ES2183113T5 - Reduccion de componentes con contenido en fosfolipidos en aceites comestibles conteniendo una cantidad elevada de fosforo no hidratable con el uso de una fosfolipasa, de una fosfolipasa de un hongo filamentoso que presenta actividad de fosfolipasa a y/o b. - Google Patents
Reduccion de componentes con contenido en fosfolipidos en aceites comestibles conteniendo una cantidad elevada de fosforo no hidratable con el uso de una fosfolipasa, de una fosfolipasa de un hongo filamentoso que presenta actividad de fosfolipasa a y/o b. Download PDFInfo
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Abstract
LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A UN METODO PARA REDUCIR EL CONTENIDO EN COMPONENTES QUE CONTIENEN FOSFORO EN ACEITES COMESTIBLES QUE INCLUYEN UNA ELEVADA CANTIDAD DE FOSFORO NO HIDRATABLE, DONDE DICHO METODO INCLUYE EL USO DE UNA FOSFOLIPASA. LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE ADEMAS A UN ENZIMA CON ACTIVIDAD FOSFOLIPASA, UNA SECUENCIA DE ADN CLONADA QUE CODIFICA EL ENZIMA CON ACTIVIDAD FOSFOLIPASA, UN METODO PARA PRODUCIR EL ENZIMA, Y EL USO DE DICHO ENZIMA EN UNA SERIE DE APLICACIONES INDUSTRIALES.
Description
Reducción de componentes con contenido en
fosfolípidos en aceites comestibles conteniendo una cantidad elevada
de fósforo no hidratable con el uso de una fosfolipasa, de una
fosfolipasa de un hongo filamentoso que presenta actividad
fosfolipasa A y/o B.
La presente invención se refiere a un método
para reducir el contenido de componentes con fósforo en un aceite
comestible que incluye una elevada cantidad de fósforo no
hidratable, mediante el uso de una fosfolipasa.
Además, la presente invención se refiere a una
enzima con actividad fosfolipasa, a una secuencia clonada de ADN que
codifica la enzima con actividad fosfolipasa, a un método para
producir la enzima y al uso de dicha enzima para varias aplicaciones
industriales.
Se conoce el uso de la fosfolipasa para el
desgomado enzimático de un aceite comestible desgomado con agua (US
5.264.367, Metallgesellschaft, Röhm) para reducir el contenido de
fósforo de dicho aceite comestible desgomado con agua.
No obstante, este proceso puede mejorarse,
especialmente para realizar el desgomado enzimático de aceites
comestibles que incluyen una alta cantidad de fósforo no hidratable
(NHP) y/o cantidades relativamente altas de mucílago.
Consecuentemente, un objetivo de la invención es
proporcionar un método para reducir el contenido de componentes con
fósforo de dichos aceites, donde dicho método consta del uso de una
fosfolipasa.
Fosfolípidos, como lecitina o fosfatidicolina,
consisten en glicerol esterificado con dos ácidos grasos en una
posición externa (sn-1) y mediana
(sn-2) y esterificados con ácido fosfórico en la
tercera posición; el ácido fosfórico, a su vez, puede ser
esterificado para un aminoalcohol. Las fosfolipasas son enzimas que
participan en la hidrólisis de fosfolípidos. Pueden distinguirse
diferentes tipos de actividad fosfolipasa, incluyendo fosfolipasas
A_{1} (PLA_{1}) y A_{2} (PLA_{2}), las cuales hidrolizan un
grupo acilo graso (en la posición sn-1 y
sn-2, respectivamente) para formar lisofosfolípido;
y la lisofosfolipasa (o fosfolipasa B (PLB)), la cual puede
hidrolizar el grupo acilo graso restante en lisofosfo-
lípido.
lípido.
Esta invención se refiere i.a. a una fosfolipasa
fúngica filamentosa que tiene la capacidad de hidrolizar uno y/o
ambos grupos acilos grasos en un fosfolípido (es decir, presenta
actividad PLA y/o PLB).
Numerosas referencias describen la
caracterización de la fosfolipasas fúngicas. Con el objetivo obtener
una perspectiva del estado de la técnica precedente más fácilmente,
las referencias se han agrupado en dos secciones.
La primera sección trata las referencias que
describen la identificación de las fosfolipasas fúngicas, las cuales
no se cree actualmente que están relacionadas con la fosfolipasa
fúngica de la presente invención. Estas referencias se incluyen
principalmente con el objetivo de resumir el estado de la técnica
dentro del campo de la caracterización de las fosfolipasas
fúngicas.
La segunda sección trata las referencias que
describen la caracterización de las fosfolipasas fúngicas, las
cuales se cree que tienen relevancia en cuanto a las fosfolipasas
fúngicas de la presente invención.
Se han encontrado enzimas con actividad
fosfolipasa A y/o B en varias fuentes fúngicas, incluyendo
Penicillium notatum (también conocido como P.
chrysogenum] N. Kawasaki, J. Biochem., 77,
1233-44, 1975; N. Masuda et al., Eur. J.
Biochem., 202, 783-787, 1991), P. cyclopium
(Process Biochemistry 30(5): 393-401 (1995)),
Saccharomyces cerevisiae (M. Ichimasa et al., Agrie.
Biol. Chem., 49 (4), 1083-89, 1985; F. Paultauf
et al., J. Biol. Chem., 269, 19725-30, 1994),
Torulaspora delbrueckii (del antiguo nombre Saccharomyces
rosei; Y. Kuwabara, Agrie. Biol. Chem., 52 (10),
2451-58, 1988; FEMS, Microbiol. Letters, 124,
29-34), Schizosaccharomyces pombe (H. Oishi
et al., Biosci. Biotech. Biochem., 60 (7),
1087-92, 1996), Aspergillus niger (Technical
Bulletin, G-zyme^{TM} G999, Enzyme
Bio-Systems Ltd.; Process Biochemistry 30(5):
393-401 (1995)) y Corticium centrifugum (S.
Uehara et al., Agrie. Biol. Chem., 43 (3),
517-525,1979).
La EP 575133 A2 describe el aislamiento y la
caracterización de una fosfolipasa fúngica A1 obtenida a partir de
Aspergillus y su uso para aplicaciones industriales.
No se describe ninguna información de la
secuencia (ni ADN ni aminoácido) en la solicitud, ni ninguna
estrategia o sugerencia para clonar cualquiera de las fosfolipasas
de Aspergillus discutidas o indicadas en la solicitud.
Tsung-Che et al.
(Phytopatological notes 58:1437-38 (1968)) describe
brevemente la caracterización de una fosfolipasa de Fusarium
solani.
La EP130064 describe una fracción aislada de un
caldo de fermentación que presenta actividad lipasa obtenida de la
cepa de Fusarium oxysporum, DSM 2672. Además, se describe su
uso en las composiciones detergentes. No obstante, la EP 130.064 no
describe esta fracción como exposición de cualquier actividad
fosfolipasa.
La WO 96/13579 describe una lipasa obtenida de
la cepa de Fusarium culmorum, CBS 513.94 que incluye su
secuencia N-terminal.
No obstante, la WO 96/13579 no describe una
enzima que presenta actividad fosfolipasa.
Se describe una secuencia de ADNc que codifica
una lipasa de Fusarium heterosporum (Cloning and nucleotide
sequence of cDNA encoding a lipase from Fusarium
heterosporum, J. Biochem. 116, 536-540, 1994).
Se cree que esta secuencia actualmente es la secuencia de ADN más
relacionada en comparación con una secuencia clonada de ADN de la
invención (Véase sección "Comparación con la técnica
precedente" (véase abajo). No obstante, esta referencia no
describe una enzima con actividad fosfolipasa.
Se describe una secuencia de ADNc que codifica
una fosfolipasa B de Penicillum notatum (Eur. J. Biochem
202:783-787, 1991). Sin embargo, esta secuencia
clonada de ADN tiene una homología muy limitada a una secuencia de
ADN de la invención (Véase sección "Comparación con la técnica
precedente" (véase abajo).
En la técnica se conocen varios usos de la
fosfolipasas, como el uso de la fosfolipasa en, p. ej. el desgomado
enzimático de un aceite desgomado con agua (US 5.264.367,
Metallgesellschaft, Röhm); tratamiento del hidrolizado de almidón
(particularmente del almidón del trigo) para mejorar la
filtrabilidad (EP 219.269, CPC International); como aditivo para la
masa del pan para mejorar la elasticidad del mismo (US 4.567.046,
Kyowa Hakko); y para la preparación de lisolecitina con propiedades
emulsionantes especiales.
Actualmente, la fosfolipasa Lecitase® (Novo
Nordisk A/S) se usa comercialmente para el desgomado de aceites.
Lecitase® es una enzima mamífera obtenida del páncreas de cerdo.
Es bien conocida la posibilidad de producir
enzimas fúngicas recombinantemente con rendimientos aceptables
industrial y económicamente, especialmente a partir de hongos
filamentosos.
Consecuentemente, un objetivo de esta invención
es proporcionar una fosfolipasa mejorada p. ej. para el uso en los
procesos anteriormente descritos.
Además, un objetivo de la presente invención es
describir unos procesos y métodos para la producción recombinante
con rendimientos aceptables industrialmente de una fosfolipasa
obtenida de un hongo filamentoso.
La presente invención se describe en referencia
a las reivindicaciones anexas.
El desgomado de agua de aceites comestibles se
realiza mediante extracción con agua. En dicho tratamiento, una
parte de los fosfátidos se deja en el aceite. Dicha parte está
descrita por el término genérico "fosfátidos no hidratables"
(NHP). En la producción de aceites, es esencial eliminar el
contenido de NHP (US 5264367).
La presente invención proporciona un método para
eliminar el contenido de NHP en un aceite que incluye una cantidad
relativamente alta de NHP.
En consecuencia, en un primer aspecto la
invención se refiere a un método para reducir el contenido de los
componentes con fósforo en un aceite comestible que tiene un
contenido de fósforo no hidratable de al menos 50 partes por millón
medido por,
- i)
- tratamiento previo del aceite comestible, a 60ºC, mediante la adición de una solución que incluye monohidrato de ácido cítrico en agua (agua añadida vs. aceite equivale al 4,8% peso/peso; [ácido cítrico] en fase de agua = 106 mM, en emulsión de agua/aceite = 4,6 mM) durante 30 minutos;
- ii)
- transferencia de 10 ml del agua tratada previamente en emulsión de aceite a un tubo;
- iii)
- calentamiento de la emulsión al baño maría durante 30 minutos;
- iv)
- centrifugado a 5000 rpm durante 10 minutos,
- v)
- transferencia de aproximadamente 8 ml de la fase superior (de aceite) a un tubo nuevo y asentamiento durante 24 horas; y
- vi)
- posteriormente, extracción de 2 gr. de la fase clara superior para la medición del contenido de fósforo no hidratable (partes por millón) en el aceite comestible;
y donde dicho método consta del,
contacto de dicho aceite a un pH de
1,5-8 con una solución acuosa de una fosfolipasa
A_{1}, una fosfolipasa A_{2} o una fosfolipasa B, cuya solución
está emulsionada en el aceite hasta que el contenido de fósforo del
aceite se reduce a menos de 11 partes por millón y posterior
separación de la fase acuosa del aceite tratado.
En la presente, se describe una nueva
fosfolipasa clonada.
Nuevas investigaciones de la actividad lipasa
encontrada en Fusarium oxysporum, DSM 2672 (y descrita en EP
130.064) revelan que la fracción aislada consta de diferentes
componentes que tienen actividad lipasa, de los cuales uno
presentaba actividad fosfolipasa.
A pesar de varias dificultades técnicas (véase
abajo), los presentes inventores han sido capaces de clonar una
enzima que presenta actividad fosfolipasa A de una cepa del género
Fusarium, más específicamente Fusarium oxysporum.
Ésta es la primera vez que una fosfolipasa A
fúngica filamentosa ha sido clonada y, en consecuencia, la presente
invención proporciona una secuencia clonada de ADN que codifica una
enzima de la fosfolipasa A fúngica filamentosa.
En consecuencia, un aspecto de la invención se
refiere a una secuencia clonada de ADN que codifica un polipéptido
que tiene actividad fosfolipasa A, donde la secuencia de ADN se
obtiene a partir de un hongo filamentoso.
Se describe una secuencia de ADNc que codifica
una fosfolipasa B de Penicillum notatum en Eur. J. Biochem
202:783-787, 1991.
No obstante, esta secuencia de ADN muestra
solamente una identidad de ADN muy limitada del 39% a la secuencia
de ADN de la presente invención (SEC ID No 1
23-1060) y, además, una característica fisiológica
como masa molecular varía considerablemente entre dicho PLB de P.
notatum (66 kDa) y una fosfolipasa de la invención (29 \pm 10
kDa (véase abajo).
Además, una comparación con el nucleótido de la
técnica precedente y secuencias de aminoácidos demuestran que la
secuencia de ADN y/o la secuencia de aminoácidos codificada
correspondiente de la invención tiene sólo una pequeña homología en
comparación con cualquier secuencia de ADN y/o de aminoácidos de la
técnica precedente (véase abajo).
En consecuencia, actualmente se cree que la
información de la secuencia de ADN proporcionada en la presente
solicitud será altamente valiosa para, por ejemplo, clonar otra
fosfolipasa relacionada/homóloga que codifica secuencias de ADN,
puesto que una sonda de hibridación específica y/o cebadores PCR
pueden ahora fácilmente construirse basándose en dicha secuencia de
ADN de la invención.
Además, actualmente se cree que es posible
clonar una fosfolipasa A relacionada/homóloga y/o fosfolipasa B que
codifica secuencias de ADN basada en la información de la secuencia
proporcionada por la presente solicitud.
En consecuencia, en otro aspecto la invención se
refiere a una secuencia clonada de ADN que codifica una enzima que
presenta actividad fosfolipasa A y/o fosfolipasa B, cuya secuencia
de ADN está seleccionada del grupo que incluye:
- (a)
- la fosfolipasa A que codifica parte de la secuencia de ADN clonada en plásmido pYES 2,0 presente en Escherichia coli DSM 11299;
- (b)
- la secuencia de ADN mostrada en las posiciones 23-1063 en la SEC ID NO 1, más preferiblemente en las posiciones 113-1063 en la SEC ID No 1, o incluso más preferiblemente en las posiciones 113-929 en la SEC ID No 1, o su cadena complementaria;
- (c)
- una secuencia de ADN que es homóloga al menos en un 70% con dichas secuencias de ADN definidas en (a) o (b);
- (d)
- una secuencia de ADN definida en (a) o (b), la cual codifica un polipéptido que presenta actividad fosfolipasa y es homóloga al menos en un 70% con la secuencia polipeptídica mostrada en las posiciones 31-346 de la SEC ID No 2, o más preferiblemente homóloga al menos en un 70% con la secuencia polipeptídica mostrada en las posiciones 31-303 de la SEC ID No 2;
- (e)
- una secuencia de ADN que se hibridiza con una sonda de ADN de doble cadena que incluye la secuencia de ADN mostrada en las posiciones 23-1063 en la secuencia ID No 1 a baja astringencia;
- (f)
- una secuencia de ADN que codifica para un polipéptido que tiene las mismas secuencias de aminoácidos en los residuos de las posiciones 1 a 346, 31 a 303 o 31 a 303 de la SEC ID No 2, o las secuencias de aminoácidos incluidas por cualquiera de las secuencias de ADN de (e); y
- (g)
- una secuencia de ADN que es un fragmento de las secuencias de ADN especificadas en (a), (b), (c), (d), (e), o (f).
Además, una fosfolipasa de la invención ha sido
intensivamente caracterizada y se ha descubierto que tiene actividad
fosfolipasa con un pH bajo; esta propiedad es muy adecuada para el
uso en el desgomado del aceite. La fosfolipasa no es un enlace de
membrana, el cual es adecuado para la producción comercial y
purificación.
En consecuencia, en otro aspecto la invención se
refiere a un polipéptido aislado que tiene actividad fosfolipasa A,
cuyo polipéptido se obtiene de una cepa del género Fusarium y
tiene
- i)
- actividad PLA en el margen de pH 3-10, medido a 40ºC;
- ii)
- una masa molecular de 29 \pm 10 kDa, como se determina por SDS-PAGE;
- iii)
- un punto isoeléctrico (pI) en el margen 4,5-8;
- iv)
- una temperatura óptima para la actividad fosfolipasa en el margen entre 25-55ºC, medido con lecitina como sustrato con un pH 5; y/o
- v)
- un pH óptimo para una actividad fosfolipasa en el margen de pH entre 6-12, medido con lecitina como sustrato a 37ºC.
Se muestra una secuencia de aminoácidos deducida
de una fosfolipasa aislada de la invención en la secuencia ID No
2.
Se ha determinado la secuencia
N-terminal de aminoácidos de una fosfolipasa madura,
secretada y aislada. Dicha secuencia N-terminal
demuestra que la parte madura de una fosfolipasa de la invención, la
cual tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la secuencia ID
No 2, comienza en el aminoácido No 31 en la secuencia ID No 2. Véase
el ejemplo para más detalle (véase abajo).
Además, se ha determinado la secuencia
C-terminal de una fosfolipasa activa y secretada de
la invención, la cual tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en
la SEC ID No 2. Dicha fosfolipasa C-terminal
determinada fue expresada recombinantemente en la cepa fúngica
filamentosa Aspergillus oryzae. Véase el ejemplo para más
referencia.
Estos resultados muestran que la enzima fue
procesada en C-terminal durante la expresión de
A. oryzae, y los resultados indican que el Ser303 en SEC ID
No 2 es el residuo C-terminal más posible en la
enzima activa y madura expresada. No obstante, está previsto que
pueda incluso tener lugar un tratamiento adicional de
C-terminal (dando un fragmento de dichas
secuencias), y teniendo todavía una enzima activa y madura
expresada.
En consecuencia, en otro aspecto la invención se
refiere a una enzima aislada que presenta actividad fosfolipasa A
y/o B siendo seleccionada del grupo que incluye:
- (a)
- un polipéptido codificado por la fosfolipasa A y/o B que codifica parte de la enzima de la secuencia de ADN clonada en plásmido pYES 2,0 presente en Escherichia coli DSM 11299;
- (b)
- un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en las posiciones 31-346 de la SEC ID No 2;
- (c)
- un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en la posición 31-303 de la SEC ID No 2;
- (d)
- un análogo del polipéptido definido en (a), (b) o (c) cuyo análogo es homólogo en al menos un 70% con dicho polipéptido; y
- (e)
- un fragmento de (a), (b) (c) o (d).
En la presente se describe un vector
recombinante de expresión, el cual facilita la producción heteróloga
recombinante de una enzima de la invención. De ese modo puede
conseguirse una composición de la fosfolipasas altamente purificada,
caracterizada por estar libre de impurezas homólogas. Esto resulta
de una gran ventaja para numerosas aplicaciones industriales.
Los Ejemplos demuestran experimentalmente (véase
abajo) que una fosfolipasa obtenida de una cepa de Fusarium
culmorum y Fusarium oxysporum ha mejorado sus propiedades
para el uso en aplicaciones industriales relevantes. Está previsto
que las fosfolipasas obtenidas de una cepa del género
Fusarium mejorará sus propiedades relevantes para el uso en
aplicaciones industriales relevantes.
En la presente se describe el uso de una
fosfolipasa obtenida de una cepa del género Fusarium, como
una cepa de F. culmorum, F. heterosporum, F.
solani, o en particular una cepa de Fusarium oxysporum,
en un proceso que comprende el tratamiento de un fosfolípido o
lisofosfolípido con fosfolipasa para hidrolizar los grupos acilos
grasos.
En la presente se describe un cultivo biológico
aislado y substancialmente puro de la cepa Escherichia coli
DSM No.11299 que alberga una secuencia de ADN que codifica una
fosfolipasa (la parte que codifica la fosfolipasa de la secuencia de
ADN clonada en plásmido pYES 2,0 presente en Escherichia coli
DSM 11299) obtenida de una cepa fúngica filamentosa Fusarium
oxysporum, o cualquier mutante de dicha cepa E. coli que
ha retenido la capacidad de codificación de la fosfolipasa.
Se realizó una búsqueda de homología con la
fosfolipasa de la invención contra el nucleótido y bases de datos de
proteínas. La búsqueda de homología muestra que la secuencia más
relacionada conocida era una lipasa de Fusarium heterosporum
(en la figura 1 se ilustra una alineación de aminoácidos).
La secuencia de ADN de la invención (SEC ID No 1
23-1060) que codifica la fosfolipasa muestra sólo el
62% de homología del ADN con la secuencia de la lipasa conocida de
Fusarium heterosporum (referencia S77816 de la base de datos
Genbank), y la correspondiente secuencia de aminoácidos de la
fosfolipasa de la invención (SEC ID No 2) muestra sólo el 60% de
homología con una secuencia de aminoácidos deducida basada en la
secuencia de ADN conocida anteriormente mencionada (véase figura
1).
Esto demuestra que la secuencia de ADN y/o la
secuencia de aminoácidos de una fosfolipasa de la invención es de
hecho diferente de cualquier secuencia(s) conocida(s)
de ADN y/o de aminoácidos.
Se describe una secuencia de ADNc que codifica
una fosfolipasa B de Penicillum notatum (Eur. J. Biochem
202:783-787, 1991). No obstante, esta secuencia de
ADN (referencia X60348 de la base de datos Genbank) muestra
solamente una identidad del ADN muy limitada 39%, para la secuencia
de ADN de la presente invención (SEC ID No 1,
23-1060), y la secuencia de aminoácidos
correspondiente de la fosfolipasa de la invención (SEC ID No 2)
muestra solamente el 20% de identidad para una secuencia de
aminoácidos deducida basada en la secuencia conocida de ADN de PLB
anteriormente mencionada.
El cálculo de la homología se realizó como se
describe más adelante en esta especificación.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 1: Alineación de la secuencia de
aminoácidos mostrada en SEC ID No 2 con una secuencia de lipasas de
la técnica precedente de Fusarium heterosporum.
Figura 2: Comparación de la capacidad de
desgomado enzimático de Lecitase^{TM} y una fosfolipasa de
Fusarium oxysporum según la invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Antes de debatir esta invención con más detalle,
se definirán los siguientes términos.
"Una secuencia clonada de ADN": El
término "secuencia clonada de ADN" se refiere a una secuencia
de ADN clonada según los procedimientos de clonación estándar
utilizados en la ingeniería genética para recolocar un segmento de
ADN desde su ubicación natural a un sitio diferente donde se
reproducirá. El proceso de clonación implica la escisión y
aislamiento del segmento de ADN deseado, inserción de la parte de
ADN en la molécula del vector e incorporación del vector
recombinante en una célula donde se duplicarán múltiples copias o
clones del segmento de ADN.
La "secuencia clonada de ADN" de la
invención puede de forma alternativa denominarse "constructo de
ADN" o " polinucleótido clonado que tiene una secuencia de
ADN" "secuencia de ADN aislada".
