JP2007528732A - 真菌脂肪分解酵素 - Google Patents

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Abstract

トリグリセリドと比較して、極性脂質に対して高い活性比を有する真菌野生型脂肪分解酵素であって、リン脂質：トリグリセリド加水分解活性比が少なくとも４であることが好ましい酵素。本発明の脂肪分解酵素の糖脂質：トリグリセリド加水分解活性比は少なくとも１．５であることが好ましい。一実施形態では、本発明の真菌脂肪分解酵素は、配列番号１又は配列番号２又は配列番号４又は配列番号６で示されるアミノ酸配列又はそれらと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。本発明は、真菌脂肪分解酵素をコードする核酸をさらに包含し、この核酸は、（ａ）配列番号３、配列番号５又は配列番号７で示されるヌクレオチド配列を含む核酸と、（ｂ）遺伝暗号の縮重によって配列番号３、配列番号５又は配列番号７のヌクレオチド配列と関連している核酸と（ｃ）配列番号３、配列番号５又は配列番号７で示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸とからなる群から選択される。

Description

本発明は、新規な真菌脂肪分解酵素(fungal lipolytic enzyme)及び１種以上の新規な真菌脂肪分解酵素をコードする１種以上のポリヌクレオチドに関する。本発明はまた、真菌脂肪分解酵素の製造方法及びその使用に関する。本発明はさらに、改良された食料品の調製、詳しくは、改良されたベークド製品の調製に関する。具体的には、本発明は、ベークド製品をはじめとする食品に改良された特性を付与することができる、新規な真菌脂肪分解酵素を提供する。
食品工業及び／又は飼料工業への応用における脂肪分解酵素（Ｅ．Ｃ．３．１．１．ｘ）の有効利用は、長年にわたって知られてきた。
例えば、ＥＰ０５８５９８８では、生地へのリパーゼの添加によって老化防止効果の改良がもたらされたということが特許請求されている。リゾプス・アリズス（Rhizopus arrhizus）から得られたリパーゼは、生地に添加された場合、ショートニング／脂肪と併用した場合に得られるパンの質を改良できるということが示唆されている。ＷＯ９４／０４０３５は、生地にリパーゼを添加することによって、生地へのさらなる油／脂を添加せずに、パンの柔らかさの改良が得られるということを教示している。Castello, P. ESEGP 89-10 Dec. 1999 Helsinkiには、外因性リパーゼがパンの体積を改変できるということが示されている。
小麦粉中のリパーゼの基質は、１．５〜３％の内因性コムギ脂質であり、これは極性脂質と非極性脂質の複合混合物である。極性脂質は糖脂質とリン脂質に分けられる。これらの脂質は２つの脂肪酸でエステル化されたグリセロールと極性基で構成されている。極性基はこれらの脂質の表面活性の原因となっている。これらの脂質の一方の脂肪酸を酵素的に切断すると、かなり高い表面活性を有する脂質が得られる。ＤＡＴＥＭなどの、高い表面活性を有する乳化剤は、生地に添加すると、極めて機能的であるということはよく知られている。
脂肪分解酵素は、食物中に存在する脂質からの脂肪酸の１つ以上を加水分解し、その結果、食料品内に強力な乳化剤分子が形成され、これが商業上価値のある機能を提供する。最も重要な乳化剤特性を与える分子としては、リゾリン脂質、リゾ糖脂質及びモノグリセリド分子などの部分加水分解生成物がある。極性脂質加水分解生成物、即ち、リゾリン脂質及びリゾ糖脂質は、特に有利である。パン製造では、このようなその場で導かれる乳化剤が、ＤＡＴＥＭなどの添加乳化剤と同等の機能を与えることができる。
しかし、脂肪分解酵素の活性はまた、食料品において有害な機能を引き起こす可能性がある、遊離脂肪酸の蓄積ももたらすことがわかっている。脂肪分解酵素のこの特有の活性によってその機能が制限されている。
パンの体積に対する負の作用は過剰添加で説明がつくことが多い。過剰添加はグルテンの弾力性の低下を引き起こし、この結果固すぎる生地となり、ひいては体積が減少することがある。さらに、又は或いは、このようなリパーゼは、生地に加えたショートニング、オイル又は乳脂肪を分解し、その結果生地及びベークド製品に異臭をもたらす場合がある。過剰添加及び異臭は、生地における遊離脂肪酸、特に短鎖脂肪酸の蓄積が原因であると考えられている。
原料又は食品中の高レベルの遊離脂肪酸（ＦＦＡ）の存在は、一般に、品質欠陥として認識されており、食品加工業者及び取引先は、通常、食品の仕様に最大のＦＦＡレベルを含める。もたらされる過剰のＦＦＡレベルの作用は、官能上の欠陥及び／又は機能上の欠陥であり得る。
ＥＰ１１９３３１４において、発明者らは、糖脂質に対して活性な脂肪分解酵素の使用は、部分加水分解生成物、リゾ糖脂質が極めて高い乳化剤機能を有し、明らかに、遊離脂肪酸の有害な蓄積と比べ、より高い比率の明確な乳化剤機能をもたらすことがわかったので、パン製造における適用において特に有益であるということを発見した。しかし、この酵素はまた、トリグリセリドに対して相当な非選択的活性も有し、これが不必要に高い遊離脂肪酸をもたらすこともわかった。
高いトリグリセリド活性というこの問題はＷＯ０２／０９４１２３で対処され、これでは、発明者らは、生地中の極性脂質（糖脂質及びリン脂質）に対して活性であるが、トリグリセリド又は１−モノグリセリドに対しては実質的に活性でない脂肪分解酵素を選択することによって、機能の改良が達成できることを発見した。
リパーゼ酵素の商業的に好ましい供給源としては、アスペルギルス属及びフザリウム属などの糸状菌がある。糸状菌から単離されたリパーゼは、工業的に適用可能な特性を有することがわかっており、また、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）、フザリウム及び酵母などの異種産生系において発現することが慣例であることがわかっている。
フザリウム・オキシスポラム（Fusarium oxysporum）由来のリパーゼは、ＥＰ０１３００６４において同定されており、食品用途におけるＦ．オキシスポラムの適用はHoshino et al. (1992) Biosci. Biotech. Biochem 56: 660-664に示唆されている。
ＥＰ０８６９１６７には、フザリウム・オキシスポラムリパーゼのクローニング及び発現並びに製パンにおけるその使用が記載されている。この酵素はホスホリパーゼ活性を有すると記載されている。この酵素は、Novozymes A/S（Denmark）によりLipopan（商標）として現在販売されている。
ＷＯ０２／００８５２には、Ｆ．ベネナツム（venenatum）、Ｆ．スルフレウム（sulphureum）、Ａ．バーケレヤナム（berkeleyanum）、Ｆ．クルモラム（culmorum）及びＦ．ソラニ（solani）から単離された５種のリパーゼ酵素及びそれらをコードするポリヌクレオチドが開示されている。５種の酵素すべてがトリアシルグリセロール加水分解活性、ホスホリパーゼ及びガラクトリパーゼ活性を有すると記載されている。これら酵素のうち３種は、ＥＰ０８６９１６７に教示されるＦ．オキシスポラム酵素と同等の活性を有する：Ｆ．ベネナツム、Ｆ．スルフレウム、Ｆ．クルモラム。
したがって、Lipopan F（商標）をはじめ、いくつかのフザリウムリパーゼは極性脂質、例えば、リン脂質及び糖脂質に対して副活性を有することがわかっていることは明らかである。ＥＰ０８６９１６７にはホスホリパーゼとして記載されているが、フザリウム・オキシスポラムに由来するリパーゼは高いリパーゼ活性を有する。この酵素はまたグリコリパーゼ活性も有する。しかし、極性脂質に対する相当な活性にもかかわらず、この酵素の使用によって達成される機能は、高いリパーゼ（即ち、トリグリセリド）活性によって制限されている。
Nagao et al (J. Biochem 116 (1994) 536-540)には、Ｆ．ヘテロスポラムに由来するリパーゼが記載されており、この酵素は主にリパーゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．１．３）として機能し、トリグリセリドを加水分解する。これは本発明の酵素とは極めて異なっている。
特定のアミノ酸置換及び融合を有する脂肪分解酵素変異体が作製されており、そのいくつかは、野生型親酵素と比較して、極性脂質に対してより増強された活性を有する。ＷＯ０１／３９６０２には、ＳＰ９７９と呼ばれる、そのような変異体が記載されており、これはサーモマイセス・ラヌギノーサス（Thermomyces lanuginosus）リパーゼと、ＥＰ０８６９１６７に記載されるフザリウム・オキシスポラムリパーゼとの融合物である。この変異体は、トリグリセリドと比較して、リン脂質及び糖脂質に対して極めて高い活性比を有することがわかっている。
ＥＰ０５８５９８８ ＷＯ９４／０４０３５ ＥＰ１１９３３１４ ＷＯ０２／０９４１２３ ＥＰ０１３００６４ ＥＰ０８６９１６７ ＷＯ０２／００８５２ ＷＯ０１／３９６０２ Castello, P. ESEGP 89-10 Dec. 1999 Helsinki Hoshino et al. (1992) Biosci. Biotech. Biochem 56: 660-664 Nagao et al (J. Biochem 116 (1994) 536-540)
しかし、本発明に先立って、トリグリセリドと比較して、極性脂質に対して高い活性比を有する天然真菌脂肪分解酵素、特に、フザリウム属由来のものは教示されていない。
広い一態様では、本発明は、トリグリセリドと比較して、極性脂質（リン脂質及び／又は糖脂質）に対してより高い活性比を、詳しくは、トリグリセリドと比較して、糖脂質に対してより高い活性比を有する真菌脂肪分解酵素に関する。
さらなる広い一態様では、本発明は、トリグリセリドと比較して、極性脂質（リン脂質及び／又は糖脂質）に対してより高い活性比を、詳しくは、トリグリセリドと比較して、糖脂質に対してより高い活性比を有する、真菌野生型脂肪分解酵素（fungal wild-type lipolytic enzyme）に関する。
いっそうさらなる広い一態様では、本発明は、本明細書に教示されるような新な規真菌脂肪分解酵素をコードする核酸に関する。
広い一態様では、本発明は食料品、好ましくは、卵ベースの食料品の調製方法に関し、この方法は食料品の１種以上の成分に本発明の真菌脂肪分解酵素を添加することを含む。
本発明は、生地の調製方法に関し、この方法は、生地の１種以上の成分に本発明の真菌脂肪分解酵素添加することと、混合して生地を形成することとを含む。
本発明のもう１つの広い態様は、生地からベークド製品を調製する方法に関し、この方法は、生地に本発明真菌脂肪分解酵素を添加することを含む。
本発明の真菌脂肪分解酵素の調製方法もまた提供し、この方法は、真菌脂肪分解酵素をコードするヌクレオチド配列を含む組換え核酸で宿主細胞を形質転換すること、核酸が発現される条件下で形質転換された宿主細胞を培養すること、及び真菌脂肪分解酵素を回収することを含み、この宿主細胞は真菌脂肪分解酵素のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を発現可能である。
さらなる広い一態様では、本発明は低温で活性を保持する脂肪分解酵素、即ち、低温脂肪分解酵素を提供する。
本発明の態様は、特許請求の範囲及び以下の解説において示す。
本発明において使用できるヌクレオチド配列に関するその他の態様としては、本発明の配列を含む構築物、本発明に用いる配列を含むベクター、本発明に用いる配列を含むプラスミド、本発明に用いる配列を含む形質転換細胞、本発明に用いる配列を含む形質転換組織、本発明に用いる配列を含む形質転換器官、本発明に用いる配列を含む形質転換宿主、本発明に用いる配列を含む形質転換生物が挙げられる。本発明はまた、宿主細胞における発現などの、本発明に用いるヌクレオチド配列を用いてそれを発現する方法を包含し、本発明に用いるヌクレオチド配列を導入する方法が含まれる。本発明はさらに、宿主細胞からの単離などの、ヌクレオチド配列を単離する方法を包含する。
本発明に用いるアミノ酸配列に関するその他の態様としては、本発明に用いるアミノ酸配列をコードする構築物、本発明に用いるアミノ酸配列をコードするベクター、本発明に用いるアミノ酸配列をコードするプラスミド、本発明に用いるアミノ酸配列を発現する形質転換細胞、本発明に用いるアミノ酸配列を発現する形質転換組織、本発明に用いるアミノ酸配列を発現する形質転換器官、本発明に用いるアミノ酸配列を発現する形質転換宿主、本発明に用いるアミノ酸配列を発現する形質転換生物が挙げられる。本発明はまた、宿主細胞における発現などの、本発明に用いるアミノ酸配列を用いてそれを精製する方法も包含し、本発明に用いるアミノ酸配列を導入し、次いでそれらの配列を精製する方法が含まれる。
参照が容易なように、本発明のこれらの態様及びさらなる態様を、適当な項の見出しのもと、以下に論じる。しかし、各項下の教示は、必ずしも各個々の項に限定されるものではない。
一態様では、本発明は、トリグリセリドと比較して、極性脂質に対してより高い活性比を有する真菌野生型脂肪分解酵素を提供する。
一態様では、本発明は、配列番号１、配列番号２、配列番号４若しくは配列番号６又はそれらと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列として示されるアミノ酸配列を含む真菌脂肪分解酵素を提供する。
さらなる一態様では、本発明は、配列番号１、配列番号２、配列番号４若しくは配列番号６又はそれらと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列として示されるアミノ酸配列を含む真菌脂肪分解酵素をコードする核酸を提供する。
配列番号１は図３７に示され、配列番号２は図３８に示され、配列番号４は図４０に示され、配列番号６は図４２に示されている。
さらなる一態様では、本発明は、真菌脂肪分解酵素をコードする核酸を提供し、この核酸は、
ａ）配列番号３、配列番号５又は配列番号７に示されるヌクレオチド配列を含む核酸と、
ｂ）遺伝暗号の縮重によって、配列番号３、配列番号５又は配列番号７のヌクレオチド配列と関連している核酸と、
ｃ）配列番号３、配列番号５又は配列番号７に示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸と
からなる群から選択される。
配列番号３は図３９に示され、配列番号５は図４１に示され、配列番号７は図４３に示されている。
もう１つの態様では、本発明は、食料品、例えば、生地、ベークド製品、卵、卵ベースの製品、ヌードル製品、チーズ製品、トルティーヤ製品、動物飼料製品、植物油又は食用油などの製造における本発明の真菌脂肪分解酵素の使用を提供する。食料品への本発明の酵素の添加が、遊離脂肪酸の蓄積の低下した、乳化の改良を導くことができると有利である。
さらなる一態様では、本発明は、生地及び／又はベークド製品の製造における本発明の真菌脂肪分解酵素の使用を提供し、これは、以下のうち１つ以上のために、生地へ前記脂肪分解酵素を添加することと、（場合によっては）生地を焼いてベークド製品を製造することとを含む：生地の粘性の低下、生地の機械加工性の改良、ベークド製品の焼きの際のふくれの減少、パン体積及び／又は柔らかさの改良、ベークド製品及び／又は生地の保存期間の延長、ベークド製品及び／又は生地の老化防止効果の改良、ベークド製品のクラム構造の改良、ベークド製品の孔の不均一性の低下、ベークド製品の孔の均一性の改良、ベークド製品の平均孔サイズの低下、生地のグルテン指数の増加、ベークド製品のフレーバー及び／又は匂いの改良、ベークド製品の外皮の色の改良。
本発明の酵素は、低ｐＨで従来の脂肪分解酵素よりも高い活性を有することができると有利であり、そのため、低ｐＨのサワードウ環境での使用に適したものであり得ることが従来の脂肪分解酵素よりもより有利である。
本発明のもう１つの態様では、生地に本発明の真菌脂肪分解酵素を添加することと、（場合によっては）生地を焼いてベークド製品を製造することとを含む、生地及び／又はベークド製品の製造方法を提供する。
本発明のさらなる態様では、テクスチャの改良、平均粒径の低下、平均粒子分布の減少、熱安定性の改良、マイクロ波性能及び／又は安定性の改良のために、卵ベースの製品の製造における本発明の真菌脂肪分解酵素の使用を提供する。
本発明のもう１つの態様では、卵又は卵ベースの製品を処理する方法を提供し、この方法は卵又は卵ベースの製品に本発明の真菌脂肪分解酵素を添加することを含む。
本発明のもう１つの態様では、ヌードル、又はヌードル生地若しくはヌードルベースの製品の製造方法を提供し、この方法はヌードル、又はヌードル生地若しくはヌードルベースの製品に本発明の真菌脂肪分解酵素を添加することを含む。
本発明の一態様では、色／黄色の度合いの改良、色特性の安定化、明度の低下、脂肪含量の低下、テクスチャ及びかむこと（かみ応え）の改良、水活性の低下、破損の減少、中心硬度の上昇及び加工の間の保形の改良のうちの１つ以上のための、ヌードル、又はヌードルベースの製品の製造における本発明の真菌脂肪分解酵素の使用を提供する。
本発明のもう１つの態様では、トルティーヤ又はトルティーヤ生地の製造方法を提供し、この方法はトルティーヤ又はトルティーヤ生地に本発明の真菌脂肪分解酵素を添加することを含む。
本発明のさらなる態様は、トルティーヤの圧延性の改良、トルティーヤの柔軟性の増加、トルティーヤ及び／又はトルティーヤ生地の老化防止特性の改良、トルティーヤ及び／又はトルティーヤ生地における柔らかさの改良及び／又は異臭の減少のための、トルティーヤ又はトルティーヤ生地の製造における本発明の真菌脂肪分解酵素の使用を提供する。
トルティーヤ及び／又はヌードルにおける脂肪分解酵素の機能は、ＤＡＴＥＭなどの乳化剤と組み合わせることによって向上させることができる。
本発明のもう１つの態様では、ミルク、チーズミルク、チーズ又はチーズベースの製品を処理する方法を提供し、この方法はチーズ又はチーズベースの製品に本発明の真菌脂肪分解酵素を添加することを含む。
本発明はまださらに、チーズにおけるフレーバー、テクスチャ及び／若しくは安定性の改良、オイリングオフ効果の減少のうちの１つ以上のための、並びに／又はチーズベースの製品の製造においてチーズ収量を増加するための、チーズ又はチーズベースの製品の製造における本発明の真菌脂肪分解酵素の使用を提供する。
本発明のもう１つの態様では、動物飼料を処理する方法を提供し、この方法は動物飼料に本発明の真菌脂肪分解酵素を添加することを含む。
本発明はさらに、飼料利用効率及び／又は転換効率、体重増加、窒素吸収消化率、乾物の代謝率及び嗜好性のうち１つ以上を増強するための、動物飼料の製造における本発明の真菌脂肪分解酵素の使用を提供する。
本発明のさらなる態様では、リン脂質（例えば、レシチン）を酵素で処理して部分加水分解生成物、即ち、リゾリン脂質を生成させることによる、リゾリン脂質、例えば、リゾレシチンの調製方法における本発明の真菌脂肪分解酵素の使用を提供する。
本発明のもう１つの態様では、リゾリン脂質、例えば、リゾレシチンの調製方法を提供し、この方法はリン脂質（例えば、レシチン）を本発明の真菌脂肪分解酵素で処理することを含む。
本発明のさらなる態様では、糖脂質（例えば、ジガラクトシルジグリセリド（ＤＧＤＧ）又はモノガラクトシルジグリセリド（ＭＧＤＧ））を本発明の脂肪分解酵素で処理して部分加水分解生成物、即ち、リゾ糖脂質を生成させることによる、リゾ糖脂質（例えば、ジガラクトシルモノグリセリド（ＤＧＭＧ）又はモノガラクトシルモノグリセリド（ＭＧＭＧ））の調製方法における、本発明の真菌脂肪分解酵素の使用を提供する。
なおさらなる態様では、リゾ糖脂質（例えば、ジガラクトシルモノグリセリド（ＤＧＭＧ）又はモノガラクトシルモノグリセリド（ＭＧＭＧ））の調製方法を提供し、この方法は糖脂質（例えば、ジガラクトシルジグリセリド（ＤＧＤＧ）又はモノガラクトシルジグリセリド（ＭＧＤＧ））を本発明の真菌脂肪分解酵素で処理することを含む。
本発明はまた、食用油又は植物油を本発明の真菌脂肪分解酵素で処理し、極性脂質（例えば、リン脂質及び／又は糖脂質）の大部分を加水分解することを含む、植物油又は食用油の酵素的脱ガム方法を提供する。
誤解を避けるために、当業者ならば食用油の酵素的処理を実施するのに適した方法を承知しているであろう（例えば、ＥＰ０８６９１６７参照）。本発明を実施する際、公知の方法を適切に使用できる。（ただし、公知の酵素を本発明の酵素と置き換える）。
さらなる態様では、本発明は、植物油又は食用油のトリグリセリド含量は維持しつつ、且つ／又は遊離脂肪酸の蓄積は防ぎつつ、若しくは低下させつつ、植物油又は食用油中のリン脂質の量を減少させるための、植物油又は食用油の製造における本発明の真菌脂肪分解酵素の使用を提供する。
なおさらなる態様では、本発明は、脂肪酸アシル基を加水分解するためのリン脂質の処理を含む方法における本発明の真菌脂肪分解酵素の使用を提供する。
もう１つの態様では、本発明は、食用油を本発明の真菌脂肪分解酵素で処理してリン脂質の大部分を加水分解することと、加水分解されたリン脂質を含有する水相を油から分離することとを含む、食用油中のリン脂質含量を減少させる方法における本発明の真菌脂肪分解酵素の使用を提供する。
さらなる態様では、本発明は低温で活性を保持する脂肪分解酵素、即ち低温脂肪分解酵素を提供する。本発明のさらなる態様は、本明細書に記載される方法及び使用における低温脂肪分解酵素の、即ち、本発明真菌脂肪分解酵素の使用を含む。
本発明の真菌脂肪分解酵素は、トリグリセリドに対してよりも、極性脂質（例えば、糖脂質及び／又はリン脂質）に対して高い活性比を有することが好ましい。
本発明の真菌脂肪分解酵素は、トリグリセリドに対してよりも、リン脂質に対してより高い活性比を有することが好ましい。
本発明の真菌脂肪分解酵素は、トリグリセリドに対してよりも、糖脂質に対してより高い活性比を有することが好ましい。
本発明の真菌脂肪分解酵素は、トリグリセリドに対してよりも、糖脂質とリン脂質の双方に対してより高い活性比を有し得ることが適している。
本発明の真菌脂肪分解酵素は、トリグリセリドに対してよりも、ジガラクトシルジグリセリド（ＤＧＤＧ）に対してより高い活性比を有することがより好ましい。
本発明の真菌脂肪分解酵素は、ＤＧＤＧ又はＭＧＤＧをＤＧＭＧ又はＭＧＭＧにそれぞれ加水分解することが好ましい。
本明細書において、用語「極性脂質に対してより高い活性比」とは、本発明の真菌脂肪分解酵素が、市販の酵素Lipopan F（商標）（Novozymes A/S, Denmark）と比べた場合により高い極性脂質：トリグリセリド加水分解活性比を有することを意味する。
本明細書において、用語「極性脂質」とは、リン脂質及び／又は糖脂質を意味する。本明細書において、用語「極性脂質」は、リン脂質と糖脂質の双方を意味することが好ましい。
本明細書において、用語「糖脂質に対してより高い活性比」及び「リン脂質のより高い活性比」とは、本発明の真菌脂肪分解酵素が、市販の酵素Lipopan F（商標）（Novozymes A/S, Denmark）を用いて達成される対応する比よりも高い、糖脂質：トリグリセリド加水分解活性比又はリン脂質：トリグリセリド加水分解活性比をそれぞれ有することを意味する。
本発明の脂肪分解酵素の極性脂質：トリグリセリド加水分解活性比は、少なくとも４であり得ることが好ましい。極性脂質：トリグリセリド加水分解活性比は、５よりも大きいものであり得ることが適している。極性脂質：トリグリセリド加水分解活性比は、８よりも、好ましくは９よりも、より好ましくは１０よりも、いっそうより好ましくは１５よりも大きいものであり得ることが適している。
本発明の真菌脂肪分解酵素のリン脂質：トリグリセリド加水分解活性比は、少なくとも４であり得ることが好ましい。極性脂質：トリグリセリド加水分解活性比が５よりも大きいものであり得ることが適している。極性脂質：トリグリセリド加水分解活性比は、８よりも、好ましくは９よりも、より好ましくは１０よりも、いっそうより好ましくは１５よりも大きいものであり得ることが適している。
本発明の真菌脂肪分解酵素の糖脂質：トリグリセリド加水分解活性比は、少なくとも１．５、好ましくは少なくとも１．８、好ましくは少なくとも２、好ましくは少なくとも３、好ましくは少なくとも４であり得ることが好ましい。糖脂質：トリグリセリド加水分解活性比は、４よりも大きいものであり得ることが適している。糖脂質：トリグリセリド加水分解活性比は、５よりも大きいものであり得ることが適している。
さらなる態様では、本発明は、極性脂質：トリグリセリド加水分解活性比が少なくとも４である真菌脂肪分解酵素を提供する。極性脂質：トリグリセリド加水分解活性比は、５よりも大きいものであり得ることが適している。極性脂質：トリグリセリド加水分解活性比は、８よりも、好ましくは９よりも、より好ましくは１０よりも、いっそうより好ましくは１５よりも大きいものであり得ることが適している。
もう１つの態様では、本発明は、リン脂質：トリグリセリド加水分解活性比が少なくとも４である真菌脂肪分解酵素を提供する。極性脂質：トリグリセリド加水分解活性比が５よりも大きいものであり得ることが適している。極性脂質：トリグリセリド加水分解活性比が８よりも、好ましくは９よりも、より好ましくは１０よりも、いっそうより好ましくは１５よりも大きいものであり得ることが適している。
なおさらなる態様では、本発明は、糖脂質：トリグリセリド加水分解活性比が少なくとも１．５、好ましくは少なくとも１．８、好ましくは少なくとも２、好ましくは少なくとも３、好ましくは少なくとも４、好ましくは５より大きい、好ましくは１０より大きい、好ましくは１５より大きい真菌脂肪分解酵素を提供する。
本発明の真菌脂肪分解酵素は、トリグリセリドリパーゼ活性（Ｅ．Ｃ．３．１．１．３）と比較して、極性脂質に対して少なくとも１．５倍大きい活性（例えば、ホスホリパーゼＡ２（Ｅ．Ｃ．３．１．１．４）活性及び／又はホスホリパーゼＡ１（Ｅ．Ｃ．３．１．１．３２）活性及び／又はグリコリパーゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．１．２６）活性）を有することが好ましく、少なくとも２倍がより好ましく、少なくとも３倍がより好ましく、少なくとも４倍がより好ましい。
本発明の真菌脂肪分解酵素が、トリグリセリドリパーゼ活性（Ｅ．Ｃ．３．１．１．３）と比較して、少なくとも１．５倍大きいグリコリパーゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．１．２６）活性）を有することが好ましく、少なくとも２倍がより好ましく、少なくとも３倍がより好ましく、少なくとも４倍がより好ましい。
最適パン体積を提供する添加量で、実施例３に詳述されるミニベーキングアッセイを用い、トリグリセリド（ＴＧ）比に対するＤＧＤＧの加水分解比が、少なくとも１．７％であることが好ましく、少なくとも１．８％が好ましく、少なくとも２％が好ましく、少なくとも３％が好ましく、少なくとも４％が好ましく、少なくとも５％が好ましく、少なくとも１０％が好ましく、少なくとも２０％が好ましく、少なくとも４０％が好ましく、少なくとも５０％が好ましい。
本明細書において、用語「グリコリパーゼ活性」は、「ガラクトリパーゼ活性」を包含する。
酵素のグリコリパーゼ活性、ホスホリパーゼ活性及びトリアシルグリセリドリパーゼ活性は以下に示すアッセイを用いて測定できる。
ガラクトリパーゼ活性の測定（グリコリパーゼ活性測定法）：
基質：
０．０５Ｍ ＨＥＰＥＳ バッファーｐＨ７に、０．６％ジガラクトシルジグリセリド（Sigma Ｄ ４６５１）と、０．４％ Triton-X 100（Sigma X-100）と５ｍＭ ＣａＣｌ２とを溶解した。
アッセイ手順：
