BRPI0710187B1 - proteína de fusão de celulase, seu método de produção, polinucleotídeo isolado, vetor de expressão, microrganismo transgênico, preparação enzimática, processos para tratar material celulósico, de esmerilhamento e de bioacabamento, composição de detergente, ração animal, e cepa de escherichia coli - Google Patents

Abstract

<b>proteínas de fusão enzimática e seu us0.<d> são descritas proteínas de fusão de celulase compreendendo uma região de núcleo de endoglucanase e um domínio de ligação de celulose heterólogo. as proteínas de fusão podem ser produzidas por técnicas recombinantes usando polinucleotídeos apropriados, expressando vetores de células hospedeiras. as proteínas de fusão e preparações enzimáticas das mesmas são úteis para tratar material celulósico, tal como material têxtil, e são particularmente úteis em bioesmerilhamento de denim ou em bioacabamento de tecidos e vestuário. além disso, as proteínas de fusão podem ser usadas na indústria de papel e polpa, em extração de óleo de plantas, composições de detergente, ou para melhorar a qualidade de ração animal.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PROTEÍNA DE FUSÃO DE CELULASE, SEU MÉTODO DE PRODUÇÃO, POLINU-CLEOTÍDEO ISOLADO, VETOR DE EXPRESSÃO, MICRORGANISMO TRANSGÈNJCO, PREPARAÇÃO ENZIMÀT1CA, PROCESSOS PARA TRATAR MATERIAL CELULÓSICO, DE ESMERILHAMENTO E DE BJOA-CABAMENTO, COMPOSIÇÃO DE DETERGENTE, RAÇÃO ANIMAL, E CEPA DE Escheríchia coli".

Campo da Invenção A presente invenção refere-se a tecnologia enzimãtica, e mais precisamente a proteínas de fusão de celulase compreendendo um domínio catalítico e um domínio de ligação de celulose. As proteínas de fusão podem ser produzidas por técnicas recombinantes usando polinucleotídeos apropriados, expressando vetores e células hospedeiras, as quais também são englobadas peta invenção. As proteínas de fusão e preparações enzimáticas das mesmas são úteis para tratar material celulósico. tal como material têxtil ASém das proteínas de fusão podem ser usadas na indústria de polpa e papel, extração de óleo de plantas, composições de detergente, ou para melhorar a qualidade de ração animal. A invenção portanto refere-se adicionai-mente a um processo para tratar material oelulósico com a proteína de fusão, e espe cia [mente a processos para bioesmeri lha mento ou bioacabamen-to de tecidos ou roupas, especialmente denim. A invenção ainda refere-se adicionaimente a composições de detergente e ração anima! contendo as proteínas de fusão.

Antecedentes da invenção Celulose é o principal componente estrutural de plantas superiores e ocorre natural mente em forma quase pura somente em fibra de algodão. Proporciona células vegetais com elevada resistência à tração ajudando as mesmas a resistir à tensão mecânica e à pressão osmótica. Celulose é um polissacarídeo linear de resíduos glicose conectados por 11-1,4-íigações Na natureza celulose é geralmente associada com lignina e hemi-celuloses. Material celulósico é degradado na natureza por uma série de vários organismos incluindo bactérias e fungos, A conversão biológica de celu- íose para glicose geralmente requer três grupos importantes de enzimas: celobiohidroíases (CSH), endoglucanases (EG) e betaglucosidases (BG). Há um amplo espectro de aplicações industriais de celulases. Na indústria têxtil, celulases são usadas em acabamento de denim para criar um lavado a pedra da moda em tecidos de denim em um processo de bio- esmerilhamento. Celulases também são usadas, por exemplo, para limpar felpa e prevenir a formação de bolinhas sobre a superfície de roupas de algodão. Na indústria de detergentes as celulases são usadas para dar brilho às cores e para prevenir o acinzentamento e a formação de bolinhas das roupas. Adicionalmente as celulases são usadas na indústria de alimentos e na fabricação de ração animal, e têm um grande potencial na indústria de polpa e papel, por exemplo, em destintagem para liberar tinta de superfícies de fibras e na melhora da drenagem da polpa.

Celulases industrialmente usadas são frequentemente misturas de enzimas tendo uma variedade de atividades e especificidades de substratos. As preparações enzimáticas comerciais frequentemente compreendem todas as três atividades de celulase, isto é, CBH, EG e BG. Além disso as propriedades únicas de cada celulase tornam algumas mais adequadas para alguns propósitos do que outras, e portanto também têm sido esforços para obter e usar celulases tendo somente as atividades desejadas. As celulases de origem fúngica mais amplamente usadas são derivadas de Trichoderma reesei. No entanto, também outras fontes fúngicas foram sugeridas, por e-xemplo, na Patente U.S. Ns U.S. 5.457.046.

Celulases aplicadas em tratamento de denim são geralmente divididas em dois grupos principais: celulases ácidas e neutras. Celulases ácidas tipicamente operam em pH 4.0 a 5.5 e celulases neutras na faixa de pH 6 a 8. Celulases tendo características tanto do grupo ácido quanto neutro podem ser denominadas celulases híbridas. Celulases ácidas usadas em bioesmerilhamento se originam essencialmente de Trichoderma reesei (forma sexual Hypocrea jecorina) e as celulases neutras se originam de uma variedade de fungos, incluindo gêneros de Meianocarpus, Humicola, Myceli-ophthora, Fusarium, Acremonium, e Chrysosporium (Haakana et ai. 2004). Enzimas de T. reesei incluem, por exemplo, celulases da família 5 de glicosil hidrolase (endoglucanase II, EGII), família 7 (celobiohidrolase I, CBHI) e família 12 (endoglucanase III, EGIII; Ward et ai. 1993), e as celulases neutras, o mais freqüentemente endoglucanases, da família 45 e família 7 (Henrissat, 1991; Henrissat e Bairoch, 1993,1996). A Patente dos U.S. NQ 5.874.293 revela uma composição de ce-lulase aprimorada compreendendo quantidades elevadas de endoglucanase EGII de T. reesei para tratar têxteis contendo celulose. A composição aprimorou propriedades de cor, aumentou a luminosidade e o aspecto visual e reduziu tendências a formação de bolinhas. A patente internacional Ne WO 97/14804 revela uma celulase de 20 kDa e uma de 50 kDa com atividade de endoglucanase derivada de Melanocarpus sp. que são especialmente úteis na indústria têxtil e de detergentes. Proteínas de fusão contendo as proteínas de 20K ou de 50K encadeadas a um domínio de ligação de celulose preferencialmente de Trichoderma reesei são sugeridas para criar novas propriedades enzimáticas. Não são dados exemplos específicos, nem são as pro-periedades desejadas descritas.

No entanto, ainda há a necessidade de celulases aprimoradas, inclusive endoglucanases que sejam mais eficientes no tratamento de tecidos e em outros campos, onde tradicionalmente são usadas celulases. Em particular, há uma necessidade contínua de celulases mais eficientes para aumentar a economia do processo. A presente invenção visa satisfazer estas necessidades.

Na indústria têxtil um aspecto lavado à pedra ou um aspecto desgastado tem sido de interesse dos produtores de denim nos últimos a-nos. A lavagem à pedra tradicional com pedras-pomes reduz a resistência do tecido e sobrecarrega os aparelhos de lavar roupas. Há uma tendência para processos de acabamento de denim enzimáticos, e celulases têm substituídos ou estão sendo usadas junto com pedras-pomes para dar ao tecido seu aspecto "usado" desejado. Tratamentos enzimáticos controlados resultam em menor dano para as roupas e máquinas e eliminam a necessidade de remoção das pedras.

Um problema geral associado com lavagem à pedra enzimático é retropigmentação causado por redeposição de pigmento índigo removido durante ou depois de abrasão. A redeposição de pigmento índigo reduz o contraste desejado entre os fios brancos e tingidos de índigo e pode ser mais facilmente observada sobre o lado reverso do denim e os bolsos interi- ores (como aumento do azulamento). Sobre o lado da face isto pode ser visto como contraste reduzido entre áreas tingidas e áreas das quais o pigmento foi removido durante o bioesmerilhamento. A retropigmentação pode ser reduzida usando agentes anti-retropigmentação tais como álcoois etoxilados não-iônicos durante o tratamentou ou adicionando agentes alvejantes durante etapas de enxágüe. A natureza da enzima tem um impacto sobre a retropigmentação. Geralmente, celulases neutras retropigmentam menos do que celulases ácidas. A publicação de patente internacional Ns W097/09410 descreve que a adição de um certo tipo de celulase a outra celulase tendo atividade abrasiva reduz a retropigmentação. A celulase adicional pertence à família 5 ou 7, mas não tem efeito abrasivo significativo por si só. Preferencialmente, a referida celulase adicional se origina de Bacillus ou Clostridium. A Patente U.S. Nõ 5.916.799 revela composições de celulase contendo tanto celobiohidrolases quanto endoglucanases que foram submetidas à proteólise limitada para separar o núcleo e domínios de ligação das enzimas. Foi visto que as composições enzimáticas obtidas reduzem a retropigmentação. A publicação de patente internacional N- WO94/07983 refere-se ao achado de que redeposição de colorante sobre tecido durante o processo de lavagem à pedra pode ser reduzido empregando uma composição de celulase fúngica, a qual é substancialmente livre de componentes do tipo de celobiohi-drolase. A publicação de patente internacional Ns W096/23928 revela tratamento de tecidos contendo celulose com enzimas celulases truncadas. Foi visto que as enzimas truncadas carecendo de domínio de ligação de celulose (CBD) reduzem redeposição de corante e aumentam abrasão. A conclusão geral das três referências citadas acima pode ser que o domínio de ligação de celulose tem um efeito negativo sobre a retropigmentação. No entanto, a presente invenção agora proporciona uma construção de celulase com baixa propriedade de retropigmentação, apesar da presença de um domínio de ligação de celulose.

Sumário da Invenção A presente invenção baseia-se na descoberta surprendente de que o efeito da endoglucanases pode ser significativamente reforçado ligando a essa um domínio de ligação de celulose em particular sem prejudicar as proprtiedades de retropigmentação.

Um objetivo da presente invenção é proporcionar novas proteínas de fusão de endoglucanase tendo aprimoradas propriedades hidrolíticas para uso em indústria têxtil, especialmente em lavagem à pedra de denim. As proteínas de fusão da invenção têm a vantagem de serem ativas tanto em valores de pH ácidos quanto neutros, e têm performance altamente a-primorada em aplicações de bioesmerilhamento. Quando usadas no tratamento de denim, as proteínas de fusão proporcionam um baixo efeito de retropigmentação. Com a aprimorada eficiência das endoglucanases da invenção, o uso das enzimas é significativamente mais econômico. Vantagens adicionais são obtidas também em termos de logística e do armazenamento dos produtos enzimáticos, porque são necessárias quantidades menores do produto enzimático. As proteínas de fusão também são úteis em composições de detergente, bem como em outros campos tais como indústria de ração, extração de óleo de plantas, ou indústria de polpa e papel.

Um objetivo adicional da presente invenção é proporcionar poli-nucleotídeos codificando as novas proteínas de fusão de endoglucanase.

Um objetivo ainda adicional da presente invenção é proporcionar um método para produzir as proteínas de fusão.

