CN117916354A - 用于清洁的衣物洗涤组合物 - Google Patents

Abstract

本文公开了用于预防、减少或去除生物膜的组合物和方法。

Description

用于清洁的衣物洗涤组合物

技术领域

描述了用于衣物洗涤或硬表面清洁的脱氧核糖核酸酶(DNA酶、核酸酶、磷酸二酯酶)。

背景技术

冷水清洗和合成材料制运动服的趋势推动了对消除细菌和气味的洗涤剂的需求，同时，行业里正不断淘汰使用传统氧漂白剂的衣物洗涤粉。因此，需要去除衣物洗涤中的臭味和微生物的新方法。

在清洗机器中和衣物洗涤纺织品上的细菌生物膜的形成加剧了有害的且产生臭味的细菌的传播(Bockmuhl 2017，Gattlen等人2010)。生物膜形成增大了去除细菌的阻力且增加了清洁过程。这种阻力是通过产生由水、多糖、蛋白质、核酸和脂质组成的生物膜细胞外基质介导的(Fleming等人，2010；Limoli等人2015；Kostakioti等人，2013)。因此，降解这些细胞外基质组分的酶可以用于减少、抑制或去除细菌生物膜(Kostakioti等人2013，Fleming等人2017)。

尽管反复暴露于来自典型衣物洗涤剂的表面活性剂、蛋白酶和淀粉酶，但细菌生物膜仍持续存在于清洗机器中并导致卫生和气味问题(Bockmuhl 2017，Gattlen等人2010)。因此，需要在衣物洗涤中去除生物膜的更有效的解决方案。

已经发现核酸酶可分散细菌生物膜(例如Nguyen和Burrows(2014)；Nijland等人(2010)；Whitchurch等人(2002))，并且最近核酸酶作为潜在的衣物洗涤剂添加剂已引起了人们的兴趣(例如Morales-Garcia等人(2020)、WO 2015181287、WO 2015155350、WO2016162556、WO 2017162836、WO 2017060475、WO 2018184816、WO 2018177936、WO2018177938、WO 2018/185269、WO 2018185285、WO 2018177203、WO 2018184817、WO2019084349、WO 2019084350、WO 2019081721、WO 2018076800、WO 2018185267、WO2018185280、和WO 2018206553)。然而，衣物洗涤剂对酶提出了特殊的挑战，因为表面活性剂、螯合剂、蛋白酶和其他组分可以使酶失活和变性。需要可以承受这些困难条件同时保持高性能的新型核酸酶。

本发明公开描述了与先前描述的核酸酶相比具有改善的稳定性和活性的新核酸酶。

发明内容

本发明描述了为衣物洗涤和家庭护理应用、特别是洗涤剂组合物提供性能改善的核酸酶。

在实施例中，本发明是用于预防、减少或去除生物膜的方法，该方法包括使生物膜与包含具有核酸酶活性的多肽的清洁组合物接触，其中该具有核酸酶活性的多肽是与选自由SEQ ID NO：1至13组成的组的酶具有至少80％序列同一性的多肽。

在另一实施例中，本发明是用于预防、减少或去除纺织品或硬表面的生物膜的方法，该方法包括：(i)使纺织品或表面与具有核酸酶活性的多肽或包含具有核酸酶活性的多肽的组合物接触；以及(ii)任选地，冲洗该纺织品或表面，其中该具有核酸酶活性的多肽是与选自由SEQ ID NO：1至13组成的组具有至少80％序列同一性的多肽。

在另一实施例中，本发明是洗涤剂组合物。

在另一实施例中，本发明是洗涤剂组合物，其包含：(i)具有核酸酶活性的多肽；(ii)具有蛋白酶活性的多肽；(iii)至少一种另外的多肽，其中该至少一种另外的多肽是选自以下的酶：DNA酶、酰基转移酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、α-半乳糖苷酶、阿拉伯糖苷酶、芳基酯酶、β-半乳糖苷酶、角叉菜胶酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、软骨素酶、角质酶、内切-β-1，4-葡聚糖酶、内切-β-甘露聚糖酶、酯酶、外切-甘露聚糖酶、半乳聚糖酶、葡糖淀粉酶、半纤维素酶、透明质酸酶、角蛋白酶、漆酶、乳糖酶、木质酶、脂肪酶、脂加氧酶、溶菌酶、甘露聚糖酶、金属蛋白酶、核酸酶、氧化酶、氧化还原酶、果胶酸裂合酶、果胶乙酰酯酶、果胶酶、戊聚糖酶、过氧化物酶、酚氧化酶、磷酸酶、磷脂酶、植酸酶、聚半乳糖醛酸酶、聚酯酶、蛋白酶、支链淀粉酶、还原酶、鼠李糖半乳糖醛酸酶、β-葡聚糖酶、鞣酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖乙酰酯酶、木聚糖酶、木葡聚糖酶、木糖苷酶、及其任何组合或混合物；以及(iv)表面活性剂，其中该具有核酸酶活性的多肽是与选自由SEQ ID NO：1至13组成的组具有至少80％序列同一性的多肽。

在另一实施例中，本发明是用于减少与纺织品或硬表面相关的臭味的方法，该方法包括：(i)使纺织品或硬表面与具有核酸酶活性的多肽或包含具有核酸酶活性的多肽的组合物接触；以及(ii)任选地，冲洗该纺织品或表面，其中该具有核酸酶活性的多肽是与选自由SEQ ID NO：1至13组成的组具有至少80％序列同一性的多肽。

在另一实施例中，本发明是具有核酸酶活性的分离的多肽或其活性片段，其中该多肽包含与选自由SEQ ID NO：1至13组成的组的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。

附图说明

图1提供了本公开的一个实施例的结果的图示，其提供了证明用100PPM酶分散生物膜的数据。该图示出了结晶紫染色剂在590nm处的吸光度。绘制所有重复的平均值，每个样品至少八个重复。

图2提供了本公开的一个实施例的结果的图示，其提供了证明用20PPM酶分散生物膜的数据。该图示出了结晶紫染色剂在590nm处的吸光度。绘制所有重复的平均值，每个样品至少八个重复。

图3提供了本公开的一个实施例的结果的图示，其提供了证明用如所指示的10PPM、50PPM和250PPM酶分散生物膜的数据。该图示出了结晶紫染色剂在590nm处的吸光度。绘制所有重复的平均值，每个样品至少八个重复。

图4提供了本公开的一个实施例的结果的图示，其提供了证明测试溶菌酶SmaLys1和核酸酶CcrNuc1的组合的数据。这些图示出了所有重复(每个样品八个)的平均值。单一酶或组合以5ppm总酶给予并与以5ppm的SEQ ID No.14进行比较。在26C下振荡6小时进行处理。

图5提供了本公开的一个实施例的结果的图示，其提供了证明测试溶菌酶SmaLys1和核酸酶CcrNuc1的组合的数据。这些图示出了所有重复(每个样品八个)的平均值。单一酶或组合以10ppm总酶给予并与以10ppm的SEQ ID NO.14进行比较。在26C下振荡6小时进行处理。

图6提供了本公开的一个实施例的结果的图示，其提供了证明CcrNuc1与SmaLys1组合的生物膜分散的数据。该图示出了所有重复(每个样品八个)的平均生物膜信号(590nm)。不同的色调是指不同的总蛋白质浓度(50ppm、12.5ppm、3.1ppm、0.78ppm或0.2ppm)。例如，黑色条指示50PPM的单独的CcrNuc1、50PPM的单独的SEQ ID No.14、或25PPMSmaLys1+25PPM CcrNuc1。使用单独的Tide 1∶1200作为阴性对照。以50ppm给予的SEQ IDNO.14用于比较。

具体实施方式

本公开提供了组合物(例如，酶和洗涤剂组合物)和使用这样的组合物预防、减少或去除生物膜(例如，来自制品如硬表面或纺织品)的方法。这些组合物通常使用至少一种具有核酸酶活性的多肽或包含具有核酸酶活性的多肽的组合物。这些组合物还任选地包含清洁洗涤剂的另外的组分，如一种或多种表面活性剂。

定义

在描述本发明的组合物和方法的实施例之前，定义以下术语。

除非本文另外定义，否则本文所用的所有技术与科学术语均具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。尽管与本文所述的那些方法和材料类似或等同的任何方法和材料可用于本发明的实践，但是本文描述了优选的方法和材料。因此，总体上通过参考说明书，紧接在下面定义的术语得以更全面地描述。此外，除非上下文另有明确指示，否则如本文所用，单数术语“一个/一种(a/an)”和“该/所述(the)”包括复数指示物。应当理解，本发明不限于所描述的特定方法、方案和试剂，因为它们可以根据本领域技术人员使用它们的情境而变化。

在本说明书通篇中给出的每一最大数值限度旨在包括每一较低数值限度，如同这样的较低数值限度在本文中明确写出一样。在本说明书通篇中给出的每一最小数值限度将包括每一较高数值限度，如同这样的较高数值限度在本文中明确写出一样。在本说明书通篇中给出的每一数值范围将包括落入这样的较宽数值范围内的每一较窄数值范围，如同这样的较窄数值范围在本文中全部明确写出一样。

术语“生物膜”是指嵌入附接到表面的细胞外聚合物基质中的微生物群落。细胞外聚合物基质是聚合物聚集体，通常由细胞外DNA、蛋白质和多糖组成。生物膜可以具有一种或多种微生物并且进一步包括水，并且可以包括其他捕获的粒子。这些微生物可以是革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌(需氧或厌氧)；藻类、原生动物、和/或酵母或丝状真菌。在一些实施例中，生物膜是包括以下一个或多个细菌属的活细胞：不动杆菌属物种(Acinetobacter sp.)、气微菌属物种(Aeromicrobium sp.)、短波单胞菌属物种(Brevundimonas sp.)、微杆菌属物种(Microbacterium sp.)、藤黄微球菌(Micrococcusluteus)、假单胞菌属物种(Pseudomonas sp.)(例如，荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens))、葡萄球菌属物种(Staphylococcus sp.)(例如，表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis))、以及寡养单胞菌属物种(Stenotrophomonas sp.)、链霉菌属物种(Streptomyces sp.)、李斯特菌属物种(Listeria sp.)、链球菌属物种(Streptococcus sp.)和埃希氏菌属物种(Escherichia sp.)。

如本文所用，“表面”意指具有足够质量以允许生物膜附着的任何结构。硬表面包括但不限于金属，玻璃，陶瓷，木材，矿物(岩石、石头、大理石、花岗岩)，骨料材料(aggregate material)如混凝土、塑料、复合材料、硬橡胶材料和石膏。硬材料可以用搪瓷和漆料完成。硬表面发现于例如水处理及储存设备和箱中；乳制品和食品加工设备和设施中；医疗设备和设施，如手术器械以及永久和临时植入物中；工业制药设备和工厂中。软表面是例如毛发和所有类型的纺织品。多孔表面还可以在某些陶瓷以及用于过滤的膜中找到。其他表面包括但不限于船体和游泳池。其他表面可以是生物表面，如皮肤、角蛋白或内脏器官。

术语“织物”是指例如机织材料、针织材料和非机织材料，以及可以转化成例如纱线和机织材料、针织材料和非机织材料的短纤维和长丝。该术语涵盖由天然的以及合成的(例如，制造的)纤维制成的材料。

术语“臭味”是指有臭味或难闻气味的织物或纺织品。

如本文所用，术语“纺织品”是指任何纺织材料，包括纱线、纱线中间体、纤维、非机织材料、天然材料、合成材料以及任何其他纺织材料、由这些材料制成的织物和由织物制成的产品(例如，服装和其他制品)。该纺织品或织物可以呈针织物、机织物、牛仔布、非机织物、毛毡、纱线和毛巾布的形式。该纺织品可以是基于纤维素的，如天然纤维素制品，包括棉、亚麻/亚麻布、黄麻、苎麻、剑麻或椰壳纤维，或者人造纤维素(例如，来源于木浆)，包括粘胶纤维/人造丝、乙酸纤维素纤维(三胞)、莱赛尔纤维(lyocell)、或其共混物。该纺织品或织物还可以不基于纤维素，如天然聚酰胺，包括羊毛、驼毛、羊绒、马海毛、兔毛和蚕丝，或合成聚合物如尼龙、芳族聚酰胺、聚酯、丙烯酸、聚丙烯和氨纶/弹性纤维(spandex/elastane)、或其共混物以及基于纤维素和不基于纤维素的纤维的共混物。共混物的实例是棉和/或人造丝/粘胶纤维与一种或多种伴生材料(companion material)的共混物，该伴生材料如羊毛、合成纤维(例如，聚酰胺纤维、丙烯酸纤维、聚酯纤维、聚氯乙烯纤维、聚氨酯纤维、聚脲纤维、芳族聚酰胺纤维)和/或含纤维素的纤维(例如，人造丝/粘胶纤维、苎麻、亚麻/亚麻布、黄麻、醋酸纤维素纤维、菜赛尔纤维)。织物可以是常规的可洗衣物，例如，沾污的家居衣物。当使用术语织物或服装时，旨在还包括广义术语纺织品。在本申请的上下文中，术语“纺织品”可与织物和布互换使用。

