JP2004522435A - 脂肪分解酵素変異体 - Google Patents

Abstract

改善された熱安定性を伴う脂肪分解酵素変異体を、真菌の脂肪分解酵素におけるある特定のアミノ酸残基の置換により得る。熱安定性脂肪分解酵素変異体は、例えば、機械パルプの製造プロセス又は機械パルプを使用する製紙プロセスにおけるピッチの問題点のコントロールにおいて有用である。

Description

【０００１】
発明の技術分野
本発明は、真菌の脂肪分解酵素の変異体、特に改善された熱安定性を伴う変異体、及びこのような変異体を作出及び使用する方法に関する。
【０００２】
発明の背景
様々な産業目的、例えば洗剤の効能を改善するため並びに紙及びパルプ製造におけるピッチの問題点を排除するための、真菌脂肪分解酵素、例えばサーモミセス・ラヌギノサス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）（別名フミコラ・ラヌギノサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ））由来のリパーゼの使用は公知である。ある状況において、改善された熱安定性を伴う脂肪分解酵素が望まれている（欧州特許第３７４７００号、国際公開公報第９２１３１３０号）。
国際公開公報第９２／０５２４９号、国際公開公報第９２／１９７２６号及び国際公開公報第９７／０７２０２号は、サーモミセス・ラヌギノサス（Ｔ． ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）（フミコラ・ラヌギノサ（Ｈ． ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ））リパーゼの変異体を開示している。
【０００３】
発明の概要
本発明者らは、アミノ酸配列のある特定の置換により真菌脂肪分解酵素の熱安定性が改善されることを発見した。
従って、本発明は、親真菌脂肪分解酵素の変異体を提供し、この変異体は、１個又は複数の特定のアミノ酸残基の置換を含み、かつ親脂肪分解酵素よりもより熱安定性である。
【０００４】
本発明は：
ａ）親真菌脂肪分解酵素を選択する工程、
ｂ）この親脂肪分解酵素において、少なくとも１個の特定のアミノ酸残基を置換する工程、
ｃ）任意に、ｂ）以外の１個又は複数のアミノ酸を置換する工程、
ｄ）工程ａ）−ｃ）で得られた変異体を調製する工程、
ｅ）この変異体の熱安定性を試験する工程、
ｆ）増大した熱安定性を有する変異体を選択する工程、及び
ｇ）選択された変異体を産生する工程、
を含む、脂肪分解酵素変異体を作出する方法も提供する。
【０００５】
この特定のアミノ酸残基は、配列番号：１の２１、２７、２９、３２、３４−４２、５１、５４、７６、８４、９０−９７、１０１、１０５、１１１、１１８、１２５、１３１、１３５、１３７、１６２、１８７、１８９、２０６−２１２、２１６、２２４−２３４、２４２−２５２及び２５６のいずれかに相当するアミノ酸残基を含む。
熱安定性は、特に４℃より大きく増大され得る。これらの置換は、異なるアミノ酸残基、特にＰｒｏとは異なるものによることができる。
【０００６】
発明の詳細な説明
親脂肪分解酵素
本発明において使用される脂肪分解酵素は、Ｅｎｚｙｍｅ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ（酵素命名法）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｈｅｍ．ｑｍｗ．ａｃ．ｕｋ／ｉｕｂｍｂ／ｅｎｚｙｍｅで入手可能）に従い、ＥＣ ３．１．１カルボン酸エステル加水分解酵素に分類される。基質特異性は、ＥＣ ３．１．１．３トリアシルグリセロールリパーゼ、ＥＣ ３．１．１．４ホスホリパーゼＡ２、ＥＣ ３．１．１．５リゾホスホリパーゼ、ＥＣ ３．１．１．２６ガラクトリパーゼ、ＥＣ ３．１．１．３２ホスホリパーゼＡ１、ＥＣ ３．１．１．７３フェルロイルエステラーゼのような活性を含むことができる。
【０００７】
この親脂肪分解酵素は、真菌性であり、かつ欧州特許第２５８ ０６８号及び欧州特許第３０５ ２１６号に開示されたサーモミセス・ラヌギノサス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）（別名フミコラ・ラヌギノサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ））由来のリパーゼに関する米国特許第５，８６９，４３８号の配列番号：２の位置１−２６９に示されるアミノ酸配列である配列番号：１と並置することができるアミノ酸配列を有する。この親脂肪分解酵素は、特に配列番号：１と少なくとも５０％の相同性を有するアミノ酸配列を有することができる。
【０００８】
サーモミセス・ラヌギノサス（Ｔ． ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）由来のリパーゼに加え、その他の例として、ペニシリウム・カメンベルティー（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃａｍｅｍｂｅｒｔｉｉ）由来のリパーゼ（Ｐ２５２３４）、フザリウム・オキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）由来のリパーゼ／ホスホリパーゼ（欧州特許第１３００６４号、国際公開公報第９８／２６０５７号）、フザリウム・ヘテロスポルム（Ｆ． ｈｅｔｅｒｏｓｐｏｒｕｍ）由来のリパーゼ（Ｒ８７９７９）、アスペルギルス・ホエティダス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｏｅｔｉｄｕｓ）由来のリソホスホリパーゼ（Ｗ３３００９）、アスペルギルス・オリゼー（Ａ． ｏｒｙｚａｅ）由来のホスホリパーゼＡ１（日本国特願平１０−１５５４９３）、アスペルギルス・オリゼー（Ａ． ｏｒｙｚａｅ）由来のリパーゼ（Ｄ８５８９５）、アスペルギルス・ニガー（Ａ． ｎｉｇｅｒ）由来のリパーゼ／フェルラ酸エステラーゼ（Ｙ０９３３０）、アスペルギルス・ツビンゲンシス（Ａ． ｔｕｂｉｎｇｅｎｓｉｓ）由来のリパーゼ／フェルラ酸エステラーゼ（Ｙ０９３３１）、アスペルギルス・ツビンゲンシス（Ａ． ｔｕｂｉｎｇｅｎｓｉｓ）由来のリパーゼ（国際公開公報第９８／４５４５３号）、アスペルギルス・ニガー（Ａ． ｎｉｇｅｒ）由来のリソホスホリパーゼ（国際公開公報第９８／３１７９０号）、等電点６．