Um objetivo ainda adicional da presente invenção é proporcionar novos vetores de expressão contendo os referidos polinucleotídeos, úteis para a produção das proteínas de fusão endoglucanase, bem como novos hospedeiros transformados com os referidos vetores de expressão.

Um objetivo ainda adicional da presente invenção é proporcionar preparações enzimáticas, as quais contêm uma ou mais novas proteínas de fusão de endoglucanase.

Um objetivo ainda adicional da presente invenção é proporcionar métodos para tratar material celulósico com a proteína de fusão, por exemplo, para uso na indústria têxtil, de detergente, de ração animal, de extração de óleo de plantas, ou de polpa e papel, e particularmente para acabamento de têxteis, especialmente para bioesmerilhamento e bioacabamento de de-nim.

Um objetivo ainda adicional da presente invenção é proporcionar ração animal ou composições detergentes contendo as proteínas de fusão. A presente invenção refere-se a uma proteína de fusão de celu-lase compreendendo uma primeira seqüência de aminoácidos de um núcleo de endoglucanase, e uma segunda seqüência de aminoácidos compreendendo um encadeador e domínio de ligação de celulose (CBD) tendo no mínimo 75% de identidade com a SEQ ID NO: 15, ou uma variante ou fragmento da mesma tendo atividade de ligação de celulose. A invenção refere-se adicionalmente a um polinucleotídeo isolado selecionado entre o grupo consistindo de: a) uma seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 3 ou 5, ou uma seqüência codificando uma proteína de fusão de celulase da reivindicação 1, b) um filamento complementar de a), c) uma seqüência que é degenerada em conseqüência do código genético a qualquer uma das seqüências de a) ou b). A invenção refere-se ainda adicionalmente a um vetor de expressão compreendendo a referida seqüência de nucleotídeos, e a uma célula hospedeira compreendendo o vetor de expressão, bem como a uma preparação enzimática compreendendo a proteína de fusão. A invenção também engloba um método para produzir a proteína de fusão, compreendendo as etapas de transformar uma célula hospedeira com um vetor de expressão codificando a referida proteína de fusão e cultivar a referida célula hospedeira sob condições possibilitando expressão da referida proteína de fusão, e opcionalmente recuperar e purifcar a proteína de fusão produzida. A invenção ainda engloba adicionalmente um processo para tratar material celulósico, em que o referido processo compreende contactar o material celulósico com a proteína de fusão. A invenção também refere-se a um processo para bioesmeri- Ihamento, cujo processo compreende a etapa de contactar a proteína de fusão de celulase ou a preparação enzimática com tecido ou roupas de de-nim, e a um processo para bioacabamento, o qual compreende a etapa de contactar a proteína de fusão de celulase ou a preparação enzimática com materiais têxteis como tecidos ou roupas ou fio.

Eventualmente, a invenção refere-se a uma composição de detergente compreendendo a proteína de fusão e auxiliares detergentes, a ração animal compreendendo a proteína de fusão, e a uma cepa de Eschrichia coli tendo número de acesso de E. coli DSM 18159.

Modalidades específicas da invenção são determinadas nas reivindicações dependentes.

Outros objetivos, detalhes e vantagens da presente invenção se tornarão evidentes a partir dos seguintes desenhos, descrição detalhada e exemplos.

Breve Descrição dos Desenhos A Figura 1 ilustra uma esboço esquemático do cassete de expressão usado na transformação de protoplastos de T. reesei para produção de celulase de T. aurantiacus EG28 ou EG28+CtCBD. O gene ce/5A ou ce/5A_Ct ce/7AlinkerCBD está sob controle do promotor de T. reesei cbhl (cbhl prom) e terminação de transcrição é assegurada com a adição do ter-minador cbhl (cbhl term). O gene amdS (amdS) é incluído para seleção de transformantes. O cassete de expressão para produção de EG28 e EG28+CtCBD foi isolado como um fragmento Notl de 8,6 kb de pALK1930 ou como um fragmento Notl de 8,9 kb de pALK1948, respectivamente. A Figura 2 ilustra a dependência de pH da celulase de T. aurantiacus EG28 produzida de modo heterólogo determinando a partir do sobre-nadante da cultura usando CMC como substrato em uma reação de 10 min a 50°C (A). A temperatura ótima da celulase EG28 foi determinada em pH ótimo (6.0). A reação contendo CMC como substrato foi realizada por 10 min (B). O pH e temperatura ótimos da proteína de fusão EG28+CtCBD foram determinados para serem o mesmo que os da celulase EG28 selvagem. A Figura 3 mostra o efeito de bioesmerilhamento de celulase EG28, medindo a cor, em diferentes temperaturas e pH 6. A Figura 4 mostra o efeito de bioesmerilhamento de EG28+CtCBD celulase, medindo a cor, em diferentes valores de pH a 50°C. A Figura 5 mostra o efeito de bioesmerilhamento de EG28+CtCBD celulase, medindo a cor, em diferentes valores de pH a 60°C. A Figura 6 mostra o efeito de bioesmerilhamento de EG28+CtCBD celulase, medindo a cor, em diferentes temperaturas (pH 6). A Figura 7 mostra a Influência da temperatura de peletização sobre a recuperação da atividade de betaglucanase de rações suplementadas com celulase EG28. A Figura 8 mostra a Influência da temperatura de peletização sobre a recuperação da atividade de celulase de rações suplementadas com celulase EG28+CtCBD.

Descrição Detalhada da Invenção Celulases compreendem um domínio catalítico / núcleo (CD) expressando atividade de celulase. Além do domínio catalítico a molécula de celulase pode compreender um ou mais "domínios de ligação de celulose" ("CBDs"), também denominados como domínios / moléculas de ligação de carboidrato (CBD/CBM), os quais podem estar localizados ou no N- ou no C-término do domínio catalítico. CBDs têm atividade de ligação de carboidrato e mediam a ligação da celulase a celulose cristalina mas têm pouco ou nenhum efeito sobre a atividade hidrolítica da enzima sobre substratos solúveis. Estes dois domínios são tipicamente conectados através de uma região de encadeador flexível e altamente glicosilada, aqui, neste requerimento de patente, denominada "encadeador". Os constructos referidos são descritos, por exemplo, em Srisodsuk et al., 1993. Algumas das endoglucanases que ocorrem naturalmente e celobiohidrolases têm um domínio de ligação de celulose (CBD), enquanto outras não.

Endoglucanases (EGs) são um dos três tipos de celulases g-eralmente necessários para a conversão biológica de celulose em glicose. Endoglucanases cortam ligações beta-1,4-glucosídicas internas, ao passo que celobiohidrolases cortam a dissacarídeo celobiose do fim da cadeia po- limérica de celulose e beta-1,4-glucosidases hidrolisam a celobiose e outros celooligossacarídeos curtos para glicose. "Endoglucanase" ("EG") em relação com a presente invenção refere-se a enzimas classificadas como E.C. 3.2.1.4. São 1,4- beta-D-glucano 4-glucanohidrolases e catalisam endohidró-lise de ligações 1,4-beta-D-glicosídicas em polímeros de glicose tais como celulose. Algumas endoglucanases também podem hidrolisar, por exemplo, 1,4-ligações em beta-D-glucanos também contendo 1,3-ligações. Portanto também podem ser classificadas como endo-1,3(4)-betaglucanases (E.C. 3.2.1.6). Portanto, uma enzima pode catalisar reações sobre vários substratos e pode pertencer a múltiplas classes.

Celulases incluindo endoglucanases também podem ser classificadas em várias famílias de glicosil hidrolase de acordo com sua seqüência primária, suportadas por análise da estrutura tridimensional de alguns membros da família (Henrissat 1991, Henrissat e Bairoch 1993, 1996). Por exemplo, a família 45 (anteriormente celK) contém endoglucanases (EC 3.2.1.4), e a família 5 (anteriormente conhecida como celA) consiste essencialmente de endoglucanases (EC 3.2.1.4). A família 7 (anteriormente celulase família celC) contém tanto endoglucanases quanto celobiohidrolases. Algumas glicosil hidrolases são enzimas multifuncionais que contêm domínios catalíticos que pertencem a diferentes famílias de glicosil hidrolase. Para os presentes fins a parte de endoglucanase da proteína de fusão preferencialmente pertence à família 45 ou família 5 de glicosídeo hidrolase, e mais preferencialmente à família 5.

De acordo com uma modalidade preferencial da invenção a parte endoglucanase da proteína de fusão é derivada de um fungo, preferencialmente do gênero Thermoascus, e mais preferencialmente de Thermoascus aurantiacus. Uma endoglucanase semelhante foi descrita, por exemplo, por Hong et al. 2003. A patente internacional Ns WO 03/062409 sugere usar esta enzima para aplicações de ração, porque além de endoglucanase também tem atividade de beta-glucanase. O mais preferencialmente a endoglucanase é derivada de T. aurantiacus cepa ALK04242 depositada como CBS 116239. O gene de endoglucanase da referida cepa foi inserido no plasmí- deo pALK1926 e depositado como DSM 17326. A proteína codificada por este gene é referida aqui, neste requerimento de patente, como "Ta EG28" ou simplesmente "EG28".

Alternativamenete, a parte endoglucanase da proteína de fusão pode ser obtida a partir de Acremonium sp. preferencialmente de A. thermo-philum, e mais preferencialmente de uma cepa tendo as características da cepa ALK04245 depositada como CBS 116240. A endoglucanase obtenível a partir desta cepa e codificada pelo gene ce/45A é referida aqui, neste requerimento de patente, como "At EG40" ou simplesmente "EG40". "Núcleo" de endoglucanase conforme usado aqui, neste requerimento de patente, significa o domínio catalítico / núcleo (CD) de uma enzima expressando no mínimo atividade de endoglucanase. Um domínio catalítico semelhante pode estar em sua forma natural (isto é, intacto) ou pode ser modificado.

