FI119434B - Entsyymifuusioproteiineja ja niiden käyttö - Google Patents

Entsyymifuusioproteiineja ja niiden käyttö Download PDF

Info

Publication number
FI119434B
FI119434B FI20065234A FI20065234A FI119434B FI 119434 B FI119434 B FI 119434B FI 20065234 A FI20065234 A FI 20065234A FI 20065234 A FI20065234 A FI 20065234A FI 119434 B FI119434 B FI 119434B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
fusion protein
cellulase
gly
thr
ser
Prior art date
Application number
FI20065234A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI20065234A0 (fi
FI20065234A (fi
Inventor
Jari Vehmaanperae
Leena Valtakari
Jarno Kallio
Pentti Ojapalo
Marika Alapuranen
Original Assignee
Ab Enzymes Oy
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ab Enzymes Oy filed Critical Ab Enzymes Oy
Publication of FI20065234A0 publication Critical patent/FI20065234A0/fi
Priority to FI20065234A priority Critical patent/FI119434B/fi
Priority to CN2007800203080A priority patent/CN101460617B/zh
Priority to KR1020087027407A priority patent/KR101439352B1/ko
Priority to PL07730683T priority patent/PL2007884T3/pl
Priority to ES07730683T priority patent/ES2384276T3/es
Priority to MYPI20084042A priority patent/MY149883A/en
Priority to DK07730683.5T priority patent/DK2007884T3/da
Priority to MX2008013143A priority patent/MX2008013143A/es
Priority to PCT/FI2007/050196 priority patent/WO2007118935A1/en
Priority to EP07730683A priority patent/EP2007884B1/en
Priority to BRPI0710187A priority patent/BRPI0710187B1/pt
Priority to CA2648926A priority patent/CA2648926C/en
Priority to RU2008140061/10A priority patent/RU2458127C2/ru
Publication of FI20065234A publication Critical patent/FI20065234A/fi
Priority to ZA200808656A priority patent/ZA200808656B/xx
Application granted granted Critical
Publication of FI119434B publication Critical patent/FI119434B/fi

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2437—Cellulases (3.2.1.4; 3.2.1.74; 3.2.1.91; 3.2.1.150)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K10/00—Animal feeding-stuffs
    • A23K10/10—Animal feeding-stuffs obtained by microbiological or biochemical processes
    • A23K10/14—Pretreatment of feeding-stuffs with enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
    • C11D3/00—Other compounding ingredients of detergent compositions covered in group C11D1/00
    • C11D3/16—Organic compounds
    • C11D3/38—Products with no well-defined composition, e.g. natural products
    • C11D3/386—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase
    • C11D3/38645—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase containing cellulase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01004—Cellulase (3.2.1.4), i.e. endo-1,4-beta-glucanase
    • D—TEXTILES; PAPER
    • D06—TREATMENT OF TEXTILES OR THE LIKE; LAUNDERING; FLEXIBLE MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • D06M—TREATMENT, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE IN CLASS D06, OF FIBRES, THREADS, YARNS, FABRICS, FEATHERS OR FIBROUS GOODS MADE FROM SUCH MATERIALS
    • D06M16/00—Biochemical treatment of fibres, threads, yarns, fabrics, or fibrous goods made from such materials, e.g. enzymatic
    • D06M16/003—Biochemical treatment of fibres, threads, yarns, fabrics, or fibrous goods made from such materials, e.g. enzymatic with enzymes or microorganisms
    • D—TEXTILES; PAPER
    • D06—TREATMENT OF TEXTILES OR THE LIKE; LAUNDERING; FLEXIBLE MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • D06P—DYEING OR PRINTING TEXTILES; DYEING LEATHER, FURS OR SOLID MACROMOLECULAR SUBSTANCES IN ANY FORM
    • D06P5/00—Other features in dyeing or printing textiles, or dyeing leather, furs, or solid macromolecular substances in any form
    • D06P5/02—After-treatment
    • D—TEXTILES; PAPER
    • D21—PAPER-MAKING; PRODUCTION OF CELLULOSE
    • D21C—PRODUCTION OF CELLULOSE BY REMOVING NON-CELLULOSE SUBSTANCES FROM CELLULOSE-CONTAINING MATERIALS; REGENERATION OF PULPING LIQUORS; APPARATUS THEREFOR
    • D21C5/00—Other processes for obtaining cellulose, e.g. cooking cotton linters ; Processes characterised by the choice of cellulose-containing starting materials
    • D21C5/005—Treatment of cellulose-containing material with microorganisms or enzymes