"Obtenida de": A los efectos de la
presente invención, el término "obtenida de", como se utiliza
en este caso en conexión con una fuente microbiana específica,
significa que la enzima y consecuentemente la secuencia de ADN que
codifica dicha enzima se produce por la fuente específica o por una
célula en la que se ha insertado un gen de la fuente.
"Un polipéptido aislado": Tal como
se define en este caso, el término "un polipéptido aislado" o
"fosfolipasa aislada", como se usa en referencia con la
fosfolipasa de la invención, es una fosfolipasa o parte de la
fosfolipasa la cual está esencialmente libre de otros polipéptidos
no fosfolipasas, p. ej. al menos un 20% puro, preferiblemente al
menos un 40% puro, más preferiblemente un 60% puro, incluso más
preferiblemente un 80% puro, lo más preferiblemente un 90% puro e
incluso lo más preferiblemente un 95% puro, como se determina por el
sistema de
SDS-PAGE.
SDS-PAGE.
Cuando el polipéptido aislado es al menos puro
en un 60%, puede utilizarse el término "un polipéptido muy
aislado". El "polipéptido aislado" puede de forma
alternativa denominarse "polipéptido purificado".
"Impurezas homólogas": Como se
utiliza en este caso, el término "impurezas homólogas"
significa cualquier impureza (p. ej. otro polipéptido que la enzima
de la invención) que se origina de la célula homóloga de la cual se
obtiene originariamente la enzima de la invención. En la presente
invención la célula homóloga puede p. ej. ser una cepa de
Fusarium oxysporum.
"Parte que codifica fosfolipasas":
Como se utiliza en este caso, el término "parte que codifica
fosfolipasas" utilizado en conexión con una secuencia de ADN
significa la región de la secuencia de ADN que corresponde con la
región traducida en una secuencia polipeptídica.
En la secuencia de ADN mostrada en la SEC ID No
1, es la región entre el primer codón de iniciación "ATG"
(codón "AUG" en ARNm) y el codón de terminación siguiente
("TAA", "TAG" o "TGA").
El polipéptido traducido puede adicionalmente,
además de la secuencia madura que presenta actividad fosfolipasa,
comprender una señal N-terminal y/o una secuencia
propeptídica. La secuencia de la señal generalmente guía la
secreción del polipéptido y el propéptido guía generalmente el
pliegue del polipéptido. Para más información véase Egnell, P. et
al. Molecular Microbiol. 6(9):1115-19
(1992) o Stryer, L., "Biochemistry" W.H., Freeman and
Company/New York, ISBN
0-7167-1920-7.
"Modificación(es) de una secuencia
de ADN y/o secuencia de aminoácidos" El término
"modificación(es)" usado en conexión con
modificación(es) de una secuencia de ADN y/o de aminoácidos
como se discute en la presente, está definido para incluir una
modificación química así como una manipulación genética.
La(s) modificación(es) puede(n) ser
sustitución, supresión y/o inserción dentro o en el amino
ácido(s) de interés.
"Fosfolipasa A": El término
"Fosfolipasa A" usado aquí en conexión con una enzima de la
invención se destina para cubrir una enzima con actividad
fosfolipasa A1 y/o Fosfolipasa A2.
- \quad
- \underbar{La fosfolipasa A1} está definida según la clasificación enzimática EC estándar como EC 3.1.1.32.
- \quad
- Nombre oficial: Fosfolipasa A1 (PLA1).
- \quad
- Reacción catalizada:
- \quad
- fosfatidicolina + H(2)O <>
- \quad
- 2-acilglicerofosfocolina + un anión de ácido graso
- \quad
- Comentario(s): tiene una especificidad mucho más amplia que la ec 3.1.1.4.
- \quad
- La \underbar{fosfolipasa A2} está definida según la clasificación enzimática EC estándar como EC 3.1.1.4
- \quad
- Nombre oficial: fosfolipasa A2 (PLA2).
- \quad
- Nombre(s) alternativo(s): fosfatidilcolina 2-acilhidrolasa. lecitinasa a; fosfatidasa; o fosfatidoslipasa.
- \quad
- Reacción catalizada:
- \quad
- fosfatidicolina + h(2)o <>
- \quad
- 1-acilglicerofosfocolina + un anión de ácido graso
- \quad
- Comentario(s): también actúa sobre fosfatidiletanolamina, plasmalógeno de colina y fosfátidos, eliminando el ácido graso retenido en la 2-posición.
\newpage
"Fosfolipasa B": La fosfolipasa
B está definida según la clasificación enzimática EC estándar
como EC 3.1.1.5.
Nombre oficial: lisofosfolipasa.
Nombre(s) alternativo(s):
lecitinasa b; lisolecitinasa; fosfolipasa b; o plb.
Reacción catalizada:
2-lisofosfatidilcolina +
h(2)o <>
glicerofosfocolina + un anión de ácido graso
\vskip1.000000\baselineskip
"Actividad fosfolipasa": El término
"actividad fosfolipasa" o "que tiene/presenta actividad
fosfolipasa" como se utiliza en este caso en conexión con una
enzima de la invención, se destina para especificar una enzima que
tiene al menos la cantidad de actividad fosfolipasa (que sea PLA o
PLB) definida experimentalmente a continuación.
En consecuencia, una enzima que presenta
actividad fosfolipasa se define aquí como una enzima que en el
"ensayo fosfolipásico monomolecular" mostrado en el ejemplo 6
de la presente (véase abajo) tiene una actividad fosfolipasa de al
menos 0,25 nmol/min, dosis enzimática: 60 \mug, a 25ºC; más
preferiblemente al menos 0,40 nmol/min, dosis enzimática: 60 \mug,
a 25ºC; más preferiblemente al menos 0,75 nmol/min, dosis
enzimática: 60 \mug, a 25ºC; más preferiblemente al menos 1,0
nmol/min, dosis enzimática: 60 \mug, a 25ºC; más preferiblemente
al menos 1,25 nmol/min, dosis enzimática: 60 \mug, a 25ºC; e
incluso más preferiblemente al menos 1,5 nmol/min, dosis enzimática:
60 \mug, a 25ºC.
Actualmente se cree que sólo las enzimas que
tienen dicha actividad fosfolipasa significante son de importancia
industrial, por ejemplo para el uso en el desgomado (US
5.264.367).
"Una lipasa con una actividad fosfolipasa
lateral": El término "lipasa con actividad fosfolipasa
lateral" se define, en consecuencia, como una lipasa con una
actividad fosfolipasa lateral, donde la actividad fosfolipasa
lateral en el "ensayo fosfolipásico monomolecular" mostrado en
el ejemplo 6 es menor que las figuras mencionadas anteriormente.
Varias lipasas tienen dicha actividad
fosfolipasa lateral. En el ejemplo 6 de la presente (véase abajo),
se muestran algunas lipasas que tienen una actividad fosfolipasa
lateral.
"Un aceite crudo": Un aceite crudo
(también llamado aceite no desgomado) puede ser un aceite prensado o
extraído o una mezcla derivada de p. ej. semilla de colza, soja o
girasol. El contenido de fosfátidos en un aceite crudo puede variar
de 0,5-3% peso/peso correspondiente a un contenido
de fósforo en el margen de 200-1200 partes por
millón, más preferiblemente en el margen de 250-1200
partes por millón. Aparte de los fosfátidos, el aceite crudo también
contiene pequeñas concentraciones de carbohidratos, compuestos de
azúcar y ácidos metálicos/fosfátidos complejos de Ca, Mg y Fe.
"Un aceite semicrudo": Cualquier
aceite que no es un aceite crudo, pero que tiene un contenido de
fosfátidos de 250 partes por millón, más preferiblemente 500 partes
por millón. Dicho aceite podría p. ej. conseguirse sometiendo un
aceite crudo a un proceso similar al proceso de "aceite desgomado
con agua" descrito a continuación.
"Un aceite desgomado con agua":
Normalmente se obtiene un aceite desgomado con agua mediante la
mezcla de 1-3% peso/peso de agua caliente con aceite
crudo caliente (60-90ºC). Los períodos normales de
tratamiento son de 30-60 minutos. La fase del
desgomado con agua remueve los fosfátidos y gomas mucilaginosas, que
se vuelven insolubles en el aceite cuando se hidratan. Las gomas y
fosfátidos hidratados pueden separarse del aceite mediante
asentamiento, filtración o centrifugado, el centrifugado es la
práctica más predominante.
El objeto esencial en dicho proceso del
desgomado con agua es separar los fosfátidos hidratados del aceite.
La mezcla de agua caliente en el aceite, descrita anteriormente,
debería entenderse aproximadamente como una mezcla de una solución
acuosa en el aceite según los procedimientos estándar de desgomado
con agua en la técnica.
De forma alternativa, el proceso aquí denominado
"aceite desgomado con agua" puede denominarse "refinación
húmeda para eliminar mucílago"(véase US 5.264.367).
\vskip1.000000\baselineskip
En un aspecto, la invención proporciona el uso
de un polipéptido que presenta actividad fosfolipasa A en un proceso
para reducir el contenido de fosfolípido en un aceite comestible,
según se define en la reivindicaciones.
Para la presente invención la cantidad de
fósforo no hidratable en un aceite comestible está medida
mediante,
- i)
- tratamiento previo del aceite comestible, a 60ºC, mediante la adición de una solución que incluye monohidrato de ácido cítrico en agua (agua añadida vs. aceite equivale a 4,8% peso/peso; [ácido cítrico] en fase acuosa = 106 mM, en una emulsión de agua/aceite = 4,6 mM) durante 30 minutos;
- ii)
- transferencia de 10 ml del agua tratada previamente en una emulsión de aceite a un tubo;
- iii)
- calentamiento de la emulsión al baño maría durante 30 minutos;
- iv)
- centrifugado a 5000 rpm durante 10 minutos,
- v)
- transferencia de aproximadamente 8 ml de la fase superior (de aceite) a un tubo nuevo y asentamiento durante 24 horas;
- vi)
- tras del asentamiento, extracción de 2 g de la fase clara superior para la medición del contenido de fósforo no hidratable (partes por millón) en el aceite comestible.
\vskip1.000000\baselineskip
Para más detalles, a continuación se hace
referencia a los ejemplos.
Como se ilustra en los ejemplos de la presente,
la composición de fosfolípidos (fosfolípidos hidratables vs. no
hidratables) de diferentes aceites comestibles varía
considerablemente. Consecuentemente, el nivel de fosfolípido
restante en diferentes aceites desgomados de agua variará sobre una
amplia gama (p. ej. alrededor de 30 partes por millón a 200 partes
por millón).
Para el desgomado enzimático, la dosificación
óptima de enzimas depende de la cantidad de fosfátidos no
hidratables presente después del desgomado con agua o pretratamiento
con ácido cítrico/agua tal como se ha definido anteriormente.
Además, cuanto más alta es la cantidad de
fosfátidos no hidratables presente en el aceite, más eficaz es el
método de desgomado enzimático.
La presente invención proporciona un método para
eliminar el contenido de NHP del aceite que incluye una cantidad
relativamente alta de NHP.
Preferiblemente, el aceite comestible consta de
un contenido de fósforo no hidratable de al menos 60 partes por
millón, más preferiblemente al menos 100 partes por millón e incluso
más preferiblemente de al menos 200 partes por millón.
Más preferiblemente, el aceite comestible consta
de un contenido de fósforo no hidratable en el margen de
60-500 partes por millón, más preferiblemente en el
margen de 100-500 partes por millón e incluso más
preferiblemente en el margen de 200-500 partes por
millón.
Un aceite comestible definido como que tiene una
cantidad relativamente alta de fósforo no hidratable, según esta
descripción, puede ser un aceite desgomado con agua o más
preferiblemente un aceite crudo o un aceite semicrudo.
En consecuencia, una forma de realización de la
invención se refiere a un método según el primer aspecto de la
invención, donde dicho aceite comestible es un aceite crudo,
caracterizado por el hecho de que dicho aceite crudo comestible,
antes de llevar a cabo el método de la invención, es un aceite con
un contenido de fósforo superior a 250 partes por millón (ppm), cuyo
aceite no ha sido desgomado con agua (el desgomado con agua consta
de la mezcla de agua caliente con un aceite crudo caliente seguido
por la eliminación de fosfátidos que se vuelven insolubles en el
aceite cuando se hidratan) antes de llevar a cabo el método de la
invención.
Preferiblemente, dicho aceite comestible crudo
tiene, antes de llevar a cabo dicho método de la invención, un
contenido de fósforo superior a 350 partes por millón, más
preferiblemente superior a 400 partes por millón, incluso más
preferiblemente superior a 500 partes por millón y más
preferiblemente superior a 600 partes por millón.
Además, dicho aceite comestible crudo
preferiblemente tiene, antes de llevar a cabo dicho método de la
invención, un contenido de fósforo en el margen de
250-1500 partes por millón, más preferiblemente en
el margen de 350-1500 partes por millón, incluso más
preferiblemente en el margen de 500-1500 partes por
millón y más preferiblemente en el margen de
500-1500 partes por millón.
El método del desgomado enzimático de un aceite
comestible crudo según la invención es de ventaja sobre el método de
la técnica precedente para el desgomado enzimático de aceites
comestibles desgomados con agua (US 5.264.367), puesto que un método
de desgomado enzimático directo para el tratamiento de un aceite
crudo, según la invención, eliminará la fase previa del desgomado
con agua del aceite.
Esto ahorra tiempo y dinero. Normalmente se
obtiene un aceite desgomado con agua mediante la mezcla de agua
caliente con aceite crudo caliente (60-90ºC) durante
normalmente 30-60 minutos. Por el contrario, el
proceso completo de desgomado enzimático de aceites crudos según la
invención puede realizarse en menos de 1 hora, con tratamiento
enzimático real durante alrededor de 25 minutos. Véanse los ejemplos
para más detalles.
Además, un aceite comestible definido como que
tiene una cantidad relativamente alta de un fósforo no hidratable,
según esta descripción, puede ser un aceite semicrudo.
En consecuencia, una forma de realización de la
invención se refiere a un método según el primer aspecto de la
invención, donde dicho aceite comestible es un aceite comestible
semicrudo, caracterizado por el hecho de que dicho aceite comestible
semicrudo, antes de llevar a cabo el método de la invención, tiene
un contenido de fósforo superior a 500 partes por millón (ppm), y
donde dicho aceite ha sido desgomado con agua antes de llevar a cabo
el método de la invención.
Preferiblemente, dicho aceite comestible
semicrudo es un aceite que, antes de llevar a cabo dicho método,
tiene un contenido de fósforo superior a 600 partes por millón
(ppm), más preferiblemente superior a 750 partes por millón
(ppm).
En general, el desgomado con agua de un aceite
comestible reducirá los contenidos de fósforo del aceite a un nivel
inferior a 500 ppm.
En consecuencia, un aceite semicrudo como se
describe en este caso puede p. ej. haber sido sólo parcialmente
desgomado con agua antes de llevar a cabo un método para reducir el
nivel de componentes con fósforo de un aceite comestible según la
invención.
El término "desgomado parcialmente con
agua" denota que el procedimiento de desgomado con agua del
aceite ha sido sólo un proceso parcial/corto en comparación con el
procedimiento de desgomado con agua estándar.
Un proceso "parcialmente desgomado con
agua" puede realizarse mezclando sólo un 0,5% de agua caliente en
el aceite (el estándar es 1-3% de agua caliente.
Véase sección "Definiciones") o reduciendo el período de
tratamiento a 10 minutos (el estándar es 30-60
minutos).
De forma alternativa, un aceite semicrudo tal
como se define aquí, puede ser una mezcla de un aceite crudo y un
aceite semicrudo.
Una forma de realización de la invención se
refiere a un método según cualquiera del primer aspecto de la
invención, la cual comprende las fases siguientes:
- i)
- ajuste de la temperatura del aceite comestible a una temperatura entre 25ºC-70ºC;
- ii)
- tratamiento previo del aceite comestible a la anterior temperatura ajustada mediante la adición de un 0,5-6% (por peso relativo al aceite) de una solución acuosa que incluye al menos el 85% de agua durante 5-120 minutos, donde dicho pretratamiento no está seguido por la extracción de mucílago hidratado y contenido de fósforo en el aceite;
- iii)
- ajuste del pH de la emulsión de agua/aceite a un pH entre 1,5-8 (p. ej. mediante la adición de una cantidad adecuada de una solución de NaOH);
- iv)
- contacto de la emulsión agua/aceite con una solución acuosa de una fosfolipasa (a una temperatura (+/- 5ºC) ajustada según la fase i), cuya fosfolipasa se emulsiona en el aceite hasta que el contenido fosfórico del aceite se reduce a menos de 11 ppm;
- v)
- separación de la fase acuosa del aceite tratado.
La temperatura del aceite comestible en la fase
i) se ajusta preferiblemente a una temperatura que es la temperatura
óptima de la actividad fosfolipasa de la enzima usada en el
método.
Para la fosfolipasa comercialmente disponible
Lecitase^{TM} (Novo Nordisk A/S), ésta es de alrededor 60ºC, y
para una fosfolipasa de la invención obtenida a partir del género
fúngico filamentoso Fusarium, es de alrededor 45ºC. Véanse
los ejemplos para más detalles en relación a esta cuestión.
Está previsto que una mayoría de la fosfolipasas
fúngicas filamentosas tendrán una temperatura óptima de alrededor
35-50ºC.
En consecuencia, una forma de realización de la
invención se refiere al método descrito anteriormente, donde la
temperatura del aceite comestible en la fase i) está ajustada a una
temperatura entre 35ºC-50ºC y la fosfolipasa usada
en la fase iv) se obtiene de una cepa fúngica filamentosa.
En la fase ii) del método anterior, el aceite
comestible es previamente tratado en la temperatura ajustada (fase
i) mediante la adición de un 0,5-6% (por peso
relativo al aceite) de una solución acuosa que incluye al menos el
85% de agua durante 5-120 minutos y donde dicho
pretratamiento no es seguido por la extracción del contenido de
fósforo y mucílago hidratado en el aceite.
Este paso es un paso del pretratamiento estándar
en el desgomado enzimático de aceites comestibles (US 5.264.367; US
5.558.781). El propósito de la fase ii) es hidratar los componentes
hidratables/hidrofílicos (como el contenido de fósforo hidratable)
en el aceite comestible, el cual cuando se hidrata se vuelve
insoluble en el aceite.
No obstante, esta fase es diferente de lo que se
denomina "desgomado con agua de un aceite comestible" en el
presente contexto. Una diferencia importante es que dicha fase de
pretratamiento no elimina los fosfátidos y mucílago hidratados del
aceite. La extracción de dicho contenido hidratado del aceite es el
objetivo principal del desgomado con agua de los aceites
comestibles.
En consecuencia, cuando la fosfolipasa contacta
con el aceite en la fase iv) anterior, el aceite todavía consta de
dichos fosfátidos y mucílago hidratados.
En otras palabras, si el aceite comestible es un
aceite comestible desgomado sin agua, el método anteriormente
mencionado describe un método de desgomado enzimático simplificado,
el cual no elimina los fosfátidos y mucílago hidratados del aceite
antes de contactar con la fosfolipasa.
Preferiblemente, la solución acuosa que incluye
al menos un 85% de agua (fase ii anterior) consta adicionalmente de
ácido cítrico. Preferiblemente, hay entre un 1-15%
(peso/peso) de ácido cítrico en dicha solución acuosa, más
preferiblemente hay entre un 3-11% (peso/peso) de
ácido cítrico en dicha solución acuosa.
Preferiblemente, el período de tiempo en la fase
ii) es de 15-50 minutos y más preferiblemente de
15-30 minutos.
Para más detalles en relación a dicho
pretratamiento en la fase ii) anterior, se hace referencia a unos
ejemplos en la presente.
En la fase iii) anterior el pH de la emulsión de
agua/aceite se ajusta a un pH de 1,5-8 (p. ej.
mediante la adición de una cantidad adecuada de una solución de
NaOH). Esto se hace con el objetivo de ajustar el valor de pH del
aceite antes de que fosfolipasa contacte con el aceite en la fase
iv). En general, el valor de pH óptimo real dependerá de la enzima
real usada para contactar el aceite en la fase iv). Para más
detalles en relación a esta cuestión, se hace referencia a los
ejemplos.
En general se prefiere, según el primer aspecto
y sus formas de realización de la invención, que el contacto de
dicho aceite con una solución acuosa que incluye una fosfolipasa se
realice en un pH de 1,5-6, más preferiblemente en un
pH de 3-6.
El valor de pH en el agua en la emulsión del
aceite se mide tomando 2 ml de agua de la emulsión del aceite y
mezclándolos con 2 ml de agua. Tras la separación de la fase, la
capa de aceite superior resultante tiene que ser pipetada y el pH
medido en la fase acuosa. Las medidas son transformadas en valores
"reales" de pH por la fórmula siguiente pH_{real} =
pH_{medido} - 0,38. Para más detalles se hace referencia a unos
ejemplos.
Preferiblemente, en un método para reducir la
cantidad de componentes con fósforo en un aceite comestible según la
invención, la cantidad de una fosfolipasa que es emulsionada en el
aceite está en el margen de 0,1-15 mg de enzima
(sustancia seca)/kg de aceite, más preferiblemente
0,25-5 mg de enzima (sustancia seca)/kg de aceite, e
incluso más preferiblemente 0,25-2,5 mg de enzima
(sustancia seca)/kg de aceite.
En general, resulta de ventaja optimizar tanto
la cantidad de la fosfolipasa usada como el tiempo usado para el
desgomado enzimático de un aceite comestible para obtener un
contenido de fósforo inferior a 11 ppm. La dosis de enzima óptima
real y el período de tiempo, i.a., dependerá de la fosfolipasa real
usada. Para más detalles en relación a la optimización de
dosificación de enzimas y período de tiempo del método, se hace
referencia a unos ejemplos.
Preferiblemente, en un método para reducir la
cantidad de componentes con fósforo en un aceite comestible según la
invención, el contenido de fósforo del aceite se reduce a menos de
11 ppm tras el contacto de dicho aceite con 0,5-6 mg
de la fosfolipasa (sustancia seca)/kg de aceite, y donde la
fosfolipasa está en contacto con dicho aceite durante un período de
tiempo de 1-6 horas, más preferiblemente el
contenido de fósforo del aceite se reduce a menos de 11 ppm tras el
contacto de dicho aceite con entre 0,25-2,5 mg de la
fosfolipasa (sustancia seca)/kg de aceite, y donde la fosfolipasa
está en contacto con dicho aceite durante un período de tiempo de 15
minutos a 2 horas.
Véanse los ejemplos para más detalles en
relación a la identificación de temperaturas óptimas para
fosfolipasas individuales.
Preferiblemente, en todos los aspectos y formas
de realización de un método para reducir la cantidad de componentes
con fósforo en un aceite comestible según la invención, el contenido
de fósforo del aceite se reduce a menos de 5 ppm.