De acordo com uma modalidade da invenção, o núcleo de endoglucanase tem no mínimo 75, 80, 85, 90, 95, 98 ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 2 (Ta EG28). Preferencialmente, o núcleo compreende no mínimo a proteína madura, a qual corresponde aos aminoácidos 19 a 334 da SEQ ID NO: 2. A previsão da seqüência de sinalização foi feita usando o programa SignalP V3.0 (Nielsen etal., 1997; Bendtsen et ai, 2004); o valor de NN foi obtido usando redes neurais e o valor de HMM foi obtido usando modelos de Markov oculto. Alternativamente, a parte endoglucanase da proteína de fusão tem no mínimo 75, 80, 85, 90, 95, 98 ou 99% de identidade com o núcleo de endoglucanase de At EG40, codificado por um polinucleotí-deo compreendido na SEQ ID NO: 8. Preferencialmente, o núcleo compreende no mínimo a proteína madura, a qual corresponde aos aminoácidos 22 a 297 de EG40. "Celobiohidrolase" ou "CBH" conforme usado aqui, neste requerimento de patente, refere-se a enzimas que clivam celulose da extremidade da cadeia de glicose e produzem essencialmente celobiose. Também são denominadas 1,4-beta-D-glucano celobiohidrolases ou celulose 1,4-beta-celobiosidases. Hidrolisam as ligações 1,4-beta-D-glucosídicas das extremi- dades redutoras ou não redutoras de um polímero contendo as referidas ligações, tais como celulose, por meio do que é liberada celobiose. O CBD incluindo o encadeador é preferencialmente derivado de Chaetomium thermophilum, e especialmente do gene codificando celobiohi-drolase (CBHI/Cel7A) de cepa ALK04265, depositado como CBS 730.95. Este CBD incluindo o encadeador é referido como "CtCBD". De acordo com uma modalidade preferencial da invenção, o encadeador mais o domínio de ligação de celulose tem uma seqüência que tem no mínimo 80, 85, 90, 95, 98 ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 15, (a qual corresponde aos aminoácidos 335 a 415 da SEQ ID NO: 4). De acordo com outra modalidade preferencial a segunda seqüência de aminoácidos compreende os aminoácidos 335 a 379 de SEQ ID NO: 4. O termo "derivado de" em relação com uma fonte de microorganismo significa que o polipeptídeo pode ser produzido naturalmente pela referida fonte de microorganismo específico, ou o polinucleotídeo codificando o polipeptídeo pode ser isolado da referida fonte de microorganismo, ou o termo significa uma célula hospedeira na qual o polinucleotídeo da referida fonte de microorganismo codificando o polipeptídeo foi introduzido. No entanto, não exclui modificações menores da seqüência, por exemplo, por substituição, eliminação, inversão e/ou inserção de um ou uns poucos aminoácidos / códons na medida que a atividade biológica da proteína codificada seja retida. O núcleo, e o encadeador+CBD, respectivamente, também pode ser um fragmento ou uma variante das referidas seqüências, em que o referido fragmento ou variante tem atividade de celulase e/ou atividade de ligação de celulose. Por exemplo, a primeira seqüência de aminoácidos pode compreender um fragmento ou variante de uma seqüência de aminoácidos tendo no mínimo 75% de identidade com a SEQ ID NO: 2 ou 8, e a segunda seqüência de aminoácidos pode compreender um fragmento ou variante de uma seqüência de aminoácidos tendo no mínimo 75% de identidade com a SEQ ID NO: 15.

No presente contexto "atividade de celulase" significa capacida- de catalítica para hidrolisar celulose ou derivados da mesma, tais como atividade de endoglucanase ou betaglucanase. Além de atividade de endoglu-canase e/ou beta-glucanase, algumas das celulases podem ter adicionalmente atividade de hemicelulase e/ou xilanase.

Conforme usado no presente contexto o termo "identidade" refe-re-se à identidade global entre duas seqüências de aminoácidos comparadas umas com as outras a partir do primeiro aminoácido codificado pelo gene correspondente até o último aminoácido. A identidade das seqüências de extensão total é medida usando programa de alinhamento global de Nee-dleman-Wunsch no pacote de programa EMBOSS (European Molecular Bio-logy Open Software Suite; Rice et al., 2000), versão 3.0.0, com os seguintes parâmetros: EMBLOSUM62, penalidade de Gap de 10,0, penalidade de Extensão de 0,5. O algoritmo é descrito em Needleman e Wunsch (1970). A pessoa versada na técnica está ciente do fato que resultados usando o algoritmo de Needleman-Wunsch são comparativos somente ao alinhar domínios correspondentes da seqüência. Conseqüentemente comparação de, por e-xemplo, seqüências de celulase incluindo CBD ou seqüências de sinalização com seqüências carecendo destes elementos são excluídas como não sendo significativas.

De acordo com uma modalidade da invenção a proteína de fusão contém um núcleo de endoglucanase codificad por um gene equivalente àquele incluído em E. coli DSM 17326. Preferencialmente, a proteína de fusão é codifiada por um gene de fusão equivalente ao incluído em E. coli DSM 18159. "Equivalente" conforme usado aqui, neste requerimento de patente, significa essencialmente similar ou similar. De acordo cm uma modalidade específica da invenção a proteína de fusão contém um núcleo de endoglucanase compreendendo a seqüência de SEQ ID NO:2 e um encadea-dor e CBD compreendendo a seqüência de SEQ ID NO: 15. Especialmente compreende a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 ou 6, ou uma variante ou fragmento da mesma tendo atividade de celulase e atividade de ligação de celulose.

Um "fragmento" é entendido como sendo parte de uma seqüên- cia de aminoácidos específica que é suficientemente longa para ter a atividade biológica desejada. Em outras palavras o fragmento pode ser, por e-xemplo, somente a parte madura da seqüência de aminoácidos ou ainda uma subseqüência da parte madura. Por uma seqüência de aminoácidos que é uma "variante" de uma seqüência de aminoácidos específica se indica uma seqüência de aminoácidos que não é idêntica à seqüência de aminoácidos específica, mas ao invés contém no mínimo algumas alterações de aminoácidos, isto é, eliminações, substituições, inversões, inserções e etc. que não afetam essencialmente a atividade biológica da proteína comparada com uma atividade similar da seqüência de aminoácidos específica, quando usada para o fim desejado. Atividade biológica neste contexto portanto refe-re-se uma atividade de celulase, atividade de ligação de celulose ou ambas. A proteína de fusão da invenção pode ser preparada ficando a parte do núcleo de endoglucanase ao encadeador e parte de CBD no DNA codificante apropriado usando técnicas de DNA recombinante conhecidas de modo geral para produzir a proteína recombinante desejada. Em resumo, os polinucleotídeos codificando os parceiros de fusão são amplificados e clona-dos, nucleotídeos também podem ser sintetizados. O polinucleotídeo fundido é inserido em um vetor de expressão, transformado em uma célula hospedeira e expressado. Preferencialmente, o encadeador e CBD é fixado no C-término do núcleo de endoglucanase.

Um "vetor de expressão" é um plasmídeo ou vetor de clonagem capaz de expressar DNA codificando as proteínas de fusão de endoglucanase depois de transformação em um hospedeiro desejado. Quando se usa um hospedeiro fúngico, o gene de interesse é preferencialmente proporcionado a um hospedeiro fúngico como parte de um veículo de clonagem ou expressão que integra no cromossoma fúngico, ou permite que o gene de interesse integre no cromossoma do hospedeiro. Outras seqüências que são parte do veículo de clonagem ou veículo de expressão também podem ser integradas com o DNA referido durante o processo de integração. Além disso, em fungos o vetor de expressão ou partes do mesmo podem ser direcionado/as para dentro de loci predeterminados. Alternativamente, o gene de fusão de- sejado é proporcionado como um plasmídeo replicando autonomamente. O DNA codificando as proteínas de fusão de endoglucanase é preferencialmente colocado sob o controle de (isto é, encadeado operavel-mente a) algumas seqüências de controle tais como seqüências promotoras proporcionadas pelo vetor. Na transformação estas seqüências de controle integram no genoma hospedeiro com o gene de interesse. Alternativamente, as seqüências de controle podem ser aquelas no sítio de integração.

As seqüências de controle de expressão de um vetor de expressão variarão dependendo de se o vetor é designado para expressar um determinado gene em um hospedeiro procariótico ou em um eucariótico (por exemplo, um vetor de vaivém pode proporcionar um gene para seleção em hospedeiros bacterianos). As seqüências de controle de expressão podem conter elementos regulatórios transcripcionais tais como promotores, elementos reforçadores, e seqüências de terminação transcripcional, e/ou elementos regulatórios transcripcionais, tais como sítios de iniciação e de terminação translacional.

Diz-se que uma molécula de polinucleotídeo, tal como DNA, é capaz de expressar um polipeptídeo, se contiver seqüências de controle de expressão, as quais contêm informação regulatória transcricional e as seqüências referidas são ligadas operavelmente à seqüência de nucleotídeos, a qual codifica o polipeptídeo.

Uma ligação operável é uma ligação na qual uma seqüência é conectada a uma seqüência regulatória (ou seqüências) de modo tal a por a expressão da seqüência sob a influência ou o controle da seqüência regulatória. Diz-se que duas seqüências de DNA (tais como uma seqüência de região promotora encadeada à extremidade 5' da seqüência codificando proteína) são encadeadas operavelmente se a função do promotor resulta na transcrição.

Os vetores da invenção podem compreender adicionalmente outros elementos regulatórios encadeados operavelmente, tais como seqüências reforçadoras.

Em uma modalidade preferencial, são construídos transforman- tes geneticamente estáveis, por meio dos quais o DNA codificando as proteínas de fusão é integrado no cromossoma hospedeiro por transformação com um vetor, o qual pode portar seqüências promovendo integração do referido vetor no cromossoma. Células que têm DNA estavelmente integrado codificando as proteínas de fusão de endoglucanase em seus cromossomas podem ser selecionadas, por exemplo, por um ou mais marcadores introduzidos, homólogos ou heterólogos, os quais possibilitam seleção de células hospedeiras as quais contêm o vetor de expressão no cromossoma, por exemplo, o marcador pode proporcionar resistência a biocida, por exemplo, resistência a antibióticos, ou metais pesados, tais como cobre, ou marcadores complementando uma mutação auxotrófica no cromossoma hospedeiro, e semelhantes. O marcador selecionável pode ser, por exemplo, um gene de seleção diretamente encadeado às seqüências genéticas de DNA a serem expressadas, ou introduzido na mesma célula por co-transformação. Também podem ser usados outros sistemas de seleção.

Uma vez que o vetor de expressão contendo o DNA codificando a proteína de fusão é preparado, é introduzido em uma célula hospedeira apropriada por qualquer um de uma variedade de meios adequados, incluindo transformação conforme de conhecimento na técnica. Depois de transformação, células receptoras são cultivadas em um meio seletivo apropriado, o qual seleciona para o crescimento de células transformadas.

Sistemas hospedeiros de expressão e produção adequados são, por exemplo, o sistema de produção desenvolvido para hospedeiros fúngi-cos Tríchoderma (patente européia EP Νδ 244 234), ou Aspergillus, tais como A. oryzae ou A. niger (publicação de patente internacional Ns WO 97/08325 e publicação de patente internacional Ns WO 95/33386, Patente U.S. Ns 5.843.745, Patente U.S. Ns 5.770.418), ou o sistema de produção desenvolvido para Fusarium, tais como F. oxysporum (Malardier et al., 1989). Sistemas de produção adequados desenvolvidos para bactérias incluem um sistema de produção desenvolvido para Bacillus, por exemplo, B. subtilis, B.licheniformis, B. amyloliquefaciens ou para E. coli, ou para um ac- tinomycete Streptomyces. Sistemas de produção adequados desenvolvidos para leveduras são sistemas desenvolvidos para Saccharomyces, Shizosac-charomyces ou Pichia pastoris. Também são possíveis sistemas de produção em outros micróbios ou em células mamíferas ou em plantas.

Expressão de uma ou mais seqüências genéticas clonadas resulta na produção da proteína desejada, ou na produção de um fragmento desta proteína. Esta expressão pode ocorrer em uma maneira contínua nas células transformadas, ou em uma maneira controlada.

Para obter as preparações enzimáticas da invenção, os hospedeiros tendo as propriedades desejadas (isto é, hospedeiros capazes de expressar quantidades economicamente viáveis das proteínas de fusão de en-doglucanase) são cultivados sob condições adequadas, e as enzimas desejadas são preferencialmente secretadas a partir dos hospedeiros no meio de cultura, e opcionalmente recuperadas do referido meio de cultura por métodos conhecidos na técnica. Preferencialmente o hospedeiro para semelhante produção é um fungo filamentoso, tal como Trichoderma ou Aspergillus, e especialmente T. reesei.