１．５ｍＬのエッペンドルフ管に４００μＬの基質を加え、３７℃のエッペンドルフサーモミキサーに５分間入れた。時間ｔ＝０分に、５０μＬの酵素溶液を添加した。酵素の代わりに水を用いたブランクも分析した。サンプルを、３７℃のエッペンドルフサーモミキサーにおいて、１０＊１００ｒｐｍで１０分間混合した。時間ｔ＝１０分に、エッペンドルフ管を、９９℃の別のサーモミキサーに１０分間入れて反応を停止させた。
サンプル中の遊離脂肪酸は、WAKO GmbH社製のＮＥＦＡ Ｃキットを用いて、分析した。
ｐＨ７で酵素活性ＧＬＵは、アッセイ条件下で１分当たりに生成された脂肪酸のマイクロモルとして算出した。
ホスホリパーゼ活性の測定（ホスホリパーゼ活性測定法）：
ホスホリパーゼ活性は、同程度の結果が得られる２種の異なる方法を用いて測定した。これらの方法のいずれかを用いて、本発明に従うホスホリパーゼ活性を測定できる。いずれの酵素のホスホリパーゼ活性を測定するのにもＰＬＵアッセイを用いることが好ましい。
ホスホリパーゼ活性の測定のための「ＰＬＵアッセイ」
基質：
０．０５Ｍ ＨＥＰＥＳバッファーｐＨ７に、０．６％ Ｌ−(ホスファチジルコリン９５％植物（Avanti 441601）と、０．４％ Triton-X 100（Sigma X-100）と、５ｍＭ ＣａＣｌ２とを溶解した。
アッセイ手順：
１．５ｍＬのエッペンドルフ管に４００μＬの基質を加え、３７℃のエッペンドルフサーモミキサーに５分間入れた。時間ｔ＝０分に、５０μＬの酵素溶液を添加した。酵素の代わりに水を用いたブランクも分析した。サンプルを、３７℃のエッペンドルフサーモミキサーにおいて、１０＊１００ｒｐｍで１０分間混合した。時間ｔ＝１０分に、エッペンドルフ管を、９９℃の別のサーモミキサーに１０分間入れて反応を停止させた。
サンプル中の遊離脂肪酸は、WAKO GmbH社製のＮＥＦＡ Ｃキットを用いて、分析した。
ｐＨ７で酵素活性ＰＬＵ−７を、アッセイ条件下で１分当たりに生成された脂肪酸のマイクロモルとして算出した。
ホスホリパーゼ活性の測定のための「ＴＩＰＵ」アッセイ
１ＴＩＰＵ（滴定ホスホリパーゼ単位）は、このアッセイ条件で１分間当たり１μモルの遊離脂肪酸を遊離させる酵素の量として定義する。
ホスホリパーゼＡ１及びＡ２は、レシチンからリゾレシチンへの変換を触媒し、それぞれ位置１及び２から遊離脂肪酸を放出する。ホスホリパーゼ 活性は、アルカリの消費が遊離される脂肪酸の量と等しいので、酵素処理の間にレシチンから遊離される脂肪酸の連続滴定によって測定できる。
基質：
４％レシチン、４％ Triton-X 100及び６ｍＭ ＣａＣｌ２：１２ｇのレシチン粉末（Avanti極性脂質44160）と１２ｇのTriton-X 100（Merck 108643）をマグネティックスターラーで攪拌している間に約２００ｍｌの脱塩水に分散させた。３．０ｍｌの０．６ＭＣａＣｌ２（p.a. Merck 1.02382）を添加した。脱塩水で容量を３００ｍＬに調整し、Ultra Thuraxを用いてエマルジョンをホモジナイズした。基質は毎日新たに調製した。
アッセイ手順：
酵素溶液は、３００μＬの酵素を添加して、０．０６〜０．１８ｍｌ／分の間の滴定曲線の傾斜を生じるよう調製した。
既知活性の対照サンプルを含める。
サンプルを、脱塩水に溶解し、３００ｒｐｍで１５分間攪拌した。２５．００ｍｌの基質をサーモスタットで３７．０℃に１０〜１５分間制御し、次いで、ｐＨを、０．０５Ｍ ＮａＯＨを用いて７．０に調整した。基質に３００μＬの酵素溶液を添加し、pHスタット滴定装置（Phm 290, Mettler Toledo）を用い、０．０５Ｍ ＮａＯＨで連続滴定を実施した。２つの活性測定は各スケーリングで行う。８分後、滴定を停止し、滴定曲線の傾斜を、５分と７分の間で算出する。検出限界は３ＴＩＰＵ／酵素溶液１ｍｌである。
算出：
ホスホリパーゼ活性（ＴＩＰＵ／酵素１ｇ）は以下の方法で算出した：
式中、
αは反応時間５分と７分の間の滴定曲線の傾斜である（ｍｌ／分）。
Ｎは用いたＮａＯＨの規定度である（ｍｏｌ／ｌ）。
Ｖ１は酵素を溶解した容量である（ｍｌ）。
ｍはＶ１に添加した酵素量である（ｇ）。
Ｖ２は基質に添加した酵素溶液の容量である（ｍｌ）。
トリアシルグリセリドリパーゼ活性の測定：基質としてのトリグリセリド（トリブチリン）（ＬＩＰＵ）に基づいたアッセイ
Food Chemical Codex, Forth Edition, National Academy Press, 1996, p 803に従い、サンプルを、グリシンバッファーの代わりに脱イオン水に溶解し、ｐＨスタット設定値を７の代わりに５．５とするという改変を行って、トリブチリンに基づいてリパーゼ活性を測定する。
１ＬＩＰＵはアッセイ条件下で１分当たり１ｍｏｌの酪酸を遊離させ得る酵素量と定義する。
ガラクト脂質（ＧＬＵ）、リン脂質（ＰＬＵ）及びトリグリセリド（ＬＩＰＵ）に対する活性のアッセイに基づき、比ＰＬＵ／ＬＩＰＵ及びＧＬＵ／ＬＩＰＵを算出することが可能である。
Lipopan F（商標）及びフザリウム・ヘテロスポラム（Fusarium heterosporum）由来の本発明の脂肪分解酵素（サンプル２０９）の分析（実施例３参照）により以下の結果が得られた。
Lipopan F（商標）とサンプル２０９の相対活性比は以下の通りである。
本明細書において、用語「相乗効果（synergy）」又は「相乗効果（synergistic effect）」とは、組合せによって、各成分（即ち、酵素）を別個に用いる場合よりもよい効果が生じることを意味する。相乗効果は、各成分（即ち、酵素）を別個に添加して、及び組み合わせて添加して、製品、例えば生地及び／又はベークド製品を製造し、効果を比較することによって調べることができる。
本明細書において、用語「真菌脂肪分解酵素」とは、酵素の天然の供給源が真菌であることを意味する。しかし、誤解を避けるために、この用語は、真菌から単離される真菌酵素、真菌宿主（天然又は非天然のいずれか）において発現される真菌酵素又は非真菌宿主（例として例えば、細菌又は酵素において）発現される真菌酵素を含み得る。
本発明の真菌脂肪分解酵素は野生型酵素であることが好ましい。
本明細書において、用語「天然」及び「野生型」とは、天然に存在する酵素を意味する。つまり、内因的に産生された成熟タンパク質配列（翻訳時及び翻訳後切断事象後）と比較した場合に、突然変異を受けていない（即ち、アミノ酸欠失、付加又は置換を含まない）、内因性遺伝暗号から発現され、内因性宿主生物から単離される酵素及び／又は異種産生される酵素である。本発明の天然及び野生型タンパク質は、異種発現のためにコドン最適化ポリヌクレオチドによってコードされ得、また、その宿主における発現のために選択された非内因性シグナルペプチドを含み得る。
本明細書において、用語「非内因性シグナルペプチド」とは、翻訳時切断の前の脂肪分解酵素の新生ポリペプチド鎖には天然に存在しないシグナルペプチドを意味する。本発明の脂肪分解酵素では、非内因性シグナルペプチドの一部又は全部、例えば、プロペプチドは、成熟ポリペプチドと結合しているままであり得、これは本明細書における用語「野生型」に包含される。
上記のように、本明細書において「天然」及び「野生型」とは、天然に存在する酵素を意味する。しかし、これは、天然に存在する成熟脂肪分解酵素と同じポリペプチド配列を含む、合成ポリペプチド又は化学合成されたポリペプチドの使用は除外する。
本明細書において、用語「変異体」とは、成熟タンパク質配列内の天然又は野生型配列と比較した場合に、１つ以上のアミノ酸の変更（即ち、アミノ酸欠失、付加又は置換）をもたらす、非内因性遺伝暗号から発現されるタンパク質を意味する。
本発明の真菌脂肪分解酵素は、低温で活性を保持する脂肪分解酵素である、即ち、低温脂肪分解酵素であることが好ましい。
用語「低温脂肪分解酵素」とは、５〜１５℃で相当な活性を有する酵素を意味し、１０℃で相当な活性を有する酵素が好ましい。
一実施形態では、本発明の低温脂肪分解酵素は、ＷＯ２００４／０６４９８７に開示されるアミノ酸配列モチーフＧＤＳＸ（ここで、Ｘは以下のアミノ酸残基のうちの１個以上である：Ｌ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｆ、Ｙ、Ｈ、Ｑ、Ｔ、Ｎ、Ｍ又はＳ）を含む脂肪分解酵素ではない。
本発明の低温脂肪分解酵素は、１０℃、脂肪分解酵素の最適ｐＨの２０％内のｐＨで、レシチン基質に対して少なくとも５％、好ましくは少なくとも７％、より好ましくは少なくとも１０％という相対活性を有すると、ＮＥＦＡ Ｃ法による遊離脂肪酸の測定（ｐＨ７で実施した、実施例５参照）によって決定される酵素であり得る。実施例６は脂肪分解酵素にｐＨ最適条件を決定する方法を提供する。
本発明の低温脂肪分解酵素は、２０℃、脂肪分解酵素の最適ｐＨの２０％内のｐＨで、レシチン基質に対して、少なくとも１０％、好ましくは少なくとも１５％、より好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも２５％及び最も好ましくは少なくとも３０％という相対活性を有すると、ＮＥＦＡ Ｃ法による遊離脂肪酸の測定（ｐＨ７で実施した、実施例５参照）によって決定される酵素であり得る。実施例６は脂肪分解酵素にｐＨ最適条件を決定する方法を提供する。
本発明の低温脂肪分解酵素はまた、実施例９に記載され、図２４及び２５に示されるアッセイを用いて、２０Ｕ／卵黄１ｇに相当する酵素添加量で４８０分という反応時間後に、少なくとも１％、好ましくは少なくとも１．５％、より好ましくは少なくとも２％の遊離脂肪酸を放出可能であることを特徴とする、５℃で卵黄レシチンの相当な活性を示し得る。
本発明の真菌脂肪分解酵素は、糸状菌から得られる（好ましくは、得る）ものであり得ることが好ましい。本真菌脂肪分解酵素は、フザリウム属から得られる（好ましくは、得る）ことがより好ましい。本発明の真菌脂肪分解酵素は、フザリウム・ヘテロスポラム又はフザリウム・セミテクタム（Fusarium semitectum）から得られる（好ましくは、得る）ものであり得ることが好ましい。本発明の真菌脂肪分解酵素は、フザリウム・ヘテロスポラム（ＣＢＳ ７８２．８３）又はフザリウム・セミテクタム（ＩＢＴ ９５０７）から得られる（好ましくは、得る）ものであり得ることが適している。
したがって、一態様では、本発明の脂肪分解酵素は糸状菌脂肪分解酵素、好ましくは、糸状菌野生型脂肪分解酵素であることが好ましい。
本発明の真菌脂肪分解酵素は、配列番号１又は配列番号２、配列番号４又は配列番号６として示されるアミノ酸配列と、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９８％、好ましくは少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むことが好ましい。
本発明の真菌脂肪分解酵素をコードする核酸は、配列番号３、配列番号５又は配列番号７に示されるヌクレオチド配列と、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９８％、好ましくは少なくとも９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むことが好ましい。
本発明の真菌脂肪分解酵素は、フザリウムタンパク質又はその一部に由来するアミノ酸配列と融合している、サーモマイセスタンパク質又はその一部に由来するアミノ酸配列を含む、融合タンパク質ではないことが好ましい。詳しくは、本発明の真菌脂肪分解酵素は、フザリウム・オキシスポラムタンパク質又はその一部に由来するアミノ酸配列と融合している、サーモマイセス・ラヌギノーサスタンパク質又はその一部に由来するアミノ酸配列を含む、融合タンパク質ではないことが好ましい。
本発明の真菌脂肪分解酵素は、サーモマイセス・ラヌギノーサから得たのものではなく、且つ／又はサーモマイセス・ラヌギノーサから得た酵素の変異体ではないことが好ましい。
本発明の真菌脂肪分解酵素は、フザリウム・ヘテロスポラムＣＢＳ ７８２．８３又はフザリウム・セミテクタム（ＩＢＴ ９５０７）の発酵培養液から単離することが好ましい。
酵素は液体クロマトグラフィーによって精製できることが適している。
精製した真菌脂肪分解酵素のアミノ酸配列は、エドマン分解及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析によって決定できる。
フザリウム・ヘテロスポラムＣＢＳ ７８２．８３由来の部分精製脂肪分解酵素は、ミニスケールベーキング試験において、及びパイロットスケールベーキング試験において調べたところ、極めて良好な結果が得られている。
Ｆ．ヘテロスポラムＣＢＳ ７８２．８３由来の真菌脂肪分解酵素のベーキング効果は、Lipopan F（商標）を上回っていることがわかり、これは、トリグリセリドと比較して、極性脂質、特に、ジガラクトシルジグリセリド（ＤＧＤＧ）などの糖脂質に対する活性の比率の増加と相関していた。
さらに、フザリウム・セミテクタムＩＢＴ ９５０７由来の脂肪分解酵素を生地スラリー中の小麦粉脂質に対する活性について調べたところ、極めて良好な結果が得られている。
Ｆ．セミテクタムＩＢＴ ９５０７由来の脂肪分解酵素は、Lipopan F（商標）と比較して、生地中のガラクト脂質に対しては相当な活性を有し、トリグリセリドに対しては、相対的に低い活性しか有さないとわかった。
本明細書において、用語「食料品」とは、食用及び／又は飼料に適している物質を意味する。
本明細書において、用語「食料品」とは、消費する状態になっている形の食料品を意味する場合もある。しかし、或いは又はさらに、本明細書において、用語食料品とは、食料品の調製に用いられる、１種以上の食品原料を意味する場合もある。ほんの一例として、用語食料品は、生地から製造したベークド製品と前記ベークド製品の調製に用いる生地の双方を包含する。
好ましい一態様では、本発明は、前記のように定義される食料品を提供し、ここでは食料品は以下のもののうち１種以上から選択される：卵、卵ベースの製品、例えば、それだけには限らないが、マヨネーズ、サラダドレッシング、ソース、アイスクリーム、卵粉、改良卵黄及びそれらから製造した製品；ベークド製品、例えば、パン、ケーキ、スイート生地製品、層状生地、液体衣用生地、マフィン、ドーナッツ、ビスケット、クラッカー及びクッキー； 菓子類、例えば、チョコレート、キャンディー、キャラメル、ハラワ（halawa）、無糖ガム及び砂糖入りガム、バブルガム、ソフトバブルガム、チューインガムをはじめとするガム及びプリン；フローズン製品、例えば、ソルベ、好ましくは、フローズン乳製品、例えば、アイスクリーム及びアイスミルク；乳製品、例えば、チーズ、バター、ミルク、コーヒークリーム、ホイップクリーム、カスタードクリーム、ミルク飲料及びヨーグルト；ムース、植物性ホイップクリーム；食用油脂、エアレイテッド（aerated）及び非エアレイテッド（non-aerated）ホイップ製品、水中油型エマルジョン、油中水型エマルジョン、マーガリン、ショートニング及びスプレッド、例えば低脂肪及び超低脂肪スプレッド、ドレッシング、マヨネーズ、ディップ、クリームベースのソース、クリームベースのスープ、飲料、スパイスエマルジョン及びソース。
一態様では、本発明に従う食料品は、生地製品又はベークド製品、例えば、パン、揚げ製品、スナック、ケーキ、パイ、ブラウニー、クッキー、ヌードル、インスタントヌードル、トルティーヤ、クラッカー、グラハムクラッカー、プレッツェル及びポテトチップなどのスナック品、及びパスタであり得る。
もう１つの態様では、本発明に従う食料品は、動物飼料であり得る。
一態様では、本食料品は、以下のもののうち１種以上から選択されることが好ましい：卵、卵ベースの製品、例えば、マヨネーズ、サラダドレッシング、ソース、アイスクリーム、卵粉、改良卵黄及びそれらから製造された製品。
本明細書に記載した用途、特に、製パン用途などの食品用途のうちいくつかでは、本発明の脂肪分解酵素は、例えば、モノグリセリド、脂肪酸のモノグリセリド及びジグリセリドのジアセチル酒石酸エステル、ナトリウムステアロイルラクチレート（ＳＳＬ）及びレシチンをはじめとする１種以上の従来の乳化剤と併用できる。
本発明の脂肪分解酵素は、脂肪を加えたパンレシピにおいて特に好ましいが、これは本発明の脂肪分解酵素のトリグリセリドに対する低活性によるものであり、この結果、短鎖トリグリセリドの割には遊離脂肪酸蓄積が減少し、異臭を減少させるか避けられると考えられる。
これに関連して、用語「脂肪を加えた」とは、小麦粉生地には脂質又は脂肪がまったく添加されていないことを示すために用いる。
さらに又は或いは、本発明の酵素は、１種以上のその他の適した食品用酵素と併用できる。したがって、ベークド製品及び／又は生地に、本発明脂肪分解酵素に加え、少なくとも１種のさらなる酵素を添加できるということは、本発明の範囲内である。このようなさらなる酵素としては、デンプン分解酵素、例えばエンドアミラーゼ又はエキソアミラーゼ、プルラミナーゼ、脱分枝酵素、キシラーゼ、セルラーゼをはじめとするヘミセルラーゼ、酸化還元酵素、例えば、グルコースオキシダーゼ、ピラノースオキシダーゼ、スルフヒドリルオキシダーゼ又はマルトースを酸化するものなどの炭水化物オキシダーゼ、例えば、ヘキソースオキシダーゼ（ＨＯＸ）、リパーゼ、ホスホリパーゼ及びヘキソースオキシダーゼ、プロテアーゼ及びアシルトランスフェラーゼ（例えば、ＷＯ０４／０６４９８７に記載されるものなど）が挙げられる。
本発明の脂肪分解酵素は、食品製造においてα−アミラーゼと併用することが特に好ましい。詳しくは、このアミラーゼはマルトース非生成アミラーゼ、例えば、マルトース非生成エキソアミラーゼ活性、詳しくは、グルカン１，４−α−マルトテトラヒドロラーゼ（ＥＣ ３．２．１．６０）活性（ＷＯ０５／００３３３９に開示されるような）を有するポリペプチドであり得る。適したマルトース非生成アミラーゼは、Powersoft（商標）（Danisco A/S, Denmarkから入手可能）として市販されている。Novamyl（商標）（Novozymes A/S, Denmark）などのマルトース生成アミラーゼも使用できる。一実施形態では、α−アミラーゼと本発明の脂肪分解酵素との併用を、生地、及び／又はベークド製品、例えば、パン、ケーキ、ドーナッツ、ケーキドーナッツ又はベーグルの製造に用いることができる。α−アミラーゼと本発明の脂肪分解酵素との組合せはまた、トルティーヤ、例えばコムギトルティーヤ及び／又はトウモロコシトルティーヤの製造方法における使用にとって好ましいものであり得ると考えられる。
もう１つの好ましい実施形態では、本発明の脂肪分解酵素は、食品製造においてキシラナーゼと併用できる。GRINDAMYL（商標）及びPOWERBake 7000がDanisco A/Sから入手可能な市販のキシラナーゼ酵素の例として挙げられる。キシラナーゼ酵素のその他の例は、ＷＯ０３／０２０９２３及びＷＯ０１／４２４３３に見出すことができる。
本発明の脂肪分解酵素は、キシラナーゼ及びα−アミラーゼと併用できることが好ましい。α−アミラーゼは、マルトース生成α−アミラーゼであっても、マルトース非生成α−アミラーゼ（例えば、Danisco A/Sから市販されている、GRINDAMYL（商標）若しくはPOWERSoft）であってもよく、又はその組合せであってもよいことが適している。
本発明の脂肪分解酵素はまた、酸化酵素、例えば、マルトース酸化酵素（ＭＯＸ）、例えばヘキソースオキシダーゼ（ＨＯＸ）と併用できることも好ましい。適した方法はＷＯ０３／０９９０１６に記載されている。市販のマルトース酸化酵素GRINDAMYL（商標）及びSUREBakeはDanisco A/Sから入手可能である。
場合によっては、本発明の酵素と組み合わせた、α−アミラーゼ、例えば、マルトース非生成エキソアミラーゼ及び／若しくはマルトース生成アミラーゼ、並びに／又はマルトース酸化酵素（ＭＯＸ）を、生地、ベークド製品、トルティーヤ、ケーキ、インスタントヌードル／揚げスナック食品、又はチーズなどの乳製品の調製方法に使用してもよい。
本発明の脂肪分解酵素は、通常、当技術分野で公知の方法によって食料品又はその他の組成物に含める。このような方法としては、食料品又は組成物に脂肪分解酵素を直接添加すること、脂肪分解酵素を安定剤及び／又は担体と組み合わせて添加すること、脂肪分解酵素と安定剤及び／又は担体とを含む混合物を添加することが挙げられる。
本発明とともに使用するのに適した安定剤としては、それだけには限らないが、無機塩（例えば、ＮａＣｌ、硫酸アンモニウム）、ソルビトール、乳化剤及び界面活性剤（例えば、Tween 20、Tween 80、トリグリセリドを含まないPanodan AB100、ポリグリセロールエステル、ソルビタンモノレエート（sorbitanmonoleate）、油（例えば、菜種油、ヒマワリ種子油及び大豆油）、ペクチン、トレハロース及びグリセロールが挙げられる。
本発明とともに使用するのに適した担体としては、それだけには限らないが、デンプン、粉末コムギ、小麦粉、ＮａＣｌ及びクエン酸塩が挙げられる。
グルテン指数はPerten Instruments（Sweden）社製のGlutomatic 2200によって測定できる。グルテン指数を測定するには、ホイロの直後に１５ｇの生地を量りとり、Glutomaticに入れ、２％ＮａＣｌ溶液５００ｍｌで１０分間洗浄する。次いで、洗浄した生地をGluten Index Centrifuge２０１５に移し、２つのグルテン画分を計量し、以下の方程式に従ってグルテン指数を算出する。
グルテン指数=（篩上に残るグルテンの重量×１００）／グルテンの全重量
生地のグルテン指数が、ポリペプチドを添加していない生地と比較して、少なくとも５％増加することが好ましく、グルテン指数は上記のGlutomatic 2200装置によって測定できる。
さらに好ましい態様は、添付の特許請求の範囲並びに以下の説明及び実施例に示す。
利点
驚くべきことに、また、予期しないことに、本発明の真菌脂肪分解酵素は、これまでに同定された真菌由来の脂肪分解酵素（詳しくは、LipopanF（商標））と比較して、極性脂質（リン脂質及び／又は糖脂質）：トリグリセリドに対してかなり高い活性比を有するということがわかった。本発明の前には真菌由来の既知の野生型脂肪分解酵素のうちこの活性を示したものはまったくなかったのでこのことは特に驚くべきことである。研究は脂肪分解酵素変異体（即ち、非天然突然変異誘発に曝されたもの及び／又は何らかのその他の方法で変更されたもの）を調べるために実施したが、真菌由来の天然、野生型酵素がこれらの高度に有益な特徴を有していたとは予想していなかった。
同定された酵素は、製パン用途に用いる場合に優れた機能を有することがわかった。本発明の真菌脂肪分解酵素の使用は、その他の真菌由来の脂肪分解酵素、詳しくはLipopanF（商標）と比較して、生地及び／又はベークド製品に著しく改良された特性をもたらすことが有利である。
低温で活性を保持する脂肪分解酵素、即ち、低温脂肪分解酵素が低温用途における使用に適したものであり得、そのために基質を加熱する必要性が取り除かれることが有利である。このことは、卵黄の酵素処理、食用油の酵素的脱ガムなどの用途において、及びミルク又は乳製品の処理、例えば、チーズ製造に先立つチーズミルクの処理において特に有利であり得る。低温脂肪分解酵素を使用することのさらなる利点は、食料品及び／又は動物飼料に見出すことができ、これでは低い操作温度での重要な活性の保持により、微生物、特に、細菌汚染の危険を低減させて実施される酵素処理が考慮される。さらに、低温での酵素の安定性が高い場合は、これにより工業適用における酵素の効率的な添加及び有効活動時間の延長が考慮される。
技術的効果
例えば、ベークド製品、例えば、パン、蒸しパン及びＵＳホワイトパンブレッドには、本発明の脂肪分解酵素の添加は以下のうち１つ以上をもたらし得る：パンの体積及び柔らかさの改良、保存期間及び／又は老化防止効果の延長、クラム構造の改良、孔の不均一性の減少、平均孔サイズの減少、グルテン指数の増大、フレーバー及び／又は匂いの改良並びに外皮の色の改良。
本発明の酵素は、食料品、例えば、生地及び／又はベークド製品中の乳化剤と置き換えて使用できることが有利である。
本発明の脂肪分解酵素は、ＤＡＴＥＭ、ＳＳＬ、ＣＳＬ、モノグリセリド、ポリソルベート及びTweenなどの乳化剤と相乗効果を有し得る。したがって、本発明の脂肪分解酵素は、１種以上の乳化剤と併用できる。１種以上の乳化剤と組み合わせた本発明の脂肪分解酵素の使用は、本発明の酵素をまったく用いない場合に必要とされる量と比較して、用いる乳化剤の全量を減少させ得るので有利である。
本発明の脂肪分解酵素はまた、親水コロイド、グアー、キサンタン及びペクチンと、並びにヘキソースオキシダーゼなどのマルトース酸化酵素と相乗効果を有し得る。
例えば、ドーナッツ、ケーキドーナッツ、ベーグル、スナックケーキ及びマフィンには、本発明の脂肪分解酵素の使用は、α−アミラーゼ、マルトース生成α−アミラーゼ及びマルトース非生成α−アミラーゼの１種以上と併用した場合に相乗効果をもたらし得る。
例えば、ケーキ、スポンジケーキ及びパームケーキには、本発明の脂肪分解酵素は、１種以上の親水コロイド、例えば、グアー及び／又は１種以上の乳化剤、例えば、ＤＡＴＥＭと併用した場合に、相乗効果をもたらし得る。
例えば、ビスケットには、本発明の脂肪分解酵素の使用は、圧延性及び取扱適性の改良を、特に冷やした場合に（冷圧延性）付与する。
例えば、マヨネーズ及びその他の卵ベースの製品では、本発明の脂肪分解酵素の使用が、テクスチャの改良、平均粒径の減少及び／又は平均粒子分布の減少、熱安定性の改良、マイクロ波性能及び／又は安定性の改良をもたらし得ることが有利である。
ケーキでは、本発明の使用は、柔らかさ、体積の改良、日持ち特性及び保存期間の改良をもたらすことが有利である。
例えば、ヌードル又はヌードル製品、例えば、インスタントヌードルには、本発明の脂肪分解酵素は以下の特徴のうち１つ以上を付与し得る：色／黄色の度合いの改良、より安定な色特性、明度の低下、脂肪含量の低下、テクスチャ及びかむこと（かみ応え）の改良、水活性の低下、破損の減少、中心硬度の上昇及び加工の間の保形の改良。
本発明の脂肪分解酵素を用いて、ヌードル又はヌードル製品、例えば、インスタントヌードルの脂肪含量を低下させ得ることが好ましい。
例えば、トルティーヤでは、本発明の酵素の使用は以下のうち１つ以上をもたらし得る：例えば柔軟性を高めることによるトルティーヤの圧延性の低下、老化防止特性の改良、柔らかさの改良及び／又は異臭の減少。
圧延性及び／又は柔軟性の改良によって、圧延した場合にトルティーヤが割れる可能性が低下し得ることが有利である。
例えば、チーズ及び／又はチーズベースの製品では、本発明の酵素の使用は以下のうち１つ以上をもたらし得る：フレーバー、テクスチャ及び／又は安定性の改良、チーズにおけるオイリングオフ効果の減少及び／又はチーズ収量の増加。
本明細書において、用語「オイリングオフ効果」とは、チーズが溶けた場合に放出される遊離オイルを指す。
本発明の脂肪分解酵素を用いて、低脂肪チーズを製造できる。本発明の酵素はミルク中の脂肪を安定化させ得、且つ／又はフレーバーを増強し得ることが有利である。
本発明の１つの利点は、酵素が低温で機能する（実際、高機能を有する）ということである。これによって、酵素が入れられる用途に応じて、いくつかの利点を有し得る。例えば、チーズ製造では、この機能によって、酵素処理の間の微生物汚染及び微生物増殖の危険を低減できる。このことの理由は酵素処理の間チーズを冷蔵されたままにできるということであり得る。したがって、本発明の脂肪分解酵素は、フレーバーの改良のための低温でのチーズの熟成に特に適している。
例えば、動物飼料では、本発明の酵素は以下のうち１つ以上をもたらし得ることが有利である：動物内での飼料利用／転換効率の増強、動物の体重増加の向上、飼料の消化性の改良、動物による、例えば飼料からの窒素取り込みの改良、飼料の乾物の代謝率の改良及び飼料の嗜好性の改良。
