ES2384276T3 - Proteínas de fusión de celulasas y uso de las mismas - Google Patents
Proteínas de fusión de celulasas y uso de las mismas Download PDFInfo
- Publication number
- ES2384276T3 ES2384276T3 ES07730683T ES07730683T ES2384276T3 ES 2384276 T3 ES2384276 T3 ES 2384276T3 ES 07730683 T ES07730683 T ES 07730683T ES 07730683 T ES07730683 T ES 07730683T ES 2384276 T3 ES2384276 T3 ES 2384276T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- fusion protein
- cellulase
- seq
- ctcbd
- sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 108010059892 Cellulase Proteins 0.000 title claims abstract description 187
- 229940106157 cellulase Drugs 0.000 title claims abstract description 121
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 title claims abstract description 85
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 title claims abstract description 85
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 62
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 claims abstract description 48
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 claims abstract description 47
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims abstract description 26
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 24
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 14
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 12
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 65
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 60
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 60
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 claims description 60
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims description 37
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 35
- 235000013305 food Nutrition 0.000 claims description 29
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 29
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 29
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 28
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 17
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 15
- 239000004753 textile Substances 0.000 claims description 15
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 14
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 13
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 10
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 10
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 10
- 239000000835 fiber Substances 0.000 claims description 8
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 8
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 6
- 101150052795 cbh-1 gene Proteins 0.000 claims description 5
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000002023 wood Substances 0.000 claims description 2
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 64
- 235000010980 cellulose Nutrition 0.000 description 42
- 108010084185 Cellulases Proteins 0.000 description 38
- 102000005575 Cellulases Human genes 0.000 description 38
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 30
- 101710126559 Endoglucanase EG-II Proteins 0.000 description 29
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 26
- 241000228182 Thermoascus aurantiacus Species 0.000 description 22
- 101710098247 Exoglucanase 1 Proteins 0.000 description 20
- 239000004575 stone Substances 0.000 description 19
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 16
- 238000005469 granulation Methods 0.000 description 16
- 230000003179 granulation Effects 0.000 description 16
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 16
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 15
- 241000499912 Trichoderma reesei Species 0.000 description 14
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 14
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 14
- 241001248634 Chaetomium thermophilum Species 0.000 description 13
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 13
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 description 13
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 108010008885 Cellulose 1,4-beta-Cellobiosidase Proteins 0.000 description 12
- 241000259810 Acremonium thermophilum Species 0.000 description 11
- 230000006399 behavior Effects 0.000 description 11
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 11
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 11
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 11
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 10
- 239000008262 pumice Substances 0.000 description 10
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 10
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 10
- 241000223259 Trichoderma Species 0.000 description 9
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 9
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 9
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 9
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 9
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 9
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 9
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 9
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 9
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 8
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 8
- COHYTHOBJLSHDF-UHFFFAOYSA-N indigo powder Natural products N1C2=CC=CC=C2C(=O)C1=C1C(=O)C2=CC=CC=C2N1 COHYTHOBJLSHDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000008569 process Effects 0.000 description 8
- 101710130006 Beta-glucanase Proteins 0.000 description 7
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 7
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 7
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 7
- 229920002498 Beta-glucan Polymers 0.000 description 6
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 description 6
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 6
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 6
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 6
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 6
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 5
- 235000000177 Indigofera tinctoria Nutrition 0.000 description 5
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 5
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 5
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 5
- 229940079919 digestives enzyme preparation Drugs 0.000 description 5
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 5
- 229940097275 indigo Drugs 0.000 description 5
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 5
- 101710098246 Exoglucanase 2 Proteins 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 4
- 229920001131 Pulp (paper) Polymers 0.000 description 4
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 4
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 4
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 4
- 108010091384 endoglucanase 2 Proteins 0.000 description 4
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 4
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 4
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 4
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 4
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 4
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 4
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 4
- 108700038091 Beta-glucanases Proteins 0.000 description 3
- 101100176947 Cellvibrio japonicus (strain Ueda107) celB gene Proteins 0.000 description 3
- GUBGYTABKSRVRQ-CUHNMECISA-N D-Cellobiose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-CUHNMECISA-N 0.000 description 3
- 101710121765 Endo-1,4-beta-xylanase Proteins 0.000 description 3
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 description 3
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 description 3
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 3
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 3
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 3
- 239000007844 bleaching agent Substances 0.000 description 3
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 3
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 description 3
- 101150043930 cel5A gene Proteins 0.000 description 3
- 108010091371 endoglucanase 1 Proteins 0.000 description 3
- 108010092450 endoglucanase Z Proteins 0.000 description 3
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 3
- 125000003147 glycosyl group Chemical group 0.000 description 3
- 108010002430 hemicellulase Proteins 0.000 description 3
- COHYTHOBJLSHDF-BUHFOSPRSA-N indigo dye Chemical group N\1C2=CC=CC=C2C(=O)C/1=C1/C(=O)C2=CC=CC=C2N1 COHYTHOBJLSHDF-BUHFOSPRSA-N 0.000 description 3
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 3
- DLFVBJFMPXGRIB-UHFFFAOYSA-N Acetamide Chemical compound CC(N)=O DLFVBJFMPXGRIB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001019659 Acremonium <Plectosphaerellaceae> Species 0.000 description 2
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 description 2
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 description 2
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 2
- 101100382641 Aspergillus aculeatus cbhB gene Proteins 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000007319 Avena orientalis Nutrition 0.000 description 2
- 244000075850 Avena orientalis Species 0.000 description 2
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 241000223218 Fusarium Species 0.000 description 2
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 2
- 241000183011 Melanocarpus Species 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 2
- 102100022647 Reticulon-1 Human genes 0.000 description 2
- 229920002334 Spandex Polymers 0.000 description 2
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 2
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 2
- LRQOQMWIEDQCHM-XCJASTIHSA-N Urobiose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@@H]1O[C@@]1(O)[C@H](CO)O[C@H](O[C@@]2(O)[C@@H](O[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]2O)CO)[C@@H](O)[C@@H]1O LRQOQMWIEDQCHM-XCJASTIHSA-N 0.000 description 2
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 2
- 102000004139 alpha-Amylases Human genes 0.000 description 2
- 108090000637 alpha-Amylases Proteins 0.000 description 2
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- UHZZMRAGKVHANO-UHFFFAOYSA-M chlormequat chloride Chemical compound [Cl-].C[N+](C)(C)CCCl UHZZMRAGKVHANO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 2
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 125000002791 glucosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 2
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 2
- 229940059442 hemicellulase Drugs 0.000 description 2
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 2
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 2
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 108010038196 saccharide-binding proteins Proteins 0.000 description 2
- 238000004513 sizing Methods 0.000 description 2
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 2
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 2
- FYGDTMLNYKFZSV-WFYNLLPOSA-N (2s,3r,4s,5s,6r)-2-[(2r,4r,5r,6s)-4,5-dihydroxy-2-(hydroxymethyl)-6-[(2r,3s,4r,5r,6s)-4,5,6-trihydroxy-2-(hydroxymethyl)oxan-3-yl]oxyoxan-3-yl]oxy-6-(hydroxymethyl)oxane-3,4,5-triol Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1[C@@H](CO)O[C@@H](O[C@@H]2[C@H](O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]2O)CO)[C@H](O)[C@H]1O FYGDTMLNYKFZSV-WFYNLLPOSA-N 0.000 description 1
- FYGDTMLNYKFZSV-URKRLVJHSA-N (2s,3r,4s,5s,6r)-2-[(2r,4r,5r,6s)-4,5-dihydroxy-2-(hydroxymethyl)-6-[(2r,4r,5r,6s)-4,5,6-trihydroxy-2-(hydroxymethyl)oxan-3-yl]oxyoxan-3-yl]oxy-6-(hydroxymethyl)oxane-3,4,5-triol Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1[C@@H](CO)O[C@@H](OC2[C@H](O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]2O)CO)[C@H](O)[C@H]1O FYGDTMLNYKFZSV-URKRLVJHSA-N 0.000 description 1
- UHPMCKVQTMMPCG-UHFFFAOYSA-N 5,8-dihydroxy-2-methoxy-6-methyl-7-(2-oxopropyl)naphthalene-1,4-dione Chemical compound CC1=C(CC(C)=O)C(O)=C2C(=O)C(OC)=CC(=O)C2=C1O UHPMCKVQTMMPCG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010001488 Aggression Diseases 0.000 description 1
- 244000144730 Amygdalus persica Species 0.000 description 1
- 239000004382 Amylase Substances 0.000 description 1
- 241000228245 Aspergillus niger Species 0.000 description 1
- 240000006439 Aspergillus oryzae Species 0.000 description 1
- 241000193744 Bacillus amyloliquefaciens Species 0.000 description 1
- 241000194108 Bacillus licheniformis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 101100299607 Bacillus subtilis (strain 168) licA gene Proteins 0.000 description 1
- 241000283084 Balaenoptera musculus Species 0.000 description 1
- 101100016206 Cellvibrio japonicus (strain Ueda107) celC gene Proteins 0.000 description 1
- 241000123346 Chrysosporium Species 0.000 description 1
- 241000193403 Clostridium Species 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010087427 Endo-1,3(4)-beta-Glucanase Proteins 0.000 description 1
- 241000223221 Fusarium oxysporum Species 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 102000005744 Glycoside Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108010031186 Glycoside Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 229920002488 Hemicellulose Polymers 0.000 description 1
- 241000223198 Humicola Species 0.000 description 1
- 229920000663 Hydroxyethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000004354 Hydroxyethyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 206010021703 Indifference Diseases 0.000 description 1
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 1
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 1
- 108010029541 Laccase Proteins 0.000 description 1
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 description 1
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 description 1
- 239000004367 Lipase Substances 0.000 description 1
- 102000006833 Multifunctional Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108010047290 Multifunctional Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000226677 Myceliophthora Species 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 206010033546 Pallor Diseases 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108700020962 Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 101100172078 Phanerodontia chrysosporium Eg5A gene Proteins 0.000 description 1
- 108010059820 Polygalacturonase Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 235000006040 Prunus persica var persica Nutrition 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 101100284150 Salipaludibacillus agaradhaerens cel5A gene Proteins 0.000 description 1
- 101100394024 Salmonella typhimurium (strain LT2 / SGSC1412 / ATCC 700720) bcsZ gene Proteins 0.000 description 1
- 241000235346 Schizosaccharomyces Species 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 229910000831 Steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 241000228178 Thermoascus Species 0.000 description 1
- 238000005299 abrasion Methods 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002299 affinity electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000016571 aggressive behavior Effects 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 229940024171 alpha-amylase Drugs 0.000 description 1
- 229940025131 amylases Drugs 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000013528 artificial neural network Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 238000002869 basic local alignment search tool Methods 0.000 description 1
- 239000003139 biocide Substances 0.000 description 1
- 238000004061 bleaching Methods 0.000 description 1
- 108020001778 catalytic domains Proteins 0.000 description 1
- 101150008363 celC gene Proteins 0.000 description 1
- 101150044976 celK gene Proteins 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- -1 cellobiose disaccharide Chemical class 0.000 description 1
- 101150083131 chbA gene Proteins 0.000 description 1
- 238000000224 chemical solution deposition Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 230000001010 compromised effect Effects 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 230000000881 depressing effect Effects 0.000 description 1
- 230000006866 deterioration Effects 0.000 description 1
- 210000002249 digestive system Anatomy 0.000 description 1
- 238000002845 discoloration Methods 0.000 description 1
- 230000002500 effect on skin Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 108010093305 exopolygalacturonase Proteins 0.000 description 1
- 239000003925 fat Substances 0.000 description 1
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 238000007730 finishing process Methods 0.000 description 1
- 210000000167 fungal chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003906 humectant Substances 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 235000019447 hydroxyethyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 229920005610 lignin Polymers 0.000 description 1
- 235000019421 lipase Nutrition 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 230000003381 solubilizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000004759 spandex Substances 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 238000013112 stability test Methods 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 238000009479 steam granulation Methods 0.000 description 1
- 239000010959 steel Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012209 synthetic fiber Substances 0.000 description 1
- 229920002994 synthetic fiber Polymers 0.000 description 1
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001446247 uncultured actinomycete Species 0.000 description 1
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000005418 vegetable material Substances 0.000 description 1
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 1
- 239000007966 viscous suspension Substances 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 230000004584 weight gain Effects 0.000 description 1
- 235000019786 weight gain Nutrition 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
- C12Y302/01004—Cellulase (3.2.1.4), i.e. endo-1,4-beta-glucanase
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23K—FODDER
- A23K10/00—Animal feeding-stuffs
- A23K10/10—Animal feeding-stuffs obtained by microbiological or biochemical processes
- A23K10/14—Pretreatment of feeding-stuffs with enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
- C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
- C11D3/00—Other compounding ingredients of detergent compositions covered in group C11D1/00
- C11D3/16—Organic compounds
- C11D3/38—Products with no well-defined composition, e.g. natural products
- C11D3/386—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
- C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
- C11D3/00—Other compounding ingredients of detergent compositions covered in group C11D1/00
- C11D3/16—Organic compounds
- C11D3/38—Products with no well-defined composition, e.g. natural products
- C11D3/386—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase
- C11D3/38645—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase containing cellulase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2405—Glucanases
- C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
- C12N9/2437—Cellulases (3.2.1.4; 3.2.1.74; 3.2.1.91; 3.2.1.150)
-
- D—TEXTILES; PAPER
- D06—TREATMENT OF TEXTILES OR THE LIKE; LAUNDERING; FLEXIBLE MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
- D06M—TREATMENT, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE IN CLASS D06, OF FIBRES, THREADS, YARNS, FABRICS, FEATHERS OR FIBROUS GOODS MADE FROM SUCH MATERIALS
- D06M16/00—Biochemical treatment of fibres, threads, yarns, fabrics, or fibrous goods made from such materials, e.g. enzymatic
- D06M16/003—Biochemical treatment of fibres, threads, yarns, fabrics, or fibrous goods made from such materials, e.g. enzymatic with enzymes or microorganisms
-
- D—TEXTILES; PAPER
- D06—TREATMENT OF TEXTILES OR THE LIKE; LAUNDERING; FLEXIBLE MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
- D06P—DYEING OR PRINTING TEXTILES; DYEING LEATHER, FURS OR SOLID MACROMOLECULAR SUBSTANCES IN ANY FORM
- D06P5/00—Other features in dyeing or printing textiles, or dyeing leather, furs, or solid macromolecular substances in any form
- D06P5/02—After-treatment
-
- D—TEXTILES; PAPER
- D21—PAPER-MAKING; PRODUCTION OF CELLULOSE
- D21C—PRODUCTION OF CELLULOSE BY REMOVING NON-CELLULOSE SUBSTANCES FROM CELLULOSE-CONTAINING MATERIALS; REGENERATION OF PULPING LIQUORS; APPARATUS THEREFOR
- D21C5/00—Other processes for obtaining cellulose, e.g. cooking cotton linters ; Processes characterised by the choice of cellulose-containing starting materials
- D21C5/005—Treatment of cellulose-containing material with microorganisms or enzymes
-
- D—TEXTILES; PAPER
- D21—PAPER-MAKING; PRODUCTION OF CELLULOSE
- D21H—PULP COMPOSITIONS; PREPARATION THEREOF NOT COVERED BY SUBCLASSES D21C OR D21D; IMPREGNATING OR COATING OF PAPER; TREATMENT OF FINISHED PAPER NOT COVERED BY CLASS B31 OR SUBCLASS D21G; PAPER NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
- D21H17/00—Non-fibrous material added to the pulp, characterised by its constitution; Paper-impregnating material characterised by its constitution
- D21H17/005—Microorganisms or enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
Abstract
Proteína de fusión de celulasa que comprende una primera secuencia de aminoácidos de un núcleo de endoglucanasa que tiene al menos una identidad del 75% con la SEQ ID n.º 2, o un fragmento de la misma que tiene actividad celulasa, y una segunda secuencia de aminoácidos que comprende un conector y un dominio de fijación a la celulosa (CBD) que tiene al menos una identidad del 75% con la SEQ ID n.º 15, o un fragmento de la misma que tiene actividad de fijación a la celulosa.