Conforme usado no presente contexto a "preparação enzimáti-ca" refere-se a qualquer produto enzimático, o qual contém no mínimo uma proteína de fusão de endoglucanase da invenção. Portanto, uma preparação enzimática semelhante pode ser um meio de cultura gasto ou filtrado. Meio de cultura gasto significa o meio de cultura do hospedeiro compreendendo as enzimas produzidas. Preferencialmente, as células hospedeiras são separadas do referido meio depois da produção. Caso desejado, as preparações referidas podem ser liofilizadas ou a atividade enzimática de modo diverso concentrada e/ou estabilizada para armazenamento. Caso requerido, uma enzima desejada pode ser adicionalmente purificada de acordo com métodos convencionais, tais como extração, precipitação, cromatografia, cromatografia por afinidade, eletroforese, ou semelhantes.

No entanto, é uma vantagem da invenção que o meio de cultura com ou sem células hospedeiras possa ser utilizado como uma preparação enzimática como tal sem purificação adicional, porque as proteínas de fusão de endoglucanase podem ser secretadas no meio de cultura, e apresentam atividade nas condições ambiente do meio de cultura gasto. As preparações enzimáticas são muito econômicas de proporcionar e usar, devido a ser desnecessário o isolamento de uma enzima específica do meio de cultura.

Além da proteína de fusão de endoglucanase, as preparações enzimáticas podem compreender uma ou mais enzimas diferentes, as quais podem ser, por exemplo, outras celulases, amilases, lipases, proteases, he-micelulases, xilanases, pectinases e/ou oxidases tais como lacases e pero-xidases. Alternativamente, antes, durante ou depois do tratamento com a proteína de fusão de endoglucanase pode ser realizado outro tratamento enzimático. O tratamento enzimático pode compreender, por exemplo, um ou mais tratamentos com amilase (por exemplo, para desengomação do de-nim), um ou mais tratamentos com celulase e/ou um ou mais tratamentos com peroxidase e/ou lacase. Depende da aplicação quais outras enzimas são incluídas na preparação enzimática ou usadas no tratamento enzimático.

Além da proteína de fusão, a preparação enzimática pode conter aditivos, tais como estabilizantes, tampões, conservantes, tensoativos e/ou componentes do meio de cultura. Aditivos preferenciais são semelhantes, os quais são comumente usados em preparações enzimáticas pretendidas para a aplicação, onde a preparação enzimática é usada.

As preparações enzimáticas podem ser proporcionadas como um líquido ou como um sólido, por exemplo, como um pó seco ou granular, especialmente grânulos não-empoeirantes, ou um líquido estabilizado. É previsto que as preparações enzimáticas podem ser adicionalmente enriquecidas, ou tornadas parcialmente ou completamente deficientes em atividades enzimáticas específicas, de modo a satisfazer os requisitos de uma utilidade específica em várias aplicações, por exemplo, na indústria têxtil. Uma mistura de atividades enzimáticas secretadas por um hospedeiro pode ser vantajosa em uma aplicação industrial em particular, por exemplo, em bioacabamento e bioesmerilhamento.

As proteínas de fusão de endoglucanase e as preparações das mesmas são úteis, por exemplo, na indústria têxtil, de ração, de óleos vegetais, de detergentes, e de polpa e papel. Podem ser usadas para tratar qualquer material celulósico, tal como material têxtil, plantas usadas em ração animal, material vegetal para extração de óleo, ou polpa mecânica ou química ou fibra secundária derivada de madeiras. Também podem ser adicionadas em detergentes, os quais normalmente contêm auxiliares, tais como a-gentes ativos na superfície, tensoativos, agentes alvejantes e/ou construtores. No presente contexto "material celulósico" refere-se a qualquer material compreendendo celulose ou derivados da mesma como um componente significativo. O material celulósico é contactado com uma quantidade eficaz da proteína de fusão sob condições adequadas, tais como pH e temperatura apropriados, e a reação é deixada para continuar por um tempo suficiente para a reação enzimática ocorrer.

As enzimas de fusão são especialmente úteis no tratamento de materiais têxteis, tais como tecidos e roupas. O material têxtil pode ser fabricado de fibras contendo celulose natural ou fibras contendo celulose sintética ou misturas das mesmas, ou uma combinação de fibras sintéticas e fibras contendo celulose. Preferencialmente, o material contendo celulose é algodão, especialmente denim. Por "denim" se indica, em relação com esta invenção, tecido de denim, geralmente roupas de denim, particularmente je-ans. Vantajosamente o denim é denim tingido com índigo. Denim também pode ser tratado com derivados de índigo ou com índigo junto com algum outro corante, por exemplo, denim tingido com índigo com fundo de enxofre.

As endoglucanases de fusão são especialmente úteis em bio-esmerilhamento e bioacabamento de têxteis. A lavagem à pedra tem três etapas: desengomação, abrasão e pós-tratamento. A primeira etapa, o processo de desengomação é normalmente o primeiro tratamento a úmido do jeans e significa remoção de amido e outros agentes de engomação geralmente aplicados aos fios de urdidura para prevenir dano durante o processo de tecedura. Alfa-amilases são usadas para remover agentes de engomação à base de amido para processamento a úmido aprimorado e uniforme. Depois de desengomar os jeans são normalmente enxaguados com água ou passados diretamente para a etapa de abrasão. A segunda etapa, abrasão, pode ser realizada com enzimas ou pedras-pomes ou ambas. Em todos os casos é necessária ação mecânica para remover o corante, e o tratamento é geralmente realizado em máquinas de lavar roupa, como lavadoras de tambor. O termo "desgastado" significa o aspecto do tecido de denim, quando foi tratado por enzimas celulase ou pedras, ou ambas. Expressões sinônimas são lavado à pedra ou "aspecto usado". Em conseqüência de remoção desigual do corante há contrastes entre áreas tingidas e áreas das quais o corante foi removido. A abrasão é geralmente seguida pela terceira etapa, pós-tratamento que inclui etapas de lavagem e enxágüe durante as quais podem ser usados detergentes, abrilhantadores óticos, agentes alvejantes ou ama-ciantes. Depois do tratamento enzimático a reação deve ser interrompida de modo a prevenir dano dos materiais tratados, por exemplo, pela temperatura e/ou inativação do pH, o último compreendendo uma enxágüe completo e/ou lavagem de detergente. Isto assegura que a resistência mecânica da fibra não é adicionalmente comprometida pela presença contínua da enzima.

Conforme usado no presente contexto a expressão "bioesmeri-Ihamento" de tecido ou roupa significa o uso de enzimas ao invés de, ou a-lém de, pedras-pomes para o tratamento de tecido ou roupa, especialmente denim.

Conforme determinado acima, tratamento com celulase pode substituir completamente tratamento com pedras-pomes (por exemplo, 1 kg de enzima comercial vs. 100 kg de pedras). No entanto, tratamento com celulase também pode ser combinado com tratamento com pedras-pomes, quando se deseja produzir um acabamento fortemente desgastado. Um efeito de pele de pêssego no qual se cria uma fina cobertura semelhante a pêlos se projetando também é obtido por uma lavagem combinando uma celulase neutra com pedras-pomes. As proteínas de fusão descritas são especialmente úteis para proporcionar de modo eficaz um aspecto desgastado e para minimizar a retropigmentação em bioesmerilhamento.

Bioesmerilhamento é tipicamente realizado em cerca de pH 3.0 a 8.0, e preferencialmente em pH 5.0 a 7.0. A temperatura da reação pode variar de cerca de 30°C a 80°C e é preferencialmente entre 50 a 60°C. A proporção de solução (a proporção do volume de líquido por peso de tecido) pode variar de cerca de 3:1 a 20:1, preferencialmente 5:1 a 10:1. O tempo de tratamento pode variar entre 15 min a 90 min e preferencialmente 30 min a 60 min. Deve ser enfatizado que a dosagem enzimática depende grandemente do tipo dos tecidos, maquinaria, condições do processo (pH, temperatura, proporção de solução, tempo de tratamento, carga de denim, escala do processo) e do tipo de preparação enzimática e semelhantes. Caso desejado, pedras-pomes podem ser usadas em combinação com as proteínas de fusão de endoglucanase. A dosagem enzimática requerida será então significativamente menor. Uma pessoa versada na técnica é capaz de definir do-sagens e condições adequadas.

As proteínas de fusão de endoglucanase da presente invenção proporcionam vantagens inesperadas em que a performance enzimática é elevada e o retrotingimento é baixo resultando em contraste muito bom. A-lém disso, as proteínas de fusão são facilmente fabricadas, e podem ser u-sadas em uma faixa relativamente ampla de temperatura e pH.

Além disso, as proteínas de fusão de endoglucanase são úteis em bioacabamento de tecidos e roupas. "Bioacabamento" refere-se ao uso de enzimas em uma hidrólise controlada de fibras celulósicas de modo a modificar a superfície do fio ou tecido em uma maneira que evita permanentemente a formação de bolinhas, melhora o manuseio do tecido como maciez e lisura, clareia a estrutura superficial reduzindo o esfiapamento, o que resulta em clarificação das cores, melhora a drapabilidade do tecido, melhora a absorvência de umidade e que pode melhorar também a tingibilidade.

Depilling enzimático pode ser realizado em qualquer estágio durante processamento a úmido de têxteis, preferencialmente depois de opcional desengomação e/ou branqueamento, e podem ser usadas condições similares como em bioesmerilhamento.

As proteínas de fusão de endoglucanase possuindo também ati- vidade de betaglucanase, hemicelulase ou xilanase são adicionalmente úteis para melhorar a qualidade de ração animal, por meio do que material vegetal é tratado com as enzimas.

Amido, proteínas e lipídeos podem ser facilmente degradados pelo sistema digestivo de animais monogástricos tais como aves domésticas e porcos, ao passo que a principal parte de polissacarídeos não amido (NSP) incluindo beta-glucanos misturados-encadeados de, por exemplo, cevada e aveia permanecem intactas devido à falta de semelhantes atividades enzimáticas dentro do animal. Além disso, a digestibilidade de outros componentes, particularmente gorduras animais, é reduzida na presença de NSP.

Beta-glucanases têm sido usadas comercialmente para aliviar problemas causados por beta-glucanos misturados-encadeados de cevada e aveia. Betaglucanases são conhecidas para reduzir a viscosidade intestinal causada por betaglucanos solúveis bem como para liberar nutrientes encap-sulados por paredes celulares ricas em beta-glucanos. O uso de betaglucanases melhora a performance animal, a qual pode ser vista como aumento do ganho de peso e da proporção de conversão da ração. Além disso, são tipicamente reduzidas as incidências de excrementos viscosos em aves domésticas.

Peletização a vapor é a principal tecnologia de processamento de ração em todo o mundo. Suas vantagens em relação à produção de rações de farelo ensopado incluem manuseio mais fácil, redução de organismos e substâncias tóxicas, e acima de tudo aumentada eficiência da ração. A termotolerância e alta performance das proteínas de fusão descritas aqui, neste requerimento de patente, as tornam adequadas para aplicações de ração. A invenção é ilustrada pelos seguintes exemplos não limitantes. No entanto, deve ser entendido que as modalidades dadas na descrição a-cima e nos exemplos são para fins ilustrativos somente, e que são possíveis várias alterações e modificações dentro do âmbito da invenção.

