CN104736700B - 包含脂解酶变体的组合物和方法 - Google Patents

包含脂解酶变体的组合物和方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了脂解酶变体。具体地讲，本发明提供了具有一个或多个修饰的脂解酶变体，与亲本脂解酶相比，其具有至少一种改善的特性。此外，本发明提供了包含本发明的脂解酶变体的组合物。本发明还提供了使用包含本发明的脂解酶变体的组合物来进行清洁的方法。

Description

包含脂解酶变体的组合物和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2012年10月12日提交的美国临时申请No.61/713,436的权益，该申请据此全文以引用方式并入本文。
背景技术
包括脂肪酶和角质酶在内的脂解酶已被用于洗涤剂清洁组合物中，以去除油性污渍。脂解酶功能发挥作用的一种机制是通过水解甘油三酯来生成脂肪酸。然而，清洁组合物中存在的表面活性剂和其他组分常常会抑制这些酶，从而干扰其除去油性污渍的能力。因此，需要可在清洁组合物的苛刻环境中起作用的脂解酶。
发明内容
本发明提供了改善的脂解酶，特别是可用于洗涤剂组合物的酶。具体地讲，本发明提供与亲本脂解酶相比具有一个或多个修饰(诸如置换)的脂解酶变体。这可通过以下来实现：通过改善在标准洗涤剂制剂和低表面活性剂洗涤剂制剂中的洗涤性能、酶在洗涤剂组合物中的稳定性、酶的热稳定性、底物水解、表达和/或改善酶在洗涤循环中的效力的改进的电荷/疏水性分布来对酶进行改善。本发明提供了特别适合于并且可用于多种清洁应用的变体脂解酶，其包括但不限于变体脂肪酶脂解酶。本发明还提供了使用本发明的脂解酶变体来进行清洁的方法。
在一个实施例中，本发明为脂解酶变体或其活性片段，其包含对亲本脂解酶的氨基酸修饰，其中该修饰是在脂解酶变体的有效位置处，其中在有效位置测试的修饰中的至少一种修饰满足以下标准中的至少一者：
a)某一位置，其中对于表达、在pH 8.2下的CS-61微样本活性(micro-swatchactivity)、在pH 6或pH 8.2下对对硝基苯基酯底物的活性以及洗涤剂稳定性、LAS稳定性或热稳定性来说，相对于TLL亲本的最小性能指数(PI)大于或等于0.9，并且对于这些测试中的任一者另外具有大于或等于1.0的PI；
b)某一位置，其中对于表达、在pH 8.2下的CS-61微样本活性、在pH 6或pH 8.2下对对硝基苯基酯底物的活性以及洗涤剂稳定性、LAS稳定性或热稳定性来说，相对于TLL亲本的最小性能指数(PI)大于或等于0.8，并且对于这些测试中的任一者另外具有大于或等于1.2的PI；
c)某一位置，其中对于表达、在pH 8.2下的CS-61微样本活性、在pH 6或pH 8.2下对对硝基苯基酯底物的活性以及洗涤剂稳定性、LAS稳定性或热稳定性来说，相对于TLL亲本的最小性能指数(PI)大于或等于0.5，并且对于这些测试中的任一者另外具有大于或等于1.5的PI；
并且其中有效位置选自：1、2、3、4、5、6、7、8、9、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、79、84、85、86、87、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、105、106、108、109、110、111、112、114、115、117、118、119、120、121、122、123、125、126、127、128、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、142、143、149、151、152、153、154、155、156、158、159、162、163、164、165、166、167、168、169、170、176、179、180、181、183、184、187、188、189、190、191、192、193、196、198、199、200、202、205、206、208、209、210、211、212、213、214、216、217、218、221、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、236、237、238、239、242、243、244、246、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、259、260、262、263、264、265、266、267、268以及269，其中脂肪酶变体的氨基酸位置的编号与SEQ ID NO:4中所示的疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)脂肪酶TLL的氨基酸序列相对应。
在一个实施例中，本发明是脂解酶变体或其活性片段，其包含对亲本脂解酶的氨基酸修饰，其中该修饰是在脂解酶变体的有效位置处，其中在有效位置测试的修饰中的至少50％满足以上所列出的标准a、b以及c中的至少一者，并且其中有效位置选自：1、2、3、4、5、6、8、9、13、23、24、25、26、27、28、29、33、37、38、39、46、51、52、54、58、64、66、68、69、71、72、75、90、93、94、111、120、122、123、130、131、137、140、162、163、189、250、252以及264，其中脂肪酶变体的氨基酸位置根据与SEQ ID NO:4中所示的疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶TLL的氨基酸序列的对应关系来进行编号。
在一个实施例中，本发明是脂解酶变体或其活性片段，其包含对亲本脂解酶的氨基酸修饰，其中该修饰是在脂解酶变体的有效位置处，其中在有效位置测试的修饰中的至少30％满足以上所列出的标准a、b以及c中的至少一者，并且其中有效位置选自：18、19、20、30、31、32、47、48、49、50、53、56、60、73、74、85、86、91、95、96、97、98、99、101、105、108、115、125、127、128、132、133、151、159、164、179、183、187、188、190、216、223、232、237、244、251、254、263、267以及269，其中脂肪酶变体的氨基酸位置根据与SEQ ID NO:4中所示的疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶TLL的氨基酸序列的对应关系来进行编号。
在一个实施例中，本发明是脂解酶变体或其活性片段，其包含对亲本脂解酶的氨基酸修饰，其中该修饰是在脂解酶变体的有效位置处，其中在有效位置测试的修饰中的至少15％满足以上所列出的标准a、b以及c中的至少一者，并且其中有效位置选自：7、11、12、15、22、35、40、42、43、44、45、61、63、65、67、76、77、84、87、114、117、119、121、134、135、136、143、154、155、156、158、165、166、168、176、180、191、199、200、202、209、211、214、217、221、224、225、228、229、231、233、248、249、253、255、256、265以及268，其中脂肪酶变体的氨基酸位置根据与SEQ ID NO:4中所示的疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶TLL的氨基酸序列的对应关系来进行编号。
在一个实施例中，本发明是脂解酶变体或其活性片段，其包含对亲本脂解酶的氨基酸修饰，其中该修饰是在脂解酶变体的有效位置处，其中在有效位置测试的修饰中有少于15％满足以上所列出的标准a、b以及c中的至少一者，并且其中有效位置选自：14、16、17、34、41、55、57、59、62、70、79、92、100、102、103、106、109、110、112、118、126、138、139、142、149、152、153、167、169、170、181、184、192、193、196、198、205、206、208、210、212、213、218、226、227、230、236、238、239、242、243、246、257、259、260、262以及266，其中脂肪酶变体的氨基酸位置根据与SEQ ID NO:4中所示的疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶TLL的氨基酸序列的对应关系来进行编号。
在一个实施例中，本发明是脂解酶变体或其活性片段，其包含对亲本脂解酶的氨基酸修饰，其中该修饰是在脂解酶变体的有效位置处，其中在有效位置测试的修饰中的至少50％满足以上所列出的标准a、b以及c中的至少一者，并且其中有效修饰选自：1(E,A,C,D,F,I,L,N,PQ,R,S,T,V,W,Y)；2(V,F,G,H,I,K,L,M,P,T)；3(S,A,D,E,G,H,K,Q,R,T,Y)；4(Q,A,D,F,G,I,K,L,M,N,P,R,S,W,Y)；5(D,H,I,K,L,S,T,V,W,Y)；6(L,A,E,H,I,K,M,Q,T,V,Y)；8(N,A,E,G,H,I,K,L,M,T,V,W,Y)；9(Q,A,D,E,G,H,I,K,N,R,W,Y)；13(F,A,H,K,M,N,Q,T,V,Y)；23(G,C,D,E,F,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W)；24(K,A,D,E,F,H,I,L,M,N,P,R,T,V,W,Y)；25(N,A,C,D,E,G,H,I,K,L,S,T,V,W)；26(N,C,G,K,L,M,Q,S,T,V,W,Y)；27(D,A,E,F,G,H,I,N,Q,R,S,T,V,Y)；28(A,D,E,F,G,H,I,L,M,N,P,Q,R,S)；29(P,C,E,G,H,I,K,L,M,Q,R,S,T,V,W,Y)；33(N,D,E,F,K,L,M,Q,R,S)；37(T,A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,P,Q,R,W,Y)；38(G,A,D,E,F,H,I,K,L,M,NT,V,W,Y)；39(N,C,E,H,I,L,P,Q,S,T,V,W,Y)；46(K,D,E,F,G,L,M,V,W)；51(F,A,D,E,G,I,L,M,N,P,R,S,T,Y)；52(L,A,E,G,I,M,R,T,V,W)；54(S,E,F,G,H,K,M,P,R,T,VW,Y)；58(S,D,G,H,I,K,M,Q,R,W)；64(T,C,D,E,G,I,K,L,N,R,V,Y)；66(F,A,G,H,I,L,M,N,Q,R,S,T,VW,Y)；68(A,C,G,I,S,T,V,W,Y)；69(L,A,D,G,H,I,K,N,S,T,W)；71(N,D,E,H,K,Q,R,S,T,V,W,Y)；72(T,A,D,E,F,H,I,K,L,N,P,R,S,V,Y)；75(L,A,D,E,G,H,I,M,N,Q,R,S,T,V,Y)；90(I,A,E,F,N,Q,T,V,Y)；93(L,D,H,I,K,N,P,Q,R,V,W)；94(N,D,G,K,M,P,R,S,T,V)；111(D,A,E,F,L,Q,T,V,W)；120(V,G,H,I,N,S,W,Y)；122(D,A,E,F,H,I,N,S,T,Y)；123(T,E,G,I,K,L,M,N,Q,W)；130(D,A,C,E,F,G,H,Q,R,T,V,W,Y)；131(A,C,H,I,K,N,Q,R,S,T,W,Y)；137(D,A,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y)；140(V,C,E,F,I,L,M,N,Q,T)；162(N,D,E,F,G,H,I,K,M,P,Q,R,S,Y)；163(G,A,F,L,M,N,P,R,S,W,Y)；189(T,D,E,G,K,M,N,Q,R,S,V)；250(P,D,E,G,K,Q,R,S,T)；252(I,A,C,D,E,F,G,H,K,L,N,Q,R,S,T,W)；以及264(L,C,E,G,H,M,N,P,Q,R,S,T)，其中脂肪酶变体的氨基酸位置根据与SEQ ID NO:4中所示的疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶TLL的氨基酸序列的对应关系来进行编号。
在一个实施例中，本发明是脂解酶变体或其活性片段，其包含对亲本脂解酶的氨基酸修饰，其中该修饰是在脂解酶变体的有效位置处，其中在有效位置测试的修饰中的至少30％满足以上所列出的标准a、b以及c中的至少一者，并且其中有效修饰选自：1(E,A,C,D,F,I,L,N,PQ,R,S,T,V,W,Y)；2(V,F,G,H,I,K,L,M,P,T)；3(S,A,D,E,G,H,K,Q,R,T,Y)；4(Q,A,D,F,G,I,K,L,M,N,P,R,S,W,Y)；5(D,H,I,K,L,S,T,V,W,Y)；6(L,A,E,H,I,K,M,Q,T,V,Y)；8(N,A,E,G,H,I,K,L,M,T,V,W,Y)；9(Q,A,D,E,G,H,I,K,N,R,W,Y)；13(F,A,H,K,M,N,Q,T,V,Y)；18(A,C,H,K,M,N,Q,S,W)；19(A,C,G,I,L,T,V,W)；20(A,G,I,P,Q,S,T)；23(G,C,D,E,F,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W)；24(K,A,D,E,F,H,I,L,M,N,P,R,T,V,W,Y)；25(N,A,C,D,E,G,H,I,K,L,S,T,V,W)；26(N,C,G,K,L,M,Q,S,T,V,W,Y)；27(D,A,E,F,G,H,I,N,Q,R,S,T,V,Y)；28(A,D,E,F,G,H,I,L,M,N,P,Q,R,S)；29(P,C,E,G,H,I,K,L,M,Q,R,S,T,V,W,Y)；30(A,D,H,L,N,R,V,W)；31(G,D,E,H,M,P,Q,S,V)；32(T,A,I,M,Q,R,S)；33(N,D,E,F,K,L,M,Q,R,S)；37(T,A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,P,Q,R,W,Y)；38(G,A,D,E,F,H,I,K,L,M,NT,V,W,Y)；39(N,C,E,H,I,L,P,Q,S,T,V,W,Y)；46(K,D,E,F,G,L,M,V,W)；47(A,D,E,F,H,M,T,W)；48(D,E,G,H,L,P,Q)；49(A,G,H,K,L,V,W)；50(T,A,D,F,K,L,R,S,W)；51(F,A,D,E,G,I,L,M,N,P,R,S,T,Y)；52(L,A,E,G,I,M,R,T,V,W)；53(Y,E,G,H,K,L,S,W)；54(S,E,F,G,H,K,M,P,R,T,VW,Y)；56(E,H,K,R,T,V)；58(S,D,G,H,I,K,M,Q,R,W)；60(V,G,K,L,Y)；64(T,C,D,E,G,I,K,L,N,R,V,Y)；66(F,A,G,H,I,L,M,N,Q,R,S,T,VW,Y)；68(A,C,G,I,S,T,V,W,Y)；69(L,A,D,G,H,I,K,N,S,T,W)；71(N,D,E,H,K,Q,R,S,T,V,W,Y)；72(T,A,D,E,F,H,I,K,L,N,P,R,S,V,Y)；73(N,E,G,H,K,R,S)；74(K,A,D,E,G,H,N,Q,S)；75(L,A,D,E,G,H,I,M,N,Q,R,S,T,V,Y)；85(S,F,H,I,N,Q,T)；86(I,L,M,P,Q,T,V,Y)；90(I,A,E,F,N,Q,T,V,Y)；91(G,E,F,H,I,M,Q,R)；93(L,D,H,I,K,N,P,Q,R,V,W)；94(N,D,G,K,M,P,R,S,T,V)；95(F,G,H,K,L,Q,T,V,W)；96(D,A,K,P,R,V)；97(L,A,D,I,M,Q,T)；98(K,D,E,H,I,M,Q)；99(E,D,K,P,Q,S,T,W)；101(N,C,D,E,H,M,Y)；105(S,A,D,E,F,K,P,W)；108(R,E,F,K,M,Q,Y)；111(D,A,E,F,L,Q,T,V,W)；115(S,G,I,L,M,N,R,T,V)；120(V,G,H,I,N,S,W,Y)；122(D,A,E,F,H,I,N,S,T,Y)；123(T,E,G,I,K,L,M,N,Q,W)；125(R,C,G,I,N,Q,T,Y)；127(K,D,E,F,G,R,T)；128(V,C,H,I,L,N,S,W,Y)；130(D,A,C,E,F,G,H,Q,R,T,V,W,Y)；131(A,C,H,I,K,N,Q,R,S,T,W,Y)；132(V,C,D,H,I,K,Q,R,W)；133(R,E,F,I,N,Q,V)；137(D,A,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y)；140(V,C,E,F,I,L,M,N,Q,T)；151(L,I,M,N,P,T,V,W)；159(L,E,M,Q,R,W)；162(N,D,E,F,G,H,I,K,M,P,Q,R,S,Y)；163(G,A,F,L,M,N,P,R,S,W,Y)；164(Y,D,N,R,S,V)；179(R,E,H,I,K,L,Q,V)；183(E,H,M,Q,S,T,V,Y)；187(V,G,H,L,N,Q,S,T,W)；188(Q,C,E,F,H,R,T)；189(T,D,E,G,K,M,N,Q,R,S,V)；190(G,D,H,R,S,Y)；216(S,D,G,N,Q,V,W)；223(K,A,H,L,M,Q,S,T,V)；232(R,C,D,I,L,M,P,T,W)；237(K,E,H,I,L,T,W,Y)；244(T,A,F,I,L,M,P,Q,S)；250(P,D,E,G,K,Q,R,S,T)；251(N,D,M,Q,S,T,W,Y)；252(I,A,C,D,E,F,G,H,K,L,N,Q,R,S,T,W)；254(D,A,H,K,N,P,T)；256(P,A,D,S,T)；263(G,C,H,I,K,M,V)；264(L,C,E,G,H,M,N,P,Q,R,S,T)；267(T,G,I,L,M,P,W)；以及269(L,D,F,M,Q,V,W)，其中脂肪酶变体的氨基酸位置根据与SEQID NO:4中所示的疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶TLL的氨基酸序列的对应关系来进行编号。
在一个实施例中，本发明是脂解酶变体或其活性片段，其包含对亲本脂解酶的氨基酸修饰，其中该修饰是在脂解酶变体的有效位置处，其中在有效位置测试的修饰中的至少15％满足以上所列出的标准a、b以及c中的至少一者，并且其中有效修饰选自：1(E,A,C,D,F,I,L,N,PQ,R,S,T,V,W,Y)；2(V,F,G,H,I,K,L,M,P,T)；3(S,A,D,E,G,H,K,Q,R,T,Y)；4(Q,A,D,F,G,I,K,L,M,N,P,R,S,W,Y)；5(D,H,I,K,L,S,T,V,W,Y)；6(L,A,E,H,I,K,M,Q,T,V,Y)；7(F,H,M,V,Y)；8(N,A,E,G,H,I,K,L,M,T,V,W,Y)；9(Q,A,D,E,G,H,I,K,N,R,W,Y)；11(N,H,K,V,Y)；12(L,F,H,V,W)；13(F,A,H,K,M,N,Q,T,V,Y)；15(Q,G,H,M,S)；18(A,C,H,K,M,N,Q,S,W)；19(A,C,G,I,L,T,V,W)；20(A,G,I,P,Q,S,T)；22(C,H,L,M)；23(G,C,D,E,F,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W)；24(K,A,D,E,F,H,I,L,M,N,P,R,T,V,W,Y)；25(N,A,C,D,E,G,H,I,K,L,S,T,V,W)；26(N,C,G,K,L,M,Q,S,T,V,W,Y)；27(D,A,E,F,G,H,I,N,Q,R,S,T,V,Y)；28(A,D,E,F,G,H,I,L,M,N,P,Q,R,S)；29(P,C,E,G,H,I,K,L,M,Q,R,S,T,V,W,Y)；30(A,D,H,L,N,R,V,W)；31(G,D,E,H,M,P,Q,S,V)；32(T,A,I,M,Q,R,S)；33(N,D,E,F,K,L,M,Q,R,S)；35(T,E,K,R)；37(T,A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,P,Q,R,W,Y)；38(G,A,D,E,F,H,I,K,L,M,NT,V,W,Y)；39(N,C,E,H,I,L,P,Q,S,T,V,W,Y)；40(A,F,M,S,W)；42(P,C,G,I,V,W)；43(E,D,I,M,R,T)；44(V,H,I,T)；45(E,F,Q,V)；46(K,D,E,F,G,L,M,V,W)；47(A,D,E,F,H,M,T,W)；48(D,E,G,H,L,P,Q)；49(A,G,H,K,L,V,W)；50(T,A,D,F,K,L,R,S,W)；51(F,A,D,E,G,I,L,M,N,P,R,S,T,Y)；52(L,A,E,G,I,M,R,T,V,W)；53(Y,E,G,H,K,L,S,W)；54(S,E,F,G,H,K,M,P,R,T,VW,Y)；56(E,H,K,R,T,V)；58(S,D,G,H,I,K,M,Q,R,W)；60(V,G,K,L,Y)；61(G,A,D,L,R)；63(V,K,Q,T)；64(T,C,D,E,G,I,K,L,N,R,V,Y)；65(G,L,V,Y)；66(F,A,G,H,I,L,M,N,Q,R,S,T,VW,Y)；67(L,H,I,Q,V)；68(A,C,G,I,S,T,V,W,Y)；69(L,A,D,G,H,I,K,N,S,T,W)；71(N,D,E,H,K,Q,R,S,T,V,W,Y)；72(T,A,D,E,F,H,I,K,L,N,P,R,S,V,Y)；73(N,E,G,H,K,R,S)；74(K,A,D,E,G,H,N,Q,S)；75(L,A,D,E,G,H,I,M,N,Q,R,S,T,V,Y)；76(I,H,S,V)；77(V,A,I,L,N,T)；84(R,H,Q,W)；85(S,F,H,I,N,Q,T)；86(I,L,M,P,Q,T,V,Y)；87(E,A,D,G,P,V)；90(I,A,E,F,N,Q,T,V,Y)；91(G,E,F,H,I,M,Q,R)；93(L,D,H,I,K,N,P,Q,R,V,W)；94(N,D,G,K,M,P,R,S,T,V)；95(F,G,H,K,L,Q,T,V,W)；96(D,A,K,P,R,V)；97(L,A,D,I,M,Q,T)；98(K,D,E,H,I,M,Q)；99(E,D,K,P,Q,S,T,W)；101(N,C,D,E,H,M,Y)；105(S,A,D,E,F,K,P,W)；108(R,E,F,K,M,Q,Y)；111(D,A,E,F,L,Q,T,V,W)；114(T,F,I,M,V)；115(S,G,I,L,M,N,R,T,V)；117(W,H,K,Q,V)；119(S,D,I,Q,T,V)；120(V,G,H,I,N,S,W,Y)；121(A,K,Q)；122(D,A,E,F,H,I,N,S,T,Y)；123(T,E,G,I,K,L,M,N,Q,W)；125(R,C,G,I,N,Q,T,Y)；127(K,D,E,F,G,R,T)；128(V,C,H,I,L,N,S,W,Y)；130(D,A,C,E,F,G,H,Q,R,T,V,W,Y)；131(A,C,H,I,K,N,Q,R,S,T,W,Y)；132(V,C,D,H,I,K,Q,R,W)；133(R,E,F,I,N,Q,V)；134(E,L,P,V)；135(H,F,K,T)；136(P,D,Q,R)；137(D,A,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y)；140(V,C,E,F,I,L,M,N,Q,T)；143(T,A,G,N,S)；151(L,I,M,N,P,T,V,W)；154(V,F,I,L,M,Y)；155(A,G,S,T)；156(G,F,M,T,W)；158(D,E,F,Y)；159(L,E,M,Q,R,W)；162(N,D,E,F,G,H,I,K,M,P,Q,R,S,Y)；163(G,A,F,L,M,N,P,R,S,W,Y)；164(Y,D,N,R,S,V)；165(D,I,P,Y)；166(I,D,G,W)；168(V,G,L,Q)；176(V,F,I,L,N,W)；179(R,E,H,I,K,L,Q,V)；180(A,D,K,Q,T)；183(E,H,M,Q,S,T,V,Y)；187(V,G,H,L,N,Q,S,T,W)；188(Q,C,E,F,H,R,T)；189(T,D,E,G,K,M,N,Q,R,S,V)；190(G,D,H,R,S,Y)；191(G,F,L,V)；199(T,G,N,V)；200(N,A,P,S)；202(I,L,M,P,V)；209(R,H,S,T)；211(F,I,R,T,W)；214(S,A,D,M)；216(S,D,G,N,Q,V,W)；217(S,H,K,V)；221(W,F,G,Y)；223(K,A,H,L,M,Q,S,T,V)；224(S,A,F,P)；225(G,C,E,K,R)；227(L,C,H,M)；228(V,A,E,R)；229(P,I,K,M,S)；231(T,G,H,K,L,M)；232(R,C,D,I,L,M,P,T,W)；233(N,D,G,H,Q)；237(K,E,H,I,L,T,W,Y)；244(T,A,F,I,L,M,P,Q,S)；248(N,D,L,Y)；249(Q,E,G,T)；250(P,D,E,G,K,Q,R,S,T)；251(N,D,M,Q,S,T,W,Y)；252(I,A,C,D,E,F,G,H,K,L,N,Q,R,S,T,W)；253(P,F,H,N,R)；254(D,A,H,K,N,P,T)；255(I,F,L,W)；256(P,A,D,S,T)；263(G,C,H,I,K,M,V)；264(L,C,E,G,H,M,N,P,Q,R,S,T)；265(I,L,M,Q,R,W)；267(T,G,I,L,M,P,W)；268(C,D,H,N)；以及269(L,D,F,M,Q,V,W)，其中脂肪酶变体的氨基酸位置根据与SEQ ID NO:4中所示的疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶TLL的氨基酸序列的对应关系来进行编号。
在一个实施例中，本发明是脂解酶变体或其活性片段，其包含对亲本脂解酶的氨基酸修饰，其中该修饰是在脂解酶变体的有效位置处，其中在有效位置测试的修饰中的至少一者满足以上所列出的标准a、b以及c中的至少一者，并且其中有效修饰选自：1(E,A,C,D,F,I,L,N,PQ,R,S,T,V,W,Y)；2(V,F,G,H,I,K,L,M,P,T)；3(S,A,D,E,G,H,K,Q,R,T,Y)；4(Q,A,D,F,G,I,K,L,M,N,P,R,S,W,Y)；5(D,H,I,K,L,S,T,V,W,Y)；6(L,A,E,H,I,K,M,Q,T,V,Y)；7(F,H,M,V,Y)；8(N,A,E,G,H,I,K,L,M,T,V,W,Y)；9(Q,A,D,E,G,H,I,K,N,R,W,Y)；11(N,H,K,V,Y)；12(L,F,H,V,W)；13(F,A,H,K,M,N,Q,T,V,Y)；14(A,S,V)；15(Q,G,H,M,S)；16(Y,H,W)；17(S,E)；18(A,C,H,K,M,N,Q,S,W)；19(A,C,G,I,L,T,V,W)；20(A,G,I,P,Q,S,T)；22(C,H,L,M)；23(G,C,D,E,F,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W)；24(K,A,D,E,F,H,I,L,M,N,P,R,T,V,W,Y)；25(N,A,C,D,E,G,H,I,K,L,S,T,V,W)；26(N,C,G,K,L,M,Q,S,T,V,W,Y)；27(D,A,E,F,G,H,I,N,Q,R,S,T,V,Y)；28(A,D,E,F,G,H,I,L,M,N,P,Q,R,S)；29(P,C,E,G,H,I,K,L,M,Q,R,S,T,V,W,Y)；30(A,D,H,L,N,R,V,W)；31(G,D,E,H,M,P,Q,S,V)；32(T,A,I,M,Q,R,S)；33(N,D,E,F,K,L,M,Q,R,S)；34(I,P)；35(T,E,K,R)；37(T,A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,P,Q,R,W,Y)；38(G,A,D,E,F,H,I,K,L,M,NT,V,W,Y)；39(N,C,E,H,I,L,P,Q,S,T,V,W,Y)；40(A,F,M,S,W)；41(C,V)；42(P,C,G,I,V,W)；43(E,D,I,M,R,T)；44(V,H,I,T)；45(E,F,Q,V)；46(K,D,E,F,G,L,M,V,W)；47(A,D,E,F,H,M,T,W)；48(D,E,G,H,L,P,Q)；49(A,G,H,K,L,V,W)；50(T,A,D,F,K,L,R,S,W)；51(F,A,D,E,G,I,L,M,N,P,R,S,T,Y)；52(L,A,E,G,I,M,R,T,V,W)；53(Y,E,G,H,K,L,S,W)；54(S,E,F,G,H,K,M,P,R,T,VW,Y)；55(F,G,W)；56(E,H,K,R,T,V)；57(D,S)；58(S,D,G,H,I,K,M,Q,R,W)；59(G,D)；60(V,G,K,L,Y)；61(G,A,D,L,R)；62(D,N)；63(V,K,Q,T)；64(T,C,D,E,G,I,K,L,N,R,V,Y)；65(G,L,V,Y)；66(F,A,G,H,I,L,M,N,Q,R,S,T,VW,Y)；67(L,H,I,Q,V)；68(A,C,G,I,S,T,V,W,Y)；69(L,A,D,G,H,I,K,N,S,T,W)；70(D,S)；71(N,D,E,H,K,Q,R,S,T,V,W,Y)；72(T,A,D,E,F,H,I,K,L,N,P,R,S,V,Y)；73(N,E,G,H,K,R,S)；74(K,A,D,E,G,H,N,Q,S)；75(L,A,D,E,G,H,I,M,N,Q,R,S,T,V,Y)；76(I,H,S,V)；77(V,A,I,L,N,T)；79(S,A,M)；84(R,H,Q,W)；85(S,F,H,I,N,Q,T)；86(I,L,M,P,Q,T,V,Y)；87(E,A,D,G,P,V)；90(I,A,E,F,N,Q,T,V,Y)；91(G,E,F,H,I,M,Q,R)；92(N,A,T)；93(L,D,H,I,K,N,P,Q,R,V,W)；94(N,D,G,K,M,P,R,S,T,V)；95(F,G,H,K,L,Q,T,V,W)；96(D,A,K,P,R,V)；97(L,A,D,I,M,Q,T)；98(K,D,E,H,I,M,Q)；99(E,D,K,P,Q,S,T,W)；100(I,M)；101(N,C,D,E,H,M,Y)；102(D,H)；103(I,Y)；105(S,A,D,E,F,K,P,W)；106(G,H)；108(R,E,F,K,M,Q,Y)；109(G,T)；110(H,N,S)；111(D,A,E,F,L,Q,T,V,W)；112(G,F,Q)；114(T,F,I,M,V)；115(S,G,I,L,M,N,R,T,V)；117(W,H,K,Q,V)；118(R,P)；119(S,D,I,Q,T,V)；120(V,G,H,I,N,S,W,Y)；121(A,K,Q)；122(D,A,E,F,H,I,N,S,T,Y)；123(T,E,G,I,K,L,M,N,Q,W)；125(R,C,G,I,N,Q,T,Y)；126(Q,I,M)；127(K,D,E,F,G,R,T)；128(V,C,H,I,L,N,S,W,Y)；130(D,A,C,E,F,G,H,Q,R,T,V,W,Y)；131(A,C,H,I,K,N,Q,R,S,T,W,Y)；132(V,C,D,H,I,K,Q,R,W)；133(R,E,F,I,N,Q,V)；134(E,L,P,V)；135(H,F,K,T)；136(P,D,Q,R)；137(D,A,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y)；138(Y,F)；139(RLT)；140(V,C,E,F,I,L,M,N,Q,T)；142(F,H,Y)；143(T,A,G,N,S)；149(G,A)；151(L,I,M,N,P,T,V,W)；152(A,I,V)；153(T,S)；154(V,F,I,L,M,Y)；155(A,G,S,T)；156(G,F,M,T,W)；158(D,E,F,Y)；159(L,E,M,Q,R,W)；162(N,D,E,F,G,H,I,K,M,P,Q,R,S,Y)；163(G,A,F,L,M,N,P,R,S,W,Y)；164(Y,D,N,R,S,V)；165(D,I,P,Y)；166(I,D,G,W)；167(D,N)；168(V,G,L,Q)；169(F,S,Y)；170(S,G)；176(V,F,I,L,N,W)；179(R,E,H,I,K,L,Q,V)；180(A,D,K,Q,T)；181(F,L)；183(E,H,M,Q,S,T,V,Y)；184(F,W,Y)；187(V,G,H,L,N,Q,S,T,W)；188(Q,C,E,F,H,R,T)；189(T,D,E,G,K,M,N,Q,R,S,V)；190(G,D,H,R,S,Y)；191(G,F,L,V)；192(T,N,P)；193(L,T)；196(I,V)；198(H,G,S)；199(T,G,N,V)；200(N,A,P,S)；202(I,L,M,P,V)；205(R,D)；206(L,N)；208(P,E,N)；209(R,H,S,T)；210(E,S)；211(F,I,R,T,W)；212(G,Q)；213(Y,S)；214(S,A,D,M)；216(S,D,G,N,Q,V,W)；217(S,H,K,V)；218(P,T)；221(W,F,G,Y)；223(K,A,H,L,M,Q,S,T,V)；224(S,A,F,P)；225(G,C,E,K,R)；226(T,D,N)；227(L,C,H,M)；228(V,A,E,R)；229(P,I,K,M,S)；230(V,W)；231(T,G,H,K,L,M)；232(R,C,D,I,L,M,P,T,W)；233(N,D,G,H,Q)；236(V,W)；237(K,E,H,I,L,T,W,Y)；238(I,V)；239(E,K)；242(D,T)；243(A,S)；244(T,A,F,I,L,M,P,Q,S)；246(G,I)；248(N,D,L,Y)；249(Q,E,G,T)；250(P,D,E,G,K,Q,R,S,T)；251(N,D,M,Q,S,T,W,Y)；252(I,A,C,D,E,F,G,H,K,L,N,Q,R,S,T,W)；253(P,F,H,N,R)；254(D,A,H,K,N,P,T)；255(I,F,L,W)；256(P,A,D,S,T)；257(A,W,Y)；259(L,W,Y)；260(W,P)；262(F,D,K)；263(G,C,H,I,K,M,V)；264(L,C,E,G,H,M,N,P,Q,R,S,T)；265(I,L,M,Q,R,W)；266(G,E)；267(T,G,I,L,M,P,W)；268(C,D,H,N)；以及269(L,D,F,M,Q,V,W)，其中脂肪酶变体的氨基酸位置根据与SEQ ID NO:4中所示的疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶TLL的氨基酸序列的对应关系来进行编号。
在一个实施例中，本发明为包含至少一种如上文所列出的脂解酶变体的清洁组合物。在一些实施例中，本发明还包括另外的酶，所述酶来自：半纤维素酶、纤维素酶、过氧化物酶、脂解酶、金属脂解酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、过水解酶、角质酶、果胶酶、果胶酸裂解酶、甘露聚糖酶、角蛋白酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂氧合酶、木质素酶、支链淀粉酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、麦拉宁酶、β-葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明质酸酶、软骨素酶、漆酶和淀粉酶。
在一个实施例中，本发明为一种清洁的方法，其包括将表面或物品与包含至少一种上文列出的脂解酶变体的清洁组合物接触。
附图说明
图1为pHYT-TLLwt的质粒图谱。
图2示出不同辅剂水平下TLL脂肪酶的脂肪酶活性。
具体实施方式
本发明提供了改善的脂解酶，特别是可用于洗涤剂组合物的酶。具体地讲，本发明提供与亲本脂解酶相比具有一个或多个修饰(诸如置换)的脂解酶变体。这可通过以下来实现：通过改善洗涤性能、酶在洗涤剂组合物中的稳定性、酶的热稳定性、和/或改进的底物水解，和/或改善酶在洗涤循环中的效力的改进的电荷/疏水性分布来对酶进行改善。本发明提供了特别适合于并且可用于多种清洁应用的变体脂解酶，其包括但不限于变体脂肪酶脂解酶。本发明包括包含本文示出的变体脂解酶(例如变体脂肪酶)中的至少一种的组合物。一些此类组合物包括洗涤剂组合物。本发明提供了嗜热丝孢菌属物种(Thermomycesspecies)变体脂解酶和包含一种或多种这种变体脂肪酶的组合物。可将本发明的脂解酶变体与可用于洗涤剂组合物中的其他酶组合。本发明还提供与已知的脂解酶(诸如已知的脂肪酶脂解酶)相比，具有可比或改善的洗涤性能的酶组合物。本发明还提供了使用本发明的脂解酶变体来进行清洁的方法。
本发明包括具有对亲本脂解酶的一个或多个修饰的脂解酶的酶变体。酶变体通过以下方式可用于洗涤剂组合物中：具有针对洗涤性能、底物水解、酶在洗涤剂组合物中的稳定性以及酶的热稳定性的最小性能指数，而同时具有对亲本脂解酶改善的这些特征中的至少一种。
另外，本发明在脂解酶的一个或多个氨基酸位置处提供了修饰，诸如置换，所述脂解酶可用于洗涤剂组合物中，其中有利的修饰导致针对洗涤性能、底物水解、酶在洗涤剂组合物中的稳定性以及酶的热稳定性的最小性能指数，而同时具有对亲本脂解酶改善的这些特征中的至少一种。这些修饰被认为是本发明的合适的修饰。这些氨基酸位置可被认为是对亲本脂解酶的组合修饰的有用位置。发现是有用位置的脂解酶氨基酸位置可进一步通过具有适合用于洗涤剂组合物的多个修饰来表征。对于各位置，更大数量的可能合适的修饰表示特定位置的更高有效性。
除非本文另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域普通技术人员所一般理解的含义相同的含义。尽管与本文描述的方法和材料相似或等同的多种方法和材料均可用于本发明的实施，但是本文中只描述了一些方法和材料。相应地，接下来定义的术语通过整体参照本说明书来更完整地描述。据此将本文提及的所有专利、专利申请、文章和出版物，包括上文中和下文中的，均明确地以引用的方式并入本文。
另外，如本文所用，除非上下文明确指明，否则单数术语“一”、“一个”和“所述”包括复数指代。除非另外指明，否则分别地，核酸从左至右以5'至3'取向写出；氨基酸序列从左至右以氨基至羧基取向写出。应当理解，本发明不限于所描述的具体方法学、方案和试剂，因为这些方面可根据本领域技术人员使用它们的背景而有所变化。
在本说明书通篇中给出的每一个最大数值限度意在包括每一个更低数值限度，就如同此类更低数值限度在本文中明确地写出一样。在本说明书通篇中给出的每一个最小数值限度将包括每一个更高数值限度，就如同此类更高树脂限度在本文中明确地写出一样。在本说明书通篇中给出的每一个数值范围将包括落入此类较宽数值范围内的每一个较窄数值范围，就如同此类较窄数值范围在本文中全部明确地写出一样。