El contenido de fósforo en el aceite se mide
como partes por millón (ppm) en la fase de aceite del agua presente
en la emulsión de aceite. El análisis del contenido de fósforo se
realiza según el procedimiento 2.421 en "Standard Methods forte
Analysis of Oils, Fats, and Derivatives, 7^{th} ed.
(1987)". Para más detalles se hace referencia a unos ejemplos en
la presente.
Se describe en la presente un método para
reducir la cantidad de componentes con fósforo en un aceite
comestible según la invención, donde la fosfolipasa se obtiene de
una especie mamífera, en particular donde la fosfolipasa se obtiene
de un páncreas en dicha especie mamífera, y más preferiblemente
donde la fosfolipasa se obtiene de un páncreas de cerdo.
Se describe en la presente un método para
reducir la cantidad de componentes con fósforo en un aceite
comestible según la invención, la fosfolipasa se obtiene de un
microorganismo, preferiblemente un hongo filamentoso, una levadura o
una bacteria.
Preferiblemente, cuando dicho hongo filamentoso
anteriormente mencionado es una especie dentro del género
Fusarium, las cepas preferidas son cepas de F.
culmorum, F. heterosporum, F. solani, o en
particular de F. oxysporum.
Además, cuando dicho hongo filamentoso
anteriormente mencionado es una especie dentro del género
Aspergillus, las cepas preferidas son las cepas de
Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus,
Aspergillus japonicus, Aspergillus niger o en
particular de Aspergillus oryzae.
Además, en un método para reducir la cantidad de
componentes con fósforo en un aceite comestible según la invención,
el aceite comestible es preferiblemente un aceite de soja, aceite de
semilla de girasol o, más preferiblemente, un aceite de semilla de
colza.
Se ha caracterizado intensivamente una
fosfolipasa de la invención obtenida de Fusarium
oxysporum.
En consecuencia, se describe en la presente una
Fosfolipasa A aislada que se obtiene de una cepa del género
Fusarium y tiene actividad fosfolipasa A en el margen de pH
3-10 medido a 40ºC, más preferiblemente que tiene
una actividad fosfolipasa A en el margen de pH 3-7
medido a 40ºC, más preferiblemente que tiene una actividad
fosfolipasa A en el margen de pH 3,5-6 medido a
40ºC, e incluso más preferiblemente que tiene una actividad
fosfolipasa A en el margen de pH 4,5-5,5 medido a
40ºC.
La actividad fosfolipasa A fue determinada con
lecitina de soja como un ensayo de las bases de prueba del sustrato
de NEFA), o en un tampón que incluye 2% Lecitina, 2% Tritón
X-100, 20 mM Britton-Robinson (BR).
Véanse los ejemplos para más detalles.
Se describe en la presente una Fosfolipasa A
aislada, la cual se obtiene de una cepa del género Fusarium,
es preferiblemente una que tiene una masa molecular de 29 \pm 10
kDa, más preferiblemente una masa molecular de 29 \pm 5 kDa,
incluso más preferiblemente una masa molecular de 29 \pm 3 kDa y
más preferiblemente una masa molecular de 29 \pm 2 kDa.
La masa molecular se mide por electroforesis
SDS-PAGE como se describe con más detalle en la
sección "Materiales y Métodos" (véase abajo).
Se describe en la presente una Fosfolipasa A
aislada, la cual se obtiene de una cepa del género Fusarium,
es preferiblemente una que tiene un punto isoeléctrico (pI) en el
margen 4,5-8, más preferiblemente un punto
isoeléctrico (pI) en el margen 5-7,5, e incluso más
preferiblemente un punto isoeléctrico (pI) en el margen
5,5-7,5.
El punto Isoeléctrico (pI) fue determinado
usando placas Ampholine PAGE de Pharmacia. Véase el ejemplo para más
detalles, (véase abajo).
Se describe en la presente una Fosfolipasa A
aislada, la cual se obtiene de una cepa del género Fusarium,
es preferiblemente una que tiene una temperatura óptima para una
actividad fosfolipasa en el margen entre 25-55ºC,
medida con lecitina como sustrato con pH 5; más preferiblemente en
el margen de 30-50ºC, medida con lecitina como
sustrato con pH 5, e incluso más preferiblemente en el margen de
40-50ºC, medida con lecitina como sustrato
con
pH 5.
pH 5.
La temperatura óptima para la actividad
fosfolipasa fue medida en un tampón que incluye 2% lecitina, 2%
Tritón X-100, 20 mM Britton Robinson tampón, con pH
5. Véase ejemplo para más detalles (véase abajo).
Se describe en la presente una Fosfolipasa A
aislada, la cual se obtiene de una cepa del género Fusarium,
es preferiblemente una que tiene una actividad fosfolipasa con pH
óptimo en el margen de pH de 6-12, a 37ºC; más
preferiblemente en el margen de pH de 7-11,5, a
37ºC; más preferiblemente en el margen de pH de
8-11, a 37ºC; e incluso más preferiblemente en el
margen de pH de 8,5-11, a 37ºC.
El pH óptimo de la actividad fosfolipasa fue
determinado en un tampón que incluye 2% Lecitina, 2% Tritón
X-100, 20 mM Britton-Robinson (BR),
a 37ºC. Véanse ejemplos para más detalles.
Se describe en la presente una fosfolipasa que
consta de al menos dos de las cinco características físicas
anteriormente mencionadas de la enzima (numeradas de i) a v)), más
preferiblemente una fosfolipasa de la invención consta de al menos
tres de las cinco características físicas anteriormente mencionadas
de la enzima (numeradas de i) a v)), incluso más preferiblemente una
fosfolipasa de la invención consta de al menos cuatro de las cinco
características físicas anteriormente mencionadas de la enzima
(numeradas de i) a v)), y de la forma más preferible una fosfolipasa
de la invención consta de las cinco características físicas
anteriormente mencionadas de la enzima (numeradas de i) a v)).
Tal como se ha descrito anteriormente, una
fosfolipasa de la invención ha sido clonada, expresada
recombinantemente, purificada, y se han determinado las secuencias
N-terminal y C-terminal de la enzima
activa secretada.
En consecuencia, otra forma de realización de la
invención se refiere a un polipéptido aislado que tiene actividad
fosfolipasa A, cuyo polipéptido se obtiene de una cepa del género
Fusarium y tiene
- i)
- actividad PLA en el margen de pH 3-10, medido a 40ºC;
- ii)
- una masa molecular de 29 \pm 10 kDa, como se ha determinado determinado por SDS-PAGE;
- iii)
- un punto isoeléctrico (pI) en el margen 4,5-8;
- iv)
- una temperatura óptima para una actividad fosfolipasa en el margen de 25-55ºC, medida con lecitina como sustrato con pH 5; y/o
- v)
- un pH de la actividad fosfolipasa óptimo en el margen de pH 6-12, medido con lecitina como sustrato a 37ºC;
y adicionalmente consta de una secuencia de
aminoácidos seleccionada del grupo que incluye:
- (a)
- un polipéptido codificado por la enzima fosfolipasa A que codifica parte de la secuencia de ADN clonada en plásmido pYES 2,0 presente en Escherichia coli DSM 11299;
- (b)
- un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos tal como se muestra en las posiciones 31-346 de la SEC ID No 2;
- (c)
- un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos tal como se muestra en la posición 31-303 de SEC ID No 2;
- (d)
- un análogo del polipéptido definido en (a), (b) o (c), el cual es homólogo en al menos un 70% con dicho polipéptido; y
- (e)
- un fragmento de (a), (b) (c) o (d).
En una forma de realización de la invención, el
polipéptido aislado que tiene actividad fosfolipasa según la
invención es la fosfolipasa con actividad fosfolipasa A1.
El polipéptido aislado que tiene actividad
fosfolipasa según la invención es la fosfolipasa con actividad
fosfolipasa A2 y, en incluso otra forma de realización, el
polipéptido aislado que tiene actividad fosfolipasa es según la
invención la fosfolipasa con actividad fosfolipasa B.
Preferiblemente, dicho polipéptido aislado que
tiene una actividad fosfolipasa según la invención es fosfolipasa
con actividad fosfolipasa A1.
Para ejemplos específicos de técnicas estándar
para medir la actividad individual PLA1, PLA2 y/o PLB se hace
referencia a unos ejemplos.
Se describe en la presente un polipéptido
aislado con actividad fosfolipasa según la invención, donde la
fosfolipasa es una fosfolipasa sustancialmente independiente de una
concentración de Ca^{2+} medida como actividad fosfolipasa
relativa a 5 mM EDTA y 5 mM Ca^{2+} en un ensayo de la actividad
fosfolipasa que mide la liberación de ácidos grasos sin lecitina en
un tampón que incluye 2% lecitina, 2% Tritón X-100,
20 mM citrato, pH 5; incubado durante 10 min. a 37ºC seguido por una
parada de la reacción a 95ºC durante 5 minutos; donde la proporción
de actividad fosfolipasa relativa a 5 mM EDTA/5 mM Ca^{2+} es
superior a 0,25, más preferiblemente superior a 0,5 y más
preferiblemente superior a 0,80.
Para más detalles relativos a la medición de la
dependencia de la actividad enzimática en la concentración
Ca^{2+}, se hace referencia a unos ejemplos.
Algunas lipasas pueden tener una actividad
fosfolipasa limitada. En el presente contexto, esta actividad
fosfolipasa limitada de dichas lipasas se definen como "una lipasa
con actividad fosfolipasa lateral" (véase sección
"Definiciones"). La presente invención se refiere a un
polipéptido aislado que tiene una actividad fosfolipasa, donde la
actividad fosfolipasa de dicho polipéptido aislado es tan alta como
es de relevancia industrial.
En consecuencia, la invención se refiere a un
polipéptido aislado que tiene una actividad fosfolipasa según la
invención, donde la fosfolipasa es una fosfolipasa que tiene una
actividad fosfolipasa que es al menos de 0,25 nmol/min, dosis
enzimática: 60 \mug, a 25ºC; más preferiblemente al menos de 0,40
nmol/min, dosis enzimática: 60 \mug, a 25ºC; medido en un ensayo
de la fosfolipasa monomolecular de la manera siguiente:
- a.
- en un equipo monomolecular (cuba de orden cero) en una superficie íntegramente purificada de una solución tampón (10 mM TRIS, pH 8,0, 25ºC) se extiende una capa monomolecular del fosfolípido DDPC (Di Dicanoil (C10) Fosfatidil Colina) de una solución de cloroformo;
- b.
- tras la relajación de la capa monomolecular (evaporación del cloroformo), se ajusta la presión de la superficie a 15 mN/m, correspondiente a una área media molecular de DDPC de aproximadamente 63 \ring{A}^{2}/molécula;
- c.
- se inyecta una solución tampón (como la anterior) que contiene 60 \mug de enzima a través de la capa monomolecular en la subfase del compartimiento de la reacción (cilindro con área 1520 mm^{2} y volumen 30400 mm^{3}) en el "cuba de orden cero";
- d.
- la actividad enzimática se determina a través de la velocidad de una barrera móvil que comprime la capa monomolecular con el objetivo de mantener la presión de la superficie constante, mientras las moléculas de sustrato insolubles son hidrolizadas en productos de reacción más hidrosolubles, donde el número de moléculas DDPC hidrolizadas por minuto por la enzima se estima desde el área media molecular (MMA) de DDPC.
Véase la sección "Definiciones" y ejemplos
para más descripciones de las cantidades preferidas de las
actividades fosfolipasas para un polipéptido aislado que tiene
actividad fosfolipasa según la invención.
Además, la actividad fosfolipasa específica de
una fosfolipasa según la invención puede medirse mediante unos
ensayos estándar de la actividad fosfolipasa conocidos.
Se describe en la presente un polipéptido
aislado que tiene actividad fosfolipasa según la invención, donde la
fosfolipasa es una fosfolipasa que tiene una actividad fosfolipasa
capaz de liberar al menos 7 \mumol de ácido graso libre/min./mg
enzima; más preferiblemente al menos 15 \mumol de ácido graso
libre/min./mg enzima; incluso más preferiblemente al menos 30
\mumol de ácido graso libre/min./mg enzima, y más preferiblemente
al menos 50 \mumol de ácido graso libre/min./mg enzima medido de
la manera siguiente:
- la actividad fosfolipasa es medida en un ensayo que mide la liberación de ácidos grasos libres de lecitina en un tampón que incluye 2% lecitina, 2% Tritón X-100, 20 mM citrato, pH 5; incubado durante 10 min. a 37ºC seguido por una parada de reacción a 95ºC durante 5 minutos.
Para más detalles relativos a esta forma de
realización de la invención se hace referencia a los ejemplos en la
presente.
Un polipéptido aislado que tiene actividad
fosfolipasa según la invención es muy adecuado para realizar el
desgomado enzimático de un aceite comestible.
\vskip1.000000\baselineskip
En consecuencia, la invención se refiere a:
- 1.
- un polipéptido aislado que tiene actividad fosfolipasa según la invención, donde la fosfolipasa es capaz de realizar el desgomado enzimático de un aceite comestible, según un método de la invención con el objetivo de reducir la cantidad de componentes con fósforo en un aceite comestible que incluye un contenido de fósforo no hidratable de al menos 50 ppm; y
- 2.
- un polipéptido aislado que tiene actividad fosfolipasa según la invención, donde la fosfolipasa es capaz de realizar el desgomado enzimático de un aceite comestible desgomado con agua (que tiene un contenido de fósforo de 50-250 ppm) reduciendo de ese modo el contenido de fósforo del aceite a menos de 11 ppm, donde el proceso del desgomado enzimático consta del contacto de dicho aceite a un pH de 1,5-8 con una solución acuosa de la fosfolipasa que es emulsionada en el aceite hasta que el contenido de fósforo del aceite se reduce a menos de 11 ppm y separando posteriormente la fase acuosa del aceite tratado.
Preferiblemente, el polipéptido aislado que
tiene actividad fosfolipasa según la invención es capaz de realizar
dicho proceso de desgomado enzimático del aceite comestible
desgomado con agua (definido anteriormente) en menos de 1,5 horas y
usa menos de 2 mg fosfolipasa (sustancia seca)/kg de aceite.
Preferiblemente, un polipéptido aislado que
presenta actividad fosfolipasa y que tiene la característica
anteriormente mostrada de la invención se obtiene de una cepa
fúngica filamentosa dentro del género Fusarium.
No obstante, sin limitarse a cualquier teoría
actualmente se contempla que una fosfolipasa de la invención puede
también obtenerse de otro microorganismo, preferiblemente otra cepa
fúngica filamentosa. En la sección "Fuente microbiana" se
ofrecen unos ejemplos (véase abajo).
A pesar de varias dificultades técnicas (véase
abajo sección "Protocolo para la clonación de una fosfolipasa
fúngica filamentosa"), los presentes inventores han sido capaces
de clonar una fosfolipasa que presenta actividad PLA de una cepa del
género Fusarium, más específicamente Fusarium
oxysporum.
Además, actualmente se cree que es posible
clonar una fosfolipasa A y/o una fosfolipasa B relacionada que
codifica la secuencia de ADN basada en la información de la
secuencia proporcionada en la presente solicitud.
Se describe en la presente una secuencia clonada
de ADN que codifica una enzima que presenta actividad fosfolipasa A
y/o fosfolipasa B, cuya secuencia de ADN es seleccionada del grupo
que incluye:
- (a)
- la parte que codifica la fosfolipasa A del polinucleótido clonado en plásmido pYES 2,0 presente en Escherichia coli DSM 11299;
- (b)
- la secuencia de ADN mostrada en la posiciones 23-1063 en la secuencia ID No 1, más preferiblemente las posiciones 113-1063 en la secuencia ID No 1, o incluso más preferiblemente las posiciones 113-929 en la secuencia ID No 1, o su cadena complementaria;
- (c)
- una secuencia de ADN que es homóloga al menos en un 70% con dicha secuencia de ADN definida en (a) o (b);
- (d)
- una secuencia de ADN definida en (a) o (b), la cual codifica un polipéptido que presenta actividad fosfolipasa y es homóloga al menos en un 70% con la secuencia polipeptídica mostrada en las posiciones 31-346 de la secuencia ID No 2, o más preferiblemente homóloga al menos en un 70% con la secuencia polipeptídica mostrada en las posiciones 31-303 de la secuencia ID No 2;
- (e)
- una secuencia de ADN que hibridiza con una sonda de ADN de doble cadena que incluye la secuencia de ADN mostrada en las posiciones 23-1063 en la secuencia ID No 1 con rigor bajo;
- (f)
- una secuencia de ADN que codifica para un polipéptido que tiene las secuencias de aminoácidos de residuos 1 a 346, 31 a 346 o 31 a 303 de la secuencia ID No 2 o las secuencias de aminoácidos codificadas por cualquiera de las secuencias de ADN de (e); y
- (g)
- una secuencia de ADN que es un fragmento de las secuencias de ADN especificadas en (a), (b), (c), (d), (e), o (f).
En esta especificación, cuando se hace
referencia a la parte que codifica fosfolipasa de la secuencia
clonada de ADN en plásmido pYES 2,0 presente en DSM 11299, tal
referencia está también destinada a incluir la parte que codifica la
fosfolipasa de la secuencia de ADN presentada en la secuencia ID No
1.
En consecuencia, los términos "la parte que
codifica la fosfolipasa de la secuencia clonada de ADN en plásmido
pYES 2,0 presente en DSM 11299" y "la parte que codifica la
fosfolipasa de la secuencia de ADN presentada en la secuencia ID No
1" puede utilizarse indistintamente.
La secuencia de ADN puede ser de origen
genómico, ADNc o sintético o de cualquier combinación de los
mismos.
Se describe en la presente una secuencia clonada
de ADN que codifica una enzima que presenta actividad fosfolipasa A
y/o fosfolipasa B que tiene la secuencia de aminoácidos presentados
como la parte madura de la secuencia ID No 2, la cual difiere de la
secuencia ID No 1 por la degeneración del código genético.
La secuencia de ADN mostrada en la SEC ID No 1
y/o una secuencia de ADN análoga de la invención puede clonarse de
una cepa del hongo filamentoso Fusarium oxysporum que produce
la enzima con actividad fosfolipasa, u otro organismo relacionado
como se describe con más detalle a continuación (véase sección
"Fuentes microbianas").
De forma alternativa, la secuencia análoga puede
formarse basándose en la secuencia de ADN presentada como la parte
que codifica la fosfolipasa de la SEC ID No. 1, p. ej. puede ser una
subsecuencia, y/o formarse mediante la introducción de sustituciones
del nucleótido que no originan otra secuencia de aminoácidos de la
fosfolipasa codificada por la secuencia de ADN, pero corresponde con
el uso del codón del organismo huésped destinado a la producción de
la enzima, o por la introducción de sustituciones del nucleótido que
pueden originar una secuencia de aminoácidos diferente (es decir una
variante de la fosfolipasa de la invención).
Cuando se realizan sustituciones del nucleótido,
los cambios de aminoácidos son preferiblemente de carácter menor, es
decir sustituciones conservadoras del aminoácido que no afectan
significativamente al pliegue o actividad de la proteína; pequeñas
eliminaciones, normalmente de uno hasta aproximadamente 30
aminoácidos; pequeñas extensiones de aminoterminales o
carboxilterminal, como un residuo aminoterminal de metionina; un
péptido de enlace pequeño de hasta aproximadamente
20-25 residuos; o una pequeña extensión que facilita
la purificación, como un tracto polihistidina; un epítopo antigénico
o un dominio de unión.
Ejemplos de sustituciones conservadoras están
dentro del grupo de aminoácidos básicos, como arginina, lisina,
histidina; aminoácidos ácidos, como ácido glutámico y ácido
aspártico; aminoácidos polares, como glutamina y asparragina;
aminoácidos hidrofóbicos, como leucina, isoleucina, valina;
aminoácidos aromáticos, como fenilalanina, triptófano, tirosina; y
aminoácidos pequeños, como glicina, alanina, serina, treonina,
metionina. Para una descripción general de sustitución del
nucleótido, véase p. ej. Ford et al., (1991), Protein
Expression and Purífication 2, 95-107.
Será obvio para los expertos en la técnica que
dichas sustituciones pueden llevarse a cabo fuera de las regiones
fundamentales para la función de la molécula y dando todavía como
resultado un polipéptido activo. Aminoácidos esenciales para la
actividad del polipéptido codificado por la secuencia clonada de ADN
de la invención y en consecuencia no sometida preferiblemente a la
sustitución pueden identificarse según unos procedimientos conocidos
en la técnica, como mutagénesis dirigida o mutagénesis de escaneado
de alanina (cf. p. ej. Cunningham y Wells, (1989), Science 244,
1081-1085). En la última técnica, las mutaciones se
introducen en cada residuo de la molécula y las moléculas mutantes
producidas se evalúan por su actividad biológica (es decir
fosfolipasa) para identificar los residuos de aminoácidos que son
fundamentales para la actividad de la molécula. También pueden
determinarse los lugares de interacción
substrato-enzima mediante análisis de la estructura
cristalina tal como se determina por técnicas como el análisis de
resonancia magnética nuclear, cristalografía o marcado por
fotoafinidad (cf. p. ej. de Vos et al., (1992), Science 255,
306-312; Smith et al., (1992), J. Mol. Biol.
224, 899-904; Wlodaver et al., (1992), FEBS
Lett. 309, 59-64).
Los polipéptidos de la presente invención
incluyen también polipéptidos fundidos o polipéptidos divisibles por
fusión, en los cuales está fundido otro polipéptido en el
N-terminal o el C-terminal del
polipéptido o fragmento del mismo. Un polipéptido fundido se produce
al fundir una secuencia de ácido nucleico (o una porción) que
codifica otro polipéptido para una secuencia de ácido nucleico (o
una porción) de la presente invención. En la técnica se conocen
técnicas para la producción de polipéptidos fundidos e incluyen la
ligadura de las secuencias de codificación que codifican los
polipéptidos de modo que se encuentran en "marco" y de modo que
la expresión del polipéptido fundido está bajo control del mismo
promotor(es) y terminador.
La secuencia de ADN de la invención puede
clonarse de la cepa Escherichia coli DSM No. 11299 usando
técnicas de clonación estándar p. ej. tal como está descrito por
Sambrook et al., (1989), Molecular Cloning: A Laboratory
Manual. Cold Spring Harbor Lab.; Cold Spring Harbor, NY.
Puesto que los presentes inventores han resuelto
el problema de desarrollar un ensayo de rastreo adecuado para su uso
en una técnica de clonación por expresión para clonar una
fosfolipasa de la invención, véase la sección con el título
"Protocolo para la clonación de una fosfolipasa fúngica
filamentosa", la secuencia de ADN de la invención puede ahora
clonarse por cualquier método general que implique
- \bullet
- clonación, en vectores adecuados, una biblioteca de ADNc de cualquier organismo supuesto para producir la fosfolipasa de interés,
- \bullet
- transformación de células huésped de levadura adecuadas con dichos vectores,
- \bullet
- cultivo de las células huésped bajo condiciones adecuadas para expresar cualquier enzima de interés codificada por un clon en la biblioteca de ADNc,
- \bullet
- selección de clones positivos determinando cualquier actividad fosfolipasa de la enzima producida por dichos clones, y
- \bullet
- aislamiento del ADN que codifica la enzima de dichos clones.