Exemplo 1. Produção de celulase ALK04242 EG28 de Thermoascus auran- tiacus em Trichoderma reesei Métodos de biologia molecular de rotina foram usados no isolamento e tratamentos enzimáticos de DNA (plasmídeos, fragmentos de DNA), em transformações de E. coli, e etc. Os métodos básicos usados são descritos nos manuais de biologia molecular de rotina, por exemplo, Sambrook et al. (1989) e Sambrook e Russell (2001). O gene de Thermoascus aurantiacus ce/5A (SEQ ID NO: 1) codificando celulase EG28 (SEQ ID NO: 2) foi amplificado por PCR diretamente a partir do DNA genômico de T. aurantiacus ALK04242, isolado pelo método de Raeder e Broda (1985). Os iniciadores dianteiro (SEQ ID NO: 9) e reverso (SEQ ID NO: 10) foram designados com base na seqüência de en-doglucanase de T. aurantiacus publicada (AF487830). O produto de 1,3 kb amplificado contendo o gene exato (do códon de START para STOP) foi clo-nado como um fragmento Sacll-Pstl no vetor pBluescript II KS+. Dois clones independentes foram seqüenciados e um clone foi selecionado e designado como pALK1926. O número de depósito da cepa de E. coli contendo pALK1926 na coleção de cultura Deutsche Sammlung von Mikroorganismen and Zellkulturen GmbH é DSM 17326.

Um plasmídeo de expressão (pALK1930, Fig. 1) foi construído para produção de celulase EG28/Cel5A de T. aurantiacus recombinante (SEQ ID NO: 2). O gene ce/5A, incluindo sua própria seqüência de sinal, foi exatamente fundido ao promotor de T. reesei cbhl (cel7A) por PCR. O gene promotor cbhl, terminador cbhl e marcador amdS foram incluídos conforme descrito em Paloheimo et al. (2003). O cassete de expressão linear (Fig. 1) foi isolado da espinha dorsal do vetor por digestão por enzima de restrição, transformado em T. reesei A96, e transformantes foram selecionados com acetamida como única fonte de nitrogênio. A cepa hospedeira carece de quatro celulases endógenas principais: CBHI/Cel7A, CBHII/Cel6A, E-GI/Cel7B e EGII/Cel5A. Transformações foram realizadas de acordo com Penttila et al. (1987) com as modificações descritas em Karhunen et al. (1993). Os transformantes foram purificados sobre placas de seleção através de conídios únicos antes de os esporular sobre PD. A produção de celulase dos transformantes foi analisada a partir dos sobrenadantes da cultura de culturas de frasco agitado (50 ml). Transformantes foram cultivados por 7 dias em um meio indutor de complexo celu-lósico (Joutsjoki et al. 1993) tamponado com 5% de KH2PO4 em pH 5.5. A atividade enzimática da proteína recombinante foi medida a partir do sobre-nadante da cultura como a liberação de açúcares redutores de carboximetil-celulose (2% de CMC) a 50°C em tampão Sitrate a 50 mM pH 4.8 essencialmente conforme descrito por Bailey e Nevalainen 1981; Haakana et al. 2004. A atividade contra beta-glucano de cevada (1%) também foi determinada medindo a liberação de açúcares redutores a 50°C em tampão de acetato a 50 mM pH 4.8 conforme descrito por St6lbrand et al. 1993. Produção da proteína recombinante também foi detectada a partir do sobrenadan-te da cultura por eletroforese por gel de poliacrilamida SDS. Os genótipos dos transformantes escohidos foram analisados por Southern blotting usando 0 cassete de expressão como uma sonda. O pH ótimo da celulase Ta EG28/Cel5A produzida heterologa-mente fgoi determinado no tampão de Mcllvaine universal dentro de uma faixa de pH de 4.0 a 8.0 usando carboximetilcelulose como substrato. Conforme mostrado na Figura 2A 0 pH ótimo para atividade de celulase EG28/Cel5A é em pH 6.0. A temperatura ótima para a atividade enzimática de celulase EG28/Cel5A foi determinada para ser 75°C (Figura 2B).

O transformante escolhido (RF6188) foi cultivado em um biorrea-tor para obter material para os testes de aplicação (vide 0 Exemplo 4). Exemplo 2. Produção da proteína de fusão recombinante de Thermoascus aurantiacus ALK04242 EG28+CtCBD

Para produzir uma proteína de fusão EG28+CtCBD de Thermoascus aurantiacus recombinante (SEQ ID NO: 4), 0 domínio de ligação de celulose (CBD) da celulase CBHI/Cel7A de Chaetomium thermophilum ALK04265 foi encadeado à celulase EG28/Cel5A. O constructo contém 0 domínio catalítico de EG28 (aminoácidos 1-334 do polipeptídeo de extensão total) ficado à região encadeadora e CBD de C. thermophilum CBHI/ Cel7A CtCBD (SEQ ID NO: 15). Métodos de biologia molecular de rotina foram usados conforme descrito no Exemplo 1. Primeiro, um único sítio de restrição SnaBI próximo à extremidade de C-terminal da seqüência EG28/Cel5A foi introduzido por PCR. Isto possibilita fusão direta de qualquer DNA "blunt-ended" depois do aminoácido Y334 do polipeptídeo EG28/Cel5A. O encadeador e região CBD do gene codificando CBHI/Cel7A de C. thermophilum (ce/7A, SEQ ID NO: 7) foi amplificado por PCR usando iniciadores dianteiro (SEQ ID NO: 11) e reverso (SEQ ID NO: 12) e DNA genômico de C. thermophilum ALK04265 como modelo. O produto de 1,6 kb amplificado foi ligado ao gene ce/5A (depois de Y334) para criar Ta ce/5A Ct ce/7AlinkerCBD (SEQ ID NO: 3). O plasmí-deo resultante foi designado como pALK1946. O número de depósito da cepa de E. coíi contendo pALK1946 na coleção de cultura Deutsche Sammlung von Mikroorganismen and Zellkulturen GmbH é DSM 18159.

Um plasmídeo de expressão (pALK1948, Fig 1) para produção da celulase EG28+CtCBD foi construído conforme descrito no Exemplo 1. O cassete de expressão de 8,9 kb linear (Figura 1) foi isolado da espinha dorsal do vetor por digestão por enzima de restrição Notl, transformado em T. reesei A33 (a cepa tem os genes codificando as quatro celulases principais CBHI/Cel7A, CBHII/Cel6A, EGI/Cel7B e EGII/Cel5A eliminados), e transfor-mantes selecionados conforme descrito no Exemplo 1. O pH e temperatura ótimos da proteína de fusão foram determinados para serem os mesmos que os da proteína EG28 selvagem. O transformante escolhido (RF6377) foi cultivado em um biorrea-tor para obter material para os testes de aplicação (vide os Exemplos 5 a 10).

Exemplo 3. Produção da proteína de fusão recombinante de Acremonium thermophilum ALK04245 EG40+CtCBD

Para produção de uma proteína de fusão EG40+CtCBD de A-cremonium thermophilum ALK04245 recombinante (SEQ ID NO: 6), o domínio de ligação de celulose de celulase EG40 é substituído com o da C-BHI/Cel7A de Chaetomium thermophilum ALK04265. O constructo contém o domínio catalítico da celulase EG40 (aminoácidos 1 a 234 do polipeptídeo de extensão total) fixado à região encadeadora e CBD de CBHI/Cel7A de C. thermophilum (CtCBD, SEQ ID NO: 15). Métodos de biologia molecular de rotina são usados conforme descrito no Exemplo 1. O gene ce/45A de Acremonium thermophilum (SEQ ID NO: 8) é amplificado por PCR a partir do DNA genômico ALK04245 de A. thermophilum usando os iniciadores (SEQ ID NO: 13) e (SEQ ID NO: 14). O fragmento de PCR de 1,1 kb é clonado como um fragmento Sacll-Pstl no vetor pBluescript II KS+. Depois disso, um único sítio de restrição Nrul próximo à extremidade de C-terminal da sequência EG40 é introduzido por P-CR. Isto possibilite fusão direta de qualquer DNA blunt-ended depois do a-minoácido S234 do polipeptídeo EG40. O encadeador mais região CBD da celulase CBHI/Cel7A de Chaetomium thermophilum (ce17A) é amplificado por PCR conforme descrito no Exemplo 2 e um fragmento de restrição do mesmo é ligado ao gene ce/45A (depois de S234) para criar At ce/45A_Ct cef7AlinkerCBD (SEQ ID NO: 5). Um plasmídeo de expressão para produção da celulase EG40+CtCBD é construído e a proteína recombinante (SEQ ID NO: 6) é produzida em Trichoderma conforme descrito no Exemplo 1. Exemplo 4. Performance de celulase EG28 em acabamento de denim em diferentes temperaturas Celulase EG28 de Thermoascus aurantiacus produzida em Trichoderma (cepa RF6188) conforme descrito no Exemplo 1 foi testada para sua capacidade para criar um aspecto desgastado similar ao proporcionado por pedras-pomes em bioesmerilhamento de denim em diferentes temperaturas. Uma enzima de acabamento de denim eficiente, uma preparação de celulase ácida enriquecida com EGII comercial produzida em Trichoderma (Patente U.S. N- 5.874.293) foi usada como uma referência.

Jeans feitos de sarja de denim tingido com índigo foram usados como material de teste depois de desengomação com alfa-amilase ECOS-TONE® A200. Os tratamentos com celulase foram realizados com lavadora-extratora Electrolux's Wascator FOM 71 CLS sob condições descritas na Tabela 1. A atividade de endoglucanase (ECU) das preparações enzimáti- cas usadas foi medida como a liberalão de açúcares redutores de hidroxietil celulose conforme previamente descrito (Bailey e Nevalainen, 1981). O concentrado enzimático enriquecido com EGII e a preparação de EG28 foram dosados a 220 ECU/g e cerca de 380 ECU/g de tecido, respectivamente. As enzimas foram testadas em sua faixa de pH ótimo, a preparação de EGII em pH 5 e a preparação de EG28 em pH 6. Depois de drenagem, a enzima foi inativada (por 10 minutos a 40°C) aumentando o pH acima de 11 com hidróxido de sódio. Os jeans foram então ensaguados três vezes com água e secados em uma secadora de tambor. O efeito de bioesmerilhamento / nível de abrasão foi avaliado medindo a cor como valores de reflectância com um espectrofotômetro Minolta CM 2500 usando as coordenadas de espaço de cor L*a*b* (iluminante D65/ 2o). A cor da face e do lado reverso do denim e dos bolsos foi medida depois de desengomação (isto é, antes do tratamento com celulase) e depois do tratamento com celulase. Cada medição sobre o lado de face, lado reverso ou bolsos foi a média de 40, 20, ou 12 medições aproximadas, respectivamente. Dois pares de jeans foram usados em cada teste e o resultado final foi a média das mesmas. Os resultados são mostrados na Tabela 2 e na Figura 3.

