CN100523181C - 具有碱性α-淀粉酶活性的多肽及其编码核酸 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及具有α-淀粉酶活性的分离的多肽和编码所述多肽的分离的核酸序列。本发明还涉及核酸构建体、载体以及含所述核酸序列的宿主细胞和生产并利用所述多肽的方法。

Description

具有碱性α-淀粉酶活性的多肽及其编码核酸
发明背景
发明领域
本发明涉及具有α-淀粉酶活性的分离的多肽和编码所述多肽的核酸序列。此外，本发明涉及本发明α-淀粉酶的变体。本发明还涉及含有所述核酸序列的核酸构建体、载体和宿主细胞以及生产和利用所述多肽的方法。另外，本发明还涉及用于洗衣、洗碗碟和/或硬表面清洁的组合物。
现有技术描述
多年来以将α-淀粉酶用于各种不同的目的，其中最重要的是淀粉液化、织物脱浆、在造纸和浆工业中的淀粉改性，以及用于酿酒和烤面包。α-淀粉酶的另一用途，而且是越来越重要的用途是在碱性pH下与洗涤剂一起在洗涤过程中除去淀粉样斑迹。
商业化的α-淀粉酶产品有
Figure C00807805D00051
DuramylTM、
Figure C00807805D00052
Figure C00807805D00053
和
Figure C00807805D00054
所有这些产品均出自丹麦的Novo NordiskA/S。这些以及来自其他公司的类似产品都具有酸性至中性的最佳pH，通常为pH5-pH7.5，因此在碱性pH的洗涤剂溶液中不能表现出最佳活性。
WO 95/26397公开了一种来自芽孢杆菌菌株的α-淀粉酶。
WO 96/23873描述了在洗涤条件下具有改善的性能的芽孢杆菌淀粉酶变体。
US 5,147,796描述了具有α-淀粉酶活性的碱性支链淀粉酶。该文献的图2b表明最佳淀粉酶活性在pH8-8.5。
M.Takagi等在发酵生物工程杂志(J.Ferment.Bioeng.，vol 81，No.6,557-559(1996))上描述了一种来自芽孢杆菌属的亲碱性的α-淀粉酶-支链淀粉酶。该酶的最佳淀粉酶活性在pH9，但在较高pH活性迅速降低，在pH10的活性比在pH7的活性低。
WO 97/00324(KAO)公开了编码适用于洗涤剂的芽孢杆菌属菌株KSMAP1378碱性液化α-淀粉酶的基因，该菌株的保藏号为FERM BP-3048。
本发明的目的是提供一种在碱性溶液，特别是在pH9-11的碱性洗涤剂溶液中具有改善的性能的新α-淀粉酶。
发明概述
本发明涉及具有α-淀粉酶活性的分离的多肽，该多肽具有选自下列的一种或多种特征或特性：
(a)与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的成熟多肽氨基酸1-485有至少85％同一性的多肽；
(b)由在中度严谨条件下与(i)SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的核酸序列，(ii)SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的cDNA序列，(iii)(i)或(ii)的至少100个核苷酸的亚序列，或(iv)(i)、(ii)或(iii)的互补链杂交的核酸序列编码的多肽；
(c)(a)或(b)的等位基因变体；
(d)(a)、(b)或(c)的具有α-淀粉酶活性的片段；
(e)在碱性洗涤剂溶液，特别是在pH9-11左右，最佳pH9-10.5左右的碱性洗涤剂溶液中具有改善的洗涤性能的多肽；
(f)用Phadebas方法(pH9.0)确定的最佳温度为55-65℃的多肽；和
(g)用等电聚焦(Pharmacia，Ampholine，pH3.5-9.3)确定的pI为7-8的多肽。
应理解本发明的α-淀粉酶具有上述一种或多种特征。
此外，本发明还涉及本发明α-淀粉酶的变体。本发明还涉及编码所述多肽的分离的核酸序列和含所述核酸序列的核酸构建体、载体和宿主细胞以及生产和利用所述多肽的方法。
附图简述
进一步参考附图说明本发明，其中：
图1是各种芽孢杆菌α-淀粉酶的排列。
图2是α-淀粉酶AAI-6和AAI-10与α-淀粉酶SP722和SP690进行比较的pH图谱。所述活性是以Abs650/mg表示的绝对值。pH图谱是在37℃测量的。
图3是α-淀粉酶AAI-6和AAI-10在pH9.0时与对照α-淀粉酶SP722和SP690进行比较的温度图谱。
图4是在AP型洗涤剂97(AP Model Detergent 97)中AAI-6和AAI-10与SP722、SP690和Termamyl
Figure C00807805D0007175355QIETU
相比的洗涤性能。
图5是在Omo Multi Acao中AAI-6和AAI-10与SP722、SP690和Termamyl
Figure C00807805D0007175355QIETU
相比的洗涤性能。
图6是在Omo Concentrated中AAI-6和AAI-10与SP722、SP690和Termamyl
Figure C00807805D0007175355QIETU
相比的洗涤性能。
图7是在Ariel Futur液体中AAI-6和AAI-10与SP722、SP690和Termamyl
Figure C00807805D0007175355QIETU
相比的洗涤性能。
发明详述
微生物来源
本发明的碱性α-淀粉酶来源于芽孢杆菌属的菌株。优选的菌株是芽孢杆菌DSM 12650(AAI-6α-淀粉酶)或DSM 12651(AAI-10α-淀粉酶)。根据有关用于专利程序的微生物保藏的布达佩斯条约的规定，本发明人于1999年1月25日将这些菌株保藏在德意志微生物和细胞培养物保藏中心(DSMZ)，Mascheroder Weg 1b，D-38124 Braunschweig DE。
根据有关用于专利程序的微生物保藏的布达佩斯条约的规定，本发明人已于1999年4月7日将分别含质粒pLiH1300(AAI-6)和pLiH1298(AAI10)中的α-淀粉酶基因的大肠杆菌菌株NN049469和NN049468保藏在德意志微生物和细胞培养物保藏中心(DSMZ)，Mascheroder Weg 1b，D-38124Braunschweig DE，保藏号分别为DSM12763和DSM12762。上述被保藏的芽孢杆菌属供体生物是1997年在冰岛收集的。
具有α-淀粉酶活性的多肽
α-淀粉酶(α-1，4葡聚糖-4-葡聚糖水解酶，EC3.2.1.1)构成一组酶，其催化淀粉和其它线性和支链1，4-糖苷寡-和多糖的水解。为了实现本发明目的，采用下面“材料和方法”部分中描述的Phadebas分析方法或pNPG7分析方法测定α-淀粉酶的活性。
酶的同系物
在第一个实施方案中，本发明涉及分离的多肽，所述多肽含有与SEQ IDNO：2或SEQ ID NO：4(即成熟多肽)的氨基酸1-485有至少约85％，优选至少约90％，优选至少约93％，更优选至少约95％，更优选至少97％，最佳99％同源性的具有α-淀粉酶活性的氨基酸序列(下文称为同源多肽)。在优选的实施方案中，所述同源多肽具有与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的氨基酸1-485有5个氨基酸，优选4个氨基酸，更优选3个氨基酸，更优选2个氨基酸，最佳一个氨基酸不同的氨基酸序列。
氨基酸序列同源性可以根据两个序列间的同一性程度确定，其表明第一序列衍生自第二序列。同源性可通过现有技术中已知的计算机程序来适当地测定。因此，可用GCG第8版中的GAP(Needleman，S.B.和Wunsch，C.D.，(1970)，分子生物学杂志，48，443-453)以默认设置进行序列的成对(pairwise)对比排列和相同程度或同源程度的计算。并可将GCG第9版的Gap与翻译的第8版的肽评分矩阵，即利用ntol’s矩阵(Http://plasmid/-bioweb/matrix/)而不用末端缺口罚分的缺口创建罚分30和缺口延伸罚分1一起使用。
与已知芽孢杆菌α-淀粉酶的同源性
已知序列的同源检索表明按上述确定的本发明序列与许多芽孢杆菌淀粉酶有67-81％的氨基酸同源。
具体地说，与本发明序列(即SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4)同源的α-淀粉酶是SP690(美国专利5856164的SEQ ID NO：1，约有81％同源)，SP722(美国专利5856164的SEQ ID NO：2，约有81％同源)以及与本发明序列有81％同源性的WO 97/00324公开的SEQ ID NO：2，该序列是得自芽孢杆菌KSM-AP1378的α-淀粉酶的成熟部分(氨基酸31-516)。
优选，本发明的多肽含有SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的氨基酸序列或其等位基因变体；或者其具有α-淀粉酶活性的片段。SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4是本发明碱性α-淀粉酶的成熟部分。
SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的片段是从该氨基酸序列的氨基和/或羧基末端缺失了一个或多个氨基酸的多肽。
等位基因变体指相同染色体座位上一个基因的两种或多种改变形式。在自然条件下，等位基因变体通过突变产生，因此可导致种群内的多样性。基因突变可以是沉默的(编码的多肽没有改变)或者可编码氨基酸序列发生改变的多肽。多肽的等位基因变体是指由基因的等位基因变体编码的多肽。
同源多肽的氨基酸序列可因一个或多个氨基酸残基的插入或缺失和/或一个或多个氨基酸残基的取代产生不同的氨基酸残基而不同于SEQ IDNO：2或SEQ ID NO：4的氨基酸序列。优选，氨基酸改变是微小的，即是不会显著影响所述蛋白质折叠和/或活性的保守氨基酸取代；小的缺失，通常指1个-30个氨基酸；小氨基-或羧基-末端的延伸，例如氨基末端甲硫氨酸残基的延伸；多达约20-25个残基的小连接肽；或通过改变净电荷或另一功能，例如聚-组氨酸区、抗原表位或结合结构域有利于纯化的小延伸。
保守取代的实例可以是碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷酰胺和天冬酰胺)、疏水氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)以及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)。通常不会改变比活性的氨基酸取代是本领域已知的，并由例如H.Neurath和R.L.Hill，1979，在《蛋白质》(In，The Proteins，Academic Press，New York)中进行了描述。最常见的交换是Ala/Ser，Val/Ile，Asp/Glu，Thr/Ser，Ala/Gly，Ala/Thr，Ser/Asn，Ala/Val，Ser/Gly，Tyr/Phe，Ala/Pro，Lys/Arg，Asp/Asn，Leu/Ile，Leu/Val，Ala/Glu和Asp/Gly及其相反的交换。
在第二个实施方案中，本发明涉及具有α-淀粉酶活性的分离的多肽，所述多肽由在中等严格，优选中等偏高严谨条件下，更优选高度严谨条件下，最佳极端严谨条件下与下述核酸探针杂交的核酸序列编码，所述核酸探针在同样条件下与(i)SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的核酸序列，(ii)SEQID NO：1或SEQ ID NO：3的cDNA序列，(iii)(i)或(ii)的亚序列，或者(iv)(i)、(ii)或(iii)的互补链杂交(J.Sambrook，E.F.Fritsch，和T.Maniatus，1989，《分子克隆-实验室手册》(Molecular Cloning，A Laboratory Manual)，2d edition，冷泉港，New York)。SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的亚序列可以至少有100个核苷酸或者优选至少200个核苷酸。此外，所述亚序列可编码具有α-淀粉酶活性的多肽片段。所述多肽还可以是具有α-淀粉酶活性的等位基因变体或所述多肽的片段。
可按照本领域熟知的方法，用SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的核酸序列或其亚序列以及SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的氨基酸序列或其片段设计核酸探针以鉴定和克隆来自不同属或种的编码具有α-淀粉酶活性的多肽的DNA。具体地说，可用所述探针与目的属或种的基因组或cDNA杂交，然后进行标准Southern印迹以便鉴定并分离相应的基因。所述探针可以明显短于完整序列，但至少应有15个，优选至少25个，更优选至少35个核苷酸。也可以使用较长的探针。DNA和RNA探针都可以使用。通常将探针加以标记以检测相应的基因(例如用32P、3H、35S、生物素或抗生物素蛋白标记)。本发明包括所述探针。
因此，从所述其他生物制备的基因组DNA或cDNA文库可用于筛选与上述探针杂交并编码具有α-淀粉酶活性之多肽的DNA。通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳或其它分离技术可分离来自所述其他生物的基因组或其他DNA。可将来自所述文库的DNA或分离的DNA转移并固定在硝酸纤维素或其他适宜的载体材料上。为了鉴定与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3或其亚序列同源的克隆或DNA，在Southern印迹中使用载体材料。为了达到本发明的目的，杂交指在中等至极端严格的条件下，核酸序列与对应于SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3、其互补链或其亚序列的核酸探针杂交。用X射线胶片检测在这些条件下与所述核酸探针杂交的分子。
在另一优选的实施方案中，所述核酸探针是分别在大肠杆菌DSM12763或大肠杆菌DSM12762内的质粒pLiH1300(AAI6)或质粒pLiH1298(AAI10)中所含的核酸序列，或者其中所述核酸序列编码具有本发明酸性α-淀粉酶活性并分别示于SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的多肽。
对于至少100个核苷酸的长探针，中等至极端严谨条件指在42℃的5XSSPE中预杂交和杂交，0.3％SDS、200微克/毫升剪切和变性鲑精DNA，35％甲酰胺是中等和中等偏高的严紧度，或者50％甲酰胺是高度和极端严紧度，然后进行标准Southern印迹。
对于至少100个核苷酸的长探针，用2xSSC，0.2％SDS至少在55℃(中等严紧度)，优选至少60℃(中等偏高严紧度)，更优选至少65℃(高严紧度)，最佳至少70℃(极高严紧度)将载体材料最后洗涤3次，每次15分钟。
对于约15个核苷酸至约70个核苷酸的短探针，将严紧度定义为在0.9MNaCl、0.09M Tris-HCl pH7.6，6mM ZDFA，0.5％NP-40，1X Denhardt’s溶液，1mM焦磷酸钠，1mM磷酸二氢钠，0.1mM ATP和0.2mg/ml酵母RNA中，在比按照Bolton和McCarthy(1962，《国家科学院进展》(Proceedings ofThe National Academy of Sciences)USA 48：1390)计算方法计算的Tm低5℃至10℃的温度下，进行预杂交、杂交和杂交后洗涤，然后进行标准Southern印迹。
对于约15个核苷酸至约70个核苷酸的短探针，在低于理论Tm 5℃-10℃的温度下，将载体材料用6X SCC加0.1％ SDS洗涤一次，15分钟，用6XSSC洗涤两次，每次15分钟。
在第三个实施方案中，本发明涉及具有下列物理化学特性的分离的多肽，即SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4中所示多肽。
用Phadebas方法(pH9)确定的最佳温度(参见图3)为55-65℃，更精确地说在约60℃。
用等电聚焦确定AAI-6的pI为7-7.3，AAI-10的pI为7-8。
本发明多肽具有SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4成熟多肽的α-淀粉酶活性的至少20％，优选至少40％，更优选至少60％，更加优选至少80％，更好至少90％，最佳至少100％。
可从任何属的微生物中得到本发明多肽。为了达到本发明的目的，与给定来源一起使用的术语“得自”应指由核酸序列编码的多肽是由该核酸序列的来源或已插入了所述来源的核酸序列的细胞生产的。
本发明多肽可以是细菌多肽。例如所述多肽可以是革兰氏阳性菌的多肽，例如芽孢杆菌多肽，例如嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌或苏云金芽孢杆菌多肽；或者链霉菌多肽，例如变青链霉菌或者鼠灰链霉菌多肽；或者革兰氏阴性菌多肽，例如大肠杆菌或假单胞菌属多肽。
在另一优选的实施方案中，所述多肽是芽孢杆菌属多肽，在更优选的实施方案中，所述多肽是芽孢杆菌属DSM 12650和芽孢杆菌属DSM 12651多肽，例如分别具有SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的氨基酸序列。
应理解对于前述种，本发明包括完美和不完美的状态以及其他分类学等同物，例如无性型，而不论它们是以何种种名为人所知。本领域技术人员很容易确定适宜等同物的同一性。
这些种的菌株很容易从各种收集中心，例如美国典型培养物保藏中心(ATCC)、德意志微生物和细胞培养物保藏中心(DSM)、真菌菌种保藏中心(CBS)和农业研究服务专利培养物收集中心(Agricultural Research ServicePatent Culture Collection)、北方地区研究中心(NRRL)获得。
此外，用上述探针可以从其他来源，包括分离自自然界(例如，土壤、堆肥、水等)的微生物中鉴定和获得所述多肽。从自然界分离微生物的技术是本领域熟知的。通过类似地筛选另一微生物的基因组或cDNA文库可一得到所述核酸序列。一旦用所述探针检测到了编码多肽的核酸序列后，用本领域技术人员熟知的技术(参见例如Sambrook等，1989，同上文)可以分离或克隆所述序列。
如文中所定义的，“分离的”多肽指基本上没有其他非α-淀粉酶多肽的多肽，例如经SDS-PAGE确定纯度至少为约20％，优选至少约40％，更优选约60％，更优选约80％，更好约90％，最佳约95％。
由本发明核酸序列编码的多肽还包括融合的多肽或可裂解的融合多肽，其中在所述多肽或其片段的N-末端或C-末端融合另一多肽。通过将编码另一多肽的核酸序列(或其部分)与本发明核酸序列(或其部分)融合生产融合的多肽。生产融合多肽的技术是本领域已知的，包括连接所述多肽的编码序列以便它们位于同一读码框中，然后在相同启动子和终止子控制下表达融合多肽。
术语“改善的洗涤性能”指在本发明实施例9所述的洗涤条件下确定的性能，所述性能高于用于洗涤的其他α-淀粉酶，例如SP690、SP722和Termamyl
Figure C00807805D0007175355QIETU
，或者本发明突变体/变体的性能高于亲本α-淀粉酶，即未突变的例如未取代的α-淀粉酶骨架。
突变的α-淀粉酶
本发明变体的改变的特性
下面讨论可以导入本发明AAI-6或AAI-10α-淀粉酶的突变，特别是取代和缺失间的关系，以及与亲本α-淀粉酶相比在特性方面合乎要求的改变。
本发明还涉及SEQ ID NO：2(AAI-10)或SEQ ID NO：4(AAI-6)所示α-淀粉酶的突变体。本发明的突变体α-淀粉酶其特征在于将一个或多个甲硫氨酸残基与除Cys和Met以外的任何氨基酸残基交换。因此根据本发明，取代甲硫氨酸残基得到氨基酸是：Ala、Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr和Val。
本发明突变体α-淀粉酶的优选实施方案其特征在于将一个或多个甲硫氨酸残基与Leu、Thr、Ala、Gly、Ser、Ile或Asp交换，优选与Leu、Thr、Ala或Gly交换。在该实施方案中，在存在氧化剂的条件下得到了非常令人满意的活性和稳定性。具体地说，这是指用任何本领域已知的适宜的技术，特别包括定点诱变和基因改组(gene shuffling)取代或缺失下列位置的一个或多个甲硫氨酸。SEQ ID NO：2中设想的位置是：10、105、202、208、246、286、309、430、440；SEQ ID NO：4中设想的位置是：10、105、202、208、246、286、309、430、440、454。本发明突变体α-淀粉酶的优选实施方案其特征在于将位置202上的甲硫氨酸残基与除Cys和Met的任何氨基酸残基，优选Leu、Thr、Ala、Gly、Ser、Ile或Asp交换。
