KR100234888B1 - 크실라나제, 대응하는 재조합 dna 서열, 크실라나제 함유 조성물, 및 조성물의 용도 - Google Patents

크실라나제, 대응하는 재조합 dna 서열, 크실라나제 함유 조성물, 및 조성물의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명의 크실라나제는 몇가지 부분적인 아미노산 서열에 의해 특성화되고 후미콜라 인솔렌스(Humicola insolens), DSM 1800에서 얻은 정제된 크실라나제에 대해 생성된 항체와 면역반응을 한다. 이 크실라나제 제제는 실질적으로 셀룰라제가 없으며, 베이킹제, 첨가제 또는 사료로서 종이펄프의 처리에 아주 적합하다.

Description

크실라나제, 대응하는 재조합 DNA 서열, 크실라나제 함유 조성물, 및 조성물의 용도
제1도는 플라스미드 pYHD17의 유전자 지도를 나타내는 도면이고,
제2도는 벡터 pHD414의 유전자 지도를 나타내는 도면이다.
본 발명은 크실라나제, 대응하는 재조합 DNA 서열, 벡터, 형질전환된 숙주, 크실라나제의 제조방법, 크실라나제를 함유한 조성물, 및 조성물의 용도에 관한 것이다.
식물성 헤미셀룰로스의 주성분인 크실란은 β-1, 4-크실로시드 결합으로 연결된 D-크실로스의 중합체이다. 크실란은 산 또는 효소 가수분해에 의해 크실로스와 크실로- 올리고머로 분해될 수 있다. 크실란의 효소 가수분해는 산에 의해 형성되는 부산물(예컨대 푸란)이 없이 자유 당을 생성한다.
최근에 크실라나제에 대한 5개의 중요한 출원이 있었다; 1) 알코올 연료의 생산을 위한 농업 폐기물의 효소적 분해; 2) 동물 사료 또는 사료 성분의 효소적 변형 또는 헤미셀룰로스 분획의 생체내 분해를 위한 동물사료에의 부가; 3) 베이킹제(baking agent)로서의 용도; 4) 셀룰로스를 생산하는 용해 펄프의 가공; 및 5) 목재 펄프의 생- 표백(bio-bleaching). [Detroym R.W. In:Organic Chemicals from Biomass, (CRC Press, Boca Raton, FL, 1981)19-41.;Paice, M.G., 및 L.Jurasek, J. Wood Chem. Technol. 4:187-198.;Plmmier, J.C., J.L.Fuentes, G. Goma. Tappi Journal(1989):187-191. ; Senior, D.J., 등, Biotechnol. Letters 10(1988): 907-912.]
펄프 및 종이산업에서는 표백된 펄프의 휘도를 증가시키고, 표백단계에 사용되는 화합물의 양을 줄이고, 및 재생된 종이의 가공시에 펄프의 여수도를 증가시키기 위해 표백 공정에 크실라나제 조성물을 사용하고 있다 [Eriksson, K.E.L., Wood Science and Technology 24(1990); 79-101.;Paice, M.G., R. Bernier, 및 L.Jurasek, Biotechnol. and Bioeng. 32(1988);235-239.:Pommier J.C., J.L.Fuentes, 및 G.Goma, Tappi Journal(1989):187-191.]
펄프 및 종이 산업에 널리 이용되는 크라프트 펄핑(kraft pulping)은 리그sls 90-98%를 제거하는 펄프의 알칼리성 설페이트 쿠킹(cooking)을 포함한다.
잔존하는 2-10%의 리그닌은 펄프에 UV광에서 또는 산화에 의해 희미해지는 암갈색을 부여한다. 고품질의 종이용 백색 펄프를 얻기 위해, 갈색은 화합물, 예컨대 염소, 과산화염소, 오존, 산소 또는 과산화수소등을 이용하는 다단 표백 공정에 의해 제거된다.
최근에, 표백 공정에서 생성되는 화합물의 환경 영향에 대한 많은 관심이 있어왔다.
효소는 해로운 부산물없이 펄프에서 리그닌을 제거하는 것에 도움을 준다.
보고서는 목재의 리그닌이 크실란에 연결되어 있음을 보여준다[Eriksson, O., 등, Wood Sci. Technol. 14(1980);267.;Takashi, N., 및 T.Koshijiima, Wood Sci. Technol. 22(1988) ; 177-189]. 크실란의 한정된 가수분해에 의해 보다 많은 리그닌이 표백시에 방출된다.
그러므로 표백전의 펄프의 효소적 처리에 의해, 필요한 표백 화합물의 양이 감소한다.[Viikari, L., 등, Proceedings of the 3rd International Symposium on Biotechnology in the Pulp and Paper Industry(1986);67.]
기술 문헌에 의하면, 트리코더마(Trichoderma)로부터 얻은 균류 제제를 이용하여 좋은 결과가 얻어지는 바 [Paice, M.G., L.Jurasek, J.Wood Chem. Technol. 4(1989): 187-198;Senior, D.J., 등, Biotechnol. Letters. 10(1988):907-912], 목재 펄프의 pH를 6.0 이하로 조절하는 것이 요구된다.
트리코더마 크실라나제 제제, PulpzymeTMHA(노보 노르디스크 아크티에 셀스카브에서 상업적으로 구입 가능)는 pH5-7에서 크라프트 펄프의 탈목질화(delignification)에 사용될 수 있다. 50℃ 및 7 이상의 pH에서, 이 효소는 효과를 거의 나타내지 않는다.
또한 바실러스 푸밀루스(Bacillus pumilus) 크실라나제 제제, Pulpzyme HB(노보 노르디스크 아크티에 셀스카브에서 상업적으로 구입가능)는 pH 5-7에서 크라프트 펄프의 탈목질화에 사용될 수 있다. 50℃ 및 7 이상의 pH에서, 이 효소는 효과를 거의 나타내지 않는다.
후미콜라 인솔렌스(Humicola insolens) 크실라나제가 개시되어 있다 (Yoshioka, H 등, Agric. Biol. Chem. 43(3)(1981)579-586). 그것들은 미정제의 제제 상태에서 6.0의 최적 pH 및 60℃의 최적 온도를 지닌다. 논문에 있는 정보에 의하면, 효소는 정제되지 않았고 따라서, US 4,435,307에는 에이치. 인솔렌스가 양호한 셀룰라제 생산자로 공지되어 있는 바와같이, 현저한 셀룰라제 활성을 지닐 것이다. 게다가 효소는 셀룰라제, Mw, pI 또는 아미노산 조성에 대해 특성화되어 있지 않고 베이킹 또는 동물 사료에 있어서의 크라프트 펄프에 대한 시험도 행해져 있지 않다.
Agric. Biol. Chem. 에 기재된 후미콜라 인솔렌스 YH-8에서 얻은 종래의 크실라나제 제제 및 상기의 다른 종래의 크실라나제 제제는 일부 상대적으로 높은 셀룰라제 함량때문에 크라프트 펄프의 탈목질화에 사용하기에는 적합하지 않다.
그러므로, 본 발명의 목적은 극소량의 다른 효소 활성, 특히 셀룰라제 활성 및 다른 크실라나제 활성을 지니는 제제로 생산되어 베이킹 조성물 및 동물 사료의 첨가물로서 크라프트 펄프의 탈목질화에 사용하기에 적합한 크실라나제를 제공하는 것이다.
본 발명의 크실라나제는 하기의 부분적인 아미노산 서열 또는 하기 서열에 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%의 상동성을 갖는 부분적인 아미노산 서열을 지니는 것을 특징으로 한다.
놀랍게도, 효소 활성, 예컨대 크실라나제 이외에 셀룰라제를 아주 적은 농도로 포함하는 크실라나제 제제의 일부로 본 발명의 크실라나제를 제조하는 것이 가능하다는 것이 밝혀졌다. 특히 본 발명의 크실라나제는 후미콜라 인솔렌스, DSM 1800에서 본래 생산되는 몇가지 크실라나제중에서 선택된 특별한 크실라나제로서 종이펄프에 첨가되는 조성물, 베이킹제 또는 동물 사료에 대한 첨가물로 매우 적합함을 알아야 한다. 또한 본 발명의 크실라나제는 종래의 어떤 크실라나제의 비활성보다 큰 비활성을 나타내는 것으로 밝혀졌다.
