JP2000507458A - ホスホリパーゼの使用による高い量の非水和性リンを含む食用油中のリン含有成分の減少、ホスホリパーゼａおよび／またはｂ活性を有する糸状菌からのホスホリパーゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ホスホリパーゼを使用することからなる、高い非水和性リン含量を含む食用油中のリン含有成分の含量を減少する方法に関する。さらに、本発明は、ホスホリパーゼ活性を有する酵素、ホスホリパーゼ活性を有する酵素をコードするクローン化されたＤＮＡ配列、前記酵素を製造する方法、および多数の工業的用途のための前記酵素の使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 ホスホリパーゼの使用による高い量の非水和性リンを含む食用油中のリン含有成 分の減少、ホスホリパーゼＡおよび／またはＢ活性を有する糸状菌からのホスホ リパーゼ 発明の分野 本発明は、ホスホリパーゼを使用して、高い量の非水和性リンを含む食用油中 のリン含有成分の含量を減少する方法に関する。 さらに、本発明は、ホスホリパーゼ活性を有する酵素、ホスホリパーゼ活性を 有する酵素をコードするクローン化ＤＮＡ配列、前記酵素を製造する方法、およ び多数の工業的用途のための前記酵素の使用に関する。 発明の背景比較的高い量の非水和性リン含量を含む食用油の酵素的脱ガム化（ｄｅｇｕｍｍ ｉｎｇ） 水−脱ガム化された食用油（米国特許第５，２６４，３６７号、 ム化して、前記水−脱ガム化された食用油のリン含量を減少するためにホスホリ パーゼを用いることは知られている。 しかしながら、この方法は、特に高い量の非水和性リン（ＮＨＰ）および／ま たは比較的高い量の粘質物を含む食用油の酵素的脱ガム化を実施するために、な お改良することができる。 結局、本発明の目的は、ホスホリパーゼを使用することを含む、このような油 のリン含有成分の含量を減少する方法を提供することである。本発明のホスホリパーゼ リン脂質、例えば、レシチンまたはホスファチジルコリンは、外側位置（ｓｎ −１）および中央位置（ｓｎ−２）においておよび２つの脂肪酸でエステル化さ れかつ第３位置においてリン酸でエステル化されたグリセロールから成る；引き 続いて、リン酸をエステル化してアミノ−アルコールにすることができる。ホス ホリパーゼは、リン脂質の加水分解に関与する酵素である。いくつかの型のホス ホリパーゼ活性を区別することができ、これらの型は下記のものを包含する：ホ スホリパーゼＡ₁（ＰＬＡ₁）およびＡ₂（ＰＬＡ₂）、これらは１つの脂肪族アシ ル基を加水分解して（それぞれ、ｓｎ−１およびｓｎ−２位置において）リゾリ ン脂質を形成する；およびリゾホスホリパーゼ（またはホスホリパーゼＢ（ＰＬ Ｂ））、これはリゾリン脂質中の残りの脂肪族アシル基を加水分解することがで きる。 本発明は、なかでも、リン脂質中の一方または双方の脂肪族アシル基を加水分 解する能力を有する（すなわち、ＰＬＡおよび／またはＰＬＢ活性を示す）糸状 菌のホスホリパーゼに関する。以前に特性決定された真菌のＰＬＡおよび／またはＰＬＢ酵素 真菌のホスホリパーゼの特性決定は多数の参考文献に記載されている。先行技 術の水準を概観することを容易にするために、参考文献を２つの区分にグループ 化した。 第１区分において、現在、本発明の真菌のホスホリパーゼに関係すると考えら れない真菌のホスホリパーゼの同定を記載している参考文献を取り扱う。主に、 真菌のホスホリパーゼの特性決定の分野の範囲内の技術水準を要約するために、 これらの参考文献を含める。 第２区分において、本発明の真菌のホスホリパーゼに多少関係す ると考えられる真菌のホスホリパーゼの特性決定を記載する参考文献を取り扱う 。第１区分 ： ホスホリパーゼＡおよび／またはＢ活性を有する酵素は、下記のものを包含す る種々の真菌源において見出されてきている：ペニシリウム・ノタツム（Ｐｅｎ ｉｃｉｌｌｉｕｍ ｎｏｔａｔｕｍ）（また、ペニシリウム・クリソゲヌム（Ｐ ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）として知られている；Ｎ．Ｋａｗａｓａｋｉ、「Ｊ ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．」、７７、１２３３−４４、１９７５；Ｎ．Ｍａｓｕｄａ他 、「Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．」、２０２、７８３−７８７、１９９１）、 ペニシリウム・シクロピウム（Ｐ．ｃｙｃｌｏｐｉｕｍ）（「Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」３０（５）；３９３−４０１（１９９５））、サッ カロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ）（Ｍ．Ｉｃｈｉｍａｓａ他、「Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．」、４９（ ４）、１０８３−８９、１９８５；Ｆ．Ｐａｕｌｔａｕｆ他、「Ｊ．Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．」、２６９、１９７２５−３０、１９９４）、トルラスポラ・デルブ ルエキイ（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）（古い名称サッ カロマイセス・ロセイ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｒｏｓｅｉ）；Ｙ．Ｋｕ ｗａｂａｒａ、「Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．」、５２（１０）、２４５ １−５８、１９８８；「ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔｅｒｓ」、１ ２４、２９−３４）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａ ｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）（Ｈ．Ｏｉｓｈｉ他、「Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔ ｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．」、６０（７）、１０８７−９２、１９９６）、アス ペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）〔「Ｔｅｃｈｎｉ ｃａｌ Ｂｌｌｅｔｉｎ、Ｇ−ｚｙｍｅ（商標）Ｇ９９９」、Ｅｎｚｙｍｅ Ｂ ｉｏ−Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｌｔｄ．；「Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ ｙ」３０（５）：３９３−４０１（１９９５）〕およびコルチウム・セントリフ グム（Ｃｏｒｔｉｃｉｕｍ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｕｍ）（Ｓ．Ｕｅｈａｒａ他、 「Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．」、４３（３）、５１７−５２５、１９７ ９）。第２区分 ： ＥＰ５７５１３３（Ａ２）号には、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ）から得られた真菌のホスホリパーゼＡ₁の単離および特性決定および工業的用 途のためのそれらの使用が記載されている。 配列の情報（ＤＮＡまたはアミノ酸）は前記出願に記載されていず、また、ア スペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）のホスホリパーゼのクローン化の戦略 または示唆は前記出願に記載または示されていない。 Ｔｓｕｎｇ−Ｃｈｅ他（「Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｎｏｔｅｓ 」５８：１４３７−３８（１９６８））は、フザリウム・ソラニ（Ｆ．ｓｏｌａ ｎｉ）からのホスホリパーゼの特性決定を簡単に記載している。 ＥＰ１３０，０６４号には、フザリウム・オキシスポラム（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏ ｒｕｍ）ＤＳＭ２６７２株から得られたリパーゼ活性を示す発酵ブロスの単離さ れた画分が記載されている。さらに、洗剤組成物におけるその使用が開示されて いる。しかしながら、ＥＰ１３０，０６４号には、この画分がホスホリパーゼ活 性を示すことは記載されていない。 ＷＯ９６／１３５７９号には、フザリウム・クルモラム（Ｆ．ｃ ｕｌｍｏｒｕｍ）株、ＣＢＳ５１３．９４から得られたリパーゼ、およびそのＮ −末端の配列が記載されている。 しかしながら、ＷＯ９６／１３５７９号には、ホスホリパーゼ活性を示す酵素 は記載されていない。 フザリウム・ヘテロスポラム（Ｆ．ｈｅｔｅｒｏｓｐｏｒｕｍ）からのリパー ゼをコードするｃＤＮＡ配列が記載されている（Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｎｕ ｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｃＤＮＡ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ａ ｌｉｐａｓｅ ｆｒｍ Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｈｅｔｅｒｏｓｐｏｒｕｍ）「Ｊ ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．」、１１６、５３６−５４０、１９９４）。この配列は、現 在、本発明のクローン化ＤＮＡ配列に比較して最も関係するＤＮＡ配列であると 考えられる（下記の「先行技術との比較」の節を参照のこと）。しかしながら、 この参考文献にはホスホリパーゼ活性を示す酵素は記載されていない。 ペニシリウム・ノタツム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｎｏｔａｔｕｍ）からの ホスホリパーゼＢをコードするｃＤＮＡ配列は記載されている（「Ｅｕｒ．Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．」２０２：７８３−７８７、１９９１）。しかしながら、この クローン化されたＤＮＡ配列は、本発明のＤＮＡ配列に対して非常に制限された 相同性を有する（下記の「先行技術との比較」の節を参照のこと）。ホスホリパーゼの工業的用途 ホスホリパーゼの多数の使用がこの分野において知られており、これらは下記 のものを包含する：水脱ガム化された油の酵素的脱ガム化（米国特許第５，２６ ４，３６７号、Ｍｅｔａｌｌｇｅｓｅｌ の）を処理して濾過性を改良すること（ＥＰ２１９，２６９号、ＣＰＣ Ｉｎｔ ｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）；パンの弾性を改良するため のパン生地に対する添加剤として（米国特許第４，５６７，０４６号、協和発酵 ）；および特定の乳化特性を有するリゾレシチンの製造におけるホスホリパーゼ の使用。 現在、ホスホリパーゼＬｅｃｉｔａｓｅ（登録商標、Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓ ｋ Ａ／Ｓ）は、例えば、油の脱ガム化について商業的に使用されている。Ｌｅ ｃｉｔａｓｅ（登録商標）はブタ膵臓から得られた哺乳動物の酵素である。 工業的、経済的に許容される収率で、特に糸状菌から、真菌の酵素を組換え的 に製造できることはよく知られている。 結局、本発明の目的は、例えば、前述の方法において使用するための、改良さ れたホスホリパーゼを提供することである。 さらに、本発明の目的は、工業的に許容される収率で、糸状菌から得られるホ スホリパーゼを組換え的に製造するプロセスおよび方法を記載することである。 発明の要約 食用油の水脱ガム化は水を使用する抽出により実施される。その処理において 、ホスファチドの一部分はその油の中に残る。その部分は一般用語「非水和性リ ン脂質」（ＮＨＰ）により記載される。油の製造において、ＮＨＰ含量を除去す ることは必須である（米国特許第５，２６４，３６７号）。 本発明は、比較的高い量のＮＨＰを含む油中のＮＨＰ含量を除去する方法を提 供する。 したがって、第１面において、本発明は、食用油中のリン含有成分の含量を減 少する方法に関し、前記油は少なくとも５０ｐｐｍの非水和性リン含量を含み、 前記非水和性リン含量は、 ｉ） ６０℃において、水中のクエン酸一水和物を含んでなる溶 液の添加（添加された水／油＝４．８％ｗ／ｗ；水相中の［クエン酸］＝１０６ ｍＭ、水／油エマルジョン中の［クエン酸］＝４．６ｍＭ）により、食用油を３ ０分間前処理し、 ｉｉ） １０ｍｌの前処理された油中水型エマルジョンを管に移し、 ｉｉｉ） 前記エマルジョンを沸騰する水浴中で３０分間加熱し、 ｉｖ） ５０００ｒｐｍにおいて１０分間遠心し、 ｖ） 約８ｍｌの上（油）相を新しい管に移し、それを２４時間沈降させ、そ して ｖｉ） 沈降後、上方の透明な相から２ｇを抜き出して、食用油中の非水和性 リン含量を測定する、ことによって測定され、そして前記方法は、前記油を、ｐ Ｈ１．５〜８において、ホスホリパーゼＡ₁、ホスホリパーゼＡ₂、またはホスホ リパーゼＢの水溶液と接触させ、これを前記油のリン含量が１１ｐｐｍより低く 減少するまで前記油中で乳化させ、次いで水性相を処理された油から分離するこ とを含む。 他の面において、本発明は新規なクローン化されたホスホリパーゼに関する。 フザリウム・オキシスポラム（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）ＤＳＭ２６７２の中 に見出される（そしてＥＰ１３０，０６４号に記載されている）リパーゼ活性の 特質のそれ以上の研究において、単離された画分がリパーゼ活性を有するいくつ かの成分を含み、それらの１つはホスホリパーゼ活性を示した。 多数の技術的困難にかかわらず（下文参照）、本発明はフザリウム（Ｆｕｓａ ｒｉｕｍ）属、さらに詳しくはフザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）の株からホスホ リパーゼＡ活性を示す酵素をクローン化することができた。 これは糸状菌のホスホリパーゼＡがクローン化された最初であり、結局、本発 明は糸状菌のホスホリパーゼＡ酵素をコードするクローン化されたＤＮＡ配列を 提供する。 したがって、本発明の１つの面は、ＤＮＡ配列が糸状菌から得られる、ホスホ リパーゼＡ活性を有するポリペプチドをコードするクローン化されたＤＮＡ配列 に関する。 ペニシリウム・ノタツム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｎｏｔａｔｕｍ）からの ホスホリパーゼＢをコードするｃＤＮＡ配列は、「Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ ．」２０２：７８３−７８７、１９９１に記載されている。 しかしながら、このＤＮＡ配列は本発明のＤＮＡ配列（配列番号：１ ２３− １０６０）に対して非常に制限されたＤＮＡの同一性を示すだけであり、そして さらに、物理的特性、例えば、分子量は前記ペニシリウム・ノタツム（Ｐ．ｎｏ ｔａｔｕｍ）からのＰＬＢ（６６ｋＤａ）と本発明のホスホリパーゼ（２９±１ ０ｋＤａ（下文参照））との間でかなり変化する。 さらに、先行技術のヌクレオチドおよびアミノ酸配列と比較すると、本発明の ＤＮＡ配列および／または対応するコードされたアミノ酸配列が先行技術のＤＮ Ａおよび／またはアミノ酸配列に対してほんのわずかの相同性を有することが示 された（下文参照）。 結局、この出願において提供されるＤＮＡ配列の情報は、例えば、他の関係す る／相同的ホスホリパーゼをコードするＤＮＡ配列をクローン化するために、高 度に価値があると現在考えられる。なぜなら、特定のハイブリダイズプローブお よび／またはＰＣＲプライマーは現在本発明の前記ＤＮＡ配列に基づいて容易に 構築することができるからである。 さらに、この出願において提供されるＤＮＡ配列の情報に基づいて関係する／ 相同的ホスホリパーゼＡおよび／またはホスホリパーゼＢをコードするＤＮＡ配 列をクローン化することができると現在考えられる。 したがって、他の面において、本発明は、ホスホリパーゼＡおよび／またはホ スホリパーゼＢの活性を示す酵素をコードするクローン化されたＤＮＡ配列に関 し、前記ＤＮＡ配列は、 （ａ） 大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＤＳＭＩ１２９９の中 に存在するプラスミドｐＹＥＳ２．０の中にクローン化されたＤＮＡ配列のホス ホリパーゼＡをコードする部分、 （ｂ） 配列番号：１中の位置２３−１０６３、より好ましくは配列番号：１ 中の位置１１３−１０６３、なおより好ましくは配列番号：１中の位置１１３− ９２９に示されるＤＮＡ配列、またはその相補的鎖、 （ｃ） （ａ）または（ｂ）において定義された前記ＤＮＡ配列と少なくとも ７０％相同性であるＤＮＡ配列、 （ｄ） ホスホリパーゼ活性を示すポリペプチドをコードし、かつ配列番号： ２の位置３１−３４６に示されるポリペプチド配列と少なくとも７０％相同性で あり、より好ましくは配列番号：２の位置３１−３０３に示されるポリペプチド 配列と少なくとも７０％相同性である、（ａ）または（ｂ）において定義された 前記ＤＮＡ配列、 （ｅ） 配列番号：１中の位置２３−１０６３に示されるＤＮＡ配列を含んで なる二本鎖ＤＮＡプローブと低いストリンジェンシイにおいてハイブリダイズす るＤＮＡ配列、 （ｆ） 配列番号：２の１〜３４６、３１〜３０３または３１〜３０３の位置 残基のアミノ酸配列あるいは（ｅ）のＤＮＡ配列のい ずれかによりコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮ Ａ配列、および （ｇ） （ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）または（ｆ）において特定 されたＤＮＡ配列のフラグメントであるＤＮＡ配列、から成る群より選択される 。 さらに、本発明のホスホリパーゼは集中的に特性決定され、そしてそれは低い ｐＨにおいてホスホリパーゼ活性を有することが見出された；この性質により、 それは油の脱ガム化において使用するために非常に適当である。ホスホリパーゼ は膜結合されていず、これによりそれは商業的生産および精製に適する。 したがって、他の面において、本発明は、ホスホリパーゼＡ活性を有する単離 されたポリペプチドに関し、前記ポリペプチドは、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕ ｍ）属の株から得られ、そして ｉ） ４０℃において測定された、ｐＨ範囲３〜１０におけるＰＬＡ活性、 ｉｉ） ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定して、２９±１０ｋＤａの分子量、 ｉｉｉ） 範囲４．５〜８の等電点（ｐＩ）、 ｉｖ） ｐＨ５において基質としてレシチンを使用して測定された、２５〜５ ５℃の範囲のホスホリパーゼ活性のための温度最適値、および／または ｖ） ３７°Ｃにおいて基質としてレシチンを使用して測定された、６〜１２ のｐＨ範囲のホスホリパーゼ活性のためのｐＨ最適値、を有する。 本発明の単離されたホスホリパーゼの推定されたアミノ酸配列は、配列番号： ２に示されている。 成熟分泌された単離されたホスホリパーゼのＮ−末端のアミノ酸 配列が決定された。前記Ｎ−末端の配列は、配列番号：２に示すアミノ酸配列を 有する、本発明のホスホリパーゼの成熟部分が、配列番号：２中のアミノ酸Ｎｏ ．３１において開始することを示した。それ以上の詳細については本明細書中の 実施例を参照のこと（下文参照）。 さらに、配列番号：２に示すアミノ酸配列を有する、本発明の活性な分泌され たホスホリパーゼのＣ−末端のアミノ酸配列が決定された。前記Ｃ−末端の決定 されたホスホリパーゼは、糸状菌の株アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉ ｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）において組換え的に発現された。それ以上の詳細につ いては本明細書中の実施例を参照のこと。 これらの結果により、酵素はアスペルギルス・オリゼ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）か らの発現の間にＣ−末端でプロセシングされることが示され、そしてこれらの結 果は配列番号：２中のＳｅｒ３０３が発現された成熟活性酵素中のＣ−末端の残 基である可能性が最も高いことを示す。しかしながら、なおそれ以上のＣ−末端 のプロセシングが起こりうること（すなわち、前記配列のフラグメントを与える こと）、およびなお発現された成熟活性酵素を有することが予測される。 したがって、他の面において、本発明は、ホスホリパーゼＡおよび／またはＢ の活性を示す単離されたポリペプチドに関し、前記ポリペプチドは、 （ａ） 大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＤＳＭ１１２９９の中 に存在するプラスミドｐＹＥＳ２．０の中にクローン化されたＤＮＡ配列のホス ホリパーゼＡおよび／またはＢ酵素をコードする部分によりコードされるポリペ プチド、 （ｂ） 配列番号：２中の位置３１−３４６に示されるアミノ酸 配列を有するポリペプチド、 （ｃ） 配列番号：２中の位置３１−３０３に示されるアミノ酸配列を有する ポリペプチド、 （ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）において定義された前記ポリペプチドの類 似体、前記類似体は前記ポリペプチドと少なくとも７０％相同性である、および （ｅ） （ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）のフラグメント、から成る群よ り選択される。 なお他の面において、本発明は、本発明の酵素の異種組換え生産を可能とする 、組換え発現ベクターを提供する。これにより、相同的不純物を含有しないこと を特徴とする、高度に精製されたホスホリパーゼ組成物を製造することができる 。これは多数の工業的用途に対して高度に有利である。 フザリウム・クルモラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｕｌｍｏｒｕｍ）およびフザ リウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）の株の双方 から得られるホスホリパーゼが工業的に関係する用途において使用するために改 良された性質を有することを、本発明は実験的に証明する（下文参照）。フザリ ウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属の株から得られるホスホリパーゼは、工業的に関係 する用途において使用するために改良された性質を有することが予測される。 したがって、なお他の面において、本発明は、リン脂質またはリゾリン脂質を ホスホリパーゼで処理して脂肪族アシル基を加水分解することを含む方法におけ る、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属の株、例えば、フザリウム・クルモラム （Ｆ．ｃｕｌｍｏｒｕｍ）、フザリウム・ヘテロスポラム（Ｆ．ｈｅｔｅｒｏｓ ｐｏｒｕｍ）、フザリウム・ソラニ（Ｆ．ｓｏｌａｎｉ）の株、特にフザリウム ・オキシスポラム（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）の株から得られたホスホリパーゼ の使用に関する。 最後に、本発明は、糸状菌のフザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）の株から得られるホスホリパーゼをコードするＤＮＡ配 列（大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＤＳＭ１１２９９の中に存在 するプラスミドｐＹＥＳ２．０の中にクローン化されたＤＮＡ配列のホスホリパ ーゼをコードする部分）を収容する大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ）ＤＳＭ Ｎｏ．１１２９９株、あるいはホスホリパーゼをコードする能力を保 持した前記大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の突然変異体の、単離された、実質的に純粋 な生物学的培養物に関する。 先行技術との配列の相同性の比較 ヌクレオチドおよびタンパク質のデータベースに対する本発明のホスホリパー ゼとの相同性のサーチを実施した。相同性のサーチにおいて、最も密接に関係す る既知の配列はフザリウム・ヘテロスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｈｅｔｅｒｏ ｓｐｏｒｕｍ）からのリパーゼであることが示された（アミノ酸の整列は第１図 に図解されている）。 ホスホリパーゼをコードする本発明のＤＮＡ配列（配列番号：１の２３〜１０ ６０）は、フザリウム・ヘテロスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｈｅｔｅｒｏｓｐ ｏｒｕｍ）からの既知のリパーゼ配列（遺伝子バンクのデータバンクの参照Ｓ７ ７８１６）に対して、わずかに６２％の相同性を示し、そして本発明のホスホリ パーゼの対応するアミノ酸配列（配列番号：２）は、前述の既知のＤＮＡ配列に 基づいて推定されたアミノ酸配列に対して、わずかに６０％の相同性を示す（第 １図参照）。 これが示すように、本発明のホスホリパーゼのＤＮＡおよび／ま たはアミノ酸配列は事実いずれの既知のＤＮＡおよび／またはアミノ酸配列とも 異なる。 ペニシリウム・ノタツム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｎｏｔａｔｕｍ）からの ホスホリパーゼＢをコードするｃＤＮＡ配列は記載されている（「Ｅｕｒ．Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．」２０２：７８３−７８７、１９９１）。しかしながら、この ＤＮＡ配列（遺伝子バンクのデータバンクの参照Ｘ６０３４８）は、本発明のＤ ＮＡ配列（配列番号：１の２３〜１０６０）に対して、わずかに非常に制限され たＤＮＡの同一性３９％を示し、そして本発明のホスホリパーゼの対応するアミ ノ酸配列（配列番号：２）は、前述の既知のＰＬＢのＤＮＡ配列に基づいて推定 されたアミノ酸配列に対して、わずかに２０％の同一性を示す。 相同性の計算はこの明細書において後述するように実施された。 図面： 第１図：配列番号：２に示すアミノ酸と、フザリウム・ヘテロスポラム（Ｆｕ ｓａｒｉｕｍ ｈｅｔｅｒｏｓｐｏｒｕｍ）からの先行技術のリパーゼの配列と の整列。 第２図：Ｌｅｃｉｔａｓｅ（商標）と本発明によるフザリウム・オキシスポラ ム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）からのホスホリパーゼとの酵素的 脱ガム化能力の比較。 定義 本発明を詳細に論ずる前に、下記の用語を定義する。 「クローン化されたＤＮＡ配列」：用語「クローン化されたＤＮＡ配列」は、 ＤＮＡのセグメントをその自然の位置からそれが再現される異なる部位へ再配置 するために遺伝子操作において使用される標準的クローン化手順に従い、クロー ン化されたＤＮＡ配列を意味する。クローン化プロセスは、所望のＤＮＡセグメ ントの切除 および単離、ベクター分子の中へのＤＮＡ片の挿入、およびＤＮＡセグメントの 多数のコピーまたはクローンが複製される細胞の中への組換えベクターの組込み を包含する。 本発明の「クローン化されたＤＮＡ配列」は、また、「ＤＮＡ構築物」または 「ＤＮＡ配列を有するクローン化されたポリヌクレオチド」「単離されたＤＮＡ 配列」と命名することができる。 「から得られる」：本発明の目的に対して、用語「から得られる」は、特定の 微生物源に関して本明細書において使用するとき、酵素および結局、前記酵素を コードするＤＮＡ配列が、特定の源によるか、あるいは前記源からの遺伝子が挿 入された細胞により産生されることを意味する。 「単離されたポリペプチド」：本明細書において定義するとき、用語「単離さ れたポリペプチド」または「単離されたホスホリパーゼ」は、本発明のホスホリ パーゼについて使用するとき、他の非ホスホリパーゼを含有しない、例えば、Ｓ ＤＳ−ＰＡＧＥにより測定して、少なくとも２０％の純度、好ましくは少なくと も４０％の純度、より好ましくは少なくとも６０％の純度、なおより好ましくは 少なくとも８０％の純度、最も好ましくは少なくとも９０％の純度、なお最も好 ましくは少なくとも９５％の純度であるホスホリパーゼまたはホスホリパーゼの 部分である。 単離されたポリペプチドが少なくとも６０％の純度であるとき、用語「高度に 単離されたポリペプチド」を使用することができる。「単離されたポリペプチド 」は、また、「精製されたポリペプチド」と命名することができる。 「相同的不純物」：本明細書において使用するとき、用語「相同的不純物」は 、本発明の酵素が本来得られた相同的細胞から由来する、任意の不純物（例えば 、本発明の酵素以外のポリペプチド） を意味する。本発明において、相同的細胞は、例えば、フザリウム・オキシスポ ラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）の株であることができる。 「ホスホリパーゼをコードする部分」：本明細書において使用するとき、ＤＮ Ａ配列に関して使用する「ホスホリパーゼをコードする部分」は、ポリペプチド 配列に翻訳される領域に対応するＤＮＡ配列の領域を意味する。 配列番号：１に示すＤＮＡ配列において、それは第１「ＡＴＧ」開始コドン（ ｍＲＮＡにおける「ＡＵＧ」コドン）と次に続く停止コドン（「ＴＡＡ」、「Ｔ ＡＧ」または「ＴＧＡ」との間の領域である。 翻訳されたポリペプチドは、ホスホリパーゼ活性を示す成熟配列に加えて、Ｎ −末端のシグナルおよび／またはプロペプチドの配列をさらに含むことができる 。シグナル配列は一般にポリペプチドの分泌をガイドし、そしてプロペプチドは 一般にポリペプチドの折りたたみをガイドする。それ以上の情報については、下 記の文献を参照のこと：Ｅｇｎｅｌｌ、Ｐ．他、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃ ｒｏｂｉｏｌ．」６（９）：１１１５−１９（１９９２）またはＳｔｒｙｅｒ、 Ｌ．、「Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」Ｗ．