Description

119434
Entsyymifuusioproteiineja ja niiden käyttö
Keksinnön ala
Esillä oleva keksintö koskee entsyymitekniikkaa ja tarkemmin sellu-laasifuusioproteiineja, jotka käsittävät katalyyttisen domeenin ja selluloosaa si-5 tovan domeenin. Fuusioproteiinit voidaan tuottaa rekombinanttitekniikoilla käyttäen tarkoituksenmukaisia polynukleotideja, ekspressiovektoreita ja isäntäsolu-ja, jotka myös kuuluvat keksintöön. Fuusioproteiinit ja niiden entsyymivalmis-teet ovat käyttökelpoisia selluloosamateriaalin, kuten tekstiilimateriaali, käsittelemisessä. Lisäksi fuusioproteiineja voidaan käyttää massa- ja paperiteollisuu-10 dessa, öljyn uutossa kasveista, pesuainekoostumuksissa ja eläinten rehun laadun parantamiseen. Keksintö siten edelleen koskee prosessia selluloosa-materiaalin käsittelemiseen fuusioproteiinilla ja erityisesti prosesseja kankaiden tai vaatteiden, erityisesti denimin, biokivipesuun tai bioviimeistelyyn. Keksintö vielä edelleen koskee pesuainekoostumuksia ja eläinten rehua, jotka sisältävät 15 fuusioproteiineja.
Keksinnön tausta
Selluloosa on korkeampien kasvien päärakennekomponentti ja esiintyy luonnostaan melkein puhtaassa muodossa vain puuvillakuidussa. Se varustaa kasvisolut korkealla vetolujuudella auttaen niitä vastustamaan me- .,)·* 20 kaanista kuormitusta ja osmoottista painetta. Selluloosa on β-1,4-sidosten yh- :*·]: distämien glukoosiosien suoraketjuinen polysakkaridi. Luonnossa selluloosa :*·.· liitetään yleensä ligniiniin ja hemisellulooseihin. Useat erilaiset organismit, mu- • · : .·. kaan lukien bakteerit ja sienet, hajottavat selluloosamateriaalia luonnossa. Sel- luloosan biologinen muuttaminen glukoosiksi vaatii yleisesti entsyymien kolme • · * .I”, 25 pääryhmää: sellobiohydrolaasit (CBH), endoglukanaasit (EG) ja beta-glukosi- **“* daasit (BG).
On olemassa sellulaasien teollisten sovellusten laaja kirjo. Tekstiili- • ♦ : ** teollisuudessa sellulaaseja käytetään denimin viimeistelyssä muodikkaan kivi- ««· pestyn ulkomuodon luomiseksi denim-kankaille biokivipesuprosessissa. Sellu- ;*··. 30 laaseja käytetään myös esimerkiksi poistamaan nukkaa ja ehkäisemään nyp- * .···. pyjen muodostumista puuvillavaatteiden pintaan. Pesuaineteollisuudessa sei- • · /·) lulaaseja käytetään kirkastamaan värejä ja ehkäisemään vaatteiden harmaan- : tuminen ja nyppyyntyminen. Sellulaaseja käytetään edelleen elintarviketeolli- ««* suudessa ja eläinten rehun valmistamisessa ja niillä on suuri potentiaali mas- 2 119434 sa- ja paperiteollisuudessa, esimerkiksi siistauksessa vapauttamaan väriä kuitupinnoista ja parantamaan vedenpoistoa massasta.
Teollisesti käytetyt sellulaasit ovat usein entsyymien seoksia, joilla on useita eri aktiivisuuksia ja substraattispesifisyyksiä. Kaupalliset entsyymi-5 valmisteet usein käsittävät kaikkia kolmea sellulaasiaktiivisuutta ts. CBH, EG ja BG. Lisäksi kunkin sellulaasin ainutlaatuiset ominaisuudet tekevät joistakin sopivampia tiettyihin tarkoituksiin kuin toisista ja siksi on myös tehty pyrkimyksiä sellulaasien, joilla on vain toivotut aktiivisuudet, saamiseksi ja käyttämiseksi. Laajimmin käytetyt sieniperäiset sellulaasit ovat peräisin Trichoderma reeseis-10 tä. Kuitenkin myös muita sienilähteitä on ehdotettu esimerkiksi julkaisussa US 5 457 046.
Denim in käsittelyssä käytetyt sellulaasit jaetaan yleensä kahteen pääryhmään: happamiin ja neutraaleihin sellulaaseihin. Happamat sellulaasit tyypillisesti toimivat pH:ssa 4,0-5,5 ja neutraalit sellulaasit pH-välillä 6-8. Sel-15 lulaaseja, joilla on sekä happaman että neutraalin ryhmän ominaispiirteitä, voidaan kutsua hybridisellulaaseiksi. Biokivipesussa käytetyt happamat sellulaasit ovat pääosin peräisin Trichoderma reese/stä (suvullinen muoto Hypocrea jeco-rina) ja neutraalit sellulaasit tulevat useista eri sienistä, mukaan lukien suvut Melanocarpus, Humicola, Myceliophthora, Fusarium, Acremonium ja Chryso-20 sporium (Haakana ym. 2004). T. reesei -entsyymit sisältävät esim. sellulaaseja glykosyylihydrolaasiperheestä 5 (endoglukanaasi II, EGII), perheestä 7 (sello-···j biohydrolaasi I, CBHI) ja perheestä 12 (endoglukanaasi III, EGIII; Ward ym.
: 1993) ja neutraaleja sellulaaseja, useimmin endoglukanaaseja, perheestä 45 :.**i ja perheestä 7 (Henrissat, 1991; Henrissat ja Bairoch, 1993,1996).
25 US 5 874 293 esittää parannetun sellulaasikoostumuksen, joka kä- : sittää korotettuja määriä T. reesein EGII-endoglukanaasia, selluloosaa sisältä- • ® · ·"*: vien tekstiilien käsittelemiseen. Koostumus paransi väriominaisuuksia, lisäsi • · * vaaleutta ja visuaalista ulkomuotoa ja vähensi nyppyyntymistaipumuksia. :·. WO97/14804 esittää yhden 20 kDa:n ja yhden 50 kDa:n sellulaasin, joilla on • φ · 30 endoglukanaasiaktiivisuutta, jotka ovat peräisin Melanocarpus-\a\\sla ja jotka • · T ovat erityisen käyttökelpoisia tekstiili- ja pesuaineteollisuudessa. Fuusioprote- • · · : iineja, jotka sisältävät 20K- ja 50K-proteiineja liitettynä selluloosaa sitovaan domeeniin, edullisesti Trichoderma reese/stä, ehdotetaan uusien entsyymiomi- • ]·. naisuuksien luomiseen. Erityisiä esimerkkejä ei anneta eikä toivottuja ominai- • · · *".* 35 suuksia kuvailla.
• * • · ··« 3 119434
Kuitenkin on edelleen tarvetta parannetuille sellulaaseille, mukaan lukien endoglukaanaseille, jotka ovat tehokkaampia kankaan käsittelyssä ja muilla aloilla, joissa sellulaaseja perinteisesti käytetään. Etenkin on jatkuva tarve tehokkaammille sellulaaseille prosessien taloudellisuuksien parantami-5 seksi. Esillä oleva keksintö tähtää näiden tarpeiden kohtaamiseen.
Tekstiiliteollisuudessa ’’kivipesty” ulkonäkö tai kulunut ulkonäkö on ollut denimin tuottajien mielenkiinnon kohteena viime vuosina. Perinteinen ki~ vipesu hohkakivillä vähentää kankaan lujuutta ja kuormittaa pesukoneita. Trendi on kohti entsymaattisia denimin viimeistelyprosesseja ja sellulaasit ovat 10 korvanneet tai niitä käytetään yhdessä hohkakivien kanssa antamaan kankaalle toivottu ’’kulunut” ulkonäkö. Kontrolloidut entsyymikäsittelyt johtavat vaatteiden ja koneiden vähempään vahingoittumiseen ja poistavat kivien hävittämis-tarpeen.
Entsymaattiseen kivipesuun liittyvä yleisongelma on poistetun indi-15 go-värin uudelleenkerrostumisen aiheuttama takaisinvärjäytyminen hankauksen aikana tai sen jälkeen. Indigo-värin uudelleenkerrostuminen vähentää toivottua kontrastia valkoisten ja indigo-värjättyjen lankojen välillä ja se voidaan helpoiten huomata denimin nurjalta puolella ja sisätaskuissa (lisääntyneenä sinisyytenä). Oikealla puolella tämä voidaan nähdä vähentyneenä kontrastina 20 värjättyjen alueiden ja alueiden, joilta väri on biokivipesun aikana poistettu, välillä. Takaisinvärjäytymistä voidaan vähentää käyttämällä käsittelyn aikana ta-kaisinvärjäytymistä ehkäiseviä aineita, kuten ionittomia etoksyloituja alkohole- ·· · : ja, tai lisäämällä valkaisuaineita huuhteluvaiheiden aikana. Entsyymin luonteel- · :,*·{ la on vaikutusta takaisinvärjäytymiseen. Yleisesti neutraalit sellulaasit takaisin- : 25 värjäävät vähemmän kuin happamat sellulaasit.
: W097/09410 kuvaa, että tietyn tyypin sellulaasin lisäys toiseen sei- • « .***. lulaasin, jolla on hankausaktiivisuutta, vähentää takaisinvärjäytymistä. Lisäsel- lulaasi kuuluu perheeseen 5 tai 7, mutta sillä ei itsessään ole merkittävää han- kausvaikutusta. Edullisesti mainittu lisäsellulaasi on peräisin Bacilluksesta tai *...* 30 Clostridiumista.
• * *·;** US 5 916 799 esittää sellulaasikoostumuksia, jotka sisältävät sekä :T: sellobiohydrolaaseja että endoglukanaaseja, jotka on altistettu rajatulle proteo- lyysille entsyymien ytimen ja sitovien domeenien erottamiseksi. Saatujen ent-. \# syymikoostumusten havaittiin vähentävän takaisinvärjäytymistä. WO94/07983 35 koskee havaintoa, että väriaineen uudelleenkerrostumista kankaalle kivipesu- • « ***** prosessin aikana voidaan vähentää käyttämällä sieniperäistä sellulaasikoos- . 119434 4 tumusta, joka on oleellisesti vapaa sellobiohydrolaasityypin komponenteista. W096/23928 esittää selluloosaa sisältävien kankaiden käsittelyn typistetyillä sellulaasientsyymeillä. Typistettyjen entsyymien, joista puuttui selluloosaa sitova domeeni (CBD), havaittiin vähentävän värin uudelleenkerrostumista ja li-5 säävän hankausta.
Yleispäätelmä yllä mainituista kolmesta viitteestä voisi olla, että selluloosaa sitovalla domeenilla on negatiivinen vaikutus takaisinvärjäytymiseen. Kuitenkin esillä oleva keksintö nyt saa aikaan sellulaasirakenteen, jolla on matala takaisinvärjäytymisominaisuus huolimatta selluloosaa sitovan domeenin 10 läsnäolosta.
Keksinnön yhteenveto
Esillä oleva keksintö perustuu yllättävään havaintoon, että endoglu-kanaasien vaikutusta voitaisiin merkittävästi parantaa yhdistämällä niihin erityinen selluloosaa sitova domeeni ilman takaisinvärjäytymisominaisuuksien huo-15 nontamista.
Esillä olevan keksinnön yksi kohde on saada aikaan uusia endoglu-kanaasifuusioproteiineja, joilla on parannetut hydrolyyttiset ominaisuudet, käyttöön tekstiiliteollisuudessa, erityisesti denimin kivipesussa. Keksinnön fuusio-proteiineilla on se etu, että ne ovat aktiivisia sekä happamissa että neutraa-20 teissä pH-arvoissa ja niillä on suuresti parantunut teho biokivipesusovelluksis-sa. Käytettäessä denimin käsittelemisessä fuusioproteiinit saavat aikaan mata-{**): lan takaisinvärjäytymisvaikutuksen. Keksinnön endoglukanaasien parantuneen tehokkuuden myötä entsyymien käyttö on merkittävästi taloudellisempaa. Li- • säetuja saavutetaan myös entsyymituotteiden logistiikan ja varastoinnin suh-·· * . .·. 25 teen, koska pienempiä määriä entsyymituotetta tarvitaan. Fuusioproteiinit ovat .·**. käyttökelpoisia myös pesuainekoostumuksissa sekä muilla aloilla, kuten rehu- ♦ * teollisuudessa, öljyn uutossa kasveista tai massa- ja paperiteollisuudessa.
.. Esillä olevan keksinnön lisäkohteena on saada aikaan polynukleoti- ♦ · deja, jotka koodittavat uusia endoglukanaasifuusioproteiineja.
*···* 30 Esillä olevan keksinnön lisäkohteena on vielä saada aikaan mene- telmä fuusioproteiinien tuottamiseen.
.*··. Esillä olevan keksinnön lisäkohteena on vielä saada aikaan uusia • · • * · . ·. ekspressiovektoreita, jotka sisältävät tällaisia pölynukleotideja ja jotka ovat · · :;j(: käyttökelpoisia endoglukanaasifuusioproteiinien tuotantoon, sekä mainituilla 35 ekspressiovektoreilla transformoituja uusia isäntiä.
5 119434
Esillä olevan keksinnön lisäkohteena on vielä saada aikaan entsyymi valmisteita, jotka sisältävät yhtä tai useampia endoglukanaasifuusiopro-teiineja.
Esillä olevan keksinnön lisäkohteena on vielä saada aikaan mene-5 telmiä selluloosamateriaalin käsittelemiseen fuusioproteiinilla esim. käyttöön tekstiili-, pesuaine- tai eläinten rehuteollisuudessa, öljyn uutossa kasveista tai massa- ja paperiteollisuudessa ja erityisesti tekstiilien viimeistelyyn, erityisesti denimin biokivipesuun ja bioviimeistelyyn.
Esillä olevan .keksinnön lisäkohteena on vielä saada aikaan eläinten 10 rehu- tai pesuainekoostumuksia, jotka sisältävät fuusioproteiineja.
Esillä oleva keksintö koskee sellulaasifuusioproteiinia, joka käsittää ensimmäisen endoglukanaasiytimen aminohapposekvenssin, jolla on vähintään 75 % identtisyys sekvenssin nro: 2 tai sen fragmentin kanssa, jolla on sel-lulaasiaktiivisuutta ja toisen aminohapposekvenssin, joka käsittää linkkerin ja 15 selluloosaa sitovan domeenin (CBD), jolla on vähintään 75 % identtisyys sekvenssin nro: 15 kanssa tai sen fragmentin kanssa, jolla on selluloosaa sitovaa aktiivisuutta.
Keksintö kohdistetaan edelleen eristettyyn polynukleotidiin, joka valitaan ryhmästä, joka koostuu: 20 (a) sekvenssin nro: 3 mukaisesta nukleotidisekvenssistä tai patentti- . vaatimuksen 1 mukaista sellulaasifuusioproteiinia koodittavasta sekvenssistä, (b) kohdan a) komplementaarisesta juosteesta, : (c) sekvenssistä, joka on degeneroitu geneettisen koodin suhteen • * missä tahansa kohdassa (a) tai (b) määritellystä sekvenssistä.
jt:*; 25 Keksintö koskee vielä edelleen ekspressiovektoria, joka käsittää : mainitun nukleotidisekvenssin, ja isäntäsolua, joka käsittää ekspressiovektorin, :***· sekä entsyymivalmistetta, joka käsittää fuusioproteiinin.
···
Keksintöön kuuluu myös fuusioproteiinin tuotantomenetelmä, joka käsittää vaiheet, joissa transformoidaan isäntäsolu mainittua fuusioproteiinia • · f M, 30 koodittavalla ekspressiovektorilla ja viljellään mainittua isäntäsolua mainitun *"·* fuusioproteiinin ilmentämisen mahdollistavissa olosuhteissa ja valinnaisesti ·· : ’·· otetaan talteen ja puhdistetaan tuotettu fuusioproteiini.
Keksintöön kuuluu vielä edelleen selluloosamateriaalin käsittelypro- ,·!·, sessi, jossa mainittu prosessi käsittää selluloosamateriaalin saattamisen kos- • · 35 ketuksiin fuusioproteiinin kanssa.
• * • · 6 119434
Keksintö kohdistetaan myös biokivipesuprosessiin, joka prosessi käsittää vaiheen, jossa sellulaasifuusioproteiini tai entsyymivalmiste saatetaan kosketuksiin denim-kankaan tai -vaatteiden kanssa, ja bioviimeistelyproses-siin, joka käsittää vaiheen, jossa sellulaasifuusioproteiini tai entsyymivalmiste 5 saatetaan kosketuksiin kankaiden tai vaatteiden tai lankojen kaltaisten tekstiilimateriaalien kanssa.
Lopuksi keksintö kohdistetaan pesuainekoostumukseen, joka käsittää fuusioproteiinin ja pesuaineen apuaineita, eläinten rehuun, joka käsittää fuusioproteiinin, ja Escheria coli -kantaan, jolla on talletusnumero E. coli DSM 10 18159.
Keksinnön erityiset suoritusmuodot esitetään riippuvaisissa patenttivaatimuksissa.
Esillä olevan keksinnön muut kohteet, yksityiskohdat ja edut tulevat Ilmeisiksi seuraavlsta piirustuksista, yksityiskohtaisesta kuvauksesta ja esimer-15 keistä.
Piirustusten lyhyt kuvaus
Kuva 1 havainnollistaa kaaviokuvan ekspressiokasetista, jota käytetään T. reeselh protoplastien transformaatiossa T. aurantiacuksen EG28- tai EG28+CtCBD-sellulaasien tuotantoon. ce/5A- tai ce/5A_Ct ce/7AlinkkeriCBD -20 geeni on T. reesein cö/il-promoottorin (cbhl prom) kontrollin alainen ja tran-skription terminaatio varmistetaan cbhl-terminaattorin (cbhl term) lisäyksellä. fV amdS-geeni (amdS) sisällytetään transformanttien valikointia varten. Ekspres- :\i siokasetti EG28- ja EG28+CtCBD-tuotantoon eristettiin 8,6 kb:n A/ofl-frag- • menttina pALK1930:stä tai 8,9 kb:n A/ofl-fragmenttina pALK1948:sta mainitus- • ·· · . .·. 25 sa järjestyksessä.
.···. Kuva 2 havainnollistaa heterologisesti tuotetun T. aurantiacuksen • · EG28-sellulaasin pH-riippuvuuden määrittämällä viljelysupematantista käyttä- . . en CMC:aa substraattina 10 minuutin reaktiossa 50°C:ssa (A). EG28-sellu- laasin lämpötilaoptimi määritettiin optimaalisessa pH:ssa (6,0). Reaktio, joka :···* 30 sisälsi CMC substraattina, suoritettiin 10 minuutin ajan (B). EG28+CtCBD-fuu- sioproteiinin pH- ja lämpötilaoptimien määritettiin olevan samat kuin villityypin ;***; EG28-sellulaasin.
···
Kuva 3 osoittaa EG28-sellulaasin biokivipesuvaikutuksen mittaamal- • ♦ la värin eri lämpötiloissa ja pH:ssa 6.
J ·* 35 Kuva 4 osoittaa EG28+CtCBD-sellulaasin biokivipesuvaikutuksen mittaamalla värin eri pH-arvoissa 50 °C:ssa.
7 119434
Kuva 5 osoittaa EG28+CtCBD-sellulaasin biokivipesuvaikutuksen mittaamalla värin eri pH-arvoissa 60 °C:ssa.
Kuva 6 osoittaa EG28+CtCBD-sellulaasin biokivipesuvaikutuksen mittaamalla värin eri lämpötiloissa (pH 6).
5 Kuva 7 osoittaa pelietointilämpötilan vaikutuksen EG28-sellulaasilla täydennettyjen rehujen betaglukanaasiaktiivisuuden talteenottoon.
Kuva 8 osoittaa pelietointilämpötilan vaikutuksen EG28+CtCBD-sel-lulaasilla täydennettyjen rehujen sellulaasiaktiivisuuden talteenottoon.
Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus 10 Sellulaasit käsittävät katalyyttisen domeenin/ytimen (CD), joka il mentää sellulaasiaktiivisuutta. Katalyyttisen domeenin lisäksi sellulaasimoie-kyyli voi käsittää yhden tai useampia ’’selluloosaa sitovia domeeneja" fCBDt”), joita kutsutaan myös hiilihydraattia sitoviksi domeeneiksi/moduleiksi (CBD/CBM), jotka voivat sijaita katalyyttisen domeenin joko N- tai C-termi-15 nuksessa. CBD:eilla on hiilihydraattia sitovaa aktiivisuutta ja ne välittävät sellu-laasin sitoutumisen kiteiseen selluloosaan, mutta niillä on vähän tai ei lainkaan vaikutusta entsyymin hydroiyyttiseen aktiivisuuteen liukoisia substraatteja kohtaan. Nämä kaksi domeenia tyypillisesti yhdistyvät joustavan ja erittäin gly-kosyloidun linkkerialueen, jota tässä kutsutaan "linkkeriksi”, kautta. Tällaisia 20 konstrukteja kuvataan esim. julkaisussa Srisodsuk ym., 1993. Joillakin luon-nostaen esiintyvillä endoglukanaaseilla ja sellobiohydrolaaseilla on selluloosaa • V sitova domeeni (CBD), kun taas toisilla ei ole.
Endoglukanaasit (EGt) ovat yksi kolmesta sellulaasityypistä, joita ; yleisesti tarvitaan selluloosan biologiseen muuttamiseen glukoosiksi. Endoglu- ; 25 kanaasit katkaisevat sisäisiä beta-1,4-glukosidisidoksia, kun sellobiohydrolaa- .**·. sit taas katkaisevat disakkaridisellobioosia selluloosan polymeeriketjun päästä ja beta-1,4-glukosidaasit hydrolysoivat sellobioosia ja muita lyhyitä sello-oligosakkarideja glukoosiksi. "Endoglukanaasi” ("EG”) esillä olevan keksinnön yhteydessä viittaa entsyymeihin, jotka luokitellaan E.C. 3.2.1.4:ksi. Ne ovat • · *·;·* 30 1,4-beta-D-glukaani-4-glukanohydrolaaseja ja katalysoivat 1,4-beta-D-glykosi- disidoksien endohydrolyysiä glukoosin polymeereissä, kuten selluloosassa.
·*": Jotkut endoglukanaasit voivat myös hydrolysoida esim. 1,4-sidoksia beta-D- ··* glukaaneissa, jotka sisältävät myös 1,3-sidoksia. Ne voidaan siksi luokitella * 9 myös endo-1,3(4)-betaglukanaaseiksi (E.C. 3.2.1.6). Siten entsyymi voi kataly- • · * • ♦* 35 soida reaktioita useilla substraateilla ja voi kuulua useisiin luokkiin.
8 119434
Sellulaasit, mukaan lukien endoglukanaasit, voidaan myös luokitella erilaisiin glykosyylihydrolaasiperheisiin primäärisen sekvenssinsä mukaisesti, mitä tukee perheen joidenkin jäsenten kolmiulotteisen rakenteen analyysi (Henrissat 1991, Henrissat ja Bairoch 1993, 1996). Esimerkiksi perhe 45 (en-5 nen celK) sisältää endoglukanaaseja (EC 3.2.1.4) ja perhe 5 (ennen tunnettu celA:na) koostuu pääosin endoglukanaaseista (EC 3.2.1.4). Perhe 7 (ennen sellulaasiperhe celC) sisältää sekä endoglukanaaseja että sellobiohydrolaase-ja. Jotkut glykosyylihydrolaasit ovat monitoiminnallisia entsyymejä, jotka sisältävät katalyyttisiä domeeneja, jotka kuuluvat eri glykosyylihydrolaasiperheisiin. 10 Esillä oleviin tarkoituksiin fuusioproteiinin endoglukanaasiosa kuuluu perheeseen 5.
Keksinnön edullisen suoritusmuodon mukaisesti fuusioproteiinin endoglukanaasiosa on peräisin sienestä, edullisesti Thermoascus-suvusta ja edullisemmin Thermoascus aurantiacuksesia. Tällainen endoglukanaasi on 15 kuvattu esim. julkaisussa Hong ym. 2003. W003/062409 ehdottaa tämän entsyymin käyttämistä rehusovelluksiin, koska endoglukanaasin lisäksi sillä on myös beta-glukanaasiaktiivisuutta. Edullisimmin endoglukanaasi on peräisin T. aurantiacus-kannasta ALK04242, joka on talletettu CBS 116239:nä. Mainitun kannan endoglukanaasigeeni on insertoitu pALK1926-plasmidiin ja talletettu 20 DSM 17326:na. Tämän geenin koodittamaan proteiiniin viitataan tässä Ta EG28:na" tai yksinkertaisesti ”EG28:na”.
• · ·
Endoglukanaasin "ydin”, kuten tässä käytetään, tarkoittaa entsyymin • ·[ katalyyttistä domeenia/ydintä (CD), joka ilmentää vähintään endoglukanaasi- ·.*·: aktiivisuutta. Tällainen katalyyttinen domeeni voi olla luonnostaan esiintyvässä * · 25 muodossaan (ts. koskematon) tai se voi olla modifioitu.
Keksinnön yhden suoritusmuodon mukaisesti endoglukanaasiyti-mellä on vähintään 75, 80, 85, 90, 95, 98 tai 99 %:n identtisyys sekvenssin nro: 2 kanssa (Ta EG28). Edullisesti ydin käsittää vähintään kypsän proteiinin, :y; joka vastaa sekvenssin nro: 2 aminohappoja 19-334. Ennuste signaalisek- 30 venssille tehtiin käyttäen SignalP V3,0 -ohjelmaa (Nielsen ym., 1997; Bendt- • · "* sen ym., 2004); NN-arvo saatiin käyttäen neuraaliverkkoja ja HMM-arvo käyt- ·· : *·· täen kätkettyjä Markov-malleja.
"Sellobiohydrolaasi” tai ”CBH", kuten tässä käytetään, viittaa ent- .···. syymeihin, jotka lohkaisevat selluloosaa glukoosiketjun päästä ja tuottavat • · 35 pääosin sellobioosia. Niitä kutsutaan myös 1,4-beta-D-glukaanisellobiohydro-* ’ laaseiksi tai selluloosa-1,4-beta-sellobiosidaaseiksi. Ne hydrolysoivat 1,4-beta- 9 119434 D-glukosidisidoksia polymeerin, joka sisältää mainittuja sidoksia, kuten selluloosan, pelkistyvistä tai pelkistymättömistä päistä, jolloin sellobioosia vapautuu.
Linkkerin sisältävä CBD on edullisesti peräisin Chaetomium thermo-philumista ja erityisesti kannan ALK04265, joka on talletettu CBS 730.95:nä, 5 geenin koodittamasta sellobiohydrolaasista (CBHI/Cel7A). Tähän linkkerin sisältävään CBD:iin viitataan ”CtCBD:na”. Keksinnön edullisen suoritusmuodon mukaisesti linkkerillä ynnä sellulosaa sitovalla domeenilla on sekvenssi, jolla on vähintään 80, 85, 90, 95, 98 tai 99 %:n identtisyys sekvenssin nro: 15 kanssa (joka vastaa sekvenssin nro: 4 aminohappoja 335-415). Toisen edulli-10 sen suoritusmuodon mukaisesti toinen aminohapposekvenssi käsittää sekvenssin nro: 4 aminohapot 335-379.
Termi "peräisin” mikro-organismilähteen yhteydessä tarkoittaa, että polypeptidi voidaan luonnostaan tuottaa mainitussa tietyssä mikro-organismi-lähteessä tai polypeptidiä koodittava polynukleotidi voidaan eristää mainitusta 15 mikro-organismilähteestä tai termi tarkoittaa isäntäsolua, johon polypeptidiä koodittava polynukleotidi mainitusta mikro-organismilähteestä on tuotu. Kuitenkaan se ei sulje pois sekvenssin pieniä modifikaatioita, esim. substituutiolla, deleetiolla, inversiolla ja/tai yhden tai muutaman aminohapon/kodonin insertiol-la niin kauan kuin kooditetun proteiinin biologinen aktiivisuus säilytetään.
20 Ydin ja linkkeri+CBD mainitussa järjestyksessä voivat myös olla , mainitun sekvenssin fragmentti tai variantti, jossa mainitulla fragmentilla tai va- • * ·
Hantilla on sellulaaslaktiivisuutta ja/tai selluloosaa sitovaa aktiivisuutta. Esimer- : V kiksi ensimmäinen aminohapposekvenssi voi käsittää aminohapposekvenssin, • · jolla on vähintään 75 % identtisyys sekvenssin nro: 2 tai 8 kanssa, fragmentin • · ·.: * 25 tai variantin ja toinen aminohapposekvenssi voi käsittää aminohapposekvenssi]: sin, jolla on vähintään 75 % identtisyys sekvenssin nro: 15 kanssa, fragmentin :***: tai variantin.
• · ·
Esillä olevassa yhteydessä "sellulaasiaktiivisuus” tarkoittaa katalyyt-;v. tistä kykyä hydrolysoida selluloosaa tai sen johdannaisia, kuten endoglu- ,···. 30 kanaasi- tai betaglukanaasiaktiivisuutta. Endoglukanaasi- ja/tai betaglukanaa- siaktiivisuuden lisäksi joillakin sellulaaseilla voi edelleen olla hemisellulaasi- ·· : '·* ja/tai ksylanaasiaktiivisuutta.
Kuten esillä olevassa yhteydessä käytetään, termi ’’identtisyys” viit-,···. taa globaaliin identtisyyteen kahden aminohapposekvenssin välillä verrattuna 35 toisiinsa ensimmäisestä vastaavan geenin koodittamasta aminohaposta vii-* * meiseen aminohappoon saakka. Täyspitkien sekvenssien identtisyys mitataan 10 119434 käyttämällä Needleman-Wunschin globaalia linjausohjelmaa EMBOSS-ohjel-mapaketissa (European Molecular Biology Open Software Suite; Rice ym. 2000), versio 3.0.0, seuraavilla parametreillä: EMBLOSUM62, gap penalty 10.0, extend penalty 0.5. Algoritmi kuvataan julkaisussa Needleman ja 5 Wunsch (1970). Alan ammattimies on tietoinen siitä tosiasiasta, että Needleman-Wunschin algoritmia käyttäen saadut tulokset ovat vertailukelpoisia vain, kun linjataan sekvenssin vastaavia domeeneja. Sen tähden esim. sellulaasise-kvenssien, jotka sisältävät CBD:n tai signaalisekvenssin, vertailu sekvenssien kanssa, joista nämä elementit puuttuvat, suljetaan pois merkityksettöminä.
10 Keksinnön yhden suoritusmuodon mukaisesti fuusioproteiini sisältää endoglukanaasiytimen, jota koodittaa geeni, joka vastaa E. coli DSM 17326:een sisällytettyä geeniä. Edullisesti fuusioproteiinia koodittaa fuusio-geeni, joka vastaa E. coli DSM 18159:ään sisällytettyä geeniä. Keksinnön spesifisen suoritusmuodon mukaisesti fuusioproteiini sisältää endoglukanaasiyti-15 men, joka käsittää sekvenssin nro: 2 sekvenssin, ja linkkerin ja CBD:n, jotka käsittävät sekvenssin nro: 15 sekvenssin. Erityisesti se käsittää sekvenssin nro: 4 aminohapposekvenssin tai sen fragmentin, jolla on sellulaasiaktiivisuutta ja selluloosaa sitovaa aktiivisuutta.
