MXPA06015025A - Variantes de alfa-amilas con propiedades alteradas - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a variantes (mutantes) de polipéptidos, en particular alfa-amilasas tipo termamil, cuyas variantes tienen actividad alfa-amilasa y exhiben una alteración en al menos una de la siguientes propiedades con relación a la alfa-amilasa precursora:especificidad de substrato, enlace de substrato, patrón de desdoblamiento de substrato, estabilidad térmica, perfil de pH/actividad, perfil de pH/estabilidad, estabilidad hacia la oxidación, dependencia de Ca2+, actividad específica, en particular aplicaciones de lavandería y lava trastos.

Description

VARIANTES DE ALFA-AMILASA CON PROPIEDADES ALTERADAS CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se refiere a variantes (imitantes) de alfa-amilasas tipo termamilo precursoras, cuya variante tienen actividad alfa-amilasa y exhibe una alteración en por lo menos una de las siguientes propiedades relativas a dicha alfa-amilasa precursora: especificidad del substrato, enlace del substrato, patrón de división del substrato, estabilidad térmica, perfil de actividad del pH, perfil de estabilidad del pH, estabilidad hacia la oxidación, dependencia de Ca2+, pl reducida e incrementada y desempeño mejorado de lavado, actividad específica, estabilidad bajo por ejemplo, temperatura alta ylo condiciones de pH bajo/alto, en particular en concentraciones de calcio bajas, y estabilidad en presencia de detergente, por ejemplo, estabilidad de almacenamiento en los detergentes. La variante de la invención es conveniente para la conversión de almidón, producción de etanol, lavado .en lavandería, lavado de trastos de cocina, limpieza de superficies duras, producción de edulcorantes y/o desencolado textil.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION Las alfa amilasas (alfa-1 , 4-glucan-4-glucanohidrolasas , E.C. 3.2.1.1) constituye un grupo de enzimas, que catalizan •Reí . : 178266 la hidrólisis de almidón y otros oligo y polisacáridos 1,4-glucosídicos ramificados y lineales. El objetivo de la invención, es proporcionar una alfa-amilasa mejorada, en particular adecuada para usarse en detergentes .

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION El objetivo de la presente invención, es proporcionar alfa-amilasas tipo termamilo cuyas variantes en comparación con la alfa-amilasa precursora correspondiente, es decir, una alfa-amilasa no mutada, tiene actividad alfa-amilasa y exhibe una alteración en por lo menos una de las propiedades anteriores relativas a dicha alfa-amilasa precursora. Nomenc1atura En la presente descripción y en las reivindicaciones, se usan códigos de una letra .y tres letras para los residuos de aminoácidos. Para facilitar la referencia, Las variantes del alfa-amilasa de la invención son descritas mediante el uso de la siguiente nomenclatura: Aminoácido (s) originales: posición (es) : aminoácido (s) sustituidos De acuerdo a esta nomenclatura, por ejemplo, la substitución de alanina por asparigina en la posición 30 se muestra como: Ala30Asn o A30N una supresión de alanina en la misma posición se muestra como : Ala30* o A30* Una inserción de un residuo de aminoácidos adicionales, tal como la lisina, se muestra como: Ala30AlaLys o A30AK Una supresión de un estiramiento consecutivo de residuos de aminoácidos, tal como los residuos 30-33 de aminoácidos, se indica como (30-33)* o ?(?30-?33). Donde una alfa-amilasa específica contiene una "supresión" en comparación con otra alfa-amilasa y una inserción se hace en tal posición, esto se indica como: *36Asp o *36D para la inserción de un ácido aspártico en la posición 36. Las mutaciones múltiples se separan mediante signos de más, es decir: Ala30Asn + Glu34Ser o A30N+E34S que representan las mutaciones en las posiciones 30 y 34 que sustituyen a la alanina y al ácido glutámico por la asparigina y serina, respectivamente. Cuando pueden insertarse uno o más de los residuos del aminoácido más alternativos en una posición dada, esto se indica como A30N,E o A30N o A30E Además, cuando una posición conveniente para la modificación se identifica en la presente, sin que se sugiera ninguna modificación específica, será entendido que cualquier residuo de aminoácidos puede sustituirse para el residuo de aminoácidos presente en la posición. Así, por ejemplo, cuando se menciona una modificación de una alanina en la posición 30, pero no se especifica, será entendido que la alanina puede anularse o puede sustituirse para cualquier otro aminoácido, es decir, cualquiera de uno de: R,N,D, A,C,Q,E,G,H, I , L, K, , F, P, S , T, W, Y,V. Además, "A30X" significa cualquiera de una de las siguiente substituciones: A30R, A30N, A30D, A30C, A30Q, A30E, A30G, A30H, A30I, A30L, A30K, A30M, A30F, A30P, A30S, A30T, A30W, A30Y, o A30 V; o para abreviar: A30R,N,D,C,Q,E,G,H, I,L,K, ,F, P, S,T,W, Y,V. Si la enzima precursora- usada para la enumeración- ya tiene el residuo de aminoácidos en cuestión sugeridos en esa posición, se usa la siguiente nomenclatura: "X30N" o "X30N,V" en el caso, en donde por ejemplo, uno de N o V está presente en el tipo silvestre. Así, esto significa que se sustituyen otras enzimas precursoras correspondientes para una "Asn" o" Val" en la posición 30.

Características de residuos de aminoácidos Aminoácidos cargados: Asp, GIu, Arg, Lys, His Aminoácidos cargados negativamente (con el primer residuo más negativo) : Asp, Glu, Aminoácidos cargados positivamente (con el primer residuo más positivo): Arg, Lys, His Aminoácidos neutros: -Gly Ala, Val, Leu, lie, Phe, Tyr, Trp, Met, Cys, Asn, Gln, Ser, Thr, Pro Los residuos de aminoácidos hidrófobos (con el residuo más hidrófobo listado en último lugar) : Gly, Ala, Val, Pro, Met, Leu, lie, Tyr, Phe, Trp, Los aminoácidos hidrofílicos (con el residuo más hidrofílico listado en último lugar) : Thr, Ser, Cys, Gln, Asn, BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS La Figura 1 es una alineación de las secuencias de aminoácidos de las trece alfa-amilasas tipo termamilo precursoras .

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION El objetivo de la presente invención es proporcionar polipéptidos , tales como las enzimas, en particular, las alfa-amilasas , con una alteración en por lo menos una de las siguientes propiedades relativa a dichos polipéptidos progenitores: especificidad del substrato, enlace del substrato, patrón de división del substrato, estabilidad térmica, perfil del pH/actividad, estabilidad hacia la oxidación, dependencia de Ca2+ y actividad específica, en particular en las aplicaciones de lavandería y lavado de trastos. Las propiedades se definirán adicionalmente abajo. Polipéptidos Los polipéptidos de acuerdo a la invención incluyen proteínas con actividad biológica, actividad antimicrobial , y actividad enzimática. Las actividades de la enzima contempladas incluyen proteasas, las amilasas, CGTasas, manasas, amilasas maltogénicas , glucoamilasas, carbohidrasas , transíerasas, liasas, oxidoreductasas , lipasas. En una modalidad preferida, la enzima es un alfa-amilasa, en particular un alfa-amilasa Bacillus o Aspergillus. En una modalidad preferida, la alfa-amilasa Bacillus es una amilasa tipo termamilo. Los polipéptidos con la actividad biológica incluyen, EPO, TPO, hormonas de crecimiento, péptidos reguladores, factores de coagulación sanguínea, anticuerpos etc.

Estructura Terciaria de SP722 y Modelado de las Estructuras Terciarias de otra alfa-amilasa tipo Termamilo. Se han encontrado mutantes de alfa-amilasas de la presente invención basadas en la estructura terciaria de SP722 que se muestra en el APÉNDICE 1 de WO 01/66712. Los mutantes de otros polipéptidos pueden encontrarse con base en otras estructuras terciarias. Un modelo de otra amilasa tipo termamilo alcalina AA560 ha sido establecido con base a la estructura terciaria SP722 descrita en el APÉNDICE 1 de WO 01/66712. Las alfa-amilasas AA560 son aproximadamente 87% idénticas a la amilasa plantilla (SP722) y la alineación no contiene inserciones o supresiones . Los resultados de la presente invención pueden aplicarse en las amilasas tipo termamilo que son al menos 60% idénticas, preferentemente por lo menos 70% idénticas, más preferentemente 80% idénticas, más aun preferentemente 85% idénticas, más aun preferentemente 90% idénticas, más aun 95% idénticas, más aun 97% idénticas, más aun 99% idénticas a las alfa-amilasas tipo termamilo que se muestras en la SEQ ID NO: 12. Preferentemente, los resultados pueden usarse en un alfa-amilasa tipo termamilo alcalina, especialmente, alfa-amilasas alcalinas de la misma longitud, sin residuos amino adicionales o espacios en una estructura primaria alineada en comparación con SP722 (SEQ ID NO: 4 que se muestra como el número 7 en la alineación en la figura 1) . Especialmente, el resultado puede usarse en las siguientes alfa-amilasa tipo termamilo alcalinas: SP690 (SEQ ID NO: 2), SP722 (SEQ ID NO: 4), AA560 (SEQ ID NO: 12), alfa-amilasa #707 (SEQ ID NO: 13), la alfa-amilasa KSM AP 1378 se describe en la WO 97/00324, la alfa-amilasa #SP7-7 se describe en la WO 02/10356, o fragmento o formas truncas de las mismas. Las últimas alfa-amilasas alcalinas mencionadas tienen una estructura cristalina terciaria muy similar alrededor de las zonas de las interacciones antedichas y tiene la misma longitud de estructura primaria de 485 aminoácidos. Contrariamente a esto, por ejemplo, el termamilo (mostrado como la secuencia número 1 en la alineación en la figura 1) carece de dos residuos de aminoácido (posiciones 1 y 2); tiene los espacios en las posiciones 174 y 181-182; y tiene tres residuos de aminoácido adicionales -en las posiciones 378-381 cuando se alinean con SP722. BAN (que se muestra como la secuencia número 4 en la alineación en la Fig.l) carece de cinco residuos del aminoácido (posiciona 1-4 y 488) ; tiene los espacios en las posiciones 174 y 181-182; y tiene tres residuos de aminoácido adicionales en posiciones 378-381 si se alinea con SP722. BSG (que se muestra como la secuencia número 3 en la alineación en la Fig. 1) carece de un residuo de aminoácido (posición 1) ; y tiene 31 residuos de aminoácido adicionales en las posiciones 489-519 si se alinea con SP722. KSM-K36 y KSM-K38 (EP 1,022,334-A) carece de cinco residuos de aminoácido (posiciones 1 y 2) y tiene los espacios en las posiciones 174 y 181-182 cuando se alinean con SP722. AA180, AA20 y Amrk385 (solicitud de patente Danesa No, PA 2000 00347 o PCT/DK01/00133 ) tienen un aminoácido adicional en la posición 261 cuando se alinean con SP722. Debajo se describe cómo modelar un alfa-amilasa tipo termamilo de otra alfa-amilasa . Este método puede ser extrapolado a otros polipéptidos como por ejemplo, los mencionados anteriormente.

Modelado de alfa-amilasa tipo Termamilo La WO 96/23874 proporciona la estructura terciaria (estructura en 3D) , datos de la estructura cristalina con rayos X para una alfa-amilasa tipo termamilo, que consiste en los 300 residuos de aminoácido N-terminal de la alfa-amilasa B. amyloliquefaciens (BAN™) y aminoácidos 301-483 del extremo C-terminal de la alfa-amilasa B. licheniformis (SEQ ID NO: 8) . La WO 96/23874 describe además, la metodología para diseñar (modelado) , en base a un análisis de la estructura de una alfa-amilasa tipo termamilo progenitor, variantes de la alfa-amilasa tipo termamilo precursora que exhibe propiedades alteradas relativas al progenitor.

Otras estructuras tipo termamilo pueden modelarse de acuerdo con la WO 96/23874, que está en la presente incorporada por la referencia. En relación con la obtención de la variante de la presente invención en la estructura terciaria AA560, se diseño (modelada) con base a la estructura terciaria de SP722 (descrita en el APÉNDICE 1) como se describe en el Ejemplo 1. La estructura de otras alfa-amilasa tipo termamilo (por ejemplo, aquellas descritas en la presente) puede construirse análogamente.

Alfa-amilasa tipo termamilo Un número de alfa-amilasas producidas por Bacillus spp son altamente homologas (idénticas) en el nivel del aminoácido . La identidad de un número de alfa-amilasas Bacillus puede encontrarse en la Tabla 1 de abajo (ClustalW) : Tabla 1 BLA BAN AMY BSG AA56 sp70 S.p7 AMRK38 SP69 M- SP722 AAI10 K38 1048 0 7 -7 5 0 AP1378 BLA 100. 80.8 65.2 65.4 68.1 67.9 67.1 70.6 68.7 68.9 70.2 70.2 62.5 Bfi 80.6 100. 64.9 65.1 66.3 66.3 65.7 67.6 66.5 66.5 68.0 68.2 59.5 U AMiTl 53.8 53.6 100. 75.6 54.6 54.6 55.0 57.0 56.1 55.8 55.6 56.5 48.1 048 0 B9G 61.4 61,2 86,0 100, 62,3 62,5 63,1 64,1 63,7 63,7 63,1 65,6 55,2 U AA56 67,8 66,2 66,0 66,2 100, 95,5 94,6 89,7 87,0 86,0 86,8 78,6 63,7 0 0 Sp,7 67,6 66,2 66,0 66,4 95,5 100, 92,8 90,5 87,6 86,4 86,2 79,8 63,5 07 0 Sp,7 66,8 65,6 66,4 67,0 94,6 92,8 100, 89,1 88,5 87,2 87,0 79,2 63,7 -7 0 AMRK 70,2 67,3 68,7 67,9 89,5 90,3 88,9 100,0 89,3 88,9 87,5 81,9 65,4 385 SP69 68,5 68,4 67,8 67,6 87,0 87,6 88,5 89,5 100,0 95,1 87,2 81,2 65,6 U KSM- 68,7 66,4 67,4 67,6 86,0 86,4 87,2 89,1 95,1 100,0 86,6 80,6 66,2 AP13 78 SP72 69,9 67,8 67,2 67,0 86,8 86,2 87,0 87,6 87,2 86,6 100,0 80,6 66,0 o AAI1 69,9 68,0 68,3 69,7 78,6 79,8 79,2 82,1 81,2 80,6 80,8 100,0 68,5 U K38 82,9 60,0 58,8 59,2 64,4 64,2 64,4 66,3 66,3 66,9 66,7 69,2 100,0 Por ejemplo, la alfa-amilasa B. licheniformis que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 8 (comercialmente disponible como Termamyl™) se ha encontrado ser aproximadamente 81% homologa con la alfa-amilasa B. amyloliquefaciens que comprende la secuencia de aminoácido que se muestra en la SEQ ID NO: 10 y aproximadamente 65% homologa con la alfa-amilasa B. stearothermophilus que comprende la secuencia de aminoácido que se muestra en la SEQ ID NO: 6. Además, las alfa-amilasas homologas incluyen SP690 y SP722 descritas en la WO 95/26397 y referidas además en la SEQ ID NO: 2 y la SEQ ID NO: 4, respectivamente, en la presente. Otras amilasas son la alfa-amilasa AA560 derivada de Bacillus sp. y que se muestra en la SEQ ID NO: 12, y la alfa-amilasa #707 derivada del Bacillus sp. Descrito por Tsukamoto et al., Biochemical and Biophysical Research Communications, 151 (198ß) , p. 25-31. La alfa-amilasa KSM AP1378 se describe en la WO 97/00324 (de KAO Corporation) . También se contemplan las K38 y alfa-amilasas K38 descritas en la EP 1,022,334 de acuerdo a la invención. Se muestran otras alfa-amilasas en las SEQ NOS: 13, 14, 15, 16, 17, y 18. Aun, además las alfa-amilasas homologas incluyen la alfa-amilasa producida por la cepa B. licheniformis descrita en la EP 0252666 (ATCC 27811), y las alfa-amilasas identificadas en la WO 91/00353 y WO 94/18314. Otras alfa-amilasa tipo termamilo comerciales incluidas en los productos vendidos bajo las siguientes marcas comerciales: Optitherm™ y Takatherm™ (disponible de Solvay) ; Maxamyl™ (disponible de Gist-brocades/Genencor) , Spezym AA™ y Spezyme Delta AA™ (disponible de Genencor) , y Keistase™ (disponible de Daiwa) , Purastar™ ST 5000E, PURASTRA™ HPAM L (de Genencor Int.). Debido a la homología substancial encontrada entre estas alfa-amilasas, se considera que pertenecen a la misma clase de alfa-amilasas, principalmente la clase de "alfa-amilasa tipo termamilo" . Por consiguiente, en el presente contexto, el término "alfa-amilasa tipo termamilo" se pretende indicar una alfa-amilasa, que, en el nivel del aminoácido, exhibe una identidad sustancial para el Termamilo™, es decir, la alfa-amilasa B. licheniformis que tiene la secuencia de aminoácido que se muestra en la SEQ ID NO: 8 en la presente. En otras palabras, todas las siguientes alfa-amilasas que tienen las secuencias de aminoácido que se muestran en las SEQ NOS: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 13, 14, 15, 16, 17, y 18 se consideran en la presente ser "alfa-amilasa tipo termamilo" . Otras alfa-amilasa tipo termamilo son alfa-amilasa que i) que muestran por lo menos 60%, tal como por lo menos 70%, por ejemplo, por lo menos 75%, o por lo menos 80%, por lo menos 85%, por lo menos 90%, por lo menos 95%, por lo menos 97%, por lo menos 99% de homología con por lo menos una de dichas secuencias de aminoácido que se muestras en las SEQ NOS: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 13, 14, 15, 16, 17 y 18 y/o ii) se codifica mediante una secuencia de ADN que hibridiza a las secuencias de ADN que codifican a las alfa-amilasas especificadas arriba, que son aparentes a partir de la SEQ NOS: 1, 3, 5, 7, 9, 11 y de la presente especificación (qué codifica a las secuencias de codificación de las secuencias del aminoácido que se muestras en las SEQ NOS: 2, 4, 6, 8, 10 y 12 en la presente, respectivamente) También, las amilasas de termamilo consisten de 1) un dominio catalizador con la homología alta para el termamilo y 2) de un dominio que enlaza al hidrato de carbono (CBM) debe entenderse como incluido en esta aplicación. El dominio de enlace puede localizarse en cualquier N-terminal relativo a la secuencia del dominio catalítico o C-terminal relativo al dominio catalizador, podría haber más de un CBM localizado en cualquier N- o C-terminal o ambos. Las amilasas con CBM podrían venir de fuentes naturales o pueden ser los resultados de ingeniería genética en la que se fusiona el gen que fusiona a una amilasa con un gen que codifica a una CBM.

