BRPI0923915B1 - endoglucanases fúngicas, seu método de produção, processo para tratar material celulósico, composição detergente,alimento animal, cepa de e. coli, vetor de expressão, e microrganismo transgênico - Google Patents

Abstract

endoglucanases fúngicas, seu método de produção, processo para tratar material celulósico, composição detergente, alimento animal, cepa de e. coli, vetor de expressão, e microrganismo transgênico a invenção refere-se a novas endoglucanases fúngicas com substancial desempenho em temperaturas baixas. as endoglucanases são convenientemente produzidas por tecnologia recombinante, e meios para sua produção são descritos. as endoglucanases são usadas para tratar material celulósico, especialmente na indústria têxtil, por exemplo, em bioacabamento ou biotingimento. elas podem também ser usadas em detergentes, em alimentação de animais e/ou em polpa e indústria de papel ou produção de bioetanol.

Description

CANASES FÚNGICAS, SEU MÉTODO DE PRODUÇÃO, PROCESSO PARA TRATAR MATERIAL CELULÓSICO, COMPOSIÇÃO DETERGENTE, ALIMENTO ANIMAL, CEPA DE E. COLI, VETOR DE EXPRESSÃO, E MI5 CRORGANISMO TRANSGÊNICO.

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se a novas endoglucanases fúngicas, sua produção e meios para produção das mesmas. A invenção ainda se refere a preparações de enzimas compreendendo pelo menos uma nova endoglu10 canase como também aos processos para tratar material celulósico com isso. Ainda mais, a invenção refere-se às composições de detergente e alimentação de animais, compreendendo as endoglucanases.

Antecedentes da Invenção

As celulases estão entre as enzimas mais amplamente usadas na 15 indústria. Elas são geralmente aplicadas na indústria têxtil, indústria de detergente, indústria de polpa e papel, indústria de alimentação e alimentos, incluindo assar, e na hidrólise de material lignocelulósico para, por exemplo, produção de bioetanol etc. O uso prático de celulases é impedido pela natureza das composições de celulase, que muitas vezes são misturas de enzimas 20 tendo uma variedade de atividades e especificidades de substrato. Por este motivo, têm sido feito esforços para obter celulases tendo somente as atividades desejadas. As propriedades únicas de cada celulase as tornam um tanto mais apropriadas para certos propósitos do que para outros.

As celulases em tratamento de tecido atacam as cadeias de mo25 léculas de celulose que formam as fibras de algodão, dessa maneira afetando as características do tecido.

Na indústria têxtil uma aparência desbotada (“stone washed) ou desgastada tem sido de interesse dos produtores de brim (denim) nos últimos anos. A lavagem com pedra tradicional, com pedra-pome, reduz a resistência 30 do tecido e sobrecarrega os aparelhos de lavagem de roupa. A tendência tem sido em direção aos processos de acabamento de denim enzimáticos e as celulases têm substituído ou estão sendo usadas junto com pedra-pome para

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1a/38 dar ao tecido a sua aparência de “usado como desejado. Tratamentos de enzima controlados resultam em menos dano para o vestuário e para as máquinas e eliminam a necessidade de descartar as pedras.

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Adicionalmente, a indústria têxtil usa celulases em bioacabamento, isto é, para criar melhoramento permanente à presença de pequenas bolhinas (depiliing), e para melhorar a resistência às pequenas bolhinhas (pilling), clarear a estrutura da superfície através da redução de felpas (fuzz), melhorar o manuseio têxtil, como a maciez, suavidade e uma sensação sedosa, melhorar a capacidade de vestir e cores mais brilhantes do têxtil e melhorar a absorção da umidade.

Celulases compreendem um domínio / núcleo catalítico (CD) que expressa a atividade de celulase. Além disso, para o domínio catalítico a molécula de celulase pode compreender um ou mais domínios de ligação de celulose (CBDs), também denominados como domínios / módulos de ligação de carboidratos (CBD/CBM), que podem estar localizados nos terminais Nou C- do domínio catalítico. As CBDs têm atividade de ligação de carboidrato e facilitam a ação enzimática nos substratos sólidos. O núcleo catalítico e o CBD estão tipicamente conectados através de uma região de ligante flexível e altamente glicosilado.

Celulases que atacam principalmente na superfície da fibra são especialmente úteis em desbotar de denim tingida com corante índigo, uma vez que o corante está localizado na superfície da fibra. Celulases aplicadas em tratamento denim são usualmente divididas em dois grupos principais: celulases ácidas e neutras. Celulases ácidas tipicamente operam em pH 4,05,5 e as celulases neutras, na faixa de pH 6-8. Celulases ácidas são especialmente usadas em bioacabamento (ausência de pequenas bolinhas no tecido) e também em tratamento de denim (biotingimento) enquanto as celulases neutras são tipicamente usadas em aplicações de denim.

Endoglucanases (EGs) são um dos três tipos de celulases geralmente necessárias para a conversão biológica de celulose para glicose. Algumas endoglucanases de ocorrência natural têm um domínio de ligação de celulose (CBD), enquanto outras não têm. Endoglucanases são largamente usadas em indústria têxtil, detergente, bioetanol e polpa e papel.

Celulases incluindo endoglucanases podem ser classificadas em várias famílias de glicosil hidrolase de acordo com sua sequência principal,

3/38 apoiada pela análise da estrutura tridimensional de alguns membros da família (Henrissat 1991, Henrissat and Bairoch 1993, 1996). Por exemplo, famílias de glicosil hidrolase 5, 7, 12 e 45 contêm endoglucanases. A maioria das celulases têxteis ácidas pertencem à família 5, enquanto que a maioria das celulases têxteis neutras são de família 12 ou 45.

O amplo espectro de usos industriais para endoglucanases tem estabelecido uma necessidade de produtos de endoglucanase comerciais mostrando o desempenho desejado em condições desejadas como faixas de pH e temperatura.

A maioria das enzimas usadas industrialmente trabalham melhor em temperaturas elevadas, usualmente cerca de >50°C, mas por razões de economia de energia, melhor rapidez de tingimento e redução de encolhimento de vestuários, existe uma necessidade de enzimas com bom desempenho em níveis de temperatura mais baixos, isto é, <50°C, por exemplo cerca de 30 a 40°C, ou mesmo 20 a 40°C. Tais enzimas ativas a frio foram descritas, por exemplo, em bactérias, especialmente em Bacillus. Entretanto, a produção de enzimas bacterianas para aplicações industriais é complicada e laboriosa em comparação à produção de enzimas fúngicas. Existe ainda muito pouco conhecimento a cerca das possíveis endoglucanases fúngicas ativas a frio.

Segundo o conhecimento nenhuma endoglucanase da família 45 atuando a frio foi até agora descrita.

Uma endoglucanase da família de Cel45 é descrita em US 5.610.129, que descreve composições de inibção de corante contendo uma Humicola insolens kd43 celulase. Suas propriedades térmicas não estão descritas.

Enzimas Cel45 de Gibberella zeae não foram propostas para serem usadas em acabamento têxtil.

US 7.256.032 descreve celulases de Cel45 tendo bom desempenho em acabamento têxtil. O desempenho em acabamento de denim é ideal a 60°C, e a temperatura mais baixa medida é 40°C com menos de 50% de atividade ideal.

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US2007/070003 descreve preparações de celulase desempenhando bem, por exemplo, em composições de lavagem de roupa, biopolimento de têxteis fabricados recentemente, e provendo uma aparência desgastada para o tecido celulósico. Nenhuma das enzimas descritas mostra um desempenho vantajoso em temperaturas baixas.

Desta maneira, existe uma necessidade contínua de celuloses novas e vantajosas tendo propriedades desejadas e perfis térmicos. A presente invenção atende esta necessidade.

Breve Descrição da Invenção

A presente invenção agora provê novas endoglucanases da família cel45, com um perfil térmico único mostrado como tendo bom desempenho também em temperaturas baixas. As propriedades térmicas únicas significam que nenhuma diminuição notável no desempenho pode ser visto quando a temperatura está abaixo de 50°C, por exemplo, cerca de 40°C, cerca de 30°C ou até cerca de 20°C. As endoglucanases são úteis em diferentes aplicações de celulase tais como tratamento de tecidos, especialmente tratamento e evitando a presença de pequenas bolinhas (depiiling) de denim. Ao contrário do anteriormente descrito, enzimas que evitam o aparecimento de bolinhas no tecido, que geralmente são celulases acídicas, as novas endoglucanases desempenham bem também em pH relativamente neutro. Isto possibilita tratamento de bioacabamento simultaneamente com tintura, levando a economias consideráveis. Além disso, a firmeza da cor é muitas vezes melhor em condições neutras.

A presente invenção provê um polipeptídeo de endoglucanase fúngico, que pertence à família 45 de glicosil hidrolase, e que mostra substancial desempenho em temperaturas baixas. A invenção ainda provê uma preparação de enzima compreendendo a dita endoglucanase, e composições de detergente e alimentação de animais, compreendendo a dita enzima ou preparação de enzima.

Em particular a invenção é dirigida para endoglucanases que compreendem uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 65% de identidade de sequência para SEQ 5 ID NO: 13, pelo menos 48% de identi5/38 dade de sequência para SEQ ID NO: 15, pelo menos 87% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 17, pelo menos 62% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 19, pelo menos 59% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 21 ou pelo menos 49% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 23, ou um fragmento enzimaticamente ativo das mesmas.

A invenção é ainda dirigida para um polinucleotídeo isolado selecionado do grupo consistindo em:

a) uma sequência de nucleotídeo tendo SEQ ID NO: 12, 14, 16, 18, 20 ou 22, ou uma sequência codificando o polipeptídeo de endoglucanase descrito acima,

b) uma faixa complementar de a) ou

c) uma sequência que é degenerada como resultado do código genético para qualquer uma das sequências de a) ou b).

A invenção é ainda adicionalmente dirigida para um vetor de expressão compreendendo o dito polinucleotídeo, uma célula hospedeira compreendendo o dito vetor de expressão, e uma cepa de E. coli tendo número de acesso DSM 18916, DSM 19171, DSM 19173, DSM 18915, DSM 18917, ou DSM 19170.