Ｈ．、Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ ｍｐａｎｙ／Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＩＳＢＮ ０−７１６７−１９２０−７。 「ＤＮＡおよび／またはアミノ酸配列の修飾」：本明細書において論ずるよう にＤＮＡおよび／またはアミノ酸配列の修飾に関して使用する用語「修飾」は、 化学的修飾ならびに遺伝的操作を包含するように定義される。修飾は、問題のア ミノ酸の中の、あるいはアミノ酸における置換、欠失および／または挿入である ことができる。 「ホスホリパーゼＡ」：本発明の酵素に関して本明細書おいて使用される用語「 ホスホリパーゼＡ」は、ホスホリパーゼＡ₁および／またはホスホリパーゼＡ₂の 活性を有する酵素をカバーすることを意図する。 ホスホリパーゼＡ₁ は、ＥＣ３．１．１．３２として標準的酵素ＥＣ−分類に 従い定義される。 公式名称：ホスホリパーゼＡ₁ (ＰＬＡ₁）。 触媒される反応： ホスファチジルコリン＋Ｈ（２）Ｏ＜＞ ２−アシルグリセロホスホコリン＋脂肪酸アニオン 所見 ｅｃ３．１．１．４よりも非常に広い特異性を有する。ホスホリパーゼＡ₂ は、ＥＣ３．１．１．４として標準的酵素ＥＣ−分類に従い 定義される。 公式名称：ホスホリパーゼＡ₂（ＰＬＡ₂）。 別名：ホスファチジルコリン２−アシルヒドロラーゼ。 レシチナーゼａ；ホスファチダーゼ；またはホスファチドリパーゼ。 触媒される反応： ホスファチジルコリン＋Ｈ（２）Ｏ＜＞ １−アシルグリセロホスホコリン＋脂肪酸アニオン 所見：また、ホスファチジルエタノールアミン、コリンプラスミノゲンおよびホ スファチドに作用して、２−位に結合した脂肪酸を除去する。 「ホスホリパーゼＢ：ホスホリパーゼＢ」は、ＥＣ３．１．１．５として標準的 酵素ＥＣ−分類に従い定義される。 公式名称：リゾホスホリパーゼ。 別名：レシチナーゼｂ；リゾレシチナーゼ；ホスホリパーゼｂ；またはｐｌｂ。 触媒される反応： ２−アシルグリセロホスホコリン＋Ｈ（２）Ｏ＜＞ グリセロホスホコリン＋脂肪酸アニオン 「ホスホリパーゼ活性」：本発明の酵素に関して本明細書おいて使用される用 語「ホスホリパーゼ活性」または「ホスホリパーゼ活性を有する／を示す」は、 下記において実験的に定義する量のホスホリパーゼ活性（ＰＬＡまたはＰＬＢの 活性）を有する酵素を特定することを意図する。 したがって、ホスホリパーゼ活性を示す酵素は、本明細書中の実施例６に示す 「単層ホスホリパーゼアッセイ」（下文参照）において、酵素の投与量：６０μ ｇ、２５℃において、少なくとも０．２５ｎｍｏｌ／分；より好ましくは酵素投 与量：６０μｇ、２５℃において、少なくとも０．４０ｎｍｏｌ／分；より好ま しくは酵素投与量：６０μｇ、２５℃において、少なくとも０．７５ｎｍｏｌ／ 分；より好ましくは酵素投与量：６０μｇ、２５℃において、少なくとも１．０ ｎｍｏｌ／分；より好ましくは酵素投与量：６０μｇ、２５℃において、少なく とも１．２５ｎｍｏｌ／分；なおより好ましくは酵素投与量：６０μｇ、２５℃ において、少なくとも１．５ｎｍｏｌ／分のホスホリパーゼ活性を有する、酵素 として本発明において定義される。 このような有意なホスホリパーゼ活性を有する酵素のみは、例えば、脱ガム化 （米国特許第５，２６４，３６７号）において使用するために、工業的重要性を 有すると現在考えられる。 「ホスホリパーゼ副活性を有するリパーゼ」：したがって、用語「ホスホリパ ーゼ副活性を有するリパーゼ」は、実施例６に示す 「単層ホスホリパーゼアッセイ」におけるホスホリパーゼ副活性が前述の数値よ り小さい、ホスホリパーゼ副活性を有するリパーゼとして定義される。 多数のリパーゼは、このようなホスホリパーゼ副活性を有する。本明細書にお ける実施例６（下文参照）において、ホスホリパーゼ副活性を有するリパーゼの あるものが示されている。 「粗製油」：粗製油（また、非脱ガム化油と呼ぶ）は、例えば、ナタネ、大豆 、またはヒマワリから、プレスされたまたは抽出された油またはその混合物であ ることができる。粗製油中のホスファチド含量は、２００〜１２００ｐｐｍの範 囲、より好ましくは２５０〜１２００ｐｐｍの範囲のリン含量に対応して、０． ５〜３％ｗ／ｗの範囲内で変化することができる。ホスファチドは別として、粗 製油は、また、低濃度の炭水化物、糖化合物、およびＣａ、ＭｇおよびＦｅの金 属／ホスファチド酸錯体を含有する。 「半粗製油」：粗製油ではないが、２５０ｐｐｍ以上、より好ましくは５００ ｐｐｍ以上のホスファチド含量を有するあらゆる油。このような油は、例えば、 粗製油を後述する「水脱ガム化された油」に類似するプロセスに付すことによっ て、達成できるであろう。 「水−脱ガム化された油」：水脱ガム化された油は、典型的には、１〜３％ｗ ／ｗの熱水を温かい（６０〜９０℃）粗製油と混合することによって得られる。 通常の処理時間は３０〜６０分である。水脱ガム化工程は、水和したとき油の中 に不溶性となる、ホスファチドおよび粘質性ガムを除去する。水和したホスファ チドおよびガムは、沈降、濾過または遠心により油から分離することができる− 遠心はより一般的な実施である。 前記水−脱ガム化プロセスにおける本質的目的は、水和ホスファ チドを油から分離することである。前述の熱水の油の中への混合は、本発明にお いて、この分野における標準的水−脱ガム化プロセスに従い、水溶液を油の中に 混合することとして広く理解すべきである。 また、本明細書において「水−脱ガム化された油」と命名するプロセスは「粘 質物を除去する湿式精製」と呼ぶことができる（米国特許第５，２６４，３６７ 号参照）。 発明の詳細な説明 高い量の非水和性ホスファチド／リン脂質を含んでなる食用油の酵素的脱ガム 化法 本発明について、食用油中の非水和性リンの量は、 ｉ） ６０℃において、水中のクエン酸一水和物を含んでなる溶液の添加（添 加された水／油＝４．８％ｗ／ｗ；水相中の［クエン酸］＝１０６ｍＭ、水／油 エマルジョン中の［クエン酸］＝４．６ｍＭ）により、前記食用油を３０分間前 処理し、 ｉｉ） １０ｍｌの前処理された油中水型エマルジョンを管に移し、 ｉｉｉ） 前記エマルジョンを沸騰する水浴中で３０分間加熱し、 ｉｖ） ５０００ｒｐｍにおいて１０分間遠心し、 ｖ） 約８ｍｌの上（油）相を新しい管に移し、それを２４時間放置し（沈降 させ）、 ｖｉ） 沈降後、上方の透明な相から２ｇを抜き出して、食用油中の非水和性 リン含量（ｐｐｍ）を測定する、 ことによって測定される。 それ以上の詳細は、本明細書における実施例を参照のこと。 本明細書における実施例に例示されているように、異なる食用油のリン脂質組 成物（水和性／非水和性リン脂質）はかなり変化する。結局、異なる水−脱ガム 化された油中の残留するリン脂質のレベルは広い範囲にわたって変化する（例え ば、約３０ｐｐｍ〜２００ｐｐｍ）。 酵素的脱ガム化について、最適な酵素投与量は、上記において定義したように 、水脱ガム化またはクエン酸／水前処理後に存在する非水和性ホスファチドの量 に依存する。 さらに、油の中に存在する非水和性ホスファチドの量がより高くなるほど、酵 素的脱ガム化法はいっそう効率よくなる。 本発明は、比較的高い量のＮＨＰを含んでなる油中のＮＨＰ含量を除去する方 法を提供することである。 好ましくは、食用油は、少なくとも６０ｐｐｍの非水和性リン含量、より好ま しくは少なくとも１００ｐｐｍの非水和性リン含量、なおより好ましくは少なく とも２００ｐｐｍの非水和性リン含量を有する。 より好ましくは、食用油は、６０〜５００ｐｐｍの範囲、より好ましくは１０ ０〜５００ｐｐｍの範囲、なおより好ましくは２００〜５００ｐｐｍの範囲の非 水和性リン含量を有する。 本明細書における記載に従い、比較的高い量の非水和性リンを有するとして定 義された食用油は、水脱カム化された油、より好ましくは粗製油または半粗製油 であることができる。 したがって、本発明の態様は、前記食用油が粗製油であり、前記粗製油は、本 発明の方法を実施する前において、２５０部／１０⁶部（ｐｐｍ）より大きいリ ン含量を有する油であり、前記油は本発明の方法を実施する前において水−脱ガ ム化されていない（水脱ガム化は水を温かい粗製油の中に混合し、次いで水和し たとき油の中 に不溶性となるホスファチドを除去することを含む）ことを特徴とする、本発明 の第１の面に関する。 好ましくは、このような粗製食用油は、本発明の前記方法を実施する前におい て、３５０ｐｐｍ以上、より好ましくは４００ｐｐｍ以上、なおより好ましくは ５００ｐｐｍ以上、最も好ましくは６００ｐｐｍ以上のリン含量を有する。 さらに、前記粗製食用油は、好ましくは、本発明の前記方法を実施する前にお いて、２５０〜１５００ｐｐｍの範囲、より好ましくは３５０〜１５００ｐｐｍ の範囲、なおより好ましくは５００〜１５００ｐｐｍの範囲、最も好ましくは５ ００〜１５００ｐｐｍの範囲のリン含量を有する。 本発明による粗製食用油の酵素的脱ガム化法は、先行技術の水脱ガム化された 食用油の酵素的脱ガム化法（米国特許第５，２６４，３６７号）よりも有利であ る。なぜなら、本発明による、粗製油を処理するための直接的酵素的脱ガム化法 は、油の水脱ガム化の前の工程を節約するからである。 これは時間および金銭の双方を節約する。水−脱ガム化された油は、典型的に は、熱水を温かい（６０〜９０℃）粗製油の中に通常３０〜６０分間混合するこ とによって得られる。対照的に、本発明による粗製油を酵素的に脱ガム化する完 全なプロセスは１時間未満の時間内に実施することができ、実際の酵素的処理は 約２５分である。それ以上の詳細については、本明細書における実施例を参照の こと。 さらに、本明細書における記載に従い、比較的高い量の非水和性リンを有する として定義された食用油は半粗製油であることができる。 したがって、本発明の態様は、前記食用油が半粗製食用油であり 、前記半粗製食用油が５００部／１０⁶部（ｐｐｍ）以上のリン含量を有し、そ して前記油が本発明の方法を実施する前において水−脱ガム化されていることを 特徴とする、本発明の第１の面に関する。 好ましくは、前記半粗製食用油は、前記方法を実施する前において、６００部 ／１０⁶部（ｐｐｍ）以上、最も好ましくは７５０部／１０⁶部（ｐｐｍ）以上の リン含量を有する。 一般に、食用油の水脱ガム化は油中のリン含量を５００ｐｐｍ以下のレベルに 減少させる。 したがって、本明細書において記載する半粗製油は、例えば、本発明による食 用油中のリン含有成分のレベルを減少させる方法を実施する前に、わずかに部分 的に水−脱ガム化されていることができる。 用語「部分的に水脱ガム化された」は、油の水脱ガム化手順が標準的水−脱ガ ム化手順に比較して単なる部分的／短いプロセスであることを意味する。 「部分的水脱ガム化」プロセスは、わずかに０．５％の熱水を油の中に混合す る（標準は１〜３％の熱水である。本明細書における「定義」の節を参照のこと ）ことによるか、あるいは処理時間を１０分に減少する（標準は３０〜６０分で ある）ことによって実施することができる。 また、本明細書において定義する半粗製油は、粗製油と半粗製油との混合物で あることができる。 本発明の態様は、下記の工程を含む、本発明の第１の面のいずれかに従う方法 に関する： ｉ） 食用油の温度を２５℃〜７０℃の温度に調節し、 ｉｉ） 上記調節された温度において、０．５〜６％（前記油に 関する重量による）の少なくとも８５％の水を含んでなる水溶液の添加により、 食用油を５〜１２０分間前処理し、ここで前記前処理後に、油中の水和された粘 質物およびリン含量を除去せず、 ｉｉｉ） 前記水／油エマルジョンのｐＨをｐＨ１．５〜８に調節し（例えば 、適当な量のＮａＯＨ溶液の添加により）、 ｉｖ） 前記水／油エマルジョンをホスホリパーゼの水溶液と接触させ（工程 ｉ）に従い調節した温度（＋／−５℃）において）、このホスホリパーゼを前記 油のリン含量が１１ｐｐｍより低く減少するまで前記油中で乳化させ、 ｖ） 水性相を処理された油から分離する。 前述の工程ｉ）における食用油の温度を、この方法において使用する酵素の最 適ホスホリパーゼ活性温度である温度に調節することが好ましい。 商業的に入手可能なホスホリパーゼＬｅｃｉｔａｓｅ（商標、Ｎｏｖｏ Ｎｏ ｒｄｉｓｋ Ａ／Ｓ）について、これは約６０℃であり、そして糸状菌フザリウ ム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属から得られた本発明のホスホリパーゼについて、約４ ５℃である。この問題に関するそれ以上の詳細については、本明細書における実 施例を参照のこと。 糸状菌のホスホリパーゼの大部分は温度最適値約３５〜５０℃を有するであろ うことが予測される。 したがって、本発明の態様は、工程ｉ）における食用油の温度を３５℃〜５０ ℃に調節し、そして工程ｉｖ）において使用するホスホリパーゼが糸状菌株から 得られる、前述の方法に関する。 前述の方法の工程ｉｉ）において、食用油を好ましくは調節された温度（工程 ｉ））において、０．５〜６％（前記油に関する重量による）の少なくとも８５ ％の水を含んでなる水溶液の添加により 、食用油を５〜１２０分間前処理し、ここで前記前処理後に、油中の水和された 粘質物およびリン含量を除去しない。 この工程は食用油の酵素的脱ガム化における標準的前処理工程である（米国特 許第５，２６４，３６７号；米国特許第５，５５８，７８１号）。工程ｉｉ）の 目的は、水和したとき油の中に不溶性となる、食用油中の水和性／親水性成分（ 例えば、水和性リン含量）を水和することである。 しかしながら、この工程は本発明の関係における「食用油の水−脱ガム化」と 呼ぶものと異なる。１つの主要な差は、前記前処理工程が水和したホスファチド および粘質物を油から除去しないことである。油からの前記水和した含量の除去 は、食用油の水−脱ガム化の主要な目的である。 したがって、ホスホリパーゼを上記工程ｉｖ）において油と接触させるとき、 油は前記水和したホスファチドおよび粘質物をまだ含む。 換言すると、食用油が非水脱ガム化食用油である場合、上記方法は簡素化され た酵素的脱ガム化法であり、前記油とホスホリパーゼとの接触前に、水和したホ スファチドおよび粘質物を油から除去しない。 好ましくは、少なくとも８５％の水を含んでなる水溶液（上記工程ｉｉ）はク エン酸をさらに含む。好ましくは、前記水溶液中に１〜１５％（ｗ／ｗ）のクエ ン酸が存在し、より好ましくは前記水溶液中に３〜１１％（ｗ／ｗ）のクエン酸 が存在する。 好ましくは、工程ｉｉ）における時間は１５〜５０分、より好ましくは１５〜 ３０分である。 工程ｉｉ）における前記前処理に関するそれ以上の詳細については、本明細書 における実施例を参照のこと。 上記工程ｉｉｉ）において、水／油エマルジョンのｐＨをｐＨ１．５〜８に調 節する（例えば、適当な量のＮａＯＨ溶液の添加により）。これは、工程ｉｖ） においてホスホリパーゼを油と接触させる前に、実施して油のｐＨ値を調節する 。一般に、実際の最適ｐＨ値は工程ｉｖ）において油と接触させるために使用す る実際の酵素に依存するであろう。この問題に関するそれ以上の詳細については 、本明細書における実施例を参照のこと。 一般に、本発明の第１の面およびそれらの態様に従い、前記油とホスホリパー ゼを含んでなる水溶液との接触はｐＨ１．５〜６、より好ましくはｐＨ３〜６に おいて実施することが好ましい。 油中水型エマルジョンにおける水中のｐＨ値は、２ｍｌの水を油エマルジョン から取り、それらを２ｍｌの水と混合することによって測定される。相分離後、 生ずる上部の油層をピペットで取り、そしてｐＨを水性相中で測定する。下記式 ｐＨ（真の）＝ｐＨ（測定）−０．３８により、測定値を「真の（ｒｅａｌ）」 ｐＨ値に変換する。それ以上の詳細については、本明細書における実施例を参照 のこと。 好ましくは、本発明による食用油中のリン含有成分の量を減少させる方法にお いて、油中で乳化されるホスホリパーゼの量が０．１〜１５ｍｇの酵素（乾燥物 質）／ｋｇの油、好ましくは０．２５〜５ｍｇの酵素（乾燥物質）／ｋｇの油、 なおより好ましくは０．２５〜２．５ｍｇの酵素（乾燥物質）／ｋｇの油の範囲 である。 一般に、食用油の酵素的脱ガム化に使用するホスホリパーゼの量および時間を 最適化して、１１ｐｐｍ以下のリン含量を得ることが有利である。実際の最適な 酵素の投与量および時間は、なかでも、使用する実際のホスホリパーゼに依存す るであろう。この方法の酵素の投与量および時間の最適化に関するそれ以上の詳 細については 、本明細書における実施例を参照のこと。 好ましくは、本発明による食用油中のリン含有成分の量を減少させる方法にお いて、前記油を０．５〜６ｍｇのホスホリパーゼ（乾燥物質）／ｋｇの油と接触 させた後、油のリン含量は１１ｐｐｍより低く減少され、そしてホスホリパーゼ を前記油と１〜６時間の間接触させ、より好ましくは前記油を０．２５〜２．５ ｍｇのホスホリパーゼ（乾燥物質）／ｋｇの油と接触させた後、油のリン含量は １１ｐｐｍより低く減少され、そしてホスホリパーゼを前記油と１５分〜２時間 の間接触させる。 個々のホスホリパーゼについての最適な温度の同定に関するそれ以上の詳細に ついては、本明細書における実施例を参照のこと。 好ましくは、本発明による食用油中のリン含有成分の量を減少させる方法のす べての面および態様において、油のリン含量は５ｐｐｍより低く減少される。 油中のリン含量は、油エマルジョン中に存在する水の油相中の部／１０⁶部（ ｐｐｍ）として測定される。リン含量の分析は、「Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｍｅｔｈ ｏｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｏｉｌｓ， Ｆａｔｓ， ａｎｄ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ，第７版（１９８７）」における手順２．４２ １に従い実施される。それ以上の詳細については、本明細書における実施例を参 照のこと。 本発明の態様は、ホスホリパーゼが哺乳動物種から得られ、特にホスホリパー ゼが前記哺乳動物種の膵臓から得られ、最も好ましくはホスホリパーゼがブタの 膵臓から得られる、本発明による食用油中のリン含有成分の量を減少させる方法 に関する。 好ましくは、本発明による食用油中のリン含有成分の量を減少させる方法にお いて、ホスホリパーゼは微生物、好ましくは糸状菌、 酵母、または細菌から得られる。 好ましくは、前述の糸状菌がフザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属の範囲内の種 であるとき、好ましい株は、フザリウム・クルモラム（Ｆ．ｃｕｌｍｏｒｕｍ） 、フザリウム・ヘテロスポラム（Ｆ．ｈｅｔｅｒｏｓｐｏｒｕｍ）、フザリウム ・ソラニ（Ｆ．ｓｏｌａｎｉ）の株、特にフザリウム・オキシスポラム（Ｆ．ｏ ｘｙｓｐｏｒｕｍ）の株のような株である。 さらに、前記糸状菌がアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属の範囲内 の種であるとき、好ましい株は、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌ ｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・フェチダス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌ ｕｓ ｆｏｅｔｉｄｕｓ）、アスペルギルス・ジャポニカス（Ａｓｐｅｒｇｉｌ ｌｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌ ｕｓ ｎｉｇｅｒ）、特にアスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）の株のような株である。 さらに、本発明による食用油中のリン含有成分の量を減少させる方法において 、食用油は好ましくは大豆油、ヒマワリ実油、より好ましくはナタネ油である。 フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）から得 られるホスホリパーゼの特性決定 フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）から 得られる本発明のホスホリパーゼは、集中的に特性決定されてきている。 したがって、本発明の１つの面は、好ましくは、単離されたホスホリパーゼＡ である。このホスホリパーゼＡはフザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属の株から得 られ、４０℃において測定してｐＨ３〜１０においてホスホリパーゼＡ活性、よ り好ましくは４０℃におい て測定してｐＨ３〜７においてホスホリパーゼＡ活性、より好ましくは４０℃に おいて測定してｐＨ３．５〜６においてホスホリパーゼＡ活性、なおより好まし くは４０℃において測定してｐＨ４．５〜５．５においてホスホリパーゼＡ活性 を有する。 ホスホリパーゼＡ活性は、基質として大豆レシチンを使用して（ＮＥＦＡ試験 塩基アッセイ）、あるいは２％のレシチン、２％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、 ２０ｍＭのブリットン−ロビンソン（Ｂｒｉｔｔｏｎ−Ｒｏｂｉｎｓｏｎ）（Ｂ Ｒ）を含んでなる緩衝液中で測定される。それ以上の詳細については、本明細書 における実施例を参照のこと。 本発明の他の態様において、単離されたホスホリパーゼＡは、フザリウム（Ｆ ｕｓａｒｉｕｍ）属の株から得られ、好ましくは２９±１０ｋＤａｎｏ分子量、 より好ましくは２９±５ｋＤａの分子量、なおより好ましくは２９±３ｋＤａの 分子量、最も好ましくは２９±２ｋＤａの分子量を有するものである。 分子量は、「材料および方法」の節（下文参照）にさらに記載するように、Ｓ ＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動により測定される。 本発明の他の態様において、単離されたホスホリパーゼＡは、フザリウム（Ｆ ｕｓａｒｉｕｍ）属の株から得られ、好ましくは範囲４．５〜８の等電点（ｐＩ ）、より好ましくは範囲５〜７．５の等電点（ｐＩ）、なおより好ましくは範囲 ５．５〜７．５の等電点（ｐＩ）を有するものである。 等電点（ｐＩ）は、ファーマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）からのアンフォリン （Ａｍ−ｐｈｏｌｉｎｅ）ＰＡＧＥプレートを使用して測定した。それ以上の詳 細については、本明細書における実施例を参照のこと（下文参照）。 本発明の他の態様において、単離されたホスホリパーゼＡは、フ ザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属の株から得られ、好ましくはｐＨ５において基 質としてレシチンを使用して測定して、２５〜５５℃の範囲、より好ましくはｐ Ｈ５において基質としてレシチンを使用して測定して、３０〜５０℃の範囲、な おより好ましくはｐＨ５において基質としてレシチンを使用して測定して、４０ 〜５０℃の範囲のホスホリパーゼ活性のための温度最適値を有するものである。 ホスホリパーゼ活性のための温度最適値は、２％のレシチン、２％のＴｒｉｔ ｏｎ Ｘ−１００、２０ｍＭのブリットン−ロビンソン緩衝剤を含んでなる緩衝 液中でｐＨ５において測定された。それ以上の詳細については、本明細書におけ る実施例を参照のこと（下文参照）。 本発明の他の態様において、単離されたホスホリパーゼＡは、フザリウム（Ｆ ｕｓａｒｉｕｍ）属の株から得られ、好ましくは３７℃においてｐＨ範囲６〜１ ２、より好ましくは３７℃においてｐＨ範囲８〜１１、なおより好ましくは３７ ℃においてｐＨ範囲８．５〜１１のホスホリパーゼ活性のｐＨ最適値を有するも のである。 ホスホリパーゼ活性のｐＨ最適値は、２％のレシチン、２％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、２０ｍＭのブリットン−ロビンソン（ＢＲ）を含んでなる緩衝液中 で３７℃において測定された。それ以上の詳細については、本明細書における実 施例を参照のこと。 好ましくは、本発明のホスホリパーゼは酵素の５つ（番号ｉ）〜ｖ））の前述 の物理的特性のうちの少なくとも２つを有し、より好ましくは本発明のホスホリ パーゼは酵素の５つ（番号ｉ）〜ｖ））の前述の物理的特性のうちの少なくとも ３つを有し、なおより好ましくは本発明のホスホリパーゼは酵素の５つ（番号ｉ ）〜ｖ））の前述の物理的特性のうちの少なくとも４つを有し、最も好ましくは 本発明のホスホリパーゼは酵素の５つ（番号ｉ）〜ｖ））の前述の 物理的特性のすべてを有する。 前述したように、本発明のホスホリパーゼはクローン化、組換え的に発現され 、精製され、そして活性な分泌された酵素のＮ−末端およびＣ−末端の配列が決 定された。 したがって、本発明の他の態様は、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属の株か ら得られ、そして ｉ） ４０℃において測定された、ｐＨ範囲３〜１０におけるＰＬＡ活性、 ｉｉ） ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定して、２９±１０ｋＤａの分子量、 ｉｉｉ） 範囲４．５〜８の等電点（ｐＩ）、 ｉｖ） ｐＨ５において基質としてレシチンを使用して測定された、２５〜５ ５℃の範囲のホスホリパーゼ活性のための温度最適値、および／または ｖ） ３７℃において基質としてレシチンを使用して測定された、６〜１２の ｐＨ範囲のホスホリパーゼ活性のためのｐＨ最適値、を有し、そして、さらに （ａ） 大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＤＳＭ１１２９９の中 に存在するプラスミドｐＹＥＳ２．０の中にクローン化されたＤＮＡ配列のホス ホリパーゼＡ酵素をコードする部分によりコードされるポリペプチド、 （ｂ） 配列番号：２中の位置３１−３４６に示されるアミノ酸配列を有する ポリペプチド、 （ｃ） 配列番号：２中の位置３１−３０３に示されるアミノ酸配列を有する ポリペプチド、 （ｄ） （ａ）、（ｂ）または（ｃ）において定義された前記ポリペプチドと 少なくとも７０％相同性であるポリペプチドの類似体 、および （ｅ） （ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）のフラグメント、から成る群よ り選択されるアミノ酸配列を含んでなる、ホスホリパーゼＡ活性を有する単離さ れたポリペプチドに関する。 本発明の態様において、本発明によるホスホリパーゼ活性を有する単離された ポリペプチドは、ホスホリパーゼＡ₁活性を有するホスホリパーゼである。 他の態様において、本発明によるホスホリパーゼ活性を有する単離されたポリ ペプチドはホスホリパーゼＡ₂活性を有するホスホリパーゼであり、なお他の態 様において、本発明によるホスホリパーゼ活性を有する単離されたポリペプチド はホスホリパーゼＢ活性を有するホスホリパーゼである。 好ましくは、本発明によるホスホリパーゼ活性を有する前記単離されたポリペ プチドはホスホリパーゼＡ₁活性を有するホスホリパーゼである。 個々のＰＬＡ₁、ＰＬＡ₂および／またはＰＬＢ活性を測定する標準的技術の特 定の実施例については、本明細書における実施例を参照のこと。 他の態様において、本発明は、ホスホリパーゼがＣａ²⁺濃度に対して実質的に 独立であるホスホリパーゼである、本発明によるホスホリパーゼ活性を有する単 離されたポリペプチドに関し、前記Ｃａ²⁺濃度は、３７℃において１０分間イン キュベートし、次いで９５℃において５分間反応を停止する、２％のレシチン、 ２％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、２０ｍＭのクエン酸塩を含んでなる緩衝液、 ｐＨ５、中のレシチンからの遊離脂肪酸の解放を測定するホスホリパーゼ活性の アッセイにおいて５ｍＭのＥＤＴＡおよび５ｍＭのＣａ²⁺における相対ホスホリ パーゼ活性として測定され、ここで５ｍ ＭのＥＤＴＡ／５ｍＭのＣａ²⁺における相対ホスホリパーゼ活性の比は０．２５ より大きく、より好ましくは０．５より大きく、最も好ましくは０．８０より大 きい。 Ｃａ²⁺濃度に対する酵素活性の依存性の測定に関するそれ以上の詳細について は、本明細書における実施例を参照のこと。 いくつかのリパーゼは制限されたホスホリパーゼ活性を有する。本発明の関係 において、前記リパーゼのこのような制限されたホスホリパーゼ活性は「ホスホ リパーゼ副活性を有するリパーゼ」として定義される（本明細書における「定義 」の節参照）。本発明は、前記単離されたポリペプチドのホスホリパーゼ活性が それが工業的関連性を有するように高い、ホスホリパーゼ活性を有する単離され たポリペプチドに関する。 したがって、本発明は、下記のように単層ホスホリパーゼアッセイにおいて測 定して、６０μｇの酵素投与量、２５℃において少なくとも０．２５ｎｍｏｌ／ 分、より好ましくは６０μｇの酵素投与量、２５℃において少なくとも０．４０ ｎｍｏｌ分であるホスホリパーゼ活性を有するホスホリパーゼである、本発明に よるホスホリパーゼ活性を有する単離されたポリペプチドに関する： ａ． 緩衝溶液（１０ｍＭのＴＲＩＳ、ｐＨ８．０、２５℃)の完全に精製さ れた表面上の単層装置（ゼロ次トラフ）において、リン脂質ＤＤＰＣ（Ｄｉ Ｄ ｉｃａｎｏｙｌ（Ｃ１０）ホスファチジルコリン）の単層をクロロホルム溶液か ら広げ、 ｂ． 単層を緩和させた（クロロホルムを蒸発させた）後、ほぼ６４３Ų／ 分子のＤＤＰＣの平均分子面積に対応して、表面圧力を１５ｍＮ／ｍに調節し、 ｃ． ６０μｇの酵素を含有する緩衝溶液（前述）を単層を通して「ゼロ次ト ラフ」中の反応区画室（面積１５２０ｍｍ²および体 積３０４００ｍｍ³を有するシリンダー）の部分相の中に注入し、 ｄ． 不溶性基質分子がより水溶性の反応生成物に加水分解されるとき、一定 の表面圧力を維持するために、単層を圧縮する移動性バリヤーの速度により酵素 活性を測定し、ここで酵素により１分当たり加水分解されるＤＤＰＣ−分子の数 をＤＤＰＣの平均分子面積（ＭＭＡ）から推定する。 本発明によるホスホリパーゼ活性を有する単離されたポリペプチドについての ホスホリパーゼ活性の好ましい量のそれ以上の説明については、「定義」の節お よび実施例を参照のこと。 さらに、本発明によるホスホリパーゼの比ホスホリパーゼ活性は、既知の標準 的ホスホリパーゼ活性のアッセイにより測定することができる。 したがって、他の態様において、本発明は、ホスホリパーゼが、少なくとも７ μｍｏｌの遊離脂肪酸／分／ｍｇの酵素、より好ましくは少なくとも１５μｍｏ ｌの遊離脂肪酸／分／ｍｇの酵素、なおより好ましくは少なくとも３０μｍｏｌ の遊離脂肪酸／分／ｍｇの酵素、最も好ましくは少なくとも５０μｍｏｌの遊離 脂肪酸／分／ｍｇの酵素を解放することができるホスホリパーゼ活性を有するホ スホリパーゼである、本発明によるホスホリパーゼ活性を有する単離されたポリ ペプチドに関し、前記ホスホリパーゼ活性は、３７℃において１０分間インキュ ベートし、次いで９５℃において５分間反応を停止する、２％のレシチン、２％ のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、２０ｍＭのクエン酸塩を含んでなる緩衝液、ｐＨ ５、中のレシチンからの遊離脂肪酸の解放を測定するアッセイにおいて測定され る。 