ES2234067T5

ES2234067T5 - Composicion para mejorar el pan.

Info

Publication number: ES2234067T5
Application number: ES98202468T
Authority: ES
Inventors: Rudolf Franciscus Wilhelmus Van Beckhoven
Original assignee: DSM IP Assets BV
Current assignee: DSM IP Assets BV
Priority date: 1997-07-31
Filing date: 1998-07-22
Publication date: 2009-05-01
Anticipated expiration: 2018-07-22
Also published as: DK0897667T3; DE69827712T2; EP0897667B1; US20020102327A1; AU7857598A; ES2234067T3; ATE282963T1; EP0897667A2; AR013382A1; JPH11137265A; CA2239250C; US6656513B2; DE69827712T3; BR9802800A; EP0897667A3; AU744387B2; CA2239250A1; DE69827712D1; DK0897667T4; EP0897667B2

Abstract

LA PRESENTE INVENCION EXPONE UNA COMPOSICION PARA MEJORAR EL PAN, QUE CONTIENE CELOBIOHIDROLASA Y SU USO EN LA FABRICACION DEL PAN.

Description

Composición para mejorar el pan.

La presente invención se refiere a la utilización de una enzima en la fabricación de pan como actividad de mejora del pan.

Una actividad de mejora del pan es aquella que mejora cualquier propiedad del producto horneado (particularmente el volumen del pan y/o la estructura de la miga de pan), y/o mejora cualquier propiedad de la masa. A lo largo de esta especificación el término "volumen de pan" debe interpretarse como volumen del producto horneado cuando corresponda.

Además de los ingredientes básicos, generalmente harina, agua, levadura y sal, a la masa se añade una composición de mejora del pan.

Una de las características más importantes del pan es su volumen, en el que influyen las enzimas. Para obtener un gran volumen en el pan se pueden añadir composiciones que contengan hemicelulasa y/o enzimas amilolíticas. Las hemicelulasas se definen como aquellas enzimas capaces de hidrolizar los polisacáridos sin almidón en la harina. Las composiciones comercialmente disponibles proceden en su mayoría de hongos, tales como Aspergillus o Trichoderma. Estas composiciones son mezclas impuras de distintas actividades enzimáticas. Hasta ahora se han identificado endo-xilanasas y arabinofuranosidasas que contribuyen a la actividad de las composiciones de mejora del pan.

La utilización de las preparaciones de hemicelulasa en la fabricación del pan proporciona al producto horneado acabado un mayor crecimiento en el horno, mejoran el volumen del pan y proporcionan una mejor textura de grano. Sin embargo, cuando se utilizan preparaciones de hemicelulasa a concentraciones más altas, la masa puede volverse floja y pegajosa. Esto limita la utilización de las preparaciones de hemicelulasa. Aunque el problema pueda superarse mediante la adición de glucosaoxidasa, la necesidad de añadir una enzima adicional es un inconveniente. Mejor sería disponer de una enzima con actividad de mejora del pan que no tuviera ningún efecto secundario negativo sobre la masa. Esto plantea la posibilidad de que los emulsionantes puedan ser sustituidos completamente por enzimas. La resistencia de los consumidores a los aditivos químicos está creciendo y por ello existe la necesidad constante de reemplazar los emulsionantes por aditivos aceptados por los consumidores tales como las enzimas.

La presente invención, tal como se describe en las reivindicaciones adjuntas, proporciona la utilización de una CeloBioHidrolasa-I (CBH-I) con actividad de mejora del pan para su fabricación. Los efectos más importantes son un volumen mejorado del pan y una estructura mejorada de la miga que no vienen acompañados de incómodas propiedades referidas a la manipulación de la masa porque ésta se vuelva pegajosa. Preferentemente, la CBH-I es de origen microbiano, con más preferencia se utiliza CBH-I de hongos. Por ejemplo la CBH-I puede obtenerse a partir de Trichoderma o Aspergillus. La CBH-I puede obtenerse de T. reesei, T. longibrachiatum y T. viride. Las Celobiohidrolasas I procedentes de Trichoderma reesei han sido descritas en EP-B 0 137 280 y US 4.894.338, respectivamente. La CBH-I ha sido identificada también en Agaricus bisporus, Phanerochaete chrysosporium, Trichoderma viride y Humicola grisea. La presente invención también describe una composición con actividad de mejora del pan, que comprende CBH-I en una cantidad efectiva cuando se añade a otros ingredientes básicos de la masa. La composición puede comprender también cantidades efectivas de \alpha-amilasa y/o endo-xilanasa.

Por "cantidad efectiva" se entiende una cantidad de enzima que es suficiente para proporcionar un efecto mensurable sobre el efecto pretendido, en el caso de CBH-I se trataría de un efecto mensurable del volumen mejorado del pan o de la estructura mejorada de la miga.

El hecho de que la CBH-I tenga un efecto en la cocción es sorprendente porque la CBH-I actúa sobre la celulosa que constituye solamente el 0,3% de la harina de trigo. La CBH-I hidroliza los enlaces 1,4-\beta-D-glicosídicos en la celulosa provocando la liberación de celobiosa. Una explicación posible sería que la CBH-I actúa sobre las interfases celulosa-xilano en las paredes celulares del endosperma.