Ainda adicionalmente a invenção provê um método para a produção do polipeptídeo de endoglucanase, compreendendo as etapas de transformar uma célula hospedeira com um vetor de expressão codificando o dito polipeptídeo, e culturando a dita célula hospedeira sob condições que permitem a expressão do dito polipeptídeo, e opcionalmente recuperando e purificando o dito polipeptídeo.

Finalmente a invenção provê um processo para tratar material celulósico, em que o dito processo compreende contatar um material celulósico com o polipeptídeo de endoglucanase ou preparação de enzima da invenção.

Modalidades específicas da invenção são mencionadas nas reivindicações dependentes. Outros objetivos, detalhes e vantagens da presente invenção se tornarão evidentes a partir dos desenhos a seguir, da descrição detalhada e dos exemplos. Deve ficar compreendido, entretanto, que as

6/38 modalidades dadas na descrição, desenhos e nos exemplos são para propósitos ilustrativos somente, e que várias mudanças e modificações são possíveis dentro do escopo das reivindicações.

Breve Descrição dos Desenhos

Figura 1 é um quadro esquemático dos cassetes de expressão usados na transformação de protoplastos Trichoderma reesei parar superproduzir as proteínas Cel45 recombinantes.

Figura 2A mostra o pH ideal das preparações de proteínas Cel45A recombinantes, e 2B mostra a estabilidade térmica das preparações de proteínas Cel45A recombinantes.

Figuras 3A-E mostram os perfis de temperaturas das novas preparações de Cel45 comparadas às preparações de Cel45 comerciais no tratamento de denim.

Figuras 4A-B mostram o desempenho das novas preparações de Cel45 em pH diferente no tratamento de denim.

Figura 5 mostra o desempenho de Gp_RF6293_Cel45 em tratamento de bioacabamento (sem felpa) a 40°C em comparação à amostra de controle sem enzima.

Descrição Detalhada da Invenção

A invenção se baseia em estudos, em que a coleta de cultura fúngica foi rastreada para atividade celulolítica de temperatura baixa. As cepas fúngicas foram cultivadas a 20°C por 3 a 7 dias usando vários meios de produção. Os sobrenadantes foram recuperados, e a atividade celulolítica contra carboximetilcelulose (CMC) e hidroxietilcelulase (HEC) em temperaturas de 30°C e 50°C foi testada para rastrear perfis de temperaturas baixas. As cepas mais favoráveis foram ainda testadas em aplicações de biotingimento em pequena escala depois de cultivar a 20°C por 4 a 7 dias. Depois de rastreamento preliminar, quatro cepas foram selecionadas para construção de bibliotecas genômicas, e as bibliotecas foram adicionalmente rastreadas para genes de cel45 com sondas ampliadas usando iniciadores degenerados. Clones de bacteriófagos positivos foram subclonados para vetores bacterianos e confirmados por sequenciamento, antes da deposição em

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DSMZ. Para a produção das enzimas Cel45 os genes codificando atividades desejadas foram fundidos para o promotor de Trichoderma reesei cbh1/cel7A. O término da transcrição foi garantido pelo terminador T. reesei cbh1/cel7A, e um marcador amdS foi usado para rastrear clones positivos. Cassetes de expressão linear foram isolados da cadeia principal do vetor e transformados em protoplastos T. reesei tendo as principais celulases deletadas. Transformantes purificados foram culturados por 7 dias em meios de indução de celulases e a atividade de endoglucanase foi testada da sobrenadante de cultura. As propriedades térmicas e de pH foram também testadas. Material para aplicação em grande escala foi obtido por cultivos de biorreator de laboratório a 28°C durando por 3-4 dias seguidos pela filtração e concentração, quando necessário.

Os sobrenadantes de cultura foram testados em tratamento de denim em diferentes temperaturas usando duas preparações de cel45 comerciais como referências em uma máquina de lavar. O efeito de biotingimento resultante foi avaliado usando medição de refletância de cor. Surpreendentemente foi descoberto que os perfis de temperaturas medidas na aplicação foram diferentes daqueles recebidos em caracterização primária em tubos de teste. Em adição, as propriedades de pH das amostras foram testadas em aplicação de denim. Ainda, o efeito de impedir a presença de pequenas bolinhas/impedir as felpas em fios de algodão de lã merino (fleece) foi testado em uma máquina lavadora com diferentes dosagens de enzima e comparado a uma amostra da técnica anterior. Surpreendentemente, a superfície livre de felpa em temperatura baixa foi obtida usando uma dosagem menor do que poderia ser esperado com base nos testes em tratamento de denim.

A presente invenção provê novos polipeptídeos fungais de endoglucanase da família 45 de glicosil hidrolase, com substancial desempenho a temperaturas baixas. Polipeptídeo e proteína, como usados aqui no presente, são sinônimos.

Fúngico neste contexto significa que a endogiucanase ou o polinucleotídeo codificando-o pode ser derivado de um fungo, e especialmente

8/38 de um fungo filamentoso, como Geomyces ou Fusarium. De acordo com uma modalidade específica da invenção a endoglucanase é derivada de G. pannorum ou F. cfequiseti, mais preferivelmente de G. pannorum RF 6293 (CBS 119567), F. cf. equiseti RF6318 (CBS 119568), G. pannorum RF6546 (CBS 119958), ou G. pannorum RF6608 (CBS 119962).

O termo derivado de em conexão com uma fonte de microorganismos significa que o polipeptídeo pode naturalmente ser produzido pela dita fonte de micro-organismos específica, ou o polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo pode ser isolado da dita fonte de micro-organismos, e opcionalmente expresso na célula hospedeira em que o polinucleotídeo, ou uma versão sintetizada do mesmo, possivelmente usando códons alternativos, da dita fonte de micro-organismos codificando o polipeptídeo foi introduzida. Entretanto, isto não exclui modificações menores da sequência, por exemplo, por substituição, deleção, e/ou inserção de um ou uns poucos aminoácidos/nucleotídeos, enquanto a atividade enzimática da proteína codificada e secretada é retida.

Endoglucanase (EG) em conexão com a presente invenção se refere a enzimas classificadas como E.C. 3.2.1.4. Elas são 1,4-beta-D-glucan

4-glucanoidrolases e endoidrólise por catálise de ligações 1,4-beta-D-glicosídicas em polímeros de glicose como celulose. Algumas endoglucanases podem também hidrolisar, por exemplo, 1,4-ligações em beta-D-glucanos também contendo 1,3-ligações. Elas podem, desta maneira, ser também classificadas como endo-1,3(4)-beta-glucanases (E.C. 3.2.1.6). Desse modo, uma enzima pode catalisar reações em diversos substratos e pode pertencer a múltiplas classes. As endoglucanases da invenção podem, opcionalmente, conter uma sequência de sinais, e uma ou mais celuloses ligando domínios (CBDs) ligados ao domínio / núcleo catalítico (CD).

A família 45 de glicosil hidrolase se refere à família de glicosil hidrolase como definido por Henrissat 1991, e Henrissat e Bairoch 1993, 1996, que são incorporadas aqui no presente por referência. O gene codificando a família de celulase 45 é chamado ce!45 e a proteína codificada é chamada Cel45.

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As endoglucanases da invenção mostram substancial desempenho em temperatura baixa. Substancial desempenho neste contexto significa que as enzimas mostram excelente desempenho quando aplicadas em, pelo menos, um tipo de processo de aplicação de celulase como, por exemplo, biotingimento e/ou bioacabamento de têxteis, ou na lavagem. Os perfis de temperatura únicos das novas endoglucanases podem ser ilustrados por sua proporção de 30:50 em aplicação de denim, que indica desempenho relativo (%) a 30°C comparado a 50°C. Preferivelmente a proporção de 30:50 é pelo menos 72%, mais preferivelmente pelo menos 80%, e mais preferivelmente pelo menos 90% ou 95%. Alternativamente o perfil de temperatura pode ser ilustrado por uma proporção de 40:OT, que significa desempenho relativo (%) a 40°C comparado à temperatura ideal. Preferivelmente a proporção de 40:OT é pelo menos 80%, mais preferivelmente pelo menos 90%, e mais preferivelmente pelo menos 95%.

Ativo frio ou temperatura baixa, como usados aqui no presente, se referem a uma temperatura de <50°C, especialmente <45°C, preferivelmente <40°C, incluindo <30°C.

De acordo com uma modalidade da invenção, a endoglucanase compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 65% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 13, pelo menos 48% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 15, pelo menos 87% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 17, pelo menos 62% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 19, pelo menos 59% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 21 ou pelo menos 49% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 23, ou um fragmento enzimaticamente ativo da mesma. Preferivelmente a endoglucanase compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90%, preferivelmente pelo menos 95% e mais preferivelmente pelo menos 98% ou 99% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 13, 15, 17, 19, 21 ou 23, ou um fragmento enzimaticamente ativo da mesma.

Como usado no presente contexto o termo identidade se refere à identidade global entre duas sequências de aminoácidos comparadas uma com a outra, a partir do primeiro aminoácido codificado pelo gene corres10/38 pondente para o último aminoácido. Para os propósitos da presente invenção, a identidade é preferivelmente determinada por meio de programas de computador conhecidos usando algoritmos padrão. Um exemplo de tal programa é Clone Manager Suite, um programa que inclui a parte do programa Align Part e é vendido por Scientific & Educational Software, Durham, NC, USA. De acordo com a presente invenção, a versão do programa Clone Manager 7 Align Plus 5 incluindo as funções Comparar Duas Sequências/Global/Comparar sequências de DNA foi especialmente usada para determinar o grau de identidade. Neste caso, os algoritmos disponíveis das fontes a seguir foram usados: Hirschberg, D.S. (1975) A linear space algorithm for computing longest common subsequences, Commun. Assoe. Comput. Mach. 18: 341-343; Myers, E.W. and W. Miller. (1988) Optimal alignments in linear space, CABIOS 4:1, 11-17; Chao, K-M, W.R. Pearson and W. Miller. (1992) Alinhando duas sequências dentro de uma ligação diagonal especificada, CA-BIOS 8:5, 481487. O homem versado na técnica está ciente do fato de que os resultados são comparativos somente quando alinhando domínios correspondentes da sequência. Consequentemente comparação de, por exemplo, sequências de celulase incluindo CBD ou sequências de sinal com sequências sem aqueles elementos, são excluídas como não sendo significativas.

