ES2323947T3 - Variante de enzima lipolitica. - Google Patents
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Classifications
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Abstract
Enzima lipolítica que: a) tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 80% de homología con la SEC ID Nº: 1, y que en comparación con la SEC ID Nº: 1 comprende una sustitución correspondiente a L227F/P/GN, y b) es más termoestable que la enzima lipolítica que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 1.
Description
Variante de enzima lipolítica.
La presente invención se refiere a enzimas
fúngicas lipolíticas, con termostabilidad mejorada, y a métodos de
producción y uso de enzimas de este tipo.
Es conocido el uso de enzimas fúngicas
lipolíticas, p. ej. la lipasa de Thermomyces lanuginosus
(sinónimo Humicola lanuginosa), para varios objetivos
industriales, p. ej. para mejorar la eficacia de detergentes y para
eliminar problemas de resina en la producción de pulpa y papel. En
algunas situaciones es deseable una enzima lipolítica con
termostabilidad mejorada (EP 374700, WO 9213130).
WO 92/05249, WO 92/19726 y WO 97/07202 describen
variantes de la lipasa de T. lanuginosus (H.
lanuginosa).
Los inventores han descubierto que la
termostabilidad de una enzima fúngica lipolítica puede ser mejorada
por sustituciones determinadas específicas en la secuencia de
aminoácidos.
Por consiguiente, la invención proporciona una
enzima lipolítica que:
- a)
- tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 80% de homología con la SEC ID Nº: 1, y que en comparación con la SEC ID Nº: 1 comprende una sustitución correspondiente a L227F/P/GN, y
- b)
- es más termoestable que la enzima lipolítica que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 1.
La invención también proporciona un método para
producir una variante de enzima lipolítica que comprende:
- a)
- selección de una enzima madre fúngica lipolítica que tenga la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 1,
- b)
- en la enzima madre lipolítica substitución de un residuo de aminoácidos correspondiente a L227 de la la SEC ID Nº: 1,
- c)
- opcionalmente; substitución de uno o más aminoácidos distintos de b),
- d)
- preparación de la variante que resulta de las fases a)-c),
- e)
- evaluación de la termostabilidad de la variante,
- f)
- selección de una variante con una termostabilidad aumentada, y
- g)
- producción de la variante seleccionada.
La termostabilidad puede particularmente ser
aumentada en más de 4ºC. Las sustituciones pueden ser con un
residuo de aminoácido diferente, particularmente uno diferente de
Pro.
La enzima lipolítica para ser usada en la
presente invención es clasificada en Hidrolasas de Éster
Carboxílico EC 3.1.1 según la Nomenclatura Enzimática (disponible
en http://www.chem.gmw.ac.uk/iubmb/enzyme). La especificidad de
sustrato puede incluir actividades tales como
triacilglicerol-lipasa EC 3.1.1.3, fosfolipasa A2
EC 3.1.1.4, lisofosfolipasa EC 3.1.1.5, galactolipasa EC 3.1.1.26,
fosfolipasa EC 3.1.1.32 A1, feruloil esterasa EC 3.1.1.73.
La enzima madre lipolítica es fúngica y tiene
una secuencia de aminoácidos que puede ser alineada con la SEC ID
Nº: 1, que es la secuencia de aminoácidos mostrada en las
posiciones 1-269 de la SEC ID Nº: 2 de US 5,869,438
para la lipasa de Thermomyces lanuginosus (sinónimo
Humicola lanuginosa), descrita en EP 258 068 y EP 305 216.
La enzima madre lipolítica puede particularmente tener una
secuencia de aminoácidos con al menos el 80% de homología con la SEC
ID Nº: 1. Además de la lipasa de T. lanuginosus, otros
ejemplos son una lipasa de Penicillium camembertii (P25234),
lipasa/fosfolipasa de Fusarium oxysporum (EP 130064, WO
98/26057), lipasa de F. heterosporum (R87979),
lisofosfolipasa de Aspergillus foetidus (W33009),
fosfolipasa Al de A. oryzae (JP-A
10-155493), lipasa de A. oryzae (D85895),
lipasa/esterasa de ácido ferúlico de A. niger (Y09330),
lipasa/esterasa de ácido ferúlico de A. tubingensis (Y09331),
lipasa de A. tubingensis (WO 98/45453), lisofosfolipasa de
A. niger (WO 98/31790), lipasa de F. solanii con un
punto isoeléctrico de 6.9 y un peso molecular aparente de 30 kDa
(WO 96/18729).
