JP2669457B2 - 工業微生物種中の分子クローニングおよび発現 - Google Patents

工業微生物種中の分子クローニングおよび発現

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Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 発明の分野 ポリペプチドを高収率で生産するため工業単細胞微生
物株を組換えDNAを有する宿主として使用することに相
当の関心が存在する。多くの工業的に重要な酵素、例え
ばデンプン分解酵素およびタンパク分解酵素はバチルス
属の微生物、例えばB.サチリス（B.subtilis）、B.アミ
ロリクエファシエンス（B.amyloliquefaciens）、B.リ
ヘニホルミス（B.licheniformis）、B.ステアロセルモ
フィルス（B.stearothermophilus）、およびB.コアギュ
ランス（B.coagulans）、により生産される。発酵槽中
に非常に丈夫で安定な菌株が使用される。さらに菌株は
ファージ感染および、さらに遺伝子交換、すなわち普通
の形質転換手順によるDNAの導入、に耐性である。普通
の工業菌株はまた栄養培地に対する高価なアミノ酸の添
加を避けるために原栄養体である。工業菌株の他の特徴
は１週間ほどの長さであることができる発酵の終りまで
のその高い生産性、ブロスを消費するときの安定な細胞
濃度、および高い生産性、通常少くとも約0.5％w/vの分
泌タンパク質、である。さらに、培地中にDNAの実質的
な分解があるようにDNアーゼの実質的な分泌があること
がバチルスでしばしば認められる。 工業菌株の遺伝子修飾耐性およびそれを飢餓にするの
を困難にするその原栄養特性のために、それらは形質転
換に対する耐性を示す。従って、工業菌株中へDNAを導
入する有効な方法を提供することは非常に有用であり、
その場合にDNAは工業菌株中に安定に保持され、工業菌
株の生存能力および活性の喪失また実質的な喪失がな
く、内生および外生のポリペプチドまたはタンパク質生
産物の高い収率を得ることができよう。 さらに、宿主細胞の修飾または形質転換が内生遺伝子
または先に導入した遺伝子のコピー数を増加することを
含む場合に細胞の選択が困難であり、その場合に遺伝子
は生存選択と関連がない。従って、追加の遺伝子（増加
したコピー数）の存在を検出および選択できる有効な方
法をもつことが非常に望ましい。 従来技術の説明 B.サチリスの遺伝子操作はヨネダ他、Biochem.Bioph
s.Res.Commun.（1973）50:765〜770;ヨネダおよびマル
オ、J.Bacteriol.（1975）124:48〜54;セキグチ他、J.B
acteriol.（1975）121:688〜694;ヒトツヤナギ他、Agri
c.Biol.Chem.（1979）43:2342〜2349;ヨネダ、Appl.En
v.Microbiol.（1980）39:274〜276、により報告され
た。B.サチリスの一定の有効形質転換性研究室菌株、例
えばα−アミラーゼ、β−アミラーゼ、ジヒドロ葉酸還
元酵素、インターフェロンおよびインシュリン、の生産
性改良に関する組換えDNA技術の良好な応用が報告され
た（Palva,Gene（1982）19:81〜87;シノミヤ他、Agric.
Biol.Chem.（1981）45:1733〜1735;GrayおよびChang,J.
Bacteriol（1981）145:422〜428;Williams他、Gene（19
81）16:199〜206;Palva,Gene（1983）22:229〜235）。
バチルス・リヘニホルミス土壌分離体の遺伝子操作にお
ける困難はThorneおよびStull,J.Bacteriol（1966）91:
1012〜1014、により報告されている。また英国特許出願
GB2,091,091,628号；ヨーロッパ特許出願0,034,470号；
ヨーロッパ特許出願0,032,238号；およびヨーロッパ特
許出願0,077,109号、その開示はpUR1523に関するので参
照によりここに加えられる、を参照されたい。 発明の概要 遺伝子的に修飾された単細胞微生物株、殊に工業バチ
ルス株、を含む新規な方法および生成物が提供される。
工業菌株宿主中に発現できる関心のある遺伝子を含む染
色体外DNAが適当な細菌宿主、便宜には工業菌株に関連
する研究室菌株宿主、および工業菌株と組合せた修飾細
菌宿主中へ融合条件のもとで導入される。関心のある遺
伝子（類）を含む工業菌株の細胞は関心のある遺伝子に