Como ya se ha mencionado anteriormente, la utilización de preparaciones comerciales de endo-xilanasas de Trichoderma y Aspergillus es conocida. Aunque se encuentren trazas de CBH-I en estas preparaciones, la cantidad de CBH-I es insuficiente para contribuir a la mejora de la masa o del pan. De acuerdo con la presente invención, la CBH-I puede utilizarse sola o en combinación con otras enzimas con actividad de mejora del pan, preferentemente endo-xilanasa. La endo-xilanasa puede obtenerse a partir de Aspergillus o Trichoderma. Generalmente, la utilización de la composición de la invención producirá una masa con buenas propiedades de manipulación, mientras que el producto horneado final tendrá un volumen y una estructura de miga mejorados.

Con la utilización de la CBH-I es posible una optimización controlada de los productos de mejora del pan, o de las composiciones de mejora del pan.

Se entenderá que una especialista es capaz de encontrar las cantidades óptimas que puedan añadirse a la masa de pan.

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Una composición de la invención puede utilizarse en combinación con los constituyentes normales de mejora del pan y enzimas, por ejemplo xilanasas, \alpha-amilasa, endo-xilanasa, arabinofuranosidasa, \beta-amilasa, glucosaoxidasa, proteasa o lipasa. La CBH-I por tanto puede incorporarse en una composición de mejora del pan. Por "composición de mejora del pan" se entiende una composición que comprende sustancias distintas de las que se utilizan convencionalmente en la cocción (es decir, harina, agua, levadura, opcionalmente sal), y que pueden emplearse para mejorar las propiedades de la masa y/o del producto horneado.

La CBH-I puede incorporarse igualmente en una premezcla. Por "premezcla" debe entenderse una mezcla de agentes de cocción, incluyendo generalmente harina, que se prepara para facilitar la manipulación en los procesos de preparación de la masa. Normalmente, una premezcla no contendrá el agua necesaria para preparar la masa.

La masa de pan de la invención contiene al menos 0,5 mg de CBH-I por kilogramo de harina, preferentemente 1 mg/kg de harina, con más preferencia más de 5 mg de CBH-I por kilogramo de harina, incluso con más preferencia más de 10 mg de CBH-I por kilogramo de harina. En general, la cantidad de CBH-I es inferior a 100 mg de CBH-I por kilogramo de harina, preferentemente es inferior a 50 mg de CBH-I por kilogramo de harina.

Leyenda de las figuras

Figura 1: Sec. Id. Nº 5

Figura 2: Sec. Id. Nº 8

Figura 3: El volumen de pan en función de la cantidad de CBH-I.

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Ejemplo 1

Se obtuvo CBH-I a partir de una cepa Trichoderma. La cepa se cultivó en un medio que contenía celulosa para producir enzimas de degradación de celulosa. Después de la fermentación se filtró el caldo, se filtró en estéril, se sometió a ultrafiltración y se secó por aspersión. 0,5 kg del producto de este proceso se suspendieron en 2 l de NaAc 50 mM a pH 5 y se centrifugó la mezcla durante 15 minutos a 4.000 rpm. El sobrenadante claro se ultrafiltró hasta llegar a una conductividad inferior a 2 mS.

Se cargaron aproximadamente 3 gramos de proteína en una columna A DEAE (Biogel A) equilibrada en NaAc 50 mM pH 5. Las fracciones enriquecidas de CBH-I se eluyeron según un gradiente lineal del 0% al 100% de B en A, en el cual A es un tampón que contiene NaAc 50 mM pH 5 y B es NaCl 1 M en el Tampón A, el pH se ajusta a 5.

Las fracciones enriquecidas de CBH-I se ultrafiltraron hasta que la conductividad fuese inferior a la conductividad de NaAc 10 mM pH 3,6. La muestra de CBH-I se cargó entonces en una columna Mono S que estaba equilibrada en NaAc 10 mM pH 3,6. La CBH-I-I se eluyó según un gradiente lineal del 0% al 10% de B en A, seguido por un gradiente del 10% al 100% de B en A, donde A es NaAc 10 mM pH 3,6 y B es NaCl 1 M en A. La concentración de proteína en cada fracción eluída se determinó mediante la utilización de un análisis cuantitativo de aminoácidos. El producto purificado contenía 7 mg de proteína/ml y era puro según se estimó por electrofóresis en gel SDS.

Ejemplo 2

Se ensayó la CBH-I (ver el Ejemplo 1) en un ensayo de cocción a gran escala utilizando la receta siguiente:

\text{*}: 2.000 g de harina Kolibri - (Meneba) y 500 g de Ibis (Meneba);

\text{*}: 1.305 g de agua;

\text{*}: 50 g de levadura en bloque, Konings gist®;

\text{*}: 50 g de sal;

\text{*}: 12,5 g de azúcar;

\text{*}: 25 ppm de ácido ascórbico;

\text{*}: 20 ppm de Fermizime® - (TM) P200 (\alpha-amilasa de hongo, disponible de Gist-Brocades);

\text{*}: opcionalmente Fermizyme® HS 2000 y/o CBH-I (Trichoderma), ver Tabla 1.

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Se mezclaron conjuntamente los ingredientes y se utilizaron para formar tres masas de 900 gramos. Se fermentaron estas masas. La primera fermentación durante 30 minutos y la segunda durante 40 minutos a 30ºC. Después de darle forma a la masa, se realizó una fermentación final durante 70 minutos a 35ºC. Se horneó entonces el pan durante 30 minutos a 250ºC. Posteriormente se dejaron enfriar las barras de pan y se determinó el volumen del pan mediante el método de desplazamiento de semillas de colza. Se determinaron también otras propiedades.