Otros ejemplos son la familia de lipasas
Zygomycetes que comprende al menos el 50% de la homología
con la lipasa de Rhizomucor miehei (P19515) que tienen la
secuencia mostrada en la SEC ID Nº: 2. Esta familia también incluye
las lipasas de Absidia reflexa, A. sporophora, A.
corymbifera, A. blakesleeana, A. griseola (todas
descritas en WO 96/13578 y WO 97/27276) y Rhizopus oryzae
(P21811). Los números entre paréntesis indican la publicación o
acceso a EMBL, GenBank, GeneSeqp o bases de datos
Swiss-Prot.
La enzima lipolítica de la invención comprende
una sustitución correspondiente a L227F/P/G/V de la SEC ID Nº: 1.
El residuo de aminoácidos adicional para ser sustituido también
puede corresponder al residuo Y21, D27, P29, T32, A40, F51, S54,
176, R84, 190, G91, N94, N101, S105, D111, R118, R125, A131, H135,
D137, N162, V187, T189, E210, G212, S216, G225, L227, 1238 o P256
de la SEC ID Nº: 1. Algunas sustituciones particulares de interés
son aquellas correspondientes a D27N/R/S, P29S, T32S, F51I/L, I76V,
R84C, I90LN, G91A/N/S/T/W, L93F, N94K/R/S, F951, D96G/N, N101 D,
D111A/G, R118M, A131V, H135Y, D137N, N162R, V1871; F211Y, S216P,
S224I/Y, G225P, T226N, L227F/P/GN, L227X, V228C/I, 238V y P256T de
la SEC ID Nº: 1.
El número total de sustituciones en las regiones
de arriba es normalmente de no más de 10, p. ej. una, dos, tres,
cuatro, cinco, seis, siete u ocho de dichas sustituciones. Además,
la variante de enzima lipolítica de la invención puede
opcionalmente incluir otras modificaciones de la enzima madre,
normalmente no más de 10, p. ej. no más de 5 modificaciones de este
tipo. La variante puede particularmente tener un total de no más de
10 modificaciones de aminoácidos (particularmente sustituciones) en
comparación con la enzima madre lipolítica. La variante
generalmente tiene una homología con la enzima madre lipolítica de
al menos el 80%, p. ej. al menos el 85%, normalmente al menos 90% o
al menos 95%.
La variante tiene actividad enzimática
lipolítica, es decir, es capaz de hidrolizar uniones estéricas
carboxílicas para liberar carboxilato (EC 3,1,1). Puede
particularmente tener actividad lipásica (actividad de
triacilglicerol-lipasa, EC 3,1,1,3), es decir
actividad hidrolítica para uniones estéricas carboxílicas en
triglicéridos, p. ej. 1,3-actividad específica.
Los siguientes son algunos ejemplos de variantes
de la lipasa de T. lanuginosus. Las sustituciones
correspondientes pueden ser hechas haciendo sustituciones de
aminoácidos correspondientes en otras enzimas fúngicas
lipolíticas:
La termostabilidad puede ser medida a un pH
pertinente para la aplicación destinada usando un tampón adecuado.
Ejemplos de tampones y pH son: pH 10.0 (50 mM de tampón de
glicina), pH 7.0 (50 mM de tampón HEPES) o pH 5.0 (50 mM de acetato
sódico como tampón).
Por comparación, las mediciones deberían ser
hechas en el mismo tampón, en las mismas condiciones y en la misma
concentración proteica. Varios métodos pueden ser usados para medir
la termostabilidad:
\global\parskip0.930000\baselineskip
En DSC, la velocidad de la temperatura puede ser
de 90 grados por hora. La mezcla puede ser purificada hasta la
homogeneidad, y la temperatura de fusión (T_{M}) puede ser tomada
como una expresión de la termoestabilidad.
De forma alternativa, la termostabilidad puede
ser determinada midiendo la actividad enzimática residual
lipolítica tras la incubación a temperaturas seleccionadas.
P-nitrofenil éster en 10 mM
tris-HCl, pH 7.5 puede ser usado como el sustrato,
como se describe en Giver et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
95(1998)12809-12813 y Moore et
al. Nat. Biotech. 14(1996) 458-467.