如本文所用，术语“硬表面”是指具有硬表面的任何制品，包括地板、桌子、墙壁、屋顶等，以及硬物体的表面，这些硬物体如汽车(汽车清洗)、船体、餐具(餐盘)、医疗器械、管道、贮器(reservoir)或储罐(holding tank)。术语“硬表面”还包括柔性但坚固物体的表面，如可弯曲管和供能管路(supply line)的内部或者可变形储罐或容器的表面。术语“硬表面”还包括清洗机器内部的表面，如衣物洗涤清洗机器或餐具清洗机器的内部，这包括肥皂盒、墙壁、窗户、篮子、架子、喷嘴、泵、水槽、过滤器、管道、管子、接头、密封件、垫圈、配件、叶轮、鼓、排水管、存水弯(trap)、硬币存水弯入口和出口。术语硬表面不涵盖纺织品或织物。

术语“洗涤”包括家庭洗涤和工业洗涤两者，并且意指用含有如本文所提供的清洁或洗涤剂组合物的溶液处理纺织品的过程。洗涤过程可以例如使用例如家用或工业清洗机器进行，或者可以用手进行。

术语“洗涤循环”是指这样的洗涤操作，其中将纺织品浸渍在洗涤液中，对纺织品施加某种机械作用以释放污渍或促进洗涤液流入和流出纺织品，以及最后除去多余的洗涤液。在一个或多个洗涤循环之后，通常冲洗并干燥纺织品。

术语“洗涤液”在本文中定义为水和洗涤剂组分的溶液或混合物，任选地包括具有核酸酶活性的多肽。

多肽、多核苷酸和表达盒

在一个实施例中，提供了具有核酸酶活性(例如DNA酶活性)并且与选自由SEQ IDNO：1-13组成的组的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的多肽。本公开的具有核酸酶活性的多肽包括分离的、重组的、基本上纯的、或非天然存在的多肽。在一些实施例中，多肽可用于清洁应用中，并且可以掺入可用于如本文所提供的清洁方法中的清洁组合物(例如洗涤剂组合物)中。

在一些实施例中，本文提供的具有核酸酶活性的多肽包括具有与选自由SEQ IDNO：1-13组成的组的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的那些。

在一些实施例中，用于在本文提供的组合物和方法中使用的本文提供的核酸酶多肽包括具有与选自由SEQ ID NO：1-13组成的组的氨基酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的多肽。

还提供了具有核酸酶活性的SEQ ID NO：1-13的变体核酸酶多肽酶，其中该酶包含与SEQ ID NO：1-13的氨基酸序列相差不超过50个、不超过40个、不超过30个、不超过25个、不超过20个、不超过15个、不超过10个、不超过9个、不超过8个、不超过7个、不超过6个、不超过5个、不超过4个、不超过3个、不超过2个、或不超过1个氨基酸残基的氨基酸序列(当使用本文提供的比对方法进行比对时)。

本公开的变体酶多肽具有酶活性(例如，核酸酶活性)并且因此可用于多种清洁应用中，这些清洁应用包括但不限于用于清洁餐具物品、桌面器具物品、织物、纺织品和具有硬表面的物品(例如，桌子、桌面、墙壁、家具物品、地板、天花板等的硬表面)的方法。下面描述了包含本公开的一种或多种具有核酸酶活性的多肽的示例性清洁组合物。本发明的酶多肽的酶活性(例如，核酸酶活性)可以容易地使用本领域普通技术人员熟知的程序来确定。下面提供的实例描述用于评价酶活性和清洁性能的方法。可以容易地使用本领域熟知的程序和/或通过使用实例中阐述的程序来确定本发明的多肽酶在减少、预防和/或去除生物膜方面的性能。

在一些实施例中，本公开的多肽可以在宽范围的pH条件内具有核酸酶活性。在一些实施例中，多肽具有核酸酶活性，如使用实例中描述的方法所证明的。在一些实施例中，多肽在约4.0至约12.0的pH下具有核酸酶活性。在一些实施例中，多肽在约6.0至约12.0的pH下具有核酸酶活性。在一些实施例中，多肽在约6.0至约12.0、或约7.0至约12.0的pH下、或在约6至约10的pH下、或在约6至约9的pH下具有至少50％、60％、70％、80％或90％的最大核酸酶活性。在一些实施例中，多肽在高于6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0或11.5的pH下具有核酸酶活性。在一些实施例中，多肽在低于12.0、11.5、11.0、10.5、10.0、9.5、9.0、8.5、8.0、7.5、7.0或6.5的pH下具有核酸酶活性。

在一些实施例中，本公开的多肽在约10℃至约90℃或约20℃至约40℃的温度范围内具有核酸酶活性。在一些实施例中，本公开的多肽在约20℃至约40℃的温度范围内具有核酸酶活性。在一些实施例中，多肽在约20℃至约40℃的温度下具有至少50％、60％、70％、80％或90％的最大核酸酶活性。在一些实施例中，多肽在高于50℃、55℃、60℃、65℃或70℃的温度下具有活性。在一些实施例中，多肽在低于90℃、85℃、80℃、75℃、70℃、65℃、60℃或55℃的温度下具有活性。

可以使本公开的核酸酶多肽经受多种变化，如一个或多个氨基酸插入、缺失和/或取代(保守或非保守的)，包括这样的变化基本上不改变该多肽的酶活性的情况。类似地，本发明的核酸也可以经受多种变化，如在一个或多个密码子中的一个或多个核苷酸的一个或多个取代，这样使得特定的密码子编码相同或不同的氨基酸，导致沉默变异(例如，当编码的氨基酸不被核苷酸突变改变时)或非沉默变异；序列中一个或多个核酸(或密码子)的一个或多个缺失；序列中一个或多个核酸(或密码子)的一个或多个添加或插入；和/或序列中一个或多个核酸(或密码子)的切割或一个或多个截短。与由原始核酸序列编码的多肽酶相比，核酸序列中的许多这样的变化基本上不会改变所得的编码的多肽酶的酶活性。还可以对本发明的核酸序列进行修饰以便包括一个或多个密码子，该一个或多个密码子在表达系统(例如，细菌表达系统)中提供最佳表达，同时，若希望，所述一个或多个密码子仍编码一个或多个相同的氨基酸。

本公开提供了分离的、非天然存在的或重组的核酸，这些核酸可统称为“核酸”或“多核苷酸”，其编码具有与选自由SEQ ID NO：1-13组成的组的氨基酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的多肽。本公开的核酸，包括下面描述的全部，可用于本公开多肽的重组产生(例如，表达)，典型地通过包含编码目的多肽或其片段的序列的质粒表达载体进行表达。如上所讨论，本公开多肽包括具有酶活性(例如，核酸酶活性)的多肽，这些多肽可用于清洁应用和清洁组合物中，这些清洁组合物用于清洁需要清洁和/或需要减少、去除或预防生物膜的物品或表面(例如，物品的表面)，或用于去除来自物品、表面或溶液的微生物。

在一些实施例中，本公开的多核苷酸是与所示例的多核苷酸具有指定程度的核酸同源性的多核苷酸。在一些实施例中，多核苷酸具有编码如下多肽或其活性片段的核酸序列，该多肽或其活性片段与选自由SEQ ID NO：1-13组成的组的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性。如本文所述，同源性可以通过氨基酸序列比对，例如使用如BLAST、ALIGN、或CLUSTAL等程序来确定。

在一些实施例中，本公开提供了分离的、重组的、基本上纯的、合成衍生的或非天然存在的核酸，该核酸包含编码本文所述的任何具有核酸酶活性的多肽(包括任何融合蛋白等)的核苷酸序列。本公开还提供了分离的、重组的、基本上纯的、合成衍生的或非天然存在的核酸，该核酸包含编码本文提供的任何多肽中的两个或更多个的组合的核苷酸序列。本公开提供了编码本公开的具有核酸酶活性的多肽的核酸，其中该多肽是具有核酸酶活性的成熟形式。在一些实施例中，用同源前肽序列重组表达多肽。在其他实施例中，用异源前肽序列重组表达多肽。

本文提供的核酸可以通过使用任何合适的合成、操作和/或分离技术、或其组合来产生。例如，本文提供的多核苷酸可以使用本领域技术人员熟知的标准核酸合成技术、如固相合成技术来产生。在这样的技术中，典型地合成高至50个或更多个核苷酸碱基的片段，然后连接(例如通过酶或化学连接方法)以基本上形成任何需要的连续核酸序列。还可以通过本领域已知的任何合适的方法来促进核酸的合成，该方法包括但不限于使用以下方法的化学合成：经典的亚磷酰胺方法(参见例如Beaucage等人Tetrahedron Letters[四面体快报]22：1859-69[1981])；或Matthes等人描述的方法(参见Matthes等人，EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]3：801-805[1984])，如典型地在自动合成方法中所实践的。本发明的核酸还可以通过使用自动DNA合成仪来产生。可以从各种商业来源(例如，米德兰认证试剂公司(The Midland Certified Reagent Company)、大美国基因公司(Great American GeneCompany)、操纵子技术公司(Operon Technologies Inc.)和DNA2.0)订购定制的核酸。用于合成核酸的其他技术和相关原理是本领域已知的(参见例如，Itakura等人，Ann.Rev.Biochem.[生物化学年鉴]53：323[1984]；和Itakura等人，Science[科学]198：1056[1984])。

本公开还提供了包含本文所述的至少一种多核苷酸的重组载体(例如，编码本文提供的具有核酸酶活性的多肽的多核苷酸)，包含本公开的至少一种核酸或多核苷酸的表达载体或表达盒，包含本公开的至少一种核酸或多核苷酸的分离的、基本上纯的或重组的DNA构建体，包含本公开的至少一种多核苷酸的分离的或重组的细胞，以及包含一种或多种这样的载体、核酸、表达载体、表达盒、DNA构建体、细胞、细胞培养物、或其任何组合或混合物的组合物。

在一些实施例中，本公开提供了包含至少一种载体(例如表达载体或DNA构建体)的重组细胞，该至少一种载体包含本文提供的至少一种核酸或多核苷酸。一些这样的重组细胞使用这样的至少一种载体转化或转染，尽管其他方法在本领域中是可获得且已知的。这样的细胞典型地称为宿主细胞。一些这样的细胞包含细菌细胞，包括但不限于芽孢杆菌属物种(Bacillus sp.)细胞，如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)细胞。一些这样的细胞包含真菌细胞，包括但不限于木霉属(Trichoderma)细胞，如里氏木霉(Trichoderma reesei)细胞。本公开还提供包含本公开的至少一种具有核酸酶活性的多肽的重组细胞(例如，重组宿主细胞)。

在一些实施例中，本公开提供了包含如本文所述的核酸或多核苷酸的载体。在一些实施例中，载体是表达载体或表达盒，其中编码具有核酸酶活性的多肽的多核苷酸序列可操作地连接到有效基因表达所需的一个或另外的核酸区段(例如与编码本发明的丝氨酸蛋白酶多肽的本发明的多核苷酸可操作地连接的启动子)。载体可以包括转录终止子和/或能够通过在含有抗微生物剂的培养基中生长来实现质粒感染的宿主细胞的连续培养维持的选择基因，如抗生素抗性基因。

表达载体可以衍生自质粒或病毒DNA，或在替代性的实施例中，含有这两者的元件。示例性载体包括但不限于pC194、pJH101、pE194、pHP13(参见Harwood和Cutting[编辑]，第3章，Molecular Biological Methods for Bacillus[针对芽孢杆菌的分子生物学方法]，John Wiley&Sons[约翰威利父子公司][1990]；对于枯草芽孢杆菌合适的复制质粒包括第92页列出的那些)。还参见Perego，Integrational Vectors for GeneticManipulations in Bacillus subtilis[枯草芽孢杆菌遗传操作整合载体]，在Sonenshein等人，[编辑]Bacillus subtilis and Other Gram-Positive Bacteria：Biochemistry，Physiology and Molecular Genetics[枯草芽孢杆菌和其他革兰氏阳性细菌：生物化学、生理学和分子遗传学]，American Society for Microbiology[美国微生物学会]，华盛顿(1993)，第615-624页)，以及p2JM103BBI。

为了在细胞中表达并产生目的蛋白(例如，具有核酸酶活性的多肽)，将包含编码具有核酸酶活性的多肽的多核苷酸的至少一个拷贝(并且在一些情况下包含多个拷贝)的至少一种表达载体在适合于该多肽表达的条件下转化到该细胞中。在一些实施例中，将编码具有核酸酶活性的多肽的多核苷酸序列(以及载体中包括的其他序列)整合到宿主细胞的基因组中；然而在其他实施例中，包含编码具有核酸酶活性的多肽的多核苷酸序列的质粒载体在细胞内保持为自主的染色体外元件。本公开提供了染色体外核酸元件以及整合到宿主细胞基因组中的输入性核苷酸序列。本文所述的载体可用于产生如本文提供的具有核酸酶活性的多肽。在一些实施例中，编码多肽的多核苷酸构建体存在于整合载体上，该整合载体能够将编码多肽的多核苷酸整合到宿主染色体中并且任选地在宿主染色体中扩增。整合位点的实例是本领域技术人员熟知的。在一些实施例中，编码本公开的多肽的多核苷酸的转录通过启动子来实现，该启动子是所选前体核酸酶的野生型启动子。在一些其他实施例中，启动子与前体核酸酶是异源的，但在宿主细胞中具有功能。特别地，用于细菌宿主细胞的合适的启动子的实例包括但不限于例如amyE、amyQ、amyL、pstS、sacB、pSPAC、pAprE、pVeg、pHpaII启动子，嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)生麦芽糖淀粉酶基因的启动子、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)(BAN)淀粉酶基因的启动子、枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶基因的启动子、克劳氏芽孢杆菌(B.clausii)碱性蛋白酶基因的启动子、短小芽孢杆菌(B.pumilis)木糖苷酶基因的启动子、苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)cryIIIA的启动子、和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)α-淀粉酶基因的启动子。另外的启动子包括但不限于A4启动子，以及噬菌体λPR或PL启动子，以及大肠杆菌(R.coli)lac、trp或tac启动子。