本発明のこの態様に関するそれ以上の詳細については、本明細書における実施 例を参照のこと。 本発明によるホスホリパーゼ活性を有する単離されたポリペプチドは、食用油 の酵素的脱ガム化を実施するために非常に適する。 したがって、下記の単離されたポリペプチドに関する： １． 本発明に従い、少なくとも５０ｐｐｍの非水和性リン含量を含む食用油 中のリン含有成分の量を減少するために、ホスホリパーゼは食用油の酵素的脱ガ ム化を実施することができる、本発明によるホスホリパーゼ活性を有する単離さ れたポリペプチド；および ２． 水−脱ガム化された食用油（５０〜２５０ｐｐｍのリン含量を有する） の酵素的脱ガム化を実施し、これにより前記油のリン含量を１１ｐｐｍより低く 減少することができ、ここで酵素的脱ガム化プロセスが前記油をｐＨ１．５〜８ においてホスホリパーゼの水溶液と接触させ、これを前記油のリン含量が１１ｐ ｐｍより低く減少するまで前記油中で乳化させ、次いで水性相を処理された油か ら分離することからなる、本発明によるホスホリパーゼ活性を有する単離された ポリペプチド。 好ましくは、本発明によるホスホリパーゼ活性を有する単離されたポリペプチ ドは、水脱ガム化された食用油（前述）の前記酵素的脱ガム化プロセスを１．５ 時間未満で実施することができ、そして２ｍｇ未満の少ないホスホリパーゼ（乾 燥物質）／ｋｇの油を使用する。 好ましくは、本発明のホスホリパーゼ活性を示しかつ上に示した特性を有する 単離されたポリペプチドは、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属の範囲内の糸状 菌株から得られる。 しかしながら、いかなる理論にも制限されないで、本発明のホスホリパーゼは 、また、他の微生物、好ましくは他の糸状菌株から得ることができる。それらの 例は「微生物源」の節（下文参照）に記載されている。 クローン化されたＤＮＡ配列 多数の技術的困難（「糸状菌ホスホリパーゼのクローン化のプロトコール」の 節、下文参照）にかかわらず、本発明はフザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属、さ らに詳しくはフザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒ ｕｍ）の株からＰＬＡ活性を示すホスホリパーゼをクローン化することができる 。 さらに、この出願の中に提供されている配列の情報に基づいてＤＮＡ配列をコ ードする関係するホスホリパーゼＡおよび／またはホスホリパーゼＢの両方をク ローン化することが可能であると現在考えられる。 したがって、本発明の１つの面は、ホスホリパーゼＡおよび／またはホスホリ パーゼＢの活性を示す酵素をコードするクローン化されたＤＮＡ配列に関し、こ のＤＮＡ配列は、 （ａ） 大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＤＳＭ１１２９９の中 に存在するプラスミドｐＹＥＳ２．０の中にクローン化されたポリヌクレオチド のホスホリパーゼＡをコードする部分、 （ｂ） 配列番号：１中の位置２３−１０６３、より好ましくは配列番号：１ 中の位置１１３−１０６３、なおより好ましくは配列番号：１中の位置１１３− ９２９に示すＤＮＡ配列、またはその相補的鎖、 （ｃ） （ａ）または（ｂ）において定義された前記ＤＮＡ配列と少なくとも ７０％相同性であるＤＮＡ配列、 （ｄ） ホスホリパーゼ活性を示すポリペプチドをコードし、かつ配列番号： ２の位置３１−３４６に示されたポリペプチド配列と少なくとも７０％相同性で あり、より好ましくは配列番号：２の位置３１−３０３に示すポリペプチド配列 と少なくとも７０％相同性である、（ａ）または（ｂ）において定義された前記 ＤＮＡ配列、 （ｅ） 配列番号：１中の位置２３−１０６３に示すＤＮＡ配列を含んでなる 二本鎖ＤＮＡプローブと低いストリンジェンシイにおいてハイブリダイズするＤ ＮＡ配列、 （ｆ） 配列番号：２の残基１〜３４６、３１〜３４６または３１〜３０３の アミノ酸配列あるいは（ｅ）のＤＮＡ配列のいずれかによりコードされるアミノ 酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、および （ｇ） （ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）または（ｆ）において特定 されたＤＮＡ配列のフラグメントであるＤＮＡ配列、から成る群より選択される 。 この明細書において、ＤＳＭ１１２９９の中に存在するプラスミドｐＹＥＳ２ ．０の中にクローン化されたＤＮＡ配列のホスホリパーゼをコードする部分につ いて言及するときはいつでも、このような言及は、また、配列番号：１の中に表 されているＤＮＡ配列のホスホリパーゼをコードする部分を包含することを意図 する。 したがって、用語「ＤＳＭ１１２９９の中に存在するプラスミドｐＹＥＳ２． ０の中にクローン化されたＤＮＡ配列のホスホリパーゼをコードする部分」およ び「配列番号：１の中に表されているＤＮＡ配列のホスホリパーゼをコードする 部分」を互換的に使用することができる。 ＤＮＡ配列は、ゲノム、ｃＤＮＡ、または合成由来またはそれらの任意の組合 わせであることができる。 本発明は、また、配列番号：２の成熟部分として記載されたアミノ酸配列を有 するホスホリパーゼＡおよび／またはＢの活性を示す酵素をコードし、遺伝暗号 の縮退によって配列番号：１と異なる、クローン化されたＤＮＡ配列を包含する 。 本発明の配列番号：１に示すＤＮＡ配列および／または類似体Ｄ ＮＡ配列を、ホスホリパーゼ活性を有する酵素を産生する糸状菌フザリウム・オ キシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）の株、あるいはさらに 後述する（「微生物源」の節を参照のこと）他のまたは関係する微生物からクロ ーン化することができる。 また、類似の配列は配列番号：１のホスホリパーゼをコードする部分として表 わされるＤＮＡ配列をベースとして構築することができ、例えば、それらのサブ 配列であり、および／またはＤＮＡ配列によりコードされるホスホリパーゼの他 のアミノ酸配列を生じないが、酵素の産生に意図される宿主微生物のコドンの使 用に対応するヌクレオチドの置換を導入するか、あるいは異なるアミノ酸配列（ すなわち、本発明のホスホリパーゼの変異型）を生ずることができるヌクレオチ ドの置換の導入によるか、あるいは異なるアミノ酸配列（すなわち、本発明のホ スホリパーゼの変異型）を生ずることができるヌクレオチドの置換を導入するこ とによって構築することができる。 ヌクレオチドの置換を実施するとき、アミノ酸の変化は好ましくは小さい特質 を有する、すなわち、タンパク質の折りたたみまたは活性に有意に影響を与えな い、保存的アミノ酸の置換；小さい欠失、典型的には１〜約３０アミノ酸；小さ いアミノ−またはカルボキシル−末端伸長、例えば、アミノ末端メチオニン残基 ；約２０〜２５残基までの小さいリンカーペプチド；または精製を促進する小さ い伸長、例えば、ポリ−ヒスチジントラクト；抗原性エピトープまたは結合ドメ インである。 保存的置換の例は、塩基性アミノ酸、例えば、アルギニン、リジン、ヒスチジ ン；酸性アミノ酸、例えば、グルタミン酸およびアスパラギン酸；極性アミノ酸 、例えば、グルタミンおよびアスパラギン；疎水性アミノ酸、例えば、ロイシン 、イソロイシン、バリン； 芳香族アミノ酸、例えば、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン；およ び小さいアミノ酸、例えば、グリシン、アラニン、セリン、スレオニン、メチオ ニンのグループの範囲内である。ヌクレオチドの置換の一般的説明については、 例えば、下記の文献を参照のこと：Ｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．、（１９９１）、「 Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ」 ２、９５−１０７。 当業者にとって明らかなように、このような置換は分子の機能に対して重大で ある領域の外側で実施することができ、なお活性ポリペプチドを生じさせること ができる。本発明のクローン化されたＤＮＡ配列によりコードされ、したがって 、好ましくは置換に付されないポリペプチドの活性に対して必須のアミノ酸は、 この分野において知られている手順、例えば、部位特異的突然変異誘発またはア ラニン走査突然変異誘発に従い同定することができる（例えば、Ｃｕｎｎｉｎｇ ｈａｍおよびＷｅｌｌｓ、（４９８９）、「Ｓｃｉｅｎｃｅ」２４４、１０８１ −１０８５参照）。後者の技術において、突然変異は分子中のすべての残基に導 入され、そして生ずる突然変異体分子を生物学的（すなわち、ホスホリパーゼ） 活性について試験して、分子の活性に対して重大であるアミノ酸残基を同定する 。基質−酵素の相互作用部位は、また、核磁気共鳴分析、結晶学または光アフィ ニティー標識化のような技術により決定される結晶構造により決定することがで きる（下記の文献を参照のこと：例えば、ｄｅ Ｖｏｓ他、（１９９２）、「Ｓ ｃｉｅｎｃｅ」２５５、３０６−３１２；Ｓｍｉｔｈ他、（１９９２）、「Ｊ． Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．」２２４、８９９−９０４；Ｗｌｏｄａｖｅｒ他、（１９９ ２）、「ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．」３０９、５９−６４）。 本発明のポリペプチドは、また、他のポリペプチドがポリペプチ ドのＮ−末端またはＣ−末端またはそのフラグメントに融合されている、融合ポ リペプチドまたは切断可能な融合ポリペプチドを包含する。融合ポリペプチドは 、他のポリペプチドをコードする核酸配列（またはその一部分）を本発明の核酸 配列（またはその一部分）に融合することによって製造される。融合ポリペプチ ドを製造する技術はこの分野において知られており、そしてポリペプチドをコー ドするコード配列をそれらをインフレームであるようにかつ融合ポリペプチドの 発現が１または２以上の同一プロモーターおよびターミネーターの制御下にある ように結合することを包含する。 本発明のＤＮＡ配列を、例えば、下記の文献に記載されているような、標準的 クローン化技術を使用して、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＤＳ Ｍ Ｎｏ．１１２９９株からクローン化することができる：Ｓａｍｂｒｏｏｋ他 、（１９８９）、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔ ｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒ ａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．。 本発明は本発明のホスホリパーゼをクローン化する発現クローン化技術におい て使用するために適当なスクリーニングアッセイを開発するという問題を解決し たので（題目「糸状菌ホスホリパーゼのクローン化のプロトコール」の節を参照 のこと）、本発明のＤＮＡ配列は、今回、下記の工程を包含する一般的方法によ りクローン化することができる： ・ 適当なベクターにおいて、問題のホスホリパーゼを産生することが期待さ れる微生物からのｃＤＮＡライブラリーをクローン化し、 ・ 適当な酵母宿主細胞を前記ベクターで形質転換し、 ・ ｃＤＮＡライブラリー中のクローンによりコードされる問題 の酵素を発現させるために適当な条件下に、宿主細胞を培養し、 ・ このようなクローンにより生産された酵素のホスホリパーゼ活性を測定す ることによって、陽性のクローンをスクリーニングし、そして ・ このようなクローンから酵素をコードするＤＮＡを単離する。 また、本発明は糸状菌ＰＬＡ酵素をコードするクローン化されたＤＮＡ配列を 最初に提供するので、本発明のホスホリパーゼをコードするＤＮＡは、よく知ら れている手順に従い、適当な源、例えば、「微生物源」の節に記載されている微 生物から、本明細書において開示するＤＮＡ配列をベースとして製造された合成 オリゴヌクレオチドのプローブを使用して好都合にクローン化することができる 。例えば、適当なオリゴヌクレオチドのプローブは配列番号：１に表すヌクレオ チドの置換のホスホリパーゼをコードする部分またはそれらの任意の部分列をベ ースとして、あるいはアミノ酸配列配列番号：２をベースとして製造することが できる。 さらに、本発明のクローン化されたＤＮＡ配列は本発明によるホスホリパーゼ 活性を有するポリペプチドをコードするので、本発明のホスホリパーゼ活性を有 する単離されたポリペプチドは、また、ホスホリパーゼ活性を有するポリペプチ ドをコードする本発明のクローン化されたＤＮＡ配列についての本発明の態様で ある。結局、前記ホスホリパーゼ活性を有する単離されたポリペプチドの参照お よび好ましいおよび最も好ましい態様は、また、本発明のクローン化されたＤＮ Ａ配列に関する。 したがって、本発明の態様は、前記ＤＮＡ配列によりコードされるホスホリパ ーゼがホスホリパーゼＡ₁である、本発明によるクローン化されたＤＮＡ配列に 関する。 他の態様において、本発明によるクローン化された配列は、前記ＤＮＡ配列に よりコードされるホスホリパーゼがホスホリパーゼＡ₂である、クローン化され たＤＮＡ配列であり、そしてなお他の態様において、本発明によるクローン化さ れた配列は、前記ＤＮＡ配列によりコードされるホスホリパーゼがホスホリパー ゼＢである、クローン化されたＤＮＡ配列である。 好ましくは、本発明による前記クローン化されたＤＮＡ配列は、ホスホリパー ゼＡ₁活性を有するポリペプチドをコードする。 さらに、本発明は、前記ＤＮＡ配列によりコードされるホスホリパーゼがＣａ²⁺ 濃度に対して実質的に独立である、本発明によるクローン化されたＤＮＡ配列 に関し、前記Ｃａ²⁺濃度は、 ３７℃において１０分間インキュベートし、次いで９５℃において５分間反応 を停止する、２％のレシチン、２％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、２０ｍＭのク エン酸塩を含んでなる緩衝液、ｐＨ５、中のレシチンからの遊離脂肪酸の解放を 測定するホスホリパーゼ活性のアッセイにおいて５ｍＭのＥＤＴＡおよび５ｍＭ のＣａ²⁺における相対ホスホリパーゼ活性として測定され、ここで５ｍＭのＥＤ ＴＡ／５ｍＭのＣａ²⁺における相対ホスホリパーゼ活性の比は０．２５より大き く、より好ましくは０．５より大きい。 なおさらに、本発明は、前記ＤＮＡ配列によりコードされるホスホリパーゼが 、下記のようにして単層ホスホリパーゼアッセイにおいて測定して、６０μｇの 酵素投与量、２５℃において少なくとも０．２５ｎｍｏｌ／分、より好ましくは ６０μｇの酵素投与量、２５℃において少なくとも０．４０ｎｍｏｌ／分である ホスホリパーゼ活性を有する、本発明によるクローン化されたＤＮＡ配列に関す る： ａ． 緩衝溶液（１０ｍＭのＴＲＩＳ、ｐＨ８．０、２５℃）の 完全に精製された表面上の単層装置（ゼロ次トラフ）において、リン脂質ＤＤＰ Ｃ〔ジ デカノイル（Ｄｉｃａｎｏｙｌ）（Ｃ１０）ホスファチジルコリン〕の 単層をクロロホルム溶液から広げ、 ｂ． 単層を緩和させた（クロロホルムを蒸発させた）後、ほぼ６３Ų／分 子のＤＤＰＣの平均分子面積に対応して、表面圧力を１５ｍＮ／ｍに調節し、 ｃ． ６０μｇの酵素を含有する緩衝溶液（前述）を単層を通して「ゼロ次ト ラフ」中の反応区画室（面積１５２０ｍｍ²および体積３０４００ｍｍ³を有する シリンダー）の部分相の中に注入し、 ｄ． 不溶性基質分子がより水溶性の反応生成物に加水分解されるとき、一定 の表面圧力を維持するために、単層を圧縮する移動性バリヤーの速度により酵素 活性を測定し、ここで酵素により１分当たり加水分解されるＤＤＰＣ−分子の数 をＤＤＰＣの平均分子面積（ＭＭＡ）から推定する。 他の態様において、本発明は、前記ＤＮＡ配列によりコードされるホスホリパ ーゼが、少なくとも７μｍｏｌの遊離脂肪酸／分／ｍｇの酵素、より好ましくは 少なくとも１５μｍｏｌの遊離脂肪酸／分／ｍｇの酵素を解放することができる ホスホリパーゼ活性を有するホスホリパーゼである、本発明によるクローン化さ れたＤＮＡ配列に関し、前記ホスホリパーゼ活性は、３７℃において１０分間イ ンキュベートし、次いで９５℃において５分間反応を停止する、２％のレシチン 、２％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、２０ｍＭのクエン酸塩を含んでなる緩衝液 、ｐＨ５、中のレシチンからの遊離脂肪酸の解放を測定するアッセイにおいて測 定される。 他の態様において、本発明は下記のクローン化されたＤＮＡ配列に関する： 前記ＤＮＡ配列によりコードされるホスホリパーゼが、本発明の 方法に従い食用油の酵素的脱ガム化を実施して、少なくとも５０ｐｐｍの非水和 性リン含量を含む食用油中のリン含有成分の量を減少させることができる、本発 明によるクローン化されたＤＮＡ配列；および 前記ＤＮＡ配列によりコードされるホスホリパーゼが、水−脱ガム化された食 用油（５０〜２５０ｐｐｍのリン含量を有する）の酵素的脱ガム化を実施し、こ れにより前記油のリン含量を１１ｐｐｍより低く減少させることができ、ここで 酵素的脱ガム化プロセスが前記油をｐＨ１．５〜８においてホスホリパーゼの水 溶液と接触させ、これを前記油のリン含量が１１ｐｐｍより低く減少するまで前 記油中で乳化させ、次いで水性相を処理された油から分離することからなる、本 発明によるクローン化されたＤＮＡ配列。 好ましくは、本発明によるクローン化されたＤＮＡ配列は、前記ＤＮＡ配列に よりコードされるホスホリパーゼが、２ｍｇより少ないホスホリパーゼ（乾燥物 質）／ｋｇの油を使用することによって水−脱ガム化された食用油の前記酵素的 脱ガム化を実施することができ、そして前記ホスホリパーゼを前記油と１５分〜 ２時間の間接触させる、クローン化されたＤＮＡ配列である。 糸状菌ホスホリパーゼをクローン化するプロトコール 本発明のホスホリパーゼを単離するか、あるいはそれをコードするポリヌクレ オチドをクローン化しようと試みるとき、多数の困難に直面した。酵素を単離す ることは不可能であるように思われ、そしてポリヌクレオチドをクローン化する という問題が追求された。 本明細書において記載するように、糸状菌ホスホリパーゼＡをコードする先行 技術のＤＮＡ配列は入手可能ではなかった。結局、本発明は、酵母技術において 発現クローン化に基づくクローン化戦略を開発した（Ｈ．Ｄａｌｂｏｅｇｅ他、 「Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎ ｅｔ．」（１９９４）２４３：２５３−２６０；ＷＯ９３／１１２４９号；およ びＷＯ９４／１４９５３号）。 この技術に直面した主要な問題は、酵母がプレートアッセイに対してホスホリ パーゼのバックグラウンドを生ずる内部活性を産生することであった。このバッ クグラウンドはアッセイプレート中の基質の量に対して高度に依存性であること が見出され、したがって、バックグラウンドが発現クローン化スクリーニング手 法の間においてアッセイが信頼性であるために十分に低いけれども、反応が起こ るのに十分に高いレベルに、基質の量を注意して滴定しなくてはならなかった。 さらに、糸状菌株は一般に多数の異なるリパーゼを含み、それらのいくつかは 制限されたホスホリパーゼ活性を示す。このようなリパーゼは本明細書において 「ホスホリパーゼ副活性を有するリパーゼ」として定義される（本明細書におけ る「定義」の節を参照のこと）。 プレートアッセイにおいて、このようなホスホリパーゼ副活性を有するリパー ゼのバックグラウンドは、また、アッセイプレートにおける基質の量に対して高 度に依存性であることが見出され、したがって、酵母細胞および糸状菌の双方の ホスホリパーゼ副活性を有するリパーゼからバックグラウンドの活性を排除する ように、基質の量をいっそう注意して滴定しなくてはならなかった。 最初に、基質を注意して選択しなくてはならないことが見出された。なぜなら 、ホスホリパーゼ活性をもたないリパーゼは、基質に対して反応することができ たので、試験した多数のホスホリパーゼ基質はバックグラウンドの活性を与えた からである。したがって、極めて多い数の基質を試験し、滴定して、適当な基質 を同定しなくてはならなかった。 ホスホリパーゼをコードするポリヌクレオチドの発現クローン化の実施を可能 とすることが見出されたた解決法は、注意してモニターした濃度でリポイド（Ｌ ｉｐｏｉｄ）Ｅ８０（Ｌｉｐｏｉｄ ＧｍｂＨから）を使用することであった。 本明細書における材料および方法の節において、前述の問題を解決するプレート アッセイを含む、酵母のプロトコールにおける完全な発現クローン化の詳細な説 明が開示されている。ＤＮＡ配列の相同性／同一性 前述のＤＮＡ配列の相同性／同一性は、第１配列から第２配列への偏りを示す ２つの配列の間の同一性の程度として決定される。相同性は、この分野において 知られているコンピュータープログラム、例えば、ＧＣＧプログラムパッケージ で提供されるＧＡＰにより適当に決定することができる（Ｐｒｏｇｒａｍ Ｍａ ｎｕａｌ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｖｅｒｓｉ ｏｎ ８、Ａｕｇｓｔ １９９４、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒ ｏｕｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎ ｓｉｎ，ＵＳＡ ５３７１１）（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ、Ｓ．Ｂ．およびＷｕｎｃ ｓｈ、Ｃ．Ｄ．、（１９７０）、「Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、４８、４４３−４５３）。ＤＮＡ配列の比較のための下記 の設定を有するＧＡＰを使用する：５．０のＧＡＰクリエーション・ペナルティ ーおよび０．３のＧＡＰ発現ペナルティー、ＤＮＡ配列コーディング領域は、配 列番号：１に示すＤＮＡ配列のホスホリパーゼをコードする部分（すなわち、配 列番号：１中の位置２３−１０６３）と；より好ましくは配列番号：１中の位置 １１３−１０６３に示すＤＮＡ配列（成熟酵素のＮ−末端の残基に対応する位置 １１３）と；なおより好ましくは配列番号：１中の位置２３−９２９に示すＤＮ Ａ配列（Ｃ−末端のプロセシング、分泌された活性酵 素中のＣ−末端の残基に対応する位置９２９）と、少なくとも７０％、好ましく は少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なく とも９５％、より好ましくは少なくとも９７％の同一性の程度を示す。 ハイブリダイズ 前述のハイブリダイズは類似のＤＮＡ配列を含むことを意図し、前記類似のＤ ＮＡ配列は、配列番号：１に示すＤＮＡ配列のホスホリパーゼをコードする部分 、すなわち、ヌクレオチド２３−１０６３に対応する二本鎖ＤＮＡプローブと、 より好ましくは配列番号：１中の位置１１３−１０６３に示すＤＮＡ配列（成熟 酵素のＮ−末端の残基に対応する位置１１３）に対応する二本鎖ＤＮＡプローブ と、なおより好ましくは配列番号：１中の位置２３−９２９に示すＤＮＡ配列（ Ｃ−末端のプロセシング、分泌された活性酵素中のＣ−末端の残基に対応する位 置９２９）に対応する二本鎖ＤＮＡプローブと、下記において詳細に説明するよ うに、少なくとも低いストリンジェンシイの条件下に、ハイブリダイズする。 ヌクレオチドのプローブと、相同性ＤＮＡまたはＲＮＡとの間の、低い、中程 度、または高いストリンジェンシイにおけるハイブリダイズを決定するために適 当な実験的条件は、ＤＮＡフラグメントまたはＲＮＡを含有するフィルターを前 ソーキングして５×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム、Ｓａｍｂｒ ｏｏｋ他、１９８９）中で１０分間ハイブリダイズし、５×ＳＳＣ、５×デンハ ルト溶液（Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、１９８９）、０．５％のＳＤＳおよび１００μ ｇ／ｍｌの変性超音波処理したサケ精子ＤＮＡ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、１９８９ ）の溶液中でフィルターをプレハイブリダイズし、次いで１０ｎｇ／ｍｌのラン ダム−プライムド（Ｆｅｉｎｂｅｒｇ、Ａ．Ｐ．およびＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎ、 Ｂ．（１９８ ３）「Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．」１３２：６−１３）、³²Ｐ−ｄＣＴＰ−標 識化（比活性＞１×１０⁹ｃｐｍ／μｇ）プローブを含有する同一溶液中で約４ ５℃において１２時間ハイブリダイズすることを包含する。次いで、フィルター を２×ＳＳＣ、０．５％のＳＤＳ中で３０分間、少なくとも５５℃（低いストリ ンジェンシイ）、より好ましくは少なくとも６０℃（中程度のストリンジェンシ イ）、なおより好ましくは少なくとも６５℃（中程度／高いストリンジェンシイ ）、なおより好ましくは少なくとも７０℃（高いストリンジェンシイ）、なおよ り好ましくは少なくとも７５℃（非常に高いストリンジェンシイ）の温度におい て２回洗浄する。 これらの条件下にオリゴヌクレオチドのプローブがハイブリダイズする分子は 、Ｘ線フィルムを使用して検出される。 ２つの所定のＤＮＡ配列がある種の特定した条件下にハイブリダイズするか否 かを理論的に予測できることが見出された。 したがって、前述の実験的方法に対する別法として、類似のＤＮＡ配列が前述 のヌクレオチドのプローブにハイブリダイズするか否かの決定は、既知の配列を 有する２つの異種ＤＮＡ配列が特定した条件下に（例えば、カチオン濃度および 温度に関して）ハイブリダイズするＴｍ（溶融温度）の理論的計算に基づくこと ができる。 異種ＤＮＡ配列のための溶融温度（Ｔｍ（ヘテロ））を決定するために、相同 ＤＮＡ配列のための溶融温度（Ｔｍ（ホモ））を最初に決定することが必要であ る。 ２つの完全に相補的なＤＮＡ鎖（ホモ二本鎖の形成）の間の溶融温度（Ｔｍ（ ホモ））を、下記の式を使用して決定することができる： Ｔｍ（ホモ）＝８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇＭ）＋０．４１（ＧＣ％）−０． ６１（ｆｏｒｍ％）−５００／Ｌ（「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈ ｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、１９９５）、ここで、 「Ｍ」は、洗浄緩衝液中のカチオンのモル濃度である。 「ＧＣ％」は、ＤＮＡ配列中の塩基の合計数のグアニン（Ｇ）およびシトシン （Ｃ）の％である。 「ｆｏｒｍ％」は、洗浄緩衝液中のホルムアミドの％である。 「Ｌ」は、ＤＮＡ配列の長さである。 この式および前述の実験の洗浄条件を使用して、配列番号：１に示すＤＮＡ配 列、すなわち、ヌクレオチド２３−１０６０に対応するヌクレオチドのプローブ のホモ二本鎖の形成のためのＴｍ（ホモ）は、下記の通りである： Ｔｍ（ホモ）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ０．３０）＋０．４１（５６）−０ ．６１（０）−（５００／１０３８） Ｔｍ（ホモ）＝１０３．５℃。 「Ｍ」：２×ＳＳＣは０．３Ｍのカチオン濃度に相当する。 「ＧＣ％」：配列番号：１の位置２３−１０６０中のＧＣ％は５６％である。 「ｆｏｒｍ％」：洗浄緩衝液の中にホルムアミドは存在しない。 「Ｌ」：配列番号：１の長さ配列番号：１位置２３−１０６３１０３８ｂｐ。 上記の式により決定されたＴｍは、２つの完全に相補的なＤＮＡ配列の間のホ モ二本鎖の形成のＴｍ（Ｔｍ（ホモ））である。Ｔｍ値を２つの異種ＤＮＡ配列 のＴｍに適合させるために、２つの異種配列の間のヌクレオチド配列の１％の差 はＴｍの１℃の減少に等しいと仮定する（「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａ ｎｄ Ｓｏｎｓ、１９９５）。したがって、異種二本鎖の形成についてのＴｍ（ ヘテロ）は、問題の類似の配列と前述のヌクレオチドのプローブとの間の相同性 ％の差をＴｍ（ホモ）から減ずることによって見出される。減ずべきＤＮＡの相 同性の百分率は、本明細書において記載するように計算される（下文参照）。 アミノ酸配列に対する相同性 前述のポリペプチドの相同性は、第１配列の第２配列からの偏りを示す、２つ の配列の同一性の程度として決定される。相同性は、この分野において知られて いるコンピュータープログラム、例えば、ＧＣＧプログラムパッケージで提供さ れるＧＡＰにより適当に決定することができる（Ｐｒｏｇｒａｍ Ｍａｎｕａｌ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｖｅｒｓｉｏｎ ８ 、Ａｕｇｓｔ １９９４、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、 ５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ， ＵＳＡ ５３７１１）（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ、Ｓ．Ｂ．およびＷｕｎｃｓｈ、Ｃ ．Ｄ．、（１９７０）、「Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏ ｌｏｇｙ」、４８、４４３−４５３）。ＤＮＡ配列の比較のための下記の設定を 有するＧＡＰを使用する：３．０のＧＡＰクリエーション・ペナルティーおよび ０．１のＧＡＰ発現ペナルティー、類似のＤＮＡ配列によりコードされるポリペ プチドの成熟部分は、配列番号：２に示すアミノ酸配列の成熟部分、すなわち、 配列番号：２中の位置３１−３４６と、より好ましくは配列番号：２の位置３１ −３０３に示すアミノ酸配列（位置３０３はＣ−末端のプロセシング、分泌され た活性酵素中のＣ−末端の残基である）と、好ましくは少なくとも７０％、より 好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましく は少なくとも９５％、特に少なくとも９ ７％の同一性の程度を示す。 本発明は、また、配列番号：２に記載するアミノ酸配列の成熟部分と３以下の アミノ酸、好ましくは２以下のアミノ酸、より好ましくは１以下のアミノ酸だけ 異なるアミノ酸配列を有するホスホリパーゼの変異型に関する。 さらに、前述の好ましいアミノ酸の同一性は、また、ホスホリパーゼ活性を示 し、かつ配列番号：２の位置３１−３４６に示すポリペプチド配列と少なくとも ７０％の相同性、より好ましくは配列番号：２の位置３１−３０３を構成するポ リペプチド配列と少なくとも７０％の相同性を有するポリペプチドをコードする 、本発明のクローン化されたＤＮＡ配列に関する。 