関連したマーカーにより選択される。 図面の簡単な説明 第１図はプラスミドpGB33の線図であり、 第２図はプラスミドpGB34の線図であり、 第３図はプラスミドpLC28の線図であり、 第４図はプラスミドpLC83の線図であり、 第５図はプラスミドpLC87の線図であり、 第６図はプラスミドpGP35の線図であり、 第７図はプラスミドpLP33の線図であり、 第８図はプラスミドpLP87の線図であり、 第９図は種々のバチルス工業菌株により分泌された生
成物のタンパク質分子量マーカーに関するSDSポリアク
リルアミドゲル−電気泳動図である。 特定態様の説明 ポリペプチド生成物を好収率で生産するために発酵に
使用する工業単細胞微生物株を遺伝子操作する方法が提
供される。バチルス株が他の微生物の例証として使用さ
れる。生ずる修飾された工業菌株は、工業菌株の所望の
特性を保持し、同時に内生（同種）または外生（異種）
の遺伝子の表現生成物の高い収率を与える。 この方法は、DNAを複製することができ、染色体外DNA
の導入が容易に可能である細菌宿主中へ染色体外DNAを
導入することを含む。染色体外要素を含む修飾された細
菌宿主細胞は次いで工業バチルス株と融合条件のもとで
組合され、そこで受容株バチルス細胞を、次に染色体外
要素が生ずる関心のある遺伝子または遺伝子類の存在に
ついて選択することができる。 本発明は次の部分に分けることができる：（１）バチ
ルス宿主中の高められた発現が望まれる遺伝子を含むプ
ラスミド構築体の調製；（２）工業バチルス菌株との融
合に使用できる和合性宿主（compatiblehost）中のプラ
スミド構築体のクローニング；（３）プラスミド構築体
を含む宿主と工業バチルス株との融合、そのような工業
菌株の選択を含む；および（４）関心の遺伝子の表現生
成物を生産するための適当な栄養培地中の前記菌株の生
長。 関心のある遺伝子（類）は原核細胞または真核細胞の
遺伝子であることができる。これらの遺伝子は細菌遺伝
子、単細胞微生物遺伝子、哺乳動物遺伝子などを含むこ
とができる。構造遺伝子は合成、ゲノムDNAからの分
離、cDNAからの調製またはそれらの組合せを含む種々の
方法で調製することができる。遺伝子の種々の操作法が
よく知られ、制限消化、切除（resection）、連結（lig
ation）、in vitro突然変異誘発、プライマー修復、リ
ンカーおよびアダプターの使用などが含まれる。従っ
て、宿主から得られるDNA配列は、DNA構築の要件により
種々の方法で操作することができる。Maniatis他、More
cular Cloning,Gold Spring Harbor Laboratory,Cold S
pring Harbor,N.Y.,1982参照。 遺伝子が、工業バチルス株により認識される転写およ
び翻訳の開始および終結の調節シグナルを有する宿主か
ら得られる場合には、通常工業バチルス宿主中に発現で
きるシストロンを与えるために構造遺伝子の５′−およ
び３′−フランキング領域（frankingregion）を維持す
ることが便宜であろう。転写開始領域は、適当な状態に
おいて、関心の構造遺伝子の高水準の発現が得られる前
に宿主が高密度に生長できるように構造的または誘導的
発現を与えることができる。 構造遺伝子が、調節シグナルがバチルスにより認識さ
れない源からである場合に、バチルスにより認識される
調節領域を得、開始および終結の調節シグナルの間に構
造遺伝子を挿入することが必要であろう。ある場合に
は、自身の停止コドン（類）を有する外生構造遺伝子を
リーディングフレーム中、自然調節シグナルを有する外
生バチルス構造遺伝子のＮ−末端コドンの背後に挿入す
ることができる。生ずる生成物はそのとき若干の、例え
ば０〜30個の、、追加Ｎ−末端アミノ酸を有することが
できる。あるいは、オペロンを調製することができ、そ
の場合に単一プロモータが複数のポリペプチドをコード
するメッセンジャーRNAの転写開始を与える。 ある場合には、表現生成物が分泌されることが望まし
いかもしれない。表現生成物が自然に分泌され、リーダ
ーシグナルおよびプロセッシングシグナル（類）がバチ
ルス宿主により認識される場合に、これらは何ら困難を
要しない。しかし、生成物が普通には分泌されないか、
またはバチルスが分泌シグナルおよび（または）プロセ
ッシングシグナル（類）を認識しない、すなわちシグナ
ルがバチルスに十分な程度に機能しない場合には、バチ
ルスポリペプチドの分泌シグナルおよびプロセッシング
シグナル（類）をコードするDNA配列を分離または合成