Pueden ser añadidas muestras periódicamente, o sólo una muestra
puede ser usada con o sin aditivos diferentes para prevenir o
intensificar la desnaturalización, p. ej. en un formato de 96
pocillos.
Espectroscopia de CD como se describe p. ej. en
Yamaguchi et al. Protein engineering
9(1996)789-795. La concentración
enzimática normal es de alrededor de 1 mg/ml, temperatura entre
5-80 grados.
La enzima lipolítica puede ser usada en varios
procesos, y algunos usos particulares son descritos abajo. La
variante es usada normalmente a 60-95ºC
(particularmente 75-90ºC, 70 90ºC o
70-85ºC) y pH 4.5-11
(particularmente 4.5-8 o
5-6.5).
La lipasa puede ser usada en un proceso para
evitar problemas de resina en un proceso mecánico para la
producción de pulpa o en un proceso para hacer papel usando pulpa
mecánica, que comprende la adición de lipasa a la pulpa y la
incubación. La adición de lipasa puede ocurrir en la denominada agua
blanca (agua del proceso de reciclaje). Puede también ser usada
para eliminar tinta del papel usado. La termostabilidad mejorada
permite que la enzima sea usada a una temperatura más alta,
generalmente preferida en la industria. Esto puede ser hecho en
analogía con WO 9213130, WO 9207138, JP 2160984 A, EP 374700.
La enzima lipolítica puede ser añadida a una
masa, y la masa puede ser usada para preparar un producto horneado
(particularmente pan), pasta o fideos. La termostabilidad mejorada
de la enzima permite que permanezca activa durante más tiempo
durante la fase de calentamiento (cocción, ebullición o fritura).
Esto puede ser hecho en analogía con WO 94/04035, WO 00/32758,
PCT/DK 01/00472, EP 1057415.
La adición de la enzima puede llevar a
estabilización mejorada de la masa, es decir, un volumen mayor de
la rebanada del producto horneado y/o una mejor retención de la
forma durante el horneado, particularmente en un sistema estresado,
p. ej. en el caso de sobre-leudado o
sobre-mezcla. Puede también llevar a una solidez
inicial inferior y/o a una miga más uniforme y fina, a una
estructura de la miga mejorada (miga más fina, membranas celulares
más delgadas, células más redondeadas), del producto horneado, y
puede además mejorar las propiedades de la masa, p. ej. una masa
menos blanda, elasticidad más alta, extensibilidad inferior.
La enzima lipolítica puede ser usada como un
catalizador en la síntesis orgánica, p. ej. en un proceso para
hidrolizar sintetizar o interesterificar un éster, que comprende la
reacción del éster con agua, reaccionando un ácido con un alcohol o
interestificando el éster con un ácido, un alcohol o un segundo
éster en presencia de la enzima lipolítica. Favorablemente, la
termostabilidad mejorada permite que el proceso sea conducido a una
temperatura relativamente alta que
puede ser favorable para aumentar la velocidad de reacción y para procesar los sustratos a un punto de fusión elevado.
puede ser favorable para aumentar la velocidad de reacción y para procesar los sustratos a un punto de fusión elevado.
El éster puede ser un éster de ácido
carboxílico, p. ej. un triglicérido. La interesterificación puede
ser hecha en presencia o ausencia de un solvente. La enzima puede
ser usada en forma inmovilizada. El proceso puede ser conducido en
analogía con WO 8802775, 6156548, 5776741, EP 792106, EP 93602, o EP
307154.
La enzima puede ser usada en un proceso para la
eliminación enzimática de ésteres hidrofóbicos de telas,
comprendiendo el proceso el tratamiento de la tela con una cantidad
eficaz de enzima lipolítica para conseguir la eliminación de
ésteres hidrofóbicos de la tela. El tratamiento puede ser hecho a
una temperatura de 75ºC o por encima, p. ej. por un periodo de
1-24 horas. El tratamiento puede ser precedido de
la impregnación de la tela con una solución acuosa de la lipasa a
una proporción de absorción de la solución del
50-200%, y puede ser seguido del lavado y aclarado
para eliminar los ácidos grasos.
El proceso puede ser realizado en analogía con
US 5578489 o US 6077316.