“蛋白质”或“多肽”包含氨基酸残基的多聚序列。在本文中，术语“蛋白质”与“多肽”可互换使用。遵照国际纯化学及应用化学联合会-国际生物化学联合会的生物化学命名委员会(IUPAC-IUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature,JCBN))所定义的氨基酸的单字母和三字母代码在整个本公开中使用。还应理解，由于遗传密码的简并性，多肽可由不止一种核苷酸序列编码。突变可按以下方式命名：亲本氨基酸的单字母代码，后跟编号，然后是变体氨基酸的单字母代码。例如，第87位处的甘氨酸(G)突变为丝氨酸(S)可表示为“G087S”或“G87S”。可通过在突变之间插入“-”来表示多重突变。例如，第87和90位处的突变可表示为“G087S-A090Y”或“G87S-A90Y”或“G87S+A90Y”或“G087S+A090Y”。
术语“来自”和“得自”不仅指由所考虑的生物菌株产生或可产生的脂解酶，还指由从这种菌株分离的DNA序列编码并在包含这种DNA序列的宿主生物中产生的脂解酶。另外，所述术语指由合成来源的和/或cDNA来源的DNA序列编码的，并且具有所考虑的脂解酶的识别特性的脂解酶。举例说明，“来自嗜热丝孢菌属的脂解酶”是指由嗜热丝孢菌属天然产生的具有脂解活性的那些酶，以及类似于由嗜热丝孢菌属源产生的那些酶，但通过使用基因工程技术、由使用编码脂解酶的核酸转化的非嗜热丝孢菌属生物产生的脂解酶。
如本文所用，“同源性”指序列相似性或同一性，其中同一性是优选的。同源性可以使用本领域已知的标准技术测定(参见例如Smith and Waterman,Adv.Appl.Math.2:482(1981)(Smith和Waterman，《应用数学进展》，第2卷，第482页，1981年)；Needleman andWunsch,J.Mol.Biol.48:443(1970)(Needleman和Wunsch，《分子生物学杂志》，第48卷，第443页，1970年)；Pearson and Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444(1988)(Pearson和Lipman，《美国国家科学院院刊》，第85卷，第2444页，1988年)；软件程序，诸如在威斯康星遗传学软件包(Wisconsin Genetics Software Package)(威斯康星州麦迪逊市遗传学计算机小组(Genetics Computer Group,Madison,WI))中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA；和Devereux et al.,Nucl.Acid Res.12:387-395(1984)(Devereux等人，《核酸研究》，第12卷，第387-395页，1984年))。可用的算法的一个例子是PILEUP。PILEUP利用渐进性逐对比对从一组相关序列产生多序列比对。其还可以绘出关系树，所述关系树示出了用于产生比对的集群关系。PILEUP使用Feng和Doolittle的简化渐进式比对方法(参见Feng andDoolittle,J.Mol.Evol.35:351-360(1987)(Feng和Doolittle，《分子进化杂志》，第35卷，第351-360页，1987年))。所述方法与Higgins和Sharp描述的方法(参见Higgins andSharp,CABIOS 5:151-153(1989)(Higgins和Sharp，《计算机在生物科学中的应用》，第5卷，第151-153页，1989年))类似。可用的PILEUP参数包括：默认空位权重＝3.00，默认空位长度权重＝0.10，以及加权的末端空位。可用的算法的另一个例子是Altschul等人描述的BLAST算法(参见Altschul et al.,J.Mol.Biol.215:403-410(1990)(Altschul等人，《分子生物学杂志》，第215卷，第403-410页，1990年)；以及Karlin and Altschul,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5787(1993)(Karlin和Altschul，《美国国家科学院院刊》，第90卷，第5873-5787页，1993年))。特别有用的BLAST程序为WU-BLAST-2程序(参见Altschul et al.,Meth.Enzymol.266:460-480(1996)(Altschul等人，《酶学方法》，第266卷，第460-480页，1996年))。WU-BLAST-2使用数种搜索参数，大部分参数设定为默认值。可调参数设定为如下值：重叠跨度(overlap span)＝1，重叠分数(overlap fraction)＝0.125，字串阈值(word threshold)(T)＝11。HSP S和HSP S2参数是动态值，并且由程序自身根据特定序列的组成和被用来搜索所关注的序列的特定数据库的组成来确定。然而，可以调整所述值来增加灵敏度。
参考序列和所关注的测试序列之间的序列同一性百分数可由本领域技术人员容易地测定。多核苷酸或多肽序列共有的同一性百分数通过分子之间序列信息的直接比较测定，所述比较通过序列比对并使用本领域已知的方法确定同一性来进行。适用于确定序列相似性的算法的例子是BLAST算法(参见Altschul,et al.,J.Mol.Biol.,215:403-410(1990)(Altschul等人，《分子生物学杂志》，第215卷，第403-410页，1990年))。用于进行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心(National Center for BiotechnologyInformation)公开获得。此算法涉及首先通过在查询序列中确定长度为W的短字串来确定高打分序列对(high scoring sequence pair,HSP)，所述短字串当与数据库序列中相同长度的字串比对时匹配或满足某取正值的阈值分数T。这些最初的邻近命中字串充当起点来寻找含有它们的更长的HSP。使命中字串沿进行比较的两条序列的每一条朝两个方向扩展至累积比对分数不能增加为止。命中字串的延伸在如下情况会停止：累积比对分数从最大获得值下降达数量X；累积分数达到零或零以下；或者到达任一序列的末端。BLAST算法参数W、T和X决定所述比对的灵敏度和速度。BLAST程序使用的默认值是字长(W)为11、BLOSUM62打分矩阵(参见Henikoff and Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915(1992)(Henikoff和Henikoff，《美国国家科学院院刊》，第89卷，第10915页，1992年))，比对数(B)为50，期望值(E)为10，M’5，N’-4，以及对两条链的比较。
BLAST算法然后对两条序列之间的相似性进行统计分析(参见例如Karlin和Altschul，出处同上)。BLAST算法提供的一种相似性量度是最小合计概率(smallest sumprobability,P(N))，其提供两条核苷酸或氨基酸序列之间的匹配会偶然发生的概率。例如，如果在测试核酸与脂解酶核酸的比较中最小合计概率低于约0.1，更优选低于约0.01，并且最优选低于约0.001，则所述核酸被认为与本发明的脂解酶核酸相似。在测试核酸编码脂解酶多肽的情况中，如果比较得到低于约0.5，更优选低于约0.2的最小合计概率，则其被认为与指定的脂解酶核酸相似。
在两条或更多条核酸或多肽序列的语境中，“相同”或“同一性”百分数是指，当针对最大相似性进行比较和比对时，两条或更多条序列是相同的或分别具有指定百分比的相同核酸残基或氨基酸残基，如使用序列比较算法或通过目测所确定的。受试氨基酸序列与参考(即查询)氨基酸序列的“序列同一性百分数”或“同一性％”或“序列同一性％”或“氨基酸序列同一性％”意指当将序列进行最佳比对时，在比较长度上受试氨基酸序列与查询氨基酸序列相同(即以氨基酸比氨基酸计)达指定的百分数。因此，就两条氨基酸序列而言，80％氨基酸序列同一性或80％同一性意指两条最佳比对的氨基酸序列中80％氨基酸残基是相同的。
受试核酸序列与参考(即查询)核酸序列的“序列同一性百分数”或“同一性％”或“序列同一性％”或“核苷酸序列同一性％”意指当将序列进行最佳比对时，在比较长度上受试核酸序列与查询序列相同(即以多核苷酸序列的核苷酸比核苷酸计)达指定的百分数。因此，就两条核酸序列而言，80％核苷酸序列同一性或80％同一性意指两条最佳比对的核酸序列中80％核苷酸残基是相同的。
“最佳比对”或“最佳比对的”指两条(或更多条)序列的给出最高同一性百分比分数的比对。例如，可通过将两条蛋白质序列进行手动比对使得每条序列中最大数目的相同氨基酸残基被一起比对，或通过使用本文描述的或本领域已知的软件程序或方法，来实现所述序列的最佳比对。可通过将两条核酸序列进行手动比对使得每条序列中最大数目的相同核苷酸残基被一起比对，或通过使用本文描述的或本领域已知的软件程序或方法，来实现所述序列的最佳比对。
在一些实施例中，当用限定的参数，例如限定的氨基酸置换矩阵、空位存在罚分(也称为空位开放罚分)和空位延伸罚分来比对两条多肽序列，以实现所述对序列可能的最高相似性分数时，这两条多肽序列被认为是“最佳比对的”。在多肽序列比对算法(例如BLASTP)中，BLOSUM62打分矩阵(参见Henikoff和Henikoff，出处同上)通常用作默认的打分置换矩阵。施加空位存在罚分以在被比对的序列中的一者中引入单个氨基酸空位，并为所述空位中的每一个残基位置施加空位延伸罚分。所采用的示例性比对参数是：BLOSUM62打分矩阵，空位存在罚分＝11，空位延伸罚分＝1。比对分数由每条序列的比对开始和结束的氨基酸位置(如比对窗口)，以及任选由一条或两条序列中一个空位或多个空位的插入来限定，以实现可能的最高相似性分数。
两条或更多条序列之间的最佳比对可通过目测手动来确定，或通过使用计算机，例如但不限于诸如BLASTP程序(用于氨基酸序列)和BLASTN程序(用于核酸序列)(参见例如Altschul et al.,Nucleic Acids Res.25(17):3389-3402(1997)(Altschul等人，《核酸研究》，第25卷，第17期，第3389-3402页，1997年)；还可参见美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)网站)来确定。
如果所关注的多肽包含与亲本多肽的氨基酸序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约99.5％序列同一性的氨基酸序列，则可称所关注的多肽与亲本多肽“实质上相同”。两条这类多肽之间的同一性百分数可通过检测两条经最佳比对的多肽序列来手动确定，或通过使用软件程序或算法(例如BLAST、ALIGN、CLUSTAL)采用标准参数来确定。两个多肽实质上相同的一个指示是第一多肽与第二多肽是免疫交叉反应性的。通常，差别在于保守氨基酸置换的多肽是免疫交叉反应性的。因而，例如在某条多肽与第二多肽仅因保守氨基酸置换或一个或多个保守氨基酸置换而不同的情况中，这两条多肽是实质上相同的。
如果所关注的核酸包含与亲本核酸的核苷酸序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约99.5％序列同一性的核苷酸序列，则可称所关注的核酸与亲本核酸“实质上相同”。两条这类核酸之间的同一性百分数可通过检测两条经最佳比对的核酸序列来手动确定，或通过使用软件程序或算法(例如BLAST、ALIGN、CLUSTAL)采用标准参数来确定。两条核酸序列实质上相同的一个指示为这两条核酸分子在严格条件(例如，在中等严格性至高严格性的范围内)下彼此杂交。
当核酸或多核苷酸从其他组分(包括但不限于例如其他蛋白质、核酸、细胞等)部分地或完全地分开时，核酸或多核苷酸是“分离的”。相似地，当多肽、蛋白质或肽从其他组分(包括但不限于例如其他蛋白质、核酸、细胞等)部分地或完全地分开时，多肽、蛋白质或肽是“分离的”。以摩尔浓度计，在组合物中，分离的物质的丰度比其他物质更高。例如，分离的物质可以占所有存在的大分子物质的至少约50％、约70％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％(以摩尔浓度计)。优选地，所关注的物质被纯化为基本上均一的(即通过常规检测方法在组合物中检测不到污染物)。纯度和均一性可以使用本领域熟知的多种技术测定，例如对蛋白质或核酸样品进行琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后在染色后进行目测观察。如果需要，可采用高分辨率技术，如高效液相色谱法(HPLC)或类似的方法来纯化材料。
应用于核酸或多肽的术语“纯化的”一般表示经本领域熟知的分析技术测定，核酸或多肽基本上不含其他组分(例如纯化的多肽或多核苷酸在电泳凝胶、色谱洗脱物和/或经密度梯度离心的介质中形成离散的条带)。例如，在电泳凝胶中产生基本上一个条带的核酸或多肽是“纯化的”。纯化的核酸或多肽的纯度为至少约50％，通常纯度为至少约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、约99.5％、约99.6％、约99.7％、约99.8％，或更纯(例如以摩尔浓度计的重量％)。在相关的意义上，本发明提供对组合物富集一种或多种本发明的分子，例如一种或多种本发明的多肽或多核苷酸的方法。在应用纯化或富集技术后某分子的浓度有实质性增加时，则组合物富集所述分子。基本上纯的本发明的多肽或多核苷酸(例如分别为基本上纯的本发明的变体脂解酶或编码本发明的变体脂解酶的多核苷酸)通常将占特定组合物中的所有大分子物质重量(以摩尔浓度为基础计)的至少约55％、约60％、约70％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98、约99％、约99.5％，或更高。
在本文中，给定的氨基酸序列中的氨基酸残基的位置通常使用SEQ ID NO:4中所示的疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶TLL氨基酸序列的对应氨基酸残基的位置的编号方式来进行编号。因此SEQ ID NO:4的疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶TLL氨基酸序列用作参考亲本序列。可利用本文所述的比对算法将给定氨基酸序列(诸如本文所述的变体脂解酶氨基酸序列)与TLL序列(SEQ ID NO:4)比对，并且给定氨基酸序列中与TLL序列中的氨基酸残基比对(优选最佳比对)的氨基酸残基可通过参考脂肪酶TLL序列中的对应氨基酸残基便利地进行编号。
本发明的脂解酶
如本文所用，脂解酶包括呈现出脂质降解能力(如降解甘油三酯或磷脂的能力)的酶、多肽或蛋白质。脂解酶可为例如脂肪酶、磷脂酶、酯酶或角质酶。脂解酶可为具有α/β水解酶倍数的脂解酶。这些酶通常具有丝氨酸、天冬氨酸和组氨酸残基的催化三联体。α/β水解酶包括脂肪酶和角质酶。角质酶(如果有的话)显示出很小的界面活化作用，其中脂肪酶通常在脂质-水界面的存在下经历构象改变(Longhi and Cambillau(1999)Biochimica etBiophysica Acta 1441:185-96(Longhi和Cambillau，1999年，《生物化学与生物物理学报》，第1441卷，第185-196页))。脂解酶的活性片段为保持脂质降解能力的脂解酶的一部分。活性片段保留催化三联体。如本文所用，可以根据本领域中已知的任何工序测定脂解活性(参见例如Gupta et al.,Biotechnol.Appl.Biochem.,37:63-71,2003(Gupta等人，《生物技术与应用生物化学》，第37卷，第63-71页，2003年)；美国专利No.5,990,069；和国际专利公布No.WO 96/1 8729A1)。
在一些实施例中，本发明的脂解酶为α/β水解酶。在一些实施例中，本发明的脂解酶为脂肪酶。在一些实施例中，本发明的脂解酶为角质酶。
脂解酶的有效位置
本发明在脂解酶中提供了氨基酸位置，所述脂解酶可用于洗涤剂组合物中，其中有利的修饰导致针对洗涤性能、底物水解、酶在洗涤剂组合物中的稳定性以及酶的热稳定性的最小性能指数，而同时具有对亲本脂解酶改善的这些特征中的至少一种。这些修饰被认为是本发明的合适的修饰。
可比较本发明的脂解酶的稳定性与标准物例如SEQ ID NO:3的疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶TLL的稳定性。
术语“热稳定性(thermal stability)”和“热稳定性(thermostability)”是指本公开脂肪酶在本文中公开的脂解、水解、清洁或其他处理期间常见的条件下暴露于标识温度(例如当暴露于改变的温度时)通常指定时间段后保留指定量的酶活性。变化的温度包括增加或降低的温度。在一些实施例中，脂肪酶在暴露于改变的温度指定时间段(例如至少约60分钟、约120分钟、约180分钟、约240分钟、约300分钟等)后保留至少约50％、约60％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约92％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％的脂解活性。
如本文所用，变体脂解酶的改善的特性包括相对于对应的亲本脂解酶(例如野生型或天然存在的脂解酶)，变体脂解酶具有改善的或增强的洗涤或清洁性能、和/或改善的或增强的稳定性，任选地与保留的洗涤或清洁性能。变体脂解酶的改善的特性可包括改善的洗涤或清洁性能、和/或改善的稳定性、和/或改善的底物水解、和/或改善的表达。在一些实施例中，本发明提供了呈现出以下特性中的一者或多者的本发明的变体脂解酶：相对于参考亲本脂解酶(例如野生型脂解酶，诸如野生型脂肪酶)，改善的手动洗涤性能、改善的手动或人工餐具洗涤性能、改善的自动餐具洗涤性能、改善的衣物洗涤性能和/或改善的稳定性。
发现为可用位置的脂解酶氨基酸位置可具有适于在洗涤剂组合物中使用的不同修饰。修饰可包括在特定位置的插入、缺失或置换。在一个实施例中，修饰为置换。对于各位置，更大数量的可能合适的修饰得到所述位置的更高有效性分数。例如，氨基酸位置可具有在有效位置所测试的修饰中的至少50％、30％或15％作为合适修饰，其中所述修饰满足以下适合性标准中的至少一者：
a)某一位置，其中对于表达、在pH 8.2下的CS-61微样本活性、在pH 6或pH 8.2下对对硝基苯基酯底物的活性以及洗涤剂稳定性、LAS稳定性或热稳定性来说，相对于TLL亲本的最小性能指数(PI)大于或等于0.9，并且对于这些测试中的任一者另外具有大于或等于1.0的PI；
b)某一位置，其中对于表达、在pH 8.2下的CS-61微样本活性、在pH 6或pH 8.2下对对硝基苯基酯底物的活性以及洗涤剂稳定性、LAS稳定性或热稳定性来说，相对于TLL亲本的最小性能指数(PI)大于或等于0.8，并且对于这些测试中的任一者另外具有大于或等于1.2的PI；或者
c)某一位置，其中对于表达、在pH 8.2下的CS-61微样本活性、在pH 6或pH 8.2下对对硝基苯基酯底物的活性以及洗涤剂稳定性、LAS稳定性或热稳定性来说，相对于TLL亲本的最小性能指数(PI)大于或等于0.5，并且对于这些测试中的任一者另外具有大于或等于1.5的PI。
本发明的具有至少50％被测试为合适修饰的修饰的脂解酶位置包括位置1、2、3、4、5、6、8、9、13、23、24、25、26、27、28、29、33、37、38、39、46、51、52、54、58、64、66、68、69、71、72、75、90、93、94、111、120、122、123、130、131、137、140、162、163、189、250、252以及264，其中脂肪酶变体的氨基酸位置根据与SEQ ID NO:4中所示的疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶TLL的氨基酸序列的对应关系来进行编号。
本发明的具有至少50％被测试为合适修饰的修饰的脂解酶修饰包括修饰1(E,A,C,D,F,I,L,N,PQ,R,S,T,V,W,Y)；2(V,F,G,H,I,K,L,M,P,T)；3(S,A,D,E,G,H,K,Q,R,T,Y)；4(Q,A,D,F,G,I,K,L,M,N,P,R,S,W,Y)；5(D,H,I,K,L,S,T,V,W,Y)；6(L,A,E,H,I,K,M,Q,T,V,Y)；8(N,A,E,G,H,I,K,L,M,T,V,W,Y)；9(Q,A,D,E,G,H,I,K,N,R,W,Y)；13(F,A,H,K,M,N,Q,T,V,Y)；23(G,C,D,E,F,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W)；24(K,A,D,E,F,H,I,L,M,N,P,R,T,V,W,Y)；25(N,A,C,D,E,G,H,I,K,L,S,T,V,W)；26(N,C,G,K,L,M,Q,S,T,V,W,Y)；27(D,A,E,F,G,H,I,N,Q,R,S,T,V,Y)；28(A,D,E,F,G,H,I,L,M,N,P,Q,R,S)；29(P,C,E,G,H,I,K,L,M,Q,R,S,T,V,W,Y)；33(N,D,E,F,K,L,M,Q,R,S)；37(T,A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,P,Q,R,W,Y)；38(G,A,D,E,F,H,I,K,L,M,NT,V,W,Y)；39(N,C,E,H,I,L,P,Q,S,T,V,W,Y)；46(K,D,E,F,G,L,M,V,W)；51(F,A,D,E,G,I,L,M,N,P,R,S,T,Y)；52(L,A,E,G,I,M,R,T,V,W)；54(S,E,F,G,H,K,M,P,R,T,VW,Y)；58(S,D,G,H,I,K,M,Q,R,W)；64(T,C,D,E,G,I,K,L,N,R,V,Y)；66(F,A,G,H,I,L,M,N,Q,R,S,T,VW,Y)；68(A,C,G,I,S,T,V,W,Y)；69(L,A,D,G,H,I,K,N,S,T,W)；71(N,D,E,H,K,Q,R,S,T,V,W,Y)；72(T,A,D,E,F,H,I,K,L,N,P,R,S,V,Y)；75(L,A,D,E,G,H,I,M,N,Q,R,S,T,V,Y)；90(I,A,E,F,N,Q,T,V,Y)；93(L,D,H,I,K,N,P,Q,R,V,W)；94(N,D,G,K,M,P,R,S,T,V)；111(D,A,E,F,L,Q,T,V,W)；120(V,G,H,I,N,S,W,Y)；122(D,A,E,F,H,I,N,S,T,Y)；123(T,E,G,I,K,L,M,N,Q,W)；130(D,A,C,E,F,G,H,Q,R,T,V,W,Y)；131(A,C,H,I,K,N,Q,R,S,T,W,Y)；137(D,A,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y)；140(V,C,E,F,I,L,M,N,Q,T)；162(N,D,E,F,G,H,I,K,M,P,Q,R,S,Y)；163(G,A,F,L,M,N,P,R,S,W,Y)；189(T,D,E,G,K,M,N,Q,R,S,V)；250(P,D,E,G,K,Q,R,S,T)；252(I,A,C,D,E,F,G,H,K,L,N,Q,R,S,T,W)；以及264(L,C,E,G,H,M,N,P,Q,R,S,T)，其中脂肪酶变体的氨基酸位置根据与SEQ ID NO:4中所示的疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶TLL的氨基酸序列的对应关系来进行编号。
本发明的具有至少30％、但小于50％被测试为合适修饰的修饰的脂解酶位置包括位置18、19、20、30、31、32、47、48、49、50、53、56、60、73、74、85、86、91、95、96、97、98、99、101、105、108、115、125、127、128、132、133、151、159、164、179、183、187、188、190、216、223、232、237、244、251、254、263、267以及269，其中脂肪酶变体的氨基酸位置根据与SEQ ID NO:4中所示的疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶TLL的氨基酸序列的对应关系来进行编号。
本发明的具有至少30％被测试为合适修饰的修饰的脂解酶修饰包括修饰1(E,A,C,D,F,I,L,N,PQ,R,S,T,V,W,Y)；2(V,F,G,H,I,K,L,M,P,T)；3(S,A,D,E,G,H,K,Q,R,T,Y)；4(Q,A,D,F,G,I,K,L,M,N,P,R,S,W,Y)；5(D,H,I,K,L,S,T,V,W,Y)；6(L,A,E,H,I,K,M,Q,T,V,Y)；8(N,A,E,G,H,I,K,L,M,T,V,W,Y)；9(Q,A,D,E,G,H,I,K,N,R,W,Y)；13(F,A,H,K,M,N,Q,T,V,Y)；18(A,C,H,K,M,N,Q,S,W)；19(A,C,G,I,L,T,V,W)；20(A,G,I,P,Q,S,T)；23(G,C,D,E,F,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W)；24(K,A,D,E,F,H,I,L,M,N,P,R,T,V,W,Y)；25(N,A,C,D,E,G,H,I,K,L,S,T,V,W)；26(N,C,G,K,L,M,Q,S,T,V,W,Y)；27(D,A,E,F,G,H,I,N,Q,R,S,T,V,Y)；28(A,D,E,F,G,H,I,L,M,N,P,Q,R,S)；29(P,C,E,G,H,I,K,L,M,Q,R,S,T,V,W,Y)；30(A,D,H,L,N,R,V,W)；31(G,D,E,H,M,P,Q,S,V)；32(T,A,I,M,Q,R,S)；33(N,D,E,F,K,L,M,Q,R,S)；37(T,A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,P,Q,R,W,Y)；38(G,A,D,E,F,H,I,K,L,M,NT,V,W,Y)；39(N,C,E,H,I,L,P,Q,S,T,V,W,Y)；46(K,D,E,F,G,L,M,V,W)；47(A,D,E,F,H,M,T,W)；48(D,E,G,H,L,P,Q)；49(A,G,H,K,L,V,W)；50(T,A,D,F,K,L,R,S,W)；51(F,A,D,E,G,I,L,M,N,P,R,S,T,Y)；52(L,A,E,G,I,M,R,T,V,W)；53(Y,E,G,H,K,L,S,W)；54(S,E,F,G,H,K,M,P,R,T,VW,Y)；56(E,H,K,R,T,V)；58(S,D,G,H,I,K,M,Q,R,W)；60(V,G,K,L,Y)；64(T,C,D,E,G,I,K,L,N,R,V,Y)；66(F,A,G,H,I,L,M,N,Q,R,S,T,VW,Y)；68(A,C,G,I,S,T,V,W,Y)；69(L,A,D,G,H,I,K,N,S,T,W)；71(N,D,E,H,K,Q,R,S,T,V,W,Y)；72(T,A,D,E,F,H,I,K,L,N,P,R,S,V,Y)；73(N,E,G,H,K,R,S)；74(K,A,D,E,G,H,N,Q,S)；75(L,A,D,E,G,H,I,M,N,Q,R,S,T,V,Y)；85(S,F,H,I,N,Q,T)；86(I,L,M,P,Q,T,V,Y)；90(I,A,E,F,N,Q,T,V,Y)；91(G,E,F,H,I,M,Q,R)；93(L,D,H,I,K,N,P,Q,R,V,W)；94(N,D,G,K,M,P,R,S,T,V)；95(F,G,H,K,L,Q,T,V,W)；96(D,A,K,P,R,V)；97(L,A,D,I,M,Q,T)；98(K,D,E,H,I,M,Q)；99(E,D,K,P,Q,S,T,W)；101(N,C,D,E,H,M,Y)；105(S,A,D,E,F,K,P,W)；108(R,E,F,K,M,Q,Y)；111(D,A,E,F,L,Q,T,V,W)；115(S,G,I,L,M,N,R,T,V)；120(V,G,H,I,N,S,W,Y)；122(D,A,E,F,H,I,N,S,T,Y)；123(T,E,G,I,K,L,M,N,Q,W)；125(R,C,G,I,N,Q,T,Y)；127(K,D,E,F,G,R,T)；128(V,C,H,I,L,N,S,W,Y)；130(D,A,C,E,F,G,H,Q,R,T,V,W,Y)；131(A,C,H,I,K,N,Q,R,S,T,W,Y)；132(V,C,D,H,I,K,Q,R,W)；133(R,E,F,I,N,Q,V)；137(D,A,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y)；140(V,C,E,F,I,L,M,N,Q,T)；151(L,I,M,N,P,T,V,W)；159(L,E,M,Q,R,W)；162(N,D,E,F,G,H,I,K,M,P,Q,R,S,Y)；163(G,A,F,L,M,N,P,R,S,W,Y)；164(Y,D,N,R,S,V)；179(R,E,H,I,K,L,Q,V)；183(E,H,M,Q,S,T,V,Y)；187(V,G,H,L,N,Q,S,T,W)；188(Q,C,E,F,H,R,T)；189(T,D,E,G,K,M,N,Q,R,S,V)；190(G,D,H,R,S,Y)；216(S,D,G,N,Q,V,W)；223(K,A,H,L,M,Q,S,T,V)；232(R,C,D,I,L,M,P,T,W)；237(K,E,H,I,L,T,W,Y)；244(T,A,F,I,L,M,P,Q,S)；250(P,D,E,G,K,Q,R,S,T)；251(N,D,M,Q,S,T,W,Y)；252(I,A,C,D,E,F,G,H,K,L,N,Q,R,S,T,W)；254(D,A,H,K,N,P,T)；256(P,A,D,S,T)；263(G,C,H,I,K,M,V)；264(L,C,E,G,H,M,N,P,Q,R,S,T)；267(T,G,I,L,M,P,W)；以及269(L,D,F,M,Q,V,W)，其中脂肪酶变体的氨基酸位置根据与SEQID NO:4中所示的疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶TLL的氨基酸序列的对应关系来进行编号。
本发明的具有至少15％、但小于30％被测试为合适修饰的修饰的脂解酶位置包括位置7、11、12、15、22、35、40、42、43、44、45、61、63、65、67、76、77、84、87、114、117、119、121、134、135、136、143、154、155、156、158、165、166、168、176、180、191、199、200、202、209、211、214、217、221、224、225、228、229、231、233、248、249、253、255、256、265以及268，其中脂肪酶变体的氨基酸位置根据与SEQ ID NO:4中所示的疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶TLL的氨基酸序列的对应关系来进行编号。
本发明的具有至少15％被测试为合适修饰的修饰的脂解酶修饰包括修饰1(E,A,C,D,F,I,L,N,PQ,R,S,T,V,W,Y)；2(V,F,G,H,I,K,L,M,P,T)；3(S,A,D,E,G,H,K,Q,R,T,Y)；4(Q,A,D,F,G,I,K,L,M,N,P,R,S,W,Y)；5(D,H,I,K,L,S,T,V,W,Y)；6(L,A,E,H,I,K,M,Q,T,V,Y)；7(F,H,M,V,Y)；8(N,A,E,G,H,I,K,L,M,T,V,W,Y)；9(Q,A,D,E,G,H,I,K,N,R,W,Y)；11(N,H,K,V,Y)；12(L,F,H,V,W)；13(F,A,H,K,M,N,Q,T,V,Y)；15(Q,G,H,M,S)；18(A,C,H,K,M,N,Q,S,W)；19(A,C,G,I,L,T,V,W)；20(A,G,I,P,Q,S,T)；22(C,H,L,M)；23(G,C,D,E,F,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W)；24(K,A,D,E,F,H,I,L,M,N,P,R,T,V,W,Y)；25(N,A,C,D,E,G,H,I,K,L,S,T,V,W)；26(N,C,G,K,L,M,Q,S,T,V,W,Y)；27(D,A,E,F,G,H,I,N,Q,R,S,T,V,Y)；28(A,D,E,F,G,H,I,L,M,N,P,Q,R,S)；29(P,C,E,G,H,I,K,L,M,Q,R,S,T,V,W,Y)；30(A,D,H,L,N,R,V,W)；31(G,D,E,H,M,P,Q,S,V)；32(T,A,I,M,Q,R,S)；33(N,D,E,F,K,L,M,Q,R,S)；35(T,E,K,R)；37(T,A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,P,Q,R,W,Y)；38(G,A,D,E,F,H,I,K,L,M,NT,V,W,Y)；39(N,C,E,H,I,L,P,Q,S,T,V,W,Y)；40(A,F,M,S,W)；42(P,C,G,I,V,W)；43(E,D,I,M,R,T)；44(V,H,I,T)；45(E,F,Q,V)；46(K,D,E,F,G,L,M,V,W)；47(A,D,E,F,H,M,T,W)；48(D,E,G,H,L,P,Q)；49(A,G,H,K,L,V,W)；50(T,A,D,F,K,L,R,S,W)；51(F,A,D,E,G,I,L,M,N,P,R,S,T,Y)；52(L,A,E,G,I,M,R,T,V,W)；53(Y,E,G,H,K,L,S,W)；54(S,E,F,G,H,K,M,P,R,T,VW,Y)；56(E,H,K,R,T,V)；58(S,D,G,H,I,K,M,Q,R,W)；60(V,G,K,L,Y)；61(G,A,D,L,R)；63(V,K,Q,T)；64(T,C,D,E,G,I,K,L,N,R,V,Y)；65(G,L,V,Y)；66(F,A,G,H,I,L,M,N,Q,R,S,T,VW,Y)；67(L,H,I,Q,V)；68(A,C,G,I,S,T,V,W,Y)；69(L,A,D,G,H,I,K,N,S,T,W)；71(N,D,E,H,K,Q,R,S,T,V,W,Y)；72(T,A,D,E,F,H,I,K,L,N,P,R,S,V,Y)；73(N,E,G,H,K,R,S)；74(K,A,D,E,G,H,N,Q,S)；75(L,A,D,E,G,H,I,M,N,Q,R,S,T,V,Y)；76(I,H,S,V)；77(V,A,I,L,N,T)；84(R,H,Q,W)；85(S,F,H,I,N,Q,T)；86(I,L,M,P,Q,T,V,Y)；87(E,A,D,G,P,V)；90(I,A,E,F,N,Q,T,V,Y)；91(G,E,F,H,I,M,Q,R)；93(L,D,H,I,K,N,P,Q,R,V,W)；94(N,D,G,K,M,P,R,S,T,V)；95(F,G,H,K,L,Q,T,V,W)；96(D,A,K,P,R,V)；97(L,A,D,I,M,Q,T)；98(K,D,E,H,I,M,Q)；99(E,D,K,P,Q,S,T,W)；101(N,C,D,E,H,M,Y)；105(S,A,D,E,F,K,P,W)；108(R,E,F,K,M,Q,Y)；111(D,A,E,F,L,Q,T,V,W)；114(T,F,I,M,V)；115(S,G,I,L,M,N,R,T,V)；117(W,H,K,Q,V)；119(S,D,I,Q,T,V)；120(V,G,H,I,N,S,W,Y)；121(A,K,Q)；122(D,A,E,F,H,I,N,S,T,Y)；123(T,E,G,I,K,L,M,N,Q,W)；125(R,C,G,I,N,Q,T,Y)；127(K,D,E,F,G,R,T)；128(V,C,H,I,L,N,S,W,Y)；130(D,A,C,E,F,G,H,Q,R,T,V,W,Y)；131(A,C,H,I,K,N,Q,R,S,T,W,Y)；132(V,C,D,H,I,K,Q,R,W)；133(R,E,F,I,N,Q,V)；134(E,L,P,V)；135(H,F,K,T)；136(P,D,Q,R)；137(D,A,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y)；140(V,C,E,F,I,L,M,N,Q,T)；143(T,A,G,N,S)；151(L,I,M,N,P,T,V,W)；154(V,F,I,L,M,Y)；155(A,G,S,T)；156(G,F,M,T,W)；158(D,E,F,Y)；159(L,E,M,Q,R,W)；162(N,D,E,F,G,H,I,K,M,P,Q,R,S,Y)；163(G,A,F,L,M,N,P,R,S,W,Y)；164(Y,D,N,R,S,V)；165(D,I,P,Y)；166(I,D,G,W)；168(V,G,L,Q)；176(V,F,I,L,N,W)；179(R,E,H,I,K,L,Q,V)；180(A,D,K,Q,T)；183(E,H,M,Q,S,T,V,Y)；187(V,G,H,L,N,Q,S,T,W)；188(Q,C,E,F,H,R,T)；189(T,D,E,G,K,M,N,Q,R,S,V)；190(G,D,H,R,S,Y)；191(G,F,L,V)；199(T,G,N,V)；200(N,A,P,S)；202(I,L,M,P,V)；209(R,H,S,T)；211(F,I,R,T,W)；214(S,A,D,M)；216(S,D,G,N,Q,V,W)；217(S,H,K,V)；221(W,F,G,Y)；223(K,A,H,L,M,Q,S,T,V)；224(S,A,F,P)；225(G,C,E,K,R)；227(L,C,H,M)；228(V,A,E,R)；229(P,I,K,M,S)；231(T,G,H,K,L,M)；232(R,C,D,I,L,M,P,T,W)；233(N,D,G,H,Q)；237(K,E,H,I,L,T,W,Y)；244(T,A,F,I,L,M,P,Q,S)；248(N,D,L,Y)；249(Q,E,G,T)；250(P,D,E,G,K,Q,R,S,T)；251(N,D,M,Q,S,T,W,Y)；252(I,A,C,D,E,F,G,H,K,L,N,Q,R,S,T,W)；253(P,F,H,N,R)；254(D,A,H,K,N,P,T)；255(I,F,L,W)；256(P,A,D,S,T)；263(G,C,H,I,K,M,V)；264(L,C,E,G,H,M,N,P,Q,R,S,T)；265(I,L,M,Q,R,W)；267(T,G,I,L,M,P,W)；268(C,D,H,N)；以及269(L,D,F,M,Q,V,W)，其中脂肪酶变体的氨基酸位置根据与SEQ ID NO:4中所示的疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶TLL的氨基酸序列的对应关系来进行编号。
本发明的具有至少一个修饰、但小于15％被测试为合适修饰的修饰的脂解酶位置包括位置14、16、17、34、41、55、57、59、62、70、79、92、100、102、103、106、109、110、112、118、126、138、139、142、149、152、153、167、169、170、181、184、192、193、196、198、205、206、208、210、212、213、218、226、227、230、236、238、239、242、243、246、257、259、260、262以及266，其中脂肪酶变体的氨基酸位置根据与SEQ ID NO:4中所示的疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶TLL的氨基酸序列的对应关系来进行编号。