’’Fragmentin” ymmärretään olevan spesifisen aminohapposekvens-20 sin osa, joka on riittävän pitkä omaamaan toivotun biologisen aktiivisuuden.
, Toisin sanoen fragmentti voi olla esim. vain aminohapposekvenssin kypsä osa ·»· tai jopa kypsän osan alisekvenssi. Aminohapposekvenssillä, joka on spesifisen * · * ·] aminohapposekvenssin "variantti”, tarkoitetaan aminohapposekvenssiä, joka ei !.*·: ole identtinen spesifisen aminohapposekvenssin kanssa vaan pikemminkin si- • · :.· * 25 sältää vähintään joitakin aminohappomuutoksia ts. deleetioita, substituutioita, inversioita, insertioita jne. jotka eivät oleellisesti vaikuta proteiinin biologiseen :***: aktiivisuuteen, kun verrataan spesifisen aminohapposekvenssin samanlaiseen ··· aktiivisuuteen toivottuun tarkoitukseen käytettäessä. Biologinen aktiivisuus ,y. tässä yhteydessä siten viittaa sellulaasiaktiivisuuteen, selluloosaa sitovaan ak- 30 tiivisuuteen tai molempiin.
• *
Keksinnön fuusioproteiini voidaan valmistaa liittämällä endogluka- • t ; *·· naasiydinosa linkkeriin ja CBD-osaan tarkoituksenmukaisessa koodittavassa DNA:ssa käyttäen yleisesti tunnettuja rekombinantti-DNA-tekniikoita. Lyhyesti ,··*. fuusiopartnereita koodittavat polynukleotidit vahvistetaan ja kloonataan, nuk- 35 leotidit voidaan myös syntetisoida. Sulautettu polynukleotidi insertoidaan eks- * · • · 11 119434 pressiovektoriin, transformoidaan isäntäsoluun ja ilmennetään. Edullisesti link-keri ja CBD liitetään endogiukanaasiytimen C-terminukseen.
"Ekspressiovektori” on kloonausplasmidi tai -vektori, joka pystyy ilmentämään endoglukanaasifuusioproteiineja koodittavaa DNA:ta transformaa-5 tion toivottuun isäntään jälkeen. Käytettäessä sieniperäistä isäntää mielenkiinnon kohteena oleva geeni edullisesti välitetään sieniperäiselle isännälle osana kloonaus- tai ekspressiovehikkeliä, joka integroituu sieniperäiseen kromosomiin tai sallii mielenkiinnon kohteena olevan geenin integroitua isäntäkro-mosomiin. Muut sekvenssit, jotka ovat kloonausvehikkelin tai ekspressiovehik-10 kelin osia, voidaan myös integroida mainittuun DNA:han integraatioprosessin aikana. Lisäksi sienessä ekspressiovektori tai sen osia voidaan suunnata ennalta määrättyyn lokukseen. Vaihtoehtoisesti toivottu fuusiogeeni välitetään autonomisesti replikoituvana plasmidina.
Endoglukanaasifuusioproteiineja koodittava DNA asetetaan edulli-15 sesti vektorin välittämien tiettyjen kontrollisekvenssien, kuten promoottorise-kvenssien, kontrollin alaiseksi (ts. toiminnallisesti näihin liitettynä). Transformaatiossa nämä kontrollisekvenssit integroituvat isäntägenomiin mielenkiinnon kohteena olevan geenin kanssa.
Vaihtoehtoisesti kontrollisekvenssit voivat olla niitä, jotka ovat integ-20 raatiokohdassa.
, Ekspressiovektorin ekspressiota kontrolloivat sekvenssit tulevat • · · vaihtelemaan riippuen siitä, onko vektori suunniteltu ilmentämän tiettyä geeniä i V prokaryootti- vai eukaryootti-isännässä (esimerkiksi sukkulavektori voi välittää • · :.’ i geenin bakteeriperäisten isäntien valintaan). Ekspressiota kontrolloivat sek- 25 venssit voivat sisältää transkriptionaalisia säätelyelementtejä, kuten promootto-: reita, vahvistaja-elementtejä ja transkriptionaalisia terminaatiosekvenssejä ja/tai translationaalisia säätelyelementtejä, kuten translationaalisia aloitus- ja *>» terminaatiokohtia.
Polynukleotidimolekyyliri, kuten DNA:n, sanotaan pystyvän ilmen- * · « l.!t 30 tämään polypeptidiä, jos se sisältää ekspressiota kontrolloivia sekvenssejä, '*:** jotka sisältävät transkriptionaalista säätely informaatiota, ja tällaiset sekvenssit ·· : ’·· on toiminnallisesti liitetty nukleotidisekvenssiin, joka koodittaa polypeptidiä.
Toiminnallinen sidos on sidos, jossa sekvenssi yhdistetään sääte- ,.ί., lysekvenssiin (tai sekvensseihin) sillä tavoin, että sekvenssin ekspressio asete- • · 35 taan säätelysekvenssin vaikutuksen tai kontrollin alaiseksi. Kahden DNA-: ·* sekvenssin (kuten promoottorialueen sekvenssi liitettynä sekvenssiä kooditta- 12 119434 van proteiinin 5’-päähän) sanotaan olevan toiminnallisesti liitettyjä, jos promoottorin toiminta johtaa transkriptioon.
Keksinnön mukaiset vektorit voivat edelleen käsittää muita toiminnallisesti liitettyjä säätelyelementtejä, kuten vahvistajasekvenssejä.
5 Edullisessa suoritusmuodossa kostruoidaan geneettisesti stabiileja transformantteja, joiden avulla fuusioproteiineja koodittava DNA integroidaan isäntäkromosomiin transformaatiolla vektorin kanssa, joka voi suojata mainitun vektorin integraatiota kromosomiin edistäviä sekvenssejä.
Soluja, joilla on endoglukanaasifuusioproteiineja koodittava DNA 10 stabiilisti kromosomiinsa integroituna, voidaan valitaan esim. tuomalla markke-ri/eita, homologisia tai heterologisia, jotka sallivat ekspressiovektorin kromosomissa sisältävien isäntäsolujen valinnan, esimerkiksi markkeri voi saada aikaan biosidiresistenssin, esim. resistenssin antibiootteja tai raskasmetalleja, kuten kuparia, vastaan, tai markkereita, jotka täydentävät auksotrofista mutaa-15 tiota isäntäkromosomissa tms. Valittavissa oleva markkeri voi esimerkiksi olla valikointigeeni suoraan liitettynä ilmennettäviin DNA-geenisekvensseihin tai tuodaan samaan soluun yhteistransformaatiolla. Myös muita valikointisystee-mejä voidaan käyttää.
Kun fuusioproteiinia koodattavan DNA:n sisältävä ekspressiovektori 20 valmistetaan, se tuodaan tarkoituksenmukaiseen isäntäsoluun millä tahansa , useista sopivista tavoista, mukaan lukien alalla tunnetun mukaisella transfer- ··· •**| maatiolla. Transformaation jälkeen vastaanottajasoluja kasvatetaan tarkoituk- : V senmukaisessa valikoivassa väliaineessa, joka valitsee transformoidut solut t · \*·; kasvamaan.
j,:'· 25 Sopivia ekspressio- ja tuotantoisäntäsysteemejä ovat esimerkiksi sieniperäisille Trichoderma (EP 244 234) tai Aspergillus-isännille, kuten A. oryx'*; zae tai A. niger (WO 97/08325 ja WO 95/33386, US-patentti nro 5 843 745, US-patentti nro 5 770 418), kehitetty tuotantosysteemi tai Fusariumille, kuten F. oxysporumille (Malardier ym., 1989), kehitetty tuotantosysteemi. Bakteereille • · · l.lm 30 kehitetyt sopivat tuotantosysteemit sisältävät BacillukseHe, esimerkiksi B. subti- '*:** //sille, B. lichaniformisiWe, B. amyloliquefaciensiWe, tai E. colille tai aktinomysete ·* • *·· S/repfomycesille kehitetyn tuotantosysteemin. Hiivoille kehitettyjä sopivia tuo- tantosysteemejä ovat Saccharomycasitte, Shizosaccharomyces\\\e tai Pichia .···. pasfer/sille kehitetyt systeemit. Tuotantosysteemit muissa mikrobeissa tai nisä- • · /.".t 35 kässoluissa tai kasveissa ovat myös mahdollisia.
• · * * 13 119434
Kloonatun/kloonattujen geenisekvenssi(e)n ekspressio johtaa toivotun proteiinin tuotantoon tai tämän proteiinin fragmentin tuotantoon. Tämä ekspressio voi tapahtua jatkuvalla tavalla transformoiduissa soluissa tai kontrolloidulla tavalla.
5 Keksinnön mukaisten entsyymivalmisteiden saamiseksi isäntiä, joilla on toivotut ominaisuudet, (nimittäin isäntiä, jotka pystyvät ilmentämään taloudellisesti toteuttamiskelpoisia määriä endoglukanaasifuusioproteiineja) viljellään sopivissa olosuhteissa ja toivotut entsyymit edullisesti erittyvät isännistä viljelyväliaineeseen ja valinnaisesti otetaan talteen mainitusta viljelyväliainees-10 ta alalla tunnetuilla menetelmillä. Edullisesti isäntä tällaiseen tuotantoon on fi-lamenttihome, kuten Trichoderma tai Aspergillus, ja erityisesti T. reesei.
Kuten esillä olevassa yhteydessä käytetään, "entsyymivalmiste” viittaa mihin tahansa entsyymituotteeseen, joka sisältää vähintään yhtä keksinnön mukaista endoglukanaasifuusioproteiinia. Siten tällainen entsyymivalmiste 15 voi olla kulutettu viljelyväliaine tai suodos. Kulutettu viljelyväliaine tarkoittaa isännän viljelyväliainetta, joka käsittää tuotetut entsyymit. Edullisesti isäntä-solut erotetaan mainitusta väliaineesta tuotannon jälkeen. Niin toivottaessa tällaiset valmisteet voidaan pakastekuivata tai entsyymiaktiivisuus voidaan muulla tavoin väkevöidä ja/tai stabiloida varastointia varten. Vaadittaessa toivottu 20 entsyymi voidaan edelleen puhdistaa perinteisten menetelmien mukaisesti, ku-. ten uutolla, saostuksella, kromatografialla, affiniteettikromatografialla, elektro- foreesilla tai muilla sellaisilla.
·*' ·* Kuitenkin on keksinnön etu, että viljelyväliainetta isäntäsolujen :.**i kanssa tai ilman voidaan käyttää sellaisenaan entsyymivalmisteena ilman jät- * · · 25 kopuhdistusta, koska endoglukanaasifuusioproteiinit voidaan erittää viljelyväli- aineeseen ja ne näyttävät aktiivisuutta kulutetun viljelyväliaineen olosuhteissa, f": Entsyymivalmisteet ovat erittäin taloudellisia hankkia ja käyttää, koska spesifi sen entsyymin eristäminen viljelyväliaineesta on tarpeetonta.
Endoglukanaasifuusioproteiinin lisäksi entsyymivalmisteet voivat 30 käsittää yhtä tai useampia muita entsyymejä, jotka voivat olla esimerkiksi muita φ t "* sellulaaseja, amylaaseja, lipaaseja, proteaaseja, hemisellulaaseja, ksylanaa- : **· seja, pektinaaseja ja/tai oksidaaseja, kuten lakkaaseja ja peroksidaaseja. Vaih- ··· toehtoisesti endoglukanaasifuusioproteiinilla käsittelyä ennen, sen aikana tai ,···. sen jälkeen voidaan suorittaa toinen entsyymikäsittely. Entsyymikäsittely voi ;vt 35 käsittää esimerkiksi yhden tai useampia amylaasikäsittelyjä (esim. denimin liis-* * terin poistoon), yhden tai useampia sellulaasikäsittelyjä ja/tai yhden tai useam- 14 119434 pia peroksidaasi- ja/tai lakkaasikäsittelyjä. Se, mitä muita entsyymejä sisällytetään entsyymivalmisteeseen tai käytetään entsyymikäsittelyssä, riippuu sovelluksesta.
Fuusioproteiinin lisäksi entsyymivalmiste voi sisältää lisäaineita, ku-5 ten stabilointiaineita, puskureita, säilöntäaineita, surfaktantteja ja/tai viljelyväli-aineen komponentteja. Edulliset lisäaineet ovat sellaisia, joita tavallisesti käytetään entsyymivalmisteissa, jotka on tarkoitettu sovellukseen, jossa entsyymi-valmistetta käytetään.
Entsyymivalmisteet voidaan saada aikaan nesteenä tai kiintoainee-10 na, esimerkiksi kuivattuna jauheena tai rakeina, erityisesti pölyämättöminä ra-keina, tai stabiloituna nesteenä. Ajatellaan, että entsyymivalmisteet voidaan edelleen rikastaa tai niistä voidaan osittain tai täysin poistaa spesifiset entsyymiaktiivisuudet niin, että ne tyydyttävät spesifisten käyttötarkoitusten vaatimukset erilaisissa sovelluksissa, esim. tekstiiliteollisuudessa. Isännän erittämien 15 entsyymiaktiivisuuksien seos voi olla edullinen erityisissä teollisissa sovelluksissa, esimerkiksi bioviimeistelyssä ja biokivipesussa.
Endoglukanaasifuusioproteiinit ja niiden valmisteet ovat käyttökelpoisia esim. tekstiili-, rehu-, kasviöljy-, pesuaine- ja massa- ja paperiteollisuudessa. Niitä voidaan käyttää minkä tahansa selluloosamateriaalin käsittelemi-20 seen, kuten tekstiilimateriaalin, eläinten rehuksi käytettävien kasvien, kasvima-. teriaalin öljyn uuttoon tai puusta peräisin olevan mekaanisen tai kemiallisen massan tai kierrätyskuidun. Niitä voidaan myös lisätä pesuaineisiin, jotka nor-i maalisti sisältävät apuaineita, kuten pinta-aktiivisia aineita, surfaktantteja, val- kaisuaineita ja/tai täyteaineita. Esillä olevassa yhteydessä nselluloosamateriaa- • * ·,· { 25 li” viittaa mihin tahansa materiaaliin, joka käsittää selluloosaa tai sen johdan- : naisia merkittävänä komponenttina. Selluloosamateriaali saatetaan kosketuk- :***: seen tehokkaan määrän fuusioproteiinia kanssa sopivissa olosuhteissa, kuten φ«· tarkoituksenmukaisessa pH.ssa ja lämpötilassa, ja reaktion annetaan jatkua , V, riittävän pitkän ajan, jotta entsyymireaktio tapahtuu.
• · · a>.'( 30 Fuusioentsyymit ovat erityisen käyttökelpoisia tekstiilimateriaalien, 7 kuten kankaiden ja vaatteiden käsittelyssä. Tekstiilimateriaali voidaan valmis- *· • *·· taa luonnollista selluloosaa sisältävistä kuiduista tai keinotekoista selluloosaa sisältävistä kuiduista tai niiden seoksista tai synteettisten kuitujen ja selluloo-,···, saa sisältävien kuitujen sekoituksesta. Edullisesti selluloosaa sisältävä materi- • t 35 aali on puuvillaa, erityisesti denimiä. "Denimillä” tarkoitetaan tämän keksinnön : ’* yhteydessä denim-kangasta, yleensä denim-vaatteita, erityisesti farkkuja. Edul- 15 119434 lisesti denim on indigo-värjättyä denimiä. Denim voidaan myös käsitellä indigon johdannaisilla tai indigolla yhdessä joidenkin muiden värien kanssa, esimerkiksi indigovärjätty denim rikkiväripohjalla.
Fuusioendoglukanaasit ovat erityisen käyttökelpoisia tekstiilien bio-5 kivipesussa ja bioviimeistelyssä.
Kivipesussa on kolme vaihetta: liisterin poisto, hankaaminen ja jälkikäsittely. Ensimmäinen vaihe, liisterin poistoprosessi on normaalisti farkkujen ensimmäinen märkäkäsittely ja tarkoittaa tärkkelyksen tai muiden liistereiden poistamista, joita yleensä käytetään loimilangoille niiden vaurioitumisen ehkäi-10 semiseksi kutomisprosessin aikana. Alfa-amylaaseja käytetään tärkkelyspoh-jaisen liisterin poistamiseksi parannetun ja yhdenmukaisen märkäkäsittelyn aikaansaamiseksi. Liisterin poiston jälkeen farkkuja huuhdellaan normaalisti vedellä tai ne siirretään suoraan hankaamisvaiheeseen.
Toinen vaihe, hankaaminen, voidaan suorittaa entsyymeillä tai hoh-15 kakivillä tai molemmilla. Kaikissa tapauksissa mekaanista toimintaa tarvitaan värin poistamiseksi ja käsittely yleensä suoritetaan pesukoneissa, kuten rum-pupesukoneissa. Termi "kulunut” tarkoittaa denim-kankaan ulkomuotoa, kun sitä on käsitelty sellulaasientsyymeillä tai kivillä tai molemmilla. Synonyymisiä ilmaisuja ovat "kivipesty ulkonäkö” tai "kulutettu ulkonäkö”. Epätasaisen värin 20 poiston seurauksena värjättyjen alueiden ja alueiden, joilta väri on poistettu, välillä on kontrasteja.
.···* Hankaamista seuraa yleisesti kolmas vaihe, jälkikäsittely, joka sisäl- ·· · : V tää pesu- ja huuhteluvaiheita, joiden aikana pesuaineita, optisia kirkasteita, :,'··* valkaisuaineita tai pehmennysaineita voidaan käyttää. Entsymaattisen käsittein*: 25 lyn jälkeen reaktio täytyy pysäyttää käsiteltyjen materiaalien vaurioitumisen : ·’: ehkäisemiseksi, esimerkiksi lämpötila- ja/tai pH-inaktivoinnilla jälkimmäisen ··· käsittäessä huolellisen huuhtelemisen ja/tai pesuaineen poispesun. Tämä varmistaa, että kuidun mekaaninen voima ei enempää vaarannu entsyymin (V, jatkuvalla läsnäololla.
30 Kuten esillä olevassa yhteydessä käytetään, ilmaisu kankaan tai '*;** vaatteen "biokivipesu” tarkoittaa entsyymien käyttöä hohkakivien sijasta tai Ιί- ί*··· säksi kankaan tai vaatteen, erityisesti denimin, käsittelyyn.
Kuten yllä todetaan, käsittely sellulaasilla voi täysin korvata käsitte-lyn hohkakivillä (esimerkiksi 1 kg kaupallista entsyymiä vastaa 100 kg kiviä). .”1 35 Kuitenkin seilulaasikäsittely voidaan myös yhdistää hohkakivikäsitteiyyn, kun : ** on toivottua tuottaa voimakkaasti kulunut viimeistely. Persikkamainen vaikutus, 16 119434 jossa luodaan hieno kerros pinnasta ulostyöntyviä karvoja, saavutetaan myös pesulla, jossa yhdistetään neutraali sellulaasi hohkakivien kanssa. Kuvatut fuusioproteiinit ovat erityisen käyttökelpoisia tehokkaasti saamaan aikaan kulutetun ulkonäön ja minimoimaan takaisinvärjäytymisen biokivipesussa.
5 Biokivipesu suoritetaan tyypillisesti pH:$sa noin 3,0-8,0 ja edullises ti pH:ssa 5,0-7,0. Reaktion lämpötila voi vaihdella noin 30-80 °C ja on edullisesti välillä 50-60 °C. Liuossuhde (nesteen tilavuuden suhde kankaan painoa kohti) voi vaihdella noin 3:1-20:1, edullisesti 5:1-10:1. Käsittelyaika voi vaihdella välillä 15 min-90 min ja edullisesti 30 min-60 min. Täytyy korostaa, että 10 entsyymiannos riippuu suuresti kankaiden, koneiden, prosessiolosuhteiden tyypistä (pH, lämpötila, liuossuhde, käsittelyaika, denim-kuorma, prosessin mittakaava) ja entsyymivalmisteen tyypistä ja muusta sellaisesta. Niin toivottaessa hohkakiviä voidaan käyttää yhdessä endoglukanaasifuusioproteiinien kanssa. Vaadittu entsyymiannos tulee tällöin olemaan merkittävästi alhaisempi.
15 Alan ammattimies pystyy määrittelemään sopivat annokset ja olosuhteet.
Esillä olevan keksinnön endoglukanaasifuusioproteiinit saavat aikaan odottamattomia etuja niin, että entsyymiteho on korkea ja takaisinväijäy-tyminen on matala johtaen erittäin hyvään kontrastiin. Lisäksi fuusioproteiineja voidaan helposti valmistaa ja niitä voidaan käyttää suhteellisen leveällä lämpö- 20 tila- ja pH-välillä.
, Edelleen endoglukanaasifuusioproteiinit ovat käyttökelpoisia kan- • · · "•j kaiden ja vaatteiden bioviimeistelyssä. ’’Bioviimeistely” viittaa entsyymien käyt- : V töön selluloosakuitujen kontrolloidussa hydrolyysissä kankaan tai langan pin- • » nan modifioimiseksi tavalla, joka ehkäisee pysyvästi nyppyyntymistä, parantaa ·,;*· 25 kankaan tuntua, kuten pehmeyttä ja sileyttä, selkeyttää pintarakennetta vähen- tämällä nukkaantumista, mikä johtaa värien kirkastumiseen, parantaa kankaan :***: laskeutuvuutta, parantaa kosteuden imeytymistä, mikä voi parantaa myös vär- • es jäytyvyyttä.
Entsymaattinen nyppyyntymisen esto voidaan suorittaa missä ta- • · · 30 hansa vaiheessa tekstiilin märkäkäsittelyn aikana, edullisesti valinnaisen liiste-*:* rin poiston ja/tai valkaisun jälkeen, ja samanlaisia olosuhteita kuin biokivi- : ’·· pesussa voidaan käyttää.
Endoglukanaasifuusioproteiinit, joilla on betaglukanaasi-, hemisellu- ,··*. laasi- tai ksylanaasiaktiivisuutta, ovat edelleen käyttökelpoisia eläinten rehun • · 35 laadun parantamiseen, jolloin kasvimateriaali käsitellään entsyymeillä.
• · • · 17 119434 Tärkkelys, proteiinit ja rasvat voidaan helposti hajottaa yksimahais-ten eläinten, kuten siipikarjan ja sikojen, ruoansulatussysteemissä, kun taas suurin osa ei-tärkkelyspitoisista polysakkarideista (NSP), mukaan lukien esim. ohran ja kauran sekasidoksiset betaglukaanit, pysyy koskemattomana johtuen 5 tällaisten entsyymiaktiivisuuksien puutteesta eläimessä. Lisäksi muiden komponenttien, erityisesti eläinperäisten rasvojen, sulavuus vähenee NSP:n ollessa läsnä.
Betaglukanaaseja on kaupallisesti käytetty ohran ja kauran se-kasidoksisten beta-glukaanien aiheuttamien ongelmien lieventämiseksi. Beta-10 glukanaasien tiedetään vähentävän liukoisten betaglukaanien aiheuttamaa suolen sisällön viskositeettia sekä vapauttavan runsaasti betaglukaaneja sisältäviin soluseinämiin kapseloituja ravintoaineita. Betaglukanaasien käyttö parantaa eläinten tuottavuutta, joka voidaan nähdä parantuneena painon nousuna ja rehuhyötysuhteena. Myös tahmeiden jätösten ilmaantuvuuksia siipikarjalle la tyypillisesti vähennetään.
Höyrypelletointi on päätekniikka rehun jalostuksessa kaikkialla maailmassa. Sen edut rehumäskien tuottamiseen nähden sisältävät helpomman käsittelyn, myrkyllisten aineiden ja organismien vähentymisen ja ennen kaikkea parantuneen rehun tehokkuuden. Tässä kuvattujen fuusioproteiinien läm-20 mönsietokyky ja korkea teho tekevät niistä sopivia rehusovelluksiin.
Keksintö havainnollistetaan seuraavilla rajoittamattomilla esimerkeil- • · · ••‘j lä. Pitäisi kuitenkin olla ymmärrettävää, että yllä olevassa kuvauksessa ja esi- : *.· merkeissä annetut suoritusmuodot ovat vain havainnollistaviin tarkoituksiin ja • * \*·: että erilaiset muutokset ja modifikaatiot ovat mahdollisia keksinnön suoja-alan : 25 sisällä.
··· · « * * · • · » IT. Esimerkki 1. Thermoascus aurantiacus ALK04242:n EG28-sellulaasin • · '···’ tuotanto Trichoderma reeseissä . . Molekyylibiologian perusmenetelmiä käytettiin DNA:n (plasmidit, *;]·* DNA-fragmentit) eristämisessä ja entsyymikäsittelyissä, E. co//-transformaati- • · ’···* 30 oissa jne. Käytetyt perusmenetelmät kuvataan molekyylibiologian peruskäsikir- joissa, esim. Sambrook ym. (1989) ja Sambrook ja Russell (2001).
EG28-sellulaasia (sekvenssin nro: 2) koodittava Thermoascus au-
• •I
ranf/äcuksen ce/5A-geeni (sekvenssi nro: 1) vahvistettiin PCRilla suoraan T.
m · j·;’ aurantiacus ALK04242:n genomisesta DNA:sta, eristettiin Raederin ja Brodan • ·* 35 (1985) menetelmällä. Forward- (sekvenssi nro: 9) ja reverse-alukkeet (sek venssi nro: 10) suunniteltiin julkaistun T. aurantiacuksen endoglukanaasise- 18 119434 kvenssin (AF487830) perusteella. Vahvistettu 1,3 kb:n tuote, joka sisälsi tarkan geenin (START-kodonista STOP-kodoniin) kloonattiin Sacll-Psfl-fragmenttina pBluescript II KS+ -vektoriin. Kaksi itsenäistä kloonia sekvensoitiin ja yksi klooni valittiin ja nimettiin pALK1926:k$i. pALK1926:n sisältävän E. coli -kan-5 nan talletusnumero Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkultu-ren GmbH -viljelmäkokoelmassa on DSM 17326.
Ekspressioplasmidi (pALK1930, kuva 1) konstruoitiin rekombinantin T. aurantiacuksen seliulaasin EG28/Cel5A (sekvenssi nro: 2) tuotantoon. ce/5A-geeni, mukaan lukien sen oma signaalisekvenssi, sulautettiin tarkalleen 10 T. raesein cb/7 /-promoottoriin (cel7A) PCR:lla. cb/7 f-promoottori, cbh1-termi-naattori ja amdS-markkerigeeni sisällytettiin, kuten kuvataan julkaisussa Paloheimo ym. 2003. Lineaarinen ekspressiokasetti (kuva 1) eristettiin vektorirun-gosta restriktioentsyymidigestiolla, transformoitiin T. reesein A96:een ja trans-formantit valittiin asetamidilla ainoana typen lähteenä. Isäntäkannalta puuttuu 15 neljä endogeenistä pääsellulaasia: CBHI/Cel7A, CBHII/Cel6A, EGI/Cel7B ja EGII/Cel5A. Transformaatiot suoritettiin julkaisun Penttilä ym. (1987) mukaisesti niiden modifikaatioiden kanssa, jotka kuvataan julkaisussa Karhunen ym. (1993). Transformantit puhdistettiin valintamaljoilla yksittäisten konidioiden kautta, ennen kuin ne idätettiin PD:lla.
20 Transformanttien sellulaasituotanto analysoitiin ravistelijoissa kasva tettavien pulloviljelmien (50 ml) viljelysupematanteista. Transformantteja kas-···:’ vaiettiin 7 päivän ajan kompleksisessa seliulaasin ilmentymistä indusoivassa M · : V väliaineessa (Joutsjoki ym. 1993), joka oli puskuroitu 5-prosenttisella !,*·· KH2P04:lla, pH:ssa 5,5. Rekombinantin proteiinin entsyymiaktiivisuus mitattiin : 25 viljelysupematantista pelkistettyjen sokereiden vapautumisena karboksimetyy- :liselluloosasta (2 % CMC) 50 °C:ssa 50 mM sitraattipuskurissa pH:ssa 4,8 ·φ· .··*. oleellisesti kuten kuvataan julkaisuissa Bailey ja Nevalainen 1981; Haakana ym. 2004.
..... Aktiivisuus ohran betaglukaania (1 %) vastaan määritettiin myös 30 mittaamalla pelkistettyjen sokereiden vapautuminen 50 °C:ssa 50 mM asetaat- *·;·* tipuskurissa pH:ssa 4,8, kuten kuvataan julkaisussa Stälbrand ym. 1993. Re- kombinantin proteiinin tuotanto detektoitiin myös viljelysupematantista SDS- polyakryyliamidigeelielektroforeesilla. Valittujen transformanttien genotyypit .!.t analysoitiin Southem-blottauksella käyttäen ekspressiokasettia koettimena.
I;*;' 35 Heterologisesti tuotetun Ta EG28/Cel5A-sellulaasin pH-optimi mää- • · · : ·* ritettiin universaalissa Mcllvainen puskurissa pH-välillä 4,0-8,0 käyttäen kar- 19 119434 boksimetyyliselluloosaa substraattina. Kuten osoitetaan kuvassa 2A, EG28/Cel5A-sellulaasiaktiivisuuden pH-optimi on pH:ssa 6,0. Optimilämpötilan EG28/Cel5A-sellulaasin entsyymiaktiivisuudelle määritettiin olevan 75 °C (Kuva 2B).
5 Valittu transformantti (RF6188) viljeltiin bioreaktorissa materiaalin saamiseksi sovellustesteihin (katso esimerkki 4).
Esimerkki 2. Rekombinantin Thermoascus aurantiacus ALK04242:n EG28+CtCBD-fuusioproteiinin tuotanto
Rekombinantin Thermoascus aurantiacuksen EG28+CtCBD-fuusio-10 proteiinin (sekvenssi nro: 4) tuottamiseksi Chaetomium thermophilum ALK04265:n CBHI/Cel7A-selluiaasin selluloosaa sitova domeeni (CBD) liitettiin EG28/Cel5A-sellulaasiin. Konstrukti sisältää EG28:n katalyyttisen domee-nin (täyspitkän polypeptidin aminohapot 1-334) liitettynä C. thermophilumm CBHI/Cel7A CtCBD:n linkkerialueeseen ja CBDiiin (sekvenssi nro: 15).