其他设想的优选突变包括缺失氨基酸R181、G182、D183或G184、K185、G186中的一个、两个或多个残基，或者取代其中的一个或多个残基。优选的突变是缺失D183-G184。特别相关的突变是用Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr和Val取代G186。特别优选的取代是G186R。
还设想用Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr和Val取代N195。特别优选的取代是N195F。
上述突变的下列组合包括：D183-G184+N195F的缺失、D183-G184+G186R的缺失、D183-G184+G186R+N195F和G186R+N195F的缺失。
提高的热稳定性
导致本发明变体(AAI-10和AAI-6)具有例如提高的热稳定性，特别是在酸性pH和/或低Ca2+浓度下热稳定性提高的突变包括在下列位置的突变(使用AAI-10α-淀粉酶的编号，即SEQ ID NO：2)：
R158、S174、A186、N195、N197、H210、E212、I214、N215、E216、K269、N270。
在本文中术语“酸性pH”指低于7.0的pH，特别是低于正常进行工业淀粉液化的pH5.5-6.2。
在本文中，术语“低的钙浓度”指低于工业淀粉液化所用的正常水平的浓度。正常浓度变化取决于谷物中游离Ca2+的浓度。通常添加相当于1mM(40ppm)的剂量，其与谷物中的水平一起产生40-60ppm的游离Ca2+。
本文中术语“高温”指95-160℃间的温度，特别是正常进行工业淀粉液化的95-105℃。
本发明人现已发现通过将包括上述突变和/或V206的其他突变彼此组合还可以进一步提高热稳定性，特别是在酸性pH和/或在低Ca2+浓度的热稳定性。
所述“其他”突变是指如下突变(相对于AAI-10α-淀粉酶，SEQ ID NO：2)：
N195、E212、E216、K269和V206。
所述突变还可与WO 96/23873所述的一个，优选两个或更优选三个或多个位置(即本文SEQ ID NO：2中的位置R181、G182、D183、G184)的缺失结合。
根据本发明，亲本AAI-10和AAI-6α-淀粉酶的变体可含有上述位置的一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或更多的突变。
应强调的是本发明不仅包括AAI-10和AAI-6α-淀粉酶，还包括具有如下定义的同源性(同一性)的α-淀粉酶。
在此应提及分别在对应于SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的N195、V206、E212和E216位置上的氨基酸残基构成在许多Termamyl-样α-淀粉酶，即Termamyl
Figure C00807805D0007175355QIETU
(地衣芽孢杆菌α-淀粉酶)中保守的氨基酸残基。因此，例如，在图1的排列和下列表1和表2中可以发现在AAI-10和AAI-6及Termamyl的相应位置上的残基。
表1
Figure C00807805D00141
表2
Figure C00807805D00151
这些保守氨基酸残基的突变对于改变特性是非常重要的。
当用SEQ ID NO：2编号时，根据本发明，为了改变特性，特别是提高在酸性pH和/或低Ca2+浓度的热稳定性，可以在下列位置进行两个、三个、四个、五个、六个或七个突变(相对于本文SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4)：
1：R181*，G182*，D183*，G184*；
2：N195A，R，D，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V；
3：V206A，R，D，N，C，E，Q，G，H，，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y；
4：E212A，R，D，N，C，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V；
5：E216A，R，D，N，C，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V；
6：K269A，R，D，N，C，E，Q，G，H，I，L，M，F，P，S，T，W，Y，V.
7：R181A，N，D，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V。
根据本发明构想的是组合三个、四个、五个、六个或七个突变。
根据本发明具体的双突变是(用SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4进行编号)：
-R181*/G182*/N195A，R，D，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V；
-G182*/T183*/N195A，R，D，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V；
-T183*/G184*/N195A，R，D，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V；
-T183*/G184*/R181A，N，D，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V；
-R181*/G182*/V206A，R，D，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y；
-G182*/T183*/V206A，R，D，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y；
-T183*/G184*/V206A，R，D，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y；
-R181*/G182*/E212A，R，D，N，C，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V；
-G182*/T183*/E212A，R，D，N，C，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V；
-T183*/G184*/E212A，R，D，N，C，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V：
-R181*/G182*/E216A，R，D，N，C，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V；
-G182*/T183*/E216A，R，D，N，C，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V；
-T183*/G184*/E216A，R，D，N，C，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V；
-R181*/G182*/K269A，R，D，N，C，E，Q，G，H，I，L，M，F，P，S，T，W，Y，V；
-G182*/T183*/K269A，R，D，N，C，E，Q，G，H，I，L，M，F，P，S，T，W，Y，V；
-T183*/G184*/K269A，R，D，N，C，E，Q，G，H，I，L，M，F，P，S，T，W，Y，V；
-N195A，R，D，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V
/V206A，R，D，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y；
-N195A，R，D，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V
/E212A，R，D，N，C，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V；
-N195A，R，D，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V
/E216A，R，D，N，C，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V；
-N195A，R，D，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V
/K269A，R，D，N，C，E，Q，G，H，I，L，M，F，P，S，T，W，Y，V；
-V206A，R，D，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y
/E212A，R，D，N，C，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V；
-V206A，R，D，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y
/E216A，R，D，N，C，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V；
-V206A，R，D，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y
/K269A，R，D，N，C，E，Q，G，H，I，L，M，F，P，S，T，W，Y，V；
-E212A，R，D，N，C，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V
/E216A，R，D，N，C，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V；
E212A，R，D，N，C，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V
/K269A，R，D，N，C，E，Q，G，H，I，L，M，F，P，S，T，W，Y，V；
-E216A，R，D，N，C，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V
/K269A，R，D，N，C，E，Q，G，H，I，L，M，F，P，S，T，W，Y，V。
在优选的实施方案中，变体包括下列突变：在SEQ ID NO：2或SEQ IDNO：4或本文定义的85％同源α-淀粉酶的相应位置的N195F/K264S。在另一实施方案中，本发明的变体包括下列突变：在SEQ ID NO：2或SEQ IDNO：4或另一同源α-淀粉酶的相应位置的R181*/G182*/N195F。所述变体可能还包括在位置E216Q的取代。
在pH8-10.5，AAI-10和AAI-6变体的提高的Ca2 + 稳定性
提高的Ca2+稳定性指在Ca2+耗尽的情况下，所述酶的稳定性提高。本文中就达到提高在高pH的Ca2稳定性而言，重要的突变(包括氨基酸取代和缺失)包括在上述“提高的热稳定性”节中公开的突变和/或缺失。
本发明的一般突变
优选本发明的变体在上述突变外还含有一个或多个修饰。因此，有利的是在α-淀粉酶变体被修饰的部分中一个或多个脯氨酸被任何天然非脯氨酸残基取代，优选被丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸或亮氨酸取代。
类似地，优选将用以修饰亲本α-淀粉酶的氨基酸残基中的一个或多个半胱氨酸用非半胱氨酸残基例如丝氨酸、丙氨酸、苏氨酸、甘氨酸、缬氨酸或亮氨酸取代。
此外，可以对本发明变体进行修饰，可以仅仅进行某一修饰或者与上述修饰组合进行修饰，以便使对应于SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的氨基酸片段190-214的氨基酸片段分别被Asn和/或Gln取代。在α-淀粉酶中，还可以用Arg取代对应于SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的氨基酸片段190-214中的一个或多个Lys残基。
应理解本发明包括掺入两个或多个上述修饰的变体。
此外，还可以在本文所述的任何变体中导入点突变。
本发明的突变适宜地包括在下列位置的突变：Y135、V17、M202、I214。
克隆编码α-淀粉酶的DNA序列
用本领域熟知的各种方法，从生产所述α-淀粉酶的任何细胞或微生物中可分离编码上述亲本α-淀粉酶的DNA序列。首先应用来自产生所述α-淀粉酶的生物体的染色体DNA或信使RNA构建基因组DNA和/或cDNA文库。然后，如果所述α-淀粉酶的氨基酸序列是已知的，则可合成同源、标记的寡核苷酸探针并用于从制备自所研究生物的基因组文库中鉴定编码α-淀粉酶的克隆。或者，利用较低严紧度的杂交和洗涤条件，可用含有与已知α-淀粉酶基因同源之序列的标记的寡核苷酸探针作为探针鉴定编码α-淀粉酶的克隆。
用于鉴定编码α-淀粉酶克隆的另一种方法是将基因组DNA片段插入到表达载体，例如质粒中，用所得基因组DNA文库转化α-淀粉酶阴性菌，然后将转化的细菌铺在含α-淀粉酶底物的琼脂上，由此鉴定标的α-淀粉酶的克隆。
或者，通过已确立的标准方法，例如通过S.L.Beaucage和M.H.Caruthers所述的亚瞵酰胺法(1981)或者Matthes等(1984)所述的方法合成制备编码所述酶的DNA序列。在亚瞵酰胺方法中，用例如自动DNA合成仪合成寡核苷酸，纯化、退火、连接，然后克隆到适宜的载体中。
最后，所述DNA序列可以是按照标准技术通过连接合成的、基因组的或cDNA序列而制备的基因组和合成序列的混合序列、合成序列与cDNA序列的混合序列或者基因组和cDNA的混合序列(根据需要，对应于完整DNA序列各部分的片段)。还可通过聚合酶链反应(PCR)，用特定的引物，例如按US4683202或R.K.Saiki等(1981)所述制备DNA序列。
定点诱变
分离了编码α-淀粉酶的DNA序列并鉴定了合乎要求的突变位点后，用合成的寡核苷酸导入突变。这些寡核苷酸含有位于所需突变位点侧的核苷酸序列；在寡核苷酸合成的过程中插入突变核苷酸。在具体的方法中，在携带α-淀粉酶基因的载体中产生跨编码α-淀粉酶序列的单链DNA缺口。然后，将携带所需突变的合成核苷酸与单链DNA的同源部分退火。用DNA聚合酶I(Klenow片段)填平剩余缺口，用T4连接酶连接构建体。Morinaga等(1984)描述了该方法的具体实施例。US4760025公开了通过对表达盒进行微小改变来导入编码多个突变的寡核苷酸。但是，通过Morinaga方法可以在任何时间导入更多种的突变，因为可以导入不同长度的众多寡核苷酸。
Nelson和Long(1989)描述了另一种将突变导入编码α-淀粉酶的DNA序列的方法。该方法包括经3步产生PCR片段，该片段含有通过用化学合成的DNA链作为PCR反应中的一个引物而导入的所需突变。通过用限制核酸内切酶裂解从PCR-产生的片段中分离携带突变的DNA片段，然后再插入到表达质粒中。
随机诱变
在翻译成所需氨基酸序列的基因的至少3个部分中或整个基因内按照定位或区域特异性随机诱变适宜地完成随机诱变。
用本领域已知的任何方法均可方便地完成对编码亲本α-淀粉酶的DNA序列的随机诱变。
就上述而言，本发明的另一方面涉及产生亲本α-淀粉酶之变体的方法，例如其中所述变体与所述亲本相比具有改变或提高的热稳定性，所述方法包括：
(a)对编码亲本α-淀粉酶的DNA序列进行随机诱变，
(b)在宿主细胞中表达步骤(a)中得到的突变DNA序列，和
(c)筛选表达与亲本α-淀粉酶相比具有改变之特性(例如热稳定性)的α-淀粉酶变体的宿主细胞。
本发明上述方法的步骤(a)优选用掺杂的(doped)引物完成。
例如，用适宜的物理或化学诱变剂、适宜的寡核苷酸或者使DNA序列经PCR产生的诱变可以完成随机诱变。此外，利用这些诱变剂的任何组合也可以完成随机诱变。诱变剂例如可以是诱导产生转换、颠换、倒置、转频(scrambling)、缺失和/或插入的那些。
存在所选诱变剂的情况下，在适宜发生诱变的条件下，然后筛选具有所需特性的突变DNA。
当用寡核苷酸完成诱变时，在合成所述寡核苷酸的过程中，在待改变的位置，所述寡核苷酸可掺杂或掺加(spike)3个非亲本核苷酸。可以进行掺杂或掺加以便避免不想要氨基酸的密码子。通过任何公开的技术，例如用PCR、LCR或任何适宜的DNA聚合酶和连接酶可将掺杂或掺加的寡核苷酸掺入编码α-淀粉酶的DNA中。
优选用“恒定随机掺杂”完成掺杂，其中预先确定在各位置的野生型和突变百分比。此外，掺杂可以是直接优先导入特定核苷酸，因此而优先导入一种或多种特异性氨基酸残基。掺杂可以是例如使得在各位置导入90％野生型和10％突变。在选择掺杂方案时的其他考虑是基于遗传和蛋白质结构的限制。可利用DOPE程序(参见“材料和方法”节)设计掺杂方案，特别是确保避免导入终止密码子。
当使用PCR-产生的诱变时，可在增加核苷酸错误掺入的条件下，对经化学处理或未经处理的编码亲代α-淀粉酶的基因进行PCR(Deshler 1992；Leung等，技术，Vol.1，1989，pp.11-15)。
可使用大肠杆菌(Fowler等，Molec.Gen.Genet.，133，1974，pp.179-191)，酿酒酵母或任何其它微生物的增变株对编码α-淀粉酶的DNA进行随机诱变，诱变方法包括例如：将含有亲代糖基酶的质粒转化至增变株，培养含有质粒的增变株，从增变株中分离突变的质粒。随后，将突变的质粒转化至表达生物。
待诱变的DNA序列可以方便地存在于基因组或cDNA文库中，所述文库生产自表达亲代α-淀粉酶的生物。或者，DNA序列可以存在于适当的载体，如质粒或噬菌体上，再与诱变剂一起保温或要不然暴露于诱变剂中。待诱变的DNA也可存在于宿主细胞中，或者整合于所述细胞的基因组中，或者存在于细胞所携带的载体上。最后，待诱变的DNA也可以是分离的形式。应理解接受随机诱变的DNA序列优选为cDNA或基因组DNA序列。
在某些情况下可于实施表达步骤b)或筛选步骤c)前方便地扩增突变的DNA序列。可根据本领域已知的方法进行扩增，本发明优选的方法是：使用根据亲代酶的DNA或氨基酸序列生产的寡核苷酸引物进行PCR扩增。
与诱变剂保温或暴露于诱变剂之后，通过在允许发生表达的条件下培养携有突变DNA序列的适当宿主细胞来表达突变的DNA。用于此目的的宿主细胞可以是被突变的DNA序列(任选其存在于载体上)转化的宿主细胞，或者是在诱变处理的过程中携有编码亲代酶的DNA序列的宿主细胞。适当宿主细胞的例子如下：革兰氏阳性细菌，如枯草芽孢杆菌，地衣芽孢杆菌，迟缓芽孢杆菌，短芽孢杆菌，嗜热脂肪芽孢杆菌，嗜碱芽孢杆菌，解淀粉芽孢杆菌，凝结芽孢杆菌，环状芽孢杆菌，灿烂芽孢杆菌，巨大芽孢杆菌，苏云金芽孢杆菌，浅青紫链霉菌或鼠灰链霉菌；和革兰氏阴性细菌，如大肠杆菌。
突变的DNA序列可进一步含有能使突变的DNA序列表达的DNA序列。
定域随机诱变
随机诱变可有利地定域于所述亲代α-淀粉酶的一部分。例如，当酶的某些区域被鉴定为对酶的给定特性特别重要时，以及当预期修饰能导致具有改良特性的变体时，定域随机诱变较为有利。当亲代酶的三级结构已被阐明，且所述结构与酶的功能相关时，一般可鉴定出所述区域。
通过使用上述的PCR产生的诱变技术或本领域已知的任何其它适当的技术，可以方便地进行定域的或区域-特异性的随机诱变。或者，通过例如插入适当的载体来分离编码待修饰的DNA序列部分的DNA序列，随后可使用上述任何诱变方法对所述部分进行诱变。
提供α-淀粉酶变体的其它方法
提供α-淀粉酶变体的其它方法包括本领域已知的基因改组方法，所述方法包括例如WO 95/22625(Affymax Technologies N.V.)和WO96/00343(Novo Nordisk A/S)所述的方法。
表达本发明的α-淀粉酶变体
根据本发明，可使用表达载体，以酶的形式表达通过上述方法，或通过本领域已知的任何其它方法产生的编码变体的DNA序列，所述表达载体一般包括编码启动子，操纵子，核糖体结合位点，翻译起始信号的控制序列，并任选包括阻抑基因或多种激活基因。
