ES2217333T3 - Nuevas xilanasas, genes que las codifican y sus usos. - Google Patents

Abstract

SE DESCRIBE UN ADN QUE CODIFICA NUEVAS XILANASAS, VECTORES QUE CONTIENEN ESTE ADN, HUESPEDES TRANSFORMADOS CON DICHO ADN, PREPARACIONES ENZIMATICAS Y EL USO DE DICHAS PREPARACIONES.

Description

Nuevas xilanasas, genes que las codifican y sus usos.

Antecedentes de la invención Campo de la invención

La presente invención se refiere a genes que codifican nuevas xilanasas y composiciones que contienen las nuevas xilanasas. Estas composiciones son especialmente útiles en las industrias de la pasta y el papel y en la modificación de la biomasa de las plantas, como aditivo alimenticio o en el horneado.

Descripción de la técnica relacionada

La biomasa de una planta es un material compuesto que consiste fundamentalmente en una matriz de celulosa, hemicelulosa y lignina. Las enzimas que degradan, por ejemplo, la xilana de hemicelulosa, las xilanasas, se pueden usar por ejemplo en composiciones para la alimentación animal que son ricas en arabinoxilanas y glucoxilanas, en la cocción, y en aplicaciones de pasta y papel, por ejemplo, para mejorar el blanqueado de pastas.

Así, cuando se añade a alimentos (por ejemplo, para animales monogástricos, por ejemplo aves de corral o cerdos) que contienen cereales (por ejemplo, cebada, trigo, maíz, centeno o avena) o derivados de cereales, una enzima hemicelulótica mejora la ruptura de la pared celular de la planta que lleva a un mejor uso de los nutrientes de la planta por el animal. Esto lleva a una tasa de crecimiento y conversión alimenticia mejoradas. Además, se puede reducir la viscosidad de los alimentos que contienen xilana.

En aplicaciones de cocción, añadir pequeñas cantidades de xilanasas a la harina proporciona características favorables a la masa y al pan mismo. Dichas características incluyen, por ejemplo, el incremento en el volumen del pan y mejores características de textura (calidad de ruptura y corte y calidad de la miga).

En la industria de la pasta y el papel se usan xilanasas y otras hemicelulasas, por ejemplo, para mejorar el blanqueado de la pasta.

El propósito del blanqueado de la pasta kraft es retirar la lignina residual que queda en la pasta tras la cocción de la pasta kraft. Tradicionalmente, esto se ha hecho usando sustancias químicas que contienen cloro. Debido a preocupaciones medioambientales y peticiones de los consumidores, se han buscado tecnologías blanqueadoras alternativas.

El primer enfoque biotécnico a este problema fue atacar directamente la lignina con enzimas degradantes de lignina. Sin embargo, la química de la degradación enzimática de la lignina parece ser muy complicada y difícil de controlar.

La lignina se puede degradar, si se usa el microorganismo completo que produce ligninasas. Sin embargo, los tiempos de tratamiento son relativamente largos. Por ejemplo, los tiempos de tratamiento pueden llevar días, y los microorganismos necesitan nutrientes suplementarios para trabajar. También puede ser difícil controlar el crecimiento de otros microbios no deseados. La degradación de la lignina usando ligninasas o mediante microorganismos es el objeto de muchas investigaciones. (Véase, por ejemplo, Farrell, R.L. y col., Lignocellulosics 305-315 (1992); Jurasek, L., Lignocellulosics 317-325 (1992)).

Además de celulosa y lignina la pasta de madera contiene hemicelulosa. Otro enfoque en la retirada de lignina es atacar la hemicelulosa - el tercer componente principal de la madera. La hemicelulosa en madera noble nativa es principalmente xilana, mientras que en la madera de coníferas la hemicelulosa es principalmente glucomananas y algo de xilana. Durante la cocción de la pasta kraft, se disuelve parte de la xilana en el licor de cocción. Hacia el final del periodo de cocción cuando decrece la concentración de álcali, parte de la xilana disuelta y modificada vuelve a precipitar en la fibra de celulosa.

En 1986, se observó que el pretratamiento con xilanasa de la pasta kraft no blanqueada resulta en una necesidad disminuida de sustancias químicas en el procedimiento de blanqueado (Viikari, L. y col., Proceedings of the 3^{rd} Int. Conf. On Biotechnology in the Pulp Paper Ind., Estocolmo (1986), págs. 67-69). El pretratamiento con xilanasa de pasta kraft hidroliza parcialmente la xilana en la pasta kraft. Esto hace a la estructura de la pasta más porosa y permite una retirada más eficiente de los fragmentos de lignina en las etapas subsecuentes de blanqueado y extracción. Luego, en varios laboratorios, se observó que el pretratamiento con xilanasa era útil en conjunción con secuencias blanqueadoras que consisten en Cl_{2}, ClO_{2}, H_{2}O_{2}, O_{2} y O_{3}. Véase los informes en Viikari, L. y col., FEMS Microbiol. Rev. 13: 335-350 (1994); Viikari, L. y col., In: Saddler, J.N., ed., Bioconversion of Forest and Agricultural Plant Residues, C-A-B International (1993), págs. 181-182; Grant, R., Pulp and Paper Int. (Sept. 1993), págs. 56-57; Senior & Hamilton, J. Pulp & Paper: 111-114 (Sept. 1992); Bajpal & Bajpal, Process Biochem. 27:319-325 (1992); Onysko, A., Biotech. Adv. 11: 179-198 (1993); y Viikari, L. y col., J. Paper and Timber 73:384-389 (1991).

Como resultado directo del mejor blanqueado de la pasta tras dicho tratamiento con xilanasa, hay una reducción del consumo subsecuente de sustancias químicas blanqueadoras, que cuando se usan sustancias químicas que contienen cloro, llevan a la formación reducida de compuestos organoclorados no deseados medioambientalmente. También como resultado directo de la mejor capacidad de blanqueado de la pasta tras un tratamiento con xilanasa, es posible producir un producto con un brillo final donde tal brillo sería de otro modo difícil de conseguir (como el blanqueado totalmente libre de cloro (TCF) usando peróxido). Debido a la especifidad del sustrato de la enzima xilanasa, no se dañan las fibras de celulosa y las propiedades de fuerza del producto están bien dentro de los límites aceptables.

Sin embargo, en muchas de las aplicaciones prácticas, el uso de xilanasas no es sencillo; las xilanasas deben ser activas en las condiciones de temperatura y pH del procedimiento en que se usan. La formulación de alimentos comerciales usando granulación, extrusión o expansión, a menudo contiene etapas que conllevan elevadas temperaturas (70-180ºC). Las enzimas que se añaden al procedimiento de formulación deberían aguantar estas condiciones. Por otro lado, la temperatura correspondiente en el intestino de animales es aproximadamente 40ºC. Así, las xilanasas ideales para composiciones alimenticias deberían soportar las temperaturas extremas anteriormente mencionadas. En aplicaciones de blanqueado, la aplicación de xilanasa no es tan simple como el añadir una etapa de tratamiento con xilanasa. Debido a que el procedimiento de blanqueado, e incluso la secuencia de las etapas usadas en el procedimiento de blanqueado varía en diferentes fábricas de pasta, existe una necesidad continua de encontrar nuevas xilanasas activas en diferentes condiciones de temperatura y pH.

La mayoría de las xilanasas comerciales diseñadas para aplicaciones alimenticias y blanqueado de pasta no son muy termo-tolerantes, especialmente cuando se usan condiciones de pH neutro o alcalino. En la práctica, las xilanasas generalmente son ineficientes o inactivas a temperaturas superiores a 60ºC y a menudo estas enzimas funcionan en condiciones ácidas. Generalmente, hay diferencias en las características físicas de las xilanasas de hongos y bacterias (para revisión, véase Wong y col., Microbiol. Rev. 52:305-317 (1988). Típicamente, las xilanasas fúngicas tienen una temperatura óptima a aproximadamente 50ºC y un pH óptimo más bajo que los que tienen aquellos con origen bacteriano. Las xilanasas de origen bacteriano generalmente tienen una temperatura óptima en el intervalo de 50 a 70ºC.

El documento PCT/US90/05933 (WO 91/05908) propone el uso de xilanasa en el blanqueado de pasta junto con cloro o compuestos de cloro. Se propone Chaetomium como fuente de xilanasa. Se describe la selección de xilanasa en cadenas de Streptomyces y Chainia. Se realizaron experimentos de blanqueado usando preparaciones de xilanasa en medios de cultivo de Chainia sp.

El documento EP-A0406617 propone el uso de xilanasa en un procedimiento enzimático de deslignificación de material lignocelulósico, especialmente después de una enzima ligninolítica. La xilanasa se puede derivar de varias fuentes, por ejemplo de Chaetomium. Se ejemplifica el uso de xilanasa de medio de cultivo de Chainia sp.

Gandhi, J.P. y col., J. Chem. Tech. Biotechnol. 60:55-60 (1994) presenta estudios sobre la termoestabilidad y estabilidad del pH de preparaciones de xilanasa cruda de Chaetomium globosum. La temperatura óptima de la xilanasa se encontró en el intervalo de 50 a 60ºC, mientras que el pH óptimo se encontró en 5,0. Se informó de que la enzima no perdía nada de la actividad original en el intervalo de 40 a 60ºC por un periodo de 10 minutos y se informó de que retenía más del 70% de la actividad original en el intervalo de 70 a 100ºC por 10 minutos. Los estudios sobre la estabilidad del pH indicaron que la enzima retenía toda la actividad a un pH de entre 5 y 6 y más del 70% de la actividad original en un intervalo amplio de valores alcalinos de pH (7-10). Se sugirió usar los filtrados del cultivo para el tratamiento de pastas de celulosa sin posterior purificación.

También se estudiaron las xilanasas de Chaetomium cellulolyticum y Chaetomium trilaterale (Dubeau, H. y col., Biotechnol. Lett. 9:275-280 (1987) y Kawaminami, T. y Litzuka, H. J. Ferment. Technol. 48:161-168 (1970), respectivamente). Sin embargo, no se informó del perfil de termoestabilidad ni de pH de las enzimas. Se sugirió que las xilanasas serían útiles en la clarificación de zumos de fruta. No se sugirió el uso de estas enzimas en el blanqueado de pasta o como aditivo alimenticio.

Ganju, R.K. y col., Can. J. Microbiol. 35:836-842 (1989) informó de la purificación y caracterización de dos xilanasas de Chaetomium thermophile var. coprophile. Se purificaron dos xilanasas (I y II) de varias xilanasas extracelulares producidas por C. Thermophile var. coprophile hasta la homogeneidad. Estas enzimas tenían pesos moleculares de 26.000 Daltons (xilanasa I) y 7.000 Daltons (xilanasa II). Las temperaturas óptimas para las xilanasas I y II eran de 70 y 60ºC, y eran óptimamente activas a pH 4,8-6,4 y 5,4-6,9, respectivamente. No se sugirió el uso de estas xilanasas en el blanqueado de pasta o como aditivo alimenticio.

Irle y col., Hakko Kogaku Kaishi 70(2): 109-114 (1992) informó de la purificación de una xilanasa de un mutante de Chaetomium gracile. Se informó de que el peso molecular era de 19.000 daltons, y la xilanasa contenía dos subunidades: una con un peso molecular de 14.400 daltons y la otra de un peso molecular de 4.800 daltons. El pH era de 8,35. La máxima actividad formadora de xilobiosa se encontró a un pH de 5,0 y 50ºC. El intervalo de pH se estableció en 4,0-7,0. Yoshino y col., Curr. Genet. 29:73-80 (1995) informó del aislamiento y secuenciación de dos genes de xilanasa de cadenas de Chaetomium gracile salvajes y mutantes y su expresión en Aspergillus nidulans. Las xilanasas CgXA y CgXB maduras contienen 189 y 211 aminoácidos, respectivamente, y comparten el 68,5% de homología. Los genes cgxA y cgxB se introdujeron en Aspergillus nidulans y se informó de que se expresaban con sus propios promotores. No se sugirió el uso de estas xilanasas de C. Gracile en el blanqueado de pasta o como aditivo alimenticio.