Tabela 1. Condições de teste / parâmetros do processo usados em tratamentos com celulase.

Tabela 2. Medições da cor de denim tratado com celulase EG28 em diferentes temperaturas.

Como referência foi usado tratamento com preparação enrique- cida de EGII. L* indica a luminosidade, -b* é a direção do azul, +b* é a direção do amarelo.

Os resultados na Tabela 2 e na Fig. 3 mostram que o melhor efeito de abrasão com a preparação EG28 (cepa RF6188) foi obtido na faixa de 50 a 70°C. Usando uma dosagem de 380 ECU/g de tecido da preparação EG28 a 70°C foi obtido um nível de abrasão similar (luminosidade L*) comparado com usando a dosagem de 220 ECU/g de tecido de uma preparação enriquecida de EGII a 60°C. No entanto, o efeito de retro-pigmentação (re-deposição de corante índigo) sobre o lado reverso do denim e bolsos foi menor com a preparação EG28 (maior luminosidade, menos azul) do que com a preparação EGII enriquecida. Além disso o contrasts sobre o lado de face do denim teve aspecto melhor.

Exemplo 5. Performance de proteína de fusão EG28+CtCBD comparada com celulase EG28 em acabamento de denim Proteína de fusão EG28+CtCBD de Thermoascus aurantiacus recombinante produzida em Trichoderma (cepa RF6377) conforme descrito no Exemplo 2 foi comparada com a preparação EG28 da cepa RF6188 em bioesmerilhamento de denim em pH 6, 60°C. O denim e sistema de teste para bioesmerilhamento foram como no Exemplo 4, exceto que a quantidade de denim foi nivelada para 1430 g com uma peça extra de denim diferente que não foi incluída nas medições. O efeito do tratamento com celulase foi avaliado como no Exemplo 4.

Os resultados na Tabela 3 mostram que o efeito de bioesmerilhamento da preparação EG28+CtCBD foi muito bom em uma baixa dosage. Com a cepa RF6377 foi obtido um nível de abrasão similar (luminosidade L*) com dosagem 6,5 vezes menor comparada com RF6188. O encadeamento do domínio de ligação de celulose (CBD) a celulase EG28 não aumentou o efeito de retropigmentação indesejável, mas aumentou muito a performance de lavagem desejada.

Tabela 3. Medições da cor de denim tratado com celulases EG28 e EG 28+CtCBD a 60°C, pH 6. L* indica a luminosidade, -b* é a direção do azul, +b* é a direção do amarelo.

Exemplo 6. Performance de celulase EG28+CtCBD comparada com celula-se EGII em acabamento de denim Proteína de fusão EG28+CtCBD de Thermoascus aurantiacus recombinante produzida em Trichoderma (cepa RF6377) foi comparada com a preparação de celulase ácida enriquecida EGII comercial (Patente Ne U.S. 5.874.293) em bioesmerilhamento de denim. O sistema de teste para bioesmerilhamento foi como no Exemplo 4, exceto que foram usadas peças (pernas) de vários tipos de Denim diferentes da Ukos Sport (Bélgica) e Vicunha (Brasil) (total de 1,2 kg). As condições para tratamento com EG28+CtCBD e EGII foram como na Tabela 4. O efeito do tratamento com celulase foi avaliado como no Exemplo 4.

Os resultados dos experimentos realziados com quatro tecidos de denim diferentes são mostrados nas Tabelas 4 e 5. Usando uma dosa- gem enzimática de 500 ECU/g de tecido de preparação EG28+CtCBD foi obtido um nível de luminosidade similar comparado com o uso de uma dosagem de 1000 ECU/g da preparação enriquecida com EGII. A performance da preparação EG28+CtCBD necessitou em torno de somente metade da atividade de ECU daquela da celulase enriquecida com EGII. Além disso, o meio de cultura de EG28+CtCBD produzida pelo hospedeiro recombinante é volumetricamente cerca de duas vezes mais tão eficaz quanto o do hospedeiro recombinante produtor de EGII em bioesmerilhamento. Foi observado consideravelmente menos retropigmentação sobre o lado reverso do denim quando foi usada a preparação EG28+CtCBD. A performance da preparação EG28+CtCBD a 50°C foi melhor em pH 6 do que em pH 5.

Tabela 4. Medições da cor sobre o lado da face de denim tratado com celulase EG28+CtCBD em pH 5 e 6. Tratamento com preparação enriquecida com EGII foi usado para comparação. L* indica a luminosidade, -b* é a direção do azul, -ι-b* é a direção do amarelo.

Tabela 5. Medições de cor sobre o lado reverso de denim tratado com celulase EG28+CtCBD em pH 5 e 6. Tratamento com preparação enriquecida com EGII foi usado para comparação. L* indica a luminosidade, -b* é a direção do azul.

Exemplo 7. Efeito do pH sobre a performance de preparação de celulase EG28+CtCBD a 50°C e a 60°C

Proteína de fusão EG28+CBD de Thermoascus aurantiacus re-combinante produzida em Trichoderma (cepa RF6377) foi testada para sua performance em bioesmerilhamento de denim em diferentes valores de pH em 50°C e em 60°C.

Sarja de denim tingida com índigo (diferente dos exemplos prévios) que foi desengomada e cortada em pedaços foi usada como material de teste. Tratamentos com celulase foram realizados em LP-2 Launder Ometer como se segue. Cerca de 7,2 g de tecido de denim (amostra de cerca de 12 cm x 12 cm), 200 ml de tampão de fosfato de citrato de Mc llvaine, e 90 bolas de aço (diâmetro 0,6 cm) foram carregados em recipientes de 1,2 litro. O Launder Ometer foi rodado por 120 min em diferentes valores de pH de 4 a 8 usando temperaturas de 50°C e de 60°C. Depois de remover as amostras dos recipientes eles foram enxaguados com água e embebidas em água contendo NaOH (pH>11) por 10 min com misturação. Depois disso, as amostras foram embebidas em água quente contendo detergente líquido (OMO Color) e misturadas por 10 min, seguidos por cuidadoso enxágüe com água quente por várias vezes. As amostras foram secadas em temperatura ambiente. O efeito de bioesmerilhamento foi avaliado medindo a cor como unidades de reflectância conforme descrito no Exemplo 4. Cada valor de medição sobre o lado de face da amostra de denim foi a média de no mínimo 20 medições.

Os resultados mostrados nas Tabelas 6 e 7 e nas Figuras 4 e 5 mostram que a faixa de pH mais ótimo para a celulase EG28+CtCBD em 50° é 5.5 a 6.5 e em 60°C é 5 a 7.

Tabela 6. Medições de cor sobre o lado de face de denim tratado com celulase EG28+CtCBD em diferentes valores de pH em Launder a 50°C. L* indica a luminosidade, -b* é a direção do azul.

Tabela 7. Medições de cor sobre o lado de face de denim tratado com celulase EG28+CtCBD em diferentes valores de pH em Launder a 60°C. L* indica a luminosidade, -b* é a direção do azul.

Exemplo 8. Performance de preparação de celulase EG28+CtCBD em acabamento de denim em diferentes temperaturas Proteína de fusão EG28+CtCBD de Thermoascus aurantiacus recombinante produzida em Trichoderma (cepa RF6377) conforme descrito no Exemplo 1 foi testada para sua capacidade para criar um aspecto desgastado similar ao proporcionado por pedras-pomes em bioesmerilhamento de denim em diferentes temperaturas. Enzimas de acabamento de denim eficientes, preparação de celulase ácida enriquecida com EGII comercial (patente Ns U.S. 5.874.293) e preparação de celulase neutra ECOSTONE® C1 foram usadas como referência. O sistema de teste para bioesmerilhamento foi como no Exemplo 4, exceto que foram usados sarja de denim diferente e um tempo de lavagem de 55 min. A atividade enzimática (unidade de endoglucanase, ECU) das preparações enzimáticas enriquecidas com EG28+CtCBD e EGII foi medida como no Exemplo 4. A atividade (unidade de celulase neutra, NCU) da preparação de celulase neutra ECOSTONE® C1 foi medida como a liberação de açúcares redutores de carboximetil celulose conforme previamente descrito (Bailey e Nevalainen, 1981; Haakana et al. 2004). As preparações ECOSTONE® C1, EG28+CtCBD, ou EGII enriquecidas foram dosadas a 250 NCU/g, 500 ECU/g, ou 1000 ECU/g de tecido, respectivamente. O efeito do tratamento com celulase foi avaliado como no Exemplo 4. A performance de EG28+CtCBD em temperaturas de 40 a 70°C, pH 6 é mostrada na Tabela 8 e na Figura 6. A faixa de temperatura preferencial oara a enzima é 50 a 70°C. Temperaturas menores como 40°C podem ser usadas para obter um efeito de abrasão com menos retirada de cor se for desejável um visual mais escuro.

Os resultados também estão de acordo com os obtidos no E-xemplo 6, onde foi mostrado que a performance de EG28+CtCBD em bio-esmerilhamento era cerca de duas vezes mais eficaz do que a da preparação de celulase ácida enriquecida EGII comercial. Celulases ácidas geralmente têm uma tendência de retropigmentação. Celulases neutras, como ECOSTONE® C1, tipicamente causam baixa retropigmentação portanto resultando em bom contraste. Os resultados obtidos aqui mostram que foi obtido um efeito similar com a celulase EG28+CtCBD como com as celulases neutras (Tabela 8).

Tabela 8. Medições de cor de denim tratado com celulase EG28+CtCBD em diferentes temperaturas.

Tratamento com celulase ácida enriquecida com EGII e preparação de celulase neutra ECOSTONE® C1 foi usada como referência. L* indica a luminosidade, -b* é a direção do azul, +b* é a direção do amarelo.

Exemplo 9. Performance de celulases EG28 e EG28+CtCBD em bioacaba-mento (depilling) Foi testada a performance da celulase EG28 da cepa RF6188 e da preparação EG28+CtCBD da cepa RF6377 em depilling de artigos de malha de algodão. Os tratamentos com celulase foram realizados com lava-dora-extratora Wascator FOM 71 CLS da Electrolux sob condições descritas na Tabela 9.

Pedaços de dois tipos de suéteres de gola Polo de baixa qualidade com superfície esfiapada, feitos de tecido à base de 100% de jérsei de algodão ou estrutura feita de 95% de algodão e 5% de lycra foram usados como material de teste com material de enchimento. Primeiro, as amostras foram pré-lavadas por 10 min a 60°C com 1 ml/L de tensoativos / agentes umectantes (Sandoclean PCJ da Sandos e Imacol CN da Clariant) e enxaguadas três vezes com água. Depois disso, as malhas de algodão foram tratadas com celulase a 60°C por 60 minutos, na presença dos mesmos auxiliares têxteis conforme usado na pré-lavagem. A enzima foi inativada conforme descrito no Exemplo 4, exceto pela temperatura, a qual foi de 60°C durante o enxágüe alcalino. Os pedaços de artigos de malha foram enxa-güados três vezes e depois disso secados na secadora de tambor.

Tabela 9. Condições de teste / parâmetros do processo usados em tratamentos de bioacabamento. O efeito do tratamento com celulase foi avaliado visualmente a olho nu e com uma lupa. Uma amostra pré-lavada sem enzima foi usada como controle.