가장 놀랄만한 것은 본 발명의 크실라나제가 서로 관련이 없는 것을 제외하고는 모든 기술분야와 관련하여 우수한 특성을 나타낸다는 것이다.
본 발명의 크실라나제는, 뒤에 예시되어 있는 바와같이, pH 8에서 펄프로부터 리그닌을 제거하는데 있어 뛰어난 효과를 나타낸다. 리그닌 제거 효과는, 뒤에 나타나 있는 바와 같이, 종래 기술(비. 푸밀루스) 보다 현저히 높다.
리그닌 제거와 관련한 높은 효능은 놀랍게도, 비록 에이치, 인솔렌스의 몇가지 크실라나제 성분중의 하나지만, 본 발명의 크실라나제 단독으로 얻어진다.
리그닌 제거 공정은 유전공학을 이용하여 높은 수율로 생산되는 오직 한종류의 크실라나제 성분을 이용할 경우에 더욱 경제적이다.
놀랍게도 현저한 셀룰라제 활성이 없이 본 발명의 크실라나제를 생산함으로써, 리그닌 제거를 위해 크실라나제를 사용하는 동안 펄프에 있는 셀룰로스 섬유에 대한 셀룰로스 용해성 공격에 의해 야기되는 생산량의 감소를 피할 수 있다.
뒤에 논의되어 있는 바와같이, 놀랍게도 본 발명의 크실라나제는 pH 프로필이 매우 유사한 바실러스 푸밀루스 크실라나제보다 연질 목재로부터 리그닌을 더 제거할 수 있다.
크실라나제 (펜토사나제 표기가 베이킹 산업에 통상적으로 사용된다)는 몇가지 목적에 있어서 밀빵용 베이킹제로 사용된다:
-밀가루반죽 형성
-밀가루반죽의 탄력성 및 안정성 개선
-빵 부피 증대
-빵가루의 구조개선
-딱딱해짐 방지
일부 크실라나제는 펜토산 (아라비노크실란)을 분해함으로써 변형된 펜토산이 밀가루 반죽의 탄력성, 안정성 및 반죽형성을 개선시키는 것으로 믿어진다. 놀랍게도 본 발명의 크실라나제는 그러한 방식으로 펜토산을 변형시킬 수 있다. 본 발명의 크실라나제는 다른 크실라나제 및 크실란 변형 효소가 없이 제조될 수 있어, 펜토산의 조절된 변형물을 얻는 것이 가능하다.
밀가루반죽의 pH는 6.0 내지 5.5인데, 이는 크실라나제를 베이킹제로 사용하기에 이상적인 것인바, 본 발명 크실라나제의 최족 pH는 5.5 내지 7.5이다.
본 발명의 크실라나제는 동물사료의 변화 또는 헤미셀룰로스 분획의 생체내 분해를 위한 동물사료에의 첨가를 위해 또한 사용될 수 있다. 본 발명의 크실라나제는 실제적으로 부작용없는 제제로 사용될 수 있는 반면, 다른 크실라나제를 포함하여 에이치. 인솔렌스 크실라나제 생성물로 표시되는 종래의 크실라나제는 몇가지 부작용을 나타낸다. 본 발명의 크실라나제 및 종래의 크실라나제는 병아리 사육 시험에서 중량증가와 관련하여 동일한 효과를 나타냈다. 이것은 본 발명의 크실라나제가 활성적이거나 또는 에이치. 인솔렌스 크실라나제의 한가지가 사료 첨가물의 이용과 관련하여 활성적이라는 것을 나타낸다. 더욱이, 본 발명의 크실라나제는 매우 순수한 크실라나제를 포함하여 재생성 중량 증가가 달성될 수 있는 현저한 장점을 나타낸다. 이와 반대로 종래의 크실라나제는 배치(bacth)에서 배치마다 다양한 비율로 많은 다른 부수적 활성을 나타낸다. 또한 단일성분인 본 발명의 크실라나제의 이용은 보다 경제적인 사료첨가물의 가능성을 열었다.
본 발명 크실라나제의 바람직한 구체예는 크실라나제가 후미콜라 인솔렌스, DSM 1800으로부터 유도되어 정제된 크실라나제에 대해 생성된 항체와 면역반응을 한다는 사실에 의해 특성화된다.
본 발명의 크실라나제의 바람직한 구체예는 크실라나제가 7.5 내지 9.5, 바람직하게는 8.0 내지 8.5의 등전점을 갖는다는 사실에 의해 특성화된다.
본 발명 크실라나제의 바람직한 구체예는 크실라나제가 330 EXU/단백질mg이상, 바람직하게는 400 EXU/단백질mg이상의 비활성을 나타낸다는 사실에 의해 특성화된다.
EXU 크실라나제 활성 단위는 AF 293.9/1에 정의되어 있다. 본 명세서에 나타나 있는 이 AF 간행물 및 다른 AF 간행물은 요구에 의해 노보 노르디스크 아크티에 셀스카브(노보 알레, 디케이-2880 박스베르트, 덴마크)로부터 구입할 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 크실라나제를 암호화한 것을 특징으로 하는 재조합 DNA 서열을 포함한다.
본 발명의 재조합 DNA 서열의 바람직한 구체예는 하기의 부분적인 DNA 서열을 포함하는 것에 의해 특성화된다.
본 발명의 재조합 DNA 서열의 바람직한 구체예는 하기로부터 선택되는 DNA 서열을 포함하는 것에 의해 특성화된다.
a) pHD450 내의 후미콜라 인솔렌스 크실라나제 DNA 삽입체, b) a)의 DNA 삽입체에 포함된 완전한 크실라나제 DNA에 대한 코딩부위와 혼성화 하고 크실라나제 활성을 지니는 폴리펩티드에 대한 구조유전자를 포함하고, 선택적으로 프로모터, 시그널 또는 리더 펩티드 및/ 또는 전사 터미네이터에 대한 코딩 부위를 포함하는 DNA 서열, c) T. Maniatis, A laboratory Manual (CSH)을 참조하여 상대적으로 스트린전트 조건(1.0×SSC, 0.1%, 65℃)하에서 제 6항에 기재된 서열과 혼성화하기에 충분한 상동성을 지닌 DNA 서열, d) a), b) 또는 c)에 정의된 DNA 서열의 유도체, 또는 e) 완전한 크실라나제 또는 그의 시그널 펩티드 또는 리더 펩티드를 암호화하고 a), b) 또는 c)의 DNA서열에 대한 유전암호의 의미내에서 변질된 DNA 서열.
pHD450의 구조는 19쪽 2행-18행에 설명되어 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 재조합 DNA 서열을 포함하는 것에 의해 특성화되는 벡터를 포함한다.
본 발명 벡터의 바람직한 구체예는 프로모터가 아스퍼질러스 오리제(Aspergillusoryzae) 타카아밀라제 프로모터이고 및/ 또는 크실라나제 유전자는 EC 3-2로부터 분리되고, 및/또는 터미네이터가 아스퍼질러스 오리제 AMG 터미네이터, 바람직하게는 pHD450인 것을 특징으로 한다. pHD450의 구조는 18쪽 22행-19쪽 5행에 설명되어 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 벡터를 포함하는 것에 의해 특성화되는 형질전환 숙주를 포함한다.
본 발명의 형질전환 숙주의 바람직한 구체예는 아스퍼질러스 균주인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 형질전환 숙주의 바람직한 구체예는 아스퍼질러스 아쿨레아투스(Aspergillus aculeatus), 아스퍼질러스 나이가(Aspergillus niger), 아스퍼질러스 오리제(Aspergillus oryzae) 또는 아스퍼질러스 아와모리(Aspergillus awamori) 종에 속하는 균주인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 형질전환 숙주의 바람직한 구체예는 비- 형질전환 상태에서는 크실라나제를 생산하지 않거나 또는 단지 미량의 크실라나제를 생산하는 미생물, 바람직하게는 바실러스종(Bacillus sp.), 이. 콜라이(E.coli) 또는 에스. 세레비시에(S.cerevisiae)인 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 형질전환된 숙주를 이용하는 것을 특징으로 하는 크실라나제의 제조방법을 포함한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 방법으로 제조된 크실라나제를 포함한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 크실라나제를 바람직하게는 비분진성 과립형태, 안정화된 액체형태 또는 보호된 효소형태로 함유하여 크실라나제가 전체 효소 단백질의 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 30%를 구성하는 조성물을 포함한다.
