RU2458127C2 - Целлюлозные белки слияния и их применение - Google Patents
Целлюлозные белки слияния и их применение Download PDFInfo
- Publication number
- RU2458127C2 RU2458127C2 RU2008140061/10A RU2008140061A RU2458127C2 RU 2458127 C2 RU2458127 C2 RU 2458127C2 RU 2008140061/10 A RU2008140061/10 A RU 2008140061/10A RU 2008140061 A RU2008140061 A RU 2008140061A RU 2458127 C2 RU2458127 C2 RU 2458127C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- fusion protein
- cellulase
- seq
- cellulose
- endoglucanase
- Prior art date
Links
- 108010059892 Cellulase Proteins 0.000 title claims abstract description 175
- 229940106157 cellulase Drugs 0.000 title claims abstract description 101
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 title claims description 93
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 title claims description 93
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 79
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 54
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 claims abstract description 48
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 claims abstract description 48
- 239000000463 material Substances 0.000 claims abstract description 35
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims abstract description 27
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 24
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 20
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims abstract description 20
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 19
- 239000003599 detergent Substances 0.000 claims abstract description 16
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims abstract description 15
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 14
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims abstract description 14
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims abstract description 14
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 71
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 71
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 claims description 71
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 39
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 30
- 239000004744 fabric Substances 0.000 claims description 25
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 25
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 23
- 241000228182 Thermoascus aurantiacus Species 0.000 claims description 19
- 239000004753 textile Substances 0.000 claims description 16
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 13
- 241000223259 Trichoderma Species 0.000 claims description 13
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 13
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 12
- 108010008885 Cellulose 1,4-beta-Cellobiosidase Proteins 0.000 claims description 11
- 241001248634 Chaetomium thermophilum Species 0.000 claims description 11
- 241000233866 Fungi Species 0.000 claims description 8
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 claims description 7
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 7
- 125000003147 glycosyl group Chemical group 0.000 claims description 6
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 6
- 239000000654 additive Substances 0.000 claims description 5
- 230000012743 protein tagging Effects 0.000 claims description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 claims description 3
- 239000000835 fiber Substances 0.000 claims description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 3
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 3
- 235000019621 digestibility Nutrition 0.000 claims description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 2
- 239000002023 wood Substances 0.000 claims description 2
- 241000894007 species Species 0.000 claims 1
- 229940079919 digestives enzyme preparation Drugs 0.000 abstract description 11
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 abstract 1
- 108010084185 Cellulases Proteins 0.000 description 54
- 102000005575 Cellulases Human genes 0.000 description 54
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 32
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 24
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 23
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 20
- 238000005469 granulation Methods 0.000 description 20
- 230000003179 granulation Effects 0.000 description 20
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 20
- 101710098247 Exoglucanase 1 Proteins 0.000 description 19
- 101710126559 Endoglucanase EG-II Proteins 0.000 description 18
- 239000004575 stone Substances 0.000 description 17
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 16
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 15
- 239000000047 product Substances 0.000 description 15
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 14
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 14
- 239000008262 pumice Substances 0.000 description 13
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 13
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 11
- 230000008569 process Effects 0.000 description 11
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 241000499912 Trichoderma reesei Species 0.000 description 10
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 10
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 10
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 10
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 9
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 9
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 9
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 9
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 8
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 8
- COHYTHOBJLSHDF-UHFFFAOYSA-N indigo powder Natural products N1C2=CC=CC=C2C(=O)C1=C1C(=O)C2=CC=CC=C2N1 COHYTHOBJLSHDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 8
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 8
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 7
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 7
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 7
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 7
- 241000259810 Acremonium thermophilum Species 0.000 description 6
- 229920002498 Beta-glucan Polymers 0.000 description 6
- 101710130006 Beta-glucanase Proteins 0.000 description 6
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 6
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 6
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000009990 desizing Methods 0.000 description 6
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 6
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 6
- 235000000177 Indigofera tinctoria Nutrition 0.000 description 5
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 5
- 229940097275 indigo Drugs 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 108700038091 Beta-glucanases Proteins 0.000 description 4
- 101710098246 Exoglucanase 2 Proteins 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 4
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 4
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 4
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 4
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 4
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 4
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 4
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 4
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 4
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 4
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 4
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 4
- FYGDTMLNYKFZSV-URKRLVJHSA-N (2s,3r,4s,5s,6r)-2-[(2r,4r,5r,6s)-4,5-dihydroxy-2-(hydroxymethyl)-6-[(2r,4r,5r,6s)-4,5,6-trihydroxy-2-(hydroxymethyl)oxan-3-yl]oxyoxan-3-yl]oxy-6-(hydroxymethyl)oxane-3,4,5-triol Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1[C@@H](CO)O[C@@H](OC2[C@H](O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]2O)CO)[C@H](O)[C@H]1O FYGDTMLNYKFZSV-URKRLVJHSA-N 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000001674 Agaricus brunnescens Nutrition 0.000 description 3
- 101100382641 Aspergillus aculeatus cbhB gene Proteins 0.000 description 3
- 229920003043 Cellulose fiber Polymers 0.000 description 3
- GUBGYTABKSRVRQ-CUHNMECISA-N D-Cellobiose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-CUHNMECISA-N 0.000 description 3
- 101710121765 Endo-1,4-beta-xylanase Proteins 0.000 description 3
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 description 3
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 description 3
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 3
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 3
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 3
- 238000010170 biological method Methods 0.000 description 3
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 3
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 3
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 3
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 3
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 3
- 108010002430 hemicellulase Proteins 0.000 description 3
- COHYTHOBJLSHDF-BUHFOSPRSA-N indigo dye Chemical compound N\1C2=CC=CC=C2C(=O)C/1=C1/C(=O)C2=CC=CC=C2N1 COHYTHOBJLSHDF-BUHFOSPRSA-N 0.000 description 3
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 3
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 3
- 238000005096 rolling process Methods 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 3
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 3
- UHPMCKVQTMMPCG-UHFFFAOYSA-N 5,8-dihydroxy-2-methoxy-6-methyl-7-(2-oxopropyl)naphthalene-1,4-dione Chemical compound CC1=C(CC(C)=O)C(O)=C2C(=O)C(OC)=CC(=O)C2=C1O UHPMCKVQTMMPCG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DLFVBJFMPXGRIB-UHFFFAOYSA-N Acetamide Chemical compound CC(N)=O DLFVBJFMPXGRIB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001019659 Acremonium <Plectosphaerellaceae> Species 0.000 description 2
- 244000144730 Amygdalus persica Species 0.000 description 2
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 description 2
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 description 2
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000007319 Avena orientalis Nutrition 0.000 description 2
- 244000075850 Avena orientalis Species 0.000 description 2
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 241000223218 Fusarium Species 0.000 description 2
- 241000183011 Melanocarpus Species 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 108700020962 Peroxidase Proteins 0.000 description 2
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 2
- 235000006040 Prunus persica var persica Nutrition 0.000 description 2
- 101100382629 Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) cbh1 gene Proteins 0.000 description 2
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 2
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 2
- 238000005299 abrasion Methods 0.000 description 2
- 102000004139 alpha-Amylases Human genes 0.000 description 2
- 108090000637 alpha-Amylases Proteins 0.000 description 2
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 description 2
- 229940025131 amylases Drugs 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000007844 bleaching agent Substances 0.000 description 2
- 101150048033 cbh gene Proteins 0.000 description 2
- 101150043930 cel5A gene Proteins 0.000 description 2
- -1 cellobiose disaccharide Chemical class 0.000 description 2
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 2
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 description 2
- 125000002791 glucosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 2
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 2
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 2
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 108010038196 saccharide-binding proteins Proteins 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- FYGDTMLNYKFZSV-WFYNLLPOSA-N (2s,3r,4s,5s,6r)-2-[(2r,4r,5r,6s)-4,5-dihydroxy-2-(hydroxymethyl)-6-[(2r,3s,4r,5r,6s)-4,5,6-trihydroxy-2-(hydroxymethyl)oxan-3-yl]oxyoxan-3-yl]oxy-6-(hydroxymethyl)oxane-3,4,5-triol Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1[C@@H](CO)O[C@@H](O[C@@H]2[C@H](O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]2O)CO)[C@H](O)[C@H]1O FYGDTMLNYKFZSV-WFYNLLPOSA-N 0.000 description 1
- GHCZTIFQWKKGSB-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylic acid;phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O.OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O GHCZTIFQWKKGSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000228245 Aspergillus niger Species 0.000 description 1
- 240000006439 Aspergillus oryzae Species 0.000 description 1
- 241000193744 Bacillus amyloliquefaciens Species 0.000 description 1
- 241000194108 Bacillus licheniformis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 101100299607 Bacillus subtilis (strain 168) licA gene Proteins 0.000 description 1
- 208000023514 Barrett esophagus Diseases 0.000 description 1
- 101100176947 Cellvibrio japonicus (strain Ueda107) celB gene Proteins 0.000 description 1
- 101100016206 Cellvibrio japonicus (strain Ueda107) celC gene Proteins 0.000 description 1
- 241000123346 Chrysosporium Species 0.000 description 1
- 241000193403 Clostridium Species 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010087427 Endo-1,3(4)-beta-Glucanase Proteins 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 241000223221 Fusarium oxysporum Species 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 229920002488 Hemicellulose Polymers 0.000 description 1
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 1
- 108010029541 Laccase Proteins 0.000 description 1
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 description 1
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 description 1
- 239000004367 Lipase Substances 0.000 description 1
- 102000006833 Multifunctional Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108010047290 Multifunctional Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000226677 Myceliophthora Species 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 101100172078 Phanerodontia chrysosporium Eg5A gene Proteins 0.000 description 1
- 108010059820 Polygalacturonase Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 101100284150 Salipaludibacillus agaradhaerens cel5A gene Proteins 0.000 description 1
- 101100394024 Salmonella typhimurium (strain LT2 / SGSC1412 / ATCC 700720) bcsZ gene Proteins 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 229920002334 Spandex Polymers 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 229910000831 Steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000228178 Thermoascus Species 0.000 description 1
- 108700029229 Transcriptional Regulatory Elements Proteins 0.000 description 1
- LRQOQMWIEDQCHM-XCJASTIHSA-N Urobiose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@@H]1O[C@@]1(O)[C@H](CO)O[C@H](O[C@@]2(O)[C@@H](O[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]2O)CO)[C@@H](O)[C@@H]1O LRQOQMWIEDQCHM-XCJASTIHSA-N 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002299 affinity electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 229940024171 alpha-amylase Drugs 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000013528 artificial neural network Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 239000003139 biocide Substances 0.000 description 1
- 238000006065 biodegradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004061 bleaching Methods 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 108020001778 catalytic domains Proteins 0.000 description 1
- 101150008363 celC gene Proteins 0.000 description 1
- 101150044976 celK gene Proteins 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 101150083131 chbA gene Proteins 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 230000035617 depilation Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 210000002249 digestive system Anatomy 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 108010093305 exopolygalacturonase Proteins 0.000 description 1
- 239000003925 fat Substances 0.000 description 1
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- 238000007730 finishing process Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 210000000167 fungal chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 210000003736 gastrointestinal content Anatomy 0.000 description 1
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940059442 hemicellulase Drugs 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 229920005610 lignin Polymers 0.000 description 1
- 235000019421 lipase Nutrition 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- 239000012521 purified sample Substances 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 239000012925 reference material Substances 0.000 description 1
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000004759 spandex Substances 0.000 description 1
- 230000028070 sporulation Effects 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 238000013112 stability test Methods 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 239000010959 steel Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 1
- 229920002994 synthetic fiber Polymers 0.000 description 1
- 239000012209 synthetic fiber Substances 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 238000009423 ventilation Methods 0.000 description 1
- 238000009941 weaving Methods 0.000 description 1
- 230000004584 weight gain Effects 0.000 description 1
- 235000019786 weight gain Nutrition 0.000 description 1
- 230000036642 wellbeing Effects 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
- C12Y302/01004—Cellulase (3.2.1.4), i.e. endo-1,4-beta-glucanase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23K—FODDER
- A23K10/00—Animal feeding-stuffs
- A23K10/10—Animal feeding-stuffs obtained by microbiological or biochemical processes
- A23K10/14—Pretreatment of feeding-stuffs with enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
- C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
- C11D3/00—Other compounding ingredients of detergent compositions covered in group C11D1/00
- C11D3/16—Organic compounds
- C11D3/38—Products with no well-defined composition, e.g. natural products
- C11D3/386—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
- C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
- C11D3/00—Other compounding ingredients of detergent compositions covered in group C11D1/00
- C11D3/16—Organic compounds
- C11D3/38—Products with no well-defined composition, e.g. natural products
- C11D3/386—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase
- C11D3/38645—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase containing cellulase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2405—Glucanases
- C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
- C12N9/2437—Cellulases (3.2.1.4; 3.2.1.74; 3.2.1.91; 3.2.1.150)
-
- D—TEXTILES; PAPER
- D06—TREATMENT OF TEXTILES OR THE LIKE; LAUNDERING; FLEXIBLE MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
- D06M—TREATMENT, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE IN CLASS D06, OF FIBRES, THREADS, YARNS, FABRICS, FEATHERS OR FIBROUS GOODS MADE FROM SUCH MATERIALS
- D06M16/00—Biochemical treatment of fibres, threads, yarns, fabrics, or fibrous goods made from such materials, e.g. enzymatic
- D06M16/003—Biochemical treatment of fibres, threads, yarns, fabrics, or fibrous goods made from such materials, e.g. enzymatic with enzymes or microorganisms
-
- D—TEXTILES; PAPER
- D06—TREATMENT OF TEXTILES OR THE LIKE; LAUNDERING; FLEXIBLE MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
- D06P—DYEING OR PRINTING TEXTILES; DYEING LEATHER, FURS OR SOLID MACROMOLECULAR SUBSTANCES IN ANY FORM
- D06P5/00—Other features in dyeing or printing textiles, or dyeing leather, furs, or solid macromolecular substances in any form
- D06P5/02—After-treatment
-
- D—TEXTILES; PAPER
- D21—PAPER-MAKING; PRODUCTION OF CELLULOSE
- D21C—PRODUCTION OF CELLULOSE BY REMOVING NON-CELLULOSE SUBSTANCES FROM CELLULOSE-CONTAINING MATERIALS; REGENERATION OF PULPING LIQUORS; APPARATUS THEREFOR
- D21C5/00—Other processes for obtaining cellulose, e.g. cooking cotton linters ; Processes characterised by the choice of cellulose-containing starting materials
- D21C5/005—Treatment of cellulose-containing material with microorganisms or enzymes
-
- D—TEXTILES; PAPER
- D21—PAPER-MAKING; PRODUCTION OF CELLULOSE
- D21H—PULP COMPOSITIONS; PREPARATION THEREOF NOT COVERED BY SUBCLASSES D21C OR D21D; IMPREGNATING OR COATING OF PAPER; TREATMENT OF FINISHED PAPER NOT COVERED BY CLASS B31 OR SUBCLASS D21G; PAPER NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
- D21H17/00—Non-fibrous material added to the pulp, characterised by its constitution; Paper-impregnating material characterised by its constitution
- D21H17/005—Microorganisms or enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии и касается целлюлазных слитых белков. Представленные слитые белки содержат аминокислотную последовательность эндоглюканазного ядра, имеющую, по крайней мере, 95%-ную идентичность с SEQ ID NO:2, слитую с аминокислотной последовательностью, содержащей линкер и целлюлозосвязывающий домен (CBD), имеющую, по крайней мере 95%-ную идентичность с SEQ ID NO:15. Такие слитые белки могут быть получены с помощью рекомбинантной технологии при использовании подходящих полинуклеотидов, экспрессирующих векторов и клеток-хозяев. Представленное изобретение обеспечивает целлюлазу, обладающую низкой активностью в отношении восстановления окраски, и может быть использовано для обработки целлюлозного материала, например, текстильного материала и для биологической абразивной обработки денима. Кроме того, представленные слитые белки и ферментные препараты на их основе могут использоваться для приготовления детергентных композиций или для улучшения качества кормов для животных. 12 н. и 14 з.п. ф-лы, 8 ил., 10 табл., 10 пр.