携有编码本发明α-淀粉酶变体的DNA序列的重组表达载体可以是能对其方便地进行重组DNA操作的任何载体，载体的选择经常取决于导入该载体的宿主细胞。因此，载体可以是自我复制的载体，即作为染色体外实体存在的载体，所述载体的复制独立于染色体的复制，所述载体包括例如质粒，噬菌体或染色体外元件，微型染色体或人工染色体。或者，载体可以是当导入宿主细胞时可以整合至宿主细胞基因组，并与整合了该载体的染色体一起复制的载体。
在载体中，DNA序列应该与适当的启动子序列可操作相连。启动子可以是在选定宿主细胞中显示出转录活性的任何DNA序列，启动子可以得自编码与宿主细胞同源或异源之蛋白质的基因。介导编码本发明α-淀粉酶变体之DNA序列转录，尤其是在细菌宿主中的转录的适当启动子的例子是：大肠杆菌lac操纵子的启动子，天蓝色链霉菌琼脂酶基因dagA启动子，地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)启动子，嗜热脂肪芽孢杆菌产麦芽糖淀粉酶基因(amyM)启动子，解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶(amyQ)启动子，枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因的启动子等。为了在真菌宿主中转录，有用的启动子的例子是得自编码下列酶的基因的启动子：米曲霉TAKA淀粉酶，米赫根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶，黑曲霉中性α-淀粉酶，黑曲霉酸稳定的α-淀粉酶，黑曲霉葡糖淀粉酶，米赫根毛霉脂肪酶，米曲霉碱性蛋白酶，米曲霉丙糖磷酸异构酶或构巢曲霉乙酰胺酶。
本发明的表达载体也含有适当的转录终止子，在真核生物中，还含有与编码本发明α-淀粉酶变体的DNA序列可操作相连的聚-腺苷酸化序列。终止和聚腺苷酸化序列可适当地得自与启动子相同的来源。
载体可进一步含有能使载体在所述宿主细胞中复制的DNA序列。所述序列的例子是质粒pUC19，pACYC177，pUB110，pE194，pAMB1和pIJ702的复制起点。
载体也可含有选择标记，例如其产物可以补偿宿主细胞缺陷的基因，如枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因，或能赋予抗生素抗性的基因，所述抗生素抗性如氨苄青霉素，卡那霉素，氯霉素或四环素抗性。另外，载体可含有曲霉属选择标记，如amdS，argB，niaD和sC，产生潮霉素抗性的标记，或者可通过WO 91/17243中所述的共-转化来完成选择。
尽管细胞内表达在某些方面(例如当使用某些细菌作为宿主细胞时)有利，但一般优选在细胞外进行表达。通常，本文所述的芽孢杆菌α-淀粉酶含有允许表达的蛋白酶分泌至培养基的前区。必要时，该前区可被不同的前区或信号序列取代，通过取代编码各个前区的DNA序列可以方便地实现此目的。
分别连接编码α-淀粉酶变体的本发明DNA构建体，启动子，终止子和其它元件，并将它们插入含有复制所需信息的适当载体的方法是本领域技术人员众所周知的(参见例如Sambrook等，分子克隆：实验室手册，第2版，冷泉港，1989)。
含有上文所定义的本发明DNA构建体或表达载体的本发明细胞可以有利地用作宿主细胞，以重组产生本发明的α-淀粉酶变体。可以方便地通过将编码变体的本发明DNA构建体(一个或多个拷贝)整合至宿主染色体，用所述DNA构建体转化细胞。一般认为整合是有利的，因为整合后DNA序列可以在细胞中更加稳定地维持。根据常规方法，例如通过同源或异源重组可以将DNA构建体整合至宿主染色体。或者，可用与不同类型的宿主细胞有关的上述表达载体转化细胞。
本发明的细胞可以是高等生物，如哺乳动物或昆虫的细胞，但优选其为微生物细胞，例如细菌或真菌(包括酵母)细胞。
适宜细菌的实例是革兰氏阳性菌例如枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、缓慢芽孢杆菌、短芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、变青链霉菌或鼠灰链霉菌，或革兰氏阴性菌例如大肠杆菌。例如通过原生质体转化或用本身已知的方法用感受态细胞完成细菌的转化。
酵母生物最好是选自糖酵母属或裂殖糖酵母属，例如啤酒酵母。丝状真菌有利的是属于曲霉属，例如米曲霉或黑曲霉。用本身已知的方法通过与原生质体形成和原生质体转化然后使细胞壁再生的过程可以转化真菌细胞。在EP238023中描述了用于转化曲霉宿主细胞的适宜方法。
在另一方面，本发明涉及生产本发明α-淀粉酶变体的方法，该方法包括在有利于所述变体生产的条件下培养上述宿主细胞，然后从细胞和/或培养基中回收所述变体。
用于培养所述细胞的培养基可以是适宜所研究的宿主细胞生长并使本发明α-淀粉酶变体表达的任何常规培养基。适宜的培养基可从供应商处购买或按照公开的方法(例如按美国典型培养物收集中心目录中所述)制备。
用熟知的方法，包括离心或过滤从培养基中分离细胞，然后用盐例如硫酸铵沉淀培养基中的蛋白质组分，然后用层析例如离子交层析、亲和层析等可以从培养基中方便地回收从宿主细胞分泌的α-淀粉酶变体。
核酸序列
本发明还涉及编码本发明多肽的分离的核酸序列。在优选的实施方案中，所述核酸序列列于SEQ ID NO：1。在另一更优选的实施方案中，所述核酸序列是分别在质粒pLIH1300(AAI6)或质粒LiH1298(AAI10)中所含的序列，所述质粒分别含于大肠杆菌DSM12763和大肠杆菌DSM12762中。在另一优选的实施方案中，所述核酸序列是SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的成熟多肽编码区。本发明还包括编码具有SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4之氨基酸序列的多肽的核酸序列，该核酸序列因遗传密码简并性而与SEQID NO：1或SEQ ID NO：3有所不同。本发明还涉及分别编码SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4之片段的具有α-淀粉酶活性的SEQ ID NO：1或SEQ IDNO：3的亚序列。
SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的亚序列是由SEQ ID NO：1或SEQ IDNO：3所包括的核酸序列，不同的是已缺失了5’和/或3’末端的一个或多个核苷酸。
本发明还涉及在SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3成熟多肽的编码序列中包括至少一个突变的突变核酸序列，其中突变核酸序列编码一种由SEQID NO：2或SEQ ID NO：4的1至485位氨基酸组成的多肽。
用于分离或克隆编码多肽的核酸序列的技术是本领域已知的并且包括从基因组DNA中分离、由cDNA生产或其组合。从所述基因组cDNA中克隆本发明核酸序列可以通过，例如，采用已知的聚合酶链反应(PCR)或用抗体筛选表达文库来检测具有共享结构特征的克隆的DNA片段。见，例如Innis等，1990，PCR：方法及应用指南，学院出版社，纽约。可以采用其它的核酸扩增方法如连接酶链反应(LCR)，连接激活转录(LAT)和基于核酸序列的扩增反应(NASBA)。核酸序列可以从芽孢杆菌的菌株或另外一种或有关的生物克隆，因此，例如，其可以是核酸序列的多肽编码区域的等位变体或种特异性变体。
本文所述的术语“分离的核酸序列”指基本不含其它核酸序列的核酸序列，例如，由琼脂糖凝胶电泳测定的至少约20％的纯度，优选至少约40％的纯度，更优选至少约60％的纯度，甚至更优选至少约80％的纯度，最优选至少约90％的纯度。例如，通过基因工程中使用的标准克隆方法获得一种分离的核酸序列，以便将所述核酸序列从它的天然位置重新定位到它将被复制的另一位点上。克隆方法包括切割和分离含有编码所述多肽之核酸序列的所需核酸片段，将该片段插入载体分子，将重组载体掺入宿主细胞，使所述核酸序列的多拷贝或克隆在该宿主细胞中复制。核酸序列可以是基因组、cDNA、RNA、半合成的、合成来源或其任意组合。
编码所述酶的DNA序列的同源性
本发明还涉及与SEQ ID NO：1(即核苷酸1-1458)或SEQ ID NO：3(即核苷酸1-1458)的成熟多肽编码序列在DNA水平上有至少约85％同源性、优选约90％、更优选约93％、更优选约95％、甚至更优选约97％，最佳约99％同源性并编码活性多肽的核酸序列。
根据表明第一个序列衍生于第二个序列的两个序列间的同一性程序可以确定DNA序列同源性。用本领域已知的计算机程序例如在GCG程序包中提供的GAP(上述)可适当地确定同源性。因此，可将Gap GCGv8与下列缺省参数一起使用：5.0的GAP产生罚分和0.3的GAP延伸罚分，缺损评分矩阵。GAP使用Needleman/Wunsch/Sellers的方法产生排列。
编码本发明的多肽的核酸序列的修饰对于合成与所述多肽基本类似的多肽可能是必需的。术语与所述多肽“基本类似”指所述多肽的非天然存在形式。这些多肽的某些改造方式不同于从其自然来源分离到的多肽，例如，比活性、热稳定性、PH最适值等方面不同的变体。可以根据SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的多肽编码部分例如，其亚序列，的核酸序列来构建变体序列，和/或通过引入不产生所述核酸序列编码多肽的另一种氨基酸序列，但对应于用来生产所述酶的宿主生物的密码子利用特点的核苷酸置换，或者通过引入产生另一种氨基酸序列的核苷酸置换。关于核苷酸置换的一般描述，例见，Ford等，1991，蛋白质表达和纯化2：95-107.
本领域技术人员显而易见，这种置换可以在对分子功能关键的区域外进行并且仍能产生活性肽。本发明分离的核酸序列所编码多肽的活性必需的，因而优选不进行置换的氨基酸序列，可以按照本领域已知的方法进行鉴定，如定点诱变或丙氨酸-扫描诱变(例见，Cunningham和Wells，1989，科学244：1081-1085)。在后一技术中，在分子中的每一个带正电荷的残基处引入突变，并检测所得突变体分子的[酶]活性来鉴别对该分子活性起关键作用的氨基酸残基。底物-酶相互作用的位点还可以通过三维结构的分析来测定，所述三维结构是通过诸如核磁共振分析、结晶学或光亲和标记技术测定的(例见，de Vos等，1992，科学255：306-312；Smith等，1992，分子生物学杂志244：899-904；Wlodaver等，1992，FEBS Letters 309：59-64)。
本发明还涉及分离的编码本发明多肽的核酸序列，该核酸序列在中等严谨条件下，优选在中等偏高严谨条件下，更优选在高度严谨条件下，和最优选非常高度的严谨条件下与在同样条件下与本文所定义的SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的核酸序列或其互补链；或其等位变体及其亚序列杂交的核酸探针杂交(Sambrook等，1989，出处同上)。
本发明还涉及分离的编码本发明多肽或其本文所述的等位基因变体和其亚序列的核酸序列，该核酸序列在中等严谨条件下，优选在中等偏高严谨条件，更优选高严谨条件，最佳很高严谨条件下与核酸探针杂交，所述探针在相同的条件下与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3或其互补链的核酸序列杂交(Sambrook等1989，同上文)。
本发明还涉及通过(a)在中、中等偏高、高或很高严谨条件下DNA与SEQID NO：1或SEQ ID NO：3的序列或其互补链或其亚序列杂交；和(b)分离核酸序列而产生的分离的核酸序列。所述亚序列优选甚至少100个核苷酸的序列，例如编码具有α-淀粉酶活性的多肽片段的序列。
产生突变核酸序列的方法
本发明进一步涉及生产突变的核酸序列的方法，包括将至少一个突变引入SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的成熟多肽编码序列或其亚序列中，其中突变的核酸序列编码一种由SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的1至485位或其具有α-淀粉酶活性的片段组成的多肽。
为了将突变引入核酸序列以便使一个核苷酸换为另一个核苷酸，可以通过本领域中任何已知方法经定点诱变来完成。特别有用的是利用具有所需插入片段的超螺旋双链DNA载体和两个具有所需突变的合成引物的方法。每一与载体的相对链互补的寡聚核苷酸引物在采用了pfu DNA聚合酶的循环变温过程中延伸。通过引物的结合，产生了含有交错切口的突变质粒。循环变温后，用对甲基化和半甲基化DNA特异的DpnI处理产物，以便消化亲代DNA模板并选出含有突变的合成DNA。也可以采用本领域其它已知的方法。其它那些方法包括基因改组，例如，WO95/22625所述(来源于Affymax Technologies N.V.)和WO96/00343所述(来源于Novo NordiskA/S)。
核酸构建体
本发明还涉及含有本发明核酸序列并使其可操作性地连接一个或多个控制序列的核酸构建体，所述控制序列指导编码序列在与控制序列相匹配地条件下于合适的宿主细胞中进行表达。表达应当理解为包括任何多肽产生的步骤，其包括，但不限于，转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。
本文中“核酸构建体”被定义为单链-或双链的核酸分子，其分离自天然基因或经修饰而含有以非天然方式组合和连接的核酸片段的基因。当核酸构建体含有本发明编码序列的表达所需的全部控制序列时，术语“核酸构建体”是术语“表达盒”的同义词。术语“编码序列”在本文中被定义为核酸序列的一部分，其直接确定了其蛋白产物的氨基酸序列。编码序列的界限通常通过核糖体结合位点(原核生物)或通过紧邻mRNA5’端开放读框上游的ATG起始密码子(真核生物)和紧邻mRNA3’端开放读框下游的转录终止子序列来确定。编码序列可以包括，但不限于，DNA、cDNA和重组核酸序列。
编码本发明多肽的核酸序列可用多种方式处理以便多肽表达。根据表达载体的不同，有时优选或必需在插入载体前对核酸序列进行操作。利用重组DNA方法修饰核酸序列的技术是本领域已知的。
术语“控制序列”在本文中被定义为包括表达本发明多肽所需或有利的所有组件。每一控制序列可以是编码所述多肽之核酸序列固有的或外来的。这种控制序列包括，但不限于，前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。至少，所述控制序列包括启动子和转录和翻译终止信号。控制序列可以含有用于引入特定限制位点的接头，以便于控制序列与编码多肽的核酸序列的编码区进行连接。术语“可操作性地连接”在这里被定义为一种构型，其中控制序列被置于相对于DNA序列的编码序列的适当位置，以便于控制序列能指导多肽的表达。
启动子序列
控制序列可以是适当的启动子序列，即由表达所述核酸序列的宿主细胞识别的核酸序列。启动子序列含有介导所述多肽表达的转录控制序列。启动子可以是在所选宿主细胞中显示转录活性的任何核酸序列，包括突变型、截短型和杂交型启动子，并且可以从编码与宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因中获得。
指导本发明核酸构建体转录，尤其是在细菌宿主中的转录的适当启动子有：大肠杆菌lac操纵子的启动子，天蓝色链霉菌琼脂糖酶基因(dagA)，枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、嗜热脂肪芽孢杆菌产麦芽淀粉酶基因(amyM)、解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penp)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因，和原核生物β-内酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等，1978，美国国家科学院学报75：3727-3731)的启动子，以及tac启动子(DeBoer等，1983，美国国家科学院学报80：21-25)。其它启动子见“来源于重组细菌的有用蛋白质”，Scientific American，1980，242：74-94；和在Sambrook等，1989，出处同上。
终止子序列
控制序列也可以是适当的转录终止子序列，其被宿主细胞识别后终止转录。终止子序列可操作性地连接到编码所述多肽的核酸序列的3’端。在所选宿主细胞中具有功能的任何终止子都可用于本发明。
信号肽
控制序列也可以是编码连接到多肽氨基末端之氨基酸序列并指导该编码多肽进入细胞分泌途径的信号肽-编码区。核酸序列的编码序列5’端可天然含有与编码区片段天然连接于一个翻译读框中的信号肽-编码区，其编码分泌型多肽。或者，编码序列5’端可以含有一个相对该编码区外来的信号肽-编码区。当编码序列并非天然含有信号肽-编码区时，就需要外来的信号肽-编码区。另外，可将外来信号肽-编码区简单地取代天然信号肽-编码区以增强多肽的分泌。然而，任何指导表达的多肽进入所选细胞分泌途径的信号肽-编码区都可用于本发明。
对细菌宿主细胞有效的信号肽-编码区是从枯草杆菌NCIB 11837产麦芽淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草蛋白酶、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)和枯草芽孢杆菌prsA的基因中获得的信号肽-编码区。另外的信号肽如Simonen和Palva，1993，微生物学综述(Microbiological Reviews)：57：109-137中所述。
调控系统
此外还优选添加调控序列，其可调节所述多肽相对于宿主细胞之生长的表达。调控系统的实例是使基因应答化学或物理刺激，包括调控化合物的存在而开启或关闭表达的那些。原核系统中的调控系统包括lac、tac、和trp操纵子系统。在酵母中，可以使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，TAKAα-淀粉酶启动子、黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、和米曲霉葡糖淀粉酶启动子可作为调控序列使用。调控序列的其它实例是允许基因扩增的那些。在真核系统中，这些包括在有氨甲蝶呤存在时被扩增的二氢叶酸还原酶基因，和有重金属时被扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码多肽的核酸序列与调控序列可操作性地连接。
表达载体
本发明还涉及含有本发明的核酸序列、启动子和转录及翻译终止信号的重组表达载体。可将上述各种核酸和调控序列连接在一起以生产一种重组表达载体，使其包含一个或多个方便的限制位点，所述位点能允许编码多肽的核酸序列在这类位点插入或置换。或者，本发明的核酸序列可以通过将该核酸序列或含有该核酸序列的核酸构建体插入适当表达载体来表达。在创建表达载体的过程中，可使编码序列在表达载体中与适当调控序列可操作性地连接以便表达。
重组表达载体可以是任何载体(例如，质粒或病毒)，其可方便地进行重组DNA操作并且能使核酸序列表达。载体的选择将主要决定于载体与引入了该载体的宿主细胞之间的相容性。载体可以是线性或闭合环状质粒。
载体可以是自主复制载体，即以染色体外实体形式存在的载体，其复制独立于染色体的复制，例如质粒，染色体外元件，小染色体(minichrmosome)或人工染色体。载体可含有任何确保自我复制的手段。或者，载体可以是引入宿主细胞后整合到基因组中并与其整合的染色体一起复制的那种。此外，可使用单个载体或质粒，或一起含有待引入宿主细胞基因组中的全长DNA的两个或更多个载体或质粒，或转座子。