본 발명 조성물의 바람직한 구체예는 크실라나제 활성 및 셀룰라제 활성간의 비율이 EXU/g의 크실라나제 활성 및 ECU/g의 셀룰라제 활성간의 비로 표시할 때, 10이상의 값, 바람직하게는 30이상의 값, 가장 바람직하게는 100 이상의 값을 갖는 것을 특징으로 한다.
셀룰라제 활성 단위 ECU는 AF 302-1에 정의되어 있다.
본 발명의 조성물의 바람직한 구체예는 적어도 10 EXU/ 효소단백질mg, 바람직하게는 적어도 100 EXU/효소단백질mg, 더욱 바람직하게는 적어도 300 EXU/효소단백질mg의 크실라나제 활성을 지니는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 크실란 분해에 사용하는 것을 특징으로 하는 본 발명 조성물의 용도를 포함한다.
본 발명 용도의 바람직한 구체예는 7 이상의 바람직한 pH값에서 표백전에 또는 표백의 일부로 화학펄프 또는 재생 종이 펄프에 관한 것을 특징으로 한다.
본 발명 용도의 바람직한 구체예는 밀가루를 포함하는 빵의 제조에 관한 것을 특징으로 한다.
본 발명 용도의 바람직한 구체예는 동물사료에 관한 것을 특징으로 한다.
본 발명의 크실라나제는 하기 방법으로 제조될 수 있다.
크실라나제는 US 4,435,307, 실시예 6 처음부터 세로단 11, 29행에 기재된 바와같이 후미콜라 인솔렌스 DSM 1800을 배양하여 제조하였다. 냉동건조된 분말을 물로 희석하여 건조물 함량이 10%가 되게 하고, 10% HCℓ로 pH를 2.3으로 낮추었다. 혼합물을 22℃에서 50분간 방치한 후, 이어서 NaOH를 이용하여 pH를 8.0으로 증가시켰다.
다음에 pH 5.0에서 액체 kg당 Na2SO4250g으로 염침전을 수행하였다.
염덩어리를 재용해시킨후 이어서 농축시키고 초여과로 세척하였다. 최종적으로 제제를 냉동시켰다.
12% 건조물 용액에서 크실라나제는 다음의 효소 활성을 나타냈다: 444 CSU/㎖ 및 144EXU/㎖, CSU는 셀룰라제 활성 단위로서 AF 267을 참조하라.
이 제제를 DEAE 세파덱스 A-50(Pharmacia)을 이용한 배치 이온교환, AMICON 초여과에 의한 농축, 세파크릴 S-200(Pharmacia)상에서의 겔 여과, 및 고적화 S-세파로스(Pharmacia)를 이용한 양이온 교환으로 더욱 정제하였다.
크실라나제는 측정할만한 셀룰라제의 부수적 활성을 나타내지 않은 것으로 밝혀졌다. 그러므로, 정제된 크실라나제 생성물은 셀룰라제 활성이 0.1 CSU/단백질mg 미만이고 크실라나제 활성은 350 EXU/단백질mg보다 큰 것으로 나타났다. 정제된 크실라나제생성물은 분자량이 22 kD 인 하나의 SDS-PAGE 밴드만 나타냈다. 등전점기전영동으로 결정한 결과 pI는 8.5였다.
이 정제된 크실라나제 생성물과 반응하는 항체를 하기 방법으로 제조하였다.
정제된 크실라나제에 대한 항혈청은 N. Axelsen 등: A Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis, Blackwell Scientific Publications, 1973, 제23장에 기재된 방법에 따라 토끼를 면역화시켜 만들었다. 정제된 면역글로불린은 염침전((NH4)2SO4), 투석 및 DEAE-세파덱스상에서의 이온교환 크로마토그래피를 통해 항혈청으로부터 얻었다.
정제된 크실라나제의 면역화학적 특성화는 로켓(rocket) 면역전기영동(N. Axelsen등, 제2장)으로 수행되었다. 상기 항체를 이용한 결과 정제된 크실라나제는 로켓 면역전기영동에서 음극으로 이동하는 하나의 아치(arch)를 나타냈다.
크실라나제를 화학적으로 특성화하기 위해 Moore 및 Stein(1963), Methods Enzymol. 6,819-831에 따른 산 가수분해, 및 Heinrikson 및 Meredith(1984), Anal. Biochem. 136, 65-74(유도) 및 Edelhoch(1967), Biochemistry 6, 1948-1954(트립토판 결정)에 따라 가수분해 혼합물에서 아미노산의 정성적 및 정량적 분석을 통해 전체 아미노산 조성분을 결정하였다. 마지막에 지적한 참고문헌에는 트립토판 함량의 분광측광 결정이 기재되어 있다. 하기 아미노산 조성분이 확인되었다.
정제된 크실라나제의 N-말단 아미노산 서열은 다음과 같다.
또한 키모트립신을 이용한 효소적 분해후에, 3개의 펩티드 서열을 결정하였으며, 이들중 하나는 다른 하나의 펩티드의 서열결정중에 부수 서열(side sequence(ss))로서 결정되었다.
CNBr을 이용하여 화학적으로 분해하고 펩신을 이용하여 효소적으로 분해한 후 2개의 펩티드의 서열을 결정하였다.
본 발명의 크실라나제는 종래의 크실라나제, 예컨대 스키조필룸 콤무누(Schizophyllum communue), 바실러스 푸밀루스(Bacillus pumilus) 및 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)에서 생산가능한 크실라나제와 약간의 유사성을 나타낸다.
본 발명은 하기 실시예에 의해 예시될 것이다.
실시예 1은 크실라나제 생산 유전자의 선별 및 유전적으로 변형된 숙주 유기체를 이용한 크실란의 제조를 예시한다. 실시예 2는 시험공장에서의 크실라나제의 생산 및 크실라나제의 정제를 예시한다. 실시예 3은 종이 펄프 제조시에 표백증폭제로서 크실라나제의 용도를 예시하고 실시예 4는 베이킹제로서 크실라나제의 용도를 예시한다.
[배지]
YPD: 효모추출물 10g, 펩톤 20g, H2O를 넣어 810㎖로 함. 멸균, 20% 글루코스90㎖(여과하여 멸균) 첨가.
10x 기저염: 효모질소염기 66.8g, 숙신산 100g, NaOH 60g, H2O를 첨가하여 1000㎖로 함.
여과하여 멸균.
SC-URA: 10x 기저염 90㎖, 20% 카사미노산 22.5㎖, 1% 트립토판 9㎖, H2O를 넣어 806㎖로 함, 여과하여 멸균, 5% 트레오닌 3.6㎖ 및 20% 글루코스 90㎖ 첨가.
SC-H 한천: 아미노산이 없는 효모 질소 염기 7.5g/ℓ, 숙신산 11.3g/ℓ, NaOH 6.8g/ℓ, 비타민이 없는 카사미노산 5.6g/ℓ, 트립토판 0.1g/ℓ 및 한천 20g/ℓ(Bacto). 121℃에서 20분간 멸균. 멸균후 22% 갈락토스 용액 55㎖ 및 5% 트레오닌 용액 1.8㎖를 한천 450㎖에 첨가하였다.
YNB-1 한천: KH2PO43.3g/ℓ, 한천 16/7g/ℓ, pH를 7로 조절. 121℃에서 20분간멸균. 멸균후 아미노산이 없는 13.6% 효모 질소 염기 25㎖, 40% 글루코스 용액 25㎖, 1% L-루신용액 1.5㎖ 및 1% 히스티딘 용액 1.5㎖ 한천 450㎖에 첨가하였다.
YNB-1 액체배지: 조성분은 YNB-1 한천과 같으나 한천이 없음.