免疫学的交差反応性 免疫学的交差反応性を決定するとき使用すべき抗体は、精製されたホスホリパ ーゼを使用して製造することができる。さらに詳しくは、下記の文献に記載され ている手順に従い、ウサギ（または他の齧歯類）を免疫化することによって、本 発明のホスホリパーゼに対して抗血清を発生させることができる：Ｎ．Ａｘｅｌ ｓｅｎ他、「Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｉｍｍｎｕ ｎｏｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ」、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉ ｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、１９７３、Ｃｈａｐｔｅｒ ２３、または Ａ．ＪｏｈｎｓｔｏｎｅおよびＲ．Ｔｈｏｒｐｅ、「Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓ ｔｒｙ ｉｎ Ｐｒａｃｔｉｃｅ」、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉ ｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、１９８２（さらに詳しくは、ｐ．２７−３１） 。得られた抗血清から、例えば、塩沈降（（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄）、引き続く透析お よびイオン交換クロマトグラフィー、例えば、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘのイ オン交換クロマトグラフィーにより、 精製された免疫グロブリンを単離することができる。タンパク質の免疫化学的特 性決定は、アウトシェルロニイ（Ｏｕｔｃｈｅｒｌｏｎｙ）二重拡散分析（Ｏ． Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ、「Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａ ｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ、編）、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、１９６７、ｐｐ．６５５− ７０６）、交差免疫電気泳動（Ｎ．Ａｘｅｌｓｅｎ他、前記、Ｃｈａｐｔｅｒ ３および４）、またはロケット免疫電気泳動（Ｎ．Ａｘｅｌｓｅｎ他、Ｃｈａｐ ｔｅｒ ２）により、実施することができる。 微生物源 本発明の優先権主張日において、下記において適用した分類学は、ワールド・ ワイド・ウェブ（ＷＷＷ）ＮＣＢＩ分類学ブラウサー（ｂｒｏｗｓｅｒ）に従う 。 本発明のホスホリパーゼ活性を有する単離されたポリペプチドおよび対応する クローン化されたＤＮＡ配列は、任意の微生物、好ましくは糸状菌、酵母細胞、 または細菌から得ることができる。 好ましくは、本発明のホスホリパーゼおよび対応するクローン化されたＤＮＡ 配列は糸状菌株から得ることができ、ここで好ましい門は子嚢菌門（Ａｓｃｏｍ ｙｃｏｔａ）であり、ここで好ましい網は好ましいアカツグダケ科（Ｎｅｃｔｒ ｉａｃｅａｅ）を含む核菌網（Ｐｙｒｅｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）である。 より好ましくは、本発明のホスホリパーゼおよび対応するクローン化されたＤ ＮＡ配列は、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属の株、例えば、フザリウム・ク ルモラム（Ｆ．ｃｕｌｍｏｒｕｍ）、フザリウム・ヘテロスポラム（Ｆ．ｈｅｔ ｅｒｏｓｐｏｒｕｍ）、またはフザリウム・ソラニ（Ｆ．ｓｏｌａｎｉ）の株、 特にフザリウ ム・オキシスポラム（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）の株から得ることができる。 さらに、本発明のホスホリパーゼおよび対応するクローン化されたＤＮＡ配列 は、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属の範囲内の株、例えば、アス ペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ）、アスペル ギルス・フェチダス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｏｅｔｉｄｕｓ）、アスペル ギルス・ジャポニカス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、アス ペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、特にアスペルギ ルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）の株から得ることがで きる。 本発明のホスホリパーゼを得ることができるフザリウム・オキシスポラム（Ｆ ｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）の株の単離物は、特許手続きの目的のた めの微生物の寄託の国際的承認についてのブダベスト条約の規定に従いドイツ国 の微生物株保存機関（Ｄｅｕｔｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏ ｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ．、Ｍａ ｓｃｈｅｒｏｄｅｒ Ｗｅｇ １ｂ、Ｄ−３８１２４ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉ ｇ、ドイツ国（ＤＳＭ））に寄託された。 寄託日 ：１９８３年６月６日 寄託番号 ：ＮＮ０１４７５９ ＤＳＭ Ｎｏ． ：フザリウム・オキシスポラム（Ｆ．ｏｘｙｓ Ｐｏｒｕｍ） ＤＳＭ Ｎｏ．２６７２ さらに、本発明のホスホリパーゼをコードする全長のｃＤＮＡ配列からなる発 現プラスミドｐＹＥＳ２．０は大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）の 株の中に形質転換され、特許手続きの目 的のための微生物の寄託の国際的承認についてのブダベスト条約の規定に従いド イツ国の微生物株保存機関（Ｄｅｕｔｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉ ｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ、 Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ Ｗｅｇ １ｂ、Ｄ−３８１２４ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗ ｅｉｇ、ドイツ国（ＤＳＭ））に寄託された。 寄託日 ：１９９６年１１月２５日 寄託番号 ：ＮＮ０４９２７９ ＤＳＭ Ｎｏ． ：大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ） ＤＳＭ Ｎｏ． １１２９９ 発現ベクター 本発明の発現ベクターは組換えＤＮＡ手順に好都合に付される任意の発現ベク ターであることができ、ベクターの選択はベクターを導入すべき宿主細胞にしば しば依存する。したがって、ベクターは自律的に複製するベクター、すなわち、 染色体外の実在物として存在するベクターであることができ、その複製は染色体 の複製、例えば、プラスミドに対して独立である。また、ベクターは、宿主細胞 の中に導入されたとき、宿主細胞の遺伝子操作の中に組込まれ、それが組込まれ た染色体と一緒に複製されるものであることができる。 発現ベクターにおいて、ホスホリパーゼをコードするＤＮＡ配列は適当なプロ モーターおよびターミネーターの配列に作用可能に接続されているべきである。 プロモーターは選択した宿主細胞においてホスホリパーゼ活性を示す任意のＤＮ Ａ配列であることができ、そして宿主細胞に対して相同または異種であるタンパ ク質をコードする遺伝子から誘導することができる。ホスホリパーゼをコードす るＤＮＡ配列、プロモーターおよびターミネーターを結合し、そしてそれらを適 当なベクターの中に挿入する手順は当業者によく知られている（例えば、Ｓａｍ ｂｒｏｏｋ他、（１９８９）、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌ ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ 、ＮＹ、を参照のこと）。 糸状菌の宿主細胞において使用するために適当なプロモーターの例は、例えば 、ＡＤＨ３プロモーター（ＭｃＫｎｉｇｈｔ他、「Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊ．」、 ４（１９８５）、２０９３−２０９９）またはｔｐｉＡプロモーターである。他 の有用なプロモーターの例は、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕ ｓ ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼ、リゾムコル・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍ ｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）アスパラギン酸プロテイナーゼ、アスペルギルス・ニ ガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）中性α−アミラーゼ、アスペルギ ルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）酸安定性α−アミラーゼ 、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）またはアス ペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ）グルコアミ ラーゼ（ｇｌｕＡ）、リゾムコル・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈ ｅｉ）リパーゼ、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚ ａｅ）アルカリ性ホスファターゼ、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌ ｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）トリオースホスフェートイソメラーゼまたはアスペルギ ルス・ニヅランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）アセトアミダ ーゼをコードする遺伝子に由来する。 宿主細胞 本発明は、また、本発明の核酸配列を含む組換え宿主細胞に関し 、前記細胞はホスホリパーゼの組換え生産において好都合に使用ことができる。 用語「宿主細胞」は、複製の間に起こる突然変異のために親細胞と同一ではない 親細胞の子孫を包含する。 細胞は好ましくは本発明の核酸配列を含んでなるベクターで形質転換され、次 いでベクターは宿主染色体の中に挿入される。 「形質転換」は、ベクターが染色体の組込み体として、または自己複製する染 色外ベクターとして維持されるように、本発明の核酸配列を含んでなるベクター を宿主細胞の中に導入することを意味する。核酸配列は細胞において安定に維持 された可能性が高いので、組込みは一般に有利であると考えられる。宿主染色体 の中へのベクターの組込みは、前述したように相同的または非相同的組換えによ り起こることがある。 好ましい態様において、宿主細胞は真菌細胞である。「真菌」は、本明細書に おいて使用するとき、子嚢菌門（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）、担子菌門（Ｂａｓｉ ｄｉｏｍｙｃｏｔａ）、ツボカビ門（Ｃｈｙｔｒｉｄｏｍｙｃｏｔａ）、および 接合菌門（Ｚｙｇｏｍｙｃｏｔａ）（Ｈａｗｋｓｗｏｒｔｈ他、「Ｉｎ、Ａｉｎ ｓｗｏｒｔｈ ａｎｄ Ｂｉｓｂｙ’ｓ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｔｈｅ Ｆｕｎｇｉ」、第８版、１９９５、ＣＡＢ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｕ ｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、英国ケンブリッジ、において定義されている ）ならびに卵菌門（Ｏｏｍｙｃｏｔａ）（Ｈａｗｋｓｗｏｒｔｈ他、１９９５、 上記、ｐ．１７１、に記載されている）およびすべての有糸分裂性真菌（Ｈａｗ ｋｓｗｏｒｔｈ他、１９９５、上記）を包含する。子嚢菌門（Ａｓｃｏｍｙｃｏ ｔａ）の代表的なグループは、例えば、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ）、エウペニシリウム（Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）（＝Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉ ｕｍ）、エメリセラ（Ｅｍｅｒｉｃｅｌ ｌａ）（＝Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、ユーロチウム（Ｅｕｒｏｔｉｕｍ）（＝ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、および前述の真の酵母を包含する。担子菌門（Ｂａ ｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）の例は、キノコ菌、銹病菌、およびクロボ病菌を包含 する。ツボカビ門（Ｃｈｔｒｉｄｏｍｙｃｏｔａ）の代表的なグループは、例え ば、アロミセス（Ａｌｌｏｍｙｃｅｓ）、ブラストクラヂエラ（Ｂｌａｓｔｏｃ ｌａｄｉｅｌｌａ）、セロモミセス（Ｃｏｅｌｏｍｏｍｙｃｅｓ）、および水生 菌類を包含する。卵菌門（Ｏｏｍｙｃｏｔａ）の代表的なグループは、例えば、 サプロレグニオミセタス（ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉｏｍｙｃｅｔｏｕｓ）水生菌類 （水かび）、例えば、アキリア（Ａｃｈｌｙａ）を包含する。栄養胞子性真菌の 例は、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃ ｉｌｌｉｕｍ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、およびアルテルナリア（Ａｌｔ ｅｒｎａｒｉａ）を包含する。接合菌門（Ｚｙｇｏｍｙｃｏｔａ）の代表的なグ ループは、例えば、リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）およびムコル（Ｍｕｃｏｒ） を包含する。 好ましい態様において、真菌の宿主細胞は糸状菌の細胞である。「糸状菌」は 、再分割真菌門（Ｅｕｍｙｃｏｔａ）および卵菌門（Ｏｏｍｙｃｏｔａ）のすべ ての糸状形態を包含する（Ｈａｗｋｓｗｏｒｔｈ他、１９９５、上記、により定 義されている）。糸状菌は、キチン、セルロース、グルカン、キトサン、マンナ ン、および他の複雑な多糖類から構成された栄養菌糸により特徴づけられる。栄 養増殖は菌糸の伸長により、そして炭素の異化は偏性好気性である。対照的に、 酵母、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃ ｅｒｅｖｉｓｉａｅ）による栄養増殖は単細胞の葉状体の発芽により、そして炭 素の異化は発酵性である。より好ましい態様において、糸状菌の宿主細胞は下記 の種の細胞で あるが、これらに限定されない：アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、ア スペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、 フミコラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、ムコル（Ｍｕｃｏｒ）、ミセリオフトラ（Ｍｙ ｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ペニ シリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、チエラビア（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、ト リポクラジウム（Ｔｏｌｙｐｏｃａｄｉｕｍ）、およびトリコデルマ（Ｔｒｉｃ ｈｏｄｅｒｍａ）またはそれらのテレオモルフまたはシノニム。なおいっそう好 ましい態様において、糸状菌の宿主細胞はアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌ ｕｓ）の細胞である。他のなおいっそう好ましい態様において、糸状菌の宿主細 胞はアクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）の細胞である。他のなおいっそう 好ましい態様において、糸状菌の宿主細胞はフザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）の 細胞である。他のなおいっそう好ましい態様において、糸状菌の宿主細胞はフミ コラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）の細胞である。他のなおいっそう好ましい態様におい て、糸状菌の宿主細胞はムコル（Ｍｕｃｏｒ）の細胞である。他のなおいっそう 好ましい態様において、糸状菌の宿主細胞はミセリオフトラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐ ｈｔｈｏｒａ）の細胞である。他のなおいっそう好ましい態様において、糸状菌 の宿主細胞はニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）の細胞である。他のなお いっそう好ましい態様において、糸状菌の宿主細胞はペニシリウム（Ｐｅｎｉｃ ｉｌｌｉｕｍ）の細胞である。他のなおいっそう好ましい態様において、糸状菌 の宿主細胞はチエラビア（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）の細胞である。他のなおいっそ う好ましい態様において、糸状菌の宿主細胞はトリポクラジウム（Ｔｏｌｙｐｏ ｃａｄｉｕｍ）の細胞である。他のなおいっそう好ましい態様において、糸状菌 の宿主細胞はトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈ ｏｄｅｒｍａ）の細胞である。最も好ましい態様において、糸状菌の宿主細胞は 、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ）、ア スペルギルス・フェチダス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｏｅｔｉｄｕｓ）、ア スペルギルス・ジャポニカス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ） 、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）またはアス ペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａe)の細胞である。他 の最も好ましい態様において、糸状菌の宿主細胞はディスカラー（Ｄｉｓｃｏｌ ｏｒ）セクションのフザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）細胞である（フザリウム（ Ｆｕｓａｒｉｕｍ）のセクションとしても知られている）。他の好ましい態様に おいて、糸状菌の宿主細胞はエレガンス（Ｅｌｅｇａｎｓ）のセクションのフザ リウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）株、例えば、フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓ ａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）である。他の最も好ましい態様において、糸 状菌の宿主細胞はフミコラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎ ｓ）またはサーモミセス・ラヌギノスス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ lａｎｕｇ ｉｎｏｓｕｓ）の細胞である。他の最も好ましい態様において、糸状菌の宿主細 胞はリゾムコル・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）の細胞であ る。他の最も好ましい態様において、糸状菌の宿主細胞はミセリオフトラ・サー モフィルム（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ）の細 胞である。他の最も好ましい態様において、糸状菌の宿主細胞はニューロスポラ ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）の細胞である。他の最も好 ましい態様において、糸状菌の宿主細胞はニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒ ｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）の細胞である。他の最も好ましい態様において、 糸状菌の宿主細胞はペニシリウム・ プルプロゲヌム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｐｕｒｐｕｒｏｇｅｎｕｍ）の細胞 である。他の最も好ましい態様において、糸状菌の宿主細胞はチエラビア・テレ ストリス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）の細胞である。他の最 も好ましい態様において、トリコデルマの細胞はトリコデルマ・ハルジアナム（ Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、トリコデルマ・コニンギイ（ Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｋｏｎｉｎｇｉｉ）、トリコデルマ・ロンギブラキア ツム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）、トリコデ ルマ・リーシエ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｉｅ）またはトリコデルマ ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅ）の細胞である。 真菌の細胞は、それ自体知られている方法におけるプロトプラストの形成、プ ロトプラストの形質転換、および細胞壁の再生を包含するプロセスにより形質転 換することができる。アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）宿主細胞の形 質転換に適当な手順は、ＥＰ２３８，０２３号およびＹｅｌｔｏｎ他、１９８４ 、「Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｄｅｍ ｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＵＳＡ」８１：１４７０−１４７４に記載されて いる。フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）種を形質転換する適当な方法は、Ｍａｌ ａｒｄｉｅｒ他、１９８９、「Ｇｅｎｅ」７８：１４７−１５６または同時継続 米国出願第０８／２６９，４４９号に記載されている。酵母は下記の文献に記載 されている手順を使用して形質転換することができる：ＢｅｃｋｅｒおよびＧｕ ａｒｅｎｔｅ、Ｉｎ Ａｂｅｌｓｏｎ、Ｊ．Ｎ．およびＳｉｍｏｎ、Ｍ．Ｉ．、 編、「Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃ ｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」、 Ｖｏｌ．１９４、ｐｐ．１ ８２−１８７、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ； Ｉｔｏ他、１９８３、「Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ」１ ５３：１６３；およびＨｉｎｎｅｎ他、１９７８、「Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ ｏ ｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＵＳＡ」７５：１９２０。哺乳動物細胞は、ＧｒａｈａｍおよびＶａｎ ｄｅｒ Ｅｂ（１９７８、「Ｖｉｒｏｌｏｇｙ」５２：５４６）のリン酸カルシウム沈 澱法による直接的吸収により形質転換することができる。 ホスホリパーゼを生産する方法 本発明は、酵素の産生を可能とする条件下に、酵素をコードするＤＮＡ配列で 形質転換された適当な宿主細胞を培養し、そして生ずる酵素を培養物から回収す る、本発明による単離された酵素を製造する方法を提供する。 酵素をコードするＤＮＡ配列を含んでなる発現ベクターを異種宿主細胞の中に 形質転換するとき、本発明の酵素の異種組換え製造を可能とすることができる。 これにより、相同的不純物を含有しないことを特徴とする、高度に精製された ホスホリパーゼ組成物を得ることができる。 本発明において、相同宿主細胞はフザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉ ｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）の株であることができる。 形質転換された宿主細胞を培養するために使用する培地は、問題の宿主細胞の 成長に適当な任意の慣用の培地であることができる。発現されたホスホリパーゼ は好都合に培地の中に分泌され、そしてよく知られた手順により培地から回収す ることができ、例えば、遠心または濾過により培地から細胞を分離し、硫酸アン モニウムのよ うな塩により培地からタンパク質成分を沈降させ、次いでクロマトグラフィー手 順、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィ ー、またはその他により培地から回収することができる。 ホスホリパーゼの使用 高い量の非水和性リンを含む食用油を酵素的脱ガム化する本発明の新規な方法 におけるホスホリパーゼの使用の外に、ホスホリパーゼの多数の他の使用がこの 分野において知られている。 ホスホリパーゼのこのようなこの分野において知られている使用／用途を後述 する。 本発明のホスホリパーゼは、リン脂質またはリゾリン脂質、例えば、レシチン またはリゾレシチンの脂肪族アシル基を加水分解しようとする、任意の用途にお いて使用することができる。好ましくは、ホスホリパーゼはｐＨ３〜１０および ３０〜７０℃（特に４０〜６０℃）において使用される。必要に応じて、ホスホ リパーゼを、反応後、それを、例えば、ｐＨ７、８０℃において１時間、あるい は９０℃において１０分間熱処理することによって不活性化することができる。 １例として、本発明のホスホリパーゼを、たとえば、パンまたはケーキの弾性 を改良するために、練り粉、パンおよびケーキの製造に用いることができる。 このように、本発明のホスホリパーゼを練り粉（ｄｏｕｇｈ）の成分に添加し 、練り粉を混練し、焼いてパンを製造する方法において、本発明のホスホリパー ゼを使用することができる。これは米国特許第４，５６７，０４６号（協和発酵 ）、特開昭６０−７８５２９号（キューピー Ｃｏｒｐ．）、特開昭６２−１１ １６２９号（キューピー Ｃｏｒｐ．）、特開昭６３−２５８５２８号（キュー ピー Ｃｏｒｐ．）またはＥＰ４２６２１１号（Ｕｎｉｌｅｖｅｒ）と同様に実 施することができる。 本発明のホスホリパーゼは、リン脂質を含有する炭水化物由来の水性溶液また はスラリーをホスホリパーゼで処理することによって、その濾過性を改良するた めにも使用することができる。これは、特に、澱粉の加水分解物、特にコムギ澱 粉の加水分解物を含有する溶液またはスラリーに適用可能である。なぜなら、こ れは濾過が困難でありかつ曇った濾過液を与える傾向があるからである。この処 理はＥＰ２１９，２６９号（ＣＰＣ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）と同様に実 施することができる。 さらに、本発明のホスホリパーゼは、改良されたリン脂質の乳化剤を得るため に、リン脂質、好ましくはレシチンを部分的加水分解するために使用することが できる。この用途は、さらに、それに関するＬｅｃｉｔａｓｅ（商標）（Ｎｏｖ ｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ Ａ／Ｓ）の製品のカタログ、およびウルマンのＵｌｌｍａ ｎｎ’ｓ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｃｈｅｍ ｉｓｔｒｙ（発行所：ＶＣＨ Ｗｅｉｎｈｅｉｍ（１９９６））に記載されてい る。 さらに、本発明のホスホリパーゼは、ホスホリパーゼを飼料物質および少なく とも１つのリン脂質と混合することからなる、動物飼料を製造する方法において 使用することができる。これはＥＰ７４３，０１７号と同様に実施することがで きる。 この分野において知られている手順に従う植物油／食用油の脱ガム化 この分野において知られている手順に従い、食用油をホスホリパーゼで処理し てリン脂質の主要部分を加水分解し、そして加水分解されたリン脂質を含有する 水性相を前記油から分離することからな る、食用油中のリン脂質の含量を減少する方法において、本発明のホスホリパー ゼを使用することができる。このプロセスは、リン脂質を含有する任意の食用油 、例えば、植物油、例えば、大豆油、ナタネ油、およびヒマワリ油の精製に適用 可能である。 酵素処理の前に、植物油を前処理して、例えば、湿式精製により、粘液（粘質 物）を除去することが好ましい。