De forma alternativa, puesto que la presente
invención proporciona por primera vez una secuencia clonada de ADN
que codifica una enzima PLA fúngica filamentosa, el ADN que codifica
una fosfolipasa de la invención puede, según procedimientos bien
conocidos, ser clonado convenientemente de una fuente adecuada como
cualquiera de los organismos mencionados en la sección "Fuentes
microbianas", usando sondas sintéticas de oligonucleótido
preparadas sobre la base de una secuencia de ADN descrita aquí. Por
ejemplo, una sonda de oligonucleótidos adecuada puede ser preparada
basándose en la parte que codifica fosfolipasa de las secuencias
nucleótidicas presentadas como SEC ID No 1 o cualquier subsecuencia
adecuada de la misma, o la base de la secuencia de aminoácidos SEC
ID No 2.
Adicionalmente, puesto que una secuencia clonada
de ADN de la invención codifica un polipéptido que tiene actividad
fosfolipasa según la invención, un número de las formas de
realización específicas relativas a un polipéptido aislado que tiene
actividad fosfolipasa de la invención son también formas de
realización de la invención para una secuencia clonada de ADN de la
invención que codifica un polipéptido que tiene actividad
fosfolipasa. Consecuentemente, referencias y formas de realización
preferidas de dicho polipéptido aislado que tiene actividad
fosfolipasa se refieren también a una secuencia clonada de ADN de la
invención.
Se describe en la presente una secuencia clonada
de ADN según la invención, donde la fosfolipasa codificada por dicha
secuencia de ADN es una fosfolipasa A1.
Se describe en la presente una secuencia clonada
según la invención es una secuencia clonada de ADN, donde la
fosfolipasa codificada por dicha secuencia de ADN es una fosfolipasa
A2 y, en incluso una forma de realización adicional, una secuencia
clonada según la invención es una secuencia clonada de ADN, donde la
fosfolipasa codificada por dicha secuencia de ADN es una fosfolipasa
B.
Preferiblemente, dicha secuencia clonada de ADN
según la invención codifica un polipéptido que tiene actividad
fosfolipasa A1.
Se describe en la presente una secuencia clonada
de ADN según la invención, donde la fosfolipasa codificada por dicha
secuencia de ADN es una fosfolipasa que es sustancialmente
independiente de la concentración Ca^{2+} medida como:
- actividad fosfolipasa relativa a 5 mM EDTA y 5 mM Ca^{2+} en un ensayo de la actividad fosfolipasa que mide la liberación de ácidos grasos libres de lecitina en
- un tampón que incluye 2% lecitina, 2% Tritón X-100, 20 mM citrato, pH 5; incubado durante 10 min. a 37ºC seguido por una parada de reacción a 95ºC durante 5 minutos.;
donde la proporción de actividad fosfolipasa
relativa a 5 mM EDTA/5 mM Ca^{2+} es una proporción que es
superior a 0,25, más preferiblemente una proporción que es superior
a 0,5.
Se describe en la presente una secuencia clonada
de ADN según la invención, donde la fosfolipasa codificada por dicha
secuencia de ADN es una fosfolipasa que tiene una actividad
fosfolipasa que es al menos 0,25 nmol/min, dosis enzimática: 60
\mug, a 25ºC; más preferiblemente al menos 0,40 nmol/min, dosis
enzimática: 60 \mug, a 25ºC; medido en un ensayo de la fosfolipasa
monomolecular de la manera siguiente:
- a.
- en un equipo monomolecular (cuba de orden cero) en una superficie íntegramente purificada de una solución tampón (10 mM TRIS, pH 8,0, 25ºC) una capa monomolecular del fosfolípido DDPC (Di Dicanoil (C10) Fosfatidil Colina) se extiende desde una solución de cloroformo;
- b.
- tras la relajación de la capa monomolecular (evaporación del cloroformo), la presión de la superficie se ajusta a 15 mN/m, correspondiente a una área media molecular de DDPC de aproximadamente 63 \ring{A}^{2}/molécula;
- c.
- una solución tampón (como la anterior) con 60 \mug de enzima se inyecta a través de la capa monomolecular en la subfase del compartimiento de reacción (cilindro con área 1520 mm^{2} y volumen 30400 mm^{3}) en el "cuba de orden cero";
- d.
- la actividad enzimática se determina a través de la velocidad de una barrera móvil que comprime la capa monomolecular con el objetivo de mantener la presión de la superficie constante, mientras las moléculas del sustrato insolubles son hidrolizadas en productos de reacción más hidrosolubles, donde el número de DDPC-moléculas hidrolizadas por minuto por la enzima se estima del área media molecular (MMA) de DDPC.
Se describe en la presente una secuencia clonada
de ADN según la invención, donde la fosfolipasa codificada por dicha
secuencia de ADN es una fosfolipasa que tiene una actividad
fosfolipasa capaz de liberar al menos 7 \mumol de ácido graso
libre/min./mg enzima; más preferiblemente al menos 15 \mumol de
ácido graso libre/min./mg enzima; medido de la siguiente manera:
- La actividad fosfolipasa es medida en un ensayo que mide la liberación de ácidos grasos libres de lecitina en un tampón que incluye 2% lecitina, 2% Tritón X-100, 20 mM citrato, pH 5; incubado durante 10 min. a 37ºC seguido por una parada de reacción a 95ºC durante 5 minutos.
Se describe en la presente:
- una secuencia clonada de ADN según la invención, donde la fosfolipasa codificada por dicha secuencia de ADN es capaz de realizar el desgomado enzimático de un aceite comestible según un método de la invención con el objetivo de reducir la cantidad de componentes con fósforo en un aceite comestible que incluye un contenido de fósforo no hidratable de al menos 50 ppm; y
- una secuencia clonada de ADN según la invención, donde la fosfolipasa codificada por dicha secuencia de ADN es capaz de realizar un desgomado enzimático de un aceite comestible desgomado con agua (que tiene un contenido de fósforo de 50-250 ppm) reduciendo de ese modo el contenido de fósforo del aceite a menos de 11 ppm, donde el proceso de desgomado enzimático consta del contacto de dicho aceite a un pH de 1,5-8 con una solución acuosa de la fosfolipasa, la cual es emulsionada en el aceite hasta que el contenido de fósforo del aceite se reduce a menos de 11 partes por millón, y separando posteriormente la fase acuosa del aceite tratado.
Preferiblemente, una secuencia clonada de ADN
según la invención es una secuencia clonada de ADN, donde la
fosfolipasa codificada por dicha secuencia de ADN es capaz de
realizar dicho proceso de desgomado enzimático del aceite comestible
desgomado con agua usando menos de 2 mg de la fosfolipasa (sustancia
seca)/kg de aceite, y donde la fosfolipasa está en contacto con
dicho aceite durante un período de tiempo de 15 minutos a 2
horas.
Hubo varias dificultades técnicas cuando se
intentó aislar una fosfolipasa de la invención o clonar un
polinucleótido que codifica para ella. Parecía imposible aislar la
enzima y el problema para clonar el polinucleótido continuaba.
Como se describe en la presente, no estaba
disponible ninguna secuencia de ADN previa que codifica una
fosfolipasa fúngica filamentosa A. Consecuentemente, los presentes
inventores desarrollaron una estrategia de clonación basada en la
clonación por expresión en la técnica de levadura (H. Dalboege et
al. Mol. Gen. Genet (1994) 243:253-260.; WO
93/11249; y WO 94/14953).
Uno de los principales problemas de esta técnica
es que la levadura produce una actividad interna que provoca bases
de la fosfolipasa en ensayos de placa. Estas bases resultaron ser
altamente dependientes de la cantidad de sustrato en las placas de
ensayo y, por este motivo, la cantidad de sustrato tenía que
valorarse cuidadosamente a un nivel donde las bases fueran
suficientemente bajas para que el ensayo fuese fiable durante el
procedimiento de selección de la clonación por expresión, pero
suficientemente altas para que la reacción tuviera lugar.
Además, las cepas fúngicas filamentosas
comprenden en general varias lipasas diferentes, algunas de las
cuales incluso presentan una actividad fosfolipasa limitada. Dichas
lipasas se definen aquí como "una lipasa con una actividad
fosfolipasa lateral" (véase sección "Definiciones" de la
presente invención).
En el ensayo de placa, también se observó que
las bases de dichas lipasas con una actividad fosfolipasa lateral
eran altamente dependientes de la cantidad de sustrato en las placas
de ensayo y, de este manera, la cantidad de sustrato tenía que
incluso valorarse más cuidadosamente con el objetivo de eliminar la
actividad de base de tanto las células de levadura como de las
lipasas fúngicas filamentosas con actividad fosfolipasa lateral.
Además, se descubrió que tenía que realizarse
una selección cuidadosa del sustrato, puesto que muchos no
suministraron ninguna solución funcional a este problema, ya que
varios de los substratos de la fosfolipasas evaluados dieron una
actividad de base porque las lipasas, sin actividad fosfolipasa,
pudieron reaccionar sobre los substratos. En consecuencia, con el
objetivo de identificar un sustrato adecuado un alto número de
substratos tenían que ser evaluados y valorados.
La solución encontrada para poder realizar la
clonación por expresión de un polinucleótido que codifica
fosfolipasa fue usar Lipoid E80 (de Lipoid GmbH) en unas
concentraciones cuidadosamente controladas. En la sección Materiales
y Método de la presente se presenta una descripción detallada de la
clonación por expresión completa en protocolo de la levadura,
incluyendo un ensayo de placa que resuelve los problemas descritos
anteriormente.
La homología/identidad de secuencias de ADN
arriba mencionada se determina como el grado de identidad entre dos
secuencias que indican una desviación de la primera secuencia de la
segunda. La homología puede determinarse idóneamente mediante unos
programas informáticos conocidos en la técnica, como GAP provisto en
el paquete del programa GCG (Program Manual for Wisconsin
Package, Versión 8, Agosto 1994, Genetics Computer Group,
575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711)(Needleman, S.B. y
Wunsch, C.D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48,
443-453). Usando GAP con las siguientes
disposiciones para la comparación de secuencias de ADN: penalización
de creación de GAP de 5,0 y penalización de extensión de GAP de 0,3,
la zona codificante de la secuencia de ADN presenta un grado de
identidad de preferiblemente al menos 70%, más preferiblemente al
menos 80%, más preferiblemente al menos 90%, más preferiblemente al
menos 95%, más preferiblemente al menos 97% con la parte que
codifica la fosfolipasa de la secuencia de ADN mostrada en SEC ID No
1 (es decir posición 23-1063 en SEC ID No 1); o más
preferiblemente con la secuencia de ADN mostrada en la posición
113-1063 en SEC ID No 1 (pos. 113 corresponde al
residuo N-terminal de la enzima madura); o incluso
más preferiblemente con la secuencia de ADN mostrada en la posición
23-929 en SEC ID No 1 (pos. 929 corresponde al
residuo C-terminal en la enzima secretada y
procesada de C-terminal).
La hibridación mencionada se destina a
comprender una secuencia de ADN análoga que se hibridiza en una
sonda de ADN de doble cadena correspondiente a la parte que codifica
fosfolipasa de la secuencia de ADN mostrada en SEC ID No 1, es decir
nucleótidos 23-1063, o más preferiblemente con una
sonda de ADN de doble cadena correspondiente a la secuencia de ADN
mostrada en la posición 113-1063 en SEC ID No 1
(pos. 113 corresponde con el residuo N-terminal de
la enzima madura); o incluso más preferiblemente con una sonda de
ADN de doble cadena correspondiente a la secuencia de ADN mostrada
en la posición 23-929 en SEC ID No 1 (pos. 929
corresponde con el residuo C-terminal en la enzima
activa secretada y procesada de C-terminal), según
al menos unas condiciones de rigor bajo tal como se describe con más
detalle abajo.
Las condiciones experimentales adecuadas para
determinar una hibridación con astringencia baja, media o alta entre
una sonda de nucleótidos y una secuencia de ADN o ARN homóloga
implican una preinmersión del filtro que contiene los fragmentos de
ADN o ARN para hibridizar en 5 x SSC (cloruro de sodio/citrato de
sodio, Sambrook et al. 1989) durante 10 minutos y
prehibridización del filtro en una solución de 5 x SSC, 5 x solución
de Denhardt (Sambrook et al. 1989), 0,5% SDS y 100 \mug/ml
del ADN de esperma de salmón desnaturalizado y sometido a un baño de
ultrasonido (Sambrook et al. 1989), seguida de hibridación en
la misma solución con 10 ng/ml de una sonda cebada aleatoriamente
(Feinberg, A. P. y Vogelstein, B. (1983) Anal. Biochem.
132:6-13), marcada ^{32}P-dCTP
(actividad específica > 1 x 10^{9} cpm/\mug) durante 12 horas
alrededor de 45ºC. Entonces se lava el filtro dos veces durante 30
minutos en 2 x SSC, 0,5% SDS a una temperatura de al menos 55ºC
(astringencia baja), más preferiblemente al menos 60ºC (astringencia
media), además más preferiblemente al menos 65ºC (astringencia
media/alta), incluso más preferiblemente al menos 70ºC (astringencia
alta), incluso más preferiblemente al menos 75ºC (astringencia muy
alta).
Las moléculas a las cuales la sonda de
oligonucleótido hibridiza bajo estas condiciones son detectadas
usando una película radiográfica.
Se ha descubierto que es posible pronosticar
teóricamente si dos secuencias de ADN dadas se hibridizarán o no
bajo condiciones especificas determinadas.
En consecuencia, como una alternativa al método
experimental descrito anteriormente, la determinación de si una
secuencia de ADN análoga hibridará o no a la sonda de nucleótido
anteriormente descrita, puede basarse en un cálculo teórico de la Tm
(temperatura de fusión) en la que dos secuencias de ADN heterólogas
con secuencias conocidas se hibridarán bajo unas condiciones
específicas (p. ej. con respecto a la concentración de catión y
temperatura).
Con el objetivo de determinar la temperatura de
fusión para las secuencias del ADN heterólogas (Tm(hetero))
es preciso determinar inicialmente la temperatura de fusión
(Tm(homo)) para las secuencias de ADN homólogas.
\vskip1.000000\baselineskip
La temperatura de fusión (Tm(homo) entre
dos secuencias totalmente complementarias de ADN (formación de
homodúplex) puede determinarse usando la fórmula siguiente:
("Current protocols in
Molecular Biology". John Wiley and Sons, 1995),
donde
"M" denota la concentración de catión molar
en tampón de lavado,
"%GC" % Guanina (G) y Citosina (C) del
número total de las bases en la secuencia de ADN,
"% forma" % formamida en el tampón
delavado, y
"L" la longitud de la secuencia de ADN.
\vskip1.000000\baselineskip
Usando esta fórmula y las condiciones de lavado
experimentales anteriormente mencionadas, la Tm(homo) para la
formación de homodúplex de la sonda de nucleótido correspondiente a
la secuencia de ADN mostrada en SEC ID No 1, es decir nucleótidos
23-1060 es:
"M": 2 X SSC corresponde con una
concentración catiónica de 0,3M.
"%GC" El %GC en SEC ID No 1 pos.
23-1060 es de 56%
"% form": No hay ninguna formamida en el
tampón del lavado.
"L": La longitud de SEC ID No 1 SEC ID No 1
pos. 23-1063 1038 bp.
La Tm determinada por la fórmula anterior es la
Tm de una formación de homodúplex (Tm(homo)) entre dos
secuencias de ADN totalmente complementarias. Con el objetivo de
adaptar el valor Tm a aquel de dos secuencias del ADN heterólogas,
se asume que un 1% de diferencia en la secuencia de nucleótidos
entre las dos secuencias heterólogas equivale a una disminución de
1ºC de la Tm ("Current protocols en Molecular Biology".
John Wiley and Sons, 1995). En consecuencia, la Tm(hetero)
para la formación de heterodúplex se obtiene al substraer la
diferencia en % de la homología entre la secuencia análoga en
cuestión y la sonda de nucleótido anteriormente descrita de la
Tm(homo). El porcentaje de la homología de ADN que debe
substraerse se calcula como se describe en este caso (véase
arriba).
La homología del polipéptido mencionada
anteriormente se determina como el grado de identidad entre dos
secuencias que indican una desviación de la primera secuencia a la
segunda. La homología puede determinarse idóneamente mediante
programas informáticos conocidos en la técnica como GAP provisto en
el paquete del programa GCG (Program Manual for the Wisconsin
Package, Versión 8, Agosto 1994, Genetics Computer Group,
575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711) (Needleman, S.B.
and Wunsch, C.D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48,
443-453. Usando GAP con las siguientes disposiciones
para la comparación de la secuencia polipeptídica: penalización de
creación del GAP de 3,0 y penalización de extensión del GAP de 0,1,
la parte madura de un polipéptido codificado por una secuencia de
ADN análoga presenta un grado de identidad preferiblemente de al
menos 70%, más preferiblemente al menos de 80%, más preferiblemente
al menos de 90%, más preferiblemente al menos de 95%, especialmente
al menos de 97% con la parte madura de la secuencia de aminoácidos
mostrada en SEC ID No 2, es decir posición 31-346 en
SEC ID No 2, o más preferiblemente con la secuencia de aminoácidos
mostrada en la posición 31-303 de SEC ID No 2 (pos.
303 es el residuo C-terminal en la enzima activa,
secretada y procesada de C-terminal).
Se describen en la presente unas variantes de la
fosfolipasa con una secuencia de aminoácidos que no difiere en más
de tres aminoácidos, preferiblemente en no más de dos aminoácidos, y
más preferiblemente en no más de un aminoácido de la parte madura de
la secuencia de aminoácidos presente en la SEC ID No 2.
Además, las identidades del aminoácido
preferidas mencionadas anteriormente también se refieren a un
análogo de una secuencia clonada de ADN de la invención, cuya
secuencia codifica un polipéptido que presenta actividad fosfolipasa
y que es homóloga al menos en un 70% con la secuencia polipeptídica
mostrada en las posiciones 31-346 de la SEC ID No 2,
o más preferiblemente homóloga al menos en un 70% con la secuencia
polipeptídica que incluye las posiciones 31-303 de
SEC ID No 2.
Los anticuerpos que se utilizan para determinar
la reactividad cruzada inmunológica pueden prepararse usando una
fosfolipasa purificada. Más específicamente, el antisuero contra la
fosfolipasa de la invención puede aumentar mediante la inmunización
de conejos (u otros roedores) según el procedimiento descrito por N.
Axelsen et al. en A Manual of Quantitative
Immunoelectrophoresis, Blackwell Scientific Publications, 1973,
Capítulo 23, o A. Johnstone y R. Thorpe, Immunochemistry in
Practice, Blackwell Scientific Publications, 1982 (más
específicamente p. 27-31). Las inmunoglobulinas
purificadas pueden obtenerse del antisuero obtenido, por ejemplo por
la precipitación de sal ((NH_{4})_{2}SO_{4}), seguido
por diálisis y cromatografía de intercambio iónico, e.g. en
DEAE-Sefadex. La caracterización inmunoquímica de
las proteínas pueden realizarse bien por el análisis de doble
difusión de Ouchterlony (O. Ouchterlony in: Handbook of
Experimental Immunology (D.M. Weir, Ed.), Blackwell Scientific
Publications, 1967, pp. 655-706), por
inmunoelectrofóresis cruzada (N. Axelsen et al.,
supra. Capítulos 3 y 4), o por inmunoelectrofóresis de cohete
(N. Axelsen et al., Capítulo 2).
En la fecha de prioridad de la presente
invención, la taxonomía aplicada abajo es conforme al navegador de
la taxonomía NCBI del World Wide Web (WWW).
Un polipéptido aislado que tiene actividad
fosfolipasa y la secuencia clonada de ADN correspondiente de la
invención puede obtenerse de cualquier microorganismo,
preferiblemente un hongo filamentoso, una célula de levadura, o una
bacteria.
Preferiblemente, una fosfolipasa y la secuencia
clonada de ADN correspondiente de la invención puede obtenerse de
una cepa fúngica filamentosa, donde un tipo preferido es
Ascomycota, donde una clase preferida es Pyrenomycetes
que incluye la familia preferida Nectriaceae.
Más preferiblemente, la fosfolipasa y la
secuencia clonada de ADN correspondiente de la invención pueden
obtenerse de una cepa del género Fusarium, como una cepa de
F. culmorum, F. heterosporum, o F. solani, en
particular una cepa de Fusarium oxysporum.
Además, una fosfolipasa y la secuencia clonada
de ADN correspondiente de la invención puede obtenerse de una cepa
fúngica filamentosa dentro del género Aspergillus, como una
cepa de Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus,
Aspergillus japonicus, Aspergillus niger en particular
Aspergillus oryzae.
Un aislamiento de una cepa de Fusarium
oxysporum, de la cual puede obtenerse una fosfolipasa de la
invención, se ha depositado según el Tratado de Budapest sobre el
Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos a los
fines del Procedimiento en materia de Patente en el Deutche
Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder
Weg 1b, D-38124 Braunschweig, República federal de
Alemania, (DSM).
Además, el plásmido de expresión pYES 2,0 que
incluye la longitud total de la secuencia de ADNc que codifica la
fosfolipasa de la invención se ha transformado en una cepa de
Escherichia coli que se depositó según el Tratado de Budapest
sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de
Microorganismos a los fines del Procedimiento en materia de Patente
en el Deutche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen
GmbH, Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig,
República federal de Alemania, (DSM).
El vector de expresión de la invención puede ser
cualquier vector de expresión, que es convenientemente sometido a
procedimientos de ADN recombinante, y la elección del vector
dependerá a menudo de la célula huésped en la cual tiene que
introducirse el vector. Así, el vector puede ser un vector de
replicación autónoma, es decir un vector que existe como una entidad
extracromosómica, cuya reproducción es independiente de la
replicación cromosómica, p. ej. un plásmido. De forma alternativa,
el vector puede ser aquel que, cuando se introduce en una célula
huésped, se integra en el genoma de la célula huésped y se reproduce
junto con el cromosoma(s) en el cual se ha integrado.
En el vector de expresión, la secuencia de ADN
que codifica fosfolipasa estaría operativamente conectada a una
secuencia adecuada de terminador y promotor. El promotor puede ser
cualquier secuencia de ADN que muestra una actividad transcripcional
en la célula huésped de elección y puede derivarse de proteínas que
codifican genes que son bien homólogas o heterólogas a la célula
huésped. Los procedimientos usados para enlazar las secuencias de
ADN que codifican para la fosfolipasa, el promotor y terminador y
para insertarlas en vectores adecuados son bien conocidos por los
expertos en la técnica (cf. p. ej. Sambrook et al., (1989),
Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor,
NY).