し、それらの適当なリーディングフレーム中の構造遺伝
子の５′−端に接合することが必要であろう。 構造遺伝子は酵素、ホルモン、リンフォカイン、サー
フェスタンパク質、血液タンパク質、構造タンパク質、
免疫グロブリンなどのような種々のポリペプチドまたは
タンパク質を、哺乳動物、単細胞微生物、例えば細菌、
菌類例えば酵母菌または線状菌、藻類、原生動物など、
植物、あるいは他のDNA源から表現することができる。
特に重要なものは酵素、より詳しくはヒドロラーゼ、よ
り詳しくはプロテアーゼおよびサッカリダーゼ（saccar
idase）である。そのような酵素の例はエンドペプチダ
ーゼ、エキソペプチダーゼ、セリンおよび非セリンプロ
テアーゼ、α−およびβ−アミラーゼ（殊に耐熱性のα
−アミラーゼ）などである。 和合性宿主並びにバチルス株に使用できる広い数のベ
クターが存在する場合には、複製系は和合性宿主および
バチルス株に対し同じでも異なっていてもよい。（ベク
ターは１つまたはより多くの宿主と和合性の複製系、通
常宿主中の、少くとも１つの便宜な、通常独自の制限部
位を選択するマーカーを意味する。）通常、和合性宿
主、非工業用または研究室バチルス株を有することは便
利であろうが、しかしこれは必須ではなくてある場合に
は他の生物、例えばE.coli.を使用することができる。
ベクターは１つまたはより多くの複製系を含むので少く
とも和合性宿主中でクローニングされることができる。
複製系は高または低コピー数、好ましくは少くとも約1
0、一般に約100を超えないコピー数を与えることができ
る。 工業バチルス株中の構造遺伝子の組込みを望むか染色
体外要素上の保持を望むかにより、バチルスに対する複
製系が含まれ、または含まれないことができる。あるい
は、組込みのために、ベクターまたはプラスミド構築体
中の相同のストレッチ（stretch）にバチルスゲノムを
与え組換えの確率を高めることができる。 複製系に加えて、少くとも１つのマーカーが存在し、
１つより多くのマーカー、通常約３個を超えないマーカ
ーが存在することができる。マーカーは宿主中で発現で
きる構造遺伝子を意味し、それが生存選択を与える。
「生存選択」は栄養要求性宿主に原栄養性、生物致死剤
またはウイルス耐性を与えることを意味する。原栄養性
のために種々の遺伝子、例えばleu,ura,trpなどを用い
ることができる。生物致死剤耐性のためにこれは例えば
neo,cam,tet,tun,kanなど、抗生物質に対する耐性を含
むことができる。他のマーカーには重金属、免疫などに
対する耐性が含まれる。種々のDNA配列は、種々の源か
ら誘導し、接合して１つまたはより多くの便宜な、好ま
しくは独自の制限部位を含むベクターを与え、そのよう
な部位に、または失ったフラグメントの代わりに、構造
遺伝子の挿入または置換を可能にしプラスミド構築体を
与えることができる。 プラスミド構築体が調製されれば、次にそれを和合性
またはクローニング宿主として示す適当な和合性宿主中
にクロンすることができる。便宜な、容易に形質転換さ
れる、プラスミド構築体の複写および融合による工業バ
チルス株への転移を与える任意の宿主を用いることがで
きる。形質転換の高い効率を有し、通常栄養要求性およ
び（または）抗生物質感受性である多数の研究室菌株を
利用できる。プラスミド構築体のクローニングに対する
バチルス宿主の使用は、それが１つの複製系並びに同一
マーカーの和合性宿主および工業菌株の両方における生
存選択に対する使用を可能にする点で多くの利点を有す
る。従って、大抵はプラスミド構築体が適当なバチルス
宿主中でクロンされよう。バチルス宿主は工業宿主と同
じバチルス株である必要がなく、主に便宜上選択され
る。プラスミド構築体は常法、例えば形質転換により、
カルシウム沈殿DNA、接合、または他の便宜な方法を用
いて和合性宿主中へ導入することができる。和合性宿主
は次いで適当な栄養培地中で、フラグメント構築体を含
む宿主を選択する選択条件のもとで生長させることがで
きる。栄養要求性宿主のために栄養培地は必要栄養素を
欠き、一方生物致死剤耐性のために細胞傷害量の生物致
死剤（類）例えば抗生物質（類）が栄養培地中に使用さ
れる。和合性宿主を十分な密度に生長させた後、次に和
合性宿主を処理して融合のための細胞を調製する。 便宜に、細胞は原形質体の形成前または形成中に細胞
傷害剤で殺（kill）される。抗生物質を含め、種々の試
薬を使用できるが、しかし、ヨードアセトアミドが便利
かつ有効であることが認められ、後の融合を干渉しな
い。原形質体は普通の方法、例えばリソチームまたはチ