典型的には、油はホスホリパーゼを使用する処 理の開始において、リン脂質として５５〜２５０ｐｐｍのリンを含有するであろ う、そして本発明の方法はこの値を１１ｐｐｍ以下、より好ましくは５ｐｐｍ以 下に減少させることができる。 酵素処理は、ホスホリパーゼの水溶液を、好ましくは１０μ（マイクロ）ｍ以 下の平均直径の液体粒子として、分散させることによって実施される。水の量は 油に関して好ましくは０．５〜５重量％である。必要に応じて、乳化剤を添加す ることができる。機械的撹拌を加えてエマルジョンを維持することができる。 酵素処理は、１．５〜８の範囲の任意のｐＨにおいて実施することができる。 ｐＨはクエン酸、クエン酸塩の緩衝剤またはＨＣｌの添加により調節可能である 。 適当な温度は、一般に３０〜７０℃（特に４０〜６０℃）である。反応時間は 典型的には０．５〜１２時間（例えば、２〜６時間）であり、そして酵素の適当 な投与量は通常１００〜５０００ＩＵ／ｌの油、特に２００〜２０００ＩＵ／ｌ であろう。 酵素処理は、バッチ式に、例えば、撹拌しながらタンク中で実施することがで きるか、あるいはそれは連続的に、例えば、１連の撹拌されたタンクの反応器中 で実施することができる。 酵素処理後、水性相と油相との分離を行う。この分離は慣用手段、例えば、遠 心により実施することができる。 他の面において、このプロセスはこの分野において知られている原理に従い、 例えば、下記の文献に記載されているように実施することができる：米国特許第 ５，２６４，３６７号（Ｍｅｔａｌｌｇｅｓｅｌｓｃｈａｆｔ、Ｒ ｈｍ）；Ｋ ．Ｄａｈｌｋｅ ＆ Ｈ．Ｂｕｃｈｏｌｄ、「ＩＮＦＯＲＭ」、６（１２）、１ ２８４−９１（１９９５）；Ｈ．Ｂｕｃｈｏｌｄ、「Ｆａｔ Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈ ｎｏｌ．」、９５（８）、３００−３０４（１９９３）；特開平２−１５３９９ ７号（昭和産業）；またはＥＰ６５４，５２７号（Ｍ ベーキングにおける本発明のホスホリパーゼの使用 本発明のホスホリパーゼは、また、パンまたは他の焼かれた製品の性質を改良 するためにパンまたは他の焼かれた製品の製造プロセスの間に粉または練り粉に 通常添加される、パン改良添加剤、例えば、練り粉組成物、練り粉添加剤、練り 粉コンディショナー、プレミックス、および同様な調製物において使用すること ができる。 したがって、本発明の態様は、パン改良および／または練り粉改良組成物に関 し、さらに、このような組成物における本発明のホスホリパーゼの使用、および 本発明のパン改良および／または練り粉改良組成物を含んでなる練り粉または焼 かれた製品に関する。 本発明の関係において、用語「パン改良組成物」および「練り粉改良組成物」 は、酵素成分に加えて、練り粉および／または焼かれた製品の性質を改良するた めに通常使用される他の物質を含むことができる、組成物を示すことを意図する 。このような成分の例を下に示す。 本発明の関係において、用語「改良された性質」は、本発明のホスホリパーゼ 酵素の作用により改良することができる性質を示すことを意図する。特に、ホス ホリパーゼを使用すると、焼かれた製品 の体積が増加しかつパンの中身の構造が改良され、品質変化の防止性が得られ、 ならびに練り粉の強度、サザンブロットが増加しかつ粘着性が減少し、これによ り機械加工性が改良される。練り粉に対する効果は、低い品質の粉を使用したと き、特にすぐれることが見出された。この機械加工性の改良は、工業的にプロセ シングすべき練り粉と関連して、特に重要である。 性質の改良は、本発明によるホスホリパーゼを添加しないで製造された練り粉 および／または焼かれた製品との比較により評価される。 本発明のパン改良および／または練り粉改良組成物は、他の酵素をさらに含む ことができる。他の酵素の例は下記の通りである：セルラーゼ、ヘミセルラーゼ 、ペントサナーゼ（練り粉の伸長性を増加するペントサンの部分的加水分解に有 効である）、グルコースオキシダーゼ（練り粉の強化に有効である）、リパーゼ （練り粉を軟化するために練り粉または練り粉成分の中に存在する脂質の変性に 有効である）、ペルオキシダーゼ（練り粉のコンシステンシーの改良に有効であ る）、プロテアーゼ（特に固いコムギ粉を使用するとき、グルテンの弱化に有効 である）、ペプチダーゼおよび／またはアミラーゼ、例えば、α−アミラーゼ（ 酵母により発酵可能な糖類を提供するために有効である）。 他の酵素成分に加えて、またはそれらの代替物として、練り粉改良および／ま たはパン改良組成物は通常に使用されているベーキング剤、例えば、下記の成分 １または２以上を含むことができる： ミルク粉末（表面の色を提供する）、グルテン（弱い粉のガス保持力を改良す るため）、乳化剤（練り粉の伸長性を改良しかつ生ずるパンのコンシステンシー をある程度改良するため）、粒状化された脂肪（練り粉の軟化およびコンシステ ンシーのため）、酸 化体（グルテン構造を強化するために添加される；例えば、アスコルビン酸、臭 素酸カリウム、ヨウ素酸カリウムまたは過硫酸アンモニウム）、アミノ酸（例え ば、システイン）、糖、および塩（練り粉を固くするために、例えば、塩化ナト リウム、酢酸カルシウム、硫酸ナトリウムまたは硫酸カルシウム）、粉または澱 粉）。 適当な乳化剤の例は、モノグリセリドまたはジグリセリド、モノグリセリドま たはジグリセリドのジアセチル酒石酸エステル、脂肪酸の糖エステル、脂肪酸の ポリグリセロールエステル、モノグリセリドの乳酸エステル、モノグリセリドの 酢酸エステル、ポリオキシエチレンステアレート、リン脂質およびレシチンであ る。 本発明の関係において、用語「焼かれた製品」は、柔らかいか、あるいはさく さくした特性の、練り粉から製造された任意の製品を包含することを意図する。 白色、淡いまたは暗色であり、好都合には本発明により製造することができる、 焼かれた製品の例は、典型的には一塊またはロールの形態の、パン（特に白色、 完全小麦粉またはライムギのパン）、フレンチバゲット型のパン、ピタパン、タ コス、ケーキ、パンケーキ、ビスケット、かりかりするパンおよびその他である 。 本発明の練り粉は前述の型の任意のものであり、かつ新鮮であるか、あるいは 凍結されていることができる。 上記の開示から明らかなように、本発明の練り粉は通常発酵を起こさせた練り 粉または発酵すべき練り粉である。練り粉は種々の方法で、例えば、重炭酸ナト リウムまたはその他を添加するか、あるいはパン種（発酵している練り粉）を添 加することによって発酵させることができるが、適当な酵母培養物、例えば、サ ッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａ ｅ）（パン酵母）の培養物の添加により練り粉を発酵させることができる。商業 的に入手可能なサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の任 意のものを使用することができる。 最終の態様において、本発明は、好ましくはマカロニコムギ粉または匹敵する 品質の粉から製造された、パスタ練り粉を製造するための本発明のホスホリパー ゼの使用に関する。慣用技術および前述したものに類似する投与量でホスホリパ ーゼを使用することによって、練り粉を製造することができる。ホスホリパーゼ は好ましくは微生物由来、例えば、本明細書において開示した由来のものである 。パスタの製造において使用するとき、ホスホリパーゼはグルテン構造を強化し 、こうして、練り粉の粘着性を減少しかつ練り粉の強度を増加させると考えられ る。 本発明の酵素のリパーゼ活性の使用 本明細書における実施例において示すように、本発明のホスホリパーゼはリパ ーゼ活性をさらに示す。 したがって、本発明は、リパーゼの標準的使用において、特にクリーニングお よび洗剤組成物において使用するための、このリパーゼ活性の使用に関する。こ のようなクリーニングおよび洗剤組成物はこの分野においてよく記載されており 、そして適当なクリーニングおよび洗剤組成物のそれ以上の説明については、Ｗ Ｏ９６／３４９４６号、ＷＯ９７／０７２０２号およびＷＯ９５／３００１１号 を参照のこと。 下記の実施例により、本発明をさらに詳細に説明する。これらの実施例はいか なる方法おいても本発明の範囲を限定することを意図しない。 材料および方法 寄託された微生物： フザリウム・オキシスポラム（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）ＤＳＭ Ｎｏ．２６ ７２は、本発明のホスホリパーゼをコードするＤＮＡ配列を含んでなる。 大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＤＳＭ１１２９９は、シャトル ベクターｐＹＥＳ２．０中の、本発明のホスホリパーゼをコードする、全長のｃ ＤＮＡ配列を含んでなるプラスミドを含有する。他の株： 酵母株：使用したサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）は、Ｗ３１２４であった（ＭＡＴａ；ｕｒａ ３−５ ２；ｌｅｕ ２−３、１１２；ｈｉｓ３−Ｄ２００；ｐｅｐ ４−１１３７；ｐ ｒｃｌ：：ＨＩＳ３；ｐｒｂｌ：：ＬＥＵ２：ｃｉｒ＋）。 大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株：ＤＨ１０Ｂ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ ｓ） プラスミド： アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）発現ベクターｐＨＤ４１４は、プ ラスミドｐ７７５の誘導体である（ＥＰ２３８，０２３号に記載されている）。 ｐＨＤ４１４の構築は、ＷＯ９３／１１２４９号にさらに記載されている。 ｐＹＥＳ２．０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ） ｐＡ２ＰＨ１０（実施例７参照） 一般的分子生物学の方法 特記しない限り、ＤＮＡの操作および形質転換は分子生物学の標準的方法を使 用して実施した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、（１９８９）、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ Ｓｐ ｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ；Ａｕｓｕｂｅｌ、Ｆ．Ｍ．他（編）「Ｃｕｒｒ ｅｎｔ ｐｒ ｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」 、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、１９９５；Ｈａｒｗｏｏｄ、Ｃ．Ｒ．およびＣ ｕｔｔｉｎｇ、Ｓ．Ｍ（編）「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍ ｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｂａｃｉｌｌｕｓ」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、１９９０）。 ＤＮＡの操作のための酵素は、供給会社の規格書に従い使用した。 ＤＮＡの操作のための酵素 特記しない限り、ＤＮＡの操作のためのすべての酵素、例えば、制限エンドヌ クレアーゼ、リガーゼおよびその他は、ニュー・イングランド・バイオラブス・ インコーポレーテッド（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｉｎｃ．） から入手した。 ＮＥＦＡ−ｃ試験をベースとするホスホリパーゼ活性のアッセイ 基質：Ｌ−α−リゾホスファチジルコリン（Ｓｉｇｍａ）。 基質：大豆レシチン（Ｓｉｇｍａ ＃Ｐ３６４４）。ホスホリパーゼＡ活性を 測定するために使用する。 Ｎｅｆａ−ｃ試験キットは、ワコ・ケミカルス・ジャーマニー（Ｗａｋｏ Ｃ ｈｅｍｉｃａｌｓ Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手した。 緩衝液：２０ｍＭのＮａＯＡｃ ｐＨ４．５。 基質溶液：１ｍｌのミリＱ水および１ｍｌの緩衝液中の１０ｍｇの基質（すべ ての試料に対して十分な基質溶液を調製する）。 １． １５μｌの酵素を１５０μｌの基質溶液に添加する。 ２． ４０℃において１０分間インキュベートする。 ３． ３０μｌを３００μｌの試薬１に添加する（Ｎｅｆａキットから）。 ４． ３７℃において１０分間インキュベートする。 ５． ６００μｌの試薬２を添加する（Ｎｅｆａキットから）。 ６． ３７℃において１０分間インキュベートする。 ７． Ｎｅｆａキットの使用説明書に従い、最終反応生成物の吸収を５５０ｎｍ において測定する。 酵素反応の１分当たり１μｍｏｌの脂肪酸を生産するために必要な酵素活性を １単位として定義した。酵母中の発現クローン化 酵母中の発現クローン化を下記の文献に包括的に記載されているように実施し た：Ｈ．Ｄａｌｂｏｅｇｅ他、「Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．」（１９９４） ２４３：２５３−２６０；ＷＯ９３／１１２４９号；ＷＯ９４／１４９５３号） 、これらは引用することによって本明細書の一部とされる。 全体のＲＮＡの抽出、ｃＤＮＡの合成、ヤエナリ（ｍｕｎｇ ｂｅａｎ）ヌク レアーゼの処理、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを使用する平滑末端化、およびライブ ラリーの構築のすべての個々の工程は、前述の参考文献に従い実施した。ｍＲＮ Ａの単離のためのフザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐ ｏｒｕｍ）ＤＳＭ Ｎｏ．２６７２の発酵手順： フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）ＤＳ Ｍ Ｎｏ．２６７２を、ＹＰＤ培地中で３０℃において４日間培養した。後述す るプレートアッセイにおいて、１０μｌの上清をホスホリパーゼ活性について試 験した。 下記の文献に記載されているように、ｍＲＮＡをこの培養からの菌糸体から単 離した：Ｈ．Ｄａｌｂｏｅｇｅ他、「Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．」（１９９ ４）２４３：２５３−２６０；ＷＯ９３／１１２４９号；ＷＯ９４／１４９５３ 号）、 陽性の酵母のクローンの同定（プレートアッセイ）： 陽性の酵母のクローン（すなわち、ホスホリパーゼ活性をコード する遺伝子を含むクローン）の同定を、後述するように実施した。 ２％のグルコースを含有するＳＣ寒天上に酵母の形質転換体をプレートし、３ ０℃において３日間インキュベートした。酢酸セルロースのフィルター（ＯＥ６ ７、Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ）を細胞の上部に配置し、次い でフィルターの上部上の細胞とともにＳＣ寒天および２％のガラクトースを含有 するプレートに移す。３０℃において３日間インキュベートした後、細胞を有す るフィルターを基質プレートに移す。陽性のクローンは、コロニーの下に基質プ レート中の青−緑色ゾーンを生ずるコロニーとして同定される。 基質プレートを下記の方法でつくる：２．５ｇの寒天（ＢＡ−３０ＩＮＡ Ａ ｇａｒ（登録商標）、Ｆｕｎａｋｏｓｉ Ｃｏ． Ｌｔｄ．）を１３７．５ｍｌ のＨ₂Ｏに添加し、電子レンジ中で加熱沸騰させる。約６０℃に冷却した後、３ ０ｍｌの下記の混合物を添加する：６２．５ｍｌの０．４ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ 緩衝液（ｐＨ７．５）および５０ｍｌの３％のＬｉｏｉｄ Ｅ８０（Ｌｉｏｉｄ ＧｎｂＨ、Ｄ−６７０６５ Ｌｕｄｗｉｇｓｈａｆｅｎ、ドイツ国）と２％の Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（ｖ／ｖ）および０．５ｍｌのＨ₂Ｏ中の２％のブリ リアント・グリーン溶液との溶液。基質の濃度は重要である。この濃度が高い場 合、それは酵母細胞からおよび／またはホスホリパーゼ副活性を有する糸状菌の リパーゼからバックグラウンドの活性を生ずることがある。 アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）中の発現のためのｃＤＮＡ遺伝子の 単離 ホスホリパーゼを産生する酵母コロニーを、５０ｍｌのガラス製試験管中の２ ０ｍｌのＹＰＤブロスの中に接種する。試験管を３０℃において２日間震盪する 。３０００ｒｐｍにおいて１０分間遠心 することによって、細胞を収集する。 ＤＮＡをＷＯ９４／１４９５３号に従い単離し、５０ｍｌの水中に溶解する。 ＤＮＡを標準的手順により大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の中に形質転換する。プラス ミドＤＮＡを標準的手順により大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から単離し、制限酵素分 析により分析する。適当な制限酵素を使用してｃＤＮＡインサートを切除し、ア スペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）の発現ベクターの中に結合する。 アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）またはアス ペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）の形質転換 ＷＯ９５／０２０４３号、第１６ページ、第２１行〜第１７ページ、第１２行 （これは引用することによって本明細書の一部とされる）に記載されているよう にして、プロトプラストを調製する。 １００μｌのプロトプラストの懸濁液を５〜２５μｌの適当なＤＮＡと１０μ ｌのＳＴＣ（１．２Ｍのソルビトール、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ＝７ ．５、１０ｍＭのＣａＣｌ₂）中で混合する。プロトプラストをｐ３ＳＲ２（プ ラスミドを有するアスペルギルス・ニヅランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）のａｍ ｄＳ遺伝子）と混合する。この混合物を室温において２５分間放置する。０．２ ｍｌの６０％のＰＥＧ４０００（ＢＤＨ２９５７６）、１０ｍＭのＣａＣｌ₂お よび１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ＝７．５を添加し、注意して混合し（２ 回）、最後に０．８５ｍｌの同一溶液を添加し、注意して混合する。この混合物 を室温に２５分間放置し、２５００ｇにおいて１５分間回転し、ペレットを２ｍ ｌの１．２Ｍのソルビトールの中に再懸濁させる。さらに１回沈降させた後、プ ロトプラストを１．０Ｍのスクロース、ｐＨ７．０、窒素源として１０ｍＭのア セトアミドおよびバックグラウンドの生長を阻止する ために２０ｍＭのＣｓＣｌを含有する最少プレート（Ｃｏｖｅ、Ｂｉｏｃｈｉｍ ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １１３（１９６６）５１−５６）上に広げる。３ ７℃において４〜７日間インキュベートした後、胞子を取り上げ、単一のコロニ ーについて広げる。この手順を反復し、第２回の再単離後の単一のコロニーの胞 子を規定された形質転換体として貯蔵する。 アスペルギルス・オリゼ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）またはアスペルギルス・ニガー（ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）の形質転換体の試験 アスペルギルス・オリゼ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）の形質転換体の各々を１０ｍｌ のＹＰＭ（下記を参照）の中に接種し、増殖させる。３０℃において２〜５日間 インキュベートした後、上清を取出す。２０μｌの上清を基質プレート（上を参 照）の中に押抜いた孔の中に負荷する。１〜２４時間後、ホスホリパーゼ活性は 孔の回りの青−緑色のゾーンとして現れる。 流加発酵 炭素源としてマルトデキストリン、窒素源として尿素および酵母エキスを含ん でなる培地中で、流加発酵を実施した。問題のアスペルギルス・オリゼ（Ａ．ｏ ｒｙｚａｅ）宿主細胞の震盪フラスコの培養物を３．５％の炭素源および０．５ ％の窒素源を含んでなる培地の中に接種することによって、流加発酵を実施した 。ｐＨ７．０および３４℃において２４時間培養した後、追加の炭素源および窒 素源の連続的供給を開始した。炭素源を制限因子として保持し、そして酸素が過 剰量で存在するようにした。流加培養法を４日間続けた。 配列番号：１に示すＤＮＡ配列の単離 本発明のホスホリパーゼをコードする配列番号：１に示すＤＮＡ 配列のホスホリパーゼをコードする部分は、この分野において知られている方法 によりプラスミドＤＮＡの抽出により、寄託された微生物大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒ ｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＤＳＭ１１２９９から得ることができる（Ｓａｍｂｒｏ ｏｋ他（１９８９）「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａ ｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ）。 培地 ＹＰＤ：１０ｇの酵母エキス、２０ｇのペプトン、９００ｍｌとするＨ₂Ｏ。 オートクレーブ処理し、１００ｍｌの２０％のグルコース（滅菌濾過した）を添 加する。 ＹＰＭ：１０ｇの酵母エキス、２０ｇのペプトン、９００ｍｌとするＨ₂Ｏ。 オートクレーブ処理し、１００ｍｌの２０％のマルトデキストリン（滅菌濾過し た）を添加する。 １０×基礎塩：７５ｇの酵母窒素塩基、１１３ｇのコハク酸、６８ｇのＮａＯ Ｈ、１０００ｍｌとする水を滅菌濾過した。 ＳＣ−ＵＲＡ：１００ｍｌの１０×基礎塩、２８ｍｌの２０％のカサミノ酸、 ビタミンを含まない、１０ｍｌの１０％のトリプトファン、９００ｍｌとする水 をオートクレーブ処理し、３．６ｍｌの５％のスレオニンおよび１００ｍｌの２ ０％のグルコースまたは２０％のガラクトースを添加する。 ＳＣ寒天：ＳＣ−ＵＲＡ、２０ｇ／ｌの寒天を添加する。 ＳＣ−変異型寒天：２０ｇの寒天、２０ｍｌの１０×基礎塩、９００ｍｌとす る水をオートクレーブ処理する。 ＰＥＧ４０００（ポリエチレングリコール、分子量＝４０００）（ＢＤＨ、英 国）。 実施例 実施例１ フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）ホスホ リパーゼの発酵 寒天斜面上のフザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏ ｒｕｍ）ＤＳＭ２６７２の培養物を、各々が１００ｍｌのＢｏｕｉｌｌｏｎ−３ 培地を有する、５本の５００ｍｌの震盪フラスコに移し、３０℃において１日間 震盪した（２００ｒｐｍ、振幅２．５ｃｍ）。 Ｂｏｕｉｌｌｏｎ−３培地の組成は下記の通りであった： ペプトン ６ｇ／ｌ トリプシン消化カゼイン ４ｇ／ｌ 酵母エキス ３ｇ／ｌ 肉エキス １．５ｇ／ｌ グルコース １ｇ／ｌ 培地を１２１℃において４０分間オートクレーブ処理した。 これらのＢｏｕｉｌｌｏｎ−３震盪フラスコの培養ブロスを、各々がＰＬ−１ 培地を含む、２０本の５００ｍｌの震盪フラスコのための種培養物として使用し た。 ＰＬ−１培地の組成は下記の通りであった： ペプトン １０ｇ／ｌ Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−８０ １２ｇ／ｌ ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ２ｇ／ｌ ＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ ０．１ｇ／ｌ オートクレーブ処理前のｐＨ ６．０ 培地を１２１℃において４０分間オートクレーブ処理した。 各ＰＬ−１震盪フラスコを０．５〜２ｍｌのＢｏｕｉｌｌｏｎ− ３培養ブロスで接種し、２００ｒｐｍ（振幅２．５ｃｍ）で３０℃において５日 間震盪した。震盪フラスコからの培養ブロスを収集時にプールした、合計３．９ リットル、酵素収量５３ＬＵ／ｍｌ。 実施例２ ホスホリパーゼの精製 工程１）− １リットルの発酵上清を遠心し、生ずる沈澱を廃棄した。次いで 、固体の酢酸アンモニウムの添加により、上清を０．８Ｍの酢酸アンモニウムに 調節した。 工程２）− 疎水性クロマトグラフィー − トヨパール（Ｔｏｙｏｐｅａｒ ｌ）ブチル６５０Ｃマトリックスをトソ・ハス（Ｔｏ 入した。５０ｍｌのカラムにマトリックスを詰めた。カラムを５０％のエタノー ルで洗浄し、次いで水で洗浄した。次いでカラムを０．８Ｍの酢酸アンモニウム と平衡化した。次いで、０．８Ｍの酢酸アンモニウムで調節した発酵上清をカラ ムに適用した。次いで未結合の物質を０．８Ｍの酢酸アンモニウムで洗浄して、 すべての紫外線吸収物質（２８０ｎｍ）を除去した。 次いでカラムを水で溶離し、引き続く５０％のエタノールで溶離した。 前述したＮＥＦＡキットを使用して、ホスホリパーゼ活性をｐＨ４．５および ４０℃において測定した。水およびアルコールの溶出液の中に活性を含有する画 分をプールした。ＮＥＦＡキットアッセイを使用して、活性をｐＨ４．５におい てアッセイした。 次いでホスホリパーゼ活性を含有する画分をプールし、透析し、１０ｋＤａの カットのアミコン（Ａｍｉｃｏｎ）限外濾過膜を使用して濃縮した。 工程３）− ＤＥＡＥ高速クロマトグラフィー上の陰性の吸収。 ＤＥＡＥ ＦＦをファーマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）から購入し、５０ｍｌ のカラムにマトリックスを詰めた。 次いでカラムを製造業者が記載するように洗浄し、２５ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液 ｐＨ７と平衡化した。 透析し、濃縮した試料をｐＨ７、コンダクタンス２ｍＳｉに調節し、アニオン 交換体ＤＥＡＥ ＦＦカラムに適用した。 活性を流出液として集めた。活性はアニオン交換体にｐＨ７において結合しな い。 活性を含有するＤＥＡＥ ＦＦからの流出液を濃縮し、１０ｋＤａのカットの アミコン膜を使用して透析し、２５ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６で緩衝化 した。 スーパーデックス（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ）７５上のゲル濾過。 ファーマシアからのスーパーデックス７５を前もって充填したカラムＨｉｌｏ ａｄ Ｔｍ１６／２０を洗浄し、１５０ｍＭのＮａＣｌを含有する２５ｍＭの酢 酸ナトリウムｐＨ６と平衡化した。 ｐＨ４．５および４０℃においてホスホリパーゼ活性を示すアニオン交換体か らの濃縮された流出液の２ｍｌを、スーパーデックスカラム上に適用した。 活性を１ｍｌ／分の流速のゲル濾過により分離した。 実施例３ フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）から得 られた精製されたホスホリパーゼの特性決定 実施例１に記載したように発酵させ、実施例２に記載したように精製したフザ リウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）のホスホリ パーゼについて、後述する特性決定を実施した。 ノベックス（Ｎｏｖｅｘ）Ｔｍからの４〜２０％のＳＤＳ−ＰＡ ＧＥプレキャストプレートを使用することによって、ホスホリパーゼ酵素の分子 量を測定した。前述したように還元性条件下に、このタンパク質の分子量を測定 した。 フザリウム・オキシスポラム（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）のホスホリパーゼに ついて、分子量は還元性条件下に２９〜３０ｋＤａであることが見出された。 ファーマシアからのアンフォライン（Ａｍｐｈｏｌｉｎｅ）ＰＡＧＥプレート を使用することによって、等電点を測定した。 フザリウム・オキシスポラム（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）について、タンパク 質のｐＩは、ほぼ中性のｐＨにおいて、好ましくは５．８〜６．８の範囲である 。 ホスホリパーゼの熱安定性 フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）から のホスホリパーゼの熱安定性をＤＳＣ（示差走査熱量計）により試験した。一定 の、プログラミングされた加熱速度において酵素溶液を加熱した後に得られたサ ーモグラム（Ｃｐ／Ｔ）中の変性ピークの頂部として、熱変性温度、Ｔｄ、を取 った。 実験： ハート・サイエンティフィック（Ｈａｒｔ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）（米国ユ タ州、１９９３）からのＤＳＣ ＩＩを実験に使用した。 ｐＨ１０（５０ｍＭのグリシン緩衝液）、ｐＨ７（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝 液＋１０ｍＭのＥＤＴＡ）またはｐＨ４（５０ｍＭのクエン酸塩緩衝液）におい て、５０ｍＭの緩衝化溶液を酵素（ほぼ２ｍｇ／ｍｌ）のための溶媒として使用 した。前述の実施例２に従い、酵素を精製した。 ７５０μｌの酵素溶液をハート・サイエンティフィックからの標 準的１ｍｌの密閉可能なハステロイのアンプルの中に移した。アンプルを熱量計 の中に入れ、５℃に１５分間冷却した。ＤＳＣ走査の前に、熱的平衡化を実施し た。ほぼ９０Ｋ／時の走査速度で５℃から９５℃まで、ＤＳＣ走査を実施した。 ほぼ＋／−２℃の正確度で、変性温度を測定した。 結果： 表１：ｐＨの関数として変性ピークに対する頂部 酵素の安定性に影響を有意に及ぼすことがある油マトリックスの非存在におい て、これらの実験を実施したことに注意すべきである。ＤＳＣの結果は、中性の ｐＨ付近における最大の安定性を示す。 不可逆的熱変性を仮定すると、工業的用途、例えば、油の脱ガム化（米国特許 第５，２６４，３６７号）における関係する実施温度は、上記表１に記載するＴ ｄ温度よりも少なくとも１０°低い。 アミノ末端の配列 製造業者の記載するようにアプライド・バイオシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂ ｉｏｓｙｓｔｅｍ）の装置（ＡＢＩ ４７３Ａタンパク質配列決定装置、Ａｐｐ ｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ、米国）を使用して、エドマン分解法によりアミ ノ末端の分析を実施した。 