Homología (Identidad) La homología puede determinarse como el grado de dentidad entre las dos secuencias que indican una derivación de la primera secuencia del segundo. La homología puede determinarse adecuadamente por medio de programas de computadora conocidos en el arte como -GAP proporcionado en paquete del programa GCG (descrito anteriormente) . Así, el Gap GCGv8 puede usarse con la matriz de puntuación de valor por defecto para la identidad y los siguiente parámetros predefinidos: penalidad de creación GAP de 5.0 y penalidad de extensión GAP de 0.3, respectivamente para la comparación de la secuencia de ácido nucleicos, y penalidad de creación de GAP de 3.0 y penalidad de extensión GAP de 0.1, respectivamente, para la comparación de secuencia de proteína. GAP usa el método de Needleman y Wunsch, (1970), J. Mol. Biol. 48, p.443-453, para hacer las alineaciones y calcular la identidad. Una alineación estructural entre el Termamilo (SEQ ID NO: 8) y, por ejemplo, otra alfa-amilasa puede usarse para identificar las posiciones equivalente/correspondiente en otras alfa-amilasa tipo termamilo. Un método de obtener dicha alineación estructural es usar el programa Pile Up del paquete GCG que usa valores predefinidos de penalidades GAP, es decir, una penalidad de creación de espacio de 3.0 y penalidad de excepción espacio de 0.1. Otros métodos de alineación estructurales incluyen el análisis de grupos hidrófobo (Gaboriaud et al., (1987), FEB LETTERS 224, pp. 149-155) y hebra inversa (Huber, T; Torda, AE, PROTEIN SCIENCE Vol. 7, No., 1 p . 142-149 (1998) Hibridización La sonda del oligonucleotido usada en la caracterización del polipéptido, tal como la alfa-amilasa tipo termamilo de acuerdo con la propiedad ii) de arriba puede prepararse adecuadamente en base a la secuencia de aminoácidos o nucleótido parcial o total de la alfa-amilasa en cuestión. Las condiciones adecuadas para probar la hibridización involucran el pre-remojado en 5xSSC y pre hibridización durante 1 hora a ~40°C en una solución de 20% de formamida, solución de 5x Denhardt, 50 mM de fosfato de sodio, pH 6.8, y 50 mg de ADN de timo de ternero sonicado desnaturalizado, seguido por la hibridización en la misma solución complementada con 100 mM ATP durante 18 horas a ~40°C, seguido por tres veces el lavado del filtro en 2xSSC, 0.2% SDS a 40°C durante 30 minutos (baja severidad) , preferido a las 50°C (severidad media) , más preferentemente a 65°C (severidad alta) , más aun preferentemente a ~75°C (severidad muy alta) . Pueden encontrarse más detalles sobre el método de hibridización en Sambrook et al., Molecular_Cloning : A Laboratory Manual, 2 Ed., Cold Spring Harbor, 1989. En el presente contexto, "derivado de" se pretende no solo indicar una alfa-amilasa producida o producible por una cepa del organismo en cuestión, sino tambi-én una alfa-amilasa codificada por una secuencia de ADN aislada de tal cepa y producida en un organismo hospedero transformado con dicha secuencia de ADN. Finalmente, el término pretende indicar una alfa-amilasa, que se codifica por una secuencia de ADN sintética y/o origen de ADNc y que tiene las características de identificación del alfa-amilasa en cuestión. También, el término pretende indicar que la alfa-amilasa precursora puede ser una variante de una alfa-amilasa que ocurre naturalmente, es decir, una variante que es el resultado de una modificación (inserción, substitución, supresión) de una o más residuos del aminoácido de la alfa-amilasa que ocurre naturalmente .

Alfa-amilasas tipo termamilo precursoras De acuerdo con la invención, todas las alfa-amilasa tipo termamilo, definidas arriba, pueden usarse como la alfa-amilasa precursora (es decir, la estructura) . En una modalidad preferida de la invención, la alfa-amilasa precursora se deriva de la B. licheniformis , por ejemplo, una de aquella referida anteriormente, tal como la alfa-amilasa B. licheniformis que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 10. En una modalidad preferida, la alfa-amilasa tipo termamilo precursora es la SP722 o BSG o ??5-6? que incluye cualquiera de SP722+R181*+G182* , SP722+D183*+3184* ; SP722+D183*+G184*+N195F; SP722+D183*+G184*+M202L; SP722+D183*+G184*+N195F+M202L; SP722+D183 *+G184*+Rl81 Q; SP722+D183*+G184*+R118K+N195F+R320K+R458K; BSG+1181* +G182*; BSG+I181*+G182*+N193F; BSG+I181*+G182*+M200L; BSG+1181* +G182*+N193F+M200L; AA560+D183*+G184* ; AA560+D183*+G184*+N195F; AA560+D183 *+G184*+M202L; AA560+D183*+Gl84*+N195F+M202L; AA560+D183*+Gl84*+R118K+N195F+R320K+R458K. "BSG+1181 * +G182*+N193F" quiere decir o significa que la alfa-amilasa B. stearothermophilus ha sido imitada como sigue: supresiones en las posiciones 1181 y G182 y una substitución de Asn (N) a Phe (F) en la posición 193.

Alfa-amilasas tipo termamilo híbridas precursoras La alfa-amilasa precursora (es decir, la estructura alfa-amilasa) puede también ser una alfa-amilasa híbrida, es decir, una alfa-amilasa, que comprende una combinación de secuencias de aminoácidos parciales derivadas de por lo menos una alfa-amilasa. La alfa-amilasa híbrida precursora puede ser una, que con base a la homología de los aminoácidos (identidad) y/o hibridación de ADN (como se definió anteriormente) puede determinarse para pertenecer a la familia alfa-amilasa tipo termamilo. En este caso, la alfa-amilasa híbrida -está típicamente compuesta de por lo menos, una parte de una alfa-amilasa tipo termamilo y parte (s) de una o más de otras alfa-amilasas seleccionadas de alfa-amilasa tipo termamilo o alfa-amilasa no del tipo termamilo de origen microbiano (bacteriano o fúngico) y/o mamífero. Así, la alfa-amilasa tipo termamilo precursora puede comprender una combinación de secuencias de aminoácidos parciales que se derivan de por lo menos dos alfa-amilasa tipo termamilo, o de al . menos un tipo termamilo y al menos una alfa-amilasa bacteriana tipo termamilo, o de al menos un tipo termamilo y de al menos una alfa-amilasa fúngico. La alfa-amilasa tipo termamilo de la cual se deriva una secuencia de aminoácidos parciales, puede ser cualquiera de aquellas alfa-amilasa tipo termamilo específicas referidas en la presente. Por ejemplo, la alfa-amilasa precursora puede comprender una parte C terminal de una alfa-amilasa derivada de una cepa de B. licheniformis, y una parte N-terminal de una alfa-amilasa derivada de una cepa de B. amyloliquefaciens o de una cepa de B. stearothermophilus . Por ejemplo, la a-amilasa precursora puede comprender 430 residuos de aminoácidos de la parte C-terminal de la alfa-amilasa B. licheniformis, y puede, por ej-emplo, comprender a) un segmento del aminoácido que corresponde a los 37 residuos del aminoácido N-terminal de la alfa-amilasa B. amyloliquefaciens que tiene la secuencia del aminoácido que se muestra en la SEQ ID NO: 10 y un segmento del aminoácido que corresponden a los 445 residuos de aminoácido C-terminal de la alfa-amilasa B. licheniformis que tiene la secuencia del aminoácido que se muestra en la SEQ ID NO: 8, o una alfa-amilasa tipo termamilo híbrida que es idéntica a la secuencia del Termamilo, es decir, la alfa-amilasa Bacillus licheniformis que se muestra en la SEQ ID NO: 8, sólo que los 35 residuos del aminoácido N-terminal (de la proteína madura) se han reemplazado por los 33 residuos N-terminal de BAN (proteína madura) , es decir, la alfa-amilasa del Bacillus amyloliguefaciens que se muestra en la SEQ ID NO: 10; o b) un segmento del aminoácido que corresponde a los 68 residuos de aminoácidos N-terminal de la a-amilasa B. stearothermophilus que tiene la secuencia del aminoácido que se muestra en la SEQ ID NO: 6 y un segmento del aminoácido que corresponden a los 415 residuos del aminoácido C-terminal de la alfa-amilasa B. licheniformis que tiene la secuencia del aminoácido que se muestra en la SEQ ID NO: 8. Otra alfa-amilasa híbrida precursora adecuada es una que se describe previamente en la WO 96/23874 (-de Novo Nordisk) que constituye el término N de BAN, la alfa-amilasa Bacillus amyloliguefaciens (aminoácidos 1-300 de la proteína madura) y el C-terminal del Termamilo (aminoácidos 301-483 de la proteína madura) . Aun otra alfa-amilasa híbrida precursora adecuada consiste de la secuencia de las SEQ NOS: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 13, 14, 15, 16, 17, o 18, y los últimos 99 aminoácidos de la SEQ ID NO: 13 (AMY1048) . En una modalidad preferida de la invención, la alfa-amilasa tipo termamilo precursora es una alfa-amilasa híbrida de la SEQ ID NO: 8 y la SEQ ID NO: 10. Específicamente, la alfa-amilasa tipo termamilo híbrida precursora puede ser una alfa-amilasa híbrida que comprende los 445 residuos de aminoácido C-terminal de la alfa-amilasa B. licheniformis que se muestra en la SEQ ID NO: 8 y los 33 residuos de aminoácido N-terminal de la alfa-amilasa derivados de la B. amyloliguefaciens que se muestra en la SEQ ID NO: 10 que pueden tener adecuadamente además, las siguientes mutaciones: H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S (usando la enumeración en la SEQ ID NO: 8) . El último híbrido mencionado se usa en los ejemplos de abajo y se refieren como LE174. Otra alfa-amilasa precursora contemplada específicamente incluye LE174 con menos mutaciones, es decir, arriba a la derecha se menciona un híbrido que tiene las siguientes mutaciones: A181T+N190F+A209V+Q264S; N190F+A209V+Q264S ; A209V+Q264S; Q264S H156Y+N190F+A2O9V- .264S; H156Y+A209V+Q264S; H156Y+Q264S ; H156Y+A181T+A209V+Q264S; H156Y+A181T+Q264S; H156Y+Q264S; H156Y+A181T+N190F+Q264S ; H156Y+A181T+N190F; H156Y+A181T+N190F+A209V. Estos híbridos también son considerados parte de la invención.

En una modalidad preferida, la alfa-amilasa tipo termamilo precursora es LE174 que incluye cualquiera de LE174+G48A+T49I+G107A+I201F; LE174+M197L; o LE174+G48A+T49I+G107A+M197L+I201F. Otras alfa-amilasas precursoras contempladas incluyen LE429, que es LE174 con una substitución adicional en 1201F. De acuerdo a la invención LE335 es la alfa-amilasa, que en comparación a la LE429 tiene substituciones adicionales en T49I+G107A; LE399 es LE335+G48A, es decir, LE174, con G48A+T49I+G107A+I201F.

Construcción de variantes de la invención. La construcción de la variante de interés puede lograrse cultivando un microorganismo que comprende una secuencia de ADN que codifica la variante bajo condiciones que son conducivas para producir la variante. La variante puede recuperarse entonces como consecuencia del caldo de cultivo resultante. Esto se describe con mayor detalle abajo.

Propiedades alteradas Lo siguiente discute la relación .entre las mutaciones, que están presentes en las variantes de la invención y alteraciones deseables en las propiedades (relativas a aquellas alfa-amilasa tipo termamilo) , que puede resultar de ello.

Como se menciona arriba, la invención se refiere a las alfa-amilasa tipo termamilo con propiedades alteradas, en particular, a temperaturas altas y/o a un pH bajo, en particular, en concentraciones bajas en calcio. En el contexto de la invención "temperatura alta" significa temperaturas de 70-120°C, preferentemente 80-100°C, especialmente 85-95°C. En el contexto de la presente invención, el término "pH bajo" significa un pH en el rango de 4-6, preferentemente 4.2-5.5, especialmente 4.5-5. En el contexto de la presente invención, el término "pH alto" significa de un pH en el rango de 8-11, especialmente 8.5-10.6. En el contexto de la presente invención, el término "concentración de calcio baja" significa libre de niveles de calcio inferiores a 60 ppm, preferentemente 40 ppm, más preferentemente 25 ppm, especialmente 5 ppm de calcio. La alfa-amilasa tipo termamilo precursora contemplada específicamente en una relación que va a través de las propiedades alteradas específicamente son las alfa-amilasa tipo termamilo precursora mencionada arriba y la alfa-amila-sa tipo termamilo híbrida precursora. La alfa-amilasa SP722 se usa como el punto de partida, pero las correspondientes posiciones en por ejemplo, los termamilo, BSG, BA , ??56?, SP690, AA180, KSM AP1378, SP7-7 y #707, K38, y K36 deben comprenderse también como se describen.