Los resultados obtenidos figuran en la Tabla 1.

Cada ensayo de cocción se realizó por triplicado. Estas pruebas triplicadas se llevaron a cabo en paralelo. La evaluación de las barras de pan se da en valor promedio de los resultados obtenidos de 3 barras. Las características de la masa y de la estructura de la miga fueron estimadas por panaderos cualificados.

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TABLA 1

1

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Fermizyme® HS2000 es una preparación de endo-xilanasa de A. niger de la firma Gist-Brocades. Como puede verse a partir de los resultados en la Tabla 1, la CBH-I mejora las propiedades de manipulación de la masa así como la estructura de la miga de pan, tanto cuando se utiliza sola como en combinación con Fermizyme® HS2000.

Ejemplo 3

Se clonó un gen que codificaba una CBH procedente de A. niger y se preparó una muestra de CBH mediante la expresión de la enzima clonada tal como se describe en el Ejemplo 5.

Se realizó un ensayo de cocción utilizando el mismo protocolo descrito en el Ejemplo 2. Se añadieron 2,5 mg de la CBH de A. niger expresada por kilogramo de harina. Esto resultó en un incremento de volumen de la barra de pan del 10%, en unas propiedades mejoradas de manipulación de la masa y en una estructura mejorada de la miga en comparación con la referencia donde no se añadía CBH.

Ejemplo 4

Se realizó un ensayo de cocción tal como se describe en el Ejemplo 2, excepto que la harina empleada era harina Kluut (Meneba) y que se utilizó un mezclador de distinto tipo. Se añadió CBH-I (ver Ejemplo 1) procedente de Trichoderma además de una preparación de Trichoderma (hemicelulasa) comercial. La preparación de hemicelulasa se ensayó a 15 ppm (la cantidad recomendada era de 3 a 20 ppm). Tal como se muestra en la Figura 3, puede obtenerse un incremento significativo en volumen además del ocasionado por la preparación de hemicelulasa. El volumen de la referencia, donde no se añadía ni hemicelulasa ni CBH-I, era de 2.554 ml.

Ejemplo 5

Cepas:

: E. coli LE 392 (Murray, 1977):

: e14^{-} (mcrA) hsdR514, supE44, supF58, lacY1, ó \Delta(lac1ZY)6, galK2, galT22, metB1, trpR55

Ejemplo 5.1

Identificación de una celobiohidrolasa de A. niger

Se cultivó A. niger N402 en un medio mínimo (MM) de Aspergillus (contiene por litro: 6,0 g de NaNO_{3}, 1,5 g de KH_{2}PO_{4}, 0,5 g de MgSO_{4}\cdot7H_{2}O, 0,5 g de KCl, pH 6,0 y 1 ml de una solución Vishniac (Vishniac and Santer, 1957, contiene por litro: 10 g de EDTA, 4,4 g de ZnSO_{4}\cdot7H_{2}O, 1,0 g de MnCl_{2}\cdot4H_{2}O, 0,32 g de CoCl_{2}\cdot6H_{2}O, 0,32 g de CuSO_{4}\cdot5H_{2}O, 0,22 g (NH_{4})_{6}Mo_{7}O_{24}\cdot4H_{2}O, 1,47 g de CaCl_{2}\cdot2H_{2}O, 1,0 g de FeSO_{4}\cdot7H_{2}O, pH 4,0) y se completó con un 1,5% de arabinoxilano de trigo. Este medio se inoculó con 1x10^{6} esporas por ml y se cultivó el micelio durante 96 horas a 30ºC y 250 rpm en un batidor orbital New Brunswick. Se recogió el filtrado del cultivo después de filtrar el micelio en un Myracloth (gasa de nylon) utilizando un embudo Büchner y aspiración suave. Se ajustó el pH del filtrado del cultivo a pH 6,0 con NaOH 0,1M, después de lo cual el filtrado del cultivo se diluyó mediante adición de 2 volúmenes de agua Millipore.