Ejemplos de promotores adecuados para su uso en
células huésped fúngicas filamentosas son, p. ej. el promotor
ADH3 (McKnight et al., The EMBO J. 4 (1985),
2093 - 2099) o el promotor tgiA. Ejemplos de otros promotores
útiles son esos derivados del gen que codifica TAKA amilasa de
Aspergillus oryzae, proteinasa aspártica de Rhizomucor
miehei, \alpha-amilasa neutra de
Aspergillus niger, \alpha-amilasa de ácido
estable de Aspergillus niger, glucoamilasa (gluA) de
Aspergillus awamori o Aspergillus niger, lipasa de
Rhizomucor miehei, proteasa alcalina de Aspergillus
oryzae, triosa fosfato isomerasa de Aspergillus oryzae o
acetamidasa de Aspergillus hidulans.
La presente invención también se refiere a
células huéspedes recombinantes que incluyen una secuencia de ácido
nucleico de la invención, las cuales pueden ventajosamente usarse en
la producción recombinante de los polipéptidos. El término "célula
huésped" comprende cualquier progenie de una célula madre que no
es idéntica a la célula madre debido a las mutaciones que tienen
lugar durante la replicación.
La célula se transforma preferiblemente con un
vector que incluye una secuencia de ácido nucleico de la invención
seguida por la integración del vector en el cromosoma huésped.
"Transformación" significa la introducción
de un vector que incluye una secuencia de ácido nucleico de la
presente invención en una célula huésped, de modo que el vector se
mantiene como un integrante cromosómico o como un vector
extracromosómico de propia replicación. La integración se considera
generalmente una ventaja, ya que la secuencia de ácido nucleico es
más posible que sea mantenida de manera estable en la célula. La
integración del vector en el cromosoma huésped puede tener lugar por
recombinación homóloga o no homóloga en el modo descrito
anteriormente.
En una forma de realización preferida, la célula
huésped es una célula fúngica. "Hongos" como se utiliza en este
caso incluye el filo Ascomycota, Basidiomycota,
Chytridiomycota y Zygomycota (tal como se define por
Hawksworth et al., En, Ainsworth and Bisby's Dictionary
ofthe Fungi, 8ª edición, 1995, CAB Internacional, University
Press, Cambridge, UK) así como el Oomycota (como se cita en
Hawksworth et al., 1995, supra, página 171) y todos
los hongos mitospóricos (Hawksworth et al., 1995,
supra). Grupos representativos de Ascomycota incluyen,
p. ej., Neurospora, Eupenicillium
(=Penicillium), Emericella (=Aspergillus),
Eurotium (=Aspergillus) y las levaduras verdaderas
anteriormente catalogadas. Ejemplos de Basidiomycota incluyen
hongos, herrumbres y tizones. Grupos representativos de
Chytridiomycota incluyen, p. ej., Allomyces,
Blastocladiella, Coelomomyces y hongos acuáticos.
Grupos representativos de Oomycota incluyen, p. ej., hongos
acuáticos de saprolegniomycetous (moldes de agua) como
Achlya. Ejemplos de hongos mitospóricos incluyen
Aspergillus, Penicillium, Candida y
Alternaria. Grupos representativos de Zygomycota
incluyen, p. ej., Rhizopus y Mucor.
En una forma de realización preferida, la célula
huésped fúngica es una célula fúngica filamentosa. "Hongo
filamentoso" incluye todas las formas filamentosas de la
subdivisión Eumycota y Oomycota (tal como se define
por Hawksworth et al., 1995, supra). Los hongos
filamentosos se caracterizan por un micelio vegetativo compuesto de
quitina, celulosa, glucano, quitosano, manano y otros polisacáridos
complejos. El crecimiento vegetativo tiene lugar por alargamiento
hifal y el catabolismo del carbono es estrictamente aeróbico. Por el
contrario, el crecimiento vegetativo en levaduras como
Saccharomyces cerevisiae tiene lugar mediante el brote de un
tallo unicelular y el catabolismo del carbono puede ser
fermentativo. En otra forma de realización preferida, la célula
huésped fúngica filamentosa es una célula de una especie de, pero no
limitada a, Acremonium, Aspergillus, Fusarium,
Humicola, Mucor, Myceliophthora,
Neurospora, Penicillium, Thielavia,
Tolypocladium, y Trichoderma o un teleomorfo o
sinónimo del mismo. En otra forma de realización aún más preferida,
la célula huésped fúngica filamentosa es una célula de
Aspergillus. En otra forma de realización aún más preferida,
la célula huésped fúngica filamentosa es una célula de
Acremonium. En otra forma de realización aún más preferida,
la célula huésped fúngica filamentosa es una célula de
Fusarium. En otra forma de realización preferida, la célula
huésped fúngica filamentosa es una célula de Humicola. En
otra forma de realización preferida, la célula huésped fúngica
filamentosa es una célula de Mucor. En otra forma de
realización incluso más preferida, la célula huésped fúngica
filamentosa es una célula de Myceliophthora. En otra forma de
realización preferida, la célula huésped fúngica filamentosa es una
célula de Neurospora. En otra forma de realización preferida,
la célula huésped fúngica filamentosa es una célula de
Penicillium. En otra forma de realización preferida, la
célula huésped fúngica filamentosa es una célula de
Thielavia. En otra forma de realización preferida, la célula
huésped fúngica filamentosa es una célula de Tolypocladium.
En otra forma de realización preferida, la célula huésped fúngica
filamentosa es una célula de Trichoderma. En otra forma de
realización preferida, la célula huésped fúngica filamentosa es una
célula de Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus,
Aspergillus japonicus, Aspergillus niger o
Aspergillus oryzae. En otra forma de realización más
preferida, la célula huésped fúngica filamentosa es una célula de
Fusarium de la sección Discolor (también conocida como la
sección de Fusarium). En otra forma de realización preferida,
la célula madre fúngica filamentosa es una cepa de Fusarium
de la sección Elegans, p. ej., Fusarium oxysporum. En otra
forma de realización preferida, la célula huésped fúngica
filamentosa es una célula de Humicola insolens o
Thermomyces lanuginosa. En otra forma de realización
preferida, la célula huésped fúngica filamentosa es una célula de
Rhizomucor miehei. En otra forma de realización preferida, la
célula huésped fúngica filamentosa es una célula de
Myceliophthora thermophilum. En otra forma de realización
preferida, la célula huésped fúngica filamentosa es una célula de
Neurospora crassa. En otra forma de realización preferida, la
célula huésped fúngica filamentosa es una célula de Penicillium
purpurogenum. En otra forma de realización preferida, la célula
huésped fúngica filamentosa es una célula de Thielavia
terrestris. En otra forma de realización preferida, la célula de
Trichoderma es una célula de Trichoderma Harzianum,
Trichoderma Koningii, Trichoderma longibrachiatum,
Trichoderma Reesei o Trichoderma viride.
Las células fúngicas pueden transformarse por un
proceso que implica la formación de protoplasto, la transformación
de los protoplastos y la regeneración de la membrana celular en una
manera conocida per se. Los procedimientos adecuados para la
transformación de células huéspedes Aspergillus se describen
en la EP 238 023 y en Yelton et al., 1984, Proceedings
ofthe National Academy of Sciences USA
81:1470-1474. Un método adecuado para transformar la
especie Fusarium es descrito por Malardier et al.,
1989, Gene 78:147-156 o en la patente
divisional US No de serie 08/269,449. La levadura puede
transformarse usando los procedimientos descritos por Becker y
Guarente, En Abelson, J.N. y Simón, M.I., editors, Guide to Yeast
Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volumen
194, pp 182-187, Academic Press, Inc., New York; Ito
et al., 1983, Journal of Bacteriology 153:163; y
Hinnen et al., 1978, Proceedings of the Nacional Academy
of Sciences USA 75:1920. Células mamíferas pueden transformarse
mediante respuesta directa usando el método de precipitación del
fosfato de calcio de Graham y Van der Eb (1978, Virology
52:546).
\vskip1.000000\baselineskip
Se describe en la presente un método para
producir una enzima aislada según la invención, donde una célula
huésped adecuada, la cual ha sido transformada con una secuencia de
ADN que codifica la enzima, es cultivada bajo condiciones que
permiten la producción de la enzima, y la enzima resultante es
recuperada del cultivo.
Cuando un vector de expresión que incluye una
secuencia de ADN que codifica la enzima se transforma en una célula
huésped heteróloga puede permitir la producción recombinante
heteróloga de la enzima de la invención.
De ese modo es posible obtener una composición
de la fosfolipasa altamente purificada, caracterizada por ser libre
de impurezas homólogas.
La célula huésped homóloga puede ser una cepa de
Fusarium oxysporum.
El medio usado para cultivar las células
huéspedes transformadas puede ser cualquier medio convencional
adecuado para el crecimiento de las células huéspedes en cuestión.
La fosfolipasa expresada puede convenientemente ser secretada en el
medio de cultivo y recuperada mediante procedimientos bien conocidos
que incluyen la separación de las células del medio por centrifugado
o filtración, la precipitación de los componentes proteínicos del
medio mediante una sal como sulfato amónico, seguido por unos
procedimientos eromatográficos como la cromatografía de intercambio
iónico, cromatografía de afinidad o similares.
\vskip1.000000\baselineskip
A parte del uso de una fosfolipasa en un método
nuevo de la invención para el desgomado enzimático de un aceite
comestible, el cual incluye una alta cantidad de fósforo no
hidratable, también se conocen otros usos de la fosfolipasas.
Dichos usos/aplicaciones en la técnica conocida
de la fosfolipasas se describen a continuación.
La fosfolipasa de la invención puede usarse en
cualquier aplicación deseada para hidrolizar el grupo(s)
acilo graso de un fosfolípido o liso-fosfolípido,
como lecitina o lisolecitina. La fosfolipasa se utiliza
preferiblemente a pH 3-10 y a
30-70ºC (particularmente 40-60ºC).
Si se desea, la fosfolipasa puede inactivarse después de la reacción
sometiéndola a un tratamiento térmico, p. ej. a pH 7, 80ºC durante 1
hora o 90ºC durante 10 minutos.
Como ejemplo, la fosfolipasa de la invención
puede usarse en la preparación de masa, pan y pasteles, p. ej. para
mejorar la elasticidad del pan o del pastel. Así, la fosfolipasa
puede usarse en un proceso para hacer pan, el cual incluye la
adición de la fosfolipasa a los ingredientes de una masa, amasadura
de la masa y cocción de la masa para hacer el pan. Esto puede
hacerse en analogía con US 4,567,046 (Kyowa Hakko),
JP-A 60-78529 (QP Corp.),
JP-A 62-111629 (QP Corp.),
JP-A 63-258528 (QP Corp.) o EP
426211 (Unilever).
La fosfolipasa de la invención puede también
usarse para mejorar la filtrabilidad de una solución acuosa o pasta
basada en carbohidratos mediante su tratamiento con fosfolipasa.
Esto es aplicable particularmente a una solución o pasta que
contiene un hidrolizado de almidón, especialmente un hidrolizado de
almidón de trigo, puesto que éste suele ser difícil de filtrar y a
producir filtrados turbios. El tratamiento puede hacerse en analogía
con EP 219,269 (Internacional CPC).
Además, una fosfolipasa de la invención puede
usarse para la hidrólisis parcial de fosfolípidos, preferiblemente
Lecitina, para obtener mejores emulsionantes del fosfolípido. Esta
aplicación se describe en las hojas del producto para
Lecitase^{TM} (Novo Nordisk A/S) relativa a este uso y en
Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry (Publisher:
VCH Weinheim (1996)).
Además, una fosfolipasa de la invención puede
usarse en un proceso para la producción de un pienso que comprende
la mezcla de la fosfolipasa con substancias alimenticias y al menos
un fosfolípido. Esto puede hacerse en analogía con EP 743 017.
\vskip1.000000\baselineskip
Según procedimientos conocidos en la técnica, la
fosfolipasa de la invención puede usarse en un proceso para reducir
el contenido de fosfolípidos en un aceite comestible, el cual
incluye el tratamiento del aceite con fosfolipasa para hidrolizar
una parte importante del fosfolípido y la separación de una fase
acuosa que contiene el fosfolípido hidrolizado del aceite. Este
proceso es aplicable a la purificación de cualquier aceite
comestible que contiene fosfolípido, p. ej. aceite vegetal como
aceite de soja, aceite de semilla de colza y aceite de girasol.
Antes del tratamiento enzimático, el aceite
vegetal es preferiblemente pretratado para eliminar el limo
(mucílago), p. ej. mediante refinado húmedo. Normalmente, el aceite
contendrá 50-250 partes por millón de fósforo como
fosfolípido en la iniciación del tratamiento con fosfolipasa y la
invención del proceso puede reducir este valor a menos de 11 ppm,
más preferiblemente a menos de 5 ppm.
El tratamiento enzimático se realiza mediante la
dispersión de una solución acuosa de la fosfolipasa, preferiblemente
en gotitas con un diámetro promedio inferior a 10
\mu(micro)m. La cantidad de agua es preferiblemente
de 0,5-5% por peso en relación con el aceite.
Opcionalmente puede agregarse un emulsionante. Puede aplicarse
agitación mecánica para mantener la emulsión.
El tratamiento enzimático puede realizarse con
cualquier pH en el margen 1,5-8. El pH puede
ajustarse añadiendo ácido cítrico, un tampón de citrato o HCl.
Una temperatura adecuada es generalmente
30-70ºC (particularmente 40-60ºC).
El tiempo de reacción normalmente será de 0,5-12
horas (p. ej. 2-6 horas) y una dosificación de la
enzima adecuada será normalmente de 100-5000 IU por
litro de aceite, particularmente 200-2000 IU/l.
El tratamiento enzimático puede realizarse de
forma discontinua, p. ej. en un tanque con agitación, o continua, p.
ej. una serie de reactores de tanque con agitación.
El tratamiento enzimático es seguido por la
separación de una fase acuosa y una fase de aceite. Esta separación
puede realizarse por medios convencionales, p. ej. centrifugado.
En otros aspectos, el proceso puede realizarse
según principios conocidos en la técnica, p. ej. en analogía con US
5.264.367 (Metallgesellschaft, Röhm); K. Dahlke & H. Buchold,
INFORM, 6 (12), 1284-91 (1995); H. Buchold, Fat Sci.
Technol., 95 (8), 300-304 (1993);
JP-A 2-153997 (Showa Sangyo); o EP
654.527 (Metallgesellschaft, Röhm).
\vskip1.000000\baselineskip
La fosfolipasa de la invención puede también
usarse en los aditivos de mejoramiento del pan, p. ej. composiciones
de la masa, aditivos de la masa, acondicionadores de la masa,
premezclas y preparaciones similares convencionalmente añadidas a la
harina y/o la masa durante los procesos para hacer el pan u otros
productos horneados, para proporcionar propiedades mejoradas del pan
u otros productos horneados.
Se describe en la presente una composición de
mejoramiento del pan y/o de mejoramiento de la masa y,
adicionalmente, al uso de una fosfolipasa de la invención en dichas
composiciones, y a una masa o producto horneado que incluye un
mejoramiento del pan y/o una composición de mejoramiento de la masa
de la invención.
En el presente contexto los términos
"composición de mejoramiento del pan" y "composición de
mejoramiento de la masa" están destinados a indicar las
composiciones que, además del componente enzimático, pueden
comprender otros substancias convencionalmente usadas en la cocción
para mejorar las propiedades de la masa y/o productos horneados. A
continuación se ofrecen unos ejemplos de dichos componentes.
En el presente contexto el término
"propiedades mejoradas" está destinado a indicar cualquier
propiedad que puede mejorarse por la acción de una enzima
fosfolipasa de la invención. En particular, el uso de la
fosfolipasas produce un aumento del volumen y una mejora de la
estructura migajosa y unas propiedades contra el gusto rancio del
producto horneado, así como un aumento de la resistencia y la
estabilidad y una reducción de la pegajosidad y, de ese modo, de la
trabajabilidad de la masa. Se ha descubierto que el efecto sobre la
masa es particularmente bueno cuando se utiliza una harina de baja
calidad. La mejora de la trabajabilidad es de particular importancia
en conexión con la masa que tiene que ser procesada
industrialmente.
Las propiedades mejoradas son valoradas por
comparación con la masa y/o productos horneados preparados sin
adición de la fosfolipasa según la presente invención.
La composición de mejoramiento del pan y/o de la
masa de la invención puede comprender adicionalmente otra enzima.
Ejemplos de otras enzimas son una celulasa, una hemicelulasa, una
pentosanasa (útil para la hidrólisis parcial de pentosanos que
aumentan la elasticidad de la masa), una glucosa oxidasa (útil para
reforzar la masa), una lipasa (útil para la modificación de lípidos
presentes en la masa o constituyentes de la masa para ablandar la
masa), una peroxidasa (útil para perfeccionar la consistencia de la
masa), una proteasa (útil para el debilitamiento del gluten, en
particular cuando se usa harina de trigo dura), una peptidasa y/o
una amilasa, p. ej. \alpha-amilasa (útil para
suministrar azúcares fermentables por levadura).
Además o como una alternativa para otros
componentes enzimáticos, la composición que mejora la masa y/o el
pan puede comprender una levadura artificial usada
convencionalmente, p. ej. uno o más de los constituyentes
siguientes:
Una leche en polvo (proporcionando color
costra), gluten (para mejorar el poder de retención de gas de las
harinas blandas), un emulsionante (para mejorar la elasticidad de la
masa y la consistencia del pan resultante), grasa granulada (para
ablandar la masa y la consistencia del pan), un oxidante (añadido
para robustecer la estructura del gluten; p. ej. ej. ácido
ascórbico, bromato de potasio, iodato de potasio o persulfato de
amonio), un aminoácido (p. ej. cisteína), un azúcar y sal (p. ej.
cloruro sódico, acetato de calcio, sulfato de sodio o sulfato de
calcio que sirve para hacer la masa más firme), harina o
almidón.
Ejemplos de emulsionantes adecuados son los
monoglicéridos o diglicéridos, ásteres del ácido tartárico de
diacetilo de monoglicéridos o diglicéridos, ásteres de azúcar de
ácidos grasos, ásteres de poliglicerol de ácidos grasos, ásteres del
ácido láctico de monoglicéridos, ásteres del ácido acéticos de
monoglicéridos, estearatos de polioxietileno, fosfolípidos y
lecitina.
En el presente contexto el término "producto
horneado" incluye cualquier producto obtenido a partir de la
masa, tanto de carácter blando como crujiente. Ejemplos de productos
horneados, que sean de tipo blanco, claro o oscuro, los cuales
pueden ventajosamente producirse por la presente invención son pan
(en particular blanco, integral o pan de centeno), normalmente en
forma de hogazas o panecillos, barra de pan, pan de pita, tacos,
pasteles, crepes, galletas, pan crujiente y similares.
La masa de la invención puede ser de cualquiera
de los tipos mencionados anteriormente y puede ser fresca o
congelada.
Es obvio de la descripción anterior que la masa
de la invención es normalmente una masa leudada o una masa que tiene
que ser leudada. La masa puede leudarse de varias vías como mediante
la adición de bicarbonato sódico o similar o la adición de una
levadura (masa que fermenta), pero se prefiere leudar la masa
mediante la adición de un cultivo de levadura adecuado como un
cultivo de Saccharomyces cerevisiae (levadura de cocción).
Pueden emplearse cualquiera de las cepas de S. cerevisiae
comercialmente disponibles.
Se describe en la presente el uso de una
fosfolipasa de la invención para la preparación de masa de pasta,
preferiblemente obtenida a partir de harina de trigo duro o una
harina de calidad comparable. La masa puede prepararse usando
técnicas convencionales y la fosfolipasa usada en una dosificación
similar a la descrita anteriormente. La fosfolipasa ha de ser
preferiblemente de origen microbiano, tal como se describe aquí. Se
contempla que usada en la preparación de la pasta, la fosfolipasa
produce un aumento de la estructura del gluten y, así, una reducción
de la pegajosidad de la masa y un aumento de la resistencia de la
misma.
Como se muestra en los ejemplos, una fosfolipasa
de la invención puede presentar adicionalmente actividad lipasa.
Se describe en la presente el uso de esta
actividad lipasa en usos estándar de una lipasa, en particular para
el uso en composiciones de limpieza y de detergente. Dichas
composiciones de limpieza y de detergente se describen en la técnica
y se hace referencia a WO 96/34946; WO 97/07202; y WO 95/30011 para
una descripción adicional de composiciones de limpieza y de
detergente adecuadas.
La invención está descrita con más detalle en
los ejemplos siguientes, los cuales no están de ninguna manera
destinados a limitar el objetivo de la invención tal como se
reivindica.
Fusarium oxysporum DSM No. 2672 comprende
la secuencia de ADN que codifica la fosfolipasa de la invención.
Escherichia coli DSM 11299 que contiene
el plásmido que comprende la longitud total de la secuencia de ADNc,
codificando para la fosfolipasa de la invención, en el vector
transportador pYES 2,0.
Cepa de levadura: La cepa de Saccharomyces
cerevisiae usada fue W3124 (MATa; ura 3-52; leu
2-3, 112; his 3-D200; pep
4-1137; prc1::HIS3; prb1:: LEU2; cir+).
Cepa de E. coli: DH10B (Life
Technologies)
El vector de expresión pHD414 de
Aspergillus es un derivado del plásmido p775 (descrito en EP
238 023). La construcción de pHD414 está descrita en más detalle en
WO 93/11249.
pYES 2,0 (Invitrogen)
pA2PH10 (véase ejemplo 7)
Excepto cuando se mencione de otra manera, las
manipulaciones y transformaciones de ADN se realizando usando
métodos estándar de biología molecular (Sambrook et al.
(1989) Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring
Harbour lab., Cold Spring Harbor, NY; Ausubel, F. M. et al.
(eds.) "Current protocols in Molecular Biology". John
Wiley y Sons, 1995; Harwood, C. R., and Cutting, S. M. (eds.)
"Molecular Biological Methods for Bacillus". John Wiley
and Sons, 1990).
Las enzimas para las manipulaciones de ADN
fueron usadas según las especificaciones de los suministradores.
Excepto cuando se mencione de otra manera, todas
las enzimas para las manipulaciones de ADN, como p. ej.
endonucleasas de restricción, ligasas etc., se obtuvieron de New
England Biolabs, Inc.
Sustrato:
L-\alpha-lisofosfatidilcolina
(Sigma).
Sustrato: Lecitina de soja (Sigma #P3644). Usado
para medir la actividad fosfolipasa A.
Equipo de test Nefa-C es de Wako
Chemicals Germany.
Tampón: 20 mM NaOAc pH 4,5
Solución del sustrato: 10 mg de sustrato en 1 mL
de agua milli Q y 1 mL de tampón (hacer suficiente solución del
sustrato para todas las muestras).
- 1.
- Adición de 15 \mul de enzima a 150 \mul de solución del sustrato
- 2.
- Incubación durante 10 min. a 40ºC
- 3.
- Transferencia de 30 \mul a 300 \mul de. reactivo 1 (del equipo Nefa)
- 4.
