MX2011007142A - Endonucleasas fungicas, su produccion y uso. - Google Patents

Abstract

Se describen endonucleasas fúngicas novedosas con desempeño substancial a bajas temperaturas. Las endonucleasas convenientemente son producidas a través de tecnología recombinante, y se describen medios para su producción. Las endonucleasas se utilizan para tratar material celulósico, en especial en la industrial textil, por ejemplo, en el bio-acabado o bio-lavado a la piedra. También se pueden utilizar en detergentes, en alimento para animales y/o en la industria de pulpa y papel o producción de bioetanol.

Description

ENDONUCLEASAS FU NGICAS. SU PRODUCCION Y USO CAMPO DE LA INVENCION La invención se refiere a endonucleasas fúngicas novedosas, su producción y medios para su producción. La invención además se refiere a preparaciones enzimáticas que comprenden por lo menos una endonucleasa novedosa así como procedimientos para tratar material celulósico con las mismas. Aún más, la invención se refiere a composiciones detergentes y alimento para animales que comprenden las endonucleasas.

ANTECEDENTES DE LA I NVENCION Las celulasas se encuentran entre las enzimas más ampliamente utilizadas en la industria. Generalmente se aplican en la industria textil, industria de detergente, industria de pulpa y papel , industria de alimentación y de alimento, incluyendo horneado y en hidrólisis de material lignocelulósico para, por ejemplo, producción de bioetanol, etc. El uso práctico de las celulasas se ve obstaculizado por la naturaleza de las composiciones de celulasa, las cuales por lo regular son mezclas de enzimas que tienen una variedad de actividades y especificidades de substrato. Por esta razón, se han hecho esfuerzos para obtener celulasas que tengan solamente las actividades deseadas. Las únicas propiedades de cada celulasa las hacen más adecuadas para ciertos propósitos que para otros .

En el tratamiento de telas, las celulasas atacan las cadenas de moléculas de celulosa que forman las fibras de algodón, afectando así las características de la tela.

En la industria textil, una apariencia de "lavado a la piedra" o gastada ha sido el interés de los productores de dril de algodón en los últimos años. El lavado con piedra tradicional con piedra pómez reduce la resistencia de la tela y preocupaciones de los aparatos para lavar. La tendencia ha sido a procedimientos de acabado de dril de algodón enzimático y las celulasas han reemplazado o se están utilizando junto con piedras pómez para dar a la tela su apariencia de "gastada" deseada. Los tratamientos de enzima controlados dan como resultado menos daño a las prendas y máquinas y eliminan la necesidad del desecho de piedras.

Demás, la industria textil utiliza celulasas en el bio-acabado (acabado biológico), es decir, para crear una mejora permanente de depilación, y para mejorar la resistencia a la formación de motas, estructura de superficie clara a través de pelusa reducida, mejorar el manejo textil, tal como suavidad, uniformidad y una sensación sedosa , mejorar la capacidad de caída de la tela y colores más brillantes del textil y mejorar la capacidad de absorción de humedad .

Las celulasas comprenden un dominio/núcleo catalítico (CD) que expresa la actividad de la celulasa. Además del dominio catal ítico, la molécula de celulasa puede comprender uno o más dom inios de unión de celulosa (CBDs) , también denominados como dom inios/módulos de unión de carbohidrato (CBD/CBN) , los cuales pueden ser localizados ya sea en el término N o C del dom in io catalítico. Los CBDs tienen actividad de unión de carbohidrato y facilitan la acción enzimática en substratos sólidos. El núcleo catal ítico y el CBD típicamente están conectados a través de una región enlazadora flexible y altamente glicosilada.

Las celulasas que atacan principalmente sobre la superficie de la fibra son especialmente útiles en el lavado con piedra del dril de algodón teñido con un colorante índigo, ya que el colorante está colocado sobre la superficie de la fibra. Las celulasas aplicadas en un tratamiento de dril de algodón usualmente se dividen en dos grupos principales: celulasas ácidas y neutra. Las celulasas ácidas típicamente operan a un pH de 4.0-5.5 y las celulasas neutras en la escala de un pH de 6-8. Las celulasas ácidas especialmente se utilizan en el bio-acabado (depilación) y también en el tratamiento de dril de algodón (utilización de piedra, biológica), mientras que las celulasas neutras típicamente se utilizan en aplicaciones de dril de algodón .

Las endonucleasas (EGs) son uno de los tres tipos de celulasas generalmente necesarias para la conversión biológica de celulosa a glucosa. Algunas endonucleasas de existencia natural tienen un dominio de unión de celulosa (CBD), mientras que otras no. Las endonucleasas son ampliamente utilizadas en la industria textil , detergente, bioetanol, y pulpa y papel .

Las celulasas que incluyen endonucleasas pueden ser clasificadas en varias familias de glicosil hidrolasa de acuerdo con su secuencia primaria, apoyada por el análisis de la estructura tridimensional de algunos miembros de la familia (Henrissat 1991, Henrissat y Bairoch 1993, 1996). Por ejemplo, las familias de glicosil hidrolasa 5, 7, 12 y 45 contienen endonucleasas. La mayoría de las celulasas textiles ácidas pertenece a la familia 5, mientras que la mayoría de las celulasas textiles neutras son de la familia 12 ó 45.

El amplio espectro de usos industriales para endonucleasas ha establecido la necesidad de productos comerciales de endonucleasa que muestren un desempeño deseado a las condiciones deseadas, tales como escalas de pH y de temperatura.

La mayoría de las enzimas industrialmente utilizadas trabajan mejor a temperaturas elevadas, usualmente alrededor de >50°C, pero por razones de ahorro de energía, solidez del color, y reducción de encogimiento de las prendas, existe la necesidad de enzimas con buen desempeño a niveles más bajos de temperatura, es decir, <50°C, por ejemplo, de aproximadamente 30 a 40°C, o aún de 20 a 40°C. Dichas enzimas activas en frío han sido descritas en, por ejemplo, bacterias, especialmente Bacillus. Sin embargo, la producción de enzimas bacterianas para aplicaciones industriales es complicada y laboriosa, comparado con la producción de enzimas fúngicas. Sigue existiendo un conocimiento muy pequeño pero aproximadamente posible de endonucleasas fúngicas activas con frío.

Para conocimiento, ninguna endonucleasa de acción sin frío de la familia 45 ha sido aún descrita.

Una endonucleasa de la familia Cel45 se describe en la patente de E.U.A. 5,610,129, la cual describe composiciones inhibidoras de transferencia de colorante que contienen una celulasa kd43 de Humicola insolens. No se describen sus propiedades térmicas.

Las enzimas Cel45 de Gibberella zeae no han sido propuestas para ser utilizadas en acabado textil.

La Patente de E.U.A. 7,256,032 describe celulasas Cel45 que tienen buen desempeño en acabado textil. El desempeño en el acabado de dril de algodón es óptimo a 60°C, y la temperatura más baja medida es de 40°C con menos de 50% de la actividad óptima.

La Patente US2005/070003 describe preparaciones de celulasa con buen desempeño en, por ejemplo, composiciones de lavandería, textiles recientemente fabricados con bio-pulido y proporcionan una apariencia de gastado a la tela celulósica. Ninguna de las enzimas descritas muestra un desempeño ventajoso a bajas temperaturas.

De esta manera, existe la necesidad continua de celulasas nuevas y ventajosas que tengan propiedades deseadas y perfiles térmicos. La presente invención satisface esta necesidad.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION La presente invención ahora proporciona endonucleasas novedosas de la familia cel45, con un único perfil térmico mostrado por tener buen desempeño también a bajas temperaturas. Las únicas propiedades térmicas representan que no se ve ninguna reducción importante en el desempeño cuando la temperatura está por debajo de 50°C, por ejemplo, aproximadamente 40°C, aproximadamente 30°C , o aún aproximadamente 20°C. Las endonucleasas son útiles en diferentes aplicaciones de celulasa, tales como tratam iento de telas, especialmente tratamiento de dril de algodón y depilación. Contrario a las enzimas de depilación previamente descritas, las cuales generalmente son celulasas ácidas, las endonucleasas novedosas también trabajan bien a un pH relativamente neutro. Esto permite un tratamiento de bio-pulido simultáneamente con la aplicación de color, conduciendo a considerables ahorros. También la solidez del color por lo general es mejor a condiciones neutras.

La presente invención proporciona un polipéptido de endonucleasa fúngica, que pertenece a la familia 45 de glicosil hidrolasa, y que muestra un desempeño substancial a bajas temperaturas. La invención además proporciona una preparación enzimática que comprende dicha endonucleasa, y composiciones detergentes y alimento para animales que comprende dicha enzima o preparación enzimática.

En particular, la invención está dirigida a endonucleasas que comprenden una secuencia de aminoácido que tiene al menos 65% de identidad de secuencia con SEC I D NO: 1 3, al menos 48% de identidad de secuencia con SEC I D NO: 1 5, al menos 87% de identidad de secuencia con SEC ID NO: 17, al menos 62% de identidad de secuencia con SEC ID NO: 19, al menos 59% de identidad de secuencia con SEC ID NO: 21, o al menos 49% de identidad de secuencia con SEC ID NO: 23, o un fragmento enzimáticamente activo del mismo.

La invención además está dirigida a un polinucleótido aislado a partir del grupo que consiste de: a) una secuencia de nucleótido que tiene SEC ID NO: 12, 14, 16, 18, 20 ó 22, o una secuencia que codifica el polipéptido de endonucleasa descrito anteriormente, b) una estructura de cadena de complementariedad de a), o c) una secuencia que está degenerada como resultado del código genético a cualquiera de las secuencias de a) o b).

La invención además está dirigida a un vector de expresión que comprende dicho polinucleótido, una célula huésped que comprende dicho vector de expresión, y una cepa de E. coli teniendo el número de acceso DSM 18916, DSM 19171, DSM 19137, DSM 18915, DSM 18917, o DSM 19170.