本公开的多肽可以在任何合适的微生物(包括细菌和真菌)的宿主细胞中产生。在一些实施例中，本公开的多肽可以在革兰氏阳性细菌中产生。在一些实施例中，宿主细胞是芽孢杆菌属物种、链霉菌属物种、埃希氏菌属物种、曲霉属物种(Aspergillis spp.)、木霉属物种、假单胞菌属物种、棒状杆菌属物种(Corynebacterium spp.)、酵母属物种(Saccharomyces spp.)或毕赤酵母属物种(Pichia spp.)。在一些实施例中，多肽由芽孢杆菌属物种宿主细胞产生。可用于本发明的多肽的产生的芽孢杆菌属物种宿主细胞的实例包括但不限于：地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌(B.lentus)、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、短芽孢杆菌(B.brevis)、嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌(B.alkalophilus)、凝结芽孢杆菌(B.coagulans)、环状芽孢杆菌(B.circulans)、短小芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌(B.megaterium)，以及芽孢杆菌属内的其他生物。在一些实施例中，枯草芽孢杆菌宿主细胞用于产生具有核酸酶活性的多肽。US 5,264,366和4,760,025(RE 34,606)描述了可以用于产生本公开的多肽的多种芽孢杆菌属宿主菌株，尽管可以使用其他合适的菌株。

可以用于产生本公开多肽的几种细菌菌株包括非重组(即野生型)芽孢杆菌属物种菌株，以及天然存在的菌株和/或重组菌株的变体。在一些实施例中，宿主菌株是重组菌株，其中编码目的多肽的多核苷酸已经被引入宿主中。在一些实施例中，宿主菌株是枯草芽孢杆菌宿主菌株，特别是重组枯草芽孢杆菌宿主菌株。许多枯草芽孢杆菌菌株是已知的，包括但不限于例如1A6(ATCC 39085)、168(1A01)、SB19、W23、Ts85、B637、PB1753至PB1758、PB3360、JH642、1A243(ATCC 39,087)、ATCC 21332、ATCC 6051、MI113、DE100(ATCC 39,094)、GX4931、PBT 110、和PEP 211菌株(参见例如Hoch等人，Genetics[遗传学]73：215-228[1973]；还参见美国专利号4,450,235和4,302,544，以及EP 0134048，其各自通过援引以其全文并入)。使用枯草芽孢杆菌作为表达宿主细胞是本领域熟知的(参见例如，Palva等人，Gene[基因]19：81-87[1982]；Fahnestock和Fischer，J.Bacteriol.[细菌学杂志]，165：796-804[1986]；和Wang等人，Gene[基因]69：39-47[1988])。

在一些实施例中，芽孢杆菌属宿主细胞是包括以下基因中的至少一个的突变或缺失的芽孢杆菌属物种：degU、degS、degR和degQ。在一些实施例中，突变是在degU基因中，并且在一些实施例中，突变为degU(Hy)32(参见例如，Msadek等人，J.Bacteriol.[细菌学杂志]172：824-834[1990]；以及Olmos等人，Mol.Gen.Genet.[分子和普通遗传学]253：562-567[1997])。在一些实施例中，芽孢杆菌属宿主在以下中包含突变或缺失：scoC4(参见例如，Caldwell等人，J.Bacteriol.[细菌学杂志]183：7329-7340[2001])；spoIIE(参见例如，Arigoni等人，Mol.Microbiol.[分子微生物学]31：1407-1415[1999])；和/或oppA或opp操纵子的其他基因(参见例如，Perego等人，Mol.Microbiol.[分子微生物学]5：173-185[1991])。实际上，预期引起与oppA基因中的突变相同的表型的opp操纵子中的任何突变将可用于经改变的芽孢杆菌属菌株的一些实施例中。在一些实施例中，这些突变单独发生，而在其他实施例中，存在突变的组合。在一些实施例中，可以用于产生本发明的核酸酶多肽的经改变的芽孢杆菌属宿主细胞株是已经包括上述基因中的一个或多个的突变的芽孢杆菌属宿主菌株。另外，可使用包含内源蛋白酶基因的一个或多个突变和/或缺失的芽孢杆菌属物种宿主细胞。在一些实施例中，芽孢杆菌属宿主细胞包含aprE和nprE基因的缺失。在其他实施例中，芽孢杆菌属物种宿主细胞包含5个蛋白酶基因的缺失，而在其他实施例中，芽孢杆菌属物种宿主细胞包含9个蛋白酶基因的缺失(参见例如，US 2005/0202535，通过援引并入本文)。

使用本领域已知的任何合适的方法，用编码本发明的至少一种核酸酶多肽的至少一种核酸转化宿主细胞。利用质粒DNA构建体或载体将核酸(例如DNA)引入芽孢杆菌属细胞或大肠杆菌细胞并且将这样的质粒DNA构建体或载体转化到这样的细胞中的方法是熟知的。在一些实施例中，质粒随后从大肠杆菌细胞中分离并且转化到芽孢杆菌属细胞中。然而，使用介入微生物如大肠杆菌不是必需的，并且在一些实施例中，将DNA构建体或载体直接引入芽孢杆菌属宿主中。

用于将本发明的核酸序列引入芽孢杆菌属细胞中的合适方法包括描述于例如以下中的那些：Ferrari等人，“Genetics[遗传学]”，在Harwood等人[编辑]，Bacillus[芽孢杆菌属]，Plenum Publishing Corp.[普莱南出版公司][1989]，第57-72页；Saunders等人，J.Bacteriol.[细菌学杂志]157：718-726[1984]；Hoch等人，J.Bacteriol.[细菌学杂志]93：1925-1937[1967]；Mann等人，Current Microbiol.[现代微生物学]13：131-135[1986]；Holubova，Folia Microbiol.[微生物学大观]30：97[1985]；Chang等人，Mol.Gen.Genet.[分子和普通遗传学]168：11-115[1979]；Vorobjeva等人，FEMS Microbiol.Lett.[FEMS微生物学快报]7：261-263[1980]；Smith等人，Appl.Env.Microbiol.[应用与环境微生物]51：634[1986]；Fisher等人，Arch.Microbiol.[微生物学文献集]139：213-217[1981]；以及McDonald，J.Gen.Microbiol.[普通微生物学杂志]130：203[1984])。实际上，包括原生质体转化和转染、转导和原生质体融合在内的转化方法是熟知的并且适合用于本发明。本领域已知的用于转化芽孢杆菌属细胞的方法包括例如质粒标记拯救转化的方法，其涉及通过携带部分同源的驻留质粒的感受态细胞摄取供体质粒(参见，Contente等人，Plasmid[质粒]2：555-571[1979]；Haima等人，Mol.Gen.Genet.[分子和普通遗传学]223：185-191[1990]；Weinrauch等人，J.Bacteriol.[细菌学杂志]154：1077-1087[1983]；以及Weinrauch等人，J.Bacteriol.[细菌学杂志]169：1205-1211[1987])。在该方法中，输入性供体质粒在模拟染色体转化的过程中与驻留的“辅助”质粒的同源区重组。

除了通常使用的方法之外，在一些实施例中，用包含编码本发明的核酸酶多肽的核酸的DNA构建体或载体直接转化宿主细胞(即，在引入宿主细胞之前，不使用中间细胞扩增或以其他方式处理DNA构建体或载体)。将本发明的DNA构建体或载体引入宿主细胞包括本领域已知的将核酸序列(例如DNA序列)引入宿主细胞而不插入宿主基因组的那些物理和化学方法。这样的方法包括但不限于氯化钙沉淀、电穿孔、裸DNA、脂质体等。在另外的实施例中，DNA构建体或载体与质粒一起共转化而不插入质粒。在另外的实施例中，通过本领域已知的方法从经改变的芽孢杆菌属菌株中缺失选择标记(参见，Stahl等人，J.Bacteriol.[细菌学杂志]158：411-418[1984]；以及Palmeros等人，Gene[基因]247：255-264[2000])。

在一些实施例中，将本发明的转化细胞在常规营养培养基中培养。合适的特别培养条件，如温度、pH等是本领域技术人员已知的，并且详细描述于科学文献中。在一些实施例中，本发明提供包含本公开的至少一种核酸酶多肽或至少一种核酸的培养物(例如细胞培养物)。

在一些实施例中，将用编码本公开的至少一种核酸酶多肽的至少一种多核苷酸序列转化的宿主细胞在允许本发明的核酸酶表达的条件下在合适的营养培养基中培养，其后从培养物中回收所得的核酸酶。在一些实施例中，通过常规程序从培养基中回收由细胞产生的核酸酶，这些常规程序包括但不限于例如通过离心或过滤从培养基中分离宿主细胞、借助于盐(例如硫酸铵)沉淀上清液或滤液的蛋白质组分、层析法纯化(例如离子交换、凝胶过滤、亲和等)。

在一些实施例中，由重组宿主细胞产生的核酸酶多肽被分泌到培养基中。编码纯化促进结构域的核酸序列可以用于促进蛋白质的纯化。包含编码核酸酶多肽的多核苷酸序列的载体或DNA构建体可以进一步包含编码促进核酸酶多肽纯化的纯化促进结构域的核酸序列(参见例如，Kroll等人，DNA Cell Biol.[DNA细胞生物学]12：441-53[1993])。这样的纯化促进结构域包括但不限于例如金属螯合肽，如允许在固定化的金属上纯化的组氨酸-色氨酸模块(参见Porath，Protein Expr.Purif.[蛋白质表达与纯化]3：263-281[1992])、允许在固定化的免疫球蛋白上纯化的蛋白A结构域、以及在FLAGS延伸/亲和纯化系统中采用的结构域。还发现在纯化结构域与异源蛋白质之间包括可切割的接头序列如因子XA或肠激酶(例如，可获自加利福尼亚州圣地亚哥的英杰公司(Invitrogen)的序列)可用于促进纯化。

用于检测和测量酶(如本发明的核酸酶多肽)的酶活性的测定法是熟知的。用于检测和测量核酸酶的活性的多种测定法也是本领域普通技术人员已知的。特别地，测定可用于测量核酸酶活性，这些测定例如实例中所述的那些，或者例如通过用凝胶电泳监测已知大小的DNA片段的水解并用溴化乙锭或其他染色剂可视化，或者例如通过使用商业试剂盒(例如abcam DNA酶I测定试剂盒)，或者例如通过使用公开的核酸酶活性测定方法(例如，Sinicropi，D.，Baker，D.L.，Prince，W.S.，Shiffer，K.，Shak，S.(1994)Colorimetricdetermination of DNase I activity with a DNA-methyl green substrate[用DNA甲基绿底物比色测定DNA酶I活性].Analytica Biochemistry[分析生物化学]222：351-358；Nass，K，Frenkel，G.D.(1978)Adenovirus-induced inhibition of cellular DNAse[腺病毒诱导的细胞DNA酶抑制].Joumal of Virology[病毒学期刊]26：540-543.；Shak，S.，Capon，D.J.，Hellmiss，R.，Marsters，S.A.，Baker，C.L.(1990)Recombinant human DNAseI reduces the viscosity of cystic fibrosis sputum[重组人DNA酶I降低囊性纤维化唾液的粘度]，Proceedings of the National Academy of Sciences USA[美国科学院院报]87：9188-9192；Nadano，D.，Yasuda，T.，Kishi，K.(1991)Purification andcharacterization of genetically polymorphic deoxyribonuclease I from humankidney[人肾遗传多态性脱氧核糖核酸酶I的纯化和表征].Journal of Biochemistry[生物化学杂志]110：321-323)。

可以使用各种方法来确定宿主细胞中成熟核酸酶的产生水平。这样的方法包括但不限于例如使用对核酸酶具有特异性的多克隆或单克隆抗体的方法。示例性方法包括但不限于酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、荧光免疫测定(FIA)和荧光激活细胞分选术(FACS)。这些和其他测定法是本领域熟知的(参见例如，Maddox等人，J.Exp.Med.[实验医学杂志]158：1211[1983])。