Description
ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Изобретение относится к ферментной технологии и, более точно, к целлюлазным белкам слияния, содержащим каталитический домен и целлюлозосвязывающий домен. Белки слияния могут быть получены с помощью рекомбинантной технологии при использовании полинуклеотидов, экспрессирующих векторов и клеток-хозяев, которые также входят в объем изобретения. Белки слияния и ферментные препараты на их основе полезны для обработки целлюлозного материала, например текстильного материала. Кроме того, белки слияния могут использоваться для получения целлюлозной массы и в бумажной промышленности, для экстрагирования масел из растений, приготовления детергентных композиций или для улучшения качества кормов для животных. Изобретение также относится к способу обработки целлюлозного материала белками слияния, в частности, к способу биологической абразивной обработки (биостоунингу) или окончательной биологической отделки (биофинишингу) тканей или одежды, в особенности денима. Изобретение также относится к детергентным композициям и кормам для животных, содержащим белки слияния,
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Целлюлоза представляет собой основной структурный компонент высших растений и существует в природе в практически очищенной форме только в волокнах хлопка. Она придает растительным клеткам высокую прочность при растяжении, обеспечивая их устойчивость к механическим стрессам и осмотическому давлению. Целлюлоза представляет собой линейный полисахарид из остатков глюкозы, соединенных β-1,4-связями. В природе целлюлоза обычно ассоциирована с лигнином и гемицеллюлозой. Целлюлозный материал разлагается в природе под действием различных организмов, включая бактерии и грибы. Биологическая конверсия целлюлозы в глюкозу обычно осуществляется тремя основными группами ферментов: целлобиогидралазами (СВН), эндоглюканазами (EG) и бета-глюкозидазами (BG).
Целлюлазы имеют широкое промышленное применение. В текстильной промышленности целлюлазы используются для окончательной отделки денима с целью придания одежде из денима модного потертого вида, который обычно обеспечивается при стирке денима с камнями пемзы. Кроме того, целлюлазы используются, например, для ликвидации мшистости тканей и предотвращения образования узелков на поверхности одежды из хлопка. В качестве детергентов целлюлазы используются для осветления цветов и предотвращения посерения и скатывания одежды. Целлюлазы также применяются в пищевой промышленности и в производстве кормов для животных и имеют большой потенциал в производстве целлюлозной массы и в бумажной промышленности, например, в удалении чернил с волокнистых поверхностей и улучшении дренажа целлюлозной массы.
Промышленно используемые целлюлазы часто представляют собой смеси ферментов с различной активностью и субстратной специфичностью. Коммерческие ферментные препараты часто обладают активностью всех трех целлюлаз: СВН, EG и BG. Кроме того, уникальные свойства каждой целлюлазы более подходят для одних целей, нежели других, и поэтому предпринимались определенные попытки создания и использования целлюлаз, имеющих только нужную активность. Наиболее широко используемые целлюлазы получают из грибов Trichoderma reesei. Однако, для получения целлюлаз могут использоваться и другие грибы (см., например, US 5457046).
Целлюлазы, используемые для обработки денима, обычно делятся на две основные группы: кислые и нейтральные. Кислые целлюлазы обычно действуют при рН от 4, 0 до 5, 5, а нейтральные целлюлазы действуют при рН от 6 до 8. Целлюлазы, имеющие свойства как кислых, так и нейтральных целлюлаз, можно назвать гибридными целлюлазами. Кислые целлюлазы, применяемые главным образом для биостоунинга, получают из Trichoderma reesei (половая форма Hypocrea jecorina), а нейтральные целлюлазы получают из различных грибов, включая Melanocarpus, Myceliophthora, Fusarium, Acremonium и Chrysosporium (Haakana et al. 2004). Ферменты, получаемые из Т. reesei, включают, например, целлюлазы семейства гликозилгидролаз 5 (эндоклюканазу II, EG II), семейства 7 (целлобиогидролазу I, CBHI) и семейства 12 (эндоклюканазу III, EGIII; Ward et al. 1992), и нейтральные целлюлазы, большей частью эндоглюканазы семейства 45 и семейства 7 (Henrissat, 1991; Henrissat и Bairoch, 1993, 1996).
В патенте US 5874293 раскрываются улучшенная целлюлазная композиция, содержащая повышенные количества эндоклюканазы EG II из Т. reesei, для обработки содержащих целлюлозу тканей. Композиция улучшает цветовые свойства тканей, увеличивает их легкость и внешний вид, а также снижает образование узелков на поверхности тканей. В заявке WO 97/14804 описаны целлюлазы с мол. массой 20 кДа и 50 кДа с эндоглюканазной активностью, полученные из Melanocarpus sp., которые особенно эффективны в текстильной промышленности и в производстве детергентов. Предполагается, что для создания новых ферментных свойств, будут использоваться белки слияния, содержащие целлюлазы с мол. массой 20 кДа и 50 кДа, соединенные с целлюлозосвязывающим доменом, полученные из Trichoderma reesi. Однако в WO 97/14804 не приведено никаких специальных примеров получения таких белков и не описаны их свойства.
Все еще существует необходимость получения целлюлаз с улучшенными свойствами, включая эндоглюканазы, которые наиболее эффективны для обработки тканей и для применения в тех областях, где обычно используются целлюлазы. В частности, существует постоянная потребность в более эффективных целлюлазах для улучшения экономических процессов. Настоящее изобретение служит для удовлетворения этих потребностей.
В текстильной промышленности в последние годы большой интерес со стороны производителей денима вызывает технология создания внешнего вида ткани, называемая «стиркой с камнями пемзы» (stone washing) или «вывариванием» ткани. Традиционная стирка с камнями пемзы уменьшает прочность ткани и повышает нагрузку на стиральные машины. В окончательной обработке денима все больше используются ферменты, и целлюлазы заменяют камни пемзы или используются вместе с ними для придания тканям желаемого «потертого» вида. Контролируемая обработка ферментами приводит к меньшему повреждению одежды и машинного оборудования и устраняет необходимость использования камней.
Основная проблема, связанная с применением ферментной абразивной стирки, заключается в восстановлении окраски ткани за счет перераспределения удаленного красителя Индиго во время или после биостоунинга. Перераспределение красителя Индиго снижает нужный контраст между белыми и окрашенными нитями, что может быть более легко замечено на обратной стороне денима и внутренней поверхности карманов (как увеличение голубизны). На лицевой стороне это может выглядеть как уменьшенный контраст между окрашенными участками и участками, из которых краситель был удален в процессе биостоунинга. Восстановление окраски может быть снижено использованием агентов, препятствующих такому восстановлению, например, неионных этоксилированных спиртов во время обработки ткани или добавлением отбеливающих агентов на стадиях отполаскивания. Природа фермента оказывает влияние на восстановление окраски. В целом, нейтральные целлюлазы способствуют восстановлению окраски в меньшей степени, чем кислые целлюлазы.
В заявке WO 97/09410 указано, что добавление определенного типа целлюлазы к другим целлюлазам, способствующим «истиранию» ткани, снижает восстановление окраски. Дополнительная целлюлаза относится к семейству 5 или 7, но сама по себе не имеет значительной «истирающей» активности. Предпочтительно, указанная дополнительная целлюлаза происходит из Bacillus или Clostridium.
В патенте US 5916799 описана целлюлазная композиция, содержащая целлобиогидролазы и эндоглюканазы, которые используются для ограничения протеолиза за счет разделения ядра и связывающих доменов ферментов. Полученные ферментные композиции, как обнаружено, уменьшают восстановление окраски. В заявке WO 94/07983 отмечается, что перераспределение красителя в ткани во время процесса биостоунинга может быть уменьшено при использовании композиции целлюлаз из грибов, которая по существу свободна от целлобиогидролазного компонента. В заявке WO 96/23928 описана обработка тканей, содержащих целлюлозу, усеченными целлюлазами. Такие усеченные ферменты, не имеющие целлюлозосвязывающего домена (CBD), как обнаружено, уменьшают перераспределение красителя и повышают «истирание».
Главный вывод, который можно сделать при анализе приведенного ссылочного материала, заключается в том, что целлюлозосвязывающий домен способствует восстановлению окраски. Таим образом, настоящее изобретение обеспечивает целлюлазу, обладающую низкой активностью в отношении восстановления окраски, несмотря на присутствие целлюлозосвязывающего домена.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение базируется на неожиданном обнаружении того факта, что эффект эндоглюканазы может быть значительно усилен при соединении ее с определенным целлюлозосвязывающим доменом без влияния на активность в отношении восстановления окраски.
Изобретение относится к новым белкам слияния эндоглюканазы, имеющим улучшенные гидролазные свойства, для применения в текстильной индустрии, особенно в производстве денима с помощью биостоунинга. Заявленные белки слияния имеют то преимущество, что активны как при кислых, так и при нейтральных значениях рН, и поэтому более эффективны при использовании в целях биошлифования. При обработке денима белки слияния обеспечивают низкий эффект восстановления окраски. Использование более эффективных эндоглюканаз в соответствии с изобретением является экономичным. Дополнительные преимущества заключаются в том, что облегчаются перевозка и хранение ферментных продуктов, поскольку они используются в меньших количествах. Белки слияния также полезны для применения в детергентных композициях и в других областях, например, в пищевой промышленности, экстрагировании масел из растений или в производстве целлюлозной массы и бумаги.
Объектом изобретения также являются полинуклеотиды, кодирующие новые белки слияния эндоглюканазы.
Объектом изобретения также является способ получения белков слияния.
Еще один объект изобретения относится к новым экспрессирующим векторам, содержащим указанные полинуклеотиды, полезным для получения белков слияния эндоглюканазы, и новым хозяевам, трансформированным такими экспрессирующими векторами.
Еще один объект изобретения относится к ферментным композициям, содержащим один или более белков слияния эндоглюканазы.
Объектом изобретения являются также способы обработки целлюлозного материала белком слияния, например, для использования в текстильной промышленности, для приготовления детергентных композиций, кормов для животных, для экстрагирования масел из растений, для производства целлюлозной массы и бумаги и, в частности, для окончательной обработки тканей, в особенности, для биостоунинга и биофинишинга денима.