Aún más la invención proporciona un método para la producción del polipéptido de endonucleasa, que comprende los pasos de transformar una célula huésped con un vector de expresión que codifica dicho polipéptido, y cultivar dicha célula huésped bajo condiciones que permiten la expresión de dicho polipéptido, y opcionalmente recuperar y purificar dicho polipéptido.

Finalmente, la invención proporciona un procedimiento para tratar material celulósico, en donde dicho procedimiento comprende poner en contacto el material celulósico con la preparación de polipéptido de endonucleasa o enzima de la invención.

Las modalidades específicas de la invención se establecen en las reivindicaciones dependientes. Otros objetos, detalles y ventajas de la presente invención serán evidentes a partir de los siguientes dibujos, descripción detallada y ejemplos. Sin embargo, se debe entender que las modalidades dadas en la descripción, dibujos y en los ejemplos son solo para propósitos ilustrativos, y que son posibles varios cambios y modificaciones dentro del alcance de las reivindicaciones.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS La Figura 1 es una imagen esquemática de los casetes de expresión utilizados en la transformación de protoplastos de Trichoderma reesei para la sobre-producción de las proteínas Cel45 recombinantes.

La Figura 2A muestra el pH óptimo de las preparaciones de proteína Cel45 recombinante, y la Figura 2B muestra la estabilidad térmica de las preparaciones de proteína Cel45 recombinante.

Las Figuras 3A-E muestran perfiles de temperatura de preparaciones Cel45 novedosas comparados con las preparaciones Cel45 comerciales en el tratamiento de dril de algodón.

Las Figuras 4A-B muestran el desempeño de las preparaciones Cel45 novedosas a diferentes valores de pH en el tratamiento de dril de algodón.

La Figura 5 muestra el desempeño de Gp_RF6293_Cel45 en el tratamiento de bio-pulido (quitar pelusa) a 40°C comparado con una muestra de control sin enzima.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION La invención se basa en estudios en donde se examinó mediante fluoroscopia la actividad celulolítica a baja temperatura. Se cultivaron cepas fúngicas a 20°C durante 3-7 días utilizando varios medios de producción. Se recuperaron sobrenadantes y se probó la actividad celulolítica contra carboximetilcelulosa (CMC) e hidroxietilcelulasa (HEC) a temperaturas de 30°C y 50°C para clasificar perfiles a baja temperatura. Las cepas más favorables se probaron más en aplicaciones de bio-lavado a la piedra a pequeña escala después de un cultivo a 20°C durante 4-7 días. Después de la clasificación preliminar, se seleccionaron 4 cepas para la construcción de bibliotecas genómicas, y las bibliotecas además se clasificaron para genes ce/45 con sondas amplificadas utilizando iniciadores de degeneración. Se subclonaron clones de carga positiva a vectores bacterianos y se confirmó secuenciando antes de la deposición en DSMZ. Para la producción de las enzimas Cel45, los genes que codifican actividades deseadas fueron fusionados al promotor cbh1/cel7A de Trichoderma reesei. La terminación de la transcripción se aseguró a través de un terminador cbh1/cel7A de T. reesei, y se utilizó un marcador amdS para clasificar clones positivos. Se aislaron los casetes de expresión lineal a partir de la estructura de cadena del vector y se transformaron a protoplastos de T. reesei teniendo celulasas principales eliminadas. Se cultivaron transformantes purificados durante 7 días en un medio de inducción de celulasa y se probó la actividad de endonucleasa a partir del sobrenadante de cultivo. También se probaron las propiedades térmicas y de pH. Se obtuvo material para aplicación a gran escala a través de cultivos de bio-reactor de laboratorio a 28°C durante 3-4 días seguido por filtración y concentración cuando fue necesario.

Los sobrenadantes de cultivo se probaron en el tratamiento de dril de algodón a diferentes temperaturas utilizando dos preparaciones comerciales de cel45 como referencia en una máquina lavadora. Se evaluó el efecto de bio-lavado a la piedra resultante utilizando una medición de reflectancia de color. Sorprendentemente, se encontró que los perfiles de temperatura medidos en la aplicación fueron diferentes des aquellos recibidos en la caracterización primaria en tubos de ensayo. Además, se probaron las propiedades de pH de las muestras en la aplicación al dril de algodón. Además, el efecto de depilar/quitar pelusa en tejido de pelo largo de hilo de algodón se probó en una máquina lavadora con diferentes dosis de enzima y se comparó con una muestra de la técnica anterior. Sorprendentemente. Se obtuvo una superficie libre de pelusa a baja temperatura utilizando una dosis más baja que la que se esperaba basándose en pruebas en el tratamiento de dril de algodón.

La presente invención proporciona polipéptidos novedosos de endonucleasa fúngica de la familia 45 de glicosil hidrolasa con un desempeño substancial a bajas temperaturas. Polipéptido y proteína como se utilizan aquí son sinónimos.

"Fúngico" en este contexto significa que la endonucleasa o el polinucleótido que la codifica puede derivarse de un hongo, y especialmente de un hongo filamentoso, tal como Geomyces o Fusarium. De acuerdo con una modalidad específica de la invención, la endonucleasa se deriva de G. pannorum o F. cf equiseti, muy preferiblemente de G. pannorum RF 6293 (CBS 119567), F. cf. equiseti RF6318 (CBS 119568), G. pannorum RF6546 (CBS 119958), o G. pannorum RF6608 (CBS 119962).

El término "derivado o derivarse de" con relación a una fuente de microorganismo, significa que el polipéptido puede ser producido de manera natural a través de dicha fuente específica de microorganismo, o el polinucleótido que codifica al polipéptido puede ser aislado de dicha fuente de microorganismo, y opcionalmente expresarse en una célula huésped en donde el polinucleótido o una versión sintetizada del mismo, posiblemente utilizando codones alternativos, de dicha fuente de microorganismo que codifica el polipéptido, ha sido introducido. Sin embargo, no excluye modificaciones menores de la secuencia, por ejemplo, a través de substitución, eliminación y/o inserción de uno o algunos de los aminoácidos/nucleótidos siempre que la actividad enzimática de la proteína codificada o secretada sea retenida.

"Endonucleasa" ("EG") con relación a la presente invención , se refiere a enzimas clasificadas como E. C. 3.2. 1 .4. Estas son 1 , 4-beta-D-glucan 4-glucanohidrolasas y catalizan la endohidrólisis de enlaces 1 ,4-beta-D-glicosídicos en pol ímeros de g lucosa tales como celulosa . Algunas endonucleasas también pueden hidrolizar, por ejemplo, 1 , -enlaces en beta-D-glucanos también conteniendo 1 , 3-enlaces. Por lo tanto, también pueden clasificarse como endo-1 , 3(4)-beta-glucanasas (E .C. 3.2. 1 .6). De esta forma, una enzima puede catal izar reacciones en varios substratos y puede pertenecer a múltiples clases. Las endonucleasas de la invención opcionalmente pueden contener una secuencia individual, y uno o más dominios de unión de celulosa (CBDs enlazados al dominio/núcleo catal ítico (CD).

"Familia 45 de glicosil hidrolasa" se refiere a la familia de glicosil hidrolasa como se define por Henrissat 1 991 , y Henrissat y Bairoch 1993, 1996, las cuales se incorporan aquí para referencia . El gen que codifica la celulasa del familia 45 se denomina ce/45 y la proteína codificada se denomina Cel45.

Las endonucleasas de la invención muestran desempeño substancial a baja temperatura. "Desempeño substancial" en este contexto significa que las enzimas muestran un excelente desempeño cuando se aplican por lo menos en un tipo de procedimiento de aplicación de celulasa, tal como, por ejemplo, bio-lavado a la piedra y/o bio-acabado de textiles, o en el lavado. Los perfiles únicos de temperatura de las endonucleasas novedosas pueden ser ilustrados por su "relación de 30: 50" en la aplicación de dril de algodón , lo cual indica un desempeño relatico (%) a 30°C comparado con 50°C. De preferencia, la relación de 30: 50 es al menos 72% , de preferencia al menos 80%, y muy preferiblemente al menos 90% ó 95% . Alternativamente, el perfil de temperatura puede ser ilustrado por una relación "40: OT\ que significa desempeño relativo (%) a 40°C comparado con una temperatura óptima. Preferiblemente, la relación 40: OT es al menos 80%, preferiblemente al menos 90% , y muy preferiblemente al menos 95%. "activo en frío* o "baja temperatura" como se utiliza aquí se refiere a una temperatura de <50°C, en especial <45°C, preferiblemente <40°C, incluyendo <30°C.

De acuerdo con una modalidad de la invención, la endonucleasa comprende una secuencia de aminoácido que tiene por lo menos un 65% de identidad de secuencia a SEC I D NO: 13, por lo menos 48% de identidad de secuencia a SEC I D NO: 1 5, por lo menos 87% de identidad de secuencia a SEC I D NO: 1 7, por lo menos 62% de identidad de secuencia a SEC I D NO: 1 9, por lo menos os 59% de identidad de secuencia a SEC I D NO: 21 , o por lo menos 49% de identidad de secuencia a SEC I D NO: 23, o un fragmento enzimáticamente activo de la m isma. De preferencia, la endonucleasa comprende una secuencia de aminoácido que tiene por lo menos 90%, de preferencia por lo menos 95% y muy preferiblemente por lo menos 98% ó 99% de identidad de secuencia a S EC I D NO: 13, 1 5, 1 7, 19, 21 , ó 23, o un fragmento enzimáticamente activo de la misma.