本发明的具有至少一个被测试为合适修饰的修饰的脂解酶修饰包括修饰1(E,A,C,D,F,I,L,N,PQ,R,S,T,V,W,Y)；2(V,F,G,H,I,K,L,M,P,T)；3(S,A,D,E,G,H,K,Q,R,T,Y)；4(Q,A,D,F,G,I,K,L,M,N,P,R,S,W,Y)；5(D,H,I,K,L,S,T,V,W,Y)；6(L,A,E,H,I,K,M,Q,T,V,Y)；7(F,H,M,V,Y)；8(N,A,E,G,H,I,K,L,M,T,V,W,Y)；9(Q,A,D,E,G,H,I,K,N,R,W,Y)；11(N,H,K,V,Y)；12(L,F,H,V,W)；13(F,A,H,K,M,N,Q,T,V,Y)；14(A,S,V)；15(Q,G,H,M,S)；16(Y,H,W)；17(S,E)；18(A,C,H,K,M,N,Q,S,W)；19(A,C,G,I,L,T,V,W)；20(A,G,I,P,Q,S,T)；22(C,H,L,M)；23(G,C,D,E,F,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W)；24(K,A,D,E,F,H,I,L,M,N,P,R,T,V,W,Y)；25(N,A,C,D,E,G,H,I,K,L,S,T,V,W)；26(N,C,G,K,L,M,Q,S,T,V,W,Y)；27(D,A,E,F,G,H,I,N,Q,R,S,T,V,Y)；28(A,D,E,F,G,H,I,L,M,N,P,Q,R,S)；29(P,C,E,G,H,I,K,L,M,Q,R,S,T,V,W,Y)；30(A,D,H,L,N,R,V,W)；31(G,D,E,H,M,P,Q,S,V)；32(T,A,I,M,Q,R,S)；33(N,D,E,F,K,L,M,Q,R,S)；34(I,P)；35(T,E,K,R)；37(T,A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,P,Q,R,W,Y)；38(G,A,D,E,F,H,I,K,L,M,NT,V,W,Y)；39(N,C,E,H,I,L,P,Q,S,T,V,W,Y)；40(A,F,M,S,W)；41(C,V)；42(P,C,G,I,V,W)；43(E,D,I,M,R,T)；44(V,H,I,T)；45(E,F,Q,V)；46(K,D,E,F,G,L,M,V,W)；47(A,D,E,F,H,M,T,W)；48(D,E,G,H,L,P,Q)；49(A,G,H,K,L,V,W)；50(T,A,D,F,K,L,R,S,W)；51(F,A,D,E,G,I,L,M,N,P,R,S,T,Y)；52(L,A,E,G,I,M,R,T,V,W)；53(Y,E,G,H,K,L,S,W)；54(S,E,F,G,H,K,M,P,R,T,VW,Y)；55(F,G,W)；56(E,H,K,R,T,V)；57(D,S)；58(S,D,G,H,I,K,M,Q,R,W)；59(G,D)；60(V,G,K,L,Y)；61(G,A,D,L,R)；62(D,N)；63(V,K,Q,T)；64(T,C,D,E,G,I,K,L,N,R,V,Y)；65(G,L,V,Y)；66(F,A,G,H,I,L,M,N,Q,R,S,T,VW,Y)；67(L,H,I,Q,V)；68(A,C,G,I,S,T,V,W,Y)；69(L,A,D,G,H,I,K,N,S,T,W)；70(D,S)；71(N,D,E,H,K,Q,R,S,T,V,W,Y)；72(T,A,D,E,F,H,I,K,L,N,P,R,S,V,Y)；73(N,E,G,H,K,R,S)；74(K,A,D,E,G,H,N,Q,S)；75(L,A,D,E,G,H,I,M,N,Q,R,S,T,V,Y)；76(I,H,S,V)；77(V,A,I,L,N,T)；79(S,A,M)；84(R,H,Q,W)；85(S,F,H,I,N,Q,T)；86(I,L,M,P,Q,T,V,Y)；87(E,A,D,G,P,V)；90(I,A,E,F,N,Q,T,V,Y)；91(G,E,F,H,I,M,Q,R)；92(N,A,T)；93(L,D,H,I,K,N,P,Q,R,V,W)；94(N,D,G,K,M,P,R,S,T,V)；95(F,G,H,K,L,Q,T,V,W)；96(D,A,K,P,R,V)；97(L,A,D,I,M,Q,T)；98(K,D,E,H,I,M,Q)；99(E,D,K,P,Q,S,T,W)；100(I,M)；101(N,C,D,E,H,M,Y)；102(D,H)；103(I,Y)；105(S,A,D,E,F,K,P,W)；106(G,H)；108(R,E,F,K,M,Q,Y)；109(G,T)；110(H,N,S)；111(D,A,E,F,L,Q,T,V,W)；112(G,F,Q)；114(T,F,I,M,V)；115(S,G,I,L,M,N,R,T,V)；117(W,H,K,Q,V)；118(R,P)；119(S,D,I,Q,T,V)；120(V,G,H,I,N,S,W,Y)；121(A,K,Q)；122(D,A,E,F,H,I,N,S,T,Y)；123(T,E,G,I,K,L,M,N,Q,W)；125(R,C,G,I,N,Q,T,Y)；126(Q,I,M)；127(K,D,E,F,G,R,T)；128(V,C,H,I,L,N,S,W,Y)；130(D,A,C,E,F,G,H,Q,R,T,V,W,Y)；131(A,C,H,I,K,N,Q,R,S,T,W,Y)；132(V,C,D,H,I,K,Q,R,W)；133(R,E,F,I,N,Q,V)；134(E,L,P,V)；135(H,F,K,T)；136(P,D,Q,R)；137(D,A,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y)；138(Y,F)；139(RLT)；140(V,C,E,F,I,L,M,N,Q,T)；142(F,H,Y)；143(T,A,G,N,S)；149(G,A)；151(L,I,M,N,P,T,V,W)；152(A,I,V)；153(T,S)；154(V,F,I,L,M,Y)；155(A,G,S,T)；156(G,F,M,T,W)；158(D,E,F,Y)；159(L,E,M,Q,R,W)；162(N,D,E,F,G,H,I,K,M,P,Q,R,S,Y)；163(G,A,F,L,M,N,P,R,S,W,Y)；164(Y,D,N,R,S,V)；165(D,I,P,Y)；166(I,D,G,W)；167(D,N)；168(V,G,L,Q)；169(F,S,Y)；170(S,G)；176(V,F,I,L,N,W)；179(R,E,H,I,K,L,Q,V)；180(A,D,K,Q,T)；181(F,L)；183(E,H,M,Q,S,T,V,Y)；184(F,W,Y)；187(V,G,H,L,N,Q,S,T,W)；188(Q,C,E,F,H,R,T)；189(T,D,E,G,K,M,N,Q,R,S,V)；190(G,D,H,R,S,Y)；191(G,F,L,V)；192(T,N,P)；193(L,T)；196(I,V)；198(H,G,S)；199(T,G,N,V)；200(N,A,P,S)；202(I,L,M,P,V)；205(R,D)；206(L,N)；208(P,E,N)；209(R,H,S,T)；210(E,S)；211(F,I,R,T,W)；212(G,Q)；213(Y,S)；214(S,A,D,M)；216(S,D,G,N,Q,V,W)；217(S,H,K,V)；218(P,T)；221(W,F,G,Y)；223(K,A,H,L,M,Q,S,T,V)；224(S,A,F,P)；225(G,C,E,K,R)；226(T,D,N)；227(L,C,H,M)；228(V,A,E,R)；229(P,I,K,M,S)；230(V,W)；231(T,G,H,K,L,M)；232(R,C,D,I,L,M,P,T,W)；233(N,D,G,H,Q)；236(V,W)；237(K,E,H,I,L,T,W,Y)；238(I,V)；239(E,K)；242(D,T)；243(A,S)；244(T,A,F,I,L,M,P,Q,S)；246(G,I)；248(N,D,L,Y)；249(Q,E,G,T)；250(P,D,E,G,K,Q,R,S,T)；251(N,D,M,Q,S,T,W,Y)；252(I,A,C,D,E,F,G,H,K,L,N,Q,R,S,T,W)；253(P,F,H,N,R)；254(D,A,H,K,N,P,T)；255(I,F,L,W)；256(P,A,D,S,T)；257(A,W,Y)；259(L,W,Y)；260(W,P)；262(F,D,K)；263(G,C,H,I,K,M,V)；264(L,C,E,G,H,M,N,P,Q,R,S,T)；265(I,L,M,Q,R,W)；266(G,E)；267(T,G,I,L,M,P,W)；268(C,D,H,N)；以及269(L,D,F,M,Q,V,W)，其中脂肪酶变体的氨基酸位置根据与SEQ ID NO:4中所示的疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶TLL的氨基酸序列的对应关系来进行编号。
本发明的具有合适修饰的另外的脂解酶修饰包括修饰11(A,E,I)、23(A)、24(Q,S)、27(K,L)、29(N)、30(E,G,I,S,Y)、31(T)、33(C,I,P,T,V)、45(A,G,S,T)、48(N,R,T,V)、49(C,Y)、50(M)、51(H,V)、56(A,M,N,S)、58(A,F)、71(C,F,P)、73(Q,T)、74(I,M,T,W)、75(K)、91(K,N,Y)、94(A,H)、101(A)、108(A)、111(G,H,I,K,M,S,Y)、122(K,L,Q)、128(T,V)、130(K,M)、133(D,H,L,W)、135(A,D,M,N,Y)、140(Y)、159(G)、163(Q)、183(C)、187(C,I)、188(A,M,W)、190(W)、227(A,I,S)、233(F,I,V)、251(V)以及252(M,V)。
这些氨基酸位置可被认为是对亲本脂解酶的组合修饰的有用位置。因此，本发明包括在任何上述位置处具有一个或多个修饰的脂解酶。
脂解酶的合适修饰
本发明包括具有对亲本脂解酶的一个或多个修饰的脂解酶的酶变体。酶变体通过以下方式可用于洗涤剂组合物中：具有针对洗涤性能、酶在洗涤剂组合物中的稳定性以及酶的热稳定性的最小性能指数，而同时具有对亲本脂解酶改善的这些特征中的至少一种。
本发明的满足所有三种适合性标准的脂解酶修饰包括1(A,D,F,I,N,P,S,W,Y)、2(I,L)、3(D,G,Y)、4(D,F,W)、5(H,I,L,S,T,V,Y)、6(I,T)、7(Y)、8(G,H,I,L,M,T,V,W,Y)、9(H,K)、11(V)、13(H,N)、14(S)、16(W)、17(E)、18(K)、19(G)、20(T)、23(D,E,H,I,K,N,Q,T,V)、24(A,D,E,H,I,L,N,P,T,V,W)、25(I,L,T)、26(G,K,M,S,T,V,W,Y)、27(A,E,G,H,I,N,Q,R,S,T,V,Y)、28(D,E,I,N,S)、29(E,H,K,L,M,R,T,V)、31(D,H,S)、33(D,E,F,L,Q,R,S)、34(P)、37(D,E,G,I,K,P,Q,W)、38(D,F,H,I,K,L,M,N,Y)、39(E,H,I,L,S,V)、40(M,S)、42(G,I,W)、43(R,T)、44(I)、45(F,V)、46(D,L,M)、47(H)、48(E,H,P,Q)、49(V)、50(L,R,S)、51(A,E,G,I,L,M,S)、52(A,G,I,V)、54(P,T,V)、56(H,K,R,T)、58(M)、60(G)、63(T)、64(G)、66(H,M,W)、67(I,V)、68(G,I,S,T,V)、69(I,K,S,T)、70(S)、71(D,H,K,Q,R,S,T)、72(A,D,E,F,H,I,L,N,R,S,V,Y)、73(H,R,S)、74(H,S)、75(A,E,G,H,I,Q,S,T,V)、79(A)、85(T)、86(P,T)、87(G)、90(A,E,F,N)、91(E,H,I,M,Q,R)、92(T)、94(R)、95(G,Q,V,W)、96(A,K)、97(D,T)、98(Q)、99(D,S,T,W)、101(D,H,Y)、105(K)、108(K,Q,Y)、111(A,E,L,Q,T,V)、114(F,I,M,V)、115(T)、118(P)、119(T)、120(Y)、121(K)、122(H,I)、123(G,M,N,W)、125(G,Q)、127(G,T)、130(A,G,H,T)、131(H,I,Q)、132(H,R)、134(L,V)、135(K)、137(E,G,H,K,Q,T,Y)、139(T)、151(I,T,V)、154(I,L)、155(G,S)、158(E,F)、162(G,R)、163(N,P,Y)、164(V)、166(G)、176(I,L)、179(L,Q,V)、180(K)、181(L)、187(G,H,L,N,Q,S,T,W)、188(C,T)、189(D,G,N,Q,R,S)、191(F,L,V)、196(V)、199(G)、202(P,V)、208(E)、211(I,W)、216(N,W)、217(K)、223(Q,S,T,V)、225(E,K,R)、227(M)、228(R)、232(I,M,T)、233(D,G,H,Q)、237(I,L,Y)、242(T)、244(I)、250(Q,R)、251(D,W)、252(A,D,G,H,Q,R,S,T)、255(L)、256(A,S)、257(Y)、262(D)、264(E,M,N,P,Q,R)、265(M,Q)、267(L,W)以及269(D,M,Q,V,W)，其中脂肪酶变体的氨基酸位置根据与SEQ ID NO:4中所示的疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶TLL的氨基酸序列的对应关系来进行编号。
本发明的满足适合性标准中的a)与b)两者、但不满足c)的脂解酶修饰包括1(Q,T)、2(F,G,M,P)、3(K,T)、4(A,G,I,K,L,M,N,R,S)、5(K,W)、6(E,M)、8(A,E)、9(E,G,N,R)、11(H,K,Y)、12(F,H,V)、13(Q)、15(S)、18(Q)、19(C)、20(G,S)、23(C,F,L,M,S,W)、24(Y)、25(C,H,K)、26(C)、27(F)、28(H,M,P,Q,R)、29(Q,W,Y)、30(D,V)、31(E,Q)、32(A,I,M,R,S)、35(K)、37(C)、38(V,W)、39(P,T,Y)、40(W)、42(V)、43(D,M)、45(Q)、46(F,G,V,W)、47(T)、50(A)、51(N,R,T)、52(E,R,W)、53(E,G,H,K,S)、54(R,Y)、55(G)、56(V)、64(C,E,N,V)、66(N,Q,R)、67(Q)、69(A,G,H,N,W)、71(V,W,Y)、72(P)、73(E,G,K)、74(N,Q)、75(D,N,R,Y)、76(H)、77(I,L,N,T)、86(L,M)、87(P,V)、90(Q,T)、91(F)、94(D)、97(Q)、98(D,E,I)、99(K)、105(A,D,E,P)、108(E,M)、122(E,N)、123(E,L,Q)、125(N,T)、126(I)、127(E,F,R)、128(H,S)、130(F,Q)、131(R,W,Y)、132(D,K,W)、133(E,Q)、135(F,T)、136(D,Q)、137(S,V)、139(L)、140(F,M,Q,T)、143(A,G,S)、149(A)、151(N)、154(F)、156(F,W)、158(Y)、159(E)、163(S,W)、164(N,S)、165(I)、166(D,W)、167(N)、168(L)、179(E,I)、183(V)、188(H)、189(K,V)、200(A)、205(D)、209(S,T)、214(D)、216(G,Q)、217(H)、218(T)、223(M)、226(N)、228(E)、229(K)、231(K,L,M)、252(K,L,N)、254(H)、255(F)、256(T)、263(I,V)、264(H,S,T)、267(P)以及269(F)，其中脂肪酶变体的氨基酸位置根据与SEQ ID NO:4中所示的疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶TLL的氨基酸序列的对应关系来进行编号。
本发明的满足a)或b)与c)两者、但不满足全部三种适合性标准的脂解酶修饰包括1(E,R,V)、2(V,H,T)、3(S,E,Q)、4(Q,Y)、5(D)、6(L,Q,V)、7(F)、8(N)、9(Q,A,I)、11(N)、12(L)、13(F)、14(A)、15(Q)、16(Y)、17(S)、18(A,C,H,S)、19(A,T)、20(A,P)、22(C)、23(G,P)、24(K,F)、25(N,A,D,G,V,W)、26(N,L,Q)、27(D)、28(A,F,G,L)、29(P,C,I)、30(A,H,R,W)、31(G)、32(T,Q)、33(N,K)、34(I)、35(T,E,R)、37(T,A,F,L,M)、38(G,T)、39(N)、40(A)、41(C)、42(P)、43(E,I)、44(V,H,T)、45(E)、46(K,E)、47(A,D,E,F,M)、48(D)、49(A,H,K)、50(T,D,W)、51(F)、52(L,T)、53(Y,L,W)、54(S)、55(F)、56(E)、57(D)、58(S,G,H,K,Q,W)、59(G)、60(V)、61(G,L)、62(D)、63(V)、64(T,D,I,L)、65(G,V)、66(F,I,L,V)、67(L)、68(A,C,W)、69(L)、70(D)、71(N,E)、72(T,K)、73(N)、74(K,A,D,G)、75(L)、76(I,V)、77(V,A)、79(S)、84(R)、85(S,H,N,Q)、86(I,V,Y)、87(E,D)、90(I,V)、91(G)、92(N)、93(L,D,K,Q,R)、94(N,G,T,V)、95(F,K,L)、96(D)、97(L,A,M)、98(K,H)、99(E)、100(I)、101(N)、102(D)、103(I)、105(S,W)、106(G)、108(R,F)、109(G)、110(H,S)、111(D)、112(G)、114(T)、115(S,G,M,R,V)、117(W,H,V)、118(R)、119(S,D,I)、120(V,G,H,N,S,W)、121(A)、122(D,A,F)、123(T)、125(R,Y)、126(Q)、127(K)、128(V,C,I)、130(D,V,W,Y)、131(A,K,S,T)、132(V,Q)、133(R,I)、134(E)、135(H)、136(P)、137(D,I,R,W)、138(Y)、139(R)、140(V)、142(F,H,Y)、143(T)、149(G)、151(L,M,W)、152(A)、153(T,S)、154(V)、155(A)、156(G,M)、158(D)、159(L,Q,R)、162(N,D,E,F,H,I,K,Q,S)、163(G,F,L)、164(Y)、165(D)、166(I)、167(D)、168(V,G)、169(F,S)、170(S)、176(V)、179(R,H,K)、180(A,T)、181(F)、183(E)、184(F,Y)、187(V)、188(Q)、189(T)、190(G)、191(G)、192(T)、193(L,T)、196(I)、198(H,G,S)、199(T)、200(N,S)、202(I,L)、205(R)、206(L)、208(P)、209(R,H)、210(E)、211(F,R,T)、212(G)、213(Y)、214(S,A)、216(S,V)、217(S,V)、218(P)、221(W)、223(K,A)、224(S)、225(G)、226(T)、227(L,H)、228(V)、229(P)、230(V,W)、231(T,H)、232(R,P)、233(N)、236(V)、237(K,H,T,W)、238(I)、239(E)、242(D)、243(A)、244(T,Q,S)、246(G)、248(N)、249(Q)、250(P,S)、251(N)、252(I,C,E)、253(P,R)、254(D,T)、255(I)、256(P)、257(A)、259(L)、260(W)、262(F)、263(G,K)、264(L,C,G)、265(I)、266(G)、267(T,G,M)、268(C,H)以及269(L)，其中脂肪酶变体的氨基酸位置根据与SEQ ID NO:4中所示的疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶TLL的氨基酸序列的对应关系来进行编号。
本发明的仅满足适合性标准中的b)(满足b)、但不满足a)或c)的脂解酶修饰包括2(K)、3(A,H)、4(P)、6(K,Y)、7(H)、9(D,W)、12(W)、13(A,M,Y)、15(M)、16(H)、20(Q)、22(H)、23(R)、25(S)、29(G,S)、30(L,N)、33(M)、37(H)、39(Q)、40(F)、47(W)、48(G)、50(F,K)、51(D,P,Y)、52(M)、54(F,G,K,W)、55(W)、58(I)、60(L)、64(K,R,Y)、65(L)、66(G,Y)、67(H)、68(Y)、69(D)、75(M)、84(H)、86(Q)、90(Y)、92(A)、93(I,P,V)、94(S)、95(H,T)、96(V)、98(M)、100(M)、115(N)、117(Q)、122(S,T,Y)、125(I)、126(M)、127(D)、128(Y)、130(C,R)、132(I)、134(P)、140(C)、151(P)、152(V)、156(T)、164(D,R)、165(Y)、188(F)、208(N)、213(S)、216(D)、227(C)、229(I)、232(C,L)、237(E)、249(E)、250(E)、252(F)、254(A,K)、257(W)以及267(I)，其中脂肪酶变体的氨基酸位置根据与SEQ ID NO:4中所示的疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶TLL的氨基酸序列的对应关系来进行编号。
本发明的仅满足适合性标准中的c)(满足c)、但不满足a)或b)的脂解酶修饰包括1(C,L)、3(R)、6(A,H)、7(M,V)、8(K)、9(Y)、13(K,T,V)、14(V)、15(G,H)、18(M,N,W)、19(I,L,V,W)、20(I)、22(L,M)、24(M,R)、25(E)、31(M,P,V)、37(R,Y)、38(A,E)、39(C,W)、41(V)、42(C)、48(L)、49(G,L,W)、54(E,H,M)、57(S)、58(D,R)、59(D)、60(K,Y)、61(A,D,R)、62(N)、63(K,Q)、65(Y)、66(A,S,T)、74(E)、76(S)、79(M)、84(Q,W)、85(F,I)、87(A)、93(H,N,W)、94(K,M,P)、96(P,R)、97(I)、99(P,Q)、101(C,E,M)、102(H)、103(Y)、105(F)、106(H)、109(T)、110(N)、111(F,W)、112(F,Q)、115(I,L)、117(K)、119(Q,V)、120(I)、121(Q)、123(I,K)、125(C)、128(L,N,W)、130(E)、131(C,N)、132(C)、133(F,N,V)、136(R)、137(A,F,L,M,N,P)、138(F)、140(E,I,L,N)、143(N)、152(I)、154(M,Y)、155(T)、159(M,W)、162(M,P,Y)、163(A,M,R)、165(P)、168(Q)、169(Y)、170(G)、176(F,N,W)、180(D,Q)、183(H,M,Q,S,T,Y)、184(W)、188(E,R)、189(E,M)、190(D,H,R,S,Y)、192(N,P)、199(N,V)、200(P)、202(M)、206(N)、210(S)、212(Q)、214(M)、221(F,G,Y)、223(H,L)、224(A,F,P)、225(C)、226(D)、228(A)、229(M,S)、231(G)、232(D,W)、236(W)、238(V)、239(K)、243(S)、244(A,F,L,M,P)、246(I)、248(D,L,Y)、249(G,T)、250(D,G,K,T)、251(M,Q,S,T,Y)、252(W)、253(F,H,N)、254(N,P)、255(W)、256(D)、259(W,Y)、260(P)、262(K)、263(C,H,M)、265(L,R,W)、266(E)以及268(D,N)，其中脂肪酶变体的氨基酸位置根据与SEQ ID NO:4中所示的疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶TLL的氨基酸序列的对应关系来进行编号。
表面修饰
本发明包括在表面暴露的氨基酸处具有一个或多个修饰的脂解酶的酶变体。酶变体中的表面修饰通过以下方式可用于洗涤剂组合物中：具有针对洗涤性能、酶在洗涤剂组合物中的稳定性以及酶的热稳定性的最小性能指数，而同时具有对亲本脂解酶改善的这些特征中的至少一种。在一些实施例中，表面修饰改变所述位置的氨基酸的疏水性和/或电荷。可使用本领域已知的技术测定疏水性，所述技术诸如White和Wimley(White,S.H.andWimley,W.C,.(1999)Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.28:319–65(White,S.H.和Wimley,W.C,.，1999年，《生物物理学与生物分子结构年鉴》，第28卷，第319–365页))中描述的那些。
如本文所用，“表面特性”可用于指静电荷，以及蛋白质表面所展现的诸如疏水性和亲水性的特性。
本发明的具有作为合适修饰的表面修饰中的至少一者的脂解酶位置包括位置18、27、29、33、51、58、72、75、101、108、114、121、135、137、156、163、187、250、252以及264，其中脂肪酶变体的氨基酸位置根据与SEQ ID NO:4中所示的疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶TLL的氨基酸序列的对应关系来进行编号。
本发明的具有作为合适修饰的表面修饰中的至少一者的脂解酶修饰包括修饰A018K、D027N、D027S、D027T、D027V、P029E、N033D、N033E、N033R、F051T、S058M、T072R、L075Q、N101D、R108K、R108Q、R108Y、T114F、T114I、A121K、H135F、D137V、G156W、G163Y、V187N、V187W、P250E、I252A、I252T或L264P，其中脂肪酶变体的氨基酸位置根据与SEQ IDNO:4中所示的疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶TLL的氨基酸序列的对应关系来进行编号。
本发明的具有作为合适修饰的表面修饰中的至少一者(其中变化为疏水性(而不是电荷)变化)的脂解酶位置包括位置18、27、29、33、51、58、72、75、101、108、114、121、135、137、156、163、187、250、252以及264，其中脂肪酶变体的氨基酸位置根据与SEQ ID NO:4中所示的疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶TLL的氨基酸序列的对应关系来进行编号。
本发明的具有作为合适修饰的表面修饰中的至少一者(其中变化为疏水性(而不是电荷)变化)的脂解酶修饰包括修饰A018K、D027N、D027S、D027T、D027V、P029E、N033D、N033E、N033R、F051T、S058M、T072R、L075Q、N101D、R108K、R108Q、R108Y、T114F、T114I、A121K、H135F、D137V、G156W、G163Y、V187N、V187W、P250E、I252A、I252T或L264P，其中脂肪酶变体的氨基酸位置根据与SEQ ID NO:4中所示的疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶TLL的氨基酸序列的对应关系来进行编号。
本发明的具有作为合适修饰的表面修饰中的至少一者(其中变化为电荷(而不是疏水性)变化)的脂解酶位置包括位置18、27、29、33、72、101、108、121、137以及250，其中脂肪酶变体的氨基酸位置根据与SEQ ID NO:4中所示的疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶TLL的氨基酸序列的对应关系来进行编号。
本发明的具有作为合适修饰的表面修饰中的至少一者(其中变化为电荷(而不是疏水性)变化)的脂解酶修饰包括修饰A018K、D027N、D027S、D027T、D027V、P029E、N033D、N033E、N033R、T072R、N101D、R108Q、R108Y、A121K、D137V或P250E，其中脂肪酶变体的氨基酸位置根据与SEQ ID NO:4中所示的疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶TLL的氨基酸序列的对应关系来进行编号。
本发明的具有对亲本脂解酶的氨基酸修饰的脂解酶位置，其中该修饰是以下这种修饰，其中对于表达和洗涤剂稳定性来说，相对于TLL亲本的最小性能指数(PI)大于或等于0.8，并且其中对于在半数剂量下的洗涤剂性能来说，相对于TLL亲本的最小性能指数(PI)大于或等于1.1，并且其中有效修饰选自1(S)、5(H,I,S,T)、8(H)、9(K,N)、11(H,K)、13(N)、19(G)、23(K,N,Q R)、27(Q,R)、29(K,R)、32(A)、33(D)、37(G,H,Q)、38(F,L,M,W,Y)、39(I,L)、42(W)、43(D,I,R,T)、45(F,Q,V)、51(M)、53(E)、54(P)、56(H,K,R)、58(H,K,Q,W)、69(R)、73(R)、75(A,R)、75(T)、77(I,L,T)、90(F,T)、91(I,Q)、94(R)、105(P)、108(K)、122(F)、125(T)、130(A,R)、132(K,R)、134(L)、137(R)、151(T)、155(S)、156(W)、163(F,P)、164(R)、180(K)、183(V)、184(Y)、187(G,H,N,Q,S,T,W)、189(G,Q)、211(I)、214(A)、228(R)、232(P)、233(Q)、244(I)、252(N)以及265(Q)，其中脂肪酶变体的氨基酸位置根据与SEQ ID NO:4中所示的疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶TLL的氨基酸序列的对应关系来进行编号。
本发明的具有对亲本脂解酶的氨基酸修饰的脂解酶位置，其中该修饰是以下这种修饰，其中对于表达和洗涤剂稳定性来说，相对于TLL亲本的最小性能指数(PI)大于或等于0.8，并且其中对于在半数剂量下有辅剂情况下的洗涤剂性能来说，相对于TLL亲本的最小性能指数(PI)大于或等于1.1，并且其中有效修饰选自1(S)、3(T)、4(F)、5(H,I,S,T)、8(H,T,V)、9(G,H,K)、11(K)、12(V,W)、18(K)、19(G)、23(K,Q,R)、27(R,S)、32(I)、38(F,L,M,W,Y)、39(I,P)、43(I,R,T)、45(F,Q)、53(K)、54(P)、56(K,R)、58(H,Q)、75(G,Q,R)、77(I)、90(T)、91(I,Q)、105(P)、123(N)、127(F)、130(A,F,H,Q,R)、131(R)、136(Q)、137(R,S)、143(S)、156(T)、162(G)、163(S)、164(R,V)、166(G)、180(K)、187(G,H,N,Q,S,T,W)、188(F)、189(D,G)、199(G)、228(R)、252(N)、264(R)以及265(Q)，其中脂肪酶变体的氨基酸位置根据与SEQ ID NO:4中所示的疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶TLL的氨基酸序列的对应关系来进行编号。
本发明的具有对亲本脂解酶的氨基酸修饰的脂解酶位置，其中该修饰是以下这种修饰，其中对于表达和洗涤剂稳定性来说，相对于TLL亲本的最小性能指数(PI)大于或等于0.8，并且其中对于在全剂量下的洗涤剂性能来说，相对于TLL亲本的最小性能指数(PI)大于或等于1.1，并且其中有效修饰选自1(S)、5(H,I,T)、23(E,Q)、29(H,I,R,T)、39(H,I)、43(R,T)、54(T)、58(Q)、115(T)、130(A,R)、154(L)、158(E)、180(K)、187(T)、228(R)以及269(W)，其中脂肪酶变体的氨基酸位置根据与SEQ ID NO:4中所示的疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶TLL的氨基酸序列的对应关系来进行编号。
本发明的具有对亲本脂解酶的氨基酸修饰的脂解酶位置，其中该修饰是以下这种修饰，其中对于表达和在pH 8下的pNPO底物水解来说，相对于TLL亲本的最小性能指数(PI)大于或等于0.8，并且其中对于热稳定性来说，相对于TLL亲本的最小性能指数(PI)大于或等于1.1，并且其中有效修饰选自2(I)、11(K)、15(S)、18(K)、23(C,D,E,F,H,I,K,M,N,Q,S,T,V)、24(H)、26(T)、27(A,G,H,N,Q,R,S,T,V)、29(E)、37(P)、48(E,Q)、50(S)、51(A,I,L,S,T)、56(K,V,)、58(M)、66(N,Q)、75(A,G,Q,R)、77(I,T)、91(E,Q)、94(R)、96(K)、99(D,S)、101(D,H)、108(K,M,Y)、111(A,E,Q)、114(F,I,V)、117(Q)、120(N)、121(K)、135(F)、137(I,Q,R)、154(F,I,L)、155(G,S)、156(W)、163(F)、169(S)、176(I)、187(H,N,W)、226(N)、250(E)、252(A)、256(T)、264(C,H,M,P,Q,S)、265(M)以及269(Q)，其中脂肪酶变体的氨基酸位置根据与SEQ ID NO:4中所示的疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶TLL的氨基酸序列的对应关系来进行编号。
本发明的具有对亲本脂解酶的氨基酸修饰的脂解酶位置，其中该修饰是以下这种修饰，其中对于表达和在pH 8下的pNPO底物水解来说，相对于TLL亲本的最小性能指数(PI)大于或等于0.8，并且其中对于洗涤剂稳定性来说，相对于TLL亲本的最小性能指数(PI)大于或等于1.1，并且其中有效修饰选自12(F)、13(Q)、15(S)、19(C,G)、20(P)、23(D,E,F,I,V)、24(W)、26(C,T,W,Y)、28(D,P)、31(E)、34(P)、37(C,D)、39(E,L,P)、42(I,V)、45(F,V)、46(F,G,L,W)、47(F,M,T,W)、49(H,V)、51(A,G,I,L,M,S,T)、60(L)、64(V)、66(Q)、68(S,T,V)、73(E,G,R,S)、75(E,G,Q,R)、77(A,L,N,T)、91(E,Q)、94(D)、108(E,F,M,Q,Y)、114(F,I,V)、127(T)、128(H,S,Y)、131(R,W,Y)、132(D)、133(E,Q)、136(D,Q)、139(M)、140(F,M,Q)、142(Y)、154(I)、155(S)、156(W)、159(E,R)、163(F,L,P,Y)、168(G,L)、179(L)、187(H,N,Q,T)、188(F)、189(D)、205(D)、208(E)、209(S)、214(D)、223(T)、225(E)、228(E)、237(L,Y)、250(E)、251(D)、252(A)、256(T)、264(C,H,P,Q,S)以及265(M)，其中脂肪酶变体的氨基酸位置根据与SEQ ID NO:4中所示的疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶TLL的氨基酸序列的对应关系来进行编号。
本发明的具有对亲本脂解酶的氨基酸修饰的脂解酶位置，其中该修饰是以下这种修饰，其中对于表达和在pH 8下的pNPO底物水解来说，相对于TLL亲本的最小性能指数(PI)大于或等于0.8，并且其中对于LAS稳定性来说，相对于TLL亲本的最小性能指数(PI)大于或等于1.1，并且其中有效修饰选自1(F,R)、4(K,L,N,W)、5(K)、11(K)、23(K)、27(A,H,N,R,S,T,V)、37(P)、38(H,K,L,W,Y)、42(V)、43(I,R)、45(F,Q,V)、47(T)、49(V)、51(I,M,S)、56(H,K,S,T)、58(M,Q)、73(S)、75(D,E,G,Q,R)、91(Q)、94(R)、101(D)、108(K)、111(A)、119(D,T)、120(Y)、154(I)、179(L)、187(T)、189(D,Q)、200(A)、209(S)、211(W)、226(N)、250(E,Q)、251(W)、252(A)以及256(T)，其中脂肪酶变体的氨基酸位置根据与SEQ ID NO:4中所示的疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶TLL的氨基酸序列的对应关系来进行编号。
本发明的具有对亲本脂解酶的氨基酸修饰的脂解酶位置，其中该修饰是以下这种修饰，其中对于表达和热稳定性来说，相对于TLL亲本的最小性能指数(PI)大于或等于0.8，并且其中对于pNPB水解来说，相对于TLL亲本的最小性能指数(PI)大于或等于1.1，并且其中有效修饰选自2(I,L)、3(D)、4(D,I,L,W)、5(H,Y)、8(H,M)、9(K)、11(H,K)、18(K)、23(K)、24(A,T)、26(K,T)、27(A,I,Q,T)、29(H,I,K,R,T,V)、30(R,V)、32(S)、35(K)、37(G)、40(M)、54(V)、69(A,K)、71(R)、72(L)、74(A)、75(M,S)、91(I)、94(R)、101(Y)、108(K,Y)、111(L,T,V)、114(I)、122(T,Y)、123(Q)、125(Q)、130(F,H)、132(H,W)、134(L,V)、137(H,K,S,T,W,Y)、151(T,W)、155(G)、156(W)、162(G)、163(Y)、166(G)、176(I)、180(K)、187(H,S,T,W)、189(K)、232(L,P)、233(D,H)、237(L,Y)、244(I)、252(L,T)、255(L)、263(I,V)、265(M)以及269(M)，其中脂肪酶变体的氨基酸位置根据与SEQ ID NO:4中所示的疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶TLL的氨基酸序列的对应关系来进行编号。