\global\parskip1.000000\baselineskip
La enzima puede ser usada como un aditivo de
detergente, p. ej. a una concentración (expresada como proteína
enzimática pura) de 0,001-10 (p. ej.
0,01-1) mg por gramo de detergente o
0,001-100 (p. ej. 0.01-10) mg por
litro de licor de lavado. Esto puede ser hecho en analogía con WO
97/04079, WO 97/07202, WO 97/41212, WO 98/08939 y WO 97/43375.
Las enzimas de la invención pueden también ser
usadas en la industria del cuero en analogía con GB 2233665 o EP
505920.
La nomenclatura usada aquí para definir
sustituciones de aminoácidos usa el código de una única letra, como
se describe en WO 92/05249.
Así, D27N indica la sustitución de D en la
posición 27 con N. D27N/R indica una sustitución de D27 con N o R.
L227X indica una sustitución de L227 con cualquier otro aminoácido.
D27N +D111A indica una combinación de las dos sustituciones.
Para fines de la presente invención, el grado de
homología puede ser determinado adecuadamente mediante programas
informáticos conocidos en la técnica, tal como GAP proporcionado en
el paquete de programas GCG (Program Manual for the Wisconsin
Package, Version 8, August 1994, Genetics Computer Group, 575
Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711) (Needleman, S.B. and
Wunsch, C.D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48,
443-45), que usa GAP con los ajustes siguientes
para comparación de secuencia polipeptídica: penalización por
creación de GAP de 3.0 y penalización por extensión de GAP de
0.1.
En la presente invención, las posiciones
correspondientes (u homólogas) en las secuencias de lipasa de
Rhizomucor miehei (rhimi), Rhizopus delemar (rhidI),
Thermomyces lanuginosa (antes; Humicola lanuginosa)
(SP400), Penicillium camembertii (Pcl) y Fusarium
oxysporum (FoLnp11), son definidas por el alineamiento mostrado
en la Figura 1 de WO 00/32758.
Para encontrar las posiciones homólogas en las
secuencias de lipasa no mostradas en el alineamiento, la secuencia
de interés es alineada con las secuencias mostradas en la Figura 1.
La secuencia nueva es alineada con el alineamiento presente en la
Fig. 1 usando el alineamiento GAP con la secuencia más homóloga
encontrada por el programa GAP. GAP está provisto en el paquete de
programas GCG (Program Manual for the Wisconsin Package, Version 8,
August 1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison,
Wisconsin, USA 53711) (Needleman, S.B. and Wunsch, C.D., (1970),
Journal of Molecular Biology, 48, 443-45). Los
ajustes siguientes son usados para comparación de la secuencia
polipeptídica: penalización por creación de GAP de 3.0 y
penalización por extensión de GAP de 0.1.
Variantes de una enzima lipolítica pueden ser
obtenidas por métodos conocidos en la técnica, tales como la
mutagénesis dirigida, mutagénesis aleatoria o mutagénesis
localizada, p. ej. como se describe en WO 9522615 o WO 0032758.
Variantes termoestables de una enzima lipolítica
madre dada pueden ser obtenidas por el procedimiento estándar
siguiente:
- \bullet
- Mutagénesis (tendencia al error, oligo dopado, oligo adicionado)
- \bullet
- Selección primaria
- \bullet
- Identificación de mutantes estables de más temperatura
- \bullet
- Mantenimiento (cultivo de glicerol, placas LB-Amp, Mini-Prep)
- \bullet
- Estriado sobre otra placa de ensayo - selección secundaria (1 grado más alto que la selección primaria)
- \bullet
- Secuenciación de ADN
- \bullet
- Transformación en Aspergillus
- \bullet
- Cultivo en escala de 100 ml, purificación, DSC
El siguiente método de ensayo se utiliza para
seleccionar variantes de enzima lipolítica e identificar variantes
con termoestabilidad mejorada.
Las células de E. coli que contienen
variantes de un gen de enzima lipolítica son preparados, p. ej. por
PCR con tendencia al error, mutagénesis aleatoria o mutagénesis
aleatoria localizada o por una combinación de mutantes provechosos
y mutagénesis por saturación.