Como se utiliza en la presente, el término "identidad" se refiere a la identidad global entre dos secuencias de aminoácido comparadas entre sí a partir del primer aminoácido codificado por el gen correspondiente al último aminoácido. Para los propósitos de la presente invención, la identidad preferiblemente se determina a través de programas de computadora conocidos que utilizan algoritmos estándares. U n ejemplo de dicho programa es "Clone Manager Suite" , un programa que incluye la Parte de Alineación de parte del programa y se vende por Scientific & Educational Software, Durham , NC, E. U .A. de acuerdo con la presente invención, la versión del programa "Clone Manager 7Align Plus 5° que incluye las funciones "Comparar Dos Secuencias/Global/Comparar Secuencia de ADN° fue especialmente utilizado para determinar el grado de identidad. En este caso, se utilizaron algoritmos disponibles de las siguientes fuentes: Hirschberg, O. S. ( 1 975) Un algoritmo de espacio lineal para calcular sub-secuencias comunes más largas, Commun. Assoc. Comput, Mach. 1 8: 341 -343; Myers, E.W. y W. Miller. (1988) Alineaciones óptimas en espacio lineal, CABIOS 4: 1 , 1 1 -1 7; Chao, K-M, W. R. Pearson y W. Miller. (1992) Alineación de dos secuencias dentro de una banda diagonal especificada, CA-BIOS 8: 5, 481 - 487. Los expertos en la técnica están al pendiente del hecho de que los resultados son solo comparativos cuando se alinean dominios correspondientes de la secuencia. Consecuentemente, la comparación de, por ejemplo, secuencias de celulasa incluyendo C BD o secuencias de señal con secuencias que carecen de aquellos elementos son excluidas por no ser significante.

"Fragmento enzimáticamente activo" se refiere a parte de una secuencia de aminoácido específica que es lo suficientemente larga para tener la actividad enzimática deseada. En otras palabras, un fragmento puede ser, por ejemplo, solo la parte madura del polipéptido o aún una sub-secuencia de la parte madura. Puede o no contener un enlazador y un dominio CBD. Más específicamente, la actividad enzimática se refiere a la actividad de celulasa que tiene habilidad catalítica para hidrolasa celulosa o sus derivados, tal como actividad de endonucleasa o beta-glucanasa. Además de la actividad de endonucleasa y/o beta-glucanasa, algunas de las celulasas además pueden tener actividad de hemicelulasa y/o xilanasa. La actividad enzimática puede ser determinada como se describe en el Ejemplo 1.

Los polinucleótidos de la invención pueden ser ya sea ADN o ARN. De acuerdo con una modalidad de la invención, las endonucleasas son codificadas por un polinucleótido que tiene SEC IDO NO: 12, 14, 16, 18, 20 ó 22, o un fragmento del mismo lo suficientemente largos para codificar una endonucleasa enzimáticamente activa. De preferencia, las endonucleasas son codificadas por un polinucleótido similar a aquel llevado por E. coli DSM 18916, DS 19171, DSM 19173, DSM 18915, DSM 18917, o DSM 19170.

Las endonucleasas de la invención de preferencia son proteínas recombinantes. Convenientemente se preparan a través de tecnolog ía de ADN recombinante conocida en un huésped heterólogo u homólogo. De preferencia, la endonucleasa es sobre-expresada en un huésped fúngico. En resumen, el polinucleótido que codifica la endonucleasa es clonado e insertado a un vector de expresión , transformado a una célula huésped y expresado.

U n "vector de expresión" es un plásmido de clonación o vector capaz de expresar ADN que codifica las proteínas de endonucleasa después de la transformación a un huésped deseado. Cuando se utiliza un huésped fúngico, el gen de interés preferiblemente se proporciona a un huésped fúngico como parte de un vehículo de clonación o de expresión que se integra en el cromosoma fúngico, o permite que el gen de interés se integre en el cromosoma huésped . Otras secuencias que son parte del veh ículo de clonación o vehículo de expresión también pueden ser integradas con dicho ADN durante el proceso de integración . Además, en los hongos, el vector de expresión o partes del mismo pueden ser puntos de objetivo en sitios predeterminados. Alternativamente, el gene deseado puede ser provisto como un plásmido autónomamente de replicación.

El ADN que codifica las proteínas de endonucleasa de preferencia se coloca bajo el control de (es decir, operablemente enlazado a) ciertas secuencias de control tales como secuencias de promotor provistas por el vector. Después de la transformación , estas secuencias de control se integran en el genoma huésped con el gen de interés. Alternativamente, las secuencias de control pueden ser aquellas en el sitio de integración.

Las secuencias de control de expresión de un vector de expresión variarán dependiendo de si el vector está diseñado para expresar cierto gen en un huésped procariótico o en uno eucariótico. Las secuencias de control de expresión pueden contener elementos reguladores de transcripción tales como promotores, elementos mejoradores, y secuencias de terminación de transcripción , y/o elementos reguladores de transcripción, tales como sitios de inicio y de terminación de transcripción .

Se dice que una molécula de polinucleótido, tal como ADN , es capaz de expresar un polipéptido, si éste contiene secuencias de control de expresión, que contienen información reguladora de transcripción y dichas secuencias están operablemente enlazadas a la secuencia de nucleótido, que codifica el polipéptido.

Un enlace operable es un enlace en donde una secuencia está conectada a una secuencia (o secuencias) reguladora de tal manera que coloca la expresión de la secuencia bajo la influencia o el control de la secuencia reguladora. Se dice que dos secuencias de ADN (tal como una secuencia región de promotor enlazada al extremo 5' de la proteína que codifica la secuencia) están operablemente enlazadas si la función del promotor da como resultado la transcripción.

Los vectores de la invención además comprenden otros elementos operablemente reguladores, tales como secuencias mejoradoras.

En una modalidad preferida, se construyen transformantes genéticamente estables, por lo que el ADN que codifica las proteínas es integrado al cromosoma huésped a través de la transformación con un vector, que puede alojar secuencias que promueven la i ntegración de dicho vector en el cromosoma .

Las células que tienen ADN establemente integrado que codifica las proteínas de endonucleasa en sus cromosomas, pueden ser seleccionadas, por ejemplo, a través de marcadores introducidos, homólogos o heterólogos, los cuales permiten la selección de células huésped que contienen el vector de expresión en el cromosoma, por ejemplo, el marcador puede proporcionar resistencia biocida, por ejemplo, resistencia a antibióticos, o metales pesados, tales como cobre, o marcadores que complementan una mutación auxotrófica en el cromosoma huésped, y similares. El marcador seleccionable, por ejemplo, puede ser un gen de selección directamente enlazado a las secuencias de gen de ADN que se van a expresar, o introducir en la misma célula a través de co-transformación. También se pueden utilizar otros sistemas de selección.

Una vez que se prepara el vector de expresión que contiene el ADN que codifica la endonucleasa, éste es introducido en una célula huésped apropiada a través de cualquiera de una variedad de medios adecuados, incluyendo transformación como es conocido en la técnica. Después de la transformación, usualmente se desarrollan células receptoras en un medio selectivo apropiado, que se selecciona para el desarrollo de células transformadas.

Los sistemas huésped de expresión y producción son, por ejemplo, el sistema de producción desarrollado por huésped fúngicos Trichoderma (EP 244 234), o Aspergillus, tal como A. oryzae o A. niger (WO 97/08325 y WO 95/33386, Patente de E.U.A. No. 5,843,745. Patente de E.U.A. No. 5,770,418), o el sistema de producción desarrollado para Fusarium, tal como F. oxysporum (Malardier et al., 1989) o Chrysosporium lucknowense. De acuerdo con una modalidad preferida de la invención, se pueden utilizar parcialmente celulasa y/o hemicelulasa y/o proteasa deficiente de cepas huésped. Los sistemas de producción adecuados desarrollados para bacterias incluyen un sistema de producción desarrollado por Bacillus, por ejemplo, B. subtilis, B. iicheniformis, B. amyloliquefaciens o para E. coli, o para un actinomycete Streptomyces. Los sistemas de producción adecuados desarrollados para levaduras son sistemas desarrollados para Saccharomyces, Shizosaccharomyces, Pichia pastoris o Hansenula. También son posibles sistemas de producción en otros microbios que incluyen microbios de fermentación consolidados para la producción de bioetanol o en células de mamífero o en plantas.

La expresión de la secuencia(s) de gen clonada da como resultado la producción de la proteína deseada, o en la producción de un fragmento de esta proteína. Esta expresión puede tomar lugar en una forma continua en las células transformadas, o en una forma controlada.

Para obtener las preparaciones de enzima de la invención, los huéspedes que tienen las propiedades deseadas (es decir, huéspedes capaces de expresar cantidades económicamente aconsejables de las proteínas de endonucleasa) son cultivados bajo condiciones adecuadas, y las enzimas deseadas de preferencia son secretadas de los huéspedes al medio de cultivo, y opcionalmente recuperadas de dicho medio de cultivo a través de métodos conocidos en la técnica. De preferencia, el huésped para dicha producción es un hongo filamentoso, tal como Trichoderma o Aspergillus, y especialmente T. reesei.

Como se utiliza en la presente invención, la "preparación de enzima" se refiere a cualquier producto de enzima, el cual contiene por lo menos una de las endonucleasas novedosas aquí descritas. De esta manera, dicha preparación de enzima puede ser un medio de cultivo o filtro agotado. El medio de cultivo agotado significa el medio de cultivo del huésped que comprende las enzimas producidas. Preferiblemente, las células huésped son separadas de dicho medio después de la producción. Si se desea, dichas preparaciones pueden ser liofilizadas o la actividad enzimática, de otra manera, puede ser concentrada y/o estabilizada para almacenamiento. Si se requiere, una enzima deseada puede ser aislada y además purificada de acuerdo con métodos convencionales, tales como filtración, extracción, precipitación, cromatografía, cromatografía de afinidad, electroforesis, o similares.

Sin embargo, es una ventaja de la invención que el medio de cultivo con o sin células huésped pueda ser utilizado como una preparación de enzima así como sin purificación adicional, ya q ue las proteínas de endonucleasa pueden ser secretadas al medio de cultivo, y exhiben actividad en las condiciones ambientales del med io de cultivo agotado. La provisión y el uso de las preparaciones de enzima son muy económicos, ya que el aislamiento de una enzima específica del medio de cultivo es innecesario.