食用油、例えば、植物油の脱ガムでは、本発明の脂肪分解酵素は低温で高い活性を有する。これによって酵素処理に先立って、又は酵素処理の際に油を加熱する必要性が低減され得ることが有利である。このことには、処理を達成するのに必要とされるエネルギー量を低減するという有利な作用がある。本発明の酵素は、トリグリセリドと比較して、リン脂質の減少を選択的に改良し得る。食用油（例えば、植物油）中の本発明の酵素は、リン脂質と比較して、トリグリセリドに対する加水分解活性が低下したものであり得る。これは加水分解されているトリグリセリドの減少（従来の／ホスホリパーゼ酵素と比較して）をもたらしことができ、また、油収量の損失の減少及び／又は油中の遊離脂肪酸蓄積の減少（従来の脂肪分解／ホスホリパーゼ酵素と比較して）をもたらし得る。
用途
本発明の酵素には多数の適用がある。
詳しくは、本発明の真菌脂肪分解酵素は、食料品の調製において有用であり得る。
例えば、本発明の真菌脂肪分解酵素は、卵又は卵ベースの製品の処理において特に有用であり得る。
ホスホリパーゼ、特に、ホスホリパーゼＡ２（Ｅ．Ｃ．３．１．１．４）は、長年にわたって卵又は卵ベースの製品の処理のために用いられている（例えば、ＵＳ４，０３４，１２４及びDutihl & Groger 1981 J. Sci. Food Agric. 32, 451-458参照）。ホスホリパーゼ活性は、卵又は卵ベースの製品の処理の間に、極性リゾレシチンの蓄積をもたらし、これが乳化剤として作用し得る。
卵又は卵ベースの製品の本発明の真菌脂肪分解酵素での処理は、安定性、低温殺菌などの熱処理下での熱安定性を改良し得、また実質的な増粘化をもたらし得る。卵ベースの製品としては、それだけには限らないが、ケーキ、マヨネーズ、サラダドレッシング、ソース、アイスクリームなどが挙げられる。
本発明の真菌脂肪分解酵素は、ベークド製品、例えば、生地から調製されるもの、例えば、パン、ケーキ、スイート生地製品、層状生地、液体衣用生地、マフィン、ドーナッツ、ビスケット、クラッカー及びクッキーの調製において特に有用である。
本発明の真菌脂肪分解酵素はまた、パン改良性添加物、例えば、生地組成物、生地添加物、生地コンディショナー、プレミックス及び改良された特性をパン又はその他のベークド製品に提供するために、パン又はその他のベークド製品の製造工程中に小麦粉及び／又は生地に従来的に添加されている同様の調製物において使用できる。
したがって、本発明はさらに、本発明の真菌脂肪分解酵素を含む、パン改良性組成物及び／又は生地改良性組成物、並びにまたこのようなパン改良性組成物及び／又は生地改良性組成物を含む生地又はベークド製品に関する。
パン改良性組成物及び／又は生地改良性組成物は、本発明の真菌脂肪分解酵素の他、ベーキングにおいて生地及び／又はベークド製品の特性を改良するために従来的に用いられるその他の物質を含み得る。
パン改良性組成物及び／又は生地改良性組成物は、１種以上の従来のベーキング剤、例えば、以下の成分のうち１種以上を含み得る：
粉乳、グルテン、乳化剤、粒状脂肪、酸化剤、アミノ酸、糖、塩、小麦粉又はデンプン。
適した乳化剤の例としては、モノグリセリド、脂肪酸のモノグリセリド及びジグリセリドのジアセチル酒石酸エステル、糖エステル、ナトリウムステアロイルラクチレート（ＳＳＬ）及びレシチンがある。
パン改良性組成物及び／又は生地改良性組成物にはさらに、別の酵素、例えば、１種以上のその他の適した食品用酵素、例えば、デンプン分解酵素、例えばエンドアミラーゼ又はエキソアミラーゼ、プルラミナーゼ、脱分枝酵素、キシラーゼ、セルラーゼをはじめとするヘミセルラーゼ、酸化還元酵素、例えば、グルコースオキシダーゼ、ピラノースオキシダーゼ、スルフヒドリルオキシダーゼ又はマルトースを酸化するものなどの炭水化物オキシダーゼ、例えば、ヘキソースオキシダーゼ（ＨＯＸ）、リパーゼ、ホスホリパーゼ及びヘキソースオキシダーゼ、プロテアーゼ及びアシルトランスフェラーゼ（例えば、ＷＯ０４／０６４９８７に記載されるものなど）を含めることができる。
本明細書において、用語「改良された特性」とは、本発明の真菌脂肪分解酵素の作用によって改良され得るいずれかの特性を意味する。詳しくは、本発明の真菌脂肪分解酵素の使用により以下の特徴のうち１つ以上がもたらされる：ベークド製品の体積の増加、ベークド製品のクラム構造の改良、ベークド製品における老化防止特性、強度の増大、安定性の増大、生地の粘性の低下及び／又は機械加工性の改良。
改良された特性は、本発明の脂肪分解酵素を添加せずに調製した生地及び／又はベークド製品と比較することによって評価する。
本明細書において、用語「ベークド製品」とは、生地から調製された製品を含む。本発明によって有利に製造できるベークド製品の例としては（ホワイト、ライト又はダークタイプにかかわらず）、以下のもののうち１種以上が挙げられる：通常、ひと塊、又はロール又はトーストの形のパン（ホワイト、全粒パン及びライ麦パンを含む）、フレンチバゲット型のパン、ピタパン、トルティーヤ、タコス、ケーキ、パンケーキ、ビスケット、クリスプブレッド、パスタ、ヌードルなど。
本発明に従う生地は、発酵させて膨らませた生地又は発酵に付される生地であり得る。生地は、炭酸水素ナトリウムなどを添加することによって、又はサッカロミセスセレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）（パン酵母）の培養物などの適した酵母培養物を添加することによってなど、種々の方法で発酵させて膨らませることができる。
本発明はさらに、好ましくは、デュラム小麦粉又は同程度の品質の小麦粉から調製したパスタ生地を製造するための、本発明に従う真菌脂肪分解酵素の使用に関する。
本発明の真菌脂肪分解酵素は、植物油又は食用油の酵素的脱ガムにおける使用に適している。植物油又は食用油の加工では、食用油又は植物油を本発明の真菌脂肪分解酵素で処理して極性脂質（例えば、リン脂質及び／又は糖脂質）の大部分を加水分解する。脂肪酸アシル基が極性脂質から加水分解されることが好ましい。脱ガムプロセスは、通常、極性脂質、例えば、糖脂質及び／又はリン脂質の大部分（即ち、５０％より多く）の加水分解によって、食用油中の極性脂質、特に、リン脂質の含量を低下させる。通常、加水分解された極性脂質（例えば、リン脂質及び／又は糖脂質）を含有する水相を油から分離する。食用油又は植物油は、最初に（本発明の酵素でのプレトリートメント）５０〜２５０ｐｐｍのリン含量を有し得ることが適している。
さらに、本発明はチーズ製品の処理のための本発明の脂肪分解酵素の使用を対象とする。
本発明の脂肪分解酵素はまた、動物飼料の調製における使用に特に適している。
当業者ならば承知しているであろうが、本明細書において、用語「脱ガムすること」とは、ホスファチド（例えば、レシチン、ホスポホリピッド（phospoholipids）及び吸蔵油）を水和可能なホスファチドに変換することによって、油を精製することを意味する。脱ガムされている油はより流動性があり、したがって、脱ガムされていない油より良い取扱適性を有する。
以下の表は単に全体的な手引きのためのものであって、種々の適用において必要とされ得る本発明の脂肪分解酵素の添加量レベルの概観を提供する。この表はさらに、例えば乳化剤と併用した場合の、本発明の脂肪分解酵素の添加量レベルに関する手引きを提供する。当業者には明らかであろうが、もちろん、所与の適用のいずれにとっても、酵素添加量、反応温度及び反応時間の最適化は、慣例の実験を用いて容易に決定できる。
単離
一態様では、本配列は、単離された形であることが好ましい。用語「単離された」とは、配列が、自然界では天然に関連しており、同様に自然界に見られる、少なくとも１種のその他の成分を少なくとも実質的に含まないことを意味する。
精製
一態様では、本配列は精製された形であることが好ましい。用語「精製された」とは、配列が相対的に純粋な状態にある、例えば、少なくとも約９０％純粋又は少なくとも約９５％純粋又は少なくとも約９８％純粋であることを意味する。
ヌクレオチド配列
本発明の範囲には本明細書に定義される特定の特性を有する酵素をコードするヌクレオチド配列が包含される。
本明細書において、用語「ヌクレオチド配列」とは、オリゴヌクレオチド配列又はポリヌクレオチド配列、及びその変異体、相同体、断片及び誘導体（例えばその一部）を指す。ヌクレオチド配列はゲノム起源のものであっても、合成起源のものであっても組換え起源のものであってもよく、センス鎖又はアンチセンス鎖を表すかにかかわらず、二本鎖であっても一本鎖であってもよい。
本発明に関して用語「ヌクレオチド配列」は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ及びＲＮＡを含む。ＤＮＡを意味することが好ましく、本発明をコードするｃＤＮＡ配列がより好ましい。
好ましい実施形態では、ヌクレオチド配列は、本発明の範囲自体に関連している場合、及び本発明の範囲自体によって包含される場合、本発明の天然のヌクレオチド配列を、その天然環境にある場合及び同様にその天然環境にあるその天然に関連している配列と結合している場合に含まない。参照を容易にするために、本発明者らはこの好ましい実施形態を「非天然ヌクレオチド配列」と呼ばなくてはならない。これに関連して、用語「天然ヌクレオチド配列」とは、その天然環境中にある全ヌクレオチド配列を意味し、天然に関連している全プロモーターと機能しうる形で連結している場合には、そのプロモーターも天然環境にある。しかし、本発明の範囲によって包含されるアミノ酸配列は、その天然生物におけるヌクレオチド配列の発現後に単離及び／又は精製できる。しかし、本発明の範囲によって包含されるアミノ酸配列は、その天然生物においてヌクレオチド配列によって発現され得るが、そのヌクレオチド配列は、その生物内で天然に関連しているプロモーターの制御下にないことが好ましい。
ヌクレオチド配列の調製
通常、本発明の範囲によって包含されるヌクレオチド配列は、組換えＤＮＡ技術を用いて（即ち、組換えＤＮＡ）調製する。しかし、本発明の代替実施形態では、ヌクレオチド配列は、当技術分野で周知の化学法を用いて全体で又は一部で合成され得る（Caruthers MH et al., (1980) Nuc Acids Res Symp Ser 215-23及びHorn T et al., (1980) Nuc Acids Res Symp Ser 225-232参照）。
本明細書に定義される特定の特性を有する酵素をコードするヌクレオチド配列は、その酵素を産生するいずれかの細胞又は生物から同定及び／又は単離及び／又は精製できる。ヌクレオチド配列を同定及び／又は単離及び／又は精製するための種々の方法が当技術分野ではよく知られている。例として、適した配列が同定及び／又は単離及び／又は精製されると、いっそう多くの配列を調製するためのＰＣＲ増幅技術を使用できる。
さらなる例としては、酵素を産生する生物に由来する染色体ＤＮＡ又はメッセンジャーＲＮＡを用いて、ゲノムＤＮＡ及び／又はｃＤＮＡライブラリーを構築できる。酵素のアミノ酸配列又は酵素のアミノ酸配列の一部が既知である場合には、標識したオリゴヌクレオチドプローブを合成及び使用し、生物から調製したゲノムライブラリーから酵素をコードしているクローンを同定できる。或いは、別の既知酵素遺伝子と相同な配列を含有する標識したオリゴヌクレオチドプローブを用いて、酵素をコードするクローンを同定することができる。後者の場合には、より低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件及び洗浄条件を用いる。
或いは、酵素をコードするクローンは、ゲノムＤＮＡの断片を発現ベクター、例えば、プラスミド、形質転換酵素陰性細菌に挿入してゲノムＤＮＡライブラリーを得、次いで形質転換された細菌を、酵素の基質（例えば、グルコシダーゼ（マルターゼ）産生酵素のマルトース）を含有するアガープレート上にプレーティングし、それによって酵素を発現するクローンが同定されることが可能となることによって同定できる。
なおさらなる代替法では、酵素をコードするヌクレオチド配列を、確立された標準法、例えば、Beucage S.L. et al., (1981) Tetrahedron Letters 22, p 1859-1869によって記載された、ホスホロアミダイト（phosphoroamidite）法又はMatthes et al., (1984) EMBO J. 3, p 801-805によって記載された方法によって合成によって調製できる。ホスホロアミダイト法では、オリゴヌクレオチドを、例えば、自動ＤＮＡシンセサイザーで合成し、精製し、アニーリングし、ライゲーションし、適当なベクターにクローニングする。
ヌクレオチド配列は、標準技術に従って（必要に応じて）合成起源、ゲノム起源又はｃＤＮＡ起源の断片のライゲーションによって調製された、ゲノム起源と合成起源の混合されたものであってもよいし、合成起源とｃＤＮＡ起源の混合されたものであってもよいし、ゲノム起源とｃＤＮＡ起源の混合されたものであってもよい。各ライゲーションされた断片は、全ヌクレオチド配列の種々の部分に相当する。ＤＮＡ配列はまた、例えば、ＵＳ４，６８３，２０２又はSaiki R K et al., (Science (1988) 239, pp 487-491)に記載されるように、特異的なプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって調製することもできる。
遺伝暗号の縮重によって、ヌクレオチド配列を容易に作製でき、これでは、最初のヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸のいくつか又はすべてについて、トリプレットコドン使用が変更されており、それによって最初のヌクレオチド配列と相同性が低いが、最初のヌクレオチド配列によってコードされるものと同一、又は変異体、アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列が得られる。例えば、ほとんどのアミノ酸について、遺伝暗号の縮重はトリプレットコドン中の３番目の位置（ゆらぎ位置）であり（参考のため、Stryer, Lubert, Biochemistry, Third Edition, Freeman Press, ISBN 0-7167-1920-7参照）、したがって、すべてのトリプレットコドンが３番目の位置で「ゆらいでいる」ヌクレオチド配列は、最初のヌクレオチド配列と約６６％同一となる。しかし、修正されたヌクレオチド配列は、最初のヌクレオチド配列と同一、又は変異体、一次アミノ酸配列をコードする。
したがって、本発明はさらに、少なくとも１個のアミノ酸をコードするトリプレットコドンについて代替トリプレットコドン使用を有するが、最初のヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列と同一、又は変異体、ポリペプチド配列をコードするいずれかのヌクレオチド配列に関する。
さらに、特定の生物は、通常、アミノ酸をコードするために用いられるトリプレットコドンについて偏りを有する。好ましいコドン使用表は広く入手可能であり、これを用いてコドン最適化遺伝子を調製することができる。このようなコドン最適化技術は、異種宿主におけるトランスジーンの発現を最適化するために慣例的に用いられている。
アミノ酸配列
本発明の範囲はまた、本明細書に定義される特定の特性を有する酵素のアミノ酸配列を包含する。
本明細書において、用語「アミノ酸配列」とは、用語「ポリペプチド」及び／又は用語「タンパク質」と同義語である。用語「アミノ酸配列」が用語「ペプチド」と同義語である場合もある。用語「アミノ酸配列」が用語「酵素」と同義語である場合もある。
本アミノ酸配列は、適した供給源から調製／単離でき、又は合成によって作製することもでき、又は組換えＤＮＡ技術の使用によって調製することもできる。
本発明に包含される酵素はその他の酵素と併用できる。したがって、本発明はまた、酵素の組合せを対象とし、これでは、組合せは、本発明の酵素と、別の本発明の酵素であり得る別の酵素とを含む。
アミノ酸配列は、本発明の範囲自体と関連している場合、及び本発明の範囲自体に包含される場合には、天然の酵素ではないことが好ましい。これに関連して、用語「天然の酵素」とは、天然環境にあり、その天然ヌクレオチド配列によって発現されている場合の全酵素を意味する。
同一性／相同性
本発明はまた、酵素のいずれかのアミノ酸配列の、又はそのような酵素をコードするいずれかのヌクレオチド配列の相同体の使用を包含する。
ここで、用語「相同体」とは、アミノ酸配列及びヌクレオチド配列と特定の相同性を有する実体を意味する。ここで、用語「相同性」とは、「同一性」と同等として扱うことができる。本明細書ではこれらの用語は同義的に用いる。
これに関連して、相同アミノ酸配列は、配列と少なくとも９２％同一であり得る、好ましくは少なくとも９５、９６、９７、９８又は９９％同一であり得るアミノ酸配列を含むととられる。通常、相同体は、同一の活性部位など−例えば、主題アミノ酸配列のようなものを含む。相同性は類似性（即ち、類似の化学特性／機能を有するアミノ酸残基）という用語でも考えられるが、本発明の範囲では、配列同一性という用語で相同性を表すことが好ましい。
本発明の相同アミノ酸配列は、少なくとも３０個、より好ましくは４０個の連続するアミノ酸の領域にわたって、少なくとも９０％の同一性、より好ましくは少なくとも９５、９６、９７、９８又は９９％の同一性を有するものであることが好ましい。
これに関連して、相同ヌクレオチド配列は、本発明の酵素をコードするヌクレオチド配列（主題配列）と、少なくとも９２％同一であり得る、好ましくは少なくとも９５、９６、９７、９８又は９９％同一であり得るヌクレオチド配列を含むととられる。通常、相同体は主題配列のような活性部位などをコードする同一配列を含む。相同性は類似性（即ち、類似の化学特性／機能を有するアミノ酸残基）という用語でも考えられるが、本発明の範囲では、配列同一性という用語で相同性を表すことが好ましい。
本発明の相同ヌクレオチド配列は、少なくとも３０個、好ましくは４０個、より好ましくは６０個の連続するヌクレオチドの領域にわたって、少なくとも９０％の同一性、より好ましくは少なくとも９５、９６、９７、９８又は９９％の同一性を有するものであることが好ましい。
アミノ酸配列及びヌクレオチド配列について、相同性比較は目で見て実施でき、より通常は、容易に入手できる配列比較プログラムを用いて実施できる。これらの市販のコンピュータプログラムは、２以上の配列間の相同性％を算出できる。
相同性％は連続する配列にわたって算出でき、即ち、一方の配列をもう一方の配列と整列させ、また一方の配列中の各アミノ酸を、もう一方の配列中の対応するアミノ酸と、一度に一残基、直接比較する。これは「ギャップなし」アラインメントと呼ばれる。通常、このようなギャップなしアラインメントは比較的短い数の残基にわたってでのみ実施する。
これは極めて単純な、一貫した方法であるが、例えば、１個の挿入又は欠失が以後のアミノ酸残基をアラインメントから出してしまうが、そうでなければ同一である配列対を考慮できず、したがって、全体的なアラインメントを実施すると相同性％が大きく減少してしまう可能性がある。したがって、ほとんどの配列比較法は、あり得る挿入及び欠失を考慮し、全体的な相同性スコアに過度のペナルティーを課さず、最適アラインメントが得られるよう設計されている。これは局所相同性を最大にしようとして配列アラインメントに「ギャップ」を挿入することによって達成される。
しかし、これらのより複雑な方法では、同一数の同一アミノ酸について、できる限り少ないギャップを含む配列アラインメント−２つの比較される配列間のより高い類似性を反映する−が、多数のギャップを含むものより高いスコアを達成するよう、「ギャップペナルティー」を、アラインメントに生じる各ギャップに割り当てる。ギャップの存在に相対的に高いコストを課し、ギャップ中のその後の各残基にはより小さいペナルティーを課す、「アフィンギャップコスト」が通常用いられる。これは最もよく用いられるギャップスコアリングシステムである。高いギャップペナルティーによって、当然、より少ないギャップしか含まない最適化されたアラインメントが得られる。ほとんどのアラインメントプログラムではギャップペナルティーが改変されるのが許容されている。しかし、配列比較にこのようなソフトウェアを用いる場合にはデフォルト値を用いることが好ましい。例えば、GCG Wisconsin Bestfitパッケージを用いる場合には、アミノ酸配列のデフォルトギャップペナルティーはギャップに対しては−１２であり、各延長に対しては−４である。
したがって、最大相同性％の算出には、まず、ギャップペナルティーを考慮した最適アラインメントの作製が必要である。このようなアラインメントを実施するのに適したコンピュータプログラムとしては、GCG Wisconsin Bestfitパッケージ（Devereux et al 1984 Nuc. Acids Research 12 p387）がある。配列比較を実施できるその他のソフトウェアの例としては、それだけには限らないが、BLASTパッケージ（Ausubel et al., 1999 Short Protocols in Molecular Biology, 4th Ed - Chapter 18参照）、FASTA（Altschul et al., 1990 J. Mol. Biol. 403-410）及び比較ツールのGENEWORKS一式が挙げられる。BLAST及びFASTAは双方とも、オフライン及びオンライン検索に利用可能である（Ausubel et al., 1999, Short Protocols in Molecular Biology, pages 7-58 to 7-60参照）。
しかしながら、いくつかの適用には、GCG Bestfitプログラムを用いることが好ましい。BLAST2 Sequencesと呼ばれる新規ツールもタンパク質及びヌクレオチド配列を比較するのに利用可能である（FEMS Microbiol Lett 1999 174 (2): 247-50; FEMS Microbiol Lett 1999 177 (1): 187-8及びtatiana@ncbi.nlm.nih.gov参照）。
最終相同性％は、同一性という点で測定できるが、アラインメントプロセス自体は、通常、全か無かの対比較に基づいているわけではない。そうではなく、スコアを化学的類似性、又は進化距離に基づいて各対比較に割り当てる、スケールド類似性スコアマトリックスが一般に用いられる。よく用いられるこのようなマトリックスの例としては、BLOSUM62マトリックス−BLASTプログラム一式のデフォルトマトリックス−がある。GCG Wisconsinプログラムは、通常、公開デフォルト値又は提供されている場合には、カスタム記号比較表のいずれかを用いる（さらなる詳細についてはユーザマニュアル参照）。いくつかの適用には、GCGパッケージの公開デフォルト値を用いることが好ましく、またその他のソフトウェアの場合には、BLOSUM62などのデフォルトマトリックスを用いることが好ましい。
或いは、相同性パーセンテージは、DNASIS（商標）（Hitachi Software）において、CLUSTAL（Higgins DG & Sharp PM (1988), Gene 73 (1), 237-244）と類似のアルゴリズムに基づいて、マルチプルアラインメント特性を用いて算出できる。
ソフトウェアによって最適アラインメントが得られると、相同性％、好ましくは配列同一性％を算出することが可能である。ソフトウェアは通常これを配列比較の一環として行い、計算結果を作成する。
配列はまた、サイレント変化を生じ、機能的に同等な物質をもたらすアミノ酸残基の欠失、挿入又は置換を有することもある。アミノ酸特性（例えば、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性及び／又は両親媒性）の類似性に基づいて、周到なアミノ酸置換を行うことができ、したがって、アミノ酸を機能上の群にまとめることは有用である。アミノ酸はその側鎖の特性のみに基づいて群にまとめることができる。しかし、突然変異データも同様に含めることがより有用である。このように導いたアミノ酸のセットは機能上の理由から保存される可能性が高い。これらのセットは、ベン図の形で記載することができる（Livingstone C.D. and Barton G.J. (1993) "Protein Sequence alignments: a strategy for the hierarchical analysis of residue conservation" Comput.Appl Biosci. 9: 745-756）（Taylor W.R. (1986) "The classification of amino acid conservation" J.Theor.Biol. 119; 205-218）。保存的置換は、例えば、一般に認められているアミノ酸のベン図分類を記載する以下の表に従って行うことができる。
本発明はまた、生じ得る相同置換（置換（substitution）及び置換（replacement）は、本明細書では双方とも既存のアミノ酸残基の、代替残基での交換を意味するよう用いられる）、即ち、塩基性に塩基性、酸性に酸性、極性に極性などといった同種置換も包含する。非相同置換、即ち、あるクラスの残基から別のものへの置換、或いはオルニチン（本明細書では以下Ｚと呼ぶ）、ジアミノ酪酸（本明細書では以下Ｂと呼ぶ）、ノルロイシンオルニチン（本明細書では以下Ｏと呼ぶ）、ピリイルアラニン（pyriylalanine）、チエニルアラニン、ナフチルアラニン及びフェニルグリシンなどの非天然アミノ酸の包含に関する置換も起こり得る。
置換はまた非天然アミノ酸によってなされる場合もある。
変異体アミノ酸配列は、配列中のいずれか２つのアミノ酸残基間に挿入されている場合がある、適したスペーサー基を含む場合があり、これとしては、アミノ酸スペーサー、例えば、グリシン又はβ−アラニン残基の他、アルキル基、例えば、メチル、エチル又はプロピル基が挙げられる。変異体のさらなる形は、ペプトイド型の１個以上のアミノ酸残基の存在を含み、これは当業者には十分に理解されよう。誤解を避けるために、「ペプトイド型」とは、α−炭素置換基が、α−炭素ではなく残基の窒素原子上にある変異体アミノ酸残基を指すよう用いられる。ペプトイド型のペプチドの調製方法は当技術分野では公知である。例えば、Simon RJ et al., PNAS (1992) 89 (20), 9367-9371及びHorwell DC, Trends Biotechnol. (1995) 13 (4), 132-134。
本発明に用いるヌクレオチド配列は、その内部に合成ヌクレオチド又は修飾ヌクレオチドを含み得る。いくつかの異なる種類の、オリゴヌクレオチドへの修飾が当技術分野では公知である。これらとしては、メチルホスホネート及びホスホロチオエート主鎖並びに／又は分子の３’及び／若しくは５’末端でのアクリジン又はポリリジン鎖の付加が挙げられる。本発明の目的上、本明細書に記載されるヌクレオチド配列は、当技術分野で利用可能ないずれの方法によっても修飾され得るということは理解されなくはならない。このような修飾は、本発明のヌクレオチド配列のインビボ活性又は寿命を増強するために実施できる。
本発明はまた、本明細書に示される配列と相補的であるヌクレオチド配列、又はいずれかの誘導体、断片若しくはその誘導体の使用を包含する。配列がその断片と相補的である場合には、その配列を、他の生物などにおいて、同様のコード配列を同定するためのプローブとして使用できる。
本発明の配列と１００％相同ではないが、本発明の範囲内に入るポリヌクレオチドはいくつかの方法で得ることができる。本明細書に記載される配列のその他の変異体は、例えば、個体、例えば、異なる集団に由来する個体という範囲から作製したＤＮＡライブラリーを探索することによって得ることができる。さらに、その他の相同体を得ることができ、このような相同体及びその断片は、一般に、本明細書に列挙される配列中に示される配列と選択的にハイブリダイズし得る。このような配列は、その他の種から作製したｃＤＮＡライブラリー又はゲノムＤＮＡライブラリーを探索すること、及びこのようなライブラリーを、中程度から高いストリンジェンシーという条件下で、添付の配列表中のいずれか１つの配列のすべて又は一部を含むプローブを用いて探索することによって得ることができる。同様の検討が、本発明のポリペプチド又はヌクレオチド配列の種相同体及び対立遺伝子多型を得ることに当てはまる。