本发明的具有对亲本脂解酶的氨基酸修饰的脂解酶位置，其中该修饰是以下这种修饰，其中对于表达和热稳定性来说，相对于TLL亲本的最小性能指数(PI)大于或等于0.8，并且其中对于pNPO水解来说，相对于TLL亲本的最小性能指数(PI)大于或等于1.1，并且其中有效修饰选自1(D)、2(L)、3(D,T)、4(A,D,L,M)、5(H,Y)、8(A,E,M)、9(R)、18(K)、23(D,E,F,N,Q)、24(A,D,E,H,N,T)、26(G,K)、27(A,E,I,N,Q,T)、29(E,Q,R)、33(D,E,F,M,Q,R,S)、37(D,E,P,Q)、38(D,N)、40(M)、48(E,Q)、49(V)、50(E,F)、51(I,L,T)、54(F,R)、56(H,K,R,T)、58(M,Q)、64(N)、66(Q)、74(Q)、75(E,M,N,Q,R)、77(A,I,L,T)、87(P)、90(E,F,Q)、101(D)、105(D,P)、108(K,Q,Y)、111(A,E,L,Q,T)、114(F,M)、115(R)、117(Q)、120(N)、122(Y)、123(E,L,M,N,Q)、125(Q)、127(E,F,R)、130(A,F,H,Q)、132(K,Q,R)、134(L)、137(E,G,H,I,K,Q,R,S,T,V,W,Y)、154(F,L)、155(G,S)、156(F,W)、158(E,F,Y)、162(G,R)、163(F,P,S,W,Y)、169(S)、176(I)、180(K)、187(H,N,Q,S,T,W)、189(D,Q,R)、225(E)、227(M)、228(E)、232(P)、233(D,G,Q)、264(E,M,N,P,Q,R,S,T)、265(M)以及269(M,Q)，其中脂肪酶变体的氨基酸位置根据与SEQ ID NO:4中所示的疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶TLL的氨基酸序列的对应关系来进行编号。
本发明的具有对亲本脂解酶的氨基酸修饰的脂解酶位置，其中该修饰是以下这种修饰，其中对于表达和热稳定性来说，相对于TLL亲本的最小性能指数(PI)大于或等于0.8，并且其中对于pNPP水解来说，相对于TLL亲本的最小性能指数(PI)大于或等于1.1，并且其中有效修饰选自1(Q,S)、3(D,T)、4(A,D,L,M)、5(H,S,Y)、9(M)、11(K)、12(F)、15(S)、23(F)、27(E,N,Q,T)、29(R)、32(A,Q,S)、33(D,Q)、35(E,K,R)、40(M)、48(Q)、51(I,L,M,T)、56(H,K,R,T)、58(M,Q)、71(E)、75(R)、77(I,T)、87(P)、105(A)、108(K)、111(A,L)、114(M)、115(R)、127(E,F)、130(A)、132(Q,R,W)、134(L)、137(E,G,H,I,K,Q,R,S,Y)、143(A)、155(S)、162(G)、163(F,P,S,W,Y)、164(D,R)、165(I,Y)、187(H,N,Q,S,W)、189(R)、225(E)、227(A,M)、232(P)、233(Q)、244(I)、252(A,K,L,R)、263(I,V)、264(H,R,T)以及269(V)，其中脂肪酶变体的氨基酸位置根据与SEQ ID NO:4中所示的疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶TLL的氨基酸序列的对应关系来进行编号。
本发明的具有对亲本脂解酶的氨基酸修饰的脂解酶位置，其中该修饰是以下这种修饰，其中对于表达和热稳定性来说，相对于TLL亲本的最小性能指数(PI)大于或等于0.8，并且其中对于pNPB和pNPO水解来说，相对于TLL亲本的最小性能指数(PI)大于或等于1.1，并且其中有效修饰选自2(L)、3(D)、4(D,L)、5(H,Y)、8(M)、18(K)、24(A,T)、26(K)、27(A,I,Q,T)、29(R)、40(M)、75(M)、108(K,Y)、111(L,T)、122(Y)、123(Q)、125(Q)、130(F,H)、134(L)、137(H,K,S,T,W,Y)、155(G)、156(W)、162(G)、163(Y)、176(I)、180(K)、187(H,S,T,W)、232(P)、233(D)、265(M)以及269(M)，其中脂肪酶变体的氨基酸位置根据与SEQ ID NO:4中所示的疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶TLL的氨基酸序列的对应关系来进行编号。
本发明的具有对亲本脂解酶的氨基酸修饰的脂解酶位置，其中该修饰是以下这种修饰，其中对于表达和热稳定性来说，相对于TLL亲本的最小性能指数(PI)大于或等于0.8，并且其中对于pNPO和pNPP水解来说，相对于TLL亲本的最小性能指数(PI)大于或等于1.1，并且其中有效修饰选自3(D,T)、4(A,D,L,M)、5(H,Y)、23(F)、27(E,N,Q,T)、29(R)、33(D,Q)、40(M)、48(Q)、51(I,L,T)、56(H,K,R,T)、58(M,Q)、75(R)、77(I,T)、87(P)、108(K)、111(A,L)、114(M)、115(R)、127(E,F)、130(A)、132(Q,R)、134(L)、137(E,G,H,I,K,Q,R,S,Y)、155(S)、162(G)、163(F,P,S,W,Y)、187(H,N,Q,S,W)、189(R)、225(E)、227(M)、232(P)、233(Q)以及264(R,T)，其中脂肪酶变体的氨基酸位置根据与SEQ ID NO:4中所示的疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶TLL的氨基酸序列的对应关系来进行编号。
本发明的具有对亲本脂解酶的氨基酸修饰的脂解酶位置，其中该修饰是以下这种修饰，其中对于表达和热稳定性来说，相对于TLL亲本的最小性能指数(PI)大于或等于0.8，并且其中对于pNPB、pNPO和pNPP水解来说，相对于TLL亲本的最小性能指数(PI)大于或等于1.1，并且其中有效修饰选自3(D)、4(D,L)、5(H)、5(Y)、27(Q,T)、29(R)、40(M)、108(K)、111(L)、134(L)、137(H,K,S,Y)、162(G)、163(Y)、187(H,S,W)以及232(P)，其中脂肪酶变体的氨基酸位置根据与SEQ ID NO:4中所示的疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶TLL的氨基酸序列的对应关系来进行编号。
本发明的具有对亲本脂解酶的氨基酸修饰的脂解酶位置，其中该修饰是以下这种修饰，其中对于表达和热稳定性来说，相对于TLL亲本的最小性能指数(PI)大于或等于0.8，对于pNPB水解来说，相对于TLL亲本的最小性能指数(PI)小于或等于0.8，并且其中对于pNPP水解来说，相对于TLL亲本的最小性能指数(PI)大于或等于1，并且其中有效修饰选自1(Q)、9(M)、12(F)、15(S)、23(F)、27(E)、32(Q)、35(E)、48(Q)、58(M,Q)、71(E)、75(R)、115(R)、130(A)、132(Q,R)、137(E,I,Q,R)、143(A)、155(S)、163(F,P,S)、164(D)、165(I,Y)、187(Q)、225(E)、227(A,M)、233(Q)、252(A,K,R)、264(H,R,T)以及269(V)，其中脂肪酶变体的氨基酸位置根据与SEQ ID NO:4中所示的疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶TLL的氨基酸序列的对应关系来进行编号。
本发明的具有对亲本脂解酶的氨基酸修饰的脂解酶位置，其中该修饰是以下这种修饰，其中对于表达和热稳定性来说，相对于TLL亲本的最小性能指数(PI)大于或等于0.8，并且其中对于在pH 6下的pNPO水解来说，相对于TLL亲本的最小性能指数(PI)大于或等于1.1，并且其中有效修饰选自1(Q,S)、2(L)、3(T)、4(A,D,L,M)、5(H,Y)、9(K)、11(K)、12(F)、15(S)、24(A,D,E,H,N)、27(A,E,Q,T)、29(R)、32(A)、33(D,F,Q)、38(D)、40(M)、48(Q)、49(V)、51(I,L,M,T)、56(H,K,T)、58(M,Q)、69(A)、75(R)、77(T)、91(Q)、94(R)、98(I)、105(A)、108(K,Y)、111(A,L)、114(I,M,V)、121(K)、123(E,L,M,N,Q)、125(Q)、127(E,F)、130(A,H)、132(R)、134(L)、137(E,G,H,I,K,Q,R,S,V,Y)、143(A)、151(P)、154(F,I,L)、155(S)、156(W)、158(Y)、162(G)、163(F,P,W,Y)、164(D,R)、165(I,Y)、180(K)、187(H,N,Q,S,T,W)、189(R)、227(M)、228(R)、232(P)、252(L)、263(I,V)、265(M)以及269(M)，其中脂肪酶变体的氨基酸位置根据与SEQ ID NO:4中所示的疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶TLL的氨基酸序列的对应关系来进行编号。
本发明的多肽
本发明提供新型多肽，其可统称为“本发明的多肽”。本发明的多肽包括分离的、重组的、基本上纯的或非天然存在的变体脂解酶多肽，包括例如具有酶活性(例如脂解活性)的变体脂解酶多肽。在一些实施例中，本发明的多肽可用于清洁应用，并且可掺入到可在清洁需要进行清洁的物品或表面(例如物品的表面)的方法中使用的清洁组合物中。
在一些实施例中，脂解酶变体可为来自嗜热丝孢菌属的亲本脂解酶的变体。.已在嗜热丝孢菌属中发现了多种脂解酶，所述脂解酶彼此具有高的同一性，并且与如SEQ IDNO:4中所示的来自疏棉状嗜热丝孢菌的脂解酶(TLL)具有高的同一性。以上部分中所述的所有脂解酶变体可为来自嗜热丝孢菌属的亲本脂解酶的变体，并且更具体地讲，如SEQ IDNO:4中所示的来自疏棉状嗜热丝孢菌的脂解酶(TLL)的变体。
在一些实施例中，脂解酶变体可为与来自嗜热丝孢菌属的脂解酶具有50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的变体。在多个实施例中，脂解酶变体可为与如SEQ ID NO:4中所示的来自疏棉状嗜热丝孢菌的脂解酶(TLL)具有50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的变体。
所描述的是涉及从疏棉状嗜热丝孢菌克隆的脂肪酶(TLL)的组合物和方法。该组合物和方法部分基于以下观察：克隆并表达的TLL在存在洗涤剂组合物的情况下具有羧酸酯水解酶活性(作用于羧酸酯)。TLL的这些特征使其特别适用于多种清洁应用，在这些应用中所述酶可在存在于洗涤剂组合物中的表面活性剂和其他组分的存在下水解脂质。
尽管TLL对多种天然和合成底物显示出活性，但这种酶已显示出对C4-C16底物的偏好，对C8底物具有峰值活性。这种特异性分布使得TLL特别适用于水解短链、中等链和长链甘油三酯并且特别适用于进行涉及短链、中等链和长链脂肪酸酯的酯交换反应。
在一个方面，本发明组合物和方法提供了变体TLL多肽。自疏棉状嗜热丝孢菌(来自家族abH23.01，米黑根毛霉(Rhizomucor mihei)脂肪酶样(脂肪酶工程数据库(LipaseEngineering Database)，www.led.uni-stuttgart.de)，其具有示出为PDB:1DT3的成熟脂肪酶氨基酸序列)分离亲本TLL多肽。成熟TLL多肽具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列。类似地，实质上相同的TLL多肽可存在于自然界中，例如存在于疏棉状嗜热丝孢菌的其他菌株或分离株中。本发明组合物和方法涵盖这些和其他重组TLL多肽。
在一些实施例中，本发明包括分离的、重组的、基本上纯的或非天然存在的具有脂解活性的变体脂解酶，其多肽包含与如本文提供的亲本脂解酶具有至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、至少约99.5％、或100％序列同一性的多肽序列。
在一些实施例中，变体多肽为与示例性TLL多肽具有指定程度的氨基酸序列同源性，例如与SEQ ID NO:3或4的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或甚至至少99％序列同源性的变体。同源性可例如使用诸如BLAST、ALIGN或CLUSTAL之类的程序(如本文中所述)通过氨基酸序列比对来测定。
还提供分离的、重组的、基本上纯的或非天然存在的序列，其编码具有脂解活性的变体脂解酶，所述变体脂解酶(例如变体脂肪酶)包含与SEQ ID NO:4的氨基酸序列有不超过50、不超过40、不超过30、不超过35、不超过25、不超过20、不超过19、不超过18、不超过17、不超过16、不超过15、不超过14、不超过13、不超过12、不超过11、不超过10、不超过9、不超过8、不超过7、不超过6、不超过5、不超过4、不超过3、不超过2或不超过1个氨基酸残基不同的氨基酸序列，其中变体脂肪酶的氨基酸位置根据SEQ ID NO:4中所示的疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶TLL的氨基酸序列中的对应氨基酸位置的编号方式来进行编号，如通过变体脂解酶氨基酸序列与疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶TLL氨基酸序列的比对所确定。
如上所述，本发明的变体脂解酶多肽具有酶活性(例如脂解活性)并且因此可用于清洁应用，包括但不限于用于清洁餐具物品、餐具物品、织物和具有硬质表面的物品(例如桌子、桌面、墙壁、家具物品、地板、天花板等的硬质表面)的方法。包含一种或多种本发明的变体脂解酶多肽的示例性清洁组合物在下文中进行描述。本发明的变体脂解酶多肽的酶活性(例如脂解酶活性)可使用本领域普通技术人员熟知的程序容易地测定。下文所提供的实例描述用于评估酶活性、清洁性能、洗涤剂稳定性和/或热稳定性的方法。本发明的变体脂解酶在去除污渍(例如脂质污渍)、清洁硬质表面或清洁衣物、餐具或餐具物品方面的性能可用本领域所熟知的程序和/或通过使用实例部分中示出的程序容易地测定。
可对本发明的多肽进行多种改变，如一个或多个氨基酸的插入、缺失和/或置换(保守的或非保守的置换)，包括其中这类改变不会实质上改变多肽的酶活性的情况。类似地，也可对本发明的核酸进行多种改变，如在一个或多个密码子中对一个或多个核酸进行一种或多种置换使得特定的密码子编码相同或不同的氨基酸，从而导致沉默变异(如核苷酸序列中的突变导致氨基酸序列中的沉默突变，例如当所编码的氨基酸未因核酸突变而改变时)或非沉默变异；序列中一个或多个核酸(或密码子)的一种或多种缺失；序列中一个或多个核酸(或密码子)的一种或多种添加或插入；和/或序列中一个或多个核酸(或密码子)的切除或序列中一个或多个核酸(或密码子)的一种或多种截短。与原始核酸序列编码的变体脂解酶相比，核酸序列中的许多此类变化可能不会实质上改变所得的编码的变体脂解酶的酶活性。还可对本发明的核酸进行修饰以包括一个或多个使得能在表达系统(例如细菌表达系统)中提供最佳表达的密码子，同时如果需要，所述一个或多个密码子仍编码相同氨基酸。
在一些实施例中，本发明提供这样一类多肽，其包括具有所需酶活性(如脂解酶活性或清洁性能活性)的变体脂解酶多肽，所述变体脂解酶多肽包含具有本文所述的氨基酸置换的序列，并且还包含一个或多个另外的氨基酸置换，例如保守和非保守置换，其中多肽表现出、保持、或大致保持所需的酶活性(例如脂解酶活性或脂肪酶活性，如变体脂解酶的清洁活性或性能所反映的)。根据本发明的氨基酸置换可包括但不限于一个或多个非保守置换和/或一个或多个保守氨基酸置换。保守氨基酸残基置换通常涉及将一功能类别的氨基酸残基中的成员替换为属于同一功能类别的残基(在计算功能同源性百分数时相同氨基酸残基被视为在功能上是同源的或保守的)。保守氨基酸置换通常涉及用功能相似的氨基酸置换氨基酸序列中的氨基酸。例如，丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸是功能相似的，因而可充当彼此的保守氨基酸置换。天冬氨酸和谷氨酸可充当彼此的保守置换。天冬酰胺和谷氨酰胺可充当彼此的保守置换。精氨酸、赖氨酸和组氨酸可充当彼此的保守置换。异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸和缬氨酸可充当彼此的保守置换。苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸可充当彼此的保守置换。
可以设想其他的保守氨基酸置换组。例如，可通过相似的功能或化学结构或组成对氨基酸进行分组(例如酸性、碱性、脂族、芳族、含硫氨基酸)。例如，脂族组可包括：甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)。含有可视为彼此保守置换的氨基酸的其他组包括：芳族组：苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；含硫组：甲硫氨酸(M)、半胱氨酸(C)；碱性组：精氨酸(R)、赖氨酸(K)、组氨酸(H)；酸性组：天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；非极性不带电荷的残基的组：半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)和脯氨酸(P)；亲水性不带电荷的残基的组：丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、天冬酰胺(N)和谷氨酰胺(Q)。另外的氨基酸分组是本领域技术人员所熟知的并在各种标准教科书中有描述。本文的多肽序列的列表，结合上文的置换组，提供了所有经保守置换的多肽序列的明确列表。
在上文描述的氨基酸残基类别中存在更保守的置换，其也可以是合适的或者其作为另一种选择可以是合适的。用于更保守的置换的保守组包括：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸以及天冬酰胺-谷氨酰胺。因此，例如在一些实施例中，本发明提供分离或重组的具有脂解活性的变体脂解酶多肽(如变体脂肪酶)，所述变体脂解酶多肽包含与SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约99.5％序列同一性的氨基酸序列。本发明的变体脂解酶中一个氨基酸保守置换另一个氨基酸预计不会显著改变变体脂解酶的酶活性或清洁性能活性。所得的脂解酶的酶活性或清洁性能活性可容易地用标准测定法和本文所述的测定法进行测定。
本发明的多肽序列(如本发明的变体脂解酶)的保守置换变异包括用相同保守置换组的保守选择氨基酸来置换多肽序列的少百分比的，有时低于约25％、约20％、约15％、约14％、约13％、约12％、约11％、约10％、约9％、约8％、约7％或约6％的氨基酸，或多肽序列的低于约5％、约4％、约3％、约2％或约1％的氨基酸。
本发明的核酸
本发明提供分离的、非天然存在的或重组的核酸(在本文中也称为“多核苷酸”)，其可统称为“本发明的核酸”或“本发明的多核苷酸”，其编码本发明的多肽。本发明的核酸(包括下文所述的全部核酸在内)可用于本发明多肽的重组生产(如表达)，通常是通过表达包含编码所关注的多肽或其片段的序列的质粒表达载体来进行。如上文所讨论，多肽包括变体脂解酶多肽，包括具有酶活性(如脂解活性)的变体脂肪酶多肽在内，其可用于清洁应用和清洁组合物，以用于清洁需要进行清洁的物品或表面(如物品的表面)。
在一些实施例中，本发明提供分离的、重组的、基本上纯的或非天然存在的核酸，其包含编码在以上题为“本发明的多肽”的章节中以及本文其他地方描述的任何本发明多肽(包括任何融合蛋白等)的核苷酸序列。本发明还提供分离、重组、基本上纯的或非天然存在的核酸，其包含编码本发明上述和本文其他地方所述的任何多肽中两种或更多种的组合的核苷酸序列。
还提供分离的、重组的、基本上纯的或非天然存在的核酸，其包含编码具有脂解活性的变体脂解酶的多核苷酸序列，所述变体脂解酶(例如变体脂肪酶)包含与SEQ ID NO:4的氨基酸序列有不超过50、不超过40、不超过30、不超过35、不超过25、不超过20、不超过19、不超过18、不超过17、不超过16、不超过15、不超过14、不超过13、不超过12、不超过11、不超过10、不超过9、不超过8、不超过7、不超过6、不超过5、不超过4、不超过3、不超过2或不超过1个氨基酸残基不同的氨基酸序列，其中变体脂肪酶的氨基酸位置根据SEQ ID NO:1中所示的疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶TLL的氨基酸序列中的对应氨基酸位置的编号方式来进行编号，如通过变体脂解酶氨基酸序列与疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶TLL氨基酸序列的比对所确定。
如前文所述，本发明提供了编码嗜热丝孢菌属脂肪酶的脂肪酶变体的核酸，其中脂肪酶变体的氨基酸位置根据与如SEQ ID NO:4中示出的疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶TLL的氨基酸序列的对应关系进行编号。
本发明的核酸可通过使用任何合适的合成、操纵和/或分离技术或这些技术的组合来产生。例如，本发明的多核苷酸可用标准的核酸合成技术，如本领域技术人员所熟知的固相合成技术来制备。还可通过本领域已知的任何合适的方法，包括但不限于使用经典的亚磷酰胺方法(参见例如Beaucage et al.Tetrahedron Letters 22:1859-69(1981)(Beaucage等人，《四面体通讯》，第22卷，第1859-1869页，1981年))；或Matthes等人描述的方法(参见Matthes et al.,EMBO J.3:801-805(1984)(Matthes等人，《欧洲分子生物学组织杂志》，第3卷，第801-805页，1984年)，其为自动合成方法中通常实施的)进行化学合成，来促进(或者完成)本发明核酸的合成。本发明的核酸也可以通过使用自动DNA合成仪来制备。定制的核酸可从多个商业来源订购(例如米德兰认证试剂公司(Midland CertifiedReagent Company)、大美洲基因公司(Great American Gene Company)、操纵子技术公司(Operon Technologies Inc.)和DNA2.0公司(DNA2.0))。其他合成核酸的技术和相关原理是本领域已知的(参见例如Itakura et al.,Ann.Rev.Biochem.53:323(1984)(Itakura等人，《生物化学年鉴》，第53卷，第323页，1984年)；和Itakura et al.,Science 198:1056(1984)(Itakura等人，《科学》，第198卷，第1056页，1984年))。
本发明的经修饰的变体脂解酶的制备方法
多种适用于产生编码本发明变体脂解酶的本发明经修饰的多核苷酸的方法是本领域已知的，其包括但不限于例如点饱和诱变、扫描诱变、插入诱变、缺失诱变、随机诱变、定点诱变和定向进化以及各种其他重组方法。制备修饰的多核苷酸和蛋白质(例如变体脂解酶)的方法包括DNA改组方法，基于基因的非同源重组的方法，诸如ITCHY(参见Ostermeier et al.,7:2139-44(1999)(Ostermeier等人，第7卷，第2139-2144页，1999年))、SCRACHY(参见Lutz et al.98:11248-53(2001)(Lutz等人，第98卷，第11248-11253页，2001年))、SHIPREC(参见Sieber et al.,19:456-60(2001)(Sieber等人，第19卷，第456-460页，2001年))、以及NRR(参见Bittker et al.,20:1024-9(2001)(Bittker等人，第20卷，第1024-1029页，2001年)；Bittker et al.,101:7011-6(2004)(Bittker等人，第101卷，第7011-7016页，2004年))以及依赖于使用寡核苷酸来插入随机和靶向的突变、缺失和/或插入的方法(参见Ness et al.,20:1251-5(2002)(Ness等人，第20卷，第1251-1255页，2002年)；Coco et al.,20:1246-50(2002)(Coco等人，第20卷，第1246-1250页，2002年)；Zha.,4:34-9(2003)(Zha等人，第4卷，第34-39页，2003年)；Glaser et al.,149:3903-13(1992))(Glaser等人，第149卷，第3903-3913页，1992年)；
用于产生本发明的变体脂解酶的载体、细胞和方法
本发明提供分离的或重组的包含至少一种本文所述的本发明多核苷酸(例如编码本文所述的本发明变体脂解酶的多核苷酸)的载体；分离的或重组的包含至少一种本发明的核酸或多核苷酸的表达载体或表达盒；分离的、基本上纯的或重组的包含至少一种本发明的核酸或多核苷酸的DNA构建体；分离的或重组的包含至少一种本发明的多核苷酸的细胞；包含细胞的细胞培养物，所述细胞包含至少一种本发明的多核苷酸；包含至少一种本发明的核酸或多核苷酸的细胞培养物；和包含一种或多种此类载体、核酸、表达载体、表达盒、DNA构建体、细胞、细胞培养物或它们的任何组合或混合物的组合物。
在一些实施例中，本发明提供包含至少一种本发明的载体(例如表达载体或DNA构建体)的重组细胞，所述载体包含至少一种本发明的核酸或多核苷酸。一些这类重组细胞转化有或转染有此类至少一种载体。这类细胞通常称为宿主细胞。一些此类细胞包括细菌细胞，包括但不限于芽孢杆菌(Bacillus sp.)细胞，诸如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)细胞。本发明还提供包含至少一种本发明的变体脂解酶的重组细胞(例如重组宿主细胞)。
在一些实施例中，本发明提供包含本发明的核酸或多核苷酸的载体。在一些实施例中，所述载体为表达载体或表达盒，其中编码本发明变体脂解酶的本发明多核苷酸序列有效连接至一个或多个为进行有效基因表达所需的另外的核酸区段(例如与编码本发明变体脂解酶的本发明多核苷酸有效连接的启动子)。载体可包含转录终止子和/或选择基因，如抗生素抗性基因，所述抗性基因使得能通过在含有抗微生物剂的培养基中生长而对质粒感染的宿主细胞进行连续的培养维持。
表达载体可衍生自质粒或病毒DNA，或在备选实施例中，含有这二者的元件。示例性的载体包括但不限于pXX、pC194、pJH101、pE194、pHP13(参见Harwood and Cutting[eds.],Chapter 3,Molecular Biological Methods for Bacillus,John Wiley&Sons[1990](Harwood和Cutting[编辑]，第3章，《芽孢杆菌的分子生物学方法》，约翰·威利父子出版公司，1990年)；适于枯草芽孢杆菌的复制型质粒包括第92页列出的那些；还可参见Perego,Integrational Vectors for Genetic Manipulations in Bacillus subtilis(Perego，“用于在枯草芽孢杆菌中进行遗传操纵的整合载体”)，见Sonenshein et al.,[eds.]Bacillus subtilis and Other Gram-Positive Bacteria:Biochemistry,Physiology and Molecular Genetics,American Society for Microbiology,Washington,D.C.[1993],pp.615-624(Sonenshein等人[编辑]，《枯草芽孢杆菌和其他革兰氏阳性细菌：生物化学、生理学和分子遗传学》，美国微生物学学会，华盛顿哥伦比亚特区，1993年，第615-624页)。
为了在细胞中表达和产生所关注的蛋白质(如变体脂解酶)，将至少一个包含编码经修饰的脂解酶的多核苷酸的至少一个拷贝(优选包含多个拷贝)的表达载体在适于表达脂解酶的条件下转化进细胞中。在本发明的一些实施例中，将编码变体脂解酶的多核苷酸序列(以及载体中包含的其他序列)整合进宿主细胞的基因组中，而在其他实施例中，将包含编码变体脂解酶的多核苷酸序列的质粒载体在细胞内保持为自主的染色体外元件。本发明提供染色体外核酸元件以及整合进宿主细胞基因组中的输入核苷酸序列二者。本文所述的载体可用于产生本发明的变体脂解酶。在一些实施例中，编码变体脂解酶的多核苷酸构建体存在于整合型载体上，所述整合型载体使得编码变体脂解酶的多核苷酸能整合以及任选扩增进细菌染色体中。整合位点的例子是本领域技术人员熟知的。在一些实施例中，编码本发明的变体脂解酶的多核苷酸的转录通过启动子来实现，所述启动子对所选择的前体脂解酶而言是野生型启动子。在一些其他实施例中，启动子对于前体脂解酶而言是异源的，但在宿主细胞中为有功能的。具体而言，适合于在细菌宿主细胞中使用的启动子的例子包括但不限于例如amyE、amyQ、amyL、pstS、sacB、pSPAC、pAprE、pVeg、pHpaII启动子、嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)麦芽糖淀粉酶基因的启动子、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)(BAN)淀粉酶基因的启动子、枯草芽孢杆菌碱性脂解酶基因的启动子、克劳氏芽胞杆菌(B.clausii)碱性脂解酶基因的启动子、短小芽胞杆菌(B.pumilis)木糖苷酶基因的启动子、苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)cryIIIA的启动子以及地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)α-淀粉酶基因的启动子。另外的启动子包括但不限于A4启动子，以及噬菌体λPR或PL启动子，和大肠杆菌(E.coli)lac、trp或tac启动子。
本发明的变体脂解酶可在任何合适的革兰氏阳性微生物(包括细菌和真菌)的宿主细胞中产生。例如，在一些实施例中，变体脂解酶在真菌和/或细菌来源的宿主细胞中产生。在一些实施例中，宿主细胞是芽孢杆菌属、链霉菌属(Streptomyces sp.)、埃希杆菌属(Escherichia sp.)或曲霉菌属(Aspergillus sp.)。在一些实施例中，变体脂解酶是通过芽孢杆菌宿主细胞来产生。可用于产生本发明变体脂解酶的芽孢杆菌宿主细胞的例子包括但不限于地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌(B.lentus)、枯草芽孢杆菌、疏棉状嗜热丝孢菌、迟缓芽孢杆菌、短芽孢杆菌(B.brevis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)、嗜碱芽孢杆菌(B.alkalophilus)、凝结芽孢杆菌(B.coagulans)、环状芽孢杆菌(B.circulans)、短小芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌(B.megaterium)，以及芽孢杆菌属内的其他生物体。在一些实施例中，枯草芽孢杆菌宿主细胞用于产生变体脂解酶。美国专利5,264,366和4,760,025(RE 34,606)描述了各种可用于产生本发明变体脂解酶的芽孢杆菌宿主菌株，但可以使用其他合适的菌株。
可用于产生本发明变体脂解酶的数种工业细菌菌株包括非重组(即野生型)芽孢杆菌菌株，以及天然存在的菌株的变体和/或重组菌株。在一些实施例中，宿主菌株是重组菌株，其中编码所关注的多肽的多核苷酸已引入宿主中。在一些实施例中，宿主菌株是枯草芽孢杆菌宿主菌株，尤其是重组枯草芽孢杆菌宿主菌株。许多枯草芽孢杆菌菌株是已知的，其包括但不限于例如1A6(ATCC 39085)、168(1A01)、SB19、W23、Ts85、B637、PB1753至PB1758、PB3360、JH642、1A243(ATCC 39,087)、ATCC 21332、ATCC 6051、MI113、DE100(ATCC39,094)、GX4931、PBT 110和PEP 211菌株(参见例如Hoch et al.,Genetics 73:215–228[1973](Hoch等人，《遗传学》，第73卷，第215–228页，1973年)；还可参见美国专利No.4,450,235和No.4,302,544，以及EP 0134048，这些专利的每一者全文以引用方式并入)。枯草芽孢杆菌用作表达宿主细胞是本领域熟知的(参见例如Palva et al.,Gene 19:81-87[1982](Palva等人，《基因》，第19卷，第81-87页，1982年)；Fahnestock and Fischer,J.Bacteriol.,165:796–804[1986](Fahnestock和Fischer,J.Bacteriol，《细菌学杂志》，第165卷，第796–804页，1986年)；和Wang et al.,Gene 69:39–47[1988](Wang等人，《基因》，第69卷，第39–47页，1988年))。
在一些实施例中，芽孢杆菌宿主细胞是在如下基因中的至少一者中包括突变或缺失的芽孢杆菌：degU、degS、degR和degQ。优选地，突变在degU基因中，并且更优选地，突变为degU(Hy)32(参见例如Msadek et al.,J.Bacteriol.172:824-834[1990](Msadek等人，《细菌学杂志》，第172卷，第824-834页，1990年)；和Olmos et al.,Mol.Gen.Genet.253:562–567[1997](Olmos等人，《分子遗传学与普通遗传学》，第253卷，第562–567页，1997年))。一种合适的宿主菌株为携带degU32(Hy)突变的枯草芽孢杆菌。在一些实施例中，芽孢杆菌宿主包含在如下基因中的突变或缺失：scoC4(参见例如Caldwell et al.,J.Bacteriol.183:7329-7340[2001](Caldwell等人，《细菌学杂志》，第183卷，第7329-7340页，2001年))、spoIIE(参见例如Arigoni et al.,Mol.Microbiol.31:1407-1415[1999](Arigoni等人，《分子微生物学》，第31卷，第1407-1415页，1999年))；和/或oppA或opp操纵子的其他基因(参见例如Perego et al.,Mol.Microbiol.5:173-185[1991](Perego等人，《分子微生物学》，第5卷，第173-185页，1991年))。实际上，设想到opp操纵子中的任何导致与oppA基因中的突变相同的表型的突变均将可用于本发明的改变的芽孢杆菌菌株的一些实施例中。在一些实施例中，这些突变单独地出现，而在其他实施例中，存在突变的组合。在一些实施例中，可用于产生本发明的变体脂解酶的改变的芽孢杆菌宿主细胞菌株为已在上述基因中的一者或多者中包含突变的芽孢杆菌宿主菌株。另外，可使用包含内源性脂解酶基因的一个或多个突变和/或缺失的芽孢杆菌宿主细胞。在一些实施例中，芽孢杆菌宿主细胞包含aprE和nprE基因的缺失。在其他实施例中，芽孢杆菌宿主细胞包含5个脂解酶基因的缺失，而在其他实施例中，芽孢杆菌宿主细胞包含9个脂解酶基因的缺失(参见例如美国专利申请公布No.2005/0202535，该专利以引用方式并入本文)。
使用任何合适的本领域已知的方法用至少一条编码至少一种本发明的变体脂解酶的核酸转化宿主细胞。无论是将核酸整合进载体中还是在不存在质粒DNA的情况下使用核酸，通常将其引入微生物中，在一些实施例中，优选引入大肠杆菌细胞或感受态芽孢杆菌细胞中。利用质粒DNA构建体或载体并且将此类质粒DNA构建体或载体转化进芽孢杆菌细胞或大肠杆菌细胞中来将核酸(如DNA)引入此类细胞中的方法是所熟知的。在一些实施例中，随后从大肠杆菌细胞分离质粒并且转化进芽孢杆菌细胞中。然而，使用例如大肠杆菌的中间微生物不是必需的，在一些实施例中，将DNA构建体或载体直接引入芽孢杆菌宿主中。
本领域的技术人员充分了解适于将本发明的核酸或多核苷酸序列引入芽孢杆菌细胞中的方法(参见例如Ferrari et al.,“Genetics”(Ferrari等人，《遗传学》)，见Harwood et al.[eds.],Bacillus,Plenum Publishing Corp.[1989],pp.57-72(Harwood等人[编辑]，《芽孢杆菌》，普莱南出版公司，1989年，第57-72页)；Saunders et al.,J.Bacteriol.157:718-726[1984](Saunders等人，《细菌学杂志》，第157卷，第718-726页，1984年)；Hoch et al.,J.Bacteriol.93:1925-1937[1967](Hoch等人，《细菌学杂志》，第93卷，第1925-1937页，1967年)；Mann et al.,Current Microbiol.13:131-135[1986](Mann等人，《当代微生物学》，第13卷，第131-135页，1986年)；Holubova,Folia Microbiol.30:97[1985](Holubova，《微生物学大观》，第30卷，第97页，1985年)；Chang et al.,Mol.Gen.Genet.168:11-115[1979](Chang等人，《分子遗传学与普通遗传学》，第168卷，第11-115页，1979年)；Vorobjeva et al.,FEMS Microbiol.Lett.7:261-263[1980](Vorobjeva等人，《欧洲微生物学会联合会微生物学快报》，第7卷，第261-263页，1980年)；Smith et al.,Appl.Env.Microbiol.51:634[1986](Smith等人，《应用环境微生物学》，第51卷，第634页，1986年)；Fisher et al.,Arch.Microbiol.139:213-217[1981](Fisher等人，《微生物学档案》，第139卷，第213-217页，1981年)；以及McDonald,J.Gen.Microbiol.130:203[1984](McDonald，《普通微生物学杂志》，第130卷，第203页，1984年))。实际上，诸如转化(包括原生质体转化和中板集合(congression)、转导和原生质体融合)之类的方法是众所周知的并且适用于本发明。使用转化方法将包含编码本发明变体脂解酶的核酸的DNA构建体或载体引入宿主细胞中。本领域已知的转化芽孢杆菌细胞的方法包括诸如质粒标志补救转化的方法，质粒标志补救转化涉及携带部分同源的内生质粒的感受态细胞摄入供体质粒(参见Contente et al.,Plasmid 2:555-571[1979](Contente等人，《质粒》，第2卷，第555-571页，1979年)；Haima et al.,Mol.Gen.Genet.223:185-191[1990](Haima等人，《分子遗传学与普通遗传学》，第223卷，第185-191页，1990年)；Weinrauch et al.,J.Bacteriol.154:1077-1087[1983](Weinrauch等人，《细菌学杂志》，第154卷，第1077-1087页，1983年)；和Weinrauch et al.,J.Bacteriol.169:1205-1211[1987](Weinrauch等人，《细菌学杂志》，第169卷，第1205-1211页，1987年))。在这个方法中，输入的供体质粒与内生的“辅助”质粒的同源区在模拟染色体转化的过程中发生重组。
除了通常使用的方法，在一些实施例中，将宿主细胞直接用包含编码本发明的变体脂解酶的核酸的DNA构建体或载体转化(即在引入宿主细胞之前，未使用中间细胞来扩增DNA构建体或载体，或未对DNA构建体或载体以别的方式处理)。将本发明的DNA构建体或载体引入宿主细胞包括本领域已知的那些在不插入质粒或载体的情况下将核酸序列(如DNA序列)引入宿主细胞中的物理和化学方法。这类方法包括但不限于氯化钙沉淀法、电穿孔法、裸DNA法、脂质体法等等。在另外的实施例中，将DNA构建体或载体与质粒共同转化，而不插入质粒中。在另一个实施例中，通过本领域已知的方法从已改变的芽孢杆菌菌株去除选择标记(参见Stahl et al.,J.Bacteriol.158:411-418[1984](Stahl等人，《细菌学杂志》，第158卷，第411-418页，1984年)；和Palmeros et al.,Gene 247:255-264[2000](Palmeros等人，《基因》，第247卷，第255-264页，2000年))。