El ensayo es realizado con filtros en lo alto de
una placa de LB agar. Las células de E. coli son cultivadas
sobre filtros de acetato de celulosa suministrados con nutrientes a
partir de la placa de LB agar y bajo la presión de selección de
ampicilina suministrada con LB agar. Las proteínas que incluyen la
enzima deseada son recogidas sobre un filtro de nitrocelulosa entre
LB agar y filtro de acetato de celulosa. Este filtro de
nitrocelulosa es incubado en un tampón con el pH deseado
(generalmente 6.0) y a la temperatura deseada durante 15 minutos
(p. ej. 78 grados para la lipasa de T. lanuginosus). Después
de mojar los filtros en agua helada, la actividad lipasa residual
es determinada a través del seccionamiento de indol acetato y la
coloración ulterior del producto de reacción con cloruro
nitro-azul de tetrazolio como se describe por
Kynclova, E et al. (Journal of Molecular Recognition 8
(1995)139-145).
El tratamiento térmico aplicado es ajustado de
modo que la generación progenitora es ligeramente activa,
aproximadamente 5-10% en comparación con las
muestras incubadas a la temperatura ambiente. Esto facilita la
identificación de mutantes provechosos.
Ejemplo
1
El plásmido de expresión Aspergillus
oryzae pCaHj 483 (WO 98/00529) consiste en un cassette de
expresión basado en el promotor de amilasa II neutro de
Aspergillus niger fusionado a la secuencia guía no traducida
de triosafosfato isomerasa de Aspergillus nidulans
(Pna2/tpi) y el terminador de amiloglicosidasa de A. niger
(Tamg). También está presente en el plásmido el marcador amdS
selectivo de Aspergillus a partir de A. nidulans que
permite el crecimiento sobre acetamida como fuente de nitrógeno
única. Estos elementos son clonados en el vector pUC19 de E.
coli (New England Biolabs). El marcador de resistencia de
ampicilina que permite la selección en E. coli de este
plásmido fue sustituido por el marcador URA3 de Saccharomyces
cerevisiae que puede complementar una mutación pyrF en
E. coli, la sustitución fue hecha de la siguiente manera:
El origen de replicación pUC19 fue amplificado
por PCR de pCaHj483 con los cebadores 142779 (SEC ID nº: 3) y
142780 (SEC ID nº: 4).
El cebador 142780 introduce un sitio BbuI en el
fragmento de PCR. El sistema de PCR en desarrollo (Roche Molecular
Biochemicals, Basilea, Suiza) fue usado para la amplificación
siguiendo las instrucciones del fabricante para estas
amplificaciones de PCR y las siguientes.
El gen URA3 fue amplificado a partir del vector
de clonación pYES2 general de S. cerevisiae (Invitrogen
Corporation Carlsbad, Ca, EEUU) usando los cebadores 140288 (SEC ID
5) y 142778 (SEC ID 6).
El cebador 140288 introduce un sitio
EcoRI en el fragmento de PCR. Los dos fragmentos de PCR
fueron fusionados mezclándolos y amplificándolos usando los
cebadores 1142780 y 140288 en el empalme por método de recubrimiento
(Horton et al (1989) Gene, 77, 61-68).
El fragmento resultante fue digerido con
EcoRI y BbuI y ligado al fragmento mayor de pCaHj 483
digerido con las mismas enzimas. La mezcla de ligadura fue usada
para transformar la cepa pyrF E. coli DB6507 (ATCC
35673) hecha competente por el método de Mandel y Higa (Mandel, M.
and A. Higa (1970) J. Mol. Biol. 45: 154). Los transformantes
fueron seleccionados en medio sólido M9 (Sambrook et. al
(1989) Molecular cloning, a laboratory manual, 2. edition, Cold
Spring Harbor Laboratory Press) suplementado con 1 g/l de
casaminoácidos, 500 \mug/l de tiamina y 10 mg/l de
canamicina.
Un plásmido de un transformante seleccionado fue
denominado pCaHj 527. El promotor Pna2/tpi presente en pCaHj527 fue
sometido a la mutagénesis dirigida por un simple enfoque de
PCR.
El nucleótido 134 - 144 fue alterado de la SEC
ID Nº: 7 a la SEC ID Nº: 8 usando el cebador mutagénico 141223 (SEC
ID Nº: 9).
Nucleótido 423 - 436 fue alterado de la SEC ID
Nº: 10 a la SEC ID Nº: 11 usando el cebador mutagénico 141222 (SEC
ID Nº: 12).
