ES2322426T3 - Polipeptidos con actividad alfa-amilasa y acidos nucleicos que codifican a los mismos. - Google Patents
Polipeptidos con actividad alfa-amilasa y acidos nucleicos que codifican a los mismos. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2322426T3 ES2322426T3 ES00912414T ES00912414T ES2322426T3 ES 2322426 T3 ES2322426 T3 ES 2322426T3 ES 00912414 T ES00912414 T ES 00912414T ES 00912414 T ES00912414 T ES 00912414T ES 2322426 T3 ES2322426 T3 ES 2322426T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- polypeptide
- baselineskip
- seq
- sequence
- nucleic acid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2405—Glucanases
- C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
- C12N9/2411—Amylases
- C12N9/2414—Alpha-amylase (3.2.1.1.)
- C12N9/2417—Alpha-amylase (3.2.1.1.) from microbiological source
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
- C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
- C11D3/00—Other compounding ingredients of detergent compositions covered in group C11D1/00
- C11D3/16—Organic compounds
- C11D3/38—Products with no well-defined composition, e.g. natural products
- C11D3/386—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
- Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
- Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Detergent Compositions (AREA)
Abstract
Polipéptido aislado con actividad alpha-amilasa y con una secuencia de aminoácidos que consiste en los aminoácidos del 1 al 485 de la SEC ID No: 2 o la SEC ID No: 4.
Description
Polipéptidos con actividad
\alpha-amilasa y ácidos nucléicos que codifican a
los mismos.
La presente invención se refiere a polipéptidos
aislados que contienen actividad \alpha-amilasa y
secuencias de ácidos nucleicos aisladas que codifican los
polipéptidos. La invención también se refiere a constructos de
ácidos nucleicos, vectores, y células huéspedes que comprenden las
secuencias de ácidos nucleicos al igual que métodos para producir y
usar los polipéptidos. Además, la invención también se refiere a
composiciones para lavandería, lavado de vajilla y/o limpieza de
superficies duras.
Durante varios años las enzimas
\alpha-amilasas han sido usadas con algunos
propósitos diferentes, los más importantes la licuefacción de
almidón, el desencolado textil, la modificación de almidón en la
industria del papel y de la pasta de papel, y la elaboración de
cerveza y panadería. Otro uso de las
\alpha-amilasas, que cada vez es más importante,
es la eliminación de manchas amidáceas durante el lavado con un
detergente a pH alcalino.
Ejemplos de productos comerciales de
\alpha-amilasa son Termamyl®, Duramyl^{TM},
Natalase®, BAN® y Fungamyl®, todos disponibles a través de Novo
Nordisk A/S, Dinamarca. Estos y otros productos similares de otras
fuentes comerciales tienen un pH óptimo que va de ácido a neutro,
normalmente en el rango de pH 5-7.5, y éstos no
presentan actividad óptima en soluciones detergentes a pH
alcalino.
WO 95/26397 expone una
\alpha-amilasa de una cepa de Bacillus.
WO 96/23873 describe variantes de amilasas de
Bacillus con un rendimiento mejorado bajo condiciones de
lavado.
US 5.147.796 describe una pululanasa alcalina
con actividad alfa-amilasa. La Fig. 2b del
documento muestra actividad amilasa óptima a pH
8-8.5.
M. Takagi et al., J. Ferment. Bioeng.,
vol 81, Nº 6: 557-559 (1996) describe una
pululanasa de alfa-amilasa alcalifílica de
Bacillus sp. La enzima tiene actividad amilasa óptima a pH
9, pero la actividad cae rápidamente a pH más alto, y la actividad a
pH 10 es menor que a pH 7.
WO 97/00324 (KAO) expone un gen que codifica una
\alpha-amilasa alcalina licuefactante derivada de
la cepa KSM-AP1378 de Bacillus sp. con el nº
de depósito FERM BP-3048 adecuada para
detergentes.
Es un objetivo de la presente invención
proporcionar nuevas \alpha-amilasas con un
rendimiento mejorado en soluciones alcalinas, especialmente en
soluciones detergentes alcalinas a pH aproximadamente
9-11.
La presente invención se refiere a polipéptidos
aislados con actividad \alpha-amilasa y con una
secuencia de aminoácidos que consiste en los aminoácidos del 1 al
485 de la SEC ID No:2 o la SEC ID No:4.
La presente invención también se refiere a
secuencias de ácidos nucleicos aisladas que codifican los
polipéptidos y a constructos de ácidos nucleicos, vectores, y
células huéspedes que comprenden las secuencias de ácidos nucleicos
al igual que métodos para producir y usar los polipéptidos.
La presente invención está ilustrada con mayor
detalle con referencia a los dibujos anexos, donde:
La Figura 1 muestra el alineamiento de varias
\alpha-amilasas de Bacillus.
La Figura 2 muestra el Perfil de pH de las
\alpha-amilasas AAI-6 y
AAI-10 en comparación con las
\alpha-amilasas SP722 y SP690. La actividad se
muestra en valores absolutos como Abs650/mg. El perfil de pH se
mide a 37ºC.
La Figura 3 muestra el Perfil de Temperatura de
las \alpha-amilasas AAI-6 y
AAI-10 a pH 9.0 en comparación con las
\alpha-amilasas de referencia SP722 y SP690.
La Figura 4 muestra el rendimiento de lavado de
AAI-6 y AAI-10 en el AP Model
Detergent 97 en comparación con SP722, SP690 y Termamyl®.
\newpage
La Figura 5 muestra el rendimiento de lavado de
AAI-6 y AAI-10 en Omo Multi Acao en
comparación con SP722, SP690 y Termamyl®.
La Figura 6 muestra el rendimiento de lavado de
AAI-6 y AAI-10 en Omo Concentrado
en comparación con SP722, SP690 y Termamyl®.
La Figura 7 muestra el rendimiento de lavado de
AAI-6 y AAI-10 en Ariel Futur
líquido en comparación con SP722, SP690 y Termamyl®.
Las \alpha-amilasas alcalinas
de la invención pueden ser derivadas de una cepa de
Bacillus. Cepas preferidas son las cepas DSM 12650 (la
\alpha-amilasa AAI-6) o DSM 12651
(la \alpha-amilasa AAI-10) de
Bacillus sp. Estas cepas fueron depositadas el 25 de enero
de 1999 por los inventores según las condiciones del Tratado de
Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de
Microorganismos a los fines del Procedimiento en Materia de Patentes
en la empresa Deutshe Sammmlung von Microorganismen und
Zellkulturen Gmbh (DSMZ), Mascheroder Weg 1b,
D-38124 Braunschweig DE.
Las cepas denominadas NN049469 y NN049468 de
Escherichia coli que contienen los genes de
\alpha-amilasa en los plásmidos pLiH1300 (AAI 6) y
pLiH1298 (AAI10), respectivamente, también fueron depositados el 7
de abril de 1999 según las condiciones del Tratado de Budapest con
la empresa Deutshe Sammmlung von Microorganismen und Zellkulturen
Gmbh (DSMZ), Mascheroder Weg 1b, D-38124
Braunschweig DE, y fueron dados los números de acceso DSM12763 y
DSM12762, respectivamente. Los organismos donantes de
Bacillus sp. depositados anteriormente fueron recogidos en
Islandia en 1997.
Las \alpha-amilasas
(\alpha-1,4-glucano-4-glucanohidrolasas,
EC 3,2,1,1) constituyen un grupo de enzimas, que catalizan la
hidrólisis del almidón y otros oligo y polisacáridos
1,4-glucosídicos lineales y ramificados. A efectos
de la presente invención, la actividad
\alpha-amilasa es determinada usando el ensayo
Phadebas o el ensayo pNPG7 descritos más adelante en la sección
"Materiales y Métodos".
La homología de la secuencia de aminoácidos se
puede determinar como el grado de identidad entre las dos
secuencias que indica una derivación entre la primera secuencia y
la segunda. La homología puede ser determinada de forma adecuada
mediante programas informáticos conocidos en la técnica. Así, el GAP
proporcionado en la versión 8 del GCG (Needleman, S.B. and Wunsch,
C.D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48:
443-453) puede ser usado para alinear parejas de las
secuencias y calcular el grado de identidad o grado de homología
usando los ajustes por defecto. De forma alternativa, el GAP de la
versión 9 del GCG puede ser usado con una versión 8 traducida de la
matriz de marcado peptídico, una penalización de creación de Gap de
30, una penalización de extensión de Gap de 1 usando matriz de ntol
(http://plasmid/\simbioweb/matrix/) sin penalización de Gap
terminal.
Una búsqueda de homología de secuencias
conocidas mostró homologías para las secuencias de la invención con
varias amilasas de Bacillus en el rango
67-81% en aminoácidos determinadas como se ha
descrito anteriormente.
Específicamente, las
\alpha-amilasas homólogas a las secuencias de la
invención (es decir, la SEC ID No: 2 y la SEC ID No: 4) son SP690
(la SEC ID No: 1 de la patente US nº 5.856.164, que es homóloga en
aproximadamente un 81%), SP722 (la SEC ID No: 2 de la patente US nº
5.856.164, que es homóloga en aproximadamente un 81%) y la parte
madura (aminoácidos 31-516) de la
\alpha-amilasa KSM-AP1378
obtenida de Bacillus sp. divulgada como la SEC ID No: 2 de WO
97/00324, que es homóloga en aproximadamente un 81% a las
secuencias de la invención.
Preferiblemente, los polipéptidos de la presente
invención comprenden la secuencia de aminoácidos de la SEC ID No: 2
o la SEC ID No: 4 o una variante alélica de la misma; o un
fragmento del mismo que tenga actividad
\alpha-amilasa. La SEC ID No: 2 o la SEC ID No: 4
muestran la parte madura de las \alpha-amilasas
alcalinas de la invención.
Un fragmento de la SEC ID No: 2 o la SEC ID No:
4 son polipéptidos con uno o más aminoácidos delecionados del amino
y/o carboxilo terminal de esta secuencia de aminoácidos.
Una variante alélica denota cualquiera de las
dos o más formas alternativas de un gen que ocupa la misma
localización cromosómica. Una variación alélica surge de forma
natural a través de una mutación, y puede suponer polimorfismo
dentro de poblaciones. Las mutaciones de genes pueden ser
silenciosas (ningún cambio en el polipéptido codificado) o pueden
codificar polipéptidos que tengan secuencias de aminoácidos
alterados. Una variante alélica de un polipéptido es un polipéptido
codificado por una variante alélica de un gen.
Las secuencias de aminoácidos de los
polipéptidos homólogos pueden diferir de la secuencia de
aminoácidos de la SEC ID No: 2 o la SEC ID No: 4 por una inserción
o deleción de uno o más residuos aminoácidos y/o la sustitución de
uno o más residuos aminoácidos por diferentes residuos aminoácidos.
Preferiblemente, los cambios de aminoácidos son de una naturaleza
menor que la de las sustituciones de aminoácidos conservadoras que
no afectan de forma significativa al doblamiento y/o a la actividad
de la proteína; pequeñas deleciones, normalmente de uno a
aproximadamente 30 aminoácidos; extensiones amino o carboxilo
terminales pequeñas, tales como un residuo de metionina
aminoterminal; un pequeño péptido de enlace de hasta
aproximadamente 20-25 residuos; o una pequeña
extensión que facilite la purificación cambiando la carga neta u
otra función, tal como un tracto de polihistidina, un epítopo
antigénico o un dominio de unión.
Se encuentran ejemplos de sustituciones
conservadoras dentro de los grupos de aminoácidos básicos
(arginina, lisina e histidina), aminoácidos acídicos (ácido
glutámico y ácido aspártico), aminoácidos polares (glutamina y
asparagina), aminoácidos hidrofóbicos (leucina, isoleucina y
valina), aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptófano y
tirosina), y aminoácidos pequeños (glicina, alanina, serina,
treonina y metionina). Las sustituciones de aminoácidos, que
generalmente no alteran la actividad específica, son conocidas en
la técnica y son descritas, por ejemplo, por H. Neurath y R.L.
Hill, 1979, en The Proteins, Academic Press, New York. Los cambios
que se dan con más frecuencia son Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu,
Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe,
Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu y Asp/Gly al
igual que los mismos a la inversa.
En una segunda forma de realización, la presente
invención se refiere a polipéptidos aislados con actividad
\alpha-amilasa los cuales son codificados por
secuencias de ácidos nucleicos que hibridan bajo condiciones de
astringencia media, más preferiblemente bajo condiciones de
astringencia media-alta, incluso más
preferiblemente bajo condiciones de astringencia alta, y de la forma
más preferible bajo condiciones de astringencia altísima con una
sonda de ácidos nucleicos que hibride según las mismas condiciones
con (i) la secuencia de ácidos nucléicos de la SEC ID No: 1 o la
SEC ID No: 3, (ii) la secuencia de ADNc de la SEC ID No: 1 o la SEC
ID No: 3, (iii) una subsecuencia de (i) o (ii), o (iv) una cadena
complementaria de (i), (II), o (iii) (J. Sambrook, E.F. Fritsch,
and T. Maniatus, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d
edition, Cold Spring Harbor, New York). La subsecuencia de la SEC
ID No: 1 o la SEC ID No: 3 puede ser de al menos 100 nucleótidos o
preferiblemente al menos 200 nucleótidos. Además, la subsecuencia
puede codificar un fragmento de polipéptido que tenga actividad
\alpha-amilasa. Los polipéptidos pueden ser
también variantes alélicas o fragmentos de los polipéptidos que
tengan actividad \alpha-amilasa.
La secuencia de ácidos nucléicos de la SEC ID
No: 1 o la SEC ID No: 3 o una subsecuencia de la misma, al igual
que la secuencia de aminoácidos de la SEC ID No: 2 o la SEC ID No:
4 o un fragmento de la misma, puede ser usada con el fin de diseñar
una sonda de ácidos nucleicos para identificar y clonar ADN que
codifique polipéptidos con actividad
\alpha-amilasa de cepas de diferentes géneros o
especies según métodos bien conocidos en la técnica. En particular,
esta clase de sondas pueden ser usadas para la hibridación con el
ADN genómico o ADNc del género o especie de interés, siguiendo los
procedimientos de transferencia estándar de Southern, con el fin de
identificar y aislar el gen correspondiente en su interior. Este
tipo de sondas pueden ser considerablemente más cortas que la
secuencia entera, pero deberían ser de al menos 15, preferiblemente
de al menos 25, y más preferiblemente de al menos 35 nucleótidos de
longitud. También pueden ser usadas sondas más largas. Ambas sondas
de ADN y ARN pueden ser usadas. Las sondas son marcadas de forma
típica para detectar el gen correspondiente (por ejemplo, con 32P,
3H, 35S, biotina o avidina). La presente invención abarca este tipo
de sondas.
Así, un ADN genómico o una genoteca de ADNc
obtenidos a partir de estos otros organismos pueden ser cribados
para ADN que hibride con las sondas descritas anteriormente y que
codifique un polipéptido que tenga actividad
\alpha-amilasa. El ADN genómico u otro ADN puede
ser separado de estos otros organismos mediante agarosa o
electroforesis en gel de poliacrilamida, u otras técnicas de
separación. El ADN de las genotecas o el ADN separado puede ser
transferido e inmovilizado en nitrocelulosa u otro material
portador adecuado. Para identificar un clon o ADN homólogo a la SEC
ID No: 1 o la SEC ID No: 3 o subsecuencias de las mismas, el
material portador es usado en una transferencia de Southern. A
efectos de la presente invención, la hibridación indica que la
secuencia de ácidos nucléicos hibrida a una sonda de ácidos
nucleicos correspondiente a la secuencia de ácidos nucléicos
mostrada en la SEC ID No: 1 o la SEC ID No: 3, su cadena
complementaria, o una subsecuencia de la misma, bajo condiciones de
astringencia media hasta altísima. Las moléculas a las que la sonda
de ácidos nucleicos hibrida bajo estas condiciones son detectadas
usando película radiográfica.
En otra forma de realización preferida, la sonda
de ácidos nucleicos es la secuencia de ácidos nucléicos contenida
en los plásmidos pLiH1300 (AAI6) o pLiH1298 (AAI10),
respectivamente, que están contenidas en la DSM12763 de
Escherichia coli o la DSM12762 de Escherichia coli,
respectivamente, o, en el lugar donde la secuencia de ácidos
nucléicos codifica un polipéptido con actividad
\alpha-amilasa ácida de la invención y se
muestran en la SEC ID No: 2 o la SEC ID No: 4, respectivamente.
Para sondas largas de al menos 100 nucleótidos
de longitud, las condiciones de astringencia media a altísima se
definen como prehibridación e hibridación a 42ºC en 5X SSPE, 0.3%
de SDS, 200 micro g/ml de ADN de esperma de salmón cortado y
desnaturalizado, 35% de formamida para astringencias medias y
medias-altas, o 50% de formamida para astringencias
altas y altísimas, siguiendo procedimientos de transferencia
estándar de Southern.
Para sondas largas de al menos 100 nucleótidos
de longitud, el material portador es finalmente lavado tres veces
cada uno durante 15 minutos usando 2 X de SSC, 0.2% de SDS
preferiblemente al menos a 55ºC (astringencia media),
preferiblemente al menos a 60ºC (astringencia
media-alta), más preferiblemente al menos a 65ºC
(astringencia alta), y de la forma más preferible al menos a 70ºC
(astringencia altísima).
Para sondas cortas que tengan aproximadamente de
15 nucleótidos a aproximadamente 70 nucleótidos de longitud, las
condiciones de astringencia se definen como prehibridación,
hibridación, y lavado post-hibridación a 5ºC hasta
10ºC por debajo del T_{m} calculado usando el cálculo según Bolton
y McCarti (1962, Proceedings of the National Academy of Sciences
USA 48:1390) en 0.9 M de NaCl, 0.09 M de tris-HCl a
pH 7.6, 6 mM de EDTA, 0.5% de NP-40, 1X de la
solución de Denhardt, 1 mM de pirofosfato de sodio, 1 mM de sodio
fosfato monobásico, 0.1 mM de ATP, y 0.2 mg de de ARN de levadura
por ml siguiendo los procedimientos de transferencia estándar de
Southern.
Para sondas cortas, con aproximadamente 15
nucleótidos hasta aproximadamente 70 nucleótidos de longitud, el
material portador es lavado una vez en 6X SCC más 0.1% SDS durante
15 minutos y dos veces cada uno durante 15 minutos usando 6X SSC a
5ºC hasta 10ºC por debajo del T_{m} calculado.
En una tercera forma de realización, la presente
invención se refiere a polipéptidos aislados, es decir, los
polipéptidos mostrados en la SEC ID No: 2 o la SEC ID No: 4, que
tienen las propiedades fisicoquímicas siguientes:
Una temperatura óptima (véase la Fig. 3)
determinada mediante el método de Phadebas (pH 9.0) en el rango
entre 55 y 65ºC, más precisamente a aproximadamente 60ºC.
Un pl para AAI-6 determinado
mediante enfoque isoeléctrico resultó estar entre
7-7.3, y el pl para AAI-10 resultó
estar entre 7-8.