在一些实施例中，将本发明的转化的细胞在常规营养培养基中培养。合适的具体培养条件，例如温度、pH等是本领域技术人员已知的，并且在科学文献中很好地进行了描述。在一些实施例中，本发明提供包含至少一种本发明的变体脂解酶或至少一种本发明的核酸的培养物(如细胞培养物)。还提供的是包含至少一种本发明的核酸、载体或DNA构建体的组合物。
在一些实施例中，将用至少一条编码至少一种本发明变体脂解酶的多核苷酸序列转化的宿主细胞在允许本发明脂解酶表达的条件下在合适的营养培养基中培养，此后从培养物回收所得的脂解酶。用于培养细胞的培养基包含任何适于生长宿主细胞的常规培养基，如含有适当的补充成分的基本培养基和复合培养基。合适的培养基可从商业供应商获得或可根据公布的配方(参见例如美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection)的目录中公布的配方)制备。在一些实施例中，通过常规的程序从培养基回收由细胞产生的脂解酶，包括但不限于例如，通过离心或过滤从培养基分离出宿主细胞，借助于盐(如硫酸铵)沉淀出上清液或滤液的蛋白质性组分，进行色谱纯化(例如离子交换色谱、凝胶过滤色谱、亲和色谱等)。任何适于回收或纯化变体脂解酶的方法均可用于本发明。
在一些实施例中，由重组宿主细胞产生的变体脂解酶分泌进培养基中。编码利于纯化的结构域的核酸序列可用来帮助可溶性蛋白质的纯化。包含编码变体脂解酶的多核苷酸序列的载体或DNA构建体，还可包含编码利于纯化的结构域的核酸序列以利于纯化变体脂解酶(参见例如Kroll et al.,DNA Cell Biol.12:441-53[1993](Kroll等人，《DNA细胞生物学》，第12卷，第441-453页，1993年))。此类利于纯化的结构域包括但不限于，例如金属螯合肽，如使得可以在固定化金属上进行纯化的组氨酸-色氨酸模块(参见Porath,ProteinExpr.Purif.3:263-281[1992](Porath，《蛋白质表达和纯化》，第3卷，第263-281页，1992年))，使得可以在固定化免疫球蛋白上进行纯化的蛋白A结构域，以及用于FLAGS延伸/亲和纯化系统的结构域(如得自华盛顿州西雅图英姆纳克斯公司(Immunex Corp.,Seattle,WA)的蛋白A结构域)。在纯化结构域和异源蛋白质之间包括可裂解的连接序列如XA因子或肠激酶(如得自加利福尼亚州圣地亚哥的英杰公司(Invitrogen,San Diego,CA)的序列)也可用于利于纯化。
用于检测和测量酶(如本发明的变体脂解酶)的酶活性的测定法是所熟知的。各种用于检测和测量脂解酶(如本发明的变体脂解酶)活性的测定法也是本领域的普通技术人员已知的。具体地讲，可用于测量脂解酶活性的测定法是基于(添加用于脂肪酶测定的参考文献)。多种方法可用于测定成熟脂解酶(例如，本发明的成熟变体脂解酶)在宿主细胞内产生的水平。这类方法包括但不限于例如利用对该脂解酶有特异性的多克隆或单克隆抗体的方法。示例性方法包括但不限于酶联免疫吸附测定法(ELISA)、放射免疫测定法(RIA)、荧光免疫测定法(FIA)和荧光激活细胞分选法(FACS)。这些和其他测定法是本领域所熟知的(参见例如Maddox et al.,J.Exp.Med.158:1211[1983](Maddox等人，《实验医学杂志》，第158卷，第1211页，1983年))。
在一些其他实施例中，本发明提供用于制备或产生本发明的成熟变体脂解酶的方法。成熟变体脂解酶不包含信号肽或前肽序列。一些方法包括在重组细菌宿主细胞例如芽孢杆菌细胞(例如枯草芽孢杆菌细胞)中制备或产生本发明的变体脂解酶。在一些实施例中，本发明提供产生本发明的变体脂解酶的方法，所述方法包括在有利于产生变体脂解酶的条件下培养包含重组表达载体的重组宿主细胞，所述重组表达载体包含编码本发明的变体脂解酶的核酸。一些此类方法还包括从培养物回收变体脂解酶。
在一些实施例中，本发明提供了产生本发明的变体脂解酶的方法，所述方法包括：(a)将包含编码本发明的变体脂解酶的核酸的重组表达载体引入一群细胞(例如细菌细胞，如枯草芽孢杆菌细胞)中；以及(b)在有利于产生由表达载体编码的变体脂解酶的条件下在培养基中培养细胞。一些这类方法还包括：(c)从所述细胞或从所述培养基分离变体脂解酶。
织物和家庭护理产品
在一些实施例中，本发明的脂解酶变体可用于包含辅助材料和脂解酶变体的组合物，其中所述组合物为织物和家庭护理产品。合适的组合物的例子在实例1中有所描述。
在一些实施例中，包含至少一种脂解酶变体的织物和家庭护理产品组合物包含一种或多种以下成分(基于总组合物重量计)：约0.0005重量％至约0.5重量％、约0.001重量％至约0.1重量％、或甚至约0.002重量％至约0.05重量％的所述脂解酶变体；以及如下物质中的一者或多者：约0.00003重量％至约0.1重量％的织物调色剂；约0.001重量％至约5重量％的香料囊粒；约0.001重量％至约1重量％的冷水溶性增白剂；约0.00003重量％至约0.1重量％的漂白催化剂；约0.00003重量％至约0.1重量％的细菌清洁纤维素酶；和/或约0.05重量％至约20重量％的Guerbet非离子型表面活性剂。
如本文所用，脂解酶(如本发明的变体脂解酶)的“洗涤性能”是指脂解酶对洗涤的贡献，与未向组合物中添加变体脂解酶的洗涤剂相比其为洗涤剂提供额外的清洁性能。洗涤性能是在相关的洗涤条件下进行比较。在一些测试系统中，其他相关因素(如洗涤剂组成、泡沫浓度、水硬度、洗涤力学、时间、pH和/或温度)可以以使得某些细分市场中的家居应用(例如手动或人工餐具洗涤、自动餐具洗涤、餐具清洁、餐具清洁、织物清洁等)的典型条件得以模拟的方式进行控制。
在一些实施例中，织物和家庭护理产品组合物为颗粒状或粉末衣物洗涤剂。
在一些实施例中，织物和家庭护理产品组合物是液体衣物洗涤剂或餐具洗涤剂。
意在使织物和家庭护理产品以任何合适的形式(包括流体或固体)提供。织物和家庭护理产品可为单位剂量小袋的形式，尤其是当为液体的形式时，并且通常织物和家庭护理产品为至少部分地或甚至完全地被水溶性小袋封闭。此外，在包含至少一种脂解酶变体的织物和家庭护理产品的一些实施例中，织物和家庭护理产品可以具有上面详述的参数和/或特性的任何组合。
清洁组合物
清洁组合物和清洁制剂包括适于对任何物体、物品和/或表面进行清洁、漂白、消毒和/或灭菌的任何组合物。此类组合物和制剂包括但不限于例如：液体和/或固体组合物，包括清洁或洗涤剂组合物(例如液体、片状、凝胶、条状、颗粒和/或固体衣物清洁组合物或洗涤剂组合物，以及精细织物洗涤剂组合物；硬质表面清洁组合物和制剂，如用于玻璃、木材、陶瓷和金属台面和窗；地毯清洁剂；烘箱清洁剂；织物清新剂；织物软化剂；以及纺织物、衣物助洗剂清洁组合物或洗涤剂组合物、衣物洗涤添加剂清洁组合物和衣物预洗剂清洁组合物；餐具洗涤组合物，包括手动或人工餐具洗涤组合物(如“手动”或“人工”餐具洗涤剂)和自动餐具洗涤组合物(如“自动餐具洗涤剂”)。
除非另外指明，否则如本文所用，清洁组合物或清洁制剂包括颗粒状或粉末形式的多功能洗涤剂或重垢洗涤剂，尤其是清洁洗涤剂；液体、颗粒、凝胶、固体、片或糊形式的多功能洗涤剂，尤其是所谓的重垢液体(HDL)洗涤剂或重垢粉末洗涤剂(HDD)类型；液体精细织物洗涤剂；手动或人工餐具洗涤剂，包括高泡类型的那些；手动或人工餐具洗涤剂、自动餐具洗涤用洗涤剂或餐具或餐具洗涤剂，包括家居和公共场所使用的各种片、粉末、固体、颗粒、液体、凝胶和清洗助剂类型；液体清洁和消毒剂，包括抗菌手洗类型、清洁条棒、漱口水、假牙清洁剂、汽车清洗剂、地毯清洗剂、浴室清洁剂；人和其他动物的洗发剂和/或毛发清洗剂；沐浴凝胶和泡沫浴和金属洗涤剂；以及清洁辅剂，例如漂白添加剂和“去污棒”或预处理类型。在一些实施例中，颗粒状组合物为“致密”形式；在一些实施例中，液体组合物为“浓缩”形式。
如本文所用，术语“洗涤剂组合物”或“洗涤剂制剂”用于指旨在用于洗涤介质中用来清洁染污的或脏的物体(包括特定的织物和/或非织物物体或物品)的组合物。本发明的这类组合物不限于任何特定的洗涤剂组合物或制剂。实际上，在一些实施例中，本发明的洗涤剂包含至少一种本发明的变体脂解酶，此外还包含一种或多种表面活性剂、转移酶、水解酶、氧化还原酶、助洗剂(例如助洗剂盐)、漂白剂、漂白活化剂、上蓝剂、荧光染料、结块抑制剂、掩蔽剂、酶激活剂、抗氧化剂和/或增溶剂。在某些情况下，助洗剂盐为硅酸盐和磷酸盐的混合物，优选硅酸盐(如偏硅酸钠)比磷酸盐(如三聚磷酸钠)多。一些本发明的组合物(例如但不限于清洁组合物或洗涤剂组合物)不含有任何磷酸盐(如磷酸盐或磷酸盐助洗剂)。
除非另作说明，否则本文提供的所有组分或组合物水平都是指所述组分或组合物的活性水平，而且市售来源中可能存在的杂质(例如残余溶剂或副产物)排除在外。酶组分重量是以总活性蛋白质计。除非另作说明，否则所有百分比和比率都以重量计算。除非另作说明，否则所有百分比和比率都是以总组合物计算。在示例性的洗涤剂组合物中，酶水平是以纯酶占总组合物的重量比表示，并且除非另作规定，否则洗涤剂成分是以占总组合物的重量比表示。
如本文所指出，在一些实施例中，本发明的清洁组合物还包含辅助材料，其包括但不限于：表面活性剂、助洗剂、漂白剂、漂白活化剂、漂白催化剂、其他酶、酶稳定系统、螯合剂、光学增亮剂、去垢性聚合物、染料转移剂、分散剂、抑泡剂、染料、香料、着色剂、填料盐、水溶助长剂、光活化剂、荧光剂、织物调理剂、可水解表面活性剂、防腐剂、抗氧化剂、抗收缩剂、抗皱剂、杀菌剂、杀真菌剂、色粒、银护理剂、抗晦暗剂和/或抗腐蚀剂、碱度源、增溶剂、载体、加工助剂、颜料和pH控制剂(参见例如美国专利No.6,610,642、No.6,605,458、No.5,705,464、No.5,710,115、No.5,698,504、No.5,695,679、No.5,686,014和No.5,646,101，所有专利都以引用的方式并入本文)。特定清洁组合物材料的实施例在下文中举例详述。在清洁辅助材料与清洁组合物中的本发明变体脂解酶不相容的实施例中，则使用合适的方法保持清洁辅助材料与脂解酶分开(即相互不接触)，直至两种组分适宜进行组合。这种分离方法包括本领域已知的任何合适方法(例如软胶囊法、包封法、片剂法、物理分离法等)。
含有脂肪酶的洗涤剂组合物
可将本发明的洗涤剂组合物例如配制成手洗或机洗的衣物洗涤剂组合物，包括衣物洗涤添加剂组合物和适用于预处理有污渍的织物的组合物，漂洗添加的织物软化剂组合物以及用于一般家居硬质表面清洁操作和餐具洗涤操作的组合物。
根据本发明的洗涤剂组合物可为液体、糊剂、凝胶、条状或颗粒状形式。pH(在水溶液中在使用浓度下测量)通常将为中性或碱性的，例如在7-11、尤其9-11范围内。根据本发明的颗粒状组合物还可为“致密形式”，即其可具有比常规颗粒洗涤剂相对更高的密度，即550g/l至950g/l。
本发明组合物可包含一种或多种辅剂(例如，从织物有效去除脂肪酸的表面活性剂)和一种或多种脂解酶。在一些实施例中，辅剂和脂解酶存在于单一组合物中。在其他实施例中，辅剂和脂解酶存在于单独的组合物中，所述组合物在接触油性污渍之前在织物上进行组合，或者在油性污渍上进行组合。
本发明的清洁组合物可包含一种或多种辅剂(表面活性剂)供与脂解酶组合使用。合适的辅剂可具有相对较小的不带净电荷的亲水部分和直链的或饱和的疏水部分。在一些实施例中，疏水部分包括至少六、七、八或九个相邻的脂族碳。在一些实施例中，疏水部分是环状的。在一些实施例中，疏水部分是无支链的。合适的表面活性剂包括糖基化合物和两性离子化合物。WO2011078949中公开了合适的辅剂，并且据此全文以引用方式并入。
糖基表面活性剂包括吡喃麦芽糖苷、硫代吡喃麦芽糖苷、吡喃葡萄糖苷及其衍生物。麦芽糖基表面活性剂通常比葡萄糖基表面活性剂更有效。在一些实施例中，优选的糖基表面活性剂具有至少4、至少5、至少6并且甚至至少7个碳的疏水性尾链长度。尾可为脂族的或环状的。尾可为非支链的，但支化在足够链长度下是可接受的。
糖基表面活性剂的具体例子包括壬基-β-D-吡喃麦芽糖苷、癸基-β-D-吡喃麦芽糖苷、十一烷基-β-D-吡喃麦芽糖苷、十二烷基-β-D-吡喃麦芽糖苷、十三烷基-β-D-吡喃麦芽糖苷、十四烷基-β-D-吡喃麦芽糖苷、十六烷基-β-D-吡喃麦芽糖苷等、正十二烷基-β-D-吡喃麦芽糖苷等，2,6-二甲基-4-庚基-β-D-吡喃麦芽糖苷、2-丙基-1-戊基-β-D-吡喃麦芽糖苷、壬基-β-D-吡喃葡萄糖苷、壬基-β-D-吡喃葡萄糖苷、癸基-β-D-吡喃葡萄糖苷、十二烷基-β-D-吡喃葡萄糖苷、蔗糖单十二烷酸酯、某些环己基烷基-β-D-麦芽糖苷(例如和CYGLA)以及MEGATM表面活性剂。
辅剂可为非糖、非离子型表面活性剂。示例性的表面活性剂包括具有九个或更少的乙氧基化物重复单元的Triton。具体的Triton是 和在一些实施例中，辅剂是具有含至少约9个碳的疏水尾的非离子型氧化膦表面活性剂。示例性的表面活性剂包括二甲基癸基氧化膦和二甲基十二烷基氧化膦。
辅剂可为两性离子表面活性剂，诸如FOS-胆碱。在一些实施例中，FOS-胆碱具有链长为12或更长的疏水尾。疏水尾可以是饱和的和不饱和的，并且可以是环状的。示例性的FOS-胆碱表面活性剂包括 DODECAFOS、ISO不饱和11-10、ISO 11-6、CYOFO、NOPOL-FOS、 -5、-6、-7、-8等，等等。
在一些情况下，辅剂可为磺基甜菜碱两性离子表面活性剂。优选的磺基甜菜碱表面活性剂具有含至少12个碳的疏水尾，例如3-12和3-14。两性离子氧化物和CHAPS基表面活性剂(例如CHAPS和CHAPSO)也是有效的，通常以比磺基甜菜碱高的剂量。
在一些情况下，辅剂可为阴离子洗涤剂，例如肌氨酸。优选的肌氨酸具有含至少10个碳的疏水尾。在一些情况下，辅剂还可为脱氧胆酸盐。
辅剂可以以至少0.001％、至少0.005％、至少0.01％、至少0.05％、至少0.1％或更多，或者至少0.01ppm、至少0.05ppm、至少0.1ppm、至少0.5ppm、至少1ppm、至少5ppm、至少10ppm或更多的量存在于组合物中。在一些情况下，辅剂可以以例如约0.001-0.01％、约0.01-0.1％、约0.1-1％或约0.01-1ppm、约0.1-1ppm或约1-10ppm的预先选定的范围存在。在一些情况下，在一定范围内观察到最佳活性，在所述范围以上和以下则活性降低。
洗涤剂的表面活性剂系统可包含非离子、阴离子、阳离子、两性的和/或两性离子表面活性剂。表面活性剂通常以按重量计0.1％至60％，例如按重量计1％至40％，尤其是10％-40％，优选地约3％至20％的水平存在。洗涤剂将通常含有0至50％的阴离子表面活性剂，诸如直链烷基苯磺酸盐(LAS)；α-烯烃磺酸盐(AOS)；烷基硫酸盐(脂肪醇硫酸盐)(AS)；醇乙氧基硫酸盐(AEOS或AES)；仲烷基磺酸盐(SAS)；α-磺基脂肪酸甲酯；烷基或烯基琥珀酸；或皂。
洗涤剂可包含0至40％的非离子表面活性剂，即烷基酚的聚环氧烷(例如聚环氧乙烷)缩合物。优选的非离子表面活性剂为醇乙氧基化物(AEO或AE)、羧化醇乙氧基化物、壬基苯酚乙氧基化物、烷基多苷、烷基二甲基胺氧化物、乙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺、脂肪酸单乙醇酰胺、烷基(N-甲基)-葡糖酰胺或多羟基烷基脂肪酸酰胺(例如，如WO 92106154中所述)。
半极性非离子表面活性剂是另一类非离子表面活性剂，其包括水溶性胺氧化物，所述水溶性胺氧化物含有一个约10至约18个碳原子的烷基部分和2个选自以下的部分：含有约1至约3个碳原子的烷基和羟烷基；水溶性膦氧化物，其含有一个约10至约18个碳原子的烷基部分和2个选自以下的部分：含有约1至约3个碳原子的烷基和羟烷基；以及水溶性亚砜，其含有一个约10至约18个碳原子的烷基部分和选自以下的部分：约1至约3个碳原子的烷基和羟烷基部分。氧化胺表面活性剂具体地讲包括C10-C18烷基二甲基胺氧化物和C8-C12烷氧基乙基二羟基乙基胺氧化物。
洗涤剂组合物还可包含阳离子表面活性剂。所用阳离子去污表面活性剂为具有一个长链烃基的那些。此类阳离子表面活性剂的例子包括铵表面活性剂诸如烷基三甲基卤化铵。高度优选的阳离子表面活性剂为水溶性季铵化合物。合适的季铵化合物的例子包括椰油基三甲基氯化或溴化铵；椰油基甲基二羟基乙基氯化或溴化铵；癸基三乙基氯化铵；癸基二甲基羟基乙基氯化或溴化铵；C12-15二甲基羟基乙基氯化或溴化铵；椰油基二甲基羟基乙基氯化或溴化铵；肉豆蔻基三甲基铵甲基硫酸盐；月桂基二甲基苄基氯化或溴化铵；月桂基二甲基(乙烯氧基)4氯化或溴化铵；胆碱酯，二烷基咪唑啉。
洗涤剂组合物还可包含两性表面活性剂。这些表面活性剂可广义地描述为仲胺或叔胺的脂族衍生物，或杂环仲胺或叔胺的脂族衍生物，其中脂族基团可为直链或支链。脂族取代基中的一个含有至少约8个碳原子，通常约8至约18个碳原子，并且至少一个含有阴离子水增溶性基团，例如羧基、磺酸根、硫酸根。属于此定义的化合物的例子为3-(十二烷基氨基)丙酸钠、3-(十二烷基氨基)-丙烷-1-磺酸钠、2-(十二烷基氨基)乙基硫酸钠、2-(二甲氨基)十八烷酸钠、3-(N-羧甲基十二烷基氨基)丙烷-1-磺酸二钠、十八烷基-亚氨基二乙酸二钠、1-羧甲基-2-十一烷基咪唑钠以及N,N-二(2-羟乙基)-2-硫酸根合-3-十二烷氧基-丙胺钠。优选3-(十二烷基氨基)丙烷-1-磺酸钠。
两性离子表面活性剂还用于洗涤剂组合物中，尤其是在衣物洗涤组合物中。这些表面活性剂可广义地描述为仲胺和叔胺的衍生物，杂环仲胺和叔胺的衍生物，或季铵、季或叔锍化合物的衍生物。季化合物中的阳离子原子可为杂环的一部分。在所有这些化合物中，有至少一个脂族基团，其为直链或支链的、含有约3至18个碳原子；以及至少一个脂族取代基，其含有阴离子水增溶性基团，例如羧基、磺酸根、硫酸根、磷酸根或膦酸根。乙氧基化两性离子化合物组合两性离子表面活性剂已尤其在洗衣应用中用于粘土污垢去除。
洗涤剂可含有1至65％的洗涤剂助洗剂或络合剂，诸如沸石、二磷酸盐、三磷酸盐、膦酸盐、柠檬酸盐、氨三乙酸(NTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTMPA)、烷基或烯基琥珀酸、可溶性硅酸盐或层状硅酸盐(例如SKS-6，得自赫司特(Hoechst))。洗涤剂也可以是无助洗剂的，即基本上不含洗涤剂助洗剂。
洗涤剂助洗剂可细分为含磷和不含磷的类型。含磷的无机碱性洗涤剂助洗剂的例子包括水溶性盐，尤其是碱金属焦磷酸盐、正磷酸盐、多磷酸盐和膦酸盐。不含磷的无机助洗剂的例子包括水溶性碱金属碳酸盐、硼酸盐和硅酸盐以及层状二硅酸盐和多种类型的水不溶性晶体或无定形硅铝酸盐，其中沸石是最为公知的代表。合适的有机助洗剂的例子包括丁二酸、丙二酸、脂肪酸丙二酸、脂肪酸磺酸、羧甲氧基丁二酸、聚乙酸、羧酸、聚羧酸、氨基聚羧酸以及聚乙酰基羧酸的碱金属盐、铵盐或取代的铵盐。
用于包含在洗涤剂组合物中的合适螯合剂为乙二胺-N,N'-二琥珀酸(EDDS)或其碱金属盐、碱土金属盐、铵盐或取代的铵盐，或其混合物。优选的EDDS化合物为游离酸形式，及其钠盐或镁盐。EDDS的这类优选的钠盐的例子包括Na2EDDS和Na4EDDS。EDDS的这类优选的镁盐的例子包括MgEDDS和Mg2EDDS。用于包含在组合物中最优选的是镁盐。
洗涤剂可包含一种或多种聚合物。例子为羧甲基纤维素(CMC)、聚(乙烯吡咯烷酮)(PVP)、聚乙二醇(PEG)、聚(乙烯醇)(PVA)、聚羧酸酯诸如聚丙烯酸酯、马来酸/丙烯酸共聚物和甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物。
洗涤剂组合物可含有氯/溴类型或氧类型的漂白剂。漂白剂可为包衣的或封装的。无机氯/溴类型漂白剂的例子是锂、钠或钙的次氯酸盐或次溴酸盐，以及氯化磷酸三钠。漂白系统还可以包含可与形成过酸的漂白活化剂(诸如四乙酰基乙二胺(TAED)或壬酰氧基苯磺酸盐(NOBS))组合的过氧化氢源，诸如过硼酸盐或过碳酸盐。有机氯/溴类型的漂白剂的例子是杂环N-溴酰亚胺类和N-氯酰亚胺类，诸如三氯异氰脲酸、三溴异氰脲酸、二溴异氰脲酸和二氯异氰脲酸，以及其与水增溶性阳离子(诸如钾和钠)形成的盐。乙内酰脲化合物也是合适的。漂白系统还可以包含例如酰胺、酰亚胺或砜类型的过氧酸。
在餐具洗涤剂中，例如无机过酸盐形式的氧漂白剂是优选的，优选地与漂白剂前体一起或作为过氧酸化合物。合适的过氧漂白化合物的典型例子是碱金属过硼酸盐(四水合物和一水合物二者)、碱金属过碳酸盐、碱金属过硅酸盐和碱金属过磷酸盐。优选的活化剂材料为四乙酰基乙二胺(TAED)、壬酰氧基苯磺酸盐(NOBS)、3,5-三甲基-异壬酰氧基苯磺酸盐(3,5-trimethyl-hexsanoloxybenzenesulfonate)(ISONOBS)或五乙酰基葡萄糖(PAG)。
本发明的脂肪酶或任选地掺入洗涤剂组合物中的另一种酶通常是以以下水平掺入洗涤剂组合物中：按组合物的重量计0.00001％至3％的酶蛋白质，优选地水平为按组合物的重量计0.0001％至1％的酶蛋白质，更优选地水平为按组合物的重量计0.001％至0.5％的酶蛋白质，甚至更优选地水平为按组合物的重量计0.01％至0.2％的酶蛋白质。脂肪酶蛋白质的量可为每克洗涤剂0.001-30mg或每升洗涤液0.001-100mg。本发明的脂肪酶变体尤其适合于包含以下各物的洗涤剂：阴离子表面活性剂与非离子表面活性剂的组合，其中有按重量计70％-100％的阴离子表面活性剂和按重量计0-30％的非离子表面活性剂，尤其是80％-100％的阴离子表面活性剂和0-20％的非离子表面活性剂。如另外描述的，本发明的一些优选的脂肪酶还适于包含40％-70％阴离子表面活性剂和30％-60％非离子表面活性剂的洗涤剂。除了本发明的脂肪酶以外，洗涤剂组合物可包含其他一种或多种提供清洁性能和/或织物护理有益效果的酶，例如蛋白酶、另外的脂肪酶、角质酶、淀粉酶、纤维素酶、过氧化物酶、氧化酶(例如漆酶)、甘露聚糖酶、氧化还原酶、和/或果胶酸裂解酶。
可使用常规稳定剂(例如多元醇诸如丙二醇或甘油、糖或糖醇、乳酸、硼酸或硼酸衍生物例如芳族硼酸酯)来稳定洗涤剂组合物的酶。作为酶稳定剂的一取代硼酸(Boronicacid)或二取代硼酸(borinic acid)衍生物包括硼酸、噻吩-3-一取代硼酸、噻吩-2-一取代硼酸、4-甲基噻吩-2-一取代硼酸、5-乙基噻吩-2-一取代硼酸、5-甲基噻吩-2-一取代硼酸、5-溴噻吩-2-一取代硼酸、5-氯噻吩-2-一取代硼酸、二苯并噻吩-1-一取代硼酸、二苯并呋喃-1-一取代硼酸、二苯并呋喃-4-一取代硼酸、甲基吡啶-2-一取代硼酸、二苯基二取代硼酸(乙醇胺复合物)、5-甲氧基噻吩-2-一取代硼酸、硫代萘-1-一取代硼酸、呋喃-2-一取代硼酸、呋喃-3-一取代硼酸、2,5-二甲基-噻吩-3-一取代硼酸、苯并呋喃-1-一取代硼酸、3-甲氧基噻吩-2-一取代硼酸、5-正丙基-噻吩-2-一取代硼酸、5-甲氧基呋喃-2-一取代硼酸、3-溴噻吩-2-一取代硼酸、5-乙基呋喃-2-一取代硼酸、4-咔唑乙基一取代硼酸。
任选的成分为抑泡剂(例如通过硅酮-烷基化聚硅氧烷材料和二氧化硅-硅酮混合物来示例，其中二氧化硅呈二氧化硅气凝胶和干凝胶以及各种类型的疏水性二氧化硅形式)。抑泡剂可作为颗粒来结合，其中抑泡剂被有利地可释放地掺入水溶性或水分散性、基本上无表面活性的洗涤剂不可渗透载体中。或者，抑泡剂可溶解或分散在液体载体中，并且通过喷雾到一种或多种其他组分上来施加。
洗涤剂还可含有无机或有机软化剂。无机软化剂通过绿土粘土(5％至15％)来示例。有机织物软化剂(0.5％至5％)包括水不溶性叔胺，及其与单C12-C14季铵盐以及二长链酰胺或高分子量聚环氧乙烷材料的组合。
洗涤剂还可含有其他常规洗涤剂成分，例如，织物调节剂，包括粘土、抗絮凝剂材料、泡沫促进剂/消泡剂(餐具洗涤剂消泡剂)、防腐剂、污垢悬浮剂或污垢分散剂(0至10％)、抗污垢再沉积剂、染料、脱水剂、杀细菌剂、荧光增白剂、研磨剂、晦暗抑制剂、着色剂和/或封装或未封装的香料。
阴离子模型洗涤剂A
通过混合以下成分(重量％)制备模型颗粒状洗涤剂(总表面活性剂中有90％为阴离子型，溶液pH为10.2)：
8.7％阴离子表面活性剂：LAS(C10-C13)
7.4％阴离子表面活性剂：AS(C12)
1.8％非离子表面活性剂：醇乙氧基化物(C12-C15 7EO)
30％沸石P(Wessalite P)
18％碳酸钠
5％柠檬酸钠
17％硫酸钠
0.3％羧甲基纤维素
6.5％过碳酸钠一水合物
2.1％NOBS
阴离子模型洗涤剂B
通过混合以下成分(重量％)制备第二模型颗粒状洗涤剂(总表面活性剂中有79％为阴离子型，溶液pH为10.2)：
27％阴离子表面活性剂：AS(C12)
7％非离子表面活性剂(C12-15，7EO)
60％沸石P(Wessalite P)
5％碳酸钠
0.6％Sokalan CP5
1.5％羧甲基纤维素
阴离子/非离子模型洗涤剂
通过将以下成分添加至含3.2mM Ca2+/Mg2+(5:1)的纯水中来制备模型洗涤剂溶液(总表面活性剂中有32％为阴离子型，pH 10.2)：
0.300g/l的烷基硫酸盐(AS；C14-16)；
0.650g/l的醇乙氧基化物(AEO；C12-14,6EO)；
1.750g/l的沸石P
0.145g/l的Na2CO3
0.020g/l的Sokalan CP5
0.050g/l的CMC(羧甲基纤维素)
低洗涤剂组合物
欧洲洗衣粉洗涤剂
15％的表面活性剂，其中6％为LAS，3％为AES，并且6％为非离子表面活性剂。其还含有47％的包含脂肪酸、沸石A、碳酸盐和硅酸盐的助洗剂。
15％的表面活性剂，其中3％为AES，6％为LAS，并且6％为非离子表面活性剂。其还包含47％的包含脂肪酸、沸石A、碳酸盐、硅酸盐的助洗剂，并且其包含5％的聚羧酸酯聚合物。
15％的表面活性剂，其中3％为AES，6％为LAS，并且6％为非离子表面活性剂。其还含有47％的包含脂肪酸、沸石A、碳酸盐、硅酸盐的助洗剂，并且其包含5％的聚羧酸酯聚合物。
15％的表面活性剂，其中6％为LAS，3％为AES，并且6％为非离子表面活性剂。其还含有47％的由脂肪酸、沸石A、碳酸盐和硅酸盐组成的助洗剂、5％的聚羧酸酯分散聚合物、15％的过硼酸钠以及4％的四乙酰基-乙二胺(TAEO)。
15％的表面活性剂，其中6％为LAS，3％为AES并且6％为非离子表面活性剂。其还含有47％的由脂肪酸、22％沸石A、碳酸盐和硅酸盐组成的助洗剂，以及5％的聚羧酸酯分散聚合物。
15％的表面活性剂，其中6％为LAS，3％为AES并且6％为非离子表面活性剂。其还含有47％的由脂肪酸、22％沸石A、碳酸盐和硅酸盐组成的助洗剂，以及5％的聚羧酸酯分散聚合物。
15％的表面活性剂，其中6％为LAS，3％为AES，并且6％为非离子表面活性剂。其还含有47％的由脂肪酸、22％沸石A、碳酸盐和硅酸盐组成的助洗剂，以及5％的聚羧酸酯分散聚合物。
21％的表面活性剂，其中8.1％为LAS，6.5％为AS，4.0％为非离子表面活性剂，并且2.5％为阳离子表面活性剂(DSDMAC)。其还含有64％的由脂肪酸、碳酸盐、沸石A、硅酸盐和柠檬酸盐组成的助洗剂，并且还含有2.7％的分散聚合物。
16.9％的包括皂的表面活性剂，其中11％为LAS，5.9％为非离子表面活性剂，4.1％为皂；以及63％的助洗剂。
欧洲液体衣物洗涤剂
27％的表面活性剂，其中16.9％为AS，6.7％为非离子表面活性剂，并且3.5％为阳离子表面活性剂(DSDMAC)。其还含有18.7％的由脂肪酸、碳酸盐、柠檬酸盐以及硼酸组成的助洗剂。
北美洗衣液洗涤剂
23％的表面活性剂，其中16％为AES，5％为LAS，并且2％为非离子表面活性剂。其还含有6％的由皂、柠檬酸、DTPA和甲酸钙组成的助洗剂。
将洗涤剂组合物中的表面活性剂水平降低至正常水平的50％，并且用0.1％的脂肪酶蛋白质替换得到更好的性能。
23％的表面活性剂，其中16％为AES，5％为LAS，并且2％为非离子表面活性剂。其还含有6％的由皂、柠檬酸、DTPA和甲酸钙组成的助洗剂，以及5％的聚羧酸酯分散聚合物。
北美洗衣粉洗涤剂
16.3％的表面活性剂，其中7.8％为LAS，6.7％为AS，并且1.8％为非离子表面活性剂；以及60％的包含脂肪酸、沸石A、碳酸盐和硅酸盐的助洗剂。
14.9％的表面活性剂，其中11.5％为LAS，并且3.4％为非离子表面活性剂；以及55％的包含脂肪酸、沸石A、碳酸盐和硅酸盐的助洗剂。
19.5％的表面活性剂，其中4.5％为LAS，13％为AS并且2％为非离子表面活性剂；以及61％的包含脂肪酸、沸石A、碳酸盐和硅酸盐的助洗剂。
日本洗衣粉洗涤剂
24.3％的表面活性剂，其中11.1％为LAS，11.6％为磺酸酯，并且1.6％为非离子表面活性剂；以及60％的包含脂肪酸、沸石A、碳酸盐和硅酸盐的助洗剂。
27.9％的表面活性剂，其中27.5％为LAS并且0.4％为非离子表面活性剂；以及64％的包含沸石A、碳酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐和硅酸盐的助洗剂。
欧洲彩色致密洗衣粉
21.1％的表面活性剂系统，其中8.1％为LAS，6.5％为AS，2.5％为Arguat 2T-70并且4％为非离子表面活性剂；以及64％的包含脂肪酸、沸石A、碳酸盐、柠檬酸和硅酸盐的助洗剂。独立于助洗剂来制备表面活性剂系统。表面活性剂系统制备成以Neodol25-7或Lutensol ON60作为非离子表面活性剂。
有利地，本发明的清洁组合物用于例如洗衣应用、硬质表面清洁、餐具洗涤应用，以及美容应用，如假牙、牙齿、毛发和皮肤。此外，由于在较低温度溶液中效用提高的独特优势，本发明的酶理想地适合于衣物洗涤应用。此外，本发明的酶可用于颗粒状和液体组合物。
本发明的变体脂解酶还可用于清洁添加剂产品。在一些实施例中，可使用低温溶液清洁应用。在一些实施例中，本发明提供清洁添加剂产品，其包含至少一种本发明的酶，当需要额外漂白效用时，所述清洁添加剂产品理想地适于包括在洗涤过程中。此类情形包括(但不限于)低温溶液清洁应用。在一些实施例中，添加剂产品处于其最简单的形式，即一种或多种脂解酶。在一些实施例中，添加剂被包装成用于添加到清洁过程中的剂型。在一些实施例中，添加剂被包装成用于添加到采用过氧源并且增加的漂白效用是所需的清洁过程中的剂型。任何合适的单一剂量单位形式都可用于本发明，包括但不限于：丸剂、片剂、明胶胶囊，或其他单一剂量单位例如预先计量的粉末或液体。在一些实施例中，包括填料或载体材料以增加此类组合物的体积。合适的填料或载体材料包括(但不限于)多种硫酸盐、碳酸盐和硅酸盐，以及滑石、粘土等。适于液体组合物的填料或载体材料包括(但不限于)水或低分子量伯醇和仲醇，包括多元醇和二醇。这些醇的例子包括(但不限于)甲醇、乙醇、丙醇和异丙醇。在一些实施例中，组合物含有约5％至约90％的这类材料。酸性填料可用于降低pH。或者，在一些实施例中，清洁添加剂包含辅助成分，下文将予以更完整地描述。
本发明的清洁组合物和清洁添加剂需要有效量的本文所提供脂解酶变体中的至少一种，其单独使用或与其他脂解酶和/或另外的酶组合使用。所需的酶水平通过添加一种或多种本发明的脂解酶变体来实现。通常，本发明的清洁组合物包含至少约0.0001重量％、约0.0001至约10重量％、约0.001至约1重量％、或甚至约0.01至约0.1重量％的至少一种本发明的变体脂解酶。
通常将本文的清洁组合物配制成使得在水性清洁操作中使用期间，洗涤水的pH将为约5.0至约11.5、或约6.0至8.0或甚至约7.5至约10.5。液体产品制剂通常配制成净pH为约3.0至约9.0或甚至约3至约8。颗粒状衣物洗涤用产品通常配制成pH为约6至约11，或甚至约8至约10。用于将pH控制在推荐的使用水平的技术包括使用缓冲液、碱、酸等，并且这些技术是本领域技术人员熟知的。
合适的“低pH清洁组合物”的净pH通常为约3至约8，并且通常不含在这种pH环境中水解的表面活性剂。这类表面活性剂包括包含至少一个环氧乙烷部分或甚至约1至约16摩尔的环氧乙烷的烷基硫酸钠表面活性剂。这类清洁组合物通常包含足量的pH调节剂，如氢氧化钠、单乙醇胺或盐酸，用以使此类清洁组合物的净pH为约3至约8。这些组合物通常包含至少一种酸稳定性酶。在一些实施例中，所述组合物为液体，而在其他实施例中，其为固体。这类液体组合物的pH通常是以净pH度量。这类固体组合物的pH是以所述组合物的10％固形物溶液度量，其中溶剂是蒸馏水。在这些实施例中，除非另作说明，否则所有pH测量值都是在20℃下取得。
在一些实施例中，当颗粒组合物或液体中采用变体脂解酶时，期望变体脂解酶为封装颗粒的形式，以在存储过程中保护变体脂解酶免受颗粒组合物的其他组分的影响。此外，封装还是控制变体脂解酶在清洁过程期间的利用度的方式。在一些实施例中，封装可增强变体脂解酶和/或另外的酶的性能。就这一点而言，本发明的变体脂解酶使用本领域已知的任何合适的封装材料封装。在一些实施例中，封装材料通常包封本发明的变体脂解酶的催化剂的至少一部分。通常，封装材料具有水溶性和/或水分散性。在一些实施例中，封装材料的玻璃化转变温度(Tg)为0℃或更高。玻璃化转变温度在WO 97/11151中进行了更详细的描述。封装材料通常选自如下：碳水化合物、天然的或合成的树胶、甲壳质、壳聚糖、纤维素和纤维素衍生物、硅酸盐、磷酸盐、硼酸盐、聚乙烯醇、聚乙二醇、石蜡以及它们的组合。当封装材料是碳水化合物时，其通常选自单糖、寡糖、多糖以及它们的组合。在一些典型的实施例中，封装材料为淀粉(参见例如EP 0 922 499、US 4,977,252、US 5,354,559和US 5,935,826)。在一些实施例中，封装材料是由诸如热塑性塑料、丙烯腈、甲基丙烯腈、聚丙烯腈、聚甲基丙烯腈及它们的混合物之类的塑料制成的微球体；可使用的市售微球体包括(但不限于)由(瑞典斯托克韦斯文肯(Stockviksverken,Sweden))以及PM 6545、PM 6550、PM7220、PM 7228、和(宾夕法尼亚州翠谷的PQ公司(PQ Corp.,Valley Forge,PA))提供的微球体。
如本文所述，本发明的变体脂解酶尤其可用于清洁行业，包括但不限于衣物和餐具洗涤剂。这些应用使酶处于各种环境压力下。本发明的变体脂解酶由于其在各种条件下的稳定性，提供了优于多种当前使用的酶的优点。
实际上，洗涤中所涉及的脂解酶暴露于多种洗涤条件，其包括变化的洗涤剂制剂、洗涤水体积、洗涤水温度和洗涤时间长度。此外，不同地理区域中使用的洗涤剂制剂在洗涤水中存在不同浓度的其相关组分。例如，欧洲的洗涤剂通常在洗涤水中具有约2000-10000ppm的洗涤剂组分，而亚洲的洗涤剂通常在洗涤水中具有大约300-2500ppm的洗涤剂组分。在北美，尤其是在美国，洗涤剂通常在洗涤水中具有约300ppm-1500ppm的洗涤剂组分。
高洗涤剂浓度系统包括在洗涤水中存在超过约2000ppm的洗涤剂组分的洗涤剂。欧洲的洗涤剂一般被认为是高洗涤剂浓度系统，因为其在洗涤水中具有大约2000-10000ppm的洗涤剂组分。
拉丁美洲的洗涤剂一般是高泡磷酸盐助洗剂洗涤剂，而且拉丁美洲中使用的洗涤剂的范围可在中等洗涤剂浓度与高洗涤剂浓度之间，因为其在洗涤水中具有1500ppm至6000ppm的洗涤剂组分。如上所述，巴西通常在洗涤水中具有大约1500ppm的洗涤剂组分。然而，其他高泡磷酸盐助洗剂洗涤剂地理学(不限于其他拉丁美洲国家)可具有高达约6000ppm的洗涤剂组分存在于洗涤水中的高洗涤剂浓度系统。
鉴于上述内容，显然全世界典型洗涤溶液中洗涤剂组合物的浓度从小于约300ppm的洗涤剂组合物(“低洗涤剂浓度地理学”)变化至欧洲的10000ppm和高泡磷酸盐助洗剂地理学的约6000ppm。
典型的洗涤溶液的浓度凭经验确定。例如，在美国，典型洗涤机器容纳约64.4L体积的洗涤溶液。因此，为了在洗涤溶液内获得约1000ppm的洗涤剂浓度，须将约64.4g洗涤剂组合物添加至64.4L洗涤溶液中。这个量是由消费者使用随洗涤剂一起提供的量杯计量加入洗涤水中的典型量。
再举个例子，不同地理区域使用不同的洗涤温度。日本的洗涤水温度通常低于欧洲所用的洗涤水温度。例如，北美和日本的洗涤水温度通常在约10℃和约30℃之间(例如约20℃)，而欧洲的洗涤水温度通常在约30℃和约60℃之间(例如约40℃)。然而，为了节省能源，许多消费者转向使用冷水洗涤。此外，在一些另外的区域中，通常将冷水用于衣物以及餐具洗涤应用。在一些实施例中，本发明的“冷水洗涤”利用适用于在约10℃至约40℃，或约20℃至约30℃，或约15℃至约25℃，以及在约15℃至约35℃范围内的所有其他组合和在10℃至40℃内的所有范围的温度下进行洗涤的“冷水洗涤剂”。
再举个例子，不同地理区域通常具有不同的水硬度。水硬度经常按每加仑混合的Ca2+/Mg2+的格令数(grain)来描述。硬度是水中钙(Ca2+)和镁(Mg2+)的量的量度。在美国，大多数水都较硬，但硬度有变化。中等硬(60-120ppm)至硬(121-181ppm)水具有60至181份每一百万份(份每一百万份换算成每美制加仑格令数是ppm数除以17.1等于每加仑格令数)的硬度矿物质。
水 每加仑格令数 份每一百万份
软 小于1.0 小于17
略硬 10至3.5 17至60
中等硬 3.5至7.0 60至120
硬 7.0至10.5 120至180
极硬 大于10.5 大于180
欧洲的水硬度通常是每加仑中的混合Ca2+/Mg2+高于约10.5(例如约10.5至约20.0)格令(例如每加仑中的混合Ca2+/Mg2+为约15格令)。北美的水硬度通常高于日本的水硬度，但小于欧洲的水硬度。例如，北美的水硬度可介于约3至约10格令、约3至约8格令之间或为约6格令。日本的水硬度通常小于北美的水硬度，通常小于约4，例如每加仑中的混合Ca2+/Mg2+为约3格令。
因此，在一些实施例中，本发明提供的变体脂解酶在至少一组洗涤条件(例如水温、水硬度和/或洗涤剂浓度)下显示出惊人洗涤性能。在一些实施例中，本发明的变体脂解酶在洗涤性能方面可与其他脂肪酶脂解酶相比。在一些实施例中，与目前市售的脂肪酶脂解酶相比，本发明的变体脂解酶表现出增强的洗涤性能。因此，在本发明的一些实施例中，本文提供的变体脂解酶表现出增强的氧化稳定性、增强的热稳定性、增强的在各种条件下的清洁能力和/或增强的螯合剂稳定性。此外，本发明的变体脂解酶可用于不包含洗涤剂的清洁组合物，变体脂解酶同样是单独使用或与助洗剂和稳定剂组合使用。
在本发明的一些实施例中，以组合物的重量计，清洁组合物包含水平为约0.00001％至约10％的至少一种本发明的变体脂解酶，并且以组合物的重量计，余量(例如约99.999％至约90.0％)包含清洁辅助材料。在本发明的一些其他实施例中，以组合物的重量计，本发明的清洁组合物包含水平为约0.0001％至约10％、约0.001％至约5％、约0.001％至约2％、或约0.005％至约0.5％的至少一种变体脂解酶，清洁组合物的余量(如约99.9999重量％至约90.0重量％、约99.999重量％至约98重量％、约99.995重量％至约99.5重量％)包含清洁辅助材料。
在一些实施例中，本发明的清洁组合物包含一种或多种另外的洗涤酶，所述酶可提供清洁性能和/或织物护理和/或餐具洗涤有益效果。合适的酶的例子包括但不限于：半纤维素酶、纤维素酶、过氧化物酶、脂解酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、角质酶、果胶酶、果胶酸裂解酶、甘露聚糖酶、角蛋白酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂氧合酶、木质素酶、支链淀粉酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、麦拉宁酶、β-葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明质酸酶、软骨素酶、漆酶和淀粉酶，或它们的任何组合或混合物。在一些实施例中，使用包含常规应用性酶的酶组合(即“混合物(cocktail)”)，如使用脂解酶、脂肪酶、角质酶和/或纤维素酶联合淀粉酶。