Еще один объект изобретения относится к корму для животных и детергентным композициям, содержащим белки слияния.
Изобретение также относится к целлюлазному белку слияния, содержащему первую аминокислотную последовательность эндоглюканазного ядра и вторую аминокислотную последовательность, содержащую линкер и целлюлозосвязывающий домен (CBD), имеющую по крайней мере 75%-ную идентичность с SEQ ID NO:15, или варианту, или фрагменту указанного белка, имеющему целлюлозосвязывающую активность.
Изобретение также относится к выделенному полинуклеотиду, выбранному из группы, включающей:
а) нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:3 или 5, или последовательность, кодирующую белок слияния целлюлазы по п.1;
б) последовательность, комплементарную, указанной в а);
в) последовательность, полученную в соответствии с вырожденностью генетического кода, на основе последовательностей а) и б).
Изобретение также относится к экспрессирующему вектору, содержащему указанную нуклеотидную последовательность, и клетке-хозяину, содержащей экспрессирующий вектор, и к ферментным препаратам, содержащим белок слияния.
Изобретение также относится к способу получения белка слияния, включающему трансформацию клетки-хозяина экспрессирующим вектором, кодирующим указанный белок слияния, и культивирование указанной клетки-хозяина в условиях, обеспечивающих экспрессию указанного белка слияния, и, при необходимости, выделение и очистку белка слияния.
Изобретение также относится к способам обработки целлюлозного материала, предусматривающим обеспечение контактирования целлюлозного материала с белком слияния.
Изобретение также относится к способам биологической абразивной обработки тканей, включающим стадию обеспечения контактирования целлюлазного белка слияния или ферментного препарата с тканью денима или одеждой из денима, и к способам окончательной биологической обработки тканей, включающим стадию обеспечения контактирования целлюлазного белка слияния или ферментного препарата с текстильными материалами такими, как ткань, или одежда, или нити.
Изобретение также относится к детергентным композициям, содержащим белок слияния и детергентные добавки, корму для животных, содержащему белок слияния, и штамму Escherichia coli, депонированному под номером Е.coli DSM 18159.
Специфические воплощения изобретения нашли свое отражение в формуле изобретения.
Другие объекты, детали и преимущества изобретения станут ясными из представленных иллюстраций, подробного описания изобретения и примеров.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
На Фиг.1 приведена схема экспрессионной кассеты, используемой для трансформации протопластов Trichoderma reesi для получения целлюлазы EG28 или EG28+CtCBD Thermoascus aurantiacus. Ген cel5A или cel5A_Ctcel7A линкер CBD находится под контролем промотора cbhI Trichoderma reesi (cbhI prom) и терминация транскрипции обеспечивается добавлением терминатора (cbhI term). В кассету встроен ген amdS (amdS) для селекции трансформантов. Экспрессионную кассету для получения EG28 и EG28+CICBD выделяют в виде фрагмента NotI размером 8,6 kb из pALK1930 или в виде фрагмента NotI размером 8,9 kb из pALK1948, соответственно.
На Фиг.2 показана зависимость активности гетерологично продуцируемой целлюлазы EG28 T. aurantiacus, выделенной из культурального супернатанта, от величины рН при использовании CMC в качестве субстрата в течение 10 мин при 150°C (A). Температурный оптимум целлюлазы EG28 определяют при оптимальном рН (6,0). Реакционную смесь, содержащую CMC в качестве субстрата, тестируют в течение 10 мин (B). Температурный оптимум и оптимум рН слитого белка EG28+CtCBD совпадают с таковыми целлюлазы EG28 дикого типа.
На Фиг.3 показан эффект абразивной обработки целлюлазой EG28, определяемый путем измерения интенсивности цвета, при различных температурах и рН 6.
На Фиг.4 показан эффект абразивной обработки целлюлазой EG28+CtCBD, определяемый путем измерения интенсивности цвета, при различных рН и температуре 50°C.
На Фиг.5 показан эффект абразивной обработки целлюлазой EG28+CtCBD, определяемый путем измерения интенсивности цвета, при различных рН и температуре 60°C.
На Фиг.6 показан эффект абразивной обработки целлюлазой EG28+CtCBD, определяемый путем измерения интенсивности цвета, при различных температурах и рН 6.
На Фиг.7 показано влияние температуры гранулирования на бета-глюканазную активность, определяемую в корме, в который была добавлена целлюлаза EG28.
На Фиг.8 показано влияние температуры гранулирования на бета-глюканазную активность, определяемую в корме, в который была добавлена целлюлаза EG28+CtCBD.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Целлюлозы, содержащие каталитический домен/ядро (CD) обнаруживают целлюлазную активность. Кроме того, каталитический домен в молекуле целлюлазы может включать один или более «целлюлозосвязывающих доменов» (CBDs), также называемых «углеводосвязывающими доменами/модулями» (CBD/CBM), которые могут быть локализованы на N- или C-концевых участках каталитического домена CBDs имеют углеводосвязывающую активность и способны опосредовать связывание целлюлазы с кристаллической целлюлозой, но не обладают гидролитической активностью или имеют очень низкую гидролитическую активность на растворимых субстратах. Два указанные выше домена обычно соединены посредством гибкого и высоко гликозилированного линкерного участка, здесь называемого линкером. Такие конструкции описаны, например, Srisodsuk et al., 1993. Некоторые из природных эндоглюканаз и целлобиогидролаз имеют целлюлозосвязывающий домен (CBD), в то время как другие этого домена не имеют.
Эндоглюканазы (EGs) являются одним из трех типов целлюлаз, обычно необходимых для биологического разложения целлюлозы до глюкозы. Эндоглюканазы расщепляют внутренние бета-1,4-глюкозидные цепи, в то время как целлобиогидролазы отщепляют дисахарид целлобиозу от конца целлюлозной полимерной цепи, а бета-1,4-глюкозидазы гидролизуют целлобиозу и другие короткие целлоолигосахариды до глюкозы. Эндоглюканаза (EG) в соответствии с настоящим изобретением классифицируется как Е.С.3.2.1.4. Она представляет собой бета-D-глюкан-4-глюканогидролазу и катализирует эндогликолиз 1,4-бета-D-гликозидных связей в полимерах глюкозы таких, как целлюлоза. Некоторые эндоглюканазы способны гидролизовать, например, и 1,4-связи в бета-D-глюканах, также содержащих 1,3-связи. Они могут быть также классифицированы как эндо-1,3(4)-бета-глюканазы (Е.С.3.2.1.6). Таким образом, фермент может катализировать реакции на различных субстратах и принадлежать к различным классам.
Целлюлазы, включая эндоглюканазы, могут быть также классифицированы по принадлежности к различным семействам гликозилгидролаз в соответствии с первичной последовательностью, что подтверждается анализом трехмерной структуры некоторых членов семейства (Henrissat 1991, Henrissat и Bairoch, 1993, 1996). Например, семейство 45 (ранее celK) содержит эндоглюканазы (Е.С.3.2.1.4) и семейство 5 (ранее celA) содержит главным образом эндоглюканазы (Е.С.3.2.1.4). Семейство 7 (ранее семейство целлюлаз celC) содержит как эндоглюканазы, так и целлобиогидролазы. Некоторые гликозилгидролазы являются многофункциональными ферментами, содержащими каталитические домены, принадлежащие к различным семействам гликозилгидролаз. Для целей настоящего изобретения эндоглюканазная часть белка слияния, предпочтительно, принадлежит гликозилгидролазному семейству 45 или семейству 5 и, более предпочтительно, семейству 5.
В соответствии с настоящим изобретением эндоглюканазная часть белка слияния получена из грибов, предпочтительно, рода Thermoascus, и, более предпочтительно, Thermoascus aurantiacus. Такая эндоглюканаза описана, например, Hong et al., 2003. В заявке WO 03/062409 предполагается использование этого фермента в пищевых целях, поскольку помимо эндоглюканазной он также имеет бета-глюканазную активность. Более предпочтительно, эндоглюканаза происходит из штамма ALKO4242 Thermoascus aurantiacus, депонированного в CBS под номером 116239. Эндоглюканазный ген указанного штамма встроен в плазмиду pALK1926, которая депонирована в DSM под номером 17326. Белок, кодируемый данным геном, обозначен как «Та EG28» или просто «EG28».
Альтернативно, эндоглюканазная часть белка слияния может быть получена из Acremonium sp. предпочтительно, A. thermophilum, и, более предпочтительно, из штамма ALKO4245, депонированного в CBS под номером 116240. Эндоглюканаза, получаемая из этого штамма и кодируемая геном cel45A, обозначена как «At EG40» или просто «EG40».
Используемый здесь термин «эндоглюканазное ядро» означает каталитический домен/ядро (CD) фермента, обладающего по крайней мере эндоглюканазной активностью. Такой каталитический домен может быть представлен природной (интактной) формой или же может быть модифицирован.
В соответствии с одним вариантом воплощения изобретение относится к эндоглюканазному ядру, имеющему, по крайней мере, 75, 80, 85, 90, 95, 98 или 99% идентичности с SEQ ID NO:2 (Та EG28). Предпочтительно, ядро содержит, по крайней мере, зрелый белок, который соответствует аминокислотам от 19 до 334 SEQ ID NO:2. Сигнальная последовательность предсказана с помощью программы SignalP V3.0 (Nielsen et al., 1997; Bendtsen et al., 2004); значение NN получено при использовании нейральных сетей и значение НММ при использовании скрытых моделей Маркова. Альтернативно, эндоглюканазная часть белка слияния имеет, по крайней мере, 75, 80, 85, 90, 95, 98 или 99%-ную идентичность с эндоглюканазным ядром At EG40, кодируемым полинуклеотидом, содержащим SEQ ID NO:8. Предпочтительно, ядро содержит, по крайней мере, зрелый белок, который соответствует аминокислотам от 22 до 297 EG40.
Используемый здесь термин «целлобиогидролаза» или «СВН» относится к ферментам, которые отщепляют целлюлозу от конца глюкозной цепи и продуцируют целлобиозу. Их также называют 1,4-бета-D-глюкан целлюбиогидролазами или целлюлозе 1,4-бета-целлобиозидазами. Указанные ферменты гидролизуют 1,4-бета-D-глюкозидные связи на восстанавливающем или невосстанавливающем концах полимера, содержащего такие связи, например, целлюлозы, с образованием целлобиозы.
CBD, включая линкер, предпочтительно получают из Chaetomium thermophilum и, в особенности, из целлобиогидролазы (CBHI/Cel7A), кодируемой геном из штамма ALKO4265, депонированного в CBS под номером 730.95. Этот CBD, включая линкер, обозначают как «CtCBD». Согласно предпочтительному варианту осуществления изобретения линкер, соединенный с целлюлозосвязывающим доменом, имеет последовательность, по крайней мере, на 80, 85, 90, 95, 98 или 99% идентичную SEQ ID NO:15 (которая соответствует аминокислотам 335-415 SEQ ID NO:4). Согласно другому предпочтительному варианту осуществления изобретения вторая аминокислотная последовательность содержит аминокислоты 335-379 SEQ ID NO:4.
Термин «происходящий из» применительно к микроорганизму означает, что полипептид может естественным образом продуцироваться указанным специфическим микроорганизмом или же полинуклеотид, кодирующий полипептид, может быть выделен из данного микроорганизма. Данный термин также относится к клетке-хозяину, в которую встроен полинуклеотид из указанного микроорганизма, кодирующий полипептид. Однако, при этом не исключаются незначительные модификации последовательности, например, замещения, делении, вставки и/или инверсии нескольких аминокислот/кодонов так, что сохраняется биологическая активность кодируемого полипептида.
Ядро и линкер + CBD, соответственно, могут быть фрагментом или вариантом указанных последовательностей, причем указанный фрагмент или вариант имеют целлюлазную активность и/или целлюлозосвязывающую активность. Например, первая аминокислотная последовательность может содержать фрагмент или вариант аминокислотной последовательности, имеющей, по крайней мере, 75%-ную идентичность с SEQ ID NO:2 или 8, а вторая аминокислотная последовательность может содержать фрагмент или вариант аминокислотной последовательности, имеющей, по крайней мере, 75%-ную идентичность с SEQ ID NO:15.
Используемое здесь понятие «целлюлазная активность» означает каталитическую способность гидролизовать целлюлозу или ее производные, например, эндоглюконазную или бета-глюканазную активность. Кроме того, эндоглюканазная и/или бета-глюканазная активность некоторых целлюлаз может дополняться гемицеллюлазной и/или ксиланазной активностью.
Используемый здесь термин «идентичность» относится к глобальной идентичности между аминокислотными последовательностями при их сравнении друг с другом, начиная с первой аминокислоты, кодируемой соответствующим геном, и заканчивая последней аминокислотой. Идентичность полноразмерных последовательностей измеряют с использованием глобальной программы выравнивания Needleman-Wunsch при обеспечении EMBOSS (European Molecular Biology Open Software Suite; Rice et al., 2000), версия 3.0.0 со следующими параметрами: EMBLOSUM62, штрафной пробел 10.0, штраф протяженности 0.5. Алгоритм описан Needleman-Wunsch (1970). Специалисту ясно, что результаты, полученные при использовании алгоритма Needleman-Wunsch, являются сравнимыми только при выравнивании соответствующих доменов последовательности. Таким образом, сравнение, например, целлюлазных последовательностей, включающих CBD или сигнальные последовательности, с последовательностями, не содержащими указанных элементов, не является достоверным.