Fragmento enzimaticamente ativo se refere à parte de uma sequência de aminoácidos específica que é longa o suficiente para ter a atividade enzimática desejada. Em outras palavras, um fragmento pode ser, por exemplo, somente a parte madura do polipeptídeo, ou mesmo uma subsequência da parte madura. Ele pode ou não pode conter um ligante e domínio de CBD. Mais especificamente, atividade enzimática se refere à atividade de celulase que tem capacidade catalítica para hidrolisar celulose ou derivados da mesma, tal como atividade de endoglucanase ou betaglucanase. Em adição à atividade de endoglucanase e/ou betaglucanase, algumas das celulases podem ainda ter atividade de hemicelulase e/ou xilanase. A atividade enzimática pode ser determinada como descrito no Exemplo 1.

Os polinucleotídeos da invenção podem ser DNA ou RNA. De

11/38 acordo com uma modalidade da invenção as endoglucanases são codificadas por um polinucleotídeo tendo SEQ ID NO: 12, 14, 16, 18, 20 ou 22, ou um fragmento do mesmo, longo o suficiente para codificar uma endoglucanase enzimaticamente ativa. Preferivelmente as endoglucanases são codificadas por um polinucleotídeo similar àquele transportado por E. coli DSM 18916, DSM 19171, DSM 19173, DSM 18915, DSM 18917, ou DSM 19170.

As endoglucanases da invenção são preferivelmente proteínas recombinantes. Elas são convenientemente preparadas pela tecnologia de DNA recombinante geralmente conhecida em hospedeiro heterólogo ou homólogo. Preferivelmente, a endoglucanase é superexpressa em um hospedeiro fúngico. Em poucas palavras, o polinucleotídeo codificando a endoglucanase é clonado e inserido em um vetor de expressão, transformado em uma célula hospedeira e expresso.

Um vetor de expressão é um plasmídeo de clonagem ou vetor capaz de expressar DNA codificando as proteínas de endoglucanase, depois da transformação em um hospedeiro desejado. Quando um hospedeiro fúngico é usado, o gene de interesse é preferivelmente provido para um hospedeiro fúngico como parte de uma clonagem ou veículo de expressão que integra no cromossoma fúngico, ou permite o gene de interesse integrar no cromossoma hospedeiro. Outras sequências que são parte do veículo de clonagem ou veículo de expressão podem também ser integradas com o dito DNA, durante o processo de integração. Além disso, em fungos, o vetor de expressão ou partes do mesmo pode ser alvejado em locais predeterminados. Alternativamente, o gene desejado pode ser provido como um plasmídeo autonomamente replicando.

O DNA codificando proteínas de endoglucanase é preferivelmente colocado sob o controle de (isto é, operacionalmente ligado a) certas sequências de controle, tais como sequências de promotor providas pelo vetor. Mediante transformação, essas sequências de controle integram no genoma hospedeiro com o gene de interesse. Alternativamente, as sequências de controle podem ser aquelas no sítio de integração.

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As sequências de controle de expressão de um vetor de expressão irão variar dependendo de se o vetor é projetado para expressar um certo gene em um hospedeiro procariótico ou em um eucariótico. As sequências de controle de expressão podem conter elementos reguladores transicionais tais como promotores, elementos de intensificação, e sequências de terminação transicional, e/ou elementos reguladores traducionais, tais como iniciação traducional e sítios de terminação. Uma molécula de polinucleotídeo, como o DNA, é dita ser capaz de expressar um polipeptídeo, se ela contém sequências de controle de expressão que contêm informação reguladora transicional, e tais sequências são operavelmente ligadas à sequência de nucletídeo, que codifica o polipeptídeo.

Uma ligação operável é uma ligação em que uma sequência é conectada a uma sequência (ou sequências) reguladora de tal maneira como para colocar a expressão da sequência sob a influência ou controle da sequência reguladora. Duas sequências de DNA (tal como uma sequência de região promotora ligada ao terminal 5' da proteína codificando a sequência) são ditas como sendo operacionalmente ligadas, se a função do promotor resulta em transcrição.

Os vetores da invenção podem ainda compreender outros elementos reguladores ligados operadamente, como as sequências de intensificadores.

Em uma modalidade preferida, transformantes geneticamente estáveis são elaborados, desta maneira o DNA codificando as proteínas é integrado no cromossoma hospedeiro pela transformação com um vetor, que pode abrigar sequências promovendo a integração do dito vetor no cromossoma.

Células que têm DNA de estabilidade integrada codificando as proteínas de endoglucanase em seus cromossomas podem ser selecionadas, por exemplo, marcado(es) introduzido(s), homólogos ou heterólogos, que levam em conta a seleção das células hospedeiras que contêm o vetor de expressão no cromossoma, por exemplo o marcador pode prover resistência biocida, por exemplo, resistência aos antibióticos, ou metais pesados,

13/38 tais como cobre, ou marcadores complementando uma mutação auxotrófica no cromossoma hospedeiro, e similares. O marcador selecionável pode, por exemplo, ser um gene de seleção diretamente ligado às sequências de genes de DNA a serem expressas, ou introduzidas na mesma célula por cotransformação. Também outros sistemas de seleção podem ser usados.

Uma vez que o vetor de expressão contendo o DNA que codifica a endoglucanase está preparado, ele é introduzido em uma célula hospedeira apropriada por qualquer de uma variedade de meios, incluindo transformação como conhecida na técnica. Depois da transformação, as células recipientes são usualmente criadas em um meio seletivo apropriado, que seleciona para o crescimento de células transformadas.

Expressão apropriada e sistemas de hospedeiro de produção são, por exemplo, os sistemas de produção desenvolvidos para hospedeiros fúngicos Trichoderma (EP 244 234), ou Aspergillus, tais como A. oryzae ou A. niger(\NO 97/08325 e WO 95/33386, Patente U.S. No. 5.843.745, Patente U.S. No. 5.770.418), ou o sistema de produção desenvolvido por Fusarium, como F. oxysporum (Maiardier et a/., 1989) ou Chrysosporium lucknowense. De acordo com uma modalidade preferida da invenção cepas hospedeiras de celulase e/ou hemicelulase e/ou protease parcialmente deficientes podem ser usadas. Sistemas de produção apropriados desenvolvidos para bactérias incluem um sistema de produção desenvolvido para Bacillus, por exemplo, B. subtilis, B. licheniformis, B. amyloliquefaciens ou para E. coli, ou para um actinomiceto Streptomyces. Sistemas de produção apropriados desenvolvidos para leveduras são sistemas desenvolvidos para Saccharomyces, Shizosaccharomyces, Pichia pastoris ou Hansenula. Sistemas de produção em outros micróbios, incluindo micróbios fermentativos consolidados para produção de bioetanol ou em células de mamíferos ou em plantas, são também possíveis.

A expressão de sequência(s) de genes clonados resulta na produção da proteína desejada, ou na produção de um fragmento desta proteína. Esta expressão pode ter lugar de uma maneira contínua nas células transformadas, ou de uma maneira controlada.

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Para obter as preparações de enzimas da invenção, os hospedeiros tendo as propriedades desejadas (isto é, hospedeiros capazes de expressar quantidades economicamente viáveis das proteínas de endoglucanase) são cultivados sob condições apropriadas, e as enzimas desejadas são preferivelmente secretadas dos hospedeiros no meio de cultura, e opcionalmente recuperadas do dito meio de cultura pelos métodos conhecidos na técnica. Preferivelmente, o hospedeiro para tal produção é um fungo filamentoso, tal como Trichoderma ou Aspergillus, e especialmente T. reesei.

Como usado no presente contexto, a preparação de enzima se refere a qualquer produto de enzima, que contém pelo menos uma das novas endoglucanases descritas aqui no presente. Desta maneira, tal preparação de enzima pode ser em um meio de cultura usado ou filtrado. Meio de cultura usado significa o meio de cultura do hospedeiro compreendendo as enzimas produzidas. Preferivelmente, as células hospedeiras são separadas do dito meio depois da produção, se desejado, tais preparações podem ser liofilizadas ou concentradas de outra maneira por atividade enzimática e/ou estabilizadas para armazenamento. Se requerido, uma enzima desejada pode ser isolada e adicionalmente purificada de acordo com os métodos convencionais, tais como filtração, extração, precipitação, cromatografia, cromatografia de afinidade, eletroforese, ou similares.

Entretanto, é uma vantagem da invenção que o meio de cultura com ou sem células hospedeiras pode ser utilizado como uma preparação de enzima como aquelas sem purificação, porque as proteínas de endoglucanase podem ser secretadas no meio de cultura, e elas exibem atividade nas condições de ambiente do meio de cultura gasto. As preparações de enzima são muito econômicas para prover e usar, porque o isolamento de uma enzima específica do meio de cultura não é necessário.

Em adição a uma ou mais proteínas de endoglucanase, as preparações de enzima podem compreender uma ou mais outras enzimas, que podem ser, por exemplo, outras celulases, amilases, lipases, proteases, hemicelulases, xilanases, pectinases e/ou oxidases tais como lacases, peroxidases e catalases. Alternativamente, antes, durante ou depois do tratamento

15/38 com a proteína de endoglucanase outro tratamento com enzima pode ser realizado. O tratamento com enzima pode compreender, por exemplo, um ou mais tratamentos com amilase (por exemplo, para desdimensionamento de denim), um ou mais tratamentos de celulase e/ou um ou mais tratamentos com peroxidase e/ou laccase. Depende da aplicação de quais outras enzimas são incluídas na preparação de enzima ou usadas no tratamento com enzima.

Em adição à proteína de endoglucanase, a preparação de enzima pode conter aditivos, tais como estabilizadores, tampões, conservantes, tensoativos e/ou componentes de meio de cultura. Aditivos preferidos são tais, que são comumente usados em preparações de enzimas destinadas à aplicação, em que a preparação de enzima é usada.

As preparações de enzima podem ser providas como um líquido ou como um sólido, por exemplo, como um pó seco ou granular, especialmente grânulos sem polvilhar, ou um líquido estabilizado. É previsto que as preparações de enzima podem ser ainda enriquecidas para satisfazer os requisitos de uma utilidade específica em várias aplicações, por exemplo, na indústria têxtil. Uma mistura de atividades de enzima secretadas por um hospedeiro pode ser vantajosa em uma aplicação industrial particular, por exemplo, em bioacabamento e biotingimento.