Además de una o más proteína de endonucleasa, las preparaciones de enzima pueden comprender una o más de otras encimas, las cuales, por ejemplo, pueden ser otras celulasas, amilasas, lipasas, proteasas, hemicelulasas, xilanasas, pectinasas y/u oxidasas, tales como lacasas, peroxidasas y catalasas. De forma alternativa, antes, durante o después del tratamiento con la proteína de endonucleasa, se pueden realizar otro tratamiento de enzima. El tratamiento de enzima puede comprender, por ejemplo, uno o más tratamientos de amilasa (por ejemplo, para el descrudado del dril de algodón), uno o más tratamientos de celulasa y/o uno o más tratamientos de peroxidasa y/o lacasa. Depende de la aplicación para q ue otras enzimas sean incluidas en la preparación de enzima o utilizadas en el tratamiento de enzima.

Además de la proteína de endonucleasa, la preparación de enzima puede contener aditivos, tales como estabilizadores, reguladores de pH , conservadores, agentes tensoactivos y/o componentes de medio de cultivo. Los aditivos preferidos son tales que son comúnmente utilizados en preparaciones de enzima destinadas para la aplicación, en donde la preparación de enzima se utiliza.

Las preparaciones de enzima pueden ser provistas como un líq uido o como un sólido, por ejemplo, como un polvo seco o granulado, especialmente gránulos no polvosos, o un liq uido estabilizado. Se contempla que las preparaciones de enzima además pueden ser enriquecidas para satisfacer los requerimientos de una instalación especifica en varias aplicaciones, por ejemplo, en la industria textil. Una mezcla de actividades de enzima secretada por un huésped puede ser ventajosa en una aplicación industrial particular, por ejemplo, en el bio-acabado y bio-lavado a la piedra .

Las proteínas de endonucleasa y sus preparaciones son útiles , por ejemplo, en aplicaciones textiles, alimentación y alimento, por ejemplo, horneado, en hidrólisis de biomasa, por ejemplo, en la producción de bioetanol, y en aceite vegetal, detergente, e industria de pulpa y papel. Pueden ser utilizadas para tratar cualquier material celulósico, tal como material textil, plantas o materia de origen vegetal en alimentación o alimento para animales, material vegetal para extracción de petróleo, o mecánico derivado de madera, o pulpa química o fibra secundaria. También pueden ser agregadas a detergentes, por ejemplo, para mejorar las propiedades de cuidado para telas mediante anti-formación de motas, anti-grisáceo, clarificación de color y suavidad, y para mejorar el efecto de limpieza textil, por ejemplo, remoción de manchas. Las composiciones detergentes además normalmente contienen auxiliares, tales como agentes activos en la superficie (agentes tensoactivos aniónicos, no iónicos, catiónicos y anfolíticos) , mejoradores de detergencia y otros ingredientes opcionales ta les como agentes anti-redeposición y de suspensión de suciedad , abrillantadores ópticos, agentes blanqueadores, colorantes y pigmentos e hidrolasas.

En la presente invención, "material celulósico'' se refiere a cualquier material que comprende celulosa o derivados de la misma como u n componente principal. El material celulósico se pone en contacto con una cantidad efectiva de la proteína bajo condiciones adecuadas, tales como pH apropiado, y temperatura, y la reacción se deja continuar durante un tiempo suficiente para que se presente la reacción enzimática. Las endonucleasas de preferencia se utilizan a una escala de temperatura de aproximadamente 20-50°C, y muy preferiblemente alrededor de 30-50°C . Las temperaturas útiles son de <50°C , por ejemplo, <45° , o en algunos casos <40°C, o aún <30°C . Una escala de pH adecuado es de aproximadamente 3-9, de preferencia alrededor de 4-8, y especialmente alrededor de 5-6.5.

Las endonucleasas son especialmente útiles en el tratamiento de materiales textiles, tales como telas y prendas o hilo. El material textil puede ser fabricado de fibras conteniendo celulosa natural o fibras que contienen celulosa hecha por el hombre, o mezclas de las mismas, o una mezcla de fibras sintéticas y fibras que contengan celulosa. De preferencia, el material q ue contiene celulosa es algodón, especialmente dril de algodón. Por "dril de algodón" se quiere dar a entender, con relación a esta invención, tela de dril de algodón , usualmente prendas de dril de algodón, en particular pantalones de mezclilla (jeans) . Ventajosamente, el dril de algodón es dril de algodón teñido con índigo. El dril de algodón también puede ser tratado con derivados de índigo o con índigo junto con algún otro colorante, por ejemplo, dril de algodón teñido con índigo con fondo de azufre.

Las endonucleasas descritas son especialmente útiles en la industria textil, preferiblemente en bio-lavado a la piedra o bio-acabado.

El lavado a la piedra tiene tres etapas: descrudado, abrasión y tratamiento posterior. El primer paso, el procedimiento de descrudado es normalmente el primer tratamiento húmedo de los jeans y significa la remoción de almidón u otros agentes de encolado usualmente aplicados a los hilos de urdimbre para evitar el daño durante el procedimiento de tejeduría. Se utilizan alfa-amilasas para remover agentes de encolado a base de alm idón para un procesamiento en húmedo mejorado y uniforme. Después del descrudado, los jeans normalmente son enjuagados con agua o se hacen pasar directamente al paso de abrasión .

El segundo paso, abrasión, puede ser realizado con enzimas o piedras pómez, o ambas. En todos los casos, es necesaria la acción mecánica para remover el colorante, y el tratamiento usualmente se realiza en máquinas lavadores, tales como lavadoras de tambor. El término "raspado" significa la apariencia de tela de dril de algodón , cuando ha sido tratada a través de enzimas de celulasa o piedras, o ambas. Las expresiones de sinónimo son "apariencia de lavado a la piedra" o "apariencia gastada". Como resultado de una remoción dispareja de colorante se encuentran contrastes entre áreas teñidas y aéreas en donde se ha removido el colorante.

La abrasión generalmente va seguida por el tercer paso, el tratamiento posterior, que incluye los pasos de lavado y enjuague, durante los cuales se pueden utilizar detergentes, abrillantadores ópticos, agentes blanqueadores o suavizantes. Después del tratamiento enzimático, la reacción debe ser detenida con el fin de evitar un daño de los materiales tratados, por ejemplo, a través de inactivación de temperatura y/o pH, esto último comprendiendo un enjuague y/o lavado de detergente muy completo. Esto asegura que la resistencia mecánica de la fibra no se ve más comprometida por la presencia continua de la enzima.

Como se utiliza en la presente invención, la expresión " bio-lavada a la piedra" de la tela o prendas representa el uso de enzimas en lugar de, o además, piedras pómez para el tratamiento de telas o prendas, especialmente dril de algodón.

Como se estableció anteriormente, el tratamiento con celulosa puede reemplazar completamente al tratamiento con piedra pómez. Sin embargo, el tratamiento con celulasa también puede ser combinado con el tratamiento con piedra pómez, cuando se desea producir un acabado totalmente raspado.

Además, las endonucleasas son útiles en el bio-acabado de telas y prendas. "Bio-acabado" (también denominado remover formación de motas, quitar pelusa, quitar vello o bio-acabado) se refiere al uso de enzimas en una hidrólisis controlada de fibras celulósicas con el fin de modificar la superficie de la tela o hilo en una forma que permanentemente evita la tendencia a formación de motas, mejora el manejo de la tela tal como suavidad y uniformidad , limpia la estructura de la superficie al reducir la formación de pelusa, lo cual da como resultado la clarificación de colores y también puede mejorar la capacidad de la caída de la tela , absorbencia de humedad y la capacidad de teñido de la tela.

Usos adicionales incluyen el uso en composiciones detergentes para mejorar las propiedades del cuidado de telas por anti-formación de motas, anti-grisáceo, clarificación de color y suavidad, y para mejorar el efecto de limpieza del textil, por ejemplo, remoción de suciedad .

La remoción, en forma enzimática, de la formación de motas puede realizarse en cualquier etapa durante el procesamiento en húmedo de textiles, preferiblemente después del descrudado y/o blanqueo, y se pueden utilizar condiciones similares para el bio-lavado a la piedra. También se pueden tratar textiles en forma de prendas.

La relación de licor (la relación de volumen de líquido por peso de la tela) tanto en el bio-lavado a la piedra como el bio-acabado puede variar de aproximadamente 1 3: 1 a 20: 1 , de preferencia 5: 1 a 1 0: 1 . El tiempo de tratamiento puede varias de entre 15 minutos a 90 minutos y de preferencia de 30 minutos a 60 minutos. Se debe enfatizar que la dosis de enzima enormemente depende del tipo de las telas, maquinaria, condiciones de procedimiento (pH , temperatura, relación de licor, tiempo de tratamiento, carga de d ril de algodón , escala de procedimiento) y el tipo de preparación de enzima , y similares. Un experto en la técnica es capaz de definir-las dosis y condiciones adecuadas.

El procedimiento de la invención para tratar material celulósico también abarca la hidrólisis del material lignocelulósico para, por ejemplo, la producción de bioetanol. Un ejemplo del uso de bio-procesamiento consolidado (CBP) en la hidrólisis de material lignocelulósico se describe, por ejemplo, por Zyl et al. , en Adv Biochem Eng Biotechnol. 2007; 108:205-35.

La invención además se ilustra a través de los siguientes ejemplos.

Ejemplo 1 . Clasificación para cepas que expresan actividad celulósica a baja temperatura Aproximadamente 1 80 cepas fúngicas en la colección de cultivo de Roal Oy se probaron para su capacidad para producir actividad celulósica a baja temperatura. Las cepas fúng icas se cultivaron en un volumen de 100 mi en agitador giratorio (200 rpm) a una temperatura de 20°C durante 3-7 d ías. Se probaron varios medios de producción conteniendo celulosa Solka Floc como una fuente de carbón. Después del cultivo, las células y otros sólidos fueron recolectados a través de centrifugación y el sobrenadante se recuperó. Si no se utiliza inmediatamente, la preparación se almacena en alícuotas a -20°C .