DEAE-Sephadex A-50 fue equilibrado en un tampón de acetato sódico 50 mM a pH 5,0 y se añadió al filtrado del cultivo. A los 30-60 minutos de agitación a 4ºC, se pasaron el DEAE-Sephadex junto con el filtrado del cultivo por un embudo con un soporte de filtro de vidrio y se transfirió el DEAE-Sephadex A-50 a una columna. Esta columna primero se eluyó con un tampón de acetato sódico 50 mM a pH 5,0, luego con un tampón de acetato sódico 50 mM a pH 5,0 + NaCl 0,5 M. Las fracciones que contenían la actividad \alpha-arabinofuranosidasa, detectada utilizando el sustrato cromogénico 4-metilumbeliferil-\alpha-L-arabinofuranósido (detecta las \alpha-arabinofuranosidasas) (Sigma M-9519), se juntaron y desalaron mediante diálisis contra agua Millipore y posteriormente se dializaron contra un tampón piperazina-HCl 20 mM a pH 5,0. Después de la diálisis, la muestra se cargó en una columna de Flujo Rápido DEAE-Sefarosa, esta columna primero se eluyó con 3 volúmenes de un tampón de piperazina-HCl 20 mM a pH 5,0 y luego con un gradiente lineal de NaCl 0,5 M en tampón piperazina-HCl 20 mM a pH 5,0. La detección de la proteína eluída se realizó por medición continua de la absorción UV a 280 nm. Se recogieron las fracciones de 10 ml sobre para-nitrofenil-\alpha-L-arabinofuranósido (PNP-A) (Sigma N-3641), que fueron analizadas en cuanto a su actividad \alpha-arabinofuranosidasa. Se encontró actividad \alpha-arabinofuranosidasa en las fracciones 11-27, 41-47 y 52-61. Se juntaron las fracciones 41-47 y posteriormente se dializaron contra un tampón de piperazina-HCl 100 mM a pH 5,0 y se cargó la muestra completa (200 ml) en una columna DEAE Sefarosa FF (Pharmacia) para concentrar la proteína a un único valor máximo mediante un gradiente NaCl 1 M en tampón piperazina-HCl 200 mM a pH 5,0. Las fracciones que contenían la proteína se juntaron (20 ml) y primero se dializaron contra agua Millipore, después contra piperazina-HCl 20 mM a pH 5,0 y finalmente se concentraron en un concentrador Speed Vac a 6 ml. Esta preparación se cargó en una columna Sephacryl S-300, la cual se eluyó con piperazina-HCl 20 mM a pH 5,0, NaCl 0,1 M. Las fracciones que tenían actividad sobre PNP-A se juntaron, se dializaron contra piperazina-HCl 10 mM a pH 5,0 y se concentraron en un concentrador Speed Vac a 2 ml. Esta muestra se cargó entonces en una columna (columna Hiload 16/60) Superdex 75 (Pharmacia) que se equilibró y eluyó con piperazina-HCl 20 mM a pH 5,0, NaCl 0,1M. Las fracciones que tenían actividad de \alpha-arabinofuranosidasa se dializaron contra un tampón de acetato sódico 10 mM a pH 3,5. La purificación final se realizó en una columna de intercambio catiónico Mono S (HR 5/5, Pharmacia). La columna se equilibró con un tampón de acetato sódico 10 mM a pH 3,5 en la cual se cargó la muestra. La proteína se eluyó utilizando 27 ml de un gradiente lineal de
NaCl 1 M en tampón acetato sódico 10 mM a pH 3,5. La enzima se eluyó en aproximadamente 100 mM de NaCl.

La enzima purificada se envió a EUROSEQUENCE (Groningen, Holanda). Allí se aplicó a un gel de SDS-PAGE y se realizó esencialmente un análisis de secuencia interna de la proteína tal como el descrito en Rosenfeld y col. (Rosenfeld, J., Cadevielle, J., Guillemot, J., Ferrara, P. (1992) Anal. Biochem. 203: 173-179).

Se estudiaron las secuencias de aminoácidos utilizando un secuenciador automatizado (Modelo 477A, Applied Biosystems) acoplado a HPLC (Modelo 120A ABI) para el análisis de los aminoácidos feniltiodantoina (PTH). Se determinaron las secuencias internas siguientes:

Leu-Tyr-Leu-Met-Ser-Asp-Asp-Ser-Asn-Tyr-Glu-Leu-Phe-Lys

(SEC. ID. NO. 1)

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Leu-Gly-Asn-Thr-Asp-Phe-Tyr-Gly-Pro-Gly-Leu-Thr-Val-Asp-Thr-Asn- Ser-Pro-Phe-Thr-Val-Val-Thr-Gln

(SEC. ID. NO. 2)

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De forma sorprendente, la secuencia parcial de aminoácidos del fragmento interno de la enzima aislada (SEC. ID. NO. 1) mostró una alta identidad con el CBH-I de Agaricus bisporus, es decir que 11 de 13 residuos eran idénticos. Esto fue la primera indicación de celobiohidrolasas en Aspergillus.

Ejemplo 5.2 Aislamiento de la codificación de los clones de ADNc para la celobiohidrolasa de A. niger

Ejemplo 5.2.1

Generación de una sonda

La enzima CBH-I de A. bisporus es codificada por el gen cel2 (EMBL Acc. No. Z50094). Los dos oligonucleótidos siguientes fueron destinados al PCR, región de codificación del cel2:

5'-GTC GGT ACC AAC ATG GCC G-3'	(19-mer) (SEC. ID. NO. 3)

5'-ACT CAG AAA CAT TGG CTA TAG-3'	(21-mer) (SEC. ID. NO. 4)

Estos oligonucleótidos, tal como están descritos en las SEC. ID. NOs. 3 y 4, fueron utilizados en PCR (Saiki y col., 1988) utilizando ADN de plásmido que contenía secuencias cel2 de Agaricus bisporus como molde.

Para un PCR se combinaron 2 ng de plásmido de ADN con 5 \mul 10 x tampón reactivo (200 mM Tris-HCl, pH 8,4; 500 mM KCl); 3 \mul de MgCl_{2} 50 mM; 4,0 \mul 1,25 mM de cada uno de los cuatro trifosfatos desoxinucleótidos y 50 pmol de oligonucleótidos en un volumen final de 50 \mul. Se mezcló la mezcla de reacción y se añadieron 0,5 \mul de TAQ-polimerasa (5 U/\mul) (Life Technologies). El ADN fue desnaturalizado térmicamente mediante incubación durante 5 minutos a 95ºC seguido por 25 ciclos de 1 minuto a 95ºC, 1 minuto a 52ºC y 1 minuto a 72ºC. Después de estos 25 ciclos la mezcla fue incubada durante 5 minutos a 72ºC. El análisis de los productos de reacción reveló un producto discreto de 1,5 kb, que era el tamaño esperado.