モリアーゼ（zymolyase）処理により細胞から調製さ
れ、原形質体は、原形質体の結合性を維持するために適
当なオスモラリティを有する適当な媒質中に慎重に懸濁
される。 工業バチルス受容体株もまた和合性宿主菌株と同様に
処理して原形質体を形成するが、しかし生存可能細胞が
原形質体の調製に使用される。工業バチルス株の所望特
徴を有する種々のバチルス株、例えばサチリス、リヘニ
ホルミス、アミロリクエファンシス、ステアロセルモフ
ィルス、およびコアギュランス、好ましくはリヘニホル
ミスおよびサチリス、を使用することができる。工業バ
チルス株は土壌中の分離あるいは寄託所または耐性の源
から入手できる生物から選ばれ、あるいはそのようなバ
チルス株の修飾により得られる。工業バチルス株は遺伝
子交換、例えばファージ感染または形質転換、に耐性で
あることに特徴がある。菌株は安定であり、胞子形成が
可能であることも可能でないこともできる。それらは原
栄養性であり、内生タンパク質生成物、例えば酵素、α
−アミラーゼおよび種々のプロテアーゼの高い収量を与
える。それらはまたDNアーゼを分泌することが認めら
れ、それが培地中でDNAの分解を生じ、遺伝子交換に対
する保護を与える。 死（dead）和合性宿主原形質体と生存可能工業バチル
ス宿主原形質体とは適当なフソゲン（fusogen）の存在
下に組合される。所望の効率を与える任意のソフゲンを
使用できるが、大抵はポリエチレングリコールが非常に
便利で、融合の高い効率を与えることが認められる。死
原形質体とバチルス受容体株との割合は好ましくは少く
とも1:1であり、過剰の死原形質体を用いることができ
る。短時間後にフソゲン混合物は適当な栄養培地および
選択された培地中で再生した細胞で、便宜には寒天平板
上で平板培養することにより置換される。次いでクロン
は付加構造遺伝子の発現の検出のために適当な方法でス
クリーンすることができる。種々の方法を、殊に酵素が
含まれる場合に用いることができ、それはよく確立され
た検出法を有する。あるいは、酵素が含まれない場合
に、または利用できる検出系がない場合には、抗体、DN
Aまたはハイブリッド形成、あるいは生物検定をクロン
のスクリーニングに使用しプラスミッド構築体の存在お
よび関心の構造遺伝子（類）の発現を測定することがで
きる。 プラスミド構築体または染色体に組込まれたプラスミ
ド構築体類またはそれらのフラグメントを含む工業バチ
ルス宿主は次いで栄養培地中で普通の発酵条件のもとで
生長させる。発酵はブロスが消耗するまで続けることが
できる。生成物が分泌された場合には、生成物は常法、
例えば抽出、クロマトグラフィー、電気泳動など、によ
りブロスから分離することができる。生成物が細胞質中
に保持されている場合には細胞を遠心分離、ろ過などに
より収穫し、機械的せん断、洗剤、リソチームまたは他
の方法により溶解し、生成物を前記のように分離するこ
とができる。主題の方法を用いることにより内生ポリペ
プチドの非常に高い収量、通常親細胞の収量の少くとも
約150％倍、より普通には少くとも175％、好ましくは親
細胞の収量の約200％倍、を達成することができる。 以下の実施例は例証として、そして限定としてではな
く提供される。 実施例Ｉ 染色体DNAの分離 Central Bureau voor Schimmelcultures,Oosterstraa
t1,Baarn,the Netherlands（以下CBSと記す）に1983年
７月６日にNo.470.83として寄託したB.リヘニホルミス
工業株T5の染色体DNAを37℃で通気下に生長させた3L培
養物から分離した。細胞はSorvall GSAローター中で10
分間10,000rpmで回転沈降させ、25％w/vスクロースおよ
び50mM Tris−HClを含む10mlのスクロース−Tris緩衝液
pH8.0中に懸濁させ、0.5mlリソチーム溶液（20mg/ml）
の添加により溶解し、37℃で15分間インキュベートし
た。EDTA（0.5M）2mlを添加し、０℃で５分間インキュ
ベートした後、20％（w/v）ドデシル硫酸ナトリウム（S
DS）1mlを加えた。次いで懸濁液を1:1フェノール−クロ
ロホルム混合物で抽出した。上澄み液を分離し、純エタ
ノール２容を慎重に載せ、その後DNAをガラス棒を用い
て分離した。10μg/mlリボヌクレアーゼを含有する蒸留
水に溶解した後、DNA懸濁液を1:1フェノール−クロロホ
ルムで抽出し、エタノール２容で沈殿させ、TE緩衝液
（すなわち、1mMEDTAを含有する10mM Tris−HCl、pH8.