本发明的载体优选含有一个或多个选择性标记，其能容易地选择出转化细胞。一个选择性标记是一种基因，其产物能提供对杀生物剂或病毒的抗性、对重金属的抗性、原养型至营养缺陷型的转变等。细菌选择性标记的实例是来源于枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因，或赋予了抗生素抗性如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素抗性的标记。适合于酵母宿主细胞的标记是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于在丝状真菌细胞中使用的可筛选标志可以选自，但不限于，amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰转移酶)、bar(膦丝菌素乙酰转移酶)、hygB(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清苷-5′-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷酰转移酶)和trpC(邻氨基苯甲酸合成酶)，及它们的等同物。优选用于曲霉细胞中的为构巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG基因以及吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的bar基因。
本发明的载体优选含有使所述载体可以稳定整合到宿主细胞基因组中或者可以在细胞中不依赖于细胞的基因组而自我复制的元件。。
为了整合到宿主细胞基因组中，所述载体可依赖于编码多肽的核酸序列或载体上任何其他元件来通过同源或非同源重组而稳定整合到基因组中。或者，载体可能含有其它核酸序列，这些序列可指导通过同源重组整合进入宿主细胞基因组。其他核酸序列能够在染色体的精确位置使载体整合到宿主细胞基因组中。为了提高在精确位置整合的可能性，整合元件应优选含有足够量的与相应靶序列高度同源的核酸，例如100-1500个碱基对，优选400-1500个碱基对，最佳800-1500个碱基对，以便提高同源重组的可能性。整合元件可以是与宿主细胞基因组中的靶序列同源的任何序列。此外，整合元件还可以是非编码的或编码的核酸序列。另一方面，通过非同源重组可将载体整合到宿主细胞的基因组中。
为了进行自主复制，所述载体还可含有能够使载体在所研究的宿主细胞中自主复制的复制原点。细菌复制原点是实例是使载体可以在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184的复制原点，使载体可以在芽孢杆菌中复制的pUB110、pE194、pTA1060和pAMβ1的复制原点。用于酵母细胞的复制原点的实例是2μ复制原点、ARS1、ARS4、ARS1和CEN3的组合，ARS4和CEN6的组合。复制原点可以是带有突变的复制原点，所述突变可以使其在宿主细胞中发挥温度敏感性的作用(参见例如Ehrlich，1978，Proceedings of the National Academy of Sciences USA75：1433)。
可将多于一个拷贝的本发明核酸序列插入到宿主细胞中以提高基因产物的产率。通过将至少一个以上其它拷贝的序列整合到宿主细胞基因组中或者通过包括可扩增选择性标记基因与所述核酸序列，其中通过在存在适宜选择性标记的条件下列培养含扩增拷贝的选择性标记基因，由此增加了核酸序列的拷贝数的细胞可筛选所述细胞，这样可以使核酸序列拷贝数增加。
用于连接上述元件以构建本发明重组表达载体的方法是本领域技术人员熟知的(参见例如Sambrook等，1989，同上文)。
宿主细胞
本发明还涉及含有本发明核酸序列的重组宿主细胞，其优选在多肽的重组生产中使用。将含有本发明核酸序列的载体引入宿主细胞中，使载体以上述染色体整合体的形式或自我复制的染色体外载体的形式维持。术语“宿主细胞”包括亲代细胞的因在复制过程中发生突变而不同于亲代细胞的任何子代。对宿主细胞的选择很大程度上决定于编码所述多肽的基因和它的来源。
宿主细胞可以是单细胞微生物，例如原核生物，或非单细胞微生物，例如真核生物。
有用的单细胞是细菌细胞如革兰氏阳性细菌包括，但不局限于，芽孢杆菌，例如嗜碱性芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、Bacillus clausii、凝结芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌；或链霉菌细胞，例如，浅青紫链霉菌或鼠灰链霉菌，或革兰氏阴性细菌如大肠杆菌和假单胞菌。在一个优选的实施方案中，细菌宿主细胞是迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌细胞。在另一个优选的实施方案中，芽孢杆菌细胞是嗜碱性芽孢杆菌。
将表达载体引入细菌宿主细胞可通过原生质体转化(例见，Chang和Cohen，1979，分子普通遗传学168：111-115)，通过利用感受态细胞(例见，Young和Spizizin，1961，细菌学杂志81：823-829，或Dubnau和Davidoff-Abelson，1971，分子生物学杂志56：209-221)，通过电穿孔(例见，Shigekawa和Dower，1988，生物技术6：742-751)，或通过接合作用(例见，Koehler和Thorne，1987，细菌学杂志169：5771-5278)而实现。
生产方法
本发明还涉及生产本发明多肽的方法，其包括(a)培养在野生型时能产生所述多肽的菌株以产生含有所述多肽的上清液；和(b)回收所述多肽。优选所述菌株为芽孢杆菌属的菌株。
本发明还涉及生产本发明多肽的方法，其包括(a)在益于产生所述多肽的条件下培养宿主细胞；和(b)回收所述多肽。
本发明还涉及生产本发明多肽的方法，其包括(a)在益于产生所述多肽的条件下培养宿主细胞，其中该宿主细胞含有在SEQ ID NO：1或SEQ IDNO：3的成熟多肽编码区有至少一个突变的突变性核酸序列，其中该突变型核酸序列编码SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的1至485位氨基酸组成的多肽；和(b)回收所述多肽。
组合物
另一方面，本发明涉及含有本发明的α-淀粉酶或其变体的组合物。优选所述组合物富含本发明的α-淀粉酶或其变体。在本文中，术语“富含”表示组合物的α-淀粉酶活性增加了，例如，具有1.1的增强系数。
该组合物可含有本发明的多肽作为主要酶组分，例如，单组分组合物。或者，该组合物可含有多种酶活性，如氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、壳多糖酶、角化酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-糖苷酶、β-糖苷酶、卤过氧化物酶(haloperoxidase)、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶分解酶、肽谷氨酰胺酶(peptidoglutaminase)、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶或木聚糖酶。附加酶可利用下列微生物来生产，所述微生物属于曲霉属，优选棘孢曲霉、泡盛曲霉、黑曲霉或米曲霉，或木霉属，腐质霉属，优选Humicola insolens，或镰孢属，优选杆孢状镰孢、Fusarium cerealis、Fusarium crookwellense、大刀镰孢、禾谷镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖孢镰孢、多枝镰孢、玫瑰色镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、硫色镰孢、Fusarium toruloseum、Fusariumtrichothecioides或Fusarium venenatum。
所述多肽组合物可以按照本技术领域已知的方法来生产并且可以是液体或干组合物的形式。例如，多肽组合物可以是粒状或微粒状的形式。含在组合物中的多肽可以按照本技术领域已知的方法使之稳定。
下面给出了本发明多肽组合物的优选用途实例。本发明多肽组合物的用量和使用组合物的其它条件可以根据本领域已知的方法来确定。
工业应用性
由于在碱性pH时的活性，本发明的α-淀粉酶能良好适用于各种工业方法，尤其是所述酶发现了作为洗涤剂成分，例如，洗衣、洗碗和坚硬表面洗涤剂组合物的潜在用途，但它也可以用于使纺织品、织物和衣服退浆，啤酒制作或酿造，在纸浆和纸生产中应用，并进一步在从淀粉或全谷物中生产增甜剂和乙醇(如燃料、饮料和工业酒精)的过程中应用。
淀粉转化
常规的淀粉-转化方法，如液化和糖化方法在，例如美国专利3912590和欧洲专利申请252730和63909中进行了描述，此处引入作为参考。
纸浆和纸的生产
本发明的碱性α-淀粉酶也可在从淀粉增强的废纸和纸板生产木质素纤维素材料如纸浆、纸和硬纸板的过程中应用，尤其当在pH7以上发生再制浆以及当淀粉酶通过增强型淀粉的降解而促进废料的分解时。本发明的α-淀粉酶尤其适用于由淀粉-涂裹的印刷纸生产造纸纸浆的过程。所述过程可以按照WO95/14807所述进行，包括以下步骤：
a)分解纸来产生纸浆，
b)在步骤a)之前、期间、之后用-淀粉降解酶进行处理，和
c)在步骤a)和b)后从纸浆分离墨汁颗粒。
本发明的α-淀粉酶也非常适用于当经酶修饰的淀粉与碱性填充剂如碳酸钙、陶土和粘土一起被用于造纸时修饰淀粉。采用本发明的碱性α-淀粉酶，使得有可能在有填充剂存在的条件下修饰淀粉，并因此允许较简单的整合方法(integrated process)。
使纺织品、织物和衣物退浆
本发明的α-淀粉酶也非常适用于纺织品、织物和衣物的退浆。在纺织品加工工业中，α-淀粉酶通常作为退浆过程中的助剂使用以利于含淀粉胶料的去除，这种胶料在纺织过程中充当纬纱的保护层。在纺织后彻底去除胶料层对于确保在后续加工(即织物的洗刷、漂白和染色)中得到最佳结果非常重要。酶解淀粉因不涉及对纤维材料的任何损坏，故为优选。为了降低加工成本和提高工厂的生产能力，有时将退浆过程与洗刷和漂白步骤结合到一起。在这种情况下，通常用非酶助剂如碱或氧化剂降解淀粉，因为传统的α-淀粉酶与高pH值和漂白剂不能很好地相容。由于使用了破坏性强的化学剂，淀粉浆料的非酶性降解确实导致某种程度的纤维损坏。因此，由于本发明的α-淀粉酶在碱性溶液中具有改进的性能，所以使用本发明的α-淀粉酶将是理想的。α-淀粉酶可以单独使用或在含有纤维素的纤维或纺织品退浆时与纤维素酶结合使用。
退浆和漂白方法在本领域是已知的。例见WO95/21247，美国专利4643736，EP119920，这里引进作为参考。
市售退浆产品有Novo Nordisk A/S的和
Figure C00807805D00332
啤酒制作
本发明的α-淀粉酶还可有效用于啤酒的制作加工；所述α-淀粉酶通常在磨碎(mashing)过程中加入。
洗涤剂组合物
可将本发明的酶加入洗涤剂组合物并因此使之成为其中的组分。
本发明的洗涤剂组合物可以例如配成手洗或机洗的洗涤剂组合物，该组合物包括一种适于脏织物预处理的洗衣添加剂组合物和一种增加织物柔软度的漂洗组合物，或者配成一种用于一般家用坚硬表面清洁操作的洗涤剂组合物，或者配成手或机器洗碗操作中使用的洗涤剂。
在一个具体方面，本发明提供一种含有本发明的酶的洗涤剂添加剂。所述洗涤剂添加剂和洗涤剂组合物可以含有一种或多种其它的酶如蛋白酶、脂肪酶、角质酶(cutinase)、淀粉酶、糖酶、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶，例如漆酶和/或过氧化物酶。
通常所选酶的特性应当与所选洗涤剂相容，(即，pH最适值，同其它酶组分和非酶组分的相容性等)，并且所述酶应当以有效量存在。
蛋白酶：合适的蛋白酶包括动物、植物或微生物来源的蛋白酶。优选微生物来源。化学修饰型或蛋白质工程化的突变体也可包括在内。蛋白酶可以是丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶，优选碱性微生物蛋白酶或胰蛋白酶样蛋白酶。碱性蛋白酶的实例是枯草蛋白酶，尤其源自芽孢杆菌属的枯草蛋白酶，例如枯草蛋白酶Novo、枯草蛋白酶Carlsberg、枯草蛋白酶309、枯草蛋白酶147和枯草蛋白酶168(WO89/06279所述)。胰蛋白酶样蛋白酶的实例是WO89/06270和WO94/25583中所述的胰蛋白酶(例如，来源于猪或牛)和镰孢属(Fusarium)蛋白酶。
有效蛋白酶的实例是WO92/19729、WO98/20115、WO98/20116和WO98/34946中所述变体，尤其是在一个或多个下列位置具有置换的变体：27、36、57、76、87、97、101、104、120、123、167、170、194、206、218、222、224、235和274。
优选市售蛋白酶包括
Figure C00807805D00341
Figure C00807805D00342
Figure C00807805D00343
和
Figure C00807805D00344
和
Figure C00807805D00346
(Genencor InternationalInc.)。
脂肪酶：合适的脂肪酶包括细菌或真菌来源的脂肪酶。化学修饰的或蛋白质工程化的突变体也包括在内。有效脂肪酶的实例有：腐质霉属(Humicola)(同义词Thermomyces)的脂肪酶，如来自EP 258068和EP 305216所述H.lanuginosa(T.lanuginosus)或WO96/13580所述H.insolens；假单胞菌脂肪酶，如来自产碱假单胞菌或P.pseudoalcaligenes(EP 218272)、洋葱假单胞菌(EP 331376)、司徒茨假单胞菌(GB 1372034)、荧光假单胞菌、假单胞菌属菌株SD705(WO 95/06720和WO 96/27002)、P.wisconsinensis(WO96/12012)；芽孢杆菌脂肪酶，如来自枯草芽孢杆菌(Dartois等，(1993)，Biochemica et Biophysica Acta，1131，253-360)、嗜热脂肪芽孢杆菌(JP64/744992)或短芽孢杆菌(WO 91/16422)。
其它实例是脂肪酶变体，如WO92/05249、WO94/01541、EP407225、EP260105、WO95/35381、WO96/00292、WO95/30744、WO94/25578、WO95/14783、WO95/22615、WO97/04079和WO97/07202所述的脂肪酶变体。
优选市售脂肪酶包括LipolaseTM和Lipolase UltraTM(Novo NordiskA/S)。
淀粉酶：合适的淀粉酶(α和/或β)包括细菌和真菌来源的淀粉酶。化学修饰的或蛋白质工程化的突变体也包括在内。淀粉酶包括，例如从芽孢杆菌(如GB1296839所述地衣芽孢杆菌菌株)中获得的α-淀粉酶。有效的α-淀粉酶的实例是WO94/02597、WO94/18314、WO96/23873和WO97/43424所述变体，尤其是在一个或多个下列位置上具有置换的变体：15、23、105、106、124、128、133、154、156、181、188、190、197、202、208、209、243、264、304、305、391、408和444。
市售淀粉酶有DuramylTM、TermamylTM、FungamylTM和BANTM(NovoNordisk A/S)、RapidaseTM和PurastarTM(Genencor International Inc.)。
纤维素酶：合适的纤维素酶包括细菌和真菌来源的纤维素酶。化学修饰的或蛋白质工程化的突变体也包括在内。合适的纤维素酶包括来自芽孢杆菌属、假单胞菌属、腐质霉属、镰孢属、草根霉属、支顶孢属的纤维素酶，例如产自US4435307、US5648263、US5691178、US5776757和WO89/09259中所公开的Humicola isolens、嗜热毁丝霉和尖孢镰孢的真菌纤维素酶。
特别合适的纤维素酶是具有颜色保护优点的碱性或中性纤维素酶。这种纤维素酶的实例是EP0495257、EP0531372、WO96/11262、WO96/29397、WO98/08940中所述的纤维素酶。其它实例是纤维素酶变体如WO94/07998、EP0531315、US5457046、US5686593、US5763254、WO95/24471、WO98/12307和PCT/DK98/00299中所述的那些变体。
市售纤维素酶包括
Figure C00807805D00351
和
Figure C00807805D00352
(Novo Nordisk A/S)，
Figure C00807805D00361
和
Figure C00807805D00362
(Genencor International Inc.)，及(KaoCorporation)。
过氧化物酶/氧化酶：合适的过氧化物酶/氧化酶包括植物、细菌或真菌来源的过氧化物酶/氧化酶。化学修饰的或蛋白质工程化的突变体也包括在内。有效的过氧化物酶实例包括来自Coprinus，例如来自C.cinereus的过氧化物酶及其在WO93/24618、WO95/10602和WO98/15257中所述的变体。市售过氧化物酶包括
Figure C00807805D00364
(Novo Nordisk A/S)。
洗涤剂组合物中可包含去污酶，方式是加入分别含一或多种酶的不同添加剂，或加入含所有这些酶的组合添加剂。本发明的洗涤添加剂，即独立添加剂或组合添加剂可配制成颗粒、液体、浆等。优选的洗涤添加剂形式是颗粒(特别是不起尘的颗粒)，液体(特别是稳定的液体)，或浆。
不起尘的颗粒可以如US4106991和4661452中所公开的来生产，并可以任选通过本领域已知方法加涂层。蜡涂材料的实例是平均摩尔量为1000至20000的聚(环氧乙烷)产物(聚乙二醇，PEG)；具有16至50个环氧乙烷单位的乙氧基化壬基酚；其中醇含有12至20个碳原子并且其中存在15至80个环氧乙烷单位的乙氧基化脂肪醇；脂肪醇；脂肪酸；及脂肪酸的单-和双-和甘油三酯。适于通过流体床技术来应用的成膜涂层材料的实例在GB1483591中给出。液体酶预制剂可以按已有方法通过加入多元醇如丙二醇、糖或糖醇、乳酸或硼酸而稳定。被保护的酶可以按照EP238216中的方法来生产。
本发明的洗涤剂组合物可以是任何适当的形状，例如条状、片状、粉状、颗粒状、糊状或液体。液体洗涤剂可以是含水型(通常含有高达70％的水和0-30％的有机溶剂)，或不含水型。
洗涤剂组合物含有一种或多种表面活性剂，其可以是非离子型(包括半极性形式)和/或阴离子型和/或阳离子型和/或两性离子型。表面活性剂通常占总重量的0.1％至60％。
当包含在其中时，所述洗涤剂通常含有约1％至约40％的阴离子表面活性剂如线性烷基苯磺酸盐、α-烯属磺酸酯、烷基硫酸盐(脂肪醇硫酸酯)、脂肪醇乙氧基硫酸盐、仲链烷磺酸盐(alkanesulfonate)、α-磺基脂肪酸甲酯、烷基-或链烯基琥珀酸或(肥)皂。
当包括其中时洗涤剂通常含有约0.2％至40％的非离子表面活性剂如脂肪醇乙氧基化物、壬基酚乙氧基化物、烷基多苷(polyglycoside)、烷基二甲基胺氧化物、乙氧基脂肪酸单乙醇胺、脂肪酸单乙醇胺、多羟基烷基脂肪酸胺或葡糖胺的N-酰基N-烷基衍生物(“glucamide”)。
洗涤剂可含有0-65％的洗涤助洗剂或络合剂如沸石、二磷酸、三磷酸盐、膦酸酯、碳酸盐、柠檬酸盐、氨三乙酸、乙二胺四乙酸、二亚乙基三胺五乙酸、烷基-或链烯基琥珀酸、可溶性硅酸盐或分层硅酸盐(例如来源于Hoechst的SKS-6)。
洗涤剂可含有一种或多种聚合物。实例是羧甲基纤维素、聚(乙烯吡咯烷酮)、聚(乙二醇)、聚(乙烯基醇)、聚(乙烯吡啶-N-氧化物)、聚(乙烯基咪唑)、聚羧化物如聚丙烯酸类、马来酸/丙烯酸共聚物和甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物。
所述洗涤剂可含有漂白系统，其可含有H2O2源如过硼酸盐或过碳酸盐，所述H2O2源可以同过酸-形成漂白激活剂如四乙酰基乙二胺或壬酰氧苯磺酸类进行混合。或者，漂白系统可以含有过氧酸的例如酰胺、亚胺或砜形式。
本发明的洗涤剂组合物中的酶可以采用传统的稳定剂来进行稳定，所述稳定剂是，例如多元醇如丙二醇或甘油、糖或糖醇、乳酸、硼酸或硼酸衍生物，例如芳香硼酸酯或苯基硼酸衍生物如4-甲酰苯基硼酸，并且所述组合物可以按照WO92/19709和WO92/19708中所述进行配制。
洗涤剂也可含有其它传统的洗涤剂成分如织物调节剂，这些有粘土、增泡剂、抑泡剂、抗腐蚀剂、污垢悬浮剂、抗污垢再沉积剂、染料、杀菌剂、增白剂、水助溶剂、抑锈剂或香料。
根据本发明的设计，任何酶，特别是本发明的酶可以以相当于每升洗涤液0.01-100mg酶蛋白，优选每升洗涤液0.05-5mg酶蛋白，特别优选每升洗涤液0.1-1mg酶蛋白的量加到所述洗涤剂组合物中。
还可将本发明的酶加至WO97/07202(引入作为参考)中公开的洗涤剂配方中。
洗碗洗涤剂组合物
本发明的酶也可用于洗碗洗涤剂组合物中，包括下列：
1)粉状自动洗碗组合物
 