在一些其他实施例中，本发明提供了用于制备或产生本公开的成熟核酸酶多肽的方法。成熟的核酸酶多肽不包括信号肽或前肽序列。一些方法包括在重组细菌宿主细胞(例如像芽孢杆菌属物种细胞(例如，枯草芽孢杆菌细胞))中制备或产生本公开的核酸酶多肽。在一些实施例中，本公开提供了产生本发明的核酸酶多肽的方法，该方法包括在有利于产生该核酸酶多肽的条件下培养包含重组表达载体的重组宿主细胞，该重组表达载体包含编码本公开的核酸酶多肽(例如，与SEQ ID NO：1-13的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的多肽)的核酸。一些这样的方法进一步包括从培养物中回收核酸酶多肽。

在一些实施例中，本公开提供了产生本发明的核酸酶多肽的方法，这些方法包括：(a)将重组表达载体引入细胞群体(例如，细菌细胞，如枯草芽孢杆菌细胞)中，该重组表达载体包含编码本公开的核酸酶多肽(例如，与SEQ ID NO：1-13的氨基酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的多肽)的核酸；和(b)在有利于产生由该表达载体编码的核酸酶多肽的条件下在培养基中培养这些细胞。一些这样的方法进一步包括：(c)从这些细胞或从该培养基中分离该核酸酶多肽。

方法

在一个实施例中，本发明提供了用于预防、减少或去除生物膜的方法，该方法包括使生物膜与包含具有核酸酶活性的多肽的清洁组合物接触，其中该具有核酸酶活性的多肽是与选自由SEQ ID NO：1至13组成的组的酶具有至少80％序列同一性的多肽。所述生物膜在纺织品或硬表面上。硬表面选自由衣物洗涤机器表面、餐具表面、或餐具清洗机表面组成的组。清洁组合物包含具有核酸酶活性的多肽，该多肽的量选自0.001至10,000mg/L、或0.001至2000mg/L、或0.01至5000mg/L、或0.01至2000mg/L、或0.01至1300mg/L、或0.1至5000mg/L、或0.1至2000mg/L、或0.1至1300mg/L、或1至5000mg/L、或1至1300mg/L、或1至500mg/L、或10至5000mg/L、或10至1300mg/L、或10至500mg/L。清洁组合物是衣物洗涤组合物。

在一个实施例中，本发明还是用于预防、减少或去除纺织品或硬表面的生物膜的方法，该方法包括：(i)使纺织品或表面与具有核酸酶活性的多肽或包含具有核酸酶活性的多肽的组合物接触；以及(ii)任选地，冲洗该纺织品或表面，其中该具有核酸酶活性的多肽是与选自由SEQ ID NO：1至13组成的组具有至少80％序列同一性的多肽。纺织品包含在纺织品的表面上的生物膜。从纺织品减少或去除生物膜。与使纺织品与具有核酸酶活性的多肽或包含具有核酸酶活性的多肽的组合物接触之前存在于纺织品上的生物膜的量相比，从制品减少或去除的生物膜的量选自由以下组成的组：至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更高。使用实例2的方法通过用结晶紫染色来测量生物膜。另外，接触步骤包括使用具有核酸酶活性的多肽，该多肽的量选自由以下组成的组：0.002至10,000mg蛋白质、0.005至5000mg蛋白质、0.01至5000mg蛋白质、0.05至5000mg蛋白质、0.05至1300mg蛋白质、0.1至1300mg蛋白质、0.1至500mg蛋白质、0.1至100mg蛋白质/升洗涤液，或该量为至少0.002ppm活性核酸酶。清洁组合物的pH为pH 7.4至pH 11.5、或pH 7.4至pH 11.0、或pH 7.5至pH 11.5。接触步骤在洗涤液中发生，并且接触步骤发生的时间长度选自由以下组成的组：约5分钟至约10天、约5分钟至约400分钟、约5分钟至约300分钟之间、约5分钟至约250分钟之间、约5分钟至约200分钟之间、约5分钟至约150分钟之间、约5分钟至约100分钟之间、约5分钟至约50分钟之间、约5分钟至约30分钟之间。接触步骤在选自由以下组成的组的温度发生：约10°至60℃、15°至约55℃之间、20°至约50℃之间以及20°至约45℃之间。

在一个实施例中，本发明是用于预防、减少或去除生物膜的方法，该方法包括使生物膜与包含具有核酸酶活性的多肽以及至少一种另外的酶的清洁组合物接触，该至少一种另外的酶选自由以下组成的组：DNA酶、酰基转移酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、α-半乳糖苷酶、阿拉伯糖苷酶、芳基酯酶、β-半乳糖苷酶、角叉菜胶酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、软骨素酶、角质酶、内切-β-1，4-葡聚糖酶、内切-β-甘露聚糖酶、酯酶、外切-甘露聚糖酶、半乳聚糖酶、葡糖淀粉酶、半纤维素酶、透明质酸酶、角蛋白酶、漆酶、乳糖酶、木质酶、脂肪酶、脂加氧酶、溶菌酶、甘露聚糖酶、金属蛋白酶、核酸酶、氧化酶、氧化还原酶、果胶酸裂合酶、果胶乙酰酯酶、果胶酶、戊聚糖酶、过氧化物酶、酚氧化酶、磷酸酶、磷脂酶、植酸酶、聚半乳糖醛酸酶、聚酯酶、蛋白酶、支链淀粉酶、还原酶、鼠李糖半乳糖醛酸酶、β-葡聚糖酶、鞣酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖乙酰酯酶、木聚糖酶、木葡聚糖酶、木糖苷酶、及其任何组合或混合物。

本发明是用于预防、减少或去除生物膜的方法，该方法包括使生物膜与包含具有核酸酶活性的多肽和溶菌酶的清洁组合物接触。本发明还是洗涤剂组合物，其包含：(i)具有核酸酶活性的多肽和(ii)溶菌酶。

组合物

包含具有核酸酶活性的多肽的组合物进一步包含表面活性剂。表面活性剂选自由以下组成的组：非离子表面活性剂、两性表面活性剂、半极性表面活性剂、阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、兼性离子表面活性剂、及其组合和混合物。组合物是洗涤剂组合物。组合物可以包含选自由以下组成的组的一种或多种另外的酶：酰基转移酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、α-半乳糖苷酶、阿拉伯糖苷酶、芳基酯酶、β-半乳糖苷酶、角叉菜胶酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、软骨素酶、角质酶、内切-β-1，4-葡聚糖酶、内切-β-甘露聚糖酶、酯酶、外切-甘露聚糖酶、半乳聚糖酶、葡糖淀粉酶、半纤维素酶、透明质酸酶、角蛋白酶、漆酶、乳糖酶、木质酶、脂肪酶、脂加氧酶、溶菌酶、甘露聚糖酶、金属蛋白酶、氧化酶、氧化还原酶、果胶酸裂合酶、果胶乙酰酯酶、果胶酶、戊聚糖酶、过氧化物酶、酚氧化酶、磷酸酶、磷脂酶、植酸酶、聚半乳糖醛酸酶、聚酯酶、蛋白酶、支链淀粉酶、还原酶、鼠李糖半乳糖醛酸酶、β-葡聚糖酶、鞣酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖乙酰酯酶、木聚糖酶、木葡聚糖酶、木糖苷酶、及其任何组合或混合物。另外，接触步骤在清洗机器或餐具清洗机中发生。

在一个实施例中，本发明是洗涤剂组合物，其包含：(i)具有核酸酶活性的多肽；(ii)具有蛋白酶活性的多肽；(iii)至少一种另外的多肽，其中该至少一种另外的多肽是选自以下的酶：DNA酶、酰基转移酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、α-半乳糖苷酶、阿拉伯糖苷酶、芳基酯酶、β-半乳糖苷酶、角叉菜胶酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、软骨素酶、角质酶、内切-β-1，4-葡聚糖酶、内切-β-甘露聚糖酶、酯酶、外切-甘露聚糖酶、半乳聚糖酶、葡糖淀粉酶、半纤维素酶、透明质酸酶、角蛋白酶、漆酶、乳糖酶、木质酶、脂肪酶、脂加氧酶、溶菌酶、甘露聚糖酶、金属蛋白酶、核酸酶、氧化酶、氧化还原酶、果胶酸裂合酶、果胶乙酰酯酶、果胶酶、戊聚糖酶、过氧化物酶、酚氧化酶、磷酸酶、磷脂酶、植酸酶、聚半乳糖醛酸酶、聚酯酶、蛋白酶、支链淀粉酶、还原酶、鼠李糖半乳糖醛酸酶、β-葡聚糖酶、鞣酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖乙酰酯酶、木聚糖酶、木葡聚糖酶、木糖苷酶、及其任何组合或混合物；以及(iv)表面活性剂，其中该具有核酸酶活性的多肽是与选自由SEQ ID NO：1至13组成的组具有至少80％序列同一性的多肽。表面活性剂选自由以下组成的组：非离子表面活性剂、两性表面活性剂、半极性表面活性剂、阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、兼性离子表面活性剂、及其组合和混合物。组合物进一步包含按组合物的重量计约0.1％至约60％、约1％至约50％、或约5％至约40％的表面活性剂。组合物进一步包含选自由以下组成的组的一种或多种辅助材料：助洗剂、漂白剂、漂白活化剂、漂白催化剂、其他酶、酶稳定系统、螯合剂、光学增亮剂、污垢释放聚合物、染料转移剂、分散剂、泡沫抑制剂、染料、香料、着色剂、填料盐、助水溶剂、光活化剂、荧光剂、织物调理剂、可水解表面活性剂、防腐剂、抗氧化剂、抗收缩剂、抗皱剂、杀菌剂、杀真菌剂、颜色点缀剂、银护理剂、抗晦暗剂和/或抗腐蚀剂、碱性来源、增溶剂、载剂、加工助剂、颜料和pH控制剂。所述核酸酶是DNA酶。

臭味减少

在一个实施例中，本发明是用于减少与纺织品或硬表面相关的臭味的方法，该方法包括：(i)使纺织品或硬表面与具有核酸酶活性的多肽或包含具有核酸酶活性的多肽的组合物接触；以及(ii)任选地，冲洗该纺织品或表面，其中该具有核酸酶活性的多肽是与选自由SEQ ID NO：1至13组成的组具有至少80％序列同一性的多肽。纺织品包含在纺织品或硬表面的表面上的生物膜。另外，从纺织品减少或去除生物膜。另外，与使纺织品或硬表面与具有核酸酶活性的多肽或包含具有核酸酶活性的多肽的组合物接触之前存在的臭味的量相比，该臭味减少至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更高。接触步骤包括使用具有核酸酶活性的多肽，该多肽的量选自由以下组成的组：0.002至10,000mg蛋白质、0.005至5000mg蛋白质、0.01至5000mg蛋白质、0.05至5000mg蛋白质、0.05至1300mg蛋白质、0.1至1300mg蛋白质、0.1至500mg蛋白质、0.1至100mg蛋白质/升洗涤液，或该量为至少0.002ppm活性核酸酶。具有核酸酶活性的多肽是与选自由SEQ ID NO：1至13组成的组具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽。接触步骤在洗涤液中发生。另外，接触步骤在选自由以下组成的组的温度发生：约10°至60℃、15°至约55℃之间、20°至约50℃之间以及20°至约45℃之间。另外，包含具有核酸酶活性的多肽的组合物进一步包含表面活性剂。表面活性剂选自由以下组成的组：非离子表面活性剂、两性表面活性剂、半极性表面活性剂、阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、兼性离子表面活性剂、及其组合和混合物。所述组合物是洗涤剂组合物。接触步骤进一步包括使纺织品与一种或多种另外的酶接触，该一种或多种另外的酶选自由以下组成的组：酰基转移酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、α-半乳糖苷酶、阿拉伯糖苷酶、芳基酯酶、β-半乳糖苷酶、角叉菜胶酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、软骨素酶、角质酶、内切-β-1，4-葡聚糖酶、内切-β-甘露聚糖酶、酯酶、外切-甘露聚糖酶、半乳聚糖酶、葡糖淀粉酶、半纤维素酶、透明质酸酶、角蛋白酶、漆酶、乳糖酶、木质酶、脂肪酶、脂加氧酶、溶菌酶、甘露聚糖酶、金属蛋白酶、氧化酶、氧化还原酶、果胶酸裂合酶、果胶乙酰酯酶、果胶酶、戊聚糖酶、过氧化物酶、酚氧化酶、磷酸酶、磷脂酶、植酸酶、聚半乳糖醛酸酶、聚酯酶、蛋白酶、支链淀粉酶、还原酶、鼠李糖半乳糖醛酸酶、β-葡聚糖酶、鞣酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖乙酰酯酶、木聚糖酶、木葡聚糖酶、木糖苷酶、及其任何组合或混合物。另外，接触步骤在清洗机器或餐具清洗机中发生。

在一个实施例中，本发明是具有核酸酶活性的分离的多肽或其活性片段，其中该多肽包含与选自由SEQ ID NO：1至13组成的组的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。

清洁方法

本文提供的多肽、组合物和方法可用于需要预防、减少或去除生物膜的广泛应用中，如家用清洁，包括清洗机器、餐具清洗机和家用表面。多肽、组合物和方法还应用于处理医学和牙科生物膜中，包括但不限于牙齿上、肺部感染、导管和植入的医疗设备上、隐形眼镜上、医疗器械清洁中、和伤口愈合中的斑块。本文提供的多肽、组合物和方法还可用于处理各种工业环境中的生物污垢，包括但不限于油气回收、水处理设施、海洋设备、动物护理环境、和食品保存中的生物污垢。