В соответствии с одним вариантом осуществления изобретения белок слияния содержит эндоглюканазное ядро, кодируемое геном, эквивалентным гену, встроенному в Е.Coli DSM 17326. Предпочтительно, белок слияния кодируется слитым геном, эквивалентным гену, встроенному в Е.Coli DSM 18159. «Эквивалентность» означает здесь практическое сходство или сходство. В соответствии со специфическим вариантом осуществления изобретения белок слияния содержит эндоглюканазное ядро, включающее последовательность SEQ ID NO:2 и линкер и CBD, включающие SEQ ID NO:15. В особенности, ядро и линкер + CBD включают последовательность SEQ ID NO:4 или 6 или вариант или фрагмент указанных последовательностей, обладающих целлюлазной и целлюлозосвязывающей активностью.
Используемый здесь термин «фрагмент» относится к части специфической аминокислотной последовательности, который имеет длину, достаточную для сохранения заданной биологической активности. Другими словами, фрагмент может быть, например, только зрелой частью аминокислотной последовательности или даже фрагментом зрелой части. Вариант специфической аминокислотной последовательности относится к аминокислотной последовательности, которая не идентична специфической аминокислотной последовательности, а содержит по крайней мере некоторые аминокислотные изменения, т.е. делеции, замещения, инверсии, вставки и т.д., которые не имеют существенного влияния на биологическую активность белка по сравнению с активностью специфической аминокислотной последовательности при использовании в нужных целях. Биологическая активность в контексте настоящего изобретения относится к целлюлазной активности, способности связывать целлюлозу или обеим указанным активностям.
Белок слияния, согласно заявленному изобретению, может быть получен путем прикрепления эндоглюканазного ядра к линкеру и участку CBD в подходящей кодирующей ДНК при использовании хорошо известной технологии рекомбинантных ДНК для продуцирования нужного рекомбинантного белка. Коротко говоря, полинуклеотиды, кодирующие участки слияния, амплифицируют и клонируют; нуклеотиды могут быть синтезированы. Слитый полинуклеотид встраивают в вектор экспрессии, вектором трансформируют клетку-хозяин и экспрессируют белок. Предпочтительно, линкер и CBD прикрепляют к C-концу эндоглюканазного ядра.
Вектор экспрессии представляет собой клонирующую плазмиду или вектор, способный экспрессировать ДНК, кодирующую эндоглюканазные белки слияния, после введения вектора в подходящую клетку-хозяин. При использовании грибов в качестве хозяев представляющий интерес ген предпочтительно вводят в грибную клетку-хозяин в составе клонирующего или экспрессирующего вектора, который интегрируется в грибную хромосому или обеспечивает интеграцию представляющего интерес гена в хромосому хозяина. Другие последовательности, которые являются частью клонирующего или экспрессирующего вектора, также могут быть интегрированы вместе с указанной ДНК в процессе интеграции. Кроме того, в клетках грибов экспрессирующий вектор или его части могут быть направлены в предопределенный локус. Альтернативно, нужный ген слияния может быть представлен в виде автономно реплицирующейся плазмиды.
ДНК, кодирующую эндоглюканазные белки слияния, предпочтительно помещают под контроль (т.е. функционально связывают) с определенными контролирующими последовательностями, такими как промоторные последовательности, в составе вектора. Во время трансформации указанные контролирующие последовательности интегрируют в геном хозяина вместе с представляющим интерес геном. Альтернативно, контролирующие последовательности могут быть встроены в сайт интеграции.
Контролирующие экспрессию последовательности в составе экспрессирующего вектора варьируют в зависимости от того, сконструирован ли вектор для экспрессии определенного гена в прокариотическом или эукариотическом хозяине (например, вектор-переносчик может содержать ген для селекции в бактериальном хозяине). Последовательности, контролирующие экспрессию, могут содержать регуляторные элементы транскрипции, такие как промоторы, энхансеры, и последовательности терминации транскрипции и/или регуляторные элементы трансляции, такие как сайты инициации трансляции и терминации.
Полинуклеотидная молекула, такая как ДНК, способна экспрессировать полипептид, если она содержит последовательности, контролирующие экспрессию, включающие информацию о регулировании транскрипции, и функционально связаны с нуклеотидной последовательностью, кодирующей полипептид.
Функциональная связь представляет собой связь, в которой последовательность соединена с регуляторной последовательностью (или последовательностями) таким образом, что экспрессирующая последовательность находится в таком участке, где подвергается влиянию или контролю со стороны регуляторной последовательности. Две ДНК-последовательности (такие, как последовательность промоторного участка, связанная с 5'-концом последовательности, кодирующей белок) считаются связанными функциональным образом, если промотор оказывает влияние на транскрипцию.
Векторы в соответствии с настоящим изобретением могут содержать и другие функционально связанные регуляторные элементы такие, как энхансерные последовательности.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения конструируют генетически стабильные трансформанты таким образом, что ДНК, кодирующую белки слияния, встраивают в хромосому хозяина путем трансформации с помощью вектора, который может содержать последовательности, обеспечивающие интеграцию указанного вектора в хромосому.
Клетки, в хромосомы которых стабильно интегрирована ДНК, кодирующая эндоглюканазные белки слияния, могут быть отобраны, например, путем включения в них маркера (маркеров), гомологичного или гетерологичного, который обеспечивает селекцию клеток-хозяев, содержащих вектор экспрессии в составе хромосомы. Маркер может обеспечивать устойчивость к биоцидам, например, устойчивость к антибиотикам или тяжелым металлам, таким, как медь. Кроме того, маркеры могут комплементировать ауксотрофную мутацию в хромосоме хозяина и т.д. Селектируемый маркер может представлять собой, например, селектируемый ген, непосредственно связанный с последовательностью ДНК, которая является подлежащим экспрессии геном, или же он может быть введен в ту же самую клетку путем совместной трансформации. Могут использоваться и другие системы селекции.
После конструирования вектор экспрессии, содержащий ДНК, кодирующую белок слияния, его вводят в подходящую клетку-хозяин любым пригодным способом, включая трансформацию, известную из уровня техники. После трансформации реципиентные клетки выращивают в подходящей селективной среде, которая отбирает трансформированные клетки по их росту.
Подходящими хозяйскими системами для экспрессии и продукции белка являются, например, системы продукции на основе грибов Trichoderma (ЕР 244 234) или Aspergillus такие, как A. oryzae или A. niger (WO 97/08325, WO 95/33386, патент США 5843745, патент США 5770418), или системы продукции на основе грибов Fusarium такие, как F. oxysporum (Malardier et al., 1989). Подходящие системы продукции на основе бактерий включают системы, основанные на Bacillus, например, В. subtilis, В. licheniformis, В. amyloliquefaciens, или Е.coli, или Streptomyces.). Подходящие системы продукции на основе дрожжей включают системы, основанные на Saccharomyces, Shizosaccharomyces или Pichia pastoris. Могут использоваться и системы продукции на основе других микроорганизмов или клеток млекопитающих или растений.
Экспрессия клонированных генных последовательностей приводит к продукции нужного белка или фрагмента белка. Такая экспрессия может происходить постоянно в трансформированных клетках или контролируемым образом.
Для получения ферментных препаратов согласно заявленному изобретению хозяева, имеющие нужные свойства (хозяева, способные экспрессировать экономически значимые количества эндоглюканазных белков слияния), культивируют в подходящих условиях и нужные ферменты предпочтительно секретируются из организма-хозяина в культуральную среду. Затем белки при необходимости выделяют из указанной культуральной среды известными способами. Предпочтительно, хозяевами для такого продуцирования являются нитчатые грибы такие, как Trichoderma или Aspergillus и, в особенности, Т. reesei.
Используемое здесь понятие «ферментный препарат» относится к любому ферментному продукту, который содержит, по крайней мере, один из заявленных эндоглюканазных белков слияния. Таким образом, ферментный препарат может представлять собой истощенную культуральную среду или фильтрат. Истощенная культуральная среда означает среду, в которой выращивался хозяин, и которая содержит продуцируемые хозяином ферменты. Предпочтительно, клетки-хозяева отделяют от указанной культуральной среды после продуцирования ферментов. При необходимости ферментные препараты могут быть лиофилизированы или же ферментная активность может быть сконцентрирована и/или стабилизирована для сохранения. Если требуется, нужный фермент может быть в дальнейшем очищен в соответствии с известными подходящими методами такими, как экстракция, преципитация, хроматография, аффинная хроматография, электрофорез и другие подобные методы.
Однако, преимущество заявленного изобретения заключается в том, что культуральная среда, содержащая или не содержащая клеток-хозяев, может быть использована в качестве ферментного препарата как таковая без дальнейшей очистки, поскольку эндонуклеазные белки слияния могут секретироваться в культуральную среду и проявлять активность в этой культуральной среде. Ферментные препараты являются чрезвычайно экономичными с точки зрения их получения и использования, поскольку выделение специфического фермента из культуральной среды не является обязательным.
В дополнение к эндоглюканазному белку слияния, ферментные препараты могут содержать один или более других ферментов, которыми могут быть, например, другие целлюлазы, амилазы, липазы, протеазы, гемицеллюлазы, ксиланазы, пектиназы и/или оксидазы такие, как лакказы и пероксидазы. Альтернативно, до, в процессе или после обработки эндоглюканазным белком слияния может осуществляться обработка другим ферментом. Обработка ферментом может включать, например, обработку одной или более амилазой (например, для расшлихтовки денима), или одной или более целлюлазой, или одной или более пероксидазой, или одной или более лактазой. Это зависит от того, какие ферменты входят в ферментный препарат или используются для обработки.
В дополнение к белку слияния, ферментный препарат может содержать различные добавки такие, как стабилизаторы, буферы, консерванты, сурфактанты и/или компоненты культуральной среды. Предпочтительными добавками являются такие добавки, которые обычно используются в ферментных препаратах в определенных целях.
Ферментные препараты могут быть получены в жидкой или твердой форме, например, в форме сухого порошка или гранул, в особенности, в форме устойчивых гранул и стабилизированной жидкости. Следует иметь в виду, что ферментные препараты могут быть дополнительно обогащены, или частично или полностью лишены определенной специфической ферментной активности для того, чтобы отвечать требованиям специфического использования в различных случаях, например, в текстильной промышленности. Смесь ферментов с разной активностью, секретируемая хозяином, может иметь преимущество при определенных промышленных применениях, например, в биостоунинге и биофинишинге.
Эндоглюканазные белки слияния и препараты, содержащие такие белки, используются, например, в для производства текстиля, пищевых и кормовых продуктов, растительных масел, целлюлозосодержащей массы и в бумажной промышленности. Указанные белки могут применяться для обработки любого целлюлозосодержащего материала такого, как текстильный материал, растения, используемые в кормах для животных, растительный материал для экстракции масла, целлюлозосодержащая масса, полученная из древесины путем механической или химической обработки, или вторичные волокна. Они могут также использоваться в детергентах, которые в норме содержат дополнительные компоненты, например, поверхностно-активные вещества, сурфактанты, отбеливатели и/или наполнители. В контексте настоящего изобретения понятие «целлюлозосодержащий материал» относится к любому материалу, содержащему целлюлозу или ее производные в качестве основного компонента. Целлюлозосодержащий материал вводят в контакт с эффективным количеством белка слияния в подходящих условиях, например, при соответствующих рН и температуре, и осуществляют реакцию в течение времени, необходимого для ее протекания.
Слитые ферменты особенно полезны для обработки текстильных материалов, таких как ткани и одежда (детали одежды). Текстильные материалы могут быть произведены из природных целлюлозных волокон или из сделанных человеком целлюлозных волокон или их смесей, или же из смеси синтетических волокон и целлюлозосодержащих волокон. Предпочтительно, целлюлозный материал представляет собой хлопок, в особенности деним. Термин «деним» в контексте настоящего изобретения относится к тканям из денима, в особенности, одежде из денима, в том числе к джинсам. Преимущественным образом, деним представляет собой материал, окрашенный Индиго. Деним также может быть обработан производными Индиго или Индиго вместе с другими красителями, например, деним окрашивают Индиго вместе с серосодержащей протравой.
Эндоглюканазные белки слияния особенно полезны для биостоунинга и биофинишинга.
Стирка с камнями пемзы включает три этапа: расшлихтовку, абразивную обработку и заключительную обработку. Первый этап обычно включает влажную обработку джинсов и сопровождается удалением крахмала и других шлихтующих агентов, обычно применяемых для обработки основы пряжи с целью предотвращения повреждений при плетении. Альфа-амилазы используются для удаления шлихтующих агентов на основе крахмала для улучшения и универсальности процесса влажной обработки. После расшлихтовки джинсы обычно отполаскивают в воде или подвергают непосредственной абразивной обработке.