Resumen de la invención

Al reconocer la importancia de desarrollar un procedimiento medioambientalmente seguro y económico para modificar la biomasa de las plantas, los inventores han buscado nuevas enzimas que serían útiles en tales procedimientos.

La invención va dirigida a secuencias de ADN, que incluyen genes que codifican nuevas xilanasas, las nuevas xilanasas codificadas por dicho ADN, vectores de expresión que contienen dicho ADN, huéspedes transformados con dicho ADN, y cualquier preparación enzimática del crecimiento de tales huéspedes que contienen las xilanasas expresadas, y el uso de dichas preparaciones enzimáticas. Tales usos incluyen el blanqueado ayudado con enzimas de pasta de madera y procedimientos para modificar la biomasa de las plantas, como usos como aditivo alimenticio o en la cocción.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 muestra el mapa plásmido del plásmido pALK475 (8,4 Kb) que porta el gen de la xilanasa 2 (xin2) de Trichoderma reesei.

La Figura 2 muestra el ADN y la secuencia de aminoácidos deducida del gen xinA de Chaetomium thermophilum CBS 730.95 (ALKO4265). El sitio de división de la peptidasa señal putativa se indica con una flecha. El codón de terminación se indica con un asterisco.

La Figura 3 muestra el ADN y la secuencia de aminoácidos deducida del gen xinB de Chaetomium thermophilum CBS 730.95 (ALKO4265). El sitio de división de la peptidasa señal putativa se indica con una flecha. El codón de terminación se indica con un asterisco.

La Figura 4 muestra el ADN y la secuencia de aminoácidos deducida del gen xinC de Chaetomium thermophilum CBS 730.95 (ALKO4265). El sitio de división de la peptidasa señal putativa se indica con una flecha. El codón de terminación se indica con un asterisco.

La Figura 5 muestra el mapa del plásmido pALK1108.

La Figura 6 muestra el mapa del plásmido pALK1111.

La Figura 7 muestra el mapa del plásmido pALK1113.

La Figura 8 (A, B y C) muestra las dependencias del pH de las actividades de la xilanasa de transformantes de T. reesei produciendo xilanasa A (Figura 8A), xilanasa B (Figura 8B) y xilanasa C (Figura 8C) de C. thermophilum CBS 730.95. Se midió la actividad enzimática tras 5 minutos de incubación.

La Figura 9 (A, B y C) muestra las dependencias de temperatura de las actividades de la xilanasa de transformantes de T. reesei produciendo xilanasa A (Figura 9A), xilanasa B (Figura 9B) y xilanasa C (Figura 9C) de C. thermophilum CBS 730.95. Se midió la actividad enzimática tras 5 minutos de incubación.

La Figura 10 muestra el análisis SDS-PAGE de los filtrados de cultivo de transformantes de T. reesei produciendo las xilanasas XLNA, XLNB y XLNC de C. thermophilum CBS 730.95. Se cultivaron la cadena huésped ALK04468 de T. reesei y las cadenas recombinantes ALKO4468/xinA (ALKO4468/1108/7) y ALKO04468/xinB (ALKO4468/1111/44) en un fermentador de laboratorio. Se cultivó la cadena ALKO4468/xinC (ALKO4468/1113/34) de producción de XLNC en un frasco agitador. Las masas de los marcadores de peso molecular (en kDa) se muestran a la derecha. Se indican las posiciones de XLNA, XLNB y XLNC.

Descripción detallada de las realizaciones preferentes Depósitos

ALKO4265, identificado como Chaetomium thermophilum La Touche por el Instituto Micológico Internacional/Servicio de Biosistemas, se depositó el 8 de noviembre de 1995 en el Centralbureau Voor Schimmelcultures de Oosterstraat 1.3742 SK BAARN, Países Bajos, y se le asignó CBS 730.95.

Los plásmidos pALK475 (que contienen el gen para la xilanasa 2 (xin2) de Trichoderma reesei) y pALK1026, pALK1028 y pALK1049 (que contiene los genes para las xilanasas A (xinA), B (xinB) y C (xinC) de Chaetomium thermophilum) se depositaron en el Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM), Mascheroder Weg 1 b, D-38124 Braunschweig, Alemania el 21 de junio de 1996 y se les asignaron los números de registro DSM 11020, DSM 11021, DSM 11022 y DSM 11023 respectivamente.

Definiciones

Para proporcionar un entendimiento más claro y consistente de la memoria descriptiva y las reivindicaciones, incluyendo el alcance que se da a dichos términos, se aportan las siguientes definiciones.

Decoloración ayudada por enzima. Por "decoloración ayudada por enzima" se entiende la extracción de lignina de pasta de celulosa tras la acción de las enzimas degradantes de hemicelulosa con o sin enzimas degradantes de lignina. La eliminación de la lignina se puede restringir con hemicelulosas bien físicamente (mediante reprecipitación en la superficie de la fibra durante la cocción) o químicamente (mediante complejos lignina-hidrato de carbono). La actividad de la hemicelulasa degrada parcialmente la hemicelulosa, lo que favorece la extracción de ligninas mediante sustancias químicas decolorantes convencionales (como cloro, dióxido de cloro, peróxido, etc.) (Viikari y col., "Bleaching with Enzimes" en Biotecnología en la Industria de la Pasta y del Papel, Proc. 3^{rd} Int. Conf., Estocolmo, págs. 67-69 (1986); Viikari y col., "Applications of Enzimes in Bleaching" en Proc. 4^{th} Int. Symp. Wood ans Pulping Chemistry, París, Vol. 1, págs. 151-154 (1987); Kantelinen y col., "Hemicellulases and their Potential Role in Bleaching" en International Pulp Bleaching Conference, Tappi Proceedings, págs. 1-9 (1988)). La ventaja de esta decoloración mejorada es un menor consumo de sustancias químicas decolorantes y menores cargas medioambientales o valores más elevados de brillo final.

Preparación enzimática. Por "preparación enzimática" se entiende una composición que contiene enzimas. Preferentemente, las enzimas se han extraído de (parcialmente o completamente purificadas de) un microbio o el medio usado para cultivar tal microbio.

"Extraido de" significa que las enzimas deseadas se separan de la masa celular. Esto se puede realizar por cualquier procedimiento que consiga este objetivo, incluyendo la ruptura de células y también eliminar simplemente el medio de cultivo de células usadas. Por lo tanto, el término "preparación enzimática" incluye composiciones que contienen medios previamente usados para cultivar un microbio(s) deseado(s) y cualquier enzima que se haya liberado de las células microbianas a dicho medio durante el cultivo, o etapas de procesamiento corriente abajo.

Por huésped "sustancialmente incapaz" de sintetizar una o más enzimas se entiende un huésped en el que la actividad de una o más de las enzimas enumeradas está deprimida, deficiente o ausente cuando se compara con el tipo salvaje.

Xilanasa. Como se usa en la presente memoria descriptiva, una xilanasa es una hemicelulosa que corta las uniones \beta-1,4 dentro de la ofxilana de cadena xilósica (la xilana es un polímero de residuos de D-xilosa que se unen mediante anclajes \beta-1,4). La actividad xilanasa es sinónimo de actividad xilanolítica.

Por secuencia de aminoácidos que es un "equivalente" de una secuencia de aminoácidos específica se entiende una secuencia de aminoácidos que no es idéntica a la secuencia de aminoácidos específica, pero más bien contiene al menos algunos cambios en los aminoácidos (alteraciones, sustituciones, inversiones, inserciones, etc) que no afectan esencialmente a la actividad biológica de la proteína en comparación a una actividad similar de la secuencia de aminoácidos específica, cuando se usa para un propósito deseado. La actividad biológica de una xilanasa es su actividad enzimática, actividad catalítica, y/o capacidad para unirse a material hemicelulósico. La actividad biológica de las xilanasas XLNA, XLNB, y XLNC también incluye su capacidad para actuar de forma sinérgica con otras hemicelulasas. Preferentemente, una secuencia de aminoácidos "equivalente" contiene al menos un 80%-99% de identidad a nivel aminoácido con la secuencia de aminoácidos específica, más preferentemente al menos un 90% y en una realización especialmente preferente, al menos el 95% de identidad, a nivel de aminoácido.

Termotolerante. Una enzima es termotolerante cuando, al hacer un ensayo como se describe en el Ejemplo 5 (también se pueden usar valores de pH y temperatura más elevados), retiene más del 50% de su actividad cuando el valor de actividad obtenido usando un tiempo de incubación de 60 minutos se compara con el valor de actividad obtenido usando un tiempo de incubación de 5 minutos (en las condiciones correspondientes) y cuando las condiciones son: pH\geq6 y una temperatura\geq60ºC.

Vehículo de clonación. Un vehículo de clonación es un plásmido o un ADN bacteriófago u otra secuencia de ADN (como un ADN lineal) que aporta un entorno para el vehículo de ácido nucleico apropiado para la transferencia de un gen de interés en una célula huésped. Los vehículos clonadores de la invención se pueden diseñar para replicarse autónomamente en huéspedes procariotas y eucariotas. En huéspedes fúngicos como Trichoderma, los vehículos clonadores generalmente no se replican autónomamente y sin embargo, aportan meramente un vehículo para el transporte del gen de interés al huésped de Trichoderma para la inserción subsecuente en el genoma de Trichoderma. El vehículo clonador también se puede caracterizar por uno o un pequeño número de sitios de reconocimiento de endonucleasa en los que dicha secuencia de ADN se puede cortar en una forma determinable sin pérdida de una función biológica esencial del vehículo, y en los que se puede unir ADN para producir la replicación y clonación de dicho ADN. El vehículo clonador también puede contener un marcador adecuado para el uso en la identificación de células transformadas con el vehículo clonador. Los marcadores, por ejemplo, son genes de resistencia a antibióticos. Alternativamente, dichos marcadores se pueden aportar en un vehículo clonador que está separado de aquel que aporta el gen de interés. A veces se usa la palabra "vector" por "vehículo clonador".

Vehículo de expresión. Un vehículo de expresión es un vehículo de clonación o vector similar a un vector de clonación pero que es capaz de expresar un gen de interés, tras la transformación en un huésped deseado. Cuando se usa un huésped fúngico, el gen de interés se aporta preferentemente a un huésped fúngico como parte de un vehículo de clonación o expresión que se integra en el cromosoma fúngico, o permite al gen de interés integrarse en el cromosoma huésped. Las secuencias que son parte del vehículo de clonación o vehículo de expresión también se pueden integrar con el gen de interés durante el procedimiento de integración. En T. reesei, los sitios de integración a los que se puede dirigir el gen de interés incluyen los loci cbh y/o egl. Más preferentemente, el gen de interés se puede dirigir para reemplazar un gen que codifica una característica no deseable del huésped.

El gen de interés también se sitúa preferentemente bajo el control de (esto es, unido de forma operativa a) ciertas secuencias de control como secuencias promotoras aportadas por el vector (que se integra con el gen de interés). Alternativamente, las secuencias de control pueden ser aquellas que están en el sitio de inserción.

Las secuencias de control de expresión de un vector de expresión variarán dependiendo de si el vector se diseña para expresar un determinado gen en un huésped procariota o eucariota (por ejemplo, un vector de enlace puede aportar un gen para la selección en huéspedes bacterianos). Las secuencias de control de expresión pueden contener elementos reguladores de la transcripción como, promotores, elementos activadores, y secuencias terminadoras de la transcripción, y/o elementos reguladores de la traducción, como, por ejemplo, sitios de iniciación y terminación de la traducción.