实施例涉及对纺织品进行衣物洗涤的方法，其中该方法包括使纺织品与具有核酸酶活性的多肽或包含具有核酸酶活性的多肽的组合物接触，持续足以预防、减少或去除该纺织品的生物膜的时间长度，以及任选地冲洗该纺织品。

实施例涉及用于清洁制品的方法，其中该方法包括使制品与具有核酸酶活性的多肽或包含具有核酸酶活性的多肽的组合物在足以减少或去除该制品的生物膜的条件下接触，以及任选地冲洗该制品。

在另一实施例中，生物膜的预防或减少包括纺织品或硬表面上的生物膜的形成、生长或增殖的减少。在一个实施例中，纺织品或硬表面上的生物膜的形成、生长或增殖的减少可以通过使用下文实例3、24和5中提供的方法或本领域中另一种合适的方法在合适的时间段内跟踪该生物膜的量的变化来测量。例如，相对于未处理的硬表面或纺织品的情况，生物膜形成或生长可以以从1％至约99％范围内的量被抑制。相对于未处理的硬表面或纺织品上的生物膜形成，生物膜形成可被抑制至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、或至少约95％。在另一实施例中，与未处理的表面的情况相比，表面上的生物膜的形成可在多个衣物洗涤周期(例如，1、2、3、4、5或更多个周期)内延迟。

可以在清洗机器或手动清洗桶(例如，用于手洗)中使纺织品或表面与多肽或包含具有核酸酶活性的多肽的组合物接触。在一个实施例中，在洗涤液中使纺织品或表面与具有核酸酶活性的多肽或包含具有核酸酶活性的肽的组合物接触。在另一实施例中，将含有具有核酸酶活性的多肽的溶液与硬表面一起孵育或流过该硬表面，如通过将该溶液泵送通过管子或管道或通过用该溶液填充贮器。

用于在本文的方法和组合物中使用的核酸酶多肽包括任何核酸酶多肽。如本文所用，“同源基因”是指来自不同的、但是通常相关的物种的基因对，这些基因彼此对应并且彼此相同或非常相似。该术语涵盖通过物种形成(即，新物种的发育)分离的基因(例如，直系同源基因)以及通过遗传重复分离的基因(例如，旁系同源基因)。如本文所用，术语“变体多肽”是指包含如下氨基酸序列的多肽，该氨基酸序列与亲本多肽或参考多肽(包括但不限于野生型多肽)的氨基酸序列的区别在于至少一个氨基酸残基。

如本文所用，“芽孢杆菌属”包括如本领域技术人员已知的“芽孢杆菌”属内的所有物种，包括但不限于枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、短芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、耐盐芽孢杆菌(B.halodurans)、巨大芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌(B.lautus)和苏云金芽孢杆菌。应认识到，芽孢杆菌属不断进行分类学重组。因此，该属旨在包括已重新分类的物种，包括但不限于如嗜热脂肪芽孢杆菌(现在称为“嗜热脂肪土芽孢杆菌(Geobacillusstearothermophilus)”)的生物。在氧存在下的抗性内生孢子的产生被认为是芽孢杆菌属的定义性特征，尽管该特征还适用于最近命名的脂环酸芽孢杆菌属(Alicyclobacillus)、双芽孢杆菌属(Amphibacillus)、硫胺素芽孢杆菌属(Aneurinibacillus)、厌氧芽孢杆菌属(Anoxybacillus)、短芽孢杆菌属(Brevibacillus)、线性杆菌属(Filobacillus)、薄壁芽孢杆菌属(Gracilibacillus)、喜盐芽孢杆菌属(Halobacillus)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、需盐芽孢杆菌属(Salibacillus)、耐热芽孢杆菌属(Thermobacillus)、脲芽孢杆菌属(Ureibacillus)和枝芽孢杆菌属(Virgibacillus)。

如本文所用，“核酸酶活性”是指展现出水解DNA主链中的磷酸二酯键的切割能力的蛋白质或多肽。测量核酸酶活性的方法是已知的，并且包括本文提供的那些。

如本文所用，“％同一性或同一性百分比”是指序列相似性。可以使用本领域已知的标准技术确定同一性百分比(参见例如，Smith和Waterman，Adv.Appl.Math.[应用数学进展]2：482[1981]；Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48：443[1970]；Pearson和Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]85：2444[1988]；威斯康星遗传学软件包(Wisconsin Genetics Software Package)(威斯康星州麦迪逊市的遗传学电脑集团(Genetics Computer Group，Madison，WI))中的软件程序，如GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA；以及Devereux等人，Nucl.Acid Res.[核酸研究]12：387-395[1984])。有用的算法的一个实例是PILEUP。PILEUP使用渐进的、两两比对创建了来自一组相关序列的多重序列比对。它还可以绘制显示用于创建该比对的聚类关系的树。PILEUP使用Feng和Doolittle的渐进比对方法的简化(参见Feng和Doolittle，J.Mol.Evol.[分子进化杂志]35：351-360[1987])。该方法类似于Higgins和Sharp所述的方法(参见，Higgins和Sharp，CABIOS[生物科学中的计算机应用]5：151-153[1989])。有用的PILEUP参数包括为3.00的默认空位权重，为0.10的默认空位长度权重，以及加权的结束空位。其他有用的算法是由Altschul等人描述的BLAST算法(参见，Altschul等人，J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]215：403-410[1990]；以及Karlin和Altschul，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]90：5873-5787[1993])。BLAST程序使用几个搜索参数，其中大部分被设置为默认值。

如本文所用，“同源蛋白质”或“同源蛋白酶”是指在一级、二级和/或三级结构中具有不同相似性的蛋白质。当比对蛋白质时，蛋白质同源性可指线性氨基酸序列的相似性。可以通过氨基酸序列比对来确定同源性，例如使用如BLAST、MUSCLE或CLUSTAL的程序。蛋白质序列的同源搜索可使用来自NCBI BLAST的BLASTP和PSI-BLAST使用0.001的阈值(E值截止值)进行。(Altschul等人，“Gapped BLAST and PSI BLAST a new generaion of proteindatabase seatoh programs”[空位BLAST和PSI BLAST：新一代蛋白质数据库搜索程序]，Nucleic Acids Res[核酸研究]，第1组；25(17)：3389-402(1997))。BLAST程序使用几个搜索参数，其中大部分被设置为默认值。NCBI BLAST算法按照生物相似性找到最相关的序列，但是不推荐用于少于20个残基的查询序列(Altschul等人，Nucleic Acids Res[核酸研究]，25：3389-3402，1997和Schaffer等人，Nucleic Acids Res[核酸研究]，29：2994-3005，2001)。用于核酸序列搜索的示例性默认BLAST参数包括：相邻字长阈值＝11；E值截止值＝10；评分矩阵(Scoring Matrix)＝NUC.3.1(匹配＝1，错配＝-3)；空位开放＝5；以及空位延伸＝2。用于氨基酸序列搜索的示例性默认BLAST参数包括：字长＝3；E值截止值＝10；评分矩阵＝BLOSUM62；空位开放＝11；以及空位延伸＝1。使用该信息，可以将蛋白质序列分组和/或从中构建系统发生树。可以在如Vector NTI Advance套件等程序中输入氨基酸序列，并且可以使用邻接(Neighbor Joining(NJ))法创建引导树(Saitou和Nei，Mol Biol Evol[分子生物学与进化]，4：406-425，1987)。可以使用针对序列距离的Kimura校正并且忽略具有空位的位置来计算树结构。程序如AlignX可以在系统发生树上显示的分子名称之后的括号内显示计算的距离值。

氨基酸序列同一性百分比(％)值由匹配相同残基的数目除以“参考”序列的残基总数(包括由程序为最佳/最大比对创建的任何空位)来确定。如果序列与SEQ ID NO：A90％同一，则SEQ ID NO：A是“参考”序列。BLAST算法将“参考”序列称为“查询”序列。

CLUSTAL W算法是序列比对算法的另一个实例(参见Thompson等人，NucleicAcids Res[核酸研究]22：4673-4680，1994)。CLUSTAL W算法的默认参数包括：空位开放罚分＝10.0；空位延伸罚分＝0.05；蛋白质权重矩阵＝BLOSUM系列；DNA权重矩阵＝IUB；延迟发散序列％＝40；空位分隔距离＝8；DNA转换权重＝0.50；列表亲水残基＝GPSNDQEKR；使用负性矩阵＝关；切换特殊残基罚分＝开；切换亲水罚分＝开；以及切换结束空位分隔罚分＝关。在CLUSTAL算法中，包括在任一末端发生的缺失。例如，在500个氨基酸的多肽的任一末端(或多肽内)具有五个氨基酸缺失的变体相对于“参考”多肽具有99％(495/500个相同的残基×100)的百分比序列同一性。这样的变体将由与该多肽具有“至少99％序列同一性”的变体所涵盖。

还提供了用于在本文提供的方法中使用的洗涤剂组合物。如本文所用，关于旨在用于在清洁污染的物体或肮脏物体(包括特定纺织品或非纺织品物体或物品)的清洗介质(例如，洗涤液)中使用的组合物，使用术语“洗涤剂组合物”或“洗涤剂配制品”。本发明的这样的组合物不限于任何特定的洗涤剂组合物或配制品。实际上，在一些实施例中，本发明的洗涤剂包含至少一种核酸酶多肽，另外还包含一种或多种表面活性剂、一种或多种转移酶、水解酶、氧化还原酶、助洗剂(例如，助洗剂盐)、漂白剂、漂白活化剂、上蓝剂、荧光染料、结块抑制剂、掩蔽剂、酶活化剂、抗氧化剂和/或增溶剂。在一些情况下，助洗剂盐是硅酸盐和磷酸盐的混合物，优选具有比磷酸盐(例如，三聚磷酸钠)更多的硅酸盐(例如，偏硅酸钠)。本发明的一些组合物，诸如但不限于清洁组合物或洗涤剂组合物，不含任何磷酸盐(例如，磷酸盐或磷酸盐助洗剂)。

本发明的洗涤剂或清洁组合物有利地用于例如衣物洗涤应用、硬表面清洁、餐具洗涤应用、以及装饰品应用(诸如假牙、牙齿、头发和皮肤清洁)。另外，由于在较低温度溶液中具有增加的有效性的独特优点，本发明的酶理想地适合于衣物洗涤应用。此外，本发明的酶可用于颗粒和液体组合物。

酶组分重量是基于总的活性蛋白。除非另有指示，否则所有百分比和比率均按重量计算。除非另有指示，否则所有百分比和比率均基于总组合物计算。在衣物洗涤剂组合物中，酶水平以ppm表示，其等于mg活性蛋白/kg洗涤剂组合物。

示例性表面活性剂包括但不限于十二烷基苯磺酸钠、C12-14链烷醇聚醚-7、C12-15链烷醇聚醚-7、C12-15链烷醇聚醚硫酸钠、C14-15链烷醇聚醚-4、月桂醇聚醚硫酸酯钠(例如，Steol CS-370)、氢化椰油酸钠、C12乙氧基化物(Alfonic 1012-6、Hetoxol LA7、Hetoxol LA4)、烷基苯磺酸钠(例如，Nacconol 90G)、及其组合和混合物。阴离子表面活性剂包括但不限于直链烷基苯磺酸盐(LAS)、α-烯烃磺酸盐(AOS)、烷基硫酸盐(脂肪醇硫酸盐)(AS)、醇乙氧基硫酸盐(AEOS或AES)、仲链烷磺酸盐(SAS)、α-磺基脂肪酸甲酯、烷基-或烯基琥珀酸、或皂。非离子表面活性剂包括但不限于醇乙氧基化物(AEO或AE)、羧化醇乙氧基化物、壬基苯酚乙氧基化物、烷基多糖苷、烷基二甲基胺氧化物、乙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺、脂肪酸单乙醇酰胺、多羟基烷基脂肪酸酰胺(例如，如WO 92/06154中所述)、脂肪酸的聚氧乙烯酯、聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯(例如，TWEEN)、聚氧乙烯醇、聚氧乙烯异醇、聚氧乙烯醚(例如，TRITON和BRIJ)、聚氧乙烯酯、聚氧乙烯-对-叔辛基苯酚或辛基苯基-环氧乙烷缩合物(例如，NONIDET P40)、环氧乙烷与脂肪醇的缩合物(例如，LUBROL)、聚氧乙烯壬基苯酚、聚亚烷基二醇(SYNPERONIC F108)、糖基表面活性剂(例如，吡喃葡萄糖苷、硫代吡喃葡萄糖苷)、及其组合和混合物。