El plásmido resultante fue denominado
pMT2188.
\vskip1.000000\baselineskip
El plásmido pEN11849 fue hecho para truncar el
gen pyrG a las secuencias esenciales para la expresión pyrG, para
reducir el tamaño del plásmido, mejorando así la frecuencia de
transformación. Un fragmento de PCR (aprox. 1800 bp) fue hecho
usando pENI1299 (se describe en WO 00/24883) como molde y los
cebadores 270999J8 (SEC ID 13) y 270999J9 (SEC ID 14).
El fragmento de PCR fue cortado con las enzimas
de restricción StuI y SphI, y clonado en pENI1298 (descrito en WO
0024883), también cortado con StuI y SphI; la clonación fue
verificada por secuenciación.
\vskip1.000000\baselineskip
El plásmido pENI1861 fue hecho para tener el
estado de la técnica promotor de Aspergillus en el plásmido
de expresión, al igual que varios sitios únicos de restricción para
clonación.
Un fragmento de PCR (aprox. 620 bp) fue hecho
usando pMT2188 (véase arriba) como molde y los cebadores 051199J1
(SEC ID 15) y 1298TAKA (SEC ID 16).
El fragmento fue cortado con BssHII y Bgl II, y
clonado en pENI1849 que fue también cortado con BssHII y Bgl II. La
clonación fue verificada por secuenciación.
\vskip1.000000\baselineskip
El plásmido pENI1902 fue hecho para tener un
promotor que funcione tanto en E. coli como en
Aspergillus. Esto fue hecho por eliminación del sitio único
usando el "kit de mutagénesis dirigida bicatearia Chameleon"
según está recomendado por Stratagene®.
El plásmido pENI1861 fue usado como molde y los
cebadores siguientes con 5' fosforilación fueron usados como
cebadores de selección: 177996 (SEC ID 17), 135640 (SEC ID 18) y
135638 (SEC ID 19).
El cebador 080399J19 (SEC ID Nº: 20) con 5'
fosforilación fue usado como cebador mutagénico para introducir una
secuencia de consenso del promotor -35 y -10 (a partir de E.
coli) en el promotor de expresión de Aspergillus. La
introducción de las mutaciones fue verificada por
secuenciación.
\vskip1.000000\baselineskip
El plásmido pSMin001 fue hecho para permitir la
expresión de la lipasa de T. lanuginosus en E. coli y
Aspergillus.
El plásmido PAHL (descrito en WO 9205249) fue
usado como molde para PCR para amplificar el gen de lipasa de T.
lanuginosus con los Cebadores siguientes: 19671 (SEC ID nº: 21)
y 991213J5 (SEC ID nº: 22). El cebador 991213J5 introdujo un sitio
SacII en el fragmento de PCR. El fragmento de PCR (aprox. 1100 bp)
fue cortado con BamHI y SacII y clonado en pEni1902
cortado con las mismas enzimas. La clonación fue verificada por
secuenciación de ADN. El plásmido fue transformado en DH5\alpha
de E. coli, y la expresión de lipasa fue detectada usando el
ensayo de filtro descrito.
Usando este plásmido recién desarrollado fue
posible expresar la enzima deseada en Aspergillus sin
ninguna modificación. Los índices de expresión conseguidos en E.
coli eran bastante bajos pero suficientes para el ensayo de
selección.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Diferentes técnicas fueron usadas para crear
diversidad en el gen de lipasa de T. lanuginosus: PCR con
tendencia al error, mutagénesis localizada aleatoriamente con la
ayuda de oligonucleótidos dopados, y mutagénesis dirigi-
da.
da.
Las variantes que exponen estabilidad de
temperatura más alta fueron seleccionadas por el ensayo primario
descrito anteriormente, y fueron cultivadas en medio LB y estriadas
nuevamente en placas de ensayo como se ha descrito anteriormente
para una selección secundaria. El ensayo en la selección secundaria
fue realizado con 1-1.5 grados más de temperatura.
El ADN de los mutantes todavía activo bajo estas condiciones fue
secuenciado y transformado en Aspergillus para obtener una
cantidad más alta de proteína, seguido de una purificación
cromatográfica. La enzima purificada fue usada para análisis de DSC
para comprobar la intensificación de la estabilidad.