Como se describe en la presente memoria descriptiva, ALK04265, Chaetomium thermophilum La Touche, depositado como CBS 730.95, se usa en la presente memoria descriptiva como ejemplo de donante de genes de xilanasa que son útiles en diversas aplicaciones (por ejemplo en la decoloración o como aditivo alimenticio). Dichas xilanasas también se pueden derivar de otras cadenas de las mismas especies o de organismos divergentes.

1. Clonación y expresión de los genes codificadores de xilanasa

El procedimiento para conseguir genéticamente los huéspedes de la invención se facilita mediante la clonación de secuencias genéticas que codifican la actividad xilanasa deseada y mediante la expresión de dichas secuencias genéticas. Como se usa en la presente memoria descriptiva el término "secuencias genéticas" pretende referirse a una molécula de ácido nucleico (preferentemente ADN). Las secuencias genéticas que codifican la xilanasa deseada se derivan de una variedad de fuentes. Estas fuentes incluyen ADN genómico, ADNc, ADN sintético y combinaciones de los mismos. Se pueden usar los sistemas de vectores para producir huéspedes para la producción de las preparaciones enzimáticas de la invención. Dicha construcción de vector (a) puede aportar además una construcción separada de vector (b) que porta al menos un gen deseado para integrarlo en el genoma del huésped y (c) un marcador elegible unido a (a) o (b). Alternativamente, se puede usar un vector diferente para el marcador.

Se dice que una molécula de ácido nucleico, como ADN, es "capaz de expresar" un polipéptido si contiene secuencias de control de expresión que contienen información reguladora de la transcripción y dichas secuencias están "unidas de forma operativa" a la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido.

Una unión operable es una unión en la que una secuencia se conecta a una secuencia (o secuencias) reguladora de tal forma que sitúa la expresión de la secuencia bajo la influencia o control de la secuencia reguladora. Se dice que dos secuencias de ADN (como una secuencia codificadora de proteína y una secuencia de región promotora unida al extremo 5' de la secuencia codificadora) están unidas de forma operable si la inducción de la función promotora resulta en la transcripción del ARNm de la secuencia codificadora de proteína y si la naturaleza de la unión entre las dos secuencias de ADN no (1) resulta en la introducción de una mutación de cambio en la estructura, (2) interfiere con la capacidad de las secuencias reguladoras de la expresión para dirigir la expresión de ARNm, ARN antisentido, o proteína, o (3) interfiere con la capacidad del patrón de ser transcrito por la secuencia de la región promotora. Así, una región promotora estaría unida operativamente a una secuencia de ADN si el promotor fuera capaz de efectuar la transcripción de esa secuencia de ADN.

La naturaleza precisa de las regiones reguladoras necesarias para la expresión del gen pueden variar entre especies o tipos de células, pero en general deberían incluir, como necesario, secuencias no transcriptoras 5' y no traductoras 5' (no codificadoras) implicadas en la iniciación de la transcripción y la traducción respectivamente.

La expresión de la proteína en los huéspedes tansformados requiere el uso de regiones reguladoras funcionales en dicho huésped. Se puede usar una gran variedad de secuencias reguladoras de la transcripción y la traducción. En eucariotas, donde la transcripción no está unida a la traducción, dichas regiones de control pueden aportar o no un codón metionina iniciador (AUG), dependiendo de si la secuencia clonada contiene tal metionina. En general, tales regiones incluirán una región promotora suficiente para dirigir la iniciación de la síntesis de ARN en la célula huésped.

Como se conoce ampliamente, la traducción del ARNm eucariótico se inicia en el codón que codifica la primera metionina. Por esta razón, es preferible asegurarse de que la unión entre un promotor eucariota y una secuencia de ADN que codifica la proteína, o un derivado funcional del mismo, no contiene ningún codón intermedio capaz de codificar una metionina. La presencia de dichos codones tiene como resultado la formación de una proteína de fusión (si el codón AUG está en el mismo marco de lectura que la proteína que codifica la secuencia de ADN) o una mutación de cambio en la estructura (si el codón AUG no está en el mismo marco de lectura que la secuencia codificadora de proteína).

En una realización preferente, se secreta una proteína deseada al medio circundante debido a la presencia de una secuencia señal de secreción. Si una proteína deseada no posee su propia secuencia señal, o si dicha secuencia señal no funciona bien en el huésped, entonces la secuencia codificadora de la proteína puede unirse operativamente a una secuencia señal homóloga o heteróloga del huésped. La secuencia codificadora deseada se puede unir a cualquier secuencia señal que permitirá la secreción de la proteína del huésped. Dichas secuencias señal se pueden diseñar con o sin sitios proteasa específicos de tal forma que la secuencia peptídica señal se puede eliminar subsecuentemente. Alternativamente, se puede usar un huésped que vierte la proteína al medio, por ejemplo un huésped con una mutación en su membrana.

Si se desea, se pueden obtener las regiones 3' no transcritas y/o no traducidas a la secuencia codificadora de una proteína mediante los procedimientos de clonación descritos anteriormente. Se puede retener la región 3' no transcrita por sus elementos de la secuencia reguladora de terminación de la transcripción; se puede retener la región 3 no traducida por sus elementos de la secuencia reguladora de la terminación de la traducción, o por aquellos elementos que dirigen la poliadenilación en células eucariotas.

Los vectores de la invención también pueden comprender otros elementos reguladores unidos operativamente como secuencias activadoras.

En una realización preferente, se construyen transformantes genéticamente estables por los cuales el ADN de una proteína deseada se integra en el cromosoma del huésped. La secuencia codificada para la proteína deseada puede provenir de cualquier fuente. Dicha integración puede ocurrir de novo dentro de la célula o, en una realización más preferente, estar asistida por transformación con un vector que se inserta funcionalmente en el cromosoma del huésped, por ejemplo, un vector que contiene elementos de ADN que promueven la integración de secuencias de ADN en cromosomas.

Se seleccionan células que han integrado de manera estable el ADN introducido en sus cromosomas introduciendo también uno o más marcadores que permiten la selección de células huésped que contienen el vector de expresión en el cromosoma, por ejemplo el marcador puede aportar resistencia biocida, por ejemplo, resistencia a antibióticos, o metales pesados, como cobre, u otros. El gen marcador seleccionable puede estar directamente unido a las secuencias de ADN del gen a expresar, o introducido en la misma célula por co-transformación.

Los factores importantes en la selección de un plásmido o vector viral particular incluyen: la facilidad con la que las células receptoras que contienen el vector se pueden reconocer y seleccionar de aquellas células receptoras que no contienen el vector; el número de copias del vector que se desean en un huésped en particular; y si es deseable ser capaz de "transportar" el vector entre células huésped de especies diferentes.

Una vez que el vector o secuencia de ADN que contiene la estructura(s) está preparado para la expresión, se introduce la estructura(s) de ADN en una célula huésped apropiada por cualquiera de una variedad de medios adecuados, incluyendo la transformación como se describe arriba. Tras la introducción del vector, se cultivan células receptoras en un medio selectivo, que selecciona el crecimiento de células transformadas. La expresión de la secuencia(s) del gen clonado resulta en la producción de la proteína deseada, o en la producción de un fragmento de esta proteína. Esta expresión puede tener lugar de manera continua en las células transformadas, o de manera controlada.

En concordancia, las secuencias codificadoras de la xilanasa se pueden unir operativamente a cualquier vector deseado y transformarse en un huésped seleccionado, para proporcionar la expresión de dichas proteínas en ese huésped.

El tema de la invención también son las moléculas de ácido nucleico que codifican proteínas que tienen la actividad biológica de una xilanasa y que se hibridan a cualquiera de las moléculas de ácido nucleico descritas arriba o que se definen a continuación:

Una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene la actividad enzimática de una xilanasa, seleccionada del grupo formado por:

(a)

moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos descrita en la Figura 2;

(b)

moléculas de ácido nucleico que comprenden la secuencia codificadora de la secuencia de nucleótidos descrita en la Figura 2;

(c)

moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos codificada por el encaje de ADN contenido en DSM 11021;

(d)

moléculas de ácido nucleico que comprenden la secuencia codificadora del encaje de ADN contenido en DSM 11021;

(e)

moléculas de ácido nucleico cuya secuencia codificadora difiere de la secuencia codificadora de una molécula de ácido nucleico de una cualquiera de (a) a (d) debido a la degeneración del código genético;

(f)

moléculas de ácido nucleico que se hibridan a una molécula de cualquiera de (a)-(d); y que codifican un polipéptido que tiene actividad xilanasa y que tiene una secuencia de aminoácidos que presenta al menos el 80% de identidad con una secuencia como se describe en la Figura 2.

El término "hibridación" en este contexto significa hibridación en condiciones de hibridación convencionales, preferentemente en condiciones estrictas como describe, por ejemplo Sambrook y col. (1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2^{nd} Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). Estas moléculas de ácido nucleico que se hibridan con las moléculas de ácido nucleico según la presente invención en principio se pueden derivar de cualquier organismo que posea dichas moléculas de ácido nucleico. Preferentemente, se derivan de hongos, concretamente aquellos del género Chaetomium. Las moléculas de ácido nucleico que se hibridan con las moléculas de ácido nucleico de la presente invención se pueden aislar, por ejemplo, de librerías genómicas o librerías de ADNc de diversos organismos, concretamente hongos.

Dichas moléculas de ácido nucleico se pueden identificar y aislar usando las moléculas de ácido nucleico de la presente invención o fragmentos de estas moléculas o los complementos invertidos de estas moléculas, por ejemplo por hibridación según las técnicas estándares (véase Sambrook y col. (1989)).

Como sonda de hibridación, por ejemplo se pueden usar moléculas de ácido nucleico que tienen exactamente o sustancialmente la misma secuencia de nucleótidos indicada en la Figura 2 o fragmentos de dicha secuencia. Los fragmentos usados como sondas de hibridación también pueden ser fragmentos sintéticos obtenidos por técnicas de síntesis convencionales y cuya secuencia es sustancialmente idéntica a la de las moléculas de ácido nucleico según la invención. Una vez se han identificado y aislado los genes que se hibridan con las moléculas de ácido nucleico de la invención es necesario determinar la secuencia y analizar las propiedades de las proteínas codificadas por dicha secuencia.

El término "molécula de ADN que hibrida" incluye fragmentos, derivados y variantes alélicas de las moléculas de ácido nucleico descritas arriba que codifican la proteína descrita arriba o un fragmento biológicamente activo de las mismas. Se entiende que los fragmentos son partes de moléculas de ácido nucleico suficientemente largas para codificar la proteína descrita o un fragmento biológicamente activo de las mismas. El término "derivativo" significa en este contexto que las secuencias de nucleótido de estas moléculas difieren de las secuencias de las moléculas de ácido nucleico descritas arriba en una o más posiciones y son altamente homólogas con dicha secuencia. Se entiende que la homología se refiere a la identidad de una secuencia de al menos el 40%, particularmente una identidad de al menos el 60%, preferentemente más del 80% y todavía más preferentemente más del 90%. Las desviaciones de las moléculas de ácido nucleico descritas arriba pueden ser el resultado de eliminación, sustitución, inserción, adición o combinación.