Ｎ−末端の配列： フザリウム・オキシスポラム（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）のホスホリパーゼにつ いて、Ｎ−末端の配列は下記の通りである： Ｎ−末端Ａ−Ｖ−Ｇ−Ｖ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｄ−Ｆ−Ｓ−Ｎ−Ｆ−Ｋ−Ｆ−Ｙ−Ｉ Ｎ−末端のアミノ酸「Ａ」（Ａｌａ）は、配列番号：２中の位置３１である。 これにより示されるように、本発明の成熟ホスホリパーゼ酵素は配列番号：２中 の位置３１において開始する。 結局、成熟配列は配列番号：２において３１−３４６である。 実施例４ ホスホリパーゼＡ活性 前述したようにｐＨ４．５、４０℃において基質として大豆レシチンを使用し て、ホスホリパーゼＡ活性を測定した（ＮＥＦＡ試験塩基アッセイ）。 フザリウム・オキシスポラム（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）のホスホリパーゼは 、前述の条件において有意なホスホリパーゼＡ活性を示した。 実施例５ Ｌ−α−リゾホスファチジルコリンに向かう活性 前述したようにｐＨ４．５、４０℃において基質としてＬ−α−リゾホスファ チジルコリンを使用して、ホスホリパーゼＡ活性を測定した（ＮＥＦＡ試験塩基 アッセイ）。 フザリウム・オキシスポラム（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）のホスホリパーゼは 、前述の条件においてＬ−α−リゾホスファチジルコリンに対して有意な活性を 示した。 実施例６ 単層の構成におけるホスホリパーゼ活性 単層装置（ゼロ次トラフ、ＫＳＶ５０００、ＫＳＶ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ 、フィンランド国）を使用して、ホスホリパーゼＤＤＰＣ（Ｄｉ Ｄｉｃａｎｙ ｌ（Ｃ１０）ホスファチジルコリン）に 対する種々の酵素の活性を評価した。 実験 緩衝溶液（１０ｍＭのＴＲＩＳ、ｐＨ８．０、25℃）の完全に精製された表面 上で、ＤＤＰＣの単層をクロロホルム溶液から広げた。単層の緩和（クロロホル ムの蒸発）後、ほぼ６３Ų／分子のＤＤＰＣの平均分子面積に対応して、表面 圧力を１５ｍＮ／ｍに調節する。ほぼ６０μｇの酵素を含有する緩衝溶液（前述 ）を単層を通して「ゼロ次トラフ」中の反応区画室（面積１５２０ｍｍ²および 体積３０４００ｍｍ³を有するシリンダー）の部分相の中に注入しする。不溶性 基質分子がより水溶性の反応生成物に加水分解されるとき、一定の表面圧力を維 持するために、単層を圧縮する移動性バリヤーの速度により、酵素活性は発現さ れる。反応生成物（カプロン酸およびＤＤＰＣ）の溶解度がＤＤＰＣについてよ りかなり高いことが確認されると、酵素により１分当たり加水分解されるＤＤＰ Ｃ−分子の数はＤＤＰＣの平均分子面積（ＭＭＡ）から推定される。 結果 表２ 単層の構成におけるＤＤＰＣに対する酵素の活性 ＊）酵素の存在により誘発された単層面積／単位時間の減少から計算した。 表２中の「フザリウム・オキシスポラム（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）からの酵 素」は、実施例２に記載するように精製された、本発明のホスホリパーゼである 。 結論 小さいホスホリパーゼ活性を示すモルモットのリパーゼから得られたリパーゼ を除外して、酵素の大部分についてホスホリパーゼ活性は検出されなかった。 フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）から 得られた本発明のホスホリパーゼは、驚くほどに高い有意なホスホリパーゼ活性 を示した。 結局、本発明において、本発明のホスホリパーゼに関して本発明において使用 する用語「ホスホリパーゼ活性」は、上に示した「単層ホスホリパーゼアッセイ 」において、少なくとも０．２５ｎｍｏｌ／分、酵素投与量：６０μｇ；より好 ましくは少なくとも０．４０ｎｍｏｌ／分、酵素投与量：６０μｇ；より好まし くは少なくとも０．７５ｎｍｏｌ／分、酵素投与量：６０μｇ；より好ましくは 少なくとも１．０ｎｍｏｌ／分、酵素投与量：６０μｇ；より好ましくは少なく とも１．２５ｎｍｏｌ／分、酵素投与量：６０μｇ；なおより好ましくは少なく とも１．５ｎｍｏｌ／分、酵素投与量：６０μｇ；である活性として定義される 。 用語「ホスホリパーゼ副活性を有するリパーゼ」は、それに応じて、実施例６ に示す「単層ホスホリパーゼアッセイ」におけるホスホリパーゼ副活性がホスホ リパーゼ活性を特定する前述の数値より低い、ホスホリパーゼ副活性を有するリ パーゼとして定義される。 本明細書における定義に従うホスホリパーゼ副活性を有するリパーゼの１例は 、上記表２に示すモルモットのリパーゼである。前記モルモットのリパーゼは、 「単層ホスホリパーゼアッセイ」において、０．２５ｎｍｏｌ／分、酵素投与量 ：６０μｇ、より低いホスホリパーゼ副活性を有する。 実施例７ フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）ＤＳＭ Ｎｏ．２６７２からのホスホリパーゼのクローン化および発現 前述した酵母技術における発現クローン化を使用することによって、クローン 化および発現を実施した。 前述したように十分なエアレーションを保証するための撹拌を含めて上記の増 殖させた、フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕ ｍ）、ＤＳＭ Ｎｏ．２６７２から、ｍＲＮＡを単離した。３〜５日間増殖させ た後、菌糸体を収集し、直ちに液体窒素中で凍結させ、−８０℃において貯蔵し た。１％のベクターのバックグラウンドをもつ前述の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中 で、ほぼ９×１０⁵の個々のクローンから成るフザリウム・オキシスポラム（Ｆ ｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、ＤＳＭ Ｎｏ．２６７２からのライブ ラリーを構築した。プールのいくつかからのプラスミドＤＮＡを酵母の中に形質 転換し、２５０〜４００の酵母コロニーを含有する５０〜１００のプレートが各 プールから得られた。 ホスホリパーゼ陽性コロニーを基質プレート（上を参照）上で同定し、単離し た。ｃＤＮＡインサートを酵母のコロニーから直接増幅し、前述の材料および方 法の節に記載するように特性決定した。ホスホリパーゼをコードするｃＤＮＡの ＤＮＡ配列を配列番号：１に示し、そして対応するアミノ酸配列を配列番号：２ に示す。配列番号：１において、Ｎｏ．２３からＮｏ．１０６０までのＤＮＡヌ クレオチドはホスホリパーゼをコードする領域を定める。ホスホリパーゼの成熟 部分をコードする配列番号：１中のＤＮＡ配列の部分は、配列番号：２における アミノ酸位置３１−３４６に相当する、位置１１３−１０６０からなる。 ｃＤＮＡはＤＳＭ１１２９９中のプラスミドから得ることができる。 全体のＤＮＡを酵母のコロニーから単離し、そして前述したように大腸菌（Ｅ ．ｃｏｌｉ）の形質転換によりプラスミドＤＮＡをレスキューした。アスペルギ ルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）中でホスホリパーゼを発現させるために、ＤＮ Ａを適当な制限酵素で消化し、ゲル上でサイズ分画し、ホスホリパーゼ遺伝子に 対応するフラグメントを精製した。遺伝子を引き続いてｐＨＤ４１４に結合し、 適当な制限酵素で消化すると、プラスミドｐＡ２ＰＨ１０が得られた。 大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中のＤＮＡを増幅した後、プラスミドを前述したよう にアスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）の中に形 質転換した。 アスペルギルス・オリゼ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）の試験 形質転換体の各々を前述したように酵素活性について試験した。形質転換体の いくつかは、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ）のバックグラウンドよりも有意に高い 、ホスホリパーゼ活性を有した。これはアスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇ ｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）中のホスホリパーゼの効率よい発現を証明する。 実施例８ フザリウム・オキシスポラム（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）のホスホリパーゼの組 換え発現 アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）の発現ベクターｐＡ２ＰＨ１０を含 むアスペルギルス・オリゼ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）の形質転換体（実施例７参照） を、前述したように流加発酵させた。組換え的に生産されたフザリウム・オキシ スポラム（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）のホスホリパーゼの精製を、実施例２に記 載するように実施した。 実施例９ フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）から得 られた組換え的に発現させ、精製したホスホリパーゼの特性決定 組換え的に発現させ、引き続いて精製したホスホリパーゼ（実施例８参照）を 特性決定した。 本発明の組換えフザリウム・オキシスポラム（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）のホ スホリパーゼに関するこれらの特性決定の結果は、実施例３に示す特性決定の結 果と完全に相関し、ここで組換え的に発現させ、精製した酵素は、実施例３にお いて特性決定した非組換え的に発現させ、精製したホスホリパーゼと同一であっ た。 フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）から得 られた組換え的に生産されたホスホリパーゼを特性決定するために使用した一般 的アッセイ ホスホリパーゼのアッセイ： ホスホリパーゼ活性（ＰＨＬＵ）を、レシチンからの遊離脂肪酸の放出として 測定した。５０μｌの５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７、中の４％のＬ−α−ホス ファチジルコリン（植物のレシチン、Ａｖｎｔｉ、米国）、４％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、５ｍＭのＣａＣｌ₂を添加し、５０μｌの酵素溶液を５０ｍＭの ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７、中で適当な濃度に希釈した。試料を３０℃において１０分 間インキュベートし、９５℃において５分間反応を停止させた後、遠心（７００ ０ｒｐｍにおいて５分）した。ワコ・ケミカル社（Ｗａｋｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｓ ＧｍｂＨ）からのＮＥＦＡ Ｃキットを使用して、遊離脂肪酸を定量した； ２５μｌの反応混合物を２５０μｌの試薬Ａに添加し、３７℃において１０分間 インキュベートした。次いで５００μｌの試薬Ｂを添加し、試料を再び３７℃に おいて１０分間インキュベートした。ＨＰ８４５２Ａダイオード配列分光光度計 を使用して、５５０ｎｍにおける吸収を測定した。試料を少なくとも二重反復実 験において試験した。基質および酵素の盲検試料（予熱した酵素試料（９５℃に おいて１０分）＋基質）を含めた。オレイン酸を脂肪酸の標準として使用した。 １ＰＨＬＵは、これらの条件下に、１μｍｏｌの遊離脂肪酸／分を解放すること ができる酵素の量に等しい。 また、このアッセイを３７℃において２０ｍＭのクエン酸塩緩衝液、ｐＨ５（ Ｃａ²⁺依存性）または２０ｍＭのブリットン−ロビンソン緩衝液（ｐＨ−プロフ ィル／温度−プロフィル／安定性）中で実施した。基質として１−（Ｓ−デカノ イル）−２−デカノイル）−１−チオ−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（Ｄ ３７６１分子プローブ）を使用して、ホスホリパーゼＡ₁活性（ＰＬＡ₁）を測定 した。２００μｌのクベット中の１９０μｌの基質（１００μｌのＤ３７６１（ エタノール中の２ｍｇ／ｍｌ）＋５０μｌの１ ％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００＋１．８５ｍｌの５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．３ ｍＭのＤＴＮＢ、２ｍＭのＣａＣｌ₂、ｐＨ７）を１ｏμｌの酵素に添加し、そ して室温においてＨＰ８４５２Ａダイオード配列分光光度計により時間の関数と して、４１０ｎｍにおける吸収を測定した。線状の範囲における曲線の勾配とし て、活性を計算した。ＰＬＡ₁は、これらの条件下に、１μｍｏｌの遊離脂肪酸 （チオール）／分を解放することができる酵素の量に等しい。 １−ヘキサデカノイル−２−（１−ピレンデカノイル）−１−チオ−ｓｎ−グ リセロ−３−ホスホコリン（Ｈ３６１分子プローブ）を使用して、４０℃におい てホスホリパーゼＡ₁活性（ＰＬＡ₁）を測定した。２ｍｌのクベット中の２ｍｌ の基質（５０μｌの１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００＋２５μｌのメタノール中 の０．１％のＨ３６１＋１０ｍｌの５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７）を撹拌しな がら１０μｌの酵素に添加し、そしてパーキンエルマー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍ ｅｒ）ＬＳ５０装置を使用して時間の関数（１秒の間隔）として３７６ｎｍ（３ ４０ｎｍにおける励起）においてピレン蛍光放射を測定した。Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ −１００／ホスホリパーゼの菌糸体において、ホスホリパーゼの濃度を励起二量 体が形成する（４８０ｎｍにおいて放射する）ように調節した。切断が起こると 、ピレン基を含有する２−位における脂肪酸は水性相の中に放出され、モノマー の放射が増加する。線状の範囲における曲線の勾配として、ＰＬＡ₂活性を取っ た。 リパーゼアッセイ： リパーゼ活性（ＬＵ）はノボ・ノルディス（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ）の刊 行物ＡＦ９５に従い測定した。ｐＨスタット滴定実験において、３０℃、ｐＨ７ においてトリブチリンの加水分解を追跡した。１ＬＵは、標準的条件下に、１μ ｍｏｌの酪酸／分を放出す ることができる酵素の量に等しい。 オリーブ油に対する活性（ＳＬＵ）を下記のようにして測定した：１２ｍｌの ５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、４０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ₂、ｐＨ９ 、を２．５ｍｌの（Ｓｉｇｍａ）リパーゼ基質に添加した。ｐＨをｐＨ９または それよりちょうど低い値に調節した後、０．５ｍｌのリパーゼ溶液（緩衝液中で 希釈した）を添加し、そしてラジオメーター（Ｒａｄｉｏｍｅｔｅｒ Ａ／Ｓ、 デンマーク国コペンハーゲン）から商業的に入手可能であるチトララブ（Ｔｉｔ ｒａｌａｂ）を使用して、３０℃においてｐＨスタット滴定アッセイを実施した 。１ＳＬＵはｐＨ９、３０℃において１μｍｏｌの遊離脂肪酸／分を放出するこ とができる酵素の量に等しい。 本発明の組換え的に生産されたフザリウム・オキシスポラム（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏ ｒｕｍ）のホスホリパーゼの特性決定 後述する酵素を特性決定するために使用したアッセイは、直ぐ上に記載したア ッセイであった。酵素： 配列番号：２に示すアミノ酸配列を有するフザリウム・オキシスポラム（Ｆｕ ｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）からのＰＬ。 バッチＦ−９７００９８９、ＯＤ₂₈₀ ０．８３（０．６９ｍｇ／ｍｌ）、純 度＞９５％（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）。 前述したように、酵素を組換え的に発現させ、精製した。 Ｌｅｃｉｔａｓｅ（商標）バッチＬ５４６−Ｆ０６（１０３６８ ＩＵ／ｍｌ 、ほぼｍｇ／ｍｌ）。 Ｌｉｐｏｌａｓｅ（登録商標）（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ Ａ／Ｓ）。 フザリウム・オキシスポラム（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）リパーゼ／ホスホリ パーゼのホスホリパーゼ活性に対するＣａ²⁺の影響を 研究した。ＥＤＴＡまたはＣａ⁺²をアッセイに含めるか否かにかかわらず、主要 な差は観察されず（下記表３参照）、こうして、酵素はＣａ²⁺に対して比較的独 立であるように見える。 表３ ＥＤＴＡおよびＣａ²⁺に対するフザリウム・オキシスポラム（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏ ｒｕｍ）のホスホリパーゼ活性（ＰＨＬＵ）の依存性−２％のレシチン、２％の Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、２０ｍＭのクエン酸塩、ｐＨ５、３７℃ ¹相対活性は１ｍＭのＣａＣｌ₂における活性に関し、１に正規化されている。 基質として植物レシチンを使用して、ｐＨ−プロフィルをブリットン−ロビン ソン緩衝液中で研究した（表４）。酵素はホスホリパーゼに対するアルカリ性の ｐＨ−プロフィルを示し、最適値はｐＨ９以上であるが、活性は低いｐＨにおい て油を脱ガム化しかつベーキングにおける性能を提供するのに十分に高い（比活 性の比較については下記を参照）。 表４ フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）のホス ホリパーゼのｐＨ−プロフィル、２％のレシチン、２％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１ ００、２０ｍＭのＢＲ、３７℃ ¹相対活性はｐＨ９における活性に関し、１に正規化されている。 ホスホリパーゼについて温度のプロフィルをｐＨ５において得た；活性は４０ ℃以上の温度において下向し始める（表５）。これは酵素を前インキュベートし 、次いで残留活性を測定することによって測定した温度安定性（表６）と合理的 に一致し、ここで酵素はｐＨ５において４５℃までの温度において安定である。 表５ フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）のホス ホリパーゼの温度プロフィル、２％のレシチン、２％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１０ ０、２０ｍＭのＢＲ すべてのデータは、ｐＨ５、４０℃における活性に関する相対活性のデータと して示されており、１に正規化されている。 表６ フザリウム・オキシスポラム（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）のホスホリパーゼの温 度安定性；２０ｍＭのＢＲ中で３０分間のインキュベート すべてのデータは残留活性のデータとして示されており、ここで５℃における 前インキュベーション後の活性は１に正規化されている。 酵素の低い安定性は究極的製品をプロセス助剤として記録するために有利であ ることがある。なぜなら、活性酵素は食用油の脱ガム化または焼かれた製品にお いて最終生成物として期待されないであ ろうからである。 本発明のフザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕ ｍ）から得られたホスホリパーゼは、ホスホリパーゼ活性およびリパーゼ活性の 双方を有する。 したがって、種々の異なるリパーゼおよびホスホリパーゼの基質に対する酵素 活性を研究し、商業的に入手可能なホスホリパーゼＬｅｃｉｔａｓｅ（商標）、 および商業的に入手可能なリパーゼＬｉｐｏｌａｓｅ（登録商標、Ｎｏｖｏ Ｎ ｏｒｄｉｓｋ Ａ／Ｓ）の活性と比較した。 フザリウム・オキシスポラム（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）のホスホリパーゼ／ リパーゼはｐＨ７および９においてトリブチリンおよびオリーブ油の双方に対し て高い活性を有する（表７）。比較の理由で、Ｌｉｐｏｌａｓｅ（登録商標）の 比活性は約５０００ＬＵ／ｍｇである。しかしながら、Ｌｉｐｏｌａｓｅ（登録 商標）と反対に、フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐ ｏｒｕｍ）のリパーゼは非常に広い特異性を示し、かなりのホスホリパーゼ活性 およびまたチオエステラーゼ活性を有する〔上記単層の実施例を参照、Ｌｉｐｏ ｌａｓｅ（登録商標）は測定可能なホスホリパーゼ活性をもたない〕。 本発明のフザリウム・オキシスポラム（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）のホスホリ パーゼ／リパーゼは、ｐＨ７においてホスホリパーゼＬｅｃｉｔａｓｅ（商標） （ブタ膵臓のＰＬＡ₂）のそれよりかなり高いレシチンに対する比活性を有する （表７）。 Ｌｅｃｉｔａｓｅ（商標）に比較して、フザリウム・オキシスポラム（Ｆ．ｏ ｘｙｓｐｏｒｕｍ）酵素はｐＨ７において１００倍高い活性を有する。フザリウ ム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）酵素についてホ スホリパーゼ／リパーゼの 比は、同様な条件（ｐＨ７および３０℃）下に、約０．２２５（１０００ＬＵ／ ｍｇ／２２５ＰＨＬＵ／ｍｇ）である。 表７ フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）のリパ ーゼ／ホスホリパーゼの活性−Ｌｅｃｉｔａｓｅ（商標）に対する比較 ¹ＰＬＵはＰＨＬＵのように測定したが、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７、３０ ℃の代わりに、２０ｍＭのクエン酸塩中で、ｐＨ５および３７℃において測定し た。 ホスホリパーゼＡ₁に対して特異的な基質を使用し、１−（Ｓ−デカノイル） −２−デカノイル）−１−チオ−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンの１−位に おけるチオエステル結合の切断を測定することによって、フザリウム・オキシス ポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）のリパーゼ／ホスホリパーゼ の特異性を研究した。 この酵素はホスホリパーゼ中の１−位を明瞭に加水分解する（表７）が、Ｌｅ ｃｉｔａｓｅ（商標）（ブタ膵臓のＰＬＡ₂）は期待されるようにこの基質に対 して活性を示さなかった。 本発明のフザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ）のホスホリパーゼのＣ−末端のアミノ酸配列 組換え的に発現された成熟ホスホリパーゼのタンパク質のＮ−末端のアミノ酸 配列を実施例３に記載するように決定し、そしてこのＮ−末端の配列は非組換え 的に生産され、精製された酵素（実施例 ３参照）について決定された配列と同一であると確証された。 Ｃｈｒｉｓｔｇａｕ他、「Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．」３１９、７０５−７１２、 １９９６に記載されているように、ＶＧＴｏｆＳｐｅｃ質量分析計（Ｍｉｃｒｏ ｍａｓｓ、英国マンチェスター）を使用して、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦの質量分析を 実施した。 バックグラウンド ＤＮＡ配列から推定された、フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）のホスホリパーゼのＮ−末端のアミノ酸配列は、成熟ホ スホリパーゼの既知のＮ−末端のアミノ酸配列と組み合わせて、３１５アミノ酸 残基のタンパク質（配列番号：２中のアミノ酸３１−３４６）を予知する。この 予測されるタンパク質の理論的分子量は３３，２５６．８Ｄａである。 ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦの質量分析を使用して、我々はフザリウム・オキシスポラ ム（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）からの真性のリパーゼ／ホスホリパーゼの分子量 が２８．２ｋＤａ（データは示されていない）であると以前に測定し、そしてＳ ＤＳ−ＰＡＧＥ上で、分子量は２９〜３０ｋＤａ（上を参照）であることが示さ れた。 真性および組換えのフザリウム・オキシスポラム（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ） のリパーゼのＮ−末端のアミノ酸配列は同一であるので、予測された分子量と実 験の分子量との間の差はＣ−末端のプロセシングにより引き起こされるようであ る。 これを研究するために、我々はアスペルギルス・オリゼ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ） において発現された組換えフザリウム・オキシスポラム（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕ ｍ）のリパーゼからＣ−末端のペプチドを単離し、そのＣ−末端を通してそれを 配列決定した。 戦略 ２８．２ｋＤａのフザリウム・オキシスポラム（Ｆ．ｏｘｙｓｐ ｏｒｕｍ）からの真性のリパーゼ／ホスホリパーゼの平均分子量を使用して、最 も期待できそうなＣ−末端の残基を予測することができ、これはＳｅｒ３０３で あると判明する（配列番号：２）。 この推定は、酵素がグリコシル化されていないという仮定に基づく。Ａｓｎ１ ６３において配列の中に見出された単一の潜在的Ｎ−グリコシル化部位は、Ｐｒ ｏ残基が位置１６４に見出されるので、多分使用されない。Ｎ−グリコシル化の ためのコンセンサス配列（Ａｓｎ−Ｘａａ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）中の第２残基とし てのＰｒｏ残基の存在は、決して報告されていない。さらに、質量スペクトル中 のピークの形状はグリコシル化を示さない。しかしながら、このピークは相同タ ンパク質について通常直面するピークよりも広く、サイズの異質性の可能性を示 す。この酵素のＮ−末端はよく定められているので、サイズの異質性は異種Ｃ− 末端のプロセシングにその基礎を有することが最も期待される。 配列番号：２（下記を参照のこと）を検査すると、予測されるＣ−末端は配列 中の８つのＣｙｓ残基の最後に密接して位置することが明らかになる。これらの Ｃｙｓ残基上に放射性標識を導入すると、Ｃｙｓ残基を含有するペプチドをペプ チド精製により追跡することが容易となる。放射性標識化と、Ａｓｐ残基の前に おいて切断するＡｓｐ−Ｎプロテアーゼを使用するタンパク質分解とを組合わせ ると、標識化Ｃ−末端のペプチドが生ずる。さらに、３つの内部のペプチドが標 識化されるであろう。すべての標識化ペプチドを配列決定すると、酵素のＣ−末 端が明らかとなるであろう。配列番号：２：フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏ ｒｕｍ）のリパーゼ／ホスホリパーゼの予測されたアミノ酸配列 配列はＤＮＡ配列から推定され、真性および組換えの双方の酵素について実験 的に決定されたＮ−末端において開始する。８つのＣ 量分析から予測されたＣ−末端のＳｅｒ残基は↑で示されている。Ｎ−グリコシ ル化のためのコンセンサス配列（ＮＸＳ／Ｔ）の中に見出されるＡｓｎ残基は（ ◇）で示されているが、ＸはＰｒｏ残基であるので、すべての確度において使用 されていない。 実験結果 実施例は、配列番号：２に示すアミノ酸配列を有するフザリウム・オキシスポ ラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）からのＰＬであった。 バッチＦ−９７００９８９、ＯＤ₂₈₀ ０．８３（０．６９ｍｇ／ｍｌ）、純 度＞９５％（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）。 前述したように、酵素を組換え的に発現させ、精製した。 酵素を変性し、ジスルフィド結合を還元した後、チオール基をＩ［１−１４Ｃ ］ＣＨ₂ＣＯＮＨ₂と反応させた。 Ｃｙｓ残基の放射性標識化後、リパーゼをＡｓｐ−Ｎプロテアーゼを使用して 分解した。 発生したペプチドを逆相ＨＰＬＣにより分画した。収集した画分をＭＡＬＤＩ −ＴＯＦ質量分析し、シンチレーションカウンティングに付した。有意な量の反 応性を含有する画分を、逆相ＨＰＬＣによる再精製のための選択した。 再精製した画分をシンチレーションカウンティングに付し、引き続いて放射性 を含有する画分を配列決定した。 結果の要約を下に記載する。このスキームは、記載する多数の配列のために、 混沌しているように見えることがある。しかしながら、このスキームは放射性画 分から得られた配列のデータのすべてを含有し、したがって、引き出された結論 のための基礎を表す。すべてのＣｙｓ残基は配列決定を通してカバーされている ことに注意すべきである；それらの大部分は１回より大きくカバーされている。 注意すべき他の事柄は、多数の小さい放射性的に標識化されたペプチドを生ずる ように見られる異常な切断である。 放射性標識化されたペプチドの配列決定により得られたアミノ酸配列は、組換 えフザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）酵素から誘導された。これらの配列は、ＤＮＡ配列から推 定された、予測されたアミノ酸に対して整列された。８つのＣｙｓ残基は で示 されているが、真性酵素のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析から予測されたＣ−末端 のＳｅｒ残基は↑で示されている。 