ｓ−Ａ１２８Ｐ−Ｇ１６５Ｑ−Ｔ２１０Ｐ−Ａ２４２Ｇ−Ｓ２５８Ｐ；Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ｇ９９Ｑ−Ａ１２８Ｐ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ｎ２１７Ｓ；Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ａ１２８Ｐ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ａ２０２Ｖ−Ｎ２１７Ｓ；Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ａ１２８Ｐ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ｎ２１７Ｓ−Ｓ２５８Ｄ；Ｔ３Ｖ−Ａ６８Ｓ−Ｔ７７Ｎ−Ｔ７８Ｉ−Ｇ９９Ｓ−Ｇ１０１Ａ−Ｍ１２３Ｉ−Ｇ１２７Ｓ−Ａ１２８Ｐ−Ｇ１６５Ｑ−Ｎ１８４Ｑ−Ａ２０２Ｖ−Ｔ２１０Ｐ−Ｎ２１７Ｓ−Ａ２４２Ｇ−Ｓ２５８ＰおよびＶ４５Ｒ−Ｓ９８Ｒから選択される１つ以上のアミノ酸置換セットを含むアミノ酸配列を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載のスブチリシン変異体。
  8. 前記変異体は、さらに、
    ｉ．モチーフＡ、モチーフＢまたはそれらの組み合わせ；
    ｉｉ．モチーフＡおよびモチーフＢ；
    ｉｉｉ．Ａｓｐ３２とＨｉｓ６３の間のモチーフ１；
    ｉｖ．Ｌｙｓ２３６とＡｒｇ２４６の間のモチーフ６またはモチーフ７；あるいは
    ｖ．Ａｓｐ３２とＨｉｓ６３の間のモチーフ１、およびＬｙｓ２３６とＡｒｇ２４６の間のモチーフ６またはモチーフ７を含み；
    モチーフＡは、モチーフ１、モチーフ２、モチーフ３およびモチーフ４から選択され；
    モチーフＢはモチーフ５、モチーフ６、モチーフ７、モチーフ８、モチーフ９、モチーフ１０、モチーフ１１、モチーフ１２、モチーフ１３およびモチーフ１４から選択され；かつアミノ酸の位置は、配列番号２のアミノ酸配列に対応して番号付けされている、請求項１〜７のいずれか一項に記載のスブチリシン変異体。
  9. 前記変異体は、図１で同定されたＡｐｒＬ−Ｃｌａｄｅスブチリシン酵素のアミノ酸配列に対して、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％で１００％未満のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載のスブチリシン変異体。
  10. 前記変異体は、配列番号２または９のアミノ酸配列に対して、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％で１００％未満のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の単離されたスブチリシン変異体。
  11. 前記変異体は、（ｉ）モチーフＡ、モチーフＢもしくはそれらの組合せ、または（ｉｉ）モチーフＡおよびモチーフＢを含むＡｐｒＬ−Ｃｌａｄｅスブチリシン酵素に対して、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有する親由来であり；モチーフＡはモチーフ１、モチーフ２、モチーフ３およびモチーフ４から選択され；かつモチーフＢはモチーフ５、モチーフ６、モチーフ７、モチーフ８、モチーフ９、モチーフ１０、モチーフ１１、モチーフ１２、モチーフ１３およびモチーフ１４から選択される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のスブチリシン変異体。
  12. 前記変異体は、配列番号２または９のアミノ酸配列を含む親由来である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のスブチリシン変異体。
  13. 前記変異体は、プロテアーゼ活性を有し、かつ／または単離されている、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のスブチリシン変異体。
  14. 前記変異体は、参照スブチリシンと比較して１つ以上の改善された特性を有し；前記改善された特性は、改善されたプロテアーゼ活性、改善された洗剤中の洗浄性能、改善された洗剤中の熱安定性、および改善された洗剤中の劣化洗濯洗浄性から選択され；かつ前記洗剤は、任意選択により、ホウ素を含まない組成物である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のスブチリシン変異体。
  15. 前記参照スブチリシンは、配列番号２、９または６３のアミノ酸配列を含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のスブチリシン変異体。
  16. 前記改善された特性は、
    （ｉ）改善されたプロテアーゼ活性であって、前記変異体は、Ｎ−ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡまたはジメチルカゼイン基質でＰＩ＞１を有し；
    （ｉｉ）改善された洗剤中の洗浄性能であって、前記変異体は、ＢＭＩ、ＰＯＭ、卵および／または卵黄洗浄性ＰＩ＞１を有し；
    （ｉｉｉ）改善された洗剤中の熱安定性であって、前記変異体は、安定性ＰＩ＞１、または６０℃、６１℃、６２℃、６３℃、６４℃、６５℃、６６℃、６７℃、６８℃、６９℃もしくはそれ以上のストレス温度で１５〜２０分後の％残留活性≧５％、１０％ ２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％もしくはそれ以上を有し；かつ／あるいは