As proteínas de endoglucanase e as preparações das mesmas são úteis, por exemplo, em aplicações têxteis, alimentares e alimento, por exemplo, aplicações para assar, em hidrólise de biomassa, por exemplo, em produção de bioetanol, e em óleo de planta, detergente, e indústria de papel e polpa. Elas podem ser usadas para tratar qualquer material celulósico, tal como material têxtil, plantas ou material de origem de planta, usado em alimento ou alimentação de animal, material de planta para a extração de óleo, ou polpa ou fibra secundária mecânica ou química derivada de madeira. Elas podem também ser adicionadas em detergentes, por exemplo, para melhorar as propriedades de cuidados com tecido por antidepilação, antiescurecimento, clarificação da cor e amaciamento, e para melhorar o efeito de limpeza têxtil, por exemplo, remoção de sujeira. As composições de detergente

16/38 ainda normalmente contêm auxiliares, tais como agentes de superfície ativos (tensoativos aniônicos, não-iônicos, catiônicos e anfolíticos), integradores e outros ingredientes opcionais tais como agentes de antirredeposição e de suspensão do solo, branqueadores ópticos, agentes alvejantes, corantes e pigmentos e hidrolases.

No presente contexto material celulósico se refere a qualquer material compreendendo celulose, ou derivados das mesmas, como um componente significativo. O material celulósico é contatado com uma quantidade eficaz da proteína sob condições apropriadas, como pH apropriado, e temperatura, e a reação é deixada para continuar por um tempo suficiente para a reação enzimática ter lugar. As endoglucanases descritas são preferivelmente usadas em uma faixa de temperatura de cerca de 20-50°C, e mais preferivelmente cerca de 30-50°C. Temperaturas úteis são <50°C, por exemplo <45°C, ou em alguns casos <40°C, ou mesmo <30°C. Uma faixa de pH apropriada é cerca de 3-9, preferivelmente cerca de 4-8, e especialmente cerca de 5-6,5.

As endoglucanases são especialmente úteis no tratamento de materiais têxteis, como tecidos e vestuário ou fio de lã. O material têxtil pode ser fabricado de celulose natural contendo fibras ou celulose feita pelo homem contendo fibras ou misturas das mesmas, ou uma blenda de fibras sintéticas e celulose contendo fibras. Preferivelmente, a celulose contendo material é algodão, especialmente denim. Por denim se quer dizer, em conexão com esta invenção, tecido de denim, usualmente vestuário de denim, particularmente jeans. Vantajosamente o denim é denim tingido de índigo. Denim pode também ser tratado com derivados de índigo ou com índigo junto com outro corante, por exemplo, denim tingido com índigo com fundo de enxofre.

As endoglucanases descritas são especialmente úteis na indústria têxtil preferivelmente em biotingimento e bioacabamento.

A capacidade de desbotar tem três etapas: desengomagem, fricção e depois do tratamento. A primeira etapa, o processo de desengomar, é normalmente o primeiro tratamento úmido de jeans e significa remoção de

17/38 goma e outros agentes de tamanho, usualmente aplicados, para urdir os fios a fim de evitar danos durante o processo de tecelagem. Alfa-amilases são usadas para remover agentes de tamanho à base de goma para processamento de umidificação melhorado e uniforme. Depois de desengomar, os jeans são normalmente enxaguados com água ou passados diretamente para a etapa de fricção.

A segunda etapa, fricção, pode ser realizada com enzimas ou pedra-pome ou ambas. Em todos os casos a ação mecânica é necessária para remover o corante, e o tratamento é usualmente realizado em máquinas de lavar roupa, como lavadoras de tambor. O termo friccionado significa a aparência do tecido de denim, quando ele foi tratado por enzimas de celulase ou pedras, ou ambas. Expressões sinônimas são aparência de desbotado ou aparência de usado. Como resultado da remoção de corante irregular existem contrastes entre áreas tingidas e áreas das quais o corante foi removido.

A fricção é geralmente seguida por uma terceira etapa, depois do tratamento, que inclui etapas de lavagem e enxágue durante as quais detergentes, branqueadores ópticos, agentes alvejantes ou amaciantes podem ser usados. Depois do tratamento enzimático, a reação deve ser interrompida a fim de evitar danos dos materiais tratados, por exemplo, pela temperatura e/ou inativação do pH, o último compreendendo um enxágue completo e/ou lavagem com detergente. Isto garante que a resistência mecânica da fibra não seja adicionalmente comprometida pela presença contínua da enzima.

Como usado no presente contexto, a expressão biotingimento do tecido ou vestuário significa o uso de enzimas no lugar de, ou em adição a, pedras-pomes para o tratamento de tecido ou vestuário, especialmente denim.

Como especificado acima, o tratamento com celulase pode substituir completamente o tratamento com pedras-pomes. Entretanto, o tratamento com celulase pode também ser combinado com tratamento de pedra-pome, quando se deseja produzir um acabamento pesadamente friccio18/38 nado.

Ainda, as endoglucanases são úteis no bioacabamento de tecidos e vestuários. Bioacabamento (também chamado impedir a presença de bolinhas de fibras embaraçadas, defuzzing, depilação ou biopolimento) se refere ao uso de enzimas em uma hidrólise controlada de fibras celulósicas a fim de modificar a superfície do tecido ou fio de uma maneira que permanentemente evita a tendência para formação de felpas, melhora o manuseio do tecido como maciez e suavidade, clareia a estrutura da superfície reduzindo frisado, que resulta em clareamento de cores e pode também melhorar a capacidade de fazer dobras de cores, absorção de umidade e a capacidade de tingir o tecido.

Usos adicionais incluem o uso em composições de detergente para melhorar as propriedades de tratar o tecido por antidepilação, anticinza, clarificação da cor e maciez, e para melhorar o efeito de limpeza têxtil, por exemplo, remoção de sujeira.

Depilling enzimático pode ser realizado em qualquer estágio durante o processamento de umedecimento do têxtil, preferivelmente depois do desdimensionamento opcional e/ou branqueamento, e condições similares como na bioesmerilhação (biostoning) podem ser usadas. Os têxteis também em forma de vestuário podem ser tratados.

A proporção de líquido (a proporção do volume de líquido por peso de tecido) em ambos, bioesmerilhação e bioacabamento, pode ser na faixa de cerca de 3:1 a 20:1, preferivelmente 5:1 a 10:1. O tempo de tratamento pode variar entre 15 minutos a 90 minutos e, preferivelmente, 30 min a 60 min. Deverá ser enfatizado que a dosagem de enzima depende grandemente do tipo de tecidos, maquinaria, condições do processo (pH, temperatura, proporção de líquido, tempo de tratamento, carga de denim, escala de processo) e tipo de preparação de enzima e similares. A pessoa versada na técnica é capaz de definir dosagens e condições apropriadas.

O processo da invenção para tratar material celulósico também abrange hidrólise de material lignocelulósico, por exemplo produção de bioetanol. Um exemplo do uso de bioprocessamento consolidado (CBP) em hi19/38 drólise de material lignocelulósico é descrito, por exemplo por van Zyl et a/, in Adv Biochem Eng Biotechnol. 2007;108:205-35.

A invenção é ainda ilustrada pelos exemplos não limitantes a seguir.

Exemplo 1. Varredura de cepas expressando atividade celulolítica em temperatura baixa

Cerca de 180 cepas fúngicas em coleção de cultura Roal Oy foram testadas para ver sua capacidade de produzir a atividade celulolítica em temperatura baixa. As cepas fúngicas foram cultivadas em 100 ml de volume em uma batedeira rotativa (200 rpm) a temperatura de 20°C por 3 a 7 dias. Diversos meios de produção foram testados contendo celulose Solka Floe como uma fonte de carbono. Depois do cultivo, as células e os outros sólidos foram coletados por centrifugação e o sobrenadante foi recuperado. Se não usada imediatamente, a preparação foi armazenada em alíquotas a -20°C.

Para a estimativa da atividade da enzima em temperaturas mais baixas, foram realizados ensaios de preparação de cultivo em frasco de vibração a 30°C e 50°C por 1 hora. Todos os sobrenadantes do frasco de vibração foram ensaiados para as atividades a seguir:

A atividade de endoglucanase (CMCase):

Esta foi ensaiada com 3% (peso/volume) de carboximetlcelulose (CMC) como o substrato em 50 mM de tampão de citrato, essencialmente como descrito por Bailey and Nevalainen 1981; Haakana era/., 2004. Redução de açúcares foi medida com o reagente DNS. O ensaio foi realizado em pH 5,0 e 7,0.

A atividade de endoglucanase (HEC):

Isto foi ensaiado com 1% (peso/volume) de hidroxietilcelulose (HEC) como o substrato em 50 mM de tampão de citrato essencialmente como descrito por Bailey e Nevalainen 1981. A redução de açúcares foi medida com o reagente DNS. O ensaio foi realizado por ambos em pH 5,0 e 7,0.

As preparações de sobrenadantes de cultura de cepas foram testadas em aplicação de biotingimento em pequena escala em um LP-2

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Launder Ometer como a seguir. Cerca de 7,2 g de pedaços de denim desengomagem (12x12 cm) foram carregados com bolas de aço em recipientes de 1,2 litro contendo 100 ml Mc de tampão de llvaine e 100 ml de sobrenadante de cultura, a a Launder Ometer funcionou a 30°C por 120 minutos. Depois da lavagem alcalina e detergente, as amostras de tecido foram enxaguadas cuidadosamente com água morna e secas no ar. Os resultados foram avaliados visualmente e através de medição da cor como valores de refletância (dados não mostrados).