15 Molekyylibiologian perusmenetelmiä käytettiin, kuten kuvataan esi merkissä 1. Ensin ainutlaatuinen SnaBI-restriktiokohta lähellä EG28/Cel5A-sekvenssin C-terminaalista päätä tuotiin PCR:lla. Tämä mahdollistaa minkä tahansa tylppäpäisen DNA:n suoran fuusion EG28/Cel5A-polypeptidin aminohapon Y334 jälkeen. C. thermophilumm CBHI/Cel7A:n linkkeriä ja CBD-aluetta , 20 koodittava geeni (cel7A, sekvenssi nro: 7) vahvistettiin PCR:lla käyttäen for- • * * ·;·; ward- (sekvenssi nro: 11) ja reverse-alukkeita (sekvenssi nro: 12) ja C. ther- :* V mophilum ALK04265:n genomista DNA:ta templaattina. Vahvistettu 1,6 kb:n • · tuote ligoitiin ce/5A-geeniin (Y334:n jälkeen) Ta ce/5A_Ct ce/7AlinkkeriCBD:n j,·'; (sekvenssi nro: 3) luomiseksi. Saatu plasmidi nimettiin pALK1946:ksi.
25 pALK1946:n sisältävän E. coli -kannan talletusnumero Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH -viljelmäkokoelmassa on DSM 18159.
Ekspressioplasmidi (pALK1948, kuva 1) EG28+CtCBD-sellulaasin • · * M tuotantoon konstruoitiin, kuten kuvataan esimerkissä 1. Lineaarinen 8,9 kb:n **;*' 30 ekspressiokasetti (kuva 1) eristettiin vektorirungosta /Vofl-restriktioentsyymi- • · • *·· digestiolla, transformoitiin T. reesein A33:een (kannasta on deletoitu neljää pääsellulaasia CBHI/Cel7A, CBHII/Cel6A, EGI/Cel7B ja EGII/Cel5A koodittavat .···. geenit) ja transformantit valittiin, kuten kuvataan esimerkissä 1.
• ·
Fuusioproteiinin pH- ja lämpötilaoptimin määritettiin olevan samat ’ 35 kuin villityypin EG28-proteiinin.
20 119434
Valittu transformantti (RF6377) viljeltiin bioreaktorissa materiaalin saamiseksi sovellustesteihin (katso esimerkit 5-10).
Esimerkki 3. Rekombinantin Acremonium thermophilum ALK04245:n EG40+CtCBD-fuusioproteiinin tuotanto 5 Rekombinantin Acremonium thermophilum ALK04245:n EG40+CtCBD-fuusiopnoteiinin (sekvenssi nro: 6) tuottamiseen EG40-sellulaa-sin selluloosaa sitova domeeni korvataan Chaetomium thermophilum ALK04265:n CBHI/Cel7A:n domeenilla. Konstrukti sisältää EG40-sellulaasin katalyyttisen domeenin (täyspitkän polypeptidin aminohapot 1-234) liitettynä 10 C. thermophilumin CBHI/Cel7A:n linkkerialueeseen ja CBD:iin (CtCBD, sekvenssi nro: 15).
Molekyylibiologian perusmenetelmiä käytetään, kuten kuvataan esimerkissä 1. Acremonium thermophilumin ce/45A-geeni (sekvenssi nro: 8) vahvistetaan PCR:lla A. thermophilum ALK04245:n genomisesta DNA:sta käyttä-15 en alukkeita (sekvenssi nro: 13) ja (sekvenssi nro: 14). 1,1 kb:n PCR-frag-mentti kloonataan Sacll-Psfl-fragmenttina pBluescript II KS+ -vektoriin. Tämän jälkeen ainutlaatuinen A/rul-restriktiokohta lähellä EG40-sekvenssin C-termi-naalista päätä tuodaan PCR:lla. Tämä mahdollistaa minkä tahansa tylppäpäisen DNA:n suoran fuusion EG40-polypeptidin aminohapon S234 jälkeen. 20 Chaetomium thermophilumin CBHI/Cel7A-sellulaasin linkkeri- ynnä CBD-alue ···:' (ce/7A) vahvistetaan PCR:lla, kuten kuvataan esimerkissä 2, ja sen restriktio- • · · : V fragmentti ligoidaan ce/45A-geeniin (S234:n jälkeen) At ce/45A_Ct ce/7AlinkkeriCBD:n (sekvenssi nro: 5) luomiseksi. Ekspressioplasmidi jt:*: EG40+CtCBD-sellulaasin tuotantoon konstruoidaan ja rekombinantti proteiini : 25 (sekvenssi nro: 6) tuotetaan Trichodermassa, kuten kuvataan esimerkissä 1.
··· • · • · ***** Esimerkki 4. EG28-sellulaasin teho denimin viimeistelyssä eri lämpöti loissa • · • · 1 ’;[·* Thermoascus aurantiacuksen EG28-sellulaasia, joka tuotettiin *···1’ Trichodermassa (kanta RF6188), kuten kuvataan esimerkissä 1, testattiin sen 30 kyvyn suhteen luoda samanlainen kulunut ulkonäkö, joka saadaan aikaan * ;***: hohkakivillä, denimin biokivipesussa eri lämpötiloissa. Tehokasta denimin vii- meistelyentsyymiä, kaupallista EGII-rikastettua hapanta sellulaasivalmistetta, • * '··;* joka tuotettiin Trichodermassa (US 5 874 293), käytettiin referenssinä.
: V Indigo-värjätystä denim-tvvillistä tehtyjä farkkuja käytettiin testimate- 35 naalina liisterin poiston ECOSTONE® A200 -alfa-amylaasilla jälkeen. Sellu- 21 119434 laasikäsittelyt suoritettiin Electroluxin Wascator FOM 71 CLS -pesulakoneella taulukossa 1 kuvatuissa olosuhteissa.
Käytettyjen entsyymivalmisteiden endogiukanaasiaktiivisuus (ECU) mitattiin pelkistettyjen sokeroiden vapautumisena hydroksyylietyyliselluloosas-5 ta, kuten aiemmin on kuvattu (Bailey ja Nevalainen, 1981). EGII-rikastettua entsyymikonsentraattia ja EG28-valmistetta annosteltiin 220 ECU/g ja noin 380 ECU/g kangasta mainitussa järjestyksessä. Entsyymit testattiin optimi-pH-välillään, EGII-valmiste pH:ssa 5 ja EG28-valmiste pH:ssa 6. Veden poiston jälkeen entsyymi inaktivoitiin (10 minuutin ajan, 40 °C) nostamalla pH yli 11:n 10 natriumhydroksidilla. Farkut huuhdeltiin sitten kolme kertaa vedellä ja kuivattiin kuivausrummussa.
Biokivipesuvaikutus/hankaustaso arvioitiin mittaamalla väri heijas-tussuhdearvoina Minolta CM 2500-spektrofotometrillä käyttäen L*a*b*-väri-avaruuskoordinaatteja (valolaji D65/20). Väri denimin oikealta ja nurjalta puolel-15 ta ja taskujen väri mitattiin liisterin poiston jälkeen (ts. ennen sellulaasikäsitte-lyä) ja sellulaasikäsittelyn jälkeen. Kukin mittausarvo oikealta puolelta, nuijalta puolelta tai taskuista oli likimäärin 40, 20 tai 12 mittauksen keskiarvo mainitussa järjestyksessä. Kaksi paria farkkuja käytettiin kussakin testissä ja lopullinen tulos oli niiden keskiarvo. Tulokset osoitetaan taulukossa 2 ja kuvassa 3.
20 • · · • · · · »· · • · • · • · • · • · · • · * • · • · • « • · · ♦ ·· · • · · • * · ··· • · · • » • · ··* • · • · · • · · ♦ · ··· • · • * ··· ·· • · «·· • * • · ·«· • ·· • • ♦ ·* 1 · • · · • · • « 22 119434
Taulukko 1. Sellulaasikäsittelyissä käytetyt testiolosuhteet/prosessl· parametrit
Prosessiparametri________
Denim-kuorma__1,3 kg ____
Vesi__19 litraa_ pH-kontrolli (pH 5-5,3) 35 g Na2HP042H20 + 22 g sitruunahappoa pH-kontroHi (pH 6,1-6,3) 35,5 g Na2HPQ42H2Q + 15 g sitruunahappoa
Aika__45 min_ Lämpötila__40, 50, 60 tai 70 °C_
Sellulaasiannos__220 tai noin 380 ECU/g kangasta_
Taulukko 2. EG28-sellulaasilla eri lämpötiloissa käsitellyn denimin väri-5 mittaukset Käsittelyä EGII-rikastetulla valmisteella käytettiin referenssinä. L* ilmaisee vaaleutta, -b* on sininen suunta, +b* on keltainen suunta. __
Entsyymi- ECU/g Olosuhteet Ennen sellulaasi· Sellulaaaikäsittelyn deltaL* deltab* valmiste vaatetta _käsittelyä__jälkeen_ ____r______£___
Oikea puoli:____________ EG28 380 70 °C, pH 6,1-6,3 23,67 -16,07 32.63 -16,94 8.96 -0.87 • _ “ EG28__370 60 °C, pH 6,1-6,3 23,67 -16,38 31,94 -17,09 8,27 -0,71 Γ**: EG28 380 50 °C, pH 6,1-6,3 23,62 -16,24 31,91 -16,86 8.30 -0.63 S Λ ~ ------- " .*. : EG28 380 40 °C. pH 6,1-6,3 23.75 -16,07 30,57 -17,32 8.82 -1,25 • ·· " ' r " r ............ — -- : .*! EGII-rikastettu 220 60 °C. pH 5,2-5,3 23,45 -16,10 32,90 -17,29 9,46 -1,19 • · · "*/ Nurja puoli:_______________ • · * " " *·ί·* EG28 380 70 “C, pH 6,1-6,3 49,76 -6,95 49,80 -10,43 -0.18 -3.48 ----- -—--- _ '* ·............. ” EG28 370 60 °C· pH 6,1-6,3 49,55 -6,87 50,78 -9,57__1,24 -2,71 EG28__380 50 °C, pH 6,1-6,3 49,92 -7,05 50.49 -9,83__0,57 -2,78 J’· EG28__380 40 °C, pH 6,1-6,3 49,89 -6,93 49,73 -9,73__-0,16 -2,80 .···. EGII-rikastettu 220 60 °C, pH 5,2-6,3 49,75 -6,82 48,28 -12,28 -1,47 -5,45
Taskut:_________ iti : EG28__380 70 °C, pH 6,1-6,3 77,40 -8,14 68,53 -12,60 -8,86 -4,47 ·1; EG28 374 60 °C, pH 6,1-6,3 77,91 -7,71 70,29 -12,34 -7,62 -4,63 • >l ’ " , *. EG28__380 50 °C, pH 6,1-6,3 78,11 -7,62 70,63 -12,02 -7,49 -4,40 • 1 *·· ! EG28 380 40 °C, pH 6,1-6,3 77,51 -7,60 70,47 -11,91 -7,04 -4,32 ··· ^ .....
EGII-rikastettu 220 60 °C, pH 5,2-5,3 77,46 -7,68 66,18 -14,17 -11,29 -6,49 23 119434
Tulokset taulukossa 2 ja kuvassa 3 osoittavat, että paras hankaus-vaikutus EG28-valmisteella (kanta RF6188) saatiin välillä 50-70 °C. Käyttäen EG28-valmisteen annosta 380 ECU/g kangasta 70 °C:ssa saatiin samanlainen hankaustaso (vaaleus L*) kuin käyttäen EGII-rikastetun valmisteen annosta 5 220 ECU/g kangasta 60 °C:ssa. Kuitenkin takaisinvärjäytymisvaikutus (indigo-värin uudelleenkerrostuminen) denimin nurjalle puolelle ja taskuihin oli matalampi EG28-valmisteella (korkeampi vaaleus, vähemmän sinistä) kuin EGII-rikastetulla valmisteella. Myös kontrasti denimin oikealla puolella näytti paremmalta.
10 Esimerkki 5. EG28+CtCBD-fuusioproteiinin teho verrattuna EG28-sellu-laasiin denimin viimeistelyssä
Rekombinanttia Thermoascus aurantiacuksen EG28+CtCBD-fuusio-proteiinia, joka tuotettiin Trichodermassa (kanta RF6377), kuten kuvataan esimerkissä 2, verrattiin EG28-valmisteeseen kannasta RF6188 denimin biokivi-15 pesussa pH:ssa 6, 60 °C. Denim ja testisysteemi biokivipesuun oli esimerkin 4 kaltainen paitsi, että denimin määrä tasoitettiin 1430 g:aan ylimääräisellä palalla eri denimiä, jota ei sisällytetty mittauksiin. Sellulaasikäsittelyn vaikutus arvioitiin kuten esimerkissä 4.
Tulokset taulukossa 3 osoittavat, että EG28+CtCBD-valmisteen bio-20 kivipesuvaikutus oli erittäin hyvä matalalla annoksella. Kannalla RF6377 sa-manlainen hankaustaso (vaaleus L*) saatiin 6,5 kertaa matalammalla annok-j‘\: sella verrattuna RF6188:aan. Selluloosaa sitovan domeenin (CBD) liittäminen EG28-sellulaasiin ei lisännyt epäsuotavaa takaisinvärjäytymisvaikutusta, mutta • ·*: lisäsi toivottua pesutehoa suuresti.
·»* * • · • · · • · · ·«· • · • · • t · ·· • · • M « ··· • t • * ··· ·♦· • · · • · · ·♦· • · • · ··· • · • · · • · · ··· · 1 • · • · ···
Taulukko 3. EG28- ja EG28+CtCBD-sellulaaseilta 60 °C:ssa pH:ssa 6 käsi tellyn denimin värimittaukset 24 119434 L* ilmaisee vaaleutta, -b* on sininen suunta, +b* on keltainen suunta;_^__
Entsyymi- ECU/g Ennen sellulaasi- Sellulaasl- deltaL* deltab* valmiste vaatetta käsittelyä käsittelyn jälkeen ___L* b* L* b*___
Oikea puoli: EG28 325 23,40 -16,02 31,01 -17,12 7,62 -1,10 EG28+CtCBD 50__23,81 -16,21 31,60 -16,92 7,80 -0,71
Nurja puoli:___ _ EG28 325 49,46 -6,83 50,03 -9,62 0,57 -2,79 EG28+CtCBD 50 49,36 -7,03 50,62 -9,61 1,27 -2,58
Taskut:________ EG28__325 76,11 -8,36 68,53 -12,46 -7,58 -4,10 EG28+CtCBD 50 76,02 -8,45 68,81 -12,39 -7,21 -3,94 5
Esimerkki 6. EG28+CtCBD-sellulaasin teho verrattuna EGII-sellulaasiin denimin viimeistelyssä
Rekombinanttia Thermoascus aurantiacuksen EG28+CtCBD-fuusio-proteiinia, joka tuotettiin Trichodermassa (kanta RF6377), verrattiin kaupalli-10 seen EGII-rikastettuun happamaan sellulaasivalmisteeseen (US 5 874 293) • ·# .*'/ denimin biokivipesussa.
:*V Testisysteemi biokivipesuun oli esimerkin 4 kaltainen paitsi, että • · · *·*·* useita eri denim-tyyppien paloja (lahkeita) Ukos Sportilta (Belgia) ja Vicunhalta (Brasilia) käytettiin (kokonaisuudessaan 1,2 kg). Olosuhteet EG28+CtCBD- ja 15 EGII-käsittelylle olivat taulukon 4 kaltaiset. Sellulaasikäsittelyn vaikutus arvioi-{*·.. tiin kuten esimerkissä 4.
Neljällä eri denim-kankaalla suoritettujen kokeiden tulokset osoite-/*,m taan taulukoissa 4 ja 5. Käyttäen EG28+CtCBD-valmisteen entsyymiannosta *;!.* 500 ECU/g kangasta saatiin samanlainen vaaleustaso kuin käyttäen EGII- *·;** 20 rikastetun valmisteen annosta 1000 ECU/g kangasta. EG28+CtCBD-valmis- : teen teho vaati karkeasti vain puolet siitä ECU-aktiivisuudesta kuin EGII-rikas- tetun sellulaasin teho, Myös rekombinantin isännän tuottaman EG28+CtCBD:n • · · viljelyväliaine on tilavuuden suhteen noin kaksi kertaa niin tehokasta kuin re- 25 119434 kombinantin isännän tuottaman EGII:n väliaine biokivipesussa. Huomattavasti vähemmän takaisinvärjäytymistä havaittiin denimin nurjalla puolella, kun EG28+CtCBD-valmistetta käytettiin. EG28+CtCBD-valmisteen teho 50 °C:ssa oli parempi pH:ssa 6 kuin pH:ssa 5.
• · 1 · i1 · • v · • · » 1 • · • · · • 1« ' · · • · • · # • · • f1 · • tl • ♦ · *»1
Ml t · « · «·· M • ·
• M
··· • · • · «·· 9 ··· • · · I 1 1 · " ··· • · * · ··· · • · ·
I I I «·· I
• · t • 9 • ·
• M
Taulukko 4. Värimittaukset EG28+CtCBD-sellulaasilla pH:ssa 5 ja 6 käsi tellyn denimin oikealta puolelta 26 119434 Käsittelyä EGII-rikastetulla valmisteella käytettiin vertailuun. L* il-_maisee vaaleutta, -b* on sininen suunta, +b* on keltainen suunta.__
Entsyymi- Denim ECU/g Olo-suhteet Ennen sellulaasi- Seliulaasi- deltaL* deltab* valmiste vaatetta käsittelyä käsittelyn Jälkeen ________L* b*__L» b*_______
Atlanta, 19,96 -15,91 27,44 -18,49 7,48 -2,58
Ukos sport
Mathew, pH säädetty 18,28 ~7'97 21,87 -11,71 3,59 ‘3-74
Ukos sport , . „ --- etikka-hapolta-------—.........
Nostalgy, . 19,12 -8,78 23,90 -13,50 4.78 -4,72 55 min, EGII- Ukos sport 1000 50 °C, pH 5____—___ rikastettu Viounha, 17,24 -10,49 21,51 -14,93 4,27 -4,44
Savana _____
Keski- 18,65 -10,79 23,68 -14,66 5,03 -3,87 __arvo__ _____
Atlanta, 19,79 -16,02 25,88 -18,44 6,09 -2,42
Ukos sport ___
Mathew, 18,07 -8,58 21,45 -11,80 3,38 -3,22
Ukos sport pH säädetty _ _ _
Nostalgy, etikka-hapolla 19,05 -8,73 22,65 -12,69 3,60 -3,96 ♦ · ·
Ukos sport 55 min, _ • * I EG28+CtCBD Vicunha, 500 50 °C, pH 5 17 38 -10,11 20,75 -14,18 3.37 -4,07 ·*· · Savana ♦ ^ S» - _ ______ ____ : .·, Keski- 18,57 -10,86 22,68 -14,28 4,11 -3,42 * * ·
Itä · . arvo • · * —-------- *···* Atlanta, 19,98 -16,18 27,35 -18,20 7,37 -2,02 ···
Ukos sport _____
Mathew, 17,51 -8,84 21,40 -11,62 3,89 -2,78 ", Ukos sport pH säädetty • ·· · —------------------ *··· Nostalgy, etikka-hapolla 18,58 -8,65 22,96 -12,75 4,38 -4,10 f 8 ’*· Ukos sport 55 min, ______ EG2$+CtCBD Vicunha, 500 50 °C, pH 6 17,50 -10,16 21,49 -14,06 3,99 -3,90 • ' ,***. Savana • · , ------ — —— —— ---- -- '·* Keski- 18,39 -10,96 23,30 -14,16 4,91 -3,20 Φ · * · · s arvo
• · · __. _ .._________ I
• » -——— 1 ♦ · ·*·
Taulukko 5. Värimittaukset EG28+CtCBD-sellulaasilla pH:ssa 5 ja 6 käsi tellyn denimin nurjalta puolelta 119434 27 Käsittelyä EGII-rikastetulla valmisteella käytettiin vertailuun. L* il-_maisee vaaleutta, -b* on sininen suunta __
Entsyymi- Denim ECU/g Olo-suhteet Ennen sellulaasi- Sellulaasi- deltaL* deltab* valmiste vaatetta käsittelyä käsittelyn Jälkeen __________ L* b* L*__b^_______
Atlanta, 47,98 -7,25 40,18 -14,63 -7,80 -7,38
Ukos sport
Mathew, pH säädetty 38·41 -7·17 36·11 ’10·93 '2·30 "3·76
Ukos sport etikka-hapolla EGII- 1000 ""
Nostalgy, 55 min, 46,70 -6,06 41,87 -11,73 -4,83 -5,67 rikastettu
Ukos sport 50 °C, pH 5
Vicunha, 35,65 -9,24 33.48 -12,44 -2,17 -3,20
Savana __Keski-arvo____42,19 -7,43 37,91 -12,43 -4,28 -5,00
Atlanta, 48,01 -7,29 41,82 -13,25 -6,19 -5,96
Ukos sport ____
Mathew, 37,60 -7,27 35,59 -10,50 -2,01 -3,23 pH säädetty
Ukos sport - etikka-hapolla------ EG28+CtCBD Nostalgy, 500 „ . 46,79 -5,99 44,75 -9,37 -2,04 -3,38 φ· | 55 min, ?V Utl0-i-S-L0?- 50 °C, pH 5 ------- ---- ! *.ί Vicunha, 35,08 -9,48 33,72 -11,80 -1,36 -2,32 * · • ·
Savana ··* # - —-- • ·*· Keski-arvo 41,87 -7,51 38,97 -11,23 -2,90 -3,72 ··· ----” -------------- - .·**, Atlanta, 47,55 -7,43 42,41 -13,30 -5,14 -5,87 ‘ M»
Ukos sport ___ ··, Mathew, 37,27 -7,58 36,01 -10,27 -1,26 -2,69 i ** pH säädetty >·· Ukos sport • ; - etikka-hapolla-----— — ·** EG28+CtCBD Nostalgy, 500 rl_ . 47,02 -6,01 44,61 -10,13 -2,41 -4,12 ,,, 55 min, !*?! Uk0SSpOrt 50 °C, pH 5_____—- • t>>! Vicunha, 34,84 -9,39 33,53 -11,20 -1,31 -1,81 • ,·, Savana • · · ---- - — -"--
Keski-arvo 41,67 -7,60 39,14 -11,23 -2,53 -3,62 • * ··* 28 119434
Esimerkki 7. pH;n vaikutus EG28+CtCBD-sellulaasivalmisteen tehoon 50 °C:ssa ja 60 °C:ssa
Rekombinantti Thermoascus aurantiacuksen EG28+CBD-fuusio-proteiini, joka tuotettiin Trichodermassa (kanta RF6377), testattiin sen tehon 5 suhteen denimin biokivipesussa eri pH-arvoissa 50 °C:ssa ja 60 °C:ssa.
Indigo-värjättyä denim-twilliä (erilainen kuin aiemmissa esimerkeissä), josta oli poistettu liisteri ja joka oli leikattu palasiksi, käytettiin testimateri-aalina. Sellulaasikäsittelyt suoritettiin LP-2-pesulaitteessa seuraavasti. Noin 7,2 g denim-kangasta (noin 12 cm x 12 cm kaistale), 200 ml Mc llvainen sit-10 raattifosfaattipuskuria ja 90 teräspalloa (halkaisija 0,6 cm) ladattiin 1,2-litran säiliöihin. Pesulaitetta käytettiin 120 minuutin ajan eri pH-arvoissa 4-8 käyttäen lämpötiloja 50 °C ja 60 °C. Kaistaleiden poiston säiliöistä jälkeen ne huuhdeltiin vedellä ja liotettiin NaOH:a sisältävässä vedessä (pH > 11) 10 minuutin ajan sekoittaen. Sen jälkeen kaistaleet liotettiin nestemäistä pesuainetta (OMO 15 Color) sisältävässä lämpimässä vedessä ja sekoitettiin 10 minuutin ajan, mitä seurasi varovainen huuhtelu lämpimällä vedellä useita kertoja. Kaistaleet kuivattiin huoneenlämmössä. Biokivipesuvaikutus arvioitiin mittaamalla väri hei-jastussuhdeyksikköinä, kuten kuvataan esimerkissä 4. Kukin mittausarvo de-nim-kaistaleen oikealta puolelta oli vähintään 20 mittauksen keskiarvo.
20 Taulukoissa 6 ja 7 ja kuvissa 4 ja 5 osoitetut tulokset osoittavat, että ,·. optimaalisin pH-väli EG28+CtCBD-sellulaasille 50 °C:ssa on 5,5-6,5 ja 60 °C:ssa 5-7.
i · · • * « · • · • · * • «* • · • · • · · • · · ··· · • · · li·
IM lii « I
• I Ml «·
• I
• ·· • · S • · • « ··· *«· • · · I I « ··· • · ·
IM
• · • · ·
• I I IM I
Ml • « • ·
Ml 29 119434
Taulukko 6. Värimittaukset EG28+CtCBD-sellulaasilla eri pH-arvoissa pesukoneessa 50 °C:s$a käsitellyn denimin oikealta puolelta _L1 ilmaisee vaaleutta, -b1 on sininen suunta__
Entsyymi- ECU/g Olosuhteet Ennen sellulaasi- Sellulaasikäsittelyn L1:n valmiste vaatetta käsittelyä__Jälkeen_ lisäys _____L« b»__L1____
Puskurikontrolli__0__pH 6 17,28 -13,07 18,77 -14,13 1,49
Puskurikontrolli__0 pH 8 17,01 -13,4 18,18 -14,45 1,17 EG28+CtCBD 1000__pH 4 16,79 -13,59 20,86 -16,40 4,07 EG28+CtCBD 1000__pH 5 17,34 -13,18 21,59 -16,44 4,25 EG28+CtCBD 1000 pH 5,5 17,30 -13,25 22,06 -16,39 4,76 EG28+CtCBD 1000__pH 6 17,35 -13,42 22,29 -16,47 4,94 EG28+CtCBD__1000__pH 6,5 17,31 -13,41 22,48 -16,65 5,17 EG28+CtCBD 1000 pH 7 17,34 -13,25 21,55 -16,23 4,21 EG28+CtCBD 1000 pH 8 16,91 -13,63 19,62 -15,72 2,71 5 Taulukko 7. Värimittaukset EG28+CtCBD-$ellulaasilla eri pH-arvoissa pesukoneessa 60 °C:ssa käsitellyn denimin oikealta puolelta L1 ilmaisee vaaleutta, -b1 on sininen suunta__ (1( Entsyymi- ECU/g Olosuhteet Ennen sellulaasi- Sellulaasikäsittelyn L1:n !2· valmiste vaatetta käsittelyä jälkeen lisäys • · · I j \ \ L1 b1 L1 b1 / / EG28+CtCBD 1000__pH 4 17,19 -13,58 20,48 -15,77 3,29 !·ϊ 1 EG28+CtCBD 1000 pH 5 17,10 -13,24 22,74 -16,59 5,64 • 111 —-- !.ϊ.: EG28+CtCBD 1000 pH 5,5 17,10 -13,54 22,66 -16,61 5,56 • •e----— — 1 ---------— —- !...: EG28+CtCBD 1000__pH6__17,10 -13,65 22,83 -16,74 5,73 EG28+CtCBD 1000__pH 6,5 17,19 -13,47 22,65 -11,72 5,46 j2.. EG28+CtCBD__1000__pH7__16,99 -13,72 22,10 -16,66 5,11 i"1i EG28+CtCBD 1000 pH 8 17,13 -13,68 19,35 -15,15 2,22 ··· ————- — — -------:-
Mt··. Puskurikontrolli 0 pH 6 17,36 -13,6 18,95 -14,28 1,59 »·» • · • · ··· · • · · • e · ·«· · e· e · e · 2 • at 30 119434
Esimerkki 8. EG28+CtCBD-sellulaasivalmisteen teho denimin viimeistelyssä eri lämpötiloissa
Rekombinantti Thermoascus aurantiacuksen EG28+CtCBD-fuusio-proteiini, joka tuotettiin Trichodermassa (kanta RF6377), kuten kuvataan esi-5 merkissä 1, testattiin sen kyvyn suhteen luoda samanlainen kulunut ulkonäkö, joka saadaan aikaan hohkakivillä, denimin biokivipesussa eri lämpötiloissa. Tehokasta denimin viimeistelyentsyymiä, kaupallista EGII-rikastettua hapanta sellulaasivalmistetta (US 5 874 293) ja neutraalia sellulaasivalmistetta ECOS-TONE® 01 käytettiin referenssinä.
10 Testisysteemi biokivipesuun oli esimerkin 4 kaltainen paitsi, että eri laista denim-tvvilliä ja 55 minuutin pesuaikaa käytettiin. EG28+CtCBD-entsyy-mivalmisteen ja EGII-rikastetun entsyymivalmisteen entsyymiaktiivisuus (en-doglukanaasiyksikkö, ECU) mitattiin kuten esimerkissä 4. Neutraalin sellu-laasivalmisteen ECOSTONE® C1 aktiivisuus (neutraali sellulaasiyksikkö, NCU) 15 mitattiin pelkistettyjen sokereiden vapautumisena karboksimetyyliselluloosasta, kuten on aiemmin kuvattu (Bailey ja Nevalainen, 1981; Haakana ym. 2004). ECOSTONE® C1-, EG28+CtCBD- tai EGII-rikastetut valmisteet annosteltiin 250 NCU:nä/g, 500 ECU:nä/g tai 1000 ECU:nä/g kangasta mainitussa järjestyksessä. Sellulaasikäsittelyn vaikutus arvioitiin kuten esimerkissä 4.
20 EG28+CtCBD:n teho lämpötiloissa 40-70 °C, pH 6 osoitetaan tau- . lukossa 8 ja kuvassa 6. Edullinen lämpötilaväli entsyymille on 50-70 °C. Mata- ·♦· "•j lampia lämpötiloja, kuten 40 °C, voidaan käyttää sellaisen hankaustason saa- • · · miseksi, jolla on vähemmän värinpoistoa, jos tummempi ulkonäkö on toivotta- • · · *. 1 2: va.
• · · 25 Tulokset ovat myös yhtäpitäviä esimerkissä 6 saatujen tulosten : : kanssa, jossa EG28+CtCBD:n tehon biokivipesussa osoitettiin olevan noin :3: kaksi kertaa tehokkaampi kuin kaupallisen EGII-rikastetun happaman sellu- * · · laasivalmisteen teho. Happamilla seilulaaseilla on yleisesti takaisinvärjäytymis- m taipumusta. Neutraalit sellulaasit, kuten ECOSTONE® C1, tyypillisesti aiheut- !···. 30 tavat matalampaa takaisinvärjäytymistä siksi johtaen hyvään kontrastiin. Tässä • · *·1 saadut tulokset osoittavat, että samanlainen vaikutus saatiin EG28+CtCBD- ··· *·1 1 sellulaasilla ja neutraaleilla seilulaaseilla (taulukko 8).
• · · • · • · ··· • · • · · • · · * 1 ® · · · • · 2 • · 3 ·1» 31 119434
Taulukko 8. EG28+CtCBD-sellulaasilla eri lämpötiloissa käsitellyn deni-min värimittaukset Käsittelyä EGII-rikastetulla happamalla sellulaasilla ja neutraalilla ECOSTONE® C1-sellulaasivalmisteella käytettiin referenssinä. L* ilmaisee 5 vaaleutta, -b* on sininen suunta, +b* on keltainen suunta. __
Entsyymi- Aktiivi- Olosuhteet Ennen seilulaasi- Seliulaasikäsitteiyn deltaL* deltab* valmiste suus/g käsittelyä jälkeen __vaatetta L* b* L* b*
Oikea puoli: EG28+CBD__500 ECU/g 70 °C, pH 6,2 17,38 -13,49 27,42 -17,27 10,05 -3,78 EG28+CBD__500 ECU/g 60 °C, pH 6,2 16,76 -13,31 26,01 -17,49 9,25 -4,18 EG28+CBD__500 ECU/g 50 °C, pH 6,2 16,78 -13,40 25,00 -17,44 8,22 -4,04 EG28+CBD__500 ECU/g 40 °C, pH 6,2 16,76 -13,21 22,86 -17,25 6,11 -4,04 EGII-rikastettu 1000 ECU/g 60 °C, pH 5,1 17,24 -13,38 26,59 -17,64 9,35 -4,26 ECOSTONE C1 250 ECU/g 60 °C, pH 6,5 17,38 -13,53 26,91 -16,98 9,53 -3,45
Nurja puoli: EG28+CBD__500 ECU/g 70 °C, pH 6,2 45,67 -6,33 41,78 -13,83 -3,90 -7,51 EG28+CBD__500 ECU/g 60 °C, pH 6,2 45,60 -5,95 42,72 -13,05 -2,88 -7,10 EG28+CBD__500 ECU/g 50 °C, pH 6,2 45,67 -5,92 41,84 -13,35 -3,86 -7,44 EG28+CBD__500 ECU/g 40 °C, pH 6,2 45,80 -5,72 41,66 -12,52 -4,14 -6,81 ··· EGII-rikastettu 1000 ECU/g 60 °C, pH 5,1 46,10 -6,19 39,89 -15,24 -8,21 -9,06 • · e * ~~ i . — - .
ECOSTONE C1 250 ECU/g 60 °C, pH 6,5 45.63 -6,46 42,49 -12,76 -3,14 -6,31 • · i - I »i·!_ I I _____ • · • · • m m • «* • · • * :··* : Esimerkki 9. EG28- ja EG28+CtCBD-sellulaasien teho bioviimeistelyssä (nyppyyntymisen estossa) ·»· EG28-sellulaasin kannasta RF6188 ja EG28+CtCBD-valmisteen 10 kannasta RF6377 teho puuvillaisten neulevaatteiden nyppyyntymisen estossa j *·. testattiin. Sellulaasikäsittelyt suoritettiin Electroluxin Wascator FOM 71 CLS -pe- sulakoneella taulukossa 9 kuvatuissa olosuhteissa.
·«· (.j.' Matalan laadun poolokauluksisten neulepaitojen, joilla oli nukkainen ;!.* pinta, kahdenlaisia palasia, jotka oli tehty 100 % jersey-pohjaisesta puuvilla- • · **;·* 15 kankaasta tai resorista, joka oli tehty 95 % puuvillaa ja 5 % lycraa, käytettiin testimateriaalina täytemateriaalin kanssa. Näytteitä ensin esipestiin 10 minuu-tin ajan 60 °C:ssa 1 ml/l surfaktantteja/kostutusaineita kanssa (Sandoclean PCJ Sandosilta and Imacol CN Clariantista) ja huuhdeltiin kolme kertaa vedel- 32 1 1 9434 lä. Tämän jälkeen puuvillaneuleita käsiteltiin sellulaasilla 60 °C:ssa 60 minuutin ajan samojen tekstiiliapuaineiden, joita käytettiin esipesussa, ollessa läsnä. Entsyymi inaktivoitiin kuten kuvataan esimerkissä 4 lukuun ottamatta lämpötilaa, joka oli 60 °C emäksisen huuhtelun aikana. Neulevaatteiden palasia 5 huuhdeltiin kolme kertaa ja sen jälkeen kuivattiin kuivausrummussa.
Taulukko 9. Bioviimeistelykäsittelyissä käytetyt testiolosuhteet/prosessl· parametrit
Prosessiparametri__
Kangaskuorma__1,0 kg_
Vesi__15 litraa_
Sandoclean PCJ ja Imacol CN 1 ml/l
Puskuri/pH-kontrolli (pH 5-5,3) noin 3 ml etikkahappoa (80 %)
Aika__60 min_ Lämpötila__60 °C_
Sellulaasiannos_ 1200 ECU/g kangasta_
Sellulaasikäsittelyn vaikutus arvioitiin visuaalisesti paljaalla silmällä 10 ja luupilla. Esipestyä näytettä ilman entsyymiä käytettiin kontrollina.
Tulokset osoittavat, että EG28+CtCBD-valmiste paransi nyyppyyn- tymisen esto-ominaisuuksia. Neulevaatteen pinnan nukkaantuminen oli huo- ···! mattavasti vähentynyt käsittelyn EG28+CtCBD-valmisteella jälkeen verrattuna »· · : V kontrolliin (käsittely ilman entsyymiä). Myös EG28-valmisteella oli nyppyynty- • · 15 misen estovaikutus.