La homología también significa que las secuencias de nucleótidos o proteínas codificadas respectivas son funcional y/o estructuralmente equivalentes. Las moléculas de ácido nucleico que son homólogas con las moléculas de ácido nucleico descritas arriba y que son derivativas de dichas moléculas de ácido nucleico frecuentemente son variaciones de dichas moléculas que representan modificaciones que tienen la misma función biológica. Pueden ser variaciones que ocurren de forma natural, como secuencias de otros organismos o mutaciones. Estas mutaciones pueden ocurrir de forma natural o se pueden conseguir por mutagénesis específica. Además, estas variaciones pueden ser secuencias producidas de forma sintética. Las variantes alélicas pueden ser variantes que ocurren de forma natural al igual que variantes producidas sintéticamente o de ingeniería genética.

Las proteínas codificadas por las diversas variantes de las moléculas de ácido nucleico de la invención comparten características comunes específicas, como actividad enzimática, peso molecular, reactividad inmunológica, conformación, etc., al igual que propiedades físicas, como movilidad electroforética, comportamiento cromatográfico, coeficientes de sedimentación, solubilidad, propiedades espectroscópicas, estabilidad, pH óptimo, temperatura óptima, etc. Se puede detectar la actividad enzimática de la texilanasa por ejemplo como se describe en el Ejemplo 5.

La presente invención también se refiere a moléculas de ácido nucleico cuyas secuencias difieren de las secuencias de las moléculas identificadas arriba debido a la degeneración del código genético, y que codifica una proteína que tiene la actividad biológica de la xilanasa.

Las moléculas de ácido nucleico de la invención son preferentemente moléculas de ARN o ADN, más preferentemente ADN genómico o ADNc.

Las secuencias codificadoras de xilanasa descritas en la presente memoria descriptiva se pueden fusionar en el marco con otras secuencias para construir ADN codificando una proteína de fusión. Por ejemplo, un vector recombinante codificando un gen de xilanasa se puede preparar como arriba, excepto que la secuencia codificadora de xilanasa se fusiona con una secuencia "vehículo" de una celulasa o hemicelulasa de Trichoderma, o al menos un dominio funcional de dicha celulasa o hemicelulasa, como se describe en el documento US5.298.405, WO93/24622 y en el informe GenBank L25310. Especialmente, la celulasa o hemicelulasa se selecciona del grupo formado por CBHI, CBHII, EGI, EGII, XYLI, XYLII y MANI, o un dominio de los mismos, como la señal de secreción o la secuencia del núcleo. La mananasa tiene la misma estructura en el dominio que la de las celulasas: un dominio del núcleo, que contiene el sitio activo, un dominio bisagra que contiene una región rica en serina-treonina, y una cola, que contiene el dominio de unión.

Se pueden construir péptidos de fusión que contienen un dominio nuclear de mananasa o celobiohidrolasa o endoglucanasa o xilanasa, o los dominios nuclear y bisagra de las mismas, fusionado con la secuencia de xilanasa de la invención. El resultado es una proteína que contiene un núcleo de mananasa o celobiohidrolasa o endoglucanasa o xilanasa, o regiones nuclear y bisagra, y una xilanasa de la invención. La proteína de fusión contiene las actividades tanto de mananasa o celobiohidrolasa o endoglucanasa y xilanasa de los diversos dominios como proporciona la estructura de fusión. El polipéptido vehículo no tiene que tener actividad enzimática o su actividad puede estar inactivada. Las proteínas de fusión también se pueden construir de forma que se incluye la cola de mananasa o celobiohidrolasa o endoglucanasa o xilanasa o un fragmento deseado de las mismas, situado antes de la secuencia de xilanasa, especialmente para permitir el uso de un sitio de proteasa no específico en la cola como un sitio de proteasa para la recuperación de la xilanasa de la proteína de fusión expresada. Alternativamente, las proteínas de fusión se pueden construir de forma que aporten un sitio proteasa en un enlazador que está situado antes de la secuencia de xilanasa, con o sin secuencias cola.

Las secuencias de xilanasa o parte de ellas también se pueden usar como la parte N-terminal del péptido de fusión, como se describe arriba, para la producción de otras proteínas. En este caso, se puede construir la región de unión usando la estrategia descrita arriba.

Se pueden crear nuevas propiedades para la xilanasa mediante dominios de fusión, como un dominio de unión de celulosa (CBD), preferentemente con su enlazador, a la xilanasa de la invención. Preferentemente, dichos CBD y enlazadores son los dominios CBD y enlazadores correspondientes de una celulasa o mananasa de Trichoderma, y, más preferentemente, la de la celulasa o mananasa de Trichoderma reesei.

2. Las preparaciones enzimáticas de la invención

Se han caracterizado nuevas xilanasas de Chaetomium thermophilum. Se ha encontrado que cadenas de Chaetomium, y especialmente de Chaetomium thermophilum, expresan y secretan xilanasas que son especialmente útiles para la industria de la pasta y el papel. Estas xilanasas también son útiles en formas impuras como preparaciones enzimáticas que contienen, o esencialmente son, el medio de cultivo usado del crecimiento del organismo (Solicitud U.S. Nº 60/008.746).

En una realización preferente, las xilanasas presentes en las preparaciones enzimáticas de la invención y usadas en los procedimientos de la invención son preferentemente aquellas de Chaetomium, y especialmente Chaetomium thermophilum (CBS 730.95), y en una realización especialmente preferente, las xilanasas codificadas por el gen de la xilanasa de la invención, xinA.

La invención aporta procedimientos para producir una preparación enzimática. Esta preparación puede ser parcial o totalmente deficiente en actividad celulolítica (esto es, en la capacidad de degradar completamente celulosa a glucosa) y enriquecida en una o más xilanasas deseables para el procesamiento de pasta y papel. Por "deficiente en actividad celulolítica" se entiende una capacidad reducida, disminuida o reprimida de degradar celulosa a glucosa. Tales preparaciones deficientes en actividad celulolítica, y la formación de las mismas por procedimientos de ADN recombinante, se describen en el documento US5.298.405. El medio usado del crecimiento de los huéspedes recombinantes, o las enzimas purificadas de los mismos, se pueden usar como fuente de las preparaciones enzimáticas de la invención en la solicitud deseada. Además, si las actividades deseadas están presentes en más de un huésped recombinante, dichas preparaciones se pueden aislar de los huéspedes apropiados y combinados antes del uso en el procedimiento de la invención.

Para obtener las preparaciones enzimáticas de la invención, los huéspedes recombinantes descritos arriba que tienen las propiedades deseadas (esto es, huéspedes capaces de expresar cantidades económicamente factibles de las enzimas xilanasas deseadas y opcionalmente, aquellos que son sustancialmente incapaces de expresar una o más enzimas celulasa) se cultivan en condiciones adecuadas, las enzimas deseadas se secretan de los huéspedes al medio de cultivo, y se recupera la preparación enzimática de dicho medio de cultivo por procedimientos conocidos en la técnica. Las preparaciones enzimáticas de la invención se pueden producir cultivando las cadenas recombinantes en un fermentador en un medio de cultivo adecuado (como se muestra, por ejemplo, en el Ejemplo 5).

La preparación enzimática puede ser el medio de cultivo usado con o sin las células huésped transformadas, o puede ser una preparación que contiene xilanasa que se recupera del mismo mediante la aplicación de procedimientos bien conocidos en la técnica. Sin embargo, porque las enzimas xilanasas se secretan al medio de cultivo y muestran actividad en las condiciones ambientales del licor hemicelulótico, es una ventaja de la invención que las preparaciones enzimáticas de la invención se puedan usar directamente del medio de cultivo sin más purificación. Si se desea, dichas preparaciones se pueden filtrar o liofilizar o la actividad enzimática concentrar y/o estabilizar de otro modo para su almacenamiento. Las preparaciones enzimáticas de la invención son muy económicas de aportar y usar porque (1) las enzimas se pueden usar de una forma cruda; el aislamiento de una enzima específica del fluido de cultivo es innecesario y(2) porque las enzimas se secretan al medio de cultivo, sólo se necesita recuperar el medio de cultivo para obtener la preparación enzimática deseada; no hay necesidad de extraer una enzima de los huéspedes. Preferentemente el huésped para dicha producción es Trichoderma, y especialmente T. reesei.

Las preparaciones enzimáticas de la invención se pueden aportar como líquido o como sólido, por ejemplo, en un polvo seco o en forma granular o líquida, especialmente gránulos no espolvoreados, o un líquido estabilizado, o la preparación enzimática también se puede concentrar o estabilizar para su almacenamiento o uso.

Las preparaciones enzimáticas de la invención se pueden ajustar para satisfacer los requerimientos de necesidades específicas en diversas aplicaciones industriales. Se prevé que preparaciones enzimáticas que contienen una o más de las xilanasas de la invención se puedan también enriquecer o hacerlas parcial o completamente deficientes en actividades enzimáticas específicas, para satisfacer los requerimientos de una utilidad específica en diversas aplicaciones, por ejemplo en la industria de la pasta y el papel. Se puede elegir una mezcla de actividades enzimáticas secretadas por un huésped y especialmente un hongo, para que sea ventajosa en una aplicación industrial particular, como por ejemplo la decoloración.

La mezcla se puede preparar con otras macromoléculas que no todas se secretan del mismo huésped (por ejemplo, otras enzimas como endoglucanasas, celobiohidrolasas, proteasas, lipasas, peroxidasas, oxidasas o amilasas) o sustancias químicas que pueden incrementar la ejecución, estabilización, o tamponamiento de la preparación enzimática deseada. Los gránulos no espolvoreados se pueden revestir. Se pueden estabilizar las preparaciones enzimáticas líquidas añadiendo un poliol como propilén glicol, un azúcar o alcohol azucarado, ácido láctico o ácido bórico, según procedimientos establecidos.

Si se desea, una proteína expresada también se puede purificar de acuerdo con condiciones convencionales, como extracción, precipitación, cromatografía, cromatografía de afinidad, electroforesis, y otros.

3. Aplicaciones

Generalmente, las preparaciones enzimáticas actuales son útiles para la degradación de sustratos que contiene xilana. En particular, las preparaciones enzimáticas de esta invención son útiles en la industria de la pasta y del papel, preferentemente en la decoloración de la pasta. Las preparaciones también se pueden usar preferentemente para la preparación de piensos para animales, en composiciones de harina y en masa para la preparación de panes.

Así, en una realización preferente, la presente invención comprende un procedimiento para el tratamiento enzimático de la biomasa de las plantas en condiciones de elevada temperatura (50-80ºC) y pH 5-8 durante un tiempo deseado, como, por ejemplo, una hora.

La biomasa de las plantas es un material compuesto consistente principalmente en una matriz de celulosa, hemicelulosa, y lignina. La eliminación del componente de lignina es deseable durante la fabricación de pasta de papel por su color marrón y tendencia a reducir la fuerza del producto de papel. Se han desarrollado muchos procedimientos para la eliminación de la lignina. Típicamente, la pasta de madera se trata con sustancias basadas en cloro u otras sustancias químicas tóxicas o dañinas para el medio ambiente con objeto de retirar el componente de lignina y aportar una pasta blanqueada. Sin embargo, los subproductos no deseables de este tratamiento químico tienen un impacto negativo en la salud y estabilidad del medio ambiente al que se liberan. Consecuentemente hay una gran necesidad de desarrollar técnicas alternativas, menos dañinas medioambientalmente para conseguir el blanqueado de la pasta.

El procedimiento de la invención se lleva preferentemente a cabo in vitro en la pasta que contiene hemicelulosa. El procedimiento implica poner la preparación enzimática, el medio de cultivo usado, o la mezcla concentrada que contiene xilanasa en contacto con la pasta de madera. Los cálculos rutinarios permiten a aquellos expertos en la materia determinar las condiciones óptimas de tratamiento como el tiempo, la dosis de enzima, la consistencia de la pasta, el pH y la temperatura y otras variables.