0）中に再び懸濁した。 実施例II プラスミドDNAの分離 プラスミドpUB110を含むB.サチリス株1G20（ヨーロッ
パ特許明細書0,021,468号参照）を、５μ/mlネオマイ
シンを加えた1Lpenassayブロス培地中で一夜生長させ
た。SorvallモデルGSAローター中で5,000rpmで15分間遠
心分離した後、15mlスクロース−Tris緩衝液中に再び懸
濁させ、細胞を実施例Ｉに記載したように溶解し、EDTA
およびSDSで処理した。NaClを1Mの最終濃度に添加した
後、上澄み液を４℃で一夜貯蔵し、次いでSorvallタイ
プSS34ローター中で12.500rpmで45分間遠心分離した。
上澄み液の上部70％（w/v）をDNアーゼを含まないRNア
ーゼ20μg/mlで処理し（37℃で0.5時間）、フェノール
−クロロホルム（1:1）混合物で抽出し、次にクロロホ
ルム単独で抽出した。抽出した上澄み液から、5M NaCl
0.2容および40％（w/v）ポリエチレングリコール6,00
0、0.25容を添加することによりDNAを沈殿させ、次に４
℃で16時間インキュベートした。沈殿および遠心分離
（12,500rpmで30分、SorvallタイプSS34ローター）した
後、DNAを２〜3mlのTE緩衝液（実施例Ｉ中のように）に
再び懸濁させ、分散物を4M NaOHでpH12.0にした。次い
でpHを85に調整し、懸濁液をフェノールで抽出した。抽
出物をエタノールで沈殿させた後、プラスミドDNAを少
量のTE緩衝液中に再び懸濁させた。 プラスミドpUR1523（ヨーロッパ特許明細書Ａ−77,10
9号参照）DNAをE.コリ（E.coli）からBirnboimおよびDo
ly,Nucl.Acids Res.（1979）７:1513〜1523、により記
載された方法により分離した。 実施例III ａ） α−アミラーゼ含有組換えプラスミドpGB33およ
びpGB34（第１図および第２図）の構築 バチルス生産株T5から分離した（実施例Ｉに記載し
た）染色体DNA5μｇおよびB.サチリス1G20から分離した
（実施例IIに記載した）pUB110、１μｇをEcoR Iで消化
した。65℃で7.5分間の制限酵素の熱変性の後、DNAをエ
タノールで沈殿させ、20mM Tris−HCl pH7.6、10mM MgC
l2、10mMジチオトレイトール（DTT）、0.2mg/mlウシ血
清アルブミン、0.5mMATPおよびT4リガーゼ１単位を含む
リガーゼ混合物（Boehringer−Mannheim）20ml中に再び
懸濁させた。混合物を４℃で一夜連結させた。連結した
混合物を実施例IVに記載したようにB.サチリス中へ転移
させた。プラスミドDNAを選択した組換え微生物から分
離し（実施例IIに記載の方法を用いた）、制限エンドヌ
クレアーゼで分析した。プラスミドpGB33はpUB110およ
びα−アミラーゼシストロンを含む約3kbpの染色体EcoR
Iフラグメントの組換え体であった。pGB33を制限エン
ドヌクレアーゼHind IIIおよびBamH Iで消化し、次いで
S1エキソヌクレアーゼ切除およびT4による連結をすると
pGB34（第２図）が生じ、それはなおα−アミラーゼシ
ストロンを含むが、しかし多くの不便な制限部位を含む
DNAセグメントを欠く。B.サチリス１−85（＝trp-）中
のプラスミドpGB33およびB.サチリス1S−53（Bacillus
Genetic Stock Center,Ohio,USA）中のpGB34はそれぞれ
1983年７月６日にNo.466.83およびNo.467.83としてCBS
に寄託された。 ｂ） キモシン含有組換えプラスミドpLC28、pLC83およ
びpLC87（第３図、第４図および第５図）の構築 pGB34DNA0.5μｇおよびpUR1523、ウシキモシンのため
の遺伝子をかくまうE.コリプラスミド、0.5μｇをPst I
で消化した。実施例III a記載のように熱変性および連
結した後、混合物を形質転換に用いた。選択した形質転
換体（実施例IVに記載した選択手順を用いた）から分離
したプラスミドDNAを制限エンドヌクレアーゼで分析し
た。選択されたプラスミド、pLC28と称す、はpGB34の独
特のPst I部位中へ挿入されたpUR1523のキモシン遺伝子
を含むPst Iフラグメントの組換え体であった（第３
図）。pLC28を制限エンドヌクレアーゼCla Iで切り、次
いでエキソヌクレアーゼBal31で切除し、T4リガーゼで
連結するとpLC83（第４図）が生じ、それはキモシンの
ための遺伝子を含むが、もはや多くの不便な制限部位を
有するDNAフラグメントを含まない。ともにB.サチリス1
S−53中のプラスミドpLC28およびpLC83は1983年７月６
日にそれぞれNo.469.83およびNo.468.83としてCBSに寄
託された。 α−アミラーゼ転写および翻訳開始調節配列の背後の
相中にキモシン遺伝子を配置するために、pLC83をPst I
で消化し、ヌクレアーゼS1で切除し、T4リガーゼで連結
した。得られたプラスミドはpLC87と称され、配列分析
により正しい配置および配向を有することが示された。
第５図参照。 ｃ） プロテアーゼ含有組換えプラスミドpLP33およびp
LP87（第７図および第８図）の構築 プロテアーゼ生産B.サチリス168（Bacillus Genetic
Stock Center,Columbus,Ohio）の染色体DNA100μｇを制
限酵素Cla Iで消化した。フェノール抽出後DNAフラグメ
ントを１％アガロースゲル上で分離した。エレクトロエ
リューションにより若干のDNAフラクションをゲルから
溶離し、Cla Iで線状にしたpGB35（バチルスベクターpG
L112、W.M.de Vos,Thesis University of Groningen 19
83、およびpGB33のα−アミラーゼ遺伝子を含む組換え
プラスミド、第６図参照）と連結させた。連結生成物を
実施例IVに記載したように反応性B.サチリスRUB331細胞
中へ転移させた。得られたクロラムフェニコール耐性形
質転換体を0.4％カゼイン−アミロース平板上で高めら
れたプロテアーゼ活性（prot+）および低下したα−ア
ミラーゼ生産能力（amy-）について分析した。プラスミ
ドDNAをprot+ amy-形質転換体から分離し、制限部位地
図を作成した;pLP33はセリンプロテアーゼをコードする
構造遺伝子を含む3.3kbp Cla Iフラグメントを含むよう
に思われる（第７図）。pLP87（第８図）は非セリンプ
ロテアーゼに対する遺伝子情報を含む1.8kbpの染色体Cl
a Iインサートを有する。 実施例IV バチルス株の形質転換 細胞懸濁液1mlおよび連結したDNA1μｇを37℃で0.5時
間、穏やかに振りまぜてインキュベートすることにより
B.サチリス１−85（trp- amy-）を形質転換した（Anagn
ostopoulosおよびSpizigen,J.Bacteriol.（1961）81:74
1〜746）。形質転換体を、0.02％（w/v）カサミノ酸（D
ifco）および10μg/ml抗生物質を添加した最少培地寒天
平板上で抗生物質耐性について選択した。これらの形質
転換体は次に所望の構造遺伝子の存在について分析し
た。 α−アミラーゼの場合には、0.6％（w/v）KIおよび0.