変異体及び系統／種相同体はまた、本発明の配列内の保存されたアミノ酸配列をコードする、変異体及び相同体内の配列を標的とするよう設計されたプライマーを用いる縮重ＰＣＲを用いて得ることもできる。保存された配列は、例えば、数種の変異体／相同体に由来するアミノ酸配列をアラインすることによって予測できる。配列アラインメントは、当技術分野で公知のコンピュータソフトウェアを用いて実施できる。例えば、GCG Wisconsin PileUpプログラムが広く用いられている。
縮重ＰＣＲに用いられるプライマーは、１つ以上の縮重位置を含み、既知配列に対する単一の配列プライマーを用いる配列のクローニングに用いられるものよりも低いストリンジェンシー条件で用いられる。
或いは、このようなポリヌクレオチドは、特性決定された配列の部位特異的突然変異誘発によって得ることができる。これは、例えば、そのポリヌクレオチド配列が発現されている特定の宿主細胞にとってのコドン優先度を最適化するために、サイレントなコドン配列変化が必要とされる場合に有用であり得る。その他の配列変化が制限酵素認識部位を導入するために、又はそのポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの特性若しくは機能を変更するために求められる場合もある。
本発明のポリヌクレオチド（ヌクレオチド配列）は、プライマー、例えば、ＰＣＲプライマー、代替増幅反応のためのプライマー、プローブ、例えば、放射性標識又は非放射性標識を用いて従来の手段によって提示標識で標識されたプローブを作製するために使用でき、又は本ポリヌクレオチドはベクターにクローニングすることもできる。このようなプライマー、プローブ及びその他の断片の長さは、少なくとも１５個、好ましくは少なくとも２０個、例えば、少なくとも２５、３０又は４０個のヌクレオチドであり、また本明細書において用いられる、用語本発明のポリヌクレオチドに包含される。
本発明のＤＮＡポリヌクレオチド及びプローブなどのポリヌクレオチドは、組み換えによって作製してもよく、合成によって作製してもよく、当業者に利用可能な手段であればいずれによって作製してもよい。それらはまた、標準的な技術によってクローニングできる。
一般に、プライマーは合成手段によって作製し、これは一度に１ヌクレオチドの所望の核酸配列の段階的な製造を含む。自動化技術を用いてこれを達成する技術は、当技術分野で容易に利用可能である。
より長いポリヌクレオチドは、一般に、組換え手段を用いて、例えば、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）クローニング技術を用いて作製する。プライマーは適した制限酵素認識部位を含むよう設計することができ、その結果、増幅されたＤＮＡを適したクローニングベクターにクローニングすることができる。
生物学的活性
変異体配列などは、本明細書に提示される配列と少なくとも同程度に生物学的に活性であることが好ましい。
本明細書において「生物学的に活性」とは、天然に存在する配列と同様の構造的機能（しかし、必ずしも同程度ではない）及び／又は同様の制御機能（しかし、必ずしも同程度ではない）、及び／又は同様の生化学的機能（しかし、必ずしも同程度ではない）を有する配列を指す。
ハイブリダイゼーション
本発明はまた、本発明の核酸配列と相補的である配列、又は本発明の配列若しくはそれに相補的である配列のいずれかとハイブリダイズできる配列を包含する。
本明細書において、用語「ハイブリダイゼーション」とは、「核酸の一本の鎖が相補的な鎖と塩基対形成によって結合するプロセス」並びにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術で実施されるような増幅プロセスを含むものとする。
本発明はまた、本明細書に提示される配列、又はいずれかの誘導体、断片若しくはその誘導体と相補的である配列とハイブリダイズできるヌクレオチド配列の使用を包含する。
用語「変異体」はまた、本明細書に提示されるヌクレオチド配列とハイブリダイズできる配列と相補的である配列を包含する。
用語「変異体」は、ストリンジェントな条件（例えば、５０℃及び０．２×ＳＳＣ｛１×ＳＳＣ＝０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ クエン酸Ｎａ３ ｐＨ７．０｝）下で本明細書に提示されるヌクレオチド配列とハイブリダイズできる配列と相補的である配列を包含することが好ましい。
用語「変異体」は、高ストリンジェント条件（例えば、６５℃及び０．１×ＳＳＣ｛１×ＳＳＣ＝０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ クエン酸Ｎａ３ ｐＨ７．０｝）下で本明細書に提示されるヌクレオチド配列とハイブリダイズできる配列と相補的である配列を包含することがより好ましい。
本発明はまた、本発明のヌクレオチド配列（本明細書に提示されるものの相補配列を含む）とハイブリダイズできるヌクレオチド配列に関する。
本発明はまた、本発明のヌクレオチド配列（本明細書に提示されるものの相補配列を含む）とハイブリダイズできる配列と相補的であるヌクレオチド配列に関する。
中程度から最高のストリンジェンシーという条件下で、本明細書に提示されるヌクレオチド配列とハイブリダイズできるポリヌクレオチド配列も本発明の範囲内に含まれる。
好ましい一態様では、本発明は、ストリンジェントな条件（例えば、５０℃及び０．２×ＳＳＣ）下で本発明のヌクレオチド配列、又はその補体とハイブリダイズできるヌクレオチド配列を対象とする。
より好ましい一態様では、本発明は、高ストリンジェントな条件（例えば、６５℃及び０．１×ＳＳＣ）下で本発明のヌクレオチド配列、又はその補体とハイブリダイズできるヌクレオチド配列を対象とする。
組換え体
一態様では、本発明に用いる配列は、組換え配列、即ち、組換えＤＮＡ技術を用いて調製された配列である。
これらの組換えＤＮＡ技術は、当業者の能力の範囲内である。このような技術は文献、例えばJ. Sambrook, E. F. Fritsch, and T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Books 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Pressに説明されている。
合成
一態様では、本発明に用いる配列は、合成配列、即ち、インビトロ化学合成又は酵素的合成によって調製された配列である。それは、それだけには限らないが、宿主生物−例えば、メチロトローフ酵母ピチア（Pichia）及びハンゼヌラ（Hansenula）にとって最適コドン使用で作製された配列を含む。
酵素の発現
本発明に用いるヌクレオチド配列は、組換え複製可能ベクターに組み込むことができる。ベクターを用いてヌクレオチド配列を酵素の形で、適合する宿主細胞において、及び／又は適合する宿主細胞から複製及び発現することができる。
発現は、制御配列、例えば調節配列を用いて制御できる。
ヌクレオチド配列の発現によって宿主組換え細胞によって産生される酵素は、用いる配列及び／又はベクターに応じて、分泌される場合もあり、又は細胞内に含まれる場合もある。コード配列は、物質コード配列の、特定の原核生物の細胞膜又は真核生物の細胞膜を通る分泌に向けるシグナル配列を用いて設計できる。
発現ベクター
用語「発現ベクター」とは、インビボ又はインビトロ発現できる構築物を意味する。
発現ベクターは、適した宿主生物のゲノムに組み込まれることが好ましい。用語「組み込まれる」とは、ゲノムへの安定な組込みを対象とすることが好ましい。
本発明のヌクレオチド配列は、ベクター中に存在でき、これでは、ヌクレオチド配列は、適した宿主生物によるヌクレオチド配列の発現を提供できる調節配列と機能しうる形で連結されている。
本発明に用いるベクターは、以下に記載される適した宿主細胞に形質転換し、本発明のポリペプチドの発現を提供できる。
ベクター、例えば、プラスミド、コスミド又はファージベクターの選択は、それが導入されようとする宿主細胞に応じて変わることが多い。
本発明に用いるベクターは、１種以上の選択マーカー遺伝子、例えば、抗生物質耐性、例えば、アンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール又はテトラサイクリン耐性を付与する遺伝子を含み得る。或いは、選択は同時形質転換によっても達成できる（ＷＯ９１／１７２４３に記載されているような）。
ベクターは、例えば、ＲＮＡの製造のためにインビトロで使用でき、又は宿主細胞をトランスフェクト、形質転換、形質導入するために、又は宿主細胞に感染させるために使用できる。
したがって、さらなる実施形態では、本発明は、本発明ヌクレオチド配列を複製可能なベクターに導入することと、ベクターを適合する宿主細胞に導入することと、ベクターの複製が起こる条件下で宿主細胞を増殖させることとによって、本発明のヌクレオチド配列を作製する方法を提供する。
ベクターはさらに、ベクターが、問題の宿主細胞において複製するのを可能にするヌクレオチド配列を含み得る。このような配列の例としては、プラスミドpUC19、pACYC177、pUB110、pE194、pAMB1及びpIJ702の複製開始点がある。
調節配列
いくつかの適用では、本発明に用いるヌクレオチド配列は、例えば、選択された宿主細胞によるヌクレオチド配列の発現を提供し得る調節配列と機能しうる形で連結されている。例として、本発明は、このような調節配列と機能しうる形で連結されている本発明のヌクレオチド配列を含む、即ち、発現ベクターであるベクターを対象とする。
用語「機能しうる形で連結されている」とは、並べることを指し、これでは記載される成分が、その意図される方法で機能するのを可能にする関係にある。コード配列に「機能しうる形で連結されている」調節配列は、コード配列の発現が制御配列に適合する条件下で達成されるような方法で結合されている。
用語「調節配列」は、プロモーター及びエンハンサー及びその他の発現調節シグナルを含む。
用語「プロモーター」は、当技術分野での通常の意味、例えばＲＮＡポリメラーゼ結合部位で用いる。
本発明の酵素をコードするヌクレオチド配列の発現の増強はまた、異種調節領域、例えば、プロモーター、分泌リーダー及びターミネーター領域の選択によっても達成できる。
本発明のヌクレオチド配列は、少なくとも１つのプロモーターと機能しうる形で連結していることが好ましい。
細菌、真菌又は酵母宿主においてヌクレオチド配列の転写に向ける、適したプロモーターの例は、当技術分野では周知である。
構築物
用語「構築物」−これは、「複合物」、「カセット」及び「ハイブリッド」などの用語と同義である−は、プロモーターと直接又は間接的に結合している本発明の使用のためのヌクレオチド配列を含む。
間接結合の例としては、プロモーターと本発明のヌクレオチド配列の間に介在する、適したスペーサー基、例えば、Ｓｈ１−イントロン又はＡＤＨイントロンなどのイントロン配列の提供がある。同じことが、本発明に関連して用語「融合された」に当てはまり、これは直接結合又は間接結合を含む。この用語は、通常野生型遺伝子プロモーターと結合しているタンパク質をコードするヌクレオチド配列の天然の組合せを、それらが双方ともその天然環境にある場合には対象としないことがある。
構築物はさらに、マーカーを含み得るか、発現でき、これによって遺伝的構築物の選択が可能となる。
いくつかの適用には、本発明の構築物は、少なくとも、プロモーターと機能しうる形で結合している本発明のヌクレオチド配列を含むことが好ましい。
宿主細胞
本発明に関連して、用語「宿主細胞」は、上記のようなヌクレオチド配列か発現ベクターのいずれかを含むいずれかの細胞を含み、本明細書に定義されるような特定の特性を有する酵素の組換え生産において用いられる。
したがって、本発明のさらなる実施形態は、本発明の酵素を発現するヌクレオチド配列を用いて形質転換された、又はトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。細胞は、前記ベクターと適合するよう選択され、例えば、原核細胞（例えば、細菌細胞）、真菌細胞、酵母細胞又は植物細胞であり得る。宿主細胞は非ヒト細胞であることが好ましい。
適した細菌宿主生物の例としては、グラム陽性菌種又はグラム陰性菌種がある。
本発明の酵素をコードするヌクレオチド配列の性質、及び／又は発現されたタンパク質のさらなるプロセシングのために望ましいことによっては、酵母又はその他の真菌などの真核細胞の宿主が好ましいものである場合がある。一般に、酵母細胞は真菌細胞を上回って好ましいが、これはそれらが操作するのがより容易であるからである。しかし、酵母細胞からは不十分にしか分泌されないタンパク質もあり、又は適切にプロセシングされない場合もある（例えば、酵母における過剰グリコシル化）。これらの場合には、異なる真菌宿主生物を選択しなければならない。
適した宿主細胞−酵母、真菌及び植物宿主細胞など−の使用により、本発明の組換え発現産物に最適生物活性を付与するために必要に応じて、翻訳後修飾（例えば、ミリストイル化、グリコシル化、末端切断、ラピデーション（lapidation）及びチロシン、セリン又はトレオニンリン酸化）が提供され得る。
宿主細胞は、プロテアーゼ欠損又はプロテアーゼマイナス株であり得る。
宿主細胞の遺伝子型は、発現を改良するために改変できる。
宿主細胞改変の例としては、プロテアーゼ欠損、稀なｔＲＮＡの補充及びジスルフィド結合形成を増強するための細胞質における還元電位の改変が挙げられる。
例えば、Kane (Curr Opin Biotechnol (1995), 6, 494-500 "Effects of rare codon clusters on high-level expression of heterologous proteins in E.coli")に例示され／説明されるように、宿主細胞大腸菌（E. coli）は、稀なｔＲＮＡを過剰発現し、異種タンパク質の発現を向上させることができる。宿主細胞は、Bessette (Proc Natl Acad Sci USA (1999), 96, 13703-13708 " Efficient folding of proteins with multiple disulphide bonds in the Escherichia coli cytoplasm")に例示され／説明されるように、いくつかの還元酵素の欠損であり得るので安定なジスルフィド結合の形成に有利に働く。
生物
本発明に関連して、用語「生物」とは、本発明の酵素をコードするヌクレオチド配列及び／又はそれから得られる産物を含むことができ、且つ／又はプロモーターが、その生物中に存在する場合には本発明のヌクレオチド配列の発現を可能にし得る、いずれの生物も含む。ヌクレオチド配列は、生物のゲノムに組み込まれていることが好ましい。
適した生物としては、原核生物、真菌、酵母又は植物が挙げられる。
本発明に関連して、用語「トランスジェニック生物」とは、本発明の酵素をコードするヌクレオチド配列及び／又はそれから得られる産物を含み、且つ／又はプロモーターが、生物内で本発明のヌクレオチド配列の発現を可能にし得る、いずれの生物も含む。好ましくは、ヌクレオチド配列は生物のゲノムに組み入れられている。
用語「トランスジェニック生物」は、その天然環境にある天然のヌクレオチドコード配列を、それらが、同様にその天然環境にあるその天然プロモーターの制御下にある場合には対象としない。
したがって、本発明のトランスジェニック生物は、本発明の酵素をコードするヌクレオチド配列、本発明の構築物、本発明のベクター、本発明のプラスミド、本発明の細胞、本発明の組織のうちのいずれか１つ又はその組合せ、或いはその産物を含む生物を含む。
例えば、トランスジェニック生物はまた、異種プロモーターの制御下にある、本発明の酵素をコードするヌクレオチド配列も含み得る。
宿主細胞／生物の形質転換
先に示したように、宿主生物は原核生物であっても真核生物であってもよい。適した原核生物宿主の例としては、大腸菌及び枯草菌（Bacillus subtilis）が挙げられる。
原核生物宿主を形質転換する技術は当技術分野では十分に実証されており、例えば、Sambrook et al (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press)参照。原核生物宿主を用いる場合には、ヌクレオチド配列を形質転換の前に、イントロンの除去によってなど適切に改変する必要があり得る。
糸状菌細胞は、当技術分野で公知の種々の方法−例えば、公知の方法での、プロトプラスト形成及びプロトプラストの形質転換とそれに続く細胞壁の再生を含むプロセスを用いて形質転換できる。アスペルギルス属の宿主微生物としての使用はＥＰ０２３８０２３に記載されている。
もう１つの宿主生物としては植物があり得る。植物を形質転換するために用いられる一般的な技術の概説は、Potrykusによる論文（Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol [1991] 42: 205-225）及びChristouによる論文（Agro-Food-Industry Hi-Tech March/April 1994 17-27）に見出すことができる。植物の形質転換に関するさらなる技術はＥＰ−Ａ−０４４９３７５に見出すことができる。
真菌、酵母及び植物の形質転換に関する一般的な技術は、以下の項に示す。
形質転換された真菌
宿主生物は真菌−例えば、糸状菌などであり得る。適したこのような宿主の例としては、サーモマイセス（Thermomyces）属、アクレモニウム属（Acremonium）、アスペルギルス属、ペニシリウム（Penicillium）属、ケカビ（Mucor）属、アカパンカビ属（Neurospora）、トリコデルマ（Trichoderma）属などに属するいずれかのメンバーが挙げられる。
糸状菌の形質転換に関する教示は、ＵＳ−Ａ−５７４１６６５に概説されており、これには糸状菌を形質転換し、真菌を培養するための標準技術は当技術分野では周知であると記載されている。アカパンカビ（N. crassa）に適用されるような技術の広範囲に及ぶ概説は、例えば、Davis and de Serres, Methods Enzymol (1971) 17A: 79-143に見出される。
糸状菌の形質転換に関するさらなる教示は、ＵＳ−Ａ−５６７４７０７に概説されている。
一態様では、宿主生物は、アスペルギルス属のもの、例えば、クロコウジカビ（Aspergillus niger）であり得る。
本発明のトランスジェニックアスペルギルス属はまた、例えば、Turner G. 1994 (Vectors for genetic manipulation. In: Martinelli S.D., Kinghorn J.R. (Editors) Aspergillus: 50 years on. Progress in industrial microbiology vol 29. Elsevier Amsterdam 1994. pp. 641-666)の教示に従って調製することもできる。
糸状菌における遺伝子発現は、Punt et al. (2002) Trends Biotechnol 2002 May;20 (5): 200-6, Archer & Peberdy Crit Rev Biotechnol (1997) 17 (4): 273-306に概説されている。
形質転換された酵母
もう１つの実施形態では、トランスジェニック生物は酵母であり得る。
酵母における異種遺伝子発現の原理についての概説は、例えば、Methods Mol Biol (1995), 49: 341-54及びCurr Opin Biotechnol (1997) Oct;8 (5): 554-60に示されている。
これに関連して、酵母−サッカロミセスセレビシエ又はピキアパストリス（Pichia pastoris）種など（FEMS Microbiol Rev (2000 24 (1): 45-66参照）を、異種遺伝子発現の媒介物として使用できる。
サッカロミセスセレビシエにおける異種遺伝子発現及び遺伝子産物の分泌の原則についての概説は、E Hinchcliffe E Kenny (1993, "Yeast as a vehicle for the expression of heterologous genes", Yeasts, Vol 5, Anthony H Rose and J Stuart Harrison, Eds., 2nd edition, Academic Press Ltd.)によって示されている。
酵母の形質転換のためには、いくつかの形質転換プロトコールが開発されている。例えば、本発明のトランスジェニックサッカロミセスは、Hinnen et al., (1978, Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 75, 1929); Beggs, J D (1978, Nature, London, 275, 104); and Ito, H et al (1983, J Bacteriology 153, 163-168)の教示に従って調製できる。
形質転換された酵母細胞は種々の選択マーカー−例えば、栄養要求性マーカー優性抗生物質耐性マーカーを用いて選択できる。
形質転換された植物／植物細胞
本発明に適した宿主生物として、植物もあり得る。一般的な技術についての概説は、Potrykusによる論文（Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol [1991] 42: 205-225）及びChristouによる論文（Agro-Food-Industry Hi-Tech March/April 1994 17-27）に見出すことができる。
培養及び産生
本発明のヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞は、コードされる酵素の産生を招き、酵素の細胞及び／又は培養培地からの回収を容易にする条件下で培養できる。
細胞を培養するために用いる培地は、問題の宿主細胞の増殖及び酵素の発現の獲得に適したいずれかの従来培地であり得る。
組換え細胞から産生されるタンパク質は細胞の表面にディスプレーさせることができる。
酵素は、宿主細胞から分泌される場合もあり、周知の手順を用いて培養培地から回収することができることが好都合であり得る。
分泌
酵素は、発現宿主から、酵素をより容易に回収できる培養培地中に分泌されることが望ましいことが多い。本発明によれば、分泌リーダー配列は所望の発現宿主に基づいて選択できる。ハイブリッドシグナル配列も本発明に関連して使用できる。
異種分泌リーダー配列の代表例としては、真菌アミログルコシダーゼ（ＡＧ）遺伝子（ｇｌａＡ−例えば、アスペルギルス属由来の１８及び２４アミノ酸型の双方）、ａ−因子遺伝子（酵母、例えば、サッカロミセスクルイベロマイセス（Kluyveromyces）及びハンゼヌラ）又はα−アミラーゼ遺伝子（バシラス（Bacillus））を起源とするものがある。
例として、大腸菌における異種タンパク質の分泌がMethods Enzymol (1990) 182: 132-43に概説されている。
検出
アミノ酸配列の発現を検出及び測定するための種々のプロトコールが当技術分野では知られている。例としては、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）及び蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）が挙げられる。
広範な標識及び結合技術が当業者には公知であり、種々の核酸アッセイ及びアミノ酸アッセイに使用できる。
いくつかの企業、例えば、Pharmacia Biotech（Piscataway, NJ）、Promega（Madison, WI）及びUS Biochemical Corp（Cleveland, OH）によって、これらの手順のための市販のキット及びプロトコールが供給されている。
適したリポーター分子又は標識としては、放射線核種、酵素、蛍光、化学発光又は色素生産物質並びに基質、補助因子、阻害剤、磁性粒子などが挙げられる。このような標識の使用を教示する特許としては、ＵＳ−Ａ−３，８１７，８３７、ＵＳ−Ａ−３，８５０，７５２、ＵＳ−Ａ−３，９３９，３５０、ＵＳ−Ａ−３，９９６，３４５、ＵＳ−Ａ−４，２７７，４３７、ＵＳ−Ａ−４，２７５，１４９及びＵＳ−Ａ−４，３６６，２４１が挙げられる。
また、ＵＳ−Ａ−４，８１６，５６７に示されるように、組換え免疫グロブリンも製造できる。
融合タンパク質
本発明の使用のためのアミノ酸配列は、例えば、抽出及び精製に役立つよう融合タンパク質として作製できる。融合タンパク質パートナーの例としては、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、６×Ｈｉｓ、ＧＡＬ４（ＤＮＡ結合及び／又は転写活性化ドメイン）及び（(−ガラクトシダーゼ）が挙げられる。融合タンパク質パートナーと注目するタンパク質配列の間にタンパク質分解切断部位を含み、融合タンパク質配列の除去が可能となることも好都合であり得る。
融合タンパク質は、タンパク質配列の活性を妨げないことが好ましい。
大腸菌における遺伝子融合発現系は、Curr Opin Biotechnol (1995) 6 (5): 501-6に概説されている。
本発明のもう１つの実施形態では、アミノ酸配列は異種配列とライゲーションして融合タンパク質をコードできる。例えば、ペプチドライブラリーの、物質活性に影響を及ぼし得る因子のスクリーニングには、市販の抗体によって認識される異種エピトープを発現する化学物質をコードすることが有用であり得る。
大規模適用
本発明の好ましい一実施形態では、アミノ酸配列を大規模適用に用いる。
本アミノ酸配列は、宿主生物の培養後に、全細胞培養体積１リットル当たり１ｇ〜１リットル当たり約２ｇという量で産生されることが好ましい。
本アミノ酸配列は、宿主生物の培養後に、全細胞培養体積１リットル当たり１００ｍｇ〜１リットル当たり約９００ｍｇという量で産生されることが好ましい。
本アミノ酸配列は、宿主生物の培養後に、全細胞培養体積１リットル当たり２５０ｍｇ〜１リットル当たり約５００ｍｇという量で産生されることが好ましい。
食物
本発明の組成物は食物として−又は食物の調製において使用できる。ここで、用語「食物」とは、広い意味で用い、ヒトのための食物並びに動物のための食物（即ち、飼料）を対象とする。好ましい一態様では、食物はヒト消費のためのものである。
食物は、使用及び／又は適用様式及び／又は投与様式に応じて、溶液の形である場合も固体のような形である場合もある。
食品成分
本発明の組成物は食品成分として使用できる。
本明細書において、用語「食品成分」とは、機能性食品又は食料品であるか、機能性食品又は食料品に添加され得る製剤を含み、例えば、酸性化又は乳化を必要とする多種多様な製品に低レベルで使用できる製剤を含む。
食品成分は、使用及び／又は適用様式及び／又は投与様式に応じて、溶液の形である場合も固体のような形である場合もある。
食品
本発明の組成物は、菓子製品、乳製品、家禽生産食品、魚加工品及びベーカリー製品のうち１種以上などの食品の調製に使用できる。
本発明はまた、本発明の脂肪分解酵素と別の食品成分を混合することを含む、食物又は食料品を調製する方法を提供する。
［実施例］
これから本発明を単に実施例として説明し、それでは以下の図が参照され得る。
フザリウム・ヘテロスポラム脂肪分解酵素の、発現、精製、配列決定及びベーキング試験
発酵