Depois de varredura preliminar, quatro cepas (Geomyces pannorum RF6293, RF6546 e RF6608, e Fusarium cf. equiseti RF6318) foram escolhidas para estudos de aplicação adicional. Para esse propósito as cepas RF6546 e RF6608 foram cultivadas em 200 ml de volume em uma batedeira rotativa (200 rpm) a uma temperatura de 20°C por 4-7 dias em um meio que contém g/litro: Solka Floe celulose 10,0, pó de milho íngreme 1,5, farinha de soja 0,5, CaCCh 0,5, (ΝΗ₄)₂ΗΡ0₄ 1,5, KH₂P0₄ 2,0, MgS0₄H₂0 0,5, NaCI 0,5, NH₄N03 0,5, Tween-80 0,5, solução de elementos de micronutriente #1 0,5, solução de elementos micronutrientes #2 0,5, óleo de parafina 0,5; o pH foi ajustado para 6,4. Solução de elemento micronutriente #1 (mg/litro): MnS0₄ 1,6, ZnS0₄H₂0 3,45, CoCI₂H₂0 2,0; solução de elemento micronutriente #2 (mg/litro): FeS0₄ H₂0 5,0. As cepas RF6293 e RF6318 foram cultivadas em 200 ml de volume em uma batedeira rotativa (200 rpm) a uma temperatura de 20°C por 4 a 6 dias em um meio, que contém g/litro: celulose Solka Floe 30,0, pó de milho íngreme 9,0, farinha grossa de soja 1,5, CaC03 1,5, (NH₄)₂HP0₄ 4,5, KH₂P0₄ 6,0, MgS0₄ H₂0 1,5, NaCI 0,5, NH₄N0₃ 15, Tween80 0,5, solução de elementos micronutrientes #1 0,5, solução de elementos micronutrientes #2 0,5, óleo de parafina 0,5; o pH foi ajustado para 6,4. Solução de elementos micronutrientes #1 (mg/litro): MnS0₄ 1,6, ZnS0₄'H₂0 3,45, CoC!₂H₂0 2,0; solução de elementos micronutrientes #2 (mg/litro): FeS0₄'H₂0 5,0.

Exemplo 2. Clonagem dos genes de endoglucanase de Geomyces pannorum RF6293, RF6546, RF6608, e Fusarium cf. equiseti RF6318

Métodos de biologia molecular padrão foram usados no isola21/38 mento e tratamento com enzimas de DNA (plasmídeos, fragmentos de DNA), em transformações de E. coli, etc. Os métodos básicos usados são descritos nos manuais de biologia molecular padrão, por exemplo Sambrook et a\. (1989) e Sambrook and Russell (2001).

O vetor Lambda DASH^@ll/BafliHI (Stratagene, USA) foi usado na construção das bibliotecas genômicas para Geomyces pannorum RF6293, RF6546, RF6608, e Fusarium cf. equiseti RF6318, de acordo com as instruções do fornecedor. Os DNAs cromossomais, isolados pelo método de Raeder and Broda (1985), foram parcialmente fragmentados com Sau3A. Os DNAs fragmentados foram fracionados por tamanho e os fragmentos do tamanho escolhido (5-20 kb) foram ligados aos braços do vetor lambda fragmentado BamHI. As misturas de ligação foram embaladas usando extratos de embalagem Gigapack III Gold, de acordo com as instruções do fabricante (Stratagene, USA). Os títulos das bibliotecas genômicas construídas são apresentados na Tabela 1.

Tabela 1 .Títulos das bibliotecas genômicas construídas

Cepa	Título da biblioteca genômica pfu/ml (x106)	Título da biblioteca genômida ampliada pfu/ml (x108)
Geomyces pannorum RF6293	0,38	100,0
Geomyces pannorum RF6546	0,04	6
Geomyces pannorum R6608	0,04	0,3
Fusaium cf. equiseti RF6318	0,46	60,0

As bibliotecas genômicas de Geomyces pannorum RF6293,

RF6546, RF6608 e Fusarium cf. equiseti RF6318 foram rastreadas com as sondas que foram ampliadas PCR usando iniciadores degenerados e o DNA genômico como um gabarito. As sequências dos iniciadores heterólogos foram baseadas nas sequências de endoglucanase conservadas (Tabela 2, SEQ ID NO: 1-5). As sequências conservadas foram identificadas alinhando a sequência de aminoácidos previamente publicada de Humicola grisea var. thermoidea AB003107, Fusarium oxysporum L29381, Meianocarpus albomyces AJ515703 e Gibberella zeae AY342397. As misturas de reação de

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PCR contendo 10 mM de Tris-HCI, pH 8,8, 50 mM de KCI, 0,1% de Triton X100, 1,5 mM de MgCI₂, 0,1 mM de dNTPs, 1 μΜ de cada iniciador e 1-2 unidades de polimerase de DNA Dynazyme II (Finnzymes, Finlândia) e 0,5-1 pg do DNA genômico. As condições para as reações de PCR foram as seguintes: 5 min de desnaturação inicial a 95°C, seguida por 30 ciclos de 1 min a 95°C, 30 s de recozimento a 52,5°C (±7,5°C gradiente), 1 min de extensão a 72°C e um prolongamento final a 72°C por 5 min. Os gabaritos de DNA genômico usados nas reações de PCR estão listados na Tabela 3.

Tabela 2. Os oligonucleotídeos degenerados testados como iniciadores de PCR para ampliar sondas para rastreamento de genes de endoglucanase de Geomyces pan-norum RF6547, RF6546, RF6608, e Fusarium cf. equiseti RF6318

Oligonucleotídeo	Comprimento (bp)	Sequência(a	SEQ ID NO.
Cel45 S1	20	TAYTGGGAYTGYTGYAARCC (s)	1
Cel45 S2	17	TGGTGYTGYGCNTGYTA (s)	2
Cel45 AS1	17	TARCANGCRCARCACCA (as)	3
Cel45 AS2	17	GTRCANCCRTCRAADAT (as)	4
Cel45„AS3	23	TTRTCSGCRTTYTGRAACCARTC (as)	5

^(aD = A ou G ou T, R = A ou G, S = C ou G, N = A ou G ou T ou C, Y = T ou C; s entre parênteses = cepa senso, como entre parênteses = cepa antissenso.

Os produtos de DNA tendo os tamanhos esperados (estimados a partir das sequências de endoglucanase publicadas) foram obtidos de diversas reações. Os fragmentos de DNA dos tamanhos esperados foram isolados das reações de PCR mais específica, e eles foram clonados para o vetor pCR® 4-TOPO® (Invitrogen, USA). As inserções foram caracterizadas por sequenciamento e realizando hibridizações de Southern blot para os DNAs genômicos fragmentados com diversas enzimas de restrição. Os fragmentos de PCR, que foram escolhidos para serem usados como sondas para rastreamento de biblotecas genômicas Geomyces pannorum RF6293, RF6546, RF6608, e Fushum cf. equiseti RF6318 são apresentados na Tabela 3.

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Tabela 3. Os iniciadores usados nas reações de PCR e as sondas escolhidas para rastreamento dos genes de endoglucanase das bibliotecas genômicas Geomyces pannorum RF6293, RF6546, RF6608, e Fusaríum cf. equiseti RF6318. O DNA de gabarito genômico, e o nome do plasmídeo contendo o fragmento da sonda são mostrados.

Gene	Iniciador anterior	Iniciador Reverso	DNA Genômico usado como um gabarito na reação de PCR	Fragmento obtido (kb)	SEQ ID NO	Inserir no plasmídeo
RF6293 ce/45A	Cel45-S1	Cel45 AS3	RF6293	0,6 kb	6	PALK2038
RF6293 -ce/45B	Cel45 S1	Cel45 AS3	RF6289	0,6 kb	7	PALK2039
RF6318 -ce/45A	Cel45-S1	Cel45 AS3	RF6318	0,6 kb	8	PALK2047
RF6546 -ce/45A	Cel45 S1	Cel45 AS3	RF6546	0,6 kb	9	pALK2040
RF6608-ce/45A	Cel45 S1	Cel45„AS3	RF6608	0,6 kb	10	pALK2042
RF6608 -ce/45B	Cel45 S1	Cel45 AS3	RF6608	0,6 kb	11	PALK2041

As sequências de aminoácidos deduzidas de todas essas sondas tinham homologia para diversas sequências de Cel45 publicadas (programa BLAST, versão 2.2.9 em NCBI, National Center for Biotechnology information; Altschul etal., 1990).

As inserções dos plasmídeos listados na Tabela 3 foram rotuladas com digoxigenina, de acordo com as instruções do fornecedor (Roche, Alemanha). As bibliotecas genômicas ampliadas (placas de 1x10⁵6x10⁵) foram rastreadas com fragmentos de sonda rotulados. A temperatura de hibridização para os filtros foi 68°C e os filtros foram lavados 2x5 min a temperatura ambiente usando 2xSSC-0,1% de SDS seguido por 2x15 min a 68°C usando 0,1xSSC-0,1% de SDS. Diversas placas positivas foram obtidas de cada hibridização. Cinco placas fortemente hibridizadas foram purificadas de cada rastreamento. Os DNAs bacteriófagos foram isolados e caracterizados por hibridizações Southern blot. Os fragmentos de restrição escolhidos hibridizando a sonda foram subclonados para vetor Bluescript II KS+ e as regiões relevantes dos clones foram sequenciadas.

No total, seis genes ce/45 foram clonados; um de cepas de Geomyces pannorum RF6546 e Fusaríum cf. equiseti RF6318, e dois de genes ce/45 de cepas de Geomyces pannorum, RF6293 e RF6608. A Tabela 4 resume as informações sobre as sondas usadas para rastrear os genes, os

24/38 clones de bacteriófagos dos quais os genes foram isolados, os fragmentos de restrição escolhidos contendo os genes de comprimento total com suas regiões promotoras e de terminar, os nomes de plasmídeos, a o número de depósitos de DSM para cepas E. coli que carregam estes plasmídeos.

Tabela 4. As sondas usadas para clonar genes de endoglucanase, o clone bacteriófago e os subclones escolhidos, o número do plasmídeo e o número do depósito da cepa E. coli correspondente

Gene	Sonda usada no rastreamento	Clone de bacteriófago	0 fragmento subclonado para pBiuescript II KS+	N° do Plasmídeo	E. coli deposito no
Gp RF6293.ee/45A	PALK2038	F78	3,5 kb Hindi»	PALK2206	DSM 18916
Gp RF6293 ce/45B	pALK2039	F105	2,3 kb Xba\	PALK2221	DSM 19171
Fe RF6318 ce/45A	pALK2047	F122	2,5 kb EcoRI	PALK2226	DSM 19173
6o RF6546 -ce/45A	PALK2040	F85	6,0 kbA/oil	PALK2208	DSM 18915
Gd RF6608 -ce/45A	PALK2042	F88	2,5 kb Xbal	PALK2207	DSM 18917
Gp RF6608 ce/45B	PALK2041	F108	9,0 kb Xbal	PALK2219	DSM 19170

As informações relevantes sobre os genes e as sequências de proteínas deduzidas (SEQ ID NO: 12-23) são resumidas na Tabela 5 e Ta10 bela 6, respectivamente.