Un polipéptido de la presente invención puede
ser obtenido a partir de microorganismos de cualquier género. A
efectos de la presente invención, el término "obtenido a partir
de" utilizado en este caso, en relación con una fuente dada,
significará que el polipéptido codificado por la secuencia de ácidos
nucléicos ha sido producido por la fuente o por una célula en la
cual se ha insertado la secuencia de ácidos nucléicos de la
fuente.
Un polipéptido de la presente invención puede
ser un polipéptido bacteriano. Por ejemplo, el polipéptido puede
ser un polipéptido de bacteria gram positiva tal como un
polipéptido de Bacillus, p. ej., un polipéptido de
Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus
brevis, Bacillus circulans, Bacillus coagulans, Bacillus lautus,
Bacillus lentus, Bacillus licheni formis, Bacillus megaterium,
Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, o Bacillus
thuringiensis; o un polipéptido de Streptomyces, p. ej.,
un polipéptido de Streptomyces lividans o Streptomyces
murinus; o un polipéptido de bacteria gram negativa, p. ej., un
polipéptido de E. coli o de Pseudomona sp.
En otra forma de realización preferida, el
polipéptido es un polipéptido de Bacillus sp., en una forma
de realización más preferida, el polipéptido es un polipéptido DSM
12650 de Bacillus sp. y un polipéptido DSM 12651 de
Bacillus sp., p. ej., el polipéptido con la secuencia de
aminoácidos de la SEC ID No: 2 o la SEC ID No: 4,
respectivamente.
Se entenderá que para las especies mencionadas
anteriormente, la invención abarca tanto el estado perfecto como el
imperfecto, y otros equivalentes taxonómicos, p. ej., anamorfos, a
pesar del nombre de especie por el que estos son conocidos. Los
expertos en la técnica reconocerán fácilmente la identidad de
equivalentes apropiados.
Cepas de estas especies están fácilmente
disponibles para el público en varias colecciones de cultivo, tales
como el American Type Culture Collection (ATCC), la Deutsche
Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen Gmbh (DSM), el
Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS), y la Agricultural
Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional
Research Center (NRRL).
Además, los polipéptidos de este tipo pueden ser
identificados y obtenidos de otras fuentes incluyendo
microorganismos aislados provenientes de la naturaleza (p. ej., de
tierra, abonos, agua, etc.) usando las sondas mencionadas
anteriormente. Son bien conocidas en la materia técnicas para
aislar microorganismos de hábitats naturales.
La secuencia de ácidos nucléicos puede ser
entonces derivada seleccionando por similaridad una genoteca
genómica o genoteca de ADNc de otro microorganismo. Una vez ha sido
detectada con la(s) sonda(s) una secuencia de ácidos
nucléicos que codifique un polipéptido, la secuencia puede ser
aislada o clonada utilizando técnicas conocidas para los técnicos
en la materia (véase, p. ej., Sambrook et al., 1989,
supra).
Tal y como se define aquí, un polipéptido
"aislado" es un polipéptido esencialmente libre de otros
polipéptidos que no son de \alpha-amilasa, p. ej.,
con al menos aproximadamente un 20% de pureza, preferiblemente con
al menos aproximadamente un 40% de pureza, más preferiblemente con
aproximadamente un 60% de pureza, incluso más preferiblemente con
aproximadamente un 80% de pureza, de la forma más preferible con
aproximadamente un 90% de pureza, e incluso de la forma más
preferible con aproximadamente un 95% de pureza, como se ha
determinado por SDS-PAGE.
Los polipéptidos codificados por secuencias de
ácidos nucleicos de la presente invención también incluyen
polipéptidos fusionados o polipéptidos divisibles de fusión en los
cuales otro polipéptido es fusionado en el
N-terminal o el C-terminal del
polipéptido o fragmento del mismo. Un polipéptido fusionado es
producido fusionando una secuencia de ácidos nucléicos (o una parte
de la misma) que codifique otro polipéptido a una secuencia de
ácidos nucléicos (o una parte de la misma) de la presente
invención. Son conocidas en la materia técnicas para producir
polipéptidos de fusión, e incluyen ligar las secuencias
codificantes que codifican los polipéptidos de modo que queden en
forma estructurada y que la expresión del polipéptido fusionado
quede bajo el control del mismo promotor(es) y
terminador.
El término "rendimiento de lavado mejorado"
en el contexto de la presente invención significa un rendimiento
determinado según las condiciones de lavado descritas en el ejemplo
9, el cual es superior a otras alfa-amilasas usadas
para lavar, p. ej., SP690; SP722 y Termamyl®, o en el caso de un
mutante/variante de la invención en comparación con la
alfa-amilasa parental, es decir, el no mutado, tal
como una estructura de alfa-amilasa no
sustituida.
En el contexto de la invención el término "pH
ácido" significa un pH por debajo de 7.0, especialmente por
debajo del rango de pH en el cual son realizados normalmente los
procesos de licuefacción de almidón industrial, que está entre un pH
5.5 y 6.2.
En el contexto de la presente invención el
término "baja concentración de calcio" hace referencia a
concentraciones por debajo del nivel normal usado en la
licuefacción de almidón industrial. Las concentraciones normales
varían dependiendo de la concentración de Ca^{2+} libre en el
maíz. Normalmente se añade una dosis correspondiente a 1 mM (40
ppm), la cual junto con el nivel en el maíz hacen entre 40 y 60 ppm
de Ca^{2+} libre.
En el contexto de la invención el término
"altas temperaturas" quiere decir entre 95ºC y 160ºC,
especialmente el rango de temperatura en el cual se realizan
normalmente los procesos de licuefacción de almidón industrial, que
es entre 95ºC y 105ºC.
Se puede mencionar aquí que los residuos
aminoácidos, respectivamente, en las posiciones correspondientes a
N195, V206, E212 y E216, respectivamente, en la SEC ID No: 2 o la
SEC ID No: 4 constituyen residuos aminoácidos, los cuales son
conservados en numerosas alfa-amilasas del tipo
Termamyl, es decir, Termamyl® (alfa-amilasa de
B. licheniformis). Así, por ejemplo, las posiciones
correspondientes de los residuos en AAI-10 y
AAI-6 y Termamyl se pueden ver en el alineamiento de
la Fig. 1 y en las Tabla 1 y Tabla 2, a continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La secuencia de ADN que codifica una
alf\alpha-amilasa parental tal y como se ha
definido anteriormente puede ser aislada de cualquier célula o
microorganismo que produzca la alfa-amilasa en
cuestión, usando diferentes métodos bien conocidos en la técnica.
En primer lugar debería construirse un ADN genómico y/o genoteca de
ADNc usando ADN cromosómico o ARN mensajero del organismo que
produce la alfa-amilasa que se va a estudiar.
Entonces, si la secuencia de aminoácidos de la
alfa-amilasa es conocida, las sondas
oligonucleótidas homólogas marcadas pueden ser sintetizadas y
usadas para identificar clones que codifiquen
alfa-amilasas de una genoteca genómica obtenida a
partir del organismo en cuestión. De forma alternativa, una sonda
de oligonucleótidos marcada que contenga secuencias homólogas a un
gen conocido de alfa-amilasa podría ser usada como
sonda para identificar clones que codifiquen
alfa-amilasas, usando condiciones de hibridación y
lavado de menor astringencia.
Otro método para identificar clones que
codifiquen alfa-amilasas implicaría insertar
fragmentos de ADN genómico en un vector de expresión, tal como un
plásmido, transfomar las bacterias alfa-amilasa
negativas con la genoteca de ADN genómico resultante, y luego fijar
las bacterias transformadas sobre agar que contenga un sustrato
para alfa-amilasa, permitiendo de ese modo
identificar clones que expresen la
alfa-amilasa.
De forma alternativa, la secuencia de ADN que
codifica la enzima puede ser preparada sintéticamente mediante
métodos estándares establecidos, p. ej., el método de fosforamidita
descrito por S.L. Beaucage y M.H. Caruthers (1981) o el método
descrito por Matthes et al. (1984). En el método de
fosforamidita, los oligonucleótidos son sintetizados, p. ej., en un
sintetizador de ADN automático, purificado, anillado, ligado y
clonado en vectores apropiados.
Finalmente, la secuencia de ADN puede ser de
origen mixto genómico y sintético, de origen mixto sintético y de
ADNc o de origen mixto genómico y de ADNc, preparado mediante la
ligadura de fragmentos de origen sintético, genómico o de ADNc
(según el caso, los fragmentos correspondientes a las diferentes
partes de la secuencia de ADN entera), conforme a técnicas
estándares. La secuencia de ADN también puede ser preparada por
reacción en cadena de polimerasa (PCR) usando cebadores
específicos, por ejemplo como se describe en US 4.683.202 o en R.K.
Saiki et al. (1988).
Una vez haya sido aislada una secuencia de ADN
que codifique la alfa-amilasa, y hayan sido
identificados sitios deseables para la mutación, las mutaciones
pueden ser introducidas usando oligonucleótidos sintéticos. Estos
oligonucleótidos contienen secuencias de nucleótidos que flanquean
los sitios de mutación deseados; los nucleótidos mutantes son
insertados durante la síntesis oligonucleótida. En un método
específico, un espacio monocatenario de ADN, que conecta la
secuencia de alfa- amilasas, es creado en un vector portador del gen
de alfa-amilasa. Después, el nucleótido sintético
que soporta la mutación deseada es anillado a una parte homóloga
del ADN monocatenario. El espacio restante es llenado entonces con
ADN polimerasa I (fragmento de Klenow) y el constructo es ligado
usando T4 ligasa. Un ejemplo específico de este método está
descrito en Morinaga et al. (1984). US 4.760.025 revela la
introducción de oligonucleótidos que codifican mutaciones múltiples
realizando alteraciones menores del casete. No obstante, una
variedad de mutaciones incluso mayor puede ser introducida en
cualquier momento mediante el método de Morinaga, ya que puede ser
introducida una multitud de oligonucleótidos de diferentes
longitudes.
Se describe otro método para introducir
mutaciones en secuencias de ADN que codifiquen
alfa-amilasas en Nelson and Long (1989). Ello
implica la generación en 3 fases de un fragmento de PCR que
contenga la mutación deseada, la cual se introduce usando una
cadena de ADN sintetizada químicamente como uno de los cebadores en
las reacciones PCR. Del fragmento generado de PCR, un fragmento de
ADN portador de la mutación puede ser aislado mediante ruptura con
endonucleasas de restricción y reinsertado en un plásmido de
expresión.
Métodos alternativos para suministrar variantes
de la invención incluyen el método de redistribución de genes
conocido en la técnica, incluyendo los métodos, p. ej., descritos
en WO 95/22625 (de Affymax Technologies N.V.) y WO 96/00343 (de
Novo Nordisk NS).
Según la invención, una secuencia de ADN que
codifica la variante producida mediante métodos anteriormente
descritos, o mediante cualquier método alternativo conocido en la
técnica, puede ser expresada, en forma de enzima, usando un vector
de expresión, el cual normalmente incluye secuencias de control que
codifican un promotor, operador, centro de unión de ribosomas,
señal de iniciación de traducción, y, opcionalmente, un gen
represor o varios genes activadores.
El vector de expresión recombinante portador de
la secuencia de ADN que codifica una variante de
alfa-amilasa de la invención puede ser cualquier
vector que pueda ser expuesto convenientemente a procedimientos de
ADN recombinantes, y la elección del vector dependerá
frecuentemente de la célula huésped en la que éste se vaya a
introducir. Así, el vector puede ser un vector de replicación
autónoma, es decir, un vector que exista como una entidad
extracromosómica, la replicación del cual sea independiente de
replicaciones cromosómicas, p. ej., un plásmido, un bacteriófago o
un elemento extracromosómico, un minicromosoma o un cromosoma
artificial. De forma alternativa, el vector puede ser tal que, al
ser introducido en una célula huésped, sea integrado en el genoma
de la célula huésped y replicado junto con el (los)
cromosoma(s) en el que ha sido integrado.
En el vector, la secuencia de ADN debería estar
operativamente conectada a una secuencia promotora adecuada. El
promotor puede ser cualquier secuencia de ADN que muestre actividad
transcripcional en la célula huésped de elección y que pueda ser
derivada de genes que codifiquen proteínas, ya sean homólogas o
heterólogas a la célula huésped. Ejemplos de promotores adecuados
para dirigir la transcripción de la secuencia de ADN que codifica
una variante de alfa-amilasa de la invención,
especialmente en un huésped bacteriano, son el promotor del operón
lac de E. coli, los promotores dagA de los genes de
agarasa de Streptomyces coelicolor, los promotores de los
genes de alfa-amilasa de Bacillus
licheniformis (amyL), los promotores de los genes de amilasa
maltogénica de Bacillus stearothermophilus (amyM), los
promotores de la alfa-amilasa de Bacillus
amyloliquefaciens (amyQ), los promotores de los genes xylA y
xylB de Bacillus subtilis, etc. Para la transcripción en un
huésped fúngico son ejemplos de promotores útiles aquellos derivados
del gen que codifica la amilasa TAKA de A. oryzae, la
proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei, la
alfa-amilasa neutra de A. niger, la
alfa-amilasa estable en ácido de A. niger, la
glucoamilasa de A. niger, la lipasa de Rhizomucor
miehei, la proteasa alcalina de A. oryzae, la
Triosafosfato isomerasa de A. oryzae o la acetamidasa de
A. nidulans.
El vector de expresión de la invención también
puede comprender un terminador de transcripción adecuado y, en
eucariotas, secuencias de poliadenilación operativamente conectadas
a la secuencia de ADN que codifica la variante de
alfa-amilasa de la invención. La terminación y las
secuencias de poliadenilación pueden derivar de manera adecuada de
las mismas fuentes que el promotor.
El vector puede comprender además una secuencia
de ADN que permita replicar el vector en la célula huésped en
cuestión. Ejemplos de secuencias de este tipo son los orígenes de
la replicación de los plásmidos pUC19; pACiC177; pUB110; pE194;
pAMB1 y p0J702.
El vector puede comprender también un marcador
seleccionable, p. ej. un gen cuyo producto complemente un defecto
en la célula huésped, tal como el gen dal de B.
subtilis o B. licheniformis, o uno que confiera
resistencia antibiótica a p. ej. la ampicilina, la canamicina, el
cloranfenicol o la tetraciclina. Además, el vector puede comprender
marcadores de selección de Aspergillus tales como amdS, argB,
niaD y sC o un marcador que origine resistencia a la higromicina; o
se puede realizar la selección por cotransformación, p. ej., como
se describe en WO 91/17243.
A pesar de que la expresión intracelular puede
ser ventajosa en algunos aspectos, p. ej., cuando se usan bacterias
determinadas como células huéspedes, se prefiere generalmente que
la expresión sea extracelular. En general, las
alfa-amilasas de Bacillus mencionadas aquí
comprenden una preregión que permite la secreción en el medio de
cultivo de la proteasa expresada. Si se desea, esta preregión puede
sustituirse por una preregión diferente o secuencia de señal,
convenientemente realizada mediante sustitución de las secuencias de
ADN que codifican las respectivas preregiones.
Los procedimientos usados para enlazar el
constructo de ADN de la invención que codifica una variante de
alfa-amilasa, el promotor, terminador y otros
elementos, respectivamente, y para insertarlos en vectores
adecuados que contengan la información necesaria para la
replicación son bien conocidos por los expertos en la técnica (cf.,
por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory
Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor, 1989).
La célula de la invención, ya comprenda un
constructo de ADN o un vector de expresión de la invención tal como
se ha definido anteriormente, se usa ventajosamente como célula
huésped en la producción recombinante de una variante de
alfa-amilasa de la invención. La célula puede ser
transformada con el constructo de ADN de la invención que codifica
la variante, integrando convenientemente el constructo de ADN (en
una o más copias) en el cromosoma huésped. Esta integración está
considerada generalmente como una ventaja en tanto en cuanto la
secuencia de ADN tiene más posibilidades de mantenerse estable en
la célula. La integración de los constructos de ADN en el cromosoma
huésped puede realizarse según métodos convencionales, p. ej.,
mediante recombinación homóloga o heteróloga. De forma alternativa,
la célula puede ser transformada con un vector de expresión como se
ha descrito anteriormente en relación con los diferentes tipos de
células huéspedes.
La célula de la invención puede ser una célula
de un organismo superior tal como un mamífero o un insecto, pero
preferiblemente es una célula microbiana, p. ej., una célula
bacteriana o fúngica (incluyendo la levadura).
Son ejemplos de bacterias adecuadas las
bacterias Gram positivas tales como Bacillus subtilis, Bacillus
licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus
stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus
amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus circulans, Bacillus
lautus, Bacillus megaterium, Bacillus thuringiensis, o
Streptomyces lividans o Streptomyces murinus, o las
bacterias Gram negativas tales como E. coli. La
transformación de las bacterias puede, por ejemplo, ser efectuada
por transformación de protoplasto o usando células competentes de
manera conocida per se.
El organismo de levadura se puede seleccionar
favorablemente de una especie de Saccharomyces o
Schizosaccharomyces, p. ej., de Saccharomyces
cerevisiae. El hongo filamentoso puede pertenecer
ventajosamente a una especie de Aspergillus, p. ej.,
Aspergillus oryzae o Aspergillus niger. Las células
micóticas pueden ser transformadas mediante un proceso que implica
la formación de protoplastos y la transformación de los
protoplastos seguida de la regeneración de la pared celular de forma
conocida per se. Un procedimiento adecuado para transformar
células huéspedes de Aspergillus está descrita en EP 238
023.
En otro aspecto, la presente invención se
refiere a un método para producir una variante de
alfa-amilasa de la invención, el cual implica
cultivar una célula huésped como se ha descrito anteriormente, bajo
condiciones propicias para la producción de la variante, y
recuperar la misma a partir de las células y/o el medio de
cultivo.
El medio usado para cultivar las células puede
ser cualquier medio convencional adecuado para que crezca la célula
huésped en cuestión y para obtener la expresión de la variante de
alfa-amilasa de la invención.
Medios adecuados se pueden conseguir a través de
proveedores comerciales, o se pueden preparar según recetas
publicadas (p. ej., como se describe en los catálogos de la
American Type Culture Collection).
La variante de alfa-amilasa
segregada por las células huéspedes puede recuperarse
convenientemente a partir del medio de cultivo mediante
procedimientos bien conocidos, que incluyen separar las células del
medio por centrifugado o filtración, y precipitar componentes
proteínicos del medio utilizando una sal tal como sulfato de
amonio, seguido de procedimientos cromatográficos tales como la
cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad, o
similar.
La presente invención también se refiere a
secuencias de ácidos nucleicos aisladas, las cuales codifican un
polipéptido de la presente invención. En una forma de realización
preferida, la secuencia de ácidos nucléicos está establecida en la
SEC ID No: 1. En otra forma de realización más preferida, la
secuencia de ácidos nucléicos es la secuencia contenida en el
plásmido pLIH1300 (AAI 6) o el plásmido LiH1298 (AAI 10),
respectivamente, que está contenida en la DSM12763 de Escherichia
coli y en la DSM 12762 de Escherichia coli,
respectivamente. En otra forma de realización preferida, la
secuencia de ácidos nucléicos es la región de codificación de los
polipéptidos maduros de la SEC ID No: 1 o la SEC ID No: 3. La
presente invención también abarca secuencias de ácidos nucleicos
que codifican un polipéptido con la secuencia de aminoácidos de la
SEC ID No: 2 o la SEC ID No: 4, las cuales difieren de la SEC ID
No: 1 o la SEC ID No: 3 en virtud de la degeneración del código
genético. La presente invención también se refiere a subsecuencias
de la SEC ID No: 1 o la SEC ID No: 3 que codifican fragmentos de la
SEC ID No: 2 o la SEC ID No: 4, respectivamente, con actividad
\alpha-amilasa.