在一些实施例中，本文提供的组合物包含与蛋白酶组合的、具有核酸酶活性的多肽。用于在本公开的组合物中与核酸酶组合的蛋白酶包括具有蛋白酶活性的任何多肽。在一个实施例中，另外的蛋白酶是丝氨酸蛋白酶。在另一实施例中，另外的蛋白酶是另外的金属蛋白酶、真菌枯草杆菌蛋白酶、或碱性微生物蛋白酶或胰蛋白酶样蛋白酶。合适的另外的蛋白酶包括动物、植物或微生物来源的那些。在一些实施例中，蛋白酶是微生物蛋白酶。在其他实施例中，蛋白酶是化学或遗传修饰的突变体。在另一实施例中，蛋白酶是枯草杆菌蛋白酶样蛋白酶或胰蛋白酶样蛋白酶。在其他实施例中，另外的蛋白酶不含有与变体交叉反应的表位，如通过抗体结合或本领域可用的其他测定测量的。示例性枯草杆菌蛋白酶包括衍生自例如芽孢杆菌属(例如，BPN′、嘉士伯(Carlsberg)、枯草杆菌蛋白酶309、枯草杆菌蛋白酶147、和枯草杆菌蛋白酶168)或真菌来源的那些，例如像美国专利号8,362,222中描述的那些。示例性另外的蛋白酶包括但不限于WO 92/21760、WO 95/23221、WO 2008/010925、WO 09/149200、WO 09/149144、WO 09/149145、WO 10/056640、WO 10/056653、WO 2010/0566356、WO 11/072099、WO 2011/13022、WO11/140364、WO 12/151534、WO 2015/038792、WO2015/089447、WO 2015/089441、WO 2017/215925、美国公开号2008/0090747、US 5,801,039、US 5,340,735、US 5,500,364、US 5,855,625、RE 34,606、US 5,955,340、US 5,700,676、US 6,312,936、US 6,482,628、US 8,530,219、美国临时申请号62/180673和62/161077、以及PCT申请号PCT/US2015/021813、PCT/US2015/055900、PCT/US2015/057497、PCT/US2015/057492、PCT/US2015/057512、PCT/US2015/057526、PCT/US2015/057520、PCT/US2015/057502、PCT/US2016/022282和PCT/US16/32514、国际公开WO 2016001449、WO2016087617、WO 2016096714、WO 2016203064、WO 2017089093、和WO 2019180111中描述的那些，以及WO 1999014341、WO 1999033960、WO 1999014342、WO 1999034003、WO2007044993、WO 2009058303、WO 2009058661、WO 2014071410、WO 2014194032、WO2014194034、WO 2014194054和WO 2014/194117中描述的金属蛋白酶。示例性另外的蛋白酶包括但不限于胰蛋白酶(例如，猪或牛来源的)和描述于WO 89/06270中的镰孢菌属(Fusarium)蛋白酶。示例性商业蛋白酶包括但不限于MAXACAL^TM、MAXAPEM^TM、 OXP、PURAMAX^TM、EXCELLASE^TM、PREFERENZ^TM蛋白酶(例如P100、P110、P280)、EFFECTENZ^TM蛋白酶(例如P1000、P1050、P2000)、EXCELLENZ^TM蛋白酶(例如P1000)、和PURAFAST^TM(杜邦公司(DuPont))；变体、 16L、ULTRA、DURAZYM^TM、 PROGRESS和(诺维信公司(Novozymes))；BLAP^TM和BLAP^TM变体(汉高公司(Henkel))；LAVERGY^TM PRO 104 L(巴斯夫公司(BASF))、KAP(嗜碱芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶(花王公司(Kao)))和(AB酶制剂公司(AB Enzymes))。

示例性淀粉酶可以是化学或遗传修饰的突变体。示例性淀粉酶包括但不限于细菌或真菌来源的那些淀粉酶，例如像描述于以下中的淀粉酶：GB 1,296,839、WO 9100353、WO9402597、WO 94183314、WO 9510603、WO 9526397、WO 9535382、WO 9605295、WO 9623873、WO9623874、WO 9630481、WO 9710342、WO 9741213、WO 9743424、WO 9813481、WO 9826078、WO9902702、WO 9909183、WO 9919467、WO 9923211、WO 9929876、WO 9942567、WO 9943793、WO9943794、WO 9946399、WO 0029560、WO 0060058、WO 0060059、WO 0060060、WO 0114532、WO0134784、WO 0164852、WO 0166712、WO 0188107、WO 0196537、WO 02092797、WO 0210355、WO0231124、WO 2004055178、WO 2004113551、WO 2005001064、WO 2005003311、WO2005018336、WO 2005019443、WO 2005066338、WO 2006002643、WO 2006012899、WO2006012902、WO 2006031554、WO 2006063594、WO 2006066594、WO 2006066596、WO2006136161、WO 2008000825、WO 2008088493、WO 2008092919、WO 2008101894、WO2008/112459、WO 2009061380、WO 2009061381、WO 2009100102、WO 2009140504、WO 2009149419、WO 2010/059413、WO 2010088447、WO 2010091221、WO 2010104675、WO 2010115021、WO10115028、WO 2010117511、WO 2011076123、WO 2011076897、WO 2011080352、WO2011080353、WO 2011080354、WO 2011082425、WO 2011082429、WO 2011087836、WO2011098531、WO 2013063460、WO 2013184577、WO 2014099523、WO 2014164777、和WO2015077126。示例性商业淀粉酶包括但不限于 STAINZYMESTAINZYMESTAINZYME和BAN^TM(诺维信公司)；EFFECTENZ^TM S 1000、POWERASE^TM、PREFERENZ^TMS 100、PREFERENZ^TM S 110、EXCELLENZ^TM S 2000、和P(杜邦公司)。

本文提供的组合物和方法另外包含核酸酶，例如DNA酶或RNA酶。示例性核酸酶包括但不限于WO 2015181287、WO 2015155350、WO 2016162556、WO 2017162836、WO2017060475(例如SEQ ID NO：21)、WO 2018184816、WO 2018177936、WO 2018177938、WO2018/185269、WO 2018185285、WO 2018177203、WO 2018184817、WO 2019084349、WO2019084350、WO 2019081721、WO 2018076800、WO 2018185267、WO 2018185280、和WO2018206553中描述的那些核酸酶。可以在本文提供的组合物和方法中与具有核酸酶活性的多肽组合使用的其他核酸酶包括以下中描述的那些：Nijland R，Hall MJ，Burgess JG(2010)Dispersal of Biofilms by Secreted，Matrix Degrading，Bacterial DNase[通过分泌、矩阵降解、细菌DNA酶分散生物膜].PLoS ONE[公共科学图书馆：综合]5(12)和Whitchurch，C.B.，Tolker-Nielsen，T.，Ragas，P.C.，Mattick，J.S.(2002)ExtracellularDNA required for bacterial biofilm formation[细菌生物膜形成所需的细胞外DNA].Science[科学]295：1487。

所提供的组合物和方法可以另外包含纤维素酶。示例性纤维素酶可以是化学或遗传修饰的突变体。示例性纤维素酶包括但不限于细菌或真菌来源的那些，例如像在以下中描述的那些：WO 2005054475、WO 2005056787、US 7,449,318、US 7,833,773、US 4,435,307；EP 0495257；以及美国临时申请号62/296,678。示例性商业纤维素酶包括但不限于 和PREMIUM(诺维信公司)；REVITALENZ^TM100、REVITALENZ^TM 200/220、和2000(杜邦公司)；和KAC-500(B)^TM(花王公司(Kao Corporation))。在一些实施例中，纤维素酶作为成熟野生型或变体纤维素酶(其中N-末端的一部分缺失)的部分或片段掺入(参见例如，US 5,874,276)。

在其他实施例中，本文所述的组合物包含一种或多种另外的生物膜控制剂，如藻酸盐低聚物和益生菌。用于这样的组合物的藻酸盐低聚物包括例如美国专利号10,624,920中的那些。用于在组合物中使用的益生菌包括例如在WO 2020008053、WO 2018060475、WO2017157774和WO 2017142743中公开的那些。

在一些实施例中，本文所述的衣物洗涤剂组合物包含至少一种螯合剂。合适的螯合剂可以包括但不限于铜、铁和/或锰螯合剂、及其混合物。在一些实施例中，本文所述的衣物洗涤剂组合物包含按组合物的重量计从约0.1％至约15％、或甚至从约3.0％至约10％的螯合剂。

在一些仍另外的实施例中，本文所述的衣物洗涤剂组合物包含至少一种沉积助剂。合适的沉积助剂包括但不限于聚乙二醇、聚丙二醇、聚羧酸酯、去污聚合物(诸如聚对苯二甲酸)、粘土(诸如高岭土)、蒙脱石、绿坡缕石、伊利石、膨润土、多水高岭土、及其混合物。

在一些实施例中，本文所述的衣物洗涤剂组合物包含至少一种抗再沉积剂。

在一些实施例中，本文所述的衣物洗涤剂组合物包含一种或多种染料转移抑制剂。合适的聚合物染料转移抑制剂包括但不限于聚乙烯吡咯烷酮聚合物、聚胺N-氧化物聚合物、N-乙烯吡咯烷酮与N-乙烯基咪唑的共聚物、聚乙烯噁唑烷酮、和聚乙烯咪唑、或其混合物。在一些实施例中，本文所述的衣物洗涤剂组合物包含按组合物的重量计从约0.0001％至约10％、从约0.01％至约5％、或甚至从约0.1％至约3％的染料转移抑制剂。

在一些实施例中，本文所述的衣物洗涤剂组合物包含一种或多种硅酸盐。在一些这样的实施例中，可使用硅酸钠(例如，二硅酸钠、偏硅酸钠、和结晶层状硅酸盐)。在一些实施例中，本文所述的衣物洗涤剂组合物包含按该组合物的重量计从约1％至约20％、或从约5％至约15％的硅酸盐。

在又另外的实施例中，本文所述的衣物洗涤剂组合物包含一种或多种分散剂。合适的水溶性有机材料包括但不限于均聚合或共聚合的酸或其盐，其中多元酸包含被不超过两个碳原子彼此分开的至少两个羧基。

在一些实施例中，本文所述的衣物洗涤剂组合物包含一种或多种漂白剂、漂白活化剂、和/或漂白催化剂。在一些实施例中，本文所述的衣物洗涤剂组合物包含一种或多种无机和/或有机漂白化合物。无机漂白剂可以包括但不限于过氧化氢合物盐(例如，过硼酸盐、过碳酸盐、过磷酸盐、过硫酸盐、和过硅酸盐)。在一些实施例中，无机过氧化氢合物盐是碱金属盐。在一些实施例中，无机过氧化氢合物盐作为结晶固体包含在内而没有另外保护，但是在一些其他实施例中，该盐被包衣。合适的盐包括例如EP2100949中描述的那些盐。漂白活化剂典型地是有机过酸前体，其在清洁过程中在60℃及以下的温度下增强漂白作用。适合用于本文的漂白活化剂包括在过水解条件下给出优选具有从约1至约10个碳原子(特别是从约2至约4个碳原子)的脂肪族过氧羧酸和/或任选取代的过氧苯甲酸的化合物。漂白催化剂典型地包括例如锰三氮杂环壬烷和相关络合物，以及钴、铜、锰和铁络合物，以及US4246612、US 5227084、US 4810410、WO 9906521和EP2100949中描述的那些。

在一些实施例中，本文所述的衣物洗涤剂组合物包含一种或多种催化性金属络合物。在一些实施例中，可使用含金属的漂白催化剂。在其他实施例中，金属漂白催化剂包含含有以下的催化系统：具有限定的漂白催化活性的过渡金属阳离子(例如，铜、铁、钛、钌、钨、钼或锰阳离子)、具有很少或不具有漂白催化活性的辅助性金属阳离子(例如，锌或铝阳离子)、以及对于催化性和辅助性金属阳离子具有限定的稳定性常数的螯合物，特别是乙二胺四乙酸、乙二胺四(亚甲基膦酸)及其水溶性盐(参见例如，US4430243)。在一些实施例中，本文所述的衣物洗涤剂组合物通过锰化合物来催化。这样的化合物和使用水平是本领域熟知的(参见例如US5576282)。在另外的实施例中，钴漂白催化剂可用于本文所述的衣物洗涤剂组合物中。各种钴漂白催化剂是本领域已知的(参见例如US5597936和US 5595967)，并且通过已知的程序容易地制备。一些实施例涉及清洁方法，该清洁方法包括使有效量的本文所述的清洁组合物与包含污垢、污渍或生物膜的物品或表面接触以水解该污垢、污渍或生物膜。

在一些另外的实施例中，本文所述的衣物洗涤剂组合物包含一种或多种酶稳定剂。在一些实施例中，该酶稳定剂是钙和/或镁离子的水溶性来源。在一些实施例中，这些酶稳定剂包括寡糖、多糖、和无机二价金属盐(包括碱土金属盐，诸如钙盐)。在一些实施例中，本文使用的酶通过存在为这些酶提供以下这样的离子的成品组合物中的锌(II)、钙(II)和/或镁(II)离子的水溶性来源，以及其他金属离子(例如，钡(II)、钪(II)、铁(II)、锰(II)、铝(III)、锡(II)、钴(II)、铜(II)、镍(II)、和氧钒(IV))来稳定。氯化物和硫酸盐也可以用于一些实施例中。示例性寡糖和多糖(例如，糊精)描述于例如WO 07145964中。在一些实施例中，本文所述的衣物洗涤剂组合物含有可逆蛋白酶抑制剂，这些可逆蛋白酶抑制剂选自含硼化合物(例如，硼酸盐、4-甲酰基苯基硼酸、和苯基硼酸衍生物，例如像描述于WO9641859中)、肽醛(例如像描述于WO 2009118375和WO 2013004636中)、及其组合。

