ES2554652T3 - Endoglucanasas fúngicas, su producción y su uso - Google Patents

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Abstract

Un polipéptido de endoglucanasa de hongo, que pertenece a la familia 45 de las glucosilhidrolasas y que tiene un funcionamiento relativo (%) a 30 ºC en comparación con 50 ºC de al menos el 72% o un funcionamiento relativo (%) a 40 ºC en comparación con la temperatura óptima de al menos el 80%, cuando se analiza en la aplicación sobre tela vaquera, y que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 65% con la SEQ ID n.º 13, una identidad de secuencia de al menos el 90% con la SEQ ID n.º 17, o una identidad de secuencia de al menos el 90% con la SEQ ID n.º 19.

Description

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aminoacídicas completas, que incluían la secuencia señal. La búsqueda en la base de datos se realizó con BLAST (tblastn, base de datos nr/nt) y se utilizó el programa Clone Manager 9 (Comparar dos secuencias/Global/Comparar secuencias como aminoácidos/matriz de ponderación BLOSUM62) para determinar el grado de identidad.
imagen13
5
Tabla 9B. Secuencias de publicación de patente que tienen la mayor identidad con las secuencias de las endoglucanasas deducidas de Geomyces pannorum RF6293, RF6546, y de Fusarium cf. equiseti RF6318. Se alinearon las secuencias de aminoácidos completas, incluida la secuencia señal. Las búsquedas en las bases de datos del NCBI Chemical Abstracts Service (CAS) Registry System, DGEGE y Patented Protein Sequences se
10 realizó con BLAST y se utilizó el programa Clone Manager 9 (Comparar dos secuencias/Global/Comparar secuencias como aminoácidos/matriz de ponderación BLOSUM62) para determinar el grado de identidad.
imagen14
Ejemplo 3. Producción de las proteínas Cel45 recombinantes en Trichoderma reesei.
Se construyeron los plásmidos de expresión para la sobreexpresión de las proteínas Cel45 recombinantes de Geomyces pannorum RF6293 y RF6546, y de Fusarium cf. equiseti RF6318 en Trichoderma reesei. Los plásmidos 15 de expresión construidos se recogen en la tabla 10. Los genes de cel45 recombinantes, incluidas sus propias secuencias señal, se fusionaron exactamente con el promotor cbh1/cel7A de T. reesei (p cbh1). La terminación de la transcripción se aseguró mediante el terminador de cbh1/cel7A de T. reesei (t cbh1) y se utilizó el gen marcador amdS de A. nidulans para seleccionar los transformantes, tal y como se describe en Paloheimo et al. (2003). Los casetes de expresión lineales (figura 1) se aislaron del esqueleto del vector después de la digestión con NotI y se 20 introdujeron por transformación en los protoplastos de T. reesei A47 y/o A51 (en ambas cepas se han delecionado los genes que codifican las cuatro principales celulasas CBHI/Cel7A, CBHII/Cel6A, EGI/Cel7B y EGII/Cel5A). Las transformaciones se realizaron como en Penttilä et al. (1987) con las modificaciones descritas en Karhunen et al. (1993), seleccionando la acetamida como la única fuente de nitrógeno (gen marcador amdS). Los transformantes se
14
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imagen17
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Gp_RF6293_Cel45A
7 16,75 21,16 4,41
Fe_RF6318_Cel45A
5 16,55 19,5 2,95
Fe_RF6318_Cel45A
6 16,53 20,66 4,13
Fe_RF6318_Cel45A
6,5 16,47 20,22 3,75
Fe_RF6318_Cel45A
7 16,53 19,92 3,39
Ejemplo 6. Comportamiento de las proteínas Cel45 recombinantes en el bioacabado (desfrisado/desbarbado/eliminación de pelusas)
La capacidad de las proteínas Cel45 recombinantes producidas tal y como se describe en el ejemplo 3 mediante el
5 uso de Trichoderma como hospedador se analizó en el desfrisado del género de punto de algodón y se comparó con la enzima Cel45 con unas propiedades excelentes con respecto al desfrisado (patente internacional WO2006/117432). Los tratamientos con la celulasa se realizaron con un extractor de lavado Wascator FOM 71 CLS de Electrolux en las condiciones descritas en la tabla 16.
Tres vellones de hilo hechos de algodón al 100% (tipo 9761, Orneule, Finlandia) se utilizaron como material
10 problema con material de relleno. La tela primero se prelavó durante 10 min a 50 ºC y se enjuagó 3 veces. Después de eso, la tela de punto de algodón se trató con la celulasa a 40 ºC o 50 ºC durante 60 minutos. Las enzimas se dosificaron como unidades de actividad de celulasa neutra (UACN) por el peso del tejido. Después del escurrido, se inactivó la enzima (durante 10 min a 60 ºC) mediante el incremento del pH por encima de 11 con hidróxido de sodio. A continuación, el tejido se enjuagó tres veces y se secó en una secadora de tambor.