Las subsecuencias de la SEC ID No: 1 o la SEC ID
No: 3 son secuencias de ácidos nucleicos contenidas en la SEC ID
No: 1 o la SEC ID No: 3 excepto que el o los nucleótidos de los
extremos 5' y/o 3' han sido delecionados.
La presente invención también se refiere a
secuencias de ácidos nucleicos mutantes que comprenden al menos una
mutación en la secuencia de codificación del polipéptido maduro de
la SEC ID No: 1 o la SEC ID No: 3, en las cuales la secuencia de
ácidos nucléicos mutante codifica un polipéptido que consiste en los
aminoácidos del 1 al 485 de la SEC ID No: 2 o la SEC ID No: 4.
Las técnicas usadas para aislar o clonar una
secuencia de ácidos nucléicos que codifica un polipéptido son
conocidas en la materia e incluyen el aislamiento a partir de ADN
genómico, la preparación a partir de ADNc, o una combinación de los
mismos. La clonación de las secuencias de ácidos nucleicos de la
presente invención a partir de dicho ADN genómico puede efectuarse,
p. ej., usando la bien conocida reacción en cadena de la polimerasa
(PCR) o el cribado de anticuerpos de librerías de expresión para
detectar fragmentos de ADN clonados con características
estructurales compartidas. Véase, p. ej., Innis et al.,
1990, PCR: A Guide to Methods and Application, Academic Press, New
York. Se pueden usar otros procedimientos de amplificación de
ácidos nucleicos tales como la reacción en cadena de la ligasa
(LCR), la transcripción activada ligada (LAT) y la amplificación
basada en una secuencia de ácidos nucleicos (NASBA). La secuencia
de ácidos nucléicos puede ser clonada a partir de una cepa de
Bacillus, u otro organismo u organismo emparentado y de este
modo, por ejemplo, puede ser una variante alélica o de especie del
polipéptido que codifica una región de la secuencia de ácidos
nucléicos.
El término "secuencia de ácidos nucleicos
aislada" como se utiliza en este caso se refiere a una secuencia
de ácidos nucleicos que está esencialmente libre de otras
secuencias de ácidos nucleicos, p. ej., que tiene al menos
aproximadamente un 20% de pureza, preferiblemente al menos
aproximadamente un 40% de pureza, más preferiblemente al menos
aproximadamente un 60% de pureza, incluso más preferiblemente al
menos aproximadamente un 80% de pureza, y de la forma más
preferible al menos aproximadamente un 90% de pureza como se ha
determinado por electroforesis de agarosa. Por ejemplo, una
secuencia de ácidos nucléicos aislada puede obtenerse mediante
procedimientos de clonación estándares usados en la ingeniería
genética para recolocar la secuencia de ácidos nucleicos desde su
ubicación natural a un sitio diferente, donde ésta se reproducirá.
Los procedimientos de clonación pueden implicar la escisión y el
aislamiento de un fragmento de ácido nucleico deseado que comprenda
la secuencia de ácidos nucleicos que codifica el polipéptido, la
inserción del fragmento en una molécula de vector, y la
incorporación del vector recombinante en una célula huésped, donde
se replicarán copias múltiples o clones de la secuencia de ácidos
nucleicos. La secuencia de ácidos nucleicos puede ser de origen
genómico, de ADNc, de ARN, semisintético, sintético, o de cualquier
combinación de los mismos.
La presente invención también se refiere a
constructos de ácidos nucleicos que comprenden una secuencia de
ácidos nucleicos de la presente invención, operativamente enlazada
a una o más secuencias de control, la cual dirige la expresión de
la secuencia codificante en una célula huésped adecuada bajo
condiciones compatibles con las secuencias de control. Se entenderá
que la expresión incluye cualquier fase implicada en la producción
del polipéptido incluyendo, pero no limitándose a la transcripción,
modificación postranscripcional, traducción, modificación
postraduccional, y secreción.
Un "constructo de ácidos nucleicos" se
define aquí como una molécula de ácido nucleico, ya sea mono o
bicatenaria, que es aislada de un gen de origen natural o que ha
sido modificada para contener segmentos de ácidos nucleicos, los
cuales se combinan y superponen de modo que, de no ser así, no
existirían en la naturaleza. El término constructo de ácidos
nucleicos es sinónimo al término casete de expresión cuando el
constructo de ácidos nucléicos contiene todas las secuencias de
control requeridas para la expresión de una secuencia codificante
de la presente invención. El término "secuencia codificante"
se define aquí como una parte de una secuencia de ácidos nucleicos,
que especifica directamente la secuencia de aminoácidos de su
producto proteínico. Los límites de la secuencia codificante están
generalmente determinados por un centro de unión de ribosoma
(procariotas) o por el codón de iniciación ATG (eucariotas),
localizado justo encima del marco de lectura abierta en el extremo
5' del ARNm, y una secuencia del terminador de la transcripción
localizado justo debajo del marco de lectura abierta en el extremo
3' del ARNm. Una secuencia codificante puede incluir, pero no se
limita a ADN, ADNc, y secuencias de ácidos nucleicos
recombinantes.
recombinantes.
Una secuencia de ácidos nucleicos aislada que
codifica un polipéptido de la presente invención puede ser
manipulada de varias maneras para proporcionar la expresión del
polipéptido. La manipulación de la secuencia de ácidos nucléicos
antes de su inserción en un vector puede ser deseable o necesaria
dependiendo del vector de expresión. Las técnicas para modificar
secuencias de ácidos nucleicos utilizando técnicas de ADN
recombinante son bien conocidas en la materia.
El término "secuencias de control", según
se define aquí, incluye todos los componentes que son necesarios o
ventajosos para la expresión de un polipéptido de la presente
invención. Cada secuencia de control puede ser nativa o extraña para
la secuencia de ácidos nucleicos que codifica el polipéptido. Este
tipo de secuencias de control incluyen, pero no se limitan a una
secuencia líder, una secuencia de poliadenilación, una secuencia de
propéptidos, un promotor, una secuencia de péptidos señal, y un
terminador de la transcripción. Como mínimo, las secuencias de
control incluyen un promotor, y señales de parada transcripcionales
y traduccionales. Las secuencias de control pueden estar provistas
de enlaces con el propósito de introducir sitios de restricción
específicos que faciliten la ligadura de las secuencias de control
con la región codificante de la secuencia de ácidos nucléicos que
codifica un polipéptido. El término "operativamente enlazado"
se define aquí como una configuración en la cual una secuencia de
control está colocada apropiadamente en una posición relativa a la
secuencia codificante de la secuencia de ADN de manera que la
secuencia de control dirije la expresión de un polipéptido.
La secuencia de control puede ser una secuencia
promotora apropiada, una secuencia de ácidos nucléicos reconocida
por una célula huésped para la expresión de la secuencia de ácidos
nucleicos. La secuencia promotora contiene secuencias de control
transcripcionales, las cuales median la expresión del polipéptido.
El promotor puede ser cualquier secuencia de ácidos nucleicos que
muestre actividad transcripcional en la célula huésped de elección
incluyendo los promotores mutantes, truncados, e híbridos, y puede
obtenerse a partir de genes que codifican polipéptidos
extracelulares o intracelulares, ya sean homólogos o heterólogos a
la célula huésped.
Ejemplos de promotores adecuados para dirigir la
transcripción de los constructos de ácidos nucleicos de la presente
invención, especialmente en una célula huésped bacteriana, son los
promotores obtenidos del operón lac de E. coli, genes
de agarasa de Streptomyces coelicolor (dagA), genes
de levansucrasa de Bacillus subtilis (sacB), genes de
alfa-amilasa de Bacillus licheniformis
(amyL), genes de amilasa maltogénica de Bacillus
stearothermophilus (amyM), genes de
alfa-amilasa de Baccillus amyloliquefaciens
(amyQ), genes de penicilinasa de Bacillus
licheniformis (penP), los genes xylA y
xylB de Bacillus subtilis, y genes procariotas de
beta-lactamasa (Villa-Kamaroff et
al., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA
75: 3727-3731), al igual que el promotor tac (DeBoer
et al., 1983, Proceedings of the National Academy of
Sciences USA 80: 21-25). Se describen otros
promotores en "Useful proteins from recombinant bacteria" en
Scientific American, 1980, 242: 74-94; yen Sambrook
et al., 1989, supra.
La secuencia de control puede ser también una
secuencia adecuada del terminador de la transcripción, una
secuencia reconocida por una célula huésped para terminar la
transcripción. La secuencia del terminador está operativamente
enlazada al término 3' de la secuencia de ácidos nucleicos que
codifica el polipéptido. Cualquier terminador que sea funcional en
la célula huésped de elección puede usarse en la presente
invención.
La secuencia de control también puede ser una
región de codificación de péptido señal que codifique una secuencia
de aminoácidos enlazada al amino-término de un
polipéptido y dirija el polipéptido codificado dentro de la vía
secretora de la célula. El extremo 5' de la secuencia codificante
de la secuencia de ácidos nucléicos puede contener de forma
intrínseca una región de codificación de péptido señal naturalmente
enlazada con el segmento de la región de codificación que codifica
el polipéptido segregado en el marco de lectura de la traducción.
De forma alternativa, el extremo 5' de la secuencia codificante
puede contener una región de codificación del péptido señal extraña
para la secuencia codificante. La región de codificación extraña
del péptido señal puede ser requerida allí donde la secuencia
codificante no contenga de forma natural una región de codificación
del péptido señal. De forma alternativa, la región de codificación
extraña del péptido señal puede tan sólo reemplazar la región
codificante natural del péptido señal con el fin de aumentar la
secreción del polipéptido. No obstante, en la presente invención
puede usarse cualquier región de codificación del péptido señal que
dirija el polipéptido expresado dentro de la vía secretora de una
célula huésped de elección.
Regiones de codificación efectivas del péptido
señal para células huéspedes bacterianas son las regiones de
codificación del péptido señal obtenidas a partir de los genes para
la amilasa maltogénica NCIB 11837 de Bacillus, la
alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus,
la subtilisina de Bacillus licheniformis, la
beta-lactamasa de Bacillus licheniformis,
las proteasas neutrales Bacillus stearothermophilus (nprT,
nprS, nprM), y el prsA de Bacillus subtilis.
Otros péptidos señal están descritos en Simonen and Palva, 1993,
Microbiological Reviews 57: 109-137.
También puede ser deseable añadir secuencias
reguladoras que permitan la regulación de la expresión del
polipéptido relativa al crecimiento de la célula huésped. Ejemplos
de sistemas reguladores son aquellos que causan la expresión del gen
para conectarse o desconectarse en respuesta a un estímulo químico
o físico, incluyendo la presencia de un compuesto regulador.
Sistemas reguladores en sistemas procarióticos incluyen los
sistemas operadores lac, tac, y trp. En levadura se
pueden usar el sistema ADH2 o el sistema GAL1. En hongos
filamentosos se pueden usar el promotor de
alfa-amilasa TAKA, el promotor de glucoamilasa de
Aspergillus Niger, y el promotor de glucoamilasa de
Aspergillus otyzae como secuencias reguladoras. Otros
ejemplos de secuencias reguladoras son aquellas que permiten la
amplificación génica. En sistemas eucarióticos, éstas incluyen el
gen de dihidrofolato-reductasa, el cual se
amplifica en presencia de metotrexato, y los genes de
metalotioneina, los cuales se amplifican con metales pesados. En
estos casos, la secuencia de ácidos nucleicos que codifica el
polipéptido estaría operativamente enlazada a la secuencia
reguladora.
La presente invención también se refiere a
vectores de expresión recombinantes que comprenden una secuencia de
ácidos nucleicos de la presente invención, un promotor, y señales
de parada transcripcionales y traduccionales. Las diferentes
secuencias de ácidos nucleicos y de control anteriormente descritas
se pueden unir para producir un vector de expresión recombinante,
el cual a su vez puede incluir uno o más sitios de restricción
convenientes para permitir la inserción o sustitución de la
secuencia de ácidos nucleicos que codifica el polipéptido en tales
sitios. De forma alternativa, la secuencia de ácidos nucleicos de la
presente invención se puede expresar insertando la secuencia de
ácidos nucleicos o un constructo de ácidos nucleicos que comprenda
la secuencia dentro de un vector apropiado para la expresión. En la
creación del vector de expresión, la secuencia codificante está
localizada en el vector de tal manera que la secuencia codificante
esté operativamente enlazada a las secuencias de control apropiadas
para la expresión.
El vector de expresión recombinante puede ser
cualquier vector (p. ej., un plásmido o virus) que se pueda someter
de forma conveniente a procedimientos de ADN recombinantes y pueda
provocar la expresión de la secuencia de ácidos nucleicos. La
elección del vector dependerá normalmente de la compatibilidad del
vector con la célula huésped en la que se vaya a introducir el
vector. Los vectores pueden ser plásmidos circulares lineales o
cerrados.
El vector puede ser un vector de replicación
autónoma, es decir, un vector que existe como una entidad
extracromosómica, la replicación de la cual es independiente de la
replicación cromosómica, p. ej., un plásmido, un elemento
extracromosómico, un minicromosoma, o un cromosoma artificial. El
vector puede contener cualquier clase de medios para asegurar la
autorreplicación. De forma alternativa, el vector puede ser uno
que, al introducirse en la célula huésped, se integre dentro el
genoma y se replique junto con el cromosoma(s) en el cual
éste se ha integrado. Además, se puede usar un vector único o
plásmido o dos o más vectores o plásmidos, los cuales contienen en
conjunto el ADN total que se va a introducir en el genoma de la
célula huésped; o un transposón.
Los vectores de la presente invención contienen
preferiblemente uno o más marcadores seleccionables que permiten
una fácil selección de células transformadas. Un marcador
seleccionable es un gen cuyo producto proporciona resistencia a los
biocidas o a los virus, resistencia a los metales pesados,
prototrofía para auxótrofos, y similares. Ejemplos de marcadores
bacterianos seleccionables son los genes dal de Bacillus
subtilis o Bacillus licheniformis, o marcadores, los
cuales confieren resistencia antibiótica tal como resistencia a la
ampicilina, la canamicina, el cloranfenicol o la tetraciclina.
Marcadores adecuados para células huéspedes de levadura son ADE2,
HIS3, LEU2, LiS2, MET3, TRP1, y URA3. Un marcador seleccionable para
el uso en una célula huésped filamentosa fúngica se puede
seleccionar del grupo que incluye, pero no se limita a amdS
(acetamidasa), argB
(ornitina-carbamoiltransferasa), bar
(fosfonitricina acetiltransferasa), hygB (higromicina
fosfotransferasa), niaD (nitrato-reductasa),
pyrG
(orotidina-5'-fosfato-descarboxilasa),
sC (sulfato adenil transferasa), trpC (antranilato
sintasa), así como equivalentes de los mismos. Son preferidos para
el uso en una célula de Aspergillus los genes amdS y
pyrG de Aspergillus nidulans o Aspergillus
oryzae y el gen bar de Streptomyces higroscopicus.
Los vectores de la presente invención contienen
preferiblemente un(os) elemento(s) que
permite(n) la integración estable del vector en el genoma de
la célula huésped o la replicación autónoma del vector en la célula
independientemente del genoma de la célula.
Para su integración en el genoma de la célula
huésped, el vector puede depender de la secuencia de ácidos
nucleicos que codifica el polipéptido o cualquier otro elemento del
vector para la integración estable del vector en el genoma mediante
recombinación homóloga o no homóloga. De forma alternativa, el
vector puede contener secuencias de ácidos nucleicos adicionales
para dirigir la integración mediante recombinación homóloga en el
genoma de la célula huésped. Las secuencias de ácidos nucleicos
adicionales permiten que el vector sea integrado en el genoma de la
célula huésped en una(s) ubicación(es)
precisa(s) en el (los) cromosoma(s). Para aumentar la
probabilidad de integración en una ubicación precisa, los elementos
integracionales deberían contener preferiblemente un número
suficiente de ácidos nucleicos, tal como uno entre 100 y 1.500
pares de bases, preferiblemente entre 400 y 1.500 pares de bases, y
de la forma más preferible entre 800 y 1.500 pares de bases, que
sean altamente homólogos a la secuencia objetivo correspondiente
para aumentar la probabilidad de recombinación homóloga. Los
elementos integracionales pueden ser cualquier secuencia que sea
homóloga a la secuencia objetivo en el genoma de la célula huésped.
Además, los elementos integracionales pueden ser secuencias de
ácidos nucleicos no codificantes o codificantes. En cambio, el
vector puede integrarse en el genoma de la célula huésped mediante
recombinación no homóloga.
Para la replicación autónoma, el vector puede
comprender además un origen de replicación que permita al vector
replicarse de manera autónoma en la célula huésped en cuestión.
Ejemplos de orígenes bacterianos de replicación son los orígenes de
replicación de los plásmidos pBR322; pUC19; pACYC177, y pACYC184
que permiten la replicación en E. coli, y pUB110; pE194;
pTA1060, y pAMf\beta1 que permiten la replicación en
Bacillus. Ejemplos de orígenes de replicación para su uso en
una célula huésped de levadura son el origen de replicación de 2
micras, ARS1, ARS4, la combinación de ARS1 y CEN3, y la combinación
de ARS4 y CENE. El origen de replicación puede tener una mutación
que haga su función termosensible en la célula huésped (véase, p.
ej., Ehrlich, 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences
USA 75: 1433).
Se puede insertar más de una copia de una
secuencia de ácidos nucleicos de la presente invención en la célula
huésped para aumentar la producción del producto genético. Se puede
obtener un aumento en el número de copias de la secuencia de ácidos
nucléicos integrando al menos una copia adicional de la secuencia en
el genoma de la célula huésped o incluyendo un gen marcador
seleccionable amplificable junto con la secuencia de ácidos
nucleicos donde las células que contienen copias amplificadas del
gen marcador seleccionable, y de ese modo las copias adicionales de
la secuencia de ácidos nucléicos, pueden seleccionarse mediante el
cultivo de las células en presencia del agente seleccionable
apropiado.
Los procedimientos utilizados para enlazar los
elementos descritos anteriormente con el objetivo de construir los
vectores de expresión recombinantes de la presente invención son
bien conocidos por el experto en la materia (véase, p. ej.,
Sambrook et al., 1989, supra).
La presente invención también se refiere a
células huéspedes recombinantes que comprenden una secuencia de
ácidos nucléicos de la invención, las cuales se usan ventajosamente
en la producción recombinante de los polipéptidos. Un vector que
comprende una secuencia de ácidos nucléicos de la presente invención
se introduce en una célula huésped de tal manera que el vector es
mantenido como integrante cromosómico o como vector
extracromosómico que se replica a sí mismo como se ha descrito
anteriormente.