９及び見かけの分子量３０ｋＤａを有するフザリウム・ソレニー（Ｆ． ｓｏｌａｎｉｉ）由来のリパーゼ（国際公開公報第９６／１８７２９号）がある。
【０００９】
その他の例は、配列番号：２に示された配列を有するリゾムコール・ミーヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）のリパーゼ（Ｐ１９５１５）と少なくとも５０％の相同性を有するリパーゼを含むリパーゼの接合菌科である。この科は、アブシディア・レフレクサ（Ａｂｓｉｄｉａ ｒｅｆｌｅｘａ）、アブシディア・スポロフォラ（Ａ． ｓｐｏｒｏｐｈｏｒａ）、アブシディア・コリンビフェラ（Ａ． ｃｏｒｙｍｂｉｆｅｒａ）、アブシディア・フラケスリーアナ（Ａ． ｂｌａｋｅｓｌｅｅａｎａ）、アブシディア・グリセオラ（Ａ． ｇｒｉｓｅｏｌａ）由来のリパーゼ（全て、国際公開公報第９６／１３５７８号及び国際公開公報第９７／２７２７６号に開示されている）、及びリゾプス・オリゼー（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ）由来のリパーゼ（Ｐ２１８１１）も含む。括弧内の数字は、刊行物又はＥＭＢＬ、ＧｅｎＢａｎｋ、ＧｅｎｅＳｅｑｐ又はＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔデータベースへの寄託番号を示す。
【００１０】
アミノ酸置換
本発明の脂肪分解酵素変異体は、前述のいずれかの領域中のアミノ酸残基の１個又は複数の置換を含む。この置換は、例えば配列番号：１の２０６−２０８、２２４−２２８、２２７−２２８、２２７−２３１、２４２−２４３及び２４５−２５２に相当するいずれかの領域に行うことができる。置換されるアミノ酸残基は、配列番号：１の残基Ｙ２１、Ｄ２７、Ｐ２９、Ｔ３２、Ａ４０、Ｆ５１、Ｓ５４、Ｉ７６、Ｒ８４、Ｉ９０、Ｇ９１、Ｎ９４、Ｎ１０１、Ｓ１０５、Ｄ１１１、Ｒ１１８、Ｒ１２５、Ａ１３１、Ｈ１３５、Ｄ１３７、Ｎ１６２、Ｖ１８７、Ｔ１８９、Ｅ２１０、Ｇ２１２、Ｓ２１６、Ｇ２２５、Ｌ２２７、Ｉ２３８又はＰ２５６に相当することができる。いくつかの関心のある特定の置換は、配列番号：１のＤ２７Ｎ／Ｒ／Ｓ、Ｐ２９Ｓ、Ｔ３２Ｓ、Ｆ５１Ｉ／Ｌ、Ｉ７６Ｖ、Ｒ８４Ｃ、Ｉ９０Ｌ／Ｖ、Ｇ９１Ａ／Ｎ／Ｓ／Ｔ／Ｗ、Ｌ９３Ｆ、Ｎ９４Ｋ／Ｒ／Ｓ、Ｆ９５Ｉ、Ｄ９６Ｇ／Ｎ、Ｎ１０１Ｄ、Ｄ１１１Ａ／Ｇ、Ｒ１１８Ｍ、Ａ１３１Ｖ、Ｈ１３５Ｙ、Ｄ１３７Ｎ、Ｎ１６２Ｒ、Ｖ１８７Ｉ、Ｆ２１１Ｙ、Ｓ２１６Ｐ、Ｓ２２４Ｉ／Ｙ、Ｇ２２５Ｐ、Ｔ２２６Ｎ、Ｌ２２７Ｆ／Ｐ／Ｇ／Ｖ、Ｌ２２７Ｘ、Ｖ２２８Ｃ／Ｉ、２３８Ｖ及びＰ２５６Ｔに相当するものである。
【００１１】
前記領域の置換の総数は、該置換の、典型的には１０個を超えず、例えば１、２、３、４、５、６、７又は８個である。加えて本発明の脂肪分解酵素変異体は、任意に親株酵素の他の修飾を含み、典型的にはこのような修飾は１０個を超えず、例えば５個を超えない。この変異体は特に、親脂肪分解酵素と比べ、全部で１０個を超えないアミノ酸修飾（特に置換）を有する。この変異体は一般に、親脂肪分解酵素と少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、典型的には少なくとも９０％又は少なくとも９５％の相同性を有する。
【００１２】
脂肪分解酵素変異体
この変異体は、脂肪分解酵素活性を有し、すなわちこれはカルボン酸エステル結合を加水分解し、カルボキシラート（ＥＣ ３．１．１）を放出することが可能である。これは特に、リパーゼ活性（トリアシルグリセロールリパーゼ活性、ＥＣ ３．１．１．３）、すなわちトリグリセリドにおけるカルボン酸エステル結合の加水分解活性、例えば１，３−特異的活性を有することができる。
【００１３】
特異的変異体
下記のものは、Ｔ． ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓリパーゼの変異体のいくつかの例である。相当する置換は、他の真菌脂肪分解酵素における相当するアミノ酸置換を行うことにより達成することができる。
【００１４】
【表１】

【００１５】
熱安定性
熱安定性は、適当な緩衝液を用い、意図された用途について関連のあるｐＨで測定することができる。緩衝液及びｐＨの例を以下に示す：ｐＨ１０．０（５０ｍＭグリシン緩衝液）、ｐＨ７．０（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液）、又はｐＨ５．０（緩衝液としての５０ｍＭ酢酸ナトリウム）。
比較のための測定は、同じ緩衝液において、同じ条件下及び同じタンパク質濃度で行うこととする。熱安定性測定には、様々な方法を用いることができる：
【００１６】
示差走査型熱量測定 （ＤＳＣ）
ＤＳＣにおいて、加熱速度は、９０度／時であることができる。試料は、均質に精製し、かつ融点（Ｔ_Ｍ）を熱安定性の表現として採用することができる。