Cuando se usa para tratar la pasta vegetal, las preparaciones enzimáticas de la invención se pueden usar con alguna o todas las sustancias químicas blanqueadoras, como cloro, dióxido de cloro, peróxido de hidrógeno, ozono, oxígeno, hidróxido sódico, etc.

La dosis, pH, temperatura, y tiempo del tratamiento enzimático se pueden variar fácilmente para conseguir la máxima efectividad en el tratamiento. Por ejemplo, el pH puede oscilar de aproximadamente pH 5 a aproximadamente pH 8, la temperatura puede oscilar de aproximadamente 50ºC a aproximadamente 80ºC, el tiempo de tratamiento con la preparación enzimática de aproximadamente 0,5 horas a aproximadamente 24 horas, y la dosis de aproximadamente 20 a 200 nkat/g de materia seca de pasta. El tratamiento enzimático se puede añadir a diversos procedimientos de blanqueado, que son secuencias de etapas de tratamiento químico sucesivas. Los procedimientos de decoloración típicos son:

1)

secuencias que contienen cloro elemental que se pueden representar por, por ejemplo, una secuencia de X(C/D)EDED, donde X indica un tratamiento con una enzima, como una enzima de la invención, C/D indica tratamiento combinado con cloro elemental (C) y dióxido de cloro (D), E indica una extracción alcalina y D indica tratamiento con dióxido de cloro;

2)

secuencias libres de cloro elemental (ECF) que se pueden representar por ejemplo por una secuencia de XDEDED;

3)

secuencias totalmente libres de cloro (TCF) que se pueden representar por ejemplo por una secuencia de XQPPP, donde Q representa la quelación, esto es etapa de eliminación de metal, y P indica un tratamiento con peróxido de hidrógeno (PPP indica tres etapas de peróxido sucesivas). Típicamente las secuencias TCF también incluyen otras etapas diferentes, como diferentes etapas de extracción (E, EO, EOP), ozono (Z), oxígeno (O), etapa de peróxido presurizado (OP), etc.

Las preparaciones enzimáticas de la invención satisfacen los requerimientos de necesidades específicas en diversas aplicaciones en la industria de la pasta y del papel, incluyendo el descortezado químico de los troncos y el refinado de la madera para reducir las demandas de energía en la producción mecánica de pasta. En el agramaje de la pasta, las preparaciones enzimáticas de la invención se pueden usar para incrementar la fibrilación externa, e incrementar o facilitar el aumento de volumen de las fibras de pasta, y así mejorar las propiedades de fabricación de papel de las fibras. Las xilanasas presentes en la preparación enzimática de la invención también se pueden usar para mejorar la drenabilidad y/o disminuir la retención de agua de la pasta.

En otra realización preferente, las preparaciones enzimáticas de la invención se usan como aditivos alimenticios, y así mejorar la tasa de crecimiento animal y la conversión alimenticia. En una tercera realización preferente, la preparación enzimática actual se usa en la cocción, con lo que se puede obtener una mejora de las características de la masa y del pan.

La invención se describe con más detalle en los siguientes ejemplos. Estos ejemplos sólo muestran unas pocas aplicaciones concretas de la invención. Por lo tanto los ejemplos no se deben interpretar para estrechar el alcance de la invención sino sólo para clarificar el uso de la invención.

Ejemplos Ejemplo 1 Aislamiento del ADN cromosómico y construcción de la librería genómica

Se cultivó Chaetomium thermophilum CBS 730.95 (ALKO4265) en 2 x 250 ml de medio (formado por celulosa Solka Floc SW 200 al 0,6%, grano usado del destilador al 0,6%, xilana de avena al 0,3%, CO_{3}Ca al 0,2%, harina de soja (desnatado) al 0,15%, HPO_{4}(NH_{4})_{2} al 0,15%, salvado de cebada al 0,1%, PO_{4}KH_{2} al 0,05%, SO_{4}Mg al 0,05% x 7 H_{2}O, ClNa al 0,05%, solución -1 de oligoelemento al 0,05%, solución -2 de oligoelemento al 0,05%, NO_{3}K al 0,03%), pH 6,5, en vasos agitadores durante 3 días a 40-45º agitando a 250 rpm. La solución -1 de oligoelemento contiene 1,60 g de SO_{4}Mn, 3,45 g de SO_{4}Zn x 7 H2O, 2,00 g de Cl_{2}CO x 6 H_{2}O por litro. La solución -2 de oligoelemento contiene 5,00 g de SO_{4}Fe x 7 H_{2}O y 2 gotas de SO_{4}H_{2} concentrado por litro.

Se aisló el ADN cromosómico según Raeder y Broda, Lett. Appl. Microbiol. 1:17-20 (1985). Brevemente, se lavó el micelio con EDTA 20 mM y se lisó en tampón de extracción (Tris-ClH 200 mM (pH 8,5), ClNa 250 mM, EDTA 25 mM, SDS al 0,5%). Se extrajo el ADN con fenol y una mezcla de cloroformo:alcohol isoamílico (24:1 v/v). Se digirió el ARN con ARNasa.

El ADN cromosómico se digirió parcialmente con Sau3A (Boehringer Mannheim, Alemania) y se trató con fosfatasa alcalina intestinal de ternera. El ADN se sometió a electroforesis en gel de agarosa. Se aisló ADN de aproximadamente 20 kb del gel usando \beta-agarasa (Boehringer Mannheim, Alemania) y se usó para construir la librería genómica de Chaetomium.

El Vector Klt Lambda DASH® II BamHI (Stratagene, EEUU) predigerido se usó para construir la librería y se siguieron las instrucciones del fabricante en todas las etapas subsecuentes. Brevemente, se ligaron aproximadamente 200 ng de ADN fraccionado por tamaño a 1 \mug de ramas preparadas DASH® II, y se empaquetó usando extracto de empaquetado Gigapack II (Stratagene, EEUU). Se determinó el título de la librería infectando células de E. Coli XL1-Blue MRA (P2) con diluciones en serie del fago empaquetado y recubierto en placas NZY. La librería se usó para la selección sin amplificación.

Ejemplo 2 Aislamiento de los genes que codifican xilanasas en base a la hibridación al gen xin2 de T. reesei

Se cultivaron células de E. Coli XL1-Blue MRA (P2) (Stratagene, EEUU) en LB + maltosa al 0,2% + SO_{4}Mg 10 mM, y se diluyeron a OD_{BDD}=0,5. Se infectaron las células con la librería recombinante durante 15 min a 37ºC, y se recubrieron con agar superior NZY en placas NZY. Se incubaron las placas a 37ºC durante la noche. Se transfirieron las placas a un filtro de nailon (Hybond, Amersham, Reino Unido) según las instrucciones de Stratagene. Se seleccionó la librería genómica de Chaetomium thermophilum CBS 730.95 en vector lambda DASH® II con un fragmento HindIII de 2,4 kb marcado con digoxigenina de pALK475 que contiene el gen de la xilanasa 2 (xin2) de T. Reesei (Figura 1), según Boehringer, DIG DNA Labelling y Detection Nonradioactive, Application Manual. Se realizó la hibridación a 68ºC. Se recogieron los clones positivos en tampón SM/cloroformo, y se purificaron con una segunda ronda de selección.

En estas condiciones se encontraron 11 clones positivos. El aislamiento del ADN lambda bacteriófago a gran escala se realizó según Sambrook y col., 1989. En: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. Se analizaron los ADN bacteriófagos mediante digestión del ADN con diversas enzimas de restricción. Basándose en el análisis de hibridación (usando como sonda el fragmento de xin2 de T. Reesei de 2,4 kb marcado con DIG) estos fagos se asignaron a tres clases: Ocho de los fagos analizados se pusieron en la clase A (fagos 1, 2, 3, 5, 6, 9, 10, 11), tres en la clase B (fagos 4, 8), y el fago 7 en la clase C (Tabla 1). Los fragmentos de fago 7 dieron una ligera hibridación con el gen xin2 de T. Reesei.

TABLA 1

1

En la base de los modelos de hibridación se ligaron los tres fragmentos siguientes al vector plásmido pUC19 (Yanish-Perron y col., Gene33. 103-119 (1985)) para su posterior análisis:

1.

Se aisló el fragmento EcoRI de 4,6 kb del fago 2 (clase A) y se ligó al vector pUC19 de EcoRI digerido y desfosforilado, resultando en el plásmido pALK1026;

2.

Se aisló el fragmento EcoRI de 6,0 kb del fago 4 (clase B) y se ligó al vector pUC19 de EcoRI digerido y desfosforilado, resultando en el plásmido pALK1028; y

3.

Se aisló el fragmento Xbal de 7,0 kb del fago 7 (clase C) y se ligó al vector pUC19 de Xbal digerido y desfosforilado, resultando en el plásmido pALK1049.

Se depositaron los plásmidos pALK1026, pALK1028 y pALK1049 en Deutsche Sammlung für Mikro-organismen (DSMZ) el 21 de junio de 1996 y se les asignó la denominación DSM11021, DSM11022 y DSM11023, respectivamente.

Ejemplo 3 Secuenciación de los genes de la xilanasa de clase A, B y C

Los plásmidos pALK1026, pALK1028 y pALK1049 se sometieron a otro análisis restrictivo. Las secuencias de los tres genes de xilanasa de Chaetomium thermophilum 730.95 se determinaron subclonando fragmentos de pALK1026, pALK1028 y pALK1049 en el vector pUC19.

El ADN se secuenció usando los kits ABI (Applied Biosystems, EEUU) basados en iniciadores M13 y M13rev marcados con fluorescente, o iniciadores de secuencia específica con dideoxinucleótidos marcados con fluorescente por el protocolo de secuenciación de ciclo iniciador de colorante Taq según las instrucciones del suministrador. Se realizaron reacciones de secuenciación a temperatura de recocido de 50ºC. Las reacciones de secuenciación se analizaron sobre secuenciador ABI 373A, y las secuencias obtenidas se caracterizaron usando el paquete de software Sequence Analysis de Genetics Computer Group, versión 7.2.

Las secuencias de ADN de los genes de xilanasa de las clases A, B y C de pALK1026, pALK1028 y pALK1049, respectivamente, se presentan en las Figuras 2-4. La secuenciación del gen de la xilanasa portado por el plásmido portador de la secuencia de xilanasa de clase A reveló una secuencia de 1281 bp (que se muestra en la Figura 2) y un ORF (marco de lectura libre) de 842 bp. La parte estructural tiene 783 bp de largo y la interrumpe un único intrón de 59 bp de longitud. El polipéptido derivado de la secuencia tiene una longitud de 261 aminoácidos. Tras la Ala19 se encuentra un sitio de procesamiento de la peptidasa señal putativa, y la proteína madura predicha tiene un peso molecular calculado de aproximadamente 26 kDa. La secuencia muestra elevada homología hacia las xilanasas de diferentes organismos. A nivel de aminoácido, la secuencia de aminoácidos codificada por este gen muestra un 77,2% de identidad en la superposición de 237 aminoácidos con el gen B de la xilanasa de Chaetomium gracile, CgXB (EMBL/GenBank databases/DDBJ; número de registro D49851).

La secuenciación del gen de la xilanasa portado por el plásmido portador de la secuencia de la xilanasa de clase B reveló una secuencia de 1174 bp (que se muestra en la Figura 3) y un ORF de 754 bp. La parte estructural tiene 690 bp de largo y la interrumpe un único intrón de 64 bp de longitud. El polipéptido derivado de la secuencia tiene una longitud de 230 aminoácidos. Tras la Ala16 se encuentra un sitio de procesamiento de peptidasa señal putativa, y la proteína madura predicha tiene un peso molecular calculado de aproximadamente 23 kDa. A nivel de aminoácido, la secuencia de aminoácidos codificada por este gen muestra un 70% de identidad en la superposición de 227 aminoácidos con el gen A de la xilanasa de Chaetomium gracile, CgXA (EMBL/GenBank databases/DDBJ; número de registro D49850).