El término "célula huésped" abarca
cualquier descendiente de una célula parental que no sea idéntica a
la célula parental debido a mutaciones que ocurren durante la
replicación. La elección de una célula huésped dependerá en gran
parte del gen que codifica el polipéptido y su fuente.
La célula huésped puede ser un mocroorganismo
unicelular, p. ej., un procariota; o un microorganismo no
unicelular, p. ej., un eucariota.
Son células unicelulares útiles las células
bacterianas tales como las bacterias gram positivas incluyendo,
pero no limitándose a la célula de Bacillus, p. ej., de
Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus
brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans,
Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus
megaterium, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, y
Bacillus turingiensis; o una célula de Streptomyces,
p. ej., de Streptomyces lividans o Streptomyces
murinus, o bacterias gram negativas tales como E. coli y
Pseudomonas sp. En una forma de realización preferida, la
célula huésped bacteriana es una célula de Bacillus lentus,
Bacillus licheniformis, Bacillus stearothermophilus o
Bacillus subtilis. En otra forma de realización preferida,
la célula de Bacillus es un Bacillus alcalofílico.
\global\parskip0.900000\baselineskip
La introducción de un vector en una célula
huésped bacteriana puede, por ejemplo, efectuarse mediante
transformación de protoplasto (véase, p. ej., Chang and Cohen,
1979, Molecular General Genetics 168: 111-115),
usando células competentes (véase, p. ej., Young and Spizizin,
1961, Journal of Bacteriology 81: 823-829; o Dubnau
and Davidoff-Abelson, 1971, Journal of Molecular
Biology 56: 209-221), electroporación (véase, p.
ej., Shigekawa and Dower, 1988, Biotechniques 6:
742-751), o conjugación (véase, p. ej., Koehler and
Thorne, 1987, Journal of Bacteriology 169:
5771-5278).
La presente invención también se refiere a
métodos para producir un polipéptido de la presente invención que
comprenden (a) cultivar una cepa que sea capaz en su forma salvaje
de producir el polipéptido para producir un sobrenadante que
comprenda el polipéptido; y (b) recuperar el polipéptido.
Preferiblemente, la cepa es del género Bacillus sp.
La presente invención también se refiere a
métodos para producir un polipéptido de la presente invención que
comprenden (a) cultivar una célula huésped bajo condiciones
propicias para la producción del polipéptido; y (b) recuperar el
polipéptido.
La presente invención también se refiere a
métodos para producir un polipéptido de la presente invención que
comprenden (a) cultivar una célula huésped bajo condiciones
propicias para la producción del polipéptido, en las cuales la
célula huésped comprende una secuencia de ácidos nucléicos mutante
con al menos una mutación en la región de codificación del
polipéptido maduro de la SEC ID No: 1 o la SEC ID No: 3, donde la
secuencia de ácidos nucleicos mutante codifica un polipéptido
consistente en los aminoácidos del 1 al 485 de la SEC ID No: 2 o la
SEC ID No: 4, y (b) recuperar el polipéptido.
En otro aspecto ulterior, la presente invención
se refiere a composiciones que comprenden un polipéptido de la
presente invención. Preferiblemente, las composiciones están
enriquecidas con un polipéptido de la presente invención. En el
contexto presente, el término "enriquecido" indica que la
actividad \alpha-amilasa de la composición ha
sido aumentada, p. ej., con un factor enriquecedor de 1.1.
La composición puede comprender un polipéptido
de la invención como componente enzimático más importante, p. ej.,
una composición monocomponente. De forma alternativa, la
composición puede comprender actividades enzimáticas múltiples,
tales como una aminopeptidasa, amilasa, carbohidrasa,
carboxipeptidasa, catalasa, celulasa, quitinasa, cutinasa,
ciclodextrina glicosiltransferasa, desoxiribonucleasa, esterasa,
alfa-galactosidasa,
beta-galactosidasa, glucoamilasa,
alfa-glucosidasa, beta-glucosidasa,
haloperoxidasa, invertasa, lacasa, lipasa, manosidasa, oxidasa,
enzima pectinolítica, peptidoglutaminasa, peroxidasa, fitasa,
polifenoloxidasa, enzima proteolítica, ribonucleasa,
transglutaminasa, o xilanasa. La(s) enzima(s)
adicional(es) puede(n) ser producible(s)
mediante un microorganismo que pertenezca al género
Aspergillus, preferiblemente al Aspergillus aculeatus,
Aspergillus awamori, Aspergillus niger, o Aspergillus
oryzae, o al Trichoderma, Humicola, preferiblemente al
Humicola insolens, o al Fusarium, preferiblemente al
Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium
crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium
graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium
oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium
sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sulphureum, Fusarium
toruloseum, Fusarium tnchothecioides, o Fusarium
venenatum.
Las composiciones de polipéptidos pueden
prepararse conforme a métodos conocidos en la técnica y pueden
estar en forma líquida o de composición seca. Por ejemplo, la
composición de polipéptidos puede estar en forma granulada o
microgranulada. El polipéptido que se va a incluir en la composición
puede estabilizarse conforme a métodos conocidos en la técnica.
A continuación se dan ejemplos de usos
preferidos de las composiciones de polipéptidos de la invención. La
dosificación de la composición de polipéptidos de la invención y
otras condiciones bajo las cuales se usa la composición se pueden
determinar en base a métodos conocidos en la técnica.
Debido a su actividad a valores de pH alcalinos,
las \alpha-amilasas de la invención son adecuadas
para su uso en diversos procesos industriales, en particular la
enzima encuentra aplicaciones potenciales como componentes en
detergentes, p. ej., composiciones detergentes para lavandería,
lavado de la vajilla y limpieza de superficies duras, pero también
puede ser útil para el desencolado de tejidos, telas y prendas,
hacer o elaborar cerveza, en la producción de pasta y papel, y
también en la producción de edulcorantes y etanol, tales como
etanol combustible, industrial y bebible, a partir de almidón o
granos enteros.
Se describen procesos convencionales de
conversión de almidón, tales como los procesos de licuefacción y
sacarificación, en, p. ej., la patente US Nº. 3.912.590 y las
publicaciones de patentes EP Nos. 252.730 y 63.909, incorporadas
aquí como referencia.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Las \alpha-amilasas alcalinas
de la invención también pueden utilizarse en la producción de
materiales lignocelulósicos, tales como pasta, papel y cartón, a
partir de papel residual reforzado con almidón y cartón,
especialmente cuando se produzca la reducción a pasta a pH superior
a 7 y donde las amilasas puedan facilitar la desintegración del
material de desecho mediante la degradación del almidón de
refuerzo. Las \alpha-amilasas de la invención son
especialmente útiles en un proceso para producir una pasta de papel
a partir de papel impreso revestido de almidón. El proceso se puede
realizar como se describe en WO 95/14807, comprendiendo las fases
siguientes:
- a)
- desintegración del papel para producir una pasta,
- b)
- tratamiento con una enzima degradante de almidón antes, durante o después de la fase a), y
- c)
- separación de las partículas de tinta de la pasta después de las fases a) y b).
\vskip1.000000\baselineskip
Las \alpha-amilasas de la
invención también pueden ser muy útiles a la hora de modificar
almidón donde el almidón modificado enzimáticamente se usa en la
fabricación de papel junto con productos de relleno alcalinos tales
como carbonato cálcico, caolín y arcillas. Con las
\alpha-amilasas alcalinas de la invención se hace
posible modificar el almidón en presencia del relleno permitiendo
así un proceso integrado más simple.
Las \alpha-amilasas de la
invención también pueden ser muy útiles en el desencolado textil.
En la industria del tratamiento textil, las
\alpha-amilasas son utilizadas generalmente como
auxiliares en el proceso de desencolado para facilitar la
eliminación del encolado con contenido de almidón, el cual ha
servido como revestimiento protector en hilos de trama durante el
entretejido. La eliminación completa de la cola de revestimiento
después del entretejido es importante para asegurar resultados
óptimos en los procesos posteriores, en los cuales la tela se lava,
blanquea y tiñe. Se prefiere la descomposición de almidón enzimático
porque ésta no implica efecto nocivo alguno en la materia fibrosa.
Con el fin de reducir el coste del tratamiento y aumentar el
rendimiento del triturador, el tratamiento de desencolado se
combina a veces con las fases de lavado y blanqueamiento. En estos
casos, los auxiliares no enzimáticos tales como agentes alcalinos u
oxidantes se utilizan normalmente para descomponer el almidón, ya
que las alfa-amilasas tradicionales no son muy
compatibles con niveles altos de pH y agentes blanqueadores. La
descomposición no enzimática del encolado con contenido de almidón
conlleva algún daño en la fibra debido a los productos químicos más
bien agresivos que se usan. Por consiguiente, sería deseable usar
las alfa-amilasas de la invención por su rendimiento
mejorado en soluciones alcalinas. Las alfa-amilasas
pueden ser usadas solas o en combinación con una celulasa a la hora
de desencolar tela o tejidos con contenido de celulosa.
Los procesos de desencolado y blanqueamiento son
bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, tales procesos están
descritos en WO 95/21247, en la patente US 4.643.736, y en EP
119.920 incorporadas aquí como referencia.
Los productos para el desencolado disponibles a
nivel comercial incluyen Aquazyme® Ultra de Novo Nordisk NS.
Las \alpha-amilasas de la
invención también pueden ser muy útiles en un proceso de
elaboración de cerveza; las \alpha-amilasas
normalmente se añadirán durante el proceso de maceración.
La enzima de la invención puede añadirse
convirtiéndose así en un componente de una composición
detergente.
La composición detergente de la invención puede
formularse por ejemplo como una composición detergente para lavar a
mano o en una máquina de lavandería que incluye una composición de
aditivos para lavandería adecuada para el pretratamiento de tejidos
manchados y una composición suavizante añadida para el lavado de
tejidos, o formularse como una composición detergente para uso
doméstico en operaciones de limpieza de superficies duras, o
formularse para operaciones de lavado de la vajilla, a mano o a
máquina.
En un aspecto específico, la invención
proporciona un aditivo detergente que comprende la enzima de la
invención. El aditivo detergente, al igual que la composición
detergente, puede comprender otra u otras enzimas tales como una
proteasa, lipasa, cutinasa, amilasa, carbohidrasa, celulasa,
pectinasa, mananasa, arabinasa, galactanasa, xilanasa, oxidasa, p.
ej., lacasa, y/o peroxidasa.
En general, las propiedades de la(s)
enzima(s) elegida(s) deberían ser compatibles con el
detergente seleccionado, (es decir, pH óptimo, compatibilidad con
otros ingredientes enzimáticos y no enzimáticos, etc.), y
la(s) enzima(s) debería(n) presentarse en
cantidades eficaces. Proteasas: las proteasas adecuadas
incluyen las de origen animal, vegetal o microbiano. Se prefieren
las de origen microbiano. Se incluyen mutantes modificados
químicamente o por ingeniería proteica. La proteasa puede ser una
serina proteasa o una metalo proteasa, preferiblemente una proteasa
alcalina microbiana o una proteasa de tipo tripsina. Ejemplos de
proteasas alcalinas son las subtilisinas, especialmente aquellas
derivadas de Bacillus, p. ej., la subtilisina Novo,
subtilisina Carlsberg, subtilisina 309, subtilisina 147 y
subtilisina 168 (descrita en WO 89/06279). Ejemplos de proteasas de
tipo tripsina son la tripsina (p. ej. de origen porcino o bovino) y
la proteasa de Fusarium descrita en WO 89/06270 y WO
94/25583.
Son ejemplos de proteasas útiles las variantes
descritas en WO 92/19729, WO 98/20115, WO 98/20116, y WO 98/34946,
especialmente las variantes con sustituciones en una o más de las
siguientes posiciones: 27, 36, 57, 76, 87, 97, 101, 104, 120, 123,
167, 170, 194, 206, 218, 222, 224, 235 y 274.
Entre las enzimas proteásicas preferidas
disponibles a nivel comercial se incluyen Alcalase^{TM},
Savinase^{TM},
Primase^{TM}, Duralase^{TM}, Esperase^{TM}, y Kannase^{TM} (Novo Nordisk A/S), Maxatase^{TM}, Maxacal^{TM}, Maxapem^{TM},
Properase^{TM}, Purafect^{TM}, Purafect OxP^{TM}, FN2^{TM}, y FN3^{TM} (Genencor International Inc.).
Primase^{TM}, Duralase^{TM}, Esperase^{TM}, y Kannase^{TM} (Novo Nordisk A/S), Maxatase^{TM}, Maxacal^{TM}, Maxapem^{TM},
Properase^{TM}, Purafect^{TM}, Purafect OxP^{TM}, FN2^{TM}, y FN3^{TM} (Genencor International Inc.).
Lipasas: entre las lipasas adecuadas se
incluyen aquellas de origen bacteriano o fúngico. Se incluyen
mutantes modificados químicamente o por ingeniería protéica.
Ejemplos de lipasas útiles incluyen las lipasas de Humicola
(sinónimo de Thermomyces), p. ej. de H. lanuginosa (T.
lanuginosus) como se describe en EP 258 068 y EP 305 216 o de
H. insolens como se describe en WO 96/13580, una lipasa de
Pseudomonas, p. ej., de P. alcaligenes o P.
pseudoalcaligenes (EP 218 272), P. cepacia (EP 331 376),
P. stutzeri (GB 1.372.034), P. fluorescens, la cepa SD
705 de Pseudomonas sp. (WO 95/06720 y WO 96/27002), P.
wisconsinensis (WO 96/12012), una lipasa de Bacillus, p.
ej. de B. subtilis (Dartois et al. (1993), Biochemica
et Biophyisica Acta, 1131: 253-360), B.
stearothermophilus (JP 64/744992) o B. pumilus (WO
91/16422).
Otros ejemplos son variantes de lipasa tales
como las descritas en WO 92/05249, WO 94/01541, EP 407 225, EP 260
105, WO 95/35381, WO 96/00292, WO 95/30744, WO 94/25578, WO
95/14783, WO 95/22615, WO 97/04079 y WO 97/07202.
Entre las enzimas lipasa preferidas disponibles
a nivel comercial se incluyen Lipolase^{TM} y Lipolase
Ultra^{TM} (Novo Nordisk A/S).
Amilasas: bajo las amilasas adecuadas
(\alpha y/o \beta) se incluyen las de origen bacteriano o
fúngico. Se incluyen mutantes modificados químicamente o por
ingeniería protéica. Las amilasas incluyen, por ejemplo,
\alpha-amilasas obtenidas a partir de
Bacillus, p. ej. una cepa especial de B.
licheniformis, descrita con más detalle en GB 1.296.839.
Son ejemplos de amilasas útiles las variantes
descritas en WO 94/02597, WO 94/18314, WO 96/23873, y WO 97/43424,
especialmente las variantes con sustituciones en una o más de las
siguientes posiciones: 15, 23, 105, 106, 124, 128, 133, 154, 156,
181, 188, 190, 197, 202, 208, 209, 243, 264, 304, 305, 391, 408, y
444.
Son amilasas disponibles a nivel comercial
Duramyl^{TM}, Termamyl\dagger, Fungamyl^{TM} y BAN^{TM}
(novo Nordisk A/S), Rapidase^{TM} y Purastar^{TM} (de Genencor
International Inc.).
Celulasas: entre las celulasas adecuadas
se incluyen las de origen bacteriano o fúngico. Se incluyen
mutantes modificados químicamente o por ingeniería protéica. Entre
las celulasas adecuadas se incluyen celulasas de los géneros
Bacillus, Pseudomonas, Humicola, Fusarium, Thielavia,
Acremonium, p. ej. las celulasas fúngicas producidas a partir de
Humicola insolens, Myceliophthora thermophila y Fusarium
oxysporum descritas en US 4.435.307, 5.648.263, 5.691.178,
5.776.757 y WO 89/09259.
Celulasas especialmente adecuadas son celulasas
alcalinas o neutras que tienen beneficios en el cuidado del color.
Ejemplos de celulasas de este tipo son las celulasas descritas en
EP 0 495 257, EP 0 531 372, WO 96/11262, WO 96/29397, WO 98/08940.
Otros ejemplos son variantes de celulasa tal como las descritas en
WO 94/07998, EP 0 531 315, 5,457,046, 5,686,593, 5,763,254, WO
95/24471, WO 98/12307 y PCT/DK98/00299.
Entre las celulasas disponibles a nivel
comercial se incluyen Celluzime^{TM}, y Carezime^{TM} (Novo
Nordisk A/S), Clazinase^{TM}, y Puradax HA^{TM} (Genencor
International Inc.), y
KAC-500(B)^{TM}(Kao
Corporation).
Peroxidasas/oxidasas: entre las
peroxidasas/oxidasas adecuadas se incluyen las que provienen de
plantas, bacterias u hongos. Se incluyen mutantes modificados
químicamente o por ingeniería protéica. Ejemplos de peroxidasas
útiles incluyen peroxidasas de Coprinus, p. ej. de C.
cinereus, y variantes de las mismas como las que se describen
en WO 93/24618, WO 95/10602, y WO 98/15257.
Entre las peroxidasas disponibles a nivel
comercial se incluye Guardzime^{TM} (Novo Nordisk A/S).
La(s) enzima(s)
detergente(s) se puede(n) incluir en una composición
detergente añadiendo aditivos independientes que contengan una o más
enzimas, o añadiendo un aditivo combinado que comprenda todas estas
enzimas. Un aditivo detergente de la invención, es decir, un
aditivo independiente o un aditivo combinado, puede formularse p.
ej. como un granulado, un líquido, una pasta, etc. Formulaciones de
aditivos detergentes preferidas son las granuladas, en particular
las granuladas no pulverulentas; las líquidas, en particular
líquidas estabilizadas, o las pastas.
\newpage
Los granulados no pulverulentos se pueden
producir, p. ej., como se describe en US 4.106.991 y 4.661.452 y
opcionalmente se pueden revestir mediante métodos conocidos en la
técnica. Son ejemplos de materiales de revestimiento ceroso los
productos de óxido de poli(etileno) (polietilenoglicol, PEG)
con pesos molares medios de 1000 a 20000; los nonilfenoles
etoxilados con entre 16 y 50 unidades de óxido de etileno; los
alcoholes etoxilados grasos en los cuales el alcohol contiene de 12
a 20 átomos de carbono y en los cuales hay de 15 a 80 unidades de
óxido de etileno; los alcoholes grasos; los ácidos grasos; y los
mono-, di- y triglicéridos de ácidos grasos. Se dan ejemplos de
materiales de revestimiento filmógenos adecuados para la aplicación
mediante técnicas de lecho fluidificado en GB 1483591. Las
preparaciones enzimáticas líquidas se pueden, por ejemplo,
estabilizar añadiendo un poliol tal como propilenoglicol, azúcar o
alcohol de azúcar, ácido láctico o ácido bórico según métodos
establecidos. Se pueden preparar enzimas protegidas según el método
descrito en EP 238.216.
La composición detergente de la invención puede
tener cualquier forma conveniente, p. ej., de barra, pastilla,
polvo, gránulo, pasta o líquido. Un detergente líquido puede ser
acuoso, conteniendo normalmente hasta un 70% de agua y un
0-30% de disolvente orgánico, o no acuoso.