3％（w/v）I2を含有する溶液で平板を覆った後ハロ（ha
los）を求めることにより；生物活性酵素のＮ−末端ア
ミノ酸配列によりin vitro合成した32p標識DNAプローブ
に対する正のハイブリッド形成により；酵素に対する抗
体との免疫沈殿により、および比較エレクトロフォーカ
シングにより行なった。 キモシンの場合には、正の選択を32p標識pLR1523DNA
とのハイブリッド形成を経て、および抗キモシン抗体に
よる免疫沈殿により行なった。 バチルスプロテアーゼに対する遺伝子を同定するた
め、形質転換体をそのカゼイン最少培地寒天平板上のハ
ロの形成能力について試験した。セリンおよび非セリン
プロテアーゼ間の差異はScheinerおよびQuiglyの方法
（Anal.Biochemistry（1982）122:58〜69）により決定
した。 選択された形質転換体を細胞融合試験において供与体
菌株とて使用した。 実施例Ｖ 細胞融合および再生 形質転換したB.サチリス株（pGB33を含むB.サチリス
株１−85、pLC87を含むB.サチリス株1S−53またはpLP33
を含むB.サチリス株PUB331）を、その中に関連抗生物質
を有する50ml NBSG−Ｘ培地（ThorneおよびStull,J.Bac
teriol.（1966）91:1012〜1020（表II、p1014））中37
℃で一夜生長させた。培養物を新NBSG−Ｘ倍地で1:1に
希釈し、10mMヨードアセトアミドの存在下にさらに１〜
1.5時間生長させた。SorvallタイプGSAローター中で5,0
00rpmで10分間遠心分離し、1.5Mスクロース、0.06M MgC
l2および0.06Mマレアートを含有する10ml SMM緩衝液中
に再び懸濁した後、細胞を2mg/mlリソチームの存在下に
37℃で２時間インキュベートすることにより細胞を原形
質体化した。原形質体を回転沈降させ（10分×5,000rp
m）、5ml SMML緩衝液（1.5Mスクース、0.06M MgCl2およ
び0.006Mマレアートを溶解したＬブロス）中に再び懸濁
し、混合し、再びペレットにした。再懸濁後、原形質体
を受容体菌株T5の原形質体、前記のように原形質体化し
た生存可能細胞、と混合し、約30％（w/v）ポリエチレ
ングリコール6,000の存在下に２分間インキュベートし
た。SMML媒質による1:3希釈および遠心分離後、ペレッ
トを少量のSMML媒質中に再び懸濁した。次いで100μ
アリコートを、0.7％（w/v）K2HPO4、0.3％（w/v）KH2P
O4、0.125％（w/v）（NH4）2SO4、0.035％（w/v）MgSO4
・7H2O、1.5％（w/v）寒天、3.7％（w/v）KCl、0.1％
（w/v）グルコース;0.2％（w/v）MnSO4、0.2％（w/v）Z
nSO4、0.2％（w/v）CoCl2、0.5％（w/v）FeSO4、６％
（w/v）NaClおよび0.5％（w/v）CaCl2を含有する0.1％
（w/v）微量成分溶液を補足した0.01％（w/v）ウシ血清
アルブミンを含む再生寒天平板上で平板培養した。さら
にこれらの平板は関連抗生物質、pGB33、pLP33およびpL
C87の場合に100〜160μｇネオマイシンを含有した。37
℃で少くとも72時間インキュベートした後、平板を、受
容体菌株は耐性であるが供与体菌株が受感性である他の
抗生物質もまた含有するウシ心臓浸出液（heart−infus
ion）寒天平板上でレプリカ平板培養した。Ａ型として
示す融合体（fusant）は実施例IVに記載した方法により
分析した。α−アミラーゼの場合に手順は次のように繰
返した。Ａ型融合体をpGB36〔トリメトプリムに対する
耐性をコードする遺伝子を含むpTL12（タナカおよびカ
ワノ、Gene（1980）10:131〜136）およびB.リヘニホル
ミスα−アミラーゼをコードする遺伝子を含むpGB33のE
coR I制限フラグメントの組換えプラスミド〕を含むB.