【００１７】
残留酵素活性
あるいは熱安定性は、選択された温度でのインキュベーション後の、残留脂肪分解酵素活性の測定により決定することができる。Ｇｉｖｅｒらの論文（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、９５：１２８０９−１２８１３（１９９８））及びＭｏｏｒｅらの論文（Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１４：４５８−４６７（１９９６））に記されたように、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）中のｐ−ニトロフェニルエステルを、基質として使用することができる。試料を、定期的に添加するか、もしくは、ただひとつの試料を、例えば９６ウェルフォーマットにおいて、変性を防止又は増強するために様々な添加剤を伴う又は伴わずに使用することができる。
【００１８】
ＣＤ 測定
円偏光二色性（ＣＤ）測定は、例えばＹａｍａｇｕｃｈｉらの論文（Ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、９：７８９−７９５（１９９６））に記されている。典型的酵素濃度は、ほぼ１ｍｇ／ｍｌであり、温度は５〜８０度である。
【００１９】
変異体の使用
脂肪分解酵素変異体は、様々なプロセスにおいて使用することができ、いくつかの具体的用途を以下に記す。この変異体は、典型的には、６０〜９５℃（特に７５〜９０℃、７０〜９０℃、又は７０〜８５℃）及びｐＨ４．５〜１１（特に４．５〜８又は５〜６．５）で使用される。
【００２０】
紙及びパルプ産業における用途
前記リパーゼを、機械パルプの製造プロセス又は機械パルプを用いる製紙プロセスにおけるピッチの問題点を避けるプロセスにおいて使用することができ、これはリパーゼのパルプへの添加及びインキュベーションを含む。このリパーゼの添加は、いわゆる白水（リサイクルされた処理水）を生じることがある。これは、使用済みの紙からのインクの除去にも使用することができる。改善された熱安定性は、この変異体が比較的高温で使用されることを可能にし、これはこの産業においては一般に好ましいことである。これは、国際公開公報第９２１３１３０号、国際公開公報第９２０７１３８号、日本国特願２１６０９８４ Ａ号、欧州特許第３７４７００号と同様に行うことができる。
【００２１】
穀物を主成分とする食品における用途
前述の脂肪分解酵素変異体は、ダフに添加することができ、かつこのダフは、焼き製品（特にパン）、パスタ又はヌードルの製造に使用することができる。変異体の改善された熱安定性は、加熱工程（焼く、煮る又は揚げる）において、より長期にわたり、これが活性を維持し続けることを可能にする。これは、国際公開公報第９４／０４０３５号、国際公開公報第００／３２７５８号、ＰＣＴ／ＤＫ第０１／００４７２号、欧州特許第１０５７４１５号と同様に行うことができる。
【００２２】
この変異体の添加は、改善されたダフ安定性、すなわち、焼いている期間、特に例えば過剰加工（ｏｖｅｒ−ｐｒｏｏｆｉｎｇ）又は過剰混合の場合のようなストレスのかかったシステムにおける焼き製品のより大きい塊り容量及び／又はより良い形状の維持につながり得る。これは更に、焼き製品の、より低い最初の固さ及び／又はより均一かつ細かいパン屑、改善されたパン屑構造（より細かいパン屑、より薄いセル壁（ｃｅｌｌ ｗａｌｌ）、より丸みを帯びたセル）につながり、かつ例えば柔らかさの少ないダフ、比較的高い弾性、比較的低い伸びのような、ダフ特性を更に改善することができる。
【００２３】
油脂産業における用途
前述の脂肪分解酵素変異体は、例えばこの脂肪分解酵素変異体の存在下で、エステルを水と反応する工程、酸をアルコールと反応する工程、又はエステルを、酸、アルコール又は第二エステルによりエステル交換する工程を含む、エステルの加水分解、合成又はエステル交換のプロセスにおけるような、有機合成における触媒として使用することができる。好ましいことに、改善された熱安定性は、反応速度を増大しかつ高温融解物質を処理するのに好ましいようなプロセスが比較的高温で実行されることを可能にする。
【００２４】
エステルは、例えばトリグリセリドのような、カルボン酸エステルであることができる。エステル交換は、溶媒の存在又は非存在下で行うことができる。この酵素は、固定された形で使用することができる。この方法は、国際公開公報第８８０２７７５号、米国特許第６１５６５４８号、米国特許第５７７６７４１号、欧州特許第７９２１０６号、欧州特許第９３６０２号又は欧州特許第３０７１５４号と同様に行うことができる。
【００２５】
繊維産業における用途
この変異体は、織物から疎水性エステルを酵素的に除去するプロセスにおいて使用することができ、このプロセスは、織物から疎水性エステルを除去するのに有効量の脂肪分解酵素で織物を処理する工程を含む。この処理は、温度７５℃以上で、例えば１〜２４時間の期間行うことができる。この処理は、液体含浸比５０〜２００％のリパーゼ変異体の水溶液へ、織物を含浸することにより進行することができ、引き続き洗浄及びすすぎを行い、脂肪酸を除去することができる。
本プロセスは、米国特許第５５７８４８９号又は米国特許第６０７７３１６号と同様に行うことができる。
【００２６】
洗剤における用途
この変異体は、洗剤添加剤として、例えば濃度（純粋な酵素タンパク質として表わす）が０．００１〜１０（例えば０．０１〜１）ｍｇ／１ｇの洗剤で、又は０．００１〜１００（例えば、０．０１〜１０）ｍｇ／１Ｌの洗浄液で使用することができる。これは、国際公開公報第９７／０４０７９号、国際公開公報第９７／０７２０２号、国際公開公報第９７／４１２１２号、国際公開公報第９８／０８９３９号及び国際公開公報第９７／４３３７５号と同様に行うことができる。