Diseño de variantes de amilasa estables a la oxidación mejorada : La M197 en la SEQ ID NO: 8 o las M202 equivalentes en la SEQ ID NO: 12 se ha demostrado que incrementan la estabilidad en presencia de agentes de blanqueado como por ejemplo, perborato etc. en los detergentes. También, la mutación de M15 en la SEQ ID NO : 8 han mostrado algún efecto, pero para las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 10, y 12 y otras amilasas que no tienen una metionina correspondiente a la posición equivalente a M15, se han encontrado otros residuos, en particular otras metioninas, para incrementar la estabilidad de la que se observa para M202. Estas incluyen pero no se limitan a M9 , MIO, M105, M116 (no presentes en SP690, SP722, AMRK385) M202, M208, M261, M309, M323 (sólo en AA560, SP722), M382, M410 (SP.7-7), M430, M440, en la SEQ ID NO: 12, 17, y 18, considerando que en la SEQ ID NO: 16 (AAI-10) las posiciones más interesantes son: MIO, M105, M202, M208, M246, M286, M309, M430, M440, M454 y considerando que en la SEQ ID NO: 14(Amrk385) las posiciones más interesantes son: M9 , MIO, M105, M202, M208, M262, M310, M383, M431, M441, y considerando que en la SEQ ID NO: 15 ( 38) las posiciones más interesantes son: M7 , M8, M103, M107, M277, M281, ?3?4, M318, M380, M425, M435. Las substituciones más preferidas son: M9L.I, M10L, M105L,I,F, M116N, D, L, I , F , W, R, K, M202L,I,T,V, M208F,Y,L,I, M261 L,I, M309L,I, 323L, I , S , T, A, Q, E, N, D, M382L, I,Y,F,K, M410L,I,V, M430L,I, M440L,I,F,Y. Como se estableció arriba, M202 ha demostrado ser importante para la estabilidad en presencia de agentes blanqueadores. Sin embargo, la M202 que muta a las substituciones preferidas para su estabilidad, reduce la actividad de la amilasa. Para re-activar la amilasa, las substituciones a lo largo de la hendidura que enlaza al substrato putativo ha demostrado ser beneficiosa para la actividad. Estas incluyen entre otras: T193, K269, N270, L272, Y295, N296, N299, S303, Y304, Q311, N314, G315, Q319, y A339. Las mutaciones preferidas son: T193S,N, D, E, Q, K269S,Q, N270F,Y,D, L272I,V,A, Y295F, N, D, Q, E, N296K,Q,E, N299F,Y,Q,T, S303Q,K, Y304F,R,K, Q311N,Q,K,R,T,S,Y,F, N , 314D , S , , Q , G315N,S,T, Q319E,K,S,T, A339S,T. La enzima óptima por lavar la aplicación tiene que cumplir varios criterios para trabajar óptimamente. Debe ser estable en la matriz de detergente previo a su uso, debe ser estable durante el lavado y debe ser altamente activa durante el lavado. Existen varios ejemplos reportados para perfeccionar cada uno de éstos criterios pero debido a que las amilasas estables a la oxidación son menos activas y las amilasas activadas son menos estables, el alcance de esta invención es identificar la combinación óptima de substituciones que cumplan todas las tres reivindicaciones. Las combinaciones preferidas son: M9L+M202I M9L+M202I+M323T M9L+M202I+M323T+M382Y M202I+Y295F M202I+A339S M9L+M202I+Y295F+A339S M9L+ 202I+Y295F M9L+M202I+A339S M9L+M202I+Y295F+A339S M9L+M202I+Y295F+A339S+E345R M9L+G149A+M202I+Y295F+A339S+E345R M9L+M202L M9L+ 202L+M323T M9L+M202L+M323T+M382Y M202L+Y295F M202L+A339S 9L+M202L+Y295F+A339S M9L+ 202L+Y295F 9L+M202L+A339S M9L+M202L+Y295F+A339S M9L+M202L+Y295F+A339S+E345R M9L+G149A+M202L+Y295F+A339S+E345R 9L+M202T M9L+M202T+M323T M9L+M202T+M323T+M382Y M202T+Y295F M202T+A339S M9L+M202T+Y295F+A339S M9L+M202T+Y295F M9L+M202T+A339S M9L+M202T+Y295F+A339S M9L+M202T+Y295F+A339S+E345R 9L+G149A+M202T+Y295F+A339S+E345R 9L+G149A+M202I+V214T+Y295F+N299Y+ 323T+A339S+E345R M9L+G149A+M202L+V214I+Y295F+M323T+A339S+E345R+ 382Y M9L+G149A+G182T+G186A+ 202I+V214I+Y295F+N299Y+M323T+A339 S M9L+G149A+G182T+G186A+M202L+T257I+Y295F+N299Y+M323T+A339 S+E345R M9L+G149A+M202L+V214T+Y295F+N299Y+M323T+A339S+E345R M9L+G149A+M202I+V214I+Y295F+M323T+A339S+E345R+M382Y 9L+G149A+G182T+G186A+ 202L+V214I+Y295F+N299Y+M323T+A339 S M9L+G149A+G182T+G186A+M202I+T257I+Y295F+N299Y+M323T+A339 S+E345R M9L+G149A+M202I+V214T+Y295F+N299Y+M323T+A339S+E345R+N471 M9L+G149A+M202L+V214I+Y295F+M323T+A339S+E345R+M382Y+N471 E M9L+G149A+G182T+G186A+M202I+V214I+Y295F+N299Y+M323T+A339 S+N471 E M9L+G149A+G182T+G186A+M202L+T2571+Y295F+N299Y+M323T+A339 S+E345R+N471E. En el primer aspecto, una variante de una alfa-amilasa tipo termamilo precursora que comprende una alteración en una o más posiciones seleccionada del grupo de: 26, 30, 33, 82, 37, 106, 118, 128, 133, 149, 150, 160, 178, 182, 186, 193, 203, 214, 231 , 256, 257, 258, 269, 270, 272, 283, 295, 296, 298, 299, 303, 304, 305, 311 , 314, 315, 318, 319, 339, 345, 361 , 378, 383, 419, 421 , 437, 441 , 444, 445, 446, 447, 450, 461 , 471 , 482, 484, en donde (a) las alteración (es) son independientemente (i) una inserción de un aminoácido en dirección 3' del aminoácido que ocupa la posición, (ii) una supresión del aminoácido que ocupa la posición, o (iii) una sustitución del aminoácido que ocupa la posición con una amino. (b) la variante tiene actividad alfa-amilasa, y (c) cada posición corresponde a una posición -de la secuencia de aminoácidos de la alfa-amilasa precursora que tiene la secuencia de aminoácidos de la alfa-amilasa tipo termamilo precursora, que tiene la secuencia de aminoácidos de AA560 que se muestra en la SEQ ID NO: 12. En una modalidad preferida, la variante de la invención (usando la SEQ ID NO: 12 para la numeración) tiene una o más de las siguientes mutaciones/sustituciones: R26S, D30N, N33D, R82H, K37T, N106D, K118Q, N128Y, G133E,A, G149A,N, N150H,Q, Y160F, Y178F, G182T, G186A, T193S,N,D,E,Q, Y203L, V214I.T, D231 N, G256K, T257I, G258D, K269S,Q, N270F,Y,D, L272I,V,A, N283D, Y295F, , D, Q, E, N296K,Q,E, Y298F,H, N299F,Y,Q,T, S303Q,K, Y304F,R,K, G305D, Q311N,Q,K,R,T,S,Y,F, N314D,S,T,Q, G315N,S,T, V318L, Q319E,K,S,T, A339S,T, E345N,R, Q361E, 3378K, K383R, T419N, H421Y, N437H, F441L, R444E,Y, N445Q, K446R, A447Y, V450T, T461, N471E, 482Y, N484Q. Las mutaciones dobles, triples y múltiples que se usan en la SEQ ID NO: 12 como base para la numeración incluye: M9L+M202I, M9L+M202I+M323T, M9L+M202I+323T+M382Y, M9L+M202I+Y295F+A339S, M9L+M202I+Y295F, M9L+M202I+A339S, 9L+M202I+Y295F+A339S, 9L+M202I+Y295F+A339S+E345R, M9L+G149A+ 202I+Y295F+A339S+E345R, M9L+M202L, M9L+M202L+M323T, M9L+M202L+M232T+M382Y, M9L+M202L+Y295F+A339S, M9L+M202L+Y295F, M9L+M202L+A339S, 9L+M202L+Y295F+A339S, M9L+M202L+Y295F+A339S, E345R, M9L+G149A+M202L+Y295F+A339S+E345R, M9L+M202T, M9L+M202T+ 323T, M9L+M202T+M323T+M382Y, 9L+M202T+Y295F+A339S, M9L+M202T+Y295F, 9L+M202T+A339S, M9L+M202T+Y295F+A339S, M9L+M202T+Y295F+A339S+E345R, M9L+G149A+M202T+Y295F+A339S+E345R, M9L+G149A+M202I+V214T+Y29SF+N299Y+M323T+A339S+E345R, M9L+G149A+M202L+V214I+Y295F+M323T+A339S+E345R+M382Y, 9L+G149A+G182T+G186A+M202I+V214I+Y295F+N299Y+M323T+A339 M9L+G149A+G182T+G186A+M202L+T257I+Y295F+N299Y+M323T+A339 5R, 9L+G149A+ 202L+V214T+Y295F+N299Y+M323T+A339S+E345R, M9L+G149A+M202I+V214I+Y295F+ 323T+A339S+E345R+M382Y, M9L+G149A+G182T+G186A+M202L+V214I+Y295F+N299Y+M323T+A339 S, M9L+G149A+G182T+G186A+M202I+T257I+Y295F+N299Y+M323T+A339 S+E345R, M9L+G149A+M202I+V214T+Y295F+N299Y+ 323T+A339S+E34SR+N471 E, M9L+G149A+M202L+V214I+Y295F+ 323T+A339S+E345R+M382Y+N471 E, M9L+G149A+G182T+G186A+ 2021+V214I+Y295F+N299Y+M323T+A339 S+N471E, M9L+G149A+G182T+G186A+M202L+T257I+Y295F+N299Y+M323T+A339 S+E345R+N471E M202L+ 105F+M208F, G133E+M202L+Q361E, G133E+M202L+R444E, M202L+Y295F, M202L+A339S, M202L+ 323T, M202L+M323T+M309L, M202L+ 323T+M4301, 202L+V214T+R444Y, M202L+N283D+Q361E, M202L+M382Y+K383R, M202L+K446R+N484Q, M202I+Y295F, M202I+A339S, M202I+M105F+ 208F, G133E+M202I+Q361E, G133E+M202I+R444E, M202I+ 202I+M323T, M202I+M202I+M323T+M309L, M202I+ 323T+M430I, M202I+V214T+R444Y, M202I+N283D+Q361E, M202I+M382Y+K383R, M202I+K446R+N484Q, M2 O2V+Ml O5F+M208F, G133E+M202V+Q361E, G133E+M202V+R444E, M202V+M323T, M2 O2V+M323T+M309L, M2 O2V+ 323T+M4301, M202V+M323T+M9L, M202V+V214T+R444Y, 202V+N283D+Q361E , 202V+M382Y+K383R, M202V+K446R+N484Q, M2 2T+M105F+M208F, G133E+M202T+Q361E, G133E+M202T+R444E, M202T+Y295F, M202T+A339S, 202T+M323T, M202T+M323T+M309L, M202T+M323T+M430I, M202T+M323T+M9L, M202T+V214T+R444Y, M202T+N283D+Q361E, 202T+A339S, M202T+Y295F M202T+N299F, Y, M202T+M382Y+K383R, M202T+ 446R+N484Q.

Estabilidad En el contexto de la presente invención, las mutaciones (que incluyen substituciones y supresiones del aminoácido) de importancia con respecto a lograr una estabilidad alterada, en particular, la estabilidad mejorada (es decir, superior o baja) , a temperaturas especialmente altas (es decir, 70-120°C) y/o pH extremo (es decir pH bajo o alto, es decir, pH 4-6 o pH 8-11, respectivamente), en particular, .en concentraciones libres de calcio (es decir, no limitadas, por consiguiente en la solución) por debajo de 60 ppm, incluye cualquiera de las mutaciones listadas en la sección "Propiedades alteradas". La estabilidad puede determinarse como se describe en la sección "Materials & Methods" de abajo.

Estabilidad de Ca2+ La estabilidad de Ca+ alterada significa la estabilidad de la enzima bajo el consumo de Ca2+ que se ha mejorado, es decir, estabilidad superior o inferior. En el contexto de la presente invención, las mutaciones (que incluyen substituciones y supresiones del aminoácido) de importancia con respecto a lograr la estabilidad de Ca2+ alterada, en particular, la estabilidad de Ca2+ mejorada, es decir, estabilidad superior o inferior, a especialmente pH alto (es decir, pH 8-10.5) incluye cualquiera de las mutaciones listadas en la sección "Propiedades alteradas" .

Actividad específica En un aspecto adicional de la presente invención, las mutaciones importantes (incluso las substituciones y supresiones del aminoácido) con respecto a obtener variantes que exhiban actividad específica alterada, en particular, actividad específica disminuida o incrementada, especialmente a temperaturas de 10-60°C, preferent-emente 20-50°C, especialmente 30-40°C, incluyen cualquiera de las mutaciones listadas en la sección "Propiedades alteradas" . La actividad específica puede determinarse como se describe en la sección de abajo "Material & Methods".

Estabilidad a la oxidación Las variantes de la invención pueden haber alterado la estabilidad de la oxidación, en particular, la estabilidad de oxidación superior, comparada con el alfa-amilasa progenitor. La estabilidad de la oxidación incrementada es ventajosa en, por ejemplo, composiciones del detergente y la estabilidad de oxidación disminuida puede ser ventajosa en la composición para la licuefacción de almidón. La estabilidad de la oxidación puede determinarse como se describe en la sección "Material & Methods" de abajo.

Perfil del pH alterado Las posiciones y mutaciones importantes con respecto a la obtención de variantes con perfil de pH alterado, en particular, actividad mejorada particular a un pH especialmente alto (es decir, pH 8-10.5) o pH bajo (es decir, pH 4-6) incluye mutaciones de residuos amino localizados cerca de los residuos del sitio activo. Las mutaciones/substituciones específicas preferidas son unas que se listan arriba en la sección "Propiedades alteradas" para las posiciones en cuestión. Se describen ensayos adecuados en la sección "Materials & Methods" de abajo .

Desempeño del lavado Las mutaciones y posiciones importantes con respecto a obtener las variantes con el desempeño de lavado mejorado a especialmente un pH neutro a alto, es decir, pH 6-11, preferentemente pH 8.5-11, incluye las mutaciones/substituciones específicas listadas arriba en la sección "Propiedades alteradas" para las posiciones en cuestión. El desempeño del lavado puede probarse como se describe abajo en la sección "Materials & Methods".

Métodos para preparar variantes alfa-amilasa de la invención . Se conocen en el arte varios métodos para introducir mutaciones en los genes. Después de una discusión breve acerca de la clonación de las secuencias de ADN que codifican al alfa-amilasa, se discutirán los métodos para generar mutaciones en sitios específicos dentro de la secuencia que codifica a las alfa-amilasas .

Clonación de una secuencia de ADN que codifica a una alfa-amilasa . La secuencia de ADN que codifica a un alfa-amilasa precursora puede aislarse de cualquier célula o microorganismo que produce la alfa-amilasa en cuestión, usando varios métodos bien conocidos en el arte. Primero, debe construirse una colección de ADN y/o ADNc genómico usando ADN cromosomal o AR mensajero del organismo que produce la alfa-amilasa a ser estudiada. Entonces, si se conoce la secuencia del aminoácido del alfa-amilasa, las sondas de oligonucleótidos etiquetados homólogos pueden sintetizarse y usarse para identificar los clones que codifican al alfa-amilasa de una colección genómica preparada del organismo en cuestión. Alternativamente, una sonda de oligonucleótidos etiquetados que contienen secuencias homologas a un gen alfa-amilasa conocido podría usarse como una sonda para identificar a los clones que codifican a la alfa-amilasa, usando condiciones de hibridación y lavado de severidad baja. Aun otro método para identificar los clones que codifican a las alfa-amilasa involucraría insertar fragmentos de ADN genómico en un vector de expresión, tal como un plásmido, transformar bacterias alfa-amilasa negativas con la colección de ADN genómico resultante, y después revestir las bacterias transformadas sobre agar que contiene un substrato para la alfa-amilasa, permitiendo así, clones que expresan la alfa-amilasa a ser identificada. Alternativamente, la secuencia de ADN que codifica a la enzima puede prepararse sintéticamente mediante los métodos estándares establecidos, por ejemplo, el método de fosforoamidita descrito por S.L. Beaucage y M. H. Caruthers, Tetrahedron Letters 22, 1981, pp. 1859-1869 o el método descrito por Matthes et al., The EMBO J . 3, 1984, pp. 801-805. En el método de fosforoamidita, se sintetizan los oligonucleótidos , por ejemplo, en un sintetizador de ADN automático, purificado, templado, ligado y clonado en vectores apropiados . Finalmente, la secuencia de ADN puede ser de origen sintético y genómico, sintético mixto y de origen de ADNc o genómico mixto y de origen de ADNc, preparados mediante la ligación de fragmentos de origen de ADNc o genómico sintético (como sea apropiado, los fragmentos que corresponden a las varias partes de la secuencia de ADN completa) , de acuerdo con las técnicas estándar. La secuencia de ADN también puede prepararse mediante una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando cebadores específicos, por ejemplo, -como se describe en la US 4,683,202 o R.K. el Saiki et al., Science 239, 1988, pp. 487-491.

Mutagénesis dirigida en el sitio Una vez que la secuencia de ADN que codifica al alfa-amilasa se ha aislado, y los sitios deseables para mutación se han identificado, las mutaciones pueden introducirse usando los oligonucleótidos sintéticos. Estos oligonucleótidos contienen secuencias del nucleótido que flanquean los sitios de la mutación deseados; se insertan los nucleótidos mutantes durante la síntesis del oligonucleotido. En un método específico, un espacio de una sola hebra de ADN, que forma un puente con la secuencia que codifica al alfa-amilasa, se crea en un vector que lleva el gen alfa-amilasa . Entonces, el nucleótido sintético, que lleva la mutación deseada, se combina en pares básicos a una porción homologa del ADN de una sola hebra. El espacio restante se llena entonces con el ADN de la polimerasa I (fragmento Klenow) y los constructos que se ligan usando la ligasa T . Un ejemplo específico de este método se describe en Morinaga et al. (1984). La US 4,760,025 describe la introducción de oligonucleótidos que codifica las mutaciones múltiples realizando alteraciones menores del cásete. Sin embargo, una variedad aun mayor de mutaciones puede introducirse en cualquier un momento mediante el método de Morinaga, debido a que puede introducirse una multitud de oligonucleótidos de varias longitudes. Otro método para introducir las mutaciones en las secuencias de ADN que codifican a las alfa-amilasas se describe en Nelson y Long (1989) . Esto involucra la generación de la tercera etapa de un fragmento PCR que contiene la mutación deseada introducida usando una hebra de ADN sintetizada químicamente como una de los cebadores en las reacciones PCR. A partir del fragmento generado por PCR, un fragmento de ADN que lleva la mutación puede aislarse mediante un división con endonucleasa de restricción y reinsertadas en un plásmido de la expresión. Métodos alternativos para proporcionar variantes de la invención incluyen el mezclado de genes, por ejemplo, como se describe en la WO 95/22625 (de Affymax Technologies N.V.) o en la WO 96/00343 (de Novo Nordisk A/S) , u otras técnicas correspondientes a las que resultan de una enzima híbrida que comprende las mutación (es) , por ejemplo, substitución (es) y/ó supresión (es) , en cuestión.