Description
Proteínas de fusión de celulasas y uso de las mismas.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a la tecnología enzimática, y más exactamente, a proteínas de fusión de celulasa que comprenden un dominio catalítico y un dominio de fijación a la celulosa. Las proteínas de fusión se pueden producir con técnicas recombinantes mediante el uso de los polinucleótidos, vectores de expresión y células hospedadoras apropiados, que también están englobados por la invención. Las proteínas de fusión y las preparaciones enzimáticas de las mismas son útiles para tratar el material celulósico, tal como el material textil. Además, las proteínas de fusión se pueden utilizar en la industria papelera, en extracción de aceite desde las plantas, en composiciones de detergentes o para mejorar la calidad de los alimentos para consumo animal. Por lo tanto, la invención se refiere además a un procedimiento para tratar material celulósico con la proteína de fusión y, en especial, a los procedimientos para biodesgaste (del inglés biostonning) o bioacabado de tejidos o prendas, especialmente el dril (denim). La invención también se refiere además a composiciones de detergente y alimento para consumo animal que contienen las proteínas de fusión.
La celulosa es el componente estructural más importante de las plantas superiores y se genera en la naturaleza en forma casi pura únicamente en la fibra de algodón. Proporciona una gran resistencia tensora a células vegetales que les ayuda a resistir las agresiones mecánicas y la presión osmótica. La celulosa es un polisacárido lineal de restos de glucosa conectados mediante enlaces β-1,4. En la naturaleza, la celulosa suele estar asociada a la lignina y a las hemicelulosas. El material celulósico se degrada en la naturaleza mediante una serie de organismos deferentes, entre ellos las bacterias y los hongos. La conversión biológica de la celulosa en glucosa generalmente requiere tres grupos importantes de enzimas: celobiohidrolasas (CBH), endoglucanasas (EG) y β-glucosidasasas (BG).
Las celulasas tienen un amplio espectro de aplicaciones industriales. En la industria textil, las celulasas se utilizan en el acabado del dril para crear una apariencia de lavado a la piedra a la moda en las prendas de dril en un proceso de biodesgaste. Las celulasas también se utilizan, por ejemplo, para limpiar de pelusa e impedir la formación de pelotillas en la superficie de las prendas de algodón. En la industria del detergente, las celulasas se utilizan para abrillantar los colores y para impedir el agrisado y la formación de pelotillas en las prendas. Las celulasas se utilizan además en la industria de la alimentación y en la fabricación de alimentos para consumo animal, y tienen un gran potencial en la industria papelera, por ejemplo, en el destintado que libera la tinta de la superficie de las fibras y para mejorar el drenaje de la pasta de papel.
Las celulasas utilizadas industrialmente son a menudo mezclas de enzimas que tienen muy diversas actividades y especificidades de sustrato. Las preparaciones de enzimas comerciales a menudo comprenden tres actividades celulásicas, a saber, CBH, EG y BG. Además, las propiedades únicas de cada celulasa hacen que algunas sean más adecuadas para determinados propósitos que otras y, por lo tanto, también se han hecho esfuerzos para obtener y utilizar celulasas que tienen sólo las actividades deseadas. Las celulasas utilizadas más ampliamente de origen fúngico proceden de Trichoderma reesei. Sin embargo, también se han sugerido otras fuentes fúngicas, p. ej., en la patente de los EE.UU. n.º 5 457 046.
Las celulasas que se aplican al tratamiento del dril se suelen dividir en dos grupos principales: celulasas ácidas y celulasas neutras. Las celulasas ácidas normalmente funcionan a pH de 4,0 a 5,5, y las celulasas neutras en el intervalo de pH de 6 a 8. Las celulasas que tienen características tanto del grupo de las ácidas como de las neutras se denominan celulasas híbridas. Las celulasas ácidas utilizadas para el biodesgaste proceden principalmente de Trichoderma reesei (anamorfo de Hypocrea jecorina) y las celulasas neutrales proceden de una variedad de hongos, que incluye los géneros Melanocarpus, Humicola, Myceliophthora, Fusarium, Acremonium y Chrysosporium (Haakana et al., 2004). Las enzimas de T. reesei incluyen, p. ej., celulasas de la familia 5 (endoglucanasa II, EGII), de la familia 7 (celobiohidrolasa I, CBHI) y de la familia 12 (endoglucanasa III, EGIII; Ward et al, 1993) de las glucosilhidrolasas, y las celulosas neutras, más a menudo endoglucanasas, de la familia 45 y de la familia 7 (Henrissat, 1991; Henrissat y Bairoch, 1993, 1996).
La patente de los EE.UU. n.º 5 874 293 describe una composición mejorada de celulasas que comprende cantidades elevadas de la endoglucanasa EGII de T. reesei para tratar textiles que contienen celulosa. La composición mejoró las propiedades del color, incrementó la luminosidad y la apariencia visual y redujo la tendencia a formar pelotillas. La patente internacional WO 97/14804 describe unas celulasas de 20 kDa y una de 50 kDa con actividad endoglucanasa procedentes de Melanocarpus sp. que son especialmente útiles en la industria textil y de detergentes. Las proteínas de fusión que contienen las proteínas de 20 kDa o de 50 kDa unidas a un dominio de fijación a la celulosa, preferentemente de Trichoderma reesei, es lo que se sugiere que crea las nuevas propiedades enzimáticas. No se ofrecen ejemplos específicos, ni se describen las propiedades deseadas.
Sin embargo, sigue existiendo todavía la necesidad de mejorar las celulasas, entre ellas las endoglucanasas, para que sean más eficaces en el tratamiento de tejidos y en otros ámbitos, en donde tradicionalmente se utilizan las celulasas. En particular, hay una constante necesidad de celulasas más eficaces para mejorar los aspectos económicos del proceso. La presente invención persigue satisfacer estas necesidades.
En la industria textil, el interés de los productores de dril en los últimos años ha sido dar una apariencia de «lavado a la piedra» o una apariencia desgastada. El lavado a la piedra tradicional con piedra pómez reduce la resistencia del tejido y carga las máquinas donde se lava la ropa. Hay una tendencia hacia los procesos de acabado enzimático del dril, y las celulasas han reemplazado a la piedra pómez, o se están utilizado junto a ellas, para dar al tejido el aspecto «ajado» que se desea. Los tratamientos enzimáticos controlados dañan menos las prendas y las máquinas, y eliminan la necesidad de deshacerse de las piedras.
Un problema general asociado al lavado enzimático a la piedra es la retrotinción ocasionada por la redeposición del colorante índigo retirado durante o después del desgaste. La redeposición del colorante índigo reduce el contraste deseado entre los hilos coloreados de índigo y los blancos, y se puede observar más fácilmente por el revés del dril y en los bolsillos interiores (como un incremento del azul). En el lado del derecho, esto se puede observar como una reducción del contraste entre las áreas coloreadas y las áreas de las cuales se ha retirado el colorante durante el biodesgaste. La retrotinción se puede reducir con el uso durante el tratamiento de agentes de antirretrotinción, tales como alcoholes etoxilados no iónicos, o con la adición de blanqueantes durante las etapas de enjuague. La naturaleza de la enzima afecta a la retrotinción. Las celulasas neutras generalmente retrotiñen menos que las celulasas ácidas.
La patente internacional WO 97/09410 describe la adición de un determinado tipo de celulasa a otra celulasa que tiene actividad de desgaste para reducir la retrotinción. La celulasa adicional pertenece a la familia 5 o a la 7, pero no tiene un efecto de desgaste significativo por sí misma. Preferentemente, dicha celulasa adicional procede de Bacillus o Clostridium.
La patente de los Estados Unidos US 5 916 799 describe composiciones de celulasa que contienen tanto celobiohidrolasas como endoglucanasas que se han sometido a proteólisis limitada para separar el núcleo y los dominios de fijación de las enzimas. Se encontró que las composiciones enzimáticas obtenidas reducían la retrotinción. La patente internacional WO 94/07983 se refiere al hallazgo de que la redeposición del colorante sobre el tejido durante el proceso de lavado a la piedra se puede reducir empleando una composición de celulasas fúngicas, que está sustancialmente libre de componentes de tipo celobiohidrolasa. La patente internacional WO 96/23928 describe el tratamiento de tejidos que contienen celulosa con enzimas celulásicas truncadas. Se encontró que las enzimas truncadas que carecían del dominio de fijación a la celulosa (CBD) reducían la redeposición del colorante e incrementaban el desgaste.
La conclusión general de las tres referencias citadas más arriba podría ser que el dominio de fijación a la celulosa tiene un efecto negativo sobre la retrotinción. Sin embargo, la presente invención da a conocer ahora una construcción de celulasa con una baja propiedad de retrotinción, a pesar de la presencia de un dominio de fijación a la celulosa.
La presente invención se basa en el hallazgo sorprendente de que el efecto de las endoglucanasas podría reforzarse significativamente conjugándoles un determinado dominio de fijación a la celulosa sin alterar las propiedades de retrotinción.
Un objeto de la presente invención es dar a conocer nuevas proteínas de fusión a endoglucanasa que tienen mejores propiedades hidrolíticas para utilizarlas en la industria textil, especialmente en el dril lavado a la piedra. Las proteínas de fusión de la invención presentan la ventaja de ser activas a valores ácidos y neutros del pH, y tienen un comportamiento muy mejorado en las aplicaciones de biodesgaste. Cuando se utilizan para tratar el dril, las proteínas de fusión proporcionan poco efecto de retrotinción. Con la mejoría de la eficacia de las endoglucanasas de la invención, el uso de las enzimas es significativamente más económico. Se consiguen también otras ventajas en términos de logística y del almacenamiento de los productos enzimáticos, porque se necesita menos cantidad del producto enzimático. Las proteínas de fusión también son útiles en composiciones de detergente, así como en otros ámbitos, tales como la industria alimentaria, la extracción de aceite de las plantas, o la industria papelera.
Un objeto más de la presente invención es dar a conocer polinucleótidos que codifican las nuevas proteínas de fusión de endoglucanasa.
Otro objeto más de la presente invención es dar a conocer un método para producir las proteínas de fusión.
Otro objeto más de la presente invención es dar a conocer nuevos vectores de expresión que contienen tales polinucleótidos, útiles para la producción de las proteínas de fusión de endoglucanasa, así como nuevos hospedadores transformados con dichos vectores de expresión.
Otro objeto más de la presente invención es dar a conocer preparaciones enzimáticas que contienen una o más proteínas de fusión de endoglucanasa nuevas.
Otro objeto más de la presente invención es dar a conocer métodos para tratar material celulósico con la proteína de fusión, p. ej., para uso en la industria textil, de detergentes, de alimentos para consumo animal, de extracción de aceite a partir de plantas, o en la industria papelera, y particularmente para el acabado de los tejidos, especialmente para el biodesgaste y el bioacabado del dril.
Otro objeto más de la presente invención es dar a conocer composiciones de detergente o de alimentos para consumo animal que contienen las proteínas de fusión.
La presente invención se refiere a una proteína de fusión de celulasa que comprende una primera secuencia de aminoácidos de un núcleo de endoglucanasa que tiene al menos una identidad del 75% con la SEQ ID n.º 2, o un fragmento de la misma que tiene actividad celulasa, y una segunda secuencia de aminoácidos que comprende un conector y un dominio de fijación a la celulasa (CBD) que tiene al menos una identidad del 75% con la SEQ ID n.º 15, o un fragmento de la misma que tiene actividad fijadora de la celulosa.
La invención se refiere además a un polinucleótido aislado que se selecciona entre el grupo que consiste en:
a) una secuencia de nucleótidos de SEQ ID n.º 3, o una secuencia que codifica una proteína de fusión de celulasa según la reivindicación 1,
b) una hebra complementaria de a).
La invención se refiere adicionalmente a un vector de expresión que comprende dicha secuencia de nucleótidos, y a una célula hospedadora que comprende el vector de expresión, así como a una preparación enzimática que comprende la proteína de fusión.
La invención también abarca un método para producir la proteína de fusión, que comprende las etapas de transformar una célula hospedadora con un vector de expresión que codifica dicha proteína de fusión y cultivar dicha célula hospedadora en condiciones que permiten la expresión de dicha proteína de fusión y, opcionalmente, recuperar y purificar la proteína de fusión producida.
La invención abarca adicionalmente un procedimiento para tratar material celulósico, en donde dicho procedimiento comprende poner en contacto el material celulósico con la proteína de fusión.
La invención también se refiere a un procedimiento para biodesgaste, que comprende la etapa de poner en contacto la proteína de fusión de celulasa o la preparación enzimática con tejido o prendas de dril, y a un procedimiento para el bioacabado, que comprende la etapa de poner en contacto la proteína de fusión de celulasa o la preparación enzimática con materiales textiles como tejidos o prendas o hilos.
Finalmente, la invención se refiere a una composición de detergente que comprende la proteína de fusión y auxiliares de detergencia, a los alimentos para consumo animal que comprenden la proteína de fusión, y a una cepa de Escherichia coli que tiene el número de acceso E. coli DSM 18159.
Las realizaciones específicas de la invención se presentan en las reivindicaciones adjuntas.
Otros objetos, detalles y ventajas de la presente invención resultarán evidentes a partir de los dibujos, de la descripción detallada y de los ejemplos que vienen a continuación.
Breve descripción de los dibujos
En la figura 1 se ilustra un dibujo esquemático del casete de expresión utilizado en la transformación de los protoplastos de T. reesei para la producción de la celulasa EG28 o EG28+CtCBD de T. aurantiacus. El gen cel5A o cel5A_Ct cel7AconectorCBD está bajo el control del promotor cbhI de T. reesei (prom cbhl) y la terminación de la transcripción se asegura con la adición del terminador cbhI (term cbhl). El gen amdS (amdS) está incluido para la selección de los transformantes. El casete de expresión para la producción de EG28 y de EG28+CtCBD se aisló como un fragmento NotI de 8,6 kb a partir de pALK1930 o como un fragmento NotI de 8,9 kb a partir de pALK1948, respectivamente.
En la figura 2 se ilustra la dependencia del pH que tiene la celulasa EG28 de T. aurantiacus producida de forma heteróloga mediante la determinación del sobrenadante del cultivo con el CMC como sustrato en una reacción de 10 min a 50 ºC (A). La temperatura óptima de la celulasa EG28 se determinó al pH óptimo (6,0). La reacción que contiene el CMC como sustrato se realizó durante 10 min (B). El pH y la temperatura óptima de la proteína de fusión EG28+CtCBD se determinó que eran los mismos que los de la celulasa EG28 de tipo silvestre.