実験の結論 すべての放射性標識化されたペプチドの配列決定から、ＤＮＡにおいてコード されたアミノ酸のＣ−末端部分はフザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕ ｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）からのリパーゼの発現の間にプロセシングされること が明らかである。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析からの結果に従い、ペプチドの配 列は最も期待できそうなＣ−末端の残基としてＳｅｒ３０３を指示する。 しかしながら、データに基づいて、示差的Ｃ−末端のプロセシングが起こって 異種Ｃ−末端に導くことは除外することができない；例えば、１つのペプチドは Ｐｈｅ２７２が、Ｃ−末端の残基としても見出されうることを示す。 実施例１０ 食用油の酵素的脱ガム化についてのアッセイの一般的説明 酵素的脱ガム化を実施する装置 この装置は１リットルのジャケット付き鋼製反応器から成り、鋼製蓋、プロペ ラ（６００ｒｐｍ）、そらせ板、温度センサー、上部における入口管、上部にお ける還流冷却器（４℃）、および下部における出口管を装備する。反応器のジャ ケットはサーモスタット浴に接続されている。出口管はシリコーン管を介してシ ルバーソン（Ｓｉｌｖｅｒｓｏｎ）インラインミキサーヘッドに接続されており 、ミキサーヘッドはシルバーソンＬ４ＲＴ高剪断ラブミキサー（８５００ｒｐｍ 、流速、約１．１リットル／分）により駆動される「 正方形の孔の高剪断スクリーン」を装備する。ミキサーヘッドは冷却コイル（５ 〜１０℃）および出口管を装備し、出口管はシリコーン管を介して反応器の入口 管に接続されている。温度センサーを、ミキサーヘッドの直後において、シリコ ーン管の中に挿入されている。反応器／ミキサーヘッドのシステムからの雰囲気 への唯一の接続は、還流冷却器を通してである。 酵素的脱ガム化を実施する一般的手順 すべての冷却およびサーモスタット装置を始動させる。次いで０．６リットル （約５６０ｇ）の油を反応器の中に入れ、これを特定の実験のために必要な温度 付近にする。ラブミキサーを始動させ、これにより油は反応器からミキサーヘッ ドに行き、反応器に戻るように循環し始める。このシステムを約１０分間平衡化 させ、その間に温度を微細に調節する。前処理期間は２７ｇのＭｉｌｌｉＱ水中 の０．６ｇ（２．８６ｍｍｏｌ）のクエン酸一水和物の添加とともに開始する（ 添加された水／油＝４．８％ｗ／ｗ；水相中の［クエン酸］＝１０６ｍＭ、水／ 油エマルジョン中の［クエン酸］＝４．６ｍＭ）、ここでｔ＝０に設定する。ｔ ＝３０分において、適当な量の４ＭのＮａＯＨ溶液を添加する。 ０．０当量の４ＭのＮａＯＨ →ｐＨ３．７ １．０当量の４ＭのＮａＯＨ（０．７１４ｍｌ） →ｐＨ４．５ １．５当量の４ＭのＮａＯＨ（１．０７ｍｌ） →ｐＨ５．０ ２．０当量の４ＭのＮａＯＨ（１．４３ｍｌ） →ｐＨ５．５ ２．５当量の４ＭのＮａＯＨ（１．７９ｍｌ） →ｐＨ６．２ ３．０当量の４ＭのＮａＯＨ（２．１４ｍｌ） →ｐＨ８．０ ｔ＝３５分において、試料をＰ−分析およびpHの測定のために抜き出す。この 直後に、必要な量の酵素溶液を添加する（前処理期間の終わり）。Ｐ−分析およ びｐＨの測定のための試料をｔ＝１、 ２、３．５、５、６時間に抜き出し、次いで反応を停止させる。 反応器／ミキサーのシステムを空にし、２×５００ｍｌの１０％のＤｅｃｏｎ ｅｓ／ＤＩ水溶液ですすぎ、最小３×５００ｍｌのＤＩ水ですすぐ。反応器の間 の種々の添加およびサンプリングを表８に表す。 表８．酵素的脱ガム化のためのスケジュールリンの分析： Ｐ−分析のためにサンプリング： １０ｍｌの油中水型エマルジョンをガラス製遠心機の中に取る。沸騰水浴中で エマルジョンを３０分間加熱する。５０００ｒｐｍにおいて１０分間遠心する。 ８ｍｌの上方の（油）相を１２ｍｌのポリスチレン管に移し、１２〜２４時間放 置する（沈降させる）。沈 降後、約１〜２ｇを上方の透明相からＰ−分析のために抜き出す。 「Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｏｉｌｓ、Ｆａｔｓ、ａｎｄ Ｄｅｒｖａｔｉｖｅｓ」、第７版（１９８ ７）の手順２．４２１に従い、Ｐ−分析を実施した：１００ｍｇのＭｇＯ（ｌｅ ｉｃｈｔ、Ｍｅｒｃｋ＃５８６２）を磁器の皿の中で秤量し、ガスバーナーで加 熱する。１〜２ｇの油を添加し、ガスバーナーで強熱して、黒色の固い塊にする 。ベクスター（Ｖｅｃｓｔａｒ）炉中で８５０℃に２時間加熱して、白色の灰を 得る。灰を５ｍｌの６ＭのＨＮＯ₃の中に溶解し、２０ｍｌの試薬混合物を添加 する。４６０ｎｍにおける吸収を測定する（ゼロ調節のためにブランク（５ｍｌ のＨＮＯ₃＋２０ｍｌの試薬混合物）を使用する）。検量線を使用して計算する 。 ｐＨの測定 ２ｍｌの油中水型エマルジョンを取り、２ｍｌのＭｉｌｌｉＱ水と混合する。 相分離後、上部の油層をピペットで除去する。水性相中のｐＨをｐＨ電極オリオ ン（Ｏｒｉｏｎ）で測定する。測定値を下記式により「現実の（ｒｅａｌ）」ｐ Ｈ値に変換する： ｐＨ（真の）＝ｐＨ（測定）−０．３８ ２７ｇのＤＩ水の中に０．６ｇのクエン酸一水和物を溶解することによって、 検量線を作成した；この溶液のｐＨをｐＨ電極オリオンにより測定した〔ｐＨ（ 真の）〕。１００μｌを２ｍｌのＭｉｌｌｉＱ水と混合し、この溶液のｐＨをｐ Ｈ電極オリオンにより測定した〔ｐＨ（測定）〕。ＮａＯＨ溶液の添加により、 クエン酸溶液のｐＨを徐々に変化させ、各調節のために、希釈およびｐＨの測定 を前述したように実施した。 実施例１１ Ｌｅｃｉｔａｓｅ（商標）のために最適な脱ガム化条件 実施例１０に記載するように、食用油の脱ガム化に関するすべての実験を実施 した。 油： アアルフス・オリエファブリク（Ａａｒｈｕｓ Ｏｌｉｅｆａｂｒｉｋ、デン マーク国）からの水−脱ガム化されたナタネ油（Ｃｏｌｚｒｏ）。 バッチＣ００７３０／Ｂ０１２００、９ｋｇ、Ｐ含量１８６ｐｐｍ（０．４７ ％のホスファチド）。 この油は商業的に入手可能な製品ではなく、工場における生産ラインから直接 取る。 酵素： Ｌｅｃｉｔａｓｅ（商標）１０Ｌ。 バッチＬ６４６−Ｄ０２（１０１９０Ｕ／ｍｌ）、推定濃度２０ｍｇ／ｍｌ。 Ｌｅｃｉｔａｓｅ（商標）を使用する１連のパラメーター最適化実験のための特 定の条件を表９に記載する。標準的条件は次の通りである：酵素の投与量５３５ Ｕ／ｋｇ油（１．１ｍｇ／ｋｇ油）、６０℃、２．０当量のＮａＯＨ（ｐＨ５． ５）。酵素の投与量を２６８から１０７０Ｕ／ｋｇ油まで変化させ、温度を４０ ℃から７０℃まで変化させ、そして表９に示す種々のｐＨレベルに対応してＮａ ＯＨの添加量を１．０から３．０当量まで変化させた。 表９．Ｌｅｃｉｔａｓｅ（商標）の最適化のための特定の条件＊ｔ＝３５分〜６時間のｐＨ。この時間内に、すべてのｐＨの測定値は狭いウイ ンドウ内に存在する。これを下記の実施例１３においてさらに例示する。 別々の最適化研究を表１０に表す。 表１０における結果は、下記の事柄を示す： ｉ） 投与量／応答の研究から、最適な酵素の投与量（６０℃および２．０当 量のＮａＯＨにおいて）は約５３５Ｕ／ｋｇ油であることが理解される。半分の 投与量は脱カム化時間を約３．５時間から６時間に増加させ、そして２倍の投与 量は脱ガム化の性能にほぼ変化をなんら引き起こさない。酵素のブランクの結果 を比較のために挿入した。 ｉｉ） 最適なＮａＯＨの添加量は約２．０当量である（ｐＨ約５．５）、悪 い性能は１．０当量（ｐＨ約４．５）および３．０当量（ｐＨ約８）である。 ｉｉｉ） 最適な温度は約６０℃である。なぜなら、７０℃はＰのレベルを完 全には低下させず、５０℃は脱ガム化時間を約３．５時間から６時間に増加し、 そして４０℃は悪い性能を与えるからである。 表１０：Ｌｅｃｉｔａｓｅ（商標）の脱ガム化条件の最適化の結果 ¹示した時間（時）における油相中のリン含量（ｐｐｍ）。 実施例１２ 本発明によるフザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒ ｕｍ）のホスホリパーゼについての最適な脱ガム化条件 実施例１０に記載するように、食用油の実験のすべての酵素的脱ガム化を実施 した。 油： アアルフス・オリエファブリク（Ａａｒｈｕｓ Ｏｌｉｅｆａｂｒｉｋ、デン マーク国）からの水−脱ガム化されたナタネ油（Ｃｏｌｚｒｏ）。 バッチＣ００７３０／Ｂ０１２０８、Ｐ含量約２００ｐｐｍ バッチＣ００７３０／Ｂ０１２０９、Ｐ含量約２００ｐｐｍ バッチＣ００７３０／Ｂ０１４２９、Ｐ含量２２７ｐｐｍ バッチＣ００７３０／Ｂ０１４３０、Ｐ含量２５２ｐｐｍ この油は商業的に入手可能な製品ではなく、工場における生産ラインから直接 取る。酵素： 配列番号：２に示すアミノ酸配列を有するフザリウム・オキシスポラム（Ｆｕ ｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）からのＰＬ。 バッチＦ−９７００１２３、ＯＤ₂₈₀１．４８、純度約５８％、推定濃度０． ９ｍｇ／ｍｌ。 前述したように、酵素を組換え的に発現させ、精製した。 フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）から のＰＬを使用する１連のパラメーター最適化実験のための特定の条件を表１１に 記載する。標準的条件は次の通りである：酵素の投与量１．６ｍｇ／ｋｇ油、４ ０℃、１．５当量のＮａＯＨ（ｐＨ約５．５）。酵素の投与量を０．２から１． ６ｍｇ／ｋｇ油まで変化させ、温度を３０℃から５０°Ｃまで変化させ、そして 表１１に示す種々のｐＨレベルに対応してＮａＯＨの添加量を１．０から２．５ 当量まで変化させた。 表１１．フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕ ｍ）からのＰＬの最適化のための特定の条件 実験結果を下記表１２に表す。時間のウインドウ３５分〜６時間におけるｐＨ の偏りのすべては、期待した間隔の範囲内に入り、わずかの不規則性を伴う。 要約すると、表１２における結果は下記の事柄を示す： ｉ） 投与量／応答の研究から、最適な酵素の投与量（４０℃および１．５当 量のＮａＯＨにおいて）は約０．８ｍｇ／ｋｇ油であることが理解される。 ｉｉ） 最適なＮａＯＨの添加量は約１．５当量である（ｐＨ約５．０）、性 能の非発揮１．０当量（ｐＨ約４．５）および；制限された性能２．０当量（ｐ Ｈ約５．５）および２．５当量（ｐＨ約６．２）、そして ｉｉｉ） 最適な温度は約４５℃であり、そして５０℃は制限された性能を与 える。 表１２．フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕ ｍ）の脱ガム化条件の最適化の結果 ¹示した時間（時）における油相中のリン含量（ｐｐｍ）。 実施例１３ 酵素的脱ガム化プロセスの間の標準的ｐＨの偏りの例示 実施例１０に記載するように実施した酵素的脱ガム化プロセスの間のｐＨの偏 りの平均的例を、下記表１３に示す。 Ｌｅｃｉｔａｓｅ（商標）を使用して実験を実施する。それ以上の詳細につい ては、実施例１１を参照のこと。 表１３．ｔ＝３５分から６時間までのｐＨ値 本明細書において開示する酵素的脱ガム化実験の実施例においてそれ以上述べ ない場合、前記実験における標準的ｐＨの偏りは上記表に示す通りであった。 実施例１４ Ｌｅｃｉｔａｓｅ（商標）および本発明によるフザリウム・オキシスポラム（Ｆ ｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）からのホスホリパーゼの酵素的脱ガム化 能力の比較 第２図において、上記実施例１１および１２において測定した、それぞれの最 適条件下ににおけるＰＬからの結果を示す。 第２図に示す実験条件： Ｌｅｃｉｔａｓｅ（商標）：６０℃、ｐＨ５．５（２．０当量のＮａＯＨ）、 および１ｍｇの酵素／ｋｇの油（約５３５Ｕ）（実験＃９）。 フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）のＰ Ｌ：４０℃、ｐＨ５．０（１．５当量のＮａＯＨ）、および０．８ｍｇの酵素／ ｋｇの油（実験＃３３）。 フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏ ｒｕｍ）のＰＬ：４５℃、ｐＨ５．０（１．５当量のＮａＯＨ）、および１．６ ｍｇの酵素／ｋｇの油（実験＃６４）。 明らかなように、フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓ ｐｏｒｕｍ）からのＰＬは、Ｌｅｃｉｔａｓｅ（商標）に比較して、非常に速い 脱ガム化作用を与える。 本発明によるフザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）からのＰＬは、酵素と油との２ ５分の接触後、ほとんど完全な脱ガム化を与える。 実施例１５ 異なる型の食用油の中に存在する非水和性リン脂質の定量 油： アルフス・オリエファブリク（Åｒｈｕｓ Ｏｌｉｅｆａｂｒｉｋ）（ＡＯＭ ）、デンマーク国、からの粗製ナタネ油。バッチＣＯ０７４５／ＢＯ１１４６、 Ｐ含量６０９ｐｐｍ。このバッチは固体残留物を含有する。 スカノラ（Ｓｃａｎｏｌａ）（デンマーク国）からの粗製ナタネ油。バッチＣ ００７４５／Ｂ０１５９３、Ｐ含量３１５ｐｐｍ。 濾過した粗製ナタネ油。濾過したバッチＣ００７４５／Ｂ０１１４６、Ｐ含量 ２３１ｐｐｍ。この油は上記バッチＣ００７４５／Ｂ０１１４６（６０９ｐｐｍ ）を１００μｍのジョンソン（Ｊｏｈｎｓｏｎ）フィルターを通して濾過した油 である。 アルフス・オリエファブリク（Åｒｈｕｓ Ｏｌｉｅｆａｂｒｉｋ）（ＡＯＭ ）、デンマーク国、からの粗製ナタネ油。バッチＣ００７４５／Ｂ０１７００、 Ｐ含量４５９ｐｐｍ。 ルルギ（Ｌｕｒｇｉ）、ドイツ国、からのナタネ油。バッチＣ００９３２／Ｂ ０１３８１、Ｐ含量１４８ｐｐｍ。 アルフス・オリエファブリク（Åｒｈｕｓ Ｏｌｉｅｆａｂｒｉｋ）、デンマ ーク国、からの粗製大豆油。バッチＣ００７４４／Ｂ ０１１４５、Ｐ含量５９３ｐｐｍ。 上記実施例１０に記載するように水中のクエン酸−水和物を含んでなる溶液で 油を前処理することによって、上に示した異なる型の食用油の中に存在する非水 和性リン脂質の定量を実施した。 簡単に述べると、前処理プロセスは下記の工程からなる： ｉ） ６０℃において、水中のクエン酸−水和物を含んでなる溶液の添加（添 加された水／油＝４．８％ｗ／ｗ；水相中の［クエン酸］＝１０６ｍＭ、水／油 エマルジョン中の［クエン酸］＝４．６ｍＭ）により、前記食用油を３０分間前 処理し、 ｉｉ） １０ｍｌの前処理された油中水型エマルジョンを管に移し、 ｉｉｉ） 前記エマルジョンを沸騰する水浴中で３０分間加熱し、 ｉｖ） ５０００ｒｐｍにおいて１０分間遠心し、 ｖ） 約８ｍｌの上（油）相を新しい管に移し、それを２４時間沈降させ、 沈降後、上方の透明な相から２ｇを抜き出して、食用油中の非水和性リン含量（ ｐｐｍ）を測定する。ｐｐｍ値を上記実施例１０に記載するように測定した。 このプロセス後、上に示した異なる型の食用油の中に存在する非水和性リン脂 質の量は、下記の通りであった： ＡＯＭからの粗製ナタネ油＃１１４６は、部分的に高いＰレベル（６０９ｐｐ ｍ）の原因となる固体の粒子を含有する；１００μｍのジョンソン篩を通す濾過 は２３１ｐｐｍのＰ含量を有する透明な油を与える。 粗製油および濾過した油の前処理は１４０ｐｐｍのＰレベルを与え、これは油 の中に存在する非水和性リン脂質の測定である； スカノラからの粗製ナタネ油のリン脂質含量は、前処理により３１５ｐｐｍか ら約３０ｐｐｍに減少した； ルルギから入手したナタネ油（多分粗製油と完全に精製された油との任意の混 合物）のリン脂質含量は、前処理プロセスにより６０ｐｐｍに減少した； ＡＯＭからの粗製ナタネ油＃１７１０の前処理は、Ｐ含量を４５９ｐｐｍから ２００〜２５０ｐｐｍに減少した； ＡＯＭからの粗製大豆油＃１１４５では、前処理はＰレベルを５９３ｐｐｍか ら１０ｐｐｍに減少した。この大豆油は、水−脱ガム化／クエン酸塩の処理単独 により脱ガム化することができる油の１例を構成する。前処理後のこの粗製大豆 油への酵素の添加は、Ｐ含量をそれ以上減少しなかった。 これらのデータが示唆するように、粗製ナタネ油のリン脂質の組成（水和性／ 非水和性リン脂質）は１つのバッチから他のバッチに対して大きく変化し、結局 酵素的脱ガム化されたナタネ油中の残留するリン脂質のレベルは広い範囲（３０ ｐｐｍ（スカノラ）から２００〜２５０ｐｐｍ（ＡＯＭ）まで）にわたって変化 するであろう。 酵素的脱ガム化について、最適な酵素の投与量は脱ガム化または前処理後に存 在する非水和性リン脂質の量に依存する。 さらに、油の中に存在する非水和性リン脂質の量が高くなるほど、酵素的脱ガ ム化法はいっそう有効である。 これはまた下記の実施例１６において例示されており、ここで本発明は約１４ ０ｐｐｍの非水和性リン脂質のレベルを有する、粗製ナタネ油＃１１４６の酵素 的脱ガム化を示す。 実施例１６ 粗製ナタネ食用油の脱ガム化（Ｉ） 上記実施例１０に記載する「酵素的脱ガム化を実施する一般的手順」に従い、 実験ＡおよびＢを実施した。 油： アルフス・オリエファブリク（Åｒｈｕｓ Ｏｌｉｅｆａｂｒｉｋ）（ＡＯＭ ）、デンマーク国、からの粗製ナタネ油。バッチＣ００７４５／Ｂ０１１４６、 Ｐ含量６０９ｐｐｍ。このバッチは固体残留物を含有する。 酵素： Ｌｅｃｉｔａｓｅ（商標）１０Ｌ。 バッチＬ６４６−Ｆ０２（１０１９０Ｕ／ｍｌ）、推定濃度２０ｍｇ／ｍｌ。 配列番号：２に示すアミノ酸配列を有するフザリウム・オキシスポラム（Ｆｕ ｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）からのＰＬ。 バッチＦ−９７００１２３、ＯＤ₂₈₀１．４８、純度約５８％、推定濃度０． ９ｍｇ／ｍｌ。 この酵素は、前述したように、組換え的に発現させ、精製した。実験Ａ（参照） ０．６リットル（５８０ｇ）の粗製ナタネ油を装置に入れ、６０℃に加熱する 。ｔ＝３０分において、１．４３ｍｌ（５．７ｍｍｏｌ）の４ＭのＮａＯＨ溶液 を添加し、これによりｐＨは約５．６となる。ｔ＝３５分において、３０μｌ（ ３００単位）のＬｅｃｉｔａｓｅ １０Ｌ（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ Ａ／Ｓ から入手した）を添加する。遠心後の油相中の測定したリン含量ならびに水性相 中のｐＨ値を表１４に示す。 表１４．Ｌｅｃｉｔａｓｅ（商標）を使用する粗製ナタネ油の脱ガム化からの 結果 実験Ｂ ０．６リットル（５８１ｇ）の粗製ナタネ油を装置に入れ、４０℃に加熱する 。ｔ＝３０分において、１．０７ｍｌ（４．３ｍｍｏｌ）の４ＭのＮａＯＨ溶液 を添加し、これによりｐＨは約５．４となる。ｔ＝３５分において、１ｍｌ（０ ．９ｍｇ）のフザリウム・オキシスポラム（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）からのホ スホリパーゼを添加する。遠心後の油相中の測定したリン含量ならびに水性相中 のｐＨ値を表１５に示す。 表１５．フザリウム・オキシスポラム（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）からのホス ホリパーゼを使用する粗製ナタネ油の脱ガム化からの結果 実施例１７ 粗製ナタネ食用油の脱ガム化（ＩＩ） 上記実施例１０に記載する「酵素的脱ガム化を実施する一般的手順」に従い、 実験ＡおよびＢを実施した。 油： アルフス・オリエファブリク（Åｒｈｕｓ Ｏｌｉｅｆａｂｒｉｋ）（ＡＯＭ ）、デンマーク国、からの粗製ナタネ油。バッチＣ００７４５／Ｂ０４７１０、 Ｐ含量４５９ｐｐｍ。 酵素： Ｌｅｃｉｔａｓｅ（商標）１０Ｌ。 バッチＬ６４６−Ｆ０２（１０１９０Ｕ／ｍｌ）、推定濃度２０ｍｇ／ｍｌ。 配列番号：２に示すアミノ酸配列を有するフザリウム・オキシスポラム（Ｆｕ ｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）からのＰＬ。 バッチＦ−９７００４７６、ＯＤ₂₈₀０．８、純度約５８％、推定濃度０．４ ５ｍｇ／ｍｌ。 この酵素は、前述したように、組換え的に発現させ、精製した。実験Ａ ０．６リットル（５８０ｇ）の粗製ナタネ油を装置に入れ、６０℃に加熱する 。ｔ＝３０分において、１．４３ｍｌ（５．７ｍｍｏｌ）の４ＭのＮａＯＨ溶液 を添加し、これによりｐＨは約５．６となる。ｔ＝３５分において、適当な量（ 例えば、１ｍｇの酵素／ｋｇの油について５０μｌ（５００単位））のＬｅｃｉ ｔａｓｅ １０Ｌ（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ Ａ／Ｓから入手した）を添加す る。遠心後の油相中の測定したリン含量ならびに水性相中のリン含量を表１６に 示す。 表１６．Ｌｅｃｉｔａｓｅを使用する粗製ナタネ油の脱ガム化からの結果 実験Ｂ ０．６リットル（５８１ｇ）の粗製ナタネ油を装置に入れ、４０ ℃に加熱する。ｔ＝３０分において、１．０７ｍｌ（４．３ｍｍｏｌ）の４Ｍの ＮａＯＨ溶液を添加し、これによりｐＨは約５．０となる。ｔ＝３５分において 、適当な量（すなわち、１．６ｍｇの酵素／ｋｇ、および３．２ｍｇの酵素／ｋ ｇの油））のフザリウム・オキシスポラム（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）からのホ スホリパーゼを添加する。遠心後の油相中の測定したリン含量ならびに水性相中 のリン含量表１７に示す。 表１７．フザリウム・オキシスポラム（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）からのホス ホリパーゼを使用する粗製ナタネ油の脱ガム化からの結果 要約すると、結果は下記の事実を示す：Ｌｅｃｉｔａｓｅ、６０℃、ｐＨ５．５ 酵素の投与量を１．０から３．０ｍｇ／ｋｇ油まで変化させた。結果を上記表 １６に記載する。１．０ｍｇ／ｋｇ油において、油の脱ガム化は遅く、６時間に おいて約２０ｐｐｍを与えた。高い酵素の投与量では、脱ガム化の性能は改良さ れ、３．０ｍｇの酵素／ｋ ｇ油を使用して約３．５時間において１０ｐｐｍのリン含量を与えた。 より高い酵素の投与量を使用する場合、性能はさらに改良されることが仮定さ れる。フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）のＰＬ 、４５℃、ｐＨ５．０ 酵素の投与量１．６および３．２ｍｇ／ｋｇ油を試験し、性能は等しくすぐれ ることが見出された（上記表１７）。１．６ｍｇの酵素／ｋｇ油−または多分こ れより低い−では、きわめてすぐれた脱ガム化が約２時間において観測され、９ ｐｐｍのＰを与えた。なおより低い量のフザリウム・オキシスポラム（Ｆ．ｏｘ ｙｓｐｏｒｕｍ）のホスホリパーゼ（例えば、０．９ｍｇ／ｋｇ油）を使用する ことができ、なおすぐれた脱ガム化性能が得られることが予測される。 実施例１８ フザリウム・クルモラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｕｌｍｏｒｕｍ）から得られる ホスホリパーゼ調製物を使用する水脱ガム化された食用油の脱ガム化 上記実施例１０に記載する「酵素的脱ガム化を実施する一般的手順」に従い、 実験を実施した。 油： アルフス・オリエファブリク（Åｒｈｕｓ Ｏｌｉｅｆａｂｒｉｋ）（ＡＯＭ ）からの水−脱ガム化されたナタネ油。 バッチＣ００７３０／Ｂ０１７００、Ｐ含量２３１ｐｐｍ。 酵素： フザリウム・クルモラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｕｌｍｏｒｕｍ）から発酵ブ ロス。 フザリウム・クルモラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｕｌｍｏｒｕｍ）株を培養し 、遠心し、そして上清を後述するように精製した。 フザリウム・クルモラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｕｌｍｏｒｕｍ）ＣＢＳ５１ ３．９４株（寄託日：１９９４年１０月２５日）の種培養物を、１００ｍｌの下 記の組成物を含有する５００ｍｌの震盪フラスコ中の生産した： コーンスティープリカー（乾燥） １２ｇ／ｌ グルコース ２４ｇ／ｌ 各フラスコに０．５ｇのＣａＣＯ₃および０．５ｍｌの油を添加する 。 ｐＨを５．５に調節した後、オートクレーブ処理する。 ２６℃および２５０ｒｐｍにおいて３日後、５ｍｌの種培養物の各々を１００ ｍｌの下記の培地を含有する震盪フラスコの中に接種した： ペプトン、Ｄｉｆｃｏ ０１１８ ６ｇ／ｌ ペプチカーゼ、Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ４ｇ／ｌ 酵母エキス、Ｄｉｆｃｏ ０１２７ ３ｇ／ｌ 肉エキス、Ｄｉｆｃｏ ０１２６ １．５ｇ／ｌ デキストロース、Ｒｏｑｕｅｔｔｅ １０１−０４４１ １ｇ／ｌ オリーブ油、Ｓｉｇｍａ １０ｇ／ｌ ｐＨを７．３〜７．４に調節した後、オートクレーブ処理する。 ２６℃および２５０ｒｐｍにおいて９日間培養する。ブロスを遠心し、濾過（ ０．４５μｍ）し、上清を収集し、下に示す脱ガム化実験のために供給する。 推定された活性：２００ＰＨＬＵ／ｍｌ。 実験：フザリウム・クルモラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｕｌｍｏｒｕｍ）から 得られたホスホリパーゼ調製物を使用する水脱ガム化された油の酵素的脱ガム化 ０．６リットル（５８１ｇ）の粗製ナタネ油を装置に入れ、４０℃に加熱する 。ｔ＝３０分において、１．４３ｍｌ（５．７ｍｍｏｌ）の４ＭのＮａＯＨ溶液 を添加し、これによりｐＨは約５．５となる。ｔ＝３５分において、適当な量（ すなわち、１０７０ＰＨＬＵ／ｋｇ油）のフザリウム・クルモラム（Ｆ．ｃｕｌ ｍｏｒｕｍ）からのホスホリパーゼを添加する。遠心後の油相中の測定したリン 含量ならびに水性相中のリン含量表１８に示す。 表１８．フザリウム・クルモラム（Ｆ．ｃｕｌｍｏｒｕｍ）からのホスホリパ ーゼを使用する粗製ナタネ油の脱ガム化からの結果 実施例１９ デゴマ（Ｄｅｇｏｍｍａ）ＶＯＤを使用する粗製油の酵素的脱ガム化 油 粗製ナタネ油Ｃ００７４５／Ｂ０１７００、Ｐ含量４５９ｐｐｍ 酵素 商業的に入手可能なホスホリパーゼ、デゴマ（Ｄｅｇｏｍｍａ） ０．６リットル（５８１ｇ）の粗製ナタネ油を装置に入れ、５０℃に加熱する 。ｔ＝３０分において、０．７１４ｍｌ（２．８６ｍｍｏｌ）の４ＭのＮａＯＨ 溶液を添加し、これによりｐＨは約４．５となる。ｔ＝３５分において、適当な 量（すなわち、３．６ｍｇ／ｋｇ油、または７．１ｍｇ／ｋｇ油）の精製された デゴマ（Ｄｅｇｏｍｍａ）ＶＯＤホスホリパーゼを添加する。遠心後の油相中の 測定したリン含量ならびに水性相中のリン含量表１９に示す。 表１９． この実施例が例示するように、デゴマ（Ｄｅｇｏｍｍａ）ＶＯＤは食用油を脱 ガム化することができる。しかしながら、前記油の満足すべき脱ガム化を得るた めには、本発明のフザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）のホスホリパーゼに比較して 、比較的高い量のデゴマ（ Ｄｅｇｏｍｍａ）ＶＯＤを必要とする。比較のため、例えば、実施例１６および １７を参照。 実施例２０ パン改良剤としてのフザリウム・オキシスポラム（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）か ら得られたホスホリパーゼの使用 材料および方法 パンの製造 ヨーロッパのストレートの練り粉パンおよびロールを下記の基本的処方から製 造した： 基本的処方 小麦粉（Ｍｅｎｅｂａ ＢＢＺ） １００％（２０００ｇ） 水 ６１％ 酵母 ４％ 塩 １．５％ 砂糖 １．５％ アスコルビン酸 ４０ｐｐｍ ベーキング手順 混合（スパイラルミキサー）、６２５ＲＰＭ ３分 混合（スパイラルミキサー）、１２５０ＲＰＭ ３．５分 練り粉の評価 ７分 発酵（室温） １５分 シーティング／成形 ３分 室温における緩和 ５分 フォルディング ２分 室温における緩和 ５分 シーティング／成形／パンニング ２分 プルーフィング（３２℃、８２％の相対湿度） ロール： ４５分 パンニングされたパン： ５５分 ベーキング（２３０℃） ロール ２２分 パンニングされたパン： ３５分 練り粉および焼かれた製品の評価 練り粉および焼かれた製品の性質を下記のようにして測定した： 比体積指数：パンの一塊またはロールの体積を、伝統的ナタネ置換方法により 測定する。比体積をパン１ｇ当たりの体積ｍｌとして計算する。対照（酵素を含 まない）の比体積を１００として定義する。相対比体積指数を下記のように計算 する： 比体積指数＝（パンの一塊の比体積）／（対照のパンの一塊の比体積）×１０ ０ 下記の目盛りに従い、練り粉の粘着性をマニュアルで評価する： ロールの直立性 非常にフラット １ フラット ２ 正常 ３ すぐれる／丸い ４ 非常にすぐれる ５ 丸過ぎる ６ 結果 ＊ベーキングのための商用レシチン調製物（Ｓｕｐｅｒｆｏｓ、デンマーク国） 。 レシチンを含有しない処方において、ロールおよびパンニングされたパンの双 方に対して、フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒ ｕｍ）のホスホリパーゼは明瞭に体積を増加することを、結果は示す。処方にレ シチンを添加する場合、なおいっそうすぐれた効果が得られるが、レシチンは体 積それ自体に寄与しない。スタトグラフィックス・プラス（Ｓｔａｔｇｒａｐｈ ｉｃｓ Ｐｌｕｓ）において実施された、統計学的解析（ＡＮＯＶＡ、α＝０． ０５）は、ホスホリパーゼとレシチンとの間の有意な陽性の相乗性を示す。 処方におけるレシチンの存在および非存在の双方において、フザリウム・オキ シスポラム（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）のホスホリパーゼを使用して、有意に改 良されたロールの形状（ロールの直立性）が得られる。この実施例において、レ シチンとホスホリパーゼ（１５００ＬＵ／ｋｇ小麦粉）を組合わせることによっ て、最良のロールの直立性が得られた。 実施例２１ パンにおける品質変化の防止剤としてフザリウム・オキシスポラム（Ｆ．ｏｘｙ ｓｐｏｒｕｍ）から得られたホスホリパーゼの使用 材料および方法 パンの製造 ヨーロッパのストレートの練り粉パンおよびロールを下記の基本的処方から製 造した： 基本的処方 小麦粉（Ｍｅｎｅｂａ ＢＢＺ） １００％（２０００ｇ） 水 ６１％ 酵母 ５％ 塩 １．５％ 砂糖 １．５％ アスコルビン酸 ４０ｐｐｍ ベーキング手順 混合（スパイラルミキサー）、６２５ＲＰＭ ３分 混合（スパイラルミキサー）、１２５０ＲＰＭ ３．５分 練り粉の評価 ７分 発酵（室温） １５分 シーティング／成形 ３分 室温における緩和 ５分 フォルディング ２分 室温における緩和 ５分 シーティング／成形／パンニング ２分 プルーフィング（３２℃、８２％の相対湿度） ５５分 ベーキング（２３０℃） ３５分 この実施例において、パンの一塊を蓋付きパンの中でパンニングして、テキス チャーの分析の前における比体積の差を回避した。冷 却後、パンの一塊を室温において貯蔵し、プラスチックのバッグの中の中に包装 した。 焼かれた製品の評価 ＡＡＣＣ法７４−０９に従い、品質変化およびテキスチャーの評価を実施した 。