Tabela 5. O resumo de genes de endoglucanase isolados de Geo-myces pannorum RF6293, RF6546, RF6608, e Fusarium cf. equiseti RF6318

Gene	Comprimento com introns (bp)(a	Codificando região (bp)lb	No de introns	Com ps de introns (bp)	SEQ ID NO:
Gp RF6293 ce/45A	1036	912	1	121	12
Gp RF6293 ce/45B	966	846	2	58,59	14
Fe RF6318 ce/45A	1162	1098	1	61	16
Gp„RF6546 ce/45A	1028	912	1	113	18
Gp RF6608„ce/45A	1026	912	1	111	20
Gp RF6608 ce/45B	969	846	2	61,59	22

^(a O códon STOP é incluído.

^(b O códon STOP não é incluído.

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Tabela 6. O resumo da sequência de aminoácidos deduzida das sequências de genes de endoglucanase de Geomyces pannorum RF6293, RF6546, RF6608, e Fusarium cf. equiseti RF6318

Endoglucanase proteína	No de aas	Compr. de ss NN|n	CBD(S	MW Previsto (Da), ss não incl(c	pl Previsto {ss não inct)	SEQID NO:
Gp RF6293 Cei45A	304	22	T247a L282	28678	5,13	13
Gp RF6293 Cel45B	282	26		27309	4,17	15
Fe RF6318 Cel45A	366	20	A306 a N346	36284	8,25	17
Gp RF6546 Cel45A	304	22	T247 a L282	28762	4,93	19
Gp RF6608 Cel45A	304	22	T247 a L282	28504	4,33	21
Gp RF6608 Cel45B	282	26		30324	4,37	23

^t(aA previsão na sequência de sinal foi feita usando o programa SignalP V3.0 (Nielsen ef a/., 1997; Bendtsen era/., 2004); o valor de NN foi obtido usando redes neurais.

^(b O domino de ligação de celulose (CBD), os aminoácidos da região de CBD são indicados [M1(Met#1) incluídos na numeração], ^(c A sequência de sinal prevista não foi incluída. A previsão foi feita usando a ferramenta Compute pl/MW no servidor ExPASy (Gasteiger ef al., 2003).

As comparações das sequências de Cel45 deduzidas das cepas de Geomyces pannorum RF6293, RF6546, RF6608, e Fusarium cf. equiseti RF6318 uma com a outra, são apresentadas na Tabela 7 e Tabela 8. Ambas, a sequência de aminoácidos de comprimento total e as proteínas de núcleo sem a região de CBD das sequências de Cel45 deduzidas são mostradas. Um programa de Clone Manager (versão 9) incluindo as funções Comparar Duas Sequências/Global/Comparar sequências como matriz de escore de aminoácidos/BLOSUM62 foi usado para determinar o grau de identidade.

Tabela 7. Os valores de identidade (%) obtidos do alinhamento da sequência de aminoácidos deduzida Cel45 de Geomyces pannorum RF6293, RF6546 e RF6608, e Fusarium cf. equiseti RF6318. A sequência de aminoácidos de comprimento total incluindo as sequências de sinal foram alinhadas.

Proteína	Gp RF62 93 Cel45A	Gp_RF6293 Ce!45B	Fe_RF6318 Cei45A	Gp„RF65 Gp_RF6608 Gp_RF6608
46 Cel45A	Cel45A C	el45B
Gp RF6293 Cel45A	100	39	46	85	87	38
Gp RF6293 Cel45B		100	30	40	38	89
Fe RF6318 Ce!45A			100	45	45	31
Gp RF6546 Cei45A				100	87	38
Gp RF6608 Cel45A					100	38
Gp RF6608ACel45B						100

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Comparação das sequências de endoglucanase Cel45 deduzidas de Geomyces pannorum RF6293, RF6546, RF6608, e Fusarium cf. equiseti RF6318 com sequências encontradas em bancos de dados são mostradas nas Tabelas 9A e 9B.

Tabela 8. Os valores de identidade (%} obtidos do alinhamento da sequência de aminoácidos Cel45 deduzida de Geomyces pannorum RF6293, RF6546, RF6608, e Fusarium cf. equiseti RF6318. As sequências de núcleo excluindo a sequência de sinal e as regiões de ligador CBD foram alinhadas.

Proteína	Gp_RF6293 Gp„RF6293 Fe_RF6318 Gp„RF6546 Gp RF6608 Gp RF6608
Cel45A	Cel45B	Cel4SA	Cel45A Cel45A Cel45B
Gp RF6293„Cel45A	100	41	58	88	89	41
Gp RF6293„Cel45B		100	39	42	42	89
Fe RF6318 Cei45A			100	60	60	39
Gp RF6546 CeS45				100	92	42
Gp RF6608„Cel45A					100	41
Gp RF6608 Cel45B						100

Tabela 9A. AS sequências de identidades mais altas para as sequências de endo10 giucanase deduzidas de Geomyces pannorum RF6293, RF6546, RF6608, e Fusarium cf. equiseti RF6318. A sequência de aminoácidos de comprimento total incluindo as sequências de sinal foram alinhadas. A pesquisa do banco de dados foi realizada usando BLAST (tblastn, nr/nt banco de dados), e o programa Clone Manager 9 (Comparar Duas Sequências/Globai/Comparar sequências como matriz de escore 15 de aminoácidos/BLOSUM62) foi usada para determinar o grau de identidade.

Organismo e número de acesso	Identidade {%)
Gp_RF6293_Cel45A	100
Neurospora crassa, XM 952014	57
Gp_RF6293_Cel45B	100
Pyrenophora thtici-repentis, XM 001935986	47
Fe_RF6318_Cel45A	100
Gibberetla zeae, AY342397 Gibberella zeae, XM 382834	86 86
Gp_RF6546_Cel45A	100
Neurospora crassa, XM 952014	57
Gp_RF6608_Cel45A	100
Sclerotinia sclerotiorum, XM 001597582	58
Gp_RF6608_Cel45B	100
Pyrenophora tritici-repentis, XM 001935986	48

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Tabela 9B. AS maiores identidades de sequências em documentos de patentes publicados para as sequências de endogiucanase deduzidas de Geomyces pannorum RF6293, RF6546, RF6608, e Fusarium cf. equiseti RF6318. A sequência de aminoácidos de comprimento total incluindo as sequências de sinal foram alinhadas. A pesquisa no sistema de registro do Chemical Abstracts Service (CAS), no banco de dados de DGEGE e Sequências de Proteína Patenteadas NCBI foi realizada usando BLAST e o programa Clone Manager 9 (Comparar Duas Sequências/Globai/Comparar sequências como matriz de escore de aminoácidos/BLOSUM62) foi usada para determinar o grau de identidade.

Organismo e número de acesso	Identidade {%)
Gp_RF6293_Cel45A	100
US7256032, SEQ ID: 21	64
Fe_RF6318_Cel45A	100
US5610129 A, SEQ ID: 4	78
Gp_RF6546_Cel45A	100
US2005070003 AQ, SEQ ID: 6	61

Exemplo 3. Produção de proteínas Cel45 recombinantes em Trichoderma reesei

Plasmídeos de expressão foram construídos para a superexpressão de proteínas Cel45 recombinantes de Geomyces pannorum RF6293 e RF6546, e Fusarium cf. equiseti RF6318 em Trichoderma reesei. Os plasmídeos de expressão construídos são listados na Tabela 10. Os genes recombinantes ce/45, incluindo suas próprias sequências de sinal, foram exatamente fundidos para o promotor T. reesei cbh1/ceHk (p cbhl). O término da transcrição foi garantido pelo terminador 7. reesei cbhMceUA (t cbhl) e o gene do marcador A. nidulans amdS foi usado para seleção dos transformantes como descrito em Paloheimo ef ai. (2003). Os cassetes de expressão linear (figura 1) foram isolados das estruturas principais de vetor depois da fragmentação de Not\ e foram transformados em T. reesei AA7 e/ou protoplastos A51 (ambas as cepas têm os genes codificando as quatro principais celulases CBHI/Cel7A, CBHII/Cel6A, EGI/Cel7B e EGII/Cel5A de

28/38 letadas). As transformações foram realizadas como em Penttilã et al. (1987) com as modificações descritas em Karhunen et ai. (1993), selecionando acetamida como uma única fonte de nitrogênio (gene de marcador amdS). Os transformantes foram purificados em placas de seleção através de conídia única antes de esporular as mesmas em PD.

Tabela 10. Os cassetes de expressão construídos para superproduzir proteínas Cel45 de Geomyces pannorum RF6293 e RF6546, e Fusarium cf. equiseti RF6318 em Trichoderma reesei. A estrutura total dos cassetes de expressão foi como descrito na figura 1. Os genes clonados cel45 foram exatamente fundidos para o promotor T. reesei cbhMceUA.

Proteína Endoglucanase	Plasmídeo de Expressão	Cassete13 de Expressão	Terminador(b
Gp-RF6293_Cel45A	PALK2215	8,6 kb Noil	196 bp (Mly\)
Gp_RF6293_Cel45B	pALK2224	8,6 kb Noil	196 bp (Sa/I)
Fe„RF6318_Cel45A	PALK2230	8,9 kb Nor!	335 bp (EcoR\)
Gp_RF6546_Cel45A	PALK2218	8,6 kb Nori	225 bp (Sspl)

^(a O cassete de expressão para transformação de T. reesei foi isolado da cadeia principal do vetor usando fragmentação de Notl.

^(b O número dos nucleotídeos depois do códon STOP do gene recombinante clonado que foi incluído no cassete de expressão. O sítio de restrição na extremidade 3'- do fragmento de gene genômico que foi usado na elaboração do cassete de expressão está indicado entre parênteses.