【００２７】
革における用途
本発明の変異体は、英国特許第２２３３６６５号又は欧州特許第５０５９２０号と同様に、革産業において使用することもできる。
【００２８】
アミノ酸置換の命名
アミノ酸置換を定義するために本願明細書において使用される命名法は、国際公開公報第９２／０５２４９号に開示されたような、一文字コードを使用する。
従って、Ｄ２７Ｎは、２７位のＤがＮで置換されていることを示す。Ｄ２７Ｎ／Ｒは、Ｄ２７が、Ｎ又はＲにより置換されていることを示す。Ｌ２２７Ｘは、Ｌ２２７が、いずれかの他のアミノ酸で置換されていることを示す。Ｄ２７Ｎ ＋ Ｄ１１１Ａは、２種の置換の組合せを示す。
【００２９】
相同及びアラインメント
本発明の目的に関して、相同の程度は、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｐｒｏｇｒａｍ Ｍａｎｕａｌ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ、８版、１９９４年８月、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， ５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ、ＵＳＡ、５３７１１）により提供されたＧＡＰのような、当該技術分野において公知のコンピュータプログラムを用い（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ， Ｓ．Ｂ．及びＷｕｎｓｃｈ， Ｃ．Ｄ．、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、４８：４４３−４５ （１９７０））、ポリペプチド配列比較に関する下記の設定でＧＡＰを使用し、適切に決定することができる：ＧＡＰクリエーション・ペナルティ３．０及びＧＡＰエクステンション・ペナルティ０．１。
【００３０】
本発明において、リゾムコール・ミーヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）（ｒｈｉｍｉ）、リゾプス・デレマー（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｄｅｌｅｍａｒ）（ｒｈｉｄｌ）、サーモミセス・ラヌギノサス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）（以前；フミコラ・ラヌギノサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ））（ＳＰ４００）、ペニシリウム・カメンベルティー（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃａｍｅｍｂｅｒｔｉｉ）（Ｐｃｌ）及びフザリウム・オキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）（ＦｏＬｎｐ１１）のリパーゼ配列の対応する（又は相同の）位置は、国際公開公報第００／３２７５８号の図１に示されたようなアラインメントにより定義される。
【００３１】
アラインメント内に示されていないリパーゼ配列における相同な位置を発見するために、注目の配列は、図１に示された配列と並置される。新規配列は、ＧＡＰプログラムにより見つけられた最も相同な配列に対するＧＡＰアラインメントを用い、図１中の本アラインメントと並置される。ＧＡＰは、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｐｒｏｇｒａｍ Ｍａｎｕａｌ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ、８版、１９９４年８月、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， ５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ、ＵＳＡ、５３７１１）により提供される（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ， Ｓ．Ｂ．及びＷｕｎｓｃｈ， Ｃ．Ｄ．、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、４８：４４３−４５ （１９７０））。下記の設定を、ポリペプチド配列比較に関し使用する：ＧＡＰクリエーション・ペナルティ３．０及びＧＡＰエクステンション・ペナルティ０．１。
【００３２】
熱安定性変異体の獲得法
脂肪分解酵素の変異体は、例えば国際公開公報第９５２２６１５号又は国際公開公報第００３２７５８号に開示されたような、位置指定突然変異誘発、ランダム突然変異誘発又は局在化突然変異誘発のような、当該技術分野において公知の方法により得ることができる。
【００３３】
所定の親脂肪分解酵素の熱安定性変異体は、下記の標準手順で得ることができる：
＊突然変異誘発（エラー−頻発型、オリゴ浸漬型（ｄｏｐｅｄ ｏｌｉｇｏ）、オリゴスパイク型（ｓｐｉｋｅｄ ｏｌｉｇｏ））
＊一次スクリーニング
＊より温度に対し安定した突然変異体の同定
＊維持（グリセロール培地、ＬＢ−Ａｍｐプレート、ミニプレップ）
＊別のアッセイプレート上への画線−二次スクリーニング（一次スクリーニングよりも１度高い）
＊ＤＮＡ配列決定