Ejemplo 5.2.2

^{32}P-marcado del fragmento PCR de 1,5 kb

El fragmento de 1,5 kb obtenido por PCR se aisló y marcó tal como se describe en EP-A-0 463 706, Ejemplos 2.2 y 7.1.

Ejemplo 5.2.3

Cribado de la biblioteca de ADNc N400 de A. niger para obtener clones de ADNc de celobiohidrolasa

La construcción de la biblioteca de ADNc de A. niger viene descrita en WO 96/06935 (Ejemplo 3).

Para cribar la biblioteca de ADNc N400 de A. niger con el fin de obtener los clones de ADNc CBH, 5x10^{3} pfu por placa fueron colocados en placas topagarosa NZYCM, que contenían un 0,7% de agarosa en placas NZYCM (1,5% agar) de 85 mm de diámetro como las descritas en Maniatis y col., 1982, pp. 64, utilizando E. coli LE392 como bacteria de placa.

Después de incubar las placas durante toda la noche a 37ºC se realizaron dos réplicas de cada una en filtros HybondN (Amersham) tal como se describe en Maniatis y col. (1982, pp. 320-321).

Los filtros se prehibridaron a 65ºC durante dos horas en un tampón de hibridación que contenía 6 x SSC, 0,5% SDS, 5 x solución Denhardt, 0,01 M EDTA y 100 \mug/ml de ADN de esperma de arenque desnaturalizado térmicamente (Boerhinger Mannheim). Después de dos horas de prehibridación, el tampón de prehibridación fue sustituido por un tampón de hibridación que era idéntico al de prehibridación, pero que contenía el fragmento marcado ^{32}P PCR de 1,5 kb con las secuencias cel2 de Agaricus bisporus y se preparó tal como se describe en el Ejemplo 5.2.2. Los filtros fueron hibridizados durante 18 horas a una temperatura de 60ºC.

Después de la hibridación, los filtros se lavaron primero a 60ºC durante 30 minutos en 4 x SSC/0,5% SDS, seguido por dos etapas de lavado a 60ºC durante 30 minutos en 2 x SSC/0,5% SDS. Los filtros secados al aire se extrajeron en una hoja de papel Whatman 3 MM, se marcaron con tinta radioactiva y se cubrieron el papel Whatman y los filtros con Saran Wrap. Las placas de hibridación se identificaron por exposición a película de rayos-X Kodak XAR durante 72 horas a -70ºC utilizando una pantalla de intensificación.

Se encontraron aproximadamente cincuenta pocillos de hibridación positiva por cada placa, que aparecieron en duplicado. Se seleccionaron doce pocillos positivos de la placa con una pipeta Pasteur y se eluyeron los fagos del obturador de agar en 1 ml de tampón SM que contenía 20 \mul de cloroformo, tal como se describe en Maniatis y col. (1982, p. 64). Los fagos obtenidos fueron purificados por repetición del procedimiento descrito anteriormente mediante la utilización de réplicas filtradas procedentes de las placas que contenían 50-100 pocillos de fagos aislados.

Después de la purificación los fagos se colocaron en placas de 5x10^{3} fagos en un medio NZYCM. Después de incubación durante toda la noche a 37ºC se obtuvieron unas placas confluyentes, a partir de las cuales se eluyeron los fagos mediante la adición de 5 ml de tampón SM y se almacenaron las placas durante 2 horas a 4ºC con agitación intermitente. Después de recoger el sobrenadante con una pipeta, se eliminaron las bacterias de la solución mediante centrifugación a 4.000g durante 10 minutos a 4ºC. Se añadió al sobrenadante cloroformo al 0,3% y se determinó el número de pfu. Estos almacenamientos de fagos contienen aproximadamente 10^{7} pfu/ml.

Ejemplo 5.2.4

Análisis de restricción de los clones CBH-I de ADNc

Clones recombinantes Uni-ZAP XR que contenían CBH-I ADNc se convirtieron en fagómidos Bluescript por superinfección con el fago filamentoso auxiliar ExAssist^{TM}, que está incluido en el kit de síntesis ZAP^{TM}-ADNc de Stratagene, siguiendo las instrucciones del fabricante.

El ADN del fagómido fue posteriormente aislado tal como se describe en Sambrook y col. (1989, pp. 1.25-1.28).

Se sometió a análisis de restricción el ADN aislado de ocho clones de CBH ADNc utilizando las enzimas de restricción siguientes: EcoRI y XhoI. El ADN fue digerido durante 2 horas a 37ºC en una mezcla de reacción compuesta por las soluciones siguientes: 2 \mul (»1 \mug) de solución de ADN; 2 \mul del tampón adecuado 10xReact (Life Technologies); 10 U de cada enzima de restricción (Life Technologies) y agua destilada estéril hasta conseguir un volumen final de 20 \mul. Después de la adición de 4 \mul de un tampón de carga de ADN, se cargaron las muestras en un 0,7% de gel TAE-agarosa. Los fragmentos de ADN se separaron por electroforesis a 80 V durante 1,5 horas. El análisis de restricción de los clones de ADNc aislados revelaron dos tipos de plásmido; uno que contenía injertos de 1,2 kb, los demás injertos de 1,8 kb.