귀리 스펠트 크실란 상층 겔: pH 7인 Tris-말레산 완충액중의 1% 아가로스, 1% 귀리 스펠트 크실란(sigma Chemical Company). 상층을 한천 플레이트위에 붓기전에 겔을 끓여서 55℃로 냉각시켰다.
FG-4- 한천: 한천 35g/ℓ, 콩가루 30g/ℓ, 말토덱스트린(Glucidex 6) 15g/ℓ, 박토 펩톤 5g/ℓ, pH 7, 121℃에서 40분간 멸균.
FG-4 배지: 콩가루 30g/ℓ, 말토덱스트린(Glucidex 6) 15g/ℓ, 박토 펩톤 5g/ℓ, 121℃에서 40분간 멸균
[효모 발현 플라스미드의 제조]
시판되는 플라스미드 pYES II(Invitrogen)를 SpeI으로 절단한 후 클레노우 DNA 폴리머라제와 dNTP를 이용하여 채운 후 ClaI으로 절단하였다. DNA를 아가로스 겔상에서 크기별로 분리하고, 약 2000 bp의 단편을 전기용출로 정제하였다.
두 단편을 효모 TPI 프로모터를 포함하는 블런트-말단의 SphI/EcoRI 단편에 연결시켰다. 이 단편을 에스. 세레비시에(S.cerevisiae)(T. Albers 및 G. Kawasaki, J. Mol. Genet. 1. 1982, pp. 419-434 참조)의 TPI 프로모터가 약간 변형되어 있는 플라스미드로부터 분리하였다:
이 부분의 중심부를 구성하는 4개의 염기쌍을 제거하여 내부 SphI 부분을 제거하었다.
더욱이, 프로모터의 상류에 있는 여분의 서열을 BalI 엑소뉴클레아제로 처리하여 제거하고 SphI 링커를 첨가하였다.
최종적으로 EcoRI 링커를 위치-10에 첨가하였다.
이들 변형후에, 프로모터를 SphI-EcoRI 단편에 포함시켰다. 원래의 프로모터와 비교한 그것의 효능은 변형에 의해 영향을 받지 않은 것으로 나타났다. 얻어진 플라스미드 pYHD 17을 제 1도에 나타냈다.
[도너(Donor) 유기체]
충분한 통기를 위해 교반하면서 셀룰로스가 풍부한 발효 배지에서 생장하는 에이치.인솔렌스, DSM 1800.
[mRNA의 분리]
전체 RNA를 대략 7g의 균사체로부터 분리하였다. 균사체를 액체질소에 냉동시킨후 1g의 석영 모래와 함께 모르타르에서 마쇄하여 가루로 만들었다.
본질적으로 Sambrook등, 1989 (상기 참조)에 기재된 바와같이 구아니디움 티오시아네이트로 RNA를 추출하고 CsCl을 통해 원심분리하였다. 올리고 dT 셀룰로스상에서 크로마토그래피하여 전체 RNA로부터 폴리 A RNA를 분리하였다.
[DNA 합성]
Invitrogen의 cDNA 합성 키트를 사용하여 제조자의 지침대로 cDNA를 합성하였다. stxI 링커(Invitrogen)를 첨가하여 DNA를 발현 벡터에 연결한 후, 아가로스 겔에서 크기별로 분획하였다. 연결된 cDNA를 BstxI으로 절단된 적절한 효모 발현벡터에 연결하였다. 시험 연결 (라이브러리의 크기를 결정하기 위한 것임) 후에, 라이브러리를 플레이트당 약 5000개의 형질전환체가 형성되도록 50개의 한천 플레이트에 깔았다. 대략 5000개의 각 클론을 포함하는 각 플레이트에 배지 3㎖를 첨가하였다. 박테리아를 긁어모은 후 글리세롤 1㎖를 첨가하고, 50개의 풀pool)로 하여 -80℃에 저장하였다. 나머지 2㎖를 DNA 분리에 사용하였다. 만약 DNA 양이 원하는 수의 효모 형질전환체를 만들기에 충분하지 않은 경우 (하기 참조), 밤새 증식시킨 -80℃ 박테리아 원액 50㎕를 접종한 배지(TB) 500㎖로부터 대규모 DNA를 제조하였다. 라이브러리의 20개의 클론으로부터 DNA를 분리하여, cDNA 삽입에 대해 분석하였다.
삽입 빈도는 ＞90%였고 평균 삽입체 크기는 대략 1400bp였다.
[모의 형질전환]
이용한 효모 균주는 yNG231.(MAT 알파 leu2, ura3-52, his4-539, pep4-델타 1, cirt)였다. 하나의 콜로니를 YPD 10㎖에서 밤새 30℃에서 증식시켰다.
이 배양물 10, 30 및 60㎕를 YPD 100㎖를 포함하는 3개의 진동 플라스크에 첨가하여 30℃에서 교반하면서 밤새 배양하였다. OD600이 0.3 내지 0.4에 가장가까울때 배양물을 선택하였다. 세포를 Beckman 원심분리기 (스피드 6, 10분)에서 50㎖ 튜브에 모은후, 세포를 H2O 2×5㎖에 재현탁하여 상기한 바와같이 원심분리한 후, 0.1M LiAc, 10mM Tris-Cℓ, 1mM EDTA를 함유하는 pH 7.5의 완충액 5㎖에 재현탁하여 다시 원심분리하였다. 세포를 상기 완충액 500㎕에 재현탁하여 30℃에서 60분간 배양하였다. 캐리어 DNA 250㎍(멸균한 연어- 정자 DNA 10mg/㎖, 하기 참조)을 첨가하고 100㎕의 분취량을 제조하였다. 형질전환될 DNA(약 5㎍)를 100㎕의 분취량에 첨가하여 서서히 혼합한 후 30℃에서 30분간 배양하였다. 40% PEG 4000 700㎕, 0.1 M LiAc, 10mM Tris-Cℓ, 1mM EDTA, pH 7.5를 첨가하고, 30℃에서 60분간 배양을 계속하였다.
형질전환 혼합물을 42℃에서 5분간 열 쇼크를 준 후, 마이크로원심분리기에서 짧게 회전시키고, H2O 100-200㎕에 재현탁시킨후, 우라실이 없는 SC 플레이트에 플레이팅하여, 30℃에서 3 일간 배양하였다.
[캐리어 DNA의 제조]
연어-정자 DNA 100mg을 달아서, 10㎖의 10mM Tris-Cℓ, 1mM EDTA, pH 7.5(TE)에서 밤새 용해시켰다. 이어서 용액이 점성을 띠지 않을때까지 빙수중의 플라스틱 용기에서 초음파로 분쇄하였다. 다음에 용액을 페놀로 추출한 후 EtOH로 침전시키고, 펠릿을 세척한 후 TE 5㎖에 재현탁하였다. 현탁액을 EtOH로 침전시킨후, 페릿을 세척하여 TE 5㎖에 재현탁하였다. OD260을 측정하고 현탁액을 TE로 희석하여 10mg/㎖로 만들었다.
[효모의 스크리닝]
상기한 바와같이 후미콜라 라이브러리, 풀 1-10의 DNA를 효모로 형질전환시키고, 각 풀에 대해서 20-25,000 콜로니를 포함하는 플레이트를 얻었다. 콜리니를 긁어모아서 -80℃에서 글리세롤에 저장하였다.
라이브러리의 효모 세포를 전체가 약 400,000 콜로니가 되도록 YNB 한천에 엷게 발랐다.
플레이트당 콜로니의 수는 50 내지 500이었다. 4일 또는 5일간 증식시킨 후, 한천 플레이트를 한 세트의 SC-H 한천 플레이트에 복제 플레이팅을 하였다. 이어서 이들 플레이트를 30℃에서 2-4 일동안 배양하고, 크실라나제 검출용 귀리 스펠트 크실란 상층 겔로 한천 플레이트를 덮었다. 40℃에서 밤새 배양한 후, 효소 반응물을 콩고 레드(Congo Red)로 시각화하였다. 0.1% 콩고 레드 용액 10-15㎖를 상층에 붓고 10-20 분후에 제거하였다. 이어서 2M NaCℓ 10-15㎖를 플레이트에 부어서 플레이트를 1회 또는 2 회 세척하였다.