15 Tabla 16. Los parámetros del procedimiento/condiciones de la prueba que se utilizan en los tratamientos de bioacabado
Parámetro del procedimiento
Carga de tela
1,0 kg
Agua
15 l
Ajuste del pH
Con ácido acético (80%)
Tiempo
60 min
Temperatura
40 ºC/50 ºC
Dosis de la celulasa
250 UACN/g de tela
Las muestras del género de punto se evaluaron visualmente de acuerdo con la cantidad detectada de fibrillas y pelusa superficiales. El resultado de cada evaluación se cuantificó mediante la indicación del resultado respecto a 20 una escala que consiste en estándares. Estos estándares eran piezas de la misma tela lavada con diferentes cantidades de celulasa y tenían un margen de intensidad de fibrillas/pelusa superficiales de 1 a 5 con intervalos de media unidad. El número 0 era una muestra de control tratada sin la enzima. Cuanto mayor es el número, mejor es el efecto de desfrisado/desbarbado. El número 5 significa que se retiraron las fibrillas/pelusa superficiales. Los resultados se muestran en las tablas 17 y 18. Los resultados de las tablas 17 y 18 muestran que
25 Gp_RF6293_Cel45A, Gp_RF6546_Cel45A y Fe_RF6318_Cel45A tienen excelentes propiedades de desfrisado. Era sorprendente que Gp_RF6293_Cel45A fuera eficaz a una dosificación de la actividad mucho más baja a la hora del desfrisado/desbarbado que en el tratamiento de la tela vaquera en los ejemplos anteriores. También se encontró que el margen de pH más óptimo para Gp_RF6293_Cel45A para el desfrisado era de 5,5 a aproximadamente 7.
19
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SEQ ID n.º
Secuencia
9
Fragmento de PCR obtenido de F. cf. equiseti RF6546 con los cebadores Cel45_S1 y Cel45_AS3
10
Fragmento de PCR obtenido de G. pannorum RF6608 con los cebadores Cel45_S1 y Cel45_AS3
11
Fragmento de PCR obtenido de G. pannorum RF6608 con los cebadores Cel45_S1 y Cel45_AS3
12
Secuencia de nucleótidos del gen cel45A de G. pannorum RF6293
13
Secuencia de aminoácidos deducida de Cel45A de G. pannorum RF6293
14
Secuencia de nucleótidos del gen cel45B de G. pannorum RF6293
15
Secuencia de aminoácidos deducida de Cel45B de G. pannorum RF6293
16
Secuencia de nucleótidos del gen cel45A de F. cf. equiseti RF6318
17
Secuencia de aminoácidos deducida de Cel45A de F. cf. equiseti RF6318
18
Secuencia de nucleótidos del gen cel45A de G. pannorum RF6546
19
Secuencia de aminoácidos deducida de Cel45A de G. pannorum RF6546
20
Secuencia de nucleótidos del gen cel45A de G. pannorum RF6608
21
Secuencia de aminoácidos deducida de Cel45A de G. pannorum RF6608
22
Secuencia de nucleótidos del gen cel45B de G. pannorum RF6608
23
Secuencia de aminoácidos deducida de Cel45B de G. pannorum RF6608
Microorganismos depositados Cepa depositada Colección del cultivo Fecha del depósito Número de acceso
Geomyces pannorum RF6293 1) 7 de abril de 2006 CBS 119567 Fusarium cf. equiseti RF6318 1) 7 de abril de 2006 CBS 119568 Geomyces pannorum RF6546 1) 16 de junio de 2006 CBS 119958 Geomyces pannorum RF6608 1) 16 de junio de 2006 CBS 119962 Cepa de E. coli que incluye el 2) 10 de enero de 2007 DSM 18916 plásmido pALK2206 Cepa de E. coli que incluye el 2) 16 de marzo de 2007 DSM 19171 plásmido pALK2221 Cepa de E. coli que incluye el 2) 16 de marzo de 2007 DSM 19173 plásmido pALK2226
23
Cepa de E. coli que incluye el 2) 10 de enero de 2007 DSM 18915 plásmido pALK2208
Cepa de E. coli que incluye el 2) 10 de enero de 2007 DSM 18917 plásmido pALK2207
Cepa de E. coli que incluye el 2) 16 de marzo de 2007 DSM 19170 plásmido pALK2219
1) Centraalbureau Voor Schimmelcultures en Upsalalaan 8, 3508 AD, Utrecht, Países Bajos.
2) Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Inhoffenstrasse 7B, D-38124 Braunschweig, Alemania.
24

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  1. imagen1
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FI20086253A FI122029B (fi) 2008-12-30 2008-12-30 Sieniperäiset endoglukanaasit, niiden tuotto ja käyttö
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PCT/FI2009/051043 WO2010076388A1 (en) 2008-12-30 2009-12-28 Fungal endoglucanases, their production and use

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