サイジング原形質体と融合させるとＢ型として示す融合
体が生じた。Ａ型およびＢ型の融合体はともに、32p標
識プラスミドpGB33を用いるゲノム分析により、および
比較SDSゲル−電気泳動により特性化した。最後に、得
られた融合体を種々の酵素の発酵生産のために選択し
た。 実施例VI 遺伝子的に操作したバチルス生産株によるα−アミラー
ゼ、プロテアーゼおよびキモシンの発酵生産 pGB33を含むB.サチリス株１−85との融合により（実
施例Ｖに記載したように）得られたB.リヘニホルミスT5
の遺伝子的に操作した生産菌株を工業栄養ブロス中で、
分泌したタンパク質の生産が少くとも0.5％w/vであるよ
うな、α−アミラーゼが主成分である、発酵条件のもと
で７日間培養した。この操作した菌株の生産を親菌株B.
リヘニホルミスT5の生産と比較した。生産菌株B.リヘニ
ホルミスT5により分泌された生成物（第９図レーン３参
照）およびpGB33を含む遺伝子的に操作した菌株B.リヘ
ニホルミスT5により分泌された生成物（第９図レーン２
参照）のSDSポリアクリルアミドゲル−電気泳動図によ
り示されるように、α−アミラーゼの生産はプラスミド
pGB33の導入により相当に増加した。 類似の結果がプラスミドpLP33、その導入はプロテア
ーゼの生産を改良した、およびプラスミドpLC87、その
導入はキモシンを生産できるB.リヘニホルミスT5株を生
じた、で得られた。 表Ｉはそれぞれの遺伝子的に操作した微生物の改良の
量的表示の要約結果を示す。 主題の方法はバチルスに非常に良好であることを示し
た。しかし、バチルス以外の多くの単細胞微生物が工業
的発酵に使用され、そしてそれらを効率的な形質転換を
受けつけなくする工業バチルス株のような性質を有す
る。従って主題の方法は、原核生物および真核生物例え
ば他の細菌、菌類例えば酵母菌および線状菌、原生動
物、藻類などの工業菌株で適用を見出すことができよ
う。属の種、例えばアスペルギルス（Aspergillus）、
カンジタ（Candida）、エシエリヒア（Escherichia）、
クルイベロマイセス（Kluyveromyces）、ペニシラム（P
enicillum）、シュードモナス（Pseudomonas）、サッカ
ロマイセス（Saccharomyces）およびストレプトマイセ
ス（Streptomyces）は殊に重要である。 これらの生物中およびバチルスについて示した部分中
で殊に重要なものは内生ポリペプチド、例えばα−アミ
ラーゼ、アミログルコシダーゼ、カタラーゼ、セルラー
ゼ、キモシン、β−ガラクトシダーゼ、グリコースイソ
メラーゼ、ヘミセルラーゼ、インベルダーゼ、ラクター
ゼ、リパーゼ、ペクチナーゼ、ペクチンエステラーゼ、
ペニシリンアミラーゼ、ペニシリナーゼ、プロテアー
ゼ、エキソ−およびエンド−ペクチダーゼ、プルラナー
ゼ並びにキシラナーゼの工業生産である。また外生タン
パク質例えば、哺乳動物の血液タンパク質例えば因子VI
II、ＣおよびＲ、血清アルブミン、組織プラスミノーゲ
ン活性化因子、他の血液因子例えばＶ、VI、VII、IX、
Ｘ、XIおよびXII、リンフォカイン、インターフェロン
例えばα−、β−およびγ−、哺乳動物の酵素、細胞表
面レセプター、免疫グロブリンなどが重要である。 上記結果から相同または異種の遺伝子を工業バチルス
株中へ安定に導入し、一方菌株の所望特性を保持し、バ
チルス宿主に内生の所望の表現生成物を増加した生産、
または関心のある新規表現生成物の生産における高い受
容能力を与えるための簡単で効率的な手順が提供される
ことが明らかである。転移の高い効率が達成され、実質
的な相同関係がプラスミド構築物と工業バチルス株染色
体との間に存在する場合に構造遺伝子の１つまたは複数
のコピー組込みを達成できる。主題の方法は、現在存在
する工業バチルス株を関心のある種々のポリペプチドお
よびタンパク質の効率的な発酵生産を与えるために修飾
する能力を非常に高める。 前記の発明は理解を平明にするために例示および実施
例としてかなり詳しく記載されたけれども、一定の変更
および変形を請求の範囲内で実施できることが明らかで
あろう。