• · • * · i · » "V Esimerkki 10. Rehun pelletoinnin stabiiliuskoe • · »
,*··. Kaksi selluloosavalmistetta, EG28 (kanta RF6188) ja EG28+QCBD
• φ (kanta RF6377) testattiin erikseen kokeessa, joka simuloi teollista rehun tuo- .. tantoprosessia. Ennen testausta suihkukuivatut EG28- tai EG28+CtCBD-val- • ♦ :mm\m 20 misteet jauhettiin vehnäjauhon kanssa homogeenisyyden parantamiseksi re-*···* hutasolla. Jauhojen kanssa esisekoitetut EG28- ja EG28+CtCBD-entsyymit li- :*·*: sättiin annoksina 200 g/t ja 500 g/t rehua mainitussa järjestyksessä. Entsyymin m .·**. yliannostusta käytettiin analyysin helpottamiseksi korkeissa lämpötiloissa, jois- ··* . *. sa aktiivisuus on voinut oleellisesti vähentyä, pelletoiduista näytteistä.
• « · :;j.: 25 Myllyä ja sekoitinta käytetään jauhoseosten tuottamiseen osana • · *···* puoliteollista rehulaitteistoa, jolla on nimellinen 5 t/h:n pelletointikapasiteetti.
33 119434
Mylly on Champion hammer mill varustettuna 0 3,0 mm:n suulakkeella. Jauhettu raakamateriaali sekoitetaan 2 500 litran horisontaalisessa sekoittimessa nopeudella 27 rpm, ennen kuin siirretään pienoissyötön jauhatuslaitteistoon. Laitteisto käsittää horisontaalisen sekoittimen (tilavuus 700 I, nopeus 48 rpm, 5 300 kg:n sekoituserät), Skjold TR -annosteluruuvin ja Kahl -kaskadisekoittimen (pituus 130 cm, halkaisija 30 cm, nopeus 155 rpm, varustettu 37 säädettävällä lavalla). Puristusaika 300 kg:lle/h on likimäärin 30 sekuntia. Asennettuna kaskadisekoittimen kylkeen on jakoputki veden polsvirtauksella ja 3 höyryventtiilil-lä, joista höyry johdetaan jauhoon. Höyry saadaan aikaan korkeapaineisessa 10 höyrykattilassa 400 kg höyryä / h maksimikapasiteetilla. Testit hoidetaan 2 ilmakehän ylipaineessa ja höyry johdetaan paineenalennusventtiilin läpi, joka kontrolloi höyryn lisäystä kaskadisekoittimeen. Kolmea venttiiliä jakoputkessa käytetään toivotun jauhon lämpötilan hienosäätöön. Jauhon lämpötila mitattiin digitaalisella lämpömittarilla, joka asetettiin kaskadisekoittimen poistoputkeen, 15 juuri ennen kuin jauho tuli sisään pellettisuulakkeeseen. Pellettipuristin on Simon Heesen, type labor (monoroll) 0 3 mm x 35 mm suulakkeella ja 7,5 kW:n moottorilla. Suulakkeen sisähalkaisija: 173 mm, puristusrulian korkeus: 50 mm, puristusrullan halkaisija: 140 mm, käyntinopeus 500 rpm ja nimellinen kapasiteetti: 300 kg/h. Näytteitä otettiin pelletinpuristuksen jälkeen ja jäähdytettiin osi-20 tetussa jäähdytyslaatikossa, jossa oli rei’itetty pohja, tuuletin: 1500 m3 ilmaa / h.
300 kg:n erä vehnäpohjaista rehumäskiä tuotettiin. Esisekoite tuo- ··· * * · · tettiin 10 kg:sta tätä jauhoa ja 200 g:sta (tai 500 g:sta) testientsyymiä 70-litran : pakkosekoittimessa. Sekoittimen nopeus: 45 rpm. Sekoitusaika: 10 min. Tämä • · \*·: esisekoite lisättiin 290 kg:n rehua kanssa horisontaaliseen sekoittimeen pie- 25 noissyötön jauhatuslaitteistossa ja sekoitettiin 10 minuutin ajan. Näytteenoton mäskistä jälkeen rehu pelletoitiin pellettipuristimen läpi (suulake 0 3 mm). Jau- :**·; ho kuumennettiin tavoitelämpötilaan (65-90 °C) säätämällä höyrynlisäystä * * * kaskadisekoittimeen. Kullekin lämpötilalle otettiin ensin näyte 10 minuuttia sen :·, jälkeen, kun tavoitepelletointilämpötila (mitattuna jauhosta juuri ennen pelle- • »t 30 tointia) saavutettiin. Näytteet otettiin 1,0 minuutin aikana, mikä vastasi 5,0 kg pelletoitua rehua. Näyte otettiin likimäärin 500 gramman alinäytteinä ja asetet- ··· v : tiin jäähdytyslaatikkoon 10-15 sekunnin ajaksi sen jälkeen, kun pelletit olivat i"\ jättäneet pellettipuristimen. Kaikki näytteet tuuletettiin ja jäähdytettiin huoneen- : )·. lämmössä 15 minuutin ajan. Näytteet jaettiin homogeenisesti alinäytteisiin • · · 35 hiekkurinäytteenjakajalla ja täytettiin muovipusseihin.
• · • · · 34 119434 Näytteet analysoitiin seuraavasti: 2,5 g hyvin jauhettua näytettä ja 20 ml asetaattipuskuria (0,05 M, pH 5,0) sekoitettiin 30 minuutin ajan huoneenlämmössä, sentrifugoitiin (10 min, 400 rpm) ja laimennettiin. 1,0 ml kirkastettua näytettä kolmena kappaleena tasapainotettiin 5 minuutin ajan vesihauteessa 5 40 °C:ssa. Reaktio aloitettiin Beta-Glucazyme-tabletin (Megazyme, Irlanti) lisä yksellä ilman sekoittamista. Tasan 30 minuutin jälkeen reaktio pysäytettiin lisäämällä 5,0 ml Trizma Basea 1 % (massa/tilavuus) (Sigma-AIdrich) kiivaasti sekoittaen vortex-sekoittimella. Putki jätettiin huoneenlämpöön noin 5 minuutin ajaksi; liete sekoitettiin taas ja suodatettiin Whatman 1 -suodatinpaperin läpi. 10 Suodoksen absorbanssi mitattiin 590 nm:llä. Tulokset analysoitiin käyttäen standardikäyrää.
Entsyymiaktiivisuuden talteenotot ennen pelletointia ja sen jälkeen esitetään taulukossa 10. Peiletointilämpötilan vaikutus betaglukanaasiaktiivi-suuden talteenottoon on myös esitetty kuvissa 7 ja 8. EG28- ja EG28+CtCBD-15 sellulaasit olivat stabiileja 80°C:seen saakka. EG28+CtCBD-sellulaasi oli taipuvainen olemaan stabiilimpi kuin EG28 90 °C:n pelletointilämpötilassa.
Taulukko 10. Entsyymiaktiivisuuksien talteenotot ennen pelletointia (jauho horisontaalisesti sekoittimesta) ja sen jälkeen lämpötiloissa, jotka vaihtelivat 65-90 °C
Pelletointilämpötila _Betaglukanaasiakti visuus (FBU/kg rehua)_ ..li*__(EG28)_ (EG28+CtCBD)_ • V Jauho horisontaalisesta 239 000 ± 9 000 (100 %) 1 148 000 ± 48 000 (100 %) sekoittimesta • « ____________- . _ . . . -------- je:‘: Pelletti (65 °C)_ 227 000 ± 16 000 (95 %) 1 007 000 ± 67 000 (88 %) : Pelletti (70 °C)__217 000 ± 5 000 (91 %) 1 012 000 ± 54 000 (88 %) . Pelletti (75 °C)__227 000 ± 14 000 (95 %) 993 000 ± 49 000 (86 %)
Pelletti (80 °C) 215 000 ± 6 000 (90 %) 1 030 000 i 87 000 (90 %)
Pelletti (85 °C) 188 000 ± 7 000 (79 %) 904 000 ± 56 000 (79 %) \... Pelletti (90 °C) 149 000 ± 8 200 (62 %) 861 000 ± 32 000 (75 %) e · X r .......
··· AA
. 20 ··· • · · • · · ·«· • · • · ··* • · • ♦ · • · · • M · ··· • · • · • · · 35 119434
Lista talletetuista organismeista
Kanta Sisällytetty Talletuslaitos Talletuspäivä Talletusnumero __plasmldi____
Acremonium - CBS(1) 20. syyskuuta 2004 CBS 116240 thermophilum ALKQ4245________
Thermoascus - CBS(1) 20. syyskuuta 2004 CBS 116239 aurantiacus ALKQ4242_____
Chaetomium - CBS(2) 8. marraskuuta 1995 CBS 730,95 thermophilum ALKQ4265_____
Escherichia coH pALK1946 DSMZ*3* 7. huhtikuuta 2006 DSM 18159
Escherichia coli pALK1926__DSMZ__13. toukokuuta 2005 DSM 17326 (1) Centralbureau Voor Schimmelcultures at Upsalalaan 8, 3584 CT, Ultrecht, Alankomaat (2) Centralbureau Voor Schimmelcultures at Oosterstraat 1, 3742 SK BAARN, 5 Alankomaat (3) Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Mascheroder Weg 1 b, D-38124 Braunschweig, Saksa • * e **a* • e · • e e • e a · a a a a e • aa * a e a a a a a a a aaa a a aaa aaa aaa aaa a a a a a# * aa a a a a a a aaa a a a a aaa a aaa aaa aaa a aa* a a a a aaa a a a aaa aaa aaa a aa* a a a * aa* 119434
sekluetxt.txt SEQUENCE LISTING
<110> AB Enzymes Oy <120> Enzyme fusion proteins and their use <130> 2060570 <160> 15 <170> Patentin version 3.2 <210> 1 <211> 1317
<212> DNA
<213> Thermoascus aurantiacus <220> <221> gene <222> Cl)..(1317) <220> <221> Intron <222> ¢107)..(161) <220> <221> Intron <222> (221)..(280) <220> <221> Intron <222> (434)..(492) <220> <221> Intron <222> (558)..(631) <220> <221> intron <222> (730)..(790) ..ΙΓ <400> 1 j·.·, atgaagctcg gctctctcgt gctcgctctc agcgcagcta ggcttacact gtcggcccct 60 • · φ ·
.·. i ctcgcagaca ggaagcagga gaccaagcgt gcgaaagtat tccaatgttc gtaacatcca 120 *· M
: .·. cgtctggctt gctggcttac tggcaactga caatggcgaa gggttcggtt caaacgagtc 180 • · · Φ · · . cggtgctgaa ttcggaagcc agaaccttcc aggagtcgag gtcagcatgc ctgtactctc 240 • * » ··· .*··. tgcattatat taatatctca agaggcttac tctttcgcag ggaaaggatt atatatggcc 300 • tgatcccaac accattgaca cattgatcag caaggggatg aacatctttc gtgtcccctt 360 . .·. tatgatggag agattggttc ccaactcaat gaccggctct ccggatccga actacctggc 420 • · · * · .···. agatctcata gcggtacatt tcaattccac catgtttgga gctgtcttcg ttgtgctgac 480 • · ··· *. atttaatggt agactgtaaa tgcaatcacc cagaaaggtg cctacgccgt cgtcgatcct 540 ··· *·" cataactacg gcagatagtg aggtccccgg ttctggtatt gctgctgtat atctaagtag 600 t · "*"* atatgtgttt ctaacatttc cacgatttca gctacaattc tataatctcg agcccttccg 660 ·· · • *.! atttccagac cttctggaaa acggtcgcct cacagtttgc ttcgaatcca ctggtcatct 720 t tcgacactag taagctgaac acccgaaatt aactgagtct gagcatgtct gacaagacga 780 sivu 1 119434 sekluetxt.txt tccatgaaag ataacgaata ccacgatatg gaccagacct tagtcctcaa tctcaaccag 840 gccgctatcg acggcatccg ttccgccgga gccacttccc agtacatctt tgtcgagggc 900 aattcgtgga ccggggcatg gacctggacg aacgtgaacg ataacatgaa aagcctgacc 960 gacccatctg acaagatcat atacgagatg caccagtacc tggactctga cggatccggg 1020 acatcagcga cctgcgtatc ttcgaccatc ggtcaagagc gaatcaccag cgcaacgcaa 1080 tggctcaggg ccaacgggaa gaagggcatc atcggcgagt ttgcgggcgg agccaacgac 1140 gtctgcgaga cggccatcac gggcatgctg gactacatgg cccagaacac ggacgtctgg 1200 actggcgcca tctggtgggc ggccgggccg tggtggggag actacatatt ctccatggag 1260 ccggacaatg gcatcgcgta tcagcagata cttcctattt tgactccgta tctttga 1317 <210> 2 <211> 335
<212> PRT
<213> Thermoascus aurantiacus <400> 2
Met Lys Leu Gly ser Leu val Leu Ala Leu ser Ala Ala Arg Leu Thr 15 10 15
Leu ser Ala Pro Leu Ala Asp Arg Lys Gin Glu Thr Lys Arg Ala Lys 20 25 30 val Phe Gin Trp Phe Gly ser Asn Glu ser Gly Ala Glu Phe Gly Ser 35 40 45
Gin Asn Leu Pro Gly Val Glu Gly Lys Asp Tyr lie Trp Pro Asp Pro 50 55 60 *♦· ·*·· Asn Thr lie Asp Thr Leu lie Ser Lys Gly Met Asn lie Phe Arg val : : 65 70 75 80 • · • ·
• » I
*. . ρΓΟ pfog Met Met G-|U Apg Leu Va1 ρΓΟ Asn Ser Met G1y Ser ρΓΟ ::: 85 90 95 ·»· * » · « ASP Pro Asn Tyr Leu Ala Asp Leu lie Ala Thr val Asn Ala lie Thr : : loo 105 no
Gin Lys Gly Ala Tyr Ala val val Asp Pro His Asn Tyr Gly Arg Tyr ::: ii5 120 125 ··· ·»· • · *** Tyr Asn Ser lie lie ser ser Pro ser Asp Phe Gin Thr Phe Trp Lys .:. 130 135 140 ···· «··
Thr val Ala Ser Gin Phe Ala Ser Asn pro Leu val lie Phe Asp Thr • 145 150 155 160 ·· · • · * • ♦ * ·
Asn Asn Glu Tyr His Asp Met Asp Gin Thr Leu val Leu Asn Leu Asn sivu 2 119434 sekluetxt.txt 165 170 175
Gin Ala Ala Ile Asp Gly Ile Arg Ser Ala Gly Ala Thr ser Gin Tyr 180 185 190
Ile Phe vai Glu Gly Asn Ser Trp Thr Gly Ala Trp Thr Trp Thr Asn 195 200 205 vai Asn Asp Asn Met Lys Ser Leu Thr Asp Pro Ser Asp Lys Ile Ile 210 215 220
Tyr Glu Met His Gin Tyr Leu Asp ser Asp Gly Ser Gly Thr Ser Ala 225 230 235 240
Thr Cys Vai ser Ser Thr Ile Gly Gin Glu Arg Ile Thr Ser Ala Thr 245 250 255
Gin Trp Leu Arg Ala Asn Gly Lys Lys Gly Ile Ile Gly Glu Phe Ala 260 265 270
Gly Gly Ala Asn Asp vai Cys Glu Thr Ala Ile Thr Gly Met Leu Asp 275 280 285
Tyr Met Ala Gin Asn Thr Asp vai Trp Thr Gly Ala Ile Trp Trp Ala 290 295 300
Ala Gly Pro Trp Trp Gly Asp Tyr Ile Phe Ser Met Glu Pro Asp Asn 305 310 315 320
Gly Ile Ala Tyr Gin Gin Ile Leu Pro Ile Leu Thr Pro Tyr Leu 325 330 335 • · · <2io> 3
: · : <211> 1621 *. <212> DNA
• ’·· <213> Thermoascus aurantiacus ’ ί I <221> gene ::: <222> cd..ci62d • φ **"* <220> <221> intron . <222> (107)..(161) • · · <22o> ! : <221> Intron T <222> (221)..(280) <220> .*··. <221> Intron *...· <222> (434)..(492) <220> * *. <221> intron ·:·*: <222> (558)..(631)
Sivu 3 <220> <221> Intron <222> (730)..(790) 119434 sekluetxt.txt <220> <221> Intron <222> (1549)..(1612) <400> 3 atgaagctcg gctctctcgt gctcgctctc agcgcagcta ggcttacact gtcggcccct 60 ctcgcagaca ggaagcagga gaccaagcgt gcgaaagtat tccaatgttc gtaacatcca 120 cgtctggctt gctggcttac tggcaactga caatggcgaa gggttcggtt caaacgagtc 180 cggtgctgaa ttcggaagcc agaaccttcc aggagtcgag gtcagcatgc ctgtactctc 240 tgcattatat taatatctca agaggcttac tctttcgcag ggaaaggatt atatatggcc 300 tgatcccaac accattgaca cattgatcag caaggggatg aacatctttc gtgtcccctt 360 tatgatggag agattggttc ccaactcaat gaccggctct ccggatccga actacctggc 420 agatctcata gcggtacatt tcaattccac catgtttgga gctgtcttcg ttgtgctgac 480 atttaatggt agactgtaaa tgcaatcacc cagaaaggtg cctacgccgt cgtcgatcct 540 cataactacg gcagatagtg aggtccccgg ttctggtatt gctgctgtat atctaagtag 600 atatgtgttt ctaacatttc cacgatttca gctacaattc tataatctcg agcccttccg 660 atttccagac cttctggaaa acggtcgcct cacagtttgc ttcgaatcca ctggtcatct 720 tcgacactag taagctgaac acccgaaatt aactgagtct gagcatgtct gacaagacga 780 tccatgaaag ataacgaata ccacgatatg gaccagacct tagtcctcaa tctcaaccag 840 gccgctatcg acggcatccg ttccgccgga gccacttccc agtacatctt tgtcgagggc 900 aattcgtgga ccggggcatg gacctggacg aacgtgaacg ataacatgaa aagcctgacc 960 ...*:* gacccatctg acaagatcat atacgagatg caccagtacc tggactctga cggatccggg 1020 • · · i *.* acatcagcga cctgcgtatc ttcgaccatc ggtcaagagc gaatcaccag cgcaacgcaa 1080 • · tggctcaggg ccaacgggaa gaagggcatc atcggcgagt ttgcgggcgg agccaacgac 1140 * · :.: : gtctgcgaga cggccatcac gggcatgctg gactacatgg cccagaacac ggacgtctgg 1200 actggcgcca tctggtgggc ggccgggccg tggtggggag actacatatt ctccatggag 1260 • · · ccggacaatg gcatcgcgta tcagcagata cttcctattt tgactccgta cgtacctggc 1320 cttgacggca gcaaccccgg caacccgacc accaccgtcg ttcctcccgc ttctacctcc 1380 ♦ acctcccgtc cgaccagcag cactagctct cccgtttcga ccccgactgg ccagcccggc 1440 ··· *...· ggctgcacca cccagaagtg gggccagtgc ggcggtatcg gctacaccgg ctgcactaac 1500 m *;* tgcgttgctg gcaccacctg cactcagctc aacccctggt acagccaggt atgtttctct 1560 *·«· :***: tcccccttct agactcgctt ggatttgaca gttgctaaca tctgctcaac agtgcctgta 1620 ··· ·· · ä 1621 • · · • · • * <210> 4
Sivu 4 119434 sekluetxt.txt <211> 415
<212> PRT
<213> Thermoascus aurantiacus <400> 4
Met Lys Leu Gly Ser Leu val Leu Ala Leu Ser Ala Ala Arg Leu Thr 15 10 15
Leu ser Ala Pro Leu Ala Asp Arg Lys Gin Glu Thr Lys Arg Ala Lys 20 25 30
Val Phe Gin Trp Phe Gly ser Asn Glu ser Gly Ala Glu Phe Gly Ser 35 40 45
Gin Asn Leu Pro Gly vai Glu Gly Lys Asp Tyr He Trp Pro Asp Pro 50 55 60
Asn Thr lie Asp Thr Leu lie ser Lys Gly Met Asn He Phe Arg val 65 70 75 80
Pro Phe Met Met Glu Arg Leu val Pro Asn Ser Met Thr Gly Ser Pro 85 90 95
Asp Pro Asn Tyr Leu Ala Asp Leu He Ala Thr val Asn Ala lie Thr 100 105 110
Gin Lys Gly Ala Tyr Ala val val Asp Pro His Asn Tyr Gly Arg Tyr 115 120 125
Tyr Asn Ser He He Ser Ser Pro Ser Asp Phe Gin Thr Phe Trp Lys 130 135 140 • *·* Thr Val Ala Ser Gin Phe Ala Ser Asn Pro Leu val He Phe Asp Thr :: . 145 150 155 160 • · · ♦ · • · ! *·· Asn Asn Glu Tyr His Asp Met Asp Gin Thr Leu val Leu Asn Leu Asn . . 165 170 175 • · · • · · ··· · : 0 Gin Ala Ala lie Asp Gly He Arg Ser Ala Gly Ala Thr ser Gin Tyr ::: iso ies 190 • · « · • I* lie Phe val Glu Gly Asn Ser Trp Thr Gly Ala Trp Thr Trp Thr Asn 195 200 205 • · * • · * • · * :"*! val Asn Asp Asn Met Lys Ser Leu Thr Asp Pro Ser Asp Lys He He 210 215 220 • · t ··« · .·*·. Tyr Glu Met His Gin Tyr Leu Asp Ser Asp Gly Ser Gly Thr Ser Ala 225 230 235 240 9 • · * t t » : *. Thr cys val ser Ser Thr lie Gly Gin Glu Arg lie Thr Ser Ala Thr ·:··: 245 250 255
Sivu 5 1 1 Q 4 λ 4 sek1uetxt.txt ^ o
Gin Trp Leu Arg Ala Asn Gly Lys Lys Gly Ile Ile Gly Glu phe Ala 260 265 270
Gly Gly Ala Asn Asp Vai Cys Glu Thr Ala Ile Thr Gly Met Leu Asp 275 280 285
Tyr Met Ala Gin Asn Thr Asp vai Trp Thr Gly Ala Ile Trp Trp Ala 290 295 300
Ala Glv Pro Trp Trp Gly Asp Tyr Ile Phe Ser Met Glu Pro Asp Asn 305 310 315 320
Gly lie Ala Tyr Gin Gin Ile Leu Pro Ile Leu Thr pro Tyr vai Pro 325 330 335
Gly Leu Asp Gly Ser Asn Pro Gly Asn Pro Thr Thr Thr vai vai Pro 340 345 350
Pro Ala Ser Thr Ser Thr Ser Arg Pro Thr Ser Ser Thr ser Ser Pro 355 360 365
Vai ser Thr Pro Thr Gly Gin Pro Gly Gly Cys Thr Thr Gin Lys Trp 370 375 380
Gly Gin Cys Gly Gly Ile Gly Tyr Thr Gly Cys Thr Asn Cys vai Ala 385 390 395 400
Gly Thr Thr cys Thr Gin Leu Asn Pro Trp Tyr ser Gin cys Leu 405 410 415 ...Ί* <210> 5
:· . <211> 1211 : .·* <212> DNA
• . <213> Acremonium thermophilum : • · <220> . <221> gene <222> ¢13).. C1206) C: <220> <221> intron <222> (96)..(154) <220> ..I <221> intron <222> (404)..(526) <220> <221> intron <222> (1134)..(1197) • ♦ <400> 5 : * ; ggactgcgca tcatgcgctc ctcacccttt ctccgcgcag ctctggctgc cgctctgcct 60 *:**: ctgagcgccc atgccctcga cggaaagtcg acgaggtatg ccaatcctcg tacctctgcc 120
Sivu 6 119434 sekluetxt.txt ctctgtagaa acaagtgacc gactgcaaag acagatactg ggactgctgc aagccgtcct 180 gcggctgggc cggaaaggcc tcggtgaacc agcccgtctt ctcgtgctcg gccgactggc 240 agcgcatcag cgacttcaac gcgaagtcgg gctgcgacgg aggctccgcc tactcgtgcg 300 ccgaccagac gccctgggcg gtcaacgaca acttctcgta cggcttcgca gccacggcca 360 tcgccggcgg ctccgagtcc agctggtgct gcgcctgcta tgcgtgagtt ctctgcaagc 420 cgcttcccac ccccgctttc tgtgcaggcc gcttcccccc tacccaccca cttccccccc 480 cccgcctctg tgatcgggca tccgagctaa gttgcgtgtc gtccagactc accttcaact 540 cgggccccgt cgcgggcaag accatggtgg tgcagtcgac cagcaccggc ggcgacctgg 600 gcagcaacca gttcgacctc gccatccccg gcggcggcgt gggcatcttc aacggctgcg 660 cctcccagtt cggcggcctc cccggcgccc agtacggcgg catcagcgac cgcagccagt 720 gctcgtcctt ccccgcgccg ctccagccgg gctgccagtg gcgcttcgac tggttccaga 780 acgccgacaa ccccaccttc accttccagc gcgtgcagtg cccgtccgag ctcacgtccc 840 gcacgggctg taagcgcgac gacgacgcca gctatcccgt cttcaacccg cctagcgtcc 900 ctggccttga cggcagcaac cccggcaacc cgaccaccac cgtcgttcct cccgcttcta 960 cctccacctc ccgtccgacc agcagcacta gctctcccgt ttcgaccccg actggccagc 1020 ccggcggctg caccacccag aagtggggcc agtgcggcgg tatcggctac accggctgca 1080 ctaactgcgt tgctggcacc acctgcactc agctcaaccc ctggtacagc caggtatgtt 1140 tctcttcccc cttctagact cgcttggatt tgacagttgc taacatctgc tcaacagtgc 1200 ctgtaactgc a 1211 <210> 6 . <211> 315
•J· <212> PRT
"** <213> Acremonium thermophilum • · · *.* <400> 6 • I * .* / Met Arg ser ser Pro Phe Leu Arg Ala Ala Leu Ala Ala Ala Leu Pro :::1 5 10 15 ··· « • · · "· Leu Ser Ala His Ala Leu Asp Gly Lys Ser Thr Arg Tyr Trp Asp Cys :: 20 25 30 ··· . Cys Lys Pro Ser Cys Gly Trp Ala Gly Lys Ala Ser Val Asn Gin Pro : : : 35 40 45 ··« ♦ ·· • · ”·* Val Phe Ser cys Ser Ala Asp Trp Gin Arg ile Ser Asp Phe Asn Ala .:. 50 55 60 »4**
• M
Lys ser Gly Cys Asp Gly Gly Ser Ala Tyr ser Cys Ala Asp Gin Thr 65 70 75 80 • * · I t • · ....: pro Trp Ala val Asn Asp Asn Phe ser Tyr Gly Phe Ala Ala Thr Ala sivu 7 119434 sekluetxt.txt ° ^ 85 90 95
Ile Ala Gly Gly Ser Glu Ser ser Trp cys cys Ala Cys Tyr Ala Leu
100 105 HO
Thr Phe Asn ser Gly Pro vai Ala Gly Lys Thr Met vai Vai Gin ser 115 120 125
Thr ser Thr Gly Gly Asp Leu Gly ser Asn Gin phe Asp Leu Ala Ile 130 135 140
Pro Gly Gly Gly vai Gly Ile Phe Asn Gly cys Ala Ser Gin Phe Gly 145 150 155 160
Gly Leu Pro Gly Ala Gin Tyr Gly Gly Ile Ser Asp Arg Ser Gin Cys 165 170 175
Ser ser Phe Pro Ala Pro Leu Gin Pro Gly Cys Gin Trp Arg Phe Asp 180 185 190
Trp Phe Gin Asn Ala Asp Asn Pro Thr Phe Thr Phe Gin Arg Vai Gin 195 200 205
Cys Pro Ser Glu Leu Thr ser Arg Thr Gly Cys Lys Arg Asp Asp Asp 210 215 220
Ala ser Tyr pro vai Phe Asn pro Pro ser vai Pro Gly Leu Asp Gly 225 230 235 240
Ser Asn Pro Gly Asn Pro Thr Thr Thr vai Vai Pro Pro Ala Ser Thr 245 250 255 • * * "‘l Ser Thr Ser Arg Pro Thr Ser Ser Thr Ser Ser Pro vai Ser Thr pro :*··; 260 265 270 « · • · • · ♦ *· Thr Gly Gin Pro Gly Gly Cys Thr Thr Gin Lys Trp Gly Gin Cys Gly : 275 280 285 1·« · 0 • · ·
Gly Ile Gly Tyr Thr Gly Cys Thr Asn cys vai Ala Gly Thr Thr cys ·*’*: 290 295 300 ···
Thr Gin Leu Asn Pro Trp Tyr ser Gin Cys Leu : 305 310 315 »•f *»· • · '··* <210> 7 • <211> 1663
<212> DNA
<213> Chaetonrium thermophilum • · • · · <220> I <221> gene <222> Cl).. (1663)
Sivu 8 <220> <221> Intron <222> (1591)..(1654) sekluetxt.txt 119434 <400> 7 atgatgtata agaagttcgc cgctctcgcc gccctcgtgg ctggcgcctc cgcccagcag 60 gcttgctccc tcaccgctga gaaccaccct agcctcacct ggaagcgctg cacctctggc 120 ggcagctgct cgaccgtgaa cggcgccgtc accatcgatg ccaactggcg ctggactcac 180 accgtctccg gctcgaccaa ctgctacacc ggcaaccagt gggatacctc cctctgcact 240 gatggcaaga gctgcgccca gacctgctgc gtcgatggcg ctgactactc ttcgacctat 300 ggtatcacca ccagcggtga ctccctgaac ctcaagttcg tcaccaagca ccagtacggc 360 accaacgtcg gctcccgtgt ctatctgatg gagaacgaca ccaagtacca gatgttcgag 420 ctcctcggca acgagttcac cttcgatgtc gatgtctcca acctgggctg cggtctcaac 480 ggcgccctct acttcgtttc catggatgct gatggtggca tgagcaaata ctctggcaac 540 aaggctggcg ccaagtacgg taccggctac tgcgatgctc agtgcccgcg cgacctcaag 600 ttcatcaacg gcgaggccaa cgttgggaac tggaccccct cgaccaacga tgccaacgcc 660 ggcttcggcc gctatggcag ctgctgctct gagatggatg tctgggaggc caacaacatg 720 gctactgcct tcactcctca cccttgcacc accgttggcc agagccgctg cgaggccgac 780 acctgcggtg gcacctacag ctctgaccgc tatgctggtg tttgcgaccc tgatggctgc 840 gacttcaacg cctaccgcca aggcgacaag accttctacg gcaagggcat gactgtcgac 900 accaacaaga agatgaccgt cgtcacccag ttccacaaga actcggctgg cgtcctcagc 960 gagatcaagc gcttctacgt ccaggacggc aagatcattg ccaacgctga gtccaagatc 1020 cccggcaacc ccggaaactc cattacccag gagtattgcg atgcccagaa ggtcgccttc 1080 .:. agtaacaccg atgacttcaa ccgcaagggc ggtatggctc agatgagcaa ggccctcgca 1140 »··» .*·.*. ggccccatgg tcctggtcat gtccgtctgg gatgaccact acgccaacat gctctggctc 1200 • ·* .·. : gactcgacct accccatcga ccaggccggc gcccccggcg ccgagcgcgg tgcttgcccg 1260 • *· : .·, accacctccg gtgtccctgc cgagatcgag gcccaggtcc ccaacagcaa cgtcatcttc 1320 *·· · . .·. tccaacatcc gtttcggccc catcggctcg accgtccctg gccttgacgg cagcaacccc 1380 «·· .*·*. ggcaacccga ccaccaccgt cgttcctccc gcttctacct ccacctcccg tccgaccagc 1440 * * • * · agcactagct ctcccgtttc gaccccgact ggccagcccg gcggctgcac cacccagaag 1500 . .·. tggggccagt gcggcggtat cggctacacc ggctgcacta actgcgttgc tggcaccacc 1560 ···* .*··. tgcactcagc tcaacccctg gtacagccag gtatgtttct cttccccctt ctagactcgc 1620 ·»· ttggatttga cagttgctaa catctgctca acagtgcctg taa 1663 • ·φ ··*· <2io> 8 *:* <211> 1076
•V. <212> DNA
: ,· <213> Acremonium thermophilum
Sivu 9 <220> <221> gene <222> Cl)(1076) 119434
sekluetxt.txt 1 1 7 H J H
<220> <221> Intron <222> (84)..(142) <220> <221> Intron <222> (392)..(514) <400> 8 atgcgctcct caccctttct ccgcgcagct ctggctgccg ctctgcctct gagcgcccat 60 gccctcgacg gaaagtcgac gaggtatgcc aatcctcgta cctctgccct ctgtagaaac 120 aagtgaccga ctgcaaagac agatactggg actgctgcaa gccgtcctgc ggctggccgg 180 gaaaggcctc ggtgaaccag cccgtcttct cgtgctcggc cgactggcag cgcatcagcg 240 acttcaacgc gaagtcgggc tgcgacggag gctccgccta ctcgtgcgcc gaccagacgc 300 cctgggcggt caacgacaac ttctcgtacg gcttcgcagc cacggccatc gccggcggct 360 ccgagtccag ctggtgctgc gcctgctatg cgtgagttct ctgcaagccg cttcccaccc 420 ccgctttctg tgcaggccgc ttccccccta cccacccact tccccccccc cgcctctgtg 480 atcgggcatc cgagctaagt tgcgtgtcgt ccagactcac cttcaactcg ggccccgtcg 540 cgggcaagac catggtggtg cagtcgacca gcaccggcgg cgacctgggc agcaaccagt 600 tcgacctcgc catccccggc ggcggcgtgg gcatcttcaa cggctgcgcc tcccagttcg 660 gcggcctccc cggcgcccag tacggcggca tcagcgaccg cagccagtgc tcgtccttcc 720 ccgcgccgct ccagccgggc tgccagtggc gcttcgactg gttccagaac gccgacaacc 780 ccaccttcac cttccagcgc gtgcagtgcc cgtccgagct cacgtcccgc acgggctgta 840 ··* agcgcgacga cgacgccagc tatcccgtct tcaacccgcc tagcggtggc tcccccagca 900 • * · : ·* ccaccagcac caccaccagc tccccgtccg gtcccacggg caaccctcct ggaggcggtg 960 • * · ]· gctgcactgc ccagaagtgg gcccagtgcg gcggcactgg cttcacgggc tgcaccacct 1020
t » I
··· * gcgtctcggg caccacctgc caggtgcaga accagtggta ttcccagtgt ctgtga 1076 • · « • * ♦ ·· .**·. <210> 9 *·** <211> 45
<212> DNA
<213> Thermoascus aurantiacus <400> 9 ·*’*. attaaccgcg gactgcgcat catgaagctc ggctctctcg tgctc 45 «· *:* <2io> ίο *::: <2n> 29
<212> DNA
"* <213> Thermoascus aurantiacus ·· · : V <400> 10 ....: aactgaggca tagaaactga cgtcatatt 29 • ·
Sivu 10 sekluetxt.txt ^79434
<210> 11 <211> 28 <212> DNA
<213> Chaetomium thermophilum <400> 11 taatttacgt acctggcctt gacggcag 28 <210> 12 <211> 30
<212> DNA
<213> Chaetomium thermophilum <400> 12 attaactgca gttacaggca ctgttgagca 30 <210> 13 <211> 42
<212> DNA
<213> Acremonium thermophilum <400> 13 attaaccgcg gactgcgcat catgcgctcc tcaccctttc tc 42 <210> 14 <211> 33
<212> DNA
<213> Acremonium thermophilum <400> 14 ttaatctgca gtcacagaca ctgggaatac cac 33 <210> 15
<211> 81 <212> PRT
<213> Chaetomium thermophilum ...t <400> 15 • · · • * ·* val Pro Gly Leu Asp Gly ser Asn pro Gly Asn pro Thr Thr Thr val . 1 5 10 15 • · · • ·· • · • · • .· I val Pro Pro Ala Ser Thr Ser Thr ser Arg pro Thr ser Ser Thr Ser 20 25 30 • * « * · · ··· • • ! Ser Pro Val Ser Thr Pro Thr Gly Gin Pro Gly Gly Cys Thr Thr Gin 35 40 45 I : : Lys Trp Gly Gin cys Gly Gly He Gly Tyr Thr Gly cys Thr Asn cys ... 50 55 60 • · • · «•9 .:. val Ala Gly Thr Thr cys Thr Gin Leu Asn Pro Trp Tyr Ser Gin cys —: 65 70 75 80 ··· • · • 9 • · · • Leu 99 9 • · 9 • 9 • · « • »* « • ·
Sivu 11