非离子型表面活性剂 0.4-2.5％
硅酸钠 0-20％
二硅酸钠 3-20％
三磷酸钠 20-40％
碳酸钠 0-20％
过硼酸钠 2-9％
四乙酰基乙二胺(TAED) 1-4％
硫酸钠 5-33％
酶 0.0001-0.1％
2)粉状自动洗碗组合物
非离子型表面活性剂(例如脂肪醇乙氧基化物)1-2％
 
二硅酸钠 2-30％
碳酸钠 10-50％
磷酸钠 0-5％
二水合柠檬酸三钠 9-30％
次氮基三乙酸钠(Nitrilotrisodium acetate)(NTA) 0-20％
一水合过硼酸钠 5-10％
四乙酰基乙二胺(TAED) 1-2％
聚丙烯酸聚合物(例如马来酸/丙烯酸共聚物) 6-25％
酶 0.0001-0.1％
香料 0.1-0.5％
水 5-10％
3)粉状自动洗碗组合物
 
非离子型表面活性剂 0.5％-2.0％
二硅酸钠 25-40％
柠檬酸钠 30-55％
碳酸钠 0-29％
碳酸氢钠 0-20％
一水合过硼酸钠 0-15％
四乙酰基乙二胺(TAED) 0-6％
马来酸/丙烯酸共聚物 0-5％
粘土(clay) 1-3％
 
聚氨基酸 0-20％
聚丙烯酸钠 0-8％
酶 0.0001-0.1％
4)粉状自动洗碗组合物
非离子型表面活性剂              1-2％
沸石MAP                         15-42％
 
二硅酸钠 30-34％
柠檬酸钠 0-12％
碳酸钠 0-20％
一水合过硼酸钠 7-15％
四乙酰基乙二胺(TAED) 0-3％
聚合物 0-4％
马来酸/丙烯酸共聚物 0-5％
有机膦酸酯 0-4％
粘土 1-2％
酶 0.0001-0.1％
硫酸钠 余量(balance)
5)粉状自动洗碗组合物
 
非离子型表面活性剂 1-7％
二硅酸钠 18-30％
柠檬酸三钠 10-24％
碳酸钠 12-20％
单过硫酸盐(2KHSO<sub>5·</sub>KHSO<sub>4·</sub>K<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>) 15-21％
漂白稳定剂 0.1-2％
马来酸/丙烯酸共聚物 0-6％
二亚乙基三胺五乙酸，五钠盐 0-2.5％
酶 0.0001-0.1％
硫酸钠，水 余量
6)具有洗净型表面活性剂系统的粉状和液体洗碗组合物
 
非离子型表面活性剂 0-1.5％
十八烷基二甲胺N-氧化物二水合物 0-5％
 
十八烷基二甲胺N-氧化物二水合物和十六烷基二甲胺N-氧化物二水合物以80:20的C<sub>18</sub>C<sub>16</sub>重量比掺合的混合物 0-4％
十八烷基双(羟乙基)胺无水N-氧化物和十六烷基双(羟乙基)胺无水N-氧化物以70:30的C<sub>1g</sub>/C<sub>16</sub>重量比掺合的混合物 0-5％
具有乙氧基化平均程度为3的C<sub>13</sub>-C<sub>15</sub>乙氧基硫酸烷基酯 0-10％
乙氧基化平均程度为3的C<sub>12</sub>-C<sub>15</sub>乙氧基硫酸烷基酯 0-5％
乙氧基化平均程度为12的C<sub>13</sub>-C<sub>15</sub>乙氧基脂肪醇 0-5％
乙氧基化平均程度为9的C<sub>12</sub>-C<sub>15</sub>乙氧基脂肪醇的混合物 0-6.5％
乙氧基化平均程度为30的C<sub>13</sub>-C<sub>15</sub>乙氧基脂肪醇的混合物 0-4％
二硅酸钠 0-33％
三聚磷酸钠(Sodium tripolyphosphate) 0-46％
柠檬酸钠 0-28％
柠檬酸 0-29％
碳酸钠 0-20％
一水合过硼酸钠 0-11.5％
四乙酰基乙二胺(TAED) 0-4％
马来酸/丙烯酸共聚物 0-7.5％
硫酸钠 0-7.5％
酶 0.0001-0.1％
7)无水液体自动洗碗组合物
 
液体非离子型表面活性剂(例如脂肪醇乙氧基化物) 2.0-10.0％
碱金属硅酸盐 3.0-15.0％
碱金属磷酸盐 20.0-40.0％
选自高级二元醇，聚乙二醇、多氧化物和乙二醇醚的液体载体 25.0-45.0％
稳定剂(例如磷酸和C<sub>16</sub>-C<sub>18</sub>链烷醇的部分酯) 0.5—7.0％
抑泡剂(例如硅氧烷) 0-1.5％
酶 0.0001-0.1％
8)无水液体自动洗碗组合物
 
液体非离子型表面活性剂(例如脂肪醇乙氧基化物) 2.0-10.0％
硅酸钠 3.0-15.0％
碱金属碳酸盐 7.0-20.0％
 
柠檬酸钠 0.0-1.5％
稳定系统(如细分的硅氧烷和低分子量二烷基聚乙二醇醚的混合物) 0.5-7.0％
低分子量聚丙烯酸酯聚合物 5.0-15.0％
粘土凝胶增稠剂(例如膨润土) 0.0-10.0％
羟丙基纤维素聚合物 0.0-0.6％
酶 0.0001-0.1％
选自高级二元醇、聚乙二醇、多氧化物和乙二醇醚的液体载体 余量
9)触变液体自动洗碗组合物
 
C<sub>12</sub>-C<sub>14</sub>脂肪酸 0-0.5％
嵌段共聚物表面活性剂 1.5-15.0％
柠檬酸钠 0-12％
三聚磷酸钠 0-15％
碳酸钠 0-8％
三硬脂酸铝 0-0.1％
枯烯磺酸钠 0-1.7％
聚丙烯酸酯增稠剂 1.32-2.5％
聚丙烯酸钠 2.4-6.0％
硼酸 0-4.0％
甲酸钠 0-0.45％
甲酸钙 0-0.2％
正癸基二苯基(decydiphenyl)氧化物二磺酸钠 0-4.0％
单乙醇胺(MEA) 0-1.86％
氢氧化钠(50％) 1.9-9.3％
1，2-丙二醇 0-9.4％
酶 0.0001-0.1％
泡沫抑制剂、染料、香料、水 余量
10)液体自动洗碗组合物
 
脂肪醇乙氧基化物 0-20％
磺酸脂肪酸酯(Fatty acid sulphonate) 0-30％
十二烷基硫酸钠 0-20％
烷基多苷 0-21％
 
油酸 0-10％
一水合二硅酸钠 18-33％
二水合柠檬酸钠 18-33％
硬脂酸钠 0-2.5％
一水合过硼酸钠 0-13％
四乙酸乙烯二胺(TAED) 0-8％
马来酸/丙烯酸共聚物 4-8％
酶 0.0001-0.1％
11)含有受保护的漂白颗粒的液体自动洗碗组合物
 