- Incubación durante 10 min. a 37ºC
- 5.
- Adición de 600 \mul de. reactivo 2 (del equipo Nefa)
- 6.
- Incubación durante 10 min. a 37ºC
- 7.
- Medición de la absorción del producto de reacción final a 550 nm, según las instrucciones del equipo Nefa.
La actividad enzimática necesaria para producir
1 \mumol de ácido graso por minuto de la reacción enzimática fue
definida como 1 unidad.
\vskip1.000000\baselineskip
La clonación por expresión en levadura se
realizó como está descrito exhaustivamente por H. Dalboege et
al. (H. Dalboege et al Mol. Gen. Genet (1994)
243:253-260.; WO 93/11249; WO 94/14953), los cuales
se incorporan en la presente por referencia.
Se realizaron todos los pasos individuales de
extracción de ARN total, síntesis de ADNc, tratamiento de nucleasa
de la judía mung, extremo romo con polimerasa T4 de ADN y
construcción de bibliotecas según las referencias anteriormente
mencionadas.
\vskip1.000000\baselineskip
Fusarium oxysporum DSM No. 2672 fue
cultivado en el medio YPD durante 4 días a 30ºC. Se evaluaron 10
\mul de sobrenadante para la actividad fosfolipasa en el ensayo de
placa descrito abajo.
El ARNm fue aislado del micelio de este cultivo
como se describe en H. Dalboege et al Mol. Gen. Genet (1994)
243:253-260.; WO 93/11249; y WO 94/14953.
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizó la identificación de clones positivos
de levadura (es decir clones que comprenden un gen que codifica para
una actividad fosfolipasa) como se describe a continuación.
Los transformantes de levadura se recubren de
ágar SC con 2% de glucosa y se incuban durante 3 días a 30ºC. Se
coloca un filtro de acetato de celulosa (OE67, Schleicher &
Schuell) encima de las células y posteriormente se transfiere a las
placas que contienen ágar SC y 2% de galactosa con las células
encima del filtro. Después de 3 días de incubación a 30ºC, se
transfiere el filtro con células a las placas del sustrato. Los
clones positivos se identifican como colonias que producen una zona
azul-verde en la placa del sustrato bajo la
colonia.
Las placas de sustrato se realizan de la manera
siguiente: se añaden 2,5 g de ágar (BA-30 INA ágar®,
Funakoshi Co. Ltd.) a 137,5 ml de H_{2}O, se calientan hasta
hervir en un horno microondas. Después del enfriamiento a
aproximadamente 60ºC, se añade 30 ml de la mezcla siguiente: 62,5 ml
0,4 M de tampón Tris-HCl (pH 7,5) y 50 ml 3% Lipoid
E80 (Lipoid GmbH, D-67065 Ludwigshafen, Alemania)
disuelto en 2% de Tritón X-100 (v/v) y 0,5 ml 2% de
solución verde brillante en H_{2}O. La concentración del sustrato
es importante. Si la concentración es demasiado alta puede
causar
una actividad de base de las células de levadura y/o de lipasas fúngicas filamentosas con actividad fosfolipasa lateral.
una actividad de base de las células de levadura y/o de lipasas fúngicas filamentosas con actividad fosfolipasa lateral.
Una colonia de levadura que produce fosfolipasa
es inoculada en 20 ml de caldo de YPD en un tubo de ensayo de
cristal de 50 ml. El tubo es agitado durante 2 días a 30ºC. Las
células son recogidas por centrifugado durante 10 min. a 3000
rpm.
El ADN es aislado según WO 94/14953 y disuelto
en 50 ml de agua. El ADN es transformado en E. coli mediante
procedimientos estándar. El ADN del plásmido es aislado de E.
coli usando procedimientos estándar y analizado mediante un
análisis de la enzima de restricción. El inserto de ADNc es cortado
usando unas enzimas de restricción apropiadas y ligado a un vector
de expresión Aspergillus.
Los protoplastos pueden prepararse como se
describe en WO 95/02043, p. 16, línea 21 - página 17, línea 12, que
se incorpora en la presente por referencia.
Se mezclan 100 \mul de suspensión de
protoplasto con 5-25 \mug de ADN apropiado en 10
\mul de STC (1,2 M sorbitol, 10 mM Tris-HCl, pH =
7,5, 10 mM CaCl_{2}). Los protoplastos son mezclados con p3SR2
(un gen amdS de A. nidulans que lleva plásmido). La mezcla se
deja a temperatura ambiente durante 25 minutos. Se añade 0,2 mi de
60% PEG 4000 (BDH 29576), 10 mM CaCl_{2} y 10 mM
Tris-HCl, pH 7,5 y se mezcla cuidadosamente (dos
veces) y finalmente se añade 0,85 ml de la misma solución y se
mezcla cuidadosamente. La mezcla se deja a temperatura ambiente
durante 25 minutos, se centrifuga a 2500 g durante 15 minutos y el
granulado se resuspende en 2 ml de 1,2 M sorbitol. Después de una
sedimentación más, los protoplastos se extienden en placas mínimas
(Cove, Biochem. Biophys. Acta 113 (1966) 51-56) con
1,0 M de sucrosa, pH 7,0, 10 mM de acetamida como fuente de
nitrógeno y 20 mM de CsCl para inhibir el crecimiento residual.
Tras la incubación durante 4-7 días a 37ºC, las
esporas son recogidas y extendidas para colonias únicas. Se repite
este procedimiento y se almacenan las esporas de una colonia única
después del segundo reaislamiento como transformantes definidos.
Cada uno de los transformantes de A.
oryzae son inoculados en 10 ml de YPM (cf. abajo) y propagados.
Tras 2-5 días de incubación a 30ºC, se elimina el
sobrenadante. Se agregan 20 \mul de sobrenadante en agujeros
troquelados en una placa de sustrato (véase arriba). Tras
1-24 horas, la actividad fosfolipasa aparece como
una zona azul-verde alrededor del agujero.
La fermentación alimentada se realizó en un
medio que incluye maltodextrina como fuente de carbono, úrea como
fuente de nitrógeno y extracto de levadura. La fermentación
alimentada se realizó mediante la inoculación de un cultivo en
frasco de agitación de las células huésped de A. oryzae en
cuestión en un medio que incluye el 3,5% de la fuente de carbono y
el 0,5% de la fuente de nitrógeno. Tras 24 horas de cultivo a pH 7,0
y 34ºC, se inició el suministro continuo de fuentes de nitrógeno y
carbono. Se mantuvo la fuente de carbono como factor de limitación y
se aseguró que el oxígeno estuviera presente en cantidades
excesivas. El cultivo de alimentación fue continuado durante 4
días.
La parte que codifica la fosfolipasa de la
secuencia de ADN mostrada en la SEC ID No. 1 que codifica para la
fosfolipasa de la invención puede obtenerse del organismo depositado
Escherichia coli DSM 11299 mediante extracción del ADN del
plásmido por métodos conocidos en la técnica (Sambrook et al.
(1989) Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring
Harbor lab., Cold Spring Harbor, NY).
YPD: adición de 10 g de extracto de levadura, 20
g de peptona, H_{2}O a 900 ml. Esterilizado en autoclave, 100 ml
20% de glucosa (filtrada estérilmente).
YPM: adición de 10 g de extracto de levadura, 20
g de peptona, H_{2}O a 900 ml. Esterilizado en autoclave, 100 ml
20% de maltodextrina (filtrada estérilmente).
10 x sal basal: 75 g de base nitrogenada de
levadura, 113 g de ácido sucínico, 68 g de NaOH, H_{2}O hasta 1000
ml, filtrado estérilmente.
SC-URA: adición de 100 ml 10 x
sal basal, 28 ml 20% de casaminoácidos sin vitaminas, 10 ml 1%
triptófano, H_{2}O hasta 900 ml, esterilizado en autoclave, 3,6 ml
5% treonina y 100 ml 20% de glucosa o 20% de galactosa.
SC-agar: adición de
SC-URA, 20 g/l ágar.
Ágar variante SC: 20 g de ágar, 20 ml 10 x sal
basal, H_{2}O hasta 900 ml, esterilizado en autoclave
PEG 4000 (polietilenoglicol, peso molecular =
4.000) (BDH, Reino Unido)
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Un cultivo de Fusarium oxysporum, DSM
2672, en una inclinación de agra, fue transferido a cinco frascos de
agitación de 500 ml, cada uno con 100 ml del medio
Bouillon-3 y agitado a 30ºC durante 1 día (200 rpm,
amplitud 2,5 cm).
La composición del medio
Bouillon-3 es la siguiente:
El medio fue esterilizado en autoclave a 121ºC
durante 40 minutos.
El caldo de cultivo de estos frascos de
agitación de Bullion-3 fue usado como un cultivo de
semilla para inocular veinte frascos de agitación de 500 ml, cada
uno con 200 mi de medio PL-1.
La composición del medio PL-1 es
la siguiente:
El medio fue esterilizado en autoclave a 121ºC
durante 40 minutos.
Cada frasco de agitación de PL-1
fue inoculado con 0,5-2 ml de caldo del cultivo
Boullion-3 y agitado a 200 rpm (amplitud 2,5 cm) a
30ºC durante 5 días. El caldo de cultivo de los frascos de agitación
fue agrupado en cosecha, sumando 3,9 l con un rendimiento enzimático
de 53 LU/ml.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Fase 1) un litro de sobrenadante de fermentación
fue centrifugado y el precipitado resultante descartado. El
sobrenadante fue posteriormente ajustado a 0,8 M de acetato de
amonio añadiendo acetato de amonio sólido.
Fase 2) - Cromatografía hidrofóbica - matriz de
butilo Toyopearl 650 C fue comprada de Toso Hass (Röhm y Haas
company, Germany). Una columna de cincuenta mi fue embalada con la
matriz. La columna fue lavada con 50% de etanol y posteriormente con
agua. La columna fue luego equilibrada con 0,8 M de acetato de
amonio. El sobrenadante de la fermentación ajustado con 0,8 M de
acetato de amonio fue posteriormente aplicado en la columna. El
material desenlazado fue luego lavado con 0,8 M de acetato de amonio
hasta que se eliminó todo el material absorbente UV (280 nm).
La columna fue entonces eluída con agua y
posteriormente con 50% de etanol.
La actividad fosfolipasa fue determinada a pH
4,5 y 40ºC usando un equipo NEFA como se ha descrito anteriormente.
Se agruparon as fracciones que contienen una actividad en agua y
eluato de alcohol. Se evaluó la actividad a pH 4,5 usando un ensayo
del equipo NEFA.
Las fracciones que contienen una actividad
fosfolipasa fueron posteriormente agrupadas y dializadas y
concentradas usando una membrana de ultrafiltración Amicon con un
corte de 10 kDa.
Fase 3) Absorción negativa en cromatografía DEAE
de flujo rápido.
DEAE FF se compró de Pharmacia y una columna de
50 ml fue embalada con la matriz.
La columna fue posteriormente lavada como se ha
descrito por el fabricante y equilibrada con 25 mM tampón acetato
Tris pH 7.
La muestra dializada y concentrada fue entonces
ajustada a pH 7 y la conductancia a 2 mSi y aplicada en una columna
de intercambiador aniónico DEAE FF.
La actividad fue recogida como efluente. La
actividad no enlaza con el intercambiador aniónico a pH 7.
El efluente de DEAE FF con actividad fue
concentrado y dializado usando una membrana Amicon con un corte de
10 kDa. y tampón 25 mM tampón de acetato sódico pH 6.
Gelfiltración en Superdex 75.
Una columna preempaquetada Superdex 75 Hiload Tm
16/60 de Pharmacia fue lavada y equilibrada con 25 mM de acetato
sódico pH 6 con 150 mM NaCl.
Dos ml del efluente concentrado de
intercambiador aniónico que presenta actividad fosfolipasa a pH 4,5
y 40 grados fueron aplicados en la columna superdex.
La actividad fue separada por filtración en gel
con una velocidad de flujo de 1 ml/minuto.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Una caracterización, como se describe abajo, fue
realizada en una fosfolipasa Fusarium oxysporum fermentada
como se describe en el ejemplo 1 y purificada como se describe en el
ejemplo 2.
El peso molecular de la enzima de la fosfolipasa
fue determinada usando de 4 a 20% de placas prefundidas del sistema
de dilución simple por electroforesis en gel de poliacrimida de
Novex Tm. El peso molecular de la proteína fue determinado bajo
condiciones de reducción que se han descrito anteriormente.
Para la fosfolipasa de F. oxysporum el
peso molecular resultó ser de 29-30 kDa bajo
condiciones de reducción.
El punto isoeléctrico fue determinado mediante
el uso de placas Ampholine PAGE de Pharmacia.
Para el F. oxysporum pl de la proteína
resultó ser alrededor de pH neutral, preferiblemente en el margen
5,8 a 6,8.
\vskip1.000000\baselineskip
La termostabilidad de la fosfolipasa de
Fusarium oxysporum fue evaluada mediante calorimetría por DSC
(Calorimetría diferencial por barrido). La temperatura de
desnaturalización térmica, Td, fue tomada como tope del valor máximo
de la desnaturalización en termogramos (Cp vs. T) obtenida después
del calentamiento de las soluciones enzimáticas a un nivel de
calentamiento programado y constante.
\vskip1.000000\baselineskip
Para los experimentos se utilizó una DSC II de
Hart Scientific (Utah, US, 1993).
Se usaron soluciones tamponadas de 50 mM como
solvente para la enzima (aproximadamente 2 mg/ml) a pH 10 (50 mM de
tampón de glicina), pH 7 (50 mM tampón HEPES +10 mM EDTA) o pH 4
(50 mM fr tampón de citrato). La enzima fue purificada según el
ejemplo 2 anterior.
Se transfirieron 750 \mul de solución
enzimática en unas ampollas hastelloy selladas estándar de 1 ml de
Hart Scientific. Las ampollas fueron cargadas en el calorímetro y
enfriadas a 5ºC durante 15 min. El equilibrio térmico se efectuó
antes del barrido de DSC. El barrido de DSC fue realizado de 5ºC a
95ºC a una frecuencia de barrido de aproximadamente 90 K/hr. Las
temperaturas de desnaturalización fueron determinadas a una
exactitud de aproximadamente +/- 2ºC.
Debería observarse que estos experimentos fueron
realizados en ausencia de una matriz de aceite que puede influir
significativamente en la estabilidad enzimática. Los resultados de
la DSC indican una estabilidad máxima cerca del pH neutral.
Asumiendo la desnaturalización térmica
irreversible, una temperatura relevante del rendimiento en una
aplicación industrial como el desgomado de aceites (US 5.264.367) es
al menos aproximadamente 10 grados inferior a las temperaturas Td
incluidas en la tabla No 1 anterior.
Un análisis aminoterminal fue determinado usando
la degradación Edman con el equipo Applied Biosystem (secuenciador
de proteínas ABI 473A, Applied Biosystem, USA) realizado como el
fabricante describe.
Para la fosfolipasa de F. Oxysporum, la
secuencia N-terminal es:
N-terminal
A-V-G-V-T-T-T-D-F-S-N-F-K-F-Y-I
El aminoácido N-terminal
"A" (Ala) se encuentra en la posición 31 de la secuencia ID No.
2. Esto indica que la enzima fosfolipasa madura de la invención
comienza en la posición 31 de la SEC ID No 2.
Consecuentemente, la secuencia madura se
encuentra en 31-346 de la SEC ID No 2.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
La actividad fosfolipasa A fue determinada con
Lecitina de soja como sustrato en el modo descrito anteriormente
(ensayo con bases de prueba NEFA) a pH 4,5 a 40ºC.
La fosfolipasa de F. oxysporum mostró una
actividad fosfolipasa A significante en las condiciones
anteriormente descritas.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5
La actividad fosfolipasa fue determinada con
L-\alpha-lisofosfatidilcolina como
sustrato en el modo descrito anteriormente (ensayo con bases de
prueba NEFA) a pH 4,5 a 40ºC.
La fosfolipasa de F. oxysporum muestra
una actividad significante contra
L-\alpha-lisofosfatidilcolina en
las condiciones anteriormente descritas.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
6
Se ha usado un equipo monomolecular (cuba de
orden cero, KSV5000, instrumentos KSV, Finlandia) para valorar la
actividad de varias enzimas hacia el fosfolípido DDPC (Di Dicanoil
(C10) Fosfatidil Colina).
\vskip1.000000\baselineskip
En una superficie íntegramente purificada de una
solución tampón (10 mM TRIS, pH 8,0, 25ºC), se extendió una capa
monomolecular de DDPC de una solución de cloroformo. Después de la
relajación de la capa monomolecular (evaporación del cloroformo), la
presión de la superficie se ajusta a 15 mN/m, correspondiente a una
área media molecular de DDPC de aproximadamente 63
\ring{A}^{2}/molec. Una solución tampón (véase arriba) con
aproximadamente 60 \mug (micro gramo) de enzimas se inyecta a
través de la capa monomolecular en la subfase del compartimiento de
la reacción (cilindro con área 1520 mm^{2} y volumen 30400
mm^{3}) en el "cuba de orden cero", la actividad enzimática
se manifiesta a través de la velocidad de una barrera móvil que
comprime la capa monomolecular con el objetivo de mantener la
presión constante de la superficie, mientras las moléculas del
sustrato insolubles son hidrolizadas en unos productos reactivos más
hidrosoluble. Después de haber verificado que la solubilidad acuosa
de los productos reactivos (ácido cáprico y DDPC) es
considerablemente superior que para DDPC, se estima el número de
moléculas DDPC hidrolizadas por minuto por la enzima de la área
media molecular (MMA) de DDPC.
\vskip1.000000\baselineskip
"Enzima de F. Oxysporum" en la tabla
2 es una fosfolipasa de la invención, purificada como se describe en
el ejemplo 2.
\vskip1.000000\baselineskip
Ninguna actividad fosfolipasa fue detectada para
la mayor parte de las enzimas excepto para las lipasas obtenidas de
la lipasa del conejillo de indias, la cual mostró una actividad
fosfolipasa mínima.
La fosfolipasa de la invención obtenida de
Fusarium oxysporum mostró sorprendentemente una actividad
fosfolipasa menor.
Consecuentemente, en la presente invención el
término "actividad fosfolipasa", usado aquí en conexión con una
fosfolipasa de la invención, se define como una actividad que, en el
"ensayo monomolecular fosfolipásico" mostrado anteriormente, es
al menos 0,25 nmol/min, dosis enzimática: 60 \mug; más
preferiblemente al menos 0,40 nmol/min, dosis enzimática: 60 \mug;
más preferiblemente al menos 0,75 nmol/min, dosis enzimática: 60
\mug; más preferiblemente al menos 1,0 nmol/min, dosis enzimática:
60 \mug; más preferiblemente al menos 1,25 nmol/min, dosis
enzimática: 60 \mug; e incluso más preferiblemente al menos 1,5
nmol/min, dosis enzimática: 60 \mug.
En consecuencia, el término "lipasa con
actividad fosfolipasa lateral" se define como una lipasa con una
actividad fosfolipasa lateral, donde la actividad fosfolipasa
lateral, en el "ensayo monomolecular fosfolipásico" mostrado en
el ejemplo 6, es inferior a las figuras mencionadas anteriormente
que especifican actividad fosfolipasa.
Un ejemplo de una lipasa con actividad
fosfolipasa lateral según estas definiciones es la lipasa del
conejillo de indias mostrada en la tabla 2 anterior. Dicha lipasa
del conejillo de indias tiene una actividad fosfolipasa lateral en
el "ensayo monomolecular fosfolipásico" que es inferior a 0,25
nmol/min, dosis enzimática: 60 \mug.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
7
Se realizó una clonación y expresión usando la
clonación por expresión en la técnica de levadura en el modo
descrito anteriormente.
El ARNm fue aislado de Fusarium
oxysporum, DSM No. 2672, cultivado en el modo descrito
anteriormente que incluye agitación para asegurar una aireación
suficiente. Los micelios fueron recogidos después de
3-5 días de crecimiento, inmediatamente congelados
en nitrógeno líquido y almacenados a -80ºC. Una biblioteca de
Fusarium oxysporum, DSM No. 2672, consistente en
aproximadamente 9x10^{5} clones individuales, fue construida en
E. coli como se describe con una base del vector de 1%. El
ADN del plásmido de algunos depósitos fue transformado en levadura y
se obtuvieron 50-100 placas que contienen
250-400 colonias de levadura de cada agrupación.
Colonias positivas de la fosfolipasa fueron
identificadas y aisladas en placas de sustrato (véase arriba).
Insertos de ADNc fueron amplificados directamente de las colonias de
levadura y caracterizadas como se describe en la sección Materiales
y Métodos anterior. La secuencia de ADN del ADNc que codifica
fosfolipasa se muestra en la secuencia ID No. 1 y la secuencia de
aminoácidos correspondiente se muestra en la secuencia ID No. 2. En
la secuencia ID No. 1, los nucleótidos de ADN del No 23 al No. 1060
define la región que codifica fosfolipasa. La parte de la secuencia
de ADN en la secuencia ID no 1, que codifica la parte madura de la
fosfolipasa, consta de las posiciones 113 a 1060, las cuales
corresponden a las posiciones de aminoácidos 31-346
en la SEC ID no 2.
El ADNc puede obtenerse del plásmido en DSM
11299.
El ADN total fue aislado de una colonia de
levadura y el ADN del plásmido salvado mediante transformación del
E. coli en el modo descrito anteriormente. Con el objetivo de
expresar fosfolipasa en Aspergillus, el ADN fue digerido con
enzimas de restricción apropiadas, su tamaño fraccionado en gel, y
un fragmento correspondiente a los genes de la fosfolipasa
purificados. El gen fue posteriormente ligado a pHD414, digerido con
enzimas de restricción apropiadas, dando como resultado el plásmido
pA2PH10.
Después de la amplificación del ADN en E.
Coli, el plásmido fue transformado en Aspergillus oryzae
en el modo descrito anteriormente.
\vskip1.000000\baselineskip
Cada uno de los transformantes fue evaluado para
una actividad enzimática en el modo descrito anteriormente. Algunos
transformantes tenían una actividad fosfolipasa que era
significativamente más alta que la base de Aspergillus
oryzae. Esto demuestra una expresión eficaz de la fosfolipasa en
Aspergillus oryzae.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
8
Un transformante A. oryzae que incluye el
vector de expresión Aspergillus pA2PH10 (véase ejemplo 7) fue
fermentado en discontinuo como se ha descrito anteriormente. La
purificación de la fosfolipasa de F. oxysporum producida
recombinantemente fue realizada como se describe en el ejemplo
2.
\newpage
Ejemplo
9
La caracterización fue realizada en una
fosfolipasa de Fusarium oxysporum expresada recombinantemente
y purificada posteriormente (véase ejemplo 8).
Estos resultados de caracterización respecto a
la fosfolipasa de F. oxysporum recombinante de la invención
correlacionaba perfectamente con los resultados de la
caracterización mostrados en el ejemplo 3, donde se demostró que la
enzima expresada recombinantemente y purificada fue la misma que la
fosfolipasa no expresada recombinantemente y purificada
caracterizada en el ejemplo 3.