Второй этап, абразивная обработка, проводится при использовании ферментов или камней пемзы или с обоими указанными средствами. Во всех случаях для удаления красителя необходимо механическое воздействие и обработку обычно осуществляют в стиральных машинах, подобных машинам с барабанами. Термин «состаренная» («вареная») относится к внешнему виду ткани денима, которая прошла обработку целлюлазными ферментами или камнями пемзы или обоими указанными средствами. Синонимами данного термина являются термины «потертый вид» и «вид стирки с камнями». В результате неравномерного удаления красителя существует контраст между окрашенными участками и участками, с которых краситель был удален.
За абразивной обработкой следует третий этап, заключительная обработка, которая включает стадии стирки и отполаскивания, в процессе которых могут использоваться детергенты, оптические осветлители, отбеливающие агенты или размягчители. После обработки ферментами реакцию останавливают для предотвращения повреждения обработанного материала, например, инактивацией температуры и/или рН, во время которой происходит окончательное отмывание и/или удаление детергентов Это означает, что механическая прочность уже не подвергается воздействию ферментов.
Используемый здесь термин «биостоунинг» ткани или одежды означает использование ферментов вместо, или в дополнение, к использованию камней пемзы для обработки ткани или одежды, в особенности денима.
Как отмечалось выше, обработка целлюлазами может полностью заменять стирку с камнями пемзы (например, 1 кг коммерческого фермента заменяет использование 100 кг камней). Однако, обработка целлюлазами может быть скомбинирована с обработкой камнями пемзы, когда нужно получить сильно истертый продукт. Эффект персиковой кожи, когда создается внешний вид, напоминающий тонкий выступающий пушок персика, также достигается комбинированной стиркой с нейтральной целлюлазой и камнями пемзы. Описанные белки слияния особенно полезны для эффективного обеспечения потертого внешнего вида и минимизации обратного окрашивания в процессе биостоунинга.
Биостоунинг обычно осуществляют при рН от 3,0 до 8,0, предпочтительно, при рН от 5,0 до 7,0. Температура может варьировать от около 30°C до 80°C и, предпочтительно, от 50°C до 60°C. Отношение объема жидкости к весу ткани может варьировать от около 3:1 до 20:1, предпочтительно, от 5:1 до 10:1. Время обработки составляет от 15 мин до 90 мин, предпочтительно, от 30 мин до 60 мин. Следует иметь в виду, что доза фермента существенным образом зависит от типа ткани, стиральной машины, условий стирки (рН, температура, отношение объема жидкости к весу ткани, нагрузка денима, скорость процесса) и типа используемого ферментного препарата и т.д. Если необходимо, могут использоваться камни пемзы в сочетании с эндоглюканазными белками слияния. Доза ферментов может быть значительно снижена. Специалисту в данной области понятно, каким образом можно подобрать подходящие дозы ферментов и условия стирки.
Заявленные эндоглюканазные белки слияния обеспечивают неожиданные преимущества, поскольку ферменты обладают высокой активностью при минимальном обратном окрашивании ткани и хорошем контрасте окрашенных и неокрашенных участков. Кроме того, белки слияния легко получить и они могут быть использованы при относительно высоком разбросе температуры и рН.
Эндоглюканазные белки слияния полезны для биофинишинга тканей и одежды. Биофинишинг относится к использованию ферментов в процессе контролируемого гидролиза целлюлозных волокон для модификации поверхности тканей или нитей таким образом, чтобы предотвратить перманентное скатывание, улучшить мягкость и гладкость ткани, когда ее пробуют на ощупь, очистить поверхностную структуру с удалением катышек, что приводит к более ясному цвету, улучшает драпируемость ткани, впитывание влаги и поглощение красителя.
Ферментный депилинг может осуществляться на любой стадии влажной обработки ткани, предпочтительно, после необязательной расшлихтовки и/или отбеливания при условиях, сходных с условиями биостоунинга.
Используемые эндоглюканазные белки слияния, включающие также бета-глюканазы, гемицеллюлазы или ксиланазы, могут оказаться полезными и для улучшения качества кормов для животных, в особенности для обработки растительного материала ферментами.
Крахмал, белки и липиды могут легко расщепляться в пищеварительной системе моногастрических животных, таких как домашняя птица и свиньи, в то время как большая часть некрахмальных полисахаридов (NSP), в том числе связанные смешанным образом бета-глюканы, например из ячменя и овса, остаются нерасщепленными, поскольку у указанных животных отсутствуют ферменты с необходимой активностью. Более того, перевариваемость других компонентов, в особенности животных жиров, снижается в присутствии NSP.
Бета-глюканазы коммерчески использовались для решения проблем, имеющих отношение к связанным смешанным образом бета-глюканам из ячменя и овса. Известно, что бета-глюканазы снижают вязкость кишечного содержимого, вызываемую растворимыми бета-глюканами, а также высвобождают питательные вещества, инкапсулированные клеточными стенками, богатыми бета-глюканами. Использование бета-глюканаз улучшает самочувствие животных, что определяется прибавкой в весе и показателем отношения переработки корма. Кроме того, у домашней птицы уменьшается липкость помета.
Гранулирование с применением пара является основной технологической процедурой приготовления пищевых продуктов во всем мире. Преимущества ее при производстве продуктов из пищевой массы заключаются в более легкой обработке, уменьшении токсических компонентов и организмов и в перечисленных выше улучшениях качества продукта. Термоустойчивость и высокая активность белков слияния, описанные выше, делают их подходящими для использования в производстве пищевых продуктов.
Изобретение иллюстрируется приведенными ниже неограничивающими примерами. Следует понимать, что варианты осуществления изобретения, приведенные в описании, так же, как и примеры, служат исключительно в иллюстративных целях и в объем изобретения входят его различные изменения и модификации.
Пример 1. Получение целлюлазы Thermoascus aurantiacus ALKO4242 EG 28 в Trichoderma reesei
Для выделения и ферментной обработки ДНК (плазмиды, ДНК-фрагменты), трансформации Е.coli и т.д. используются стандартные биологические методы. Используемые базовые методы описаны в известных руководствах по молекулярной биологии, например, в руководстве Sambrook et al. (1989) и Sambrook и Russel (2001).
Ген cel5A Thermoascus aurantiacus (SEQ ID NO:1), кодирующий целлюлазу EG28 (SEQ ID NO:2), амплифицируют с помощью ПЦР непосредственно из геномной ДНК Thermoascus aurantiacus ALKO4242, выделенной методом Raeder и Broda (1985). Прямой (SEQ ID NO:9) и обратный (SEQ ID NO:10) праймеры конструируют на основе опубликованной последовательности эндоглюканазы Thermoascus aurantiacus (AF487830). Амплифицированный продукт размером 1,3 кб, включающий полный ген (от старт-кодона до стоп-кодона), клонируют в виде SacII-PstI-фрагмента в векторе pBluescript II KS+. Секвенируют два независимых клона и отбирают один клон, который обозначают pALK.1926. Штамм Е.coli, содержащий pALK1926, депонирован в немецкой коллекции микроорганизмов и клеточных культур GmbH под номером DSM 17326.
Плазмиду экспрессии (pALK1930, Фиг.1) конструируют для получения рекомбинантной целлюлазы Thermoascus aurantiacus EG28/Cel5A (SEQ ID NO:2). Ген cel5A, включающий собственную сигнальную последовательность, точно сливают с промотором cbhl Trichoderma reesei с помощью ПЦР. Промотор cbhl, терминатор cbhl и маркерный ген amdS включают в состав плазмиды, как описано Paloheimo et al. (2003). Линейную кассету экспрессии (Фиг.1) выделяют из остова вектора расщеплением ферментами рестрикции, вводят трансформацией в Trichoderma reesei A96, и отбирают трансформанты с помощью ацетамида как единственного источника азота. Хозяйский штамм лишен четырех основных эндогенных целлюлаз: CBHI/Cel7A, CBHII/Cel6A EGI/Cel7B и EGII/Cel5A. Трансформанты выращивают в соответствии с методами Penttilä et al. (1987) с модификациями, описанными Karhunen et al. (1993) Трансформанты очищают на селекционных планшетах до стадии конидий и споруляции на PD.
Продуцирование целлюлазы трансформантами анализируют в культуральных супернатантах при культивировании во встряхиваемых флаконах (50 мл). Трансформанты выращивают в течение 7 дней на сложной среде с целлюлозой (Joutsjoki et al. 1993), забуференной 5%-ным KH2PO4 при рН 5,5. Ферментная активность рекомбинантного белка измеряют в культуральном супернатанте по высвобождению редуцирующих Сахаров из карбоксиметилцеллюлозы (2% CMC) при 50°C в 50 мМ ацетатного буфера (рН 4,8), как описано Bailey и Nevalainen, 1981; Haakana et al. 2004. Активность по отношению к бета-глюкану ячменя (1%) также определяют измерением высвобождения редуцирующих сахаров 50°C в 50 мМ ацетатного буфера (рН 4,8), как описано Stálbrand et al. 1993. Продуцирование рекомбинантного белка также определяют в культуральном супернатанте путем SDS-полиакриламидного гель-электрофореза. Генотипы отобранных трансформантов анализируют Саузерн-блоттингом при использовании кассеты экспрессии в качестве пробы.
Оптимум рН гетерологично продуцируемой целлюлазы EG28/Cel5A определяют в универсальном буфере Mcllvaine при диапазоне рН от 4,0 до 8,0 при использовании карбоксиметилцеллюлозы в качестве субстрата. Как показано на Фиг.2А, оптимум рН для активности целлюлазы EG28/Cel5A составляет 6,0. Оптимальная температура ферментной активности целлюлазы EG28/Cel5A составляет 75°C (Фиг.2B).
Отобранный трансформант RF6188 культивируют в биореакторе с получением материала для тестирования возможных применений (см. Пример 4).
Пример 2. Получение рекомбинантного белка слияния Thermoascus aurantiacus ALKO4242 EG28+CtCBD
Для получения рекомбинантного белка слияния Thermoascus aurantiacus ALK04242 EG 28+CtCBD (SEQ ID NO:4) целлюлозо-связывающий домен (CBD) целлюлазы CBHI/Cel7A Chaetomium thermophilum ALKО4265 соединяют с целлюлазой EG28/Cel5A. Конструкцию, содержащую каталитический домен EG28 (аминокислоты 1-334 полноразмерного полипептида), прикрепляют к линкеру и CBD Chaetomium thermophilum CBHI/Cel7A CtCBD (SEQ ID NO:15).
Используют стандартные молекулярно-биологические методы, описанные в Примере 1. Сначала встраивают уникальный рестрикционный сайт SnaBI около C-концевого участка EG28/Cel5A путем ПЦР. Это обеспечивает непосредственное слияние любой ДНК со слепыми концами после аминокислоты Y334 полипептида EG28/Cel5A. Линкер и CBD-домен CBHI/Cel7A Chaetomium thermophilum кодирующего гена (Cel7A, SEQ ID NO:17) амплифицируют с помощью ПЦР при использовании прямого (SEQ ID NO:11) и обратного (SEQ ID NO:12) праймеров и геномной ДНК Chaetomium thermophilum ALKО4265 в качестве матрицы. Амплифицированный 1,6 кб продукт лигируют с геном Cel5A (после Y334) с получением Та Cel5A_Ct Cel7линкерCBD (SEQ ID NO:3). Полученную плазмиду обозначают pALK1946. Штамм E.coli, содержащий pALK1946, депонирован в немецкой коллекции микроорганизмов и клеточных культур GmbH под номером DSM 18159.
Плазмиду экспрессии (pALK1948, Фиг.1) для получения целлюлазы EG28+CtCBD конструируют, как описано в Примере 1. Линейную кассету размером 8,9 кб (Фиг.1) выделяют из остова вектора расщеплением рестрикционным ферментом Notl, вводят трансформацией в Trichoderma reesei A33 (штамм лишен генов, кодирующих четыре основные эндогенные целлюлазы: CBHI/Cel7A, CBHII/Cel6A EGI/Cel7B и EGII/Cel5A) и отбирают трансформанты, как описано в Примере 1. Оптимум рН и температуры для белка слияния определяют так же, как и для белка дикого типа EG28.
Отобранный трансформант RF6377 культивируют в биореакторе с получением материала для тестирования возможных применений (см. Примеры 5-10).
Пример 3. Получение рекомбинантного белка слияния Acremonium thermophilum ALKO4245 EG40+CtCBD
Для получения рекомбинантного белка слияния Acremonium thermophilum ALKO4245 EG40+CtCBD (SEQ ID NO:6) целлюлозо-связывающий домен (CBD) целлюлазы EG40 замещают таковым Chaetomium thermophilum ALKO4265 CBHI/Cel7A. Конструкцию, содержащую каталитический домен EG40 (аминокислоты 1-234 полноразмерного полипептида), прикрепляют к линкеру и CBD Chaetomium thermophilum (CtCBD, SEQ ID NO:15).