硅酸钠 5-10％
焦磷酸四钾 15-25％
三磷酸钠(Sodium triphosphate) 0-2％
碳酸钾 4-8％
受保护的漂白颗粒，例如氯 5-10％
聚合物增稠剂 0.7-1.5％
氢氧化钾 0-2％
酶 0.0001-0.1％
水 余量
11)如1)、2)、3)、4)、6)和10)所述的自动洗碗组合物，其中的过硼酸盐被过碳酸盐所取代。
12)如1)-6)所述的自动洗碗组合物，该组合物另外含有锰催化剂。锰催化剂可以是“用于低温漂白的有效锰催化剂”，自然369，1994，637-639中所述的化合物之一。
应用
本发明还涉及本发明具有α-淀粉酶活性的多肽在洗涤剂，尤其洗衣洗涤剂组合物和洗碗洗涤剂组合物，坚硬表面清洁组合物，以及使纺织品、织物或衣服退浆，生产纸浆和纸、啤酒制作和淀粉转化等上述工艺中应用的方法。
本发明进一步通过以下实施例描述，但不应理解为本发明限于此。
材料和方法
用作缓冲剂和底物的化学试剂是至少试剂纯的商品。
材料
酶：
SP690：美国专利5856164的SEQ ID NO：1中公开的α-淀粉酶。
SP722：美国专利5856164的SEQ ID NO：2中公开的α-淀粉酶。
美国专利5830837的SEQ ID NO：1中公开的地衣芽胞杆菌α-淀粉酶。
AAI-10：SEQ ID NO：2所示的本发明α-淀粉酶。
AAI-6：SEQ ID NO：4所示的本发明α-淀粉酶。
洗涤剂型号
A/P(亚洲/太平洋)型洗涤剂具有下列组分：20％STPP(三聚磷酸钠)、25％Na2SO4、15％Na2CO3、20％LAS(线性烷基苯磺酸盐，Nansa 80S)、5％C12-C15脂肪醇乙氧基化物(Dobanol 25-7)、5％ Na2Si2O5、0.3％ NaCl。
Omo Multi Acao(巴西)，
Omo浓缩粉(EU)(联合利华(Unilever))
Ariel Futur液体(EU)(Procter和Gamble)
生物材料的保藏
根据布达佩斯条约的规定，下列生物材料被保藏在德意志微生物和细胞培养物保藏中心(DSMZ)，Mascheroder Weg1b，D-38124 BraunschweigDE，并被给予下列保藏号：
保藏物          保藏号            保藏日期
NN17562         DSM12650          1999年1月25日
NN17563         DSM12651          1999年1月25日
NN049469        DSM12763          1999年4月7日
NN049468        DSM12762          1999年4月7日
菌株保藏的条件是在由专利和商标委员会根据37 C.F.R.§1.14和35U.S.C.§122决定是否授权该专利申请的过程中确保能够得到该培养物。保藏物代表被保藏菌株的基本纯的培养物。在进行主体申请的再申请或它的子案进行再申请的境外国家中专利法的要求下，所述寄存物应当能得到。然而，应理解得到保藏物并不非许可实施所述主体发明而对由政府行为授予的专利权造成损害。
宿主生物
SHa273公开于WO95/10603。
大肠杆菌菌株SJ2(Diderichsen等，(1990)，细菌学杂志172卷，4315-4321)。
质粒：
Genebank载体pSJ1678进一步由WO94/19454(引入作为参考)公开
方法
普通分子生物学方法：
除非另外提到，所述DNA操作和转化都是通过采用标准的分子生物学方法进行的(Sambrook等，(1989)；Ausubel等，(1995)；Harwood和Cutting(1990))。
α-淀粉酶及其变体的发酵生产
可以通过本技术领域已知的方法或按下述方法进行发酵。
携有相关表达质粒的一株枯草芽孢杆菌菌株在含有-80℃贮存的10微克/毫升卡那霉素的LB-琼脂平板上划线接种，并在37℃下过夜培养。将菌落转移到装在500ml摇瓶中的添加有10微克/毫升卡那霉素的100ml BPX培养基中。
BPX培养基的组成：
马铃薯淀粉                     100g/l
大麦粉                         50g/l
BAN 5000 SKB                   0.1g/l
酪蛋白酸钠                     10g/l
大豆粉(Soy Bean Meal)          100g/l
Na2HPO4，12H2O                 9g/l
PluronicTM                     0.1g/l
培养物在37℃下以270rpm振荡培养5天。
通过4500rpm离心20-25分钟除去发酵液中的细胞和细胞碎片。然后将上清液过滤来获得完全澄清的溶液。浓缩滤液并在UF滤器上进行洗涤(10000截留膜)，再将缓冲液换成pH5.5的20mM的醋酸(Acetate)。将UF滤液上样到S-Sepharose F.F上并且在同样的缓冲液中通过采用0.2MNaCl的逐步洗脱法进行洗脱。洗脱液对10mM Tris pH9.0透析，上样到Q-SepharoseF.F上，利用0-0.3M NaCl的线性梯度洗脱6个柱体积。收集具有活性(通过Phadebas分析法测定)的馏分，调节pH到pH7.5并通过采用0.5％w/v的活性碳处理5分钟来除去残留色素。
α-淀粉酶活性的测定
1.Phadebas分析法
通过以
Figure C00807805D00451
片为底物的方法测定α-淀粉酶活性。Phadebas片淀粉酶试验，由Pharmacia Diagnostic提供)含有交联的不可溶蓝色淀粉聚合物，其与牛血清白蛋白和一种缓冲物质相混合并被压片。
每次测定时，将一个片剂悬浮在含有5ml 50mM Britton-Robinson缓冲液(50mM醋酸、50mM磷酸、50mM硼酸、0.1mM CaCl2，用NaOH将pH调到所需值)的试管中。试验在所需温度的水浴中进行。要测定的α-淀粉酶用x ml的50mM Britton-Robinson缓冲液稀释。1ml的该α-淀粉酶溶液被加到5ml50mM Britton-Robinsond缓冲液中。淀粉被该α-淀粉酶水解并产生可溶的蓝色片段。在620nm下分光光度法测定蓝色溶液的吸光度，其是α-淀粉酶活性的函数。
重要的是经10或15分钟温育(试验时间)后在620nm下测定的吸光度是在0.2至2.0个620nm光吸收单位的范围内。在这一光吸收范围内活性与光吸收值之间成线性关系(Lambert-Beer定律)。因此必须调节酶的稀释度以适合这一标准。在一系列特定的条件(温度、pH、反应时间、缓冲液)下，1mg的给定α-淀粉酶将水解一定量的底物并产生蓝色。在620nm下测定颜色的强度。测定的吸光值直接与在所述一系列特定条件下测得的目标α-淀粉酶的比活性成比例(活性/mg纯α-淀粉酶蛋白)。
2.另一种方法(PNG-G7分析法)
通过采用PNP-G7底物测定α-淀粉酶的活性。PNG-G7是对硝基苯-α，D-麦芽酚庚糖苷(maltoheptaoside)的缩写，它能被内淀粉酶裂解的嵌段(blocked)寡糖。裂解后，试剂盒中包括的α-葡萄糖苷酶消化底物而释放一种游离PNP分子，该PNP分子呈黄色因而通过在λ＝405nm(400-420nm)下的可视分光光度测定法(spectophometry)来测定。包括PNP-G7低物和α-葡萄糖苷酶的试剂盒是由Boehringer-Mannheim生产的(目录号1054635)。
为了生产底物，将一瓶底物(BM1442309)加到5ml缓冲液(BM1442309)中。为了生产α-葡萄糖苷酶，将一瓶α-葡萄糖苷酶(BM1462309)加到45ml缓冲液(BM1442309)中。工作溶液通过混合5ml的α-葡萄糖苷酶溶液和0.5ml底物来制得。
分析是通过将20μl酶溶液转到96孔微滴板中并在25℃下温育。在25℃下加入200μl工作溶液。将所述溶液混合并预温育1分钟，然后每15秒在OD405nm下测定吸光值一次，共测3分钟。
依赖时间的吸光值-曲线的斜率直接与所述一系列特定条件下目标α-淀粉酶的比活性成比例(每mg酶的活性)。
钙-和pH-依赖的稳定性的测定
为了改进95℃-105℃时的稳定性，标准的工业化液化处理过程是在以pH6.0-6.2为液化pH和加入40ppm的游离钙来操作的。通过进行本文建议的一些替换来改进在以下条件下的稳定性：
1.比pH6.2低的pH和/或
2.在游离钙浓度低于40ppm游离钙的情况下。
利用两种不同方法来测定通过在AA560α-淀粉酶中进行不同的替换而得到的稳定性的改变。
方法1：一种在降低的pH即pH5.0、5ppm游离钙的条件下测定稳定性的分析方法。
在下列条件下温育10μg所述变体：0.1M的醋酸盐溶液、调到pH5.0、含有5ppm钙和5％w/w的普通玉米淀粉(不含钙)。温育是在95℃的水浴中进行30分钟。
方法2：一种在不存在游离钙和pH被维持在pH6.0的条件下测定稳定性的分析方法。这种分析方法测定钙敏感性的降低。
在下列条件下温育10μg所述变体：0.1M的醋酸盐溶液、调到pH6.0并5％w/w的普通玉米淀粉(不含钙)。温育是在95℃的水浴中进行30分钟。
稳定性的测定
所有的稳定性试验都采用相同的设置进行。方法如下：
在相关条件(1-4)下温育所述酶。在0、5、10、15和30分钟取样并用分析缓冲液(0.1M50mM Britton缓冲液pH7.3)稀释25倍(所有取样采用相同稀释度)，在标准条件pH7.3、37℃下采用Phadebas分析方法(Pharmacia)测定活性。
温育前(0分)所测活性被用作参考(100％)。百分数的下降被计算为温育时间的函数。
比活性的测定
采用Phadebas分析方法(Pharmacia)将比活性测定为活性/mg酶。
用α-淀粉酶及其变体进行喷射蒸煮(Jet cooking)和液化
液化实验是在微型-喷射(mini-jet)系统中用50NU/g DS在pH5.5下加入5ppm Ca++而进行，以便比较所配制的α-淀粉酶变体与亲代α-淀粉酶的性能。反应通过测量DE增长对时间的函数(Neocuproine方法)来进行监控。
通过用去离子水悬浮约11.8kg的Cerestar C＊pharm GL03406(89％的淀粉)至接近30kg来生产玉米淀粉浆。在室温下加入0.55g的CaCl2·2H2O后将pH调到5.5。
加入相当于50NU/g DS的酶，并用NaCl将电导率调到300mS。标准条件如下所示：
底物浓度            35％w/w(起始)
                    31.6-31.9％w/w(终)
温度                105℃、5分钟(首次液化)
                    95℃、90分钟(第二次液化)
pH(起始)            5.5
喷射(jet)后，收集液化了的淀粉并用密封的热烧瓶从小规模的工厂转运到试验室中，在这里于95℃下继续进行第二次液化。
15至90分钟内每隔15分钟取10ml的样品。加入2滴1N的HCl以使酶失活。从这些样品中称出0.3-0.1g(根据期望的DE)并稀释到100ml。然后，根据Neocuproine方法测定还原糖(精度改进的还原糖测定。Dygert，Li，Florida和Thomas(1965).Anal.Biochem 13,368)并测定的DE值。比较作为时间函数的DE的变化。
退浆材料：
标准织物：        TS526，斜纹织法，100％棉
浸渍：            55℃，60ppm CaCl2，pH6.5
酶溶液：          亲代AA560(1g/l)
用量：            浸渍液中0.05，0.1，0.2，0.5和2.0g/l酶溶液。
温育：            在55或65℃下2小时
                  在30℃下22小时
洗涤：            水中10分钟
干燥：            室温
程序：           退浆结果的评估一Violet scale(TEGEWA)。
利用DOPE程序进行随机诱变的常规方法
通过以下步骤可以进行随机诱变：
1.在亲代酶中选择用于修饰的目标区域，
2.在所选区域中决定突变位点和非突变位点，
3.根据如待构建变体的所需稳定性和/或性能，决定突变的类型，
4.选择结构合理的突变，
5.根据步骤4调整步骤3所选残基，
6.通过采用适当的掺入算法(dope algorithm)分析核苷酸的分布，
7.如果需要，调整所需残基使之符合基因密码的真实性，如考虑基因密码导致的限制因素，如为了避免引入终止密码子；技术人员应认识到某些密码子组合不能应用于实践，需要调整，
8.生产引物，
9.利用所述引物进行随机诱变，
10.通过筛选所需要改进的性能来选择所得葡萄糖淀粉酶变体。
掺入算法
用于步骤6的合适掺入算法为本领域已知。如Tomandl，D.等，1997，计算机-辅助的分子设计杂志(Journal of Computer-Aided MolecularDesign)11：29-38。另一种算法是DOPE(Jensen，LJ，Andersen，KV，Svendsen，A，和Kretzschmar，T，(1998)，核酸研究26：697-702)。
滤膜筛选试验
该试验可用于根据对筛选温度的设置，筛选在高pH下比亲代酶稳定性提高的AA560变体，和在高pH和中温下比亲代酶稳定性提高的AA560α-淀粉酶变体。
高pH滤膜试验
将芽孢杆菌文库铺于含有10μg/ml卡那霉素之TY琼脂平板上醋酸纤维素(OE67，Schleicher & Schuell，Dassel，德国)-硝酸纤维素滤膜(Protran-Ba 85，Schleicher & Schuell，Dassel，德国)的夹心结构上，37℃保持至少21小时。醋酸纤维素层被安置在TY琼脂平板上。
每一滤膜夹心于铺板后但温育前用针做特别标记，以便能定位滤膜上的阳性变体，将结合了变体的硝酸纤维素滤膜转移到盛有对羟苯基甘氨酸(glycin)-NaOH缓冲液(pH8.6-10.6)的容器中，室温(可以变为10℃C-60℃)温育15分钟。将有菌落的醋酸纤维素滤膜室温保存在TY-平板上备用。温育后，在含有1％琼脂糖、0.2％淀粉之对羟苯基甘氨酸-NaOH缓冲液(pH8.6-10.6)的平板上测定残留活性。带硝酸纤维素滤膜的试验板按照与滤膜夹心相同的方法标记，室温温育2小时。除去滤膜后，试验板用10％Lugol溶液染色。淀粉降解变体为深蓝背景下的白点，然后保存板上对其进行鉴定。阳性变体相同于第一次筛选的条件再筛选两次。
低钙滤膜试验
将芽孢杆菌文库铺板于含有相关抗生素如卡那霉素或氯霉素之TY琼脂平板上的醋酸纤维素(OE67，Schleicher & Schuell，Dassel，德国)-硝酸纤维素滤膜(Protran-Ba 85，Schleicher & Schuell，Dassel，德国)的夹心结构中，37℃保持至少21小时。醋酸纤维素层被安置在TY琼脂平板上。
每一滤膜夹心于铺板后但温育前用针做特别标记，以便能定位滤膜上的阳性变体，将结合了变体的硝酸纤维素滤膜转移到盛有碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液(pH8.5-10)和不同EDTA浓度(0.001mM-100mM)的容器中。将有菌落的醋酸纤维素滤膜室温保存在TY-平板上备用。温育后，在含有1％琼脂糖、0.2％淀粉之碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液(pH8.5-10)的平板上测定残留活性。带硝酸纤维素滤膜的试验板按照与滤膜夹心相同的方法标记，室温温育2小时。除去滤膜后，试验板用10％Lugol溶液染色。淀粉降解变体为深蓝背景下的白点，然后保存板上对其进行鉴定。阳性变体相同于第一次筛选的条件再筛选两次。
实施例
实施例1
分离DSM 12560和DSM 12651菌株的基因组DNA
在液体TY培养基(按Ausubel et al.(1995)所述)中增殖芽孢杆菌属菌株DSM 12650(the AAI-6 α淀粉酶)和芽孢杆菌属菌株DSM 12651(the AAI-10α淀粉酶)在37℃和300rpm保温16小时后，收获细胞，用Pitcher等(1989)描述的方法分离基因组DNA。