Ejemplo 5.2.5

Análisis de la secuencia del clon CBH-I ADNc de A. niger, CBHA-C9

La secuencia de los clones CBH ADNc de A. niger se determinó mediante subclonación de los fragmentos procedentes de uno de los clones positivos del Ejemplo 5.2.4 con un injerto de 1,8 kb, llamado CBHA-C9, en pBluescript SK (SEC. ID. Nº. 5). Las reacciones de secuenciación se realizaron por medio del kit secuenciador de marcado fluorescente de ciclo principal ThermoSequenase (Amersham) con cebadores universales de secuenciación. Las reacciones de secuenciación se analizaron en un secuenciador ALFexpress (Pharmacia). El análisis de la secuencia se realizó mediante el programa Winstar (LaserGene) y produjo la secuencia tal como se muestra en la Figura 1/SEC. ID. NO. 5. La secuencia de aminoácidos de la región codificante, correspondiente a los nucleótidos 49 a 1404, se muestra en la Figura 2/SEC. ID. NO. 8. La región codificante que codifica la enzima nativa (aminoácido 18 a 452) más su presecuencia (aminoácido 1 a 17). La proteína no contiene ningún péptido enlazante, ni tampoco ningún campo ligante de celulosa.

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Ejemplo 5.2.6

Cribado de la biblioteca genómica de A. niger para el gen CBHA

Para cribar la biblioteca genómica de A. niger construida tal como se describe en Harmsen y col. (1990), para obtener el gen CBHA, se colocaron 3 x 10^{3} pfu por placa en placas en top-agarosa NZYCM que contenía un 0,7% de agarosa sobre cinco placas de NZYCM (1,5% agar) de 85 mm de diámetro tal como se describe en Maniatis y col., 1982, pp. 64, utilizando E. coli LE392 como bacteria de placa.

Después de incubar durante toda la noche las placas a 37ºC se realizaron dos réplicas de cada una en filtros HybondN (Amersham) tal como viene descrito en Maniatis y col. (1982, pp. 320-321).

Los filtros fueron prehibridizados a 68ºC durante dos horas en un tampón de prehibridación que contenía: 6xSSC, 0,5% de SDS, una solución 5xDenhardt, EDTA 0,01 M y 100 \mug/ml de ADN de esperma de arenque desnaturalizado térmicamente (Boerhinger Mannheim). Después de dos horas de prehibridación, el tampón de prehibridación fue sustituido por un tampón de hibridación que era idéntico al tampón de prehibridación, pero que contenía el injerto marcado con ^{32}P de 1,8 kb procedente del clon CBH-IA-C9 de ADNc y se preparó tal como se describe en el Ejemplo 5.2.2. Los filtros fueron hibridizados durante 18 horas a una temperatura de 68ºC.

Después de la hibridación, los filtros se lavaron primero a 68ºC durante 30 minutos en 4xSSC/0,1% de SDS, seguido por un segundo lavado a 68ºC durante 30 minutos en 2xSSC/0,1% de SDS. Los filtros se lavaron entonces dos veces a 68ºC durante 30 minutos con 0,1xSSC/0,1% de SDS. Los filtros secados al aire se extrajeron en un papel Whatman 3 MM, se hicieron marcas de manipulación con tinta radioactiva y se cubrieron el papel Whatman y los filtros con Saran Wrap. Las placas de hibridación se identificaron mediante exposición a película de rayos-X Kodak XAR durante 72 horas a -70ºC utilizando una pantalla de intensificación.

Se encontraron de dos a tres pocillos de hibridación positiva por cada placa, que aparecieron en duplicado. Cinco de ellos fueron recogidos de la placa utilizando una pipeta Pasteur y se eluyeron los fagos del obturador de agar en 1 ml de tampón SM que contenía 20 \mul de cloroformo, tal como se describe en Maniatis y col. (1982, pp. 64). Los fagos obtenidos fueron purificados por repetición del procedimiento descrito anteriormente utilizando réplicas de filtro procedentes de las placas que contenían 50-100 pocillos de los fagos aislados.

Ejemplo 5.3 Expresión del ADNc de CBH-IA en A. niger

Ejemplo 5.3.1

Construcción de un cassette de expresión de CBH-IA

El clon CBHA-C9 de ADNc del Ejemplo 5.2.5 se utilizó para construir un plásmido de expresión. Todas las digestiones se realizaron mediante 1-3 \mug de ADN, 2 \mul del tampón adecuado 10xReact (Life Technologies), 10 U de enzima Restriction (Life Technologies) y agua destilada estéril hasta obtener un volumen final de 20 \mul. Las digestiones se incubaron a 37ºC durante 1-2 horas. Las muestras digeridas se cargaron en un gel de agarosa al 0,7% en un tampón TAE y los fragmentos de ADN fueron separados posteriormente mediante electroforesis a 80 V. Después de la electroforesis se cortó la banda correspondiente y el fragmento de ADN se aisló utilizando el kit GeneClean^{TM} (Biogel 101 Inc.) de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes. Las ligaciones se realizaron en un tampón 10xligante (Promega), 50-100 ng del vector de ADN, un exceso molar del triple de ADN de injerto, 1 U de T4-Ligasa que resultaron en un volumen final de 10 \mul. Después de incubación durante toda la noche a 15ºC, 4 \mul de la mezcla se utilizaron para transformar las células competentes DH5\alpha de E. coli preparadas como sigue: 200 \mul de un cultivo precultivado durante toda una noche de DH5\alpha de E. coli en un medio LB (medio LB por cada 1.000 ml: 10 g de peptona tripticasa (Life Technologies), 5 g de extracto de levadura (Life Technoligies), 10 g de NaCl, 0,5 mM Tris-HCl a pH 7,5. Este cultivo se incubó en un agitador orbital a 37ºC hasta que su densidad correspondiera a un O.D. 600 de 0,15-0,2. Se recogieron entonces las bacterias mediante centrifugación a 3.000 rpm a 4ºC. Después de desechar el sobrenadante, las células se mantuvieron constantemente en hielo. El aglomerado bacteriano se lavó en 40 ml de tampón de transferencia K-MES (por cada 100 ml: 6 ml de CaCl_{2} 1M, 0,5 ml de MgCl_{2} 1M, 4 ml de K-MES 0,5M a pH 6,0, 0,5 ml de MnCl_{2} 1M) mediante resuspensión de estas células seguida por centrifugación tal como se ha descrito anteriormente. Finalmente, las células fueron sometidas a resuspensión en 10 ml de K-MES/glicerol (= tampón de transferencia K-MES + 15% de glicerol). Partes alícuotas (50 \mul) se utilizaron bien sea en el momento para la transformación o bien se congelaron a -70ºC.