Os resultados mostraram que a preparação EG28+CtCBD aumentaram as propriedades de depilling. O esfiapamento superficial do artigo de malha foi consideravelmente reduzido depois de tratamento com a preparação EG28+CtCBD comparado com o controle (tratamento sem enzima). Além disso, a preparação EG28 teve um efeito de depilling.

Exemplo 10. Teste da estabilidade de peletização de ração Duas preparações de celulose, EG28 (cepa RF6188) e EG28+CtCBD (cepa RF6377) foram testadas separadamente em um experimento, o qual estimula um processo de produção de ração industrial. Antes de experimentação as preparações EG28 ou EG28+CtCBD secadas por pulverização foram trituradas com polvilho de trigo de modo a melhorar a homogeneidade no nível da ração. Enzimas EG28 ou EG28+CtCBD pré-misturadas com polvilho foram adicionadas em uma dosagem de 200 g/t e em 500 g/t de ração, respectivamente. Foi usada superdosagem enzimática para facilitar análise de amostras peletizadas em altas temperaturas, onde a atividade pode ter sido substancialmente reduzida. O moinho e misturador são usados para produzir misturas de farinha grossa como parte de uma planta de ração semi-industrial com uma capacidade de peletização nominal de 5 t/h. O moinho é um moinho de martelos Champion equipado com molde de c 3,0 mm. A matéria-prima triturada é misturada em um misturador horizontal de 2.500 litros a 27 rpm antes de ser transferida para a miniplanta de moagem de ração. A planta compreende um misturador horizontal (700 L de volume, velocidade de 48 rpm, lotes de mistura de 300 kg), um dozing screw Skjold TR e um misturador de cascata Kahl (extensão 130 cm, diâmetro 30 cm, velocidade 155 rpm, equipado com 37 palhetas ajustáveis). O tempo de pausa para 300 kg/h é aprox. 30 seg. Montada sobre o lado do misturador de cascata está uma tubulação com um descarregador de água e 3 válvulas de vapor a partir das quais o vapor é conduzido para a farinha grossa. O vapor é proporcionado por um boiler de alta pressão com uma capacidade máxima de 400 kg de vapor/h. Os testes são conduzidos com superpressão de 2 atmosferas e o vapor é conduzido através de uma válvula de redução da pressão, a qual controla a adição de vapor ao misturador de cascata. Três válvulas sobre a tubulação são usadas para fino ajustamento da temperatura da farinha grossa desejada. A temperatura da farinha grossa é medida por um termômetro digital colocado na saída do misturador de cascata, logo antes da farinha grossa entrar no molde de pélete. A prensa de pélete é um Simon Heesen, tipo labor (monorrolo) com um molde de 0,3 mm * 35 mm e um motor de 7,5 kW. Diâmetro interno do molde: 173 mm, altura do rolo de pressão: 50 mm, diâmetro do rolo de pressão: 140 mm, taxa de curso 500 rpm e capacidade nominal: 300 kg/h. As amostras são colhidas depois da prensa de pélete e resfriadas em uma caixa de refrigeração particionada com fundo perfurado, ventilador: 1500 m3 de ar/ hora.

Foi produzido um lote de 300 kg de uma ração de farelo ensopado à base de trigo. Uma pré-mistura foi produzida a partir de 10 kg desta farinha grossa e 200 g (ou 500 g) da enzima de teste em um misturador compulsório de de 70 litros. Velocidade do misturador: 45 rpm. Tempo de mistura: 10 min. Esta pré-mistura foi adicionada com 290 kg da ração ao misturador horizontal na miniplanta de moagem de ração e foi misturada por 10 minutos. Depois de amostragem da ração de farelo ensopado, a ração foi peletizada através da prensa de pélete (molde de G 0,3 mm). A farinha grossa foi aquecida até temperatura alvo (65 a 90°C) ajustando adição de vapor ao misturador de cascata. Para cada temperatura, uma amostra foi primeiro colhida 10 minutos depois de ser obtida a temperatura de peletização alvo (conforme medida na farinha grossa logo antes da peletização). Amostras foram colhidas durante 1,0 min correspondendo a 5,0 kg de ração peletizada. A amostra foi colhida como subamostras de aproximadamente 500 gramas e colocada em uma caixa de refrigeração por 10 a 15 segundos depois das péletes terem deixado a prensa de pélete. Todas as amostras foram ae-radas e resfriadas em temperatura ambiente por 15 minutos. As amostras foram homogeneamente sub-amostradas sobre um divisor de amostras de dispositivo de calha para retenção das mesmas e preenchidas em sacos plásticos.

As amostras foram analisadas como se segue: 2,5 g de amostra bem triturada e 20 ml de tampão de acetato (0,05 M, pH 5.0) foram agitados por 30 min em temperatura ambiente, centrifugadas (10 min, 4000 rpm) e diluídas. 1,0 ml de amostra clareada em triplicata foi equilibrado por 5 min em um banho de água a 40°C. A reação foi iniciada por adição de um comprimido de Beta-Glucazyme (Megazyme, Irlanda) sem agitação. Depois de exatamente 30 min a reação foi interrompida adicionando 5,0 ml de Trizma Base a 1% (peso/ vol) (Sigma-Aldrich) com vigorosa agitação sobre um misturador de vórtice. O tubo foi deixado em temperatura ambiente por cerca de 5 min; a pasta semifluida foi agitada de novo e filtrada através de papel-filtro Whatman 1. A absorvência do filtrado foi medida a 590 nm. Os resultados foram analisados usando uma curva padrão.

Recuperações da atividade enzimática antes e depois de peletização são apresentadas na Tabela 10. A influência da temperatura de peletização sobre a recuperação da atividade de betaglucanase também foi a-presentada nas Figuras 7 e 8. As celulases EG28 e EG28+CtCBD foram es- táveis até 80°C. A celulase EG28+CtCBD tendeu a ser mais estável do que EG28 na temperatura de peletização de 90°C.

Tabela 10. Recuperações da atividade enzimática antes (farinha grossa de misturador horizontal) e depois de peletização em temperaturas variando de 65 a 90°C.

Lista de organismos depositados (1) o Centralbureau Voor Schimmelcultures em Uppsalalaan 8, 3584 CT, Utre-cht, Países Baixos (2) o Centralbureau Voor Schimmelcultures em Oosterstraat 1, 3742 SK BA-ARN, Países Baixos (3)Deutsche Sammiung von Mikroorganismen and Zellkulturen GmbH (DSMZ), Mascheroder Weg 1 b, D-38124 Braunschweig, Alemanha Referências Altschul SF, W Gish, W Miller, EW Myers and DJ Lipman. 1990. Basic local alignment search tool. J. Mol. Biol. 215:403-410.