15-25 분후에 NaCℓ용액을 제거하였다. 크실라나제- 양성 콜로니는 플레이트 상층에서 무색 또는 빨간 배경에서 엷은 빨간색의 투명부분으로 확인하였다.
효소- 양성 콜로니의 세포를 단일 콜로니의 분리를 위해 한천에 엷게 바른 후, 확인한 각각의 크실라나제- 생산 콜로니에 대해 효소- 생산 단일 콜로니를 선별하였다.
[크실라나제 양성 콜로니의 특성과]
크실라나제- 생산 콜로니 각 147 개를 분리하였다. 이들 콜로니의 일부를 50㎖ 유리시험관중의 YNB-1 액체배지 20㎖에 접종하였다. 시험관을 30℃에서 2일간 흔들었다. 3000rpm에서 10분간 원심분리하여 세포를 수확하였다.
세포를 1㎖의 0.9M 소르비톨, 0.1 M EDTA, pH 7.5에 재현탁하였다.
펠릿을 에펜도르프 튜브에 옮기고, 최대속도로 30초간 회전시켰다. 세포를 0.4㎖의 0.9M 소르비톨, 0.1 M EDTA, 14mM β-메르캅토에탄올에 재현탁하였다.
20mg/㎖ 지몰라제 100㎕를 첨가하고, 현탁액을 37℃에서 30분간 배양한 후 30초간 회전시켰다. 펠릿(스페로플라스트)을 TE 0.4㎖에 재현탁하였다.
0.5M EDTA pH 8.0, 1.5㎖, 2M Tris-Cℓ pH 8.0, 0.6㎖, 10% SDS 0.6㎖의 용액에서 90㎕를 취하여 첨가한 후, 현탁액을 65℃에서 30분간 배양하였다.
5M KOAc 80㎕를 첨가하고, 현탁액을 최소 60분간 얼음에서 배양한 후 최대 속도에서 15분간 회전시켰다. 상징액을 EtOH이 들어있는 새로운 튜브에 옮기로 (실온), 서서히 철저하게 혼합하고 30초간 회전시켰다. 펠릿을 차가운 70% EtOH로 세척하여 30초간 회전시킨후 실온에서 건조시켰다. 펠릿을 TE 50㎕에 재현탁하고, 15분간 회전시켰다. 상징액을 새로운 튜브에 옮겼다. 100㎎/㎖ RNase 2.5㎕를 첨가하여 37℃에서 30분간 배양하고 이소프로판올 500㎕를 서서히 첨가하면서 혼합하였다.
혼합물을 30초간 회전시키고 상징액을 제거하였다. 펠릿을 차가운 96% EtOH로 헹군후 실온에서 건조시켰다. DNA를 물 50㎕에 용해시켜, 최종농도가 약 100㎕/㎖가 되게 하였다.
DNA를 표준방법을 이용하여 이. 콜라이 내로 형질전환시켰다. 두개의 이. 콜라이콜로니를 각 형질전환에서 분리하여 DNA 삽입체를 삭제시키는 제한효소 HindIII 및 XbaI으로 분석하였다. 이들 콜로니중 하나의 DNA를 효모내로 형질전환시키고 효소활성에 대해 재스크리닝하였다.
몇가지 양성 클론의 DNA 서열을 부분적으로 결정하였다. DNA 서열에 근거하여, 15개의 클론을 동일한 족으로 분리하였으며, 이들 크실라나제 족의 서열은 정제된 본 발명 크실라나제의 아미노산 서열과 거의 동일하였다. 부분적인 서열을 특허청구범위의 제 53항에 나타냈다.
pYES2 중의 크실라나제 HindIII/XbaI cDNA 단편을 포함하는 이. 콜라이 균주는 1992년 3월 18일에 DSM에 DSM 6995로 기탁되어 있다. HindIII/XbaI을 이용한 절단을 통하여 콜로니중 하나로부터 크실라나제 cDNA 단편을 분리하였다.
HindIII/XbaI 단편을 아가로스 겔 전기영동 전기용출로 정제하여 연결 반응물을만들었다.
cDNA단편을 HindIII/XbaI으로 소화한 PHD414 (하기 참조)에 연결하여, cDNA가 아스퍼질러스 오리제의 TAKA 프로모터 및 아스퍼질러스 나이가의 AMG 터미네이터의 전사 조절하에 있는 pHD 450을 만들었다.
이. 콜라이 내의 DNA를 증폭시킨후 플라스미드를 하기와 같이 아스퍼질러스 오리제에 형질전환시켰다.
[아스퍼질러스 발현 벡터의 제조]
벡터 pHD414 (제 2도)는 프라스미드 p775(EP 238 023에 기재되어 있음)의 유도체이다. 이 플라스미드와 대조적으로, pHD414는 프로모터와 터미네이터 사이에 유일한 제한 위치의 줄(string)을 갖고 있다. 플라스미드는 터미네이터의 3'말단에 위치하는 약 200bp 길이의단편( 부적당한 RE 위치 포함)의 제거 및, 이어서, 역시 부적당한 위치를 지니는, 프로모터의 5'말단에 위치하는 약 250bp 길이의 단편을 제거하여 만들었다.
200bp 부위는 NarI (pUC 벡터에 위치함) 및 XbaI (터미네이터의 3'에 위치)을 이용한 절단을 통해 제거하고, 이어서 클레노우 DNA 폴리머라제와 dNTP로 생성된 단말을 채우고, 겔상에서 벡터 단편을 정제하고 벡터 단편을 다시 연결하였다. 이 플라스미드를 pHD 413이라 명명하였다. pHD 413을 StuI (프로모터의 5'말단에 위치) 및 PvuII (pUC 벡터에 위치)로 절단하여 겔상에서 분획하고 다시 연결하여 pHD 414를 얻었다.
제2도는 플라스미드 pHD 414의 지도인바, "AMG 터미네이터"는 에이, 나이가 글루코아밀라제 터미네이터를 가리키고 "TAKA 프로모터"는 에이. 오리제 TAKA 아밀라제 프로모터를 가리킨다.
[아스퍼질러스 오리제의 형질전환]
YPD(Sherman 등, Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, 1981) 100㎖에 에이. 오리제의 포자를 접종하여 37℃에서 약 2시간동안 교반하면서 배양하였다. 균사체를 미라클로스(miracloth)를 통해 여과하여 수확한 후 0.6M MgSO4200㎖로 세척하였다. 균사체를 15㎖의 1.2M MgSO4, 10mM NaH2PO4, pH=5.8에 현탁하였다.
현탁액을 얼음에서 냉각시키고 Novozym 234 120mg을 함유하는 완충액 1㎖를 첨가하였다. 5분후에 12mg/㎖ BSA(Sigma type H25) 1㎖를 첨가하고 현미경으로 검사하는 샘플에 많은 수의 원형질체가 나타날때까지 37℃에서 1.5-2.5 시간동안 서서히 교반하면서 배양을 계속하였다.
미라클로스로 현탁액을 여과하고, 여과물을 멸균된 튜브에 옮기고 5㎖의 0.6 M 소르비톨, 100mM Tris-HCℓ, pH=7.0으로 덮었다. 100g에서 15분간 원심분리를 수행하고 MgSO4쿠션(cushion)의 상층에서 원형질체를 수집하였다 STC(1.2M 소르비톨, 10mM Tris-HCℓ, pH=7.5, 10mM CaCℓ2)2 부피를 원형질체 현탁액에 첨가하고 혼합물을 1000g에서 5분간 원심분리하였다. 원형질체 펠릿을 STC 3㎖에 재현탁하고 다시 펠릿으로 만들었다. 이 과정을 반복하였다. 최종적으로 원형질체를 STC 0.2~1㎖에 재현탁하였다.
원형질체 현탁액 100㎕를 STC 10㎕중의 적절한 DNA 5-25㎍과 혼합하였다.