En la figura 3 se muestra el efecto de biodesgaste de la celulasa EG28, mediante la medición del color, a temperaturas diferentes y pH 6.
En la figura 4 se muestra el efecto de biodesgaste de la celulasa EG28+CtCBD, mediante la medición del color, a diferentes valores de pH a 50 ºC.
En la figura 5 se muestra el efecto de biodesgaste de la celulasa EG28+CtCBD, mediante la medición del color, a diferentes valores de pH a 60 ºC.
En la figura 6 se muestra el efecto de biodesgaste de la celulasa EG28+CtCBD, mediante la medición del color, a temperaturas diferentes (pH 6).
En la figura 7 se muestra la influencia de la temperatura de granulación sobre la recuperación de la actividad βglucanasa de los alimentos complementados con la celulasa EG28.
En la figura 8 se muestra la influencia de la temperatura de granulación sobre la recuperación de la actividad celulasa de los alimentos complementados con la celulasa EG28+CtCBD.
Descripción detallada de la invención
Las celulasas comprenden un dominio/núcleo catalítico (CD) que expresa actividad celulásica. Además del dominio catalítico, la molécula de celulasa puede comprender uno o más «dominios de fijación a la celulosa» («CBD»), también denominados módulos/dominios de fijación a glúcidos (CBD/CBM), que se pueden localizar o bien en el extremo amino o bien en el extremo carboxilo del dominio catalítico. Los CBD tienen actividad de fijación a glúcidos e intervienen en la fijación de la celulasa a la celulosa cristalina, pero tienen poco o ningún efecto sobre la actividad hidrolítica de la enzima en los sustratos solubles. Estos dos dominios están típicamente conectados mediante una región conectora muy glucosilada y flexible, llamada en la presente memoria «conector». Tales construcciones se describen, p. ej., en Srisodsuk et al., 1993. Algunas de las endoglucanasas y celobiohidrolasas que se producen de forma natural tienen un dominio de fijación a la celulosa (CBD), mientras que otras no.
Las endoglucanasas (EG) son uno de los tres tipo de celulasas que se necesitan generalmente para la conversión biológica de la celulosa en glucosa. Las endoglucanasas cortan los enlaces β-1,4-glucosídicos internos, mientras que las celobiohidrolasas cortan el disacárido celobiosa desde el extremo de la cadena polimérica de celulosa, y las β-1,4-glucosidasas hidrolizan la celobiosa y otros celooligosacáridos pequeños en glucosa. «Endoglucanasa» («EG») en conexión con la presente invención se refiere a las enzimas clasificadas como EC 3.2.1.4. Son 4glucanohidrolasas de 1,4-β-D-glucano y catalizan la endohidrólisis de los enlaces 1,4-β-D-glucosídicos en los polímeros de glucosa tales como la celulosa. Algunas endoglucanasas pueden también hidrolizar, p. ej., los enlaces 1,4 en los β-D-glucanos que también contienen enlaces 1,3. Por consiguiente, también se pueden clasificar como endo-1,3(4)-β-glucanasas (EC 3.2.1.6). Así pues, una enzima puede catalizar reacciones sobre varios sustratos y puede pertenecer a varias clases.
Las celulasas, entre ellas las endoglucanasas, también se pueden clasificar en varias familias de hidrolasas de glucosilos de acuerdo con su secuencia primaria, apoyado por el análisis de la estructura tridimensional de algunos miembros de la familia (Henrissat 1991, Henrissat y Bairoch 1993, 1996). Por ejemplo, la familia 45 (con anterioridad celK) contiene endoglucanasas (EC 3.2.1.4) y la familia 5 (antes conocida como celA) consiste principalmente en endoglucanasas (EC 3.2.1.4). La familia 7 (antes familia de la celulasa celC) contiene tanto endoglucanasas como celobiohidrolasas. Algunas hidrolasas de glucosilos son enzimas multifuncionales que contienen dominios catalíticos que pertenecen a diferentes familias de hidrolasas de glucosilos. Para los propósitos de la presente invención, la parte endoglucanasa de la proteína de fusión pertenece preferentemente a la familia 45 o a la familia 5 de las hidrolasas de glucósidos, y más preferentemente a la familia 5.
De acuerdo con una realización preferente de la invención, la parte endoglucanasa de la proteína de fusión procede de un hongo, preferentemente del género Thermoascus, y más preferentemente de Thermoascus aurantiacus. Tal endoglucanasa la han descrito, p. ej., Hong et al., 2003. La patente internacional WO 03/062409 sugiere la utilización de esta enzima para aplicaciones en alimentos, porque además de la actividad endoglucanasa, también tiene actividad β-glucanasa. Más preferentemente, la endoglucanasa procede de la cepa de T. aurantiacus ALKO4242 depositada como CBS 116239. El gen de la endoglucanasa de dicha cepa se ha insertado en el plásmido pALK1926 y se ha depositado como DSM 17326. La proteína codificada por este gen se denomina en la presente memoria «Ta EG28» o simplemente «EG28».
Como referencia, la parte endoglucanasa de la proteína de fusión se puede obtener de Acremonium sp., preferentemente de A. thermophilum, y más preferentemente de una cepa que tiene las características de la cepa ALKO4245 depositada como CBS 116240. La endoglucanasa que se obtiene de esta cepa y que está codificada por el gen cel45A se denomina en la presente memoria «At EG40» o simplemente «EG40».
El «núcleo» de la endoglucanasa, tal y como se utiliza en la presente memoria, se refiere al dominio/núcleo catalítico (CD) de una enzima que expresa al menos actividad endoglucanásica. Tal dominio catalítico puede estar en la forma en que se produce en la naturaleza (p, ej, intacto), o puede estar modificado.
De acuerdo a una realización de la invención, el núcleo de la endoglucanasa tiene una identidad de al menos el 75, 80, 85, 90, 95, 98 o 99% con la SEQ ID n.º 2 (Ta EG28). Preferentemente, el núcleo comprende al menos la proteína madura, que corresponde a los aminoácidos 19 a 334 de la SEQ ID n.º 2. La predicción de la secuencia señal se realizó con el programa SignalP V3.0 (Nielsen et al., 1997; Bendtsen et al., 2004); el valor de NN se obtuvo con redes neuronales y el valor de HMM con modelos ocultos de Markov.
«Celobiohidrolasa» o «CBH», tal y como se utiliza en la presente memoria, se refiere a las enzimas que escinden la celulosa desde el extremo de la cadena de glucosas y que producen principalmente celobiosa. También se denominan celobiohidrolasas de 1,4-β-D-glucano o 1,4-β-celobiosidasas de celulosa. Hidrolizan los enlaces 1,4-β-Dglucosídicos desde los extremos reductor y no reductor de un polímero que contiene dichos enlaces, tal como la celulosa, mediante lo cual se libera la celobiosa.
El CBD que incluye el conector procede preferentemente de Chaetomium thermophilum, y especialmente del gen que codifica la celobiohidrolasa (CBHI/Cel7A) de la cepa ALKO4265, depositada como CBS 730.95. Este CBD que incluye el conector se denomina «CtCBD». De acuerdo a una realización preferente de la invención, el conector más el dominio de fijación a la celulosa tiene una secuencia que tiene una identidad de al menos el 80, 85, 90, 95, 98 o 99% con la SEQ ID n.º 15, (que corresponde a los aminoácidos 335 a 415 de la SEQ ID n.º 4). De acuerdo con otra realización preferente, la segunda secuencia de aminoácidos comprende los aminoácidos 335 a 379 de la SEQ ID n.º 4.
La terminología «procedente de» en conexión con una fuente de microorganismo significa que el polipéptido puede producirse de forma natural en dicha fuente de microorganismo específico, o el polinucleótido que codifica el polipéptido puede aislarse de dicha fuente de microorganismo, o la terminología se refiere a una célula hospedadora en la que se ha introducido el polinucleótido de dicha fuente de microorganismo que codifica el polipéptido. Sin embargo, esto no descarta modificaciones menores de la secuencia, p. ej., por sustitución, deleción, inversión y/o inserción de uno o unos pocos aminoácidos/codones siempre y cuando se conserve la actividad biológica de la proteína codificada.
El núcleo, y el conector+CBD, respectivamente, también pueden ser un fragmento de dichas secuencias, en donde dicho fragmento tiene actividad celulasa y/o actividad de fijación a la celulosa. Por ejemplo, la primera secuencia de aminoácidos puede comprender un fragmento de una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 75% con la SEQ ID n.º 2 u 8, y la segunda secuencia de aminoácidos puede comprender un fragmento de una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 75% con la SEQ ID n.º 15.
En el presente contexto, la «actividad celulasa» significa la capacidad catalítica para hidrolizar la celulosa o los derivados de la misma, tal como actividad endoglucanasa o β-glucanasa. Además de la actividad endoglucanasa y/o β-glucanasa, algunas de las celulasas pueden además tener actividad hemicelulasa y/o xilanasa.
Tal y como se utiliza en el presente contexto, la terminología «identidad» se refiere a la identidad global entre dos secuencias de aminoácidos comparadas entre sí desde el primer aminoácido codificado por el correspondiente gen hasta el último aminoácido. La identidad de las secuencias completas se mide con el programa de alineamiento global de Needleman-Wunsch del paquete de programas EMBOSS (European Molecular Biology Open Software Suite; Rice et al., 2000), versión 3.0.0, con los parámetros siguientes: EMBLOSUM62, penalización por hueco 10,0, penalización por extensión 0,5. El algoritmo se describe en Needleman y Wunsch (1970). El experto en la técnica es consciente del hecho de que los resultados con el algoritmo de Needleman-Wunsch son comparables sólo cuando se alinean los correspondientes dominios de la secuencia. Por consiguiente, se descartan por no ser significativas las comparaciones de, p. ej., secuencias de celulasa que incluyen el CBD o las secuencias señal con secuencias que carecen de esos elementos.
De acuerdo con una realización de la invención, la proteína fusión contiene un núcleo de endoglucanasa codificado por un gen similar al incluido en E. coli DSM 17326. Preferentemente, la proteína de fusión está codificada por una gen de fusión similar al incluido en E. coli DSM 18159. De acuerdo con una realización específica de la invención, la proteína de fusión contiene un núcleo de endoglucanasa que comprende la secuencia de SEQ ID n.º 2 y un conector y un CBD que comprende la secuencia de SEQ ID n.º 15. Especialmente, comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID n.º 4, o un fragmento de la misma que tiene actividad celulasa y actividad de fijación a la celulosa.
Se entiende que un «fragmento» es parte de una secuencia de aminoácidos específica que es suficientemente larga para tener la actividad biológica deseada. En otras palabras, el fragmento puede ser, p. ej., sólo la parte madura de la secuencia de aminoácidos o incluso una subsecuencia de la parte madura. Así pues, la actividad biológica en este contexto se refiere a la actividad celulasa, a la actividad de fijación a la celulasa, o a ambas.
La proteína de fusión de la invención se puede preparar con la unión de la parte del núcleo de la endoglucanasa a la parte de conector y CBD en el ADN codificante adecuado mediante las técnicas de ADN recombinante conocidas de forma general para producir la proteína recombinante deseada. Brevemente, se amplifican y se clonan los polinucleótidos que codifican los compañeros de fusión, pudiéndose también sintetizar los nucleótidos. El polinucleótido fusionado se inserta en un vector de expresión, se introduce por transformación en una célula hospedadora y se expresa. Preferentemente, el conector y el CBD están unidos al extremo carboxilo del núcleo de la endoglucanasa.
Un «vector de expresión» es un plásmido o vector de clonación capaz de expresar el ADN que codifica las proteínas de fusión de endoglucanasa después de introducirlo por transformación en un hospedador deseado. Cuando se utiliza un hospedador fúngico, el gen de interés se suministra preferentemente a un hospedador fúngico como parte de un vehículo de expresión o de clonación que se integra en el cromosoma fúngico, o que permite que el gen de interés se integre en el cromosoma del hospedador. Otras secuencias que son parte del vehículo de clonación o del vehículo de expresión también se pueden integrar con dicho ADN durante el proceso de integración. Además, en los hongos, el vector de expresión o partes del mismo se pueden dirigir a locus predeterminados. Alternativamente, el gen de fusión deseado se suministra como un plásmido de replicación autónoma.
El ADN que codifica las proteínas de fusión de endoglucanasa se coloca preferentemente bajo el control de (p. ej., unido operativamente a) determinadas secuencias de control, tales como las secuencias promotoras proporcionadas por el vector. Tras la transformación, estas secuencias de control se integran en el genoma del hospedador con el gen de interés. Alternativamente, las secuencias de control pueden ser las del sitio de integración.
Las secuencias de control de expresión de un vector de expresión variarán según si el vector está diseñado para expresar un determinado gen en un huésped procariótico o en un huésped eucariótico (por ejemplo, un vector lanzadera puede proporcionar un gen para la selección en los hospedadores bacterianos). Las secuencias control de la expresión pueden contener elementos reguladores de la transcripción, tales como promotores, elementos potenciadores y secuencias de terminación de la transcripción, y/o elementos reguladores de la traducción, tales como sitios de iniciación y de terminación de la traducción.
Se dice que una molécula polinucleotídica, tal como el ADN, es capaz de expresar un polipéptido si contiene las secuencias de control de la expresión, las cuales contienen información reguladora de la transcripción, y tales secuencias están unidas operativamente a la secuencia nucleotídica que codifica el polipéptido.
Una unión operativa es una unión en la que una secuencia está conectada con una secuencia o secuencias reguladoras de tal modo que se coloca la expresión de la secuencia bajo la influencia o bajo el control de la secuencia reguladora. Se dice que dos secuencias de ADN (tal como una secuencia de la región promotora unida al extremo de 5' de la secuencia que codifica la proteína) están unidas operativamente si el funcionamiento del promotor da lugar a la transcripción.
Los vectores de la invención pueden además comprender otros elementos reguladores unidos operativamente, tales como secuencias potenciadoras.
En una realización preferente se construyen transformantes genéticamente estables, mediante los cuales el ADN que codifica las proteínas de fusión está integrado en el cromosoma del hospedador al haber sido transformado con un vector, el cual puede albergar secuencias que favorecen la integración de dicho vector en el cromosoma.
Las células que tienen integrado de forma estable el ADN que codifica las proteínas de fusión de endoglucanasa en el cromosoma se pueden seleccionar, p. ej., mediante el o los marcadores introducidos, homólogos o heterólogos, que permiten la selección de las células hospedadoras que contienen el vector de expresión en el cromosoma, por ejemplo, el marcador puede proporcionar resistencia a biocidas, p. ej., resistencia a antibióticos, o a metales pesados, tales como el cobre, o el marcador complementa una mutación auxótrofa en el cromosoma del hospedador, y similares. El marcador de selección puede, por ejemplo, ser un gen de selección unido directamente a la secuencia del ADN del gen a expresar, o introducirse en la misma célula mediante cotransformación. También se pueden utilizar otros sistemas de selección.
Una vez que se prepara el vector de expresión que contiene el ADN que codifica la proteína de fusión, se introduce en una célula hospedadora adecuada mediante uno cualquiera de los muchos medios adecuados, entre ellos la transformación como se conoce en la técnica. Después de la transformación, las células receptoras se hacen crecer en un medio de selección apropiado, que sólo dejará crecer a las células transformadas.