基因组文库构建
用限制酶Sau3A部分消化所述菌株的基因组DNA，然后通过在0.7％琼脂糖凝胶上电泳大小分级分离。通过在DEAE-纤维素纸上电泳(Dretzen等(1981)分离大小为2-10kb的片段。
将分离的DNA片段与BamHI消化的pSJ1678DNA相连，然后用连接混合物转化大肠杆菌SJ2。
转化
制备大肠杆菌SJ2宿主细胞，用BIO-RAD的基因PULSERTM电穿孔仪按供应商的说明通过电穿孔.转化所述宿主细胞。
鉴定阳性转化体
在含0.5％ AZCL-直链淀粉(Megazyme)和10μg/ml氯霉素的LB琼脂平板(在Ausbel等(1995)中所述的)上筛选按上述构建的大肠杆菌SJ2中的DNA文库，然后在37℃保温过夜。表达淀粉酶活性的克隆出现蓝色扩散晕。将表达AAI-6淀粉酶的一个所述克隆命名为LiH1300。将表达AAI-10淀粉酶的另一个所述克隆命名为LiH1298。通过将克隆的Sau3A DNA片段部分测序进一步表征所述DNA。
实施例2
确定编码菌株DSM 12650(AAI-6)的α淀粉酶之基因的DNA序列
用由大染色体片段构成的克隆作为模板以特异性PCR扩增淀粉酶编码基因的内DNA片段，所述染色体片段含有插入到质粒pSJ1678，pLiH1300中的编码淀粉水解活性的基因，在所述PCR中利用针对已知芽孢杆菌α淀粉酶保守区的简并引物。
简并引物针对下列区域/氨基酸序列：
For36：GITA(L/V/I)W(I/L)(SEQ ID NO：5)
For97：VY(G/A)D(V/F/L)V(M/L/I/F)NH(SEQ ID NO：6)
For227：DG(F/I)R(F/L/I/V)DA(A/V)KH(SEQ ID NO：7)
Rev235：DG(F/I)R(F/L/I/V)DA(A/V)KH(SEQ ID NO：8)
Rev328：VTFV(D/E)NHD(SEQ ID NO：9)
Rev410：GWTREG(SEQ ID NO：10)
在PCR中使用前向(For)和反向(Rev)引物的各种组合，这样可扩增内DNA片段。
用QIA快速自旋柱(QUIGEN)纯化DNA片段，用相同的简并引物测序。从该起始序列开始，通过引物步行法(primers-walking approach)确定AAI-6α-淀粉酶完整编码区SEQ ID NO：2的DNA序列。
实施例3
确定编码菌株DSM 12651的α-淀粉酶(AAI-10)之基因的DNA序列：
用由大染色体片段构成的克隆作为模板以特异性PCR扩增淀粉酶编码基因的内DNA片段，所述染色体片段含有插入到质粒pSJ1678，pLiH1298中的编码淀粉水解活性的基因，在所述PCR中利用针对已知芽孢杆菌α淀粉酶保守区的简并引物。
简并引物针对下列区域/氨基酸序列：
For36：GITA(L/V/I)W(I/L)(SEQ ID NO：5)
For97：VY(G/A)D(V/F/L)V(M/L/I/F)NH(SEQ ID NO：6)
For227：DG(F/I)R(F/L/I/V)DA(A/V)KH(SEQ ID NO：7)
Rev235：DG(F/I)R(F/L/I/V)DA(A/V)KH(SEQ ID NO：8)
Rev328：VTFV(D/E)NHD(SEQ ID NO：9)
Rev410：GWTREG(SEQ ID NO：10)
在PCR中使用前向(For)和反向(Rev)引物的各种组合，这样可扩增内DNA片段。
用QIA快速自旋柱(QUIGEN)纯化DNA片段，用相同的简并引物测序。从该起始序列开始，通过引物步行法确定AAI-10α-淀粉酶完整编码区(SEQID NO：4)的DNA序列(SEQ ID NO：1)。
实施例4
将DSM 12650(AAI-6)α-淀粉酶亚克隆到pTVB110
pTVB110是在枯草芽孢杆菌中利用pUB110(Gryczan，T.J.(1978)J.Bact134：318-329)的复制原点复制的质粒。该质粒还编码得自质粒pC194(Horinouchi，S.and Weisblum，B.(1982)，J.Bact.150：815-825)的cat基因，其赋予氯霉素抗性。该质粒含有截断的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因，amyL，以及含有amyL启动子，信号序列和转录终止子，但没有amy+表型(在含淀粉琼脂上有晕形成)。
为了表达大量AAI-6淀粉酶将成熟基因精确地与amyL信号序列融合以便由amyL启动子引发转录，由amyL信号序列指导转运。
用Pwo聚合酶在制造商(Boehringer Mannheim)推荐的条件下在质粒pLiH1300上通过PCR用引物197cloningN和197cloningC扩增约1480bp片段。
将所得约1480bp片段用限制核酸内切酶PstI和SfiI消化，然后与用相同的酶消化的质粒相连。
用连接混合物转化蛋白酶和淀粉酶缺失的枯草芽孢杆菌菌株SHa273(公开于W095/10603)，然后确定amy+转化体的DNA序列。将该质粒命名为pTVB230。
寡核苷酸：
197克隆C：5′CCG AGC TCG GCC GGC TGG GCC GTC GAC TTA TCGTTT CAC CCA TAC GG(SEQ ID NO：11)
197克隆N：5′CAT TCT GCA GCA GCG GCG CAT CAC GAT GGG ACGAAC GG(SEQ ID NO：12)
实施例5
将AAI-10α淀粉酶亚克隆到pTVB110.
DNA测序表明菌株AAI-6和AAI-10间的α-淀粉酶有相当高的同一性。这样可以将相同的寡核苷酸和策略用于将AAI-10α-淀粉酶克隆到表达载体pTVB110中，得到质粒pTVB229，然后用标准技术发酵该质粒。
实施例6
AAI-6α-淀粉酶的纯化
通过加入0.01ml50％(w/w)CaCl2，2H20，0.ml12％(w/w)铝酸钠，0.025ml10％C521和0.075ml 0.1％ A130pr.ml培养液使培养液成为絮状。离心后得到澄清的溶液。向酶溶液中加入硫酸铵达到1.2M的终浓度，然后加到预先用1.2M硫酸铵，10mM Tris-HCl，pH7.0.平衡的Butyl Toyo Pearl柱(100ml)上。用5mM Tris-HCl，pH7.0洗脱淀粉酶，然后将洗脱液收集物用5mMTris-HCl透析过夜。然后将馏分用预先用20mM Tris-HCl，pH9.0平衡的Q-Sepharose柱(200ml)进行离子交换层析。用平衡缓冲液洗出未吸附物质，用0-1M NaCl，20mM Tris-HCl，pH9.0线性梯度洗脱淀粉酶。淀粉酶制品纯度由SDS-PAGE判断为高于95％。
实施例7
AAI-10α-淀粉酶的纯化
按上述使培养液成絮状。向酶溶液中加入硫酸铵达到1.2M的终浓度，然后加到预先用1.2M硫酸铵，10mM Tris-HCl，pH7.0.平衡的Butyl ToyoPearl柱(100ml)上。用5mM Tris-HCl，pH7.0洗脱20％活性，剩余的用异丙醇洗脱。将合并的馏分在Q-Sepharose柱(100ml)，pH9.7上分级分离。用平衡缓冲液洗掉未结合的物质，用0-1M NaCl，20mM Tris-HCl，pH9.4线性梯度洗脱淀粉酶。将含淀粉酶的汇集液最后上样至S Sepharose柱，pH5.5分级分离。经SDS-PAGE判断所述淀粉酶制品的纯度在95％以上。
实施例8
AAI-6和AAI-10α-淀粉酶的表征
用上述Phadebas检测方法(37℃，pH7.3)和另一种pNPG7检测方法(25℃，pH7.1)测定α-淀粉酶活性。在所选的pH和温度值制作pH-和温度图。在37℃测定pH图，在pH9.0测定温度图。
用等电聚焦(Pharmacia，Ampholine，pH3.5-9.3)确定等电点。
表1.比活性和pI
Figure C00807805D00531
AAI-6和AAI-10的E＝3.0cm-1*(g/l)-1
在图2和图3中分别列出了最佳pH和最佳温度的结果。
实施例9
洗涤试验
在分别含本发明AAI-6和AAI-10α-淀粉酶的洗涤剂溶液中，在25和40℃用15和30分钟，通过洗涤有污垢的试验样品来评估洗涤性能。
在下表3中公开了所用的洗涤剂。在上述材料节中描述了A/P ModelDetergent。另一种洗涤剂是市售洗涤剂。在洗涤前通过微波使含淀粉酶的市售洗涤剂失活。
将实施例6和7的纯化的重组AAI-6和AAI-10α-淀粉酶以下文所述浓度加到洗涤剂溶液中。用橙色大米淀粉弄脏试验样品(CS-28样品得自CFT，Center for Test Material，Holland).
洗涤后，用Elrepho Remission Spectrophotometer在460nm测量污垢的减少来评估样品。将结果表示为ΔR＝用o-淀粉酶洗涤的样品污垢的减少-在相同条件下不用α-淀粉酶洗涤的样品之污垢的减少。
表3.洗涤剂和洗涤条件
Figure C00807805D00541
图4-7中列出了结果。结果表明本发明的α-淀粉酶在高碱性pH的两种洗涤剂中均是有效的。
实施例10
用AAI-10脱浆试验
用TEGEWA方法(方法和标准规模得自Verband TEGEWA，Karlstrasse21，Frankfurt a.M.，德国)，将亲本AAI-10α-淀粉酶用于纺织品脱浆。在“材料和方法”节中描述了条件。
将AAI-10α-淀粉酶用于30和55℃完成的脱浆试验。该酶在浸透液中的剂量0.05-2g/l。通过用水洗涤纺织品-而不是用通常的热苏打水洗涤来完成洗涤后步骤。
用Violet Scale(TEGEWA)，TEGEWA scale：1-9测定效果。
实施例11
AAI-10变体的构建
按WO 99/23211的实施例4所述构建AAI-10的变体。
实施例12
检测AAI-10变体的洗涤性能
按实施例9所述检测本发明AAI-10变体的洗涤性能。
实施例13
检测AAI-10变体的比活性
按实施例8所述确定AAI-10变体的比活性。
实施例14
检测AAI-10变体的钙稳定性
用“材料和方法”节中所述的检测方法检测AAI-10变体的钙稳定性。
本文所述和要求的本发明并不限于本文所公开的具体实施方案的范围，因为这些实施方案只是为了说明本发明的几个方面。任何等同实施方案均在本发明范围内。实际上，除本文所列和所述的外，从前文的描述中，本发明的各种改变对于本领域技术人员是显而易见的。所述改变也在本发明权利要求的范围内。在冲突的情况下，包括定义的本发明说明书将起决定作用。
本文引用了各种参考文献，其内容全部引入本文作为参考。
参考文献
Ausubel，F.M.等(eds.)；《分子生物学的现有工具》(Current protocols inMolecular
Biology)；1995；John Wiley和Sons.
Sambrook等；《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning：A LaboratoryManual)；1989，；
冷泉港实验室.；冷泉港；纽约.
Harwood C.R.，和Cutting S.M.(eds.)；《芽孢杆菌的分子生物学方法》(Molecular Biological
Methods for Bacillus)；1990；John Wiley和Sons.
Diderichsen B.，Wedsted U.，Hedegaard L.，Jensen B.R.，Sjφholm C.；《细菌学杂志》，aldB的克隆，它编码α-乙酰乳酸脱羧酶，一种短芽孢杆菌胞外酶(Cloning of，which encodes alpha-acetolactate decarboxylase，an exoenzymefrom Bacillus brevis；J.Bacteriol.)，1990，vol.172，pp.4315-4321.
Pitcher D.G.，Saunders N.A.，Owen R.J.；《应用微生物通讯》，用硫氰酸胍快速提取基因组(DNA Rapid extraction of bacterial genomic DNA withguanidium thiocyanate；Lett.Appl.Microbiol.)1989；vol.8；pp.151-156.
Dretzen G.，Bellard M.，Sassone-Corsi P.，Chambon P.；从琼脂糖和丙烯酰胺凝胶回收DNA片段的可靠方法(A reliable method for the recovery of DNAfragments from琼脂糖和acrylamide gels；Anal.Biochem.；)1981；vol.112；pp.295-298.
序列表
<110>诺维信公司(Novozyme)
<120>具有碱性α-淀粉酶活性的多肽及其编码核酸
<160>12
<170>适用于Windows 3.0版的FastSEQ
<210>1
<211>1458
<212>DNA
<213>芽孢杆菌属菌株(Bacillus sp.)
<220>
<221>CDS
<222>(1)...(1458)
<221>mat_peptide
<222>(1)...(1458)
<400>1
Figure C00807805D00571
Figure C00807805D00581
Figure C00807805D00591
<210>2
<211>485
<212>PRT
<213>芽孢杆菌属菌株(Bacillus sp.)
<400>2
Figure C00807805D00592
Figure C00807805D00601
<210>3
<211>1458
<212>DNA
<213>芽孢杆菌属菌株(Bacillus sp.)
<220>
<221>CDS
<222>(1)...(1458)
<221>mat_peptide
<222>(1)...(1458)
<400>3
Figure C00807805D00602
Figure C00807805D00611
Figure C00807805D00621
<210>4
<211>485
<212>PRT
<213>芽孢杆菌属菌株(Bacillus sp.)
<400>4
Figure C00807805D00632
Figure C00807805D00641
<210>5
<211>7
<212>PRT
<213>未知
<220>
<223>Xaa＝Leu，Val，Ile
<223>Xaa＝Ile，Leu
<223>简并引物区
<400>5
<210>6
<211>9
<212>PRT
<213>未知
<220>
<223>简并引物区
<223>Xaa＝Gly，Ala
<223>Xaa＝Val，Phe，Leu
<223>Xaa＝Met，Leu，Ile，Phe
<400>6
Figure C00807805D00643
<210>7
<211>10
<212>PRT
<213>未知
<220>
<223>Xaa＝Phe，Ile
<223>Xaa＝Phe，Leu，Ile，Val
<223>Xaa＝Ala，Val
<223>简并引物区
<400>7
<210>8
<211>10
<212>PRT
<213>未知
<220>
<223>简并引物区
<223>Xaa＝Phe，Ile
<223>Xaa＝Phe，Leu，Ile，Val
<223>Xaa＝Ala，Val
<400>8
Figure C00807805D00652
<210>9
<211>8
<212>PRT
<213>未知
<220>
<223>简并引物区
<223>Xaa＝Asp，Glu
<400>9
Figure C00807805D00653
<210>10
<211>6
<212>PRT
<213>未知
<220>
<223>简并引物区
<400>10
Figure C00807805D00661
<210>11
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物197克隆C
<400>11
<210>12
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>197克隆N
<400>12
Figure C00807805D00663