Para el cálculo de la actividad enzimática a temperaturas más bajas, se realizaron ensayos de la preparación de cultivo del matraz de agitación a 30°C y 50°C durante 1 hora . Todos los sobrenadantes del matraz de agitación se analizaron para las siguientes actividades.

La actividad de endonucleasas (CMCase): Esto se analizó con 3% (p/v) de carboximetilcelulosa (CMC) como el substrato en 50 mM de regulador de pH de citrato esencialmente como se describió por Baley y Nevalainen 1 981 : Haakana et al. , 2004. Se midieron los azúcares de reducción con el reactivo DNS. El ensayo se realizó a un pH tanto de 5.0 como de 7.0.

La actividad de la endonucleasa (HEC) : Esta se analizó con 1 % (p/v) de hidroxietilcelulosa (HEC) como el substrato en 50 mM de regulador de pH de citrato esencialmente como se describió por Baley y Nevalainen 1 981 . Se midieron los azúcares de reducción con el reactivo DNS. El ensayo se realizó a un pH tanto de 5.0 como de 7 0 Se probaron preparaciones de sobrenadante de cultivo de las cepas en una aplicación de bio-lavado a la piedra a pequeña escala en un LP-2 Launder Ometer, como sigue. Aproximadamente 7.2 g de muestras de dril de algodón descrudado ( 12x12 cm) se cargaron con bolas de acero en contenedores de 1 .2 litros conteniendo 1 00 mi de regulador de pH de Me LLvaine y 100 mi de sobrenadante de cultivo, y el aparato Launder Ometer se corrió a 30°C durante 120 minutos. Después del lavado alcalino y detergente, las muestras de tela se enjuagaron cuidadosamente con agua caliente y se secaron con aire. Los resultados se evaluaron visualmente y midiendo el color como valores de reflectancia (datos no mostrados).

Después de la clasificación preliminar, se eligieron cuatro cepas (Geomyces pannorum RF6293, RF6546 y RF6608, y Fusarium cf. equiseti RF6318) para estudios de aplicación adicionales. Para ese propósito, las cepas RF6546 y RF6608 se cultivaron en un volumen de 200 mi en un agitador giratorio (200 rpm) a una temperatura de 20°C durante 4-7 días en un medio, el cual contuvo, g/litro: celulosa Solka Floc 10.0, polvo de maíz fermentado 1.5, soya 0.5, CaC03 0.5, (NH4)2HP04 1.5, KH2P04 2.0, MgS04 H20 0.5, NaCI 0.5, NH4NO3 0.5, Tween- 80 0.5, solución de elementos huella #1 0.5, solución de elementos huella #2 0.5, aceite de parafina 0.5; el pH se ajustó a 6.4. Solución de elementos huella #1 (mg/litro): MnS04 1.6, ZnS04 H20 3.45, CoCI2 H20 2.0; solución de elementos huella #2 (mg/litro): FeS04 H20 5.0. Las cepas RF6293 y RF6318 se cultivaron en un volumen de 200 mi en un agitador giratorio (200 rpm) a una temperatura de 20°C durante 4-6 días en un medio, el cual contuvo, g/litro: celulosa Solka Floc 30.0, polvo de maíz fermentado 9.0, soya 1.5, CaC03 1.5, (NH4)2HP04 4.5, KH2P04 6.0, MgS04H20 1.5, NaCI 0.5, NH4N03 1.5, Tween-80 0.5, solución de elementos huella #1 0.5, solución de elementos huella #2 0.5, aceite de parafina 0.5; el pH se ajustó a 6.4. Solución de elementos huella #1 (mg/litro): MnS04 1.6, ZnS04 H20 3.45, CoCI2 H20 2.0; solución de elementos huella #2 (mg/litro): FeS0 H20 5.0.

Ejemplo 2: Clonación de los genes de endonucleasa a partir de Geomyces pannorum RF6293, RF6546, RF6608, y Fusarium cf. equiseti RF6318 Se utilizaron métodos moleculares estándares en el aislamiento y tratamiento de enzima de ADN (plásmidos, fragmentos de ADN), en transformaciones de E. coli, etc. Los métodos básicos utilizados se describen en los libros estándares de biología molecular, por ejemplo, Sambrook et at., (1989) y Sambrook y Russell (2001).

Se utilizó el vector Lambda DAS ®\\/BamHI (Stratagene, USA) en la construcción de las bibliotecas genómicas para Geomyces pannorum RF6293, RF6546, RF6608, y Fusarium cf. equiseti RF6318 de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Los ADNs cromosómicos, aislados a través del método de Raede y Broda (1985), fueron parcialmente digeridos con Sau3A. Los ADNs digeridos fueron fraccionados por tamaño y los fragmentos del tamaño seleccionado (5-20 kb) se ligaron a los brazos del vector lambda digerido con BamH\. Las mezclas de ligación se empacaron utilizando extractos de empaque Gigapack III Gold de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Stratagene, USA). Las titulaciones de las bibliotecas genómicas construidas se presentan en el Cuadro 1.

Cuadro 1. Titulaciones de las bibliotecas genómicas construidas Las bibliotecas genómicas de Geomyces pannorum RF6293, RF6546, RF6608, y Fusarium cf. equiseti RF6318 se clasificaron con las sondas, las cuales fueron amplificadas a través de PCR utilizando iniciadores de degeneración y el ADN genómico como una plantilla. Las secuencias de los iniciadores heterólogos se basaron en las secuencias conservadas de endoglucanasa (Cuadro 2, SEC ID NO: 1-5). Las secuencias conservadas se identificaron al alinear las secuencias de aminoácido previamente publicadas de Humicola grísea var. Thermoidea AB003107, Fusarium oxysporum L29381, Melanocarpus albomyces AJ515703 y Gibberella zeae AY342397. Las mezclas de reacción de PCR contuvieron 10 mM Tris-HCI, pH 8.8, 50 mM KCI, 0.1 % Tritón X-100, 1.5 mM MgCI2, 0.1 mM dNTPs, 1 µ? de cada iniciador y 1-2 unidades de polimerasa de ADN Dynazyme II (Finnzymes, Finlandia) y 0.5-1 pg del ADN genómico. Las condiciones para las reacciones de PCR fueron las siguientes: 5 minutos de desnaturalización inicial a 95°C, seguido por 30 ciclos de 1 minuto a 95°C, 30 seg de fijación a 52.5°C (±7.5°C), 1 minuto de extensión a 72°C y una extensión final a 72°C durante 5 minutos. Las plantillas de ADN genómico utilizadas en las reacciones de PCR se listan en el Cuadro 3.

C uadro 2. Los oligonucleótidos de degeneración probados como iniciadores de PCR para amplificar sondas para la clasificación de genes de endonucleasa a partir de Geomyces pannorum RF6547, RF6546, RF6608, y Fusarium cf. equiseti RF6318 (a D = A o G o T, R = A o G, S = C o G, N = A o g o T o C, Y = T o C; "s" entre paréntesis = estructura de cadena de sentido, "as" entre paréntesis = estructura de cadena antisentido.

A partir de varias reacciones se obtuvieron productos de ADN teniendo los tamaños esperados (estimados a partir de las secuencias de endonucleasa publicadas). Los fragmentos de ADN de los tamaños esperados se aislaron de las reacciones de PCR más específicas y se clonaron al vector pCR® 4-TOPO® (I nvitrogen , USA). Los insertos se caracterizaron por secuenciación y realizando hibridaciones de tinción Southern a los ADNs genómicos digeridos con varias enzimas de restricción. Los fragmentos de PCR, los cuales fueron elegidos como sondas para la clasificación de las bibliotecas genómicas Geomyces pannorum RF6293, RF6546, RF6608, y Fusarium cf. equiseti RF6318 se presentan en el Cuadro 3.

Cuadro 3. Los iniciadores utilizados en las reacciones de PCR y sondas elegidas para clasificar los genes de endonucleasa a partir de bibliotecas genómicas de Geomyces pannorum RF6293, RF6546, RF6608, y Fusarium cf. equiseti RF6318. Se muestran el ADN de plantilla genómico y el nombre del plásmido conteniendo el fragmento de sonda.

Las secuencias de aminoácido deducidas a partir de todas estas sondas tuvieron homología con varias secuencias Cel45 publicadas (programa BLAST, versión 2.2.9 a NCBI, National Center for Biotechnology Information; Altschul et al., 1990).

Los insertos de los plásmidos listados en el Cuadro 3 fueron marcados con digoxigenina de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Roche, Alemania). Las bibliotecas genómicas amplificadas (1x105-6x105 placas) fueron clasificadas con fragmentos de sonda marcados. La temperatura de hibridación para los filtros fue de 68°C y los filtros se lavaron 2x5 minutos a temperatura ambiente utilizando 2xSSC-0.1% SDS seguido por 2x15 minutos a 68°C utilizando 0.1xSSC-0.1% SDS. Se obtuvieron varias placas positivas de cada una de las hibridaciones. Se purificaron cinco placas de muy fuerte hibridación a partir de cada clasificación. Los ADNs de fago se aislaron y caracterizaron a partir de hibridaciones de tinción Southern. Los fragmentos de restricción elegidos que hibridizaron a la sonda se sub-clonaron al vector pBluescript II KS+ y se secuenciaron las regiones relevantes de los clones.

En total, se clonaron seis genes ce/45; de una de las cepas Geomyces pannorum RF6546 y Fusarium cf. equiseti RF6318, y dos genes ce/45 de las cepas Geomyces pannorum, RF6293 y RF6608. El Cuadro 4 resume la información en las sondas utilizadas para clasificar los genes, los clones de fago a partir de los cuales se aislaron los genes, los fragmentos de restricción elegidos conteniendo los genes de longitud completa con sus regiones de promotor y de terminador, los nombres de plásmidos, y los números de depósito DSM para las cepas de E. coli llevando estos plásmidos.