Mutagénesis aleatoria La mutagénesis aleatoria se realiza adecuadamente ya sea como mutagénesis aleatoria de región-específica o localizada en por lo menos tres partes del gen que traduce a la secuencia del aminoácido que se muestra en cuestión, o dentro del gen completo. La mutagénesis aleatoria de una secuencia de ADN que codifica a un alfa-amilasa precursora puede ser realizada convenientemente mediante el uso de cualquier método conocido en el arte. Respecto a lo anterior, un aspecto adicional de la presente invención se refiere a un método para generar una variante de una alfa-amilasa precursora, por ejemplo, en donde la variante exhibe una capacidad reducida de desdoblar un substrato de oligo-sacáridos cerca del punto de la bifurcación, y exhibir además una especificidad del substrato mejorada y/o actividad específica mejorada en relación al método del progenitor: (a) someter una secuencia de ADN que codifica a la alfa-amilasa precursora a una mutagénesis aleatoria, (b) expresar la secuencia de ADN imitada obtenida en la etapa (a) en una célula hospedera, y (c) separar por exclusión a las células hospederas que expresan una variante de la alfa-amilasa, que tiene una propiedad alterada (es decir, estabilidad térmica) en relación con las alfa-amilasas precursoras. La etapa (a) del método anterior de la invención se realiza preferentemente usando los cebadores estimulados ("doped primers"). Por ejemplo, la mutagénesis aleatoria puede realizarse mediante el uso de un agente de mutagenización físico o químico mediante el uso de un oligonucleótido adecuado, o sometiendo la secuencia de ADN a una mutagénesis generada por PCR. Además, la mutagénesis aleatoria puede realizarse mediante el uso de cualquier combinación de estos agentes de mutagenización. El agente de mutagenización puede por ejemplo, ser uno, que induce las transiciones, transversiones, inversiones, mezclado, supresiones, y/o inserciones. Ejemplos de un agente de mutagenización físico o químico conveniente para el presente propósito incluye la irradiación ultravioleta (UV) , la hidroxilamina, N-metil-N' -nitro-N-nitrosoguanidina (M G) , 0-metil hidroxilamina, ácido nitroso, sulfonato etil metano (SME) , bisulfito de sodio, ácido fórmico, y nucleótidos análogos. Cuando se usan tales agentes, la mutagénesis se realiza típicamente incubando la secuencia de ADN que codifica a la enzima precursora a ser mutagenizada en presencia del agente de mutagenización de elección bajo condiciones convenientes para la mutagénesis que va a tener lugar, y seleccionando el ADN mutado que tiene las propiedades deseadas. Cuando la mutagénesis se realiza mediante el uso de un oligonucleotido, los oligonucleótidos pueden ser activados con los tres nucleótidos no progenitores durante la síntesis del oligonucleotido en las posiciones que serán cambiadas. La estimulación puede hacerse de manera que se eviten codones de aminoácidos no deseados. Los oligonucleótidos estimulados pueden incorporarse en el ADN que codifica a la enzima del alfa-amilasa mediante cualquiera técnica publicada, usando por ejemplo, PCR, LCR o cualquier polimerasa de ADN y ligasa como sea apropiadamente estimado. Preferentemente, el estimulado se lleva a cabo usando "un estimulado aleatorio constante" en el cual el porcentaje del tipo silvestre y mutación en cada posición es el predefinido. Además, la estimulación puede dirigirse hacia una preferencia para la introducción de ciertos nucleótidos, y por consiguiente, una preferencia para la introducción de uno o más residuos del aminoácido específicos. La estimulación puede hacerse por ejemplo, para permitir la introducción de 90% del tipo silvestre y 10% de mutaciones en cada posición. Una consideración adicional en la elección de un esquema de estimulación se basa en la genética, así como en las restricciones de la estructura de la proteína. El esquema de estimulación puede hacerse usando el programa DOPE, que, entre otros, asegura la introducción de codones de detención. Cuando se usa la mutagénesis generada por PCR, ya sea un gen tratado químicamente o no tratado químicamente que codifica a una alfa-amilasa precursora se somete a PCR bajo condiciones que incrementan la incorporación mis de nucleótidos (Deshler 1992; Leung et al., Technique Vol.l, 1989, pp. 11-15). Una cepa del mutante de la E.coli (Fowler et al., Molec. Gen. Genet, 133, 1974, pp. 179-191), S. cereviseae o cualquier otro organismo microbiano pueden usarse para la mutagénesis aleatoria del ADN que codifica a la alfa-amilasa mediante por ejemplo, transformando un plásmido que contiene la glicosilasa precursora en la cepa mutante, haciendo crecer la cepa mutante con el plásmido y aislando el plásmido mutado de la cepa mutante. Los plásmidos mutados pueden transformarse como consecuencia en el organismo de expresión. La secuencia de ADN a ser mutagenizada puede estar convenientemente presente en una colección de ADNc o genómica preparadas a partir de un organismo que expresa el alfa-amilasa precursora. Alternativamente, la secuencia de ADN puede estar presente en un vector conveniente tal como un plásmido o un bacteriófago, que como tal puede incubarse con o por otra parte puede exponerse al agente mutagenizante . El ADN a ser mutagenizado también puede estar presente ya sea en una célula hospedera que se integra en el genoma de dicha célula o estar presente en un vector hospedado en la célula. Finalmente, el ADN a ser mutagenizado puede estar en forma aislada. Se entenderá que la secuencia de ADN a ser sometida a una mutagénesis aleatoria es preferentemente un ADNc o una secuencia de ADN genómica. En algunos casos, puede ser adecuado amplificar la secuencia de ADN mutada previo a la realización de la etapa de expresión b) o la etapa de separación por exclusión c) . Tal amplificación puede realizarse de acuerdo con métodos conocidos en el arte, el método actualmente preferido es la amplificación generada por PCR usando los cebadores del oligonucleótido preparados con base al ADN o secuencia de aminoácidos de la enzima precursora. Subsecuente a la incubación con o exposición al agente mutagenizante, el ADN mutado se expresa cultivando una célula hospedera conveniente que lleva la secuencia de ADN bajo condiciones que permiten que ocurra la expresión. La célula hospedera usada para este propósito puede ser una que se ha transformado con la secuencia de ADN mutada, opcionalmente presente en un vector, o una que se llevó la secuencia de ADN, que codifica a la enzima precursora durante el tratamiento de mutagénesis. Ejemplos de células hospederas convenientes son los siguientes: las bacterias gram positivas tales como el Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliguefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus circulans, Bacillus lautus, Bacillus jnegaterium, Bacillus thuringiensis, Streptomyces lividans o Streptomyces murinus; y bacterias gram-negativas como la E. coli. La secuencia de ADN mutada puede comprender además, una secuencia de ADN que codifica funciones que permiten la expresión de la secuencia de ADN mutada.

Mutagénesis aleatoria localizada La mutagénesis aleatoria pueden localizarse ventajosamente en una parte del alfa-amilasa precursora en cuestión. Esto puede por ejemplo, ser ventajoso cuando se han identificado ciertas regiones de la enzima para ser de importancia particular para una propiedad dada de la enzima, y cuando están modificadas se espera que resulte en un variante que tiene propiedades mejoradas. Normalmente tales regiones pueden identificarse cuando la estructura terciaria de la enzima precursora se ha elucidado y se ha relacionado a la función de la enzima. La mutagénesis aleatoria -de región-específica localizada, se realiza convenientemente mediante el uso de técnicas de mutagénesis generadas por PCR como se describe anteriormente o cualquier otra técnica conveniente conocida en el arte. Alternativamente, la secuencia de ADN que codifica la parte de la secuencia de ADN a ser modificada puede aislarse, mediante por ejemplo, la inserción en un vector adecuado, y dicha parte puede someterse posteriormente a una mutagénesis mediante el uso de cualquiera de los métodos de mutagénesis discutidos anteriormente.

Métodos alternativos para proporcionar variantes de la alfa-amilasa Los métodos alternativos para proporcionar variantes de la invención incluye el método conocido en el arte como mezclado de genes, también se incluyen los métodos descritos por ejemplo en la WO 95/22625 (de Affymax Technologies N.V. ) y la WO 96/00343 (de Novo Nordisk A/S) .

Expresión de variantes alfa-amilasa De acuerdo con la invención, una secuencia de ADN que codifica la variante producida por los métodos descritos arriba, o mediante cualquier método alternativo conocido en el arte, puede expresarse, en la forma de una enzima, usando un vector de la expresión que incluye típicamente secuencias de control que codifican a un promotor, operador, sitio que enlaza al ribosoma, señal de iniciación de la traducción, y, opcionalmente, un gen represor o varios genes activadores. El vector de expresión recombinante que lleva la secuencia de ADN, que codifica a una variante de la alfa-amilasa de la invención puede ser cualquier vector que pueda somete serse convenientemente a los procedimientos de ADN recombinantes , y la opción de vector dependerá a menudo de la célula hospedera en la que será introducido. Así, el vector puede ser un vector de replicación autónoma, es decir, un vector que existe como una entidad extracromosomal , la replicación es independiente de la replicación cromosomática, por ejemplo, un plásmido, un bacteriófago o un elemento extracromosomal, minicromosoma o un cromosoma artificial. Alternativamente, el vector puede ser uno que, cuando se introduce en una célula hospedera, se integra en el genoma de la célula hospedera y se replica junto con los cromosoma (s) en los que se ha integrado. En el vector, la secuencia de ADN debe acoplarse operablemente a una secuencia promotora conveniente. El promotor puede ser cualquier secuencia de ADN, que muestra actividad transcripcional en la célula hospedera de elec-ción y puede derivarse de genes que codifican a las proteínas ya sea homólogos o heterólogos a la célula hospedera. Ejemplos de promotores adecuados para dirigir la trascripción de la secuencia de ADN que codifica a una variante de la alfa-amilasa de la invención, especialmente en una hospedera bacteriana, son el promotor del operon lac de la E.coli, los promotores dagA del gen de la agarasa Streptomyces coelicolor, los promotores del gen de la alfa-amilasa (amyh) Bacillus licheniformis, los promotores del gen amilasa maltogenic (amyM) Bacillus stearothermophilus, los promotores de la alfa-amilasa (amyQ) del Bacillus amyloliquefaciens, los promotores de los genes xylB y xylA del Bacillus subtilis, etc. Para la transcripción en un hospedero fúngico, ejemplos de promotores útiles son aquellos derivados del gen que codifica a la amilasa TAKA A. oryzae, proteinasa aspártica Rhizomucor miehei, alfa-amilasa neutral A. niger, alfa-amilasa estable a los ácidos A. niger, glucoamilasa A. niger, lipasa Rhizomucor miehei, proteasa alcalina A. oryzae, isomerasa de la triosa fosfato A. oryzae o la acetamidasa de A. nidulans. El vector de la expresión de la invención también puede comprender un terminador de transcripción adecuado y, -en las eucariotas, las secuencias de poliadenilación se conectan operablemente a la secuencia de ADN que codifica a la variante del alfa-amilasa de la invención. La terminación y las secuencias de poliadenilación pueden derivarse apropiadamente a partir de las mismas fuentes como el promotor . El vector puede comprender una secuencia de ADN que permite al vector replicarse en la célula hospedera en cuestión. Ejemplos de tales secuencias son los orígenes de replicación de los plásmidos pUC19, pACYC177, pUBllO, pE194, pAMBl y plJ702. El vector también puede comprender un marcador seleccionable, por ejemplo, un gen, el producto que complementa un defecto en la célula hospedera, tal como los genes dal de la B. subtilis o B. licheniformis, o uno que confiere resistencia antibiótica tal como ampicilina, kanamicina, cloranfenicol o resistencia a la tetraciclina . Además, el vector puede comprender los marcadores de selección Aspergillus tal como un marcador amdS, argB, niaD y SC, un marcador que da lugar a la resistencia de la higromicina, o la selección puede lograrse mediante la co-transformación, por ejemplo, como se describe en la WO 91/17243. Mientras que la expresión intracelular puede ser ventajosa en algunos respectos, por ejemplo, cuando se usan ciertas bacterias como las células hospederas, generalmente se prefiere que la expresión sea extracelular . En general, las a-amilasas Bacillus mencionadas en la presente comprenden una región previa que permite la secreción de la proteasa expresada en el medio de cultivo. Si es deseable, esta región previa puede reemplazarse por una región previa diferente o secuencia del signo, realizada convenientemente por la substitución de las secuencias de ADN que codifican a las regiones previas respectivas. Los procedimientos usados para ligar el constructo de ADN de la invención, que codifica a una variante de la alfa-amilasa, el promotor, terminador y otros elementos, respectivamente, para insertarlos en vectores convenientes que contienen la información necesaria para la replicación, se conocen bien por personas experimentadas en el arte (cf.,por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2 Ed. , Cold Spring Harbor, 1989). La célula de la invención, cualquiera que -comprende un constructo de ADN o un vector de expresión de la invención como se define anteriormente, se usa ventajosamente como una célula hospedera en la producción recombinante de una variante del alfa-amilasa de la invención. La célula puede transformarse con el constructo del ADN de la invención que codifica a la variante, integrando convenientemente la estructura de ADN (en uno o más copias) en el cromosoma de la hospedera. Generalmente, esta integración se considera ser una ventaja debido a que es más probablemente que la secuencia del ADN se mantenga estable -en la célula. La integración de los constructos del ADN en el cromosoma hospedero puede realizarse de acuerdo a los métodos convencionales, por ejemplo, mediante recombinación homóloga o heteróloga. Alternativamente, la célula puede transformarse con un vector de la expresión como se describe anteriormente en relación con tipos diferentes de células hospederas. La célula de la invención puede ser una célula de un organismo superior tal como un mamífero o un insecto, pero es preferentemente una célula microbiana, por ejemplo, una célula bacteriana o una fúngica (incluida la levadura) . Ejemplos de bacterias adecuadas son las bacterias Gram-positivas tales como la Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus br-evis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus circulans, Bacillus lautus, Bacillus megaterium, Bacillus thuringi-ensis, Streptomyces lividans o Streptomyces murinus, o bacterias gram-negativas tales como la E.coli. La transformación de las bacterias puede, por ejemplo, ser efectuada mediante la transformación del protoplasto o usando células competentes de una manera conocida per se. El organismo de levadura puede seleccionarse favorablemente de una especie de Saccharomyces o Schizosaccharo yces, por ejemplo Saccharomyces cerevisia . El hongo filamentoso puede pertenecer venta osamente a una especie de Aspergillus, por ejemplo, Aspergillus Oryzae o Aspergillus niger. Las células fúngicas pueden ser transformadas mediante un proceso que involucra la formación del protoplasto y la transformación de los protoplastos seguido por la regeneración de la pared celular de una manera conocida por se. Un procedimiento conveniente para la transformación de las células hospederas Aspergillus se describe en la EP 238 023. En un aspecto adicional todavía, la presente invención se refiere a un método para producir una variante del alfa-amilasa de la invención, cuyo método comprende cultivar una célula hospedera como se describe anteriormente bajo condiciones conducentes a la producción de la variante y recuperando la variante de las células y/o el medio de cultivo . El medio usado para cultivar las células puede ser cualquier medio convencional conveniente para hacer crecer la célula hospedera en cuestión y obtener la expresión de la variante del alfa-amilasa de la invención. Los medios adecuados se encuentran disponibles a partir de los proveedores comerciales o pueden prepararse de acuerdo a las recetas publicadas (por ejemplo, como se describe en los catálogos de la Colección del Tipo de Cultivo Americana) . La variante del alfa-amilasa secretada de las células hospederas puede recuperarse convenientemente del medio de cultivo mediante procedimientos bien conocidos, que incluyen separar las células del medio mediante centrifugación o filtración, y precipitando los componentes de la proteína del medio a través de una sal tal como el sulfato de amonio, seguido por el uso de procedimientos cromatográficos tal como la cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad, o similares.