Los sistemas hospedadores adecuados de producción y de expresión son, por ejemplo, el sistema de producción desarrollado para los hospedadores fúngicos Trichoderma (patente europea EP 244 234), o Aspergillus, tal como A. oryzae o A. niger (patentes internacionales n.º WO 97/08325 y WO 95/33386, patente de los EE.UU. n.º 5 843 745, patente de los EE.UU. n.º 5 770 418), o el sistema de producción desarrollado por Fusarium, tal como F. oxysporum (Malardier et al., 1989). Los sistemas de producción adecuados desarrollados para las bacterias incluyen un sistema de producción desarrollado para Bacillus, por ejemplo, B. subtilis, B. licheniformis, B. amyloliquefaciens o para E. coli, o para un actinomiceto como Streptomyces. Los sistemas de producción adecuados desarrollados para las levaduras son sistemas desarrollados para Saccharomyces, Schizosaccharomyces o Pichia pastoris. También se pueden utiliar los sistemas de producción en otros microbios o en las células de mamíferos o en las plantas.
La expresión de la secuencia o secuencias génicas clonadas da lugar a la producción de la proteína deseada, o a la producción de un fragmento de esta proteína. Esta expresión puede llevarse a cabo de forma continua en las células transformadas, o de una manera controlada.
Para obtener las preparaciones enzimáticas de la invención, los hospedadores que tienen las propiedades deseadas (esto es, hospedadores capaces de expresar cantidades económicamente asequibles de proteínas de fusión de endoglucanasa) se cultivan en las condiciones adecuadas, y las enzimas deseadas se secretan preferentemente desde los hospedadores hacia el medio de cultivo, y opcionalmente se recuperan de dicho medio de cultivo mediante los métodos conocidos en la técnica. Preferentemente, el hospedador para tal producción es un hongo filamentoso, tal como Trichoderma o Aspergillus, y en especial T. reesei.
Tal y como se utiliza en el presente contexto, la «preparación enzimática» se refiere a cualquier producto enzimático que contiene al menos una proteína de fusión de endoglucanasa de la invención. Así pues, tal preparación enzimática puede ser un medio de cultivo agotado o filtrado. El medio de cultivo agotado se refiere al medio de cultivo del hospedador que comprende las enzimas producidas. Preferentemente, las células hospedadoras se separaron de dicho medio después de la producción. Si se desea, tales preparaciones se pueden liofilizar o si no, la actividad enzimática se puede concentrar y/o estabilizar para la conservación. Si se desea, una enzima deseada se puede purificar adicionalmente de acuerdo con los métodos convencionales, tales como extracción, precipitación, cromatografía, cromatografía de afinidad, electroforesis y similares.
Sin embargo, una ventaja de la invención es que el medio de cultivo con o sin células hospedadoras se puede utilizar como una preparación enzimática como tal, sin más purificación, porque las proteínas de fusión de endoglucanasa se pueden secretar al medio de cultivo, y presentan actividad en las condiciones del ambiente del medio de cultivo agotado. Las preparaciones enzimáticas se suministran y usan de forma rentable porque no es necesario aislar una enzima específica del medio de cultivo.
Además de la proteína de fusión de la endoglucanasa, las preparaciones enzimáticas pueden comprender una o más enzimas diferentes, que pueden ser, por ejemplo, otras celulasas, amilasas, lipasas, proteasas, hemicelulasas, xilanasas, pectinasas y/u oxidasas, tales como lacasas y peroxidasas. Alternativamente, antes, durante o después del tratamiento con la proteína de fusión de la endoglucanasa, se puede llevar a cabo otro tratamiento enzimático. El tratamiento enzimático puede comprender, por ejemplo, uno o más tratamientos con amilasa (por ejemplo, para desaprestar el dril), uno o más tratamientos con celulasa y/o uno o más tratamientos con peroxidasa y/o lacasa. Las otras enzimas a incluir en la preparación enzimática o en el tratamiento enzimático dependen de la aplicación.
Además de la proteína de fusión, la preparación enzimática puede contener aditivos, tales como estabilizadores, tampones, conservantes, tensioactivos y/o componentes de medios de cultivo. Los aditivos preferentes son tales, que se utilizan habitualmente en las preparaciones enzimáticas diseñadas para la aplicación, donde se usa la preparación enzimática.
Las preparaciones enzimáticas se pueden suministrar como un líquido o como un sólido, por ejemplo, como un polvo seco o un granulado, especialmente gránulos sin pulverizar, o un líquido estabilizado. Se ha concebido que las preparaciones enzimáticas se pueden enriquecer más, o se puede hacer total o parcialmente deficientes en actividades enzimáticas específicas, de manera que satisfagan los requisitos de una utilidad específica en diferentes aplicaciones, por ejemplo, en la industria textil. Puede resultar ventajosa una mezcla de actividades enzimáticas secretadas por un hospedador en una aplicación industrial determinada, por ejemplo en bioacabado o biodesgaste.
Las proteínas de fusión de la endoglucanasa y las preparaciones de las mismas son útiles, por ejemplo, en la industria textil, alimentaria, de aceites vegetales, de detergentes y de pasta de papel. Se pueden usar para tratar cualquier material celulósico, tal como material textil, plantas usadas para alimentos consumidos por los animales, material vegetal para extracción de aceite, o fibras secundarias o pasta química o mecánica obtenida de madera. También se pueden añadir en detergentes, que normalmente contienen auxiliares, tales como tensioactivos, surfactantes, blanqueadores o reforzantes de la detergencia. En el presente contexto, «material celulósico» se refiere a cualquier material que comprende como componente significativo celulosa o derivados de la misma. El material celulósico se pone en contacto con una cantidad eficaz de proteína de fusión en las condiciones adecuadas, tal como pH y temperatura adecuados, y se deja que transcurra la reacción durante un tiempo suficiente para que se produzca la reacción enzimática.
Las enzimas de fusión son especialmente útiles para el tratamiento de los materiales textiles, tales como tejidos y prendas. El material textil puede estar fabricado con celulosa natural que contiene fibras o celulosa hecha por el hombre que contiene fibras, o mezclas de ambas, o una mezcla de fibras sintéticas y fibras que contienen celulosa. Preferentemente, el material que contiene celulosa es algodón, especialmente dril. Mediante «dril» se hace referencia, en conexión con esta invención, al tejido de dril, normalmente prendas de dril, en particular vaqueros. Ventajosamente, el dril es dril teñido de índigo. El dril también se puede tratar con derivados del índigo o con índigo junto a otros colorantes, por ejemplo, dril teñido con índico con rorcual azul.
Las endoglucanasas de fusión son especialmente útiles para el biodesgaste y el bioacabado de los tejidos.
El lavado a la piedra tiene tres etapas: desapresto, desgaste y postratamiento. La primera etapa, el proceso de desapresto, suele ser el primer tratamiento húmedo de los vaqueros y se refiere a la retirada del almidón y de otros aprestos que se suelen aplicar a los hilos tejidos para impedir que se dañen durante la confección del tejido. Se utilizan las α-amilasas para retirar los agentes de apresto a base de almidón para mejorar el procesamiento húmedo, y que sea uniforme. Después de retirar el apresto, los vaqueros se suelen enjuagar con agua o pasan directamente a la etapa de desgaste.
La segunda etapa, el desgaste, se puede realizar con enzimas o con piedra pómez, o con ambos. En todos los casos de acción mecánica se necesita retirar el colorante, y el tratamiento se suele llevar a cabo en lavadoras, como lavadoras de tambor. El término «desgaste» se refiere a la apariencia del tejido dril, cuando se ha tratado con enzimas celulásicas o piedras, o con ambos. Expresiones sinónimas son «aspecto lavado a la piedra» o «aspecto ajado». Como resultado de la retirada desigual del colorante, existe contraste entre las zonas teñidas y las zonas en las que se ha eliminado el colorante.
El desgaste suele ir seguido de la tercera etapa, el postratamiento, que incluye etapas de lavado y enjuagado durante las cuales se pueden usar detergentes, abrillantadores ópticos, blanqueantes o suavizantes. Después del tratamiento enzimático hay que detener la reacción para evitar el deterioro de los materiales tratados, por ejemplo por inactivación por temperatura o por pH, comprendiendo el último un enjuagado exhaustivo y/o eliminación del detergente por lavado. Esto garantiza que la resistencia mecánica de la fibra no se ve comprometida más por la presencia continua de la enzima.
Tal y como se utiliza en el presente contexto, la expresión «biodesgaste» de tejidos o de prendas se refiere al uso de enzimas en lugar, o además de, piedra pómez para el tratamiento de los tejidos o prendas, en espacial del dril.
Tal y como se expuso más arriba, el tratamiento con celulasas puede reemplazar completamente el tratamiento con piedra pómez (por ejemplo, 1 kg de enzima comercial frente a 100 kg de piedras). Sin embargo, el tratamiento con celulasas se puede combinar también con el tratamiento con piedra pómez cuando se desea producir un acabado muy desgastado. Mediante un lavado que combina una celulasa neutra con piedra pómez también se puede conseguir un efecto de piel de melocotón, en el que se crea un recubrimiento fino de parecido a la pelusa. Las proteínas de fusión descritas son especialmente útiles para proporcionar con eficacia un aspecto desgastado y para disminuir al mínimo la retrotinción en el biodesgaste.
El biodesgaste se realiza típicamente a un pH de 3,0 a 8,0, y preferentemente a pH de 5,0 a 7,0. La temperatura de la reacción oscila de 30 ºC a 80 ºC y está preferentemente entre 50 y 60 ºC. La proporción de agua madre (la proporción del volumen de líquido por masa de tejido) puede oscilar de unos 3:1 a 20:1, preferentemente de 5:1 a
10:1. El tiempo de tratamiento puede oscilar entre 15 min y 90 min, y preferentemente de 30 min a 60 min. Hay que recalcar que la dosis de enzima depende en gran parte del tipo de tejidos, la maquinaria, las condiciones del procedimiento (pH, temperatura, proporción de agua madre, tiempo de tratamiento, carga de dril, escala del procedimiento) y el tipo de preparación enzimática y similares. Si se desea, la piedra pómez se puede usar en combinación con las proteínas de fusión de endoglucanasa. La dosis de enzima requerida será pues significativamente menor. Un experto en la técnica es capaz de definir la dosis y condiciones adecuadas.
Las proteínas de fusión de endoglucanasa de la presente invención proporcionan ventajas inesperadas en el sentido de que la actividad enzimática es alta y la retrotinción es baja, lo que produce un contraste muy bueno. Además, las proteínas de fusión se pueden fabricar fácilmente y se pueden usar en un margen relativamente amplio de temperaturas y pH.
Además, las proteínas de fusión de endoglucanasa son útiles para el bioacabado de tejidos y prendas. «Bioacabado» hace referencia al uso de enzimas en una hidrólisis controlada de las fibras celulósicas para modificar la superficie del tejido o del hilo de manera que se impida permanentemente la formación de pelotillas, se mejore el tacto del tejido como suavidad y tersura, se aclare la estructura superficial al reducir las pelusas, lo que da lugar a que los colores sean más nítidos, se mejore la capacidad de drapeado del tejido, se mejore la absorción de la humedad, lo que podría mejorar también la capacidad de tinción.
La eliminación enzimática de la formación de pelotillas se puede llevar a cabo en cualquier momento durante el procesamiento húmedo del tejido, preferentemente después del desapresto y/o blanqueado opcionales, y se pueden utilizar condiciones similares a las del biodesgaste.
Las proteínas de fusión de endoglucanasa que poseen también actividad β-glucanasa, hemicelulasa o xilanasa son útiles adicionalmente para mejorar la calidad de los alimentos para consumo animal, gracias a las cuales el material vegetal se trata con las enzimas.
El almidón, las proteínas y los lípidos se pueden degradar fácilmente en el aparato digestivo de los animales monogástricos, tales como las aves de corral y los cerdos, mientras que la mayor parte de los polisacáridos que no son almidón (NSP por su nombre en inglés), que incluyen β-glucanos con varios tipos enlaces de, por ejemplo, cebada y avena, permanecen intactos debido a que no hay tales actividades enzimáticas en los animales. Aún más, la capacidad de digestión de otros componentes, en particular de las grasas animales, se reduce en presencia de los NSP.
Las β-glucanasas se han utilizado comercialmente para aliviar los problemas ocasionados por los β-glucanos con varios tipos de enlaces de la cebada y de la avena. Las β-glucanasas se sabe que reducen la viscosidad intestinal ocasionada por los β-glucanos solubles, así como la liberación de los nutrientes encapsulados en las paredes celulares ricas en β-glucanos. El uso de las β-glucanasas mejora el funcionamiento animal, que se puede observar como una mayor proporción de conversión entre la ganancia de peso y la alimentación. De igual forma, la incidencia de los excrementos pegajosos en las aves de corral se reduce típicamente.
La granulación al vapor es la principal tecnología de procesamiento de los alimentos en todo el mundo. Sus ventajas sobre la producción de harinas alimenticias incluyen el manejo más fácil, la disminución de sustancias tóxicas y microorganismos, y la mejor eficacia alimentaria de todos. La termotolerancia y la elevada actividad de las proteínas de fusión descritas en la presente invención las hacen adecuadas para aplicaciones en alimentación.
La invención se ilustra mediante los ejemplos no limitantes siguientes. Sin embargo, se debe entender que las realizaciones dadas en la descripción más arriba y en los ejemplos tienen únicamente un propósito ilustrativo, y que se pueden realizar diferentes cambios y modificaciones dentro del alcance de la invención.
Ejemplo 1. Producción de la celulasa EG28 de Thermoascus aurantiacus ALKO4242 en Trichoderma reesei.
Los métodos estándares de biología molecular se utilizaron para el aislamiento y para los tratamientos enzimáticos del ADN (plásmidos, fragmentos del ADN), en las transformaciones de E. coli, etc. Los métodos básicos utilizados se describen en los manuales estándares de biología molecular, p. ej., Sambrook et al., (1989) y Sambrook y Russell (2001).
El gen cel5A de Thermoascus aurantiacus (SEQ ID n.º 1) que codifica la celulasa EG28 (SEQ ID n.º 2) se amplificó por PCR directamente del ADN genómico de T. aurantiacus ALKO4242 aislado por el método de Raeder y Broda (1985). Los cebadores directo (SEQ ID n.º 9) e inverso (SEQ ID n.º 10) se diseñaron sobre la base de la secuencia publicada de la endoglucanasa de T. aurantiacus (AF487830). El producto amplificado de 1,3 kb que contiene el gen exacto (desde el codón de INICIO al codón de PARADA) se clonó como un fragmento SacII-PstI en el vector pBluescript II KS+. Se secuenciaron dos clones independientes y se seleccionó un clon que de denominó pALK1926. El número de depósito de la cepa de E. coli que contiene el pALK1926 en la colección de cultivos Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH es DSM 17326.