例如，本发明的脂解酶变体可与蛋白酶结合。合适的蛋白水解酶包括动物、植物或微生物来源的那些。在一些实施例中，使用微生物蛋白水解酶。在一些实施例中，蛋白水解酶优选地为碱性微生物蛋白水解酶或胰蛋白酶样蛋白水解酶。碱性脂解酶的例子包括脂肪酶，特别是来自芽孢杆菌(例如迟缓芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、Carlsberg、309、147和168)的那些。另外的例子包括美国专利No.RE 34,606、No.5,955,340、No.5,700,676、No.6,312,936和No.6,482,628中描述的那些突变型蛋白水解酶，所有这些专利以引用方式并入本文。另外的蛋白酶的例子包括但不限于胰蛋白酶(例如猪或牛来源的胰蛋白酶)和WO 89/06270中描述的镰孢菌属(Fusarium)蛋白酶。在一些实施例中，可用于本发明的市售蛋白酶包括但不限于MAXACALTM、MAXAPEMTM、 OXP、PURAMAXTM、EXCELLASETM和PURAFASTTM(杰能科公司(Genencor))；DURAZYMTM、 和(诺维信公司(Novozymes))；BLAPTM和BLAPTM变体(德国杜塞尔多夫汉高公司(HenkelKommanditgesellschaft auf Aktien,Duesseldorf,Germany))；以及KAP(嗜碱芽孢杆菌脂肪酶，日本东京花王公司(Kao Corp.,Tokyo,Japan))。多种蛋白水解酶在WO95/23221、WO 92/21760、美国专利公布No.2008/0090747和美国专利No.5,801,039、No.5,340,735、No.5,500,364、No.5,855,625、US RE34,606、No.5,955,340、No.5,700,676、No.6,312,936和No.6,482,628以及各种其他专利中有所描述。在一些其他实施例中，金属蛋白酶可用于本发明，其包括但不限于WO 07/044993中描述的中性金属蛋白酶。
在本发明的一些实施例中，任何合适的淀粉酶都可用于本发明。在一些实施例中，也可使用适用于碱性溶液中的任何淀粉酶(例如α和/或β淀粉酶)。合适的淀粉酶包括(但不限于)细菌或真菌来源的淀粉酶。在一些实施例中包括经化学或遗传修饰的突变体。可用于本发明的淀粉酶包括但不限于得自地衣芽孢杆菌的α-淀粉酶(参见例如GB 1,296,839)。可用于本发明的市售淀粉酶包括但不限于： STAINZYMESTAINZYME和BANTM(诺维信公司(Novozymes))以及POWERASETM、和P(杰能科公司(Genencor))。
在本发明一些实施例中，以组合物重量计，本发明清洁组合物还包含水平为约0.00001％至约10％另外淀粉酶的淀粉酶，以组合物重量计余量为清洁辅助材料。在本发明的一些其他实施例中，以组合物重量计，本发明清洁组合物还包含水平为约0.0001％至约10％、约0.001％至约5％、约0.001％至约2％、约0.005％至约0.5％淀粉酶的淀粉酶。
在一些其他实施例中，任何合适的纤维素酶都可用于本发明的清洁组合物。合适的纤维素酶包括(但不限于)细菌或真菌来源的酶。在一些实施例中包括经化学或遗传修饰的突变体。合适的纤维素酶包括但不限于特异腐质霉(Humicola insolens)纤维素酶(参见例如美国专利No.4,435,307)。特别合适的纤维素酶是具有颜色护理有益效果的纤维素酶(参见例如EP 0 495 257)。可用于本发明的可商购获得的纤维素酶包括但不限于(诺维信公司(Novozymes))以及KAC-500(B)TM(花王株式会社(Kao Corporation))、PURADAX HA 1200E(丹尼斯克公司(Danisco))、PURADAX EG7000L(丹尼斯克公司(Danisco))。在一些实施例中，纤维素酶作为成熟野生型纤维素酶或变体纤维素酶的部分或片段掺入，其中N末端的一部分缺失(参见例如美国专利No.5,874,276)。在一些实施例中，以组合物重量计，本发明清洁组合物还包含水平为约0.00001％至约10％另外纤维素酶的纤维素酶，并且以组合物重量计，余量为清洁辅助材料。在本发明的一些其他实施例中，以组合物重量计，本发明清洁组合物还包含水平为约0.0001％至约10％、约0.001％至约5％、约0.001％至约2％、约0.005％至约0.5％纤维素酶的纤维素酶。
任何适用于洗涤剂组合物中的甘露聚糖酶也可用于本发明。合适的甘露聚糖酶包括(但不限于)细菌或真菌来源的酶。在一些实施例中包括经化学或遗传修饰的突变体。各种可用于本发明的甘露聚糖酶是已知的(参见例如美国专利No.6,566,114、美国专利No.6,602,842和美国专利No.6,440,991，所有这些专利以引用方式并入本文)。在一些实施例中，以组合物重量计，本发明清洁组合物还包含水平为约0.00001％至约10％另外甘露聚糖酶的甘露聚糖酶，并且以组合物重量计，余量为清洁辅助材料。在本发明的一些其他实施例中，以组合物重量计，本发明清洁组合物还包含水平为约0.0001％至约10％、约0.001％至约5％、约0.001％至约2％、约0.005％至约0.5％甘露聚糖酶的甘露聚糖酶。
在一些实施例中，过氧化物酶与过氧化氢或其来源(例如过碳酸盐、过硼酸盐或过硫酸盐)组合用于本发明的组合物中。在一些可供选择的实施例中，氧化酶与氧气联合使用。这两种类型的酶，优选地连同增强剂一起用于“溶液漂白”(即当织物在洗涤液中一起洗涤时防止纺织品染料从一种染色织物转移到另一种织物)(参见例如WO 94/12621和WO95/01426)。合适的过氧化物酶/氧化酶包括(但不限于)植物、细菌或真菌来源的酶。在一些实施例中包括经化学或遗传修饰的突变体。在一些实施例中，以组合物的重量计，本发明清洁组合物还包含水平为约0.00001％至约10％另外过氧化物酶和/或氧化酶的过氧化物酶和/或氧化酶，并且以组合物的重量计，余量为清洁辅助材料。在本发明的一些其他实施例中，以组合物的重量计，本发明清洁组合物还包含水平为约0.0001％至约10％、约0.001％至约5％、约0.001％至约2％、约0.005％至约0.5％过氧化物酶和/或氧化酶的过氧化物酶和/或氧化酶。
在一些实施例中，可使用另外的酶，其包括但不限于过水解酶(参见例如WO 05/056782)。此外，在一些实施例中，本文涵盖上述酶的混合物，尤其是一种或多种另外的脂解酶、淀粉酶、蛋白酶、甘露聚糖酶和/或至少一种纤维素酶。实际上，设想到这些酶的各种混合物都可用于本发明。还可设想到，变体脂解酶与一种或多种另外的酶的不同水平均可独立地在约10％的范围内，清洁组合物的余量为清洁辅助材料。易于通过考虑待清洁表面、物品或织物以及针对在使用(例如通过使用洗涤剂)期间清洁条件所需的组合物形式来具体选择清洁辅助材料。
合适的清洁辅助材料的例子包括但不限于表面活性剂、助洗剂、漂白剂、漂白活化剂、漂白催化剂、其他酶、酶稳定系统、螯合剂、荧光增白剂、去垢性聚合物、染料转移剂、染料转移抑制剂、催化材料、过氧化氢、过氧化氢源、预先形成的过酸、聚合物分散剂、粘土污垢去除剂、结构增塑剂、分散剂、抑泡剂、染料、香料、着色剂、填料盐、水溶助长剂、光活化剂、荧光剂、织物调理剂、织物软化剂、载体、水溶助长剂、加工助剂、溶剂、颜料、可水解表面活性剂、防腐剂、抗氧化剂、抗收缩剂、抗皱剂、杀菌剂、杀真菌剂、色粒、银护理剂、抗晦暗剂和/或抗腐蚀剂、碱度源、增溶剂、载体、加工助剂、颜料和pH控制剂(参见例如美国专利No.6,610,642、No.6,605,458、No.5,705,464、No.5,710,115、No.5,698,504、No.5,695,679、No.5,686,014和No.5,646,101，所有这些专利均以引用方式并入本文)。特定清洁组合物材料的实施例在下文中举例说明。在清洁辅助材料与清洁组合物中的本发明变体脂解酶不相容的实施例中，则使用合适的方法保持清洁辅助材料与脂解酶分开(即相互不接触)，直至两种组分适宜进行组合。这种分离方法包括本领域已知的任何合适方法(例如软胶囊法、包封法、片剂法、物理分离法等)。
在一些实施例中，在可用于清洁多种需要去除脂质污渍的表面的组合物中包含有效量的一种或多种本文提供的变体脂解酶。此类清洁组合物包括用于诸如清洁硬质表面、织物和餐具之类的应用的清洁组合物。实际上，在一些实施例中，本发明提供织物清洁组合物，而在其他实施例中，本发明提供非织物清洁组合物。意在使本发明涵盖任何形式(即液体、颗粒状、条状、半固体、凝胶、乳液、片剂、胶囊等)的洗涤剂组合物。
举例来说，在下文更详细地描述了几种在其中可使用本发明的变体脂解酶的清洁组合物。在本发明的清洁组合物被配制成适合在洗衣机洗涤方法中使用的组合物的一些实施例中，本发明组合物优选地包含至少一种表面活性剂和至少一种助洗剂化合物，以及一种或多种清洁辅助材料，所述清洁辅助材料优选地选自有机聚合化合物、漂白剂、另外的酶、抑泡剂、分散剂、石灰皂分散剂、污垢悬浮剂和抗再沉积剂以及腐蚀抑制剂。在一些实施例中，衣物洗涤组合物还含有软化剂(即作为额外的清洁辅助材料)。本发明组合物还可用于固体或液体形式的洗涤添加剂产品。此类添加剂产品旨在补充和/或提高常规洗涤剂组合物的性能，并且可在洗涤过程的任何阶段添加。在一些实施例中，在20℃下测量时，本文中衣物洗涤剂组合物的密度在约400至约1200g/L的范围内，而在其他实施例中，其在约500至约950g/L组合物的范围内。
在配制为在人工餐具洗涤方法中使用的组合物的实施例中，本发明组合物优选地包含至少一种表面活性剂，以及优选地至少一种另外的选自以下的清洁辅助材料：有机聚合化合物、泡沫增强剂、II族金属离子、溶剂、水溶助长剂和另外的酶。
在一些实施例中，各种清洁组合物(例如美国专利No.6,605,458中提供的那些)可与本发明的变体脂解酶一起使用。因此，在一些实施例中，包含至少一种本发明的变体脂解酶的组合物是致密的颗粒状织物清洁组合物，而在其他实施例中，所述组合物是可用于清洗有色织物的颗粒状织物清洁组合物，在另外的实施例中，所述组合物是通过洗涤能力提供软化作用的颗粒状织物清洁组合物，在其他实施例中，所述组合物是重垢型液体织物清洁组合物。在一些实施例中，包含至少一种本发明变体脂解酶的组合物是织物清洁组合物，例如美国专利No.6,610,642和No.6,376,450中所述的那些。此外，本发明的变体脂解酶可用于在欧洲或日本洗涤条件下特别具有实用性的颗粒状衣物洗涤组合物中(参见例如美国专利No.6,610,642)。
在一些另选的实施例中，本发明提供包含至少一种本文提供的变体脂解酶的硬质表面清洁组合物。因此，在一些实施例中，包含至少一种本发明变体脂解酶的组合物是硬质表面清洁组合物，例如美国专利No.6,610,642、No.6,376,450和No.6,376,450中所述的那些。
在又一些实施例中，本发明提供包含至少一种本文提供的变体脂解酶的餐具洗涤组合物。因此，在一些实施例中，包含至少一种本发明的变体脂解酶的组合物是硬质表面清洁组合物，例如美国专利No.6,610,642和No.6,376,450中的那些。在又一些实施例中，本发明提供包含至少一种本文提供的变体脂解酶的餐具洗涤组合物。在一些另外的实施例中，包含至少一种本发明的变体脂解酶的组合物包含口腔护理组合物，例如美国专利No.6,376,450和No.6,376,450中的那些。上述美国专利No.6,376,450、No.6,605,458、No.6,605,458和No.6,610,642中所包含的化合物和清洁辅助材料的配制和描述可用于本文提供的变体脂解酶。
本发明清洁组合物被配制成任何合适的形式并且由配制者选择的任何方法制备，其非限制性例子描述于美国专利No.5,879,584、No.5,691,297、No.5,574,005、No.5,569,645、No.5,565,422、No.5,516,448、No.5,489,392和No.5,486,303中，所有这些专利均以引用方式并入本文。当低pH清洁组合物是所需的时，通过添加单乙醇胺或酸性材料(如HCl)之类的材料来调整此类组合物的pH。
尽管不是实现本发明目的所必需的，但下文示例的辅助材料的非限制性名单适用于本发明清洁组合物。在一些实施例中，掺入这些辅助材料，例如以帮助或增强清洁性能以便处理待清洁的基底，或改变清洁组合物的美观性，如利用芳香剂、着色剂、染料等情形就是如此。应当理解，这些辅助材料是本发明的变体脂解酶的补充。这些另外的组分的精确性质以及其掺入的水平将取决于组合物的物理形式和打算使用组合物的清洁操作的性质。合适的辅助材料包括(但不限于)：表面活性剂、助洗剂、螯合剂、染料转移抑制剂、沉积助剂、分散剂、另外的酶和酶稳定剂、催化材料、漂白活化剂、漂白增强剂、过氧化氢、过氧化氢源、预先形成的过酸、聚合物分散剂、粘土污垢去除剂/抗再沉积剂、增亮剂、抑泡剂、染料、芳香剂、结构增塑剂、织物软化剂、载体、水溶助长剂、加工助剂和/或颜料。除下文的公开内容外，此类其他助剂及使用水平的适合例子见于美国专利No.5,576,282、No.6,306,812和No.6,326,348(以引用的方式并入本文)中。上述辅助成分可构成本发明清洁组合物的余量。
在一些实施例中，根据本发明的清洁组合物包含至少一种表面活性剂和/或表面活性剂系统，其中表面活性剂选自非离子表面活性剂、阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、两性表面活性剂、两性离子表面活性剂、半极性非离子表面活性剂以及它们的混合物。在一些低pH清洁组合物实施例(例如净pH为约3至约5的组合物)中，组合物通常不含烷基乙氧基化硫酸盐，因为据信此类表面活性剂可能会被此类组合物的酸性内容物水解。在一些实施例中，以清洁组合物的重量计，表面活性剂以约0.1％至约60％的水平存在，而在可供选择的实施例中，所述水平为约1％至约50％，而在其他实施例中，所述水平为约5％至约40％。
在一些实施例中，本发明的清洁组合物包含一种或多种洗涤剂助洗剂或助洗剂体系。在一些掺入至少一种助洗剂的实施例中，以清洁组合物的重量计，清洁组合物包含至少约1％、约3％至约60％或甚至约5％至约40％的助洗剂。助洗剂包括但不限于：多磷酸的碱金属盐、铵盐和链烷醇铵盐；碱金属硅酸盐；碱土金属和碱金属碳酸盐；铝硅酸盐；聚羧酸盐化合物；醚羟基聚羧酸盐；马来酸酐与乙烯或乙烯基甲基醚的共聚物；1,3,5-三羟基苯-2,4,6-三磺酸；和羧甲基氧基丁二酸；聚乙酸(如乙二胺四乙酸和氨三乙酸)的各种碱金属盐、铵盐和置换的铵盐；以及聚羧酸盐，如苯六甲酸、丁二酸、柠檬酸、氧基二丁二酸、聚马来酸、苯1,3,5-三甲酸、羧甲基氧基丁二酸以及它们的可溶性盐。实际上，设想到任何合适的助洗剂都将可用于本发明各个实施例中。
在一些实施例中，助洗剂形成水溶性硬度离子络合物(例如螯合助洗剂)，如柠檬酸盐和多磷酸盐(例如三聚磷酸钠和六水合三聚磷酸钠、三聚磷酸钾以及三聚磷酸钠与三聚磷酸钾的混合物等)。可以设想到，任何合适的助洗剂都将可用于本发明，包括本领域已知的那些助洗剂(参见例如EP 2 100 949)。
在一些实施例中，本发明的清洁组合物包含至少一种螯合剂。合适的螯合剂包括但不限于：铜、铁和/或锰螯合剂以及它们的混合物。在使用至少一种螯合剂的实施例中，以本发明主题清洁组合物的重量计，本发明清洁组合物包含约0.1％至约15％或甚至约3.0％至约10％的螯合剂。
在一些其他实施例中，本文中提供的清洁组合物含有至少一种沉积助剂。合适的沉积助剂包括(但不限于)：聚乙二醇；聚丙二醇；聚羧酸盐；去污聚合物，如聚对苯二甲酸；粘土，如高岭土、蒙脱土、绿坡缕石(atapulgite)、伊利石、膨润土、多水高岭土以及它们的混合物。
如本文所指出，在一些实施例中，抗再沉积剂可用于本发明的一些实施例。在一些实施例中，可使用非离子表面活性剂。例如，在自动餐具洗涤实施例中，非离子表面活性剂可用于表面修饰目的，尤其用于被单料子，以避免成膜和起斑以及用于改善光泽度。这些非离子表面活性剂也可用于防止污垢再沉积。在一些实施例中，抗再沉积剂是本领域已知的非离子表面活性剂(参见例如EP 2100949)。
在一些实施例中，本发明清洁组合物包含一种或多种染料转移抑制剂。合适的聚合物染料转移抑制剂包括(但不限于)：聚乙烯吡咯烷酮聚合物、聚胺N-氧化物聚合物、N-乙烯吡咯烷酮与N-乙烯咪唑的共聚物、聚乙烯唑烷酮和聚乙烯咪唑或它们的混合物。在使用至少一种染料转移抑制剂的实施例中，以清洁组合物的重量计，本发明清洁组合物包含约0.0001％至约10％、约0.01％至约5％或甚至约0.1％至约3％。
在一些实施例中，硅酸盐包含在本发明的组合物中。在一些此类实施例中，使用硅酸钠(例如二硅酸钠、偏硅酸钠和结晶页硅酸盐)。在一些实施例中，硅酸盐以约1％至约20％的水平存在。在一些实施例中，以组合物的重量计，硅酸盐以约5％至约15％的水平存在。
在一些另外的实施例中，本发明清洁组合物还包含分散剂。合适的水溶性有机材料包括(但不限于)均聚酸或共聚酸或它们的盐，其中聚羧酸包含至少两个羧基，彼此以不超过两个碳原子分开。
在一些其他实施例中，通过任何合适的技术使清洁组合物中使用的酶稳定。在一些实施例中，本文所用的酶由成品组合物中存在的可给所述酶提供钙和/或镁离子的水溶性钙和/或镁离子源来稳定。在一些实施例中，酶稳定剂包括寡糖、多糖和无机二价金属盐(包括碱土金属，如钙盐)。设想到，各种酶稳定化技术将可用于本发明。例如，在一些实施例中，本文所采用的酶由成品组合物中存在的可给所述酶提供锌(II)、钙(II)和/或镁(II)离子的水溶性的这类离子源，以及其他金属离子(例如钡(II)、钪(II)、铁(II)、锰(II)、铝(III)、锡(II)、钴(II)、铜(II)、镍(II)和氧钒(IV))来稳定。氯化物和硫酸盐也可用于本发明一些实施例。合适的寡糖和多糖(例如糊精)的例子是本领域已知的(参见例如WO 07/145964)。在一些实施例中，也可使用可逆的酶抑制剂，诸如含硼化合物(例如硼酸盐、4-甲酰基苯基硼酸)和/或必要时，可使用三肽醛进一步改善稳定性。
在一些实施例中，漂白剂、漂白活化剂和/或漂白催化剂存在于本发明的组合物中。在一些实施例中，本发明的清洁组合物包含无机和/或有机漂白化合物。无机漂白剂包括但不限于过氧化氢合物盐(例如过硼酸盐、过碳酸盐、过磷酸盐、过硫酸盐和过硅酸盐)。在一些实施例中，无机过氧化氢合物盐是碱金属盐。在一些实施例中，包括的无机过氧化氢合物盐为结晶固体形式，无额外保护，但在一些另外的实施例中，所述盐带涂层。本领域已知的任何适合的盐都可用于本发明(参见例如EP 2 100 949)。
在一些实施例中，将漂白活化剂用于本发明的组合物中。漂白活化剂通常为有机过酸前体，这些有机过酸前体在60℃和低于60℃的温度下进行的清洁过程中会增强漂白作用。适用于本文的漂白活化剂包括这样的化合物，其在过氧化氢解条件下产生优选具有约1至约10个碳原子、尤其约2至约4个碳原子的脂族过氧羧酸，和/或任选取代的过苯甲酸。另外的漂白活化剂是本领域已知的并且可用于本发明(参见例如EP 2 100 949)。
此外，在一些实施例中以及如本文中进一步描述的，本发明的清洁组合物还包含至少一种漂白催化剂。在一些实施例中，可使用三氮杂环壬烷锰和相关络合物，以及钴、铜、锰和铁络合物。其他漂白催化剂可用于本发明中(参见例如US 4,246,612、5,227,084、4,810410、WO 99/06521和EP 2 100 949)。
在一些实施例中，本发明的清洁组合物含有一种或多种催化性金属络合物。在一些实施例中，可使用含金属的漂白催化剂。在一些实施例中，金属漂白催化剂包括催化剂系统，所述催化剂系统包含具有确定的漂白催化活性的过渡金属阳离子(例如铜、铁、钛、钌、钨、钼或锰阳离子)、具有极低漂白催化活性或无漂白催化活性的辅助性金属阳离子(例如锌或铝阳离子)，和对催化性和辅助性金属阳离子具有确定的稳定性常数的螯合剂(sequestrate)，尤其可使用乙二胺四乙酸、乙二胺四(亚甲基膦酸)以及它们的水溶性盐(参见例如美国专利No.4,430,243)。在一些实施例中，借助于锰化合物来催化本发明的清洁组合物。此类化合物及其使用水平是本领域熟知的(参见例如美国专利No.5,576,282)。在另外的实施例中，钴漂白催化剂可用于本发明的清洁组合物中。多种钴漂白催化剂是本领域已知的(参见例如美国专利No.5,597,936和No.5,595,967)且易于通过已知程序制备。
在一些另外的实施例中，本发明的清洁组合物包括大多环刚性配体(MRL)的过渡金属络合物。作为一种实践(但绝非限制)，在一些实施例中，对本发明提供的组合物和清洁方法进行调整以在含水洗涤介质中提供约至少1ppm的活性MRL物质，而在一些实施例中在洗涤液中提供约0.005ppm至约25ppm、更优选约0.05ppm至约10ppm且最优选约0.1ppm至约5ppm的MRL。
在一些实施例中，本发明过渡金属漂白催化剂中的过渡金属包括但不限于锰、铁和铬。MRL还包括但不限于交叉桥接的特异性超刚性配体(例如5,12-二乙基-1,5,8,12-四氮杂双环[6.6.2]十六烷)。合适的过渡金属MRL易于通过已知程序制备(参见例如WO 2000/32601和美国专利No.6,225,464)。
在一些实施例中，本发明的清洁组合物包含金属护理剂。金属护理剂可用于防止和/或减少包括铝、不锈钢和非铁金属(例如银和铜)在内的金属的锈污、腐蚀和/或氧化。合适的金属护理剂包括EP 2 100 949、WO 9426860和WO 94/26859中所述的金属护理剂。在一些实施例中，金属护理剂是锌盐。在一些其他实施例中，本发明清洁组合物包含约0.1重量％至约5重量％的一种或多种金属护理剂。
如上文所指出，本发明清洁组合物配制成任何合适的形式并由配制者选择的任何方法制备，其非限制性例子描述于美国专利No.5,879,584、No.5,691,297、No.5,574,005、No.5,569,645、No.5,516,448、No.5,489,392和No.5,486,303中，所有这些专利均以引用方式并入本文。在低pH清洁组合物是所需的一些实施例中，通过添加诸如HCl之类的酸性材料来调节此类组合物的pH。
本文所公开的清洁组合物可用于清洁位置(例如表面、物品、餐具或织物)。通常，使所述位置的至少一部分与纯的形式的或在洗涤液中稀释的本发明清洁组合物的实施例接触，随后任选洗涤和/或漂洗所述位置。出于本发明的目的，“洗涤”包括但不限于擦洗和机械搅动。在一些实施例中，清洁组合物在溶液中通常以约300ppm至约15,000ppm的浓度使用。当洗涤溶剂为水时，水温通常在约5℃至约90℃的范围内，并且当所述位置包括织物时，水与织物的质量比通常为约1:1至约30:1。
清洁组合物的制备和使用方法
本发明的清洁组合物被配制成任何合适的形式并通过配制者所选择的任何合适方法制备(参见例如美国专利No.5,879,584、No.5,691,297、No.5,574,005、No.5,569,645、No.5,565,422、No.5,516,448、No.5,489,392、No.5,486,303、No.4,515,705、No.4,537,706、No.4,515,707、No.4,550,862、No.4,561,998、No.4,597,898、No.4,968,451、No.5,565,145、No.5,929,022、No.6,294,514和No.6,376,445)。
在一些实施例中，本发明的清洁组合物以单位剂型提供，包括片剂、胶囊剂、扁囊剂、袋剂和多隔室袋剂。在一些实施例中，对单位剂量形式进行设计以提供多隔室小袋(或其他单位剂量形式)内的成分的受控释放。合适的单位剂量和受控释放形式是本领域已知的(有关适用于单位剂量和受控释放形式的材料，参见例如EP 2 100 949、WO 02/102955、美国专利No.4,765,916和No.4,972,017，以及WO 04/111178)。在一些实施例中，单位剂型以包有水溶性膜或水溶性小袋的片剂提供。各种用于单位剂量的形式在EP 2 100 947中提供，并且是本领域已知的。
使用方法
在一些实施例中，本发明的清洁组合物可用于清洁表面(例如餐具)、衣物、硬质表面、隐形眼镜等。在一些实施例中，该表面的至少一部分与纯形式的或在洗涤液中稀释的本发明清洁组合物的至少一个实施例接触，然后任选地洗涤和/或漂洗所述表面。出于本发明的目的，“洗涤”包括(但不限于)擦洗和机械洗涤。在一些实施例中，本发明的清洁组合物在溶液中以约500ppm至约15,000ppm的浓度使用。在其中洗涤溶剂为水的一些实施例中，水温通常在约5℃至约90℃的范围内。
本发明提供用于清洁或洗涤需要清洁的物品或表面(例如硬质表面)的方法，其包括但不限于清洁或洗涤餐具物品、餐具物品、织物物品、衣物物品、个人护理物品等的方法，以及清洁或洗涤硬质或软质表面(例如物品的硬质表面)的方法。
在一些实施例中，本发明提供清洁需要清洁的物品、物体或表面的方法，该方法包括使物品或表面(或希望进行清洁的物品或表面的一部分)与至少一种本发明的变体脂肪酶脂解酶或本发明的组合物接触足以清洁所述物品、物体或表面至所需程度的时间，和/或在适于和/或有效清洁所述物品、物体或表面至所需程度的条件下进行接触。一些此类方法还包括用水漂洗物品、物体或表面。对于一些此类方法，清洁组合物是餐具洗涤剂组合物，而待清洁的物品或物体是餐具物品或餐具物品。如本文所用，“餐具物品”是通常用于供给食物或食用食物的物品。餐具物品可以是但不限于例如盘子、碟子、杯子、碗等等。如本文所用，“餐具”是更广泛的术语，其包括但不限于例如餐具、刀具、餐刀、餐叉、匙、筷子、玻璃器具、罐壶、调味汁碟、饮用容器、盛菜物品等。预期“餐具物品”包括这些或相似的用于供应食物或食用食物的物品中的任何一种。对于一些此类方法，清洁组合物是自动餐具洗涤剂组合物或手动餐具洗涤剂组合物，而待清洁的物品或物体是餐具或餐具物品。对于一些此类方法，清洁组合物是衣物洗涤剂组合物(例如粉末衣物洗涤剂组合物或液体衣物洗涤剂组合物)，而待清洁的物品是织物物品。在一些其他实施例中，清洁组合物是衣物预处理组合物。
在一些实施例中，本发明提供用于清洁或洗涤任选需要分别清洁或洗涤的织物物品的方法。在一些实施例中，该方法包括提供包含变体脂解酶的组合物(包括但不限于织物或衣物清洁组合物)和需要清洁的织物物品或衣物物品，并使该织物物品或衣物物品(希望进行清洁的物品的一部分)与该组合物在足以或有效清洁或洗涤该织物或衣物物品至所需程度的条件下接触。
在一些实施例中，本发明提供清洁或洗涤任选需要清洁的物品或表面(例如硬质表面)的方法，该方法包括提供待清洁或洗涤的物品或表面，使该物品或表面(希望进行清洁或洗涤的物品或表面的一部分)与至少一种本发明的脂肪酶变体或包含至少一种此类脂肪酶变体的本发明组合物接触足以清洁或洗涤该物品或表面至所需程度的时间，和/或在足以或有效清洁或洗涤该物品或表面至所需程度的条件下接触。此类组合物包括但不限于例如本发明的清洁组合物或洗涤剂组合物(例如手动餐具洗涤剂组合物、手动餐具洗涤清洁组合物、衣物洗涤剂组合物、或织物洗涤剂组合物、或者衣物或织物清洁组合物、液体衣物洗涤剂、液体衣物清洁组合物、粉末衣物洗涤剂组合物、粉末衣物清洁组合物、自动餐具洗涤剂组合物、衣物助洗剂清洁组合物或洗涤剂组合物、衣物清洁添加剂和衣物预洗剂组合物等)。在一些实施例中，将该方法重复一次或多次，尤其是如果需要额外的清洁或洗涤的话。例如，在某些情况下，该方法任选地还包括让物品或表面与至少一种变体脂解酶或组合物保持接触足以或有效清洁或洗涤该物品或表面至所需程度的一段时间。在一些实施例中，这些方法还包括用水和/或另一种液体漂洗物品或表面。在一些实施例中，这些方法还包括再次用至少一种本发明的变体脂解酶或本发明的组合物接触物品或表面，并且让该物品或表面与至少一种变体脂解酶或组合物保持接触足以清洁或洗涤该物品或表面至所需程度的一段时间。在一些实施例中，清洁组合物是餐具洗涤剂组合物，而待清洁的物品是餐具或餐具物品。在本发明方法的一些实施例中，清洁组合物是自动餐具洗涤剂组合物或手动餐具洗涤剂组合物，而待清洁的物品是餐具或餐具物品。在所述方法的一些实施例中，清洁组合物是衣物洗涤剂组合物，而待清洁的物品是织物物品。
本发明还提供在自动洗碗机中清洁餐具或餐具物品的方法，该方法包括提供自动洗碗机，在机器中放入足以清洁餐具或餐具物品的量的包含至少一种本发明脂肪酶变体或本发明组合物的自动餐具洗涤组合物(例如通过将该组合物置于机器中的合适的或提供的洗涤剂隔室或分配器中)，将餐具或餐具物品放入该机器中，运行该机器以清洁该餐具或餐具物品(例如按照生产商的说明书)。在一些实施例中，所述方法包括本文所述的任何自动餐具洗涤组合物，其包含但不限于至少一种本文提供的脂肪酶变体。待使用的自动餐具洗涤组合物的量可根据生产商的说明书或建议容易地确定，并且可采用任何形式的包含至少一种本发明变体脂解酶的自动餐具洗涤组合物(例如液体、粉末、固体、凝胶、片剂等)，包括本文所述的任何组合物在内。
本发明还提供清洁任选需要清洁的表面、物品或物体的方法，该方法包括使物品或表面(或希望进行清洁的物品或表面的一部分)与纯形式的或在洗涤液中稀释的至少一种本发明变体脂肪酶或本发明清洁组合物接触足以清洁或洗涤该物品或表面至所需程度的时间和/或在足以或有效清洁或洗涤该物品或表面至所需程度的条件下进行接触。然后如果需要，可对表面、物品或物体(任选)进行洗涤和/或漂洗。出于本发明的目的，“洗涤”包括但不限于例如擦洗和机械搅动。在一些实施例中，清洁组合物在溶液(如水溶液)中以约500ppm至约15,000ppm的浓度使用。当洗涤溶剂是水时，水温通常在约5℃至约90℃的范围内，并且当表面、物品或物体包括织物时，水与织物的质量比通常为约1:1至约30:1。
本发明还提供在洗涤机中清洁衣物或织物物品的方法，该方法包括提供洗涤机，将足以清洁衣物或织物物品的量的包含至少一种本发明的变体脂肪酶的衣物洗涤剂组合物置于该机器中(例如通过将该组合物置于机器中的合适的或提供的洗涤剂隔室中或分配器中)，将衣物或织物物品置于该机器中，运行该机器以清洁衣物或织物物品(例如按照生产商的说明书)。本发明的方法包括本文所述的任何衣物洗涤剂组合物，其包含但不限于本文提供的任何变体脂肪酶中的至少一种。要使用的衣物洗涤剂组合物的量可根据生产商的说明书或建议容易地确定，并且可采用任何形式的包含至少一种本发明变体脂解酶的衣物洗涤剂组合物(例如固体、粉末、液体、片剂、凝胶等)，包括本文所述的任何组合物在内。
本发明还提供具有酯酶活性的变体，诸如TLL变体。酯酶活性包括对酯的裂解，例如单体形式、可溶形式的三甘油酯。在本发明的一些实施例中，本发明的变体可在存在辅剂的情况下使用，所述辅剂包括非离子辅剂或两性离子辅剂，例如正十二烷基-β-D-吡喃麦芽糖苷(D310)、LysoFos胆碱14(L214)、Anzergent 3-12(AZ312)和CHAPSO(C317)。在本发明的一些实施例中，本发明的变体可与不同的辅剂浓度水平一起使用，所述浓度水平包括但不限于1×、0.5×和0.25×临界胶束浓度(CMC)。
本发明还提供变体，诸如TLL变体，该变体可用于纸浆和纸张加工，包括控制纤维中的有机污染物。该纤维可以是纤维素纤维，并且在一些情况下是从多种纸制品或含纤维的制品中回收的纤维，所述纸制品或含纤维的制品诸如旧瓦楞纸箱(OCC)、旧新闻纸(ONP)、混合办公废纸(MOW)、或者它们的组合。这些类型的含纸制品通常包含存在于纸制品中的大量有机污染物。当回收这些类型的纸制品时，这些有机污染物与在造纸工艺的制浆阶段中形成的纤维一起存在。这些有机污染如果没有被充分移除，可通过影响最终形成的纸张的品质和/或影响用于形成纸张的机器而严重地妨碍造纸工艺的后续阶段。因此，当此类有机污染物存在于纤维中时，此类有机污染物的移除对于造纸工艺而言很重要。
出于本发明的目的，有机污染物的例子包括在工业中称为“胶粘物”的那些，并且包括但不限于由粘合剂等形成的合成聚合物、胶、热熔胶、涂料、涂布胶粘剂、墨渣、化学脱墨剂、木材树脂、松香和未浆化的湿强树脂。这些类型的材料通常存在于含纸制品中，诸如新闻纸、瓦楞纸箱和/或混合办公废纸。这些有机污染物通常将存在有聚合物，诸如丁苯橡胶、丙烯酸乙烯酯、聚异戊二烯、聚丁二烯、天然橡胶、乙基乙酸乙烯酯、聚醋酸乙烯酯、乙基乙烯醇、聚乙烯醇、苯乙烯丙烯酸酯和其他合成型聚合物。
在本发明的方法中，这些有机污染物是通过使包含有机污染物的纤维与包含本发明的至少一种变体的组合物以足够的量接触足够的时间以控制纤维中存在的有机污染物来进行控制的。本发明的组合物优选地将有机污染物分散或转化成不会影响造纸工艺的有机物质。例如，聚醋酸乙烯酯优选地被分散和/或转化成聚乙烯醇，聚乙烯醇不会影响造纸工艺。这种以组合物实现对有机污染物的控制的优选方式与通过浮选法收集污染物是完全不同的。
出于本发明的目的，控制含有有机污染物的纤维中存在的有机污染物被理解为以下各项中的一者或多者：减少污染物粒子的尺寸、减少存在的可测量粒子的数目或数量、和/或减少有机污染物的粘著性。在一些实施例中，当使用本发明的方法控制有机污染物时，会发生以上所有减少事件。在一些实施例中，相比于不存在本发明的变体时，污染物粒子的尺寸减少至少约5％，或者减少约10％至约75％。相似地，当与未使用本发明的变体处理的纤维进行比较时，纤维中存在的有机污染物的数目或数量减少至少约5％，或者减少约10％至约75％。另外，当与未使用本发明的变体处理的纤维进行比较时，有机污染物的粘著性可减少至少约5％，或者减少约10％至约75％。
包含本发明的至少一种变体的组合物还可包含作为一种选择的其他常规纸张处理化学品或成分，诸如但不限于表面活性剂、溶剂、助悬剂、填料、螯合剂、防腐剂、缓冲液、水、稳定剂等等。这些额外的成分可以常规量存在。
在本发明的一些实施例中，提供了一种用于处理聚酯(包括洁净、未被污染的聚酯)的方法，该方法包括在使聚酯的性质得以改进的条件下使所述聚酯纺织物与具有本发明的变体的酶溶液接触一定时间。优选地，聚酯为纤维、纱线、织物，或者包含此类纤维、纱线或织物的纺织物成品。更优选地，被改进的性质包括由此类纤维、纱线、制品制成的纺织物产品的那些性质，诸如改善的手感和/或重量。在一些实施例中，本发明提供了一种改进包含聚酯的纺织物的纺织物特性的机制。因此，在本发明的该实施例中，将聚酯酶施用于纺织物产品往往是有利的，这些纺织物产品是未受污染的，即不包含通常需经受市售洗涤剂的污渍。在其他实施例中，本发明提供了一种从聚酯织物清洗污渍的方法。
在本发明的另一个实施例中，提供了一种在将聚酯纤维、纱线或织物结合到纺织物产品中之前对其进行处理，或者在使聚酯的性质得到改进的条件下施用纺织物整理剂和本发明的酶变体达一定时间的方法。因此，在其中分别对纺织物组分进行处理的实施例中，经处理的聚酯组分(即，纤维、纱线、织物)可通过用于生产聚酯纺织物的标准方法而结合到纺织物产品中，从而使纺织物成品得以改进，所述标准方法为诸如编织、缝合以及裁剪和缝制的工艺。
在本发明的又一个方法实施例中，提供了一种用于在使聚酯的性质得以改进的条件下用本发明的酶变体处理聚酯树脂或膜达一定时间的方法。经处理的聚酯可以是树脂或膜成品，或者可通过例如机械构造结合到产品中，从而使纺织物成品得以改进。
在本发明的又一个方法实施例中，用本发明的酶变体处理聚酯废品以降解聚酯废品，以便容易地对回收的化合物进行处置。该实施例尤其可用于聚酯类塑料的降解，聚酯类塑料正日益成为垃圾处理和倾倒中的问题。本实施例的一种替代形式为本发明可用于增加废品中微生物可降解材料的量，以便有利于此类垃圾的完全降解或堆肥处理。
在根据本发明所述的方法中，在适用于使酶表现出聚酯改进的条件下，使包含如本文所提供的本发明的酶变体的溶液与聚酯纤维、纱线、织物或者包含此类纤维、纱线或织物的纺织物接触。本发明优选地涉及聚酯酶在纺织物产品的制造中的应用，并且不一定与用于清除在穿着过程中出现的污渍的洗涤剂结合使用。因此，在该实施例中，将本发明的酶变体施用至聚酯制品发生在将纤维纺丝成纱线之前、在将纱线结合到织物中之前和/或在构造包含该聚酯的纺织物产品之前。然而，在本发明中并且也作为此处的优选实施例，还用本文所展示的本发明的酶变体对完成的纺织物产品进行处理。
实验
在以下实例中对本发明进行更详细地描述，这些实例并非旨在以任何方式限制受权利要求书保护的本发明的范围。