La secuenciación del gen de la xilanasa portado por el plásmido portador de la secuencia de la xilanasa de clase C reveló una secuencia de 1142 bp (que se muestra en la Figura 4) y un ORF de 746 bp. La parte estructural tiene 672 bp de largo y la interrumpe un único intrón de 74 bp de longitud. El polipéptido derivado de la secuencia tiene una longitud de 224 aminoácidos. Tras la Thr18 se encuentra un sitio de procesamiento de peptidasa señal putativa, y la proteína madura predicha tiene un peso molecular calculado de aproximadamente 23 kDa. A nivel de aminoácido, la secuencia de aminoácidos codificada por este gen muestra un 51,7% de identidad en la superposición de 180 aminoácidos con el gen de la xilanasa de Aspergillus nidulans, (EMBL/GenBank databases/DDBJ; número de registro Z49892).

A nivel de aminoácido, la secuencia de Clase A tiene un 67,4% de identidad en la superposición de 190 aminoácidos con la secuencia de clase B, y un 42,2% de identidad en la superposición de 211 aminoácidos con la secuencia de clase C. La identidad entre las secuencias de clase B y de clase C es del 50,6% en una superposición de 172 aminoácidos. Así las tres xilanasas de la invención son diferentes, y se denominan xinA, xinB y xinC, respectivamente.

A nivel de aminoácido las xilanasas codificadas por xinA, xinB y xinC exhiben mucha homología con las xilanasas de la familia G según la clasificación de Gilkes y col., Microbiol. Rev. 55:303-315 (1991).

Ejemplo 4 Producción de xilanasas A, B y C de Chaetomium thermophilum en T. reesei

Se construyeron cadenas de Trichoderma reesei para la producción de la xilanasa de Chaetomium thermophilum CBS 730,95. Las cadena producen xilanasa de Chaetomium en exceso en un medio deficiente en celulasa. Dichas preparaciones deficientes en actividad celulolítica, y la realización de las mismas por procedimientos de ADN recombinante, se describen en el documento US5.298.405 o Suominen y col., Mol. Gen. Genet. 241:523-530 (1993). Para la sobreproducción de la xilanasa de Chaetomium, se expresaron los genes xinA, xinB y xinC del promotor fuerte cbhl de T. reesei.

Los plásmidos pALK1108, pALK1111 y pALK1113 (Figuras 5-7) que se usaron en la construcción de las cadenas superproductoras de xilanasa de Chaetomium, son sin embargo idénticas unas de otras, excepto que las secuencias de Chaetomium difieren.

Los plásmidos pALK1108, pALK1111 y pALK1113 contienen:

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promotor de cbhl (celobiohidrolasa 1): El promotor es de Trichoderma reesei VTT-D-80133 (Teerl y col., Biol. Technology 1:696-699 (1983)). Se usa el fragmento EcoRI-SacII de 2,2 kb (Karhunen y col., Mol. Gen. Genet. 241:515-522 (1993)) en las construcciones. La secuencia que precede a ATG la publicó Shoemaker y col., Biol. Technology 1. 691-696 (1983). En la cadena VTT-D-80133 de T. reesei la secuencia que precede a ATG es CCGCGGACTGCGCATC (el sitio SacII está subrayado, una citosina adicional en la secuencia de ADN, comparada con la secuencia de Shoemaker y col., está en negrita).

Para hacer una fusión exacta, los 10 nucleótidos del promotor, del sitio SacII a ATG, y el extremo 5' del xinA o xinB (a los sitios Xhol internos, véase las Figuras 5 y 6) se sintetizaron usando una reacción en cadena de polimerasa (PCR). La fusión exacta del xinC al promotor también se realizó mediante PCR, en este caso se sintetizó el gen xinC completo.

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genes xinA, xinB y xinC: Las secuencias de nucleótidos y secuencias de aminoácidos deducidas de los genes de xilanasa de C. thermophilum se presentan en las Figuras 2-4. Los genes se clonaron de una librería genómica de C. thermophilum CBS 730,95 en base a la hibridación al gen xin2 de T. reesei. Se usó un fragmento de 1084 bp del codón de INICIO ATG al sitio Stul 239 bps tras el final del gen xinA en la construcción del plásmido pALK1108. Se usó un fragmento de 965 bp del ATG al sitio Xhol de 209 bps tas el final del gen xinC en la construcción del plásmido pALK1111. Se usó un fragmento de 977 bp del ATG a 225 bps tras el final del gen xinC para la construcción del plásmido pALK1113. Los fragmentos de los genes xinA y xinB (del sitio Xhol interno, véase abajo) son ADN genómicos aislados de los plásmidos pALK1026 y pALK1028. El xinC se sintetizó mediante PCR usando pALK1049 como patrón.

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Terminador cbh1: Se añadió el fragmento AvaII de 739 bp (Karhunen y col., Mol. Gen. Genet. 241:515-522 (1993)) empezando 113 bp antes del FIN del gen cbhl tras los genes xinA, xinB y xinC, para asegurar la terminación de la transcripción.

\bullet

Gen amdS: El gen se aisló de Aspergillus nidulans VH 1-TRSX6. Codifica la acetamidasa (Hynes y col., Mol. Cell. Biol. 3: 1430-1439 (1983)). La acetamidasa permite a la cadena crecer usando acetamida como única fuente de nitrógeno y esta característica se usó para seleccionar transformantes. El fragmento de 3,1 kb (SpeI-XbaI) del plásmido p3SR2 (Kelly J. y Hynes M., EMBO J. 4:475-479 (1985)) se usó en los plásmidos. El fragmento contiene 1007 bps del área promotora, 1897 bps de la región codificadora (incluidos los intrones) y los 183 bps del área de terminación del gen amdS.

\bullet

Fragmento 3' de cbhl: El fragmento se aisló de T. reesei ALK02466 usando un rescate plásmido (1,7 kb, BamHI-EcoRI, empezando 1,4 kb tras el FINAL del gen, Suominen y col., Mol. Gen. Genet. 241: 523-530). La cadena ALK02466 deriva de la cadena ALKO233 (Harkki y col., Enzyme Microb. Technol. 13: 227-233 (1991)).

El fragmento 3' de cbhl se usó junto con el promotor cbhl para dirigir los cassettes de expresión de xinA, xinB y xinC en el sitio cbhl mediante recombinación homóloga.

Los cassettes de expresión para los genes xinA, xinB y xinC de C. thermophilum se aislaron por la digestión de EcoRI de los plásmidos pALK1108, pALK1111 y pALK1113, respectivamente.

La cadena ALK04468 (deficiente en EGI y EGII) de T. reesei se transformó con los cassettes de expresión aislados: fragmento EcoRI de 8,8 kb de pALK1108, fragmento EcoRI de 8,7 kb de pALK1111 y fragmento EcoRI de 8,7 kb de pALK1113. La transformación se realizó como describe Penttilä y col., Gene 61: 155-164 (1987) con las modificaciones descritas en Karhunen y col., Mol. Gen. Genet. 241: 515-522 (1993). Los transformantes de T. reesei se transfirieron a un medio selectivo y se purificaron con conidia.

En la cadena huésped ALK04488 se ha sustituido el gen de la endoglucanasa 2 (egl2) por el fragmento BghI-XbaI de 3,3 kb del plásmido pAN8-1 (Mattern y col., Fungal Genet. Newlett. 35:25 (1988)). Este fragmento contiene un gen marcador de la transformación, ble de Streptoalloteichus hindustanus (Drocourt y col., Nucl. Acids Res. 18: 4009 (1990)). El gen ble confiere resistencia a diversos antibióticos, por ejemplo fleomicina y, en la construcción, se expresa del promotor gpdA (gliceraldehido-3 fosfato deshidrogenasa) de Aspergillus nidulans, el terminador trpC de A. Nidulans se usa para finalizar la transcripción. La sustitución se hizo usando procedimientos de ADN recombinante descritos en el documento US5.298.405. Además, el gen de la endoglucanasa 1 (egl1) se ha sustituido por el fragmento NotI-NslI de 1,7 kb de pRLM_{ex}30 (Mach y col., Curr. Genet. 25: 567-570 (1994)) que contiene el promotor de la piruvato quinasa (pkl) de 0,7 kb de Aspergillus nidulans y el gen de la higromicina B fosfotransferasa (hph) de 1,0 kb aislado de Escherichia coli. El gen hph confiere resistencia a la higromicina.

Los procedimientos de ADN estándares descritos por Sambrook y col. (1989) en: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^{nd} ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. se usaron en la construcción de vectores. Las enzimas restrictivas, T4 ADN ligasa, fragmento Klenow de la ADN polimerasa I, T4 ADN polimerasa, polinucleótido quinasa y Taq polimerasa eran de Boehringer (Mannheim, Alemania) y New England Biolabs (EEUU). Cada enzima se usó según las instrucciones del suministrador. El ADN plásmido se aisló usando columnas Qiagen (Qiagen GmbH, Alemania) o Promega Magic Minipreps (Promega, EEUU) según los protocolos del fabricante. Los oligonucleótidos usados en las reacciones PCR y en las reacciones de secuenciación se sintetizaron con un Sintetizador de ADN ABI (Applied Biosystems, EEUU) 381A. La secuenciación de ADN se realizó usando kits ABI basados en iniciadores marcados con fluorescente, o cuando se usan iniciadores de secuencia específicos, en dideoxinucleótidos marcados con fluorescente, mediante el procedimiento de secuenciación cíclica Taq según las instrucciones del suministrador. Se analizaron las reacciones de secuenciación en un secuenciador ABI 373A.

Se aislaron fragmentos de ADN para la clonación o transformación de geles de agarosa usando el Kit de Extracción en Gel Qiaex II (Qiagen GmbH, Alemania) según las instrucciones del suministrador.

Ejemplo 5 Características de los transformantes productores de xilanasa de Chaetomium

Para seleccionar para la producción de XLNA, XLNB y XLNC recombinante, se cultivaron transformantes de T. reesei en vasos agitadores en un medio que contenía suero al 4%, fuente de nitrógeno compleja al 1,5% derivada de grano, PO_{4}KH_{2} al 1,5% y SO_{4}(NH_{4})_{2} al 0,5%. Los cultivos se mantuvieron a 30ºC y 250 rpm durante 7 días.

La actividad xilanasa de los transformantes se determinó según Bailey y col., J. Biotechnol. 23: 257-270 (1992) excepto que el ensayo se realizó a pH 6,5, 60ºC con un tiempo de incubación de 60 min en tampón McIlvain 50 mM. Se usó xilana de abedul (Roth 7500) al 1% (p/v) como sustrato. Se define una unidad de xilanasa (1 nkat) como la cantidad de enzima que produce la reducción de los hidratos de carbono que tienen una fuerza de reducción correspondiente a un nmol de xilosa en un segundo de xilana de abedul en las condiciones de ensayo deseadas.

El fenotipo CBHI de los transformantes se analizó mediante tinción de puntos. Se tiñeron los sobrenadantes de cultivo de vasos agitadores en filtros de nitrocelulosa mediante un aparato tinción por puntos. Se detectó el CBHI mediante immunocoloración usando un anticuerpo CI-258 monoclonal específico de CBHI (Aho y col., Eur. J. Biochem, 200: 643-649 (1991)) y el sistema ProtoBlot Western blot AP (Promega, EEUU) según las recomendaciones del fabricante. Luego se caracterizaron los transformantes deficientes en CBHI.