Cuadro 4. Las sondas utilizadas para clonar genes de endonucleasa, el clon de fago y los sub-clones elegidos, el número de plásmido y el número del depósito de la cepa E. coli correspondiente La información relevante en los genes y las secuencias de proteína deducidas (SEC ID NO: 12-23) se resumen en el Cuadro 5 y el Cuadro 6, respectivamente.

Cuadro 5. Resumen en los genes de endonucleasa aislados de Geomyces pannorum RF6293, RF6546, RF6608, y Fusarium cf. equiseti RF6318 <a Se incluye codón de DETENCION (b no se incluye codón de DETENCION.

Cuadro 6. El resumen de las secuencias de aminoácido deducidas de las secuencias de gen de endonucleasa a partir de Geomyces pannorum RF6293, RF6546, RF6608, y Fusarium cf. equiseti RF6318 (a La predicción en la secuencia de señal se hizo utilizando el programa SignalIP V3.0 (Nielsen et al., 1997; Bendtsen et al., 2004); el valor NN se obtuvo usando redes neurales. <b Se indican el dominio de unión de celulosa (CBD), los aminoácidos de la región de CBD. La secuencia de señal pronosticada no fue incluida. (c La predicción se hizo utilizando la herramienta Compute pl/MW en el servidor ExPASy (Gasteiger et al, 2003).

Las comparaciones de las secuencias Cel45 deducidas a partir de las cepas Geomyces pannorum RF6293, RF6546, RF6608, y Fusarium cf. equiseti RF6318 entre sí se presentan en el Cuadro 7 y el Cuadro 8. Se muestran tanto las secuencias de aminoácido de longitud completa como las proteínas de núcleo sin la región CBD de las secuencias Cel45 deducidas. Un programa de Clon Manager (versión 9) incluyendo las funciones de "Comparar Dos Secuencias/ Global/Comparar secuencias como matriz de clasificación de am inoácidos/BLOSUM62° se utilizó para determinar el grado de identidad.

Cuadro 7. Valores de identidad (%) obtenidos de la alineación de las secuencias de aminoácido Cel45 deducidas a partir de Geomyces pannorum RF6293, RF6546, y RF6608, y Fusarium cf. equiseti RF6318. Se alinearon secuencias de aminoácido de longitud completa incluyendo las secuencias de señal.

Gp_RF6293 Gp_RF6293 Fe_RF6318 Gp_RF65 6 Gp_RF6608 Gp_RF6608 Proteína CeWSA Cel45B CeW5A Cel45A Cel45A Cel45B 6p_RF6293_Cel45A 100 39 46 85 87 38 Gp_RF6293_CeW5B 100 30 40 38 89 Fe_RF6318_CeW5A 100 45 45 31 Gp_RF6546_Cel45A 100 87 38 Gp_RF6608_Cel45A 100 38 Gp_RF6608_Cel45B 100 C uadro 8. Valores de identidad (%) obtenidos de la ali neación de las secuencias de ami noácido Cel45 ded ucidas a pa rti r de Geomyces pannorum RF6293, RF6546, y RF6608, y Fusarium cf. equiseti RF631 8. Se ali nearon secuencias de núcleo excluyendo la secuencia de señal y regiones de en lazador-C BD.

Gp_RF6293 Gp_RF6293 Fe_RF6318 Gp_RF6546 Gp_RF6608 Gp_RF6608 Proteína Cel45A Cel 5B Cel45A Cel45A CeW5A Cel45B Gp_RF6293_Cel45A 100 41 58 88 89 41 Gp_RF6293_CeW5B 100 39 42 42 89 Fe_RF6318_CeW5A 100 60 60 39 Gp_RF6546_CeW5A 100 92 42 Gp_RF6608_CeW5A 100 41 Gp_RF6608_CeW5B 100 La com paración de l as secuencias de endonucleasa Cel45 deducidas a partir de Geomyces pannorum RF6293 , RF6546 , y R F6608, y Fusarium cf. equiseti RF631 8 con secuencias encontradas en las bases de datos se muestran en los Cuadros 9A y 9B.

Cuadro 9A. Secuencia de identidad más alta a las secuencias de endonucieasa deducidas de Geomyces pannorum RF6293, RF6546, y RF6608, y Fusarium cf. equíseti RF6318. Se alinearon secuencias de aminoácido de longitud completa incluyendo las secuencias de señal. La búsqueda de base de datos se realizó utilizando BLAST (tbiastn, base de datos nr/nt), y se utilizó el programa Clone Manager 9 (Comparar Dos Secuencias/Global/ Comparar secuencias como matriz de clasificación de aminoácidos/BLOSUM62) para determinar el grado de identidad.

Organismo y número de acceso Identidad (%) Gp_RF6293_Cet45A 100 Neurospora crassa, XM 952014 57 Gp_RF6293_Cel45B 100 Pyrenophora trititi-repentis, XM_001935986 47 Fe_RF6318_Cel45A 100 Gibberella zeae, AY342397 86 Gibberella zeae, XM_382834 86 Gp_RF6546_Cel45A 100 Neurospora crassa, XM_952014 57 6p_RF6546_Cel45A 100 Sclerotinia scelrotionim, XM_001597582 58 Gp_RF6608_Cel45 100 Pymnophora tritichrepentis, XM_001935986 48 Cuadro 9B. La actividad más alta de las secuencias de publicación de patente a las secuencias de endon ucleasa deducidas de Geomyces pannorum RF6293, RF6546, y Fusarium cf. equiseti RF6318. Se alinearon secuencias de aminoácido de longitud completa incluyendo las secuencias de señal. Se realizaron búsquedas de base de datos de Chemical Abstráete Service (CAS) Registry System, DGEGE and Patended Protein Sequences NCBI utilizando BLAST, y se utilizó el programa Clone Manager 9 (Comparar Dos Secuencias/Global/ Comparar secuencias como matriz de clasificación de aminoácidos/BLOSUM62) para determinar el grado de identidad.

Ejemplo 3. Producción de proteínas Cel45 recombínantes en Trichoderma reesei Se construyeron plásmidos de expresión para la sobre-expresión de proteínas Cel45 recombínantes de Geomyces pannorum RF6293 y RF6546, y Fusarium cf. equiseti RF631 8 en Trichoderma reesei. Los plásmidos de expresión construidos se listan en el Cuadro 10. Los genes ce/45 recombinante, incluyendo sus propias secuencias de señal, se fusionaron exactamente a promotor T. reesei cbhMceUA (p cbhl). La terminación de transcripción se aseguró a través del terminador T reesei co »1/ce/7A (t cbhl) y se utilizó el gen marcador A. nidulans amdS para la selección de los transformantes como se describe por Paloheimo et al. (2003). Los casetes de expresión líenla (Figura 1) se aislaron de las estructuras de base del vector después de la digestión de /Vori y se transformaron a protoplastos de T. Reesei A47 y/o A51 (ambas cepas tienen los genes que codifican las cuatro celulasas principales CBHI/Cel7A, CBHII/Cel6A, EGI/Cel7B y EGII/Cel5A eliminada). Las transformaciones se realizaron como se describió por Penttilá et al. (1987) con las modificaciones descritas por Karhunen et al. (1993), seleccionado acetamida como la única fuente nitrógeno (gen marcador amdS). Los transformantes de purificaron en placas de selección a través de conidios individuales antes de la esporulación de los mismos en PD.

Cuadro 10. Casetes de expresión construidos para sobre-producir proteínas Cel45 a partir de Geomyces pannorum RF6293 y RF6546, y Fusarium cf. equiseti RF6318 en Trichoderma reesei. La estructura total de los casetes de expresión se describe en la Figura 1. Los genes ce/45 clonados fueron con exactitud fusionados al promotor T. reesei cbhi/cell A.

El cásete de expresión para la transformación de T. reesei se aisló a partir de la estructura de base del vector utilizando digestión Not\. <b El número de nucleótidos después del codón de DETENCION del gen recombinante clonado que se incluyó en el cásete de expresión. El sitio de restricción en el extremo 3' del fragmento de gen genómico que se utilizó en la construcción del cásete de expresión se indica entre paréntesis.

La producción de endonucleasa de los transformantes se analizó a partir de los sobrenadantes de cultivo de los cultivos del matraz de agitación (50 mi). Los transformantes se desarrollaron durante 7 días en un medio de inducción de celulasa a base de lactosa, en complejo (Joutsjoki et al. 1993) regulada en su pH con 5% KH2P04. La actividad de endonucleasa se probó con 3% (p/v) carboximetilcelulosa (CMC) como el substrato en 50 mM regulador de pH de citrato de acuerdo con Bailey y Nevalainen 1981 y Haakana et al . , 2004. Los genotipos de los transformantes seleccionados se confirmaron utilizando tinciones Southern , en donde se incluyeron varias digestiones genómicas y se utilizó el cásete de expresión respectivo como una sonda. La producción heteróloga de prote ínas recombinantes de endonucleasa se analizó a través de SCS-PAGE con tinción subsecuente de Coomassive.

Las preparaciones de enzima recombinante Cel45A se caracterizaron en términos de pH óptimo y estabilidad térm ica. El pH óptimo de las proteínas Cel45A sobre-producidas se determinó en un regulador de pH de Mcllvaine universal dentro de una escala de pH de 4.0-8.0 utilizando 3% (p/v) carboximetilcelulosa (CMC) como substrato (Figura 2A). La estabilidad térmica de las proteínas recombinantes de endonucleasa se determinó midiendo la actividad de CMCase en el regulador de pH de Mcllvaine universal al pH óptimo con un tiempo de reacción de 1 hora (Figura 2B) .