Las células competentes DH5\alpha de E. coli se utilizaron en los experimentos de transformación por combinación de 50 \mul de la suspensión de células con 4,5 \mul de la mezcla de ligación. Después de un período de incubación de 30 minutos en hielo, se incubaron las células durante 2 minutos a 42ºC. Luego se añadió 1 ml de medio LB y se incubaron las células a 37ºC durante 1 hora. Posteriormente se recogieron las bacterias por centrifugación a 14.000 g durante 20 segundos, después de desechar el sobrenadante las células se resuspendieron en 100 \mul de medio LB. La suspensión bacteriana resultante se colocó en placas en medio LB que contenía 100 \mug/ml de ampicilina y 50 \mug/ml de X-gal y 60 \mug/ml de IPTG en el caso de cribado azul/blanco.

Una selección de 2-12 de las colonias resultantes se cultivó durante una noche en un medio LB que contenía 100 \mug/ml de ampicilina. De los cultivos se aisló el ADN de plásmido mediante el método de lisis alcalina descrito en Maniatis y col. (1982, pp. 368-369), que se utilizó en el análisis de restricción tal como se describe en el Ejemplo 5.2.4 para seleccionar un clon con el plásmido deseado.

Los métodos anteriormente descritos se utilizaron para construir el plásmido de expresión CBHA designado por pIM3006. El plásmido promH, que contenía el promotor pkiA de A. niger, fue digerido con SstI y NsiI y se ligó dentro del pCBHA-C9 digerido por SstI-NsiI. Después de linealización del plásmido resultante, que contenía la fusión de pkiA-CBHA, utilizando SstI, este constructo fue parcialmente digerido utilizando BglII. El fragmento SstI-BglII de 2,4 kb se ligó dentro de un plásmido digerido por BamHI-SstI que llevaba un fragmento BamHI-HindIII y que contenía el terminador del gen trpC de Aspergillus nidulans. El lugar de restricción de BglII caía aproximadamente a 150 pb "aguas abajo" del codón de parada putativo. El constructo resultante se designó como pIM3006.

Se aisló el ADN de plásmido a gran escala a partir de los cultivos de 100 ml de DH5\alpha de E. coli que contenían el plásmido de expresión final pIM3006 cultivado en un medio LB con 100 \mug/ml de ampicilina utilizando el kit PC-100 Nucleobond (Nagel) siguiendo las instrucciones de los fabricantes.

Ejemplo 5.3.2

Introducción del constructo de expresión CBH-IA en 752.1 de A. niger mediante cotransformación y cribado de los transformantes para la expresión del gen CBHA de A. niger

El plásmido pIM3006, obtenido en el Ejemplo 3.1, fue introducido en A. niger por cotransformación del 752.1 de A. niger utilizando pyrA de A. niger como marcador selectivo sobre el plásmido pGW635 (Goosen y col., 1989) y el plásmido pIM3006 como plásmido cotransformante.

Se prepararon protoplastos a partir de micelio mediante cultivo de 752.1 de A. niger sobre un medio mínimo completado por un 0,5% de extracto de levadura, un 0,2% de casaminoácidos, glucosa 50 mM, leucina 1,5 mM y uridina 10 mM durante 18 horas a 30ºC. La preparación de protoplastos de 752.1 de A. niger y el procedimiento de transformación se realizaron tal como se describe en Goosen y col., 1987. Los transformantes PYR^{+} resultantes se analizaron en cuanto a la expresión del gen CBHA de A. niger mediante SDS-PAGE.

Se analizaron los transformantes en cuanto a la formación del producto genético CBHA de A. niger, la proteína CBH-IA. Se utilizaron doce de estos transformantes en un experimento de cultivo para analizar la expresión de CBHA. Los transformantes se cultivaron en 50 ml de medio mínimo (medio por litro: 15 g de KH_{2}PO_{4}, 0,5 g de KCl, 0,5 g de MgSO_{4}\cdot7H_{2}O, 6 g de NaNO_{3}, 1 ml de solución Vishniac (Vishniac and Santer, 1957), a pH 6,0) que contenía un 4% de D-fructosa, un 0,1% de extracto de levadura y leucina 1,5 mM durante 30 horas a 30ºC. Después del cultivo, se eliminó el micelio por filtración y se analizó el filtrado del cultivo por medio de SDS-PAGE. El transformante 752.1::pIM3006-55 fue el mejor productor de CBH-IA (aprox. 20 \mug ml^{-1}).