Используют стандартные молекулярно-биологические методы, описанные в Примере 1. Ген Cel45A Acremonium thermophilum (SEQ ID NO:8) амплифицируют с помощью ПЦР из геномной ДНК Acremonium thermophilum ALKO4245 при использовании праймеров (SEQ ID NO:13) и (SEQ ID NO:14). ПЦР-фрагмент 1,1 кб клонируют в векторе pBluescript II KS+ в виде фрагмента SacII-PstI. После этого встраивают уникальный рестрикционный сайт NruI около-С-концевого участка EG40 путем ПЦР. Это обеспечивает непосредственное слияние любой ДНК со слепыми концами после аминокислоты S234 полипептида EG40. Линкер и CBD-домен CBHI/Cel7A Chaetomium thermophilum кодирующего гена (Cel7A) амплифицируют с помощью ПЦР, как описано в Примере 2. Рестрикционный фрагмент лигируют с геном Cel45A (после S234) с получением At Cel45A_Ct Cel7линкерCBD (SEQ ID NO:5). Далее конструируют плазмиду экспрессии для продуцирования целлюлазы EG40+CtCBD и нарабатывают рекомбинантный белок (SEQ ID NO:6) в Trichoderma, как описано в Примере 1.
Пример 4. Активность целлюлазы EG28 при окончательной обработке денима при различных температурах
Целлюлазу Thermoascus aurantiacus EG28, полученную в Trichoderma (штамм RF6188), как описано в Примере 1, тестируют на способность создавать потертый вид денима (биостоунинг), который обеспечивается традиционной стиркой с камнями пемзы, при различных температурах. В качестве контроля сравнения используют эффективный фермент для окончательной обработки денима, представляющий собой коммерческий препарат EGII, обогащенный кислыми целлюлазами, полученный в Trichoderma (патент США 5874293).
В качестве тестируемого материала используют джинсы, сделанные из окрашенного Индиго денима, после расшлихтовки альфа-амилазой ECOSTONE® A200. Обработку целлюлазой проводят в стиральной машине Electrolux Wascator FOM 71 CLS при условиях, описанных в Таблице 1.
Эндоглюканазную активность (ECU) препарата ферментов определяют по высвобождению редуцирующих сахаров из гидроэтилцеллюлозы, как ранее описано Bailey и Nevalainen, 1981. Препарат EGII, обогащенный кислыми целлюлазами, и EG28 дозируют как 220 ECU/г и около 380 ECU/г ткани, соответственно. Ферменты тестируют при их оптимальном рН, а именно препарат EGII при рН 5 и препарат EG28 при рН 6. После сушки ферменты инактивируют (10 мин при 40°C) повышением рН до 11 с помощью гидроксида натрия. Затем джинсы трижды отполаскивают водой и высушивают в барабане.
Эффект биостоунинга/уровень потертости определяют измерением цвета по значениям отражения в спектрофотометре Minolta CM 2500 при использовании координат цветовой шкалы L*a*b* (освещение D65/2°). Интенсивность цвета лицевой и обратной сторон денима и карманов измеряют после расшлихтовки (т.е. до обработки целлюлазами) и после обработки целлюлазами. Каждое измерение цвета лицевой и обратной сторон денима и карманов представляют как среднее примерно 40, 20 или 12 измерений, соответственно. Для каждого тестирования используют по две пары джинсов и конечный результат представляют как среднее значение. Результаты экспериментов приведены в Таблице 2 и на Фиг.3
Таблица 1. | |
Условия тестирования целлюлаз при обработке денима | |
Параметры процесса тестирования | |
Загрузка денима | 1,3 кг |
Вода | 19 л |
Контроль рН (рН 5-5,3) Контроль рН (рН 6,1-6,3) |
35 г Na2HPO42H2O+22 г лимонной кислоты 35, 5 г Na2HPO42H2O+15 г лимонной кислоты |
Время | 45 мин |
Температура | 40, 50, 60 или 70°C |
Доза целлюлазы | 220 или около 380 ECU/г ткани |
Результаты, приведенные в Таблице 2 и на Фиг.3, свидетельствуют о том, что наилучший эффект потертости при использовании препарата EG28 (штамм RF6188), обеспечивается при температуре от 50 до 70°C. При использовании дозы 380 ECU/г ткани препарата EG28 при 70°C наблюдается сходный уровень потертости (потеря цвета L*) при сравнении с использованием дозы 220 ECU/г ткани препарата EGII при 60°C. Однако, эффект обратного окрашивания (перераспределение красителя Индиго) на обратной стороне денима и карманах ниже при использовании препарата EG28 (более высокая потеря цвета, меньше голубого) при сравнении с использованием препарата EGII. Также контраст окраски на лицевой стороне денима более ярко выражен.
Пример 5. Активность целлюлазного белка слияния EG28+CtCBD по сравнению с целлюлазой EG28 при окончательной обработке денима
Рекомбинантный белок слияния Thermoascus aurantiacus EG28+CtCBD, полученный в Trichoderma (штамм RF6377), как описано в Примере 2, сравнивают с препаратом EG28 из штамма RF6188 в процессе биостоунинга денима при рН 6 и температуре 60°C. Деним и тестирующая система для биостоунинга такая же, как и в Примере 4, за исключением того, что вес денима достигает 1430 г вместе с дополнительными различными кусками денима, которые не включаются в измерения. Эффект обработки целлюлазами оценивают так же, как и в Примере 4.
Результаты, приведенные в Таблице 3, свидетельствуют о том, что эффект биостоунинга препарата EG28+CtCBD является очень хорошим при низкой дозе. При сравнении продуктов штамма RF6377 и штамма RF6188 наблюдается сходный эффект потертости (потеря цвета L*), однако для этого требуется в 6,5 раз меньшая доза продукта RF6377 по сравнению с продуктом RF6188. Присоединение целлюлозо-связывающего домена (CBD) к целлюлазе EG28 не увеличивает нежелательного эффекта обратного окрашивания, но существенно повышает активность, направленную на истирание (вываривание) ткани.
Таблица 3. | |||||||
Измерение цвета ткани деннма, обработанного EG28 и EG28+CtCBD целлюлазами, при рН 6 и температуре 60°C | |||||||
L* обозначает потерю цвета, -b* голубизну и +b* желтизну. | |||||||
Ферментный препарат | ECU/г одежды | До обработки целлюлазой | После обработки целлюлазой | Дельта L* | Дельта b* | ||
L* | b* | L* | b* | ||||
Лицевая сторона | |||||||
EG28 | 325 | 23,40 | -16,02 | 31,01 | -17,12 | 7,62 | -1,10 |
EG28+CICBD | 50 | 23,81 | -16,21 | 31,60 | -16,92 | 7,80 | -0,71 |
Обратная сторона | |||||||
EG28 | 325 | 49,46 | -6,83 | 50,03 | -9,62 | 0,57 | -2,79 |
EG28+CICBD | 50 | 49,36 | -7,03 | 50,62 | -9,61 | 1,27 | -2,58 |
Карманы | |||||||
EG28 | 325 | 76,11 | -8,36 | 68,53 | -12,46 | -7,58 | -4,10 |
EG28+CICBD | 50 | 76,02 | 8,45 | 68,81 | -12,39 | -7,21 | -3,94 |
Пример 6. Активность целлюлазного белка слияния EG28+CtCBD по сравнению с целлюлазой EGII при окончательной обработке денима
Рекомбинантный белок слияния Thermoascus aurantiacus EG28+CtCBD, полученный в Trichoderma (штамм RF6377), как описано в Примере 2, сравнивают с коммерческим препаратом EGII, обогащенным кислыми целлюлазами (патент США 5874293), при биостоунинге денима.
Тестирующая система для биостоунинга такая же, как и в Примере 4, за исключением того, что используют куски различных типов денима Ukos Sport (Бельгия) и Vicunha (Бразилия) при общем весе 1, 2 кг. Условия обработки EG28+CtCBD и EGII приведены в Таблице 4. Эффект обработки целлюлазами оценивают так же, как и в Примере 4.
Результаты экспериментов по обработке четырех различных типов денима приведены в Таблицах 4 и 5. При использовании дозы 500 ECU/г ткани препарата EG28+CtCBD наблюдается сходный уровень потертости при сравнении с использованием дозы 1000 ECU/г ткани препарата EGII. При использовании препарата EG28+CtCBD требуется примерно только половина ECU-дозы препарата EGII, обогащенного кислыми целлюлазами. Кроме того, для процесса биостоунинга культуральная среда, в которой выращивался рекомбинантный хозяин, продуцирующий EG28+CtCBD, по объему в два раза эффективнее среды, в которой выращивался рекомбинантный хозяин, продуцирующий EGII. Соответственно, обратное окрашивание в меньшей степени наблюдалось на обратной стороне денима при использовании препарата EG28+CtCBD. Активность препарата EG28+CtCBD при 50°C была лучшей при рН 6, чем при рН 5.
Пример 7. Влияние рН на активность целлюлазного препарата EG28+CtCBD при 50°C и 60°C
Рекомбинантный белок слияния Thermoascus aurantiacus EG28+CtCBD, полученный в Trichoderma (штамм RF6377), как описано в Примере 2, тестируют на активность при биостоунинге денима при 50°C и 60°C.
Окрашенный Индиго деним (отличный от используемого в ранее приведенных примерах) после расшлихтовки и разрезания на куски используют в качестве тестового материала. Обработку целлюлазой осуществляют в устройстве LP-2 Launder Ometer, как описано ниже. Около 7,2 г ткани денима (лоскут размером примерно 12 см × 12 см), 200 мл цитрат-фосфатного буфера Mcllvaine и 90 стальных шариков (диаметром 0,6 см) загружают в 1, 2 л контейнеры. Устройство Launder Ometer работает в течение 120 мин при различных значениях рН от 4 до 9 и температуре 50°C и 60°C. После удаления лоскутов из контейнеров их отполаскивают водой и вымачивают в воде, содержащей NaOH (рН больше 11) в течение 10 мин при перемешивании. Затем лоскуты вымачивают в теплой воде, содержащей жидкий детергент (ОМО Color) и перемешивают в течение 10 мин и далее осторожно отполаскивают теплой водой несколько раз. Лоскуты высушивают при комнатной температуре. Эффект обработки целлюлазой оценивают так же, как и в Примере 4. Каждое измерение на лицевой стороне лоскута денима определяют как среднее из 20 измерений.
Результаты экспериментов, приведенные в Таблицах 6 и 7 и на Фиг.4 и 5, показывают, что оптимальное значение рН для целлюлазы EG28+CtCBD при 50°C составляет от 5,5 до 6,5 и при 60°C от 5 до 7.
Таблица 6. | |||||||
Измерение цвета ткани на лицевой стороне денима, обработанного целлюлазой EG28+CtCBD, при различных рН в устройстве Launder при 50°C | |||||||
L* обозначает потерю цвета, -b* голубизну. | |||||||
Ферментный препарат | ECU/г одежды | Условия | До обработки целлюлазой | После обработки целлюлазой | Увеличение L* | ||
L* | b* | L* | b* | ||||
Буферный контроль | 0 | рН 6 | 17,28 | -13,07 | 18,77 | -14,13 | 1,49 |
Буферный контроль | 0 | рН 8 | 17,01 | -13,4 | 18,18 | -14,45 | 1,17 |
EG28+CICBD | 1000 | рН 4 | 16,79 | -13,59 | 20,86 | -16,40 | 4,07 |
EG28+CICBD | 1000 | рН 5 | 17,34 | -13,18 | 21,59 | -16,44 | 4,25 |
EG28+CICBD | 1000 | рН 5,5 | 17,30 | -13,25 | 22,06 | -16,39 | 4,76 |
EG28+CICBD | 1000 | рН 6 | 17,35 | -13,42 | 22,29 | -16,47 | 4,94 |
EG28+CICBD | 1000 | рН 6,5 | 17,31 | -13,41 | 22,48 | -16,65 | 5,17 |
EG28+CICBD | 1000 | рН 7 | 17,34 | -13,25 | 21,55 | -16,23 | 4,21 |
EG28+CICBD | 1000 | рН 8 | 16,01 | -13,63 | 19,62 | -15,72 | 2,71 |
Таблица 7. | |||||||
Измерение цвета ткани на лицевой стороне денима, обработанного целлюлазой EG28+CtCBD, при различных рН в устройстве Launder при 60°C | |||||||
L* обозначает потерю цвета, -b* голубизну. | |||||||
Ферментный препарат | ECU/г одежды | Условия | До обработки целлюлазой | После обработки целлюлазой | Увеличение L* | ||
L* | b* | L* | b* | ||||
EG28+CICBD | 1000 | рН 4 | 17,19 | -13,58 | 20,48 | -15,77 | 3,29 |
EG28+CICBD | 1000 | рН 5 | 17,10 | -13,24 | 22,74 | -16,59 | 5,64 |
EG28+CICBD | 1000 | рН 5,5 | 17,10 | -13,54 | 22,66 | -16,61 | 5,56 |
EG28+CICBD | 1000 | рН 6 | 17,10 | -13,65 | 22,83 | -16,74 | 5,73 |
EG28+CICBD | 1000 | рН 6,5 | 17,19 | -13,47 | 22,65 | -11,72 | 5,46 |
EG28+CICBD | 1000 | рН 7 | 16,99 | -13,72 | 22,10 | -16,66 | 5,11 |
EG28+CICBD | 1000 | рН 8 | 17,13 | -13,68 | 19,35 | -15,15 | 2,22 |
Буферный контроль | 0 | рН 6 | 17,36 | -13,6 | 18,95 | -14,28 | 1,59 |
Пример 8. Активность целлюлазного препарата EG28+CtCBD при окончательной обработке денима различных температурах
Рекомбинантный белок слияния Thermoascus aurantiacus EG28+CtCBD, полученный в Trichoderma (штамм RF6377), как описано в Примере 1, тестируют на способность создавать потертый вид ткани, сходный с тем, который обеспечивается при стирке денима с камнями пемзы, при различных температурах. В качестве контроля сравнения используют эффективные ферменты для окончательной обработки денима, а именно коммерческий препарат EGII, обогащенный кислыми целлюлазами (патент США 5874293), и препарат на основе нейтральных целлюлаз ECOSTONE® С1. Тестирующая система для биостоунинга такая же, как и в Примере 4, за исключением того, что используют куски различных типов денима и время стирки составляет 55 мин. Ферментную активность (эндоглюканазная единица, ECU) препаратов EG28+CtCBD и EGII определяют, как описано в Примере 4. Активность (единица нейтральной целлюлазы, NCU) препарата на основе нейтральных целлюлаз ECOSTONE® C1 определяют по высвобождению редуцирующих сахаров из карбоксиметилцеллюлозы, как описано Bailey и Nevalainen, 1981; Haakana et al. 2004. Дозы ECOSTONE® C1, EG28+CtCBD и EGII составляют 250 NCU/г ткани, 500 ECU/г ткани или 1000 ECU/г ткани, соответственно. Эффект обработки целлюлазой оценивают так же, как и в Примере 4.