[0351] La actividad fosfolipasa (PHLU) fue
medida como la liberación de ácidos grasos libres de lecitina. Se
añadió 50 \mul 4%
L-alfa-fosfatidilcolina (lecitina de
planta de Avanti, USA), 4% Tritón X-100, 5 mM
CaCl_{2} en 50 mM HEPES, pH 7 y se diluyó 50 \mul de solución
enzimática en una concentración apropiada en 50 mM HEPES, pH 7. Las
muestras fueron incubadas durante 10 minutos a 30ºC y la reacción
terminada a 95ºC durante 5 minutos antes del centrifugado (5 minutos
a 7000 rpm). Los ácidos grasos libres fueron determinados usando el
equipo NEFA C de Wako Chemicals GmbH; 25 \mul de mezcla reactiva a
250 \mul de reactivo A fueron añadidos e incubados durante 10
minutos a 37ºC. Posteriormente se añadió 500 \mul de reactivo B y
la muestra fue incubada nuevamente, 10 minutos a 37ºC. La absorción
fue medida a 550 nm usando un espectrofotómetro de la ordenación de
diodos HP 8452A. Las muestras fueron realizadas al menos en
duplicados. Se incluyeron el sustrato y las capas enzimáticas
(muestras de enzimas precalentadas (10 minutos a 95ºC) + sustrato).
El ácido oleico fue usado como un estándar del ácido graso. 1 PHLU
equivale a la cantidad de enzima capaz de liberar 1 \mumol de
ácido graso libre/min bajo estas condiciones.
De forma alternativa, se realizó el ensayo a
37ºC en 20 mM tampón de citrato, pH 5
(Ca^{2+}-dependencia) o 20 mM de tampón
Britton-Robinson
(pH-perfil/temperatura-perfil/estabilidad).
La actividad fosfolipasa A1 (PLA1) fue medida
usando
1-(S-decanoil)-2-decanoil-1-tio-sn-glicero-3-fosfocolina
(sondas moleculares D3761) como sustrato. Se añadió 190 \mul de
sustrato (100 \mul D3761 (2 mg/ml en etanol) + 50 \mul 1% Tritón
X-100 + 1,85 ml 50 mM HEPES, 0,3 mM DTNB, 2 mM
CaCl_{2}, pH 7) en una cubeta de 200 \mul a 10 \mul de enzima,
y la absorción a 410 nm fue medida como función de tiempo en el
espectrofotómetro de ordenación de diodos HP 8452A a temperatura
ambiente. La actividad fue calculada como la inclinación de la curva
en el margen lineal. PLA1 equivale a la cantidad de enzima capaz de
liberar 1 \mumol de ácido graso libre (tiol)/min bajo estas
condiciones.
La actividad fosfolipasa A2 (PLA2) fue medida a
40ºC usando
1-hexadecanoil-2-(1-pirenodecanoil)-sn-glicero-3-fosfocolina
(sondas moleculares H361). Se añadió 2 ml de sustrato (50 \mul 1%
Tritón X-100 + 25 \mul 0,1% H361 en metanol + 10
ml 50 mM HEPES, pH 7) en una cubeta de 2 ml con agitación a 10
\mul de enzima, y se midió la emisión de la fluorescencia del
pireno a 376 nm (excitación a 340 nm) como función de tiempo
(intervalos de 1 seg.) usando el aparato Perkin Elmer LS50. En el
Tritón X-100/micelas fosfolípidas, la concentración
de fosfolípido fue ajustada para tener una formación excímera (emite
a 480 nm). Después de la disociación, el ácido graso en la posición
2, el cual contiene el grupo pireno, es liberado en la fase acuosa
dando como resultado un aumento de la emisión del monómero. PLA2 fue
tomado como la inclinación de la curva en el margen lineal en
condiciones iguales.
[0355] La actividad lipasa (LU) fue medida según
la publicación de Novo Nordisk AF 95. La hidrólisis de tributirino a
30ºC a pH 7 fue seguido por un experimento de valoración de
pH-stat. 1 LU equivale a la cantidad de enzima capaz
de liberar 1 \mumol de ácido butírico/min bajo condiciones
estándar.
La actividad en aceite de oliva (SLU) fue medida
de la manera siguiente: se añadieron 12 ml 5 mM
Tris-HCl, 40 mM NaCl, 5 mM CaCl_{2}, pH 9 a 2,5
ml de sustrato de la lipasa sigma. El pH fue ajustado a pH 9 antes
de añadir 0,5 ml de solución de lipasa (diluida en tampón) y llevar
a cabo un ensayo de valoración de pH-stat a 30ºC
usando el Titralab disponible comercialmente de Radiometer A/S,
Copenhague, Dinamarca. 1 SLU equivale a la cantidad de enzima capaz
de liberar 1 \mumol de ácido graso libre/min a pH 9, 30ºC.
Los ensayos usados para caracterizar las enzimas
que se mencionan a continuación fueron los ensayos descritos
anteriormente.
PL de Fusarium oxysporum que tiene la
secuencia de aminoácidos mostrada en la secuencia no 2.
Lote F-9700989, OD_{280} 0,83
(0,69 mg/ml), pureza > 95% (sistema de dilución simple por
electroforesis en gel de poliacrimida).
La enzima fue expresada recombinantemente y
purificada en el modo descrito anteriormente.
Lecitase^{TM} Lote L546-F06
(10368 IU/ml, aproximadamente 20 mg/ml)
Lipolase® (Novo Nordisk A/S)
Se investigó la influencia de Ca^{2+} en la
actividad fosfolipasa de la lipasa/fosfolipasa F. Oxysporum.
No se observó ninguna diferencia significante tanto si EDTA o
Ca^{2+} estaba incluido en el ensayo o no (véase tabla 3 a
continuación), y así la enzima parece ser relativamente
independiente de Ca^{2+}.
Se estudió el perfil de pH en el tampón
Britton-Robinson usando la lecitina de planta como
sustrato (tabla 4). Aunque la enzima muestra un perfil de pH
alcalino sobre fosfolípido con un óptimo a pH 9 o más alto, la
actividad es aún suficientemente alta para proporcionar el desgomado
de aceites a un rendimiento y pH bajo en la cocción (véase a
continuación para una comparación de actividades específicas).
Se obtuvieron los perfiles de temperatura para
la fosfolipasa a pH 5; la actividad comienza a declinar a
temperaturas superiores a 40ºC (tabla 5). Esto concuerda
razonablemente con la estabilidad de la temperatura medida mediante
la preincubación de la enzima y medición posterior de la actividad
residual (tabla 6), donde la enzima es estable a temperaturas de
hasta 45ºC a pH 5.
Todos los datos se muestran como datos de la
actividad relativa, relativos a la actividad a pH 5, 40ºC, la cual
está normalizada a 1.
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Todos los datos se muestran como datos
residuales de la actividad, donde la actividad después de la
preincubación a 5ºC está normalizada a 1.
La estabilidad baja de la enzima puede ser
ventajosa para registrar un producto eventual como un proceso
auxiliar, ya que la enzima activa no debería estar presente en el
producto final en el desgomado de aceites comestibles o productos
horneados.
La fosfolipasa obtenida de Fusarium
oxysporum de la invención tiene tanto actividad fosfolipasa como
lipasa.
En consecuencia, se investigó la actividad de la
enzima en varios substratos de lipasa y de la fosfolipasa y se
comparó con la actividad de la fosfolipasa Lecitase^{TM}
disponible comercialmente y de la lipasa Lipolase® disponible
comercialmente (Novo Nordisk A/S).
La lipasa/fosfolipasa de F. oxysporum
tiene una alta actividad tanto en el aceite de tributirino como en
el aceite de oliva a pH 7 y 9 (tabla 7). Por razones comparativas la
actividad específica de Lipolase® es alrededor de 5000 LU/mg. No
obstante, contrariamente a Lipolase®, la lipasa de F.
oxysporum presenta una especificidad mucho más amplia con
actividad fosfolipasa considerable y también actividad tioesterasa
(véase el ejemplo 6 de la capa monomolecular anterior, el cual
muestra que Lipolase® no tiene una actividad fosfolipasa que pueda
medirse).
La fosfolipasa/lipasa de F. oxysporum de
la invención tiene una actividad específica en lecitina
considerablemente superior a la de la fosfolipasa Lecitase^{TM}
(PLA2 pancreática del cerdo) a pH 7 (tabla 7).
Comparada con Lecitase^{TM}, la enzima de
F. oxysporum tiene una actividad de 100 pliegues más alta a
pH 7. La proporción fosfolipasa:lipasa para la enzima de F.
oxysporum es alrededor de 0,225 (1000 LU/mg/225 PHLU/mg) bajo
condiciones similares (pH 7 y 30ºC).
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La especificidad de la lipasa/fosfolipasa de
F. oxysporum fue investigada usando substratos específicos
para la fosfolipasa A1; midiendo la disociación del enlace
tio-éster en la posición 1 de
1-(S-decanoil)-2-decanoil-1-tio-sn-glicero-3-fosfocolina.
La enzima hidroliza claramente la posición 1 en
fosfolípido (tabla 7), mientras que Lecitase^{TM} (PLA2
pancreática del cerdo) no mostró ninguna actividad en este sustrato
tal como se esperaba.
La secuencia de aminoácidos
N-terminal de la proteína de la fosfolipasa madura
expresada recombinantemente se determinó como se describe en el
ejemplo 3, y se confirmó que esta secuencia
N-terminal era la misma que la que se determinó para
la enzima purificada y producida de manera no recombinante (véase
ejemplo 3).
La espectrometría de masas
MALDI-TOF se efectuó usando un espectrómetro de masa
VG TofSpec (Micromass, Manchester, UK) como se describe en Christgau
et al. Biochem. J. 319, 705-712, 1996.
\vskip1.000000\baselineskip
La secuencia de aminoácidos
N-terminal de la fosfolipasa de Fusarium
oxysporum, tal como se deduce de la secuencia de ADN,
proporciona en combinación con la secuencia de aminoácidos
N-terminal conocida de la fosfolipasa madura, una
proteína de 315 residuos aminoácidos (Aminoácidos
31-346 en la secuencia ID no. 2). La masa teórica de
esta proteína pronosticada es de 33.256,8 Da.
Usando una espectrometría de masas
MALDI-TOF hemos determinado previamente que la masa
de la fosfolipasa/lipasa auténtica de F. oxysporum es 28,2
kDa (datos no mostrados), y en el sistema de dilución simple por
electroforesis en gel de poliacrimida se mostró que el peso
molecular es de 29-30 kDa (véase arriba).
Como las secuencias de aminoácidos
N-terminal de las lipasas auténticas y recombinantes
de F. oxysporum son idénticas, es posible que la diferencia
de la masa observada entre la masa pronosticada y la masa
experimental esté provocada por el tratamiento de
C-terminal.
Para investigar este hecho, hemos aislado el
péptido C-terminal de lipasa recombinante de F.
oxysporum expresado en A. oryzae y ordenado a través de
su C-terminal.
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La masa media de la fosfolipasa/lipasa auténtica
de F. oxysporum de 28,2 kDa puede utilizarse para pronosticar
el residuo C-terminal más posible que viene a ser
Ser303 (secuencia ID No 2).
Esta deducción se basa en la suposición de que
la enzima no está glucosilada. El único sitio
N-glicosilación potencial encontrado en la secuencia
en Asn163 probablemente no se utiliza, ya que se ha encontrado un
Pro-residuo en la posición 164. No se ha informado
nunca sobre la presencia de un Pro-residuo como
segundo residuo en la secuencia de consenso para
N-glicosilación
(Asn-Xaa-Ser/Tr). Además, la forma
del valor máximo en el espectro de la masa no indica glicosilación.
No obstante, el valor máximo es más amplio que el normalmente
encontrado para las proteínas homogéneas, lo que indica la
posibilidad de una heterogeneidad del tamaño. Como el
N-término de la enzima está bien definido, la
heterogeneidad del tamaño tiene muy posiblemente su base en el
tratamiento heterogéneo de C-terminal.
La inspección de la SEC ID no 2 (ver abajo)
revela que el C-término pronosticado está localizado
cerca del último de los 8 residuos de Cys en la secuencia. La
introducción de una marca radioactiva en los residuos de Cys hace
posible que los péptidos con residuos de Cys sean fácilmente
encontrados a través de la purificación del péptido. La combinación
del mareaje radioactivo con la degradación proteolítica, usando la
proteasa Asp-N que se disasocia delante de los
residuos de Asp, daría como resultado un péptido marcado
C-terminal. Además, tres péptidos internos estarían
marcados. La secuenciación de todos los péptidos marcados deberían
revelar el C-término de la
enzima.
enzima.
SEC ID no 2: Secuencia
pronosticada de aminoácidos de fosfolipasa/lipasa de F.
Oxysporum.
\vskip1.000000\baselineskip
La secuencia se deduce de la secuencia de ADN y
comienza en el N-término determinado
experimentalmente para tanto la enzima auténtica como la enzima
recombinante. Los 8 residuos de Cis están indicados por \Downarrow
mientras el residuo Ser de C-terminal pronosticado
de la espectrometría de masas MALDI-TOF de la enzima
auténtica está indicado por \uparrow. El residuo Asn encontrado en
la secuencia de consenso para N-glicosilación
(NXS/T) está mostrado por (\lozenge) pero cuando no se utiliza con
toda probabilidad mientras X es un Pro-residuo.
La enzima era PL de Fusarium oxysporum
que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la secuencia no
2.
Lote F-9700989, OD280 0,83 (0,69
mg/ml), pureza > 95% (sistema de dilución simple por
electroforesis en gel de poliacrimida).
La enzima fue expresada recombinantemente y
purificada en el modo descrito anteriormente.
La enzima fue desnaturalizada y los enlaces
disulfuro reducidos antes de que los grupos tiol reaccionaran con
[1-^{14}C]CH_{2}CONH_{2}.
Después del mareaje radioactivo de los residuos
de Cis, la lipasa fue degradada usando la proteasa
Asp-N.
Los péptidos generados fueron fraccionados
usando HPLC de fase inversa. Las fracciones recogidas fueron sujetas
a espectrometría de masas MALDI-TOF y recuento de
escintilaciones. Las fracciones con cantidades significantes de
radioactividad fueron seleccionadas para la repurificación usando
HPLC de fase inversa.
Las fracciones repurificadas fueron sometidas a
recuento de escintilaciones y las fracciones con radioactividad
posteriormente clasificadas.
A continuación se presenta un resumen de los
resultados. Este esquema puede parecer caótico debido a las muchas
secuencias presentadas. No obstante, el esquema contiene todos los
datos de secuencia obtenidos de las fracciones radioactivas y, así,
representa la base para la conclusión. Debe observarse que todos los
residuos de Cis han sido recubiertos a través de la secuenciación;
la mayor parte de éstos más de una vez. Otra cuestión a precisar son
las divisiones aberrantes observadas, las cuales dan como resultado
un gran número de pequeños péptidos marcados radioactivamente.
Las secuencias de aminoácidos obtenidas mediante
la secuenciación de los péptidos marcados radioactivamente se
derivaron de la enzima de F. oxysporum recombinante. Las
secuencias están alineadas a la secuencia de aminoácidos
pronosticada como se deduce de la secuencia de ADN. Los 8 residuos
de Cys están indicados por \Downarrow mientras que el residuo de
Ser de C-terminal pronosticado a partir de la
espectrometría de masas MALDI-TOF de la enzima
auténtica está indicado por \uparrow.
De la secuenciación de todos los péptidos
marcados radioactivamente está claro que la parte
C-terminal de la secuencia de aminoácidos codificada
en el ADN es procesada durante la expresión de la lipasa de F.
oxysporum. Las secuencias péptidicas apuntan a Ser303 como el
residuo C-terminal más probable en la enzima madura,
según el resultado de la espectrometría de masas
MALDI-TOF.
No obstante, basándose en los datos no puede
descartarse que ocurra el tratamiento diferencial de
C-terminal llevando a C-terminales
heterogéneos; p. ej. un péptido indica que Phe272 podría también
encontrarse como residuo C-terminal.
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Ejemplo
10
El equipo consiste en un 1 l de reactor de acero
con envoltura exterior ajustado con una tapa de acero, un propulsor
(600 rpm), deflectores, un sensor de temperatura, un tubo de entrada
en la parte superior, un refrigerante de reflujo (4ºC) en la pare
superior y un tubo de salida en la parte inferior. La envoltura
exterior del reactor está conectada a un baño de termostato. El tubo
de salida está conectado por medio de un tubo de silicona a la parte
superior del mezclador en línea Silverson equipado con un "tamiz
de alto cizallamiento de agujeros cuadrados", accionado por un
mezclador de laboratorio de alto cizallamiento Silverson L4RT (8500
rpm, flujo ca. 1.1 l/minuto). La parte superior del mezclador está
ajustada con un serpentín de enfriamiento (5-10ºC) y
un tubo de salida, el cual está conectado al tubo de entrada del
reactor por medio del tubo de silicona. Un sensor de temperatura
está insertado en el tubo de silicona justo después de la parte
superior del mezclador. La única conexión del sistema de la parte
superior del reactor/mezclador a la atmósfera es a través del
condensador de reflujo.
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Se enciende todo equipo de termostato y de
enfriamiento. Entonces se agregan 0,6 l (ca. 560 g) de aceite en el
reactor, el cual se mantiene aproximadamente a la temperatura
necesaria para el experimento específico. Se enciende el mezclador
de laboratorio y, de esta manera, el aceite comienza a circular del
reactor a la parte superior del mezclador y otra vez al reactor. Se
deja que el sistema se equilibre durante aproximadamente 10 minutos,
período durante el cual se sintoniza con precisión la temperatura.
El período de pretratamiento comienza con la adición de 0,6 g (2,86
mmol) de monohidrato de ácido cítrico en 27 g MilliQ de agua (agua
añadida vs. aceite equivale a 4,8% peso/peso; [ácido cítrico] en
fase acuosa = 106 mM, en emulsión de agua/aceite = 4,6 mM), que
define t = 0. Cuando t = 30 minutos, se añade una cantidad adecuada
de solución 4 M de NaOH.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Cuando t = 35 minutos, las muestras son
extraídas para el análisis de P y determinación del pH.
Inmediatamente después, se añade la cantidad requerida de solución
enzimática (final del período de pretratamiento). Las muestras para
el análisis de P y determinación del pH son extraídas cuando t = 1,
2, 3,5, 5, 6 horas y, entonces, termina la reacción.
El sistema del reactor/mezclador es vaciado y
enjuagado con 2x500 ml 10% solución de agua DI/Deconex seguida por
un mínimo 3x500 ml de agua DI. La tabla 8 es una presentación de las
diferentes adiciones y muestras durante la reacción.
Coger 10 ml de agua en emulsión de aceite en un
tubo de centrifugado de vidrio. Calentar la emulsión al baño maría
durante 30 minutos. Centrifugar a 5000 rpm durante 10 minutos.
Transferir aproximadamente 8 ml de fase superior (de aceite) a un 12
ml de tubo de poliestireno y dejar (reposar) durante
12-24 horas. Después del reposo, tomar
aproximadamente 1-2 g de la fase clara superior para
el analisis del P.
El análisis de P se efectuó según el
procedimiento 2,421 de "Standard Methods for the Analysis of
Oils, Fats, and Derivatives, 7^{th} ed. (1987)":
Pesar 100 mg de MgO (leicht, Merck #5862) en un
plato de porcelana y calentar con un mechero de gas. Añadir
1-2 g de aceite y encender con un mechero de gas
para producir una masa negra y dura. Calentar en un horno Vecstar a
850ºC durante 2 horas para producir las cenizas blancas. Disolver
las cenizas en 5 ml de 6 M HNO_{3} y añadir 20 ml de mezcla del
reactivo. Dejar durante 20 minutos. Medir la absorbencia a 460 nm
(usar un ensayo en vacío (5 ml HNO_{3} + 20 ml mezcla de
reactivos) para el ajuste a cero). Calcular mediante el uso de la
curva de calibración.
Coger 2 ml de agua en la emulsión de aceite y
mezclar con 2 ml de agua MilliQ. Después de la separación de la
fase, pipetar la capa superior del aceite. Medir el pH en la fase
acuosa con electrodo de pH Orion. Las medidas se transforman en
valores "reales" de pH por la fórmula
pH_{real} =
pH_{medido} -
0,38.
Una curva de calibración se obtuvo mediante la
disolución de 0,6 g de monohidrato de ácido cítrico en 27 g de agua
DI; el pH de esta solución fue medido por el electrodo de pH Orion
(pH_{real}). Se mezclaron 100 \mul con 2 ml de agua MilliQ, y se
midió el pH de esta solución por el electrodo de pH Orion
(pH_{medido}). El pH de la solución de ácido cítrico fue
gradualmente cambiando mediante la adición de una solución NaOH y,
para cada regularización, se realizaron la dilución y medidas del pH
en el modo descrito anteriormente).
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Ejemplo
11
Todos los experimentos en relación con el
desgomado de aceite comestible se realizaron como se describe en el
ejemplo 10.
Aceite de semilla de colza desgomado con agua
(Colzro) de Aarhus Oliefabrik, Dinamarca.
Lote C00730/B01200, 9 kg, contenido de P 186
partes por millón (0,47% fosfátido).
El aceite no es un producto disponible
comercialmente, pero se ha cogido directamente de la línea de
producción de la fábrica.
Lote L646-F02 (10190 U/ml),
conc. estimada 20 mg/ml.
Las condiciones específicas para una serie de
experimentos de optimización del parámetro con Lecitase^{TM} se
presentan en la tabla 9. Las condiciones estándar son: dosificación
enzimática 535 U/kg aceite (1,1 mg/kg aceite), 60ºC, 2,0 eq. NaOH
(pH 5,5). La dosificación enzimática ha sido variada de
268-1070 U/kg aceite, la temperatura ha sido variada
de 40-70ºC y la adición de NaOH ha sido variada de
1,0-3,0 eq. correspondiente a los diferentes niveles
de pH que se muestran en la tabla 9.
En la tabla 10 se ofrecen las presentaciones de
los estudios de optimización separados.
Los resultados en la tabla 10 muestran que,
- i)
- de la investigación dosis/reacción puede observarse que la dosis de la enzima óptima (a 60ºC y 2,0 eq. NaOH) es de aproximadamente 535 U/kg aceite. La mitad de la dosificación aumenta el tiempo del desgomado de aproximadamente 3,5 a 6 horas y la dosificación doble no aporta ningún cambio en el rendimiento del desgomado. Se insertaron los resultados enzimáticos en blanco para comparar;
- ii)
- que la adición óptima NaOH es aproximadamente de 2,0 eq. (pH a aproximadamente 5,5), con un rendimiento pobre a 1,0 eq. (pH a aproximadamente 4,5) y 3,0 eq. (pH a aproximadamente 8);
- iii)
- que la temperatura óptima es aproximadamente de 60ºC, ya que 70ºC no hace bajar totalmente el nivel de P, 50ºC aumenta el tiempo del desgomado de aproximadamente 3,5 a 6 horas y 40ºC proporciona un rendimiento pobre.