Los transformantes de producción de endonucleasa elegidos se cultivaron a bioreactores de laboratorio a 28°C en el medio indicado anteriormente durante 3-4 días con un control de pH de 4.4 ± 0.2 (N H3/H3PO4) para obtener un material para las pruebas de aplicación. Los sobrenadantes se recuperaron a través de centrifugación y filtración mediante filtros de Seitz-K 1 50 y EK (Pall SeitzSchenk Filtersystems GmbH, Bad Kreuznach, Alemania).

Ejemplo 4. Desempeño de proteínas Cel45 recombi nantes en tratamiento de dril de algodón a diferentes temperaturas Las proteínas Cel45 recombinantes producidas como se describe en el Ejemplo 3 utilizando Trichoderma como el huésped se probaron para su efecto en la bio-tinción de dril de algodón a diferentes temperaturas para crear una apariencia de gastado a aquella provista por piedras pómez. Para comparación, se utilizaron enzimas Cel45 comerciales, Ecostone®N400 (Roal Oy, Finlandia) y Denimax™ 399S (Novozymes) .

Un par de jeans hechos de dril de algodón teñidos con índigo obtenidos de un proveedor americano se utilizó como el material de prueba principal después del descrudado con ECOSTON E® A200 alfa-amilasa y 2 pares de jeans Apache descrudado (Labels Fashion Limited, U . K. ) como material llenador. Los tratamientos de celulasa se realizaron con un extractor lavador Wascator FOM 71 CLS de Electrolux bajo las condiciones descritas en el Cuadro 1 1 .

Cuadro 1 1 . Condiciones de prueba/parámetros de procedimiento utilizados en tratamientos de celulasa Parámetros de procedimiento Carga de dril de algodón 1.6 kg Agua 17 litros Regulador de pH/control de pH (pH 6) Ajustado con Na2HP04 H20 y ácido cítrico Tiempo 55 minutos Temperatura 20, 30, 40, 50 ó 60°C Dosis de celulasa 250-1500 NCU/g tela Las enzimas fueron dosificadas como unidades de actividad de celulasa neutra (NCU) por peso de la tela. La actividad de enzima se midió como la liberación de azúcares reductores a partir de carboximetilcelulosa (3% CMC) a 50°C en 50 mM regulador de pH H EPES pH 7.0 (actividad NCU Haakana et al. 2004). Las proteína Cel45 recombinantes se dosificaron como 1250 NCU/g de tela y Denimax™ 399S NCU/g. La dosificación de cada enzima fue suficiente para dar diferencias fácilmente medibles/detectables (incremento de brillantez = delta L*>2 unidades) a la escala de temperatura completa. Las enzimas fueron inactivadas después de drenar elevando el pH por arriba de 1 1 agregando 4.2 g de NaOH ( 1 0 minutos, 40°C) y enjuagando tres veces. Los jeans se secaron en un tambor g iratorio.

El nivel de bio-lavado a la piedra/abrasión del material de prueba principal se evaluó midiendo el color como valores reflectancia con un espectrofotómetro Minolta CM 2500 utilizando coordenadas de espacio de cloro L*a*b* (iluminación D65/2"). El color del lado de cara y el lado inverso del dril de algodón se midió después del descrudado (es decir, antes del tratamiento con celulasa) y después del tratamiento con celulasa. Cada medición sobre el lado de cara del dril de algodón fue el promedio de aproximadamente 40 mediciones. También se ilustran perfiles de temperatura en la aplicación de dril de algodón calculando el desempeño relativo (%) a 30°C comparado con 50°C (relación 30: 50) y desempeño relativo (%) a 40°C comparado con la temperatura óptima (relación 40/OT) . Los resu ltados se muestran en los cuadros 1 2- 1 4 y Fig u ra 3.

C uad ro 1 2. Perfiles de tem peratura de preparaciones de Cel45 en tratam iento de dril de algodón. Se utilizaron tratam ientos con preparaciones de enzima Cel45 comerciales para comparación Enzima Temp. (°C) Incremento relativo de L* (%) Gp_RF6293Cel45A 60 54 Gp_RF6293Cel45A 50 95 Gp_RF6293CeW5A 40 100 Gp_RF6293Cel45A 30 93 Gp_RF6293CeW5A 20 65 Gp_RF6546Cel45A 60 99 Gp_RF65 6CeW5A 50 100 Gp_RF6546Cel45A 40 81 Gp_RF6546CeW5A 30 74 Fe_RF6318_Cel45A 50 96 Fe_RF6318_CeW5A 40 100 Fe_RF6318_Cel45A 30 76 Fe_RF6318_Cel45A 20 62 Ecostone® N400 60 100 Ecostone® N400 50 91 Ecostone® N400 40 75 Ecostone® N400 30 64 Denimax™ 399S 60 100 Denimax™ 399S 50 92 Denimax™ 399S 40 62 Denimax™ 399S 30 40 Cuadro 13. Relaciones 30:50 y 40:OT calculadas a partir de los perfiles de temperatura de enzimas Cel45 novedosas y preparaciones de Cel45 comerciales Los resultados del Cuadro 12 y Figura 3 muestran que las enzimas Cel45 recombinantes novedosas tienen perfiles de temperatura más bajos en la aplicación que las enzimas Cel45 comerciales, Ecostone® N400 y Denimax™ 399S . Gp_RF6293_Cel45A muestra un desempeño óptimo a una escala de temperatura muy amplia de 30 a 50°C, lo cual es sorprendente. Ya que la temperatura óptima a condiciones analíticas fue remarcablemente más alta (55-60°C , Figura 2B). La escala de temperatura óptima para Gp_RF6546_Cel45A y Fe_RF631 8_Cel45A también fue más baja que para las enzimas comerciales.

Tanto Gp_RF6293_Cel45A como Fe_RF6318_Cel45A tienen un desempeño superior a 40°C que a 50°C, lo cual es una propiedad única comparado con otras enzimas que pertenecen a la famil ia cel45, como las preparaciones comerciales usadas como referencia , y las cuales típicamente trabajan mejor a 50-60°C. Los resultados en el Cuadro 1 3 muestran que las relaciones tanto de 30/50 como de 40/OT son más favorables con estas endonucleasas que con preparaciones Cel45 comerciales.

Los resultados en el Cuadro 14 muestran que con la enzima recombinante Gp_RF6293_Cel45A se puede obtener un efecto superior de bio-lavado a la piedra/abrasión a baja temperatura (30°C) comparado con enzimas Cel45 comerciales.

C uadro 14. Mediciones de color del lado de cara del dril de algodón tratado con la preparación Gp_RF6293_Cel45A a 30°C y pH 6. Se utilizaron tratamiento con preparaciones de enzima comerciales para comparación. L* indica la brillantes Ejemplo 5. Desempeño de proteínas Cel45 recombinantes en tratamiento de dril de algodón a un pH diferente Las proteína Cel45 recombinantes producidas como se describe en el Ejemplo 3 utilizando Trichoderma, como huésped, se probaron para su efecto en bio-lavado a la piedra de dril de algodón a un pH diferente para crear una apariencia de gastado similar a aquella provista por piedras pómez.

El sistema de prueba para el bio-lavado a la piedra fue como en el Ejemplo 4, excepto que se utilizó un lote diferente de jeans y la temperatura fue de 40°C y un pH 5-7. También, el efecto del tratamiento con celulasa se evaluó como en el Ejemplo 4.

Los resultados se establecen en el Cuadro 1 5 y Figura 4, que muestra que la escala de pH óptima para Gp_RF6293_Cel45A es de 5-6.5 y para Fe_RF631 8_Cel45A es de 6-6.5.

C uadro 15. Mediciones de color del lado de cara del dril de algodón tratado con preparaciones Cel45 recombinante a diferentes valores de pH a 40°C. L* indica la brillantez Enzima pH Antes de Después de Incremento tratamiento con tratamiento con de L* celulasa celulasa L* L* Gp_RF6293_Cel45A 5 16.70 22.33 5.63 Gp_RF6293_Cel45A 6 16.63 22.36 5.73 Gp_RF6293_CeW5A 6.5 16.75 22.2 5.45 Gp_RF6293_Cel45A 7 16.75 21.16 4.41 Fe_RF6318_CeW5A 5 16.55 19.5 2.95 e_RF6318_Cel45A 6 16.53 20.66 4.13 Fe_RF6318_CeW5A 6.5 16.47 20.22 3.75 e_RF6318_Cel45A 7 16.53 19.92 3.39 Ejemplo 6. Desempeño de proteínas Cel45 recombinantes en bio-acabado (quitar motas/quitar pelo/quitar pelusa) La habilidad de las proteínas Cel45 recombinantes producidas como se describe en el Ejemplo 3, utilizando Trichoderma, como huésped, se probó para quitar motas de tejido de punto de algodón y se comparó con la enzima Cel45 con excelentes propiedades para quitar motas (WO2006/117432). Se realizaron tratamientos con celulasa con un extracto lavador Wascator FOM 71 CLS de Electrolux bajo las condiciones descritas en el Cuadro 16.

Se utilizaron tres tejidos de pelo largo de hilo 100% algodón (Tipo 9761, Orneule, Finlandia) como material de prueba con material de llenado. Primero la tela fue pre-lavada durante 10 minutos a 50 °C y se enjuagó tres veces. Después de eso, la tela de punto de algodón se trató con celulasa a 40°C ó 50°C durante 60 minutos. Las enzimas se dosificaron como unidades de actividad de celulasa neutra (NCU) por el peso de la tela. Después del drenado, la enzima se inactivó (durante 10 minutos a 60°C) elevando el pH por arriba de 11 con hidróxido de sodio. La tela después se enjuagó tres veces y se secó en un tambor giratorio.