フザリウムヘテロスポラムＣＢＳ７８２．８３株は、Centraalbureau voor Schimmelcultures（the Netherlands）から入手した。
増殖培地
グルコース−酵母抽出物寒天
酵母抽出物 ４ｇ／Ｌ
ＫＨ２ＰＯ４ １ｇ／Ｌ
ＭｇＳＯ４、７Ｈ２Ｏ ０．５ｇ／Ｌ
グルコース １５ｇ／Ｌ
寒天 ２０ｇ／Ｌ
グルコースはオートクレーブ処理後に加えた。
１．４ プレ発酵培地
ダイズ粉 ５０ｇ／Ｌ
グルコース一水和物 ５０ｇ／Ｌ
ＫＨ２ＰＯ４ ２ｇ／Ｌ
Ｎａ２ＨＰＯ４ ３ｇ／Ｌ
ダイズ油 １ｇ／Ｌ
培地は５００ｍＬバッフル付き振盪フラスコ中に調製し、１００ｍＬをｐｒ振盪フラスコに加えた。各フラスコにダイズ油を個別に加えた。
グルコースはオートクレーブ処理後に加えた。
産生培地
ペプトン １０ｇ／Ｌ
Tween TM-80 １２ｇ／Ｌ
ＭｇＳＯ４、７Ｈ２Ｏ ２ｇ／Ｌ
ＣａＣｌ２、２Ｈ２Ｏ ０．１ｇ／Ｌ
培地は５００ｍＬバッフル付き振盪フラスコ中に調製し、１００ｍＬをｐｒ振盪フラスコに加えた。各フラスコにTween TM-80を個別に加えた。
ｐＨはオートクレーブ処理前に６．０に調整した。
培養条件
フザリウム・ヘテロスポラムＣＢＳ７８２．８３をグルコース−酵母抽出物寒天プレートに播種し、これを２４℃で胞子が発達するまでインキュベートした。
プレ発酵培地を含む振盪フラスコに、十分に胞子形成した培養物を含む４ｃｍ２の寒天プレートを播種した。この振盪フラスコを３０℃、２００ＲＰＭでインキュベートした。３日間増殖させた後、３０本の産生培地振盪フラスコに、プレ発酵振盪フラスコから５ｍＬの発酵培養液を各々播種した。この産生培地振盪フラスコを３０℃、２００ＲＰＭでインキュベートした。
２日間、３日間及び４日間増殖させた後、１０本の産生培地振盪フラスコを回収した。遠心分離と、それに続く、Gelman Laboratory社製の０．２μｍフィルター（VacuCap90フィルターユニットｗ／０．２μｍ Supor Membrane）を通す上清の滅菌濾過によってバイオマスを取り除いた。濾過後、濾液を−８０℃で凍結し、分析まで保存した。
分析手順
ホスホリパーゼ活性は、本明細書において先に記載した「ＰＬＵアッセイ」に従って測定した。
適用
ＴＬＣ分析
ＴＬＣプレートを加熱用戸棚（１１０℃）中で１／２時間活性化した。
ふた付きクロマトグラフィーチャンバーに、１００ｍＬのランニングバッファーを注ぎ入れた。チャンバーの壁を濾紙（Whatman２）で覆い、チャンバーを溶媒蒸気で飽和させた。
ＴＬＣプレートをフレームに入れ、ＴＬＣプレートの底から２ｃｍにサンプルをアプライした。次いで、ＴＬＣプレートを選択したランニングバッファーを含むＴＬＣチャンバーに入れた。ランニングバッファーがプレートの底から１４ｃｍに到達した時点で、ＴＬＣプレートを取り出し、フュームボード（fume board）中で乾燥させ、次いで１１０℃の加熱用戸棚に１０分間入れた。
次いで、ＴＬＣプレートを展開試薬中に浸漬し、１１０℃の加熱用戸棚中で１５分間乾燥させた。
ランニングバッファー：
番号IV：クロロホルム：メタノール：Ｈ２Ｏ（６５：２５：４）
番号Ｉ：Ｐ−エーテル：メチル−ｔ−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）：酢酸（６０：４０：１）
展開バッファー（バナジウム酸バッファー）：
３２ｇＮａ２ＣＯ３添加３００ｍＬＨ２Ｏ（１Ｍ）
１８．２ｇの五酸化バナジウム（Ｖ２Ｏ５）を加え、穏やかに加熱しながら溶解し、「ＢＡＣＯ−ＬＩＮＥ」オーブン中で６分間ベークした。
溶液を周囲温度まで冷却した。
２．５Ｍ Ｈ２ＳＯ４４６０ｍＬ（４６０ｍＬ Ｈ２Ｏ＋６１ｍＬ Ｈ２ＳＯ４）を注意深く加え、
水を加えて１００ｍＬとした。
ガスクロマトグラフィー
WCOT溶融石英カラム１２．５ｍ×０．２５ｍｍ ＩＤ×０．１μｍ ５％フェニル−メチル−シリコン（Crompack社製CP Sil 8 CB）を備えたPerkin Elmer8420キャピラリーガスクロマトグラフィー。
担体：ヘリウム。
注入：１．５μＬ（スプリットあり）
検出器：ＦＩＤ。３８５℃
オーブンプログラム： １ ２ ３ ４
オーブン温度［℃］ ８０ ２００ ２４０ ３６０
等温時間［分］ ２ ０ ０ １０
温度率［℃／分］ ２０ １０ １２
サンプル調製：コムギ脂質５０ｍｇを、内部標準ヘプタデカン、２ｍｇ／ｍＬを含有する、ヘプタン：ピリジン２：１、１２ｍＬに溶解した。５００μＬのサンプルをクリンプバイアルに移した。ＭＳＴＦＡ（Ｎ−メチル−Ｎ−トリメチルシリル−トリフルオラセタミド（trifluoracetamid）１００μＬを加え、反応物を９０℃で１５分間インキュベートした。
算出：モノ−ジ−トリグリセリド、遊離脂肪酸及びガラクト脂質の反応因子は、これらの成分の参照混合物から求めた。これらの反応因子に基づいて、生地中の脂質を算出した。
ミニベーキング試験
以下の成分を５０ｇのBrabrenderミキシングボウルに加え、３０℃で５分間捏ねた：小麦粉５０ｇ、乾燥酵母１０ｇ、砂糖０．８ｇ、塩０．８ｇ、７０ｐｐmアスコルビン酸及び水（４００Brabenderユニットという生地の硬さまで）。休止時間は３４℃で１０分とした。生地を量り、生地当たり１５ｇとした。次いで、生地が木皿とプレキシグラスフレームの間で巻かれる特殊な装置で成形した。この生地をスズ製容器中、３４℃で４５分間ホイロに付し、Voss householdオーブンで、２２５℃で８分間焼いた。
焼いた後、パンを冷却し、２０分後には周囲温度とした。パンを量り、体積は菜種置換法によって測定した。また、パンを切断し、クラムと外皮を評価した。
パイロットベーキング試験（ハードクラストロール）
小麦粉、Danish reform１５００ｇ、圧搾酵母９０ｇ、砂糖２４ｇ、塩２４ｇ、水４００Brabender単位＋２％を、フック付きHobartミキサー中で低速で２分間、及び高速で９分間捏ねた。生地温度は２６℃であった。生地を量り１３５０グラムとした。生地を３０℃で１０分間休ませ、Fortuna成形機で成形した。次いで、生地を３４℃で４５分間ホイロに付した。この生地をBagoオーブンで、２２０℃で１８分間焼き、１２秒間蒸らした。
冷却後、ロールを量り、ロールの体積は菜種置換法によって測定した。
比パン体積
比体積＝パンの体積、ｍｌ
パンの重量、グラム
結果及び考察
発酵
発酵サンプルはホスホリパーゼ活性について分析し、結果を表１に示す。
ａ培地Ｄ＝産生培地
２日目、３日目及び４日目でホスホリパーゼ活性はほぼ同一であるとわかったので、すべてのサンプルをプールし、ＪＢＳ−２２５４−９７−３と名づけた。
精製及び配列決定
陰イオン交換クロマトグラフィーを用いる、粗抽出物からのホスホリパーゼの精製：
カラム（Q-SepharoseFF、１．５×２．８ｃｍ、５ｍＬゲル）を、製造業者（Amersham Bio.）によって記載されるように調製し、次いで、２０ｍＭ ｔｒｉｓ／ＨＣｌバッファー、０．１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５（バッファーＡ）で平衡化した。サンプル（１５ｍＬ）に０．１Ｍ ＮａＣｌを加え、流速３．５ｍＬ／分でカラムにアプライした。バッファーＡ中０〜０．６Ｍ ＮａＣｌの直線勾配を用いて脂肪分解酵素を溶出した（図１参照）。ラン全体の間に３．５ｍＬの画分を回収した。各画分の１０μＬをスポットプレートアッセイに付した。リパーゼ活性はトリブチリン及びレシチンスポットプレートアッセイによって求めた（各画分の１０μＬを穴に移し、このプレートを４０℃でインキュベートした。アガロースゲルにハローの形成が時間の関数として起こる。酵素を含まないブランクもまた、比較のため、穴の１つに加える）。次いで、脂肪分解活性を含む画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図２参照）及びＮ末端分析に付した。
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによる酵素によるフィンガープリント法及びアミノ酸配列決定
タンパク質をジチオトレイトールで還元し、システイン残基を、ヨードアセトアミドを用いるカルボキシメチル化によって保護した。このタンパク質をトリプシンによって切断し、トリプシンペプチドの断片化パターンをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析によって調べた。ペプチドはＣ１８逆相ＨＰＬＣカラムでのクロマトグラフィーによって分離し、精製度はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析によってモニターした。アミノ酸配列は、ＴＲ６４５２において先に詳細に記載したようにエドマン分解によって決定した。
フザリウム・ヘテロスポラム脂肪分解酵素の全アミノ酸配列を決定した。トリプシンでの消化によって、極めて特異的なペプチドが得られ、これでＭＷ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）は決定的に求めることができた。すべてのペプチドのアミノ酸配列もまた、エドマン分解によって決定した。エドマン分解によって決定したアミノ酸配列は、Ｆ．ヘテロスポラム脂肪分解酵素のポリペプチド鎖の９９．６４％に及ぶ。
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ及びエドマン分解研究の概要を表２に示す。
＋＝エドマン配列決定によって確認されたもの
＊＝酸化されたトリプトファン 配列カバー度＝９９．６４％
フザリウム・ヘテロスポラム脂肪分解酵素の完全なアミノ酸配列は、配列番号１（図３７参照）に示されている。
適用試験
Ｆ．ヘテロスポラムの３種のサンプル（表１）、ラベル表示されたプール１７２〜１７４に由来する２リットルのプールを、Amicon限外濾過ユニットでの限外濾過（１０ｋＤａフィルター）によって濃縮した。２５０ｍｌの保持液には約１００ＰＬＵ−７／ｍｌが含まれていた。この保持液を１Ｍ酢酸アンモニウムに調整し、２７ｍｌのブチルセファロースカラム（内径２．５ｃｍ）にアプライし、Ａ−バッファー、２０ｍＭ ＴＥＡ ｐＨ７．４中、１Ｍ 酢酸ＮＨ４及びＢ−バッファー、２０ｍＭ ＴＥＡ ｐＨ７．４で溶出した。精製から得たクロマトグラム（６１）を図３に示す。
クロマトグラム６１の画分を、図４に示されるようにＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。
このクロマトグラフィーから得た１０ｍＬの画分を回収し、表３に示されるようにホスホリパーゼ活性について分析した。これらの結果は、クロマトグラムのメインピークで溶出された画分中にかなり高い量のホスホリパーゼ活性を示す。少量の活性はカラムに結合しておらず、フロントで溶出されている。ＳＤＳゲルはそれほどうまく実施されなかったが、それらの画分がいくつかのタンパク質を含んでいるが、画分１４と１５が、真菌脂肪分解酵素であると予測される、１つの主要なバンドを含んでいるということが観察される。
クロマトグラム６１から得た画分９及び画分１４をミニベーキング試験に用い、また非精製プール１７２〜１７４もミニベーキング試験で試験した。このベーキング実験から得た結果を表４に示す。これから、Ｆ．ヘテロスポラムＣＢＳ７８２．８３由来の精製脂肪分解酵素は、パン体積の改良という点で極めて良好なベーキング結果を示すということが明らかにわかる。また、非精製サンプルは極めて適切なパン体積に貢献した。図５に示されるように、Ｆ．ヘテロスポラム脂肪分解酵素によってパンのクラム構造もかなり改良され、シュードモナス・セパシア（Pseudomonas cepacia）３０４４由来のリパーゼよりも良好であると評価した。
このミニベーキング実験から得た生地を、水飽和ブタノールで抽出し、脂質をＴＬＣによって分析した。ＴＬＣ分析によって、リパーゼ３０４４は、トリグリセリドに対してＦ．ヘテロスポラムサンプル由来の脂肪分解酵素よりも活性であることが確認された。遊離脂肪酸（ＦＦＡ）の量も、リパーゼ３０４４を用いた場合により高い。溶媒IVでのＴＬＣは、トリグリセリド加水分解性リパーゼ３０４４と比較して、Ｆ．ヘテロスポラムで処理した生地脂質のサンプルにおいて明らかに多い、成分（ＤＧＭＧ）を示している。
Ｆ．ヘテロスポラム由来の精製画分はまた、パイロットベーキング実験において試験し、結果を表５に示す。
このミニベーキング実験から得た生地を、水飽和ブタノールで抽出し、生地脂質をＧＬＣによって分析し、結果を表６に示す。
トリグリセリド加水分解と比較した、ＤＧＤＧ加水分解の比率を表７に示す。
ガラクト脂質のＧＬＣ分析はまた、図６に図示する。
ＧＬＣ結果から、Ｆ．ヘテロスポラムによって生地中に生じるＤＧＭＧの量は、４０ｐｐｍ Lipopan F（３０１６）によって生じる量よりも多いことが確認される。この結果はまた、ＭＧＤＧの、ＤＧＤＧよりも高い程度の加水分解も示している。この結果はまた、Ｐ．セパシア由来の３０４４のような正常なトリグリセリド加水分解性酵素と比較して、加水分解されたトリグリセリドの量が少ないことも示している。パイロットスケールベーキング結果及び脂質分析から、Ｆ．ヘテロスポラムＣＢＳ７８２．８３由来の脂肪分解酵素は、ジガラクトシルジグリセリド（ＤＧＤＧ）に対して明確な加水分解活性を有し、生地中にジガラクトシルモノグリセリド（ＤＧＭＧ）が形成されるということが確認された。
４．結論
この研究では、Ｆ．ヘテロスポラムＣＢＳ７８２．８３由来の真菌脂肪分解酵素を振盪フラスコにおける発酵によって製造した。この酵素を精製し、アミノ酸配列を決定した。この酵素は、Ｆ．オキシスポラム由来の市販のリパーゼ（LipopanF（商標））と約８３％の相同性を有している。この酵素は、ベーキング試験において、パン体積の改良及びクラム構造の改良という点で極めて良好な結果を示した。生地から得た脂質の分析によって、この酵素は、ガラクトモノグリセリドの生成の間、ガラクト脂質に対して活性であるということが確認された。添加量の最適化をまったく行わない、ベーキング結果は、Ｆ．ヘテロスポラムＣＢＳ７８２．８３由来の真菌脂肪分解酵素は、市販の酵素LipopanFと少なくとも同等であるということを示しており、トリグリセリド活性に対する比較ＤＧＤＧは、この酵素は、生地環境において、LipopanF（商標）と比較して優れた酵素活性を有するということを示している。
ハンゼヌラ・ポリモルファにおける、フザリウム・ヘテロスポラム（ＣＢＳ７８２．８３）由来の脂肪分解酵素をコードする合成遺伝子の構築及び発現
フザリウム・ヘテロスポラム（ＣＢＳ７８２．８３）から単離した真菌脂肪分解酵素のアミノ酸配列を調べ、ハンゼヌラ・ポリモルファで発現するための合成脂肪分解酵素遺伝子を設計及びクローニングするのに用いた。高発現に有利なように、合成遺伝子のコドンを、ハンゼヌラ・ポリモルファのコドン優先度に一致するよう最適化した。同様に、コドン最適化α−因子シグナル配列を合成し、合成脂肪分解酵素遺伝子の前にクローニングした。アセンブルした構築物を発現ベクターpB14に導入し、ハンゼヌラ・ポリモルファに形質転換した。pB14は、抗生物質耐性を付与する遺伝子を含まないプラスミドであるため、生産設備で使用できる。
いくつかの脂肪分解酵素産生フザリウム株を、トリグリセリドと比較した場合に、ガラクト脂質及び／又はリン脂質に対して高い活性比を有する活性についてスクリーニングした。
数種の株を注目する脂肪分解酵素を産生するとして選択した。これらの中には、フザリウム・ヘテロスポラム（ＣＢＳ７８２．８３）がある。したがって、この株由来の脂肪分解酵素を単離し、アミノ酸配列を決定した。アミノ酸配列を核酸配列に逆翻訳し、これを使用して、ハンゼヌラ・ポリモルファにおける発現のための合成遺伝子を設計及び構築した。
実験
この研究に用いたハンゼヌラ株は、Rhein Biotech GmbH（Dusseldorf, Germany）から入手した、ウラシル栄養要求性ハンゼヌラ・ポリモルファ株RB11（odc1）であった。
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによる、酵素によるフィンガープリント法及びアミノ酸配列決定
フザリウム・ヘテロスポラム（ＣＢＳ７８２．８３）から、脂肪分解酵素活性を有するタンパク質を単離した。このタンパク質をジチオトレイトールで還元し、ヨードアセトアミドを用いるカルボキシメチル化によってシステイン残基を保護した。このタンパク質をトリプシンによって切断し、トリプシンペプチドの断片化パターンをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析によって調べた。ペプチドをＣ１８逆相ＨＰＬＣカラムでのクロマトグラフィーによって分離し、精製度をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析によってモニターした。アミノ酸配列は、ＴＲ６４５２において先に詳細に記載したように、エドマン分解によって決定した。
合成脂肪分解酵素遺伝子の設計及び構築
ペプチド断片のアミノ酸配列を、Ｆ．ヘテロスポラムの日本の菌株（Nagao et al. 1994）とのアラインメントによって順序付けた。このように得た完全アミノ酸配列を逆翻訳して核酸配列とし、すべてのあり得るコドンを明らかにした。各コドンには、ハンゼヌラ・ポリモルファにおいて発現される遺伝子のコドン優先度表に従って、ハンゼヌラ・ポリモルファにおける発現に最も好都合なコドンを選択した。各々約１００ヌクレオチド長であり、完全遺伝子を含む合成オリゴヌクレオチドを合成し、この遺伝子をＰＣＲによってアセンブルした。遺伝子の最終増幅には、インフレーム融合を可能にする、α−因子シグナル配列の３’末端からの最も５’のヌクレオチドを含めて設計した上流プライマー（ａｌｐｓ．ｃｂｓｓ）と、クローニング目的のBam HI制限酵素部位を用いて設計した下流プライマー（ｃｂｓ．ｔ）を用いた（表８）。
酵母α接合因子に由来するシグナル配列をコードするヌクレオチド配列を、オリゴヌクレオチドによって好都合なコドンを用いて同様に合成し、ＰＣＲによって増幅した。α−シグナル配列の最終増幅のために、クローニング目的のEco RI制限酵素部位を含めて設計した上流プライマー（ａｌｐｓｙｎｔ）と、インフレーム融合を可能にする合成脂肪分解酵素遺伝子の５’末端からの最も５’末端の配列を含めて設計した下流プライマー（ｃｂｓｓ．ａｌｐｓ）とを用いた（表８）。
合成α−因子シグナル配列と合成脂肪分解酵素遺伝子とを融合するために、２つの断片を混合し、外部のプライマー、ａｌｐｓｙｎｔ及びｃｂｓｓ．ｔを用いて再増幅した（表８）。ＰＣＲ産物をベクターpCR2.1-TOPO（Invitrogen）にクローニングし、インサートのヌクレオチド配列をBigDye Terminator v3.0サイクルシークエンシングキット（Applied Biosystems）及びABI Prism 3100 Genetic Analyzer（Applied Biosystems）を用いて決定した。
合成Ｆ．ヘテロスポラム（ＣＢＳ７８２．８３）脂肪分解酵素遺伝子及び合成α−シグナル配列の増幅及びアセンブリーに用いたプライマー配列。各プライマー中の、クローニング目的の導入した制限酵素部位には下線が引いてある。合成脂肪分解酵素遺伝子と合成α−シグナルとの融合を可能にする、含まれるヌクレオチドには二重の下線が引いてある。
ハンゼヌラ・ポリモルファにおける脂肪分解酵素の発現
ハンゼヌラにおいて合成Ｆ．ヘテロスポラム（ＣＢＳ７８２．８３）脂肪分解酵素遺伝子を発現するために、組み合わせたα−シグナル配列／脂肪分解酵素遺伝子を、ハンゼヌラ発現ベクターpB14、抗生物質耐性を付与する遺伝子を含まないプラスミドのＦＭＤ−プロモーターの後ろに挿入した。大腸菌において、アセンブルされたプラスミドの予想される構造のコンホメーション後、プラスミドを、エレクトロポレーションによってコンピテントハンゼヌラ・ポリモルファ細胞に形質転換した。ＹＮＤプレート上で形質転換体を選抜し、ＹＮＤの液体培養での１：２００希釈を３及び８回通過することによってコロニーを遺伝子の多重組込みについてさらに選抜した。最後に、選抜した培養物をＹＰＤ培地に２回移すことによって安定化した。高発現体のさらなる選抜のために、高レベルの発現を示す各培養物をシングルコロニーを目的としてプレーティングし、各々を発現レベルについてアッセイした。
脂肪分解酵素遺伝子の発現レベルを調べるために、選抜したクローンを１．８％グリセロール及び０．２％グルコースを含むＹＰＤにおいて、２４℃で、２日間増殖させた。
酵素活性
培養培地のサンプルを脂肪分解酵素活性について、遊離された遊離脂肪酸を調べるためのマイクロタイタープレートに適した体積に縮小したＮＥＦＡキット（Roche）を用い、基質としてレシチン又はＤＧＤＧを用いて分析した。
結果
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによる、酵素によるフィンガープリント法及びアミノ酸配列決定
フザリウムヘテロスポラム脂肪分解酵素の全アミノ酸配列を決定した（配列番号１−図３７）。トリプシンでの消化によって、極めて特異的なペプチドが得られ、これでＭＷ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）は決定的に求めることができた。すべてのペプチドのアミノ酸配列もまた、エドマン分解によって決定した。エドマン分解によって決定したアミノ酸配列は、Ｆ．ヘテロスポラム（ＣＢＳ７８２．８３）脂肪分解酵素のポリペプチド鎖の９９．６４％に及ぶ。すべてのペプチドのアミノ酸配列を、Ｆ．ヘテロスポラムの日本の菌株（Nagao et al. 1994 J. Biochem. 116: 536-540）のリパーゼに対してアラインし、このようにしてペプチドの順序を明らかにし、成熟タンパク質のアミノ酸配列を同定した。アラインメントを図７に示す。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ及びエドマン分解研究の概要は、Nagao配列とのアラインメントに従うペプチド順序で表９に示す。
酵素によるフィンガープリント法、フザリウム・ヘテロスポラム（ＣＢＳ７８２．８３）脂肪分解酵素由来のトリプシンペプチドのエドマン分解による全アミノ酸配列のＭＷ測定。エドマン分解によって確認されたペプチド配列には、＋の印がついている。酸化されたトリプトファンには＊の印がついている。配列カバー度＝９９．６４％。
その他のフザリウム由来のリパーゼに対する同一性
Ｆ．ヘテロスポラム（ＣＢＳ７８２．８３）脂肪分解酵素のアミノ酸及びヌクレオチド配列の、その他のフザリウムリパーゼに由来する配列とのアラインメントによって、いくつかのフザリウムリパーゼ間の関係が示される。（表１０）。
その他のフザリウム リパーゼと比較した、Ｆ．ヘテロスポラム（ＣＢＳ７８２．８３）脂肪分解酵素のアミノ酸及びヌクレオチド同一性
脂肪分解酵素遺伝子及びα−シグナル配列の合成オリゴヌクレオチドのＰＣＲによる混合及び増幅によって、ＤＮＡ断片が得られ、これをクローニングし、配列決定した。正しい配列を含む断片を用い、表８に示されるプライマーを用いて再増幅することによって完全な遺伝子をアセンブルした。アセンブルしたヌクレオチド配列を、翻訳されたアミノ酸配列とともに図８に示す。用いたプライマーは矢印で示されている。
アセンブルされた遺伝子構築物を含むＤＮＡ断片を、導入した制限酵素部位を用いてハンゼヌラ発現ベクターpB14に導入した。得られたプラスミドpB14-alps.cbssを図９に図式的に示す。
選抜したクローンにおける真菌脂肪分解酵素活性の発現
選抜プロセスを経たクローンを、脂肪分解酵素の発現について分析した。2日間培養した上清１０マイクロリットルのサンプルを、ＤＧＤＧ又はレシチンのいずれかとともに１０分間インキュベートし、これらの反応物の１０マイクロリットルを、ＮＥＦＡキットを用いて分析した。クローンのうち３つのシングルコロニーを単離した後の結果を図１０に示す。
フザリウム・ヘテロスポラム（ＣＢＳ７８２．８３）という菌株由来の脂肪分解酵素のアミノ酸配列を決定し、この脂肪分解酵素をコードする合成遺伝子を構築し、ハンゼヌラ・ポリモルファにおける発現のために最適化した。成熟酵素をコードした遺伝子を、酵母接合α−因子由来の合成シグナル配列と融合した。これまでに、α−シグナル配列と、ハンゼヌラpB14ベクターのＦＭＤプロモーターとの組合せは、フザリウムリパーゼの発現に適しているとわかっている。
ハンゼヌラ・ポリモルファにおけるフザリウム・ヘテロスポラムＣＢＳ７８２．８３脂肪分解酵素の発現と、ベーキング試験における生成物の特性決定
糸状菌フザリウム・ヘテロスポラムＣＢＳ７８２．８３由来の脂肪分解酵素をコードする遺伝子を含む、ハンゼヌラ・ポリモルファ株Ｂ１４：８−３，８（ＤＣＤＫ０１７２）を、フェドバッチ様式で発酵させた。１６０時間発酵させた後、ホスホリパーゼ活性は１２００Ｕ／ｍＬに達した。発酵に基づいて、３種の生成物を製造し、さらに試験した。これらの生成物は以下のように命名した：サンプル２０５、サンプル２０６、サンプル２０９。
Ｈ．ポリモルファにおいて発現された、Ｆ．ヘテロスポラム由来の脂肪分解酵素サンプル２０５を、ミニスケールベーキング実験で試験した。ベーキング実験から得た生地を、ＧＬＣ及びＨＰＴＬＣによって分析した。
ミニスケールベーキングから得たベーキング結果により、パン体積に対する脂肪分解酵素サンプル２０５の極めて強力な改良及びクラム構造の改良が確認される。脂肪分解酵素分析によって、ジガラクトシルジグリセリド（ＤＧＤＧ）に対する、脂肪分解酵素サンプル２０５の強力な加水分解活性と、同時にジガラクトシルモノグリセリド（ＤＧＭＧ）の蓄積が確認された。
この酵素は生地中のトリグリセリドに対してはわずかな活性しか有していなかった。
サンプル２０６及び２０９を、パイロットスケールベーキング試験で試験し、パン体積の増大及びクラム構造の改良の双方に関して、脂肪分解酵素の良好なベーキング性能を確認した。ベーキング試験からは、ストレート生地手順では、サンプル２０９と比較して、サンプル２０６がわずかに良く機能するということが示されるが、この２種の生成物は互いに直接比較されておらず、これはさらなるベーキング試験によって確認されなければならない。
２．実験
発酵
微生物
この研究には、実施例２に記載した、Ｆ．ヘテロスポラムＣＢＳ７８２．８３由来の脂肪分解を含むプラスミドで形質転換したＨ．ポリモルファという菌株を用いた。構築物に用いたプロモーターは、Ｈ．ポリモルファ由来のギ酸脱水素酵素プロモーターとした。
増殖培地及び培養条件
ＹＮＢ−グリセロール培地
バイオリアクター発酵のための播種材料の調製及び振盪フラスコにおける増殖に用いた培地には以下のものを含めた：１．７ｇ／Ｌ Yeast Nitrogen Base（DIFCO, Detroit, USA, 0335-15-9）、５ｇ／Ｌ（ＮＨ４）２ＳＯ４、１０ｇ／Ｌグリセロール及びバッファーとして０．１Ｍ ２−(Ｎ−モルホリノ(エタンスルホン酸（ＭＥＳ）。ｐＨは４Ｍ ＮａＯＨで６．１（ＭＥＳのｐｋａ）に調整した（オートクレーブ処理前）。Yeast Nitrogen Base及び（ＮＨ４）２ＳＯ４は、オートクレーブ処理後、培地に濾過滅菌して加えた。この培地を、振盪フラスコにおける増殖に用いた（全体積５００ｍＬの振盪フラスコ中２５０ｍＬの培地）。
ＹＮＢ寒天
保存培養（２５％」（ｗ／ｖ）グリセロール中−８０℃で維持した）のプレーティングに用いた規定培地には、以下のものを含めた：１．７ｇ／Ｌ Yeast Nitrogen Base（DIFCO, Detroit, USA, 0335-15-9）、５ｇ／Ｌ（ＮＨ４）２ＳＯ４、１０ｇ／Ｌグリセロール及び２０ｇ／Ｌ寒天（DIFCO, Detroit, USA, 0140-01）。Yeast Nitrogen Base及び（ＮＨ４）２ＳＯ４は、オートクレーブ処理後、培地に濾過滅菌して加えた。
ＹＰＤ培地
発酵槽のコンタミネーションチェックには富栄養培地を用いた。この培地には以下のものを含めた：１０ｇ／Ｌ 酵母抽出物、１０ｇ／Ｌペプトン及び２０ｇ／Ｌグリセロール。
発酵