在以下实验公开内容中，将应用以下缩写：PI(性能指数)，ppm(份每一百万份)；M(摩尔浓度)；mM(毫摩尔浓度)；μM(微摩尔浓度)；nM(纳摩尔浓度)；mol(摩尔)；mmol(毫摩尔)；μmol(微摩尔)；nmol(纳摩尔)；gm(克)；mg(毫克)；μg(微克)；pg(皮克)；L(升)；ml和mL(毫升)；μl和μL(微升)；cm(厘米)；mm(毫米)；μm(微米)；nm(纳米)；U(单位)；V(伏特)；MW(分子量)；sec(秒)；min(分钟)；h和hr(小时)；℃(摄氏度)；QS(足量)；ND(未进行)；rpm(每分钟转数)；GH(德国硬度度数)；H2O(水)；dH2O(去离子水)；HCl(盐酸)；aa(氨基酸)；bp(碱基对)；kb(千碱基对)；kD(千道尔顿)；cDNA(拷贝DNA或互补DNA)；DNA(脱氧核糖核酸)；ssDNA(单链DNA)；dsDNA(双链DNA)；dNTP(脱氧核糖核苷三磷酸)；RNA(核糖核酸)；mgCl2(氯化镁)；NaCl(氯化钠)；w/v(重量/体积比)；v/v(体积比)；w/w(重量比)；g(重力)；OD(光密度)；ppm(份每一百万份)；杜伯科氏(Dulbecco)磷酸盐缓冲液(DPBS)；SOC(2％细菌用胰蛋白胨、0.5％细菌用酵母抽提物、10mM NaCl、2.5mM KCl)；极品肉汤(TB；12g/L细菌用胰蛋白胨、24g/L甘油、2.31g/L KH2PO4和12.54g/L K2HPO4)；OD280(280nm处的光密度)；OD600(600nm处的光密度)；A405(405nm处的吸光度)；Vmax(酶催化反应的最大初始速度)；PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)；PBS(磷酸盐缓冲盐溶液[150mM NaCl，10mM磷酸钠缓冲液，pH 7.2])；PBST(PBS+0.25％)；PEG(聚乙二醇)；PCR(聚合酶链反应)；RT-PCR(逆转录PCR)；SDS(十二烷基硫酸钠)；Tris(三(羟甲基)氨基甲烷)；HEPES(N-[2-羟乙基]哌嗪-N-[2-乙磺酸])；HBS(HEPES缓冲盐溶液)；Tris-HCl(三[羟甲基]氨基甲烷-盐酸盐)；Tricine(N-[三-(羟甲基)-甲基]-甘氨酸)；CHES(2-(N-环己基氨基)乙磺酸)；TAPS(3-{[三-(羟甲基)-甲基]-氨基}-丙磺酸)；CAPS(3-(环己基氨基)-丙磺酸；DMSO(二甲基亚砜)；DTT(1,4-二硫代-DL-苏糖醇)；SA(芥子酸(s,5-二甲氧基-4-羟基肉桂酸)；TCA(三氯乙酸)；Glut和GSH(还原型谷胱甘肽)；GSSG(氧化型谷胱甘肽)；TCEP(三[2-羧乙基]膦)；Ci(居里)；mCi(毫居里)；μCi(微居里)；HPLC(高压液相色谱)；RP-HPLC(反相高压液相色谱)；TLC(薄层色谱)；MALDI-TOF(基质辅助激光解吸/电离--飞行时间)；Ts(甲苯磺酰基)；Bn(苄基)；Ph(苯基)；Ms(甲磺酰基)；Et(乙基)，Me(甲基)；Taq(水生栖热菌(Thermus aquaticus)DNA聚合酶)；Klenow(DNA聚合酶I大(Klenow)片段)；EGTA(乙二醇-双(β-氨基乙基醚)N,N,N',N'-四乙酸)；EDTA(乙二胺四乙酸)；bla(β-内酰胺酶或氨苄青霉素抗性基因)；HDL(高密度液体)；HDD(重垢粉末洗涤剂)；HSG(高泡颗粒状洗涤剂)；CEE(中欧和东欧)；WE(西欧)；当用于指洗涤剂时，NA(北美)；当用于指洗涤剂时，Japan和JPN(日本)；MJ Research(MJ Research公司，内华达州雷诺(Reno,NV))；Baseclear(Baseclear BV公司，荷兰莱顿(Leiden,The Netherlands))；PerSeptive(PerSeptive Biosystems公司，迈阿密费雷明汉(Framingham,MA))；ThermoFinnigan(ThermoFinnigan公司，加利福尼亚州圣荷西(San Jose,CA))；Argo(Argo BioAnalytica公司，新泽西州莫里斯普莱恩斯(Morris Plains,NJ))；Seitz EKS(SeitzSchenkFiltersystems GmbH有限责任公司，德国巴特克罗伊茨纳赫(Bad Kreuznach,Germany))；Pall(Pall Corp.公司，纽约州东希尔斯(East Hills,NY)和德国巴特克罗伊茨纳赫(BadKreuznach,Germany))；Spectrum(光谱实验室公司(Spectrum Laboratories)，加利福尼亚州多明格斯农场(Dominguez Rancho,CA))；Molecular Structure(分子结构公司(Molecular Structure Corp.)，得克萨斯州伍德兰兹(Woodlands,TX))；Accelrys(阿赛乐德网络公司(Accelrys,Inc.)，加利福尼亚州圣地亚哥(San Diego,CA))；ChemicalComputing(化学计算公司(Chemical Computing Corp.)，加拿大蒙特利尔(Montreal,Canada))；New Brunswick(纽布伦斯威克科技公司(New Brunswick Scientific,Co.)，新泽西爱迪生(Edison,NJ))；CFT(测试材料中心(Center for Test Materials)，荷兰费拉尔丁恩(Vlaardingen,The Netherlands))；P&G和Procter&Gamble(宝洁公司(Procter&Gamble,Inc.)，俄亥俄州辛辛那提(Cincinnati,OH))；GE Healthcare(通用电气医疗集团(GE Healthcare)，英国查尔芬特.圣贾尔斯(Chalfont St.Giles,United Kingdom))；DNA2.0(DNA2.0公司，加利福尼亚州门洛帕克(Menlo Park,CA))；OXOID(Oxoid公司，英国汉普郡贝辛斯托克(Basingstoke,Hampshire,UK))；Megazyme(Megazyme InternationalIreland Ltd.有限公司，爱尔兰维克罗郡布雷市布雷商业园(Bray Business Park,Bray,Co.,Wicklow,Ireland))；Finnzymes(Finnzymes Oy公司，芬兰埃斯波(Espoo,Finland))；Kelco(CP Kelco公司，特拉华州威尔明顿(Wilmington,DE))；Corning(康宁生命科学(Corning Life Sciences)，纽约州科宁(Corning,NY))；(NEN(NEN生命科学产品公司(NENLife Science Products)，麻萨诸塞州波士顿(Boston,MA))；Pharma AS(Pharma AS公司,挪威奥斯陆(Oslo,Norway))；Dynal(Dynal公司，挪威奥斯陆(Oslo,Norway))；Bio-Synthesis(生物合成公司(Bio-Synthesis)，得克萨斯州刘易斯维尔(Lewisville,TX))；ATCC(美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)，马里兰州罗克维尔(Rockville,MD))；Gibco/BRL(Gibco/BRL公司，纽约州格兰德岛(rand Island,NY))；Sigma(西格玛化工有限公司(Sigma Chemical Co.)，密苏里州圣路易斯(St.Louis,MO))；Pharmacia(法玛西亚生物技术公司(Pharmacia Biotech)，新泽西州皮斯卡特维(Piscataway,NJ))；NCBI(美国国家生物技术信息中心(National Center forBiotechnology Information))；Applied Biosystems(应用生物系统公司(AppliedBiosystems)，加利福尼亚州福斯特市(Foster City,CA))；BD Biosciences和/或Clontech(BD生物科学CLONTECH实验室(BD Biosciences CLONTECH Laboratories)，加利福尼亚州帕罗奥图(Palo Alto,CA))；Operon Technologies(Operon Technologies,Inc.公司，加利福尼亚州阿拉米达(Alameda,CA))；MWG Biotech(MWG Biotech公司，北卡罗来纳州海波因特(High Point,NC))；Oligos Etc(Oligos Etc.Inc公司，俄勒冈州威尔逊维尔(Wilsonville,OR))；Bachem(Bachem Bioscience,Inc.公司，宾夕法尼亚州普鲁士王(Kingof Prussia,PA))；Difco(Difco Laboratories公司，密歇根州底特律(Detroit,MI))；Mediatech(敏达科技公司(Mediatech)，弗吉尼亚州赫恩登(Herndon,VA))；Santa Cruz(Santa Cruz Biotechnology,Inc.公司，加利福尼亚州圣塔克鲁兹(Santa Cruz,CA))；Oxoid(Oxoid Inc.公司，纽约州奥格登斯堡(Ogdensburg,NY))；Worthington(WorthingtonBiochemical Corp.公司，新泽西州弗里霍尔德(Freehold,NJ))；GIBCO BRL或Gibco BRL(生命科技公司(Life Technologies,Inc.)，马里兰州盖瑟斯堡(Gaithersburg,MD))；Millipore(密理博公司(Millipore)，麻萨诸塞州比尔里卡(Billerica,MA))；Bio-Rad(伯乐公司(Bio-Rad)，加利福尼亚州赫尔克里士(Hercules,CA))；Invitrogen(英杰公司(Invitrogen Corp.)，加利福尼亚州圣地亚哥(San Diego,CA))；NEB(新英格兰生物实验室公司(New England Biolabs)，麻萨诸塞州贝弗利(Beverly,MA))；Sigma(西格玛化工有限公司(Sigma Chemical Co.)，密苏里州圣路易斯(St.Louis,MO))；Pierce(Pierce生物技术公司(Pierce Biotechnology)，伊利诺伊州罗克福德(Rockford,IL))；Takara(宝生物工程株式会社(Takara Bio Inc.)，日本大津市(Otsu,Japan))；Roche(罗氏公司(Hoffmann-LaRoche)，瑞士巴塞尔(Basel,Switzerland))；EM Science(EM科学公司(EM Science)，新泽西州吉布斯敦Gibbstown,NJ))；Qiagen(凯杰公司(Qiagen,Inc.)，加利福尼亚瓦伦西亚(Valencia,CA))；Biodesign(Biodesign Intl.公司，缅因州索科(Saco,Maine))；Aptagen(Aptagen,Inc.公司，弗吉尼亚州赫恩登(Herndon,VA))；Sorvall(Sorvall牌，来自KendroLaboratory Products公司，北卡罗来纳州阿什维尔(Asheville,NC))；Molecular Devices(分子装置公司(Molecular Devices,Corp.)，加利福尼亚州森尼韦尔(Sunnyvale,CA))；R&D Systems(R&D Systems公司，明尼苏达州明尼阿波利斯(Minneapolis,MN))；SiegfriedHandel(Siegfried Handel AG公司，瑞士祖芬根(Zofingen,Switzerland))；Stratagene(Stratagene Cloning Systems公司，加利福尼亚州拉荷雅(La Jolla,CA))；Marsh(MarshBiosciences公司，纽约州罗彻斯特(Rochester,NY))；Geneart(Geneart GmbH有限公司，德国雷根斯堡(Regensburg,Germany))；Bio-Tek(Bio-Tek Instruments公司，佛蒙特州威努斯基(Winooski,VT))；(Biacore(Biacore,Inc.公司，新泽西州皮斯卡特维(Piscataway,NJ))；PeproTech(PeproTech公司，新泽西州罗基希尔(Rocky Hill,NJ))；SynPep(SynPep公司，加利福尼亚州都柏林(Dublin,CA))；New Objective(科学仪器服务有限公司新目标分公司(New Objective brand；Scientific Instrument Services,Inc.)，新泽西州灵戈斯(Ringoes,NJ))；Waters(沃特斯公司(Waters,Inc.)，麻萨诸塞州米尔福德(Milford,MA))；Matrix Science(Matrix Science公司，麻萨诸塞州波士顿(Boston,MA))；Dionex(戴安公司(Dionex,Corp.)，加利福尼亚州森尼韦尔(Sunnyvale,CA))；Monsanto(孟山都公司(Monsanto Co.)，密苏里州圣路易斯(St.Louis,MO))；Wintershall(Wintershall AG公司，德国卡塞尔(Kassel,Germany))；BASF(巴斯夫公司(BASF Co.)，新泽西州弗洛勒姆帕克(Florham Park,NJ))；Huntsman(亨斯迈石化公司(Huntsman Petrochemical Corp.)，犹他州盐湖城(Salt Lake City,UT))；Shell Chemicals(壳牌化学品公司(Shell Chemicals,Inc.)，英国伦敦(London,UK))；Stepan(Stepan公司，伊利诺伊州诺斯菲尔德(Northfield,IL))；Clariant(科莱恩公司(Clariant)，德国苏尔茨巴赫(Sulzbach,Germany))；Industrial Zeolite(工业沸石有限公司(Industrial Zeolite Ltd.)，英国艾塞克斯格雷斯(Grays,Essex,UK))；Jungbunzlauer(Jungbunzlauer公司，瑞士巴塞尔(Basel,Switzerland))；Solvay(苏威公司(Solvay)，比利时布鲁塞尔(Brussels,Belgium))；3VSigma(3V西格玛公司(3V Sigma)，意大利贝尔加莫(Bergamo,Italy))；Innospec(Innospec公司，英国埃尔斯米尔港(Ellesmere Port,UK))；Thermphos(天富公司(Thermphos)，荷兰弗利辛恩奥斯特(Vlissiggen-Ost,The Netherlands))；Ciba Specialty(汽巴特殊化学品公司(Ciba Specialty Chemicals)，瑞士布鲁塞尔(Basel,Switzerland))；Dow Corning(道康宁公司(Dow Corning)，英国巴里(Barry,UK))；Enichem(Enichem Iberica公司，西班牙巴萨罗那(Barcelona,Spain))；Fluka Chemie AG(Fluka Chemie AG公司，瑞士布克斯(Buchs,Switzerland))；Gist-Brocades(Gist-Brocades,NV公司，荷兰代夫特(Delft,TheNetherlands))；Dow Corning(道康宁公司(Dow Corning Corp.)，密歇根州米德兰(Midland,MI))；Mettler-Toledo(Mettler-Toledo Inc，俄亥俄州哥伦布(Columbus,OH))；RB(Reckitt-Benckiser公司，英国斯劳(Slough,UK))；以及Microsoft(微软公司(Microsoft,Inc.)，华盛顿州雷德蒙德(Redmond,WA))。
如本文所用，在一些列表中，标出了前面的“0”，以提供每个位点的三位数名称(例如“001”与“1”相同，因此“A001C”与“A1C”相同)。在一些列表中，未包括前面的“0”。此外，如本文所用，“X”是指任何氨基酸。
在本文提供的示例性洗涤剂组合物中，酶水平以按照总组合物重量计的纯酶表示，除非另外指明，否则洗涤剂成分以总组合物的重量表示。其中的缩写的组分标识具有如下含义：
对于北美(NA)和西欧(WE)重垢液体衣物(HDL)洗涤剂，通过将预称重的液体洗涤剂(于玻璃瓶中)置于95℃水浴中2小时对市售洗涤剂中存在的酶进行热灭活。热灭活NA和WE自动餐具洗涤(ADW)洗涤剂的温育时间是8小时。未加热的和加热过的洗涤剂二者均在溶解该洗涤剂5分钟内测定，以便精确地测定灭活百分比。通过AAPF测定法测试酶活性。
为了测试在热灭活洗涤剂中的酶活性，由热灭活的储备液制备洗涤剂的工作溶液。向该洗涤剂溶液中添加适当量的水硬度(如，6gpg或12gpg)和缓冲液以匹配所需的条件。通过涡旋或倒转瓶子来混合溶液。下表提供了关于本文所用的一些市售洗涤剂和测试条件的信息。在一些实验中，另外的和/或其他的市售洗涤剂可用于如下例子。
在一些另外的例子中，可使用如下溶液：
表C提供了根据本发明制备的适用于洗涤织物的颗粒状衣物洗涤剂组合物。
1无规接枝共聚物是聚乙酸乙烯酯接枝的聚环氧乙烷共聚物，其具有聚环氧乙烷主链和多条聚乙酸乙烯酯侧链。聚环氧乙烷主链的分子量为约6000，聚环氧乙烷与聚乙酸乙烯酯的重量比为约40至60，并且每50个环氧乙烷单元不超过1个接枝点。
2聚乙烯亚胺(MW＝600)，每个-NH具有20个乙氧基化基团。
3两亲性烷氧基化油脂清洁聚合物是每个–NH具有24个乙氧基化基团且每个–NH具有16个丙氧基化基团的聚乙烯亚胺(MW＝600)。
4可逆脂解酶抑制剂，具有如下结构：
5乙氧基化的噻吩调色染料如US 7,208,459 B2中所述。
在表C中，所有酶水平均以酶原料的百分比表示，(本发明的)脂解酶除外，其以添加至产品的活性蛋白质的百分比表示。
表D提供了适用于顶开式自动洗衣机的颗粒状衣物洗涤剂组合物(洗涤剂组合物7-9)和前开式洗衣机的颗粒状衣物洗涤剂组合物(洗涤剂组合物10-11)。将所测试的脂解酶变体和/或本发明的脂解酶单独添加到这些配方中，以使得洗涤液体中的最终浓度介于0.01ppm和10ppm之间。
在表D中，表面活性剂成分可购自任何合适的供应商，包括但不限于巴斯夫公司(BASF)(例如，)、壳牌化学品公司(Shell Chemicals)、斯捷潘公司(Stepan)、亨斯迈石化公司(Huntsman)和科莱恩公司(Clariant)(例如，)。沸石可购自诸如工业沸石公司(Industrial Zeolite)的来源。柠檬酸和柠檬酸钠可购自诸如Jungbunzlauer公司的来源。过碳酸钠、碳酸钠、碳酸氢钠和倍半碳酸钠可购自诸如苏威公司(Solvay)的来源。丙烯酸酯/马来酸酯共聚物可购自诸如巴斯夫公司(BASF)的来源。羧甲基纤维素和疏水改性的羧甲基纤维素可购自诸如斯比凯可公司(CPKelco)的来源。C.I.荧光增白剂260可购自3V西格玛公司(3V Sigma)(例如，2M/G、2MG/LT Extra或Ecobright。S,S-乙二胺二琥珀酸四钠可购自诸如Innospec公司的来源。对苯二甲酸酯共聚物可购自科莱恩公司(Clariant)(例如，REPELOTEX SF 2)。此外，1-羟基乙烷-1,1-二膦酸可购自天富公司(Thermphos)。基于哑嗪盐的漂白增强剂具有如下结构，其中R1＝2-丁基辛基，并根据US 2006/0089284A1制备。
酶STAINZYME 和可购自诺维信公司(Novozymes)。四磺酸基酞菁锌可购自汽巴特殊化学品公司(Ciba Specialty Chemicals)(例如，BMC)。抑泡剂颗粒可购自道康宁公司(Dow Corning)。在这些洗涤剂组合物中，无规接枝共聚物是聚乙酸乙烯酯接枝的聚环氧乙烷共聚物，其具有聚环氧乙烷主链和多条聚乙酸乙烯酯侧链。聚环氧乙烷主链的分子量为约6000，聚环氧乙烷与聚乙酸乙烯酯的重量比为约40至60，并且每50个环氧乙烷单元不超过1个接枝点。
表E-G提供了适用于洗涤机的另外的颗粒状洗涤剂组合物(洗涤剂36a-n)。将所测试的GG36脂解酶变体或本发明的冷水脂解酶单独添加到这些配方中。
表E、F、G中的洗涤剂组合物36a–n的注释：
表面活性剂成分可购自德国路德维希港的巴斯夫公司(BASF,Ludwigshafen,Germany)英国伦敦的壳牌化学品公司(Shell Chemicals,London,UK)；美国伊利诺伊州诺斯菲尔德的斯捷潘公司(Stepan,Northfield,Illinois,USA)；美国犹他州盐湖城亨斯迈路的亨斯迈石化公司(Huntsman,Huntsman,Salt Lake City,Utah,USA)；德国苏尔茨巴赫的科莱恩公司(Clariant,Sulzbach,Germany)
沸石可购自英国埃塞克斯郡格雷斯的工业沸石英国有限公司(IndustrialZeolite(UK)Ltd,Grays,Essex,UK)。
柠檬酸和柠檬酸钠可购自瑞士巴塞尔的Jungbunzlauer公司(Jungbunzlauer,Basel,Switzerland)。
过碳酸钠、碳酸钠、碳酸氢钠和倍半碳酸钠可购自比利时布鲁塞尔的苏威公司(Solvay,Brussels,Belgium)。
丙烯酸酯/马来酸酯共聚物可购自德国路德维希港的巴斯夫公司(BASF,Ludwigshafen,Germany)。
羧甲基纤维素和疏水改性的羧甲基纤维素可购自荷兰阿纳姆的斯比凯可公司(CPKelco,Arnhem,The Netherlands)。
C.I.荧光增白剂260可以商品名2M/G、2MG/LT Extra或Ecobright购自意大利贝加莫的3V西格玛公司(3V Sigma,Bergamo,Italy)。
S,S-乙二胺二琥珀酸四钠可购自英国埃尔斯米尔港的Innospec公司(Innospec,Ellesmere Port,UK)。
对苯二甲酸酯共聚物可以商品名Repelotex SF 2购自科莱恩公司(Clariant)。1-羟基乙烷-1,1-二膦酸可购自荷兰弗利辛恩的天富公司(Thermphos,Vlissingen-Oost,TheNetherlands)。
基于哑嗪盐的漂白增强剂具有如下结构，其中R1＝2-丁基辛基，并根据US2006/0089284A1制备。
酶和可购自丹麦鲍斯韦的诺维信公司(Novozymes,Bagsvaerd,Denmark)。
四磺酸基酞菁锌可以商品名BMC购自瑞士巴塞尔的汽巴特殊化学品公司(Ciba Specialty Chemicals,Basel,Switzerland)。
抑泡剂颗粒可购自英国巴里的道康宁公司(Dow Corning,Barry,UK)。
无规接枝共聚物是聚乙酸乙烯酯接枝的聚环氧乙烷共聚物，其具有聚环氧乙烷主链和多条聚乙酸乙烯酯侧链。聚环氧乙烷主链的分子量为约6000，聚环氧乙烷与聚乙酸乙烯酯的重量比为约40至60，并且每50个环氧乙烷单元不超过1个接枝点。
实例1
方法
以下测定是用于下文所述实例中的标准测定。有时，具体方案需要与这些标准测定有一定差异。在这些情况下，实例中指出了与下面这些标准测定方案的差异。
A.性能指数
酶的性能指数(PI)将相同蛋白质浓度下变体的性能(实测值)与标准酶的性能(理论值或实测值)进行比较。此外，可用标准酶的朗缪尔方程的参数来计算理论值。
大于1的性能指数(PI)(PI>1)指示与标准(如，TLL，SEQ ID NO:2)相比变体的性能改善，而PI等于1(PI＝1)则表示变体性能与标准的性能相同，并且PI小于1(PI<1)则表示变体的性能比标准的性能差。
B.对硝基苯基酯的水解测定
测定TLL变体对具有不同烷基链长的三种不同对硝基苯基(pNP)酯底物的脂肪酶活性，以确定TLL变体的链长偏好。表1-1提供了pNP酯底物的详细信息。
使用0.8mM pNP酯来制备具有pNP酯底物的反应乳液，其中将该pNP酯预悬浮于0.05M HEPES(调节至pH 8.2)或0.05M MES(调节至pH 6.0)中的乙醇(5％)中。
将pNP酯/缓冲悬浮液混合并转移至总体积为200μL的包含酶样品的96孔微量滴定板(MTP)中。调节酶样品的稀释度及其转移体积以使该反应保持在线性范围内。在3分钟的周期期间以OD405nm监测释放的pNP的生成，并用空白值(不含酶)进行校正。使用pNP标准曲线来计算每秒生成的pNP产物，然后归一化为孔中添加的酶样品(每mg加入的酶μmol pNP/s)。当使用pH 6.0的对硝基苯基辛酸酯时，将pNP酯/缓冲悬浮液混合并转移至总体积为150μL的包含酶样品的96孔微量滴定板(MTP)中。将滴定板密封并在iEMS摇动器(赛默飞世尔科技公司(Thermo scientific))中于25℃下以900rpm摇动10分钟。温育后，添加包含0.5％Triton X-100的50μL 0.2M HEPES pH8.2。在OD405nm处读取释放的pNP的生成，并用空白值(不含酶)进行校正。
水解性能指数通过将变体酶对特定pNP酯底物的水解与TLL酶(SEQ ID NO:2)对特定pNP酯底物的水解进行比较而测定。
C.洗涤剂稳定性测定
通过在高温下于商业上称为汰渍冷水洗衣液(Tide coldwater liquid)(美国宝洁公司(P&G,US)；热处理的)的10％(v/v)重垢液体(HDL)洗涤剂溶液中对TLL变体进行胁迫处理，来监测TLL变体的加速洗涤剂稳定性。
在96孔PCR板中用10％(v/v)汰渍冷水洗衣液溶液将脂肪酶的发酵原料稀释50倍。混合之后，取7.5μL转移至包含192.5μL pNP辛酸酯底物的96孔板的孔中，并且如B中所述测量活性以生成未经胁迫处理时的值。
将该PCR板密封并在PCR仪中于41℃下温育30分钟。在最终温育之后，使该板于4℃下冷却3分钟，然后再次测量活性。通过将15uL经温育的混合物转移至包含185μL pNP辛酸酯/缓冲悬浮液的96孔板来测定变体酶的活性，并且如B部分中所述测量活性以生成经胁迫处理后的值。
通过将经胁迫处理的变体酶对比未经胁迫处理的变体酶的活性比率与经胁迫处理的TLL酶(SEQ ID NO:2)对比未经胁迫处理的TLL酶的活性比率进行比较，来确定洗涤剂稳定性的性能指数。
D.热稳定性测定
通过在高温下于含有1ppm枯草杆菌蛋白酶BPN’-Y217L蛋白酶的50mM HEPES(pH8.2)中对变体进行胁迫处理，来监测TLL变体的加速热稳定性。将含有蛋白酶的80μL 50mMHEPES(pH 8.2)转移至包含20μL酶样品的96孔PCR板的孔中。混合之后，通过将2μL缓冲液/脂肪酶混合物转移至包含198μL pNP辛酸酯/缓冲悬浮液的96孔板来测定变体酶的活性，并且如B部分中所述测量活性。
将该PCR板密封并在PCR仪中于64℃下温育30分钟。在温育之后，使该板于4℃下冷却3分钟，然后测量活性。通过将4uL经温育的混合物转移至包含196μL pNP辛酸酯/缓冲悬浮液的96孔板来测定变体酶的活性，并且如B部分中所述测量活性。
基于加热后的酶活性除以加热前的酶活性来计算热稳定性活性比率，并且将热稳定性活性比率表示为剩余活性百分比。通过将变体酶的活性比率与经类似处理的TLL酶(SEQ ID NO:2)的活性比率进行比较，测定加速热稳定性的性能指数。
D.LAS稳定性测定
通过在用HEPES缓冲液(pH 8)稀释的0.1％LAS中对变体进行胁迫处理，来监测TLL变体的加速LAS(直链烷基苯磺酸盐，尤其是十二烷基苯磺酸钠，西格玛(Sigma)目录号289957)稳定性。
将80μL 0.1％LAS(w/v)(pH 8.2)转移至包含20μL酶样品的96孔PCR板的孔中。混合之后，通过将2uL缓冲液/脂肪酶混合物转移至包含198μL pNP辛酸酯/缓冲悬浮液的96孔板来测定变体酶的活性，并且如B部分中所述测量活性。
将该PCR板密封并在PCR仪中于25℃下温育30分钟。在温育之后，使该板于4℃下冷却3分钟，然后测量活性。通过将4μL经温育的混合物转移至包含196μL pNP辛酸酯/缓冲悬浮液的96孔板来测定变体酶的活性，并且如B部分中所述测量活性。
基于在LAS中温育后的酶活性除以在不存在LAS的情况下的酶活性来计算LAS稳定性活性比率，并且将LAS稳定性活性比率表示为剩余活性百分比。通过将变体酶的活性比率与经类似处理的TLL酶(SEQ ID NO:2)的活性比率进行比较，测定LAS稳定性的性能指数。
E.CS-61微样本测定
在微样本测定中测试脂肪酶变体的清洁性能。在96孔板格式中使用CS-61样本，该CS-61样本是用牛油和红色染料(荷兰的测试材料中心(Center for Testmaterial,CFT,The Netherlands))染色的预染色棉样本。将样本切割成5mm直径的片并放置到MTP的每个孔中。以三种洗涤剂本底水平检测脂肪酶变体的性能。该三种本底水平为全剂量汰渍冷水洗衣液(在95℃下经三小时的热处理，最终剂量：0.92g/L)，半剂量汰渍冷水洗衣液(在95℃下经三小时的热处理，最终剂量：0.46g/L)，以及添加有辅剂(正十二烷基-β-D-吡喃麦芽糖苷)的半剂量汰渍冷水洗衣液(在95℃下经三小时的热处理，最终剂量：洗涤剂为0.46g/L，辅剂为0.272μM)。
待测试的脂肪酶变体样品获自在MTP板中生长的培养物的经微孔过滤过的发酵液。所用的缓冲液为pH 8.2的20mM HEPES(最终浓度)，并且水硬度被调节为6gpg 2:1Ca:Mg。
将247.5μL体积的HDL洗涤剂溶液(如上所述)添加到96孔板的每个含样本的孔中。为了起始反应，向每个孔添加3.5μL体积的酶样品。将所述板密封并在iEMS摇动器(赛默飞世尔科技(Thermo scientific))中于30℃下以900rpm摇动30分钟。温育后，使用Hydrospeed洗板机(奥地利的帝肯公司(Tecan,Austria))将织物用去离子水漂洗3次，并且在50℃下干燥过夜。使用以扫描仪(MiCrotek Scan Maker 900)测得的经漂洗和干燥的织物的RGB量度对去污效果进行定量分析。将图像导入Photoshop CSII中，其中RGB值使用Reindeer Graphics公司的IPTK 5.0从包含样本的区域提取。使用如下公式计算经过洗涤的织物相对于未洗涤织物的去污百分比(SRI)值：
去污％(SRI)＝(ΔE/ΔE初始)×100
其中
其中
通过将变体酶的SRI与采用相同酶剂量的TLL标准酶(SEQ ID NO:2)的SRI进行比较来计算清洁性能的性能指数。使用朗缪尔拟合来计算酶剂量与变体相同的TLL的SRI。
F.洗涤剂
使用市售的洗涤剂：
汰渍冷水洗衣液(宝洁公司(P&G))。于2010年8月商购并经过热处理(在95℃下处理三小时)以使产品配方中的酶失活。
G.蛋白质确定测定
使用荧光激发转移免疫测定法测定在MTP板中生长的培养物的经过滤发酵液的TLL变体蛋白质浓度。将荧光素标记的TLL抗原与罗丹明标记的抗TLL兔抗体以一定抗原-抗体比率混合，其中荧光素发射被淬灭。当添加到混合物中时，TLL变体蛋白质将竞争结合到所标记的抗TLL抗体，从而导致荧光素发射的增强。荧光素发射的增强与TLL变体蛋白质浓度成正比。
将20μL的过滤掉TLL变体的发酵液转移至包含140μL磷酸盐缓冲盐溶液的黑色平底96孔板中并混合。然后将各20μL的荧光素标记的TLL和罗丹明标记的抗TLL兔抗体转移至板中并混合。在室温下于黑暗中温育30分钟后，使用495nm激发波长和520nm发射波长测量每个孔中的荧光素。使用TLL酶标准物(SEQ ID NO:2)的荧光素发射的线性拟合确定每个TLL变体的蛋白质浓度。
实例2
源自疏棉状嗜热丝孢菌的脂肪酶-3在枯草芽孢杆菌中的克隆和表达
疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶-3(TLL)对应于家族abH23.01，米黑根毛霉脂肪酶样(脂肪酶工程数据库，www.led.uni-stuttgart.de)，具有如PDB:1DT3所示的成熟脂肪酶的氨基酸序列。
TLL合成基因(SEQ ID NO.1)被设计用于在枯草芽孢杆菌中基于TLL的氨基酸序列而表达。TLL基因被亚克隆成复制型pBN类芽孢杆菌属表达载体作为BmtI-HindIII片段，该片段包含aprE启动子、aprE信号序列和BPN’枯草杆菌蛋白酶基因(解淀粉芽孢杆菌)终止子(Babéet al.(1998),Biotechnol.Appl.Biochem.27:117–124(Babé等人，1998年，《生物技术与应用生物化学》，第27卷，第117–124页))。这种载体与合成基因的连接导致TLL多肽的N末端融合至由表达载体编码的枯草芽孢杆菌AprE前肽的第三个氨基酸(在pBN类载体中，信号肽中的-2氨基酸此前经诱变以引入BmtI位点)。在宿主中天然信号肽酶切除之后，以此方式产生的TLL重组蛋白在其氨基末端具有三个额外的氨基酸(Ala-Gly-Lys)。预测信号裂解位点由设置于SignalP-NN系统的Signal P 3.0程序(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)确定(Emanuelsson et al.,(2007),Nature Protocols,2:953-971(Emanuelsson等人，2007年，《自然实验手册》，第2卷，第953-971页))。
为了使TLL基因在枯草芽孢杆菌中表达，通过将寡核苷酸盒(用5’-AATTCCATCGATGCATAAAAAACGCCCGGCGGCAACCGAGCGTTTTTTATTAGAAATCCCTTTGAGAATGTTTATATACATTCAAG退火的5’-GTTACCTTGAATGTATATAAACATTCTCAAAGGGATTTCTAATAAAAAACGCTCGGTTGCCGCCGGGCGTTTTTTATGCATCGATGG)连接到pHY300PLK类载体的BstEII位点和EcoRI位点中，而将pHY300PLK类载体(Takara)与在四环素基因之后引入的转录终止子一起使用。
然后使用BamHI-HindIII连接基(用5’-AGCTCAGGCAGTCAG退火的5-GATCCTGACTGCCTG)将源自pBN类载体的整个TLL表达盒作为EcoRI-BamHI片段克隆到该pHY300PLK类载体的EcoRI位点和HindIII位点，该BamHI-HindIII连接基在克隆后去除了pHY300PLK类载体中的原始HindIII位点。所得载体称为pHYT-TLLwt(图1)。
SEQ ID NO:1示出合成的TLL基因的核苷酸序列：
GCTAGCGCAGCTGGCAAAGAAGTTAGCCAAGATCTGTTCAACCAATTCAACCTTTTCGCTCAATACTCTGCAGCTGCTTACTGCGGAAAGAACAACGATGCACCTGCTGGTACTAACATCACTTGCACAGGTAACGCATGTCCTGAAGTAGAAAAAGCTGATGCTACATTTCTTTACTCTTTTGAAGATAGCGGCGTCGGCGATGTTACCGGTTTCTTAGCTCTGGATAACACAAACAAACTTATCGTCCTTAGCTTCAGAGGCTCTCGCTCAATCGAAAACTGGATCGGTAACCTTAATTTTGACTTGAAAGAAATCAACGATATCTGCTCTGGTTGCCGTGGCCATGACGGATTCACATCATCTTGGAGAAGCGTCGCAGACACGCTTCGCCAAAAAGTAGAAGATGCCGTACGCGAACACCCAGATTACAGAGTAGTTTTCACAGGTCACTCTCTTGGCGGAGCTTTAGCAACAGTAGCAGGCGCTGATCTCCGCGGTAACGGATACGACATTGATGTCTTCTCTTACGGCGCTCCGCGCGTCGGTAACAGAGCGTTTGCTGAATTTTTAACTGTACAAACAGGCGGAACTCTTTATCGCATCACTCACACAAACGATATTGTCCCGCGCTTACCTCCGAGAGAATTTGGTTACTCACACAGCTCTCCTGAATACTGGATCAAAAGCGGTACATTGGTACCTGTTACTCGAAACGATATCGTCAAAATTGAAGGAATTGACGCCACCGGCGGCAACAACCAACCGAACATCCCTGACATCCCGGCACACCTTTGGTACTTCGGCTTAATCGGAACATGCCTTTAAAAGCTT
SEQ ID NO:2示出产生自表达质粒pHYT-TLLwt的TLL的氨基酸序列(AprE信号序列为由Signal P预测的带有下划线的裂解位点)：
MRSKKLWISLLFALTLIFTMAFSNMSASAAGKEVSQDLFNQFNLFAQYSAAAYCGKNNDAPAGTNITCTGNACPEVEKADATFLYSFEDSGVGDVTGFLALDNTNKLIVLSFRGSRSIENWIGNLNFDLKEINDICSGCRGHDGFTSSWRSVADTLRQKVEDAVREHPDYRVVFTGHSLGGALATVAGADLRGNGYDIDVFSYGAPRVGNRAFAEFLTVQTGGTLYRITHTNDIVPRLPPREFGYSHSSPEYWIKSGTLVPVTRNDIVKIEGIDATGGNNQPNIPDIPAHLWYFGLIGTCL
SEQ ID NO:3示出产生自表达质粒pHYT-TLLwt的TLL成熟蛋白质的氨基酸序列，其具有三氨基酸的氨基末端延伸：
AGKEVSQDLFNQFNLFAQYSAAAYCGKNNDAPAGTNITCTGNACPEVEKADATFLYSFEDSGVGDVTGFLALDNTNKLIVLSFRGSRSIENWIGNLNFDLKEINDICSGCRGHDGFTSSWRSVADTLRQKVEDAVREHPDYRVVFTGHSLGGALATVAGADLRGNGYDIDVFSYGAPRVGNRAFAEFLTVQTGGTLYRITHTNDIVPRLPPREFGYSHSSPEYWIKSGTLVPVTRNDIVKIEGIDATGGNNQPNIPDIPAHLWYFGLIGTCL
SEQ ID NO:4示出基于天然存在的基因序列的TLL成熟蛋白质的氨基酸序列：
EVSQDLFNQFNLFAQYSAAAYCGKNNDAPAGTNITCTGNACPEVEKADATFLYSFEDSGVGDVTGFLALDNTNKLIVLSFRGSRSIENWIGNLNFDLKEINDICSGCRGHDGFTSSWRSVADTLRQKVEDAVREHPDYRVVFTGHSLGGALATVAGADLRGNGYDIDVFSYGAPRVGNRAFAEFLTVQTGGTLYRITHTNDIVPRLPPREFGYSHSSPEYWIKSGTLVPVTRNDIVKIEGIDATGGNNQPNIPDIPAHLWYFGLIGTCL
实例3
位点评估文库的创建
位点评估文库(SEL)由GENEART公司使用专有方法创建(WO 2004/059556A3)，并且DNA分子的制备采用GENEART公司所有或授权给GENEART公司的技术(欧洲专利No.0 200362和No.0 201 184；以及美国专利No.4,683,195、No.4,683,202和No.6,472,184)。本实例中描述的TLL SEL的构建由GENEART公司使用其专有的和/或有知识产权的文库创建技术平台来进行。GENEART公司用于产生SEL的顺序排列(permutation)方法在该公司的网站上进行了大致描述。
pHYT-TLLwt质粒DNA充当模板以在天然TLL成熟区域(SEQ ID NO:4)的所有位点处产生SEL。源自TLL重组蛋白(SEQ ID NO:3)中AprE前区域的前三个氨基酸(Ala-Gly-Lys)是未经诱变的。GENEART公司被委托使用他们的标准方案在所有天然TLL位置处创建SEL(位置编号从天然TLL成熟蛋白质的第一个氨基酸开始)。由GENEART公司构造的269个残基中每一个的位置文库包含每个位点大约16个氨基酸置换。所述文库由包含表达质粒的经转化的枯草芽孢杆菌细胞构成，该表达质粒在所述的269个位置处编码TLL变体序列。GENEART公司以96孔板的形式提供文库，每个孔有一种变体，含有冷冻在甘油中的培养物。
在含有10mg/L四环素的胰酶大豆肉汤(TSB)中将包含TLL置换变体的枯草芽孢杆菌转化株在96孔板中培养16小时，并且将10μL的这种预培养物加入到填充有190μL MBD培养基(如下所述)的Corning 3599 MTP中，该培养基补充有25mg/L四环素。将该板在37℃、80％湿度下温育60-65小时，以300rpm恒定旋转混合。通过以2500rpm离心10分钟来收获细胞，并且使用Millipore真空系统通过Millipore Multiscreen过滤板过滤。将培养物上清液用于测定。该培养基(MBD培养基)是基于MOPs缓冲液的富集的半成分确定的培养基，具有尿素作为主要氮源，葡萄糖作为主要碳源，并且补充有1％大豆胨用于茁壮的细胞生长。
实例4
有效位置和可组合突变
有效位置被描述为分子内最适用于形成显示具有改善的特性的组合变体的那些位置，其中所述位置本身允许至少一种可组合突变。可组合突变可被描述为分子中可用于形成组合变体的那些置换。可组合突变是可改善分子的至少一种所需特性，而未明显降低表达、活性或稳定性的突变。
可组合突变是可改善分子的至少一种所需特性，而未明显降低表达、活性或稳定性的突变。TLL多肽中的可组合突变是使用从
实例1中所述的测定得到的性能指数(PI)值确定的，所述测定为：CS-61微样本测定、对硝基苯基酯的水解、在洗涤剂中的稳定性、在LAS中的稳定性和热稳定性。
可组合突变已按照以下标准分组：
其中相对于TLL亲本，其对于表达、pH 8.2下的CS-61微样本活性、pH 6或pH 8.2下对对硝基苯基酯底物的活性、以及洗涤剂稳定性、LAS稳定性或热稳定性的最小性能指数(PI)大于或等于0.9，并且此外这些测试中任一者的PI大于或等于1.0的变体(A组)。
其中相对于TLL亲本，其对于表达、pH 8.2下的CS-61微样本活性、pH 6或pH 8.2下对对硝基苯基酯底物的活性、以及洗涤剂稳定性、LAS稳定性或热稳定性的最小性能指数(PI)大于或等于0.8，并且此外这些测试中任一者的PI大于或等于1.2的变体(B组)。
其中相对于TLL亲本，其对于表达、pH 8.2下的CS-61微样本活性、pH 6或pH 8.2下对对硝基苯基酯底物的活性、以及洗涤剂稳定性、LAS稳定性或热稳定性的最小性能指数(PI)大于或等于0.5，并且此外这些测试中任一者的PI大于或等于1.5的变体(C组)。
A、B和C组还包含对多个置换具有不同容许程度的氨基酸位置。为了鉴定有效位置，我们测量每个位置处容许的置换程度，并且向每个位置分配一个有效性得分。有效性得分是使用如下所述的标准，根据每个位置中落入A组、B组或C组中的置换百分比来分配的。
有效位置被定义为这样的位置，其显示出对多个置换的一定程度的容许，而同时符合下文所述的一组可组合标准。
确定有效位置的有效性得分的标准如下：
其中给定位置处50％或更多的置换落入A组、B组或C组中的位置给予有效性得分“4”。这些位置包括1、2、3、4、5、6、8、9、13、23、24、25、26、27、28、29、33、37、38、39、46、51、52、54、58、64、66、68、69、71、72、75、90、93、94、111、120、122、123、130、131、137、140、162、163、189、250、252和264。
其中给定位置处小于50％但大于或等于30％的置换落入A组、B组或C组中的位置给予有效性得分“3”。这些位置包括18、19、20、30、31、32、47、48、49、50、53、56、60、73、74、85、86、91、95、96、97、98、99、101、105、108、115、125、127、128、132、133、151、159、164、179、183、187、188、190、216、223、232、237、244、251、254、263、267和269。
其中给定位置处小于30％但大于或等于15％的置换落入A组、B组或C组的位置给予有效性得分“2”。这些位置包括
7、11、12、15、22、35、40、42、43、44、45、61、63、65、67、76、77、84、87、114、117、119、121、134、135、136、143、154、155、156、158、165、166、168、176、180、191、199、200、202、209、211、214、217、221、224、225、228、229、231、233、248、249、253、255、256、265和268。
其中给定位置处小于15％的置换落入A组、B组或C组中的位置给予有效性得分“1”。这些位置包括14、16、17、34、41、55、57、59、62、70、79、92、100、102、103、106、109、110、112、118、126、138、139、142、149、152、153、167、169、170、181、184、192、193、196、198、205、206、208、210、212、213、218、226、227、230、236、238、239、242、243、246、257、259、260、262和266。
TLL中落入此前描述的有效性得分“1、2、3和4”内的有效位置列出如下。基于成熟TLL编号的位置列于SEQ ID NO.3中。