La composición detergente comprende uno o más
agentes tensioactivos, los cuales pueden ser no iónicos, inclusive
semipolares, y/o aniónicos y/o catiónicos y/o zwitteriónicos. Los
agentes tensioactivos están presentes normalmente a un nivel del
0.1% al 60% en peso.
Cuando se incluye en él, el detergente
normalmente contendrá aproximadamente de un 1% a aproximadamente un
40% de un tensioactivo aniónico tal como alquilbencenosulfonato
lineal, alfa-olefinsulfonato, sulfato de alquilo
(sulfato de alcohol graso), etoxisulfato de alcohol,
alcanosulfonato secundario, alfa-sulfo éster
metílico de ácido graso, ácido alquilo o alquenilsuccínico o
jabón.
Cuando se incluye en él, el detergente
normalmente contendrá aproximadamente de un 0.2% a aproximadamente
un 40% de un tensioactivo no iónico tal como alcohol etoxilato,
nonilfenol, etoxilato alquilpoliglicósido, óxido de
alquildimetilamina, monoetanolamida de ácido graso etoxilado,
monoetanolamida de ácido graso, amida de ácido graso
alquilopolihidroxilado, o N-acilo
N-alquilo derivados de glucosamina
("glucamidas").
El detergente puede contener un
0-65% de un constructor de detergente o agente
complejante tal como zeolita, difosfato, trifosfato, fosfonato,
carbonato, citrato, ácido nitrilotriacético, ácido
etilenodiaminatetraacético, ácido dietilenotriaminopentaacético,
ácido alquilo o alquenilsuccínico, silicatos solubles o silicatos
estratificados (p. ej. SKS-6 de Hoechst).
El detergente puede comprender uno o más
polímeros. Son ejemplos la carboximetilcelulosa,
poli(vinilpirrolidona), poli(etilenglicol), (alcohol)
poli(vinílico), (N-óxido de poli(vinilpiridina),
poli(vinil imidazol), policarboxilatos tales como
poliacrilatos, copolímeros de ácido maléico/acrílico y copolímeros
de lauril metacrilato/ácido
acrílico.
acrílico.
El detergente puede contener un sistema
blanqueante, el cual puede comprender una fuente de H_{2}O_{2}
tal como perborato o percarbonato, la cual se puede combinar con un
activador de blanqueamiento de peracido tal como
tetraacetiletilenodiamina o nonanoiloxibencenosulfonato. De forma
alternativa, el sistema blanqueante puede comprender peroxiácidos de
tipo p. ej. amida, imida, o sulfona.
La enzima(s) de la composición detergente
de la invención se puede estabilizar usando agentes convencionales
estabilizantes, p. ej., un poliol tal como propilenoglicol o
glicerol, un azúcar o alcohol de azúcar, ácido láctico, ácido
bórico, o un derivado de ácido bórico, p. ej., un éster de borato
aromático, o un fenilo derivado de ácido borónico tal como ácido
borónico de 4-formilfenilo, y la composición puede
formularse como se describe en, p. ej., WO 92/19709 y WO
92/19708.
El detergente puede contener también otros
ingredientes de detergentes convencionales tales como, p. ej.,
acondicionadores de tela, incluyendo arcillas, reforzadores de
espuma, supresores de espuma, agentes anticorrosivos, agentes de
supensión de suciedad, agentes de redisposición antisuciedad,
tintes, bactericidas, blanqueadores ópticos, hidrotropos,
inhibidores de decoloración, o perfumes.
Actualmente se contempla que en las
composiciones detergentes se puede añadir cualquier enzima, en
particular la enzima de la invención, en una cantidad
correspondiente a 0.01-100 mg de proteína enzimática
por litro de licor de lavado, preferiblemente
0.05-5 mg de proteína enzimática por litro de licor
de lavado, en particular 0.1-1 mg de proteína
enzimática por litro de licor de lavado.
La enzima de la invención se puede incorporar de
forma adicional en las formulaciones de detergente descritas en WO
97/07202, la cual es incorporada aquí como referencia.
\newpage
La enzima de la invención también se puede usar
en composiciones detergentes para el lavado de la vajilla,
incluyendo lo siguiente:
\newpage
(Continuación)
\newpage
(Continuación)
\newpage
(Continuación)
\newpage
(Continuación)
\newpage
(Continuación)
La presente invención va dirigida también a
métodos para usar los polipéptidos que tengan actividad
\alpha-amilasa en composiciones detergentes; en
particular en composiciones detergentes para lavandería y
composiciones detergentes para el lavado de la vajilla,
composiciones para la limpieza de superficies duras, y en la
composición para el desencolado de tejidos, telas, o prendas, para
la producción de pasta y papel, la elaboración de cerveza, y los
procesos de conversión de almidón como se han descrito
anteriormente.
La presente invención se describe con más
detalle más adelante a través de los siguientes ejemplos, los
cuales no deberían ser interpretados de forma que limiten el ámbito
de la invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Los productos químicos usados como tampones y
sustratos fueron productos comerciales de al menos grado
reactivo.
\vskip1.000000\baselineskip
SP690: \alpha-amilasa descrita
en la SEC ID No: 1 de la US Nº. 5.856.164.
SP722: \alpha-amilasa descrita
en la SEC ID No: 2 de la US Nº. 5.856.164.
Termamyl®: \alpha-amilasa de
Bacillus licheniformis descrita en la SEC ID No: 1 de la US
Nº. 5.830.837.
AAI-10:
\alpha-amilasa de la invención mostrada en la SEC
ID No: 2.
AAI-6:
\alpha-amilasa de la invención mostrada en la SEC
ID No: 4.
\vskip1.000000\baselineskip
- \quad
- El detergente modelo A/P (Asia/Pacific) tiene la composición siguiente: 20% de tripolifosfato sódico (tripolifosfato de sodio), 25% de Na_{2}SO_{4}, 15% de Na_{2}CO_{3}, 20% de LAS (sulfonato de alquilbenceno lineal, Nansa 80S), 5% de alcohol etoxilato C_{12}-C_{15} (Dobanol 25-7), 5% de Na_{2}Si_{2}O_{5}, 0.3% de NaCl.
- \quad
- Omo Multi Acao (Brasil),
- \quad
- Omo polvo concentrado (EU) (Unilever)
- \quad
- Ariel Futur líquido (EU) (Procter and Gamble)
El material biológico siguiente ha sido
depositado según las condiciones del tratado de Budapest con la
Deutshe Sammmlung von Microorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ),
Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig DE, y se ha
dado el número de registro siguiente:
Las cepas se han depositado bajo condiciones que
aseguran que el acceso al cultivo estará disponible durante el
estado de pendiente de esta solicitud de patente a quien sea
autorizado por el Comisionado de Patentes y Marcas Registradas según
37 C.F.R. \NAK1.14 y 35 U.S.C. \NAK122. El depósito representa
un cultivo substancialmente puro de la cepa depositada. El depósito
está disponible según se requiere por leyes para patentes
extranjeras en países donde se soliciten duplicados del contenido de
la solicitud, o sus sucesoras. No obstante, se debe entender que la
disponibilidad de un depósito no constituye una licencia para la
práctica del contenido de la invención en derogación de los
derechos para las patentes garantizados por la acción
gubernamental.
\vskip1.000000\baselineskip
Cepa SHa273 descrita en WO 95/10603
Cepa SJ2 de E. coli (Diderichsen et
al. (1990)), J. Bacteriol., vol. 172, págs.
4315-4321.
\vskip1.000000\baselineskip
El vector de genoteca fue el pSJ1678, el cual se
describe con más detalle en WO 94/19454, la cual es incorporada
aquí como referencia.
\vskip1.000000\baselineskip
A menos que se mencione lo contrario las
manipulaciones de ADN y las transformaciones fueron realizadas
usando métodos estándares de biología molecular (Sambrook et
al. (1989); Ausubel et al. (1995); Harwood and Cutting
(1990).
La fermentación puede ser realizada por métodos
bien conocidos en la técnica o como sigue.
Una cepa de B. subtilis que contiene el
plásmido de expresión pertinente es avetado en una placa de LB agar
con 10 micro g/ml de canamicina de un caldo a -80ºC, y hecho crecer
durante la noche a 37ºC. Las colonias son transferidas a 100 ml de
medios BPX complementados con 10 micro g/ml de canamicina en un
matraz de agitación de 500 ml. Composición del medio BPX:
El cultivo se agita a 37ºC a 270 r.p.m. durante
5 días.
Las células y los detritos de células se
eliminan del caldo de fermentación por centrifugado a 4500 r.p.m.
durante 20-25 minutos. Después, el sobrenadante se
filtra para obtener una solución completamente clara. El filtrado
se concentra y lava en un filtro de ultrafiltración (membrana de
10000 cortes) y el tampón se cambia a 20 mM de acetato a pH 5.5. El
filtrado por ultrafiltración se aplica en una
S-sefarosa F.F. y la elución se realiza por elución
en fases con 0.2M de NaCl en el mismo tampón.
El eluato se dializa contra 10 mM de Tris, a pH
9.0 y se aplica a una Q-sefarosa F.F. y se eluye
con un gradiente lineal de 0-0.3M de NaCl sobre 6
volúmenes de columna. Las fracciones, las cuales contienen la
actividad (medida mediante el ensayo de Phadebas) se agrupan, el pH
se ajustó a pH 7.5 y el color restante se eliminó mediante un
tratamiento con 0.5% peso/vol. de carbón activo durante 5
minutos.
La actividad \alpha-amilasa se
determina mediante un método que utiliza comprimidos de Phadebas®
como sustrato. Los comprimidos de Phadebas (Prueba de la amilasa de
Phadebas®, suministrado por Pharmacia Diagnostic) contienen un
polímero de almidón reticulado insoluble coloreado de azul, el cual
ha sido mezclado con albúmina de suero bovino y una sustancia
tampón y dispuesto en comprimidos.
\newpage
Para cada medición se suspende un comprimido en
un tubo con un contenido de 5 ml del tampón
Britton-Robinson 50 mM (50 mM de ácido acético, 50
mM de ácido fosfórico, 50 mM de ácido bórico, 0.1 mM de CaCl_{2},
a pH ajustado al valor de interés con NaOH). El test se realiza en
un baño de agua a la temperatura de interés. La
\alpha-amilasa que se va a evaluar se diluye en x
ml del tampón Britton-Robinson 50 mM. Se añade 1 ml
de esta solución de \alpha-amilasa a los 5 ml del
tampón Britton-Robinson 50 mM. El almidón es
hidrolizado por la \alpha-amilasa obteniéndose
fragmentos azules solubles. La absorbencia de la solución azul
resultante, medida espectrofotométricamente a 620 nm, es una
función de la actividad \alpha-amilasa.
Es importante que los 620 nm de absorbencia
medidos después de 10 o 15 minutos de incubación (tiempo de prueba)
estén en el rango de 0.2 a 2.0 unidades de absorbencia a 620 nm. En
este rango de absorbencia hay linealidad entre actividad y
absorbencia (ley de Lambert-Beer). En consecuencia,
la dilución de la enzima se debe ajustar para adaptarse a este
criterio. Bajo un conjunto de condiciones especificas (temp., pH,
tiempo de reacción, condiciones de tampón), 1 mg de una
\alpha-amilasa dada hidrolizará una cantidad
determinada de sustrato y se producirá un color azul. La intensidad
del color se mide a 620 nm. La absorbencia medida es directamente
proporcional a la actividad específica (actividad/mg de proteína de
\alpha-amilasa pura) de la
\alpha-amilasa en cuestión según el conjunto de
condiciones
dadas.
dadas.
Normalmente, los procesos de licuefacción
industriales se realizan usando pH 6.0-6.2 como pH
de licuefacción y una adición de 40 ppm de calcio libre con el fin
de mejorar la estabilidad a 95ºC-105ºC. Algunas de
las sustituciones propuestas aquí se han hecho con el propósito de
mejorar la estabilidad a
1. pH inferior a pH 6.2 y/o
2. a niveles de calcio libre inferiores a 40 ppm
de calcio libre.
Pueden utilizarse dos métodos diferentes para
medir las alteraciones en la estabilidad obtenida por las
diferentes sustituciones en las alfa-amilasas en
cuestión:
Método 1. Un ensayo que mide la
estabilidad a pH reducido, pH 5.0, en presencia de 5 ppm de calcio
libre. Se incuban 10 micro g de la variante según las condiciones
siguientes: Una solución de 0,1 M de acetato, pH ajustado a pH 5.0,
conteniendo 5 ppm de calcio y un 5% p/p de almidón de maíz común
(libre de calcio). La incubación se realiza en un baño de agua a
95ºC durante 30 minutos.
Método 2. Un ensayo que mide la
estabilidad en ausencia de calcio libre, en el cual el pH se
mantiene a pH 6.0. Este ensayo mide la reducción en la sensibilidad
del calcio: 10 micro g de la variante se incubaron según las
condiciones siguientes: Una solución de 0.1 M de acetato, pH
ajustado a pH 6.0, conteniendo un 5% p/p de almidón de maíz común
(libre de calcio). La incubación se realizó en un baño de agua a
95ºC durante 30 minutos.
Todos los procesos de estabilidad se realizan
usando la misma configuración. El método es:
- \quad
- La enzima se incuba según las condiciones pertinentes (1-4). Las muestras se toman a los 0, 5, 10, 15 y 30 minutos y se diluyen 25 veces (la misma dilución para todas las muestras tomadas) en tampón de ensayo (0.1M de tampón Britton 50 mM a pH 7.3) y la actividad se mide usando el ensayo de Phadebas (Pharmacia) bajo condiciones estándares a pH 7.3 y 37ºC.
- \quad
- La actividad medida antes de la incubación (0 minutos) se usa como referencia (100%). El descenso en porcentaje se calcula como función del período de incubación.
La actividad específica se determina usando el
ensayo de Phadebas (Pharmacia) como actividad/mg de enzima.
Los experimentos de licuefacción se realizan en
el sistema mini-jet, el cual utiliza una
dosificación de 50 NU/g de DS a pH 5.5 con 5 ppm de Ca^{++}
añadido, para comparar el rendimiento de la variante de
alfa-amilasa formulada con el de de la alfa- amilasa
parental. La reacción se controla midiendo el aumento de DE (método
de la Neocuproina) en función del tiempo.
Las mezclas de almidón de maiz se preparan
suspendiendo aproximadamente 11.8 kg de Cerestar C*Pharm GL 03406
(89% de almidón) en agua desionizada y completando hasta 30 kg. El
pH se ajusta a pH 5.5 a una temperatura ambiente, después de añadir
0.55 g de CaCl_{2}. 2H_{2}O.
\newpage
Se añade una cantidad de enzima correspondiente
a 50 NU/g de DS, y la conductividad se ajusta a 300mS usando NaCl.
Las condiciones estándares son las siguientes:
Después del eyectado, el almidón licuado se
recoge y transporta en termos sellados desde la instalación de
ensayo hasta el laboratorio, donde se continúa la licuefacción
secundaria a 95ºC.
Se toman muestras de 10 ml a intervalos de 15
minutos durante 15-90 minutos. Se añaden 2 gotas de
1 N HCl para inactivar la enzima. De estas muestras, se pesan
0.3-0.1 g (según el DE previsto) y se diluyen hasta
los 100 ml. Los azúcares de reducción se determinan entonces según
el método de la Neocuproina (Determination of reducing sugar with
improved precision. Dygert, Li, Florida and Thomas (1965). Anal.
Biochem 13: 368) y los valores de DE determinados. Se compara el
desarrollo de DE en función del tiempo.
El ensayo puede utilizarse para cribar variantes
de alfa-amilasa con una estabilidad mejorada a pH
alto en comparación con la enzima parental, y de variantes de
alfa-amilasa con una estabilidad mejorada a pH alto
y a temperaturas medias en comparación con la enzima parental que
depende del ajuste de selección de temperatura.
Se colocan las bibliotecas de Bacillus en
una placa a modo de sándwich de acetato de celulosa (OE 67,
Schleicher & Schuell, Dassel, Germany) - y filtros de
nitrocelulosa (Protran-Ba 85, Schleicher &
Schuell, Dassel, Germany) en placas de agar TY con 10 micro g/ml de
canamicina a 37ºC durante al menos 21 horas. El estrato de acetato
de celulosa se encuentra en la placa de agar TY.
Cada sándwich de filtro se marca de forma
específica con una aguja después de la colocación en placas pero
antes de la incubación, con el fin de que sea capaz de localizar
variantes positivas en el filtro, y el filtro de nitrocelulosa que
contiene variantes enlazadas se transfiere a un recipiente con
tampón de glicina-NaOH, a pH
8.6-10.6 y se incuba a temperatura ambiente (puede
ser alterado entre 10º-60ºC) durante 15 minutos. Los filtros de
acetato de celulosa con colonias se almacenan en las placas TY a
temperatura ambiente hasta su uso. Tras la incubación, se detecta la
actividad residual en placas conteniendo un 1% de agarosa, un 0.2%
de almidón en un tampón de glicina-NaOH, a pH
8.6-10.6. Las placas de ensayo con filtros de
nitrocelulosa se marcan del mismo modo que el sándwich de filtro y
se incuban durante 2 horas a temperatura ambiente. Después de la
eliminación de los filtros las placas de ensayo se manchan con una
solución con un 10% de Lugol. Se detectan las variantes que
degradan con almidón en forma de manchas blancas sobre un fondo
azul oscuro y posteriormente se identifica en las placas de
almacenamiento. Las variantes positivas se recriban dos veces bajo
las mismas condiciones del primer cribado.
Se colocan las bibliotecas de Bacillus en
una placa a modo sándwich de acetato de celulosa (OE 67, Schleicher
& Schuell, Dassel, Germany) - y filtros de nitrocelulosa
(Protran-Ba 85, Schleicher & Schuell, Dassel,
Germany) en placas de agar TY con un antibiótico pertinente, p.
ej., canamicina o cloranfenicol, a 37ºC durante al menos 21 horas.
El estrato de acetato de celulosa se encuentra en la placa de agar
TY.
Cada sándwich de filtro se marca específicamente
con una aguja después de la colocación en placas y antes de la
incubación con el objetivo de que sea capaz de localizar variantes
positivas en el filtro, y el filtro de nitrocelulosa con variantes
enlazadas se transfiere a un recipiente con tampón de
carbonato/bicarbonato a pH 8.5-10 y con
concentraciones de EDTA diferentes (0.001 mM-100
mM). Los filtros se incuban a temperatura ambiente durante 1 hora.
Los filtros de acetato de celulosa que contienen colonias se
almacenan en las placas TY a temperatura ambiente hasta su uso.
Tras la incubación, se detecta la actividad residual en placas
conteniendo un 1% de agarosa y un 0.2% de almidón en tampón de
carbonato/bicarbonato a pH 8.5-10. Las placas de
ensayo con filtros de nitrocelulosa se marcan de la misma forma que
el sándwich de filtro y se incuban durante 2 horas a temperatura
ambiente. Después de la eliminación de los filtros se manchan las
placas de ensayo con una solución de Lugol al 10%. Se detectan las
variantes que degradan con almidón en forma de manchas blancas
sobre un fondo azul oscuro y después se identifica en las placas de
almacenamiento. Las variantes positivas se recriban dos veces bajo
las mismas condiciones del primer cribado.