APLICACIONES INDUSTRIALES Las variantes del alfa-amilasa de esta invención poseen valiosas propiedades que permiten una variedad de aplicaciones industriales. En particular, las variantes de la enzima de la invención son aplicables como un componente en el lavado, lavar trastes y composiciones de detergentes que limpian superficies difíciles. La variante de la invención con propiedades alteradas puede usarse para procesos relacionados con el almidón, en particular, la conversión de almidón, especialmente la licuefacción del almidón (ver por ejemplo, la US 3,912,590, solicitud de patente EP Nos. 252 730 y 63 909, la WO 99/19467, y la WO 96/28567 todas las referencias son incorporadas en la presente incorporadas mediante la referencia) . También se contemplan composiciones para los propósitos de conversión de almidón, que además la variante de la invención podría comprender una glucoamilasa, pululanasa y otras alfa-amilasas . Además, las variantes de la invención también son particularmente útiles en la producción de dulcificante y etanol (ver por ejemplo, la patente US No. 5,231,017 en la presente incorporada mediante la referencia) , tal como combustible, etanol industrial y consumible, de almidón o granos enteros. Las variantes de la invención también pueden ser útiles para el desencolado de textiles, tejidos y vestidos (ver por ejemplo, la WO 95/21247, la patente US 4,643,736 americana, EP 119,920 en la presente incorporados mediante la referencia) , para elaborar o preparar cerveza, en la pulpa y producción de papel, y en la producción de alimentos y comida .

Conversión del almidón Los procesos de conversión de almidón convencional, tal como los procesos de licuefacción y sacarificación que se describen por ejemplo, en la Patente US No. 3,912,590 y las publicaciones EP Nos. 252,730 y 63,909, en la presente incorporadas mediante la referencia. En una modalidad, el almidón que se degrada en el proceso de conversión del almidón para los componentes de carbohidratos de peso molecular bajo, tal como los azúcares o suplentes de grasa incluye una etapa de des-ramificación.

Conversión del almidón en azúcar En el caso de la conversión del almidón en un azúcar, el almidón se despolimeriza . Tal proceso de despolimerización consiste de una etapa de pre-tratamiento y dos o tres etapas del proceso consecutivos, viz. Un proceso de licuefacción, un proceso de sacarificación y dependiente del producto final deseado, y opcionalmente, un proceso de isomerización . Pre-tratamiento de almidón nativo El almidón nativo consiste de gránulos microscópicos que son insolubles en el agua a la temperatura ambiente. Cuando se calienta una lechada de almidón acuoso, los gránulos se inflan y eventualmente estallan, dispersando las moléculas del almidón en la solución. Durante este proceso de "gelatinización" se presenta un aumento dramático -en la viscosidad. Cuando el nivel de los sólidos es de 30-40% en un proceso típicamente industrial, el almidón tiene que ser adelgazado o "licuado" para que pueda manejarse. Esta reducción en viscosidad se obtiene hoy principalmente mediante la degradación enzimática. Li-cuefacción Durante la etapa de licuefacción, el almidón de cadena larga se degrada en unidades más cortas lineales y ramificadas (maltodextrinas) por un alfa-amilasa . El proceso de licuefacción se lleva a cabo a 105-110°C durante 5 a 10 minutos seguidos por 1-2 horas a 95°C. El pH queda entre 5.5 y 6.2. Para asegurar una estabilidad de la enzima óptima bajo estas condiciones, se agrega 1 mm de calcio (40 ppm libre de iones calcio) . Después de este tratamiento, el almidón licuado tendrá una "glucosa equivalente" (DE) de 10-15. Sacarificación Después del proceso de licuefacción, las maltodextrinas son convertidas en dextrosa mediante la adición de una glucoamilasa (por ejemplo, AMG) y una enzima de desramificación, tal como una isoamilasa (patente US No. 4,335,208) o una pululanasa (por ejemplo, Promozyme™) (patente US No. 4,560,651). Antes de esta etapa, el pH se reduce a un valor por debajo de 4.5, mientras se mantiene la temperatura alta (arriba de 95°C) para volver inactiva a la alfa-amilasa licuada, para reducir la formación de oligosacáridos cortos llamados "precursores de la panosa" que no pueden ser hidrolizados propiamente por la enzima de desramificación. La temperatura se reduce a 60°C, y se agrega una glucoamilasa y una enzima de desramificación. El proceso de sacarificación procede durante 24-72 horas. Normalmente, cuando se desnaturaliza la a-amilasa después de la etapa de licuefacción, aproximadamente a 0.2-0.5%, el producto de sacarificación es el trisacárido 62-alfa-glucosilo de la maltosa (panosa) ramificada qué no puede ser degradado por una pululanasa. Si la amilasa activa de la etapa de licuefacción está presente durante la sacarificación (es decir, no desnaturalizada) , este nivel puede ser tan alto como 1-2% como lo es significativamente la producción reducida de sacarificación. Isomerización Cuando el producto del azúcar final deseado es, por ejemplo, jarabe alto en fructosa, el jarabe de dextrosa puede convertirse en la fructosa . Después del proceso de sacarificación, el pH se incrementa a un valor en el rango de 6-8, preferentemente pH 7.5, y el calcio se remueve mediante intercambio de ion. El jarabe de dextrosa se convierte entonces en el jarabe alto en fructosa, por ejemplo, una glucosoisomerasa inmovilizada (tal como S eetzyme™ IT) . Producción de etanol En general, la producción del alcohol ietanol) del grano entero puede separarse en 4 etapas principales - Molienda - Licuefacción - Sacarificación - Fermentación Molienda El grano se muele para abrir la estructura y permitir un proceso adicional. Se usan dos procesos de molienda mojada o seca. En la molienda seca el grano entero se muele y se usa en la parte restante del proceso. La molienda mojada proporciona una separación muy buena de germen y la harina (los - gránulos del almidón y la proteína) y está con unas excepciones aplicadas a situaciones dónde existe una producción paralela de jarabes. Licuefacción En el proceso de licuefacción los gránulos de almidón se solubilizan mediante la hidrólisis a las maltodextrinas en la mayoría de los casos de un DP mayor a 4. La hidrólisis puede llevarse a cabo por el tratamiento ácido o enzimáticamente por el alfa-amilasa . La hidrólisis ácida se usa en una base limitada. La materia prima puede ser el grano entero molido o un flujo lateral del proceso de almidón. La licuefacción enzimática se lleva a cabo típicamente como un proceso de lechada caliente de tres etapas. La lechada se calienta entre 60-95°C, preferentemente 80-85°C, y la enzima (s) se (son) agregadas. Entonces, la lechada se cocina a reacción entre 95-14 a0C, preferentemente 105-125°C, se enfría a 60-95°C y más enzima (s) se (son) agregadas para obtener la hidrólisis final. El proceso de licuefacción se lleva a cabo a un pH de 4.5-6.5, típicamente a un pH entre 5 y 6. El molido y licuado del grano también se conoce como la masa . Sacarificación Para producir los azúcares moleculares bajos DP1-3 que pueden metabolizarse por la levadura, la maltodextrina de la licuefacción debe ser hidrolizada adicionalmente . La hidrólisis se hace típicamente enzimáticamente por las glucoamilasas , alternativamente alfa-glucosidasas o pueden usarse las alfa-amilasas ácidas. Una etapa de sacarificación completa puede durar hasta 72 horas, sin embargo, sólo es común hacer una pre-sacarificación de típicamente 40-90 minutos y entonces completar la sacarificación durante la fermentación (SSF) . La sacarificación se lleva a cabo típicamente a temperaturas de 30-65°C, típicamente alrededor de 60°C, y a un pH de 4.5. Fermentación La fermentación típicamente de Saccharomyces spp. se agrega a la masa y la fermentación se continua durante 24-96 horas, tal como típicamente 35-60 horas. La temperatura se encuentra entre 26-34°C, típicamente alrededor de aproximadamente 32°C, y el pH es de un pH de 3-6, preferentemente alrededor de un pH de 4-5. Observar que el proceso ampliamente usado es un proceso de sacarificación y fermentación simultáneo (SSF) dónde no hay ninguna etapa de mantenimiento para la sacarificación, en la que la levadura y la enzima se añaden al mismo tiempo. €0 Cuando se realiza el SSF es común introducir una etapa de pre-sacarificación a una temperatura por arriba de 50°C, justo antes de la fermentación. Destilación Siguiendo la fermentación, la masa se destila para extraer el etanol . El etanol obtenido de acuerdo al proceso de la invención puede usarse como, por ejemplo, etanol como combustible, etanol para beber, es decir, los espíritus neutros potables; o etanol industrial. Sub-productos El residuo de la fermentación es el grano que se usa típicamente o para alimento de animales ya sea en forma líquida o seca. Detalles adicionales de como se lleva a cabo la licuefacción, sacarificación, fermentación, destilación, y recuperación del etanol, son bien -conocidos por una persona experta en el arte. De acuerdo al proceso de la invención, la sacarificación y fermentación pueden llevarse a cabo simultáneamente o individualmente . Pulpa y Producción de papel La alfa-amilasa alcalina de la invención también puede usarse en la producción de materiales lignocelulósicos, tal como la pulpa, papel y cartón, del papel desechado reforzado con almidón y cartón, especialmente donde ocurre una re-pulpado a un pH arriba de 7 y en donde las amilasas facilitan la desintegración del material desechado a través de la degradación del almidón reforzado. La alfa-amilasa de la invención es especialmente útil en un proceso para producir una pulpa en la elaboración del papel a partir del papel de impresión revestido con almidón. El proceso puede realizarse como se describe en la WO 95/14807, que comprende las siguientes etapas: a) desintegrar el papel para producir una pulpa, b) tratar una enzima que se deparad con el almidón, antes, durante o después de la etapa a) , y c) separar las partículas de tinta de la pulpa después de las etapas a) y b) . Las alfa-amilasas de la invención también pueden ser muy útiles al modificar el almidón, en dónde se usa el almidón enzimáticamente modificado para elaborar papel junto con los rellenos alcalinos tales como el carbonato cálcico, caolín y las arcillas. Con las alfa-amilasas alcalinas de la invención se hace posible modificar el almidón en presencia del relleno, permitiendo así, un proceso integrado más simple. Desencolado de Textiles, Tejidos y Vestidos Una alfa-amilasa de la invención también puede ser muy útil en el desencolado de textiles, tejidos o vestidos. En la industria del procesamiento textil, se usan tradicionalmente las alfa-amilasas como auxiliares en el proceso de desencolado para facilitar la remoción de apresto que contiene almidón, que ha servido como un revestimiento protector en los hilos de la trama durante el tejido. La remoción completa del revestimiento de apresto después del tejido es importante para asegurar resultados óptimos en procesos subsecuentes, en los que el tejido se friega, blanquea y tiñe. La descomposición del almidón enzimática se prefiere debido a que no involucra cualquier efecto dañino en el material de la fibra. Para reducir los costos del proceso e incrementar la producción, el proceso de desencolado se combina a veces con las etapas de fregado y etapas de blanqueado. En algunos -casos, se usan auxiliares no enzimáticos tales como los agentes de oxidación o alcalinos que se usan típicamente para descomponer el almidón, debido a que las alfa-amilasas tradicionales no son muy compatibles con los niveles de pH altos y los agentes de blanqueado. La descomposición no enzimática del apr-esto del almidón lleva a algún daño de la fibra debido a que se usan químicos bastante agresivos. Por consiguiente, sería deseable usar las alfa-amilasas de la invención cuando posean un desempeño mejorado en las soluciones alcalinas. Las alfa-amilasas pueden usarse exclusivamente o en combinación con una celulasa para desencolar textiles o telas que -contengan celulosa. Los procesos de desencolado y blanqueado son bien conocidos en el arte. Por ejemplo, tales procesos se describen en la WO 95/21247, la patente US 4,643,736, la EP 119,920 incorporadas en la presente mediante la referencia. Los productos disponibles comercialmente para el desencolado incluyen AQUAZYME® y AQUAZYME® ULTRA de Novozymes A/S. Elaboración de la Cerveza Las alfa-amilasas de la invención también puede ser muy útiles en el proceso de la fabricación de cerveza; las alfa-amilasas se agregarán típicamente durante el proceso de amasado . Composiciones del detergente La alfa-amilasa de la invención puede agregarse a y por lo tanto, llegar a ser un componente de una composición del detergente. La composición del detergente de la invención puede formularse por ejemplo, como una composición de detergente para una maquina de lavandería o manualmente que incluye una composición de aditivos para lavandería adecuados para el pre-tratamiento de te idos manchados y un enjuague añadido a la composición suavizadora del tejido, o ser formulada como una composición de detergente para el uso casero en operaciones de limpieza de superficies difíciles, o ser formulada para operaciones de lavado en lavar trastes o manual-es.

En un aspecto específico, la invención proporciona un aditivo para detergente que comprende la enzima de la invención. El aditivo del detergente así como la composición del detergente pueden comprender una o más de otras enzimas tales como una proteasa, una lipasa, una peroxidasa, otra enzima amiolítica, por ejemplo, otra alfa-amilasa, glucoamilasa, amilasa maltogénica, CGTasa y/o una celulasa, mananasa (tal como MANNAWAY™ de Novozymes, Dinamarca), pectinasa, liasa de pectina, cutinasa, y/o lacasa. En general, las propiedades de las enzimas seleccionadas deben ser compatibles con el detergente seleccionado, (es decir, pH-óptimo, compatibilidad con otros ingredientes enzimáticos y no enzimáticos, etc.), y las enzima (s) deben estar presente en cantidades eficaces. Proteasas: las proteasas adecuadas incluyen aquellas de origen animal, vegetal u origen microbiano. Se prefiere el origen microbiano. Se incluyen los imitantes de proteínas diseñados genéticamente o químicamente modificados. La proteasa pueden ser un proteasa de serina o una proteasa de metallo, preferentemente una proteasa microbiana alcalina o una proteasa tipo tripsina. Ejemplos de proteasas al-calinas son las subtilisinas , especialmente aquellas derivadas del Bacillus, por ejemplo, subtilisin Novo, subtilisin Carlsberg, subtilisin 309, subtilisin 147 y subtilisin 168 (descritas en la WO 89/06279) . Ejemplos de proteasas tipo tripsina son la tripsina (por ejemplo, de origen porcino o de origen bovino) y la proteasa Fusarium descrita en la WO 89/06270 y la WO 94/25583. Ejemplos de proteasas útiles son las variantes descritas en la WO 92/19729, WO 98/20115, WO 98/20116, y WO 98/34946, especialmente las variantes con substituciones en una o más de las siguientes posiciones: 27, 36, 57, 76, 87, 97, 101, 104, 120, 123, 167, 170, 194, 206, 218, 222, 224, 235 y 274. Las enzimas de proteasa preferidas disponibles comercialmente incluyen ALCALASE®, SAVINASE®, PRIMASE®, DURALASE®, ESPERASE®, y KA NASE® (de Novozymes AJS) , MAXATASE®, MAXACAL, MAXAPEM®, PROPERASE®, PURAFECT®, PURAFECT OXP®, FN2®, FN3®, FN4® (Genencor Internacional Inc.). Lipasas : las lipasas adecuadas incluyen aquellas de origen bacteriano o fúngico. Se incluyen los mutantes de proteínas diseñados genéticamente o químicamente modificados. Ejemplos de lipasas útiles incluyen las lipasas de Humicola (sinónimo Thermomyces) , por ejemplo, de H. lanuginosa (T. lanuginosus) como se describe en la EP 258 068 y la EP 305 216 o de H. insolens como se describe en la WO 96/13580, una lipasa Pseudomonas, por ej-emplo, P. alcaligenes o P. pseudoalcaligenes (EP 218 272), P. cepacia (EP 331 376), P. stutzeri (GIGABIT 1,372,034), P. fluorescens, sp Pseudomonas. la cepa SD 705 (WO 95/06720 y WO 96/27002), P. wisconsinensis (WO 96/12012) , un lipasa del Bacillus, por ejemplo, por ejemplo, de B. subtilis (Dartois et al. (1993), Biochemica et Biophysica Acta, 1131, 253-360), B. stearothermophilus <JP 64/744992) o B. pumilus (WO 91/16422). Otros ejemplos son las variantes de lipasa como aquellos descritos en la WO 92/05249, WO 94/01541, EP 407 225, EP 260 105, WO 95/35381, WO 96/00292, WO 95/30744, WO 94/25578, WO 95/14783, WO 95/22615, WO 97/04079 y la WO 97/07202. Las enzimas de lipasa disponibles comercialmente preferidas incluyen LIPOLASE™ y LIPOLASE ULTRA™ (Novozymes AIS) . Amilasas: las amilasas adecuadas (alfa y/o beta) incluyen aquellas de origen bacteriano o fúngico. Se incluyen los mutantes de proteínas diseñados genéticamente o químicamente modificados. Las amilasas incluyen por ejemplo, alfa-amilasas obtenidas del Bacillus, por ejemplo, una cepa especial de B. licheniformis, descrita con mayor detalle en GB 1,296,839. Ejemplos de alfa-amilasas útiles son las variantes descritas en la WO 94/02597, WO 94/18314, WO 96/23873, y WO 97/43424, especialmente las variantes con substituciones en una o más de las siguientes posiciones: 15, 23, 105, 106, 124, 128, 133, 154, 156, 181, 188, 190, 197, 202, 208, 209, 243, 264, 304, 305, 391, 408, y 444. Las alfa-amilasas disponibles comercialmente son DURAMYL™, LIQUEZY E™ TERMAMILO™, NATALASE™, SUPRAMYL™, STAINZYME™, FU GAMYL™ y BAN™ (Novozymes A/S) , RAPIDASE™, PURASTAR™ y PURASTAR OXAM™ (de Genencor Internacional Inc.).