この研究では、３種の発酵：ＨＥＴ０４０１、ＨＥＴ０４０２及びＨＥＴ０４１０を実施し、すべて前記の菌株を用いた。３種の発酵間の変化は、バッチ培地及びフィード培地の組成である。すべてのその他のパラメーターは３種の発酵について同一とした。
６Ｌ発酵槽での発酵に用いたバッチ培地（３Ｌ）には以下のものを含めた：１３．３ ｇ／Ｌ ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４、３．０ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ４・Ｈ２Ｏ、３．３ｇ／Ｌ ＫＣｌ、０．３ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、１５ｇ／Ｌ グリセロール及び３ｍＬ／Ｌ ADD APT（登録商標）Foamstop Sin 260（ADD APT Chemicals AG, Helmond, The Netherlands）、１．０ｇ／Ｌ ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、６７ｍｇ／Ｌ（ＮＨ４）２Ｆｅ（ＳＯ４）２・６Ｈ２Ｏ、５ｍｇ／Ｌ ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、２０ｍｇ／Ｌ ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２１ｍｇ／Ｌ ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ及び６７ｍｇ／Ｌ ＥＤＴＡ）、０．６５ｍｇ／Ｌ ＮｉＳＯ４・６Ｈ２Ｏ、０．６５ｍｇ／Ｌ ＣｏＣｌ２、０．６５ｍｇ／Ｌ Ｈ３ＢＯ４、０．６５ｍｇ／Ｌ ＫＩ、０．６５ｍｇ／Ｌ Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ）、２ｍｇ／Ｌ Ｄ−ビオチン及び０．６７ｇ／Ｌ チアミンクロリド−ヒドロクロリド。
前記のバッチ培地に加え、発酵ＨＥＴ０４０２には、バッチ培地中、１０ｇ／Ｌペプトンを含めた。
前記のバッチ培地に加え、発酵ＨＥＴ０４１０には、バッチ培地中、１０ｇ／Ｌバクトトリプトンを含めた。
フィード培地ＨＥＴ０４０１及びＨＥＴ０４０２：
このフィード培地には、６３５ｇ／ｋｇグリセロール及び１３０ｇ／ｋｇギ酸を含めた。
フィード培地ＨＥＴ０４１０：
このフィード培地には、５７０ｇ／ｋｇグリセロール、１２０ｇ／ｋｇギ酸及び９５ｇ／ｋｇバクトトリプトンを含めた。
ｐＨは、２５％（ｗ／ｖ）ＮＨ３−水を添加することによって制御した。
発酵は、屋内に建設された６Ｌ発酵槽においてフェドバッチ様式で実施した。以下の発酵条件を用いた：ｐＨ５、エアレーション１ｖｖｍ、温度２６(Ｃ及び４００〜７００ｒｐｍで攪拌。
発酵槽に、２５℃、１８０ｒｐｍで増殖させ、ＯＤ−６００が約１０である、ＹＮＢ−グリセロール培養物２＊２５０ｍＬで播種した。
発酵におけるフィードフローは、ＣＯ２発生の蓄積によって、以下の方程式に基づいて制御した：
フィード−フロー［ｇ／ｈ］＝０、ＡｃＣＯ２＜０．４５
フィード−フロー［ｇ／ｈ］＝１．３３・Ｖ・ＡｃｃＣＯ２、０．４５≦ＡｃｃＣＯ２≦３．２５
フィード−フロー［ｇ／ｈ］＝４．３３・Ｖ、３．２５≦ＡｃｃＣＯ２
Ｖ：発酵培養液体積［Ｌ］
ＡｃｃＣＯ２：ＣＯ２発生の蓄積［モル］
回収
発酵物を、１６０００×ｇで１０分の遠心分離と、それに続く、上清の、Gelman Laboratory社製０．２μｍフィルター（VacuCap 90フィルターユニットｗ ０．８／０．２μｍ Supor Membrane）を通す滅菌濾過によって回収した。産物はベーキング試験に使用するまで４℃で維持した。
分析手順
リパーゼ活性の測定
発酵サンプル（１０ｍＬ）を、９０００×ｇで１０分間遠心分離し、上清を、本発明において先に教示した「ＰＬＵアッセイ」に従うホスホリパーゼ活性の分析に用いた。
バイオマス増殖
培養液中のバイオマス濃度を、培養液１０ｍＬを、予め秤量した容器中で、９０００×ｇで１０分間遠心分離することによって調べた。遠心分離した後、上清を除去し、バイオマスを１００℃で２４時間乾燥させ、次いで秤量した。バイオマス濃度は、１Ｌの培養液当たりの細胞の乾重ｇとして算出した。
酵素特性決定及びミニベーキング
酵素及び小麦粉
サンプル２０５：ＨＥＴ０４０１由来のサンプル７（１６１時間発酵）
ホスホリパーゼLipopan F、２９３８
小麦粉：Reform2003055
ミニベーキング
以下の成分を５０ｇのBrabrenderミキシングボウルに加え、３０℃で５分間捏ねた：小麦粉５０ｇ、乾燥酵母１０ｇ、砂糖０．８ｇ、塩０．８ｇ、７０ｐｐmアスコルビン酸及び水（４００Brabenderユニットという生地の硬さまで）。休止時間は３４℃で１０分とした。生地を量って生地当たり１５ｇとした。次いで、生地が木皿とプレキシグラスフレームの間で巻かれる特殊な装置で成形した。この生地をスズ製容器中、３４℃で４５分間ホイロに付し、Voss householdオーブンで、２２５℃で８分間焼いた。
焼いた後、パンを冷却し、２０分後には周囲温度とした。パンを量り、体積は菜種置換法によって測定した。また、パンを切断し、クラムと外皮を評価した。
脂質抽出
完全にホイロが終了した生地１０ｇを直ちに凍結し、凍結乾燥した。凍結乾燥した生地を、コーヒーミル中で製粉し、８００ミクロンの篩に通した。１．５ｇの凍結乾燥した生地を、１５ｍLのスクリューリット（screw lit）付き遠沈管に量り入れた。７．５ｍｌの水飽和ブタノール（ＷＳＢ）を加えた。遠沈管を沸騰水浴に１０分間入れた。この管をRotamixに入れ、４５ｒｐｍ、周囲温度で２０分間回転した。次いで沸騰水浴に再度１０分間入れ、周囲温度で３０分間Rotamixで回転した。この管を３５００ｇで５分間遠心分離した。５ｍｌの上清をバイアルに移した。窒素流下でＷＳＢを蒸発乾固した。
ガスクロマトグラフィー
ガスクロマトグラフィーは、上記の実施例１の分析手順下に記載したように実施した。
ＨＰＴＬＣ
アプリケーター：ＬＩＮＯＭＡＴ５、ＣＡＭＡＧアプリケーター
ＨＰＴＬＣプレート：１０×１０ｃｍ、Ｍｅｒｃｋ番号１．０５６３３
このプレートは、使用前に１８０℃のオーブンで２０〜３０分間乾燥させる。
アプリケーション：ＬＩＮＯＭＡＴ５アプリケーターを用いて、ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ８５：１５中１％溶液、１．０μＬを、ＨＰＴＬＣプレートにアプライする。
ランニングバッファー：
番号IV：クロロホルム：メタノール：Ｈ２Ｏ（６５：２５：４）
番号Ｉ：Ｐ−エーテル：メチル−ｔ−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）：酢酸（６０：４０：１）
アプリケーション／溶出時間：ランニングバッファーＩに対して１１分及びランニングバッファーIVに対しては１８分。
このプレートを１８０℃のオーブン中で１０分間乾燥し、冷却し、１６％Ｈ３ＰＯ４に溶かした６％酢酸銅中で発色させた。さらに１０分１８０℃で乾燥し、直接評価する。
ベーキング試験：
調べた産物：
３０１６−８７００ＬＩＰＵ／ｇ含有Lipopan F
配合表：
Reform小麦粉：2003159を用いて実施するハードクラスティーロール
ベーキング手順：
Diosnaミキサーシステム
・ １分間低速乾燥混合
・ 混合２分間低速＋４分間高速
・ 生地温度：２６℃
・ 計量：１３５０ｇ
・ 休止：加熱用戸棚中、３０℃で１０分
・ 成形：Fortuna３／１７／７
・ ホイロ：３４℃、８５％ＲＨで４５分
・ ベーキング：Bagoオーブン：２２０℃で１３分、１３秒蒸らし＋ダンパーを開けて５分
・ ＭＩＷＥストーンデッキ（srone deck）：プログラム番号１
・ 焼いた後、ロールを２５分間冷却し、その後秤量し、体積を測定する
結果及び考察
発酵生理学及びホスホリパーゼ産生
ＨＥＴ０４１０のバッチ培地及びフィード培地へのトリプトンの添加の結果、ＨＥＴ０４０１−０４０２と比較してより速いバイオマスの生成及びより高い最終レベルのバイオマスが得られた。
ＨＥＴ０４０１及びＨＥＴ０４０２は、ホスホリパーゼ活性発達に関してはほとんど同一であるが、ホスホリパーゼ生産性はＨＥＴ０４１０でかなり高い。
回収
発酵物は１６８時間の発酵の後（ＨＥＴ０４０１−０４０２）及び１６１時間の発酵の後（ＨＥＴ０４１０）に回収した。生成物はベーキング試験に使用するまで４℃で維持した。ＨＥＴ０４０１の生成物のいくらかは、サンプル２０５と名づけ、約７００ＰＬＵ−７／ｍＬを含んでいた。ＨＥＴ０４０１及びＨＥＴ０４０２の生成物のいくらかをプールし、サンプル２０６と名づけた。この生成物には約３９０ＰＬＵ−７／ｍＬが含まれていた。ＨＥＴ０４０１及びＨＥＴ０４０２の最終生成物と比較して、サンプル２０６の低い酵素活性は、貯蔵及び滅菌濾過によって引き起こされたものであり得る。ＨＥＴ０４１０の生成物はサンプル２０９と名づけ、これには約９５０ＰＬＵ−７／ｍＬが含まれていた。
酵素の特性決定及びミニベーキング
発酵ＨＥＴ０４０１由来の脂肪分解酵素サンプル２０５を、ミニベーキング実験で試験した。
種々の添加量で、また、対照及びLipopan F（商標）と比較して。このベーキング試験から得たパンの比パン体積を表１１に示す。パンの写真は図１１に示す。
ベーキング結果から、パン体積の改良に対するサンプル２０５の極めて強力な効果が確認され、この体積効果は４０ｐｐｍという標準添加量のLipopan F（商標）よりも優れていた。
また、図１１から、サンプル２０５が、クラム構造及び色の強力な改良に貢献していることがわかる。
このベーキング実験から得た、完全にホイロが終了した生地を凍結乾燥し、水飽和ブタノールで抽出し、単離した脂質をＧＬＣ及びＨＰＴＬＣで分析した。
生地脂質のＧＬＣ分析（表１２）によって、ジガラクトシルジグリセリド（ＤＧＤＧ）に対する脂肪分解酵素サンプル２０５の加水分解作用と、同時にジガラクトシルモノグリセリド（ＤＧＭＧ）の蓄積が確認される。ＤＧＤＧ（ｍｍｏｌ％＝ｍｍｏｌ／凍結乾燥生地１００ｇ）とＤＧＭＧ（ｍｍｏｌ％）の合計分子量が、酵素添加量を増加しても一定のままであるので、ＤＧＭＧに対する酵素の活性は極めて低い（図１２）。ＧＬＣ結果はまた、トリグリセリドに対するサンプル２０５の極めて低い活性も示している。
mmol%=mmol／凍結乾燥生地100g
ベーキング結果と脂質分析を比較することによって、興味深いことに、最良のベーキング効果は、ＤＧＤＧのＤＧＭＧへの完全な加水分解によっては得られないことが観察されるが、これらの結果は、ＤＧＤＧのＤＧＭＧへの部分加水分解が最良のベーキング性能を示し得ることを示す。
高い酵素添加量によってより多いＤＧＭＧが生じるが、同時に、より多くの遊離脂肪酸が生じ、これは負のベーキング効果を与えることが予想され、これが、ＤＧＤＧの部分加水分解のみが好ましいことのもう１つの説明となり得る。表１３は、表１２から算出されたＤＧＤＧとトリグリセリド加水分解の比率を示す。この結果は最良のベーキング性能は、ＤＧＤＧ対トリグリセリド活性の比率が最大である添加量で得られるということを示す。
脂質サンプルのいくらかをまた、図１３に示すようにＨＰＴＬＣによって分析した。サンプル４、５及び６はベーキング実験から得た生地脂質である。ＨＰＴＬＣ分析により、脂肪分解酵素サンプル２０５によるＤＧＤＧの加水分解とＤＧＭＧの形成が確認される。
本明細書において先に教示したアッセイを用いる、Lipopan F及びサンプル２０９の、相対的な、極性脂質：トリグリセリドの活性割合は：
リン脂質／トリグリセリド（ＰＬＵ／ＬＩＰＵ） Lipopan F＝３
サンプル２０９＝９
ガラクト脂質／トリグリセリド（ＧＬＵ／ＬＩＰＵ）Lipopan F＝１
サンプル２０９＝４
フザリウム・ヘテロスポラムＣＢＳ７８２．８３脂肪分解酵素は、ミニスケールベーキング実験において極めて強力な効果を与え、パン体積を強力に増加し、クラム構造を改良した。脂質分析により、生地中のＤＧＤＧに対する強力な加水分解活性と、同時にＤＧＭＧの蓄積が確認されている。フザリウムヘテロスポラムＣＢＳ７８２．８３脂肪分解酵素は、生地中のトリグリセリドに対しては低い活性しか示さなかった。
ハンゼヌラ・ポリモルファで発現されたフザリウムヘテロスポラムＣＢＳ７８２．８３脂肪分解酵素の、脂質基質に対する活性及び位置特異性についての特性決定
フザリウム・ヘテロスポラム由来の本発明の脂肪分解酵素を、実施例３に記載したようにハンゼヌラ・ポリモルファにおいて発現させた。
分析手順
ホスホリパーゼ活性は、本明細書において先に記載したＰＬＵアッセイを用いて調べた。
ガラクトリパーゼ活性は、本明細書において先に記載したガラクトリパーゼアッセイを用いて調べた。
トリグリセリド（トリブチリン）に対する活性は、本明細書において先に記載したＬＩＰＵアッセイを用いて調べた。
ヒマワリ油（ＬＵＳｏｌ、ｐＨスタットｐＨ６）に対する活性：
試薬：
８．４ｇアラビアガムを、脱イオン水１００ｍｌに溶解し、３０ｍＭのＣａＣｌ２１００ｍｌを加える。Turraxミキサー（２００００ｒｐｍ）で混合している間に、３６ｇのヒマワリ油をゆっくりと加える。
アッセイ：
ビーカーに入れたヒマワリ油エマルジョン２０ｍｌを、３０℃で５分間平衡化する。ｐＨを、ｐＨスタットを用いて６．３〜６．５に調整する。２ｍｌの酵素溶液を加え、０．０５ＮのＮａＯＨを、ｐＨを６．５に維持しながら１０分間連続的に加える。０．０５ＮａＯＨの添加についての曲線の傾斜を、時間の関数として算出する。
１ＬＵＳｏｌを、アッセイ条件下で１分当たり１μｍｏｌの脂肪酸を遊離させ得る酵素量として定義する。
脂肪分解酵素を、前記の手順に従って、種々の基質に対する活性について分析した。結果を表１４に示す。
ハンゼヌラ・ポリモルファで発現されたフザリウム・ヘテロスポラム由来の脂肪分解酵素は、主に、生地中のガラクト脂質及びリン脂質のｓｎ−１位置の脂肪酸を加水分解する。酵素の特異性は、パン生地に種々の濃度の酵素を添加することによって調べた。完全にホイロが終了した生地を凍結及び凍結乾燥し、生地脂質を水飽和ブタノールで抽出した。
生地脂質はＧＬＣ及びＨＰＬＣ分析によって分析した。
ＧＬＣ分析によって、ジガラクトシルジグリセリド（ＤＧＤＧ）及びジガラクトシルモノグリセリド（ＤＧＭＧ）を分析することが可能であった。さらに、ジガラクトシルモノグリセリドの位置異性体（１：ジガラクトシル１−モノグリセリド及び２：ジガラクトシル２モノグリセリド、以下の構造参照）を分析することが可能であった。これらの成分は、ＧＬＣによって分離し、定量した。
１：Ｒ１＝Ｈ及びＲ２＝脂肪酸
２：Ｒ１＝脂肪酸及びＲ２＝Ｈ
ハードクラストロールの製造についてのベーキング試験では、種々の添加量の脂肪分解酵素を加え、完全にホイロが終了した生地においてガラクト脂質を分析した。異性体ジガラクトシルモノグリセリドの量を表１５に示し、図１４に図式的に示す。
結論
表１５及び図１４の結果から、ジガラクトシルジグリセリドは主に１位で加水分解され、その間にジガラクトシル２−モノグリセリドが生成されるということが結論付けられる。ジガラクトシル１−モノグリセリドのより少量の増加も観察される。脂質中のアシル脂肪酸の２位から１位へのアシル基移動が起こることは、よく知られている。このアシル基移動は温度に応じて及びジガラクトシル２−モノグリセリドとジガラクトシル１−モノグリセリド間の平衡が生じる時間の関数として変わる。この現象によって、ジガラクトシル１−モノグリセリドの少量の増加も観察されるという事実が説明される。
フザリウム・ヘテロスポラム由来の脂肪分解酵素の温度最適条件及び温度安定性の決定
ハンゼヌラ・ポリモルファで発現されたＦ．ヘテロスポラム由来の、噴霧乾燥した脂肪分解酵素の酵素活性を、以下に記載したように改変したＰＬＵ−７に従って種々の温度で調べた。基質は０．６％ホスファチジルコリン、０．４％Triton X-100、６ｍＭ ＣａＣｌ２及び５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０のエマルジョンとした。噴霧乾燥した脂肪分解酵素発酵を、脱塩水で３ＴＩＰＵ／ｍｌに希釈した。４００μｌの基質を１０、２０、３０、４０、５０、４５、５０及び６０℃で５分間温度調節し、５０μｌのサンプルを加えた。正確に１０分後、９９℃でさらに１０分間インキュベートすることによって酵素処理を停止した。最後に、遊離脂肪酸量をＮＥＦＡ Ｃ法（Wako Chemicals GMbH, Neuss, Germany）によって調べた。呈色試薬Ａ及びＢを、製造業者のプロトコールに従って作製した。１０μｌの再分散された抽出された脂質と、１００μｌの試薬Ａとを、マイクロタイタープレートにピペットで加え、３７℃で１０分間インキュベートした。そのマイクロタイタープレートに２００μｌの試薬Ｂを加え、３７℃で１０分間インキュベートした。５４０ｎｍでの光学密度を測定した。遊離脂肪酸量は、読み取った吸光度とオレイン酸に基づく標準曲線を用いて求めた。結果を図１５に示す。
噴霧乾燥した脂肪分解酵素発酵の酵素安定性は、種々の温度で調べた。噴霧乾燥した脂肪分解酵素発酵を、５０ｍＭリン酸バッファー、ｐＨ７．０で３ＴＩＰＵ／ｍｌに希釈した。２０、３０、３７、４０及び４５℃で３０分間インキュベートした後、サンプルを氷上で保存した。その後、ホスホリパーゼ活性を、以下に記載したように改変したＰＬＵ−７に従って測定した。基質は０．６％ホスファチジルコリン、０．４％Triton X-100及び５０ｍＭ リン酸バッファーのエマルジョンとした。ＣａＣｌ２は、リン酸カルシウムの沈殿を避けるために省略したが、酵素活性には影響を及ぼさない。４００μｌの基質を３７℃で５分間温度調節し、５０μｌのサンプルを添加した。正確に１０分後、９９℃でさらに１０分間インキュベートすることによって酵素処理を停止した。最後に、遊離脂肪酸量をＮＥＦＡ Ｃ法（Wako Chemicals GMbH, Neuss, Germany）によって調べた。呈色試薬Ａ及びＢを、製造業者のプロトコールに従って作製した。１０μｌの再分散された抽出された脂質と、１００μｌの試薬Ａとを、マイクロタイタープレートにピペットで加え、３７℃で１０分間インキュベートした。そのマイクロタイタープレートに２００μｌの試薬Ｂを加え、３７℃で１０分間インキュベートした。５４０ｎｍでの光学密度を測定した。遊離脂肪酸量は、読み取った吸光度とオレイン酸に基づく標準曲線を用いて求めた。結果を図１６に示す。
フザリウム・ヘテロスポラム由来の脂肪分解酵素のｐＨ最適条件とｐＨ安定性の決定
ハンゼヌラ・ポリモルファで発現されたＦ．ヘテロスポラム由来の、噴霧乾燥した脂肪分解酵素の酵素活性を、種々のｐＨで調べた。基質は０．６％ホスファチジルコリン、０．４％Triton X-100及び５０ｍＭ リン酸バッファー、ｐＨ４．０、５．０、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０及び１０．０のエマルジョンとした。ＣａＣｌ２は、リン酸カルシウムの沈殿を避けるために省略したが、酵素活性には影響を及ぼさない。噴霧乾燥した脂肪分解酵素発酵を、脱塩水で３ＴＩＰＵ／ｍｌに希釈した。４００μｌの基質を３７℃で５分間温度調節し、５０μｌのサンプルを加えた。正確に１０分後、９９℃でさらに１０分間インキュベートすることによって酵素処理を停止した。最後に、遊離脂肪酸量をＮＥＦＡ Ｃ法（Wako Chemicals GMbH, Neuss, Germany）によって調べた。呈色試薬Ａ及びＢを、製造業者のプロトコールに従って作製した。１０μｌの再分散された抽出された脂質と、１００μｌの試薬Ａとを、マイクロタイタープレートにピペットで加え、３７℃で１０分間インキュベートした。そのマイクロタイタープレートに２００μｌの試薬Ｂを加え、３７℃で１０分間インキュベートした。５４０ｎｍでの光学密度を測定した。遊離脂肪酸量は、読み取った吸光度とオレイン酸に基づく標準曲線を用いて求めた。結果を図［１７］に示す。
噴霧乾燥した脂肪分解酵素発酵の酵素安定性を、種々のｐＨで調べた。噴霧乾燥した脂肪分解酵素発酵を、ｐＨ４．０、５．０、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０及び１０．０の５０ｍＭリン酸バッファーで３ＴＩＰＵ／ｍｌに希釈した。３７℃で３０分間インキュベートした後、サンプルを氷上で保存した。その後、ホスホリパーゼ活性を、以下に記載したように改変したＰＬＵ−７に従って測定した。基質は０．６％ホスファチジルコリン、０．４％Triton X-100及び５０ｍＭ リン酸バッファー、ｐＨ７．０のエマルジョンとした。ＣａＣｌ２は、リン酸カルシウムの沈殿を避けるために省略したが、酵素活性には影響を及ぼさない。４００μｌの基質を３７℃で５分間温度調節し、５０μｌのサンプルを添加した。正確に１０分後、９９℃でさらに１０分間インキュベートすることによって酵素処理を停止した。最後に、遊離脂肪酸量をＮＥＦＡ Ｃ法（Wako Chemicals GMbH, Neuss, Germany）によって調べた。呈色試薬Ａ及びＢを、製造業者のプロトコールに従って作製した。１０μｌの再分散された抽出された脂質と、１００μｌの試薬Ａとを、マイクロタイタープレートにピペットで加え、３７℃で１０分間インキュベートした。そのマイクロタイタープレートに２００μｌの試薬Ｂを加え、３７℃で１０分間インキュベートした。５４０ｎｍでの光学密度を測定した。遊離脂肪酸量は、読み取った吸光度とオレイン酸に基づく標準曲線を用いて求めた。結果を図１８に示す。
フザリウム・ヘテロスポラム由来の、精製した脂肪分解酵素の分子量の決定
ヘテロスポラム・フザリウム（Heterosporum Fusarium）由来の、精製した本発明の脂肪分解酵素を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに流した。図１９ａ及び１９ｂ。Novex標準マーカーに基づいて、分子量を表１５に示されるように算出した。

脂肪分解酵素の重量は２９．９ｋＤａと算出された。
フザリウム・ヘテロスポラム由来の脂肪分解酵素の等電点（ｐＩ）の決定
Ｆ．ヘテロスポラム由来の脂肪分解酵素の等電点（ｐＩ）を、アミノ酸配列配列番号６に基づいて理論的に求めた。
算出は、Informax（Invitrogen, CA, USA）社製ソフトウェアVector NTI一式９を用いて行い、６．４０というｐＩが得られた。
フザリウム・ヘテロスポラムＣＢＳ７８２．８３脂肪分解酵素による、種々の温度での卵黄におけるレシチンのリゾレシチンへの酵素的変換の特性決定
脂肪分解酵素は、レシチン（ホスファチジルコリン）をリゾレシチン（リゾホスファチジルコリン）に変換し、遊離脂肪酸を遊離できる。卵黄におけるレシチンのリゾレシチンへの酵素的変換は、リゾレシチンがレシチンよりも良好な乳化剤であるために、より良好な乳化特性を与える。卵黄の良好な乳化特性は、熱安定性マヨネーズ及びその他の食物並びに、それだけには限らないが、ケーキ及びチーズの熟成などの食品用途を製造する際には重要である。
酵素調製物：
発酵ＨＥＴ０４２０から得た、ハンゼヌラ・ポリモルファで発現された、フザリウム・ヘテロスポラム、ＣＢＳ７８２．８３由来の脂肪分解酵素を、コムギデンプン上で噴霧乾燥した。得られた酵素調製物は、１２６５Ｕ／ｇのホスホリパーゼ活性を有していると、本明細書において先に記載したＴＩＰＵアッセイによって求められた。噴霧乾燥した酵素粉末を脱塩水に溶解することによって、１０％（ｗ／ｖ）又は２０％（ｗ／ｖ）酵素保存溶液を調製した。１５分間攪拌した後、溶液を１３７０×ｇで５分間遠心分離した。上清を、酵素保存溶液として用いた。
酵素処理：
２種の異なる実験を設定し、卵黄におけるレシチンのリゾレシチンへの酵素的変換について、酵素添加量、反応温度及び反応時間最適な組合せを調べた。まず、本発明の脂肪分解酵素を用い、３種の以下の温度：３０℃、４０℃及び５０℃、各々で４種の以下の添加量：５Ｕ／卵黄１ｇ、１０Ｕ／卵黄１ｇ、２０Ｕ／卵黄１ｇ及び３０Ｕ／卵黄１ｇを用い酵素処理を実施した。
第２の実験では、本発明の脂肪分解酵素について、及びNovozymes A/S（Denmark）社製のLecitase（登録商標）Ultraを用い、以下の５つの温度：５℃、１０℃、１５℃、２０℃及び５３℃で、３０Ｕ／卵黄１ｇという酵素添加量で酵素処理を実施した。５３℃では、６０Ｕ／卵黄１ｇという酵素添加量も調べた。
両実験では、低温殺菌した、DanAg（Christiansfeld, Denmark）社製の卵黄１０．０ｇをWheaton試験管に移し、適当な温度に温度調節した加熱ブロックに入れた。サンプルは、マグネティックスターラー上で連続的に混合した。時間ｔ＝０で、表１６に従って酵素保存溶液を卵黄に添加した。各実験は２連で行った。表１７に従って、１．０ｇのサンプルを卵黄／酵素溶液から採取した。表１７のインキュベーション時間後、７．５ｍｌの有機溶媒（ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ、２：１）を添加することによってサンプル中の酵素反応を停止した。
脂質抽出：
７．５ｍｌの有機溶媒（ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ、２：１）の、サンプルへの添加によって、酵素反応を停止させるだけではなく、脂質も抽出した。さらに、０．２ｍｌの脱塩Ｈ２Ｏをサンプルに添加し、その後、Whirleyミキサーを用いて１分間分散させた。次いで、サンプルを１１０×ｇで１０分間遠心分離した。約３ｍｌの有機層を別の試験管に移し、この抽出された脂質を、種々の分析に用いた。サンプルは−１８℃で保存した。
遊離脂肪酸の測定：
１００μｌの抽出した脂質溶液を、窒素下、５０℃で蒸発させた。１．０ｍｌの脱塩Ｈ２Ｏを添加し、Whirleyミキサーを用いて脂質を分散させた。遊離脂肪酸量は、WAKO Chemicals GmbH（Neuss, Germany）社製ＮＥＦＡ Ｃキットを用いて測定した。呈色試薬Ａ及びＢを、製造業者のプロトコールに従って作製した。１０μｌの再分散された抽出された脂質と、１００μｌの試薬Ａとを、マイクロタイタープレートにピペットで加えた。このプレートを３７℃で１５分間インキュベートした。そのマイクロタイタープレートに２００μｌの試薬Ｂを加え、３７℃で１０分間インキュベートした。５４０ｎｍでの光学密度を測定した。遊離脂肪酸量は、読み取った吸光度とオレイン酸に基づく標準曲線を用いて求めた。
ＬＣ／ＭＳ−ＭＳによるレシチン及びリゾレシチンの測定：
材料
アセトン、メタノール、クロロホルムは、すべて Lab Scan, Dublin, Ireland社製のものであり、エタノール９６％はDe Danske Spritfabrikker 社製のものであり、ギ酸はAppliChem, Darmstadt, Germany社製のものであった。
機器
ＨＰＬＣシステムは、すべてAgilent Technologies（Waldbronn, Germany）社製の、四次ポンプ（Ｇ１３１１Ａ）、キャピラリーポンプ（Ｇ１３７６Ａ）、オートサンプラー（Ｇ１３７７Ａ）及びカラムコンパートメント（Ｇ１３１６Ａ）からなるものであった。LC Packings（Amsterdam, Netherlands）社製、Acurate（商標）フロースプリッター（ACM-CU-CR）を用いて、カラム流出物を、質量分析計へ、及び極性のメイクアップ溶媒を導入するために分割した。質量分析計はThermo Finnigan（San Jose, CA, USA）社製のLCQ Deca Ion Trapであった。
カラムはHypersil SI、内径１００×４．６ｍｍ、Thermo Hypersil-Keystoneから５(ｍであった。
クロマトグラフィー条件及びＭＳ条件
移動相
Ａ：未使用
Ｂ：クロロホルム
Ｃ：メタノール／ギ酸（１０００／０．１９０）
Ｄ：クロロホルム／メタノール／水／ギ酸（３００／５５０／１５０／０．１９０）
メイクアップ：エタノール９６％
注入容量は５μｌとし、カラム温度は４５℃とした。
ＬＣ−フロー： ０．６０ｍｌ／分
メイクアップフロー：１００μｌ／分