    （ｉｖ）改善された洗剤中の劣化洗濯洗浄性であって、前記変異体は、（ａ）劣化洗濯洗浄性ＰＩ＞１、（ｂ）５５℃で２４時間後の残留洗浄活性が＞１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％もしくはそれ以上、および／または（ｃ）３７℃で３日もしくは３週間後の残留洗浄活性＞１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％もしくはそれ以上を有する、
    請求項１３または１４に記載のスブチリシン変異体。
  17. （ｉ）前記プロテアーゼ活性は、実施例１のプロテアーゼ活性アッセイに従って測定され；
    （ｉｉ）前記洗剤中の洗浄性能は、実施例１の洗濯用（ＨＤＬおよびＨＤＤ）洗剤およびＡＤＷ用洗剤アッセイにおける洗浄性能に従って測定され；
    （ｉｉｉ）前記洗剤中の熱安定性は、実施例１の安定性アッセイのための一般的な試料のセットアップに従って測定され；かつ／または、
    （ｉｖ）前記洗剤中の劣化洗濯洗浄性は、実施例１の劣化洗濯洗浄アッセイに従って測定される、
    請求項１６に記載のスブチリシン変異体。
  18. 請求項１〜１７のいずれか一項に記載の１種以上のスブチリシン変異体を含む組成物。
  19. 前記組成物は洗剤組成物である、請求項１８に記載の組成物。
  20. 前記洗剤組成物は、洗濯用洗剤、布帛柔軟用洗剤、食器洗浄用洗剤および硬質表面洗浄用洗剤から選択される、請求項１９に記載の組成物。
  21. 前記組成物は、１種以上のカルシウムイオンおよび／もしくは亜鉛イオン、１種以上の酵素安定剤、約０．００１重量％〜約１．０重量％の前記スブチリシン変異体、１種以上の漂白剤、１種以上の補助材料、ならびに／またはアシルトランスフェラーゼ、アルファ−アミラーゼ、ベータ−アミラーゼ、アルファ−ガラクトシダーゼ、アラビノシダーゼ、アリールエステラーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、カラギナーゼ、カタラーゼ、セロビオヒドロラーゼ、セルラーゼ、コンドロイチナーゼ、クチナーゼ、ＤＮａｓｅもしくはヌクレアーゼ、エンド−ベータ−１、４−グルカナーゼ、エンド−ベータ−マンナナーゼ、エステラーゼ、エキソ−マンナナーゼ、ガラクタナーゼ、グルコアミラーゼ、ヘミセルラーゼ、ヒアルロニダーゼ、ケラチナーゼ、ラッカーゼ、ラクターゼ、リグニナーゼ、リパーゼ、リポキシゲナーゼ、リゾチーム、マンナナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン酸リアーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ペクチナーゼ、ペントサナーゼ、ペルオキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、ホスファターゼ、ホスフォリパーゼ、フィターゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテアーゼ、プルラナーゼ、リダクターゼ、ラムノガラクツロナーゼ、ベータ−グルカナーゼ、タンナーゼ、トランスグルタミナーゼ、キシランアセチル−エステラーゼ、キシラナーゼ、キシログルカナーゼ、キシロシダーゼ、メタロプロテアーゼ、追加のセリンプロテアーゼ、ならびにこれらの組み合わせからなる群から選択される１種以上の追加の酵素もしくは酵素誘導体をさらに含む、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の組成物。
  22. 前記組成物は、リン酸塩を含有するか、もしくはリン酸塩を含有せず、かつ／またはホウ素を含有するか、もしくはホウ素を含有しない、請求項１８〜２１のいずれか一項に記載の組成物。
  23. 前記組成物は、粒状、粉末状、固形状、棒状、液状、タブレット状、ゲル状、ペースト状、または単位用量の組成物である、請求項１８〜２２のいずれか一項に記載の組成物。
  24. 洗浄を必要とする表面または物品を、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のスブチリシン変異体、または請求項１８〜２２のいずれか一項に記載の組成物と接触させる工程を含み；かつ任意選択により、前記表面または物品を前記変異体または組成物と接触させた後に、前記表面または物品をリンスする工程をさらに含み、任意選択により、前記物品は食器または布帛である、洗浄方法。
  25. 請求項１〜１７のいずれか一項に記載のスブチリシン変異体をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドであって、前記ポリヌクレオチドは、任意選択により単離されるポリヌクレオチド。
  26. 請求項２５に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクターまたは発現カセット。
  27. 前記核酸配列はプロモーターに作動可能に連結している、請求項２６に記載の発現ベクターまたは発現カセット。
  28. 請求項２６もしくは２７に記載のベクターまたはカセット、または請求項２５に記載のポリヌクレオチドを含む組換え宿主細胞。
  29. 請求項１〜１７のいずれか一項に記載のスブチリシン変異体を含む組成物であって、前記組成物は、殺菌用、工業もしくは施設での洗浄用、医療機器洗浄用、動物飼料用、コンタクトレンズ洗浄用、創傷清拭用、または織物、レザーもしくは羽毛加工用組成物である組成物。
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