Después, las sustituciones de aminoácidos
encontradas en las variantes provechosas fueron combinadas, y la
mutagénesis de saturación fue usada para asegurar que los 20
aminoácidos fueran introducidos en las posiciones deseadas.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Todas las muestras identificadas como más
termoestables en la selección primaria y secundaria en el Ejemplo 2
fueron purificadas hasta la homogeneidad, y su estabilidad fue
controlada por calorimetría de barrido diferencial (DSC) a pH 5.0
y/o 7.0 para determinar la estabilidad de la proteína, dada por su
temperatura de fusión (T_{M}). La lipasa madre de T.
lanuginosus fue incluida para comparación.
Se descubrió que ocho variantes tenían
termostabilidad aumentada a un pH de 5.0, mostrando cuatro
variantes un aumento superior a 4ºC. Dos variantes fueron evaluadas
a un pH de 7.0 y se descubrió que tenían termostabilidad
mejorada.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
Varias variantes de la lipasa T.
lanuginosus fueron preparadas y purificadas, y la
termoestabilidad fue controlada por calorimetría de barrido
diferencial (DSC) a un pH de 5.0 para determinar la estabilidad de
la proteína, dada por su temperatura de fusión (T_{M}). La lipasa
madre de T. lanuginosus fue incluida para comparación.
\vskip1.000000\baselineskip
Se descubrió que las siguientes variantes eran
más termoestables que la lipasa madre:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se descubrió que las siguientes variantes eran
más termoestables que la lipasa madre con al menos 4ºC de aumento
de la temperatura de fusión.
\newpage
Ejemplo
5
Varias variantes de la lipasa de T.
lanuginosus fueron preparadas y evaluadas en cuanto a
termoestabilidad como se ha descrito anteriormente bajo "ensayo de
selección primaria". La lipasa madre de T. lanuginosus fue
incluida para comparación.
Se descubrió que las siguientes variantes eran
más termoestables que la lipasa madre:
\bullet EP 374700 A [0002] [0021]
\bullet WO 9213130 A [0002] [0021]
\bullet WO 9205249 A [0003] [0030] [0060]
\bullet WO 9219726 A [0003]
\bullet WO 9707202 A [0003] [0028]
\bullet US 5869438 A [0009]
\bullet EP 258068 A [0009]
\bullet EP 305216 A [0009]
\bullet EP 130064 A [0009]
\bullet WO 9826057 A [0009]
\bullet JP 10155493 A [0009]
\bullet WO 9845453 A [0009]
\bullet WO 9831790 A [0009]
\bullet WO 9618729 A [0009]
\bullet WO 9613578 A [0010]
\bullet WO 9727276 A [0010]
\bullet WO 9207138 A [0021]
\bullet JP 2160984 A [0021]
\bullet WO 9404035 A [0022]
\bullet WO 0032758 A [0022] [0033] [0035]
\bullet DK 0100472 W [0022]
\bullet EP 1057415 A [0022]
\bullet WO 8802775 A [0025]
\bullet US 6156548 A [0025]
\bullet US 5776741 A [0025]
\bullet EP 792106 A [0025]
\bullet EP 93602 A [0025]
\bullet EP 307154 A [0025]
\bullet US 5578489 A [0027]
\bullet US 6077316 A [0027]
\bullet WO 9704079 A [0028]
\bullet WO 9741212 A [0028]
\bullet WO 9808939 A [0028]
\bullet WO 9743375 A [0028]
\bullet GB 2233665 A [0029]
\bullet EP 505920 A [0029]
\bullet WO 9522615 A [0035]
\bullet WO 9800529 A [0041]
\bullet WO 0024883 A [0051] [0052]
\bulletGIVER et al. Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 1998, vol. 95,
12809-12813 [0018]
\bulletMOORE et al. Nat.
Biotech., 1996, vol. 14, 458-467
[0018]
\bulletYAMAGUCHI et al.
Protein engineering, 1996, vol. 9,
789-795 [0019]
\bulletNEEDLEMAN, S.B. WUNSCH,
C.D. Journal of Molecular Biology, 1970, vol. 48,
443-45 [0032] [0034]
\bulletKYNCLOVA, E et al.
Journal of Molecular Recognition, 1995, vol. 8,
139-145 [0039]
\bulletHORTON et al.
Gene, 1989, vol. 77, 61-68 [0045]
\bulletMANDEL, M. A. HIGA J.