ＥＬＳＤ／ＦＣ管類：内径１００ｃｍ×０．１００ｍｍ（ＳＳ）
ＭＳ管類： １００ｃｍ×１５０μｍ（ＦＳ−１５０−ＭＳ）
およその分割は２０：１である。
ＭＳ条件
標準及びサンプル調製
リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）（タマゴ、ニワトリ）（８９８６５）及びホスファチジルコリン（ＰＣ）（植物）（４４１６０１）は、AvantiPolar Lipids, Inc, Alabaster, AL, USAから入手した。ＰＣ及びＬＰＣの保存溶液（１０ｍｇ／２０ｍｌ ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ）を調製した。これの希釈物は、５０μｇ／ｍｌ〜２．５μｇ／ｍｌの濃度の範囲にわたるように調製した。
卵黄１ｇから得た７．５μｌの脂質抽出物を１．５ｍｌのＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ（１：１）中で再構成させた。
ＴＬＣ分析：
ＴＬＣ分析は実施例１に記載のように実施した。
種々のグリセリドを可視化するために、２μｌの脂質抽出物を、自動ＴＬＣサンプラー４（CAMAG）によって３ｍｍのバンドでＨＰＴＬＣシリカ６０プレート（Merck）にアプライした。シリカプレートを、ランニングバッファーＩ（Ｐ−エーテル：メチル第三ブチルエーテル：酢酸（５０：５０：１））とともに水平展開チャンバー（CAMAG）に入れた。ガス相には２０ｍｌのランニングバッファーを、スルーに５ｍｌを用い、アプライ位置から約５ｃｍまでプレートを溶出した。プレートを加熱用戸棚（１６０℃）中で５分間乾燥させた。最後に、ＴＬＣプレートを展開試薬（１６％Ｈ３ＰＯ４水溶液中、６％Ｃｕ（ＣＨ３ＣＯＯ）２）中に浸漬し、加熱用戸棚（１６０℃）中で１０分間炭化した。
結果
酵素添加量、反応温度及び反応時間の最適な組合せを決定するために、卵黄におけるレシチンからリゾレシチンへの酵素的変換について、４つの異なる酵素添加量を、３つの異なる温度及び５つの異なる反応時間で調べた。
用いた４つの酵素添加量、５Ｕ／ｇ、１０Ｕ／ｇ、２０Ｕ／ｇ及び３０Ｕ／ｇ、並びに用いた反応時間、３０分、６０分、１２０分、２４０分及び３６０分は、本明細書では対照とされていない最初の試験に基づいたものであった。３つの温度、３０℃、４０℃及び５０℃は、脂肪分解酵素の温度最適曲線に基づいて選択した、図２０参照。
酵素によって改良された卵黄中のレシチン及びリゾレシチンの量は、ＨＰＬＣによって分析し、図２１及び図２２に、反応時間の関数として表した。図２３では、酵素によって改良された卵黄中の遊離脂肪酸の量が、反応時間の関数として表されている。
この実験は、本発明の脂肪分解酵素によるレシチンからリゾレシチンへの変換が、３０℃で１２０分間の２０Ｕ／卵黄１ｇという脂肪分解酵素を用いて最適であったことを示す。２０Ｕ／卵黄１ｇという添加量は、３０Ｕ／卵黄１ｇ、１２０分の反応〜２４０分の反応で観察されたＬＰＣレベルの低下によって選択されている。
この結果に基づいて、本発明の脂肪分解酵素及びLecitase（登録商標）Ultraが、３０℃よりも低い温度で卵黄脂質に対して効果を及ぼすかどうか、及びLecitase（登録商標）Ultraについて現在工業的に用いられている温度である、５３℃でのそれらの活性と比較するために調べた。
卵黄におけるレシチンのリゾレシチンへの酵素的変換を、５つの異なる温度（５℃、１０℃、１５℃、２０℃及び５３℃）、及び６つの異なる反応時間で調べた。３０Ｕ／卵黄１ｇという酵素添加量は、これが酵素の費用から商業的に注目される最大の添加量であろうということで、また試験した温度では反応速度が低いと予想されたので試験した。記載したすべての酵素単位はＴＩＰＵによって求めた。３０Ｕ／卵黄１ｇはまた、Lecitase（登録商標）Ultraの推奨される添加量でもある。さらに、５３℃では６０Ｕ／卵黄１ｇという添加量を試験した。用いた反応時間は６０分、１２０分、２４０分及び３６０分、４８０分及び１４４０分とした。しかし、５３℃では反応時間は１５分、３０分、６０分及び９０分、１２０分及び２４０分とした。６０Ｕ／卵黄１ｇを用いる５３℃では、３３０分の反応でサンプルを採取した。
図２４及び２５では、酵素によって改良された卵黄中のリゾレシチン、遊離脂肪酸及びレシチンの量が、本発明の脂肪分解酵素及びLecitase（登録商標）ホスホリパーゼをそれぞれ用いる反応時間の関数として表されている。サンプル中のレシチン及びリゾレシチン含量は、ＬＣ−ＭＳによって求め、遊離脂肪酸含量はＮＥＦＡ Ｃ法によって求めた。対照サンプル中のＦＦＡの量（結果は示されていない）並びに図２４及び２５に示されるリゾレシチンとレシチンの合計は実験の間、一定のままであった。
図２４は、卵黄の、本発明の脂肪分解酵素での酵素処理の結果を示す。５３℃では、反応３０分後に脂肪分解酵素の活性が停止し、ＬＰＣレベルは３０Ｕ／卵黄１ｇを用いて１．７％（ｗ／ｗ）に到達していた（図２４ｂ）。ＦＦＡのレベルは、３０Ｕ／卵黄１ｇ及び６０Ｕ／卵黄１ｇを用いて、それぞれ１．０％（ｗ／ｗ）及び１．３％（ｗ／ｗ）であった。Lecitase（登録商標）Ultraを用いて、ＬＰＣ及びＦＦＡの量は期間１５〜２４０分の間に増加し（図１９）、３０Ｕ／卵黄１ｇで反応２４０分後に収率２．７％ＬＰＣ（ｗ／ｗ）であった。ＦＦＡのレベルは、３０及び６０Ｕ／卵黄１ｇを用いて反応２４０分後に、それぞれ１．４％（ｗ／ｗ）及び２．１％（ｗ／ｗ）であった。Lecitase（登録商標）Ultraの活性は、６０Ｕ／卵黄１ｇを用いて反応３３０分後に停止した。本発明の脂肪分解酵素は、Lecitase（登録商標）Ultraよりも高い初期反応速度を有していた。
本発明の脂肪分解酵素を用いた、２０℃及び５３℃では、初期反応速度は同様であった（図２４）。５〜２０℃の温度では、ＬＰＣ及びＦＦＡの量は実験の間、増加した。２０℃より低い温度では、温度が低下するにつれ、初期速度が著しく低下した。２０℃で、３０Ｕ／卵黄１ｇで反応６０分後に３．３％（ｗ／ｗ）というＬＰＣレベル及び１．６％（ｗ／ｗ）というＦＦＡレベルに到達した。このレベルはLecitase（登録商標）Ultraを用い５３℃で反応２４０分と同様であった。２０℃で反応１４４０分後、ＦＦＡ分析のために溶媒を含まない脂質抽出物を再懸濁することは可能ではなかった。５℃及び１０℃で１４４０分後、脂肪分解酵素を含むサンプルは高い粘度を有しており、これによって攪拌が不可能であった。これは、おそらくＦＦＡの結晶化によるものであった。３０Ｕ／卵黄１ｇ、３０℃、反応１２０〜２４０分でＴＮ６６４２において見られたＬＰＣレベルの低下は、これらの実験のいずれにおいても観察されなかった。
２０℃以下の温度では、卵黄のLecitase（登録商標）Ultraホスホリパーゼでの酵素処理によって、５３℃でのLecitase（登録商標）Ultraの初期速度と比較して初期速度の相当な低下が生じる（図２５）。２０℃では、３０Ｕ／卵黄１ｇで反応１４４０分後に３．０％（ｗ／ｗ）というＬＰＣレベル及び１．５％（ｗ／ｗ）というＦＦＡレベルに到達した。このレベルは５３℃で反応２４０分と同様であった。
図２６は酵素によって改良された卵黄から抽出した脂質のＴＬＣ分析を示す。この分析によって、ＬＣ−ＭＳから得た結果が確認され、本発明の脂肪分解酵素及びLecitase（登録商標）Ultraホスホリパーゼはリゾレシチン量を増加させたことが示された。
脂肪分解酵素によって触媒される酵素反応により、当量のリゾレシチンと遊離脂肪酸が生成する。可能性があり、且つ望ましくない副反応としては、トリアシルグリセリドの加水分解がある。酵素反応の間のリゾレシチンと遊離脂肪酸の量の変化の間の関係を図２７に示す。
Lecitase（登録商標）Ultraを用いた場合、リゾレシチンと遊離脂肪酸の当量の形成という良好な相関がある（図２７）。しかし、Lecitase（登録商標）Ultraを用いて処理したほとんどのサンプルでは、極めて少量の反応しかなかった。本発明の脂肪分解酵素での卵黄の酵素処理は、４０ｍＭより高いリゾレシチンレベル及び６０ｍＭより高い遊離脂肪酸レベルで、形成されるリゾレシチン当たり１より多い遊離脂肪酸の生成をもたらす。Lecitase（登録商標）Ultraでの最大変換は３０ｍＭリゾレシチン及び２５ｍＭ遊離脂肪酸である。遊離脂肪酸対リゾレシチン比が０．８（ｎ／ｎ）より低いか、又は１．２より高いサンプル及びＬＰＣ含量が１．０％（ｗ／ｗ）よりも高いサンプルを表１８に示す。
遊離脂肪酸対リゾレシチン比が１．２（ｎ／ｎ）よりも高く、ＬＰＣ含量が１．０％（ｗ／ｗ）よりも高いサンプル（図２７）は、概して、長時間の反応時間で、又は１．０％ＰＣ（ｗ／ｗ）未満しか含まないサンプルにおいて見られる。１５℃の脂肪分解酵素サンプルでは、すべてのサンプルにおいて、遊離脂肪酸対リゾレシチン比は上昇した。これは、長時間の反応時間では、又はＰＣ含量が低い場合には、酵素が基質特異性を変化させるということを示す。これは、卵黄中に見られる、ホスファチジルエタノールアミン、ジガラクトシルジアシルグリセリド又はトリアシルグリセリドの加水分解によるものであろう。遊離脂肪酸対リゾレシチン比が０．８（ｎ／ｎ）よりも低く、ＬＰＣ含量１．０％（ｗ／ｗ）よりも高いサンプルは、概して、５３℃という反応温度で見られる（表１８）。これはエステル交換によって説明がつく。
図２８は、長時間の反応時間では、又は低濃度のＰＣでは、本発明の脂肪分解酵素がトリアシルグリセリド及び１，３ジアシルグリセリドに対して加水分解活性を有すること示す。１，２ジアシルグリセリドの蓄積は、リパーゼ活性は１，３−特異的であるということを示すものである。モノグリセリドの形成は、Lecitase（登録商標）Ultraが、２０℃でトリアシルグリセリド又はジアシルグリセリドに対して加水分解作用を有していたことを示す。ＬＰＣの形成レベルは大きく異なるので、本発明の脂肪分解酵素又はLecitase（登録商標）Ultraホスホリパーゼが、最高水準のトリアシルグリセリドの加水分解を有するかどうかを調べることは不可能である。酵素添加量を低下させること及び脂肪分解酵素の反応時間を短縮することによって、加水分解は低減し得る。表１８Ａは、図２８のレーン１〜３０の対象に適用される反応時間、温度及び添加量を示す。
*) B：ブランク、Ｋ：本発明の脂肪分解タンパク質、Ｌ：Lecitase（登録商標）Ultraホスホリパーゼ
当業者には明らかであろうが、慣例の実験を用いる、酵素添加量、反応温度及び反応時間の最適化は、所与の食品用途のいずれに関しても容易に決定できる。
結論
本発明の脂肪分解酵素及びLecitase（登録商標）Ultraホスホリパーゼの、DanAg A/S社製卵黄の酵素処理を実施して、レシチンのリゾレシチンへの変換を調べた。これは、５つの温度（５〜２０℃、及び５３℃）で酵素添加量３０Ｕ／卵黄１ｇを用いて行い、６つの種々の反応時間（６０〜１４４０分、ただし５３℃では１５〜２４０分）を実施して酵素活性を調べた。５３℃は、Lecitase（登録商標）Ultraを用いて卵黄を改良するための工業において現在用いられている温度である。
本発明の脂肪分解酵素は、試験したすべての温度でLecitase（登録商標）Ultraよりも高い初期反応速度を有していた。５３℃では、脂肪分解酵素での反応は、ほんの３０分の反応の後、停止した。３０Ｕ／卵黄１ｇという添加量で、５３℃では、ＬＰＣレベルは、脂肪分解酵素及びLecitase（登録商標）Ultraを用い、それぞれ１．７及び２．７％（ｗ／ｗ）であった。脂肪分解酵素を用い、２０℃でほんの６０分という反応の後３．３％（ｗ／ｗ）ＬＰＣというレベルに到達した。
低温（５〜２０℃）では、脂肪分解酵素でのレシチンのリゾレシチンへの変換は、Lecitase（登録商標）Ultraを用いた場合よりも相当に良好であった。１０℃以下では、１５℃以上と比較して、脂肪分解酵素の反応速度は著しく低かった。脂肪分解酵素は、５℃で活性であり、反応２４時間後に、２％（ｗ／ｗ）よりも多いリゾレシチンの形成が検出可能であった。また、脂肪分解酵素を用いたサンプルは、１０℃以下で、より高い温度と比較してより粘性であった。
長時間の反応時間では、又はＰＣ含量が低い場合には、脂肪分解酵素は基質特異性を変化させ、リン脂質の他に、ホスファチジル−エタノールアミン、ジガラクトシルジアシルグリセリド又はトリアシルグリセリドを加水分解することがわかった。これは、少ない酵素添加量及び短い反応時間を用いることで避けられ、問題の各生成物の処理条件の徹底的な最適化が必要であることを立証するものである。５３℃では、エステル交換によって、脂肪分解酵素及びLecitase（登録商標）Ultraを用いて、リゾレシチン当たり１当量未満の遊離脂肪酸が生じるということの説明がつく。
結論として、本発明の脂肪分解酵素は、低温での卵黄の酵素処理のための有力候補である。低温で観察された活性はまたその他の用途においても注目される。
フザリウム・ヘテロスポラムＣＢＳ７８２．８３脂肪分解酵素の使用によるマヨネーズの製造
マヨネーズの製造：
実施例４に記載したように調製した、６．２５ｇの脂肪分解酵素を、５０ｍＬの脱塩Ｈ２Ｏに溶解したところ、１５０Ｕ／ｍＬというホスホリパーゼ活性に相当していた。１５分攪拌した後、溶液を１３７０×ｇで５分間遠心分離した。上清を、表１９に従い、１５０ｇのSanofa A/S社製の卵黄の酵素処理に用いた。別の１５０ｇのSanofa A/S社製の卵黄は、表に従い、Lecitase（登録商標）Ultra（Novozymes A/S, Denmark）で処理した。酵素処理は、ゆっくり攪拌しながら３０℃で１８０分間実施した。脂質抽出は、実施例４に記載したように実施した。
Sanofa A/S社製の、酵素によって改良された卵黄を用いたマヨネーズを、Korumaミキサー（Disho V60/10）を用いて製造した。加工の際、マヨネーズは９５℃に５分間加熱した。
ＴＬＣ分析：
ＴＬＣ分析は前記のように実施した。
マヨネーズの粒径測定
２．０ｇのマヨネーズサンプルを０．２％ＳＤＳ２２．５ｇに溶解し、３００ｒｐｍで最低３０分間攪拌した。次いで、Malvern Mastersizerで粒径分布を測定した。
結果
酵素によって改良された卵黄を用いたマヨネーズの製造には、Sanofa A/S社製の卵黄を用いた。この卵黄には８％の塩が含まれていた（DanAg社製の卵黄中の０％と比較して）。最初の試験（示されてない）によって、Sanofa A/S社製の卵黄中の高い塩濃度は、脂肪分解活性に影響を及ぼすことが示され、したがって２０Ｕ／ｇの代わりに３０Ｕ／ｇという酵素添加量を用いた。
酵素によって改良された、Sanofa A/S社製の卵黄から抽出された脂質のＴＬＣ分析により（図２９）、本発明の脂肪分解酵素はレシチン量を減少させ、同時にリゾレシチン量を増加させることが示された（図２９）。相対的に、Lecitase（登録商標）Ultraを用いた場合のレシチンのリゾレシチンへの変換は無視できる程であった。ＴＬＣによって示されたレシチンのリゾレシチンへの高変換は、酵素によって改良された、Sanofa A/S社製の卵黄から抽出された脂質で行った遊離脂肪酸の測定と相関があった（表２１）。脂肪分解酵素を用いて遊離された遊離脂肪酸量は、Lecitase（登録商標）Ultraを用いて遊離された遊離脂肪酸量よりも３．５倍多かった。
マヨネーズ中の油滴のサイズ分布を分析し、異なって、酵素によって改良された、Sanofa A/S社製の卵黄の乳化特性を評価した。示されるように、本発明の脂肪分解酵素で処理された卵黄で製造されたマヨネーズは、Lecitase（登録商標）Ultra処理された卵黄か、又は未処理卵黄のいずれかで製造されたマヨネーズと比較して最小の平均粒径並びに最小の粒径分布を有していた。小さい平均粒径並びに狭い粒径分布は、良好な乳化特性を示すものであり、したがって、脂肪分解酵素で改良された卵黄は最良の乳化特性を有していた。
酵素によって改良された、Sanofa A/S社製の卵黄で製造したエマルジョンの熱安定製を評価するために、マヨネーズを電子レンジで４秒間加熱した。図３０に示されるように、酵素によって改良された卵黄を含有するマヨネーズは熱安定性エマルジョンを示し、一方で、未処理卵黄を含有する対照は、電子レンジでの熱処理の際分離し、したがって、エマルジョンは熱安定性でなかった。
結論
酵素によって改良された、Sanofa A/S社製の卵黄のＴＬＣ分析及び遊離脂肪酸測定から得た結果と、酵素によって改良された、Sanofa A/S社製の卵黄で製造したマヨネーズの粒径分布及び熱安定性試験とは相関していた。本発明の脂肪分解酵素を用いて改良された卵黄は、レシチンからリゾレシチンへの最高の変換率及び最高量の遊離脂肪酸を有していた。予想どおり、レシチン：リゾレシチン比のこの変化は、熱安定性であり、最も最適な粒径分布を有するマヨネーズをもたらした。
Sanofa A/S社製の卵黄を改良するのLecitase（登録商標）Ultraを用いることでは、レシチン：リゾレシチン比にあまり大きな変化は得られず、また多量の遊離脂肪酸も得られなかった。レシチンからリゾレシチンへのこのあまりはっきりしない変換は、マヨネーズの粒径分布に反映され、これは改良されていない卵黄のものと同様であった。しかし、Lecitase（登録商標）Ultraを用いて生じたレシチン：リゾレシチン比の変化は、熱安定性マヨネーズを製造するのには十分であった。
３０℃で１２０分、３０Ｕ／ｇの脂肪分解酵素を用いて改良された、Sanofa A/S社製の卵黄は、レシチンのリゾレシチンへの高い変換率示し、この卵黄で製造したマヨネーズは熱安定性であり、最適粒径分布を有していた。相対的に、３０℃で１２０分、３０Ｕ／ｇのLecitase（登録商標）Ultraを用いて処理された、Sanofa A/S社製の卵黄は、レシチン：リゾレシチン比にわずかな変化しか示さず、製造したマヨネーズの粒径分布は未処理卵黄を含むマヨネーズと同様であったが、実際には熱安定性であった。したがって、本発明の脂肪分解酵素はマヨネーズの製造においてLecitase（登録商標）Ultraよりも優れていた。
ハードクラストロールの製造のための、乳化剤と組み合わせた、フザリウム・ヘテロスポラム由来の脂肪分解酵素の適用試験
この試験では、ハードクラストロールを焼くために、本発明の、及びフザリウムヘテロスポラム由来の脂肪分解酵素の発酵を単独でか、又はPanodan（登録商標）A2020 DATEM及びGRINDSTED（登録商標）SSL P55（双方ともDanisco A/S社製の乳化剤である）と組み合わせて使用した。比パン体積に対する効果を、単独又は乳化剤と組み合わせたNovozyme社製のLipopan F（商標）の比パン体積に対する効果と比較した。
適用
ハードクラストロールは、以下のレシピ及びベーキング手順を用いて焼いた。
ベーキング手順
Disnaミキサーシステム
１．１分間低速で乾燥混合する
２．２分間低速で混合＋４分間高速で混合
３．生地温度：２６℃
４．生地を量りとる：１３５０ｇ
５．休止：加熱用戸棚中３０℃で１０分
６．成形：Fortuna３／１７／７モールダー
７．ホイロ：３４℃、８５％ＲＨで４５分
８．Bagoオーブン中でベーキング：２２０℃、１３分、１３秒蒸らし＋ダンパーを開けて５分
９．MIWEストーンデッキ：プログラム番号１
１０．ベーキング後、ロールを２５分間冷却し、その後秤量する。ロールの体積は、菜種油置換法によって測定した。
比パン体積：
比体積＝パンの体積、ｃｃｍ／パンの重量、ｇ
小麦粉をベースとする、噴霧乾燥した脂肪分解酵素の添加。酵素は、水、アスコルビン酸及び圧搾酵母とともの第１の混合の後、小麦粉に添加する。すべてのその他の乾燥成分はステップ１で混合する。
結果
噴霧乾燥した、フザリウム・ヘテロスポラム由来の脂肪分解酵素を、Danisco A/S社製のPanodan（登録商標）M2020 DATEMと併用し、Lipopan F（商標）／DATEMの組合せ、並びに純粋なLipopan F（商標）又は純粋なDATEMに対して調べる。結果を表２３及び図３１に示す。
凍結乾燥した、フザリウム・ヘテロスポラム由来の脂肪分解酵素を、Panodan（登録商標）A2020 DATEM及びGRINDSTED（登録商標）SSL P55と併用し、Lipopan F（商標）／SSL又はLipopan F（商標）／DATEMの組合せ、並びに純粋なLipopan F（商標）又は純粋なDATEM及び純粋なSSLに対して調べた。
結果を表２４及び図３２に示す。
結論
表２３及び図３１の結論は、噴霧乾燥した、本発明の脂肪分解酵素の最適添加量は、約３８３ｐｐｍ脂肪分解酵素であるということ、及び生成物は、低い添加量のDATEM乳化剤と組み合わせて低い添加量で使用できるということである。並行実験では、５７４ｐｐｍ〜１９１２ｐｐｍの脂肪分解酵素の添加量で、比パン体積が低下する（データは示していない）ことが示された。３８３ｐｐｍの本発明の脂肪分解酵素の性能は、４０ｐｐｍのLipopan F（商標）と同程度である。乳化剤と併用した場合には、本発明の脂肪分解酵素も、Lipopan F（商標）を用いるレベルで機能する。本明細書において先に記載したＴＩＰＵアッセイを用いるホスホリパーゼ活性の測定によれば、１０ｐｐｍのLipopan F（商標）が、小麦粉１ｋｇ当たりおよそ１２０ＴＩＰＵであり、９６ｐｐｍの本発明の脂肪分解酵素が小麦粉１ｋｇ当たり１１７ＴＩＰＵに相当する。
さらに、表２４及び図３２の試験結果に基づいて、本発明者らは、本発明の脂肪分解酵素は、ＳＳＬ並びにＤＡＴＥＭと併用でき、それによって、低い乳化剤レベルの効果を後押しすると結論付けた。本発明の脂肪分解酵素の機能は、同様に添加すれば、Lipopan F（商標）の機能に匹敵し得る。乳化剤と組み合わせたホスホリパーゼ活性の最適レベルは、再度、小麦粉１ｋｇ当たり約１００〜１５０ＴＩＰＵであると求められる。
最終的に、純粋な本発明の脂肪分解酵素の最適添加量は、小麦粉１ｋｇ当たり約５００ＴＩＰＵであり、乳化剤と組み合わせると、脂肪分解酵素のレベルは、脂肪分解酵素の最適レベルの１／５〜１／４となるはずであり、これは、小麦粉１ｋｇ当たり約１２０ＴＩＰＵを意味する。
コムギトルティーヤの製造のための、フザリウム・ヘテロスポラム由来の脂肪分解酵素の適用試験
フマル酸を用いて製造したコムギトルティーヤ（ＵＳ手順）の圧延性に対する、本発明の、及びフザリウム・ヘテロスポラム由来の脂肪分解酵素の効果を、以下の実施例において説明するように調べた。
コムギトルティーヤは、表２５中の材料を用いて焼いた。
コムギトルティーヤ生地を作製する手順：
１．所望の生地温度：３２℃
２．Kemperミキサー中、周囲温度で捏ねを行う
３．すべての乾燥材料をミキサーボウルに入れる（場合によっては、脂肪分解酵素及び／又は乳化剤を含む）
４．乾燥混合１分間
５．水を添加
６．混合：スピード１で１１分
７．計量：１３５０ｇ×３
８．成形：glimekデバイダー／ラウンダーで生地ボールに
９．３２℃で１０分間休止
１０．ベーキング：トルティーヤオーブンCFO40で、以下の設定を用いて：上段：２３０℃、中段：２２８℃及び下段：１６０℃。
１１．冷却：２０℃、８０％ＲＨで１２分
本発明の脂肪分解酵素を、濃度を増加させて生地に添加した（試験番号３〜７）。比較のために、対照（試験番号１）及びDanisco A/S社製Panodan（登録商標）205乳化剤を用いた試験（試験番号２）を含めた。表２６参照。
脂肪分解酵素、Panodan（登録商標）205及び添加する場合にはL−システインは、第１の混合プロセスに加えた（上記ステップ３及び４）。Ｌ−システインは、作製した生地の伸展性を高めるために添加してもよく、それによってベーキングの前の生地のプレスプロセスが改良される。
トルティーヤは、室温で実施する冷圧延性試験によって評価し、これでは、トルティーヤを、直径が最大である木製の棒から出発して、種々の直径の種々の木製の棒の周りに巻く。圧延性は、トルティーヤが壊れずに巻かれることができる木製の棒の数によって示される。数が多いほど圧延性が良好である。
この結果から、本発明者らは、２００ｐｐｍ以上の本発明の脂肪分解タンパク質という添加量は、対照系と比較して圧延性を改良するようであると結論付けた。本明細書において先に記載したＴＩＰＵアッセイを用いて、圧延性を改良するために必要とされる活性レベル（２００ｐｐｍという添加量で）が、小麦粉１ｋｇ当たり約６５０ＴＩＰＵユニットに相当すると求められた。また、この結果から、貫入試験を達成する力は、高レベルの脂肪分解酵素で高められると結論付けることもでき、このことは、トルティーヤの抵抗力が改良されていることを意味する。貫入試験は、Stable Micro Systemによって製造されたテクスチャーアナライザーTAXT2の使用によって実施し、これでは、トルティーヤに貫入／トルティーヤを破壊するために必要とされる力が測定される。
この装置は以下のパラメーターで設定する：
力は圧縮状態で測定される
プレ試験速度 １０ｍｍ／ｓ
試験速度 ２ｍｍ／ｓ
ポスト試験速度 １０ｍｍ／ｓ
破壊試験間隔 １ｍｍ
間隔 ２５ｍｍ
力 １ｇ
時間 ５秒
ロードセル ５ｋｇ
温度 ２０〜２２℃（室温）
ハンゼヌラ・ポリモルファにおけるフザリウム・セミテクタム（ＩＢＴ９５０７）由来の脂肪分解酵素をコードする合成遺伝子の、分子クローニング、配列解析及び異種発現
ゲノムＤＮＡから得たＦ．セミテクタム脂肪分解酵素遺伝子の断片を、種々のフザリウム株から得た脂肪分解酵素のアラインされたタンパク質配列内のアミノ酸の保存ブロックから設計したプライマーを用いるＰＣＲを用いてクローニングした。縮重ＰＣＲプライマーは、コンピュータプログラムCODEHOP（Rose et al. 2003 (Nucleic Acids Res., 18: 3763-3766)）を用いて設計した。
遺伝子の末端をクローニングするために、５’−及び３’−ＲＡＣＥ法（Frohman et al. 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 8998-9002）を用いた。全ＲＮＡは、１％ヒマワリ油で誘導した、Ｆ．セミテクタム株の培養物から単離し、用いたプライマーは、CODEHOPプライマーを用いて得た遺伝子断片の配列から設計した。
上記の手順によって得られた３種の断片を、インシリコでアセンブルし、全長ｃＤＮＡ配列を明らかにした。１２３６ヌクレオチド長ｃＤＮＡ配列の解析により、３５２個のアミノ酸を含むオープンリーディングフレームが示された（図３３）。
ハンゼヌラにおいてＦ．セミテクタム脂肪分解酵素遺伝子を発現させるために、遺伝子に、酵母α接合因子由来のシグナル配列を与え、ハンゼヌラ発現ベクターpB14にＦＭＤプロモーターの後ろに挿入した。得られたプラスミドpB14-alp.sem（図３４に図式的に示されている）を、エレクトロポレーションによってコンピテントなハンゼヌラ・ポリモルファ細胞に形質転換した。形質転換体は、ＹＮＤプレート上で選抜し、ＹＮＤの液体培養で１：２００希釈を１０回通過することによって、コロニーを、遺伝子の多重組込みについてさらに選抜した。最後に、選抜した培養物をＹＰＤ培地に２回移した。
脂肪分解酵素遺伝子の発現レベルを調べるために、選抜したクローンを、１．８％グリセロール及び０．２％グルコースを含むＹＰＤで、３７℃で２日間増殖させた。
フザリウム・セミテクタム脂肪分解酵素の活性のための最適ｐＨ及び最適温度の決定
実施例８に記載したように、フザリウム・セミテクタムＩＢＴ９５０７から得、ハンゼヌラ・ポリモルファで発現させた本発明の脂肪分解酵素を、ホスホリパーゼ及びガラクトリパーゼ活性を測定するために生地スラリーにおける機能アッセイに用い、この酵素の活性を、ｐＨ及び温度の変化に関して調べた
分析手順
ガスクロマトグラフィー
０．８グラムの小麦粉を１２ｍｌのふた付き遠沈管に量り入れる。酵素を含有する１．５ｍｌの水を添加する。サンプルをWhirleyで混合し、３０℃の加熱用戸棚に６０分間入れる。ｎ−ブタノール：エタノール９：１を６ｍｌ添加し、サンプルを、小麦粉が溶媒に完全に分配されるまで再度混合する。次いで、この管を９５℃の水浴に１０分間入れる。次いで、再度混合し、回転装置４５ｒｐｍ上に４５分間置く。次いで、サンプルを２０００ｇで１０分間遠心分離し、２ｍｌの上清を１０ｍｌのドラムグラス（dram glass）に移す。７０℃、窒素流下で溶媒を蒸発させる。単離された脂質をＧＬＣで分析する。