원형질체를 p3SR2(에이. 니둘란스(A. nidulans) amdS 유전자 운반 플라스미드)와 혼합하였다. 혼합물을 실온에서 25분동안 방치하였다. 0.2㎖의 60% PEG 4000(BDH 29576), 10mM CaCℓ2및 10mM Tris-HCℓ, pH=7.5를 첨가하여 조심해서 혼합하고(2회), 최종적으로 동일한 용액 0.85㎖를 첨가하고 주의해서 혼합하였다. 혼합물을 실온에서 25분동안 방치하고 2500g에서 15분동안 회전시킨후 펠릿을 1.2M 소르비톨 2㎖에 현탁하였다. 1회 더 침전시킨 후 적절한 플레이트에 얇게 발랐다.
원형질체를 1.0M 자당, pH=7.0, 질소원으로 10mM 아세트아미드 및 20mM CsCℓ을 포함하여 배경 생장을 저해하는 최소 플레이트(Cove, Biochem. biophys, Acta 113(1966) 51-56)에 엷게 발랐다. 37℃에서 4-7일간 배양한 후, 포자를 고르고 단일 콜로니에 대해 엷게 발랐다. 이 방법을 반복하여 두번째 분리후의 단일 콜로니를 한정된 형질전환체로서 저장하였다.
[아스퍼질러스에서 크실라나제의 발현]
11가지의 형질진환체를 얻어서 접종하여 YPG-한천상에 유지시켰다. 각 8개의 선별한 형질전환체를 YPG-한천 사면배지에서 FG-4 배지 150㎖을 포함하는 500㎖ 교반 플라스크에 접종하였다. 양호한 통기를 위해 충분히 교반하면서 4일동안 발효시킨후, 배양한 액체 배지를 2000g에서 10분간 원심분리하고 상징액을 분석하였다.
가장 양호한 수율은 72 EXU/㎖이었다. 형질전환되지 않은 숙주 균주에서는 배경수준도 없었다. 이 균주를 Axy 40/8이라 명명하였다.
[실시예 2]
균주 Axy 40/8을 하기 방법으로 시험 공장 규모로 발효시켰다.
하기 조성분을 지니는 한천 기질을 페른바흐(Fernbach) 플라스크에서 제조하였다.
pH를 6.4-6.5 사이로 조절하고, 121℃에서 20분간 멸균하였다.
페른바흐 플라스크에 포자 현탁액을 접종하고 30℃에서 5일간 배양하였다.
하기 조성분을 지니는 기질을 500ℓ 종자 발효조에서 제조하였다.
*) 테르마밀은 노보 노르디스크 아크티에서 셀스카브에서 구입할 수 있는 알파-아밀라제이다.
수도물을 넣어 전체 부피를 약 225 리터로 만들었다. H3PO4로 pH를 약 6.5로 조절하였다.
기질을 121℃에서 1.5 시간동안 종자 발효조에서 멸균하기 전에 온도를 30분만에 60℃에서 90℃로 올리고, 90℃에서 30분간 유지시켰다. 접종전의 최종부피를 300ℓ로 하였다.
페른바흐 플라스크 포자 현탁액을 종자 발효조로 옮겼다. 종자발효조건은 다음과 같다:
발효조 형태: 높이/직경 비가 약 2.3인 통상의 통기 및 교반 발효조.
교반 : 250 rpm
통기: 분당 300 규정 리터 공기
온도 : 34℃
시간: 약 24시간
접종후 약 35시간후에 150 리터를 종자 발효조에서 주 발효조로 옮겼다.
하기 조성분을 지닌 기질을 2500리터 주 발효조에서 제조하였다:
미량 금속용액의 조성분은 다음과 같았다:
수도물을 첨가하여 전체 부피를 약 900 리터로 하였다. H3PO4로 pH를 약 6.5로 조절하였다. 온도를 30분만에 60℃에서 90℃로 증가시키고; 90℃에서 30분간 유지하였다. pH를 4.5로 조절한 후 기질을 123℃에서 1.5 시간동안 주 발효조에서 멸균하였다. 접종전의 최종부피를 약 1300리터로 하였다.
이어서 종자 배양물 150 리터를 첨가하였다.
발효조건은 다음과 같았다:
발효조 형태: 높이/직경 비가 약 2.7 인 통상의 통기 및 교반 발효조.
교반: 250 rpm(두개의 터빈 임펠러)
통기: 분당 1500 규정 리터 공기, 증가시켜서 130 시간에는 1700Nℓ/분
온도: 34℃
시간: 약 130시간
발효후 25시간후에 말토덱스트린 용액을 12시간만에 1ℓ/시간에서 4ℓ/시간으로 속도를 증가시키면서 주 발효조에 무균적으로 첨가하였다. 하기 조성분으로 550리터 급수조에서 덱스트린 용액을 제조하였다:
감자 전분 184kg
비오틴 0.04g
티아민 0.4g
시트르산 0.2kg
플루로닉 L61 200㎖
테르마밀 60L 360㎖
수도물을 넣어 전체 부피를 약 300 리터로 하였다. 기질을 123℃에서 1.5 시간 동안 급여 탱크에서 멸균하기 전에 온도를 90℃로 60분간 유지하였다.
공급전의 최종부피는 약 400 리터였다.
발효 25시간후에 NH3로 pH를 7.3-7.4로 조절하였다.
약 130 발효시간후에 발효과정을 정지하였다. 배양 액체배지 약 1850리터를 약 5℃로 냉각시키고 하기 방법에 따라 효소를 회수하였다.
배양 액체배지를 pH 7에서 원심분리하고 원심분리물을 필터의 촉진을 위해 하이플로슈퍼-셀(Hyflo Super-Cell) 구조토를 이용하여 세이쯔(Seitz) 필터 시트 (타입 Supra EKS Neu)에서 여과하였다. 여과물의 pH를 4.7로 조절하고 초여과를 이용하여 여과물을 5%의 건조물 함량으로 농축시켰다. 증발을 수행하여 30%의 건조물 함량까지 더욱 농축시켰다.
농축물의 pH를 6.5로 조절하고 농축물을 필터의 촉진을 위해 하이플로 슈퍼-셀을 이용하여 프레임 필터에서 여과하고 미생물을 세이쯔 필터 시트(타입 Supra EKS Neu)에서 여과하였다.
이 농축물은 본 명세서의 뒤에서 제제 1로 확인되었다. 제제 1은 533 EXU/g의 크실라나제 활성을 나타냈다.
제제 1은 다음과 같이 정제하였다.
총 200,000 EXU를 25% 황산암모늄으로 침전시켰다. 침전물을 물 500㎖에 용해시키고 다우 단마르크(Dow Danmark) 아크티에 셀스카브의 GR90PP막을 이용하여 아미콘(Amicon) 초여과 셀에서 세척하였다. 전도율을 1.7ms로 감소시켰다.
산출량은 150,000 EXU 였다. pH를 5.0으로 조절하고 샘플을 0.45 미크론 필터로 여과하였다: 산출량 100,000 EXU. 샘플을 200㎖ S-세파로스 고속 컬럼 크로마토그래피 및 pH 5.0의 20mM 아세트산 나트륨을 이용하여 양이온 교환 크로마토그래피를 하였다.
크실라나제는 이 pH에서 컬럼에 결합하였다. 동일 완충액중의 1M 염화나트륨을 포함하는 선형 구배를 이용하여 크실라나제를 용출시켰다. E280당 114 EXU에 대응하는 E2804.1을 갖는 160㎖에서 총 75,000 EXU를 회수하였다.
펩티드 맵핑 및 비활성의 측정 및 특성화를 위해 최종 정제단계로 고순도의 크실라나제를 얻었다. 크기 크로마토그래피 Superdex 75를 이용하여 크실라나제의 소부를 최대한 정제하였다. 정제한 크실라나제는 SDS-PAGE에서 22kD의 분자량을 갖는 단일 밴드로 나타났고, Pharmacia IEF 겔을 이용한 등전점전기영동에서의 단일 밴드는 pI가 8.2였다.
본래 및 상기와 같이 정제한 본 발명의 클론된 크실라나제는 정제된 본래의 크실라나제에 대해 형성된 토끼 항체와 동등하게 반응하였다.