本文的清洁组合物典型地被配制以使得在水性清洁操作中使用期间，洗涤水的pH为从约3.0至约11。液体产品配制品典型地被配制成净pH为从约5.0至约9.0、更优选地从约7.5至约9。颗粒衣物洗涤产品典型地被配制成pH为从约8.0至约11.0。用于将pH控制在推荐使用水平下的技术包括使用缓冲液、碱、酸等，并且是本领域的技术人员熟知的。

合适的高pH清洁组合物典型地具有从约9.0至约11.0的净pH、或甚至从9.5至10.5的净pH。这样的清洁组合物典型地包含足够量的pH调节剂(诸如氢氧化钠、单乙醇胺、或盐酸)以提供净pH为从约9.0至约11.0的这样的清洁组合物。这样的组合物典型地包含至少一种碱稳定的酶。在一些实施例中，组合物是液体，而在其他实施例中，组合物是固体。

在一个实施例中，清洁组合物包括具有pH为从7.4至pH 11.5、或pH 7.4至pH11.0、或pH 7.5至pH 11.5、或pH 7.5至pH 11.0、或pH 7.5至pH 10.5、或pH 7.5至pH 10.0、或pH 7.5至pH 9.5、或pH 7.5至pH 9.0、或pH 7.5至pH 8.5、或pH 7.5至pH 8.0、或pH 7.6至pH 11.5、或pH 7.6至pH 11.0、或pH 7.6至pH 10.5、或pH 8.7至pH 10.0、或pH 8.0至pH11.5、或pH 8.0至pH 11.0、或pH 8.0至pH 10.5、或pH 8.0至pH 10.0的那些清洁组合物。

全世界典型的洗涤溶液中的洗涤剂组合物的浓度从洗涤剂组合物的小于约800ppm(“低洗涤剂浓度地理位置”)(例如在日本为约667ppm)变化至在约800ppm至约2000ppm之间(“中洗涤剂浓度地理位置”)(例如在美国为约975ppm，在巴西为约1500ppm)，变化至大于约2000ppm(“高洗涤剂浓度地理位置”)(例如在欧洲为约4500ppm至约5000ppm，在高泡沫磷酸盐助洗剂地理位置为约6000ppm)。

当参数以范围、优选范围、或一系列上限优选值和下限优选值给出时，这应当被理解为特别公开了由任何范围上限或优选值与任何范围下限或优选值的任何配对所形成的所有范围，而不论是否单独公开该范围。当本文列举数值范围时，除非另有说明，否则该范围旨在包括其端点、以及该范围中的所有整数和分数。本发明的范围不旨在受限于如说明书中所述的特定值和实例。

实例

实例1.核酸酶的鉴定和产生

通过蛋白质家族搜索来查找核酸酶[参考https：//Www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6324024/]。鉴定并进一步分析了含有“DUF1524”结构域(https：//pfam.xfam.org/family/PF07510)或“核酸内切酶NS”结构域(https：//pfam.xfam.org/family/Endonuclease_NS)的编码序列。从表1中列出的来源中鉴定了编码这些核酸酶的基因，并将这些基因分配了表1中所示的SEQ ID NO。N-末端信号肽通过SignalP软件版本4.0(Nordahl Petersen等人(2011)Nature Methods[自然方法]，8：785-786)预测。使用标准克隆和表达技术在枯草芽孢杆菌或里氏木霉中表达蛋白质。

为了在枯草芽孢杆菌中表达，将商业合成的编码目的基因的多核苷酸插入p2JM103BBI质粒中(Vogtentanz，Protein Expr Purif[蛋白质表达与纯化]，55：40-52，2007)。表达质粒包括aprE启动子和编码靶蛋白的合成基因。在一些情况下，还包括aprE信号肽。对于在没有信号肽的情况下表达的序列并且其中CRC16475-WT的预测成熟蛋白的第一个氨基酸不是甲硫氨酸残基的情况下，在基因编码多核苷酸之前添加起始密码子‘GTG’。使用质粒转化枯草芽孢杆菌细胞，并将转化的细胞铺展到补充有5ppm氯霉素的Luria琼脂板上。选择通过PCR和测序证实的具有正确插入的菌落并使用标准方法对其进行发酵。

为了在里氏木霉中表达，将商业合成的编码目的基因的多核苷酸插入pGX256表达载体中(描述于美国公开申请2011/0136197 A1)。使用原生质体转化将质粒转化到合适的里氏木霉菌株中(Te’o等人，J.Microbiol.Methods[微生物方法杂志]51：393-99，2002)。通过WO 2016/138315中描述的方法选择并发酵这些转化体。通过培养物上清液的SDS-PAGE证实转化体的蛋白质表达。真菌细胞培养物在限定培养基中生长。96小时后，通过离心收集澄清的培养液。

通过使蛋白质穿过HiPrep Phenyl FF 16/10柱、HiPrep Q FF柱、HiPrep SP FF柱或根据需要通过使蛋白质穿过这些柱的组合来纯化蛋白质，以实现纯化。

用HiPrep Phenyl FF 16/10柱进行的纯化如下。将来自发酵的粗材料浓缩，并添加硫酸铵至终浓度为1M。将溶液加载到HiPrep Phenyl FF 16/10柱上，该柱已用补充有1M硫酸铵的20mM乙酸钠(pH 5.0)预平衡。用硫酸铵浓度递减的梯度洗脱靶蛋白。合并含有目的蛋白的级分并浓缩。

用HiPrep Q FF柱进行的纯化如下。将含有目的蛋白的溶液浓缩，并将缓冲液交换到20mM磷酸钠(pH 7.0)或20mM Tris(pH 8.0)中，然后加载到HiPrep Q FF柱上，该柱已用20mM磷酸钠(pH 7.0)或20mM Tris(pH 8.0)预平衡。用氯化钠梯度洗脱靶蛋白，并且合并活性级分并浓缩。

用HiPrep SP FF柱进行的纯化如下。将含有目的蛋白的溶液浓缩，并将缓冲液交换到20mM磷酸钠(pH 7.0)中，然后加载到HiPrep SP FF柱上，该柱已用20mM磷酸钠(pH7.0)预平衡。用氯化钠梯度洗脱靶蛋白，并且合并活性蛋白质级分并浓缩。

表1.序列、名称和基因序列信息的来源

实例2.在模拟的重复衣物洗涤中的荧光假单胞菌生物膜的分散

在96孔圆底板(康宁公司(Coming)2797)上形成荧光假单胞菌(ATCC菌株700830)生物膜。简而言之，使用来自LB琼脂板的菌落接种新鲜胰蛋白酶大豆肉汤(TSB，技术创新公司(Teknova)Tl1550)，随后将OD600调节至0.1-0.2。然后将细胞悬浮液转移到微量滴定板上，并将板在氧气室中于28℃静置孵育48h。在倾析并用1X PBS清洗板5次并风干后，用20ppm或100ppm的酶溶液处理板中的生物膜堆积，该酶溶液以1∶1200稀释的Tide原始液体洗涤剂制备(单独的溶液用作阴性对照)。包括100PPM的SEQ ID NO.14用于比较。对于每个样品，进行至少八次重复。将板在iEMS培养箱中于26℃以400rpm振荡孵育400min。然后倾析出处理溶液，并且用Milli-Q水清洗板5次并风干。处理后，将生物膜用结晶紫溶液(0.1％)染色。5min后，去除多余的结晶紫，并且将板清洗5次并风干。最后，将生物膜结合的结晶紫溶解在30％乙酸溶液中。使用分光光度计以590nm处的吸光度监测生物膜信号。

如图1和图2所示，在100PPM酶和20PPM酶剂量下，几种核酸酶比基准SEQ ID NO.14去除了更多的生物膜。

实例3.在模拟的重复衣物洗涤中的荧光假单胞菌生物膜的分散

生物膜分散测定改编自Pitts等人(2003)描述的程序。在96孔圆底板(康宁公司2797)中形成荧光假单胞菌(ATCC菌株700830)生物膜。简而言之，将来自LB板的菌落接种到新鲜TSB培养基中，随后将OD600调节至0.1-0.2。然后将细胞悬浮液转移到微量滴定板上，并将板在氧气室中于28℃静置孵育48h。在用1X PBS清洗5次并风干后，用所指示浓度的酶溶液处理板中的生物膜堆积，该酶溶液在水中以1∶1200稀释的Tide原始液体洗涤剂制备(单独的溶液用作阴性对照)。酶浓度是如所指示的10ppm、50ppm或250ppm。包括SEQ IDNO.14用于比较。对于每个样品，进行八次重复。将板在iEMS培养箱中于26℃以400rpm振荡孵育400分钟。然后倾析出处理溶液，并且用Milli-Q水清洗板5次并风干。处理后，将生物膜用结晶紫溶液(0.1％)染色。5min后，去除多余的结晶紫，并且将板清洗5次并风干。最后，将生物膜结合的结晶紫溶解在30％乙酸溶液中。使用分光光度计以OD590nm监测生物膜。

结果显示在图3中。

实例4.液体衣物洗涤剂的稳定性

在存在洗涤剂的情况下，核酸酶的稳定性通过以下确定：在Master Cycler(艾本德公司(Eppendorf))中，在大约洗涤浓度的洗涤剂(在水中以1∶1200稀释的液体Tide原始洗涤剂)中在40℃下将20PPM的核酸酶预孵育45min，然后测定残余活性，如下所述。在洗涤剂中预孵育后，将洗涤剂-酶溶液稀释到一定量，该量取决于在不存在洗涤剂预孵育的情况下每种酶的酶活性水平。为了确定稀释度，最初在不进行洗涤剂预孵育的情况下测定在10PPM、1PPM和0.1PPM下的活性，并且选择产生DNA底物完全降解的最低浓度进行测定。

活性测定如下。将酶溶液添加到含有180ng的1.8kb PCR DNA作为靶标的在1x NEB缓冲液(含有50mM Tris-HCl、100mM NaCl、10mM MgCl2和1mM DTT(pH 7.9))中的测定溶液中。在平行测试中，测试了非预孵育样品在存在和不存在Tide稀释液的情况下的活性。在Master Cycler中于37℃孵育1小时后，通过添加EDTA至30mM的终浓度并在99℃加热10min来终止反应。在将反应溶液加载到凝胶上之前，将2.8kb DNA添加到每个孔中作为后续条带定量的内部对照。在标准电泳系统上用0.5μg/ml溴化乙锭加载到1％琼脂糖凝胶上之前，用DNA Clean&Concentrator试剂盒处理反应溶液以去除洗涤剂的影响。用带有Image Lab软件(伯乐公司(BIO-RAD))的Gel Doc EZ成像仪对可视化的凝胶条带进行定量。通过对残余靶DNA进行定量以及将该信号与无酶DNA样品的信号进行比较来测量核酸酶残余活性(％)。DNA条带完全缺失对应于100％残余活性，DNA条带没有缺失对应于0％残余活性。

如表2所示，在洗涤浓度的洗涤剂中预孵育后，除了一种核酸酶之外，所有核酸酶相对于SEQ ID NO.14具有增加的活性。

表2.在洗涤浓度的Tide原始洗涤剂中预孵育后的残余核酸酶活性。

洗涤剂预孵

实例5：溶菌酶SmaLys1和核酸酶CcrNuc1的组合使荧光假单胞菌生物膜分散

生物膜分散测定改编自Pitts等人描述的程序(Pitts，B.，Hamilton，M.A.，Zelver，N.，Stewart，P.S.(2003)A microtiter-plate screening method for biofilmdisinfection and removal[用于生物膜杀菌和去除的微量滴定板筛选方法].Joumal ofMicrobiological Methods[微生物学方法杂志]54：269-276)，简述如下。在96孔圆底板(康宁公司2797)上形成荧光假单胞菌(ATCC菌株700830)生物膜。简而言之，使用来自LB生长板的菌落接种新鲜TSB培养基，随后将OD600调节至0.1-0.2。然后将细胞悬浮液转移到微量滴定板上，并将板在氧气室中于28℃静置孵育48h。在用1X PBS清洗5次并风干后，用酶溶液处理板中的生物膜堆积，该酶溶液(大致为洗涤浓度的洗涤剂溶液)以1∶1200稀释的Tide液体洗涤剂制备。单独的Tide稀释液用作阴性对照。对于每个样品，进行八次重复。将板在iEMS培养箱中于26℃以400rpm振荡孵育6小时，模拟多次洗涤。然后倾析出处理溶液，并且用Milli-Q水清洗板5次并风干。处理后，将生物膜用结晶紫溶液(0.1％)染色。5min后，去除多余的结晶紫，并且将板清洗5次并风干。最后，将生物膜结合的结晶紫溶解在30％乙酸溶液中。用分光光度计在590nm处监测残余生物膜。

图4和图5指示，在相同总蛋白量下，与单独的每种单一组分相比，溶菌酶SmaLys1和核酸酶CcrNuc1(以1∶1的比率)的组合显示出改善的活性，这表明这两种分子对生物膜分散具有协同作用。在相同的蛋白质水平下，单独的核酸酶CcrNuc1和组合均优于SEQ IDNO.14。