A produção de endoglucanase dos transformantes foi analisada a partir de sobrenadantes da cultura em frasco de cultivos em batedeira (50 ml). Os transformantes foram criados por 7 dias em um meio complexo de indução de celulase baseado em lactose (Joutsjoki et al. 1993) tamponado com 5% KH2PO4. A atividade de endoglucanase foi ensaiada com 3% (peso/volume) de carboximetilcelulose (CMC) como o substrato em 50 mM de tampão de citrato, de acordo com Bailey e Nevalainen 1981 e Haakana et al., 2004. Os genótipos dos transformantes escolhidos foram confirmados usando Southern blots em que diversos fragmentos genômicos foram incluídos e 0 respectivo cassete de expressão foi usado como uma sonda. A pro

29/38 dução heteróloga de proteínas de endoglucanase recombinante foi analisada por SDS-PAGE com subsequente coloração Coomassive.

As preparações de enzima de Cel45A recombinante foram caracterizadas em termos de pH ideal e estabilidade térmica. O pH ideal das proteínas de Cel45A superproduzidas foi determinado em tampão universal Mcllvaine dentro de uma faixa de pH de 4,0-8,0 usando 3% (peso/volume) de carboximetilcelulose (CMC) como substrato (figura 2A). A estabilidade térmica das proteínas de endoglucanase recombinantes foi determinada medindo a atividade de CMCase em tampão universal Mcllvaine no pH ideal com uma tempo de reação de 1 hora (figura 2B).

A endoglucanase escolhida produzindo transformantes foram cultivadas em biorreatores de laboratório a 28°C no meio indicado acima por 3-4 dias com controle de pH 4,4 ± 0,2 (NH3/H3PO4) para obter material para os testes de aplicação. Os sobrenadantes foram recuperados por centrifugação e filtração através de filtros Seitz-K 150 e EK (Pall SeitzSchenk Filtersystems GmbH, Bad Kreuznach, Alemanha).

Exemplo 4. Desempenho de proteínas recombinantes Cel45 no tratamento de denim em diferentes temperaturas

Proteínas recombinantes Cel45 produzidas como descrito no Exemplo 3 usando Trichoderma como hospedeiro foram testadas por seu efeito em biotingimento de denim, em temperaturas diferentes, para criar uma aparência abrasiva similar àquelas produzidas por pedras-pomes. Enzimas comerciais Cel45 Ecostone®N400 (Roal Oy, Finlândia) e Denimax™ 399S (Novozimas) foram usadas para comparação.

Um par de jeans feito de sarja de denim corada de índigo, obtida de um fornecedor inglês, foi usado como principal material de teste, depois de desengomagem com ECOS-TONE® A200 alfa-amilase e 2 pares de jeans Apache desengomados (Labeis Fashion Limited, Reino Unido) como material de agente de enchimento. Os tratamentos de celulase foram realizados com extratora lavadora Electrolux's Wascator FOM 71 CLS sob as condições descritas na Tabela 11.

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Tabela 11. Os parâmetros de condições / processo de testes usados em tratamentos com celulase

Parâmetro do processo
Carga de Denim	1,6 kg
Água	17 litros
Tampão/ Controle de pH (pH 6)	Ajustado com Na2HP04 H2O e ácido cítrico
Tempo	55 min
Temperatura	20, 30, 40, 50 ou 60°C
Dosagem de celulase	250-1500 NCU/g tecido

As enzimas foram dosadas como unidades de atividade de celulase neutra (NCU) por peso de tecido. A atividade de enzima foi medida como a liberação de redução de açúcares de carboximetilcelulose (3% de CMC) a 50°C em um tampão 50 mM de Hepes de pH 7,0 (atividade de NCU Haakana et al. 2004). Proteínas recombinantes de Cel45 foram dosadas como tecido 1250 NCU/g, tecido de Ecostone®N400 1500 NCU/g e Denimax™ 399S 250 NCU/g. A dosagem de cada enzima foi suficiente para dar diferenças facilmente mensuráveis / detectáveis (aumento de clareza = delta L*>2 unidades) em uma faixa total de temperatura. Enzimas foram inativadas depois da secagem elevando o pH 11 acima adicionando 4,2 g de NaOH (10 min, 40°C) e enxaguando três vezes. Os jeans foram secos em uma secadora.

O nível de efeito/abrasão de biotingimento do principal material de teste foi avaliado medindo a cor como valores de refletância com espectrofotômetro Minolta CM 2500 usando coordenadas de espaço de cor L*a*b* (iluminante D65/ 2^o). A cor do lado da frente e a cor do lado do avesso do denim foi medida depois da desengomagem (isto é, antes do tratamento de celulase) e depois do tratamento de celulase. Cada medição do lado da frente de denim foi a média de aproximadamente 40 medições. Os perfis de temperatura na aplicação em denim foram também ilustrados calculando o desempenho relativo (%) a 30°C comparado a 50°C (proporção 30:50) e o desempenho relativo (%) a 40°C comparado à temperatura ideal (proporção 40/OT). Os resultados são mostrados nas Tabelas 12-14 e figura 3.

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Tabela 12. Perfis das temperaturas de preparações de Cel45 em tratamento de denim. Tratamentos com preparações de enzima Cel45 comercial foram usados por comparação

Enzima	Temp. (°C)	Aumento relativo de L* (%)
Gp RF6293 Cel45A	60	54
Gp RF6293 Cel45A	50	95
Gp RF6293 Cel45A	40	100
Gp RF6293 Cel45A	30	93
Gp RF6293 Cel45A	20	65
Gp RF6546 Cel45A	60	99
Gp RF6546 Cel45A	50	100
Gp RF6546 Ce!45A	40	81
Gp RF6546 Cel45A	30	74
Fe RF6318 Ce!45A	50	96
Fe RF6318 Cel45A	40	100
Fe- RF6318 Cel45A	30	76
Fe RF6318 Cel45A	20	62
Ecostone® N400	60	100
Ecostone® N400	50	91
Ecostone® N400	40	75
Ecostone® N400	30	64
Denimax™ 399S	60	100
Denimax™ 399S	50	92
Denimax™ 399S	40	62
Denimax™ 399S	30	40

Tabela 13. Proporções de 0:50 40:OT calculadas dos perfis de temperatura de no5 vas enzimas Cel45 e Preparações de Cel45 comercial

Enzima	Proporção 30:50 (%)	Proporção 40:0T (%}
Gp-RF6293 Cel45A	98	100
Gp RF6546 Cel45A	74	81
Fe-RF6318 Cel45A	79	100
Ecostone® N400	70	75
Denimax™ 399S	43	62

Os resultados na Tabela 12 e figura 3 mostram que as novas enzimas recombinantes Cel45 têm perfis de temperatura mais baixa em aplicação do que enzimas Cel45 comerciais Ecostone®N400 e Denimax™ 399S.

Gp_RF6293_Cel45A mostram desempenho ideal em uma faixa de temperatura muito ampla de 30 a 50°C, que é surpreendente, porque a temperatura

32/38 ideal em condições analíticas foi marcadamente mais alta (55-60°C, figura 2B). A faixa de temperatura ideal para Gp_RF6546_Cel45A e Fe_RF6318_Cel45A é também mais baixa do que para as enzimas comerciais.

Ambas, Gp_RF6293_Cel45A e Fe_RF6318_Cel45A, têm um desempenho mais elevado a 40°C do que a 50°C, que é uma propriedade única em comparação a outras enzimas pertencentes à família de cel45, como as preparações comerciais usadas como referência, e que tipicamente funcionam melhor a 50-60°C. Os resultados na Tabela 13 mostram que ambas as proporções 30/50 e 40/OT são mais favoráveis com estas novas endoglucanases do que com preparações de Cel45 comerciais.

Os resultados na Tabela 14 mostram que com a enzima recombinante Gp_RF6293_Cel45A um efeito mais alto de bioengomagem/abrasão à temperatura baixa (30°C) pode ser obtido comparado às enzimas Cel45 comerciais.

Tabela 14. Medições de cor do lado da frente de denim tratado com preparação Gp_RF6293_Cel45A a 30°C e pH 6. Tratamentos com preparações comerciais de enzima foram usadas para comparação. L* indica a luminosidade.

Enzima	Atividade/ g vestuário	Antes do tratamento com celulase	Depois do tratamento com celulase	Aumento de L*
L*	L*
Gp RF6293 Cel45A	1250 NCU/g	16,87	22,19	5,32
Ecostone® N400	1500 NCU/g	16,95	21,75	4,80
Denimax™ 399S	250 NCU/g	16,82	19,29	2,47
Denimax™ 399S	1250 NCU/g	16,82	21,.36	4,54

Exemplo 5. Desempenho de proteínas recombinantes Cel45 no tratamento de denim em pH diferente

Proteínas recombinantes Cel45 produzidas como descrito no Exemplo 3 usando Trichoderma como hospedeira foram testadas para seu efeito em biotingimento de denim em pH diferente para criar uma aparência desgastada similar àquela provida por pedras-pomes.

O sistema de teste para biotingimento foi como no Exemplo 4, exceto que uma batelada diferente de jeans foi usada e a temperatura foi 40°C e pH 5-7. Também o efeito do tratamento com celulase foi avaliado

33/38 como no Exemplo 4.

Os resultados estão demonstrados na Tabela 15 e figura 4, que mostram que a faixa de pH ideal para Gp_RF6293_Cel45A é 5-6,5 e para Fe_RF6318_Cel45A, 6-6,5.

Tabela 15. Medições de cores do lado de fora do denim tratado com preparações de Cel45 recombinante em diferentes pH a 40°C. L* indica a leveza.