Se verificaron los números de integración y copia de los cassettes de transformación en hibridaciones Southern. En los transformantes ALK04468 caracterizados el gen cbhl se sustituyó por el gen marcador de amdS y la construcción xinA, xinB y xinC del cassette de expresión de pALK1108, pALK1111 o pALK1113, respectivamente. La cadena ALK04468 del huésped de transformación carece de genes egl2 y egl1 (véase el Ejemplo 4) y tras la sustitución del cassette de expresión en el sitio cbhl, los transformantes ALK04468 caracterizados no producen los componentes EGII, EGI y CBHI de la celulasa de Trichoderma.

Se seleccionaron los transformantes negativos de CBHI con las actividades xilanasa más elevadas para cultivos en un 1 l de fermentadores de laboratorio (Braun Biostat® M, Alemania). Se cultivaron transformantes productores de XLNA y XLNB en fermentadores de laboratorio a pH 4,4 \pm 0,4, transformantes productores de XLNC a pH 5,2 \pm 0,4.

Las actividades de la xilanasa se determinaron según Bailey y col., J. Biotechnol. 23: 257-270 (1992) excepto que los ensayos se realizaron a pH 5,3, 50ºC, 5 min en tampón citrato sódico 50 mM o a pH 6, 60ºC o pH 7, 70ºC con un tiempo de incubación de 5 min o 60 min en tampón McIlvain 50 mM. Se usó xilana de abedul (Roth 7500) al 1% (p/v) como sustrato. Los transformantes con la mayor producción de xilanasa de XLNA, XLNB y XLNC se muestran en la Tabla 2.

La actividad xilanasa de la cadena del huésped T. reesei ALK04468 a pH 7, 70ºC, 60 min se estableció artificialmente de nkats a valor 1. Los otros valores son actividades relativas comparadas con este valor artificial.

La mayor actividad de la xilanasa de la cadena huésped de T. reesei se obtuvo a pH 5,3, 50ºC. En estas condiciones las actividades xilanasa de los transformantes productores de las xilanasas XLNA, XLNB o XLNC de C. thermophilum CBS730,95 eran 4-7 veces más elevadas (590, 489 y 351 XU) que la de la cadena ALK04468 huésped (86 XU).

Se obtuvieron actividades xilanasa considerablemente más altas para XLNA y XLNB cuando se midió la actividad a pH 6, 60ºC, 5 min (820 y 755 XU) o a pH 7, 70ºC, 5 min (1.188 y 841 XU). A pH 7, 70ºC, 5 min las actividades fueron 84 y 120 veces mayores que la de la cadena huésped ALK04468; comparado con la cadena ALK04265 donante del gen xinA y xinB, las actividades fueron 100 y 150 veces mayores.

XLNA y XLNB parecen ser termotolerantes. XLNA retuvo el 88% (721 XU) de su actividad a pH 6, 60ºC y el 62% (740 XU) de su actividad a pH 7, 70ºC cuando se aumentó el tiempo de incubación de 5 a 60 minutos. En las mismas condiciones XLNB retuvo el 65% (491 XU) y el 17% (143 XU) de su actividad.

XLNC difirió de XLNA y XLNB. Tenía mayor actividad a pH 5,3, 50ºC, 5 min, comparado con pH 7, 70ºC, 5 min.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 2

2

Se determinó la dependencia del pH y térmica de los XLNA, XLNB y XLNC de C. Thermophilum CBS730.95 producidos por T. Reesei. Se diluyeron muestras de los sobrenadantes del cultivo en tampón McIlvain 50 mM de pH correspondiente en un intervalo de pH de 4,2-8,0. Se midieron las dependencias térmicas en un intervalo de 40-80ºC. Se determinaron las actividades tras 5 minutos de incubación. Los perfiles de pH se muestran en la Figura 8 y los perfiles de temperatura en la Figura 9.

El XLNA recombinante era más termofílico que XLNB. A pH aproximadamente 5-6 XLNA mostró la máxima actividad a 70-80ºC; a aproximadamente pH 7 la máxima actividad se observó a 70ºC; se observó una actividad considerable a pH 8, 70ºC. El XLNB recombinante mostró actividad máxima a aproximadamente pH 5-7, 50-70ºC. Ni XLNA ni XLNB mostraron actividad xilanasa notable a pH 4.

Así, como evidencia de los datos arriba indicados, las enzimas actuales se pueden usar en particular en la región de pH neutro e incluso a valores de pH moderadamente alcalinos. Esta característica hace que la enzima sea muy útil en secuencias de blanqueado de ECF y TCF modems. En particular, se pueden combinar los tratamientos enzimáticos con las actuales xilanasas con etapas de extracción/lavado alcalinas (E, E_{p}, E_{Q}) y etapas de tratamiento con peróxido (P). Dicha característica también es bastante inesperada, porque las xilanasas fúngicas conocidas generalmente son activas a pH más bajo.

XLNC era menos termófilo que XLNA y XLNB. XLNC tenía su óptimo a 60ºC, a pH 4-6.

La expresión de las xilanasas XLNA, XLNB y XLNC de C. Thermophilum CBS730.95 producidas por T. Reesei ALKO4468 se verificó mediante análisis por electroforesis en gel de poliacrilamida SDS (PAGE)(Figura 10). Las muestras que contienen 30 \mug del total de la proteína secretada se pasaron por gel al 12% y se visualizaron con tinción azul brillante Coomassie. Las tres xilanasas de C. Thermophilum CBS730.95 se expresaron en cantidades considerables en T. Reesei ALKO4468.

Ejemplo 6 Proteínas de fusión

Se prepara un vector recombinante codificando el gen de la xilanasa mediante fusión de la secuencia que codifica la xilanasa con la secuencia de la celulasa o hemicelulasa de Trichoderma o al menos un dominio funcional de dicha celulasa o hemicelulasa, como se describe en el documento US5.298.405, WO 93/24621 y en la submission L25310 GenBank. Especialmente, se selecciona la enzima del grupo formado por CBHI, CBHII, EGI, EGII, XYLI, XYLII y MANI, o un dominio de los mismos, como la señal de secreción o la secuencia del núcleo.

Se pueden construir proteínas de fusión que contienen un dominio nuclear de mananasa o celobiohidrolasa o endoglucanasa N-terminal o los dominios nuclear y bisagra de las mismas, unido a la secuencia xilanasa de Chaetomium. El resultado es una proteína que contiene una región nuclear o regiones nuclear y bisagra de mananasa o celobiohidrolasa o endoglucanasa N-terminal, y una xilanasa de Chaetomium C-terminal. La proteína de fusión contiene las actividades mananasa o celobiohidrolasa o endoglucanasa y xilanasa de los diversos dominios como se muestra en la construcción de fusión. El polipéptido vehículo no necesita tener actividad enzimática o su actividad se puede inactivar.

Las proteínas de fusión también se pueden construir de forma que la cola de mananasa o celobiohidrolasa o endoglucanasa o un fragmento deseado de los mismos, se incluye, situado delante de la secuencia xilanasa de Chaetomium, especialmente para permitir el uso de un sitio proteasa no específico en la cola como sitio proteasa para la recuperación de la secuencia xilanasa de la proteína de fusión expresada. Alternativamente, las proteínas de fusión se pueden construir de forma que aporten un sitio proteasa en un enlazador situado antes de la xilanasa de Chaetomium, con o sin secuencias cola.

Las xilanasas de Chaetomium también se pueden usar como la parte N-terminal de la proteína de fusión, como se describe arriba, para la producción de cualquier proteína que se quiera. En este caso, la región de unión se puede construir usando la estrategia descrita arriba.

Se pueden crear nuevas propiedades para las xilanasas uniendo dominios, como un dominio de unión de celulosa (CBD), preferentemente con su enlazador, a las xilanasas de la invención. Preferentemente, dichos CBD y enlazadores son los dominios CBD y enlazador correspondientes de una celulasa o mananasa de Trichoderma, y, más preferentemente, el de una celulasa o mananasa de Trichoderma reesei.

Ejemplo 7 Huéspedes

La construcción recombinante codificando las proteínas deseadas o proteínas de fusión se preparan como arriba, y se transforma en un hongo filamentoso como Aspergillus spp., o Trichoderma spp., preferentemente T. reesei.

Ejemplo 8 Blanqueado TCF de pasta de madera blanda usando las xilanasas XLNA y XLNB de Chaetomium thermophilum secretadas de Trichoderma

Se llevó a cabo un experimento de blanqueado para determinar la utilidad de las xilanasas XLNA y XLNB de Chaetomium thermophilum CBS 730,95 secretada de Trichoderma en un blanqueado TCF (totalmente libre de cloro) de pasta kraft.

Se añadieron medios usados de cultivos de las xilanasas XLNA y XLNB secretoras del huésped de Trichoderma (Ejemplo 5) a la pasta kraft de madera blanda delignificada con oxígeno escandinava (kappa número 20, 34% de brillo) en la cantidad de 100 nkat/g de materia seca de la pasta. Se midió la actividad xilanasa expresada como nkat según Bailey y col., J. Biotechnol. 23:257-270 (1992) usando xilana de abedul Roth (nº 7500) como sustrato a 70ºC, pH 7,0 con un tiempo de incubación de 5 minutos. Los tratamientos enzimáticos se realizaron a pH 7 y 70ºC durante una hora. La pasta de referencia se trató de la misma manera pero sin adición de enzima. Se realizó el blanqueado con secuencia QP para probar la respuesta del tratamiento enzimático en blanqueado basado en peróxido (Q indica etapa de quelación y P etapa de peróxido). Las secuencias de blanqueado también pueden incluir típicamente más de una etapa de peróxido (P), al igual que diferentes etapas de extracción (como E, EQ, EOP, etapas de ozono (2), etapas de peróxido presurizado (OP), etc.; E indica extracción alcalina, O oxígeno). La etapa de quelación (Q) y la etapa de peróxido de hidrógeno (P) se llevaron a cabo en las condiciones mencionadas en la Tabla 3. Las sustancias químicas blanqueadoras en la etapa P eran las siguientes: H_{2}O_{2} al 3%, OHNa al 3%, ácido dietilentriaminopentaacético al 0,2% (DTPA) y SO_{4}Mg al 0,5%. Los resultados del experimento de blanqueado se muestran en la Tabla 3.

TABLA 3

3

Como se puede observar en la Tabla 3, tras el pretratamiento con medio de cultivo usado de Trichoderma que contiene las xilanasas XLNA y XLNB de Chaetomium thermophilum CBS 730,95, las pastas finales tenían valores de brillo de 1,0 a 0,5 unidades más altos que la referencia. Las condiciones en el pretratamiento enzimático no eran óptimas para XLNB (véase la Tabla 2), y así se obtuvo un valor de brillo menor, comparado con XLNA. En las condiciones usadas las xilanasas de T. reesei no son activas (Tabla 2) y no tienen ningún efecto en el brillo obtenido.

No se incrementó la cantidad de peróxido consumida. Los tratamientos enzimáticos no afectaron a la viscosidad de las pastas debido a la baja actividad degradante de celulosa.

Ejemplo 9 Blanqueado TCF de pasta de madera dura usando las Xilanasas XLNA y XLNB de Chaetomium thermophilum CBS730,95 excretadas de Trichoderma al igual que la actividad xilanasa que contiene medio de cultivo usado de C. thermophilum CBS 730,95

Se realizó un experimento de blanqueado para determinar la utilidad de las xilanasas XLNA y XLNB de Chaetomium thermophilum CBS 730,95 secretada de Trichoderma y las actividades xilanasa del medio de cultivo usado de Chaetomium thermophilum CBS 730,95 en un blanqueado TCF de pasta kraft de madera dura.