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Tyr Leu Asp ser Asp Gly ser Gly Thr Ser Ala 225 230 235 240 Thr Cys val Ser Ser Thr ile Gly Gin Glu Arg ile Thr ser Ala Thr 245 250 255 Gin Trp Leu Arg Ala Asn Gly Lys Lgs Gly ile Ile Gly Glu Phe Ala Gly Gly Ala Asn Asp Vai cys Glu Thr Ala ile Thr Gly Met Leu Asp 275 280 285 Tyr Met Ala Gin Asn Thr Asp vai xrp Thr Gly Ala rle Trp Trp Ala 290 295 300 Ala Gly pro Trp Trp Gly Asp Tyr Ile Phe ser Met Glu Pro Asp Asn 305 310 315 320 Gly ile Ala Tyr Gin Gin Ile Leu Pro ile Leu Thr Pro Tyr vai Pro 325 330 335 Gly Leu Asp Gly ser Asn pro Gly Asn Pro Thr Thr Thr vai vai Pro 340 345 350 Pro Ala ser Thr ser Thr ser Arg pro Thr ser ser Thr Ser Ser pro 355 360 365 val Ser Thr Pro Thr Gly Gin Pro Gly Gly Cys Thr Thr Gin Lys Trp 370 375 380 Gly Gin cys Gly Gly ile Gly Tyr Thr Gly cys Thr Asn cys val Ala 385 390 395 400 Gly Thr Thr Cys Thr Gin Leu Asn Pro Trp Tyr ser Gin cys Leu 405 410 415 <110> 5 <2U> 1211 <212> ONA <213> Acremonium thermophilum <220> <221> gene <222> ¢13)..(1206) <220> <221> intron <222> (96)..(154) <220> <221> intron <222> (404)..(526) <220> <Z21> intron <222> (1134)..(1197) <400> 5 ggactgcgca tcatgcgctc etcacccttt ctccgcgcag ctctggctgc cgctctgcct 60 ctgagcgccc atgccctcga cggaaagtcg acgaggtatg ccaatcctcg tacctctgcc 120 ctctgtagaa acaagtgacc gactgcaaag acagatactg ggactgctgc aagccgtcct 180 gcggctgggc cggaaaggcc tcggtgaacc agcccgtctt ctcgtgctcg gccgactggc 240 agcgcatcag cgacttcaac gcgaagtcgg gctgcgacgg aggctccgcc tactcgtgcg 300 ccgaccagac gccctgggcg gtcaacgaca acttctcgta cggcttcgca gccacggcca 360 tcgccggcgg ctccgagtcc agctggtgct gcgcctgcta tgcgtgagtt ctctgcaagc 420 cgcttcccac ccccgctttc tgtgcaggcc gcttcccccc tacccaccca cttccccccc 480 cccgcctctg tgatcgggca tccgagctaa gttgcgtgtc gtccagactc accttcaact 540 cgggccccgt cgcgggcaag accatggtgg tgcagtcgac cagcaccggc ggcgacctgg 600 gcagcaacca gttcgacctc gccatccccg gcggcggcgt gggcatcttc aacggctgcg 660 cctcccagtt cggcggcctc cccggcgccc agtacggcgg catcagcgac cgcagccagt 720 gctcgtcctt ccccgcgccg ctccagccgg gctgccagtg gcgcttcgac 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Tyr Gly Phe Ala Ala Thr Ala 85 90 95 ile Ala Gly Gly ser Glu ser ser Trp cys Cys Ala cys Tyr Ala Leu 100 105 lio Thr Phe Asn ser Gly Pro vai Ala Gly Lys Thr wet vai vai Gin ser 115 120 125 Thr ser Thr Gly Gly Asp Leu Gly ser Asn Gin Phe asd Leu Ala ile 130 135 140 pro Gly Gly Gly Vai Gljj He Phe Asn Gly c^s Ala Ser Gin Phe Glg Gly Leu Pro Gly Ala Gin Tyr Gly Gly xle ser Asp Arg ser Gin Cys 165 170 175 ser ser Phe Pro Ala pro Leu Gin pro Gly cys Gin Trp Arg Phe Asp 180 185 ¥ 190 Trp Phe Gin Asn Ala Asp Asn Pro Thr phe Thr phe Gin Arg vai Gin 195 200 205 Cys Pro ser Glu Leu Thr ser Arg Thr Gly cys l^s Arg Asp Asp Asp Ala ser Tyr Pro Vai Phe Asn Pro Pro ser Vai Pro Gly Leu Asp Gly 225 230 235 240 Ser Asn Pro Gly Asn Pro Thr Thr Thr vai vai Pro Pro Ala Ser Thr 245 250 255 Ser Thr ser Aro Pro Thr Ser ser Thr ser ser pro vai ser Thr Pro 260 265 270 Thr Gly Gin Pro Gly Gly Cys Thr Thr Gin Lys Trp Gly Gin cys Gly 275 280 285 Gly lie Gly iyr Thr Gly cys Thr Asn Cys vai Ala Gly Thr Thr cys 290 295 300 Thr Gin Leu Asn pro Trp Tyr ser Gin Cys Leu 305 310 315 <210> 7 <211> 1663 <212> DNA <213> Chaetonium thernophi 1 um <220> <221> gene <222> (1)..(1663) <220> <221» zntron <222> (1591)..(1654) <40Q> 7 atgatgtata agaagttcgc cgctctcgcc gccctcgtgg ctggcgcctc cgcccagcag 60 gcttgctccc tcaccgctga gaaccaccct agcctcacct ggaagcgctg cacctctggc 120 ggcagctgct cgaccgtgaa cggcgccgtc accatcgatg ccaactggcg ctggactcac 180 accgtctccg gctcgaccaa ctgctacacc ggcaaccagt gggatacctc cctctgcact 240 gatggcaaga gctgcgccca gacctgctgc gtcgatggcg ctgactactc ttcgacctat 300 ggtatcacca ccagcggtga ctccctgaac ctcaagtccg tcaccaagca ccagtacggc 360 accaacgtcg gctcccgtgt ctatctgatg gagaacgaca ccaagtacca gatgttcgag 420 ctcctcggca acgagttcac cttcgatgtc gatgtctcca acctgggctg cggtctcaac 480 ggcgccctct acttcgtttc catggatgct gatggtggca tgagcaaata ctctggcaac 540 aaggctggcg ccaagtacgg taccggctac tgcgatgctc agtgcccgcg cgacctcaag 600 ttcatcaacg gcgaggccaa cgttgggaac tggaccccct cgaccaacga tgccaacgcc 660 ggcttcggcc gctatggcag ctgctgctct gagatggatg tctgggaggc caacaacatg 720 gctactgcct tcactcctca cccttgcacc accgttggcc agagccgctg cgaggccgac 780 acctgcggtg gcacctacag ctctgaccgc tatgctggtg tttgcgaccc tgatggctgc 840 gacttcaacg cctaccgcca aggcgacaag accttctacg gcaagggcat gactgtcgac 900 accaacaaga agatgaccgt cgtcacccag ttccacaaga actcggctgg cgtcctcagc 960 gagatcaagc gcttctacgt ccaggacggc aagatcattg ccaacgctga gtccaagatc 1020 cccggcaacc ccggaaactc cattacccag gagtattgcg atgcccagaa ggtcgccttc 1080 agtaacaccg atgacttcaa ccgcaagggc ggtatggctc agatgagcaa ggccctcgca 1140 ggccccatgg tcctggtcat gtccgtctgg gatgaccact acgccaacat gctctggctc 1200 gactcgacct accccatcga ccaggccggc gcccccggcg ccgagcgcgg tgcttgcccg 1260 accacctccg gtgtccctgc cgagatcgag gcccaggtcc ccaacagcaa cgtcatcttc 1320 tccaacatcc gtttcggccc catcggctcg accgtccctg gccttgacgg cagcaacccc 1380 ggcaacccga ccaccaccgt cgttcctccc gcttctacct ccacctcccg tccgaccagc 1440 agcactagct ctcccgtttc gaccccgact ggccagcccg gcggctgcac cacccagaag 1500 tggggccagt gcggcggtat cggctacacc ggctgcacta actgcgttgc tggcaccacc 1560 tgcactcagc tcaacccctg gtacagccag gtatgtttct cttccccctt ctagactcgc 1620 ttggatttga cagttgctaa catctgctca acagtgcctg taa 1663 <210> 8 <211> 1076 <212> DNA <213> Acremonlun therraophilum <220> <221> gene <222> (1)..(1076) <220> <221> Intron <222> (84)..(142) <220 <221> intron <222> (392)..(514) <400 8 atgcgctcct caccctttct ccgcgcagct ctggctgccg ctctgcctct gagcgcccat 60 gccctcgacg gaaagtcgac gaggtatgcc aatcctcgta cctctgccct ctgtagaaac 120 aagtgaccga ctgcaaagac agatactggg actgctgcaa gccgtcctgc ggctggccgg ISO gaaaggcctc ggtgaaccag cccgtcctct cgtgctcggc cgactggcag cgcatcagcg 240 acttcaacgc gaagtcgggc tgcgacggag gctccgccta ctcgtgcgcc gaccagacgc 300 cctgggcggt caacgacaac ttctcgtacg gcttcgcagc cacggccatc gccggcggct 360 ccgagtccag ctggtgctgc gcctgctatg cgtgagttct ctgcaagccg cttcccaccc 420 ccgctttctg tgcaggccgc ttccccccta cccacccact tecccccccc cgcctctgtg 480 atcgggcatc cgagctaagt tgcgtgtcgt ccagactcac cttcaactcg ggccccgtcg 540 cgggcaagac catggtggtg cagtcgacca gcaccggcgg cgacctgggc agcaaccagt 600 tcgacctcgc catccccggc ggcggcgtgg gcatcttcaa cggctgcgcc tcccagttcg 660 gcggcctccc cggcgcccag tacggcggca tcagcgaccg cagccagtgc tcgtccttcc 720 ccgcgccgct ccagccgggc tgccagtggc gcttcgactg gttccagaac gccgacaacc 780 ecaccttcac cttccagcgc gtgcagtgcc cgtccgagct cacgtcccgc acgggctgta 840 agcgcgacga cgacgccagc tatcccgtct tcaacccgcc tagcggtggc tcccccagca 900 ccaccagcac caccaccagc tccccgtccg gtcccacggg caaccctcct ggaggcggtg 960 gctgcactgc ccagaagtgg gcccagtgcg gcggcactgg cttcacgggc tgcaccacct 1020 gcgtctcggg caccacctgc caggtgcaga accagtggta ttcccagtgt ctgtga 1076 <210 9 <21l> 45 <212> DNA <213> Thermoascus auraatlacus <400 9 attaaccgcg gactgcgcat catgaagctc ggctctctcg tgctc 45 <210 10 <21I> 29 <212> DNA <213> Thermoascus auraatlacus <400 10 aactgaggca tagaaactga cgtcatatt 29 <210 11 <211> 28 <212> DNA <213> chaetori un the rmophi Ί um <400> 11 taatttacgt acctggcctt gacggcag 28 <210> 12 <211> 30 <212> DNA <213» chaetomium thermophilum <400> 12 attaactgca gttacaggca ctgttgagca 30 <210> 13 <211> 42 <212> DNA <213> Acremoniun thermophilum <400» 13 attaaccgcg gactgcgcat catgcgctcc tcaccctttc tc 42 <21Q> 14 <211> 33 <212> ONA <213» Acremoniun thermophilum <400» 14 ttaatctgca gtcacagaca ctgggaatac cac 33 <210» 15 <211> 81 <212» PRT <213» Chaetomium thermophilum <400» 15 vai Pro Gly Leu Asp Gly ser Asn Pro Gly Asn Pro Thr Thr Thr vai 1 5 10 15 vai pro pro Ala Ser Thr ser itir ser Arg Pro Thr Ser ser Thr ser 20 25 30 Ser Pro vai Ser Thr Pro Thr Gly Gin Pro Gly Gly cys Thr Thr Gin 35 40 45 Lys Trp Gly Gin Cys Gly Gly lie Gly Tyr Thr Gly cys Thr Asn cys vai Ala Gly Thr Thr Cys Thr Gin Leu Asn Pro Trp Tyr ser Gin cys 65 70 75 80 Leu REIVINDICAÇÕES

Claims (22)

1. Proteína de fusão de celulase, caracterizada pelo fato de que compreende uma primeira sequência de aminoácidos de um núcleo de en-doglucanase compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, ou um fragmento da mesma compreendendo os aminoácidos 19-334 da SEQ ID NO:2, e uma segunda sequência de aminoácidos compreendendo um espaçador e domínio de ligação de celulose (CBD) compreendendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 15.

2. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a endoglucanase pertence à família de glicosil hidro-lase 5.

3. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que o núcleo da endoglucanase é derivado de Thermoascus aurantiacus, especial mente de T. aurantiacus CBS 116239.

4. Proteína de fusão, de acodo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o espaçador e o CDB são derivados de celobiohidro-lase de Chaetomium thermophilum, especialmente de C. thermophilum CBS 730.95.

5. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4.

6. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o núcleo da endoglucanase é expresso por E. Coli DSM 17326.

7. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que é expressa por E. coli DSM 18159.

8. Polinucleotídeo isolado, caracterizado pelo fato de que é selecionado entre o grupo consistindo de: (a) uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 3, e (b) uma fita complementar de (a).

9. Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que compreende um gene de fusão incluído na cepa de E. coli DSM 18159.

10. Vetor de expressão, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO:3, como definida na reivindicação 8, operavelmente ligada a uma sequência controle.

11. Microrganismo transgênico, caracterizado pelo fato de que contém o vetor de expressão, como definido na reivindicação 10.

12. Microrganismo transgênico, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que é um fungo, preferencial mente do gênero Trichoderma.

13. Método para produzir uma proteína de fusão, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de transformar um microrganismo com o vetor de expressão, como definido na reivindicação 10, codificando a referida proteína de fusão e cultivar o microrganismo transgênico, como definido na reivindicação 11, então obtido sob condições que possibilitem a expressão da referida proteína de fusão, e opcionalmente recuperar e purificar a proteína de fusão produzida.

14. Preparação enzimática, caracterizada pelo fato de que compreende a proteína de fusão, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, e um aditivo ou componentes de meio de cultura.

15. Processo para tratar material celulósico, caracterizado pelo fato de que compreende prover material celulósico, contatar o material celulósico com a proteína de fusão, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, ou a preparação enzimática, como definida na reivindicação 14, e obter material celulósico tratado.

16. Processo, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o material celulósico é material têxtil, plantas usadas em ração animal, ou polpa derivada de madeira ou fibra secundária.

17. Processo, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o material celulósico é material vegetal para extração de óleo.

18. Processo de esmerilhamento, caracterizado pelo fato de que compreende desengomar tecido denim ou vestuário com alfa-amilase; contatar o vestuário ou tecido denim desengomado com uma proteína de fusão de celulase, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, ou uma preparação enzimática, como definida na reivindicação 10, para promover abrasão; e pós-tratar o vestuário ou tecido denim desengomado e abrasado com lavagem e enxaguamento.

19. Processo de bioacabamento, caracterizado pelo fato de que compreende pré-lavar materiais têxteis como tecidos, vestuário, ou fio; contatar os materiais têxteis pré-lavados com uma proteína de fusão de celulase, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, ou a preparação enzimática, como definida na reivindicação 10, para promover abrasão; e inativar a proteína de fusão de celulose ou a preparação enzimática.

20. Composição de detergente, caracterizada pelo fato de que compreende a proteína de fusão, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, e auxiliares de detergente.

21. Ração animal, caracterizada pelo fato de que compreende a proteína de fusão, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, e material vegetal.

22. Cepa de Escherichia coli, caracterizada pelo fato de que têm número de acesso DSM 18159.