Ejemplo
12
El desgomado enzimático de todos los
experimentos con el aceite comestible se realizó como se describe en
el ejemplo 10.
Aceite de semilla de colza desgomado con agua
(Colzro) de Aarhus Oliefabrik, Dinamarca.
Lote C00730/B01208, contenido de P
aproximadamente 200 ppm
Lote C00730/B01209, contenido de P
aproximadamente 200 ppm
Lote C00730/B01429, contenido de P 227 ppm
Lote C00730/B01430, contenido de P 252 ppm
Los aceites no están comercialmente disponibles,
pero se han cogido directamente de la línea de producción de la
fábrica.
PL de Fusarium oxysporum que tiene la
secuencia de aminoácidos mostrada en la secuencia no 2.
Lote F-9700123, OD_{280} 1,48,
pureza ca. 58%, conc. estimada 0,9 mg/ml.
La enzima fue expresada recombinantemente y
purificada en el modo descrito anteriormente.
Las condiciones específicas para una serie de
experimentos de optimización del parámetro con PL de Fusarium
oxysporum se presentan en la tabla 11. Las condiciones estándar
son: dosificación enzimática 1,6 mg/kg aceite, 40ºC, 1,5 eq. NaOH
(pH aproximadamente 5,0). La dosificación enzimática ha sido variada
de 0,2-1,6 mg/kg de aceite, la temperatura ha sido
variada de 30-50ºC y la adición de NaOH ha sido
variada de 1,0-2,5 eq. correspondiente a los
diferentes niveles de pH que se muestran en la tabla 11.
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Los resultados experimentales se presentan en la
tabla 12 posterior. Las desviaciones de pH en el margen de tiempo de
35 min. - 6 horas se encuentran dentro de los intervalos esperados,
con sólo irregularidades menores.
En resumen, los resultados de la tabla 12
posterior muestran que,
- i)
- de las pruebas dosis/reacción puede observarse que la dosis de enzimas óptimas (a 40ºC y 1,5 eq. NaOH) es aproximadamente 0,8 mg/kg de aceite;
- ii)
- la adición óptima NaOH es aproximadamente 1,5 eq. (pH aproximadamente 5,0), sin rendimiento a 1,0 eq. (pH aproximadamente 4,5) y con rendimiento limitado a 2,0 eq. (pH aproximadamente 5,5) y 2,5 eq. (pH aproximadamente 6,2); y
- iii)
- la temperatura óptima es alrededor de 45ºC, y 50ºC proporciona un rendimiento limitado.
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Ejemplo
13
La tabla 13 posterior muestra un ejemplo medio
de las desviaciones del pH durante el proceso de desgomado
enzimático realizado como se describe en el ejemplo 10.
Los experimentos son realizados con
Lecitase^{TM}. Véase ejemplo 11 para más detalles.
Si no se mencionan adicionalmente en los
ejemplos de los experimentos de desgomado enzimático descritos aquí,
las desviaciones estándar del pH, en dichos experimentos, resultaron
como se muestran en la tabla 13 anterior.
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Ejemplo
14
En la figura 2, se muestran los resultados del
PL según sus condiciones óptimas respectivas, determinados en los
ejemplos 11 y 12 anteriores.
Las condiciones experimentales mostradas en la
figura 2:
Lecitase^{TM}: 60ºC, pH 5,5 (2,0 eq. NaOH) y 1
mg enzima/kg de aceite (aproximadamente 535 U) (exp. # 9).
PL de Fusarium oxysporum: 40ºC, pH 5,0
(1,5 eq. NaOH) y 0,8 mg enzima/kg de aceite (exp. # 33).
PL de Fusarium oxysporum: 45ºC, pH 5,0
(1,5 eq. NaOH) y 1,6 mg enzima/kg de aceite (exp. # 64).
Aparentemente, la PL de Fusarium
oxysporum proporciona un efecto muy rápido del desgomado en
comparación con Lecitase^{TM}.
La PL de Fusarium, según la invención,
proporciona un desgomado casi total después de aproximadamente 25
minutos de contacto con la enzima al aceite.
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Ejemplo
15
Aceite de semilla de colza crudo de Århus
Oliefabrik (AOM), Dinamarca.
Lote C00745/B01146, contenido de P 609 partes
por millón. Este lote contiene residuos sólidos.
Aceite de semilla de colza crudo de Scanola,
(Dinamarca)
Lote C00745/B01593, contenido de P 315 ppm.
Aceite de semilla de colza crudo filtrado
Lote C00745/B01146 filtrado, contenido de P 231
ppm.
Este aceite es el lote C00745/B01146 anterior
(609 partes por millón) filtrado a través de un filtro Johnson de
100 \mum.
Aceite de semilla de colza crudo de Århus
Oliefabrik (AOM), Dinamarca.
Lote C00745/B01700, contenido de P 459 partes
por millón.
Aceite de semilla de colza de Lurgi,
Alemania
Lote C00932/B01381, contenido de P 148 ppm.
Aceite de soja crudo de Århus Oliefabrik,
Dinamarca.
Lote C00744/B01145, contenido de P 593 ppm
La determinación de la cantidad de fosfolípidos
no hidratables presente en los diferentes tipos de aceites
comestibles mostrados anteriormente se realizó mediante el
pretratamiento de los aceites con una solución que incluye
monohidrato de ácido cítrico en agua, tal como se describe en el
ejemplo 10 anterior.
Brevemente, el proceso del pretratamiento
incluye,
- i)
- tratamiento previo del aceite comestible, a 60ºC, mediante la adición de una solución que incluye monohidrato de ácido cítrico en agua (agua añadida vs. aceite equivale a 4,8% peso/peso; [ácido cítrico] en fase acuosa = 106 mM, en emulsión de agua/aceite = 4,6 mM) durante 30 minutos;
- ii)
- transferencia de 10 ml de agua tratada previamente en una emulsión de aceite a un tubo;
- iii)
- calentamiento de la emulsión al baño maría durante 30 minutos;
- iv)
- centrifugado a 5000 rpm durante 10 minutos,
- v)
- transferencia de aproximadamente 8 ml de la fase superior (de aceite) a un tubo nuevo y reposo durante 24 horas.
Tras el reposo, coger 2 g de fase clara superior
para la medición del contenido de fósforo no hidratable (partes por
millón) en el aceite comestible. El valor ppm fue determinado como
se describe en el ejemplo 10 anterior.
Después de este proceso, la cantidad de
fosfolípidos no hidratables presente en los diferentes tipos de
aceites comestibles mostrados anteriormente fue, el aceite de
semilla de colza crudo #1146 de AOM contiene materia sólida
granulosa, la cual es parcialmente responsable del alto nivel de P
(609 ppm); la filtración a través de un tamiz Johnson de 100 \mum
produjo un aceite claro con un contenido de P de 231 ppm.
El pretratamiento del aceite crudo y del aceite
filtrado produjo un nivel de P de 140 partes por millón, que es una
medida de los fosfolípidos no hidratables presente en el aceite;
- el contenido de fosfolípidos de un aceite de semilla de colza crudo de Scanola se redujo de 315 partes por millón a aproximadamente 30 partes por millón mediante el pretratamiento;
- el contenido de fosfolípidos de una semilla de aceite de colza obtenido de Lurgi (probablemente mezcla arbitraria de aceite crudo y aceite totalmente refinado) se redujo a 60 partes por millón mediante el proceso de pretratamiento;
- el pretratamiento de aceite de semilla de colza crudo #1710 de AOM redujo el contenido de P de 459 a 200-250 partes por millón;
- con aceite de soja crudo #1145 de AOM, el pretratamiento redujo el nivel de P de 593 a 10 partes por millón. Este aceite de soja constituye un ejemplo de aceites que pueden ser desgomados sólo mediante el desgomado con el tratamiento de citrato/agua. La adición enzimática a este aceite de soja crudo después del pretratamiento no redujo más el contenido de P.
Estos datos muestran que la composición de
fosfolípidos (fosfolípido hidratable vs. fosfolípido no hidratable)
del aceite de semilla de colza crudo varía inmensamente de un lote
para otro y, consecuentemente, el nivel de fosfolípidos restante en
el aceite de semilla de colza desgomado con agua variará en un
amplio margen (30 partes por millón (Scanola) a
200-250 ppm (AOM)).
Para el desgomado enzimático, la dosificación de
enzimas óptimas depende de la cantidad de fosfolípidos no
hidratables presente después del desgomado o pretratamiento.
Además, cuanto más alta es la cantidad de
fosfolípidos no hidratables presente en el aceite, más útil es el
método del desgomado enzimático.
Este hecho se ilustra también en el ejemplo 16
posterior, donde la presente invención muestra el desgomado
enzimático del aceite de semilla de colza crudo # 1146, el cual
tiene un nivel de fosfolípidos no hidratables de alrededor 140
ppm.
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Ejemplo
16
Los experimentos A y B fueron realizados según
el "Procedimiento general para realizar el desgomado
enzimático" como se describe en el ejemplo 10 anterior.
\vskip1.000000\baselineskip
Aceite de semilla de colza crudo de Århus
Oliefabrik (AOM), Dinamarca. Lote C00745/B01146, contenido de P 609
ppm. Este lote contiene residuos sólidos.
\vskip1.000000\baselineskip
Lecitase^{TM} 10L
Lote L646-F02 (10190 U/ml),
conc. estimada 20 mg/ml
PL de Fusarium oxysporum que tiene la
secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC No. 2.
Lote F-9700123, OD_{280} 1,48,
pureza ca. 58%, conc. estimada 0,9 mg/ml.
La enzima fue expresada recombinantemente y
purificada en el modo descrito anteriormente.
\vskip1.000000\baselineskip
Experimento A
(referencia)
Se agregan 0,6 l (580 g) de aceite de semilla de
colza crudo en el equipo y se calientan a 60ºC. Cuando t = 30
minutos, se agregan 1,43 ml (5,7 mmoles) de solución 4 M NaOH,
produciendo un pH de aproximadamente 5,6. Cuando t = 35 minutos, se
agregan 30 \mul (300 Unidad) de Lecitase 10L (obtenida de Novo
Nordisk A/S). El contenido de fósforo medido en la fase de aceite
tras el centrifugado, así como los valores de pH en la fase acuosa,
se muestran en la tabla 14.
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Experimento
B
Se agregan 0,6 l (581 g) de aceite de semilla de
colza crudo en el equipo y se calientan a 40ºC. Cuando t = 30
minutos, se añaden 1,07 ml (4,3 mmoles) de solución 4 M NaOH,
produciendo un pH de aproximadamente 5,4. Cuando t = 35 minutos, se
añaden 1 ml (0,9 Mg) de una solución purificada (ejemplo 2) de la
fosfolipasa F. oxysporum. El contenido de fósforo medido en
la fase de aceite tras el centrifugado, así como los valores de pH
en la fase acuosa, se muestran en la tabla 15.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
17
Los experimentos A y B fueron realizados según
el "Procedimiento general para realizar el desgomado
enzimático" como se describe en el ejemplo 10 anterior.
Aceite de semilla de colza crudo de
\ring{A}rhus Oliefabrik (AOM), Dinamarca. Lote C00745/B01710,
contenido de P 459 ppm.
Lecitase^{TM} 10L
Lote L646-F02 (10190 U/ml),
conc. estimada 20 mg/ml
PL de Fusarium oxysporum que tiene la
secuencia de aminoácidos mostrada en la secuencia No. 2.
Lote F-9700476, OD_{280} 0,8,
pureza ca. 58%, conc. estimada 0,45 mg/ml.
La enzima fue expresada recombinantemente y
purificada en el modo descrito anteriormente.
Experimento
A
Se agregan 0,6 l (580 g) de aceite de semilla de
colza crudo en el equipo y se calientan a 60ºC. Cuando t = 30
minutos, se agregan 1,43 ml (5,7 mmoles) de solución de 4 M NaOH,
produciendo un pH de aproximadamente 5,6. Cuando t = 35 minutos, se
añade una cantidad apropiada (p. ej. 50 \mul (alrededor de 500
unidades) por 1 mg enzima/kg aceite) de Lecitase 10L (obtenida de
Novo Nordisk A/S). El contenido de fósforo medido en la fase de
aceite tras el centrifugado se muestra en la tabla 16.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Experimento
B
Se agregan 0,6 l (581 g) de aceite de semilla de
colza crudo en el equipo y se calientan a 40ºC. Cuando t = 30
minutos, se agregan 1,07 ml (4,3 mmoles) de solución 4 M NaOH,
produciendo un pH de aproximadamente 5,0. Cuando t = 35 minutos, se
añaden una cantidad apropiada (es decir 1,6 mg enzima/kg aceite, y
3,2 mg enzima/kg aceite) de una solución purificada de la
fosfolipasa de F. oxysporum. El contenido de fósforo medido
en la fase de aceite tras el centrifugado se presenta en la tabla
17.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
En resumen los resultados muestran,
La dosificación enzimática varió de 1,0 a 3,0
mg/kg aceite. Los resultados se presentan en la tabla 16 anterior.
En una dosificación enzimática de 1,0 mg/kg, el desgomado de aceite
fue lento y produjo aproximadamente 20 partes por millón tras 6
horas. Con dosificaciones enzimáticas elevadas, el rendimiento del
desgomado mejoró para producir un contenido de fósforo de 10 ppm
después de aproximadamente 3,5 horas con 3,0 mg enzima/kg
aceite.
Se asume que el rendimiento mejorará
adicionalmente si se emplean dosificaciones más elevadas de
enzima.
\vskip1.000000\baselineskip
Se evaluaron las dosificaciones enzimáticas 1,6
y 3,2 mg/kg aceite, y el rendimiento resultó ser igualmente bueno
(tabla 17 anterior). Con 1,6 mg de enzima/kg aceite -o posiblemente
inferior- se observó un desgomado excelente produciendo 9 partes por
millón de P después de aproximadamente 2 horas. Se incluye la
posibilidad de usar cantidades todavía más inferiores de la
fosfolipasa de F. oxysporum (p. ej. 0,9 mg/kg aceite) y
conseguir todavía un buen rendimiento del desgomado.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
18
Un experimento según el "Procedimiento general
para realizar un desgomado enzimático" se realizó como se
describe en el ejemplo 10 anterior.
\vskip1.000000\baselineskip
Aceite de semilla de colza desgomado con agua de
Århus Oliefabrik (AOM), Dinamarca.
Lote C00730/B01700, contenido de P 231 partes
por millón.
\vskip1.000000\baselineskip
Un caldo de fermentación de Fusarium
culmorum.
Una cepa de Fusarium culmorum fue
cultivada, centrifugada y el sobrenadante purificado como se
describe a continuación.
Se produjeron cultivos de semilla de la cepa de
Fusarium culmorum CBS 513,94 (fecha de depósito 25 de octubre
de 1994) en frascos de agitación de 500 ml con 100 ml de la
composición siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
A cada frasco se añaden 0,5 g de CaCO_{3} y
0,5 ml de aceite.
El pH se ajusta a 5,5 antes de la esterilización
en autoclave.
\newpage
Después de 3 días a 26ºC y 250 rpm, se
inocularon 5 ml de cada uno de los cultivos de la semilla en frascos
de agitación con 100 ml del siguiente medio:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El pH de ajusta a 7,3-7,4 antes
de la esterilización en autoclave.
El cultivo tuvo lugar durante 9 días a 26ºC y
250 rpm. Los caldos fueron centrifugados y filtrados (0,45 (m), los
sobrenadantes recogidos y aplicados para el experimento del
desgomado que se muestra a continuación.
Actividad estimada 200 PHLU/ml.
\vskip1.000000\baselineskip
Se agregan 0,6 l (581 g) de aceite de semilla de
colza crudo en el equipo y se calientan a 40ºC. Cuando t = 30
minutos, se agregan 1,43 ml (5,7 mmoles) de solución de 4 M NaOH,
produciendo un pH de aproximadamente 5,5. Cuando t = 35 minutos, se
añade una cantidad apropiada (es decir 1070 PHLU/kg aceite) de una
solución purificada de fosfolipasa F. culmorum. El contenido
de fósforo medido en la fase de aceite tras el centrifugado se
muestra en la tabla 18.
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Ejemplo
19
Aceite de semilla de colza crudo C00745/B01700,
contenido de P 459 partes por millón.
Una fosfolipasa disponible comercialmente
Degomma VOD (Röhm; Alemania), conc. est. 10 mg/ml.
Se agregan 0,6 l (581 g) de aceite de semilla de
colza crudo en el equipo y se calientan a 50ºC. Cuando t = 30
minutos, se añaden 0,714 ml (2,86 mmoles) de solución 4 M NaOH,
produciendo un pH de aproximadamente 4,5. Cuando t = 35 minutos, se
añade una cantidad apropiada (es decir 3,6 mg/kg aceite, o 7,1 mg/kg
aceite) de una solución purificada de fosfolipasa Degomma VOD. El
contenido de fósforo medido en la fase de aceite tras el
centrifugado se muestra en la tabla 19.
Este ejemplo ilustra que Degomma VOD es capaz de
desgomar un aceite comestible. No obstante, con el objetivo de
obtener un desgomado satisfactorio de dicho aceite, se requieren
dosis relativamente altas de Degomma VOD en comparación con la
fosfolipasa Fusarium de la invención. Véase p. ej. los
ejemplos 16 y 17 para comparar.
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Ejemplo
20
Pan blanco y panecillos de masa tipo europea
fueron preparados a partir de la siguiente receta básica:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Las propiedades de la masa y los productos
horneados se determinaron de la siguiente manera:
Índice de volumen específico: El volumen
de una barra de pan o panecillo se mide mediante el método
tradicional de desplazamiento de la semilla de colza. El volumen
específico se calcula como ml de volumen por g de pan. El volumen
específico del control (sin enzima) se define como 100. El índice de
volumen específico relativo se calcula como:
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
La pegajosidad de la masa se evalúa según la
escala siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados muestran un efecto claro que
aumenta el volumen de la fosfolipasa Fusarium oxysporum en
los panecillos y en el pan colocado en el molde, en la receta que no
contiene lecitina. Si se incluye lecitina en la receta, se obtienen
efectos de volumen todavía mejores, aunque la lecitina en sí no
contribuye a aumentar el volumen. Un análisis estadístico (ANOVA,
(=0,05), realizado en Statgrafics Plus, liberación 3,0, muestra una
sinergia positiva significante entre fosfolipasa y lecitina.
Tanto con como sin lecitina en la receta, se
obtiene una forma significativamente mejorada de los panecillos
(condición del panecillo) con fosfolipasa F. oxysporum. En
este ejemplo, la mejor condición del panecillo se obtuvo mediante la
combinación de lecitina y fosfolipasa (1500 LU/kg harina).
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Ejemplo
21
Pan blanco y panecillos con masa tipo europea
fueron preparados a partir de la siguiente receta básica:
\vskip1.000000\baselineskip
En este ejemplo, las barras de pan fueron
colocadas en moldes con tapa con el objetivo de evitar diferencias
en los volúmenes específicos antes del análisis de textura. Después
del enfriamiento, las barras fueron almacenadas a temperatura
ambiente y embaladas en bolsas de plástico.
La evaluación de la dureza y textura del pan
puede realizarse según el método AACC 74-09. La
evaluación de la blandura de las migas de pan como indicadores de la
dureza del pan se realizó 0, 1, 3, y 7 días después de la cocción,
según el siguiente procedimiento:
Una rebanada de pan fue comprimida a velocidad
constante en un analizador de textura (TA TX-2) y la
fuerza para compresión fue medida en g. La solidez de la miga se
mide como la fuerza a una compresión del 25%. La solidez de una miga
de pan aumenta a medida que el pan se vuelve duro.
Los resultados de las medidas de la solidez como
función de los días del almacenamiento se muestran en la tabla 2. Se
añadió Lecimultina en una concentración de 1 g/kg de harina y se
añadió fosfolipasa Fusarium oxysporum en una dosificación de
500 U/kg de harina. Cada figura en la tabla es el valor medio de 6
medidas (2 barras de pan, 3 medidas en cada una).
Como se muestra en la tabla 21, el pan tratado
con fosfolipasa era ligeramente más blando que el control hasta 3
días de almacenamiento. En combinación con lecitina, podría
obtenerse un significante efecto contra el endurecimiento del pan a
través del almacenamiento completo (no puede obtenerse sólo con
lecitina o fosfolipasa).
\vskip1.000000\baselineskip
Esta lista de referencias citada por el
solicitante ha sido recopilada exclusivamente para la información
del lector. No forma parte del documento de patente europea. La
misma ha sido confeccionada con la mayor diligencia; la OEP sin
embargo no asume responsabilidad alguna por eventuales errores u
omisiones.
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[0371]
SEC ID No. 1 muestra una secuencia
clonada de ADN de la invención, incluyendo una secuencia de ADN que
codifica una enzima que presenta actividad
fosfolipasa.
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID no: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1170 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Fusarium oxysporum
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: DSM 2672
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 23..1063
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID no: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID No. 2 muestra la secuencia
de aminoácidos de una fosfolipasa de la
invención
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 346 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: linear
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No: 2:
Claims (3)
1. Uso de un polipéptido que presenta actividad
fosfolipasa A seleccionado del grupo consistente en:
- a)
- un polipéptido codificado por la parte que codifica la fosfolipasa A de la secuencia de ADN clonada en plásmido pYES 2,0 presente en Escherichia coli DSM 11299;
- b)
- un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en las posiciones 31-346 de la SEC ID no 2;
- c)
- un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en la posición 31-303 de la SEC ID no 2; y
- d)
- un polipéptido que es homólogo al menos en un 80% con dicho polipéptido definido en (b) o (c)
en un proceso para reducir el contenido de
fosfolípido en aceite comestible con contenido de fósforo de
50-250 ppm, comprendiendo el tratamiento del aceite
con el polipéptido para hidrolizar una parte mayor del fosfolípido,
y separar una fase acuosa conteniendo el fosfolípido hidrolizado del
aceite.
2. Uso de un polipéptido que presenta actividad
fosfolipasa A seleccionado del grupo consistente en:
- a)
- un polipéptido codificado por la parte que codifica la fosfolipasa A de la secuencia de ADN clonada en el plásmido pYES 2.0 presente en Escherichia coli DSM 11299
- b)
- un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en las posiciones 31-346 de la SEC ID no 2;
- c)
- un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en la posición 31-303 de la SEC ID no 2; y
- d)
- un polipéptido que es homólogo al menos en un 80% con dicho polipéptido definido en (b) o (c) en un porceso para hacer un producto horneado, comprendiendo la adición del polipéptido a una masa, y la cocción de la masa para hacer el producto horneado.
3. Uso según se reivindica en la Reivindicación
1 o Reivindicación 2, donde el polipéptido es una fosfolipasa
A1.
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