Se construyó un plásmido de expresión (pALK1930, figura 1) para la producción de la celulasa recombinante EG28/Cel5A de T. aurantiacus (SEQ ID n.º 2). El gen cel5A, que incluye su propia secuencia señal, se fusionó por PCR exactamente al promotor cbh1 (cel7A) de T. reesei. El promotor cbh1, el terminador cbh1 y el gen marcador amdS se incluyeron como se describe en Paloheimo et al. (2003). El casete de expresión linealizado (figura 1) se aisló del esqueleto del vector mediante la digestión con enzimas de restricción, se introdujo por transformación en T. reesei A96, y se seleccionaron los transformantes con acetamida como única fuente de nitrógeno. La cepa hospedadora carece de las cuatro celulasas endógenas principales: CBHI/Cel7A, CBHII/Cel6A, EGI/Cel7B y EGII/Cel5A. Se realizaron las transformaciones de acuerdo con Penttilä et al., (1987) con las modificaciones descritas en Karhunen et al., (1993). Los transformantes se purificaron en placas de selección mediante conidios únicos antes de esporularlos en PD.
La producción de la celulasa en los transformantes se analizó a partir de sobrenadantes de cultivo de cultivos en matraces (50 ml) en agitación. Los transformantes se hicieron crecer durante 7 días en un medio complejo inductor de celulosa (Joutsjoki et al., 1993) tamponado con KH2PO4 al 5% a pH 5,5. La actividad enzimática de la proteína recombinante se midió a partir del sobrenadante de cultivo como la liberación de azúcares reductores desde la carboximetilcelulosa (CMC al 2%) a 50 ºC en tampón de citrato a 50 mM, pH 4,8, esencialmente como describieron Bailey y Nevalainen, 1981; Haakana et al., 2004. La actividad frente al β-glucano de cebada (1%) también se determinó midiendo la liberación de azúcares reductores a 50 ºC en tampón de acetato a 50 mM, pH 4,8, como se describe en Stålbrand et al. 1993. La producción de la proteína recombinante también se detectó en el sobrenadante de cultivo mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS. Los genotipos de los transformantes elegidos se analizaron mediante transferencia Southern con el casete de expresión como sonda.
El pH óptimo de la celulasa Ta EG28/Cel5A producida heterólogamente se determinó en el tampón universal de MacIlvaine dentro de un intervalo de pH de 4,0 a 8,0 con carboximetilcelulosa como sustrato. Tal y como se muestra en la figura 2A, el pH óptimo para la actividad de la celulasa EG28/Cel5A es de 6,0. La temperatura óptima para la actividad enzimática de la celulasa EG28/Cel5A se determinó que era de 75 ºC (figura 2B).
El transformante elegido (RF6188) se cultivó en un biorreactor para obtener material para la aplicación de pruebas (véase el ejemplo 4).
Ejemplo 2. Producción de la proteína recombinante de fusión EG28+CtCBD de Thermoascus aurantiacus ALKO4242.
Para producir una proteína recombinante de fusión EG28+CtCBD de Thermoascus aurantiacus (SEQ ID n.º 4), el dominio de fijación a la celulosa (CBD) de la celulasa CBHI/Cel7A de Chaetomium thermophilum ALKO4265 se unió a la celulasa EG28/Cel5A. La construcción contiene el dominio catalítico de EG28 (aminoácidos 1 a 334 del polipéptido completo) unido a la región conectora y al CBD de CBHI/Cel7A CtCBD de C. thermophilum (SEQ ID n.º 15).
Se utilizaron métodos estándares de biología molecular como se describe en el ejemplo 1. Primero, se introdujo por PCR un sitio de restricción único SnaBI cerca del extremo carboxilo de la secuencia de EG28/Cel5A. Esto permite la fusión directa de cualquier ADN con extremos romos tras el aminoácido Y334 del polipéptido EG28/Cel5A. El conector y la región CBD del gen que codifica la CBHI/Cel7A de C. thermophilum (cel7A, SEQ ID n.º 7) se amplificó por PCR con los cebadores directo (SEQ ID n.º 11) e inverso (SEQ ID n.º 12) y el ADN genómico de C. thermophilum ALKO4265 como plantilla. El producto amplificado de 1,6 kb se ligó con el gen cel5A (detrás de Y334) para crear Ta cel5A_Ct cel7AconectorCBD (SEQ ID n.º 3). El plásmido resultante se denominó pALK1946. El número de depósito de la cepa de E. coli que contiene el pALK1946 en la colección de cultivos Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH es DSM 18159.
Se construyó un plásmido de expresión (pALK1948, figura 1) para la producción de la celulasa EG28+CtCBD tal y como se describe en el ejemplo 1. El casete de expresión linealizado de 8,9 kb (figura 1) se aisló del esqueleto del vector mediante la digestión con la enzima de restricción NotI, se introdujo por transformación en T. reesei A33 (a la cepa se le han eliminado los genes que codifican las cuatro celulasas principales CBHI/Cel7A, CBHII/Cel6A, EGI/Cel7B y EGII/Cel5A) y se seleccionaron los transformantes como se describe en el ejemplo 1. El pH y la temperatura óptimos de la proteína de fusión se determinó que eran los mismos que los de la proteína EG28 de tipo silvestre.
El transformante elegido (RF6377) se cultivó en un biorreactor para obtener material para los ensayos de aplicación (véanse los ejemplos 5 a 10).
Ejemplo 3. (Referencia) Producción de la proteína de fusión EG40+CtCBD de Acremonium thermophilum ALKO4245
Para la producción de la proteína recombinante de fusión EG40+CtCBD (SEQ ID n.º 6) de Acremonium thermophilum ALKO4245, el dominio de fijación a la celulosa de la celulasa EG40 se reemplaza con el de la CBHI/Cel7A de Chaetomium thermophilum ALKO4265. La construcción contiene el dominio catalítico de la celulasa EG40 (aminoácidos 1 a 234 del polipéptido completo) unido a la región del conector y al CBD de la CBHI/Cel7A de
C. thermophilum (CtCBD, SEQ ID n.º 15).
Los métodos estándares de biología molecular se utilizan como se describe en el ejemplo 1. El gen cel45A de Acremonium thermophilum (SEQ ID n.º 8) se amplifica por PCR a partir del ADN genómico de A. thermophilum ALKO4245 con los cebadores (SEQ ID n.º 13) y (SEQ ID n.º 14). El fragmento de PCR de 1,1 kb se clona como un fragmento SacII-PstI en el vector pBluescript II KS+. Después de esto, se introduce por PCR un sitio de restricción único NruI cerca del extremo carboxilo de la secuencia de EG40. Esto permite la fusión directa de cualquier ADN con extremos romos tras el aminoácido S234 del polipéptido de EG40. El conector más la región CBD de la celulasa CBHI/Cel7A de Chaetomium thermophilum (cel7A) se amplifica por PCR como se describe en el ejemplo 2 y un fragmento de restricción de la misma se ligó con el gen cel45A (después de S234) para crear At cel45A_Ct cel7AconectorCBD (SEQ ID n.º 5). Se construye un plásmido de expresión para la producción de la celulasa EG40+CtCBD y la proteína recombinante (SEQ ID n.º 6) se produce en Trichoderma como se describe en el ejemplo
1.
A la celulasa EG28 de Thermoascus aurantiacus producida en Trichoderma (cepa RF6188) como se describe en el
5 ejemplo 1 se le analizó su capacidad para crear un aspecto desgastado similar al proporcionado por la piedra pómez en el biodesgaste del dril a diferentes temperaturas. Se utilizó como referencia una enzima eficaz de acabado del dril, una preparación comercial de celulasa ácida enriquecida en EGII producida en Trichoderma (patente de los EE.UU. n.º 5 874 293).
Como material de prueba se utilizaron tejanos fabricados con sarga de dril teñida con índigo después de desaprestar
10 con la α-amilasa ECOSTONE® A200. Los tratamientos con celulasa se realizaron con un extractor de lavado FOM 71 CLS Wascator de Electrolux en las condiciones descritas en la tabla 1.
La actividad de la endoglucanasa (ECU) de las preparaciones enzimáticas utilizadas se midió como la liberación de azúcares reductores desde la hidroxietilcelulosa como se describió anteriormente (Bailey y Nevalainen, 1981). El concentrado enzimático enriquecido en EGII y la preparación de EG28 se dosificaron a 220 y unas 380 ECU/g de
15 tejido, respectivamente. Las enzimas se ensayaron en su intervalo óptimo de pH, la preparación de EGII a pH 5 y la preparación de EG28 a pH 6. Después de escurrir, se inactivó la enzima (durante 10 minutos a 40 ºC) al subir el pH por encima de 11 con hidróxido de sodio. Los tejanos se enjuagaron entonces tres veces con agua y se secaron en un tambor.
El nivel del efecto de biodesgaste/abrasión se evaluó midiendo el color como valores de reflectancia con un
20 espectrofotómetro Minolta CM 2500 utilizando las coordenadas espaciales de color L*a*b* (iluminante D65/2º). El color del derecho y del revés del dril, y de los bolsillos, se midió después de desaprestar (a saber, antes del tratamiento con la celulasa) y después del tratamiento con la celulasa. Cada medición del derecho, del revés o de los bolsillos era la media de aproximadamente 40, 20 o 12 mediciones, respectivamente. Se utilizaron dos pares de tejanos en cada prueba y el resultado final era la media de los mismos. Los resultados se muestran en la tabla 2 y
25 en la figura 3.
Tabla 1. Condiciones del ensayo/parámetros del procedimiento utilizados en los tratamientos con las celulasas
- Parámetro del procedimiento
- Carga de dril
- 1,3 kg
- Agua
- 19 litros
- Control de pH (pH 5-5,3) Control de pH (pH 6,1-6,3)
- 35 g de Na2HPO42H2O + 22 g de ácido cítrico 35,5 g de Na2HPO42H2O + 15 g de ácido cítrico
- Tiempo
- 45 min
- Temperatura
- 40, 50, 60 o 70 ºC
- Dosis de la celulasa
- 220 o unas 380 ECU/g de tejido
Tabla 2. Mediciones del color del dril tratado con celulasa EG28 a diferentes temperaturas
El tratamiento con la preparación enriquecida en EGII se utilizó como referencia. L* indica la luminosidad, –b* es la dirección del azul, +b* es la dirección del amarillo.
- Preparación enzimática
- ECU/g de tejido Condiciones Antes del tratamiento con la celulasa Después del tratamiento con la celulasa ∆L* ∆b*
- L*
- b* L* b*
- Derecho:
- EG28
- 380 70 ºC, pH 6,1-6,3 23,67 –16,07 32,63 –16,94 8,96 –0,87
- EG28
- 370 60 ºC, pH 6,1-6,3 23,67 –16,38 31,94 –17,09 8,27 –0,71
- EG28
- 360 50 ºC, pH 6,1-6,3 23,62 –16,24 31,91 –16,86 8,30 –0,63
- EG28
- 380 40 ºC, pH 6,1-6,3 23,75 –16,07 30,57 –17,32 6,82 –1,25
- Enriquecida en EGII
- 220 60 ºC, pH 5,2-5,3 23,45 –16,10 32,90 –17,29 9,46 –1,19
- Revés:
- EG28
- 380 70 ºC, pH 6,1-6,3 49,76 –6,95 49,60 –10,43 –0,16 –3,48
- EG28
- 370 60 ºC, pH 6,1-6,3 49,55 –6,87 50,78 –9,57 1,24 –2,71
- EG28
- 380 50 ºC, pH 6,1-6,3 49,92 –7,05 50,49 –9,83 0,57 –2,78
- EG28
- 380 40 ºC, pH 6,1-6,3 49,89 –6,93 49,73 –9,73 –0,16 –2,80
- Enriquecida en EGII
- 220 60 ºC, pH 5,2-5,3 49,75 –6,82 48,28 –12,26 –1,47 –5,45
- Bolsillos:
- EG28
- 380 70 ºC, pH 6,1-6,3 77,40 –8,14 68,53 –12,60 –8,86 –4,47
- EG28
- 374 60 ºC, pH 6,1-6,3 77,91 –7,71 70,29 –12,34 –7,62 –4,63
- EG28
- 380 50 ºC, pH 6,1-6,3 78,11 –7,62 70,63 –12,02 –7,49 –4,40
- EG28
- 380 40 ºC, pH 6,1-6,3 77,51 –7,60 70,47 –11,91 –7,04 –4,32
- Enriquecida en EGII
- 220 60 ºC, pH 5,2-5,3 77,46 –7,68 66,18 –14,17 –11,29 –6,49
Los resultados de la tabla 2 y de la figura 3 muestran que el mejor efecto de desgaste con la preparación de EG28 (cepa RF6188) se obtuvo en el intervalo de 50 a 70 ºC. Con una dosis de 380 ECU/g de tejido de la preparación de EG28 a 70º C, se obtuvo un nivel de desgaste similar (luminosidad L*) que con la dosis de 220 ECU/g de tejido de una preparación enriquecida en EGII a 60 ºC. Sin embargo, el efecto de retrotinción (redeposición del colorante índigo) en el revés del dril y en los bolsillos era menor con la preparación de EG28 (luminosidad más elevada, menos azul) que con la preparación enriquecida en EGII. De igual forma, el contraste del derecho del dril parecía
5 mejor.
Ejemplo 5. Comportamiento de la proteína de fusión EG28+CtCBD en comparación con la celulasa EG28 en el acabado del dril
La proteína recombinante de fusión EG28+CtCBD de Thermoascus aurantiacus producida en Trichoderma (cepa RF6377) como se describe en el ejemplo 2 se comparó con la preparación de EG28 de la cepa RF6188 en el
10 biodesgaste del dril a pH 6, a 60 ºC. El dril y el sistema de ensayo para biodesgaste fueron como en el ejemplo 4, salvo que la cantidad de dril se niveló a 1430 g con una pieza extra de dril diferente que no se incluyó en las mediciones. El efecto del tratamiento con la celulasa se evaluó como en el ejemplo 4.
Los resultados de la tabla 3 muestran que el efecto de biodesgaste que proporciona la preparación de EG28+CtCBD fue muy bueno a una dosis baja. Con la cepa RF6377 se obtuvo un nivel de desgaste similar (luminosidad L*) con
15 una dosis 6,5 veces más baja que con RF6188. Que la celulasa EG28 lleve unida el dominio de fijación a la celulosa (CBD) no incrementó el efecto indeseable de retrotinción, pero incrementó enormemente el resultado deseado del lavado.
Tabla 3. Mediciones del color del dril tratado con las celulasas EG28 y EG28+CtCBD a 60 ºC, pH 6.
L* indica la luminosidad, –b* es la dirección del azul, +b* es la dirección del amarillo.
- Preparación de enzima
- la ECU/g tejido de Antes del tratamiento con la celulasa Después del tratamiento con la celulasa ∆L* ∆b*
- L*
- b* L* b*
- Derecho:
- EG28
- 325 23,40 –16,02 31,01 –17,12 7,62 –1,10
- EG28+CtCBD
- 50 23,81 –16,21 31,60 –16,92 7,80 –0,71
- Revés:
- EG28
- 325 49,46 –6,83 50,03 –9,62 0,57 –2,79
- EG28+CtCBD
- 50 49,36 –7,03 50,62 –9,61 1,27 –2,58
- Bolsillos:
- EG28
- 325 76,11 –8,36 68,53 –12,46 –7,58 –4,10
- EG28+CtCBD
- 50 76,02 –8,45 68,81 –12,39 –7,21 –3,94
Ejemplo 6. Comportamiento de la celulasa EG28+CtCBD en comparación con la celulasa EGII en relación con el acabado del dril
La proteína recombinante de fusión EG28+CtCBD de Thermoascus aurantiacus producida en Trichoderma (cepa RF6377) se comparó con la preparación comercial de la celulasa ácida enriquecida en EGII (patente de los EE.UU.