パンの品質変化のインジケーターとしてのパン小片の柔軟性の評価を、下記の 手順に従い、ベーキング後、第０、１、３、および７日に実施した： パンのスライスをテキスチャー分析装置（ＴＡ ＴＸ−２）において一定速度 で圧縮し、そして圧縮力（ｇ）を測定した。パンが品質を変化させるにつれて、 パン小片の固さは増加する。 結果 固さの測定値の結果を貯蔵日数の関数として表２に示す。レシムルチン（Ｌｅ ｃｉｍｕｌｔｉｎ）を１ｇ／ｋｇ小麦粉の濃度で添加し、そしてフザリウム・オ キシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）のホスホリパーゼを５ ００Ｕ／ｋｇ小麦粉の投与量で添加した。表におけるすべての数値は６回の測定 の平均値である（２つのパンの一塊、各々についての３回の測定）。 ＊ベーキングのための商用レシチン調製物（Ｓｕｐｅｒｆｏｓ、デンマーク国） 。 表２１に示すように、ホスホリパーゼで処理したパンは３日までの貯蔵におい て対照よりもわずかに柔軟であった。レシチンと組み合わせると、有意な品質変 化防止効果が貯蔵期間全体を通じて得られた（レシチンまたはホスホリパーゼの 単独では得られない）。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１１Ｂ 3/04 Ｃ１１Ｂ 3/04 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/21 9/20 9/20 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ //(Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｒ 1:66） (Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｒ 1:77） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/20 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/20 Ｃ１２Ｒ 1:66） (Ｃ１２Ｎ 9/20 Ｃ１２Ｒ 1:77） (31)優先権主張番号 ０１９０／９７ (32)優先日 平成９年２月21日(1997．2．21) (33)優先権主張国 デンマーク（ＤＫ） (31)優先権主張番号 ０２１１／９７ (32)優先日 平成９年２月26日(1997．2．26) (33)優先権主張国 デンマーク（ＤＫ） (31)優先権主張番号 １２８３／９７ (32)優先日 平成９年11月11日(1997．11．11) (33)優先権主張国 デンマーク（ＤＫ） (81)指定国 ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ， ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，Ｔ Ｄ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ， ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ， ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，Ｌ Ｒ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ， ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，Ｔ Ｒ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ボルフ，キム デンマーク国，デーコー―2880 バグスバ エルト ノボ アレ，ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ (72)発明者 ハルキール，トルベン デンマーク国，デーコー―3460 ビルケレ ズ ヘステコーバイ 11 イー (72)発明者 バルフォーズ，マーチン デンマーク国，デーコー―2880 バグスバ エルト ノボ アレ，ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ (72)発明者 クラウセン，キム デンマーク国，デーコー―2880 バグスバ エルト ノボ アレ，ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ (72)発明者 フグルサン，クラウス クローネ デンマーク国，デーコー―2880 バグスバ エルト ノボ アレ，ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ (72)発明者 ジブダル，ロネ デンマーク国，デーコー―2880 バグスバ エルト ノボ アレ，ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 1. 食用油中のリン含有成分の含量を減少する方法であって、前記油は少なく とも５０ｐｐｍの非水和性リン含量を含み、前記非水和性リン含量は、 ｉ） ６０℃において、水中のクエン酸一水和物を含んでなる溶液の添加（添 加された水／油＝４．８％ｗ／ｗ；水相中の［クエン酸］＝１０６ｍＭ、水／油 エマルジョン中の［クエン酸］＝４．６ｍＭ）により、前記食用油を３０分間前 処理し、 ｉｉ） １０ｍｌの前処理された油中水型エマルジョンを管に移し、 ｉｉｉ） 前記エマルジョンを沸騰する水浴中で３０分間加熱し、 ｉｖ） ５０００ｒｐｍにおいて１０分間遠心し、 ｖ） 約８ｍｌの上（油）相を新しい管に移し、それを２４時間沈降させ、 ｖｉ） 沈降後、上の透明な相から２ｇを抜き出して、食用油中の非水和性リ ン含量（ｐｐｍ）を測定する、 ことによって測定され、そして前記方法は、前記油を、ｐＨ１．５〜８において 、ホスホリパーゼＡ₁、ホスホリパーゼＡ₂、またはホスホリパーゼＢの水溶液と 接触させ、これを前記油のリン含量が１１ｐｐｍより低く減少するまで前記油中 で乳化させ、次いで水性相を処理された油から分離することを含む、食用油中の リン含有成分の含量を減少する方法。 2. 前記食用油が少なくとも６０ｐｐｍの非水和性リン含量、より好ましくは 少なくとも１００ｐｐｍの非水和性リン含量、なおより好ましくは少なくとも２ ００ｐｐｍの非水和性リン含量を有する 、請求項１に記載の方法。 3. 前記食用油が粗製油であり、前記粗製油は、前記接触工程前において、２ ５０部／１０⁶部（ｐｐｍ）より大きいリン含量を有しかつ水−脱ガム化されて いない油である、請求項１または２に記載の方法。 4. 前記粗製食用油が３５０ｐｐｍ以上のリン含量、より好ましくは４００ｐ ｐｍ以上のリン含量、なおより好ましくは５００ｐｐｍ以上のリン含量を有する 、請求項３に記載の方法。 5. 前記粗製食用油が２５０〜１２００ｐｐｍの範囲、より好ましくは３５０ 〜１２００ｐｐｍの範囲、なおより好ましくは５００〜１２００ｐｐｍの範囲の リン含量を有する、請求項３〜４のいずれか一項に記載の方法。 6. 前記食用油が半粗製食用油であり、前記半粗製食用油は５００部／１０⁶ 部（ｐｐｍ）以上のリン含量を有し、かつ前記接触工程前において水−脱ガム化 されている、請求項１または２に記載の方法。 7. 工程： ｉ） 食用油の温度を２５℃〜７０℃の温度に調節し、 ｉｉ） 上記調節された温度において、少なくとも８５％の水を含んでなる水 溶液の０．５〜６％（前記油に関する重量による）の添加により、食用油を５〜 １２０分間前処理し、 ｉｉｉ） 前記水／油エマルジョンのｐＨをｐＨ１．５〜８に調節し、 ｉｖ） 前記水／油エマルジョンをホスホリパーゼＡ₁、ホスホリパーゼＡ₂、 またはホスホリパーゼＢの水溶液と接触させ、この溶液を前記油のリン含量が１ １ｐｐｍより低く減少するまで前記油中で乳化させ、 ｖ） 水性相を処理された油から分離する、 ことからなる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。 8. 工程ｉ）における食用油の温度を３５℃〜５０℃に調節し、そして工程ｉ ｖ）において使用するホスホリパーゼが糸状菌株から得られる、請求項７に記載 の方法。 9. 前記油とホスホリパーゼを含んでなる水溶液との接触をｐＨ１．５〜８、 好ましくはｐＨ３〜６において実施する、前記請求項のいずれか一項に記載の方 法。 １０． ホスホリパーゼの量が０．１ｍｇの酵素（乾燥物質）／ｋｇの油〜１ ５ｍｇの酵素（乾燥物質）／ｋｇの油の範囲である、請求項１〜９のいずれか一 項に記載の方法。 １１． ホスホリパーゼの量が０．５ｍｇのホスホリパーゼ（乾燥物質）／ｋ ｇの油〜６ｍｇのホスホリパーゼ（乾燥物質）／ｋｇの油の範囲であり、そして ホスホリパーゼを前記油と１時間〜６時間の間接触させる、請求項１〜９のいず れか一項に記載の方法。 １２． ホスホリパーゼの量が０．２５ｍｇのホスホリパーゼ（乾燥物質）／ ｋｇの油〜２．５ｍｇのホスホリパーゼ（乾燥物質）／ｋｇの油の範囲であり、 そしてホスホリパーゼを前記油と１５分〜２時間の間接触させる、請求項１２に 記載の方法。 １３． 前記ホスホリパーゼが哺乳動物種から得られ、特に前記ホスホリパー ゼが前記哺乳動物種の膵臓から得られる、請求項１〜１のいずれか一項に記載の 方法。 １４． 前記ホスホリパーゼがブタの膵臓から得られる、請求項１３に記載の 方法。 １５． 前記ホスホリパーゼが微生物、好ましくは糸状菌、酵母、または細菌 から得られる、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。 １６． 前記糸状菌が、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属、例えば、フザリ ウム・クルモラム（Ｆ．ｃｕｌｍｏｒｕｍ）、フザリウム・ヘテロスポラム（Ｆ ．ｈｅｔｅｒｏｓｐｏｒｕｍ）、フザリウム・ソラニ（Ｆ．ｓｏｌａｎｉ）の株 、特にフザリウム・オキシスポラム（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）の株の範囲内の 種である、請求項１５に記載の方法。 １７． 前記糸状菌が、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、例え ば、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ）、 アスペルギルス・フェチダス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｏｅｔｉｄｕｓ）、 アスペルギルス・ジャポニカス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ ）またはアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、特 にアスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）の株の範 囲内の種である、請求項１５に記載の方法。 １８． 前記食用油が大豆油、ヒマワリ実油、より好ましくはナタネ油である 、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。 １９． ＤＮＡ配列が糸状菌から得られた、ホスホリパーゼＡ活性を有するポ リペプチドをコードするＤＮＡ配列を有するクローン化されたポリヌクレオチド 。 ２０． ＤＮＡ配列が、 （ａ） 大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＤＳＭ１１２９９の中 に存在するプラスミドｐＹＥＳ２．０の中にクローン化されたポリヌクレオチド のホスホリパーゼＡをコードする部分、 （ｂ） 配列番号：１中の位置２３−１０６３、より好ましくは配列番号：１ 中の位置１１３−１０６３、なおより好ましくは配列番号：１中の位置１１３− ９２９に示すＤＮＡ配列、またはその相補的鎖、 （ｃ） （ａ）または（ｂ）において定義された前記ＤＮＡ配列と少なくとも ７０％相同性であるＤＮＡ配列、 （ｄ） ホスホリパーゼ活性を示すポリペプチドをコードし、かつ配列番号： ２の位置３１−３４６に示すポリペプチド配列と少なくとも７０％相同性であり 、より好ましくは配列番号：２の位置３１−３０３に示すポリペプチド配列と少 なくとも７０％相同性である、（ａ）または（ｂ）において定義された前記ＤＮ Ａ配列、 （ｅ） 配列番号：１中の位置２３−１０６３に示すＤＮＡ配列を含んでなる 二本鎖ＤＮＡプローブと低いストリンジェンシイにおいてハイブリダイズするＤ ＮＡ配列、 （ｆ） 配列番号：２の残基１〜３４６、３１〜３４６または３１〜３０３の アミノ酸配列あるいは（ｅ）のＤＮＡ配列のいずれかによりコードされるアミノ 酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、および （ｇ） （ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）または（ｆ）において特定 されたＤＮＡ配列のフラグメントであるＤＮＡ配列、から成る群より選択される 、ホスホリパーゼＡおよび／またはホスホリパーゼＢの活性を示す酵素をコード するＤＮＡ配列を有するクローン化されたポリヌクレオチド。 ２１． 前記ポリヌクレオチドによりコードされるホスホリパーゼがホスホリ パーゼＡ₁である、請求項１９または２０に記載のクローン化されたポリヌクレ オチド。 ２２． 前記ポリヌクレオチドによりコードされるホスホリパーゼがホスホリ パーゼＡ₂である、請求項１９または２０に記載のクローン化されたポリヌクレ オチド。 ２３． 前記ポリヌクレオチドによりコードされるホスホリパーゼがホスホリ パーゼＢである、請求項２０に記載のクローン化され たポリヌクレオチド。 ２４． 前記ポリヌクレオチドによりコードされるホスホリパーゼがＣａ²⁺濃 度に対して実質的に独立であり、前記Ｃａ²⁺濃度は、３７℃において１０分間イ ンキュベートし、次いで９５℃において５分間反応を停止する、２％のレシチン 、２％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、２０ｍＭのクエン酸塩を含んでなる緩衝液 、ｐＨ５、中のレシチンからの遊離脂肪酸の放出を測定するホスホリパーゼ活性 のアッセイにおいて５ｍＭのＥＤＴＡおよび５ｍＭのＣａ²⁺における相対ホスホ リパーゼ活性により決定して測定され、ここで５ｍＭのＥＤＴＡ／５ｍＭのＣａ²⁺ における相対ホスホリパーゼ活性の比は０．２５より大きく、より好ましくは ０．５より大きい、請求項１９〜２３のいずれか一項に記載のクローン化された ポリヌクレオチド。 ２５． 前記ポリヌクレオチドによりコードされるホスホリパーゼが、単層ホ スホリパーゼアッセイにおいて測定して、６０μｇの酵素投与量および２５℃に おいて少なくとも０．２５ｎｍｏｌ／分、より好ましくは６０μｇの酵素投与量 、２５℃において少なくとも０．４０ｎｍｏｌ／分であるホスホリパーゼ活性を 有する、請求項１９〜２４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。 ２６． 前記ポリヌクレオチドによりコードされるホスホリパーゼが、３７℃ において１０分間インキュベートし、次いで９５℃において５分間反応を停止す る、２％のレシチン、２％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、２０ｍＭのクエン酸塩 を含んでなる緩衝液、ｐＨ５、中のレシチンからの遊離脂肪酸の放出を決定する アッセイにおいて測定して、少なくとも７μｍｏｌの遊離脂肪酸／分／ｍｇの酵 素、より好ましくは少なくとも１５μｍｏｌの遊離脂肪酸／分／ｍｇの酵素を放 出することができるホスホリパーゼ活性を有するホス ホリパーゼである、請求項１９〜２５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド 。 ２７． 前記ポリヌクレオチドによりコードされるホスホリパーゼが、請求項 １〜１８のいずれか一項に記載の方法に従い食用油の酵素的脱ガム化を実施する ことができる、請求項１９〜２６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。 ２８． 前記ポリヌクレオチドによりコードされるホスホリパーゼが、水−脱 ガム化された食用油（５０〜２５０ｐｐｍのリン含量を有する）の酵素的脱ガム 化を実施し、これにより前記油のリン含量を１１ｐｐｍより低く減少させること ができ、ここで酵素的脱ガム化プロセスが前記油をｐＨ１．５〜８においてホス ホリパーゼの水溶液と接触させ、これを前記油のリン含量が１１ｐｐｍより低く 減少するまで前記油中で乳化させ、次いで水性相を処理された油から分離するこ とを含む、請求項１９〜２７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。 ２９． 前記ポリヌクレオチドによりコードされるホスホリパーゼが、２ｍｇ より少ないホスホリパーゼ（乾燥物質）／ｋｇの油を使用することによって水− 脱ガム化された食用油の前記酵素的脱ガム化を実施することができ、そして前記 ホスホリパーゼを前記油と１５分〜２時間の間接触させる、請求項２８に記載の ポリヌクレオチド。 ３０． 前記ポリヌクレオチドが、微生物、好ましくは糸状菌、酵母、または 細菌から得られる、請求項２０〜２９のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド 。 ３１． 前記ポリヌクレオチドが、核菌網（Ｐｙｒｅｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）、 例えば、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属の糸状菌株から得られる、請求項１ ９〜３０のいずれか一項に記載のポリヌ クレオチド。 ３２． 前記ポリヌクレオチドが、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属、例え ば、フザリウム・クルモラム（Ｆ．ｃｕｌｍｏｒｕｍ）、フザリウム・ヘテロス ポラム（Ｆ．ｈｅｔｅｒｏｓｐｏｒｕｍ）、フザリウム・ソラニ（Ｆ．ｓｏｌａ ｎｉ）の株、特にフザリウム・オキシスポラム（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）の株 から得られる、請求項３１に記載のポリヌクレオチド。 ３３． 前記ポリヌクレオチドが、フザリウム・オキシスポラム（Ｆ．ｏｘｙ ｓｐｏｒｕｍ）ＤＳＭ Ｎｏ．２６７２のＤＮＡライブラリーに基づいて得られ る、請求項32に記載のポリヌクレオチド。 ３４． 前記ポリヌクレオチドが、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ）属、例えば、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍ ｏｒｉ）、アスペルギルス・フェチダス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｏｅｔｉ ｄｕｓ）、アスペルギルス・ジャポニカス（Ａｓｐｅｒｇｉゥｌｕｓ ｊａｐｏ ｎｉｃｕｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ ）、または、特にアスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚ ａｅ）の株の範囲内の糸状菌株から得られる、請求項３０に記載のポリヌクレオ チド。 ３５． フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属の株から得られ、そして ｉ） ４０℃において測定された、ｐＨ範囲３〜１０におけるＰＬＡ活性、 ｉｉ） ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定して、２９±１０ｋＤａの分子量、 ｉｉｉ） 範囲４．５〜８の等電点（ｐＩ）、 ｉｖ） ｐＨ５において基質としてレシチンを使用して測定された、２５〜５ ５℃の範囲のホスホリパーゼ活性のための温度最適値、および／または ｖ） ３７℃において基質としてレシチンを使用して測定された、６〜１２の ｐＨ範囲のホスホリパーゼ活性のためのｐＨ最適値、を有する、ホスホリパーゼ Ａ活性を有する単離されたポリペプチド。 ３６． ホスホリパーゼＡおよび／またはＢの活性を有し、 （ａ） 大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＤＳＭ１１２９９の中 に存在するプラスミドｐＹＥＳ２．０の中にクローン化されたＤＮＡ配列のホス ホリパーゼＡおよび／またはＢ酵素をコードする部分によりコードされるポリペ プチド、 （ｂ） 配列番号：２中の位置３１−３４６に示すアミノ酸配列を有するポリ ペプチド、 （ｃ） 配列番号：２中の位置３１−３０３に示すアミノ酸配列を有するポリ ペプチド、 （ｄ） （ａ）、（ｂ）または（ｃ）において定義された前記ポリペプチドと 少なくとも７０％相同性であるポリペプチド、および （ｅ） （ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）のフラグメント、から成る群よ り選択される単離されたポリペプチド。 ３７． ホスホリパーゼＡ₁である、請求項３５または３６に記載の単離され たポリペプチド。 ３８． ホスホリパーゼＡ₂である、請求項３５または３６に記載の単離され たポリペプチド。 ３９． ホスホリパーゼＢである、請求項３５または３６に記載の単離された ポリペプチド。 ４０． Ｃａ²⁺濃度に対して実質的に独立であり、前記Ｃａ²⁺濃 度は、３７℃において１０分間インキュベートし、次いで９５℃において５分間 反応を停止する、２％のレシチン、２％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、２０ｍＭ のクエン酸塩を含んでなる緩衝液、ｐＨ５、中のレシチンからの遊離脂肪酸の放 出を測定するホスホリパーゼ活性のアッセイにおいて５ｍＭのＥＤＴＡおよび５ ｍＭのＣａ²⁺における相対ホスホリパーゼ活性として測定され、ここで５ｍＭの ＥＤＴＡ／５ｍＭのＣａ²⁺における相対ホスホリパーゼ活性の比は０．２５より 大きく、より好ましくは０．５より大きい、請求項３５〜３９のいずれか一項に 記載の単離されたポリペプチド。 ４１．単層ホスホリパーゼアッセイにおいて測定して、６０μｇの酵素投与量 および２５℃において少なくとも０．２５ｎｍｏｌ／分、より好ましくは６０μ ｇの酵素投与量、２５℃において少なくとも０．４０ｎｍｏｌ／分であるホスホ リパーゼ活性を有する、請求項３５〜４０のいずれか一項に記載の単離されたポ リペプチド。 ４２． 少なくとも７μｍｏｌの遊離脂肪酸／分／ｍｇの酵素、より好ましく は少なくとも１５μｍｏｌの遊離脂肪酸／分／ｍｇの酵素を放出することができ るホスホリパーゼ活性を有し、前記ホスホリパーゼ活性は、３７℃において１０ 分間インキュベートし、次いで９５℃において５分間反応を停止する、２％のレ シチン、２％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、２０ｍＭのクエン酸塩を含んでなる 緩衝液、ｐＨ５、中のレシチンからの遊離脂肪酸の放出を測定するアッセイにお いて測定される、請求項３５〜４１のいずれか一項に記載の単離されたポリペプ チド。 ４３． 請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法に従い食用油の酵素的脱 ガム化を実施することができる、請求項３５〜４２のいずれか一項に記載の単離 されたポリペプチド。 ４４． 水−脱ガム化された食用油（５０〜２５０ｐｐｍのリン 含量を有する）の酵素的脱ガム化を実施し、これにより前記油のリン含量を１１ ｐｐｍより低く減少することができ、ここで酵素的脱ガム化プロセスが前記油を ｐＨ１．５〜８においてホスホリパーゼの水溶液と接触させ、これを前記油のリ ン含量が１１ｐｐｍより低く減少するまで前記油中で乳化させ、次いで水性相を 処理された油から分離することからなる、請求項３５〜４３のいずれか一項に記 載の単離されたポリペプチド。 ４５．２ｍｇより少ないホスホリパーゼ（乾燥物質）／ｋｇの油を使用するこ とによって水−脱ガム化された食用油の前記酵素的脱ガム化を実施することがで き、そして前記ホスホリパーゼを前記油と１５分〜２時間の間接触させる、請求 項４４に記載の単離されたポリペプチド。 ４６． 微生物、好ましくは糸状菌、酵母、または細菌から得られる、請求項 ３６〜４５のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチド。 ４７． 核菌網（Ｐｙｒｅｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）、例えば、フザリウム（Ｆｕ ｓａｒｉｕｍ）属の株から得られる、請求項３５〜４６のいずれか一項に記載の 単離されたポリペプチド。 ４８． フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属、例えば、フザリウム・クルモラ ム（Ｆ．ｃｕｌｍｏｒｕｍ）、フザリウム・ヘテロスポラム（Ｆ．ｈｅｔｅｒｏ ｓｐｏｒｕｍ）、フザリウム・ソラニ（Ｆ．ｓｏｌａｎｉ）の株、特にフザリウ ム・オキシスポラム（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）の株から得られる、請求項４７ に記載の単離されたポリペプチド。 ４９． フザリウム・オキシスポラム（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）ＤＳＭ Ｎ ｏ．２６７２の株から得られる、請求項４８に記載の単離されたポリペプチド。 ５０． アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、例えば、アスペルギ ルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス ・フェチダス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｏｅｔｉｄｕｓ）、アスペルギルス ・ジャポニカス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、アスペルギ ルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、または、特にアスペル ギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）の株の範囲内の糸状 菌株から得られる、請求項４６に記載の単離されたポリペプチド。 ５１． 請求項１９〜３４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含んで なる組換え発現ベクター。 ５２． 請求項１９〜３４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドまたは請 求項５１に記載の組換え発現ベクターを含んでなる宿主細胞。 ５３． 真核細胞、特に真菌細胞、例えば、酵母細胞または糸状菌細胞である 、請求項５２に記載の宿主細胞。 ５４． アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）の株、特にアスペルギル ス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）またはアスペルギルス・オ リゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）の株である、請求項５３に記載 の宿主細胞。 ５５． フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属の株、特にフザリウム・オキシス ポラム（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）の株である、請求項５４に記載の宿主細胞。 ５６． ホスホリパーゼ活性を示す酵素の産生を可能とする条件下に請求項５ １〜５５のいずれか一項に記載の宿主細胞を培養し、そして培養物から前記酵素 を回収することを含む、ホスホリパーゼ活性を示す酵素を製造する方法。 ５７． （ｉ）相同的不純物を含有しせずかつ（ｉｉ）請求項５６に記載の方 法により製造されることを特徴とする、ホスホリパーゼ活性を示す単離された酵 素。 ５８． リン脂質またはリゾリン脂質をホスホリパーゼで処理して脂肪族アシ ル基を加水分解することを含む方法における、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ） 属の株、例えば、フザリウム・クルモラム（Ｆ．ｃｕｌｍｏｒｕｍ）、フザリウ ム・ヘテロスポラム（Ｆ．ｈｅｔｅｒｏｓｐｏｒｕｍ）、フザリウム・ソラニ（ Ｆ．ｓｏｌａｎｉ）の株、または、特にフザリウム・オキシスポラム（Ｆ．ｏｘ ｙｓｐｏｒｕｍ）の株から得られたホスホリパーゼの使用。 ５９． リン脂質またはリゾリン脂質をホスホリパーゼで処理して脂肪族アシ ル基を加水分解することを含む方法における、請求項３５〜５０および５７のい ずれか一項に記載のホスホリパーゼの使用。 ６０． 前記リン脂質またはリゾリン脂質がレシチンまたはリゾレシチンを含 んでなる、請求項５８または５９に記載の使用。 ６１． 前記処理をｐＨ３〜１０および３０〜７０℃（好ましくは３５〜５０ ℃）において実施する、請求項５８〜６０のいずれか一項に記載の使用。 ６２． 改良されたリン脂質の乳化剤を得るためのリン脂質の部分的加水分解 の方法における、特に前記リン脂質がレシチンである、請求項５８〜６１のいず れか一項に記載の使用。 ６３． リン脂質を含有する炭水化物由来の水性溶液またはスラリーの濾過性 を改良する方法における、請求項５８〜６１のいずれか一項に記載の使用。 ６４． 前記溶液またはスラリーが澱粉の加水分解物、特にコムギ澱粉の加水 分解物を含有する、請求項６３に記載の使用。 ６５． ホスホリパーゼを練り粉に添加し、前記練り粉を焼いて焼かれた製品 を製造する方法における、請求項５８〜６１のいずれか一項に記載の使用。 ６６． 請求項３５〜５０および５７のいずれか一項に記載のホスホリパーゼ を含んでなる練り粉または焼かれた製品。 ６７． 食用油をホスホリパーゼで処理してリン脂質の主要部分を加水分解し 、そして加水分解されたリン脂質を含有する水性相を前記油から分離することを 含む、５０〜２５０ｐｐｍのリン含量を有する食用油中のリン脂質の含量を減少 する方法における、請求項５８〜６１のいずれか一項に記載の使用。 ６８． 前記油が酵素的脱ガム化プロセスの前に水−脱ガム化された油である 油である、請求項６７に記載の使用。 ６９． ホスホリパーゼを飼料物質および少なくとも１つのリン脂質と混合す ることからなる、動物の飼料を製造する方法における、請求項５８〜６１のいず れか一項に記載の使用。 ７０． 寄託された大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＤＳＭ１１ ２９９の単離された実質的に純粋な生物学的培養物。