＊Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓにおける形質転換
＊１００ｍｌスケールにおける培養、精製、ＤＳＣ
【００３４】
一次スクリーニングアッセイ
下記のアッセイ法を用い、脂肪分解酵素変異体をスクリーニングし、かつ改善された熱安定性を伴う変異体を同定する。
脂肪分解酵素遺伝子の変異体を収容している大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）細胞を、エラー−頻発型ＰＣＲ、ランダム突然変異誘発又は局在化ランダム突然変異誘発によるか、又は有益な突然変異体の組合せ及び飽和突然変異誘発により調製される。
【００３５】
このアッセイは、ＬＢ寒天プレート表面のフィルターで行われる。大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）細胞は、ＬＢ寒天プレートから栄養素を供給した酢酸セルロースフィルター上で、ＬＢ寒天により供給されたアンピシリンの選択圧の下で増殖される。望ましい酵素を含むタンパク質を、ＬＢ寒天と酢酸セルロースフィルターの間のニトロセルロースフィルター上に収集する。このニトロセルロースフィルターを、望ましいｐＨ（一般に６．０）の緩衝液中で、望ましい温度（例えば、サーモミセス・ラヌギノサス（Ｔ． ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）リパーゼに関して７８度）で１５分間インキュベーションする。Ｋｙｎｃｌｏｖａ， Ｅらの論文（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ、８：１３９−１４５（１９９５））に記されたように、フィルターを氷水で急冷した後、残留リパーゼ活性を、インドール酢酸の切断及びその後の反応生成物のニトロブルー塩化テトラゾリウムによる呈色を通じて決定する。
【００３６】
適用した熱処理は、親世代がわずかに活性がある、室温でインキュベーションした試料と比較しておよそ５〜１０％活性があるように調節する。このことは、有益な突然変異体の同定を促進する。
【００３７】
実施例
実施例 １ ：リパーゼの発現
プラスミド ｐＭＴ２１８８
アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）発現プラスミドｐＣａＨｊ４８３（国際公開公報第９８／００５２９号）は、アスペルギルス・ニドランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）トリオースリン酸イソメラーゼ非翻訳リーダー配列（Ｐｎａ２／ｔｐｉ）及びアスペルギルス・ニガー（Ａ． ｎｉｇｅｒ）アミログリコシダーゼターミネーター（Ｔａｍｇ）に融合されたアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）中性アミラーゼＩＩプロモーターを基にした発現カセットからなる。更にこのプラスミド上には、単なる窒素給源としてのアセトアミド上で増殖することができるアスペルギルス・ニドランス（Ａ． ｎｉｄｕｌａｎｓ）由来のアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）選択マーカーａｍｄＳも存在する。これらのエレメントは、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）ベクターｐＵＣ１９（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社）にクローニングした。このプラスミドの大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）における選択を可能にするアンピシリン耐性マーカーを、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）におけるｐｙｒＦ突然突然変異を補完することができるサッカロミセス・セレビシエー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＵＲＡ３マーカーと交換し、この交換は下記の方法で行った：
【００３８】
ｐＵＣ１９複製起原を、ｐＣａＨｊ４８３から、プライマー１４２７７９（配列番号：３）及び１４２７８０（配列番号：４）を用い、ＰＣＲ増幅した。
プライマー１４２７８０は、ＰＣＲ断片にＢｂｕＩ部位を導入する。伸長されたＰＣＲシステム（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社、バーゼル、スイス）を、製造業者の指示に従い、この増幅及びその後のＰＣＲ増幅に使用した。
ＵＲＡ３遺伝子は、プライマー１４０２８８（配列番号：５）及び１４２７７８（配列番号：６）を用い、一般的なサッカロミセス・セレビシエー（Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）クローニングベクターｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カールスバッド、Ｃａ、ＵＳＡ）から増幅した。
【００３９】
プライマー１４０２８８は、ＰＣＲ断片にＥｃｏＲＩ部位を導入する。これら２種のＰＣＲ断片を、これらを混合し、かつ重複法によるスプライシングにおいてプライマー１４２７８０及び１４０２８８を用いて増幅することにより融合した（Ｈｏｒｔｏｎら、Ｇｅｎｅ、７７：６１−６８（１９８９））。