25 n.º 5 874 293) con respecto al biodesgaste del dril.
El sistema de ensayo para el biodesgaste fue como en el ejemplo 4, excepto que se utilizaron piezas (perneras) de varios tipos de dril diferentes de Ukos Sport (Bélgica) y Vicunha (Brasil) (en total, 1,2 kg). Las condiciones de tratamiento con EG28+CtCBD y EGII fueron como en la tabla 4. El efecto del tratamiento con la celulasa se evaluó como en el ejemplo 4.
Los resultados de los experimentos realizados con cuatro diferentes tejidos de dril se muestran en las tablas 4 y 5. Cuando se usaba una dosis enzimática por tejido de 500 ECU/g de la preparación de EG28+CtCBD se obtuvo un 5 nivel de luminosidad similar al obtenido con una dosis de 1000 ECU/g de la preparación enriquecida en EGII. El comportamiento de la preparación de EG28+CtCBD requirió más o menos la mitad de la actividad en ECU de la de la celulasa enriquecida en EGII. De igual forma, el medio de cultivo de EG28+CtCBD producido por el hospedador recombinante es volumétricamente unas dos veces más eficaz para el biodesgaste que la EGII que produce el hospedador recombinante. Se observó una retrotinción considerablemente menor en el revés del dril cuando se
10 utilizó la preparación de EG28+CtCBD. El comportamiento de la preparación de EG28+CtCBD a 50 ºC fue mejor a pH 6 que a pH 5.
Tabla 4. Mediciones de color en el derecho del dril tratado con la celulasa EG28+CtCBD a pH 5 y 6. El tratamiento con la preparación enriquecida en EGII se utilizó para la comparación. L+ indica la luminosidad, –b* es la dirección del azul, +b* es la dirección del amarillo.
- Preparación enzimática
- Dril ECU/g de tejido Condiciones Antes del tratamiento con la celulasa Después del tratamiento con la celulasa ∆L* ∆b*
- L*
- b* L* b*
- Enriquecida en EGII
- Atlanta, Ukos sport 1000 pH ajustado con ácido acético, 55 min, 50 ºC, pH 5 19,96 –15,91 27,44 –18,49 7,48 –2,58
- Mathew, Ukos sport
- 18,28 –7,97 21,87 –11,71 3,59 –3,74
- Nostalgy, Ukos sport
- 19,12 –8,78 23,90 –13,50 4,78 –4,72
- Vicunha, Savana
- 17,24 –10,49 21,51 –14,93 4,27 –4,44
- Promedio
- 18,65 –10,79 23,68 –14,66 5,03 –3,87
- EG28+CtCB D
- Atlanta, Ukos sport 500 pH ajustado con ácido acético, 55 min, 50 ºC, pH 5 19,79 –16,02 25,88 –18,44 6,09 –2,42
- Mathew, Ukos sport
- 18,07 –8,58 21,45 –11,80 3,38 –3,22
- Nostalgy, Ukos sport
- 19,05 –8,73 22,65 –12,69 3,60 –3,96
- Vicunha, Savana
- 17,38 –10,11 20,75 –14,18 3,37 –4,07
- Promedio
- 18,57 –10,86 22,68 –14,28 4,11 –3,42
- Preparación enzimática
- Dril ECU/g de Condiciones Antes del tratamiento con Después del tratamiento ∆L* ∆b*
- tejido
- la celulasa con la celulasa
- L*
- b* L* b*
- Atlanta,
- 19,98 –16,18 27,35 –18,20 7,37 –2,02
- Ukos
- sport
- Mathew,
- 17,51 –8,84 21,40 –11,62 3,89 –2,78
- Ukos
- EG28+CtCB
- sport pH ajustado con ácido
- D
- Nostalgy, Ukos sport 500 acético, 55 min, 50 ºC, pH 6 18,58 –8,65 22,96 –12,75 4,38 –4,10
- Vicunha, Savana
- 17,50 –10,16 21,49 –14,06 3,99 –3,90
- Promedio
- 18,39 –10,96 23,30 –14,16 4,91 –3,20
Tabla 5. Mediciones de color en el revés del dril tratado con la celulasa EG28+CtCBD a pH 5 y 6. El tratamiento con la preparación enriquecida en EGII se utilizó para la comparación. L* indica la luminosidad, -b* es la dirección del azul.
- Preparación enzimática
- Dril ECU/g de tejido Condiciones Antes del tratamiento con la celulasa Después del tratamiento con la celulasa ∆L* ∆b*
- L*
- b* L* b*
- Enriquecida en EGII
- Atlanta, Ukos sport 1000 pH ajustado con ácido acético, 55 min, 50 ºC, pH 5 47,98 –7,25 40,18 –14,63 –7,80 –7,38
- Mathew, Ukos sport
- 38,41 –7,17 36,11 –10,93 –2,30 -3,76
- Nostalgy, Ukos sport
- 46,70 –6,06 41,87 –11,73 –4,83 –5,67
- Vicunha, Savana
- 35,65 –9,24 33,48 –12,44 –2,17 –3,20
- Promedio
- 42,19 –7,43 37,91 –12,43 –4,28 –5,00
- EG28+CtCB D
- Atlanta, Ukos sport 500 pH ajustado con ácido acético, 55 min, 50 ºC, pH 5 48,01 –7,29 41,82 –13,25 –6,19 –5,96
- Mathew, Ukos sport
- 37,60 –7,27 35,59 –10,50 –2,01 -3,23
- Preparación enzimática
- Dril ECU/g de tejido Condiciones Antes del tratamiento con la celulasa Después del tratamiento con la celulasa ∆L* ∆b*
- L*
- b* L* b*
- Nostalgy, Ukos sport
- 46,79 –5,99 44,75 –9,37 –2,04 –3,38
- Vicunha, Savana
- 35,08 –9,48 33,72 –11,80 –1,36 –2,32
- Promedio
- 41,87 –7,51 38,97 –11,23 –2,90 –3,72
- EG28+CtCB D
- Atlanta, Ukos sport 500 pH ajustado con ácido acético, 55 min, 50 ºC, pH 6 47,55 –7,43 42,41 –13,30 –5,14 –5,87
- Mathew, Ukos sport
- 37,27 –7,87 36,01 –10,27 –1,26 –2,69
- Nostalgy, Ukos sport
- 47,02 –6,01 44,61 –10,63 –2,41 –4,12
- Vicunha, Savana
- 38,84 –9,39 33,53 –11,20 –1,31 –1,81
- Promedio
- 41,67 –7,60 39,14 –11,23 –2,53 –3,62
Ejemplo 7. Efecto del pH sobre la actividad de la preparación de la celulasa EG28+CtCBD a 50 ºC y 60 ºC.
A la proteína recombinante de fusión EG28+CBD de Thermoascus aurantiacus producida en Trichoderma (cepa RF6377) se le evaluó su comportamiento en el biodesgaste del dril a diferentes valores de pH a 50 ºC y 60 ºC.
5 Como material de ensayo se utilizó la sarga del dril teñida con índigo (diferente a la de los ejemplos anteriores) que se desaprestó y se cortó en trozos. Los tratamientos con la celulasa se realizaron en un Launder Ometer LP-2 del modo siguiente. Unos 7,2 g de tejido de dril (tiras de unos 12 cm x 12 cm), 200 ml de tampón de fosfato y citrato de McIlvaine, y 90 bolas de acero (diámetro de 0,6 cm) se cargaron en contenedores de 1,2 litros. El Launder Ometer se hizo funcionar durante 120 min a diferentes valores de pH de 4 a 8 con temperaturas de 50 ºC y 60 ºC. Después
10 de retirar las tiras de los contenedores, se enjuagaron con agua y se empaparon en agua con NaOH (pH > 11) durante 10 minutos con mezcla continua. Después de eso, las tiras se empaparon en agua con detergente líquido (OMO Color) y se mezclaron durante 10 minutos, y después se enjuagó cuidadosamente varias veces con agua caliente. Las tiras se secaron a temperatura ambiente. Se evaluó el efecto de biodesgaste midiendo el color como unidades de reflectancia como se describe en el ejemplo 4. Cada valor de medida del derecho de la tira de dril era el
15 promedio de al menos 20 mediciones.
Los resultados mostrados en las tablas 6 y 7 y en las figuras 4 y 5 muestran que el intervalo más óptimo de pH para la celulasa EG28+CtCBD a 50º C es de 5,5 a 6,5, y a 60 ºC es 5 a 7.
Tabla 6. Mediciones de color sobre el derecho del dril tratado con la celulasa EG28+CtCBD a valores de pH diferentes en el lavado y blanqueo a 50 ºC.
20 L* indica la luminosidad, –b* es la dirección del azul.
- Preparación enzimática
- ECU/g de tejido Condiciones Antes del tratamiento con la celulasa Después del tratamiento con la celulasa ∆L*
- L*
- b* L* b*
- Tampón de control
- 0 pH 6 17,28 –13,07 18,77 –14,13 1,49
- Control del tampón
- 0 pH8 17,01 –13,4 18,18 –14,45 1,17
- EG28+CtCBD
- 1000 pH 4 16,79 –13,59 20,86 –16,40 4,07
- EG28+CtCBD
- 1000 pH 5 17,34 –13,18 21,59 –16,44 4,25
- EG28+CtCBD
- 1000 pH 5,5 17,30 –13,25 22,06 –16,39 4,76
- EG28+CtCBD
- 1000 pH 6 17,35 –13,42 22,29 –16,47 4,94
- EG28+CtCBD
- 1000 pH 6,5 17,31 –13,41 22,48 –16,65 5,17
- EG28+CtCBD
- 1000 pH 7 17,34 –13,25 21,55 –16,23 4,21
- EG28+CtCBD
- 1000 pH 8 16,91 –13,25 19,92 –15,72 2,71
Tabla 7. Mediciones de color en el derecho del dril tratado con la celulasa EG28+CtCBD a diferentes valores de pH en el Launder a 60 ºC.
La L* indica la luminosidad, –b* es la dirección del azul.
- Preparación enzimática
- ECU/g de tejido Condiciones Antes del tratamiento con la celulasa Después del tratamiento con la celulasa ∆L*
- L*
- b* L* b*
- EG28+CtCBD
- 1000 pH 4 17,19 –13,58 20,48 –15,77 3,29
- EG28+CtCBD
- 1000 pH 5 17,10 –13,24 22,74 –16,59 5,64
- EG28+CtCBD
- 1000 pH 5,5 17,10 –13,54 22,66 –16,61 5,56
- EG28+CtCBD
- 1000 pH 6 17,10 –13,65 22,83 –16,74 5,73
- EG28 + CtCBD
- 1000 pH 6,5 17,19 –13,47 22,65 –11,72 5,46
- EG28+CtCBD
- 1000 pH 7 16,99 –13,72 22,10 –16,66 5,11
- EG28+CtCBD
- 1000 pH 8 17,13 –13,68 19,35 –15,15 2,22
- Control del tampón
- 0 pH 6 17,36 –13,6 18,95 –14,28 1,59
Ejemplo 8. Comportamiento de la preparación de la celulasa EG28+CtCBD sobre el acabado del dril a
A la proteína recombinante de fusión EG28+CtCBD de Thermoascus aurantiacus producida en Trichoderma (cepa RF6377) como se describe en el ejemplo 1 se le analizó a temperaturas diferentes su capacidad para crear un aspecto desgastado similar al proporcionado por la piedra pómez en el biodesgaste del dril. Se utilizaron como
5 referencia las enzimas eficientes de acabado de dril, la preparación comercial de celulasa ácida enriquecida en EGII (patente de los EE.UU. n.º 5 874 293) y la preparación de celulasa neutra ECOSTONE® C1.
El sistema de ensayo para el biodesgaste fue como en el ejemplo 4, salvo que se utilizó sarga de dril diferente y un tiempo de lavado de 55 minutos. Se midió la actividad enzimática (unidad de endoglucanasa, ECU) de las preparaciones enzimáticas de EG28+CtCBD y enriquecidas en EGII como en el ejemplo 4. La actividad (unidad de
10 celulasa neutra, NCU) de la preparación de celulasa neutra ECOSTONE® C1 se midió como la liberación de azúcares reductores desde la carboximetilcelulosa de como se describió anteriormente (Bailey y Nevalainen, 1981; Haakana et al., 2004). Las preparaciones enriquecidas en EGII, de EG28+CtCBD o de ECOSTONE® C1 se dosificaron a 250 NCU/g, 500 ECU/g o 1000 ECU/g de tejido, respectivamente. El efecto del tratamiento con la celulasa se evaluó como en el ejemplo 4.
15 El comportamiento de EG28+CtCBD a temperaturas de 40 a 70 ºC y pH 6 se muestra en la tabla 8 y en la figura 6. El intervalo de temperatura preferente para la enzima es de 50 a 70 ºC. Se pueden utilizar temperaturas más bajas, como 40 ºC, para obtener un efecto de desgaste con menos decoloración si se desea un aspecto más oscuro.
Los resultados también están en concordancia con los obtenidos en el ejemplo 6, en donde el comportamiento de EG28+CtCBD en el biodesgaste se observó que era unas dos veces más eficaz que la preparación comercial de
20 celulasa ácida enriquecida en EGII. Las celulasas ácidas generalmente tienen una tendencia a la retrotinción. Las celulasas neutras, como ECOSTONE® C1, normalmente ocasionan una baja retrotinción que, por lo tanto, da lugar a un buen contraste. Los resultados obtenidos aquí muestran que se obtuvo un efecto similar con la celulasa EG28+CtCBD como con las celulasas neutras (tabla 8).
Tabla 8. Mediciones de color del dril tratado con la celulasa EG28+CtCBD a diferentes temperaturas.
25 Se utilizaron como referencia el tratamiento con la preparación de celulasa ácida enriquecida en EGII y la preparación de celulasa neutra ECOSTONE® C1. L* indica la luminosidad, –b* es la dirección del azul, +b* es la dirección del amarillo.