Celulasas: las celulasas adecuadas incluyen aquellas de origen bacteriano o fúngico. Se incluyen los mutantes de proteínas diseñados genéticamente o químicamente modificados. Las celulasas adecuadas incluyen las celulasas del genero Bacillus, Pseudomonas, Humicola, Fusariu , Thielavia, Acmmonium, por ejemplo, las celulasas fúngicas producidas a partir de Humicola insolens, Myceliophthora thermophila y Fusarium oxysporum descritas en la US 4,435,307, US 5,648,263, US 5,691,178, US 5,776,757 y la WO 89/09259. Las celulasas especialmente adecuadas son las celulasas alcalinas o neutras que tienen beneficios para el cuidado del color. Ejemplos de tales celulasas son las celulasas descritas en la EP 0 495 257, EP 0 531 372, WO 96/11262, WO 96/29397, WO 98/08940. Otros ejemplos son las variantes de celulasa como aquellas descritas en la WO 94/07998, EP 0 531 315, US. 5,457,046, US 5,686,593, US 5,763,254, WO 95/24471, WO 98/12307 y la PCT/DK98/00299. Las celulasas disponibl-es comercialmente incluyen CELLUZYME®, y CAREZYME® (Novozymes A/S) , CLAZINASE®, y PURADAX HA® (Genencor Internacional Inc.), y KAC-500(B) @ (Kao Corporación) . Peroxidasas/Oxidasas : las peroxidasas/oxidasas adecuadas incluyen aquellas de origen de plantas, bacterianas o de origen fúngico. Se incluyen los mutantes de proteínas diseñados genéticamente o químicamente modificados. Ejemplos de peroxidasas útiles incluyen las peroxidasas de Coprinus, por ejemplo, de C cinereus, y variantes de las mismas como aquellas descritas en la WO 93/24618, WO 95/10602, y WO 98/15257. Las peroxidasas disponibles comercialmente incluyen GUARDZYME® (Novozymes A/S) . Las enzima (s) del detergente pueden ser incluidas en una composición del detergente agregando aditivos separados que contienen una o más enzimas, o agregando un aditivo combinado que comprende todos estas enzimas. Un aditivo del detergente de la invención, es decir, un aditivo separado o un aditivo combinado, puede formularse, por ejemplo, granulado, un líquido, una lechada, etc. Las formulaciones aditivas para el detergente preferidas son los granulados, en particular los granulados que no son en polvo, líquidos, en particular los líquidos estabilizados, o lechadas. Los granulados que no son en polvo pueden producirse por ejemplo, como se describe en la US 4,106,991 y 4,661,452 y pueden ser cubiertos opcionalmente mediante métodos conocidos en el arte. Ejemplos de materiales de revestimiento cerosos son los productos de poli (óxido de etileno) (polietilenglicol , PEG) con pesos molares medios de 1000 a 20000; nonil-fenoles etoxilados que tienen de 16 a 50 unidades de óxido de etileno; alcoholes grasos etoxilados en los que el alcohol contiene de 12 a 20 átomos del carbono y en los que existen desde 15 hasta 80 unidades de óxido de etileno; alcoholes grasos; ácidos grasos; y mono - y di - y triglicéridos de ácidos grasos. Ejemplos de materiales para revestir que forman la película adecuada para la aplicación mediante técnicas de lecho fluidizado se dan en GIGABIT 1483591. Las preparaciones de enzima líquida pueden por ejemplo, ser estabilizadas añadiendo un poliol tal como el propilenglicol , un azúcar o alcohol de azúcar, ácido láctico o ácido bórico de acuerdo a los métodos establecidos. Las enzimas protegidas pueden prepararse de acuerdo al método descrito en la EP 238,216. La composición del detergente de la invención puede estar en cualquier forma conveniente, por ejemplo, una barra, una tableta, un polvo, un gránulo, una pasta o un líquido. Un detergente líquido puede ser acuoso, que contenga típicamente hasta un 70% de agua y 0-30% de solvente orgánico, o no acuoso . La composición del detergente comprende uno o más tensoactivos que pueden ser no iónicos, que incluyen semi-polar y/o aniónico y/o catiónico y/o zwiterionico . Los tensoactivos están típicamente presentes en un nivel que va de 0.1% hasta 60% en peso. Cuando se incluye en la presente, el detergente normalmente contendrá desde aproximadamente 1% hasta aproximadamente 40% de un tensoactivo aniónico como el alquilbencenosulfonato lineal, alfa-olefinsulfonato , sulfato de alquilo (sulfato de alcohol graso), etoxisulfato de alcohol, alcanosulfonato secundario, éster metilo del ácido graso alfa-sulfo, alquilo o ácido alquenilsuccínico o jabón. Cuando se incluya en la presente, el detergente normalmente contendrá desde aproximadamente 0.2% hasta aproximadamente 40% de un tensoactivo no iónico tal como el etoxilato de alcohol, etoxilato nonil-fenol, alquilpoliglicosido , alquildimetilamina-óxido , monoetanolamida de ácido graso etoxilado, monoetanolamida de ácido graso, polihidroxi alquil amida de ácido graso, o derivados de N-acilo N-alquilo de glucosamina ( "glucamidas" ) . El detergente puede contener 0-65% de un productor de detergente o agente formador de complejos tal como la zeolita, difosfato, tripo-sfato, fosfonato, carbonato, citrato, ácido nitrilotriacético, ácido etilendiaminatetraacético, ácido dietilenetri-aminepen-taacético, ácido alquil-o alquenilsuccínico, silicatos solubles o silicatos en estratos (por ej-emplo, SKS-6 de Hoechst) . El detergente puede comprender uno o más polímeros. Ejemplos son carboximetilcelulosa, poli (vinil-pirolidona) , poli (glicol etilénico) , poli (vinil alcohol), poli (vinilpiridina-N-óxido) , poli (vinilimidazol) , policarboxilatos tal como los poliacrilatos, copolímeros de ácido maleico/acrílico y co-polímeros de laurel metacrilato/ácido acrílico. El detergente puede contener un sistema de blanqueado, que puede comprender una fuente de H2O2 tal como perborato o percarbonato que pueden combinarse con un activador de blanqueado que forma un perácido tal como una tetraacetiletilendiamina o nonanoiloxiben-zenesul-fonato . Alternativamente, el sistema de blanqueado puede comprender los peroxiácidos de por ejemplo, la amida, imida, o tipo sulfona. Las enzimas de la composición del detergente de la invención pueden estabilizarse usando agentes de estabilización convencionales, por ejemplo, un poliol tal como el propilenglicol o glicerol, un azúcar o alcohol de azúcar, ácido láctico, ácido bórico, o un derivado del ácido bórico, por ejemplo, un éster de borato aromático, o un derivado del ácido borónico de fenilo tal como el ácido borónico 4-formilfenilo y la -composición puede formularse como se describe en, por ejemplo, la WO 92/19709 y la WO 92/19708. El detergente también puede contener otros ingredientes del detergente convencionales tales como por ejemplo, los acondicionadores de tejido que incluyen arcillas, propulsores de espuma, supresores de pompas de jabón, agentes anti-corrosión, agentes que suspenden el polvo, agentes de redeposición antipolvo, tintes, bactericidas, blanqueadores ópticos, hidrotropos, inhibidores de empañadura, o perfumes. Se contempla en la actualidad, que en las composiciones del detergente -cualquier enzima, en particular la enzima de la invención, puede agregarse en una cantidad que corresponde a 0.001-100 mg de proteína de enzima por litro de licor de lavado, preferentemente 0.005-5 mg de proteína de la enzima por litro de licor de lavado, más preferentemente 0.01-1 mg de proteína de la enzima por litro de licor de lavado y en particular 0.1-1 mg de proteína de la enzima 'por litro de licor de lavado. La enzima de la invención puede incorporarse adicionalmente en las formulaciones del det-ergente descritas en la WO 97/07202 que está -en la presente incorporada mediante la referencia.

Composiciones de detergentes para lavar trastes. La enzima de la invención también puede usarse en las composiciones de detergente para lavar trastes, que incluyen las siguientes: 1) COMPOSICIÓN DEL POLVO PARA LAVADORA DE TRASTES AUTOMÁTICA.

COMPOSICIÓN DEL POLVO PARA LAVADORA DE TRASTES AUTOMÁTICA . Tensoactivos no iónico (ejemplo etoxilado 1 - 2% de alcohol) Disilicato de Sodio 2 -30% Carbonato de Sodio 10 -50% Fosfonato de Sodio 0 - 5% Citrato trisodico deshidratado 9 -30% Acetato de nitrilotrisódico (NTA) 0 -20% Perborato de sodio monohidratado 5 -10% Tetracetil etilen diamina (TAED) 1 - 2% 3) COMPOSICIÓN DEL POLVO PARA LAVADORA DE TRASTES AUTOMÁTICA ) COMPOSICIÓN DEL POLVO PARA LAVADORA DE TRASTES AUTOMÁTICA.

COMPOSICION DEL POLVO PARA LAVAVAJILLAS AUTOMÁTICA Tensoactivos no iónico 1 -7% Disilicato de Sodio 18 -30% Citrato trisódico 10 -24% Carbonato de sodio 12 -20% Monopersulfato ( 2KHS05.KHS0 .K2S04 ) 15 -21% Estabilizador de blanqueo 0.1 -2% 6) COMPOSICION DEL LÍQUIDO Y POLVO PARA LAVAR TRASTES CON EL SISTEMA DE TENSOACTIVOS LIMPIADORES.

) COMPOSICIÓN NO ACUOSA DE LÍQUIDO PARA LAVAR TRASTES ) COMPOSICIÓN NO ACUOSA DEl LÍQUIDO PARA LAVAR TRASTES Tensoactivo no iónico líquido (por 2.0 -10.0% ejemplo, alcohol etoxilado) Silicato de sodio 3.0 -15.0% Carbonato metálico alcalino 7.0 -20.0% Citrato de sodio 0.0 -15% Sistema estabilizador (por ejemplo, 0.5 -7.0 mezclas de silicón finamente dividido y éteres de poliglicol dialquilo de peso molecular bajo) ) COMPOSICIÓN DE LÍQUIDO TIXOTROPICO PARA LAVADO AUTOMÁTICO LAVAR TRASTES. 11) COMPOSICIÓN LÍQUIDA PARA LAVAR TRASTES AUTOMÁTICA CON CONTENIDO DE PARTÍCULAS BLANQUEADORAS 12) Las composiciones para lavar trastes automáticas como se describen en 1), 2), 3), 4), 6) y 10), en donde el perborato se reemplaza por el percarbonato . 13) Las composiciones para lavar trastes automática como se describen en l)-6) qué contienen adicionalmente un catalizador de manganeso. El catalizador de manganeso puede, por ejemplo ser uno de los compuestos descritos en "Efficient manganese catalysts for low-temperature bleanching" , Nature 369, 1994, pp. 637-639.

MATERIALES Y MÉTODOS Enzimas : SP722: SEQ ID NO: 4, disponible por Novozymes, y descrita en la WO 95/26397. AA560: SEQ ID NO: 12; descrita en la WO 00/60060 y disponible por Novozymes A/S; descrita en la solicitud de patente Danesa No. PA 1999 00490; registrada el 25 de enero de 1999 para el DSMZ y asignada con el DSMZ no. 12649. La AA560 se deposito bajo los términos del Tratado de Budapest en el Reconocimiento Internacional del Deposito de Microorganismos para los Propósitos de los Procedimientos de Patente en Deutshe Sammilung von Microorganismen and Zelikulturen GMBH (DSMZ), Mascheroder Weg Ib, D-38124 Braunschweig DE. AX379: Disponible por Novozymes. Bacillus subtilis SHAS273: ver la WO 95/10603.

Plásmidos El pJEl contiene el gen que codifica una variante de alfa-amilasa SP722 (SEQ ID NO: 4): viz. Supresión de 6 nucleótidos que corresponden a los aminoácidos D183-G184 en la proteína madura. La transcripción del gen JE1 se dirige desde el promotor amyL. Ademas, el plásmido contienen el origen de replicación y el gen cat confiere resistencia hacia el cloranfeniool obtenida desde el plásmido pUBllO (Gryczan, TJ et al. (1978), J. Bact. 134:318-329) El pDN1528 contiene el gen completo que codifica al termamilo amyL, la expresión que se dirige mediante su mismo promotor. Ademas, el plásmido contiene el origen de replicación, ori, del plásmido pUBUO y el gen cat del plásmido pC194 que confiere la resistencia hacia el cloranfenicol . El pDN1528 se muestra en la Fig. 9 de la WO 96/23874.

Métodos Métodos biológicos moleculares generales A menos que se mencione lo contrario, las manipulaciones y transformaciones de ADN fueron desarrolladas usando métodos estándares de biología molecular (Sambrook et al. (1989); Ausubel et al. (1995); Harwood and Cutting (1990).

Construcción del modelo Se hace una búsqueda en la base de datos de la estructura de las proteínas, tales como "The Protein Data Bank (PDB) (< http://www.pdb.bnl.gov />)" o "The Brookhaven databank at Brookhaven Nacional Laboratory, US" de proteínas similares a la molécula en cuestión para la construcción del modelo. Las secuencias de aminoácidos se alinean tomando en consideración las regiones estructuralmente conservadas y las coordenadas se copian desde la proteína de referencia a la proteína objetivo. Las coordenadas para las regiones con ' inserciones y supresiones son asignadas ya sea de otras proteínas que tienen secuencias similares de aminoácidos o usando la función generadora de estructura aleatoria encontrada en la mayoría de los paquetes de software en 3D, por ejemplo, en Homology de Giosym, MSI. Cuando han sido asignadas las coordenadas a todos los aminoácidos de la proteína subjetiva y los fragmentos han sido enlazados al mismo tiempo, ejemplo de los comandos E D REPAIR y SPLICE REPAIR, en el programa Discover de Biosym, MSI, el modelo está por ser perfeccionado. La energía del modelo se minimiza primero, relajando la molécula (comando RELAX en el programa Discover) y después se minimiza por medio de dinámicas moleculares. Las referencias pueden encontrarse en los manuales de programas de construcción homológica, por ejemplo, Homology de Biosym, MSI Método para obtener las regiones de inter-és Existen tres estructuras en 3D conocidas de a-amilasas.

Dos a-amilaseas B. licheniformis, base de datos de Brookhaven 1 BPL (Machius et al. (1995), J. Mol. Biol . 246, pág. , 545- 559) y 1VJS (Song et al (1996), Enzymes for Carbohidrate 163 Engineering (Prog. Biotechnol. V 12). Estas dos estructuras carecen de una pieza importante de la estructura del llamado dominio B, en el área circundante de los dos iones Calcio y un sitio de enlace en el ion sodio. Además, existe una estructura en 3D de una alfa amilasa BA2 (WO 96/23874 que es un híbrido entre BAN™ (SEQ ID NO.5) y la alfa-amilasa B. licheniformis (SEQ ID NO. 4) publicada que contiene el dominio B completo y por lo tanto, iones entre el dominio A y B. Además, una estructura de la parte principal de la alfa amilasa del B. estearotermofilus, ha sido publicada por Sued [? ] y la estructura de la alfa amilasa alcalina SP722 fue presentada en la WO 01/66712. Para construir el mejor modelo de una alfa amilasa dada, se elige la estructura homologa cerrada, ejemplo: un modelo adecuado de la alfa-amilasa B. licheniforme se construye mejor en base a la estructura BA2, así, es un adecuado modelo el de la alfa-amilasa B. amiloliguefaciense, mientras que las alfa-amilasas alcalinas tales como las AA560, SP707, SP7-7 y KS -AP1378, son las de mejor construcción sobre la estructura de la a-amilasa SP722 Construcción homologa de AA560 a partir de la estructura terciaria SP722 La homología global de la alfa-amilasa AA560 (SEQ ID NO: 12) hasta la SP722 (SEQ ID NO: 4) es de aproximadamente 87% como se describió anteriormente. La alineación de la secuencia de AA560 y SP722 muestra dónde no hay inserciones o supresiones, que también se pueden observar en la Figura 1. La estructura terciaria de la alfa-amilasa AA560 fue el modelo construido sobre la estructura expuesta en el apéndice 1 usando el método "Modelbuiling" descrito en la sección "Materials & Methods" . La estructura de SP722 se desplegó en un entorno UNIX que se ejecuta visionariamente por medio del software homologo de BIOSYM, MSI. Las secuencias del aminoácido fueron alineadas y el Sp722 coordinado se asignó a los aminoácidos AA560. Las coordenadas de los primeros cuatro aminoácidos en AA560, que se omitieron en la estructura SP722, fueron asignadas por medio de la función "REPARACIÓN FINAL". El modelo AA560 se refino primero, relajando del cambio lateral de los aminoácidos, usando el comando "RELAX" y ejecutando entonces las dinámicas moleculares para minimizar la energía del modelo en 3D. Los parámetros predefinidos de Insight 95, MSI fueron elegidos para ambas dinámicas de relajación molecular.