Las cepas DSM 12650 de Bacillus sp. (la
\alpha-amilasa AAI-6) y DSM 12651
de Bacillus sp. (la \alpha-amilasa
AAI-10) se propagaron en un medio de TY líquido
(según se describe en Ausubel et al.(1995)). Después de 16
horas de incubación a 37ºC y 300 r.p.m. se cosecharon las células y
se aisló el ADN genómico por el método descrito por Pitcher et
al. (1989).
El ADN genómico de las cepas anteriormente
mencionadas se digerió parcialmente con la enzima de restricción
Sau3A y se fraccionó mediante electroforesis en un gel de agarosa
al 0.7%. Los fragmentos de entre 2 y 10 kb de tamaño se aislaron
mediante electroforesis sobre papel de celulosa DEAE (Dretzen et
al. (1981).
Los fragmentos de ADN aislados se ligaron al ADN
del plásmido digerido pSJ1678 de BamHI, y la mezcla de ligadura se
usó para transformar las SJ2 de E. coli.
Las células huéspedes SJ2 de E. coli se
prepararon y transformaron mediante electroporación usando un gen
PULSER electroporador de Bio-Rad, como describe el
proveedor.
Las bibliotecas de ADN en la SJ2 de E.
coli, construidas como se ha descrito anteriormente, se
cribaron en placas de agar LB (descritas en Ausbel et
al.(1995)) con un 5% de amilosa AZCL (Megazyme) y 10 micro g/ml
de cloranfenicol y se incubaron durante toda la noche a 37ºC. Los
clones que expresan actividad amilasa de expresión aparecieron con
halos de difusión azules. Un clon de este tipo que expresaba amilasa
AAI-6 fue denominado como LiH1300. Otro clon que
expresaba amilasa AAI-10 fue denominado como
LiH1298. El ADN se caracterizó ulteriormente por secuenciar parte
de los fragmentos de ADN clonados Sau3A.
\vskip1.000000\baselineskip
El clon que constituye un fragmento cromosómico
amplio, el cual contiene el gen que codifica la actividad
amilolítica insertada en los plásmidos pSJ1678 y pLiH1300, se usó
como molde en un intento de amplificar, específicamente mediante
PCR, fragmentos de ADN internos de la amilasa que codifica el gen
usando cebadores degenerados dirigidos hacia las regiones
conservadas en las \alpha-amilasas conocidas de
Bacillus.
Los cebadores degenerados fueron dirigidos hacia
las siguientes regiones/secuencias de aminoácidos:
| For36: | GITA(L/V/I)W(I/L) | (SEC ID NO: 5) |
| For97: | VY(G/A)D(V/F/L)V(M/L/I/F)NH | (SEC ID NO: 6) |
| For227: | DG(F/I)R(F/L/I/V)DA(A/V)KH | (SEC ID NO: 7) |
| Rev235: | DG(F/I)R(F/L/I/V)DA(A/V)KKH | (SEC ID NO: 8) |
| Rev328: | VTFV(D/E)NHD | (SEC ID NO: 9) |
| Rev410: | GWTREG | (SEC ID NO: 10) |
Las diferentes combinaciones de cebadores
directos (For) e inversos (Rev) se usaron en la PCR y los
fragmentos de ADN internos se pudieron amplificar. Los fragmentos
de ADN se purificaron por columnas QIAquick spin (QUIGEN) y se
ordenaron utilizando los mismos cebadores degenerados.
De esta secuencia inicial se determinó la
secuencia de ADN de la región de codificación completa de la
\alpha-amilasa AAI-6 de la SEC ID
No: 2 mediante un proceso estándar de desplazamiento de los
cebadores.
\vskip1.000000\baselineskip
El clon que constituye un fragmento cromosómico
amplio, el cual contiene el gen que codifica la actividad
amilolítica insertada en los plásmidos pSJ1678 y pLiH1298, se usó
como molde en un intento de amplificar, específicamente mediante
PCR, fragmentos de ADN internos de la amilasa que codifica el gen
usando cebadores degenerados dirigidos hacia las regiones
conservadas en las alfa-amilasas conocidas de
Bacillus.
Los cebadores degenerados fueron dirigidos hacia
las siguientes regiones/secuencias de aminoácidos:
| For36: | GITA(L/V/I)W(I/L) | (SEC ID NO: 5) |
| For97: | VY(G/A)D(V/F/L)V(M/L/I/F)NH | (SEC ID NO: 6) |
| For227: | DG(F/I)R(F/L/I/V)DA(A/V)KH | (SEC ID NO: 7) |
| Rev235: | DG(F/I)R(F/L/I/V)DA(A/V)KH | (SEC ID NO: 8) |
| Rev328: | VTFV(D/E)NHD | (SEC ID NO: 9) |
| Rev410: | GWTREG | (SEC ID NO: 10) |
Las diferentes combinaciones de cebadores
directos (For) e inversos (Rev) se usaron en la PCR y se pudieron
amplificar los fragmentos de ADN internos.
Los fragmentos de ADN se purificaron por
columnas QIAquick spin (QUIGEN) y se ordenaron utilizando los
mismos cebadores degenerados.
A partir de esta secuencia inicial fue
determinada la secuencia de ADN (SEC ID No: 1) de la región de
codificación completa de la \alpha-amilasa
AAI-10 (SEC ID NO: 4) mediante un acercamiento
estándar de los cebadores.
\vskip1.000000\baselineskip
\global\parskip0.950000\baselineskip
La pTVB110 es una replicación del plásmido en el
Bacillus subtilis debido al uso del origen de la replicación
a partir de pUB110 (Gryczan, T.J. (1978) J. Bact
134:318-329). El plásmido también codifica el gen
cat, confiriendo resistencia frente al clorampenicol, obtenido del
plásmido pC194 (Horinouchi, S. and Weisblum, B. (1982), J. Bact.
150: 815-825). El plásmido alberga una versión
truncada de los genes de alfa-amilasa de
Bacillus licheniformis, amyL, de manera que el
promotor amyL, la secuencia señal y el terminador de
transcripción están presentes, pero el plásmido no proporciona un
fenotipo amy-plus (formación de un halo en almidón
con contenido de agar).
Con el objetivo de expresar una cantidad alta de
la amilasa AAI-6 el gen maduro fue fusionado de
forma precisa con la secuencia señal de amyL de manera que
la transcripción es iniciada por el promotor de amyL y la
translocación es dirigida por la secuencia señal amyL.
Los cebadores 197 clonador de N y 197 clonador
de C se usaron para amplificar un fragmento de aproximadamente 1480
pares de bases mediante PCR en el plásmido pLiH1300 usando la
polimerasa Pwo bajo condiciones recomendadas por el fabricante
(Boehringer Mannheim).
El fragmento resultante de aproximadamente 1480
pares de bases fue digerido con las endonucleasas de restricción
PstI y SfiI y ligado a el plásmido digerido con las mismas
enzimas.
La proteasa y amilasa de la cepa delecionada
SHa273 de Bacillus subtilis (descrita en W095/10603) se
transformó con la mezcla de ligadura y se verificó la secuencia de
ADN de un amy-plus transformante. Este plásmido se
denomina pTVB230.
197 clonador de C:
| 5' CCG AGC TCG GCC GGC TGG GCC GTC GAC TTA TCG TTT CAC CCA TAC GG | (SEC ID No: 11) |
\vskip1.000000\baselineskip
197 clonador de N:
| 5' CAT TCT GCA GCA GCG GCG CAT CAC GAT GGG ACG AAC GG | (SEC ID NO: 12) |
\vskip1.000000\baselineskip
La secuenciación del ADN reveló una identidad
más bien alta entre las alfa-amilasas de las cepas
AAI-6 y AAI-10. Por consiguiente se
utilizaron los mismos oligonucleótidos y la misma estrategia para
clonar la alfa-amilasa AAI-10 en el
vector de expresión pTVB110 dando como resultado el plásmido
pTVB229, que entonces fue fermentado mediante técnicas
estándares.
\vskip1.000000\baselineskip
El caldo de cultivo se floculó añadiendo 0.01 ml
de CaCl_{2} al 50% (p/p), 2H_{2}O, 0. ml de sodio aluminato al
12% (p/p), 0.025 ml de C521 al 10% y 0.075 ml de A130 al 0.1% por
ml de caldo de cultivo. Se obtuvo una solución clara después del
centrifugado. A la solución enzimática se le añadió sulfato de
amonio hasta conseguir una concentración final de 1.2 M y ésta se
aplicó en una columna de Butilo Toyo Pearl (100 ml) previamente
equilibrada en 1.2 M de sulfato de amonio, 10 mM de
Tris-HCl, a pH 7.0. La amilasa fue eluida usando 5
mM de Tris-HCl, a pH 7.0, y la agrupación eluida
fue dializada contra 5 mM de Tris-HCl durante la
noche. La fracción fue sometida entonces a una cromatografía de
intercambio iónico usando una columna de
Q-Sepharose (200 ml) previamente equilibrada en 20
mM de Tris-HCl, a pH 9.0. El material no enlazado
fue lavado con el tampón de equilibrado, y la amilasa fue eluida
usando un gradiente lineal de 0-1 M de NaCl, 20 mM
de Tris-HCl, a pH 9.0. La pureza de la preparación
de amilasa fue juzgada en más de un 95% por
SDS-PAGE.
\vskip1.000000\baselineskip
El caldo de cultivo fue floculado como se ha
descrito anteriormente. A la solución enzimática se le añadió
sulfato de amonio hasta obtener una concentración final de 1.2 M y
ésta fue aplicada en una columna de Butyl Toyo Pearl (100 ml)
previamente equilibrada en 1.2 M de sulfato de amonio, 10 mM de
Tris-HCl, a pH 7.0. El 20% de la actividad fue
eluida con 5 mM de Tris-HCl, a pH 7.0, y el resto
con isopropanol. La agrupación combinada fue fraccionada en una
columna de Q-Sepharose (100 ml), a pH 9.7. El
material no enlazado fue lavado con el tampón de equilibrado, y la
amilasa fue eluida usando un gradiente lineal de 0-1
M de NaCl, 20 mM de Tris-HCl, a pH 9.4. La amilasa
que contenía la agrupación fue finalmente fraccionada en un columna
de S Sefarosa, a pH 5.5. La pureza de la preparación de amilasa fue
juzgada en más de un 95% por SDS-PAGE.
\global\parskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La actividad \alpha-amilasa se
midió usando el ensayo de Phadebas (37ºC, pH 7.3) y el Ensayo
Alternativo pNPG7 (25ºC, pH 7.1) anteriormente descrito. Los
perfiles de pH y temperatura se hicieron con valores de pH y
temperatura seleccionados. El perfil de pH se midió a 37ºC y el
perfil de temperatura se midió a pH 9.0
El Punto Isoeléctrico se determinó mediante
isoelectroenfoque (Pharmacia, Ampholine, pH
3.5-9.3).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El resultado de la determinación de pH óptimo y
la determinación de temperatura óptima se muestra en la figura 2 y
figura 3, respectivamente.
\vskip1.000000\baselineskip
El rendimiento de lavado se evaluó mediante el
lavado de muestras de prueba sucias durante 15 y 30 minutos a 25 y
40ºC respectivamente en soluciones detergentes con las
\alpha-amilasas AAI-6 y
MI-10 de la invención.
Los detergentes usados están descritos a
continuación en la Tabla 3. El Detergente Modelo A/P está descrito
en la sección anterior de Materiales. Los otros detergentes son
detergentes disponibles comercialmente. Los detergentes comerciales
que contienen amilasa fueron inactivados antes del lavado mediante
microondas.
Las \alpha-amilasas
recombinantes purificadas AAI-6 y
AAI-10 de los ejemplos 6 y 7 se añadieron a las
soluciones detergentes con la concentración que se indica a
continuación. Las muestras de prueba se ensuciaron con almidón de
arroz naranja (las muestras CS-28 disponibles del
CFT, Center for Test Material, Holland).
Después del lavado, las muestras se evaluaron
midiendo la remisión a 460 nm, usando un Espectrofómetro de
Remisión Elrepho. Los resultados se expresan como \DeltaR =
remisión de la muestra lavada con la alfa amilasa menos la remisión
de una muestra lavada en las mismas condiciones sin la
alfa-amilasa.
Los resultados se muestran en las Figuras
4-7. Los resultados demuestran que la
\alpha-amilasa de la invención es eficaz en ambos
detergentes a pH alcalino alto.
\vskip1.000000\baselineskip
La alfa-amilasa parental
AAI-10 se usa para desencolar telas usando el método
de TEGEWA (Método y escalas estándar obtenibles de Verband TEGEWA,
Karlstrasse 21, Frankfurt a.M., Alemania). Las condiciones están
descritas en la sección "Materiales y Métodos".
La alfa-amilasa
AAI-10 se usa en pruebas de desencolado realizadas a
30 y 55ºC. La enzima se dosifica de 0.05 a 2 g/l en la solución de
impregnación. El procedimiento post-lavado se
realiza lavando las telas en agua en vez de en soda caliente, como
normalmente se hace.
El efecto de esto se mide usando la Escala
Violeta (TEGEWA), escala de TEGEWA: 1-9.
\vskip1.000000\baselineskip
Ausubel, F. M. et al. (eds.);
Current protocols in Molecular Biology; 1995; John
Wiley and Sons.
Sambrook et al.; Molecular
Cloning: A Laboratory Manual; 1989; Cold Spring Harbor
Lab.; Cold Spring Harbor; NY.
Harwood C. R., and Cutting S. M.
(eds.); Molecular Biological Methods for Bacillus; 1990;
John Wiley and Sons.
Diderichsen B., Wedsted U.,
Hedegaard L., Jensen B. R., Sjøholm C.; Cloning
of aldB, which encodes alpha-acetolactate
decarboxylase, an exoenzyme from Bacillus brevis; J.
Bacteriol., 1990, vol. 172, pp.
4315-4321.
Pitcher D. G., Saunders N. A.,
Owen R. J.; Rapid extraction of bacterial genomic DNA with
guanidium thiocyanate; Lett. Appl. Microbiol.; 1989;
vol. 8; pp. 151-156.
Dretzen G., Bellard M.,
Sassone-Corsi P., Chambon P.; A
reliable method for the recovery of DNA fragments from agarose and
acrylamide gels; Anal. Biochem.; 1981; vol. 112; pp.
295-298.
\vskip1.000000\baselineskip
Esta lista de documentos citados por el
solicitante ha sido recopilada exclusivamente para la información
del lector y no forma parte del documento de patente europea. La
misma ha sido confeccionada con la mayor diligencia; la OEP sin
embargo no asume responsabilidad por eventuales errores u
omisiones.
- \bullet WO 9526397 A [0004]
- \bullet WO 9535381 A [0123]
- \bullet WO 9623873 A [0005] [0125]
- \bullet WO 9600292 A [0123]
- \bullet US 5147796 A [0006]
- \bullet WO 9530744 A [0123]
- \bullet WO 9700324 A [0008] [0018]
- \bullet WO 9425578 A [0123]
- \bullet US 5856164 A [0018] [0018] [0147] [0147] [0205]
- \bullet WO 9514783 A [0123]
- {}\hskip0.2cm [0205]
- \bullet WO 9522615 A [0123]
- \bullet US 4683202 A, R.K. Saiki [0052]
- \bullet WO 9704079 A [0123]
- \bullet US 1988 A [0052]
- \bullet WO 9707202 A [0123] [0142]
- \bullet US 4760025 A [0053]
- \bullet GB 1296839 A [0124]
- \bullet WO 9522625 A [0055]
- \bullet WO 9402597 A [0125]
- \bullet WO 9600343 A [0055]
- \bullet WO 9418314 A [0125]
- \bullet WO 9117243 A [0061]
- \bullet WO 9743424 A [0125]
- \bullet EP 238023 A [0067]
- \bullet US 4435307 A [0126]
- \bullet US 3912590 A [0109]
- \bullet US 5648263 A [0126]
- \bullet EP 252730 A [0109]
- \bullet US 5691178 A [0126]
- \bullet EP 63909 A [0109]
- \bullet US 5776757 A [0126]
- \bullet W0 9514807 A [0110]
- \bullet WO 8909259 A [0126]
- \bullet WO 9521247 A [0113]
- \bullet EP 0495257 A [0127]
- \bullet US 4643736 A [0113]
- \bullet EP 0531372 A [0127]
- \bullet EP 119920 A [0113]
- \bullet W0 9611262 A [0127]
- \bullet WO 8906279 A [0119]
- \bullet WO 9629397 A [0127]
- \bullet WO 8906270 A [0119]
- \bullet WO 9808940 A [0127]
- \bullet WO 9425583 A [0119]
- \bullet WO 9407998 A [0127]
- \bullet WO 9219729 A [0120]
- \bullet EP 0531315 A [0127]
- \bullet WO 9820115 A [0120]
- \bullet US 5457046 A [0127]
- \bullet WO 9820116 A [0120]
- \bullet US 5686593 A [0127]
- \bullet WO 9834946 A [0120]
- \bullet US 5763254 A [0127]
- \bullet EP 258068 A [0122]
- \bullet WO 9524471 A [0127]
- \bullet EP 305216 A [0122]
- \bullet WO 9812307 A [0127]
- \bullet WO 9613580 A [0122]
- \bullet DK 9800299 W[0127]
- \bullet EP 218272 A [0122]
- \bullet WO 9324618 A [0128]
- \bullet EP 331376 A [0122]
- \bullet WO 9510602 A [0128]
- \bullet GB 1372034 A [0122]
- \bullet WO 9815257 A [0128]
- \bullet WO 9506720 A [0122]
- \bullet US 4106991 A [0131]
- \bullet WO 9627002 A [0122]
- \bullet US 4661452 A [0131]
- \bullet WO 9612012 A [0122]
- \bullet GB 1483591 A [0131]
- \bullet JP 64744992 B [0122]
- \bullet EP 238216 A [0131]
- \bullet WO 9116422 A [0122]
- \bullet WO 9219709 A [0139]
- \bullet WO 9205249 A [0123]
- \bullet WO 9219708 A [0139]
- \bullet WO 9401541 A [0123]
- \bullet US 5830837 A [0147]
- \bullet EP 407225 A [0123]
- \bullet WO 9510603 A [0152] [0199]
- \bullet EP 260105 A [0123]
- \bullet WO 9419454 A [0153]
\bullet M. TAKAGI et al. J. Ferment.
Bioeng., 1996, vol. 81 (6), 557-559
[0007]
\bullet H. NEURATH; R.L. HILL.
The Proteins. Academic Press, 1979 [0023]
\bullet J. SAMBROOK; E.F.
FRITSCH; T. MANIATUS. Molecular Cloning, A Laboratory
Manual. Cold Spring Harbor, 1989 [0024]
\bulletBOLTON; MCCARTHY.
Proceedings of the National Academy of Sciences USA,
1962, vol. 48, 1390 [0030]
\bulletSAMBROOK et al.
Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor,
1989 [0063]
\bulletINNIS et al. PCR: A
Guide to Methods and Application. Academic Press,
1990 [0075]
\bulletVILLA-KAMAROFF et al. Proceedings of the National Academy of Sciences
USA, 1978, vol. 75, 3727-3731 [0082]
\bulletDEBOER et al. Proceedings of
the National Academy of Sciences USA, 1983, vol. 80,
21-25 [0082]
\bullet Useful proteins from recombinant
bacteria. Scientific American, 1980, vol. 242,
74-94 [0082]
\bulletSIMONEN; PALVA.