- Preparación enzimática
- Actividad/g de tejido Condiciones Antes del tratamiento con la celulasa Después del tratamiento con la celulasa ∆L* ∆b*
- L*
- b* L* b*
- Derecho:
- EG28+CBD
- 500 ECU/g 70 ºC, pH 6,2 17,38 –13,49 27,42 –17,27 10,05 –3,78
- EG28+CBD
- 500 ECU/g 60 ºC, pH 6,2 16,76 –13,31 26,01 –17,49 9,25 –4,18
- EG28+CBD
- 500 ECU/g 50 ºC, pH 6,2 16,78 –13,40 25,00 –17,44 8,22 –4,04
- EG28+CBD
- 500 ECU/g 40 ºC, pH 6,2 16,76 –13,21 22,86 –17,25 6,11 – 4,04
- Enriquecida en EGII
- 1000 ECU/g 60 ºC, pH 5,1 17,24 –13,38 26,59 –17,64 9,35 –4,26
- ECOSTONE C1
- 250 NCU/g 60 ºC, pH 6,5 17,38 –13,53 26,91 –16,98 9,53 –3,45
- Revés:
- EG28+CBD
- 500 ECU/g 70 ºC, pH 6,2 45,67 –6,33 41,78 –13,83 –3,90 –7,51
- Preparación enzimática
- Actividad/g de tejido Condiciones Antes del tratamiento con la celulasa Después del tratamiento con la celulasa ∆L* ∆b*
- L*
- b* L* b*
- EG28+CBD
- 500 ECU/g 60 ºC, pH 6,2 45,60 –5,95 42,72 –13,05 –2,88 –7,10
- EG28+CBD
- 500 ECU/g 50 ºC, pH 6,2 45,67 –5,92 41,81 –13,35 –3,86 –7,44
- EG28+CBD
- 500 ECU/g 40 ºC, pH 6,2 45,80 –5,72 41,66 –12,52 –4,14 –6,81
- Enriquecida en EGII
- 1000 ECU/g 60 ºC, pH 5,1 46,10 –6,19 39,89 –15,24 –6,21 –9,06
- ECOSTONE C1
- 250 NCU/g 60 ºC, pH 6,5 45,63 –6,46 42,49 –12,76 –3,14 –6,31
Ejemplo 9. Comportamiento de las celulasas EG28 y EG28+CtCBD en el bioacabado (para evitar la formación de pelotillas)
Se evaluó el comportamiento de la celulasa EG28 de la cepa RF6188 y la preparación de EG28+CtCBD de la cepa
5 RF6377 a la hora de evitar la formación de pelotillas en los géneros de punto de algodón. Los tratamientos con la celulasa se realizaron con un extractor de lavado Wascator FOM 71 CLS de Electrolux en las condiciones descritas en la tabla 9.
Como material de prueba con material de relleno se utilizaron piezas de dos clases de suéteres de cuello de tipo polo de baja calidad con una superficie con pelusa, hecha de tejido para jersey de algodón al 100% o acanalado de 10 algodón al 95% y 5% de Lycra (elastano). Las muestras se prelavaron primero durante 10 minutos a 60 ºC con 1 ml/l de tensioactivos/humectantes (Sandoclean PCJ de Sandos e Imacol CN de Clariant) y se enjuagaron tres veces con agua. Después de esto, las prendas de algodón se trataron con celulasa a 60 ºC durante 60 minutos en presencia de los mismos auxiliares textiles que se utilizaron en el prelavado. La enzima se inactivó como se describe en el ejemplo 4, salvo que la temperatura era de 60 ºC durante el enjuague alcalino. Las piezas del género de punto se
15 enjuagaron tres veces y después se secaron en un tambor.
Tabla 9. Parámetros del procedimiento/condiciones del ensayo utilizados en los tratamientos de bioacabado.
- Parámetro del procedimiento
- Carga del tejido
- 1,0 kg
- Agua
- 15 litros
- Sandoclean PCJ e Imacol CN
- 1 ml/l
- Tampón/control del pH (pH 5-5,3)
- unos 3 ml de ácido acético (80%)
- Tiempo
- 60 min
- Temperatura
- 60 ºC
- Dosis de la celulasa
- 1200 ECU/g de tejido
El efecto del tratamiento con la celulasa se evaluó visualmente a simple vista y con una lupa. Se utilizó como control una muestra del prelavado sin enzima.
Los resultados mostraron que la preparación de EG28+CtCBD mejoró la renuencia a la formación de pelotillas. La pelusa en la superficie del género de punto se redujo considerablemente después del tratamiento con la preparación de EG28+CtCBD en comparación con el control (tratamiento sin enzima). De igual forma, la preparación de EG28 sirvió para impedir la formación de pelotillas.
Ejemplo 10. Prueba de estabilidad durante la granulación de alimentos
Dos preparaciones de celulosa, EG28 (cepa RF6188) y EG28+CtCBD (cepa RF6377) se evaluaron por separado en un experimento que simula un procedimiento de producción industrial de alimentos. Antes de ensayar las preparaciones de EG28 y de EG28+CtCBD secadas por pulverización, se molieron con harina de trigo para mejorar la homogeneidad a nivel del alimento. Las enzimas EG28 o EG28+CtCBD mezcladas previamente con la harina se añadieron a una dosis de 200 g/t y a 500 g/t de alimento, respectivamente. Se utilizó la sobredosificación de la enzima para facilitar el análisis de las muestras granuladas a altas temperaturas, en donde la actividad podría haberse reducido sustancialmente.
El molino y el mezclador se utilizan para producir mezclas de harinas como parte de una planta de alimentos semiindustrial con una capacidad de granulación nominal de 5 t/h. El molino es un molino de martillo Champion equipado con una matriz de Ø 3,0 mm. El material bruto molido se mezcla en un mezclador horizontal de 2500 l a 27 rpm antes de transferirlo a la miniplanta moledora de alimentos. La planta comprende un mezclador horizontal (volumen de 700 l, velocidad de 48 rpm, lotes de mezcla de 300 kg), tornillo de dosificación Skjold TR y un mezclador en cascada Kahl (longitud de 130 cm, diámetro de 30 cm, velocidad de 155 rpm, equipado con 37 palas ajustables). El tiempo de permanencia para 300 kg/h es aproximadamente 30 s. En el costado del mezclador en cascada se halla montado un colector con un descargador de agua y 3 válvulas de vapor desde las que se lleva el vapor hacia la harina. El vapor lo proporciona un hervidor a alta presión con una capacidad máxima de 400 kg de vapor por hora. Las pruebas de realiza a una sobrepresión de 2 atmósferas y el vapor se conduce mediante una válvula de reducción de presión, que controla la adición de vapor al mezclador en cascada. Las tres válvulas del colector se utilizan para el ajuste fino de la temperatura deseada de la harina. La temperatura de la harina se mide con un termómetro digital colocado en la salida del mezclador en cascada, justo antes de que la harina entre en la matriz de granulación. La prensa de granulación es un Simon Heesen, de tipo labor (monorrodillo) con una matriz de Ø 3 mm * 35 mm y un motor de 7,5 kW. Diámetro interior de la matriz: 173 mm, altura del rodillo de la prensa: 50 mm, diámetro del rodillo de la prensa: 140 mm, velocidad de funcionamiento: 500 rpm, y capacidad nominal: 300 kg/h. Las muestras se toman después de la prensa de granulación y se enfriaron en una caja de enfriamiento compartimentada con el fondo perforado, ventilador: 1500 m3 aire/h.
Se fabricó un lote de 300 kg de alimentos molidos con base de trigo. Se fabricó una mezcla previa de 10 kg de esta harina y 200 g (o 500 g) de la enzima de prueba en un mezclador reglamentario de 70 litros. Velocidad del mezclador: 45 rpm. Tiempo de mezcla: 10 min. Esta mezcla previa se añadió con 290 kg del alimento en el mezclador horizontal en la miniplanta de molido de alimentos y se mezcló durante 10 minutos. Después de la toma de muestras del molido, se granuló el alimento a través de una prensa de granulación (matriz de Ø 3 mm). La harina se calentó a la temperatura deseada (65 a 90 ºC) mediante el ajuste de la adición de vapor al mezclador en cascada. Para cada temperatura se tomó la primera muestra 10 minutos después de alcanzar la temperatura de granulación deseada (que se midió en la harina antes de la granulación). Se tomaron muestras durante 1,0 min que correspondían a 5,0 kg de alimento sedimentado. Se tomó la muestra como submuestras de aproximadamente 500 g y se colocaron en una caja de enfriamiento durante 10-15 s después de que los gránulos hubieran salido de la prensa de granulación. Todas las muestras se airearon y se enfriaron a temperatura ambiente durante 15 minutos. Las muestras se submuestrearon homogéneamente en un divisor de muestras desarenador y se llenaron en bolsas de plástico.
Las muestras se analizaron del siguiente modo: 2,5 g de muestra bien molida y 20 ml de tampón de acetato (0,05 M, pH 5,0) se agitaron durante 30 min a temperatura ambiente, se centrifugaron (10 min, 4000 rpm) y se diluyeron. Se equilibró 1,0 ml de muestra límpida por triplicado durante 5 minutos en un baño María a 40 ºC. La reacción se inició añadiendo un comprimido de β-Glucazyme (Megazyme, Irlanda) sin agitación. Después de exactamente 30 minutos, se detuvo la reacción con la adición de 5,0 ml de Trizma base al 1% (p/v) (Sigma-Aldrich) con una agitación vigorosa en un mezclador vorticial. El tubo se dejó a temperatura ambiente durante unos 5 minutos; la suspensión viscosa se agitó de nuevo y se filtró a través de papel de filtro Whatman 1. Se midió la absorbancia del filtrado a 590 nm. Los resultados se analizaron con una curva estándar.
La recuperación de la actividad enzimática antes y después de la granulación se presenta en la tabla 10. La influencia de temperatura de granulación sobre la recuperación de la actividad de la β-glucanasa también se ha presentado también en las figuras 7 y 8. Las celulasas EG28 y EG28+CtCBD eran estables incluso a 80 ºC. La celulasa EG28+CtCBD tendía a ser más estable que EG28 a la temperatura de granulación de 90 ºC.
Tabla 10. Recuperación de la actividad enzimática antes (harina del mezclador horizontal) y después de la
granulación a temperaturas que oscilan de 65 a 90 ºC.
- Temperatura de granulación
- Actividad β-glucanasa (FBU/kg de alimento)
- (EG28)
- (EG28+CtCBD)
- Harina del mezclador horizontal
- 239 000 ± 9 000 (100%) 1 148 000 ± 48 000 (100%)
- Gránulo (65 ºC)
- 227 000 ± 16 000 (95%) 1 00 7 000 ± 67 000 (88%)
- Gránulo (70 ºC)
- 217 000 ± 5 000 (91%) 1 012 000 ± 54 000 (88%)
- Gránulo (75 ºC)
- 227 000 ± 14 000 (95%) 993 000 ± 49 000 (86%)
- Gránulo (80ºC)
- 215 000 ± 6 000 (90%) 1 030 000 ± 87 000 (90%)
- Gránulo (85ºC)
- 188 000 ± 7000 (79%) 904 000 ± 56 000 (79%)
- Gránulo (90ºC)
- 149 000 ± 8 200 (62%) 861 000 ± 32 000 (75%)
Lista de organismos depositados
- Cepa
- Plásmido contenido Autoridad del depósito Fecha del depósito Número de depósito
- Acremonium thermophilum ALKO4245
- - CBS(1) 20 de septiembre de 2004 CBS 116240
- Thermoascus aurantiacus ALKO4242
- - CBS(1) 20 de septiembre de 2004 CBS 116239
- Chaetomium thermophilum ALKO4265
- _ CBS(2) 8 de noviembre de 1995 CBS 730.95
- Escherichia coli
- pALK1946 DSMZ(3) 7 de abril de 2006 DSM 18159
- Escherichia coli
- pALK1926 DSMZ 13 de mayo de 2005 DSM 17326
5 (1) Centralbureau Voor Schimmelcultures en Uppsalalaan, 8, 3584 CT, Utrech, Países Bajos.
- (2)
- Centralbureau Voor Schimmelcultures en Oosterstraat 1, 3742 SK BAARN, Países Bajos.
- (3)
- Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Mascheroder Weg 1 b, D38124 Braunschweig, Alemania.
10 Altschul SF, W Gish, W Miller, EW Myers y DJ Lipman. 1990. Basic local alignment search tool. J. Mol. Biol. 215: 403-410.
Bailey MJ y KMH Nevalainen 1981. Induction, isolation and testing of stable Trichoderma reesei mutants with improved production of solubilizing cellulase. Enz Microbiol Technol. 3: 153-157.
Bendtsen J. D., Nielsen H., von Heijne G. y Brunak S. (2004) lmproved prediction of signal peptides: Signa|P 3.0. J. 15 Mol. Biol. 340: 783-795.
Gasteiger, E, A Gattiker, C Hoogland, I lvanyi, RD Appel y A Bairoch. 2003. ExPASy: the proteomics server for indepth protein knowledge and analysis. Nucleic Acids Res. 31: 3784-3788.
Haakana H, A Miettinen-Oinonen, V Joutsjoki, A Mäntylä, P Suominen, y J Vehmaanperä. 2004. Cloning of cellulase genes from Melanocarpus albomyces and their efficient expression in Trichoderma reesei. Enz Microbiol Technol. 34: 159-167.
Henrissat B. (1991) A classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities. Biochem. J.
280: 309-316.
Henrissat B. y Bairoch A. (1993) New families in the classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities. Biochem. J. 293: 781-788.
Henrissat B. y Bairoch A. (1996).Updating the sequence-based classilication of glycosyl hydrolases. Biochem. J. 316: 695-696.
Hong J., H. Tamaki, K. Yamamoto, y H. Kumagai. 2003. Cloning of a gene encoding a thermo-stabile endo-β-1,4glucanase from Thermoascus aurantiacus and its expression in yeast. Biotech. Letters 25:657-661.
IUPAC (lntemational Union of Pure and Applied Chemistry) (1987). Measurement of cellulase activities. Pure and Appl. Chem. 59:257-268.
Joutsjoki, VV, TK Torkkeli y KMH Nevalainen. 1993. Transformation of Trichoderma reesei with the Hormoconis resinae glucoamylase P (gamP) gene: production of a heterologous glucoamylase by Trichoderma reesei. Curr. Genet. 24:223-228.
Karhunen T, A Mäntylä, KMH Nevalainen y PL Suominen. 1993. High frequency one-step gene replacement in Trichoderma reesei. I. Endoglucanase I overproduction. Mol. Gen. Genet. 241:515-522.
Malardier L, Daboussi MJ , Julien J, Roussel F, Scazzocchio C y Brygoo Y. 1989. Cloning of the nitrate reductase gene (niaD) of Aspergillus nidulans and its use for transformation of Fusarium oxysporum. Gene 15:147-156.
Needleman S. y Wunsch C. (1970) A general method applicable to the search for similarities in the amino acid sequence of two proteins. Journal of Molecular Biology 48, 443-453.
Nielsen H., Engelbrecht J., Brunak S. y von Heijne G. (1997) Identification of prokaryotic and eykaryotic signal peptides and prediction of their cleavage sites. Protein Engineering 10: 1-6.
Paloheimo M, A Mäntylä, J Kallio, y P Suominen. 2003. High-yield production of a bacterial xylanase in the filamentous fungus Trichoderma reesei requires a carrier polypeptide with an intact domain structure. Appl. Env. Microbiol. 69:7073-7082.
Penttilä M, H Nevalainen, M Rättö, E Salminen y J Knowles. 1987. A versatile transformation system for the cellulolytic tilamentous fungus Trichoderma reesei. Gene 61:155-164.
Raeder U y P Broda. 1985. Rapid preparation of DNA from filamentous fungi. Lett. Appl. Microbiol. 1:17-20.
Rice P, Longden I y Bleasby A. (2000). EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite. Trends in Genetics 16:276-277.
Sambrook J, EF Fritsch y T Maniatis. 1989. Molecular cloning, a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York, Estados Unidos.
Sambrook J y DW Russell. 2001. Molecular cloning, a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York, Estados Unidos.
Srisodsuk M, Reinikainen T, Penttiäa M y Teeri T. (1993) Role of the interdomain linker peptide of Trichoderma reesei cellobiohydrolase I in its interaction with crystalline cellulose. J. Biol. Chem. Oct 5;268(28): 20756-61.