Активность EG28+CtCBD при температуре от 40 до 70°C и рН 6 приведена в Таблице 8 и на Фиг.6. Предпочтительный температурный интервал для фермента составляет от 50 до 70°C. Более низкие температуры такие, как 40°C, могут использоваться для получения эффекта потертости с большей интенсивностью окраски, если желательно, чтобы ткань выглядела более темной.
Результаты исследований согласуются с таковыми, полученными в Примере 6, где активность EG28+CtCBD при биостоунинге примерно в два раза выше активности коммерческого препарата EGII, обогащенного кислыми целлюлазами. Кислые целлюлазы обычно способствуют обратному окрашиванию. Нейтральные целлюлазы, подобные ECOSTONE® C1, обычно вызывают слабое обратное окрашивание, обеспечивая хороший контраст. Результаты, полученные в этом примере, показывают, что сходный эффект выявляется при использовании целлюлазы EG28+CtCBD и нейтральных целлюлаз (Таблица 8).
В качестве контроля сравнения используют коммерческий препарат EGII, обогащенный кислыми целлюлазами, и препарат на основе нейтральных целлюлаз ECOSTONE® C1. L* обозначает потерю цвета, -b* голубизну и +b* желтизну.
Пример 9. Активность целлюлазных препаратов EG28 и EG28+CtCBD при биофинишинге (удалении катышек)
Тестируют активность целлюлазы EG28 из штамма RF6188 и препарата EG28+CtCBD из штамма RF6377 при удаления катышек с хлопчато-бумажного трикотажа. Обработку целлюлазами осуществляют в стиральной машине Electrolux Wascator FOM 71 CLS при условиях, описанных в Таблице 9.
Лоскуты двух низкого качества джемперов с воротником «поло», на поверхности которых имеются многочисленные катышки, сделанных из 100%-ной хлопчато-бумажной ткани типа джерси или 95%-ной хлопчато-бумажной ткани типа репса и 5%-ной лайкры используют в качестве тестируемого материала и контроля. Образцы сначала предварительно стирают в течение 10 мин при 60°C и 1 мл/л сурфактанта/увлажняющего агента (Sandoclean PCJ, Sandos, и Imacol CN, Clariant) и три раза отполаскивают водой. После этого хлопчато-бумажный трикотаж обрабатывают целлюлазой при 60°C в течение 60 мин в присутствии тех же самых текстильных добавок, который используются при предварительной стирке. Ферменты инактивируют, как описано в Примере 4, за исключением того, что температура в процессе щелочного отполаскивания составляет 60°C. Лоскуты трикотажа три раза отполаскивают и высушивают в барабане.
Таблица 9. | |
Условия тестирования целлюлаз при окончательной обработке (биофинишинге) денима | |
Параметры процесса тестирования | |
Загрузка ткани | 1,0 кг |
Вода | 15 л |
Sandoclean PCJ и Imacol CN | 1 мл/л |
Контроль рН/буфер (рН 5-5,3) | примерно 3 мл уксусной кислоты (80%) |
Время | 60 мин |
Температура | 60°C |
Доза целлюлазы | 1200 ECU/г ткани |
Эффект обработки целлюлазами оценивают визуально невооруженным глазом и с помощью лупы. В качестве контроля используют предварительно выстиранные образцы ткани без фермента.
Результаты экспериментов показывают, что препарат EG28+CtCBD повышает устойчивость ткани к скатыванию. Число катышек на поверхности трикотажа значительно снижается после обработки EG28+CtCBD по сравнению с контролем (стирка без фермента). Препарат EG28 также имеет аналогичный эффект.
Пример 10. Тест на стабильность гранулированного пищевого продукта
Два целлюлазных препарата EG28 из штамма RF6188 и препарата EG28+CtCBD из штамма RF6377 по отдельности тестируют в эксперименте, напоминающем промышленный способ производства пищевого продукта. До начала тестирования препараты EG28 и EG28+CtCBD, высушенные распылением, грунтуют с пшеничной мукой для улучшения гомогенности. Ферменты EG28 и EG28+CtCBD, предварительно смешанные с мукой, добавляют в дозах 200 г/тонну и 500 г/тонну пищевого продукта, соответственно. Сверхдозы ферментов используются для обеспечения анализа образцов, гранулированных при высоких температурах, когда их активность может быть существенным образом снижена.
Для получения пищевой смеси в процессе полупромышленного производства растительного пищевого продукта с номинальной способностью к грануляции 5 т/ч используют мельницу и миксер. Мельница представляет собой устройство Champion, оснащенное сеткой с отверстиями диаметром 3,0 мм. Загрунтованный сырой материал перемешивают в 2,000 л горизонтальном миксере при 27 rpm до помещения в устройство пищевой минимельницы. Устройство содержит горизонтальный миксер (объем 700 л, скорость 48 rpm, смешивающая емкость 300 кг), дозирующий винт Skjold TR и каскадный миксер Kahl (длина 130 см, диаметр 30 см, скорость 155 rpm), оснащенный 37 подвижными поддонами. Время перерыва для 300 кг/ч составляет около 30 с. На стороне каскадного миксера смонтирован коллектор с пусковым устройством для воды и три паровых вентеля для подачи пара на пищевой продукт. Пар образуется в бойлере под высоким давлением с максимальной емкостью 400 кг пара/час. Тестирование проводят при сверхдавлении в 2 атмосферы и пар подают из вентеля за счет уменьшения давления под контролем введения пара в каскадный миксер Три вентеля на коллекторе используют для получения нужной температуры пищевого продукта. Температуру пищевого продукта измеряют цифровым термометром, расположенным на выходе из каскадного миксера, прямо перед тем, как продукт попадает на сетку для гранулирования. Используют пресс для грануляции Simon Heesen типа монорольного с сеткой диаметром 3 мм и мотором 7,5 kW. Внутренний диаметр сетки 173 мм, высота валика пресса 50 мм, диаметр валика пресса 140 мм, скорость оборота 500 rpm и номинальная емкость 300 кг/ч. Образцы отбирают после того, как они были гранулированы в прессе и охлаждают в перегородчатом охлаждающем контейнере с перфорированным дном при скорости вентилирования 1500 м3 воздуха/ч.
Получают партию продукта из пшеничной массы весом 300 кг. Премикс получают из 10 кг указанного продукта и 200 г (или 500 г) тестируемого фермента в 70 л в миксере. Скорость вращения миксера составляет 45 rpm, а время перемешивания - 10 мин. Указанный премикс добавляют к 290 кг пищевого продукта и помещают в горизонтальный миксер в устройстве пищевой минимельницы и перемешивают 10 мин. После взятия пробы образовавшейся массы пищевой продукт гранулируют пропусканием через пресс (диаметр отверстий сетки 3 мм). Продукт нагревают до нужной температуры (от 65 до 90°C) введением пара в каскадный миксер. Для каждой температуры образец сначала отбирают через 10 мин после достижения нужной температуры гранулирования (которую измеряют в пищевом продукте точно перед началом гранулирования). Образцы отбирают в течение 1,0 мин, что соответствует с 5,0 кг гранулированного пищевого продукта. Суб-образец весом около 500 г помещают в охлаждающий контейнер на 10-15 с после того, как гранулы выйдут из пресса. Все образцы аэрируют и охлаждают при сходной температуре в течение 15 мин. Образцы однородно разделяют на специальном делящем устройстве и заполняют ими пластиковые пакеты.
Образцы анализируют следующим образом: 2,5 г хорошо загрунтованного образца и 20 мл ацетатного буфера (0,05 М, рН 5,0) перемешивают при комнатной температуре в течение 30 мин, центрифугируют (10 мин, 4000 rpm) и разводят. 1,0 мл очищенного образца в трех повторах уравновешивают в течение 5 мин в водяной бане при 40°C. Реакцию инициируют добавлением таблетки бета-глюказима (Megazyme, Ireland) без перемешивания. После 30 мин реакцию останавливают добавлением 5,0 мл Trizma Base 1% (вес на объем) (Sigma-Aldrich) с интенсивным перемешиванием на мешалке вортекс. Пробирку оставляют при комнатной температуре примерно в течение 5 мин; жидкость перемешивают снова и фильтруют через бумажный фильтр Whatman I. Поглощение фильтрата измеряют при 590 нм. Результаты анализируют при использовании стандартной кривой.
Ферментную активность определяют до гранулирования и после гранулирования. Данные представлены в Таблице 10. Влияние температуры гранулирования на активность бета-глюканазы также и показано на Фиг.7 и 8. Целлюлазы EG28 и EG28+CtCBD стабильны при температуре до 80°C. Целлюлаза EG28+CtCBD более стабильна, чем EG28 при температуре гранулирования 90°C.
Таблица 10. | ||
Активность ферментов до (пищевой продукт из горизонтального миксера) и после гранулирования при температуре 65°C до 90°C. | ||
Температура гранулирования | Активность бета-глюконазы (FBU/кг пищевого продукта) | |
(EG28) | (EG28+CtCBD) | |
Пищевой продукт из горизонтального миксера | 239000±9000 (100%) | 1148000±48000 (100%) |
Гранулирование (65°C) | 227000±16000 (95%) | 1007000±67000 (88%) |
Гранулирование (70°C) | 217000±5000 (91%) | 1012000±54000 (88%) |
Гранулирование (75°C) | 227000±14000 (95%) | 993000±49000 (86%) |
Гранулирование (80°C) | 215000±6000 (90%) | 1030000±87000 (90%) |
Гранулирование (85°C) | 188000±7000 (79%) | 904000±56000 (79%) |
Гранулирование (90°C) | 149000±8200 (62%) | 861000±32000 (75%) |
Перечень депонированных организмов
Штамм | Содержащаяся плазмида | Орган депонирования | Дата депонирования | Номер депозита |
Acremonium thermophilum ALKO4245 | - | CBS(1) | Сентябрь 20, 2004 | CBS 116240 |
Thermoascus aurantiacus ALKO4242 | - | CBS(1) | Сентябрь 20, 2004 | CBS 116239 |
Chaetomium thermophilum ALKO4265 | - | CBS(2) | Ноябрь 8, 1995 | CBS 730.95 |
Escherichia coli | pALK1946 | DSMZ(3) | Апрель 7, 2006 | DSM 18159 |
Escherichia coli | pALK1926 | DSMZ | Май 13, 2005 | DSM 17326 |
(1) Центральная коллекция клеточных культур в Uppsalalaan 8, 3584 CT, Utrecht, NL | ||||
(2) Центральная коллекция клеточных культур в Oosterstrat 1, 3742 SK BAARNt, NL | ||||
(3) Немецкая коллекция микроорганизмов и клеточных культур GmbH (DSMZ), Mascheroder Weg, 1b, D-38124 Braunschweig, DE |
Claims (25)
1. Целлюлозный слитый белок, содержащий первую аминокислотную последовательность эндоглюканазного ядра, имеющую, по крайней мере, 95%-ную идентичность с SEQ ID NO:2 и целлюлазную активность, или фрагмент указанного белка, имеющий целлюлазную активность и вторую аминокислотную последовательность, содержащую линкер и целлюлозосвязывающий домен (CBD), имеющую, по крайней мере, 95%-ную идентичность с SEQ ID NO:15 и целлюлозосвязывающую активность, или фрагмент указанного белка, имеющий целлюлозосвязывающую активность.