フロントページの続き (72)発明者 アンドレオリ ペーター ミハエル オランダ国 3055エーイエー ロツテル ダム モレンラーン 111 (72)発明者 フオス イヴオンネ ヨハンナ オランダ国 1106デーエル アムステル ダム ゼツト オー ワーメルストラー ト 42 (72)発明者 フアン エー ヤン ヘンドリツク オランダ国 3068ベーイツクス ロツテ ルダム パルクルース ４ (72)発明者 ムーレナース レオ イエー エス エ ム オランダ国 5044エーハー チルブルク クウエンデルホフ 192 (56)参考文献 Ｍｏｌ．ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，168, ｐ．111−（1979) Ｍｏｌ．ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，177, ｐ．459−（1980) Ｊ．Ｂｕｃｔｅｒｉｏｌ．，147，ｐ. 622−（1981) Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ ｌ．，ｐ．104−108（1981) Ｍｏｌ．ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，176, ｐ．239−（1979) Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｂｓｔｖａ ｃｔｓ，73（1982）ｎｏ．53368 Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｂｓｔｖａ ｃｔｓ，73（1982）ｎｏ．38805

Claims (1)

  1. (57)【特許請求の範囲】 １．原栄養体性であり、ファージ感染および遺伝子交換
    あるいは形質転換に耐性であり、DNアーゼを分泌し、か
    つ工業的醗酵条件の下において少くとも0.5％w/vの分泌
    タンパク質の生産レベルを有している遺伝子的に操作さ
    れた工業バチルス属微生物であって、 該微生物は、プラスミド構築体、染色体中に組込まれた
    プラスミド構築体またはそのフラグメントの形において
    挿入されたDNAからなり、 該構築体は、所望のタンパク質、ポリペプチドおよび選
    択マーカーをコードする遺伝子を含んでおり、 親の工業微生物に比較し、所望のタンパク質またはポリ
    ペプチドの高められた生産能力を有する、 遺伝子的に操作された微生物。 ２．（Ａ）工業バチルス株宿主中の安定な保持および関
    心のあるポリペプチドあるいはタンパク質の発現が可能
    なDNAを、該工業バチルス株宿主中へ、効率的に導入す
    る方法にして、 （Ｂ）該工業バチルス株宿主が、原栄養体性であり、遺
    伝子交換およびファージ感染あるいは形質転換に耐性で
    あり、DNAアーゼを分泌し、かつ工業的醗酵条件下にお
    いて少くとも0.5％w/vの分泌タンパク質の生産レベルを
    有する方法であって、 フソゲンの存在下に、（イ）容易に形質転換できる和合
    性の殺されたバチルス宿主細胞であって該殺されたバチ
    ルス宿主細胞中に保持できる染色体外要素として前記DN
    Aを含む該殺されたバチルス宿主細胞と、（ロ）前記工
    業バチルス株宿主細胞とを、該工業バチルス株宿主細胞
    の選択を与える条件の下で組合せ、かつ前記殺されたバ
    チルス宿主細胞と前記工業バチルス株宿主細胞とがプロ
    トプラストとして存在し、それによって前記DNAを該工
    業バチルス株宿主細胞へ転換させ；かつ 前記DNAを含む該バチルス株宿主細胞を選択する； ことを特徴とする方法。 ３．所望のタンパク質またはポリペプチドを生産する増
    加した能力を有する工業バチルス株を製造する方法であ
    って、 （ａ）所望のタンパク質またはポリペプチドをコードす
    る遺伝子を含むDNAをフラグメントにし、 （ｂ）ベクターを前記フラグメントにしたDNAに連結さ
    せ、 （ｃ）前記連結したベクターで第１宿主細胞を形質転換
    し、 （ｄ）形質転換した第１宿主細胞を、所望遺伝子の存在
    もしくは発現について選択し、次いで形質転換した第１
    宿主細胞を殺し、 （ｅ）選択した工業バチルス宿主微生物からの細胞のプ
    ロトプラストと、前記形質転換されかつ殺された第１宿
    主細胞とを融合させ、 （ｆ）所望のタンパク質またはポリペプチドをコードす
    る遺伝子を含み、所望のタンパク質またはポリペプチド
    を生産するための増加した能力を有する、融合、再生さ
    れた細胞を選択する、 ことを特徴とする方法。 ４．段階（ｂ）の連結生成物が、CBSにNo.466.83として
    寄託されたプラスミドpGB33;CBSにNo.467.83として寄託
    されたプラスミドpGB34;CBSにNo.469.83として寄託され
    たプラスミドpLC28;およびCBSにNo.468.83として寄託さ
    れたプラスミドpLC83およびpLC87からなる群から選ばれ
    るプラスミドである請求の範囲（３）の製造方法。
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