Microbiological Reviews, 1993, vol. 57,
109-137 [0085]
\bulletEHRLICH. Proceedings of the
National Academy of Sciences USA, 1978, vol. 75, 1433
[0093]
\bulletCHANG; COHEN.
Molecular General Genetics, 1979, vol. 168,
111-115 [0100]
\bulletYOUNG; SPIZIZIN.
Journal of Bacteriology, 1961, vol. 81,
823-829 [0100]
\bulletDUBNAU;
DAVIDOFF-ABELSON. Journal of Molecular
Biology, 1971, vol. 56, 209-221
[0100]
\bulletSHIGEKAWA; DOWER.
Biotechniques, 1988, vol. 6, 742-751
[0100]
\bulletKOEHLER; THORNE.
Journal of Bacteriology, 1987, vol. 169,
5771-5278 [0100]
\bulletNEEDLEMAN, S.B.; WUNSCH,
C.D. Journal of Molecular Biology, 1970, vol. 48,
443-453 [0016]
\bulletDARTOIS et al. Biochemica et
Biophysica Acta, 1993, vol. 1131,
253-360 [0122]
\bullet Efficient manganese catalysts for
low-temperature bleaching. Nature,
1994, vol. 369, 637-639 [0143]
\bulletDIDERICHSEN et al. J.
Bacteriol., 1990, vol. 172, 4315-4321
[0152]
\bulletDYGERT, LI; FLORIDA;
THOMAS. Anal. Biochem, 1965, vol. 13, 368 [0175]
\bulletGRYCZAN, T.J. J. Bact,
1978, vol. 134, 318-329 [0195]
\bulletHORINOUCHI, S.;
WEISBLUM, B. J. Bact., 1982, vol. 150,
815-825 [0195]
\bullet Current protocols in Molecular
Biology. John Wiley and Sons, 1995 [0215]
\bulletSAMBROOK et al.
Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor
Lab, 1989 [0215]
\bullet Molecular Biological Methods for
Bacillus. John Wiley and Sons [0215]
\bulletDIDERICHSEN B.; WEDSTED
U.; HEDEGAARD L.; JENSEN B. R.; SJØHOLM C.
Cloning of aldB, which encodes alpha-acetolactate
decarboxylase, an exoenzyme from Bacillus brevis. J.
Bacteriol., 1990, vol. 172, 4315-4321
[0215]
\bulletPITCHER D. G.; SAUNDERS
N. A.; OWEN R. J. Rapid extraction of bacterial genomic DNA
with guanidium thiocyanate. Lett. Appl. Microbiol.,
1989, vol. 8, 151-156 [0215]
\bulletDRETZEN G.; BELLARD M.;
SASSONE-CORSI P.; CHAMBON P. A
reliable method for the recovery of DNA fragments from agarose and
acrylamide gels. Anal. Biochem., 1981, vol. 112,
295-298 [0215]
\global\parskip0.000000\baselineskip
<110> Novo Nordisk A/S
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> POLIPÉPTIDOS CON ACTIVIDAD ALCALINA
DE ALFA-AMILASA Y ÁCIDOS NUCLEICOS QUE CODIFICAN LAS
MISMAS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> FastSEQ para Windows Version 3.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1458
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bacillus sp.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(1458)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> mat_peptido
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(1458)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 485
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bacillus sp
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1458
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bacillus sp.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(1458)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> mat_peptido
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(1458)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 485
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bacillus sp.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> desconocido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa=Leu, Val, Ile
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa=Ile, Leu
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Región de cebador degenerado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> desconocido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> región de cebador degenerado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa=Gly, Ala
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa=Val, Phe, Leu
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa=Met, Leu, Ile, Phe
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> desconocido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa=Phe, Ile
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa=Phe, Leu, Ile, Val
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa=Ala, Val
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Región de Cebador Degenerado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> desconocido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Región de Cebador Degenerado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa=Phe, Ile
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa=Phe, Leu, Ile, Val
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa=Ala, Val
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> desconocido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Región de Cebador Degenerado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa=Asp, Glu
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> desconocido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Región de Cebador Degenerado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador 197 clonador de C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccgagctcgg ccggctgggc cgtcgactta tcgtttcacc catacgg
\hfill47
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 197 clonador de N
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcattctgcag cagcggcgca tcacgatggg acgaacgg
\hfill38
Claims (13)
1. Polipéptido aislado con actividad
\alpha-amilasa y con una secuencia de aminoácidos
que consiste en los aminoácidos del 1 al 485 de la SEC ID No: 2 o la
SEC ID No: 4.
2. Polipéptido según la reivindicación 1, el
cual está codificado por la secuencia de ácidos nucleicos contenida
en los plásmidos ppLiH1300 o pLiH1298 contenidos en la DSM12769 de
E. coli o la DSM 12768 de E. coli,
respectivamente.
3. Secuencia de ácidos nucleicos aislada que
comprende una secuencia de ácidos nucleicos, la cual a su vez
codifica el polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones
1-2.
4. Secuencia de ácidos nucleicos aislada que
comprende una secuencia de ácidos nucleicos con al menos una
mutación en la secuencia codificante del polipéptido maduro de la
SEC ID No: 1 o la SEC ID No: 3, donde la secuencia de ácidos
nucleicos mutante codifica un polipéptido que consiste en los
aminoácidos del 1 al 485 de la SEC ID No: 2 o la SEC ID No: 4.
5. Secuencia de ácidos nucleicos aislada según
la reivindicación 4, producida mediante (a) la hibridación de un
ADN bajo condiciones de astringencia medias con (i) la secuencia de
ácidos nucleicos de la SEC ID No: 1, (ii) la secuencia de ADNc de
la SEC ID No: 1, (iii) una subsecuencia de (i) o (ii) de al menos
100 nucleótidos, o (iv) una cadena complementaria de (i), (ii), o
(iii); y (b) el aislamiento de la secuencia de ácidos
nucleicos.
6. Vector de expresión recombinante que
comprende la secuencia de ácidos nucleicos de cualquiera de las
reivindicaciones 3-5.
7. Célula huésped recombinante que comprende el
constructo de ácidos nucleicos según la reivindicación 6.
8. Método para producir de una secuencia de
ácidos nucleicos mutante, la cual comprende (a) la introducción de
al menos una mutación en la secuencia codificante del polipéptido
maduro de la SEC ID No: 1 o la SEC ID No: 3, donde la secuencia de
ácidos nucleicos mutante codifica un polipéptido que consiste en
los aminoácidos del 1 al 485 de la SEC ID No: 2 o la SEC ID No: 4; y
(b) la recuperación de la secuencia de ácidos nucleicos
mutante.
9. Secuencia de ácidos nucleicos mutante
producida según el método de la reivindicación 8.
10. Método para producir un polipéptido, el cual
comprende (a) el cultivo de una cepa que a su vez comprende la
secuencia de ácidos nucleicos mutante según la reivindicación 9, la
cual codifica el polipéptido para producir un sobrenadante que
comprenda el polipéptido; y (b) la recuperación del polipéptido.
11. Método para producir el polipéptido de
cualquiera de las reivindicaciones 1-2, que
comprende (a) el cultivo de una cepa para producir un sobrenadante
que comprenda el polipéptido; y (b) la recuperación del
polipéptido.
12. Composición, en particular una composición
detergente, que comprende un polipéptido de cualquiera de las
reivindicaciones 1-2.
13. Uso del polipéptido de cualquiera de las
reivindicaciones 1-2 en una composición detergente,
en particular una composición detergente para lavandería y una
composición detergente para el lavado de la vajilla y composiciones
para la limpieza de superficies duras, o en una composición de
desencolado.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DK199900438 | 1999-03-31 | ||
| DKPA199900438 | 1999-03-31 | ||
| DK199900489 | 1999-04-13 | ||
| DKPA199900489 | 1999-04-13 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2322426T3 true ES2322426T3 (es) | 2009-06-22 |
Family
ID=26063997
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES00912414T Expired - Lifetime ES2322426T3 (es) | 1999-03-31 | 2000-03-28 | Polipeptidos con actividad alfa-amilasa y acidos nucleicos que codifican a los mismos. |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1169434B1 (es) |
| JP (1) | JP4750284B2 (es) |
| CN (1) | CN100523181C (es) |
| AR (1) | AR023230A1 (es) |
| AT (1) | ATE422538T1 (es) |
| AU (1) | AU3419200A (es) |
| DE (1) | DE60041536D1 (es) |
| ES (1) | ES2322426T3 (es) |
| WO (1) | WO2000060058A2 (es) |
Families Citing this family (98)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20020155574A1 (en) | 2000-08-01 | 2002-10-24 | Novozymes A/S | Alpha-amylase mutants with altered properties |
| JP4426716B2 (ja) | 2000-10-11 | 2010-03-03 | 花王株式会社 | 高生産性α−アミラーゼ |
| AU2002254876A1 (en) | 2001-05-15 | 2002-11-25 | Novozymes A/S | Alpha-amylase variant with altered properties |
| CN1313608C (zh) * | 2004-01-18 | 2007-05-02 | 中国科学院微生物研究所 | 一种碱性α－淀粉酶及其编码基因与生产方法 |
| JP4190479B2 (ja) * | 2004-10-22 | 2008-12-03 | ライオン株式会社 | アミラーゼ含有粒状洗剤組成物 |
| CA2592083C (en) | 2004-12-22 | 2017-02-21 | Novozymes A/S | Hybrid enzymes consisting of an endo-amylase first amino acid sequence and a carbohydrate-binding module as second amino acid sequence |
| DE102006038448A1 (de) | 2005-12-28 | 2008-02-21 | Henkel Kgaa | Enzym-haltiges Reinigungsmittel |
| BRPI1009263A2 (pt) * | 2009-03-10 | 2015-10-06 | Danisco Us Inc | alfa-amilases relacionadas com cepa de bacillus megaterium dsm90 e métodos de uso das mesmas. |
| CN102869759B (zh) | 2010-02-10 | 2015-07-15 | 诺维信公司 | 在螯合剂存在下具有高稳定性的变体和包含变体的组合物 |
| MX353621B (es) | 2011-06-30 | 2018-01-22 | Novozymes As | Variantes de alfa-amilasa. |
| EP2540824A1 (en) * | 2011-06-30 | 2013-01-02 | The Procter & Gamble Company | Cleaning compositions comprising amylase variants reference to a sequence listing |
| WO2014099525A1 (en) * | 2012-12-21 | 2014-06-26 | Danisco Us Inc. | Paenibacillus curdlanolyticus amylase, and methods of use, thereof |
| CN104884614A (zh) * | 2012-12-21 | 2015-09-02 | 丹尼斯科美国公司 | α-淀粉酶变体 |
| US9902946B2 (en) | 2013-01-03 | 2018-02-27 | Novozymes A/S | Alpha-amylase variants and polynucleotides encoding same |
| EP3978604A1 (en) * | 2013-03-11 | 2022-04-06 | Danisco US Inc. | Alpha-amylase combinatorial variants |
| US20160160202A1 (en) | 2013-05-29 | 2016-06-09 | Danisco Us Inc. | Novel metalloproteases |
| EP3110833B1 (en) | 2013-05-29 | 2020-01-08 | Danisco US Inc. | Novel metalloproteases |
| EP3004342B1 (en) | 2013-05-29 | 2023-01-11 | Danisco US Inc. | Novel metalloproteases |
| US20160108388A1 (en) | 2013-05-29 | 2016-04-21 | Danisco Us Inc. | Novel metalloproteases |
| WO2015089441A1 (en) | 2013-12-13 | 2015-06-18 | Danisco Us Inc. | Serine proteases of bacillus species |
| WO2015089447A1 (en) | 2013-12-13 | 2015-06-18 | Danisco Us Inc. | Serine proteases of the bacillus gibsonii-clade |
| WO2015095046A1 (en) | 2013-12-16 | 2015-06-25 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Use of poly alpha-1,3-glucan ethers as viscosity modifiers |
| AU2014364772B2 (en) | 2013-12-18 | 2018-07-26 | Nutrition & Biosciences USA 4, Inc. | Cationic poly alpha-1,3-glucan ethers |
| WO2015123323A1 (en) | 2014-02-14 | 2015-08-20 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Poly-alpha-1,3-1,6-glucans for viscosity modification |
| ES2734726T3 (es) | 2014-03-11 | 2019-12-11 | Du Pont | Poli alfa-1,2-glucano oxidado como reforzante de detergente |
| MX2016012044A (es) | 2014-03-21 | 2017-06-29 | Danisco Us Inc | Serina proteasas de especies de bacillus. |
| WO2015189370A1 (en) * | 2014-06-12 | 2015-12-17 | Novozymes A/S | Oxidation stable alpha-amylase variants |
| CN106459944B (zh) | 2014-06-12 | 2022-04-12 | 诺维信公司 | α-淀粉酶变体 |
| US9714403B2 (en) | 2014-06-19 | 2017-07-25 | E I Du Pont De Nemours And Company | Compositions containing one or more poly alpha-1,3-glucan ether compounds |
| US9771548B2 (en) | 2014-06-19 | 2017-09-26 | E I Du Pont De Nemours And Company | Compositions containing one or more poly alpha-1,3-glucan ether compounds |
| WO2016061438A1 (en) | 2014-10-17 | 2016-04-21 | Danisco Us Inc. | Serine proteases of bacillus species |
| EP3212782B1 (en) | 2014-10-27 | 2019-04-17 | Danisco US Inc. | Serine proteases |
| EP3212662B1 (en) | 2014-10-27 | 2020-04-08 | Danisco US Inc. | Serine proteases |
| DK3212781T3 (da) | 2014-10-27 | 2019-12-16 | Danisco Us Inc | Serinproteaser |
| EP3212783A1 (en) | 2014-10-27 | 2017-09-06 | Danisco US Inc. | Serine proteases |
| WO2016069557A1 (en) | 2014-10-27 | 2016-05-06 | Danisco Us Inc. | Serine proteases of bacillus species |
| EP3221447A1 (en) | 2014-11-20 | 2017-09-27 | Novozymes A/S | Alicyclobacillus variants and polynucleotides encoding same |
| CN107109450A (zh) | 2014-12-23 | 2017-08-29 | 纳幕尔杜邦公司 | 酶促产生的纤维素 |
| EP3294881B1 (en) | 2015-05-08 | 2022-12-28 | Novozymes A/S | Alpha-amylase variants and polynucleotides encoding same |
| CN107750275A (zh) | 2015-05-08 | 2018-03-02 | 诺维信公司 | α‑淀粉酶变体以及编码它们的多核苷酸 |
| EP3294883A1 (en) * | 2015-05-08 | 2018-03-21 | Novozymes A/S | Alpha-amylase variants having improved performance and stability |
| RU2733987C2 (ru) | 2015-05-13 | 2020-10-09 | ДАНИСКО ЮЭс ИНК. | Варианты протеазы клады aprl и их применения |
| WO2016201040A1 (en) | 2015-06-09 | 2016-12-15 | Danisco Us Inc. | Water-triggered enzyme suspension |
| WO2016201044A1 (en) | 2015-06-09 | 2016-12-15 | Danisco Us Inc | Osmotic burst encapsulates |
| WO2016201069A1 (en) | 2015-06-09 | 2016-12-15 | Danisco Us Inc | Low-density enzyme-containing particles |
| EP3310911B1 (en) | 2015-06-17 | 2023-03-15 | Danisco US Inc. | Bacillus gibsonii-clade serine proteases |
| MX2018004683A (es) | 2015-10-28 | 2018-07-06 | Novozymes As | Composicion detergente que comprende variantes de amilasa y proteasa. |
| BR112018008946A2 (pt) | 2015-11-05 | 2020-11-03 | Danisco Us Inc. | mananases de paenibacillus sp. |
| EP3371307A1 (en) | 2015-11-05 | 2018-09-12 | Danisco US Inc. | Paenibacillus and bacillus spp. mannanases |
| JP6997706B2 (ja) | 2015-11-13 | 2022-01-18 | ニュートリション・アンド・バイオサイエンシーズ・ユーエスエー・フォー，インコーポレイテッド | 洗濯ケアおよび織物ケアにおいて使用するためのグルカン繊維組成物 |
| EP3374401B1 (en) | 2015-11-13 | 2022-04-06 | Nutrition & Biosciences USA 4, Inc. | Glucan fiber compositions for use in laundry care and fabric care |
| JP7045313B2 (ja) | 2015-11-13 | 2022-03-31 | ニュートリション・アンド・バイオサイエンシーズ・ユーエスエー・フォー，インコーポレイテッド | 洗濯ケアおよび織物ケアにおいて使用するためのグルカン繊維組成物 |
| BR112018011755A2 (pt) | 2015-12-09 | 2018-12-04 | Danisco Us Inc | variantes combinatórias de alfa-amilase |
| EP3390625B1 (en) | 2015-12-18 | 2023-09-06 | Danisco US Inc. | Polypeptides with endoglucanase activity and uses thereof |
| CN114480035A (zh) | 2016-04-08 | 2022-05-13 | 诺维信公司 | 洗涤剂组合物及其用途 |
| EP3452585A1 (en) | 2016-05-03 | 2019-03-13 | Danisco US Inc. | Protease variants and uses thereof |
| EP3452584B1 (en) | 2016-05-05 | 2021-01-06 | Danisco US Inc. | Protease variants and uses thereof |
| EP3464599A1 (en) | 2016-05-31 | 2019-04-10 | Danisco US Inc. | Protease variants and uses thereof |
| BR112018075933A2 (pt) | 2016-06-17 | 2019-10-01 | Danisco Us Inc | variantes de protease e usos das mesmas |
| US20190264138A1 (en) | 2016-11-07 | 2019-08-29 | Danisco Us Inc. | Laundry detergent composition |