Mol. Biol., 1970, vol. 45, 154- [0046]
\bulletSAMBROOK Molecular cloning,
a laboratory manual Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989. [0046]
\global\parskip0.000000\baselineskip
<110> Novozymes A/S
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> VARIANTE DE ENZIMA LIPOLÍTICA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 10133
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> Versión de patente 3.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 269
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Thermomyces lanuginosus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 269
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rhizomucor miehei
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
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<212> ADN
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<213> Artificial/desconocido
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<212> ADN
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<212> ADN
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<213> Artificial/desconocido
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<212> ADN
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<213> Artificial/Desconocido
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<212> ADN
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<212> ADN
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<213> Artificial/Desconocido
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<210> 15
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<211> 59
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<212> ADN
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<213> Artificial/Desconocido
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<220>
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<212> ADN
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<213> Artificial/Desconocido
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<220>
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<223> 1298TAKA
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Artificial/Desconocido
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<220>
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<221> misc_característica
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<222> ()..()
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<223> 177996
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\hskip1cm
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<212> ADN
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<213> Artificial/Desconocido
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
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Claims (10)
1. Enzima lipolítica que:
- a)
- tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 80% de homología con la SEC ID Nº: 1, y que en comparación con la SEC ID Nº: 1 comprende una sustitución correspondiente a L227F/P/GN, y
- b)
- es más termoestable que la enzima lipolítica que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 1.
2. Enzima lipolítica según la reivindicación 1
donde la secuencia de aminoácidos comprende además una sustitución
de un residuo de aminoácido correspondiente a Y21, D27, P29, T32,
A40, F51, S54, 176, R84. 190, G91, N94, N101, S105, D111, R118,
R125, A131, H135, D137, N162, V187, T189, E210, G212, S216, G225,
1238 o P256 de la SEC ID Nº: 1.
3. Enzima lipolítica según la reivindicación
precedente que comprende una o más sustituciones correspondientes a
D27N/R/S, P29S, T32S, F51I/L, I76V, R84C, I90LN, G91A/N/S/T/W,
L93F, N94K/R/S, F951, D96G/N, N101D, D111A/G, R118M, A131V, H135Y,
D137N, N162R, V1871, F211Y, S216P, S224I/Y, G225P, T226N, V228C/I,
I238V o P256T de la SEC ID Nº: 1.
4. Enzima lipolítica según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes que comprende las sustituciones
correspondientes a cualquiera de las siguientes en la SEC ID Nº:
1:
5. Secuencia de ADN que codifica la enzima
lipolítica según cualquiera de las reivindicaciones
precedentes.
6. Método para producir una enzima lipolítica
que comprende:
- a)
- selección de una enzima madre fúngica lipolítica que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 1,
- b)
- en la enzima lipolítica madre la substitución de un residuo de aminoácido correspondiente a L227 de la SEC ID Nº: 1,
- c)
- opcionalmente, la substitución de uno o más aminoácidos distintos de b),
- d)
- preparación de la variante que resulta de las fases a)-c),
- e)
- evaluación de la termoestabilidad de la variante,
- f)
- selección de una variante con una termostabilidad aumentada, y
- g)
- producción de la variante seleccionada.
7. Proceso para controlar problemas de resina
en un proceso para la producción de pulpa mecánica o un proceso de
fabricación de papel usando pulpa mecánica, que comprende la
adición de la enzima lipolítica según cualquiera de
reivindicaciones 1-4 a la pulpa y la incubación.
8. Proceso para preparar una masa o un producto
horneado obtenido a partir de la masa, que comprende la adición de
la enzima lipolítica según cualquiera de las reivindicaciones
1-4 a la masa.
9. Proceso para hidrolizar, sintetizar o
interesterificar un éster, que comprende la reacción del éster con
agua, la reacción de un ácido con un alcohol o la
interesterificación del éster con un ácido, un alcohol o un segundo
éster en presencia de la enzima lipolítica según cualquiera de las
reivindicaciones 1-4.
10. Proceso para la eliminación enzimática de
ésteres hidrofóbicos de telas, comprendiendo el proceso del
tratamiento de la tela con una cantidad de la enzima lipolítica
según cualquiera de las reivindicaciones 1-4 eficaz
para conseguir la eliminación de ésteres hidrofóbicos de la
tela.
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