Enzima	PH	Antes do tratamento com celulose	Depois do tratamento com celulose	Aumento de L*
L*	L*
Gp. RF6293 Cel45A	5	16,70	22,33	5,63
Gp.... RF6293 Cel45A	6	16,63	22,36	5,73
Gp RF6293 Ce!45A	6,5	16,75	22,2	5,45
Gp RF6293 Cei45A	7	16,75	21,16	4,41
Fe RF6318 Cel45A	5	16,55	19,5	2,95
Fe RF6318 Cel45A	6	16,53	20,66	4,13
Fe RF6318 Cel45A	6,5	16,47	20,22	3,75
Fe RF6318 Cel45A	7	16,53	19,92	3,39

Exemplo 6. Desempenho de proteínas Cel45 recombinante em bioacabamento (sem bolhinhas de fibras embaraçadas/deha/r/ng/sem felpa)

A capacidade de proteínas Cel45 recombinantes produzidas como descrito no Exemplo 3 usando Trichoderma como hospedeiro foram testadas sem bolhinhas de fibras embaraçadas em roupa de malha de algodão e comparadas à enzima Cel45 com excelentes propriedades de ausência de bolhinhas de fibras embaraçadas (W02006/117432). Os tratamentos de celulase foram realizados com extrator de máquina de lavar Wascator FOM 71 CLS de Electrolux sob condições descritas na Tabela 16.

Três mantas de fios feitas de 100% algodão (Tipo 9761, Orneule, Finlândia) foram usadas como material de teste com material de enchimento. O tecido foi primeiro pré-lavado por 10 min a 50°C e enxaguado 3 vezes. Depois disso, o algodão entrelaçado foi tratado com celulase a 40°C ou 50°C por 60 minutos. Enzimas foram dosadas como unidades de atividade de celulase neutra (NCU) por peso do tecido. Depois de secar, a enzima foi desativada (por 10 min a 60°C) elevando o pH acima de 11 com hidróxido de sódio. O tecido foi depois enxaguado três vezes e seco em um tambor.

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Tabela 16. As condições de teste/parâmetros de processos usados em tratamentos de bíoacabamento

Parâmetros de processo
Carga de tecido	1,0 kg
Água	15 litros
Ajuste de pH	Com ácido acético (80%)
Tempo	60 min
Temperatura	40°C/50°C
Dosagem de celulase	250 NCU/g tecido

As amostras de roupas de malha foram avaliadas visualmente de acordo com quantas pequenas fibras e felpas foram detectadas. O resultado de cada avaliação foi quantificado pela indicação do resultado relativo para uma escala consistindo em padrões. Esses padrões foram peças do mesmo tecido lavado com quantidades diferentes de celulase e eles tinham uma faixa de intensidade de pequenas fibras / felpas de superfície de 1 a 5 com intervalos de meia unidade. O número 0 foi uma amostra de controle tratada sem enzima. Quanto mais alto o número, melhor é o efeito sem pequenas bolhinhas de fibras / depilação. Número 5 significa que as pequenas fibras felpas de superfície foram removidas. Os resultados são mostrados nas Tabelas 17 e 18. Os resultados nas Tabelas 17 e 18 mostram que Gp_RF6293_Cel45A, Gp_RF6546_Cel45A e Fe_RF6318_Cel45A têm excelentes propriedades de impedir a presença de pequenas bolhinhas. Foi surpreendente que Gp_RF6293_Cel45A foi eficiente em dosagem de atividade muito mais baixa em impedir a presença de pequenas bolhinhas / depilação do que no tratamento de denim nos Exemplos anteriores. Foi também descoberto que a faixa mais ideal de pH para Gp_RF6293_Cel45A em impedir a presença de pequenas bolhinhas é de 5,5 a cerca de 7.

Um celulase neutra tendo excelentes propriedades de impedimento de criação de bolhinhas, como a proteína Gp_RF6293_Cel45A, possibilita o tratamento de bioacabamento simultaneamente com tingimento.

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Tabela 17. Os resultados de tratamentos de bioacabamento com proteínas Cel45 recombinantes a 40°C e pH 6

Enzima	Atividade/ g tecidos	Avaliação
Cel45 (W02006/117432)	250 NCU/g	3,5
Gp RF6293 Cel45A	500 NCU/g	5
Gp RF6293 Cel45A	250 NCU/g	4
Gp RF6293 Cel45A	125 NCU/g	3

4-5 significa excelente efeito de impedimento de criação de boIhinhas / sem felpa, 3 bom efeito de impedimento de criação de bolhinhas / sem felpa, 0 nenhum efeito de impedimento de criação de bolhinhas / sem felpa (tratamento sem enzima).

Tabela 18. Os resultados de tratamentos de bioacabamento com proteínas

Cel45 recombinantes a 50°C e pH 6

Enzima	g tecido	Condições	Avaliação
Control	0	pH 6, 50°C	0
Gp RF6293 Cel45A	500 NCU/g	pH 6, 50°C	5
Gp RF6546 Cel45A	1000 NCU/g	pH 6, 50°C	4
Fe RF6318 Ce!45A	1250 NCU/g	pH 6, 50°C	5
Fe RF6318 Cel45A	625 NCU/g	pH 6, 50°C	4,5

Referências

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Sequências

SEQ ID NO:	Sequência
1	Iniciador de oligonucleotídeo Cel45 S1
2	Iniciador de oligonucleotídeo Cel45 S2
3	Iniciador de oligonucleotídeo Cel45 AS1
4	Iniciador de oligonucleotídeo Cel45 AS2
5	Iniciador de oligonucleotídeo Cei45 AS3
6	PCR fragmento obtido de G. pannorum RF6293 usando os iniciadores Cel45 S1 e Cel45 AS3
7	PCR fragmento obtido de G. pannorum RF6289 usando os iniciadores Cel45 S1 e Cel45 AS3
8	PCR fragmento obtido de F. cf. equiseti RF6318 usando os iniciadores Cel45 S1 e Cel45 AS3
9	PCR fragmento obtido de F. cf. equiseti RF6546 usando os iniciadores Cel45 S1 e Cel45 AS3
10	PCR fragmento obtido de G. pannorum RF6608 usando os iniciadores Cel45 S1 e Cel45 AS3
11	PCR fragmento obtido de G. pannorum RF6608 usando os iniciadores Ce!45 S1 e Cel45 AS3
12	Sequência de Nucleotídeo do gene G. pannorum RF6293 cel45A
13	Sequência de aminoácidos deduzidos da G. pannorum RF6293

38/38

SEQ ID NO:	Sequência
	Cel45A
14	Sequência de nucleotídeo do gene G. pannorum RF6293 cel45B
15	Sequência de aminoácidos deduzidos da G. pannorum RF6293 Cel45B
16	Sequência de nucleotídeo do gene F. cf. equiseti RF6318 ce!45A
17	Sequência de aminoácidos deduzida de F. cf. equiseti RF6318 Cel45A
18	Sequência de nucleotídeo do gene G. pannorum RF6546 cel45A gene
19	Sequência de aminoácidos deduzida de G, pannorum RF6546 Cel45A
20	Sequência de nucleotídeo do gene G. pannorum RF6608 cel45A
21	Sequência de aminoácidos deduzida de G. pannorum RF6608 Cel45A
22	Sequência de nucleotídeo do gene G. pannorum RF6608 cel45B
23	Sequência de aminoácidos deduzida de G. pannorum RF6608 Cel45B

Mícro-orqanismos depositados

Cepas depositadas	Coleta de Cultura	Data de Deposição	Número de Acesso
Geomyces pannorum RF6293	1)	7 de abril de 2006	CBS 119567
Fusarium cf. equiseti RF6318	1)	7 de abril de 2006	CBS 119568
Geomyces pannorum RF6546	1)	16 de junho de 2006	CBS 119958
Geomyces pannorum RF6608	D	16 de junho de 2006	CBS 119962
E. coli strain incluindo o plasmídeo	2)	10 de janeiro de 2007	DSM 18916
PALK2206
E. coli strain incluindo o plasmídeo	2)	16 de março de 2007	DSM 19171
PALK2221
E. coli strain incluindo o plasmídeo	2)	16 de março de 2007	DSM 19173
pALK2226
E. coli strain incluindo o plasmídeo	2)	10 de janeiro de 2007	DSM 18915
pALK2208
E. coli strain incluindo o plasmídeo	2)	10 de janeiro de 2007	DSM 18917
PALK2207
E. colistrain incluindo o plasmídeo	2)	16 de março de 2007	DSM 19170

PALK2219

Centraaibureau Voor Schimmelcultures at Upsalalaan 8, 3508 AD, Utrecht, the Netherlands

Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zelikulturen GmbH (DSMZ),

Inhof-fenstrasse 7B, D-38124 Braunschweig, Germany 38

Claims (15)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Composição enzimática, caracterizada pelo fato de que compreende o polipeptídeo de endoglucanase tendo SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21 e/ou SEQ ID NO: 23, e conservantes.
2. 2. Processo para tratar material celulósico, caracterizado pelo fato de que compreende contatar o material celulósico com a composição enzimática como definida na reivindicação 1.
3. 3. Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que é realizado a uma temperatura menor que 50°C.
4. 4. Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que é realizado a uma temperatura menor que 40°C.
5. 5. Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que é realizado com um pH de 3-9.
6. 6. Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que é realizado com um pH de 4-8.
7. 7. Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que é realizado com um pH de 5-6,5.
8. 8. Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que é biotingimento ou bioacabamento.
9. 9. Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que é hidrólise de material lignocelulósico ou uma aplicação de alimento.
10. 10. Composição detergente, caracterizada pelo fato de que compreende um detergente, a composição enzimática como definida na reivindicação 1, e auxiliares.
11. 11. Alimento de animal, caracterizado pelo fato de que compreende alimento animal e a composição enzimática como definida na reivindicação 1.
12. 12. Cepa de E. coli, caracterizada pelo fato de que tem número de acesso DSM 18916, DSM 19171, DSM 19173, DSM 18915, DSM 18917, ou DSM 19170.
13. 13. Vetor de expressão, caracterizado pelo fato de que compreende

    Petição 870180130092, de 14/09/2018, pág. 11/18

    2/2 um polinucleotídeo selecionado dentre o grupo consistindo de:

    (a) uma sequência de nucleotídeos tendo SEQ ID NO: 12, 14, 16, 18, 20 ou 22.
14. 14. Microrganismo transgênico, caracterizado pelo fato de que compreende o vetor de expressão como definido na reivindicação 13.
15. 15. Método para a produção de um polipeptídeo de endoglucanase tendo SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21 ou SEQ ID NO: 23, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de transformação de um microrganismo transgênico com um vetor de expressão codificando o dito polipeptídeo, e cultura do referido microrganismo transgênico sob condições possibilitando a expressão do dito polipeptídeo, e opcionalmente recuperação e purificação do referido polipeptídeo.