Fermentación y purificación de las variantes de la a-a ilasa . La fermentación y purificación pueden ser llevadas a cabo mediante los métodos bien conocidos en el arte.

Fermentación de las a-amilasa y variantes La fermentación puede realizarse mediante métodos bien conocidos en el arte como sigue. Una cepa B. subtilus que alberga el plásmido de expresión relevante se divide en una placa de agar-LB con un antibiótico relevante, y se hace crecer durante toda noche a 37°C. Las colonias son transferidas a un medio de 100 mi de BPX suplementado con un antibiótico relevante (por ejemplo 10 mg/1 de cloroanfenicol ) en 500 mi de un frasco de agitación. Composición del medio BPX: Almidón de papa 100 g/i Harina de cebada 50 g/i BA 5000 SKB 0.1 g/i Caseinato de sodio 10 g/i Harina de frijol de soya 20 g/i Na2HP0, 12 H20 9 g/i Pluronic™ 0.1 g/i El cultivo se agita a 37°C a 270 rpm durante 4 a 5 días.

Las células y los desechos de las células son removidos del caldo de fermentación mediante un centrifugado a 4500 rpm durante 20-25 minutos. Luego, el sobrenadante se filtra para obtener una solución completamente clara. El filtrado se concentra y lava en un filtro UF (10000 cortes fuera de la membrana) y la solución amortiguadora se -cambia por 20mM de Acetato pH 5.5. El filtro-UF se aplica sobre una S-sefarosa F.F. y la elución se lleva a cabo mediante una etapa de elución con 0.2 M NaCI en la misma solución amortiguadora. El eluato se dializa contra 10 mm Tris, pH 9.0 y se aplica en una Q-sefarosa F.F. y se eluye con un gradiente lineal de 0-0.3M NaCI sobre 6 volúmenes de columna. Los fragmentos que contienen la actividad (medidos por un ensayo Phadebas) se agrupan, el pH se ajustó a un pH 7.5 y el color remanente se removió mediante un tratamiento con 0.5% P/vol. de carbón activo en 5 minutos .

Determinación de estabilidad La estabilidad de la amilasa se mide usando el método como sigue: La enzima se incuba bajo condiciones pertinentes. Se toman las muestras a distintos puntos de tiempo, por ejemplo, después de 0, 5, 10, 15 y 30 minutos y se diluye 25 veces (la misma dilución para todas las muestras tomadas) en la solución amortiguadora del ensayo (solución amortiguadora 0.1 M 50m Britton pH 7.3) y la actividad se mide usando el ensayo Phadebas (Pharmacia) bajo condiciones normales pH 7.3, 37°C. La actividad se mide antes de la incubación (0 minutos) se usa como la referencia (100%) . El declive en porcentaje se calcula como una función del tiempo de incubación. La tabla muestra la actividad residual después, de por ejemplo, 30 minutos de incubación.

Medición de la estabilidad dependiente del pH y del calcio Normalmente, el proceso de licuefacción industrial se lleva a cabo usando un pH 6.0-6.2 como pH de licuefacción y una adición de 40 ppm de calcio libre para mejorar la estabilidad a 95°C-105°C. Algunas de las substituciones propuestas en la presente han sido hechas para mejorar la estabilidad a 1. un pH por debajo del pH 6.2 y/o 2. niveles de calcio libres inferiores a 40 ppm de calcio libre. Pueden usarse dos métodos diferentes para medir las alteraciones en la estabilidad obtenidas mediante las distintas substituciones en la alfa-amilasa en cuestión: Método 1. Un ensayo que mide la estabilidad a un pH reducido, pH 5.0, en presencia de 5 ppm de calcio libre. 10 microgramos de la variante se incuban bajo las siguientes condiciones: Una solución de acetato 0.1 M, pH ajustado a un pH 5.0, que contiene 5 ppm de calcio y 5% p/p el almidón de maíz común (libre de calcio) . La incubación se 9? realiza en un baño de agua a 95°C durante 30 minutos. Método 2. Un ensayo que mide la estabilidad en ausencia de calcio libre y donde el pH se mantiene a un pH de 6.0. Este ensayo mide la disminución en la sensibilidad del calcio: 10 microgramos de la variante se incubaron bajo las siguientes condiciones: Una solución de acetato 0.1 M, pH ajustado a un pH 6.0, que contenía 5% p/p de almidón de maíz común (libre de calcio) . La incubación se realizó en un baño de agua a 95°C durante 30 minutos.

Ensayo para la Actividad del alfa-amilasa 1. Ensayo Phadebas La actividad de la Alfa-amilasa se determina mediante un método que emplea tabletas Phadebas® como el substrato. Las tabletas Phadebas (Prueba amilasa Phadebas®, suministrada por Pharmacia Diagnostic) contiene un polímero de almidón coloreado con azul insoluble, que ha sido mezclado con albúmina de suero bovino y una sustancia de amortiguación en pastilla . Para cada una de las mediciones, una tableta se suspende en un tubo que contiene 5 mi de 50 mM de una solución amortiguadora Britton-Robinson (ácido acético 50 mMe, ácido fosfórico 50 mM, ácido bórico 50 mM, 0.1 mM de CaCl2, el pH se ajustó al valor de interés con NaOH) . La prueba se realiza en un baño de agua a la temperatura de interés. La alfa-amilasa a ser probada se diluye en x mi de 50 mM de una solución amortiguadora Britton-Robinson . 1 mi de esta solución de alfa-amilasa se agrega a los 5 mi de la solución amortiguadora 50 mM Britton-Robinson. El almidón se hidroliza mediante la alfa-amilasa que da los fragmentos azules solubles. La absorbancia de la solución azul resultante, se mide espectrofotométricamente a 620 nm, que es una función de la actividad del alfa-amilasa. Es importante que los 620 nm de absorbancia medidos después de 10 o 15 minutos de incubación (tiempo de prueba) se encuentre en el rango de 0.2 a 2.0 unidades de absorbancia a 620 nm. En este rango de absorbancia existe una linealidad entre la actividad y la absorbancia (Ley de Lambert-Beer) . Por consiguiente, la dilución de la enzima debe ajustarse para encajar en este criterio. Bajo un conjunto específico de condiciones (temperatura, pH, tiempo de reacción, condiciones de la solución amortiguadora) 1 mg de una alfa-amilasa hidrolizará una cierta cantidad de substrato y se producirá un color azul. La intensidad del color se mide a 620 nm. La absorbancia medida es directamente proporcional a la actividad específica (actividad/mg de proteína de la alfa-amilasa pura) de la alfa-amilasa en cuestión bajo el conjunto dado de condiciones. 2. Método alternativo La actividad del alfa-amilasa se determina mediante un método que emplea el substrato de PNP-G7. El PNP-G7 que es una abreviación del p-nitrofenil-alfa, D-maltoheptaosido es un oligosacárido bloqueado que puede ser desdoblado mediante una endo-amilasa . Siguiendo el división, la alfa-glucosidasa incluida en el kit asimila el substrato para liberar una molécula de PNP libre, que tiene un color amarillo y que por lo tanto, puede medirse mediante espectofotometría visible a (400-420 nm. ) . El kit contiene el substrato PNP-G7 y la alfa-glucosidasa es fabricada por Boehringer-Mannheim (cat . No. 1054635) . Para preparar el substrato, una botella de substrato (BM 1442309) se agrega a una solución amortiguadora de 5 mi (BM1442309) . Para preparar la a-Glucosidasa, una botella de alfa-Glucosidasa (BM 1462309) se agrega a 45 mi de la solución amortiguadora (BM1442309) . La solución activa se hace mezclando 5 mi de la solución alfa-glucosidasa con 1 mi del substrato. El ensayo se realiza transformando 20µ1 de la solución de enzima a una placa de microtitulación de 96 pozos y se incuba a 25°C. Se agregan 200 µ? de la solución activa a 25°C. La solución se mezcla y se pre-incuba 1 minuto y la absorción se mide cada 15 segundos durante 3 minutos a OD 405 nm. La pendiente de la curva de absorción dependiente del tiempo es directamente proporcional a la actividad específica (actividad por mg de enzima) de la alfa-amilasa en cuestión bajo el conjunto dado de condiciones.

Determinación de la actividad específica La actividad específica se determina como actividad/mg de enzima usando uno de los métodos descritos anteriormente. Las instrucciones de fabricación se siguen (también ver abajo "Ensayo para la actividad de la alfa-amilasa").

Determinación de Estabilidad a la oxidación Los caldos de cultivo filtrados crudos con diferentes variantes de la invención, se diluyen para una actividad amilasa de 100 K U/ml (definido anteriormente) en 50 M de una solución amortiguadora Britton-Robinson a un pH 9.0 y se incubaron a 40°C. Posteriormente, se añade H2O2 a una concentración de 200 mM, y el valor del pH se re-ajusta a un 9.0. La actividad se mide ahora después de 15 segundos y después de 5, 15, y 30 minutos sacando las muestras y diluyéndolas 5 veces con el agua fría y guardándolas en hielo. La actividad restante se mide entonces usando los métodos Phadebas como se describió arriba en donde la absorbancia de la solución azul resultante, se mide espectrofotométricalmente a 620 nm, que es una función de la actividad de la alfa-amilasa. Las actividades después de los 5, 15 y 30 minutos se calculan relativamente a la actividad después de 15 segundos para determinar la estabilidad. Desempeño del lavado El desempeño del lavado se evalúa mediante pedazos de tela de prueba de lavado sucio durante 15 y 30 minutos a 25°C y 40°C, respectivamente; a un pH en el rango de 9-10.5; la dureza del agua en el rango de 6 a 15°dH; proporción de Ca:Mg de desde 2:1 hasta 4:1, en diferentes soluciones del detergente (ver arriba como se describe anteriormente en la sección de Materiales) dosificadas desde 3 hasta 5 g/1 dependientes del detergente con la variante de la alfa-amilasa en cuestión. La variante de la alfa-amilasa recombinante se agrega a las soluciones del detergente en concentraciones de por ejemplo, 0.01-5 mg/1. Los pedazos de tela de prueba de lavado sucio son ensuciados con almidón de arroz anaranjado (pedazos de tela C-28 disponibles por CFT, Center for Test Material, Holanda) . Después del lavado, los pedazos de tela se evalúan midiendo la remisión a 460 nm usando un espectrofotómetro de Remisión Elreph. Los resultados se expresan como la AR = remisión de pedazos de tela lavados con la alfa-amilasa menos la remisión de un pedazo de tela lavado con las mismas condiciones sin la alfa-amilasa.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 Construcción de variantes de AA560 de la SEQ ID NO: 12 El gen que codifica a la alfa-amilasa AA560 mostrada en la SEQ ID NO: se localizan en un plásmido pTVB223. La amilasa se expresa a partir del promotor amyL en este constructo en el Bacillus subtilis. Una variante de la invención con la mutación M202L se construyó mediante el método mega-cebador como se describe por Sarkar y Sommer, (1990), BioTechniques 8: 404-407. El plásmido resultante que codifica a la amilasa AX379 con M202L se nombró como pCA202-AX379. La construcción de las otras variantes de la invención se llevó a cabo de una manera similar.

EJEMPLO 2 Determinación de la actividad en el lavado Las variantes amilasa se construyeron usando los métodos convencionales en la amilasa AX379 o AX413, respectivamente en la prueba de actividad se usan como referencia (primera línea en la tabla) . La variante AX413 se deriva de AX379 introduciendo las mutaciones como se indica en las tablas de abajo . La actividad se midió en la solución del detergente en un lavado europeo simulado a 40°C. Se hizo una suspensión de una tableta Phadebas por 5ml de 4g/L de la solución de detergente y se adecuó bajo agitación en tubos Eppendorf. Después de 5 minutos de pre-calentado a 40°C enzima la enzima amilasa se añadió y la mezcla se incubó durante 20 minutos bajo agitación vigorosa. La reacción se detuvo añadiendo 10% de 1 M NaOH y los tubos se giraron durante 3 min a lOOOOxg como mínimo. Finalmente, la absorbancia a 650nm se midió para el sobrenadante usando una muestra que no es de la enzima como un control .

Tabla 3 : Tabla 4 : EJEMPLO 3 Determinación de estabilidad durante el lavar trastes Las variantes amilasa se construyeron usando los métodos convencionales en la amilasa AX379 o AX413, respectivamente en donde la prueba de actividad se usa como referencia (primera línea en la tabla) . La variante AX413 se deriva de AX379 introduciendo las mutaciones como se indica en las tablas de arriba. La estabilidad de la amilasa se midió incubando alrededor de 0.1 mg/ml de amilasa en 4 g/1 de detergente para el lavar trastes automático a 40°C durante 18 horas. La incubación se detuvo agregando 9 volúmenes de agua fría (< 5°C) y almacenada en hielo. Con una hora, la actividad se midió usando el Kit amilasa Phadebas y la actividad en muestras del detergente comparadas con las muestras incubadas durante el mismo período en el detergente pero en hielo.

Tabla 5: EJEMPLO 4 Las variantes amilasa de la SEC ID NO:12 se construyeron como se describe en el ejemplo 1 y se fermentaron en matraces usando un medio rico. Del sobrenadante, la proteína de la variante amilasa se purificó usando métodos de purificación estándar superiores a un 90% de pureza.

La concentración de la proteína se calculó a partir de la absorbancia A280 y de un coeficiente de extensión teórico de 2.9 inl/mg/cm. El ensayo de actividad G7-pNP se usó cano se describe bajo "Métodos" para medir la actividad de las muestras amilasa y por lo tanto, la actividad específica (SA) , es decir, la actividad de G7-pNP por mg de pro teína de amilasa se calculó y comparó a la amilasa de la referencia homologa. Reí . SA M202L <Ref.A) 1, 00 Ref .A+M9L+M323T 1, 18 Ref . A+M9L+M323T+M382Y+K383R 1,20 Ref .A+M9L+S303Q+M323T+M382Y+K383R 1,31 Ref . A+M9L+V214T+M323T+M382Y 1,37 Ref .A+M9L+M323T+A339S+M382Y+K383R+N471E 1, 55 Ref .A+M9L+V214T+M323T+A323T+A339S+N471E 1,73 M202L+V214T (Ref.B) 1,00 Ref .B+G149H 1,41 Ref .B+E345R 1,18 Ref .B+G149A+M382Y 1,24 Ref .B+G149A+N299Y+T356I+M382Y 1,27 Ref .B+M382Y 1,43 Ref .B+G149A+K269S+N270Y+Y295F+A339S+E345R+N471 1,78 Ref .B+A339S+N471E 1,80 M9L+M202I+M232T (Ref.C) 1, 00 Ref .C+V214T+Y295F+A339S+M382Y+K383R+N471E 2,60 Reí. SA M9L+M202I+V214T+Y295F+M323T+M382Y (Ref .D) 1,00 Ref .D+G149A+A339S+E345R 1,25 Ref .D+G149A+V214I+A339S 1,25 Ref .D+N83S+G149A+A339S+E345R 1,25 Ref .D+G133K+G149A+A339S+E345R 1,33 Ref .D+I206F+A339S 1,42 Ref .D+G149A+A339S 1, 50 Ref . D+G149A+V214V+K269S+N270Y+E345R+A339S 4, 08 Ref .D+G149A+V214V+ 269S+N270Y+A339S 5, 83 EJEMPLO 5 Las pruebas de lavado se dirigieron usando 9 g/1 de un detergente tradicional HDD (Henkel) con blanqueador y 0.2 mg de proteína de amilasa por litro en una maquina de lavado a baja escala, aplicando un perfil de calor superior europeo a 40°C durante 20 minutos. La dureza del agua se ajusta con Ca, Mg y NaHC03 a 16°dH. El desempeño del lavado se evalúa en pedazos de tela de algodón con almidón de arroz coloreado, (los C-28 de CFT) , midiendo la blancura del pedazo de tela después del lavado con la amilasa presente relativa a la blancura de un pedazo de tela lavado sin la amilasa. La blancura se mide usando un espectrofotómetro de remisión (Macbeth Color-Eye) , después que los pedazos de tela se han secado en línea durante la noche.