Claims (23)

119434 36
1. Sellulaasifuusioproteiini, tunnettu siitä, että se käsittää ensimmäisen endoglukanaasiytimen aminohapposekvenssin, jolla on vähintään 5 75 % identtisyys sekvenssin nro: 2 tai sen fragmentin kanssa, jolla on sellu- laasiaktiivisuutta, ja toisen aminohapposekvenssin, joka käsittää linkkerin ja selluloosaa sitovan domeenin (CBD), jolla on vähintään 75 % identtisyys sekvenssin nro: 15 tai sen fragmentin kanssa, jolla on selluloosaa sitovaa aktiivisuutta,
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen fuusioproteiini, tunnettu sii tä, että endoglukanaasiydin on peräisin Thermoascus aurantiacuksesta, erityisesti T, aurantiacus CBS 116239:stä.
3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen fuusioproteiini, tunnettu siitä, että se käsittää sekvenssin nro: 2 aminohapot 19-334.
4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen fuusioproteiini, tunnettu sii tä, että linkkeri ja CBD ovat peräisin Chaetomium thermophilumin, erityisesti C. thermophilum CBS 730.95:n, sellobiohydrolaasista.
5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen fuusioproteiini, tunnettu siitä, että endoglukanaasiydin käsittää sekvenssin nro: 2 mukaisen sekvenssin ja 20 linkkeri ja CBD käsittävät sekvenssin nro: 15 mukaisen sekvenssin.
6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen fuusioproteiini, tunnettu sii- ·· · : V tä, että se käsittää sekvenssin nro: 4 mukaisen sekvenssin tai sen fragmentin, :/·! jolla on sellulaasiaktiivisuutta ja selluloosaa sitovaa aktiivisuutta.
:7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen fuusioproteiini, tunnettu sii-• ·· · :25 tä, että endoglukanaasiydintä koodittaa geeni, joka vastaa E. coli DSM ··· . ··. 17326:een sisällytettyä geeniä.
8. Patenttivaatimuksen 1 mukainen fuusioproteiini, tunnettu sii-. . tä, että sitä koodittaa fuusiogeeni, joka vastaa E. coli DSM 18159:een sisäily- m:.:\ tettyä geeniä. '*:** 30
9. Eristetty polynukleotidi, tunnettu siitä, että se valitaan ryh- j**.. mästä, joka koostuu: (a) sekvenssin nro: 3 mukaisesta nukleotidisekvenssistä tai patentti- • · · vaatimuksen 1 mukaista fuusioproteiinia koodittavasta sekvenssistä (b) kohdan (a) komplementaarisesta juosteesta; « · * : *' 35 (c) sekvenssistä, joka on degeneroitunut geneettisen koodin suh teen missä tahansa kohdassa (a) tai (b) määritellystä sekvenssistä. 119434 37
10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen polynukieotidi, tunnettu siitä, että se käsittää fuusiogeenin, joka vastaa E. coli DSM 18159:een sisällytettyä geeniä.
11. Ekspressiovektori, tunnettu siitä, että se käsittää patentti-5 vaatimuksen 9 mukaisen nukleotidisekvenssin.
12. Isäntäsolu, tunnettu siitä, että se käsittää patenttivaatimuksen 11 mukaisen ekspressiovektorin.
13. Patenttivaatimuksen 12 mukainen isäntäsolu, tunnettu siitä, että se on sieni, erityisesti suvusta Trichoderma.
14. Menetelmä minkä tahansa patenttivaatimuksista 1-8 mukaisen fuusioproteiinin tuottamiseksi, tunnettu siitä, että menetelmä käsittää vaiheet, joissa transformoidaan isäntäsolu fuusioproteiinia koodatavalla ekspres-siovektorilla ja viljellään isäntäsolua fuusioproteiinin ilmentämisen mahdollistavissa olosuhteissa ja valinnaisesti otetaan talteen ja puhdistetaan tuotettu fuu- 15 sioproteiini.
15. Entsyymivalmiste, tunnettu siitä, että se käsittää minkä tahansa patenttivaatimuksista 1-8 mukaisen fuusioproteiinin.
16. Prosessi seliuloosamateriaalin käsittelemiseksi, tunnettu siitä, että prosessi käsittää vaiheet, joissa selluloosamateriaali saatetaan koske- 20 tuksiin minkä tahansa patenttivaatimuksista 1-8 mukaisen fuusioproteiinin tai , patenttivaatimuksen 15 mukaisen entsyymivalmisteen kanssa. • · · ;;*j
17. Patenttivaatimuksen 16 mukainen prosessi, tunnettu siitä, : V että selluloosamateriaali on tekstiilimateriaalia, eläinten rehuun käytettäviä • · \*·: kasveja tai puusta peräisin olevaa massaa tai kierrätyskuitua. :.· · 25
18. Patenttivaatimuksen 16 mukainen prosessi, tunnettu siitä, : että uutetaan kasvimateriaalista öljyä.
·*"; 19. Biokivipesuprosessi, tunnettu siitä, että prosessi käsittää • * · vaiheet, joissa denimkangas tai -vaatteet saatetaan kosketuksiin minkä tahan-sa patenttivaatimuksista 1-8 mukaisen fuusioproteiinin tai patenttivaatimuksen • I I 30 15 mukaisen entsyymivalmisteen kanssa.
*" 20. Bioviimeistelyprosessi, t u n n e 11 u siitä, että prosessi käsittää • · • *·· vaiheet, joissa tekstiilimateriaali kuten kankaat, vaatteet tai langat saatetaan kosketuksiin minkä tahansa patenttivaatimuksista 1-8 mukaisen fuusioproteii- ,···, nin tai patenttivaatimuksen 15 mukaisen entsyymivalmisteen kanssa. • · * » · • · * • · * * m • · 119434 38
21. Pesuaine, tunnettu siitä, että se käsittää minkä tahansa patenttivaatimuksista 1-8 mukaisen fuusioproteiinin tai patenttivaatimuksen 15 mukaisen entsyymivalmisteen ja pesuaineen apuaineita.
22. Eläinten rehu, tunnettu siitä, että se käsittää minkä tahansa 5 patenttivaatimuksista 1-8 mukaisen fuusioproteiinin.
23. Escherichia coli kanta, tunnettu siitä, että sillä on talletus-numero DSM 18159. · · # »· · ·· · • · · * · • · • « • I f • · * • * • · * · · * * · ··· · • · · • · · *·· *·· • · • * * · · • · • · · • · · • · *«« • · • · ·*· • · • · • ·« • · · • · · · ··· • · • * ·«· »I · • * f · • · 119434 39
FI20065234A 2006-04-13 2006-04-13 Entsyymifuusioproteiineja ja niiden käyttö FI119434B (fi)