得られた断片は、ＥｃｏＲＩ及びＢｂｕｌで消化し、かつ同じ酵素で消化された最大の断片ｐＣａＨｊ４８３にライゲーションした。このライゲーション混合物を使用し、Ｍａｎｄｅｌ及びＨｉｇａの方法（Ｍａｎｄｅｌ， Ｍ．及びＡ． Ｈｉｇａ、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、４５：１５４（１９７０））により形質転換受容性にされたｐｙｒＦ 大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＤＢ６５０７ （ＡＴＣＣ ３５６７３）を形質転換した。形質転換体を、１ｇ／Ｌカザアミノ酸、５００μｇ／ｌチアミン及び１０ｍｇ／ｌカナマイシンを補充した固形Ｍ９培地（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ， ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ、第２版（１９８９）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ社）上で選択した。
【００４０】
選択された形質転換体のプラスミドは、ｐＣａＨｊ ５２７と称した。ｐＣａＨｊ ５２７上に存在するＰｎａ２／ｔｐｉプロモーターに、単純なＰＣＲ法により、位置指定突然変異誘発を引き起した。
ヌクレオチド１３４−１４４は、突然変異誘発プライマー１４１２２３（配列番号：９）を用い、配列番号：７から配列番号：８へと変換した。
ヌクレオチド４２３ −４３６は、突然変異誘発プライマー１４１２２２（配列番号：１２）を用い、配列番号：１０から配列番号：１１へと変換した。
得られたプラスミドはｐＭＴ２１８８と称した。
【００４１】
プラスミド ｐＥＮＩ１８４９
ｐｙｒＧ遺伝子をｐｙｒＧ発現に必須の配列へと短縮化するため、プラスミドのサイズを減少し、その結果形質転換頻度を改善するために、プラスミドｐＥＮＩ１８４９を作成した。ＰＣＲ断片（約１８００ｂｐ）を、鋳型としてｐＥＮＩ１２９９（国際公開公報第００／２４８８３号に開示されている）、かつプライマー２７０９９９Ｊ８（配列番号：１３）及び２７０９９９Ｊ９（配列番号：１４）を用いて作成した。
ＰＣＲ−断片を、制限酵素ＳｔｕＩ及びＳｐｈｌで切断し、かつｐＥＮＩ１２９８（国際公開公報第００２４８８３号に開示されている）へクローニングし、更にＳｔｕＩ及びＳｐｈＩで消化し；このクローニングを、配列決定により証明した。
【００４２】
プラスミド ｐＥＮＩ１８６１
プラスミドｐＥＮＩ１８６１を、発現プラスミド中に本アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）プロモーターの状態を有し、更にクローニングのための多くの独自の制限部位を有するために作成した。
ＰＣＲ断片（およそ６２０ｂｐ）を、ｐＭＴ２１８８（前記）を鋳型として並びにプライマー０５１１９９Ｊ１（配列番号：１５）及び１２９８ＴＡＫＡ（配列番号：１６）を用い作成した。
この断片は、ＢｓｓＨＩＩ及びＢｇｌＩＩで切断し、かつ同じくＢｓｓＨＩＩ及びＢｇｌＩＩで切断したｐＥＮＩ１８４９へクローニングした。このクローニングを、配列決定により証明した。
【００４３】
プラスミド ｐＥＮＩ１９０２
プラスミドｐＥＮＩ１９０２を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）及びアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）の両方において作用するプロモーターを有するために作成した。これは、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（商標）の推奨に従い、「Ｃｈａｍｅｌｅｏｎ二本鎖位置指定突然変異誘発キット」を用い、独自の部位の除去により行った。
【００４４】
プラスミドｐＥＮＩ１８６１を鋳型として用い、及び５’リン酸化を伴う下記プライマーを、選択プライマーとして使用した：１７７９９６（配列番号：１７）、１３５６４０（配列番号：１８）及び１３５６３８（配列番号：１９）。
５’リン酸化を伴う０８０３９９Ｊ１９プライマー（配列番号：２０）を、突然変異誘発プライマーとして使用し、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）発現プロモーターにおいて−３５及び−１０プロモーターコンセンサス配列（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から）を導入した。突然変異の導入は、配列決定により証明した。
【００４５】
プラスミド ｐＳＭｉｎ００１
プラスミドｐＳＭｉｎ００１を、サーモミセス・ラヌギノサス（Ｔ． ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）リパーゼを大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）及びアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）において発現させるために作成した。
プラスミドｐＡＨＬ（国際公開公報第９２０５２４９号に開示）をＰＣＲの鋳型として用い、サーモミセス・ラヌギノサス（Ｔ． ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）リパーゼ遺伝子を下記プライマーにより増幅した：１９６７１（配列番号：２１）及び９９１２１３Ｊ５（配列番号：２２）。プライマー９９１２１３Ｊ５は、ＳａｃＩＩ部位をＰＣＲ断片へ導入した。ＰＣＲ断片（およそ１１００ｂｐ）を、ＢａｍＨＩ及びＳａｃＩＩで切断し、同じ酵素で切断したｐＥｎｉ１９０２へクローニングした。このクローニングは、ＤＮＡ配列決定により証明した。このプラスミドは、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ） ＤＨ５αにおいて形質転換し、かつリパーゼ発現を、説明されたフィルターアッセイを用いて検出した。