| DE102016221851A1 (de) * | 2016-11-08 | 2018-05-09 | Henkel Ag & Co. Kgaa | Amylase für Wasch- und Reinigungsmittelanwendungen |
| WO2018118917A1 (en) | 2016-12-21 | 2018-06-28 | Danisco Us Inc. | Protease variants and uses thereof |
| US11946081B2 (en) | 2016-12-21 | 2024-04-02 | Danisco Us Inc. | Bacillus gibsonii-clade serine proteases |
| WO2018169750A1 (en) | 2017-03-15 | 2018-09-20 | Danisco Us Inc | Trypsin-like serine proteases and uses thereof |
| CN110662836B (zh) | 2017-03-31 | 2024-04-12 | 丹尼斯科美国公司 | α-淀粉酶组合变体 |
| WO2018183662A1 (en) | 2017-03-31 | 2018-10-04 | Danisco Us Inc | Delayed release enzyme formulations for bleach-containing detergents |
| JP2020527339A (ja) | 2017-06-30 | 2020-09-10 | ダニスコ・ユーエス・インク | 低凝集の酵素含有粒子 |
| WO2019036721A2 (en) | 2017-08-18 | 2019-02-21 | Danisco Us Inc | VARIANTS OF ALPHA-AMYLASES |
| CN111373039A (zh) | 2017-11-29 | 2020-07-03 | 丹尼斯科美国公司 | 具有改善的稳定性的枯草杆菌蛋白酶变体 |
| EP3728543A1 (en) | 2017-12-21 | 2020-10-28 | Danisco US Inc. | Enzyme-containing, hot-melt granules comprising a thermotolerant desiccant |
| BR112020016068A2 (pt) | 2018-02-08 | 2020-12-08 | Danisco Us Inc. | Partículas cera termicamente resistente matriz para encapsulamento de enzima |
| WO2019245704A1 (en) | 2018-06-19 | 2019-12-26 | Danisco Us Inc | Subtilisin variants |
| EP3799601A1 (en) | 2018-06-19 | 2021-04-07 | Danisco US Inc. | Subtilisin variants |
| MX2021001213A (es) | 2018-07-31 | 2021-08-24 | Danisco Us Inc | Variantes de alfa-amilasas que tienen sustituciones de aminoácidos que bajan el pka del ácido general. |
| US20210189295A1 (en) | 2018-08-30 | 2021-06-24 | Danisco Us Inc | Enzyme-containing granules |
| EP3856882A1 (en) | 2018-09-27 | 2021-08-04 | Danisco US Inc. | Compositions for medical instrument cleaning |
| WO2020077331A2 (en) | 2018-10-12 | 2020-04-16 | Danisco Us Inc | Alpha-amylases with mutations that improve stability in the presence of chelants |
| WO2020112599A1 (en) | 2018-11-28 | 2020-06-04 | Danisco Us Inc | Subtilisin variants having improved stability |
| CN113302270A (zh) | 2018-12-03 | 2021-08-24 | 诺维信公司 | 低pH粉末洗涤剂组合物 |
| EP3976776A1 (en) | 2019-05-24 | 2022-04-06 | Danisco US Inc. | Subtilisin variants and methods of use |
| US20220306968A1 (en) | 2019-06-06 | 2022-09-29 | Danisco Us Inc | Methods and compositions for cleaning |
| WO2021080948A2 (en) | 2019-10-24 | 2021-04-29 | Danisco Us Inc | Variant maltopentaose/maltohexaose-forming alpha-amylases |
| US20240034960A1 (en) | 2020-08-27 | 2024-02-01 | Danisco Us Inc | Enzymes and enzyme compositions for cleaning |
| EP4284906A1 (en) | 2021-01-29 | 2023-12-06 | Danisco US Inc. | Compositions for cleaning and methods related thereto |
| CN117616120A (zh) | 2021-06-30 | 2024-02-27 | 丹尼斯科美国公司 | 变体脂肪酶及其用途 |
| CN117916354A (zh) | 2021-09-03 | 2024-04-19 | 丹尼斯科美国公司 | 用于清洁的衣物洗涤组合物 |
| CN117957318A (zh) | 2021-09-13 | 2024-04-30 | 丹尼斯科美国公司 | 含有生物活性物质的颗粒 |
| WO2023114939A2 (en) | 2021-12-16 | 2023-06-22 | Danisco Us Inc. | Subtilisin variants and methods of use |
| WO2023114932A2 (en) | 2021-12-16 | 2023-06-22 | Danisco Us Inc. | Subtilisin variants and methods of use |
| WO2023114988A2 (en) | 2021-12-16 | 2023-06-22 | Danisco Us Inc. | Variant maltopentaose/maltohexaose-forming alpha-amylases |
| WO2023114936A2 (en) | 2021-12-16 | 2023-06-22 | Danisco Us Inc. | Subtilisin variants and methods of use |
| WO2023168234A1 (en) | 2022-03-01 | 2023-09-07 | Danisco Us Inc. | Enzymes and enzyme compositions for cleaning |
| WO2023225459A2 (en) | 2022-05-14 | 2023-11-23 | Novozymes A/S | Compositions and methods for preventing, treating, supressing and/or eliminating phytopathogenic infestations and infections |
| WO2023250301A1 (en) | 2022-06-21 | 2023-12-28 | Danisco Us Inc. | Methods and compositions for cleaning comprising a polypeptide having thermolysin activity |
| WO2024050346A1 (en) | 2022-09-02 | 2024-03-07 | Danisco Us Inc. | Detergent compositions and methods related thereto |
| WO2024050343A1 (en) | 2022-09-02 | 2024-03-07 | Danisco Us Inc. | Subtilisin variants and methods related thereto |
| WO2024050339A1 (en) | 2022-09-02 | 2024-03-07 | Danisco Us Inc. | Mannanase variants and methods of use |
| WO2024102698A1 (en) | 2022-11-09 | 2024-05-16 | Danisco Us Inc. | Subtilisin variants and methods of use |
Family Cites Families (77)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB1296839A (es) | 1969-05-29 | 1972-11-22 | ||
| GB1372034A (en) | 1970-12-31 | 1974-10-30 | Unilever Ltd | Detergent compositions |
| US3912590A (en) | 1973-01-03 | 1975-10-14 | Novo Industri As | Procedure for liquefying starch |
| GB1483591A (en) | 1973-07-23 | 1977-08-24 | Novo Industri As | Process for coating water soluble or water dispersible particles by means of the fluid bed technique |
| GB1590432A (en) | 1976-07-07 | 1981-06-03 | Novo Industri As | Process for the production of an enzyme granulate and the enzyme granuate thus produced |
| DK187280A (da) | 1980-04-30 | 1981-10-31 | Novo Industri As | Ruhedsreducerende middel til et fuldvaskemiddel fuldvaskemiddel og fuldvaskemetode |
| FR2498783B1 (fr) | 1981-01-23 | 1988-03-04 | Decis Mario | Dispositif de controle automatique de presence |
| JPS57174089A (en) | 1981-04-20 | 1982-10-26 | Novo Industri As | Chain dividing enzyme product |
| FR2543181B1 (fr) | 1983-03-22 | 1985-07-26 | Ugine Kuhlmann | Procede ameliore de desencollage-blanchiment simultane des tissus |
| US4760025A (en) | 1984-05-29 | 1988-07-26 | Genencor, Inc. | Modified enzymes and methods for making same |
| DK263584D0 (da) | 1984-05-29 | 1984-05-29 | Novo Industri As | Enzymholdige granulater anvendt som detergentadditiver |
| US4683202A (en) | 1985-03-28 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying nucleic acid sequences |
| DE3684398D1 (de) | 1985-08-09 | 1992-04-23 | Gist Brocades Nv | Lipolytische enzyme und deren anwendung in reinigungsmitteln. |
| EG18543A (en) | 1986-02-20 | 1993-07-30 | Albright & Wilson | Protected enzyme systems |
| DK122686D0 (da) | 1986-03-17 | 1986-03-17 | Novo Industri As | Fremstilling af proteiner |
| ES2052565T3 (es) | 1986-07-09 | 1994-07-16 | Novo Nordisk As | Un procedimiento para licuar una suspension de almidon o granos amilaceos. |
| EP0258068B1 (en) | 1986-08-29 | 1994-08-31 | Novo Nordisk A/S | Enzymatic detergent additive |
| NZ221627A (en) | 1986-09-09 | 1993-04-28 | Genencor Inc | Preparation of enzymes, modifications, catalytic triads to alter ratios or transesterification/hydrolysis ratios |
| EP0305216B1 (en) | 1987-08-28 | 1995-08-02 | Novo Nordisk A/S | Recombinant Humicola lipase and process for the production of recombinant humicola lipases |
| JPS6474992A (en) | 1987-09-16 | 1989-03-20 | Fuji Oil Co Ltd | Dna sequence, plasmid and production of lipase |
| DK6488D0 (da) | 1988-01-07 | 1988-01-07 | Novo Industri As | Enzymer |
| EP0394352B1 (en) | 1988-01-07 | 1992-03-11 | Novo Nordisk A/S | Enzymatic detergent |
| JP3079276B2 (ja) | 1988-02-28 | 2000-08-21 | 天野製薬株式会社 | 組換え体ｄｎａ、それを含むシュードモナス属菌及びそれを用いたリパーゼの製造法 |
| JP2728531B2 (ja) | 1988-03-24 | 1998-03-18 | ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ | セルラーゼ調製品 |
| US5648263A (en) | 1988-03-24 | 1997-07-15 | Novo Nordisk A/S | Methods for reducing the harshness of a cotton-containing fabric |
| GB8915658D0 (en) | 1989-07-07 | 1989-08-23 | Unilever Plc | Enzymes,their production and use |
| US5147796A (en) | 1989-09-19 | 1992-09-15 | Kao Corporation | Alkaline pullulanase Y having α-amylase activity |
| JP3112937B2 (ja) | 1990-04-14 | 2000-11-27 | カリ―ヒエミー アクチエンゲゼルシヤフト | アルカリ性バチルスーリパーゼ、これをコード化するｄｎａ配列およびこのリパーゼを生産するバチルス |
| DK115890D0 (da) | 1990-05-09 | 1990-05-09 | Novo Nordisk As | Enzym |
| ATE118545T1 (de) | 1990-05-09 | 1995-03-15 | Novo Nordisk As | Eine ein endoglucanase enzym enthaltende zellulasezubereitung. |
| DE69129988T2 (de) | 1990-09-13 | 1999-03-18 | Novo Nordisk As | Lipase-varianten |
| DE69133035T2 (de) | 1991-01-16 | 2003-02-13 | Procter & Gamble | Kompakte Waschmittelzusammensetzungen mit hochaktiven Cellulasen |
| EP0511456A1 (en) | 1991-04-30 | 1992-11-04 | The Procter & Gamble Company | Liquid detergents with aromatic borate ester to inhibit proteolytic enzyme |
| ATE136055T1 (de) | 1991-04-30 | 1996-04-15 | Procter & Gamble | Gerüstsubstanzhaltige flüssigwaschmittel mit borsäure-polyolkomplex zur ptoteolytischen enzyminhibierung |
| US5858757A (en) | 1991-05-01 | 1999-01-12 | Novo Nordisk A/S | Stabilized enzymes and detergent compositions |
| DK72992D0 (da) | 1992-06-01 | 1992-06-01 | Novo Nordisk As | Enzym |
| DK88892D0 (da) | 1992-07-06 | 1992-07-06 | Novo Nordisk As | Forbindelse |
| JP3678309B2 (ja) | 1992-07-23 | 2005-08-03 | ノボザイムス アクティーゼルスカブ | 突然変異α−アミラーゼ、洗剤、皿洗い剤及び液化剤 |
| MX9306229A (es) | 1992-10-06 | 1994-05-31 | Novo Nordisk As | Variantes de celulasa y composiciones detergentes que la contienen. |
| DK0867504T4 (da) | 1993-02-11 | 2011-08-29 | Genencor Int | Oxidativ stabil alfa-amylase |
| WO1994019454A2 (en) | 1993-02-19 | 1994-09-01 | Novo Nordisk A/S | An amylolytic enzyme |
| PL306812A1 (en) | 1993-04-27 | 1995-04-18 | Gist Brocades Nv | Novel lipase variants suitable for use in detergents |
| DK52393D0 (es) | 1993-05-05 | 1993-05-05 | Novo Nordisk As | |
| JP2859520B2 (ja) | 1993-08-30 | 1999-02-17 | ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ | リパーゼ及びそれを生産する微生物及びリパーゼ製造方法及びリパーゼ含有洗剤組成物 |
| US5830837A (en) | 1994-11-22 | 1998-11-03 | Novo Nordisk A/S | Amylase variants |
| JPH09503916A (ja) | 1993-10-08 | 1997-04-22 | ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ | アミラーゼ変異体 |
| BR9407808A (pt) | 1993-10-13 | 1997-05-06 | Novo Nordisk As | Variante de peroxidase com melhorada estabilidade para peróxido de hidrogenio em condições alcalinas composição de alvejamento e composição detergente |
| DK131193D0 (es) | 1993-11-23 | 1993-11-23 | Novo Nordisk As | |
| JPH07143883A (ja) | 1993-11-24 | 1995-06-06 | Showa Denko Kk | リパーゼ遺伝子及び変異体リパーゼ |
| MY111537A (en) | 1994-02-02 | 2000-07-31 | Novo Nordisk As | A combined desizing and bleaching process. |
| US5605793A (en) | 1994-02-17 | 1997-02-25 | Affymax Technologies N.V. | Methods for in vitro recombination |
| ATE222604T1 (de) | 1994-02-22 | 2002-09-15 | Novozymes As | Methode zur herstellung einer variante eines lipolytischen enzymes |
| DK0749473T3 (da) | 1994-03-08 | 2006-02-27 | Novozymes As | Hidtil ukendte alkaliske cellulaser |
| ATE305031T1 (de) | 1994-03-29 | 2005-10-15 | Novozymes As | Alkalische amylase aus bacellus |
| AU2524695A (en) | 1994-05-04 | 1995-11-29 | Genencor International, Inc. | Lipases with improved surfactant resistance |
| AU2884595A (en) | 1994-06-20 | 1996-01-15 | Unilever Plc | Modified pseudomonas lipases and their use |
| AU2884695A (en) | 1994-06-23 | 1996-01-19 | Unilever Plc | Modified pseudomonas lipases and their use |
| DE4422198C2 (de) | 1994-06-24 | 1997-08-28 | Audi Ag | Verfahren zum Steuern der elektrischen Beheizung eines Katalysators |
| US5919691A (en) | 1994-10-06 | 1999-07-06 | Novo Nordisk A/S | Enzyme and enzyme preparation with endoglucanase activity |
| BE1008998A3 (fr) | 1994-10-14 | 1996-10-01 | Solvay | Lipase, microorganisme la produisant, procede de preparation de cette lipase et utilisations de celle-ci. |
| US5827719A (en) | 1994-10-26 | 1998-10-27 | Novo Nordisk A/S | Enzyme with lipolytic activity |
| AR000862A1 (es) * | 1995-02-03 | 1997-08-06 | Novozymes As | Variantes de una ó-amilasa madre, un metodo para producir la misma, una estructura de adn y un vector de expresion, una celula transformada por dichaestructura de adn y vector, un aditivo para detergente, composicion detergente, una composicion para lavado de ropa y una composicion para la eliminacion del |
| JPH08228778A (ja) | 1995-02-27 | 1996-09-10 | Showa Denko Kk | 新規なリパーゼ遺伝子及びそれを用いたリパーゼの製造方法 |
| CN101955921A (zh) | 1995-03-17 | 2011-01-26 | 诺沃奇梅兹有限公司 | 新的内切葡聚糖酶 |
| JP3025627B2 (ja) | 1995-06-14 | 2000-03-27 | 花王株式会社 | 液化型アルカリα−アミラーゼ遺伝子 |
| DE69633825T2 (de) | 1995-07-14 | 2005-11-10 | Novozymes A/S | Modifiziertes enzym mit lipolytischer aktivität |
| ATE267248T1 (de) | 1995-08-11 | 2004-06-15 | Novozymes As | Neuartige lipolytische enzyme |
| CN1217742A (zh) * | 1996-03-07 | 1999-05-26 | 普罗格特-甘布尔公司 | 含有改进的淀粉酶的洗涤剂组合物 |
| US5763385A (en) | 1996-05-14 | 1998-06-09 | Genencor International, Inc. | Modified α-amylases having altered calcium binding properties |
| BR9612702A (pt) * | 1996-08-01 | 1999-08-03 | Procter & Gamble | Composição detergentes compreendendo amilase aperfeiçoada para limpeza de tecidos encardidos |
| AU3938997A (en) | 1996-08-26 | 1998-03-19 | Novo Nordisk A/S | A novel endoglucanase |
| CN100362100C (zh) | 1996-09-17 | 2008-01-16 | 诺沃奇梅兹有限公司 | 纤维素酶变体 |
| AU730286B2 (en) | 1996-10-08 | 2001-03-01 | Novo Nordisk A/S | Diaminobenzoic acid derivatives as dye precursors |
| BR9712473B1 (pt) | 1996-11-04 | 2009-08-11 | variantes de subtilase e composições. | |
| BR9712878A (pt) | 1996-11-04 | 2000-02-01 | Novo Nordisk As | Variante de enzima subtilase, processos para a identificação de uma variante de protease apresentando estabilidade autoproteolìtica e paraq a produção de uma enzima subtilase mutante e de uma variante de subtilase, sequência de dna, vetor, célula hospedeira microbiana, composição e uso de uma variante de subtilase. |
| WO1998034946A1 (en) | 1997-02-12 | 1998-08-13 | Massachusetts Institute Of Technology | Daxx, a novel fas-binding protein that activates jnk and apoptosis |
| AU7908898A (en) | 1997-07-04 | 1999-01-25 | Novo Nordisk A/S | Family 6 endo-1,4-beta-glucanase variants and cleaning composit ions containing them |
-
2000
- 2000-03-28 JP JP2000609550A patent/JP4750284B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2000-03-28 AU AU34192/00A patent/AU3419200A/en not_active Abandoned
- 2000-03-28 AT AT00912414T patent/ATE422538T1/de not_active IP Right Cessation
- 2000-03-28 EP EP00912414A patent/EP1169434B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-03-28 ES ES00912414T patent/ES2322426T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2000-03-28 CN CNB00807805XA patent/CN100523181C/zh not_active Expired - Lifetime
- 2000-03-28 WO PCT/DK2000/000147 patent/WO2000060058A2/en active Application Filing
- 2000-03-28 DE DE60041536T patent/DE60041536D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-03-31 AR ARP000101459A patent/AR023230A1/es not_active Application Discontinuation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU3419200A (en) | 2000-10-23 |
| AR023230A1 (es) | 2002-09-04 |
| JP2002540784A (ja) | 2002-12-03 |
| JP4750284B2 (ja) | 2011-08-17 |
| DE60041536D1 (de) | 2009-03-26 |
| EP1169434A2 (en) | 2002-01-09 |
| CN100523181C (zh) | 2009-08-05 |
| CN1351657A (zh) | 2002-05-29 |
| WO2000060058A3 (en) | 2001-04-12 |
| WO2000060058A2 (en) | 2000-10-12 |
| EP1169434B1 (en) | 2009-02-11 |
| ATE422538T1 (de) | 2009-02-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2322426T3 (es) | Polipeptidos con actividad alfa-amilasa y acidos nucleicos que codifican a los mismos. | |
| ES2532606T3 (es) | Polipéptidos con actividad de alfa-amilasa alcalina y ácidos nucleicos que los codifican | |
| US6309871B1 (en) | Polypeptides having alkaline α-amylase activity | |
| US7566561B2 (en) | Alpha-amylase mutants | |
| ES2329528T3 (es) | Metodo para diseñar mutantes alfa-amilasa con propiedades determinadas. | |
| JP5166880B2 (ja) | α−アミラーゼ変異型 | |
| US20180051268A1 (en) | Alpha-amylase Variants With Altered Properties | |
| ES2425351T3 (es) | Polipéptidos que tienen actividad de alfa-amilasa y polinucleótidos que codifican los mismos | |
| WO2001064852A1 (en) | Polypeptides having alkaline alpha-amylase activity and nucleic acids encoding same | |
| US6623948B1 (en) | Nucleic acid sequences encoding alkaline alpha-amylases | |
| WO2000075296A1 (en) | Novel glucoamylase | |
| EP1303633A2 (en) | CGTase AND DNA SEQUENCE ENCODING SAME | |
| MXPA06015025A (es) | Variantes de alfa-amilas con propiedades alteradas |