Claims (17)

1.一种分离的多肽，其具有α-淀粉酶活性并具有选自下列的一种或多种特征或特性：
(a)具有SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的氨基酸序列的多肽，
(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过插入、缺失或取代一个或多个氨基酸且具有α-淀粉酶活性的多肽。
2.权利要求1的多肽，其为在SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的氨基酸序列上具有1至7个插入、缺失和/或取代的变体。
3.权利要求1或2的多肽，其由在高度严谨条件下与(i)SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的核酸序列，(ii)SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的cDNA序列，(iii)(i)或(ii)的至少100个核苷酸的亚序列，或(iv)(i)、(ii)、或(iii)的互补链杂交的核酸序列编码。
4.权利要求1或2的多肽，其由大肠杆菌DSM12769或大肠杆菌DSM12768中分别所含的质粒pLiH1300或pLiH1298中的核酸序列编码。
5.一种分离的核酸序列，其含有编码权利要求1-4任一项的多肽的核酸序列。
6.分离的编码具有α-淀粉酶活性的多肽的核酸序列，其含有在SEQ IDNO：1或SEQ ID NO：3的成熟多肽编码序列中含至少一个突变的核酸序列，其中所述突变核酸序列编码由SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的氨基酸1-485组成的多肽。
7.含权利要求5或6的核酸序列的重组表达载体。
8.含有权利要求7的重组表达载体的重组宿主细胞。
9.产生突变核酸序列的方法，该方法包括(a)将至少一个突变导入SEQID NO：1或SEQ ID NO：3的成熟多肽编码序列中，其中所述突变核酸序列编码由SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的氨基酸1-485组成的多肽；和(b)回收所述突变核酸序列。
10.产生权利要求1-4任一项的多肽的方法，所述方法包括(a)培养菌株DSM12650或DSM12651以产生含所述多肽的上清液；和(b)回收所述多肽。
11.权利要求1-4任一项的具有α-淀粉酶活性的多肽突变体，其中所述α-淀粉酶在下列位置(相对于SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4)含有一个或多个突变：
1：R181*，G182*，D183*，G184*；
2：N195A，R，D，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V；
3：V206A，R，D，N，C，E，Q，G，H，，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y；
4：E212A，R，D，N，C，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V；
5：E216A，R，D，N，C，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V；
6：K269A，R，D，N，C，E，Q，G，H，I，L，M，F，P，S，T，W，Y，V；
7：R181A，N，D，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V。
12.权利要求11的多肽突变体，其中所述一个或多个突变是一个或多个取代或缺失。
13.权利要求12的突变体，其选自带有下列突变的突变体：
-R181＊/G182＊/N195A，R，D，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V；
-G182＊/T183＊/N195A，R，D，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V；
-T183＊/G184＊/N195A，R，D，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V；
-T183＊/G184＊/R181A，N，D，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V；
-R181＊/G182＊/V206A，R，D，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y；
-G182＊/T183＊/V206A，R，D，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y；
-T183＊/G184＊/V206A，R，D，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y；
-R181＊/G182＊/E212A，R，D，N，C，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V；
-G182＊/T183＊/E212A，R，D，N，C，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V；
-T183＊/G184＊/E212A，R，D，N，C，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V：
-R181＊/G182＊/E216A，R，D，N，C，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V；
-G182＊/T183＊/E216A，R，D，N，C，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V；
-T183＊/G184＊/E216A，R，D，N，C，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V；
-R181＊/G182＊/K269A，R，D，N，C，E，Q，G，H，I，L，M，F，P，S，T，W，Y，V；
-G182＊/T183＊/K269A，R，D，N，C，E，Q，G，H，I，L，M，F，P，S，T，W，Y，V；
-T183＊/G184＊/K269A，R，D，N，C，E，Q，G，H，I，L，M，F，P，S，T，W，Y，V；
-N195A，R，D，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V
/V206A，R，D，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y；
-N195A，R，D，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V
/E212A，R，D，N，C，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V；
-N195A，R，D，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V
/E216A，R，D，N，C，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V；
-N195A，R，D，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V
/K269A，R，D，N，C，E，Q，G，H，I，L，M，F，P，S，T，W，Y，V；
-V206A，R，D，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y
/E212A，R，D，N，C，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V；
-V206A，R，D，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y
/E216A，R，D，N，C，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V；
-V206A，R，D，N，C，E，Q；G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y
/K269A，R，D，N，C，E，Q，G，H，I，L，M，F，P，S，T，W，Y，V；
-E212A，R，D，N，C，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V
/E216A，R，D，N，C，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V；
E212A，R，D，N，C，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V
/K269A，R，D，N，C，E，Q，G，H，I，L，M，F，P，S，T，W，Y，V。
-E216A，R，D，N，C，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V
/K269A，R，D，N，C，E，Q，G，H，I，L，M，F，P，S，T，W，Y，V.
14.组合物，其含有权利要求1-4的多肽或权利要求11-13任一项的突变体。
15.权利要求14的组合物，是洗涤剂组合物。
16.权利要求1-4的多肽或权利要求11-13任一项的突变体在洗涤剂组合物中的应用。
17.权利要求16的应用，其中所述洗涤剂组合物是洗衣组合物，洗碗洗涤剂组合物，硬表面清洁组合物，或脱浆组合物。
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