この新たに開発されたプラスミドを用い、所望の酵素を、修飾を伴わないアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）において発現することが可能であった。実現された大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）における発現率は極めて低いが、スクリーニングアッセイには十分であった。
【００４６】
実施例 ２ ：熱安定性リパーゼ変異体の作成
いくつかの技術を用い、サーモミセス・ラヌギノサス（Ｔ． ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）リパーゼ遺伝子における多様性を作成した：エラー−頻発型ＰＣＲ、浸漬したオリゴヌクレオチドによる局在化ランダム突然変異誘発、及び位置指定突然変異誘発。
【００４７】
比較的高温で安定性を示している変異体を、前述の一次アッセイにより選択し、かつＬＢ培地において培養し、かつ二次スクリーニングのために再度アッセイプレート上に前述のように画線した。二次スクリーニングにおけるアッセイは、１〜１．５度高い温度で行った。これらの条件下でも依然活性がある突然変異体ＤＮＡを、配列決定し、かつアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）に形質転換し、より大量のタンパク質を得、その後クロマトグラフィーにより精製した。精製した酵素をＤＳＣ分析に用い、安定性の増強を証明した。
次に、有益な変異体において認められたアミノ酸置換を組合せ、かつ飽和突然変異誘発を用い、２０種全てのアミノ酸が所望の位置に導入されたことを確認した。
【００４８】
実施例 ３ ：リパーゼ変異体の熱安定性
実施例２において一次及び二次スクリーニングにおいてより熱安定性であることが確定された全ての試料を、均質になるように精製し、かつそれらの安定性を、示差走査型熱量測定計（ＤＳＣ）により、ｐＨ５．０及び／又は７．０で測定し、その融点（Ｔ_Ｍ）でのタンパク質の安定性を決定した。サーモミセス・ラヌギノサス（Ｔ． ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）由来の親株リパーゼを比較のために含んだ。
８種の変異体が、ｐＨ５．０で増大した熱安定性を有し、４種の変異体が４℃を超える増大を示すことがわかった。２種の変異体は、ｐＨ７．０で試験し、かつ改善された熱安定性を有することがわかった。
【００４９】
実施例 ４ ： ＤＳＣ によるリパーゼ変異体の熱安定性
サーモミセス・ラヌギノサス（Ｔ． ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）リパーゼの多くの変異体を調製・精製し、かつその熱安定性を、示差走査型熱量測定計（ＤＳＣ）により、ｐＨ５．０でチェックし、その融点（Ｔ_Ｍ）でのタンパク質の安定性を決定した。サーモミセス・ラヌギノサス（Ｔ． ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）由来の親株リパーゼを比較のために含んだ。
下記変異体は、親株リパーゼよりもより熱安定性であることがわかった：
【００５０】
【表２】

【００５１】
下記変異体は、融点の少なくとも４℃の上昇により、親株リパーゼよりもより熱安定性であることがわかった：
【表３】

【００５２】
実施例 ５ ：プレートアッセイによる熱安定性
サーモミセス・ラヌギノサス（Ｔ． ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）リパーゼの多くの変異体を調製し、かつ熱安定性について先に「一次スクリーニングアッセイ」において説明したように試験した。Ｔ． ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ由来の親株リパーゼを比較のために含んだ。
下記変異体は、親株リパーゼよりもより熱安定性であることがわかった：
【００５３】
【表４】

Claims (27)

1. 親真菌脂肪分解酵素の変異体であり、ここでこの変異体が：
   ａ）親脂肪分解酵素と比較し、配列番号：１のアミノ酸の２１、２７、２９、３２、３４−４２、５１、５４、７６、８４、９０−９７、１０１、１０５、１１１、１１８、１２５、１３１、１３５、１３７、１６２、１８７、１８９、２０６−２１２、２１６、２２４−２３４、２４２−２５２及び２５６のいずれかに相当するアミノ酸残基の置換を含むアミノ酸配列を有し、及び
   ｂ）親脂肪分解酵素よりもより熱安定性である、変異体。
2. 親脂肪分解酵素よりも少なくとも４℃高い熱安定性を有する、請求項１記載の変異体。
3. 前記アミノ酸残基が、Ｐｒｏと異なるアミノ酸残基により置換されている、請求項１又は２のいずれか１項記載の変異体。
4. 親脂肪分解酵素が、配列番号：１に対して少なくとも５０％の相同性を有する、請求項１〜３のいずれか１項記載の変異体。
5. 親脂肪分解酵素がサーモミセス・ラヌギノサス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ） ＤＳＭ ４１０９により産生されるリパーゼであり、かつ配列番号：１のアミノ酸配列を有する、請求項１〜４のいずれか１項記載の変異体。