Se añadieron medios usados de cultivos de las xilanasas XLNA y XLNB secretoras del huésped de Trichoderma (Ejemplo 5) al igual que de C. thermophilum CBS 730,95 a pasta kraft de madera dura lavada escandinava (kappa número 8,9) en la cantidad de 100 nkat/g de materia seca de pasta. Se midió la actividad xilanasa expresada como nkat según Bailey y col., J. Biotechnol. 23: 257-270 (1992) usando xilana de madera de abedul Roth (nº 7500) como sustrato a 70ºC, pH 7,0 con un tiempo de incubación de 5 minutos. Se realizaron los tratamientos enzimáticos a pH 7 y 70ºC durante una hora. La pasta de referencia se trató de la misma manera pero sin adición de enzima. Se realizó el blanqueado con secuencia QP. La etapa de quelación (Q) y la etapa de peróxido de hidrógeno (P) se llevaron a cabo en las condiciones mencionadas en la Tabla 4. Las sustancias químicas blanqueadoras en la etapa P eran las siguientes: H_{2}O_{2} al 3%, OHNa al 3%, ácido dietilentriaminopentaacético al 0,2% (DTPA) y SO_{4}Mg al 0,5%. Los resultados de los experimentos de blanqueado se muestran en la Tabla 4.

TABLA 4

4

Se obtuvieron valores de brillo mayores cuando las xilanasas XLNA y XLNB de Chaetomium thermophilum CBS 730,95, secretadas de cadenas de T. reesei recombinantes, eran valores usados, comparados con el medio de cultivo usado de Chaetium thermophilum CBS 730,95. Como se puede ver en la Tabla 4, tras el pretratamiento con medio de cultivo usado de Trichoderma que contiene XLNA y XLNB, las pastas finales tenían valores de brillo de 1,4 a 0,5 unidades mayores que la referencia. El medio de cultivo usado de C. thermophilum CBS730,95 que contiene diversas actividades xilanasa tenía sólo un efecto menor en el brillo con la cantidad usada de actividad xilanasa (0,3 unidades). La cantidad de peróxido consumido no se incrementó. Los tratamientos enzimáticos con XLNA y XLNB no afectaron a la viscosidad de las pastas debido a la baja actividad degradante de celulosa.

Las xilanasas XLNA y XLNB producidas separadamente en la cadena huésped de T. reesei dieron mayor brillo que el medio de cultivo de C. thermophilum CBS 730,95. El medio de cultivo de C. thermophilum CBS 730,95 contiene diversas xilanasas que no parecen ser tan efectivas en la aplicación.

Ejemplo 10 Experimento de blanqueado usando xilanasas de Chaetomium thermophilum secretadas de Trichoderma y sustancias químicas cloradas

Se puede realizar un experimento de blanqueado para determinar la utilidad de xilanasas de Chaetomium thermophilum CBS 730,95 secretadas de Trichoderma en el blanqueado libre de cloro elemental (ECF) o que contiene cloro de la pasta.

Se añaden medios usados de cultivos de las xilanasas de Chaetomium thermophilum CBS 730,95 secretoras del huésped de Trichoderma a pasta de madera dura o blanda en la cantidad de 20-200 nkat/g de materia seca de pasta. Los tratamientos enzimáticos se realizan a pH 5-8 y a 50-80ºC durante una a tres horas. La pasta de referencia se mantiene en las mismas condiciones sin adición de enzima. Tras los tratamientos enzimáticos se realiza el blanqueado por ejemplo con secuencia C/DEDED o DEDED, donde C representa cloro elemental, D representa un tratamiento con dióxido de cloro y E representa la extracción alcalina.

Habiendo descrito ya totalmente la invención, aquellos expertos en la técnica entenderán que la invención se puede realizar dentro de un intervalo de condiciones, parámetros y otros amplio y equivalente, sin afectar el espíritu o alcance de la invención o cualquier realización de la misma. Todas las referencias citadas en la presente memoria descriptiva se incorporan totalmente a la presente memoria descriptiva por referencia.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i)

SOLICITANTE:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE: Primalco Ltd.

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

CALLE: Valta-akseli

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(C)

CIUDAD: Nurmijarvi

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(D)

PAÍS: Finlandia

\vskip0.333000\baselineskip

(E)

CÓDIGO POSTAL (ZIP): FIN-05200

\vskip0.333000\baselineskip

(F)

TELÉFONO: +358 9 13311

\vskip0.333000\baselineskip

(G)

TELEFAX: +358 9 133 1546

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Nuevas xilanasas, genes que las codifican, y usos de las mismas.

\vskip0.666000\baselineskip

(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 6

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(iv)

FORMATO DE ORDENADOR LEGIBLE:

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(A)

TIPO MEDIO: Diskette

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: PC IBM Compatible

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

PROGRAMAS: PatentIn Release #1.0, Versión #1.30 (EPO)

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA IDENTIFICADA Nº 1:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1281 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Chaetomium thermophilum

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

CADENA: CBS730,95

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: exon

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(B)

SITUACIÓN: 195..423

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

OTRA INFORMACIÓN:/producto= "XLNA"

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: exon

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

SITUACIÓN: 483..1039

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

OTRA INFORMACIÓN:/producto= "XLNA"

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEQ Nº: 1:

5

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA IDENTIFICADA Nº: 2:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 261 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Chaetomium thermophilum

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

CADENA: CBS730,95

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE:Proteína

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

SITUACIÓN: 1..261

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

OTRA INFORMACIÓN:/etiqueta= XLNA

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEQ Nº: 2:

6

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA Nº: 3:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\newpage

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1174 pares de bases

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(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Chaetomium thermophilum

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

CADENA: CBS730,95

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

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(A)

NOMBRE/CLAVE: exon

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

SITUACIÓN: 204..472

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

OTRA INFORMACIÓN:/producto= "XLNB"

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: exon

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

SITUACIÓN: 537..960

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

OTRA INFORMACIÓN:/producto= "XLNB"

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 3:

\vskip1.000000\baselineskip

7

8

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA IDENTIFICADA Nº: 4:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 230 aminoácidos

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(B)

TIPO: aminoácido

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(C)

CADENA: sencilla

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Chaetomium thermophilum

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

CADENA: CBS730,95

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: Proteína

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(B)

SITUACIÓN: 1..230

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(D)

OTRA INFORMACIÓN:/etiqueta= XLNB

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 4:

\vskip1.000000\baselineskip

9

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA IDENTIFICADA Nº: 5:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1142 pares de bases

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(B)

TIPO: ácido nucleico

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(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLECULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Chaetomium thermophilum

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

CADENA: CBS730,95

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: exon

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

SITUACIÓN: 169..425

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN:/producto= "XLNC"

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(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: exon

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

SITUACIÓN: 500..917

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN:/producto= "XLNC"

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 5:

\vskip1.000000\baselineskip

10

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA IDENTIFICADA Nº: 6:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 224 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

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(A)

ORGANISMO: Chaetomium thermophilum

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

CADENA: CBS730,95

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

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(A)

NOMBRE/CLAVE: Proteína

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

SITUACIÓN: 1..224

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(C)

OTRA INFORMACIÓN:/etiqueta= XLNC

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 6:

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12

13

14

15

16

17

Claims (35)

1. Una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene la actividad enzimática de una xilanasa, seleccionada del grupo formado por:

(a)

moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácido como se describe en la Figura 2;

(b)

moléculas de ácido nucleico que comprenden la secuencia codificadora de la secuencia de nucleótidos como se describe en la Figura 2;

(c)

moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos codificada por el ADN insertado contenido en DSM 11021;

(d)

moléculas de ácido nucleico que comprenden la secuencia codificadora del ADN insertado contenido en DSM 11021;

(e)

moléculas de ácido nucleico cuya secuencia codificadora difiere de la secuencia codificadora de una molécula de ácido nucleico de cualquiera de (a) a (d) debido a la degeneración del código genético;

(f)

moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que tiene actividad xilanasa y que tiene una secuencia de aminoácidos que muestra al menos un 80% de identidad con una secuencia como se describe en la Figura 2.

2. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1 que codifica un polipéptido que tiene una temperatura óptima de más de 50ºC.

3. La molécula de ácido nucleico según las reivindicaciones 1 y 2 que codifica un polipéptido que tiene una temperatura óptima de más de 50ºC a pH 4 a 8.

4. La molécula de ácido nucleico según las reivindicaciones 1 a 3 que codifica un polipéptido que tiene una temperatura óptima de más de 50ºC a pH 5 a 7.

5. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1 que es ARN.

6. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1 que es ADN.

7. El ADN de la reivindicación 4 que es ADN genómico o ADNc.

8. Un vector que contiene una molécula de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

9. El vector de la reivindicación 8, en el que la molécula de ácido nucleico está unida operativamente a secuencias de control de expresión permitiendo la expresión en células huésped procariotas o eucariotas.

10. Una célula huésped transformada con una molécula de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 o con un vector de la reivindicación 8 ó 9.

11. La célula huésped de la reivindicación 10 que pertenece a hongos filamentosos.

12. La célula huésped de las reivindicaciones 10 a 11 que pertenece al género Trichoderma o Aspergillus.

13. La célula huésped de la reivindicación 12 que es Trichoderma reesei.

14. Un procedimiento para la producción de un polipéptido que tiene actividad xilanasa que comprende las etapas de cultivo de la célula huésped de cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13 y recuperando el polipéptido del medio de cultivo.

15. Un polipéptido que tiene actividad xilanasa codificado por una molécula de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, un vector de la reivindicación 8 ó 9 y obtenible por el procedimiento de la reivindicación 14.

16. Un procedimiento para la preparación de una preparación enzimática que comprende un polipéptido de la reivindicación 15 que comprende las etapas de cultivo de una célula huésped de cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13 y recuperando el polipéptido de las células o separando las células del medio de cultivo y obteniendo el sobrenadante.

17. Una preparación enzimática obtenible por el procedimiento de la reivindicación 16.

18. La preparación enzimática de la reivindicación 17, que es líquida.

19. La preparación enzimática de la reivindicación 17, que es seca.

20. La preparación enzimática de la reivindicación 17, en la que dicho sobrenadante se ha concentrado.

21. Un procedimiento para tratar pasta o fibra derivada de madera, que comprende la etapa de adición de una preparación enzimática de cualquiera de las reivindicaciones 17 a 20 a pasta mecánica o química derivada de madera o fibra secundaria.

22. Un procedimiento de blanqueado de pasta, que comprende la etapa de contactar dicha pasta con una preparación enzimática de cualquiera de las reivindicaciones 17 a 20.

23. Un procedimiento para mejorar la calidad del alimento animal, que comprende el tratamiento del material de las plantas con una preparación enzimática de cualquiera de las reivindicaciones 17 a 20.

24. Un procedimiento de cocción, que comprende la adición de una preparación enzimática de cualquiera de las reivindicaciones 17 a 20 a harina usada en la preparación de la masa.

25. Uso de una preparación enzimática según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 20 en la degradación de sustrato que contiene xilana.

26. Uso de una preparación enzimática según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 20 en la preparación de forraje animal.

27. Una composición de forraje animal que comprende una preparación enzimática según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 20.

28. Uso de una preparación enzimática según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 20 en una masa para la preparación de panes.

29. Una composición de harina que comprende una preparación enzimática según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 20.

30. Una composición de una masa que comprende una preparación enzimática según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 20 como componente para mejorar el pan.

31. Uso de una preparación enzimática según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 20 en la producción de pasta de madera.

32. Uso de una preparación enzimática según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 20 en el blanqueado de pasta de madera.

33. Uso de una preparación enzimática según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 20 y de la reivindicación 29 en el blanqueado de pasta de madera química o mecánica.

34. Uso de una preparación enzimática según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 20 para el tratamiento de pasta derivada de madera.

35. Uso de una preparación enzimática según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 20 y de la reivindicación 31 para el tratamiento de fibras químicas, mecánicas o secundarias.