在图6中，通过绘制剂量响应曲线，与单一组分CcrNuc1相比，溶菌酶SmaLys1和核酸酶CcrNuc1(以1∶1的比率)的组合的增加性能得到进一步改善。即使剂量降低至0.2ppm时，该组合仍能发挥作用并显示出益处。

序列表：

SEQ ID NO：1 TreNuc1的预测成熟蛋白质序列

SEQ ID NO：2 TinNuc1的预测成熟蛋白质序列

SEQ ID NO：3 BdeNuc1的预测成熟蛋白质序列

SEQ ID NO：4 GteNuc1的预测成熟蛋白质序列

SEQ ID NO：5 SdyNuc1的预测成熟蛋白质序列

SEQ ID NO：6 TceNuc1的预测成熟蛋白质序列

SEQ ID NO：7 RcoNuc1的预测成熟蛋白质序列

SEQ ID NO：8 CcrNuc1的预测成熟蛋白质序列

SEQ ID NO：10 AbiNuc1的预测成熟蛋白质序列

SEQ ID NO：11 AclNuc1的预测成熟蛋白质序列

SEQ ID NO：12 MacNuc1的预测成熟蛋白质序列

SEQ ID NO：13 AocNuc1的预测成熟蛋白质序列

SEQ ID NO：14 BciNuc1的预测成熟蛋白质序列

Claims (42)

1.一种用于预防、减少或去除生物膜的方法，所述方法包括使所述生物膜与包含具有核酸酶活性的多肽的清洁组合物接触，其中所述具有核酸酶活性的多肽是与选自由SEQ IDNO：1至13组成的组的酶具有至少80％序列同一性的多肽。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述生物膜在纺织品或硬表面上。

3.如权利要求2所述的方法，其中所述硬表面选自由衣物洗涤机器表面、餐具表面、或餐具清洗机表面组成的组。

4.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述清洁组合物包含具有核酸酶活性的多肽，所述多肽的量选自0.001至10,000mg/L、或0.001至2000mg/L、或0.01至5000mg/L、或0.01至2000mg/L、或0.01至1300mg/L、或0.1至5000mg/L、或0.1至2000mg/L、或0.1至1300mg/L、或1至5000mg/L、或1至1300mg/L、或1至500mg/L、或10至5000mg/L、或10至1300mg/L、或10至500mg/L。

5.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述清洁组合物是衣物洗涤组合物。

6.一种用于预防、减少或去除纺织品或硬表面的生物膜的方法，所述方法包括：(i)使纺织品或表面与具有核酸酶活性的多肽或包含具有核酸酶活性的多肽的组合物接触；以及(ii)任选地，冲洗所述纺织品或表面，其中所述具有核酸酶活性的多肽是与选自由SEQ IDNO：1至13组成的组具有至少80％序列同一性的多肽。

7.如权利要求6所述的方法，其中所述纺织品包含在所述纺织品的表面上的生物膜。

8.如权利要求7所述的方法，其中从所述纺织品减少或去除所述生物膜。

9.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中与使所述纺织品与所述具有核酸酶活性的多肽或包含具有核酸酶活性的多肽的组合物接触之前存在于所述纺织品上的生物膜的量相比，从制品减少或去除的所述生物膜的量选自由以下组成的组：至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更高。

10.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中通过用结晶紫染色来测量所述生物膜。

11.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述接触步骤包括使用具有核酸酶活性的多肽，所述多肽的量选自由以下组成的组：0.002至10,000mg蛋白质、0.005至5000mg蛋白质、0.01至5000mg蛋白质、0.05至5000mg蛋白质、0.05至1300mg蛋白质、0.1至1300mg蛋白质、0.1至500mg蛋白质、0.1至100mg蛋白质/升洗涤液，或所述量为至少0.002ppm活性核酸酶。

12.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述清洁组合物的pH为pH 7.4至pH11.5、或pH 7.4至pH 11.0、或pH 7.5至pH 11.5。

13.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述具有核酸酶活性的多肽是与SEQID NO：8具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％序列同一性的多肽。

14.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述接触步骤在洗涤液中发生。

15.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述接触步骤发生的时间长度选自由以下组成的组：约5分钟至约10天、约5分钟至约400分钟、约5分钟至约300分钟之间、约5分钟至约250分钟之间、约5分钟至约200分钟之间、约5分钟至约150分钟之间、约5分钟至约100分钟之间、约5分钟至约50分钟之间、约5分钟至约30分钟之间。

16.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述接触步骤在选自由以下组成的组的温度发生：约10°至60℃、15°至约55℃之间、20°至约50℃之间以及20°至约45℃之间。

17.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述包含具有核酸酶活性的多肽的组合物进一步包含表面活性剂。

18.如权利要求17所述的方法，其中所述表面活性剂选自由以下组成的组：非离子表面活性剂、两性表面活性剂、半极性表面活性剂、阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、兼性离子表面活性剂、及其组合和混合物。

19.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述组合物是洗涤剂组合物。

20.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述接触步骤进一步包括使所述纺织品与一种或多种另外的酶接触，所述一种或多种另外的酶选自由以下组成的组：酰基转移酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、α-半乳糖苷酶、阿拉伯糖苷酶、芳基酯酶、β-半乳糖苷酶、角叉菜胶酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、软骨素酶、角质酶、内切-β-1，4-葡聚糖酶、内切-β-甘露聚糖酶、酯酶、外切-甘露聚糖酶、半乳聚糖酶、葡糖淀粉酶、半纤维素酶、透明质酸酶、角蛋白酶、漆酶、乳糖酶、木质酶、脂肪酶、脂加氧酶、溶菌酶、甘露聚糖酶、金属蛋白酶、氧化酶、氧化还原酶、果胶酸裂合酶、果胶乙酰酯酶、果胶酶、戊聚糖酶、过水解酶、过氧化物酶、酚氧化酶、磷酸酶、磷脂酶、植酸酶、聚半乳糖醛酸酶、聚酯酶、蛋白酶、支链淀粉酶、还原酶、鼠李糖半乳糖醛酸酶、β-葡聚糖酶、鞣酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖乙酰酯酶、木聚糖酶、木葡聚糖酶、木糖苷酶、及其任何组合或混合物。

21.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述接触步骤在清洗机器或餐具清洗机中发生。

22.一种洗涤剂组合物，其包含：(i)具有核酸酶活性的多肽；(ii)具有蛋白酶活性的多肽；(iii)至少一种另外的多肽，其中所述至少一种另外的多肽是选自以下的酶：DNA酶、酰基转移酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、α-半乳糖苷酶、阿拉伯糖苷酶、芳基酯酶、β-半乳糖苷酶、角叉菜胶酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、软骨素酶、角质酶、内切-β-1，4-葡聚糖酶、内切-β-甘露聚糖酶、酯酶、外切-甘露聚糖酶、半乳聚糖酶、葡糖淀粉酶、半纤维素酶、透明质酸酶、角蛋白酶、漆酶、乳糖酶、木质酶、脂肪酶、脂加氧酶、溶菌酶、甘露聚糖酶、金属蛋白酶、核酸酶、氧化酶、氧化还原酶、果胶酸裂合酶、果胶乙酰酯酶、果胶酶、戊聚糖酶、过水解酶、过氧化物酶、酚氧化酶、磷酸酶、磷脂酶、植酸酶、聚半乳糖醛酸酶、聚酯酶、蛋白酶、支链淀粉酶、还原酶、鼠李糖半乳糖醛酸酶、β-葡聚糖酶、鞣酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖乙酰酯酶、木聚糖酶、木葡聚糖酶、木糖苷酶、及其任何组合或混合物；以及(iv)表面活性剂，其中所述具有核酸酶活性的多肽是与选自由SEQ ID NO：1至13组成的组具有至少80％序列同一性的多肽。

23.如权利要求22所述的组合物，其中所述表面活性剂选自由以下组成的组：非离子表面活性剂、两性表面活性剂、半极性表面活性剂、阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、兼性离子表面活性剂、及其组合和混合物。

24.如权利要求22所述的组合物，其中所述组合物包含按所述组合物的重量计约0.1％至约60％、约1％至约50％、或约5％至约40％的表面活性剂。

25.如权利要求22所述的组合物，其中所述组合物进一步包含选自由以下组成的组的一种或多种辅助材料：助洗剂、漂白剂、漂白活化剂、漂白催化剂、其他酶、酶稳定系统、螯合剂、光学增亮剂、污垢释放聚合物、染料转移剂、分散剂、泡沫抑制剂、染料、香料、着色剂、填料盐、助水溶剂、光活化剂、荧光剂、织物调理剂、可水解表面活性剂、防腐剂、抗氧化剂、抗收缩剂、抗皱剂、杀菌剂、杀真菌剂、颜色点缀剂、银护理剂、抗晦暗剂和/或抗腐蚀剂、碱性来源、增溶剂、载剂、加工助剂、颜料和pH控制剂。

26.如权利要求22所述的组合物，其中所述核酸酶是DNA酶。

27.一种用于减少与纺织品或硬表面相关的臭味的方法，所述方法包括：(i)使纺织品或硬表面与具有核酸酶活性的多肽或包含具有核酸酶活性的多肽的组合物接触；以及(ii)任选地，冲洗所述纺织品或表面，其中所述具有核酸酶活性的多肽是与选自由SEQ ID NO：1至13组成的组具有至少80％序列同一性的多肽。

28.如权利要求27所述的方法，其中所述纺织品包含在所述纺织品或硬表面的表面上的生物膜。

29.如权利要求28所述的方法，其中从所述纺织品减少或去除所述生物膜。

30.如权利要求27至28中任一项所述的方法，其中与使所述纺织品或硬表面与所述具有核酸酶活性的多肽或包含具有核酸酶活性的多肽的组合物接触之前存在的臭味的量相比，所述臭味减少至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更高。

31.如权利要求27至30中任一项所述的方法，其中所述接触步骤包括使用具有核酸酶活性的多肽，所述多肽的量选自由以下组成的组：0.002至10,000mg蛋白质、0.005至5000mg蛋白质、0.01至5000mg蛋白质、0.05至5000mg蛋白质、0.05至1300mg蛋白质、0.1至1300mg蛋白质、0.1至500mg蛋白质、0.1至100mg蛋白质/升洗涤液，或所述量为至少0.002ppm活性核酸酶。

32.如权利要求27-31中任一项所述的方法，其中所述具有核酸酶活性的多肽是与选自由SEQ ID NO：1至13组成的组具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽。

33.如权利要求27-32中任一项所述的方法，其中所述接触步骤在洗涤液中发生。

34.如权利要求27-33中任一项所述的方法，其中所述接触步骤在选自由以下组成的组的温度发生：约10°至60℃、15°至约55℃之间、20°至约50℃之间以及20°至约45℃之间。

35.如权利要求27-34中任一项所述的方法，其中所述包含具有核酸酶活性的多肽的组合物进一步包含表面活性剂。

36.如权利要求35所述的方法，其中所述表面活性剂选自由以下组成的组：非离子表面活性剂、两性表面活性剂、半极性表面活性剂、阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、兼性离子表面活性剂、及其组合和混合物。

37.如权利要求27-36中任一项所述的方法，其中所述组合物是洗涤剂组合物。

38.如权利要求27-37中任一项所述的方法，其中所述接触步骤进一步包括使所述纺织品与一种或多种另外的酶接触，所述一种或多种另外的酶选自由以下组成的组：酰基转移酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、α-半乳糖苷酶、阿拉伯糖苷酶、芳基酯酶、β-半乳糖苷酶、角叉菜胶酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、软骨素酶、角质酶、内切-β-1，4-葡聚糖酶、内切-β-甘露聚糖酶、酯酶、外切-甘露聚糖酶、半乳聚糖酶、葡糖淀粉酶、半纤维素酶、透明质酸酶、角蛋白酶、漆酶、乳糖酶、木质酶、脂肪酶、脂加氧酶、溶菌酶、甘露聚糖酶、金属蛋白酶、氧化酶、氧化还原酶、果胶酸裂合酶、果胶乙酰酯酶、果胶酶、戊聚糖酶、过水解酶、过氧化物酶、酚氧化酶、磷酸酶、磷脂酶、植酸酶、聚半乳糖醛酸酶、聚酯酶、蛋白酶、支链淀粉酶、还原酶、鼠李糖半乳糖醛酸酶、β-葡聚糖酶、鞣酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖乙酰酯酶、木聚糖酶、木葡聚糖酶、木糖苷酶、及其任何组合或混合物。

39.如权利要求27-38中任一项所述的方法，其中所述接触步骤在清洗机器或餐具清洗机中发生。

40.一种具有核酸酶活性的分离的多肽或其活性片段，其中所述多肽包含与选自由SEQID NO：1至13组成的组的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。

41.一种用于预防、减少或去除生物膜的方法，所述方法包括使所述生物膜与包含具有核酸酶活性的多肽和溶菌酶的清洁组合物接触。

42.一种洗涤剂组合物，其包含：(i)具有核酸酶活性的多肽和(ii)溶菌酶。