로켓 면역전기영동을 이용한 결과 두 효소는 동등한 EXU 기저상에서 동일한 면역침전을 일으켰다. EXU 방법을 이용한 결과 착색된 크실란에 대한 정제된 크실라나제의 활성도는 E280당 130 EXU 또는 단백질 mg당 450 EXU였다.
흡광도계수는 3.5 E280였다.
[실시예 3]
이 실시예에서 종래의 비 푸밀루스(B.pumilus) 크실라나제를 본 발명의 크실라나제와 비교하였다. 실시예 2에 기재된 제제 1을 비교에 사용하였다. 연질목재 펄프에서 본 발명의 크실라나제는 현저히 양호한 표백 촉진 효과를 나타냈다.
본 발명의 크실라나제: 에이치. 인솔렌스 크실라나제, 액체 제제 533 EXU/g
종래의 크실라나제: 비. 푸밀루스 크실라나제 액체 제제 1070 EXU/g
[펄프]
스웨덴 제분기로부터의 표백되지 않은 연질목재, 펄프를 세척하여 공기 건조하고, 냉방에서 ＜5℃로 저장하였다.
펄프를 ＞12시간동안 물에 담근후, 실험실 펄프제조기로 1% DS, 10,000 리버션(reversion)으로 펄프를 만들었다.
두가지 표백시험을 수행하였으며, 각각은 하기의 두단계로 이루어졌다.:
1) 효소 처리
2) (D50C50)E 탈목질화
[실험실 표백 조건]
효소
50℃, pH 8.0(Britton-Robinson 완충액). 처리시간 및 용량은 효소처리 제목하에 뒤에 기재되어 있다.
(D50C50)
45분, 40℃, 5% DS, 최종 pH: 1.9-2.9.
aCL-배수: 0.15, 0.19, 0.23, 0.27
E
60분, 60℃, 12% DS, 최종 pH: 10.6-12.2.
NaOH 용량은 탈목질화 단계에 사용한 염소화합물로부터 다음과 같이 계산하였다.
[0.5·(kg Cl2/톤+ClO2/톤)+3]kg/톤
표백단계는 수욕중의 가열된 플라스틱 자루에서 수행하였다. 자루를 일정한 간격을 두고 손으로 주물렀다.
[효소 처리]
두가지 펄프 샘플을 동일한 효소 단계에서 처리하였다: 하나는 본 발명의 크실라나제, 및 다른 하나는 종래의 크실라나제, 3시간동안 처리하였으며 용량은 1000 EXU/kg이었다.
이어서 펄프를 냉수로 철저히 세척하였다. 세번째 샘플-대조표준-을 효소의 첨가없이 동일하게 처리하였다.
두 효소간의 현저한 차이는 이 실험에서 나타나지 않았다.
효소처리후에 측정한 카파수 및 흡광도를 표 2에 나타냈다.
[(D50C50)E 탈목질화]
세가지 샘플의 각각으로부터 얻은 펄프 약 17g의 4개 부분을 다른 용량의 활성염소로 탈목질화하였다. 이어서, 카파수 및 ISO 휘도값을 측정하였다.
결과를 표 3에 나타냈다.
표 3에서 알 수 있는 바와같이 본 발명의 에이치. 인솔렌스 크실라나제는 종래의 크실라나제보다 현저히 낮은 카파수 및 양호한 휘도를 제공하였다.
비록 표 3에는 본 발명의 크실라나제에 대한 카파수가 종래의 크실라나제에 대한 카파수보다 단지 약간 작은 것으로 나타나 있지만, 약간의 차이는 사용한 활성염소의 현저한 저장 및 훨씬 많음을 의미한다.
* 대조표준의 카파 수에 대한 배수
이 실험에 사용한 펄프에 대해서 본 발명의 크실라나제는 종래의 크실라나제보다 높은 표백 촉진 효과를 나타낼 것이라고 결론을 내릴 수 있다.
[실시예 4]
이 실시예는 본 발명 크실라나제의 베이킹제로서의 용도를 예시한다.
크실라나제 (펜토사나제 표기가 일반적으로 제과산업에 사용된다)는 몇가지 목적의 달성을 위해 밀빵용 베이킹제로 사용된다:
-밀가루반죽 형성
-밀가루반죽의 탄력성 및 안정성 개선
-빵 부피 증대
-빵가루의 구조 개선
-딱딱해짐 방지
제제 1을 밀빵에 시험한 바 빵의 품질에 매우 양호한 효과를 나타냈다.
이 효소는 충분한 밀가루 연화 효과를 지니고 있다. 43-150 FXU의 제제 1을 첨가한 결과 물빵의 부피가 5-20% 증가하고 빵가루 구조가 더욱 균일해지며 빵가루가 효소없는 빵보다 부드러워졌다. 크실라나제 활성도 단위 FXU는 AF 293.6에 정의되어 있다.
종래의 크실라나제 베이킹제는 몇가지 효소 활성을 포함한 반면에, 본 발명의 베이킹제는 크실라나제 활성 이외에는 현저히 낮은 함량의 효소활성을 지닌채 용이하게 제조될 수 있다. 그러므로 본 발명의 베이킹제를 이용하므로서 한 베이킹 조작에서 다음 베이킹 조작까지 보다 일정한 특성을 지닌 제과제품을 얻을 수 있다.
[조리법 및 베이킹 방법]
이 실시예에서의 기본 조리법:
-밀가루 1000g
-소금 16g
-설탕 16g
-효모 50g
-물 590g
-효소
성분을 나선형 반죽형성 기계로 혼합하였다. 가루반죽을 저속에서 2분동안, 그리고 고속에서 5분동안 반죽하였다. 반죽온도는 약 26-28℃였다. 10분간 방치한 후, 가루반죽을 나누어서 30개의 롤빵과 1개의 빵을 만들었다. 33℃, 80% RH에서 롤빵은 45분동안 그리고 빵은 40분동안 내구력을 준후 롤빵 및 빵을 220℃에서 각 15분 및 30분동안 구웠다.
[결과]
아밀라제 활성이 없는 제제 1에서 숙주 유기체에 의해 생성된 아밀라제 활성도는 통상의 크로마토그래피 기법을 이용하여 크실라나제로부터 분리시킬 수 있다.
통상적인 레이프 시드(rape seed) 방법을 이용하여 롤빵 및 빵의 부피를 측정하였다. 이어서 측정한 값을 상대지수로 계산하였다.
빵가루 연성을 SMS-Texture Analyzer에서 측정하였다. 직경 25mm의 플런저로 두께가 11mm인 빵조각의 중앙을 눌렀다. 3.3mm/s의 속도로 빵가루 3mm를 압착하는 플런저에 필요한 힘을 기록하고, 그것을 빵가루 연성으로 표시하였다. 이어서 정의에 의해 100의 지수를 갖는 기준샘플에 대한 상대적인 지수로 값을 다시 계산하였다. 빵가루의 연성에 대한 지수가 낮을수록 빵가루는 더 부드럽다.
가루반죽 형성 및 빵가루 구조에 대한 특성을 시각적 평가에 따라 나타냈다: +는 가루반족이 정상적이고, 빵부스러기도 또한 굵은 구조를 지니며 정상적임을 의미하고, ++는 가루반죽이 기준보다 부드럽고 기준보다 탄력적이며, 빵가루 구조는 균일하고 부드러움을 의미한다.
노보 노르디스크 아크티에 셀스카브에서 구입할 수 있는 시판되는 제제인 Pento-panTM은 에이지. 인솔렌스에서 얻은 다른 크실라나제 및 또한 다른 에이치. 인솔렌스 효소활성을 지니는 종래의 크실라나제이다. 본 발명의 크실라나제는 종래의 베이킹제보다 우수한 효능을 지니고 있어 보다 큰 부피 및 보다 부드러운 빵가루를 제공한다. 종래의 크실라나제와 비교하여, 본 발명의 크실라나제에 관한 가장 중요한 베이킹 장점을 본 발명의 크실라나제가 실제로 다른 부수적 활성이 없는 베이킹제로 이용될 수 있어, 결과적으로 배치에서 배치마다 매우 균일한 특성을 지닌 빵을 만들 수 있다는 것이다.