6. 配列番号：１のＹ２１、Ｄ２７、Ｐ２９、Ｔ３２、Ａ４０、Ｆ５１、Ｓ５４、Ｉ７６、Ｒ８４、Ｉ９０、Ｇ９１、Ｎ９４、Ｎ１０１、Ｓ１０５、Ｄ１１１、Ｒ１１８、Ｒ１２５、Ａ１３１、Ｈ１３５、Ｄ１３７、Ｎ１６２、Ｖ１８７、Ｔ１８９、Ｅ２１０、Ｇ２１２、Ｓ２１６、Ｇ２２５、Ｌ２２７、Ｉ２３８又はＰ２５６に相当するアミノ酸残基の置換を含む、請求項１〜５のいずれか１項記載の変異体。
7. 配列番号：１のＤ２７Ｎ／Ｒ／Ｓ、Ｐ２９Ｓ、Ｔ３２Ｓ、Ｆ５１Ｉ／Ｌ、Ｉ７６Ｖ、Ｒ８４Ｃ、Ｉ９０Ｌ／Ｖ、Ｇ９１Ａ／Ｎ／Ｓ／Ｔ／Ｗ、Ｌ９３Ｆ、Ｎ９４Ｋ／Ｒ／Ｓ、Ｆ９５Ｉ、Ｄ９６Ｇ／Ｎ、Ｎ１０１Ｄ、Ｄ１１１Ａ／Ｇ、Ｒ１１８Ｍ、Ａ１３１Ｖ、Ｈ１３５Ｙ、Ｄ１３７Ｎ、Ｎ１６２Ｒ、Ｖ１８７Ｉ、Ｆ２１１Ｙ、Ｓ２１６Ｐ、Ｓ２２４Ｉ／Ｙ、Ｇ２２５Ｐ、Ｔ２２６Ｎ、Ｌ２２７Ｆ／Ｐ／Ｇ／Ｖ、Ｌ２２７Ｘ、Ｖ２２８Ｃ／Ｉ、２３８Ｖ及びＰ２５６Ｔに相当する１個又は複数の置換を含む、請求項１〜６のいずれか１項記載の変異体。
8. 前記置換の１、２、３、４、５、６、７又は８個を有する、請求項１〜７のいずれか１項記載の変異体。
9. 更に、請求項１記載のもの以外のアミノ酸残基の１個又は複数の置換、好ましくはこのような置換を１〜５個含む、請求項１〜８のいずれか１項記載の変異体。
10. 配列番号：１において下記に相当する置換を含む、請求項１〜９のいずれか１項記載の変異体：
    

    

    
11. 好ましくはｐＨ５〜７で測定された場合に、親脂肪分解酵素よりも少なくとも５℃高い変性温度を有する、請求項１〜１０のいずれか１項記載の変異体。
12. 請求項１〜１１のいずれか１項記載の変異体をコードしているＤＮＡ配列。
13. 請求項１〜１２記載のＤＮＡ配列を含むベクター。
14. 請求項１２記載のＤＮＡ配列又は請求項１３記載のベクターを収容している形質転換された宿主細胞。
15. 請求項１〜１１のいずれか１項記載の変異体を産生する方法であり：
    ａ）変異体を発現しかつ好ましくは分泌するために、請求項１４記載の細胞を培養する工程、及び
    ｂ）変異体を回収する工程、
    を含む方法。
16. 脂肪分解酵素変異体を産生する方法であり：
    ａ）親真菌脂肪分解酵素を選択する工程、
    ｂ）親脂肪分解酵素において、配列番号：１の２１、２７、２９、３２、３４−４２、５１、５４、７６、８４、９０−９７、１０１、１０５、１１１、１１８、１２５、１３１、１３５、１３７、１６２、１８７、１８９、２０６−２１２、２１６、２２４−２３４、２４２−２５２及び２５６のいずれかに相当する少なくとも１個のアミノ酸残基を置換する工程、
    ｃ）任意に、上記ｂ）以外の１個又は複数のアミノ酸を置換する工程、
    ｄ）工程ａ）〜ｃ）から得られる変異体を調製する工程、
    ｅ）変異体の熱安定性を試験する工程、
    ｆ）増大した熱安定性を有する変異体を選択する工程、及び
    ｇ）選択された変異体を産生する工程、
    を含む方法。
17. 親脂肪分解酵素が、配列番号：１と少なくとも５０％の相同性を有する、請求項１５又は１６に記載の方法。
18. 親脂肪分解酵素が、サーモミセス・ラヌギノサス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ） ＤＳＭ ４１０９により産生され、配列番号：１のアミノ酸配列を有するリパーゼである、請求項１５〜１７記載の方法。
19. 配列番号：１のＹ２１、Ｄ２７、Ｐ２９、Ｔ３２、Ａ４０、Ｆ５１、Ｓ５４、Ｉ７６、Ｒ８４、Ｉ９０、Ｇ９１、Ｎ９４、Ｎ１０１、Ｓ１０５、Ｄ１１１、Ｒ１１８、Ｒ１２５、Ａ１３１、Ｈ１３５、Ｄ１３７、Ｎ１６２、Ｖ１８７、Ｔ１８９、Ｅ２１０、Ｇ２１２、Ｓ２１６、Ｇ２２５、Ｌ２２７、Ｉ２３８又はＰ２５６に相当するアミノ酸残基の置換を含む、請求項１５〜１８のいずれか１項記載の方法。
20. 配列番号：１のＤ２７Ｎ／Ｒ／Ｓ、Ｐ２９Ｓ、Ｔ３２Ｓ、Ｆ５１Ｉ／Ｌ、Ｉ７６Ｖ、Ｒ８４Ｃ、Ｉ９０Ｌ／Ｖ、Ｇ９１Ａ／Ｎ／Ｓ／Ｔ／Ｗ、Ｌ９３Ｆ、Ｎ９４Ｋ／Ｒ／Ｓ、Ｆ９５Ｉ、Ｄ９６Ｇ／Ｎ、Ｎ１０１Ｄ、Ｄ１１１Ａ／Ｇ、Ｒ１１８Ｍ、Ａ１３１Ｖ、Ｈ１３５Ｙ、Ｄ１３７Ｎ、Ｎ１６２Ｒ、Ｖ１８７Ｉ、Ｆ２１１Ｙ、Ｓ２１６Ｐ、Ｓ２２４Ｉ／Ｙ、Ｇ２２５Ｐ、Ｔ２２６Ｎ、Ｌ２２７Ｆ／Ｐ／Ｇ／Ｖ、Ｌ２２７Ｘ、Ｖ２２８Ｃ／Ｉ、２３８Ｖ及びＰ２５６Ｔに相当するアミノ酸残基の置換を含む、請求項１５〜１９記載の方法。
21. エステルを、水の存在下で、請求項１〜１１のいずれか１項記載のリパーゼと共にインキュベーションする工程を含む、カルボン酸エステルを加水分解する方法。
22. 請求項１〜１１のいずれか１項記載のリパーゼをパルプに添加する工程、及びインキュベーションする工程を含む、機械パルプの製造プロセス又は機械パルプを用いる製紙プロセスにおけるピッチの問題をコントロールする方法。
23. インキュベーションが、６０〜９５℃、特に７５〜９０℃で行われる、請求項１５〜２２のいずれか１項記載の方法。
24. インキュベーションが、ｐＨ範囲、４．５〜１１、特に５〜６．５で行われる、請求項１５〜２３のいずれか１項記載の方法。
25. 請求項１〜１１のいずれか１項記載の脂肪分解酵素を、ダフへ添加する工程を含む、ダフ又はダフから調製された焼き製品を調製する方法。
26. 請求項１〜１１のいずれか１項記載の脂肪分解酵素の存在下で、エステルを水と反応する工程、酸をアルコールと反応する工程、又はエステルを、酸、アルコールもしくは第二エステルによりエステル交換する工程を含む、加水分解、合成又はエステル交換する方法。
27. 織物から疎水性エステルを酵素的に除去する方法であり、織物から疎水性エステル除去を達成するのに有効な量の請求項１〜１１のいずれか１項記載の脂肪分解酵素で織物を処理する工程を含む方法。