Ejemplo 5.3.3

Purificación de la enzima de CBH-IA

Un matraz Erlenmeyer de 1 litro que contenía 300 ml de medio (medio por litro: 4 g de NH_{4}Cl, 1,5 g de KH_{2}PO_{4}, 0,5 g de KCl, 0,5 g de MgSO_{4}\cdot7H_{2}O, 1 ml de una solución de sal Vishniac (contiene por litro 10 g de EDTA, 4,4 g de ZnSO_{4}\cdot7H_{2}O, 1,0 g de MnCl_{2}\cdot4H_{2}O, 0,32 g de CoCl_{2}\cdot6H_{2}O, 0,32 g de CuSO_{4}\cdot5H_{2}O, 0,22 g (NH_{4})_{6}Mo_{7}O_{24}\cdot4H_{2}O, 1,47 g de CaCl_{2}\cdot2H_{2}O, 1,0 g de FeSO_{4}\cdot7H_{2}O, pH de 4,0 (Vishniac and Santer, 1957), de pH 5,0 completado con un 0,2% de extracto ultrafiltrado de levadura (Life Technologies), un 0,5% de casaminoácidos (Life Technologies), leucina 10 mM y un 5% de sacarosa como fuente-C) fue inoculado con 2x10^{9} esporas de la cepa 752.1::pIM3006-55 y se cultivó durante 6 horas a 30ºC. La totalidad de este cultivo se añadió entonces a 1,7 litro de medio en un fermentador Applikon de 3 litros (BTS06) que estaba controlado por una unidad Bioprocesadora ADI 1020 (Applikon). La temperatura de fermentación estaba controlada a 30ºC y se dejó caer el pH hasta un pH de 3,0 al cual se mantuvo mediante adición de NaOH 5N. Se drenó desde el fermentador 1,9 litros de caldo de cultivo 30 horas después de la inoculación. Los micelios se separaron del caldo de cultivo por filtración. Se volvió a llenar el fermentador con 2 litros de medio de cultivo fresco y se cultivó durante otras 30 horas tal como se describe más arriba. Después de esta segunda operación, los micelios se separaron del caldo de cultivo por filtración. Los filtrados de cultivo procedentes de ambas operaciones se combinaron y se añadió piperazina a una concentración final de 10 mM. El pH se ajustó a un pH de 5,5 con NaOH 10N. Se colocó entonces el filtrado de cultivo en una columna de intercambio aniónica Streamline^{TM} (Pharmacia). Después de cargarla, la columna se lavó con piperazina-HCl (pip-HCl) 10 mM a pH 5,5. La enzima fue eluída de la columna aplicando un pulso salino utilizando pip-HCl 10 mM a pH 5,5/NaCl 1 M. Se recogieron fracciones de 15 ml y se detectó la actividad CBH mediante un sustrato cromogénico 4-metilumbeliferil-\beta-D-celobiósido (detecta las celobiohidrolasas) (Sigma M-6018). La mayoría de la actividad de CBH estaba presente en las fracciones 2, 3 y 4. Se juntaron estas fracciones y se dializaron contra pip-HCl 10 mM a pH 5,5.

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Referencias

Goosen, T., Engelenburg, F. van, Debets, F., Swart, K., Bos, K., Briek, H. van den, (1989) Mol. Gen. Genet. 219: 282-288.

Harmsen, J.A.M. y col., (1990). Curr. Genet. 18: 161-166.

Maniatis T., E. F. Fritsch, J. Sambrook (1982): Molecular cloning, a laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory, New York.

Murray, N. (1977) Mol. Gen. Genet. 150: 53-58.

Saiki R.K. y col., (1988) Science, 239, 487-491.

Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T. (1989) In: Molecular Cloning: a Labatory Manual, 2ª ed., Cold Spring Harbor Labatory Press, NY.

Visniac, W. and Santer, M. (1957), Bact. Rev. 21: 195-213.

Claims

1. Utilización de celobiohidrolasa-I (CBH-I) en una cantidad efectiva para mejorar:

(i): las propiedades de manipulación de una masa;

(ii): el volumen del pan; y/o

(iii): la estructura de la miga de pan.

2. Utilización según la reivindicación 1, caracterizada porque la CBH-I está incluida en una composición que comprende además otras enzimas con actividad de mejora del pan.

3. Utilización según la reivindicación 2, caracterizada porque la composición comprende además los constituyentes usuales de mejora del pan.

4. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque la CBH-I se encuentra en una forma sustancialmente exenta de otro material fúngico.

5. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque la CBH-I se expresa a partir de un gen clonado.

6. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque la CBH-I es una CBH-I de Aspergillus o Trichoderma.

7. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6, caracterizada porque la composición que comprende la CBH-I comprende además una \alpha-amilasa y/o endo-xilanasa en una cantidad efectiva.

8. Masa que comprende al menos 0,5 mg de CBH-I por kg de harina.

9. Proceso para producir una masa según la reivindicación 8, que comprende la mezcla de (i) harina, (ii) agua, (iii) levadura y (iv) CBH-I en una cantidad efectiva para formar una masa, o que complete una masa con CBH-I.

10. Proceso según la reivindicación 9 que comprende además la adición de endo-xilanasa y/o \alpha-amilasa.