Priority Applications (14)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FI20065234A FI119434B (fi) 2006-04-13 2006-04-13 Entsyymifuusioproteiineja ja niiden käyttö
DK07730683.5T DK2007884T3 (da) 2006-04-13 2007-04-12 Cellulasefusionsproteiner og deres anvendelse
PCT/FI2007/050196 WO2007118935A1 (en) 2006-04-13 2007-04-12 Enzyme fusion proteins and their use
PL07730683T PL2007884T3 (pl) 2006-04-13 2007-04-12 Białka fuzyjne celulazy i ich zastosowanie
ES07730683T ES2384276T3 (es) 2006-04-13 2007-04-12 Proteínas de fusión de celulasas y uso de las mismas
MYPI20084042A MY149883A (en) 2006-04-13 2007-04-12 Enzyme fusion proteins and their use
CN2007800203080A CN101460617B (zh) 2006-04-13 2007-04-12 酶融合蛋白及其应用
MX2008013143A MX2008013143A (es) 2006-04-13 2007-04-12 Proteinas de fusion enzimatica y su uso.
KR1020087027407A KR101439352B1 (ko) 2006-04-13 2007-04-12 효소 융합 단백질 및 이의 용도
EP07730683A EP2007884B1 (en) 2006-04-13 2007-04-12 Cellulase fusion proteins and their use
BRPI0710187A BRPI0710187B1 (pt) 2006-04-13 2007-04-12 proteína de fusão de celulase, seu método de produção, polinucleotídeo isolado, vetor de expressão, microrganismo transgênico, preparação enzimática, processos para tratar material celulósico, de esmerilhamento e de bioacabamento, composição de detergente, ração animal, e cepa de escherichia coli
CA2648926A CA2648926C (en) 2006-04-13 2007-04-12 Cellulase fusion proteins and their use
RU2008140061/10A RU2458127C2 (ru) 2006-04-13 2007-04-12 Целлюлозные белки слияния и их применение
ZA200808656A ZA200808656B (en) 2006-04-13 2008-10-09 Enzyme fusion proteins and their use