[서열목록]
(1) 일반적인 정보
(i) 출원인 : 노보 노르디스크 아크티에 셀스카브
(ii) 발명의 명칭 : 크실라나제, 대응하는 재조합 DNA 서열, 크실라나제 함유 작용물, 및 작용물의 농도
(iii) 서열 수 : 7
(iv) 통신 주소:
(A) 수신인 : 노보 노르디스크 아크티에 셀스카브
(B) 거리 : 노보 알레
(C) 시 : 디케이-2880 박스베르트
(E) 국가 : 덴마크
(v) 컴퓨터 판독 형식 :
(A) 매체 종류 : 플로피 디스크
(B) 컴퓨터 : IBM PC 호환성
(C) 작동 시스템 : PC-DOS/MS-DOS
(D) 소프트웨어 : 파텐트인 릴리스 #1.0, 비젼 #.25
(viii) 변호사/대리인 정보
(A) 이름 : 바흐, 닐스 등.
(B) 등록 번호 : GA 24307
(C) 증명서/인가증 번호 : 3588.204-WO
(ix) 전기통신 정보:
(A) 전화 : +45 4444 8888
(B) 전화팩시밀리 : +45 4449 3256
(C) 텔렉스 : 37304
(2) SEQ ID NO : 1에 대한 정보:
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 21 아미노산
(B) 종류 : 아미노산
(C) 가닥수 : 단일
(D ) 형태 : 선형
(ii) 분자 종류 : 펩티드
(vi) 본래의 출처
(A) 유기체 : 후미콜라 인솔렌스
(B) 균주 : DSM 1800
(xi) 서열 기술 : SEQ ID NO:1:
(2) SEQ ID NO : 2에 대한 정보:
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 9 아미노산
(B) 종류 : 아미노산
(C) 가닥수 : 단일
(D ) 형태 : 선형
(ii) 분자 종류 : 펩티드
(vi) 본래의 출처
(A) 유기체 : 후미콜라 인솔렌스
(B) 균주 : DSM 1800
(xi) 서열 기술 : SEQ ID NO:2:
(3) SEQ ID NO : 3에 대한 정보:
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 12 아미노산
(B) 종류 : 아미노산
(C) 가닥수 : 단일
(D ) 형태 : 선형
(ii) 분자 종류 : 펩티드
(vi) 본래의 출처
(A) 유기체 : 후미콜라 인솔렌스
(B) 균주 : DSM 1800
(xi) 서열 기술 : SEQ ID NO:3:
(2) SEQ ID NO : 4에 대한 정보:
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 24 아미노산
(B) 종류 : 아미노산
(C) 가닥수 : 단일
(D ) 형태 : 선형
(ii) 분자 종류 : 펩티드
(vi) 본래의 출처
(A) 유기체 : 후미콜라 인솔렌스
(B) 균주 : DSM 1800
(xi) 서열 기술 : SEQ ID NO:4:
(2) SEQ ID NO : 5에 대한 정보:
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 29 아미노산
(B) 종류 : 아미노산
(C) 가닥수 : 단일
(D ) 형태 : 선형
(ii) 분자 종류 : 펩티드
(vi) 본래의 출처
(A) 유기체 : 후미콜라 인솔렌스
(B) 균주 : DSM 1800
(xi) 서열 기술 : SEQ ID NO:5:
(2) SEQ ID NO : 6에 대한 정보:
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 15 아미노산
(B) 종류 : 아미노산, N-말단
(C) 가닥수 : 단일
(D ) 형태 : 선형
(ii) 분자 종류 : 펩티드
(vi) 본래의 출처
(A) 유기체 : 후미콜라 인솔렌스
(B) 균주 : DSM 1800
(xi) 서열 기술 : SEQ ID NO:6:
(2) SEQ ID NO : 7에 대한 정보:
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 516 염기쌍
(B) 종류 : 핵산
(C) 가닥수 : 이중
(D ) 형태 : 선형
(ii) 분자 종류 : rDNA
(vi) 본래의 출처
(A) 유기체 : 후미콜라 인솔렌스
(B) 균주 : DSM 1800
(xi) 서열 기술 : SEQ ID NO:7:

Claims (26)

  1. 하기의 부분적인 아미노산 서열 또는 그것에 대해 적어도 80%의 상동성을 갖는 부분적인 아미노산 서열을 지니는 크실라나제:
  2. 제1항에 있어서, 크실라나제는 후미콜라 인솔렌스(Humicola insolens) DSM 1800에서 얻은 정제된 크실라나제에 대한 생성된 항체와 면역반응성인 것을 특징으로 하는 크실라나제.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서. 크실라나제는 7.5-9.5의 등전점을 지니는 것을 특징으로 하는 크실라나제.
  4. 제1항에 있어서, 크실라나제는 330 EXU/단백질mg 이상의 비활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 크실라나제.
  5. 제1항 내지 제4항중 어느 한항의 크실라나제를 암호화하는 재조합 DNA 서열.
  6. 비교적 스트린전트 조건(1.0X SSC, 0.1% SDS, 65℃)하에서. 하기의 부분적인 DNA 서열에 혼성화할 수 있는 크실라나제를 암호화하는 재조합 DNA서열:
  7. 제6항에 있어서, SEQ ID No.7인 부분적인 DNA 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 DNA 서열.
  8. 제6항의 재조합 DNA 서열을 포함하는 벡터.
  9. 제8항에 있어서, 프로모터는 아스퍼질러스 오리제(Aspergillus oryzae) 타카아밀라제 프로모터이고 및/또는 터미네이터는 아스퍼질러스 오리제 AMG 터미네이터인 것을 특징으로 하는 벡터.
  10. 제8항 또는 제9항의 벡터를 포함하는 형질전환된 숙주.
  11. 제10항에 있어서, 형질전환된 숙주는 아스퍼질러스 균주인 것을 특징으로 하는 형질전환된 숙주.
  12. 제10항에 있어서, 형질전환된 숙주는 비-형질전환된 상태에서는 크실라나제를 생산하지 않거나 또는 단지 미량의 크실라나제를 생산하는 미생물인 것을 특징으로 하는 형질전환된 숙주.
  13. 제10항, 제11항 및 제12항중 어느 한항의 형질전환된 숙주를 이용한 크실라나제의 제조방법.
  14. 제6항에 따른 DNA 서열에 의해 암호화되는 크실라나제.
  15. 제1항 내지 제4항 및 제14항중 어느 한항의 크실라나제를 전체 효소 단백질의 적어도 10%로 함유하는 조성물.
  16. 제15항에 있어서, 크실라나제 활성 및 셀룰라제 활성간의 비는 EXU/g의 크실라나제 활성 및 ECU/g의 셀룰라제 활성간의 비로 표현하여 10이상의 값을 지니는 것을 특징으로 하는 조성물.
  17. 제15항에 있어서, 적어도 10 EXU/효소단백질mg의 크실라나제 활성을 지니는 것을 특징으로 하는 조성물.
  18. 크실란 분해에 사용되는 것을 특징으로 하는 제15항의 조성물.
  19. 화학펄프 또는 재생종이펄프에 관련하여 표백 전 또는 표백의 일부로서 사용되는 것을 특징으로 하는 제15항의 조성물.
  20. 밀가루를 포함하는 빵의 제조에 관련하여 사용되는 것을 특징으로 하는 제15항의 조성물.
  21. 동물사료에 관련하여 사용되는 것을 특징으로 하는 제15항의 조성물.
  22. 제6항에 있어서, 후미콜라 인솔렌스 DSM 1800 크실라나제 Hind III/Xbal DNA 단편으로부터 유래된 것을 특징으로 하는 재조합 DNA 서열.
  23. 제6항에 있어서, 부분적인 서열인 SEQ ID No. 1~6을 갖는 크실라나제를 암호화하는 것을 특징으로 하는 재조합 DNA 서열.
  24. 제5항의 재조합 DNA 서열을 포함하는 벡터.
  25. 제24항의 벡터를 포함하는 형질전환된 숙주.
  26. 제25항의 형질전환된 숙주를 이용한 크실라나제의 제조방법.
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