IF AX379 1, 00 M9L+G149A+M202I+V214T+Y295F+M323T+A339S+E345R+M382Y 1, 06 G149A+G182T+G186A+M202I+V214I+Y295F+N299Y+ 323T+A33 1, 12 9S M9L+G149A+M202I+V214I+Y295F+M323T+A339S+M382Y 1, 13 9L+N106D+M202L+ 323T 1, 14 M9L+M202L+M323T+M382Y+K383R 1,14 M9L+M202L+V214T+Y295F+M323T+ 382Y 1,14 M9L+G133K+G149A+M202I+V214T+Y295F+M323T+A339S+E345R 1, 14 + 382Y M9L+M2021+V214T+M323T+A339S+M382Y+K383R+N471E 1, 16 M9L+M202L+V214T+M323T+ 382Y 1, 17 M9L+G149A+ 202L+V214T+ 323T+M382Y 1, 17 M9L+M202L+S303Q+M323T+M382Y+K383R 1, 17 M9L+G149A+G182T+M2O2L+T257I+Y295F+S303Y+M323T+A339S 1, 17 +E345R M9L+G149A+M202L+V214T+N299Y+M323T+T356I+M382Y 1,18 M9L+G149H+M202L+V214T+M323T 1,20 M9L+M202L+V214T+M323T+E345R 1,25 9L+G149A+G182T+M202L+T257I+Y295F+N299Y+M323T+A339S 1,25 +E345R 9L+G149A+ 202L+V214I+Y295F+ 323T+A339S 1,26 M9L+G149A+ 202L+V214I+Y295F+M323T+A339S+E345R 1,30 M9L+M202L+V214T+Y295F+M323T+A339S 1,31 M9L+G149A+G182T+G186A+M202L+T257I+Y295F+N299Y+M323T 1,35 +A339S+E345R 9L+M202L+M323T+A339S+M382Y+K383R+N471E 1,38 EJEMPLO 6 Las pruebas de lavado se dirigieron usando 6 g/1 de un detergente de megaperlas Persil (Henkel) y 0.2 mg de proteína de amilasa por litro en una maquina de lavado a baja escla, aplicando un perfil de calor superior europeo a 40°C durante 20 minutos. La dureza del agua se ajusta con Ca, Mg y NaHC03 a 16°dH. El desempeño del lavado se evalúa en pedazos de tela de algodón con almidón de arroz coloreado, (C-28 de CFT) , midiendo la blancura del pedazo de tela después del lavado con la amilasa presente relativa a la blancura de un pedazo de tela lavado sin la amilasa. La blancura se mide usando un espectrofotómetro de remisión (Macbeth Color-Eye) , después que los pedazos de tela se han secado en línea durante la noche . Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (37)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones . 1. Una variante de un alfa-amilasa tipo termamilo precursora, caracterizada porque comprende una alteración en una o más de las posiciones seleccionadas del grupo de: 26, 30, 33, 82, 37, 106, 118, 128, 133, 149, 150, 160, 178, 182, 186, 193, 203, 214, 231, 256, 257, 258, 269, 270, 272, 283, 295, 296, 298, 299, 303, 304, 305, 311, 314, 315, 318, 319, 339, 345, 361, 378, 383, 419, 421, 437, 441, 444, 445, 446, 447, 450, 461, 471, 482, 484, en donde (a) las alteración (es) son independientemente (i) una inserción de un aminoácido en dirección 3' del aminoácido que ocupa la posición, (ii) una supresión del aminoácido que ocupa la posición, o (iii) una substitución del aminoácido que ocupa la posición con un aminoácido diferente, (b) la variante tiene actividad alfa-amilasa, y (c) cada posición corresponde a una posición de la secuencia del aminoácido del alfa-amilasa precursora que tiene la secuencia de aminoá-cido de la alfa-amilasa tipo termamilo precursora que tiene la secuencia del aminoácido de AA560 que se muestra en la SEQ ID NO: 12.
2. 2. La variante de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque las mutaciones son: R26S, D30N, N33D, R82H, K37T, N106D, K118Q, N128Y, G133E,A, G149A,N< N150H,Q, Y160F, Y178F, G182T, G186A, T193S , , D, E, Q, Y203L, V214I,T, D231N, G256K, T257I, G258D, K269S,Q, N270F,Y,D, L272l,V<A, N283D, Y295F,N,D,Q,Ef N296K,Q,E, Y298F,H, N299F,Y,Q,T, S303Q,K, Y304F,R,K, G305D, Q311N, Q, K, R, T, S, Y, F, N314D,S,T,Q, G315N,S,T, V318L, Q319E,KfS,T, A339S,T, E345N,R, Q361E, G378K, K383R, T419N, H421Y, N437H, F441 L, R444E,Y, N445Q, K446R, A447Y, V450T, T461, N471E, W482Y, N484Q.
3. 3. La variante de conformidad con las reivindicaciones 1-2, caracterizada porque tiene una mutación adicional en uno o más residuos de la metionina.
4. 4. La variante de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque los residuos de la metionina son: M9, MIO, M116, M202, M208, M261, M309, M323, M382, M410, M430, y M440.
5. 5. La variante de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada porque las mutaciones son: M9L,I, M10L, M105L,I,F, M11€N,D,L, I,F,W,R,K, M202I,L,V,T, M208F,Y,L,1, M261L,I, M309L,I, M323L, I , S, , A, Q, E, , D, M382L,Y,F,K, M410L,I,V, M430L,I, y M440L, I, F, Y.
6. 6. La variante de conformidad con las reivindicaciones 1-5, caracterizada porque tiene una o más de las siguientes mutaciones : M9L+M202I, M9L+M202I+M323T, M9L+M2021+323T+M382Y, M9L+M202I+Y295F+A339S, M9L+M202I+Y295F, M9L+ 202I+A339S, 9L+M202I+Y295F+A339S, M9L+M202I+Y295F+A339S+E345R, M9L+G149A+M202I+Y295F+A339S+E345R, M9L+M202L, M9L+M202L+M323T, M9L+M202L+M232T+M382Y, M9L+M202L+Y295F+A339S, M9L+M202L+Y295F, M9L+M202L+A339S, M9L+M202L+Y295F+A339S, M9L+M202L+Y295F+A339S+E345R, M9L+G149A+M202L+Y295F+A339S+E345R, 9L+M202T, M9L+M202T+M323T, M9L+M202T+M323T+M382Y, M9L+M202T+Y295F+A339S, M9L+M202T+Y295F, M9L+M202T+A339S, 9L+M202T+Y295F+A339S, M9L+M202T+Y295F+A339S+E345R, M9L+G149A+ 202T+Y295F+A339S+E345R, M9L+G149A+M202I+V214T+Y295F+N299Y+ 323T+A339S+E345R, M9L+G149A+M202L+V214I+Y295F+M323T+A339S+E345R+M382Y, M9L+G149A+G182T+G186A+M202I+V214I+Y295F+N299Y+M323T+A339 S, M9L+G149A+G182T+G186A+M202L+T257I+Y295F+N299Y+M323T+A339 S+E345R, M9L+G149A+M202L+V214T+Y295F+N299Y+ 323T+A339S+E345R, 9L+G149A+M202I+V214I+Y295F+M323T+A339S+E345R+M382Y, M9L+G149A+G182T+G186A+M202L+V214I+Y295F+N299Y+M323T+A339 S, M9L+G149A+G182T+G186A+M202I+T257I+Y295F+N299Y+ 323T+A339 S+E345R, M9L+G149A+M202I+V214T+Y295F+N299Y+M323T+A339S+E345R+N471 E, M9L+G149A+M202L+V214I+Y295F+M323T+A339S+E345R+ 382Y+N471 E, 9L+G149A+G182T+G186A+M202I+V214I+Y295F+N299Y+M323T+A339 S+N471E, M9L+G149A+G182T+G186A+M202L+T257I+Y295F+N299Y+ 323T+A339 S+E345R+N471E, M202L+M105F+M208F, G133E+M202L+Q361 E, 11.0 G133E+M202L+R444E, 202L+Y295F, M202L+A339S, M202L+M323T, M202L+M323T+M309L, M202L+M323T+M4301, M202L+V214T+R444Y, M202L+N283D+Q361E, M202L+M382Y+K383R, 202L+K446R+N484Q, 202I+Y295F, M202I+A339S, M202I+M105F+M208F, G133E+M202I+Q361E, G133E+ 202I+R444E, M2021+M202I+M323T, M202I+ 202I+ 323T+M309L, M202I+M323T+M430I, 202I+V214T+R444Y, 202I+N283D+Q361 E, M202I+M382Y+K383R, 2021+K446R+N4S4Q, 202V+ 105F+M208F, G133E+ 202V+Q361 E, G133E+M202V+R444E, M202V+M323T, M2O2V+ 323T+M3O9L , M202V+M323T+M430I , M202V+M323T+M9L, M202V+V214T+R444Y, M202V+N283D+Q361 E, M202V+M382Y+K383R, M202V+K446R+N484Q , M202T+M105F+M208F, G133E+M202T+Q361E, G133E+M202T+R444E, 202T+Y295F, M202T+A339S, M202T+M323T, 202T+M323T+M309L, 202T+M323T+M430I, M202T+M323T+M9L, M202T+V214T+R444Y, M202T+N283D+Q361E, M202T+A339S, M202T+Y295F M202T+N299F, Y, 202T+M382Y+K383R, M202T+K446R+N484Q
7. 7. La variante de conformidad con las reivindicaciones 1-6, caracterizada porque comprende además la mutación D183*+G184* .
8. 8. La variante de conformidad con las reivindicaciones 1-7, caracterizada porque además una mutación en R118, en particular R118K.
9. 9. La variante de conformidad con las reivindicaciones 1-8, caracterizada porque comprende además una mutación en N195, en particular N195F.
10. 10. La variante de conformidad con las reivindicaciones 1-9, caracterizada porque comprende una mutación en R320, en particular R320K.
11. 11. La variante de conformidad con las reivindicaciones 1-10, caracterizada porque comprende una mutación en R458, en particular R458K.
12. 12. La variante de conformidad con las reivindicaciones 1-11, caracterizada porque comprende la mutación D183*+G184*+R118K+N195F+R320K+R458K en combinación con una o más de las siguientes mutaciones: K118Q, K37T, H421Y, V450T, K383R, N445Q, Y178F, V318L, W482Y, N283D+Q361E, 105F+M208F, M2O2L+M323T+M4301, K446R+N484Q, R444Y, N106D, Y203L, G133E+Q361E, M323E, V214T, M202L+ 323T+M309L, M202L, M202L+M323T, M202L+ 323T+M9L+M382Y+K383R, M202L+M323T+M9L+M382Y, M202L+ 323T+M9L.
13. 13. La variante de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porque comprende la mutación D183*+G184*+R118K+N195F+R320K+R458K+M202L+M323T+M9L.
14. 14. La variante de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada porque comprende una o más de las siguientes mutaciones : T461P, Y298H, G133E+R444E, Y298F, M202T, M202I, M202V, V214T+M323E+M382Y+K383R+N471E Y178F+G258D+T419N+N437H G149N+N150Q+M382Y+K383R Y160F+V214T+M382Y N128Y+G149A+V214T+D231N+M382Y+F441L R82H+N128Y+G149A+V214T+M382Y N150H+V214T V214T+E345N V214T+G305D+M382Y+R444E V214T+M382Y+A447Y M2021+V214T+M382Y+K383R+R444Y V214T+G378K V214T+A256K R26S+D30N+N33D+V214T+ 382Y
15. 15. La variante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-14, caracterizada porque la alfa-amilasa tipo termamilo precursora se deriva de una cepa de B. lichenifor is, B. amyloliguefaciens, B. stearothermophilus, Bacillus sp. NCIB 12289, NCIB 12512, NCIB 12513 o DSM 9375, o DSMZ no. 12649, KSM AP1378, o RSM K36 o KSM 38.
16. 16. La variante de conformidad con las reivindicaciones 1-15, caracterizada porque la alfa-amilasa tipo termamilo precursora es cualquiera de las alfa-amilasas seleccionadas del grupo descrito en las SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 13, 14, 15, 16, 17, y 18.
17. 17. La variante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-16, caracterizada porque la alfa-amilasa tipo termamilo precursora tiene una secuencia de aminoácidos que tiene un grado de identidad a la SEQ ID NO: 4 de por lo menos 60%, preferentemente 70%, más preferentemente por lo menos 80%, más aun preferentemente por lo menos de aproximadamente 90%, más aun preferentemente por lo menos 95%, más aun preferentemente por lo menos 97%, y más aun preferentemente por lo menos de 99%.
18. 18. La variante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-17, caracterizada porque la alfa-amilasa tipo termamilo precursora se codifica mediante una secuencia del ácido nucleico que hibridiza bajo condiciones de severidad bajas, preferentemente medias, preferentemente altas, con la secuencia del ácido nucleico de la SEQ ID NO: 11.
19. 19. La variante de conformidad con las reivindicaciones 1-18, caracterizada porque la variante tiene una alteración en por lo menos una de las siguientes propiedades relativas a dicha alfa-amilasa precursora: la especificidad del substrato, enlace del substrato, patrón de división del substrato, estabilidad térmica, perfil de actividad del pH, perfil de estabilidad del pH, estabilidad hacia la oxidación, dependencia de Ca2+, pl reducida e incrementada y desempeño mejorado de lavado, actividad específica, estabilidad bajo por ejemplo, temperatura alta ylo condiciones de pH bajo/alto, en particular, en concentraciones de calcio bajo, y estabilidad en presencia de detergente, por ejemplo, estabilidad de almacenamiento en los detergentes.
20. 20. Un constructo de ADN, caracterizado porque comprende una secuencia de ADN que codifica a una variante del alfa-amilasa de acuerdo con cualquiera de una de las reivindicaciones 1 a 19.
21. 21. Un vector de expresión recombinante, caracterizado porque lleva un constructo del ADN de acuerdo con la reivindicación 20.
22. 22. Una célula que se transforma con un constructo de ADN, caracterizada porque es de acuerdo con la reivindicación 20 o un vector de acuerdo con la reivindicación 21.
23. 23. Una célula de conformidad con la reivindicación 22, caracterizada porque es un microorganismo, preferentemente una bacteria o un hongo, en particular, una bacteria gram-positiva, tal como el como el Bacillus subtilis, Bacillus lichenifor is, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliguefacíens, Bacillus coagulans, Bacillus circulans Bacillus lautus o Bacillus thuringiensis .
24. 24. Una composición caracterizada porque comprende una variante del alfa-amilasa de conformidad con las reivindicaciones 1-19.
25. 25. Un aditivo de detergentes que comprende una variante del alfa-amilasa de conformidad con cualquiera de una de las reivindicaciones 1 a 19, caracterizado porque opcional ente está en la forma de una enzima protegida o líquida estabilizada, granulada que no se encuentra en forma de polvo .
26. 26. El aditivo de detergentes de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque contiene 0.02-200 mg de proteína/g de la enzima del aditivo.
27. 27. Un aditivo de detergentes de conformidad con las reivindicaciones 25 o 26, caracterizado porque adicionalmente comprende otra enzima tal como una proteasa, una lipasa, una peroxidasa, mananasa, amilasa maltogénica, -CGTasa, amilasa u otra enzima amilolítica tal como la glucoamilasa y/o una celulasa .
28. 28. Una composición detergente caracterizada porque comprende una variante del alfa-amilasa, de conformidad con cualquiera de las reivindi-caciones 1 a 19.
29. 29. Una composición detergente de conformidad con la reivindicación 28, caracterizada porque adicionalmente comprende otra enzima tal como una proteasa, una lipasa, una peroxidasa, mananasa, amilasa maltogénica, CGTasa, otra enzima amilolítica y/o una celulasa.
30. 30. Una composición detergente para lavar trastes de forma automática o manual caracterizada porque comprende una variante de alfa-amilasa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19.
31. 31. Una composición detergente para lavar trastes de conformidad con la reivindicación 30, caracterizada porque comprende adicionalmente otra enzima tal como una proteasa, una lipasa, una peroxidasa, mananasa, amilasa maltogénica, CGTasa, amilasa u otra enzima amilolítica tal como glucoamilasa y/o una celulasa.
32. 32. Una composición para lavado de lavandería automática o manual, caracterizada porque comprende una variante de alfa-amilasa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19.
33. 33. Una composición para lavado de lavandería de conformidad con la reivindicación 32, caracterizada porque adicionalmente comprende otra enzima tal como una proteasa, una lipasa, una peroxidasa, mananasa, amilasa maltogénica, CGTasa, una amilasa y/o otra enzima amilolítica tal como la glucoamilasa y/o una celulasa.
34. 34. El uso de una variante del alfa-amilasa de conformidad con cualquiera de una de las reivindicaciones 1 a 19 o una composición de conformidad con las reivindicaciones 24 a 34 para lavado y/o lavar trastes.
35. 35. El uso de una variante del alfa-amilasa de conformidad con cualquiera de una de las reivindicaciones 1 a 19 o una composición de conformidad con las reivindicaciones 24 a 34 para el desencolado textil.
36. 36. El uso de una variante del alfa-amilasa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19 o una composición de conformidad con las reivindicaciones 24 a 34 para la licuefacción del almidón.
37. 37. Un método para producir una variante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-19, caracterizado porque una célula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 22 a 23 se cultiva bajo condiciones que conducen a la producción de la variante, y la variante se recupera posteriormente del cultivo.