ガスクロマトグラフ及びガラクトリパーゼ活性アッセイは、実施例１に記載のように実施した。
温度最適条件
ホスホリパーゼ活性
温度の関数として活性を測定するために、ホスホリパーゼアッセイを、実施例１におけるようにであるが、温度は３０℃、３７℃、４５℃、５２℃又は６０℃に設定して実施した。
ｐＨ最適条件
ホスホリパーゼ 活性
ｐＨの関数として活性を測定するために、ホスホリパーゼアッセイを、実施例１におけるようにであるが、０．６％Ｌ−αホスファチジルコリン９５％植物（Avanti 441601）及び０．４％Triton-X 100（Sigma X-100）を、０．０５Ｍリン酸バッファーｐＨ５、ｐＨ６、ｐＨ７、ｐＨ８又はｐＨ９に溶解した。
結果
フザリウムセミテクタムＩＢＴ９５０７由来の本発明の脂肪分解酵素を、ホスホリパーゼ活性ＰＬＵ−７及びガラクトリパーゼ活性ＧＬＵについて分析し、結果を表２７に示す。
フザリウム・セミテクタムＩＢＴ９５０７を、記載した手順に従って、０．８グラムの小麦粉に１ＰＬＵ−７を添加することによって、生地スラリー実験において試験した。酵素の代わりに水を用いた対照サンプル及びLipopan F（商標）を用いたサンプルも調製した。生地から抽出した脂質はＧＬＣによって分析し、結果を表２８に示した。
表２８の結果は、Ｆ．セミテクタム由来のリパーゼはガラクト脂質に対して相当な活性を、トリグリセリドに対してはLipopan F（商標）と比較して相対的に少ない活性を有することを示す。
また、フザリウム・セミテクタムＩＢＴ９５０７を、温度（表２９）及びｐＨ（表３０）の関数としての活性に関して分析した。
表２９及び３０に列挙した活性をまた、図３５及び３６で図式的に示す。
結論
フザリウムセミテクタム由来の本発明の脂肪分解酵素は、生地中のガラクト脂質に対して極めて強力な活性を示し、トリグリセリドに対する活性はLipopan F（商標）のトリグリセリド活性より少ない。この酵素の活性の温度最適条件は、約４５℃であり、ｐＨ最適条件は７である。
飼料における本発明の脂肪分解酵素の使用
本発明の脂肪分解酵素の有効性を評価するために、ブロイラーの全生産期間の間、通常の飼料に種々の用量レベルで使用した。
概要：
予備段階の結果から、ブロイラーの飼料に本発明の脂肪分解酵素を添加することは、トリの能力を向上させるための、栄養保持を向上させるための、及び窒素排出を低減させるための有効な栄養学的戦略であるということが示唆されている。詳しくは、予備調査によって、動物の飼料に本発明の脂肪分解酵素を添加することによって、体重増加、飼料転換効率並びに乾物の、及び動物の窒素の代謝率が改良されると示唆されている。
飼料は、本発明の脂肪分解酵素を含むか含まないマッシュとして調製する。
飼料及び水は自由に与える。試験飼料を試験期間を通じて連続して給餌する。飼料サンプルに、本発明の脂肪分解酵素を３３０ｇ／トンで場合により追加する。酵素は飼料を混合しながら乾燥酵素として添加できる。
以下の時点で観察を行う：
生体重（ケージベース）： ０、２１及び４２日目
体重増加： ０〜２１日、２２〜４２日、０〜４２日
摂餌量： ０〜２１日、２２〜４２日、０〜４２日
ＦＣＲ（食物転換率）： ０〜２１日、２２〜４２日、０〜４２日
回腸内容物の採取： ２１及び４２日目
飼料及びトリの全ケージ重量を測定し、並びに、期間当たりの各ケージの全死亡重量及びトリ数を分析する。ケージ当たりの飼料消費を、死亡率について補正せずに求める。飼料転換効率データを、生体重当たりの全消費として、及び全重量（死亡重量を含む）ベースで求める。
研究開始に先立って、動物を、健康障害の兆候及び負傷について調べる。状態が悪いと思われるものはいずれも研究から排除する。
研究動物を、無作為化技術を用いてその処理群に割り当てる。試験飼料の投与を開始する前に、動物及びその格納用囲いを一意的に特定する。
処理群から得たデータを、適当な統計試験を用いてその関連対照群のものと比較し、０．０５未満の確率という水準を有意性を示すものとして認める。
体重、摂餌及び食物転換率を、分散分析及び最小有意差試験によって分析する。
動物
処理数 ：２
反復数 ：１３〜２１日及び９〜４２日
反復当たりの動物 ：８〜２１日及び２〜４２日
動物の種 ：ブロイラー
動物の品種 ：Ross
性別 ：雄
試験動物の齢 ：０〜４２日
試験動物の体重 ：約４０ｇ
飼料／畜舎
飼料情報 ：上記参照
飼料形態 ：マッシュ
抗コクシジウム開始剤 ：なし
抗コクシジウム仕上げ剤：なし
成長促進開始剤 ：なし
成長促進仕上げ剤 ：なし
実施した主な測定
変量：体重増加、飼料変換、栄養消化率
時期：０〜２１日、２２〜４２日
酵素／添加物
使用した酵素（１）：フザリウム・セミテクタム及び／又はフザリウム・ヘテロスポラム由来の脂肪分解酵素−３３０ｇ／トン
中国産小麦粉から製造したインスタントヌードルの品質に対するフザリウム・ヘテロスポラムＣＢＳ７８２．８３脂肪分解酵素の効果の評価
序論
インスタントヌードル（ＩＮ）市場は、東南アジア及び欧州のある程度及びＵＳＡではここ５〜８年で驚異的な成長を示している、この成長は、伝統的に米及び／又はパスタに根差している市場である領域においてでさえ明白である（Food Navigator, 2000）。最近のＩＮの人気は、主にその極めて手頃な費用、利便性及び清潔な製造手順によるものと考えられる。
平均タンパク質含量（９〜１１％）、低い灰分値（約０．５０％）、高Ｌ＊（８５）明度及びｂ＊（＞８．０）黄色の度合い及び高いデンプンペースト粘度（＜７５０ＢＵ）を有する小麦粉から、クリーム色／黄色のインスタントヌードル（ＩＮ）が得られ、所望のマウスフィール特性を有する。いくつかの異なる種類のヌードルが消費され、それぞれは最終製品の品質に影響を及ぼす固有の小麦粉品質特性を有する。
エンドユーザの要求に応えることは、多数の最終製品及び広範な消費者の期待のために小麦粉業界では手腕の問われるところとなっている。詳しくは、設計された成分及び添加物は、正しい用量で、最後の最終製品のテースト、テクスチャ、外観、保存期間及び／又は栄養価の改良において極めて重要な役割を果たす。
調理したＩＮの色及びテクスチャの重要性を軽視できない一方で、消費者はますます目が利くようになり、健康を意識するようになっており、品質を損なうことのない低脂肪の代替物が求められている。
本発明の脂肪分解酵素を、ＩＮの脂肪含量に対する効果を評価するため、及び加工の間のテクスチャ及び色の変化を調べるために中国産小麦粉で試験した。
材料及び方法
このプロジェクトには、ＩＮ製造のための標準的なAgrifood Technology手順及び拡張された評価法を用いた。中国産小麦粉を対照小麦粉として用い、毎日の開始時に実施した。中国産小麦粉のタンパク質含量、水分、灰分、色、湿潤グルテン及びジアスターゼ活性を、ＡＡＣＣ（米国臨床化学会）承認法を用いて測定した。生地レオロジー試験には、ファリノグラム、エキステンソグラム（４５分引き伸ばし）、アルベオグラム及びアミログラムを含めた。
ＩＮ製造は以下の様に要約できる：
各バッチのＩＮは、３５０ｇの小麦粉から製造し、低速で混合し、その間に３３パートの１％塩化ナトリウム及び０．２％アルカリ塩（６：４の割合の炭酸カリウム：炭酸ナトリウム）を含有する塩水溶液を徐々に加えた。添加サンプルについては、小麦粉を一定量の成分と完全に混合し、その後塩水溶液を加えた。
もろい生地を、さらに４分間中速で混合し、８回薄く伸ばした。薄く伸ばすことは、スチール製圧縮機で開始し、その後２回プラスチック製溝つきローラーで、最後に５回ステンレス製のスムースローラーで行い、各ロール間の縮小率は３０％とした。最終生地シートの厚みは１．３５ｍｍとした。生地シートは切断する前にもう一度薄く伸ばした。切断ロールとコンベヤーベルト間の速度の差によってきついカールが形成された。きつくカールされたヌードルの撚糸状のものを２分間蒸し、１８０℃のヤシ油で両側を１分間揚げた。ヌードルブロックを冷却し、さらなる分析のためにクリップシールバッグ（clip seal bags）に詰めた。
製造のいくつかの段階で、分析のためにサンプルを回収した。Minolta Chromameter及びノギスを用いてクラムの色及び粒径をそれぞれ測定した。生地シート及び最終製品の色を、Minolta Chromameterで記録し、双方のデジタル写真をとった（示していない）。水分活性測定は、蒸したヌードルで実施した。水分活性は、蒸したヌードルの重量を、蒸した直後と９０℃のオーブンで乾燥することによって完全に水分含量を除去した後の双方で調べることによって測定できた−その結果、水分含量は乾燥の前後の重量の差を乾燥後の重量で除すことによって求めることができる。
最適調理時間、調理収率、調理損失（重量法）、調理したヌードルの色及びテクスチャ（堅さ）を、当業者に公知の標準的なAgrifood Technology手順を用いて測定した。調理したヌードルテクスチャでテクスチャプロフィール分析（ＴＰＡ）も実施し、結着性、弾力性及びかみ応えを測定した。
結着性は、製品が、第１の変形下でどのように挙動したかに対し、第２の変形に如何によく耐えるかとして定義される。第１の圧縮の際の動作面積で除した第２の圧縮の際の動作面積として測定するので、測定値の単位はない。この場合には結着性は、製品の「アルデンテ」と関連し、これはＩＮにとっては望ましい特性ではない。
弾力性は、製品が、第１の圧縮の際に変形した後に、物理的に如何によくはね返るかとして定義される。弾力性は、いくつかの方法で測定されるが、最も一般には、第２の圧縮に対する製品の検出された高さの距離によって測定される。
かみ応えは固体製品にのみ当てはまり、弾力性を乗じた粘着度として算出される。かみ応えは粘着性と相互排他的である。
各添加率を代表する１つのヌードルブロックをコーヒーグラインダーで粉にし、均質な下位サンプルを、酸性加水分解法による脂肪分析に用いた（脂肪含量を測定するために代替標準法も使用できる）。
結果及び考察
小麦粉のタンパク質含量及び色（明度、Ｌ＊に関して）は、インスタントヌードルの製造のための許容範囲内であった。吸水率はＩＮ製造のための高い方の端にかろうじてあったが、ヌードル生地は相当もろいので、それが機械加工性に影響を与えることはなかった。
小麦粉は良好な一方向伸展性（エキステンソグラム）及び二軸伸展性（アルベオグラム）を有しており、これがヌードルの食味にプラスの影響を及ぼす。アミログラフのピーク粘度は、ＩＮにとって望ましいものである８７０ＢＵであった。
２番目に高い用量の脂肪分解酵素を含有するＩＮの調理損失は、対照及び最小量の本発明の脂肪分解酵素を含有するＩＮよりも高かった。最高量の脂肪分解酵素を含むＩＮの脂肪含量は、対照及び最低量の脂肪分解酵素を含む実験用ＩＮよりも有意に低かった。いくつかの実験用ＩＮの弾力性及びかみ応えは、対照よりも良好であった。このデータに基づいて、脂肪分解酵素を、種々の添加量でさらに調べなくてはならない。
結論
この研究からなされ得るいくつかの顕著な点は以下の通りである：
本発明の脂肪分解酵素のＩＮへの添加は、クラムの大きさ、生地粘性、機械加工性又は加工特性に対して劇的には影響を与えなかった。重要なことに、脂肪分解酵素の添加量を増加した結果、ＩＮの脂肪含量が低下した。脂肪分解酵素は、用量を増加すると対照と比較してヌードルの堅さを高めたが、結着性は影響を受けなかった。脂肪分解酵素は、調理したヌードルの黄色の度合いに対してプラスの効果を有していた。
したがって、脂肪分解酵素は、ＩＮの脂肪含量を低減させ、テクスチャを改良し、調理したヌードルの黄色の度合いを高めた。
上記の明細書中で記載したすべての刊行物は参照により本明細書に組み込まれる。本発明の記載した方法及びシステムの種々の改変及び変法は、当業者には明らかであり、本発明の範囲及び趣旨から逸脱するものではない。本発明を特定の好ましい実施形態に関連して記載してきたが、特許請求される本発明はこのような特定の実施形態に過度に制限されてはならないということは理解されなくてはならない。実際、生化学及びバイオテクノロジー又は関連分野の当業者には自明の、本発明を実施するための記載した様式の種々の改変は、特許請求の範囲内にあるものとする。
図１は、ＩＥＣクロマトグラフィー後に得られた、リパーゼ活性のプロフィール（ハッチ領域で示され、プールＢとして印がつけられた）及びタンパク質（折れ線）を示す。 図２は、ゲル（製造業者Novex, USAによって記載されるように調製したＮＵ−ＰＡＧＥ、４〜１２％）にアプライされ、次いで、クーマシー染色された、精製された真菌脂肪分解酵素（レーン３〜５）を示す。 図３は、クロマトグラム６１を示す。 図４は、ブチルセファロースカラムから得た画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す（Ｐ：１：１０希釈した、プール１７２〜１７４ １００Ｕ／ｍｌ、Ｓｔｄ＝標準タンパク質シリーズ）。 図５は、１）クロマトグラム６１画分９、２）プール１７２〜１７４、３）クロマトグラム６１画分１４、４）対照、５）リパーゼ３０４４を用いたミニベーキング実験を示す。 図６は、ＢＳ８９４８−２由来の生地脂質ジガラクトシルジグリセリド（ＤＧＤＧ）及びジガラクトシルモノグリセリド（ＤＧＭＧ）のＧＬＣ分析を示す。 図７は、すべてのＣＢＳペプチドのアミノ酸配列の、Ｆ．ヘテロスポラムの日本の菌株（Nagao et al. 1994）のリパーゼに対するアラインメントを示す。同一及び類似（十分に保存されている）アミノ酸には、アラインメントの下にそれぞれ＊及び・で印がつけられている。 図８は、合成α−シグナル配列と融合している、合成Ｆ．ヘテロスポラム（ＣＢＳ ７８２．８３）脂肪分解酵素遺伝子のヌクレオチド配列及び翻訳されたアミノ酸配列を示す。アミノ酸配列はヌクレオチド配列の上に示されている。制限酵素部位Eco RI及びBam HIを含有するヌクレオチドに下線が引かれており、翻訳開始及び停止コドンには二重の下線が引かれている。矢じりの形のものはα−シグナル配列と脂肪分解酵素遺伝子間の融合の位置を記す。矢印は、遺伝子の構築に用いたプライマーを示す。 図９は、合成α−シグナル配列（αｓｓ）と融合している、合成Ｆ．ヘテロスポラム（ＣＢＳ ７８２．８３）脂肪分解酵素遺伝子（ＬＩＰＡＳＥ）を含有するハンゼヌラ発現ベクターpB14の模式図を示す。ＵＲＡ３、ハンゼヌラの選択のためのウラシル相補性のためのオロチジン−５’−ホスフェート−デカルボキシラーゼ遺伝子。ＨＡＲＳ、ハンゼヌラにおける複製のための自立複製配列。ＦＭＤ−Ｐ、ハンゼヌラにおける発現のためのＦＭＤプロモーター。 図１０は、合成Ｆ．ヘテロスポラム脂肪分解酵素遺伝子を含む、選択したハンゼヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）クローンのホスホリパーゼ活性を示す。基質としてレシチンを用い、遊離脂肪酸はＮＥＦＡキット（Roche）を用いて調べた。 図１１は、ホスホリパーゼサンプル２０５の添加量（ＰＬＵ）を増加させて、及びLipopan F（商標）を用いて焼いたミニブレッドを示す。 図１２は、生地脂質のＧＬＣ分析を示す。ＤＧＤＧ＝ジガラクトシルジグリセリド。ＤＧＭＧジガラクトシルモノグリセリド。合計＝ＤＧＤＧ＋ＤＧＭＧ（実施例３）。 図１３は、Ａ）参照：１．分画した小麦粉脂質、２．加水分解したＤＧＤＧ、３．ＤＧＤＧ、Ｂ）生地から抽出した脂質：４．対照、５．２０００ＰＬＵ−７／サンプル２０５ １ｋｇ及び６．４０ｐｐｍ Lipopan F（商標）のＨＰＴＬＣクロマトグラムを示す。 図１４は、フザリウム・ヘテロスポラム由来の脂肪分解酵素で処理した生地中の異性体ジガラクトシル−モノグリセリドのＧＬＣ分析を示す。 図１５は、ｐＨ７．０、種々の温度でのレシチン基質に対する１０分間の酵素処理と、その後のＮＥＦＡ Ｃ法による遊離脂肪酸の測定によって調べたフザリウム・ヘテロスポラム由来の脂肪分解酵素の活性を示す。 図１６は、３ＴＩＰＵ／ｍｌ、種々の温度（５０ｍＭ リン酸バッファー、ｐＨ７．０）の５０ｍＭリン酸バッファー中で３０分インキュベーションした後、３７℃、ｐＨ７．０でのレシチン基質に対する１０分間の酵素処理（ＣａＣｌ２を含まない）と、それに続くＮＥＦＡ Ｃ法による遊離脂肪酸の測定によって調べた、フザリウム・ヘテロスポラム由来の脂肪分解酵素の活性を示す。 図１７は、３７℃、種々のｐＨ（５０ｍＭ リン酸バッファー）でのレシチン基質に対する１０分の酵素処理（ＣａＣｌ２を含まない）と、それに続くＮＥＦＡ Ｃ法による遊離脂肪酸の測定後に調べた、フザリウムヘテロスポラム由来の脂肪分解酵素の活性を示す。 図１８は、３ＴＩＰＵ／ｍｌ及び種々のｐＨ（５０ｍＭリン酸バッファー）の５０ｍＭリン酸バッファーでの３０分のインキュベーション後に、レシチン基質に対する３７℃、ｐＨ７．０での１０分の酵素処理（ＣａＣｌ２を含まない）と、それに続くＮＥＦＡ Ｃ法による遊離脂肪酸の測定によって調べた、フザリウムヘテロスポラム由来の脂肪分解酵素の活性を示す。 図１９ａ及び１９ｂは、フザリウム・ヘテロスポラム由来の脂肪分解酵素のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって求められる分子量の測定を示す。 図２０は、本発明の脂肪分解酵素の温度最適条件を表す。酵素反応は種々の温度で実施した。 図２１は、酵素によって改良された卵黄中のレシチン量を、Ａ：３０℃、Ｂ：４０℃及びＣ：５０℃での反応時間の関数として表す。レシチン量はＬＣ／ＭＳ−ＭＳによって分析し、卵黄のパーセンテージとして表されている。 図２２は、酵素によって改良された卵黄中のリゾレシチン量を、Ａ：３０℃、Ｂ：４０℃及びＣ：５０℃での反応時間の関数として表す。リゾレシチン量はＬＣ／ＭＳ−ＭＳによって分析し、卵黄のパーセンテージとして表されている。 図２３は、酵素によって改良された卵黄中の遊離脂肪酸量を、Ａ：３０℃、Ｂ：４０℃及びＣ：５０℃での反応時間の関数として表す。遊離脂肪酸量は、ＮＥＦＡ Ｃ法によって分析し、卵黄のパーセンテージとして表されている。 図２４は卵黄の、本発明の脂肪分解酵素での酵素的変換を表す（実施例４）。反応時間の関数としての、リゾレシチン（Ａ）、遊離脂肪酸（Ｂ）及びレシチン（Ｃ）の量。エラーバーは、二重測定の標準偏差を示す（ｎ＝２）。レシチン及びリゾレシチン量はＬＣ／ＭＳ−ＭＳによって測定し、遊離脂肪酸量はＮＥＦＡ Ｃ法によって測定した。結果は卵黄のパーセンテージとして表されている。 図２５は、卵黄の、Novozymes A/S社製のLecitase（登録商標）Ultraホスホリパーゼでの酵素的変換を表す（実施例４）。反応時間の関数としての、リゾレシチン（Ａ）、遊離脂肪酸（Ｂ）及びレシチン（Ｃ）の量。エラーバーは、二重測定の標準偏差を示す（ｎ＝２）。レシチン及びリゾレシチン量はＬＣ／ＭＳ−ＭＳによって測定し、遊離脂肪酸量はＮＥＦＡ Ｃ法によって測定した。結果は卵黄のパーセンテージとして表されている。 図２６は、改良された卵黄からの脂質抽出物のＴＬＣ分析（溶媒はクロロホルム：メタノール：水（６５：２４：４）とした）を示す（実施例４）。１：ＰＣ及びＬＰＣ標準。２：本発明の脂肪分解酵素、１０℃、２４０分。３：本発明の脂肪分解酵素、２０℃、２４０分。４：本発明の脂肪分解酵素、５３℃、２４０分。５：本発明の脂肪分解酵素、２０℃、１４４０分。６：Lecitase（登録商標）Ultra、１０℃、４時間。７：Lecitase（登録商標）Ultra、２０℃、２４０分。８：Lecitase（登録商標）Ultra、５３℃、４時間。９：Lecitase（登録商標）Ultra、２０℃、１４４０分。１０：対照サンプル。ＴＬＣプレートの左側に列挙した化合物はコレステロール（Ｃ）、トリアシルグリセリド（ＴＧ）、ジアシルグリセリド（ＤＧ）、遊離脂肪酸（ＦＦＡ）、モノアシルグリセリド（ＭＧ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、リゾホスファリジルエタノールアミン（ＬＰＥ）及びリゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）である。 図２７は、卵黄の酵素処理の際のリゾレシチン及び遊離脂肪酸含量の変化と、それぞれ本発明の脂肪分解酵素及びLecitase（登録商標）Ultraホスホリパーゼ間の関係を表す（実施例４）。結果は、５２３というリゾレシチンのモル重量及び２８３という遊離脂肪酸のモル重量に基づいている。遊離脂肪酸はＮＥＦＡ Ｃ法によって測定した。リゾレシチン及びレシチンはＬＣ／ＭＳ−ＭＳによって測定した。 図２８は、改良した卵黄からの脂質抽出物のＨＰＴＬＣ分析（溶媒はｐ−エーテル：ＭＴＢＥ：酢酸（５０：５０：１）とした）を示す（実施例４）。ＴＬＣプレートの左に列挙した化合物は、トリアシルグリセリド（ＴＧ）、遊離脂肪酸（ＦＦＡ）、１，３ジアシルグリセリド（１，３ＤＧ）、１，２ジアシルグリセリド（１，２ＤＧ）、コレステロール（Ｃ）、モノアシルグリセリド（ＭＧ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、リゾホスファチジルエタノールアミン（ＬＰＥ）及びリゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）である。 図２９は、Sanofa A/S社製の酵素によって改良された卵黄で製造したマヨネーズのＴＬＣ分析を（溶媒IV）示す（実施例５）。 図３０は、電子レンジ中で熱処理した、Sanofa A/S社製の酵素によって改良された卵黄から調製したマヨネーズを示す（実施例５）。サンプル１は、酵素溶液の代わりに水を加えた対照とし、サンプル２には３０Ｕ／ｇの本発明の脂肪分解酵素を含め、サンプル３には３０Ｕ／ｇのLecitase（登録商標）Ultraを含めた。 図３１は、種々の濃度の本発明の脂肪分解酵素を単独又はPanodan（登録商標）M2020 DATEM乳化剤と組み合わせて用いて焼き、Lipopan F（商標）とDATEMの組合せ、並びに純粋なLipopan F（商標）又は純粋なDATEMに対して試験したハードクラスティーロールの比パン体積を示す。 図３２は、種々の濃度の本発明の脂肪分解酵素を単独又はPanodan（登録商標）A2020 DATEM又はSSL P 55乳化剤と組み合わせて用いて焼き、Lipopan F（商標）／SSL P 55又はLipopan（商標）／DATEMの組合せ並びに純粋なLipopan F、純粋なDATEM及び純粋なSSL P 55に対して試験したハードクラスティーロールの比パン体積を示す。 図３３は、Ｆ．セミテクタム（ＩＢＴ９５０７）リパーゼｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号５）及び推定アミノ酸配列（配列番号４）を示す。推定アミノ酸配列はヌクレオチド配列の上に示されている。矢印はｃＤＮＡの増幅に用いられるプライマーを示す。 図３４は、α−シグナル配列（αｓｓ）と融合している、ハンゼヌラ発現ベクターpDB14-alp-semを含有するＦ．セミテクタムリパーゼ遺伝子（Ｌｉｐａｓｅ）の模式図を示す。ＡＰ（Ｒ）、ＵＲＡ３、選択のためのウラシル相補性のためのオロチジン−５’リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子。ＨＡＲＳ、ハンゼヌラにおける複製のための自立複製配列。ＦＭＤ−Ｐ、ハンゼヌラにおける発現のための、ＦＭＤプロモーター。 図３５は、フザリウム・セミテクタムＩＢＴ９５０７由来の脂肪分解酵素のホスホリパーゼ活性を、温度の関数として示す。 図３６は、フザリウム・セミテクタムＩＢＴ９５０７由来の脂肪分解酵素のホスホリパーゼ活性を、ｐＨの関数として示す。 図３７は、フザリウム・ヘテロスポラム由来の真菌脂肪分解酵素のアミノ酸配列（配列番号１）を示す 図３８は、Ｎ末端シグナル配列（下線を引いた）を含むフザリウム・ヘテロスポラム由来の真菌脂肪分解酵素のアミノ酸配列（配列番号２）を示す。 図３９は、本発明に従う、フザリウム・ヘテロスポラム由来の真菌脂肪分解酵素をコードするヌクレオチド配列（配列番号３）を示す。 図４０は、フザリウム・セミテクタム由来の脂肪分解酵素のアミノ酸配列（配列番号４）を示す。 図４１は、フザリウム・セミテクタム由来の脂肪分解酵素をコードするヌクレオチド配列（配列番号５）を示す。 図４２は、フザリウム・ヘテロスポラム由来の脂肪分解酵素のアミノ酸配列（配列番号６）を示す（ＥＡＥＡは、α−因子シグナル配列を起源とするプロペプチドである）。 図４３は、α−因子シグナル配列を含む、フザリウム・ヘテロスポラム由来の脂肪分解酵素のヌクレオチド配列（配列番号７）を示す。

Claims (19)

  1. トリグリセリドと比較して極性脂質に対してより高い活性比を有する真菌野生型脂肪分解酵素。
  2. 酵素のリン脂質：トリグリセリド加水分解活性比が少なくとも４である、請求項１に記載の真菌脂肪分解酵素。
  3. 酵素の糖脂質：トリグリセリド加水分解活性比が少なくとも１．５である、請求項１に記載の真菌脂肪分解酵素。
  4. 酵素が配列番号１若しくは配列番号２で示されるアミノ酸配列、又はそれらと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、真菌脂肪分解酵素。
  5. 酵素が糸状菌から得られる、請求項１から４のいずれか一項に記載の真菌脂肪分解酵素。
  6. 酵素がフザリウム属から得られる、請求項１から５のいずれか一項に記載の真菌脂肪分解酵素。
  7. 酵素がフザリウム・ヘテロスポラムから得られる、請求項６に記載の真菌脂肪分解酵素。
  8. 酵素がフザリウム・ヘテロスポラムＣＢＳ７８２．８３から得られる、請求項７に記載の真菌脂肪分解酵素。
  9. 請求項４から８のいずれか一項に記載の真菌脂肪分解酵素をコードするヌクレオチド配列。
  10. 真菌脂肪分解酵素をコードする核酸であって、
    ａ）配列番号３に示されるヌクレオチド配列を含む核酸と、
    ｂ）遺伝コードの縮重によって配列番号３のヌクレオチド配列と関連している核酸と、
    ｃ）配列番号３に示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸と
    からなる群から選択される核酸。
  11. 食料品の１種以上の成分に、請求項１から８のいずれか一項に記載の真菌脂肪分解酵素を添加することを含む、食料品の製造方法。
  12. 生地に請求項１から８のいずれか一項に記載の真菌脂肪分解酵素を添加することと、生地を焼いてベークド製品を製造することとを含む、ベークド製品の製造方法。
  13. 食料品が卵又は卵ベースの製品、ベークド製品、菓子類、フローズン製品、チーズをはじめとする乳製品、ムース、植物性ホイップクリーム、食用油脂、エアレイテッド及び非エアレイテッドホイップ製品、水中油型エマルジョン及び油中水型エマルジョン、マーガリン、ショートニング、低脂肪及び超低脂肪スプレッドなどのスプレッド、ドレッシング、マヨネーズ、ディップ、クリームベースのソース、クリームベースのスープ、飲料、スパイスエマルジョン及びソースのうちの１種以上である、請求項１１に記載の方法。
  14. リン脂質を、請求項１から８のいずれか一項に記載の真菌脂肪分解酵素で処理し、リゾリン脂質を生成させることを含む、リゾリン脂質の調製方法。
  15. 糖脂質を、請求項１から８のいずれか一項に記載の真菌脂肪分解酵素で処理し、リゾ糖脂質を生成させることを含む、リゾ糖脂質の調製方法。
  16. 食用油又は植物油を、請求項１から８のいずれか一項に記載の真菌脂肪分解酵素で処理し、それに存在する極性脂質の大部分を加水分解することを含む、植物油又は食用油の酵素的脱ガム法。
  17. 請求項１１に記載の方法によって得られる食料品。
  18. 請求項１２に記載の方法によって得られるベークド製品。
  19. 説明及び図面を参照して、本明細書に概説した真菌脂肪分解酵素。
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