1、2、3、4、5、6、7、8、9、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、79、84、85、86、87、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、105、106、108、109、110、111、112、114、115、117、118、119、120、121、122、123、125、126、127、128、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、142、143、149、151、152、153、154、155、156、158、159、162、163、164、165、166、167、168、169、170、176、179、180、181、183、184、187、188、189、190、191、192、193、196、198、199、200、202、205、206、208、209、210、211、212、213、214、216、217、218、221、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、236、237、238、239、242、243、244、246、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、259、260、262、263、264、265、266、267、268和269。
TLL中落入此前描述的有效性得分“2、3和4”内的有效位置列出如下。基于成熟TLL编号的位置列于SEQ ID NO.3中。
1、2、3、4、5、6、7、8、9、11、12、13、15、18、19、20、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、35、37、38、39、40、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、56、58、60、61、63、64、65、66、67、68、69、71、72、73、74、75、76、77、84、85、86、87、90、91、93、94、95、96、97、98、99、101、105、108、111、114、115、117、119、120、121、122、123、125、127、128、130、131、132、133、134、135、136、137、140、143、151、154、155、156、158、159、162、163、164、165、166、168、176、179、180、183、187、188、189、190、191、199、200、202、209、211、214、216、217、221、223、224、225、228、229、231、232、233、237、244、248、249、250、251、252、253、254、255、256、263、264、265、267、268和269。
TLL中落入此前描述的有效性得分“3和4”内的有效位置列出如下。基于成熟TLL编号的位置列于SEQ ID NO.3中。
1、2、3、4、5、6、8、9、13、18、19、20、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、37、38、39、46、47、48、49、50、51、52、53、54、56、58、60、64、66、68、69、71、72、73、74、75、85、86、90、91、93、94、95、96、97、98、99、101、105、108、111、115、120、122、123、125、127、128、130、131、132、133、137、140、151、159、162、163、164、179、183、187、188、189、190、216、223、232、237、244、250、251、252、254、263、264、267和269。
TLL中落入此前描述的有效性得分“4”内的有效位置列出如下。基于成熟TLL编号的位置列于SEQ ID NO.3中。
1、2、3、4、5、6、8、9、13、23、24、25、26、27、28、29、33、37、38、39、46、51、52、54、58、64、66、68、69、71、72、75、90、93、94、111、120、122、123、130、131、137、140、162、163、189、250、252和264。
TLL中落入此前描述的有效性得分“1、2、3和4”内的有效位置以及这些位置中可组合的置换列出如下。基于成熟TLL编号的位置列于SEQ IDNO.3中。
1(E,A,C,D,F,I,L,N,PQ,R,S,T,V,W,Y)；2(V,F,G,H,I,K,L,M,P,T)；3(S,A,D,E,G,H,K,Q,R,T,Y)；4(Q,A,D,F,G,I,K,L,M,N,P,R,S,W,Y)；5(D,H,I,K,L,S,T,V,W,Y)；6(L,A,E,H,I,K,M,Q,T,V,Y)；7(F,H,M,V,Y)；8(N,A,E,G,H,I,K,L,M,T,V,W,Y)；9(Q,A,D,E,G,H,I,K,N,R,W,Y)；11(N,H,K,V,Y)；12(L,F,H,V,W)；13(F,A,H,K,M,N,Q,T,V,Y)；14(A,S,V)；15(Q,G,H,M,S)；16(Y,H,W)；17(S,E)；18(A,C,H,K,M,N,Q,S,W)；19(A,C,G,I,L,T,V,W)；20(A,G,I,P,Q,S,T)；22(C,H,L,M)；23(G,C,D,E,F,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W)；24(K,A,D,E,F,H,I,L,M,N,P,R,T,V,W,Y)；25(N,A,C,D,E,G,H,I,K,L,S,T,V,W)；26(N,C,G,K,L,M,Q,S,T,V,W,Y)；27(D,A,E,F,G,H,I,N,Q,R,S,T,V,Y)；28(A,D,E,F,G,H,I,L,M,N,P,Q,R,S)；29(P,C,E,G,H,I,K,L,M,Q,R,S,T,V,W,Y)；30(A,D,H,L,N,R,V,W)；31(G,D,E,H,M,P,Q,S,V)；32(T,A,I,M,Q,R,S)；33(N,D,E,F,K,L,M,Q,R,S)；34(I,P)；35(T,E,K,R)；37(T,A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,P,Q,R,W,Y)；38(G,A,D,E,F,H,I,K,L,M,NT,V,W,Y)；39(N,C,E,H,I,L,P,Q,S,T,V,W,Y)；40(A,F,M,S,W)；41(C,V)；42(P,C,G,I,V,W)；43(E,D,I,M,R,T)；44(V,H,I,T)；45(E,F,Q,V)；46(K,D,E,F,G,L,M,V,W)；47(A,D,E,F,H,M,T,W)；48(D,E,G,H,L,P,Q)；49(A,G,H,K,L,V,W)；50(T,A,D,F,K,L,R,S,W)；51(F,A,D,E,G,I,L,M,N,P,R,S,T,Y)；52(L,A,E,G,I,M,R,T,V,W)；53(Y,E,G,H,K,L,S,W)；54(S,E,F,G,H,K,M,P,R,T,VW,Y)；55(F,G,W)；56(E,H,K,R,T,V)；57(D,S)；58(S,D,G,H,I,K,M,Q,R,W)；59(G,D)；60(V,G,K,L,Y)；61(G,A,D,L,R)；62(D,N)；63(V,K,Q,T)；64(T,C,D,E,G,I,K,L,N,R,V,Y)；65(G,L,V,Y)；66(F,A,G,H,I,L,M,N,Q,R,S,T,VW,Y)；67(L,H,I,Q,V)；68(A,C,G,I,S,T,V,W,Y)；69(L,A,D,G,H,I,K,N,S,T,W)；70(D,S)；71(N,D,E,H,K,Q,R,S,T,V,W,Y)；72(T,A,D,E,F,H,I,K,L,N,P,R,S,V,Y)；73(N,E,G,H,K,R,S)；74(K,A,D,E,G,H,N,Q,S)；75(L,A,D,E,G,H,I,M,N,Q,R,S,T,V,Y)；76(I,H,S,V)；77(V,A,I,L,N,T)；79(S,A,M)；84(R,H,Q,W)；85(S,F,H,I,N,Q,T)；86(I,L,M,P,Q,T,V,Y)；87(E,A,D,G,P,V)；90(I,A,E,F,N,Q,T,V,Y)；91(G,E,F,H,I,M,Q,R)；92(N,A,T)；93(L,D,H,I,K,N,P,Q,R,V,W)；94(N,D,G,K,M,P,R,S,T,V)；95(F,G,H,K,L,Q,T,V,W)；96(D,A,K,P,R,V)；97(L,A,D,I,M,Q,T)；98(K,D,E,H,I,M,Q)；99(E,D,K,P,Q,S,T,W)；100(I,M)；101(N,C,D,E,H,M,Y)；102(D,H)；103(I,Y)；105(S,A,D,E,F,K,P,W)；106(G,H)；108(R,E,F,K,M,Q,Y)；109(G,T)；110(H,N,S)；111(D,A,E,F,L,Q,T,V,W)；112(G,F,Q)；114(T,F,I,M,V)；115(S,G,I,L,M,N,R,T,V)；117(W,H,K,Q,V)；118(R,P)；119(S,D,I,Q,T,V)；120(V,G,H,I,N,S,W,Y)；121(A,K,Q)；122(D,A,E,F,H,I,N,S,T,Y)；123(T,E,G,I,K,L,M,N,Q,W)；125(R,C,G,I,N,Q,T,Y)；126(Q,I,M)；127(K,D,E,F,G,R,T)；128(V,C,H,I,L,N,S,W,Y)；130(D,A,C,E,F,G,H,Q,R,T,V,W,Y)；131(A,C,H,I,K,N,Q,R,S,T,W,Y)；132(V,C,D,H,I,K,Q,R,W)；133(R,E,F,I,N,Q,V)；134(E,L,P,V)；135(H,F,K,T)；136(P,D,Q,R)；137(D,A,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y)；138(Y,F)；139(RLT)；140(V,C,E,F,I,L,M,N,Q,T)；142(F,H,Y)；143(T,A,G,N,S)；149(G,A)；151(L,I,M,N,P,T,V,W)；152(A,I,V)；153(T,S)；154(V,F,I,L,M,Y)；155(A,G,S,T)；156(G,F,M,T,W)；158(D,E,F,Y)；159(L,E,M,Q,R,W)；162(N,D,E,F,G,H,I,K,M,P,Q,R,S,Y)；163(G,A,F,L,M,N,P,R,S,W,Y)；164(Y,D,N,R,S,V)；165(D,I,P,Y)；166(I,D,G,W)；167(D,N)；168(V,G,L,Q)；169(F,S,Y)；170(S,G)；176(V,F,I,L,N,W)；179(R,E,H,I,K,L,Q,V)；180(A,D,K,Q,T)；181(F,L)；183(E,H,M,Q,S,T,V,Y)；184(F,W,Y)；187(V,G,H,L,N,Q,S,T,W)；188(Q,C,E,F,H,R,T)；189(T,D,E,G,K,M,N,Q,R,S,V)；190(G,D,H,R,S,Y)；191(G,F,L,V)；192(T,N,P)；193(L,T)；196(I,V)；198(H,G,S)；199(T,G,N,V)；200(N,A,P,S)；202(I,L,M,P,V)；205(R,D)；206(L,N)；208(P,E,N)；209(R,H,S,T)；210(E,S)；211(F,I,R,T,W)；212(G,Q)；213(Y,S)；214(S,A,D,M)；216(S,D,G,N,Q,V,W)；217(S,H,K,V)；218(P,T)；221(W,F,G,Y)；223(K,A,H,L,M,Q,S,T,V)；224(S,A,F,P)；225(G,C,E,K,R)；226(T,D,N)；227(L,C,H,M)；228(V,A,E,R)；229(P,I,K,M,S)；230(V,W)；231(T,G,H,K,L,M)；232(R,C,D,I,L,M,P,T,W)；233(N,D,G,H,Q)；236(V,W)；237(K,E,H,I,L,T,W,Y)；238(I,V)；239(E,K)；242(D,T)；243(A,S)；244(T,A,F,I,L,M,P,Q,S)；246(G,I)；248(N,D,L,Y)；249(Q,E,G,T)；250(P,D,E,G,K,Q,R,S,T)；251(N,D,M,Q,S,T,W,Y)；252(I,A,C,D,E,F,G,H,K,L,N,Q,R,S,T,W)；253(P,F,H,N,R)；254(D,A,H,K,N,P,T)；255(I,F,L,W)；256(P,A,D,S,T)；257(A,W,Y)；259(L,W,Y)；260(W,P)；262(F,D,K)；263(G,C,H,I,K,M,V)；264(L,C,E,G,H,M,N,P,Q,R,S,T)；265(I,L,M,Q,R,W)；266(G,E)；267(T,G,I,L,M,P,W)；268(C,D,H,N)；以及269(L,D,F,M,Q,V,W)。
TLL中落入此前描述的有效性得分“2、3和4”内的有效位置以及这些位置中可组合的置换列出如下。基于成熟TLL编号的位置列于SEQ ID NO.3中。
1(E,A,C,D,F,I,L,N,PQ,R,S,T,V,W,Y)；2(V,F,G,H,I,K,L,M,P,T)；3(S,A,D,E,G,H,K,Q,R,T,Y)；4(Q,A,D,F,G,I,K,L,M,N,P,R,S,W,Y)；5(D,H,I,K,L,S,T,V,W,Y)；6(L,A,E,H,I,K,M,Q,T,V,Y)；7(F,H,M,V,Y)；8(N,A,E,G,H,I,K,L,M,T,V,W,Y)；9(Q,A,D,E,G,H,I,K,N,R,W,Y)；11(N,H,K,V,Y)；12(L,F,H,V,W)；13(F,A,H,K,M,N,Q,T,V,Y)；15(Q,G,H,M,S)；18(A,C,H,K,M,N,Q,S,W)；19(A,C,G,I,L,T,V,W)；20(A,G,I,P,Q,S,T)；22(C,H,L,M)；23(G,C,D,E,F,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W)；24(K,A,D,E,F,H,I,L,M,N,P,R,T,V,W,Y)；25(N,A,C,D,E,G,H,I,K,L,S,T,V,W)；26(N,C,G,K,L,M,Q,S,T,V,W,Y)；27(D,A,E,F,G,H,I,N,Q,R,S,T,V,Y)；28(A,D,E,F,G,H,I,L,M,N,P,Q,R,S)；29(P,C,E,G,H,I,K,L,M,Q,R,S,T,V,W,Y)；30(A,D,H,L,N,R,V,W)；31(G,D,E,H,M,P,Q,S,V)；32(T,A,I,M,Q,R,S)；33(N,D,E,F,K,L,M,Q,R,S)；35(T,E,K,R)；37(T,A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,P,Q,R,W,Y)；38(G,A,D,E,F,H,I,K,L,M,NT,V,W,Y)；39(N,C,E,H,I,L,P,Q,S,T,V,W,Y)；40(A,F,M,S,W)；42(P,C,G,I,V,W)；43(E,D,I,M,R,T)；44(V,H,I,T)；45(E,F,Q,V)；46(K,D,E,F,G,L,M,V,W)；47(A,D,E,F,H,M,T,W)；48(D,E,G,H,L,P,Q)；49(A,G,H,K,L,V,W)；50(T,A,D,F,K,L,R,S,W)；51(F,A,D,E,G,I,L,M,N,P,R,S,T,Y)；52(L,A,E,G,I,M,R,T,V,W)；53(Y,E,G,H,K,L,S,W)；54(S,E,F,G,H,K,M,P,R,T,VW,Y)；56(E,H,K,R,T,V)；58(S,D,G,H,I,K,M,Q,R,W)；60(V,G,K,L,Y)；61(G,A,D,L,R)；63(V,K,Q,T)；64(T,C,D,E,G,I,K,L,N,R,V,Y)；65(G,L,V,Y)；66(F,A,G,H,I,L,M,N,Q,R,S,T,VW,Y)；67(L,H,I,Q,V)；68(A,C,G,I,S,T,V,W,Y)；69(L,A,D,G,H,I,K,N,S,T,W)；71(N,D,E,H,K,Q,R,S,T,V,W,Y)；72(T,A,D,E,F,H,I,K,L,N,P,R,S,V,Y)；73(N,E,G,H,K,R,S)；74(K,A,D,E,G,H,N,Q,S)；75(L,A,D,E,G,H,I,M,N,Q,R,S,T,V,Y)；76(I,H,S,V)；77(V,A,I,L,N,T)；84(R,H,Q,W)；85(S,F,H,I,N,Q,T)；86(I,L,M,P,Q,T,V,Y)；87(E,A,D,G,P,V)；90(I,A,E,F,N,Q,T,V,Y)；91(G,E,F,H,I,M,Q,R)；93(L,D,H,I,K,N,P,Q,R,V,W)；94(N,D,G,K,M,P,R,S,T,V)；95(F,G,H,K,L,Q,T,V,W)；96(D,A,K,P,R,V)；97(L,A,D,I,M,Q,T)；98(K,D,E,H,I,M,Q)；99(E,D,K,P,Q,S,T,W)；101(N,C,D,E,H,M,Y)；105(S,A,D,E,F,K,P,W)；108(R,E,F,K,M,Q,Y)；111(D,A,E,F,L,Q,T,V,W)；114(T,F,I,M,V)；115(S,G,I,L,M,N,R,T,V)；117(W,H,K,Q,V)；119(S,D,I,Q,T,V)；120(V,G,H,I,N,S,W,Y)；121(A,K,Q)；122(D,A,E,F,H,I,N,S,T,Y)；123(T,E,G,I,K,L,M,N,Q,W)；125(R,C,G,I,N,Q,T,Y)；127(K,D,E,F,G,R,T)；128(V,C,H,I,L,N,S,W,Y)；130(D,A,C,E,F,G,H,Q,R,T,V,W,Y)；131(A,C,H,I,K,N,Q,R,S,T,W,Y)；132(V,C,D,H,I,K,Q,R,W)；133(R,E,F,I,N,Q,V)；134(E,L,P,V)；135(H,F,K,T)；136(P,D,Q,R)；137(D,A,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y)；140(V,C,E,F,I,L,M,N,Q,T)；143(T,A,G,N,S)；151(L,I,M,N,P,T,V,W)；154(V,F,I,L,M,Y)；155(A,G,S,T)；156(G,F,M,T,W)；158(D,E,F,Y)；159(L,E,M,Q,R,W)；162(N,D,E,F,G,H,I,K,M,P,Q,R,S,Y)；163(G,A,F,L,M,N,P,R,S,W,Y)；164(Y,D,N,R,S,V)；165(D,I,P,Y)；166(I,D,G,W)；168(V,G,L,Q)；176(V,F,I,L,N,W)；179(R,E,H,I,K,L,Q,V)；180(A,D,K,Q,T)；183(E,H,M,Q,S,T,V,Y)；187(V,G,H,L,N,Q,S,T,W)；188(Q,C,E,F,H,R,T)；189(T,D,E,G,K,M,N,Q,R,S,V)；190(G,D,H,R,S,Y)；191(G,F,L,V)；199(T,G,N,V)；200(N,A,P,S)；202(I,L,M,P,V)；209(R,H,S,T)；211(F,I,R,T,W)；214(S,A,D,M)；216(S,D,G,N,Q,V,W)；217(S,H,K,V)；221(W,F,G,Y)；223(K,A,H,L,M,Q,S,T,V)；224(S,A,F,P)；225(G,C,E,K,R)；227(L,C,H,M)；228(V,A,E,R)；229(P,I,K,M,S)；231(T,G,H,K,L,M)；232(R,C,D,I,L,M,P,T,W)；233(N,D,G,H,Q)；237(K,E,H,I,L,T,W,Y)；244(T,A,F,I,L,M,P,Q,S)；248(N,D,L,Y)；249(Q,E,G,T)；250(P,D,E,G,K,Q,R,S,T)；251(N,D,M,Q,S,T,W,Y)；252(I,A,C,D,E,F,G,H,K,L,N,Q,R,S,T,W)；253(P,F,H,N,R)；254(D,A,H,K,N,P,T)；255(I,F,L,W)；256(P,A,D,S,T)；263(G,C,H,I,K,M,V)；264(L,C,E,G,H,M,N,P,Q,R,S,T)；265(I,L,M,Q,R,W)；267(T,G,I,L,M,P,W)；268(C,D,H,N)；以及269(L,D,F,M,Q,V,W)。
TLL中落入此前描述的有效性得分“3和4”内的有效位置以及这些位置中可组合的置换列出如下。基于成熟TLL编号的位置列于SEQ ID NO.3中。
1(E,A,C,D,F,I,L,N,PQ,R,S,T,V,W,Y)；2(V,F,G,H,I,K,L,M,P,T)；3(S,A,D,E,G,H,K,Q,R,T,Y)；4(Q,A,D,F,G,I,K,L,M,N,P,R,S,W,Y)；5(D,H,I,K,L,S,T,V,W,Y)；6(L,A,E,H,I,K,M,Q,T,V,Y)；8(N,A,E,G,H,I,K,L,M,T,V,W,Y)；9(Q,A,D,E,G,H,I,K,N,R,W,Y)；13(F,A,H,K,M,N,Q,T,V,Y)；18(A,C,H,K,M,N,Q,S,W)；19(A,C,G,I,L,T,V,W)；20(A,G,I,P,Q,S,T)；23(G,C,D,E,F,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W)；24(K,A,D,E,F,H,I,L,M,N,P,R,T,V,W,Y)；25(N,A,C,D,E,G,H,I,K,L,S,T,V,W)；26(N,C,G,K,L,M,Q,S,T,V,W,Y)；27(D,A,E,F,G,H,I,N,Q,R,S,T,V,Y)；28(A,D,E,F,G,H,I,L,M,N,P,Q,R,S)；29(P,C,E,G,H,I,K,L,M,Q,R,S,T,V,W,Y)；30(A,D,H,L,N,R,V,W)；31(G,D,E,H,M,P,Q,S,V)；32(T,A,I,M,Q,R,S)；33(N,D,E,F,K,L,M,Q,R,S)；37(T,A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,P,Q,R,W,Y)；38(G,A,D,E,F,H,I,K,L,M,NT,V,W,Y)；39(N,C,E,H,I,L,P,Q,S,T,V,W,Y)；46(K,D,E,F,G,L,M,V,W)；47(A,D,E,F,H,M,T,W)；48(D,E,G,H,L,P,Q)；49(A,G,H,K,L,V,W)；50(T,A,D,F,K,L,R,S,W)；51(F,A,D,E,G,I,L,M,N,P,R,S,T,Y)；52(L,A,E,G,I,M,R,T,V,W)；53(Y,E,G,H,K,L,S,W)；54(S,E,F,G,H,K,M,P,R,T,VW,Y)；56(E,H,K,R,T,V)；58(S,D,G,H,I,K,M,Q,R,W)；60(V,G,K,L,Y)；64(T,C,D,E,G,I,K,L,N,R,V,Y)；66(F,A,G,H,I,L,M,N,Q,R,S,T,VW,Y)；68(A,C,G,I,S,T,V,W,Y)；69(L,A,D,G,H,I,K,N,S,T,W)；71(N,D,E,H,K,Q,R,S,T,V,W,Y)；72(T,A,D,E,F,H,I,K,L,N,P,R,S,V,Y)；73(N,E,G,H,K,R,S)；74(K,A,D,E,G,H,N,Q,S)；75(L,A,D,E,G,H,I,M,N,Q,R,S,T,V,Y)；85(S,F,H,I,N,Q,T)；86(I,L,M,P,Q,T,V,Y)；90(I,A,E,F,N,Q,T,V,Y)；91(G,E,F,H,I,M,Q,R)；93(L,D,H,I,K,N,P,Q,R,V,W)；94(N,D,G,K,M,P,R,S,T,V)；95(F,G,H,K,L,Q,T,V,W)；96(D,A,K,P,R,V)；97(L,A,D,I,M,Q,T)；98(K,D,E,H,I,M,Q)；99(E,D,K,P,Q,S,T,W)；101(N,C,D,E,H,M,Y)；105(S,A,D,E,F,K,P,W)；108(R,E,F,K,M,Q,Y)；111(D,A,E,F,L,Q,T,V,W)；115(S,G,I,L,M,N,R,T,V)；120(V,G,H,I,N,S,W,Y)；122(D,A,E,F,H,I,N,S,T,Y)；123(T,E,G,I,K,L,M,N,Q,W)；125(R,C,G,I,N,Q,T,Y)；127(K,D,E,F,G,R,T)；128(V,C,H,I,L,N,S,W,Y)；130(D,A,C,E,F,G,H,Q,R,T,V,W,Y)；131(A,C,H,I,K,N,Q,R,S,T,W,Y)；132(V,C,D,H,I,K,Q,R,W)；133(R,E,F,I,N,Q,V)；137(D,A,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y)；140(V,C,E,F,I,L,M,N,Q,T)；151(L,I,M,N,P,T,V,W)；159(L,E,M,Q,R,W)；162(N,D,E,F,G,H,I,K,M,P,Q,R,S,Y)；163(G,A,F,L,M,N,P,R,S,W,Y)；164(Y,D,N,R,S,V)；179(R,E,H,I,K,L,Q,V)；183(E,H,M,Q,S,T,V,Y)；187(V,G,H,L,N,Q,S,T,W)；188(Q,C,E,F,H,R,T)；189(T,D,E,G,K,M,N,Q,R,S,V)；190(G,D,H,R,S,Y)；216(S,D,G,N,Q,V,W)；223(K,A,H,L,M,Q,S,T,V)；232(R,C,D,I,L,M,P,T,W)；237(K,E,H,I,L,T,W,Y)；244(T,A,F,I,L,M,P,Q,S)；250(P,D,E,G,K,Q,R,S,T)；251(N,D,M,Q,S,T,W,Y)；252(I,A,C,D,E,F,G,H,K,L,N,Q,R,S,T,W)；254(D,A,H,K,N,P,T)；256(P,A,D,S,T)；263(G,C,H,I,K,M,V)；264(L,C,E,G,H,M,N,P,Q,R,S,T)；267(T,G,I,L,M,P,W)；以及269(L,D,F,M,Q,V,W)。
TLL中落入此前描述的有效性得分“4”内的有效位置以及这些位置中可组合的置换列出如下。基于成熟TLL编号的位置列于SEQ ID NO.3中。
1(E,A,C,D,F,I,L,N,PQ,R,S,T,V,W,Y)；2(V,F,G,H,I,K,L,M,P,T)；3(S,A,D,E,G,H,K,Q,R,T,Y)；4(Q,A,D,F,G,I,K,L,M,N,P,R,S,W,Y)；5(D,H,I,K,L,S,T,V,W,Y)；6(L,A,E,H,I,K,M,Q,T,V,Y)；8(N,A,E,G,H,I,K,L,M,T,V,W,Y)；9(Q,A,D,E,G,H,I,K,N,R,W,Y)；13(F,A,H,K,M,N,Q,T,V,Y)；23(G,C,D,E,F,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W)；24(K,A,D,E,F,H,I,L,M,N,P,R,T,V,W,Y)；25(N,A,C,D,E,G,H,I,K,L,S,T,V,W)；26(N,C,G,K,L,M,Q,S,T,V,W,Y)；27(D,A,E,F,G,H,I,N,Q,R,S,T,V,Y)；28(A,D,E,F,G,H,I,L,M,N,P,Q,R,S)；29(P,C,E,G,H,I,K,L,M,Q,R,S,T,V,W,Y)；33(N,D,E,F,K,L,M,Q,R,S)；37(T,A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,P,Q,R,W,Y)；38(G,A,D,E,F,H,I,K,L,M,NT,V,W,Y)；39(N,C,E,H,I,L,P,Q,S,T,V,W,Y)；46(K,D,E,F,G,L,M,V,W)；51(F,A,D,E,G,I,L,M,N,P,R,S,T,Y)；52(L,A,E,G,I,M,R,T,V,W)；54(S,E,F,G,H,K,M,P,R,T,VW,Y)；58(S,D,G,H,I,K,M,Q,R,W)；64(T,C,D,E,G,I,K,L,N,R,V,Y)；66(F,A,G,H,I,L,M,N,Q,R,S,T,VW,Y)；68(A,C,G,I,S,T,V,W,Y)；69(L,A,D,G,H,I,K,N,S,T,W)；71(N,D,E,H,K,Q,R,S,T,V,W,Y)；72(T,A,D,E,F,H,I,K,L,N,P,R,S,V,Y)；75(L,A,D,E,G,H,I,M,N,Q,R,S,T,V,Y)；90(I,A,E,F,N,Q,T,V,Y)；93(L,D,H,I,K,N,P,Q,R,V,W)；94(N,D,G,K,M,P,R,S,T,V)；111(D,A,E,F,L,Q,T,V,W)；120(V,G,H,I,N,S,W,Y)；122(D,A,E,F,H,I,N,S,T,Y)；123(T,E,G,I,K,L,M,N,Q,W)；130(D,A,C,E,F,G,H,Q,R,T,V,W,Y)；131(A,C,H,I,K,N,Q,R,S,T,W,Y)；137(D,A,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y)；140(V,C,E,F,I,L,M,N,Q,T)；162(N,D,E,F,G,H,I,K,M,P,Q,R,S,Y)；163(G,A,F,L,M,N,P,R,S,W,Y)；189(T,D,E,G,K,M,N,Q,R,S,V)；250(P,D,E,G,K,Q,R,S,T)；252(I,A,C,D,E,F,G,H,K,L,N,Q,R,S,T,W)；以及264(L,C,E,G,H,M,N,P,Q,R,S,T)。
在后续研究中，TLL中有效位置的额外置换经过测试并被发现是可组合的。这些位置中的可组合的额外置换列出如下。基于成熟TLL编号的位置列于SEQ ID NO.3中。
11(A,E,I)、23(A)、24(Q,S)、27(K,L)、29(N)、30(E,G,I,S,Y)、31(T)、33(C,I,P,T,V)、45(A,G,S,T)、48(N,R,T,V)、49(C,Y)、50(M)、51(H,V)、56(A,M,N,S)、58(A,F)、71(C,F,P)、73(Q,T)、74(I,M,T,W)、75(K)、91(K,N,Y)、94(A,H)、101(A)、108(A)、111(G,H,I,K,M,S,Y)、122(K,L,Q)、128(T,V)、130(K,M)、133(D,H,L,W)、135(A,D,M,N,Y)、140(Y)、159(G)、163(Q)、183(C)、187(C,I)、188(A,M,W)、190(W)、227(A,I,S)、233(F,I,V)、251(V)、252(M,V)。
实例5
可组合突变和适宜性得分
如实例3所示，TLL中的可组合突变是使用从实例1中所述的测定得到的性能指数(PI)值确定的，所述测定为：CS-61微样本测定、对硝基苯基酯的水解(活性)、洗涤剂稳定性、LAS稳定性和热稳定性的测定，以及蛋白质确定(表达)。根据实例3中所示的标准将可组合突变分配至A组、B组或C组。基于其中出现这些置换的组(A、B、C)为所述置换进一步分配适宜性得分，并且其中越高的适宜性得分代表置换越适用于形成可组合的变体。适宜性得分在表5.1中有所定义。TLL中符合上述标准的各个置换的适宜性得分记录于表5.2中。
表5.1定义各个适宜性得分与可组合突变和有效位置的组之间的关系。
表5.2列出了TLL中各个置换的适宜性得分。基于成熟TLL编号的位置列于SEQ IDNO:3中。
实例6
表面修饰
表5.1中示出了有助于实现有利的表面修饰的位置和置换，所述有利的表面修饰诸如TLL的改变的电荷或疏水性。包含所有可组合置换的有效位置是使用如实例3中所述的有效位置标准来确定的。进一步分析数据以确定改变了疏水性或电荷并维持所有重要特性的置换。每个置换的疏水性是使用White和Wimley的方法(White,S.H.and Wimley,W.C.,Annu.Rev.Biophys.Biomol.Strut.28:319-65,(1999)(White,S.H.和Wimley,W.C.，《生物物理学与生物分子结构年评》，第28卷，第319-365页，1999年))确定的。在TLL中显示出有利的表面修饰的可组合位置和置换的子组示于表6.1中。
表6.1示出了显示出有利的表面修饰的置换。基于成熟TLL编号的位置列于SEQ IDNO:3中。
实例7
基于洗涤剂性能的可组合突变
TLL中额外的可组合突变是使用从CS-61微样本测定(以半剂量、半剂量+辅剂或全剂量进行)、洗涤剂稳定性和蛋白质确定(表达)得到的性能指数(PI)值来确定的。表7.1列出了相对于TLL亲本显示出表达的性能指数(PI)≥0.8、洗涤剂稳定性的性能指数(PI)≥0.8并且在半剂量、半剂量+辅剂或全剂量下洗涤剂性能的性能指数(PI)≥1.1的可组合位置和置换。基于成熟TLL编号的位置列于SEQ ID NO:3中。
实例8
基于稳定性的可组合突变
TLL中额外的可组合突变是使用从热稳定性、洗涤剂稳定性或LAS稳定性测定、pH8下pNPO底物的水解以及蛋白质确定(表达)得到的性能指数(PI)值来确定的。表8.1列出了相对于TLL亲本显示出表达的性能指数(PI)≥0.8、pH 8下pNPO底物水解的性能指数(PI)≥0.8并且热稳定性、洗涤剂稳定性或LAS稳定性的性能指数(PI)≥1.1的可组合位置和置换。基于成熟TLL编号的位置列于SEQ ID NO:3中。
实例9
基于酯水解的可组合突变
TLL中额外的可组合突变是使用从pH 8下pNPB、pNPO和pNPP底物的水解、热稳定性和蛋白质确定(表达)得到的性能指数(PI)值来确定的。表9.1列出了相对于TLL亲本显示出表达的性能指数(PI)≥0.8、热稳定性的性能指数≥0.8并且pNPB水解的性能指数(PI)≥1.1，或者pNPO水解的性能指数≥1.1，或者pNPP水解的性能指数(PI)≥1.1，或者pNPB和pNPO水解的性能指数(PI)≥1.1，或者pNPO和pNPP水解的性能指数(PI)≥1.1，或者pNPB、pNPO和pNPP水解的性能指数(PI)≥1.1的可组合位置和置换。基于成熟TLL编号的位置列于SEQ ID NO:3中。
实例10
基于变化的C4:C16底物水解比率的可组合突变
TLL中额外的可组合突变是使用从pH 8下pNPB和pNPP底物的水解、热稳定性和蛋白质确定(表达)得到的性能指数(PI)值来确定的。表10.1列出了相对于TLL亲本显示出表达的性能指数(PI)≥0.8、热稳定性的性能指数(PI)≥0.8、并且pNPB水解的性能指数(PI)≤0.8和pNPP水解的性能指数(PI)≥1的可组合位置和置换。基于成熟TLL编号的位置列于SEQ ID NO:3中。
实例11
基于低pH下的水解的可组合突变
TLL中额外的可组合突变是使用从pH 6下pNPO的水解、热稳定性和蛋白质确定(表达)得到的性能指数(PI)值来确定的。表11.1列出了相对于TLL亲本显示出表达的性能指数(PI)≥0.8、热稳定性的性能指数(PI)≥0.8并且pH 6下pNPO水解的性能指数(PI)≥1.1的可组合位置和置换。基于成熟TLL编号的位置列于SEQ ID NO:3中。
实例12
不同水平的辅剂中脂肪酶活性的测试
在存在不同水平的四种辅剂化合物(表12.1)的情况下测定TLL亲本酶的酯酶活性。每种辅剂以对应于其临界胶束浓度(CMC)、半CMC或四分之一CMC的浓度在pH 8.2的0.05M HEPES缓冲液中混合，其中增加了6gpg水硬度。如上文在实例1B中所述，测量pNP辛酸酯的水解速率。对于所有四种辅剂化合物，相较于全CMC水平或二分之一CMC水平时，TLL亲本酶的酯酶活性在四分之一CMC水平时显著较高(图1)。
表12.1：

Claims (25)

1.一种衍生自疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)亲本脂肪酶TLL的脂肪酶变体，其中所述变体与亲本脂肪酶的区别在于位置187处的氨基酸修饰187(G,H,N,Q,S,T,W)，其中相对于TLL亲本其对于表达和洗涤剂稳定性的最小性能指数(PI)大于或等于0.8，并且其中相对于TLL亲本其清洁性能的最小PI大于或等于1.1，其中所述脂肪酶变体的氨基酸位置根据与SEQ ID NO:4中所示脂肪酶TLL的氨基酸序列的对应关系来进行编号，并且其中所述脂肪酶变体的氨基酸序列与SEQ ID NO:4具有至少95％的序列同一性。
2.权利要求1的脂肪酶变体，其中相对于TLL亲本对于半剂量的清洁性能的最小PI大于或等于1.1。
3.权利要求1的脂肪酶变体，其中相对于TLL亲本对于半剂量并具有辅剂下的清洁性能的最小PI大于或等于1.1。
4.权利要求1的脂肪酶变体，其中相对于TLL亲本对于全剂量下的清洁性能的最小PI大于或等于1.1，并且其中所述修饰包含187(T)，其中所述脂肪酶变体的氨基酸序列与SEQ IDNO:4具有至少95％的序列同一性。
5.一种清洁组合物，包含至少一种根据权利要求1-4中任一项所述的脂肪酶变体。
6.根据权利要求5所述的清洁组合物，其中所述清洁组合物为颗粒、粉末、固体、条棒、液体、片剂、凝胶或糊剂组合物。
7.根据权利要求5或6所述的清洁组合物，其中所述清洁组合物为洗涤剂组合物。
8.根据权利要求5或6所述的清洁组合物，其中所述清洁组合物为衣物洗涤剂组合物、餐具洗涤剂组合物或硬质表面清洁组合物。
9.根据权利要求8所述的清洁组合物，其中所述餐具洗涤剂为手动餐具洗涤剂组合物或自动餐具洗涤剂组合物。
10.根据权利要求8所述的清洁组合物，其中所述清洁组合物为衣物洗涤剂组合物。
11.根据权利要求5或6所述的清洁组合物，还包含至少一种漂白剂。
12.根据权利要求5或6所述的清洁组合物，其中所述清洁组合物不含磷酸盐。
13.根据权利要求5或6所述的清洁组合物，其中所述清洁组合物含有磷酸盐。
14.根据权利要求5或6所述的清洁组合物，还包含至少一种另外的酶。
15.根据权利要求14所述的清洁组合物，其中所述另外的酶选自半纤维素酶、纤维素酶、过氧化物酶、脂解酶、金属脂解酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、过水解酶、角质酶、果胶酶、果胶酸裂解酶、甘露聚糖酶、角蛋白酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂氧合酶、木质素酶、支链淀粉酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、麦拉宁酶(malanase)、β-葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明质酸酶、软骨素酶、漆酶和淀粉酶。
16.一种清洁方法，包括用包含至少一种根据权利要求1-4中任一项所述的脂解酶变体的清洁组合物来接触表面或物品。
17.一种清洁方法，包括用权利要求5-15中任一项示出的清洁组合物来接触表面或物品。
18.权利要求16或17所述的方法，还包括在用所述清洁组合物分别接触所述表面或物品之后漂洗所述表面或物品。
19.根据权利要求16或17所述的方法，其中所述物品为餐具。
20.根据权利要求16或17所述的方法，其中所述物品为织物。
21.根据权利要求16或17所述的方法，还包括在用所述清洁组合物接触所述表面或物品之后漂洗所述表面或物品的步骤。
22.根据权利要求21所述的方法，还包括在所述表面或物品的所述漂洗之后干燥所述表面或物品的步骤。
23.一种清洁表面或物品的方法，包括：提供权利要求5-15中任一项示出的所述清洁组合物和需要清洁的表面或物品；以及在适于所述表面或物品的所述表面的清洗的条件下，用需要清洁的所述表面或物品接触所述清洁组合物，以产生洁净的表面或物品。
24.根据权利要求23所述的方法，还包括漂洗所述洁净的表面或物品以产生漂洗过的表面或物品的步骤。
25.根据权利要求23所述的方法，还包括干燥所述洁净的表面或物品的步骤。
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