C uadro 1 6. Condiciones de prueba/parámetros de proced im iento usados en tratamientos de bio-aca bado Las muestras de tejido se evaluaron visualmente de acuerdo con cuánta cantidad de fibrilas y pelusa se detectó en la superficie. El resultado de cada evaluación se cuantificó indicando el resultado relativo a una escala que consiste de estándares. Estos estándares fueron piezas de la misma tela lavada con diferentes cantidades de celulasa y presentaron una escala de densidad de fibrilas/pelusa en superficie de 1 a 5 con intervalos de unidad media. El número 0 fue una muestra de control tratada sin enzima. Entre más alto es el número, mejor es el efecto de quitar motas/quitar pelusa. El número 5 significa que la fibrila/pelusa de la superficie fue removida. Los resultados se muestran en los Cuadros 1 7 y 1 8. Los resultados en los Cuadros 17 y 18 muestran que Gp_RF6293_Cel45A, Gp_RF6546_Cel45 y Fe_RF631 8_Cel45A tienen excelentes propiedades de remoción de motas. Fue sorprendente que Gp_RF6293_Cel45A fue eficiente en una dosis de actividad mucho más baja para remover motas/remover pelusa que en el tratam iento de dri l de algodón en los Ejemplos previos. Tam bién se encontró q ue la escala de pH óptimo para Gp_RF6293_Cel45A pa ra remover m otas es de 5.5 a aproximadamente 7.

U na celulasa neutra que tenga excelentes propied ades de remoción de motas, como la prote ína Gp_RF6293_Cel45A, permite el tratam iento de bio-acabado sim ultáneamente con la ti nció n .

C uadro 17. Resultados de tratamientos de bio-acabado con proteínas Cel45 recombinante a 40°C y pH 6 4-5 representa n un excelente efecto de remoción de motas/remoción de pel usa , 3 representa un buen efecto de remoción de motas/remoción de pelusa, 0 representa ningú n efecto de remoción de motas/remoción de pelusa (tratamiento sin enzima) .

C uadro 18. Resultados de tratamientos de bio-acabado con proteínas Cel45 recombinantes a 50°C y pH6 Enzima g de tela Condiciones Evaluación Control 0 pH 6, 50°C 0 Gp_RF6293_Cel45A 500 NCU/g pH 6, 50°C 5 Gp_RF626546_Cel45A 1000 NCU/g pH 6, 50°C 4 Fe_RF6318_CeW5A 1250 NCU/g pH 6, 50°C 5 Fe_RF6318_Cel45A 625 NCU/g pH 6, 50°C 4.5 Referencias Altschul SF, W Gish, W Miller, EW Myers and DJ Lipman. 1990. Basic local alignment search tool. J. Mol. Biol. 215:403-410.

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Secuencias SEC ID NO: Secuencia 1 Iniciador de oligonucleótido Cel45_S1 2 Iniciador de oligonucleotido Cel45_S2 3 Iniciador de oligonucleotido Cel45_AS1 4 Iniciador de oligonucleotido CeW5_AS2 5 Iniciador de oligonucleotido Cel45_AS3 6 Fragmento de PCR obtenido de G. pannorum RF6293 usando los iniciadores Cel45_S1 y CeW5_AS3 7 Fragmento de PCR obtenido de G. pannorum RF6289 usando los iniciadores Cel45_S1 y Cel45_AS3 8 Fragmento de PCR obtenido de F. ct. equiseti RF6318 usando los iniciadores Cel45_S1 y Cel45_AS3 9 Fragmento de PCR obtenido de F. ct. equiseti RF6546 usando los iniciadores Cel45_S1 y Cel45_AS3 10 Fragmento de PCR obtenido de G. pannorum RF6608 usando los iniciadores CeW5_S1 y Cel45_AS3 11 Fragmento de PCR obtenido de G. pannorum RF6608 usando los iniciadores CeW5_S1 y Cel45_AS3 12 Secuencia de nucleótido del gen G. pannorum RF6293 cel45A 13 Secuencia deducida de aminoácido de G. pannorum RF6293 cel45A 14 Secuencia de nucleótido del gen G. pannorum RF6293 ce!45B 15 Secuencia deducida de aminoácido de G. pannorum RF6293 ceW5B 16 Secuencia de nucleótido del gen F. cf. equiseti RF6318 cel45A 17 Secuencia deducida de aminoácido de F. cf. equiseti RF6318 cel45A 18 Secuencia deducida de aminoácido de G. pannorum RF6546 ceW5A 19 Secuencia deducida de aminoácido de G. pannorum RF6546 cel45A 20 Secuencia de nucleótido del gen G. pannorum RF6608 cel45A 21 Secuencia deducida de aminoácido de G. pannorum RF6608 cel45A 22 Secuencia de nucleótido del gen G. pannorum RF6608 cel45B 23 Secuencia deducida de aminoácido de G. pannorum RF6608 cel45B Microorganismos Depositados Cepa Depositada Colección de Fecha de Depósito Número de Cultivo Acceso Geomyces pannarum RF6293 1 ) 7 de Abril del 2006 CBS 119567 Fusarium cf. equiseti RF6318 1) 7 de Abril del 2006 CBS 119568 Geomyces pannarum RF6546 1) 16 de Junio del 2006 CBS 119958 Geomyces pannarum RF6608 1) 16 de Junio del 2006 CBS 119962 Cepa £ coli incluyendo el 2) 10 de Enero del 2007 DSM 18916 plásmido pALK2206 Cepa E. coli incluyendo el 2) 16 de Marzo del 2007 DSM 19171 plásmido pALK2221 Cepa E coli incluyendo el 2) 16 de Marzo del 2007 DSM19173 plásmido pALK2226 Cepa £ coli incluyendo el 2) 10 de Enero del 2007 DSM 18915 plásmido pALK2208 Cepa £ coli incluyendo el 2) 10 de Enero del 2007 DSM 18917 plásmido pALK2207 Cepa £. coli incluyendo el 2) 16 de Marzo del 2007 DSM 19170 plásmido pALK2219 1 ) Centraaibureau Voor Schimmelcuitures at U psaSalaa n 8, 3508 AD , Utrecht, Holanda 2) Deutsche Sammlung von ikroorganismen und Zelikulturen Gm bH (DSMZ) , I nhoffenstrasse 7B , D-381 24 Brau nschweig , Alem an i a

Claims (18)

REIVINDICACIONES

1. Un polipéptido fúngico de endonucleasa, el cual pertenece a la familia glicosil hidrolasa 45, y el cual muestra un desempeño substancial a bajas temperaturas, y el cual comprende una secuencia de aminoácido que tiene por lo menos 65% de identidad de secuencia a SEC ID NO: 13, por lo menos 48% de identidad de secuencia a SEC ID NO: 15, por lo menos 87% de identidad de secuencia a SEC ID NO: 17, por lo menos 90% de identidad de secuencia a SEC ID NO: 21, o por lo menos 49% de identidad de secuencia a SEC ID NO:23, o un fragmento activo de celulasa del mismo.

2. El polipéptido de endonucleasa de acuerdo con la reivindicación 1, el cual comprende una secuencia de aminoácido que tiene por lo menos 90%, de preferencia por lo menos 95% y muy preferiblemente por lo menos 98% de identidad de secuencia a SEC ID NO: 13, 15, 17 ó 23, o un fragmento activo de celulasa del mismo.

3. El polipéptido de endonucleasa de acuerdo con la reivindicación 1, el cual comprende una secuencia de aminoácido que tiene por lo menos 95%, de preferencia por lo menos 98% de identidad de secuencia a SEC ID NO: 19 ó 21, o un fragmento activo de celulasa del mismo.

4. El polipéptido de endonucleasa de acuerdo con la reivindicación 1, el cual se deriva de Geomyces o Fusarium, de preferencia de G. pannorum o F. cf. equiseti, muy preferiblemente de RF 6293 (CBS 119567), RF6318 (CBS 119568), RF6546 (CBS 119958), o RF6608 (CBS 119962).

5. Un polinucleótido aislado seleccionado del grupo que consiste de: a) una secuencia de nucleótido que tiene SEC ID NO: 12, 14, 16, 18, 20 ó 22, o una secuencia que codifica el polipéptido de endonucleasa de la reivindicación 1, b) una estructura de cadena complementaria de a), c) una secuencia que es degenerada como resultado del código genético a cualquiera de las secuencias de a) o b).

6. El polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 1, el cual es similar a un polinucleótido llevado por E. coli DSM 18916, DSM 19171, DSM 19173, DSM 18915. DSM 18917, o DSM 19170.

7. Un vector de expresión que comprende un polinucleótido de la reivindicación 5.

8. Una célula huésped que comprende el vector de expresión de la reivindicación 7.

9. Un método para la producción de un polipéptido de endonucleasa de la reivindicación 1, que comprende los pasos de transformar una célula huésped con un vector de expresión que codifica dicho polipéptido, y cultivar dicha célula huésped bajo condiciones que permiten la expresión de dicho polipéptido, y opcionalmente recuperar y purificar dicho polipéptido.

10. Una preparación de enzima que comprende el polipéptido de endonucleasa de la reivindicación 1.

11. Un procedimiento para tratar material celulósico, en donde dicho procedimiento comprende poner en contacto el material celulósico con el polipéptido de endonucleasa de la reivindicación 1 , o una preparación de enzima de la reivindicación 1 0.

12. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 1 , el cual se realiza a una tem peratura de <50°C, preferiblemente <40°C.

13. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 1 , el cual se realiza a un pH de aproximadamente 3-9, de preferencia 4-8 , y muy preferiblemente a 5-6.5.

14. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 1 , el cual es de bio-lavado a la piedra o bio-acabado.

1 5. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 1 , el cual es la hidrólisis de material lignocelulósico o una aplicación alimenticia.

16. Una composición detergente que comprende el polipéptido de endonucleasa de la reivindicación 1 ó la preparación de enzima de la reivindicación 1 0.

17. Un alimento para animales que comprende el polipéptido de endonucleasa de la reivindicación 1 ó la preparación de enzima de la reivindicación 10.

18. La cepa de E. coli que tiene el número de acceso DSM 1 8916, DSM 1 91 71 , DSM 1 9173, DSM 1 891 5, DSM 1 891 7, o DSM 1 91 70.