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FI20065234 2006-04-13
FI20065234A FI119434B (fi) 2006-04-13 2006-04-13 Entsyymifuusioproteiineja ja niiden käyttö

Publications (3)

Publication Number Publication Date
FI20065234A0 FI20065234A0 (fi) 2006-04-13
FI20065234A FI20065234A (fi) 2007-10-14
FI119434B true FI119434B (fi) 2008-11-14

Family

ID=36293827

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI20065234A FI119434B (fi) 2006-04-13 2006-04-13 Entsyymifuusioproteiineja ja niiden käyttö

Country Status (3)

Country Link
CN (1) CN101460617B (fi)
FI (1) FI119434B (fi)
ZA (1) ZA200808656B (fi)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SE538958C2 (en) * 2014-11-07 2017-03-07 Stora Enso Oyj Improved method for determination of microorganisms
CN110734901B (zh) * 2019-10-29 2021-07-09 深圳大学 一种酶融合蛋白及其应用

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1182451A (zh) * 1995-03-17 1998-05-20 诺沃挪第克公司 新的内切葡聚糖酶
WO1999057256A1 (en) * 1998-05-01 1999-11-11 The Procter & Gamble Company Laundry detergent and/or fabric care compositions comprising a modified cellulase
DK2295544T3 (en) * 2001-06-26 2016-09-26 Novozymes As Polypeptides with cellobiohydrolase I activity and the same coding polynucleotides

Also Published As

Publication number Publication date
CN101460617B (zh) 2013-04-10
FI20065234A0 (fi) 2006-04-13
FI20065234A (fi) 2007-10-14
ZA200808656B (en) 2009-07-29
CN101460617A (zh) 2009-06-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101439352B1 (ko) 효소 융합 단백질 및 이의 용도
US6562612B2 (en) Cellulase producing actinomycetes, cellulase produced therefrom and method of producing same
EP1088080B1 (en) Recombinant production of cellulase from actinomycetes
FI122028B (fi) Sieniperäiset endoglukanaasit, niiden tuotto ja käyttö
ES2637008T3 (es) Enzimas nuevas
US6566112B2 (en) Cellulase producing actinomycetes, cellulase produced therefrom and method of producing same
US20060154843A1 (en) Neutral cellulase catalytic core and method of producing same
US20070148732A1 (en) Novel enzymes
WO1999025847A2 (en) Cellulase produced by actinomycetes and method of producing same
WO1999025846A2 (en) Cellulase produced by actinomycetes and method for producing same
US7361487B2 (en) Enzyme fusion proteins and their use
BRPI0806921A2 (pt) Endoglicanase ii modificada e métodos de uso
FI119325B (fi) Uusia endoglukanaasi polypeptidejä ja niiden tuotto ja käyttö
FI119434B (fi) Entsyymifuusioproteiineja ja niiden käyttö
US6187577B1 (en) Cellulase producing Actinomycetes cellulase produced therefrom and method of producing same
AU4437002A (en) Cellulase producing actinomycetes, cellulase produced therefrom and method of producing same

Legal Events

Date Code Title Description
FG Patent granted

Ref document number: 119434

Country of ref document: FI