Stålbrand H, Siika-aho M, Tenkanen M y L Viikari. 1993. J. Biotechnol. 29: 229-242.
Ward M, Shan W, Dauberman J, Weiss G, Larenas E, Bower B, Rey M, Clarkson K y Bott R. (1993) Cloning, sequence and preliminary structural analysis of a small, high pl endoglucanase (EGIII) from Trichoderma reesei. Proceedings of the second TRICEL symposium on TRICHODERMA REESEI CELLULASES AND OTHER HYDROLASES, Espoo, Finland, 1993, ed. por P. Suominen y T. Reinikainen. Foundation for Biotechnical and lndustrial Fermentation Research 8 (1993): 153-158.
<110> AB Enzymes Oy
<120> Proteínas de fusión de enzimas y uso de las mismas
<130> 2060570
<160> 15
<170> PatentIn versión 3.2
<210> 1
<211> 1317
<212> DNA
<213> Thermoascus aurantiacus
<220>
<221> gen
<222> (1)..(1317)
<220>
<221> Intrón
<222> (107)..(161)
<220>
<221> Intrón
<222> (221)..(280)
<220>
<221> Intrón
<222> (434)..(492)
<220>
<221> Intrón
<222> (558)..(631)
<220>
<221> Intrón
<222> (730)..(790)
<400> 1
<210> 2
<211> 335
- <212>
- PRT 10 <213> Thermoascus aurantiacus
<400> 2
<210> 3
<211> 1621
- <212>
- DNA 5 <213> Thermoascus aurantiacus
<220>
<221> gen
- <222>
- (1)..(1621) 10
<220>
<221> Intrón
<222> (107)..(161)
<220>
<221> Intrón
- <222>
- (221)..(280) 5
<220>
<221> Intrón
<222> (434)..(492)
10 <220>
<221> Intrón
<222> (558)..(631)
<220> 15 <221> Intrón
<222> (730)..(790)
<220>
<221> Intrón 20 <222> (1549)..(1612)
<400> 3 <210> 4
<211> 415 5 <212> PRT
<213> Thermoascus aurantiacus
<400> 4
<210> 5
5 <211> 1211
<212> DNA
<213> Acremonium thermophilum
<220> 10 <221> gen
<222> (13)..(1206)
<220>
<221> Intrón 15 <222> (96)..(154)
<220>
<221> Intrón
<222> (404)..(526)
5 <220>
<221> Intrón
<222> (1134)..(1197)
<400> 5
<210> 6
- <211>
- 315 15 <212> PRT
<213> Acremonium thermophilum
<400> 6
<210> 7
- <211>
- 1663 5 <212> DNA
<213> Chaetomium thermophilum
<220> <221> gen
<222> (1)..(1663)
<220> 5 <221> Intrón
<222> (1591)..(1654)
<400> 7 <210> 8
<211> 1076 5 <212> DNA
<213> Acremonium thermophilum <220>
<221> gen
<222> (1)..(1076)
5 <220>
<221> Intrón
<222> (84)..(142)
<220> 10 <221> Intrón
<222> (392)..(514)
<400> 8
<210> 9
- <211> 45 <212> DNA <213> Thermoascus aurantiacus
- <400> 9 attaaccgcg gactgcgcat catgaagctc ggctctctcg tgctc
- 45
- <210> 10 <211> 29 <212> DNA <213> Thermoascus aurantiacus
- <400> 10 aactgaggca tagaaactga cgtcatatt <210> 11 <211> 28 <212> DNA <213> Chaetomium thermophilum
- 29
- <400> 11 taatttacgt acctggcctt gacggcag
- 28
- <210> 12 <211> 30 <212> DNA <213> Chaetomium thermophilum
- <400> 12 attaactgca gttacaggca ctgttgagca
- 30
- <210> 13 <211> 42 <212> DNA <213> Acremonium thermophilum
- <400> 13 attaaccgcg gactgcgcat catgcgctcc tcaccctttc tc
- 42
- 5
- <210> 14 <211> 33 <212> DNA <213> Acremonium thermophilum
- 10
- <400> 14 ttaatctgca gtcacagaca ctgggaatac cac 33
- 15
- <210> 15 <211> 81 <212> PRT <213> Chaetomium thermophilum
- <400> 15
Claims (15)
- REIVINDICACIONES
- 1.
- Proteína de fusión de celulasa que comprende una primera secuencia de aminoácidos de un núcleo de endoglucanasa que tiene al menos una identidad del 75% con la SEQ ID n.º 2, o un fragmento de la misma que tiene actividad celulasa, y una segunda secuencia de aminoácidos que comprende un conector y un dominio de fijación a la celulosa (CBD) que tiene al menos una identidad del 75% con la SEQ ID n.º 15, o un fragmento de la misma que tiene actividad de fijación a la celulosa.
-
- 2.
- Proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 1, en la que el núcleo de endoglucanasa tiene al menos el 80% de identidad con la SEQ ID n.º 2, o un fragmento de la misma que tiene actividad celulasa.
-
- 3.
- Proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 1, en la que el conector y el CBD tienen al menos el 80% de identidad con la SEQ ID n.º 15, o un fragmento de la misma que tiene actividad de fijación a la celulosa.
-
- 4.
- Proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 1, en la que el núcleo de endoglucanasa comprende la secuencia de SEQ ID n.º 2, y el conector y el CBD comprenden la secuencia de SEQ ID n.º 15.
-
- 5.
- Proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID n.º 4, o un fragmento de la misma que tiene actividad celulasa y actividad de fijación a la celulosa.
-
- 6.
- Proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 1, en la que el núcleo de endoglucanasa está codificado por un gen similar al incluido en E. coli DSM 17326, o cuya proteína de fusión está codificada por una fusión génica similar a la incluida en E. coli DSM 18159.
-
- 7.
- Polinucleótido aislado seleccionado entre el grupo que consiste en:
a) una secuencia de nucleótidos de SEQ ID n.º 3, o una secuencia que codifica una proteína de fusión de celulasa de acuerdo con la reivindicación 1,b) una hebra complementaria de a). -
- 8.
- Vector de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la reivindicación 7.
-
- 9.
- Célula hospedadora que comprende el vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 8.
-
- 10.
- Método para producir una proteína de fusión de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende las etapas de transformar una célula hospedadora con un vector de expresión que codifica dicha proteína de fusión y cultivar dicha célula hospedadora en condiciones que permiten la expresión de dicha proteína de fusión y, opcionalmente, recuperar y purificar la proteína de fusión producida.
-
- 11.
- Preparación enzimática, que comprende la proteína de fusión de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.
-
- 12.
- Procedmiento para tratar material celulósico, en donde dicho procedimiento comprende poner en contacto el material celulósico con la proteína de fusión de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, o con la preparación enzimática de acuerdo con la reivindicación 11.
-
- 13.
- Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 12, en el que el material celulósico es material textil, plantas utilizadas en alimentos para consumo animal, o pasta de papel o fibra secundaria procedente de madera.
-
- 14.
- Alimento para consumo animal, que comprende la proteína de fusión de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.
-
- 15.
- Cepa de Escherichia coli que tiene el número de acceso DSM 18159.
Figura 1prom cbh1 term cbh1Figura 2 (A)3,5 4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0 8,5Figura 2 (B)Figura 4Figura 6Figura 8
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US404065 | 2006-04-13 | ||
| US11/404,065 US7361487B2 (en) | 2006-04-13 | 2006-04-13 | Enzyme fusion proteins and their use |
| FI20065234 | 2006-04-13 | ||
| FI20065234A FI119434B (fi) | 2006-04-13 | 2006-04-13 | Entsyymifuusioproteiineja ja niiden käyttö |
| PCT/FI2007/050196 WO2007118935A1 (en) | 2006-04-13 | 2007-04-12 | Enzyme fusion proteins and their use |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2384276T3 true ES2384276T3 (es) | 2012-07-03 |
Family
ID=38609079
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES07730683T Active ES2384276T3 (es) | 2006-04-13 | 2007-04-12 | Proteínas de fusión de celulasas y uso de las mismas |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP2007884B1 (es) |
| KR (1) | KR101439352B1 (es) |
| BR (1) | BRPI0710187B1 (es) |
| CA (1) | CA2648926C (es) |
| DK (1) | DK2007884T3 (es) |
| ES (1) | ES2384276T3 (es) |
| MX (1) | MX2008013143A (es) |
| MY (1) | MY149883A (es) |
| PL (1) | PL2007884T3 (es) |
| RU (1) | RU2458127C2 (es) |
| WO (1) | WO2007118935A1 (es) |
Families Citing this family (20)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| PL2242829T3 (pl) * | 2008-01-04 | 2013-08-30 | Procter & Gamble | Kompozycja detergentu piorącego zawierająca hydrolazę glikozylową oraz korzystny składnik zawierający cząstkę przenoszącą |
| EP2242830B2 (en) * | 2008-01-04 | 2020-03-11 | The Procter & Gamble Company | Enzyme and fabric hueing agent containing compositions |
| FI122028B (fi) | 2008-12-30 | 2011-07-29 | Ab Enzymes Oy | Sieniperäiset endoglukanaasit, niiden tuotto ja käyttö |
| BRPI0923993A2 (pt) | 2009-03-12 | 2016-01-26 | Ind Nutrigrains S A De C V | proteína vegetal híbrida e métdo para obter uma proteína vegetal híbrida |
| US9334515B2 (en) | 2010-07-30 | 2016-05-10 | The Regents Of The University Of California | Polypeptides for use in the deconstruction of cellulose |
| AU2011283091B2 (en) * | 2010-07-30 | 2014-04-10 | The Regents Of The University Of California | Polypeptides for use in the deconstruction of cellulose |
| KR20140018890A (ko) | 2011-02-09 | 2014-02-13 | 노보자임스 에이/에스 | 탈필링을 위한 셀룰라제 효소 혼합물 및 그것의 이용 |
| EP2753749B1 (en) | 2011-09-09 | 2019-03-27 | Novozymes A/S | Improving properties of paper materials |
| FI124476B (en) * | 2012-05-24 | 2014-09-15 | Roal Oy | Improved endoglucanases for handling cellulosic material |
| US8975058B2 (en) | 2012-05-24 | 2015-03-10 | Roal Oy | Endoglucanases for treatment of cellulosic material |
| EP3189137A1 (en) | 2014-09-05 | 2017-07-12 | Novozymes A/S | Carbohydrate binding module variants and polynucleotides encoding same |
| WO2016040265A1 (en) | 2014-09-08 | 2016-03-17 | Novozymes A/S | Cellobiohydrolase variants and polynucleotides encoding same |
| FI127093B (en) | 2014-10-27 | 2017-11-15 | Ab Enzymes Oy | Fungal-derived endoglucanase variants, their production and use |
| US10392742B2 (en) | 2015-06-26 | 2019-08-27 | Novozymes A/S | Biofinishing system |
| EP3192866A1 (en) * | 2016-01-15 | 2017-07-19 | CIC nanoGUNE - Asociación Centro de Investigación Cooperativa en Nanociencias | Endocellulases and uses thereof |
| ES2697920B2 (es) * | 2017-07-26 | 2019-06-27 | Abengoa Bioenergia Nuevas Tecnologias Sa | Celulasas con actividad celulolitica mejorada |
| US20210009927A1 (en) * | 2018-04-17 | 2021-01-14 | Novozymes A/S | Polypeptides Comprising Carbohydrate Binding Activity in Detergent Compositions And Their use in Reducing Wrinkles in Textile or Fabrics |
| EP3653706A1 (en) * | 2018-11-13 | 2020-05-20 | AB Enzymes Oy | Fusion protein |
| CN109989271B (zh) * | 2019-04-10 | 2021-07-13 | 杭州优标科技有限公司 | 一种大米蛋白再生纤维素纤维的制备方法 |
| US20220204956A1 (en) * | 2020-12-22 | 2022-06-30 | Fornia Biosolutions, Inc. | Additional Endoglucanase Variants and Methods |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101173263A (zh) * | 1995-03-17 | 2008-05-07 | 诺沃奇梅兹有限公司 | 新的内切葡聚糖酶 |
| AU7564198A (en) * | 1998-05-01 | 1999-11-23 | Procter & Gamble Company, The | Laundry detergent and/or fabric care compositions comprising a modified cellulase |
| AU2001258799A1 (en) * | 2000-05-22 | 2001-12-03 | Meiji Seika Kaisha Ltd. | Endoglucanase nce5 and cellulase preparations containing the same |
| AU2002316809A1 (en) * | 2001-06-26 | 2003-01-08 | Novozymes A/S | Polypeptides having cellobiohydrolase i activity and polynucleotides encoding same |
| WO2007071820A1 (en) * | 2005-12-22 | 2007-06-28 | Ab Enzymes Oy | Novel enzymes |
-
2007
- 2007-04-12 EP EP07730683A patent/EP2007884B1/en active Active
- 2007-04-12 CA CA2648926A patent/CA2648926C/en active Active
- 2007-04-12 MY MYPI20084042A patent/MY149883A/en unknown
- 2007-04-12 WO PCT/FI2007/050196 patent/WO2007118935A1/en active Application Filing
- 2007-04-12 KR KR1020087027407A patent/KR101439352B1/ko active IP Right Grant
- 2007-04-12 RU RU2008140061/10A patent/RU2458127C2/ru active
- 2007-04-12 BR BRPI0710187A patent/BRPI0710187B1/pt active IP Right Grant
- 2007-04-12 ES ES07730683T patent/ES2384276T3/es active Active
- 2007-04-12 PL PL07730683T patent/PL2007884T3/pl unknown
- 2007-04-12 DK DK07730683.5T patent/DK2007884T3/da active
- 2007-04-12 MX MX2008013143A patent/MX2008013143A/es active IP Right Grant
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR101439352B1 (ko) | 2014-09-16 |
| EP2007884B1 (en) | 2012-05-16 |
| WO2007118935A8 (en) | 2009-07-30 |
| CA2648926C (en) | 2015-11-24 |
| CA2648926A1 (en) | 2007-10-25 |
| WO2007118935A1 (en) | 2007-10-25 |
| KR20090006182A (ko) | 2009-01-14 |
| BRPI0710187A8 (pt) | 2016-04-19 |
| BRPI0710187B1 (pt) | 2017-02-21 |
| RU2008140061A (ru) | 2010-05-20 |
| RU2458127C2 (ru) | 2012-08-10 |
| BRPI0710187A2 (pt) | 2011-08-09 |
| DK2007884T3 (da) | 2012-06-18 |
| MX2008013143A (es) | 2008-12-12 |
| EP2007884A1 (en) | 2008-12-31 |
| MY149883A (en) | 2013-10-31 |
| EP2007884A4 (en) | 2010-07-14 |
| PL2007884T3 (pl) | 2012-08-31 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2384276T3 (es) | Proteínas de fusión de celulasas y uso de las mismas | |
| EP1683860B1 (en) | Novel endoglucanases | |
| EP1969123B1 (en) | Novel enzymes | |
| FI122028B (fi) | Sieniperäiset endoglukanaasit, niiden tuotto ja käyttö | |
| US7256032B2 (en) | Enzymes | |
| US7741093B2 (en) | Cellulases and their uses | |
| US7361487B2 (en) | Enzyme fusion proteins and their use | |
| CN101346464B (zh) | 新型酶 | |
| CN101460617A (zh) | 酶融合蛋白及其应用 |