2. Слитый белок по п.1, где эндоглюканаза принадлежит семейству 5 гликозилгидролаз.
3. Слитый белок по любому из пп.1 или 2, где эндоглюканазное ядро происходит из Thermoascus aurantiacus, в особенности из Т. aurantiacus CBS 116239.
4. Слитый белок по п.1, где эндоглюканазное ядро имеет, по крайней мере, 98%-ную идентичность с SEQ ID NO:2, или фрагмент указанного белка, имеющий целлюлазную активность.
5. Слитый белок по п.1, где эндоглюканазное ядро имеет, по крайней мере, 99%-ную идентичность с SEQ ID NO:2, или фрагмент указанного белка, имеющий целлюлазную активность.
6. Слитый белок по п.4, где эндоглюканазное ядро содержит аминокислоты 19-334 SEQ ID NO:2.
7. Слитый белок по п.1, где линкер и CBD происходят из целлобиогидролазы Chaetomium thermophilum.
8. Слитый белок по п.7, где линкер и CBD происходят из целлобиогидролазы С. thermophilum CBS 730.95.
9. Слитый белок по п.1, где эндоглюканазное ядро содержит последовательность SEQ ID NO:2, а линкер и CBD содержат последовательность SEQ ID NO:15.
10. Слитый белок по п.1, где эндоглюканазное ядро кодируется геном, который включен в штамм E.coli DSM 17326.
11. Слитый белок по п.1, который кодируется слитым геном, который включен в штамм E.coli DSM 18159.
12. Выделенный полинуклеотид, кодирующий целлюлазный слитый белок и выбранный из группы, включающей:
а) нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:3;
б) последовательность, полученную в соответствии с вырожденностью генетического кода, на основе последовательности а) и
в) нуклеотидную последовательность, кодирующую белок слияния, содержащий первую аминокислотную последовательность эндоглюканазного ядра, имеющую, по крайней мере, 95%-ную идентичность с SEQ ID NO:2 и целлюлазную активность, или фрагмент указанного белка, имеющий целлюлазную активность и вторую аминокислотную последовательность, содержащую линкер и целлюлозосвязывающий домен (CBD), имеющую, по крайней мере, 95%-ную идентичность с SEQ ID NO:15 и целлюлозосвязывающую активность, или фрагмент указанного белка, имеющий целлюлозосвязывающую активность.
а) нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:3;
б) последовательность, полученную в соответствии с вырожденностью генетического кода, на основе последовательности а) и
в) нуклеотидную последовательность, кодирующую белок слияния, содержащий первую аминокислотную последовательность эндоглюканазного ядра, имеющую, по крайней мере, 95%-ную идентичность с SEQ ID NO:2 и целлюлазную активность, или фрагмент указанного белка, имеющий целлюлазную активность и вторую аминокислотную последовательность, содержащую линкер и целлюлозосвязывающий домен (CBD), имеющую, по крайней мере, 95%-ную идентичность с SEQ ID NO:15 и целлюлозосвязывающую активность, или фрагмент указанного белка, имеющий целлюлозосвязывающую активность.
13. Полинуклеотид по п.12, представляющий собой слитый ген, кодирующий целлюлазный слитый белок по п.1.
14. Вектор экспрессии целлюлазного слитого белка по п.1, несущий полинуклеотид по п.12.
15. Клетка-хозяин, относящаяся к нитевидным грибам, содержащая вектор экспрессии по п.14 и продуцирующая слитый белок по п.1.
16. Клетка-хозяин по п.15, относящаяся к виду грибов рода Trichoderma, содержащая экспрессирущий вектор по п.14 и продуцирующая слитый белок по п.1.
17. Способ получения слитого белка по любому из пп.1-11, включающий трансформацию клетки-хозяина экспрессирующим вектором, кодирующим указанный белок слияния, и культивирование указанной клетки-хозяина в условиях, обеспечивающих экспрессию указанного белка слияния, и при необходимости выделение и очистку продуцируемого клеткой белка слияния.
18. Ферментный препарат, имеющий целлюлазную и целлюлозосвязывающую активность и содержащий слитый белок по любому из пп.1-11, полученный способом, включающим трансформацию клетки-хозяина экспрессирующим вектором, кодирующим указанный слитый белок, и культивирование указанной клетки-хозяина в условиях, обеспечивающих экспрессию указанного слитого белка, и при необходимости выделение и очистку продуцируемого клеткой белка слияния.
19. Способ обработки целлюлозного материала, предусматривающий обеспечение контактирования целлюлозного материала со слитым белком по любому из пп.1-11 или ферментным препаратом по п.18.
20. Способ по п.19, где целлюлозный материал представляет собой текстильный материал, растение, используемое для кормления животных, или полученную из древесины целлюлозную массу, или вторичное волокно.
21. Способ биологической абразивной обработки тканей (биостоунинг), включающий стадию обеспечения контактирования целлюлазного белка слияния по любому из пп.1-11 или ферментного препарата по п.18 с тканью денима или одеждой из денима.
22. Способ окончательной биологической обработки тканей (биофинишинг), включающий стадию обеспечения контактирования целлюлазного белка слияния по любому из пп.1-11 или ферментного препарата по п.18 с текстильными материалами, такими, как ткань, или одежда, или нити.
23. Детергентная композиция, содержащая белок слияния по любому из пп.1-11 и детергентные добавки для обработки целлюлозного материала, такого, как текстильный материал.
24. Корм для животных, содержащий белок слияния по любому из пп.1-11 для улучшения пищеварения и степени усвояемости корма, содержащий целлюлозный материал, такой, как растительный материал.
26. Штамм Escherichia coli, содержащий ген, кодирующий слитый белок по п.1, депонированный под номером DSM 18159.
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US11/404,065 | 2006-04-13 | ||
US11/404,065 US7361487B2 (en) | 2006-04-13 | 2006-04-13 | Enzyme fusion proteins and their use |
FI20065234A FI119434B (fi) | 2006-04-13 | 2006-04-13 | Entsyymifuusioproteiineja ja niiden käyttö |
FI20065234 | 2006-04-13 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2008140061A RU2008140061A (ru) | 2010-05-20 |
RU2458127C2 true RU2458127C2 (ru) | 2012-08-10 |
Family
ID=38609079
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2008140061/10A RU2458127C2 (ru) | 2006-04-13 | 2007-04-12 | Целлюлозные белки слияния и их применение |
Country Status (11)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP2007884B1 (ru) |
KR (1) | KR101439352B1 (ru) |
BR (1) | BRPI0710187B1 (ru) |
CA (1) | CA2648926C (ru) |
DK (1) | DK2007884T3 (ru) |
ES (1) | ES2384276T3 (ru) |
MX (1) | MX2008013143A (ru) |
MY (1) | MY149883A (ru) |
PL (1) | PL2007884T3 (ru) |
RU (1) | RU2458127C2 (ru) |
WO (1) | WO2007118935A1 (ru) |
Families Citing this family (20)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101910392B (zh) * | 2008-01-04 | 2012-09-05 | 宝洁公司 | 酶和包含组合物的织物调色剂 |
EP2242829B1 (en) * | 2008-01-04 | 2013-03-13 | The Procter & Gamble Company | Laundry detergent composition comprising a glycosyl hydrolase and a benefit agent containing delivery particle |
FI122028B (fi) | 2008-12-30 | 2011-07-29 | Ab Enzymes Oy | Sieniperäiset endoglukanaasit, niiden tuotto ja käyttö |
WO2010103342A2 (es) * | 2009-03-12 | 2010-09-16 | Industrias Nutrigrains, S.A. De C.V. | Proteína vegetal híbrida y método para obtener la misma |
WO2012015605A1 (en) * | 2010-07-30 | 2012-02-02 | The Regents Of The University Of California | Polypeptides for use in the deconstruction of cellulose |
US9334515B2 (en) | 2010-07-30 | 2016-05-10 | The Regents Of The University Of California | Polypeptides for use in the deconstruction of cellulose |
WO2012106824A1 (en) | 2011-02-09 | 2012-08-16 | Iogen Bio-Products Corporation | Cellulase enzyme mixtures for depilling and uses thereof |
US9284687B2 (en) | 2011-09-09 | 2016-03-15 | Novozymes A/S | Properties of paper materials |
US8975058B2 (en) | 2012-05-24 | 2015-03-10 | Roal Oy | Endoglucanases for treatment of cellulosic material |
FI124476B (en) * | 2012-05-24 | 2014-09-15 | Roal Oy | Improved endoglucanases for handling cellulosic material |
BR112017004251A2 (pt) | 2014-09-05 | 2017-12-12 | Novozymes As | variantes de módulos de ligação a carboidrato e polinucleotídeos que os codificam |
WO2016040265A1 (en) | 2014-09-08 | 2016-03-17 | Novozymes A/S | Cellobiohydrolase variants and polynucleotides encoding same |
FI127093B (en) | 2014-10-27 | 2017-11-15 | Ab Enzymes Oy | Fungal-derived endoglucanase variants, their production and use |
BR112017028065A2 (pt) | 2015-06-26 | 2018-09-11 | Novozymes As | sistema de bioacabamento |
EP3192866A1 (en) | 2016-01-15 | 2017-07-19 | CIC nanoGUNE - Asociación Centro de Investigación Cooperativa en Nanociencias | Endocellulases and uses thereof |
ES2697920B2 (es) * | 2017-07-26 | 2019-06-27 | Abengoa Bioenergia Nuevas Tecnologias Sa | Celulasas con actividad celulolitica mejorada |
WO2019201793A1 (en) * | 2018-04-17 | 2019-10-24 | Novozymes A/S | Polypeptides comprising carbohydrate binding activity in detergent compositions and their use in reducing wrinkles in textile or fabric. |
EP3653706A1 (en) * | 2018-11-13 | 2020-05-20 | AB Enzymes Oy | Fusion protein |
CN109989271B (zh) * | 2019-04-10 | 2021-07-13 | 杭州优标科技有限公司 | 一种大米蛋白再生纤维素纤维的制备方法 |
US20220204956A1 (en) * | 2020-12-22 | 2022-06-30 | Fornia Biosolutions, Inc. | Additional Endoglucanase Variants and Methods |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7138263B2 (en) * | 2000-05-22 | 2006-11-21 | Meiji Seika Kabushiki Kaisha | Endoglucanase enzyme NCE5 and cellulase preparations containing the same |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
NZ303162A (en) * | 1995-03-17 | 2000-01-28 | Novo Nordisk As | Enzyme preparations comprising an enzyme exhibiting endoglucanase activity appropriate for laundry compositions for textiles |
AU7564198A (en) * | 1998-05-01 | 1999-11-23 | Procter & Gamble Company, The | Laundry detergent and/or fabric care compositions comprising a modified cellulase |
EP2295544B1 (en) * | 2001-06-26 | 2016-06-22 | Novozymes A/S | Polypeptides having cellobiohydrolase I activity and polynucleotides encoding same |
ES2637008T3 (es) * | 2005-12-22 | 2017-10-10 | Ab Enzymes Oy | Enzimas nuevas |
-
2007
- 2007-04-12 EP EP07730683A patent/EP2007884B1/en active Active
- 2007-04-12 KR KR1020087027407A patent/KR101439352B1/ko active IP Right Grant
- 2007-04-12 PL PL07730683T patent/PL2007884T3/pl unknown
- 2007-04-12 DK DK07730683.5T patent/DK2007884T3/da active
- 2007-04-12 WO PCT/FI2007/050196 patent/WO2007118935A1/en active Application Filing
- 2007-04-12 RU RU2008140061/10A patent/RU2458127C2/ru active
- 2007-04-12 BR BRPI0710187A patent/BRPI0710187B1/pt active IP Right Grant
- 2007-04-12 CA CA2648926A patent/CA2648926C/en active Active
- 2007-04-12 ES ES07730683T patent/ES2384276T3/es active Active
- 2007-04-12 MY MYPI20084042A patent/MY149883A/en unknown
- 2007-04-12 MX MX2008013143A patent/MX2008013143A/es active IP Right Grant
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7138263B2 (en) * | 2000-05-22 | 2006-11-21 | Meiji Seika Kabushiki Kaisha | Endoglucanase enzyme NCE5 and cellulase preparations containing the same |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
GARRAD G. et al., Cellulose binding domains promoter hydrolysis of different sites on crystalline cellulose, PNAS, 2000, v.97, №19, p.10342-10347. POOLE D.M. et al., Characterization of hybrid proteins consisting of the catalytic domain of Clostridium and Ruminococcus endoglucanases, fused to Pseudomonas non-catalytic cellulose binding domain, Biochem J., 1991, v.279, p.787-792. KIM Y. et al., Functional analysis of a hybrid endoglucanase of bacterial origin having a cellulose binding domain from a fungal exoglucanase, Applied biochemistry and biotechnology, 1998, v.75, p.193-204. * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP2007884A1 (en) | 2008-12-31 |
PL2007884T3 (pl) | 2012-08-31 |
DK2007884T3 (da) | 2012-06-18 |
RU2008140061A (ru) | 2010-05-20 |
WO2007118935A1 (en) | 2007-10-25 |
MX2008013143A (es) | 2008-12-12 |
WO2007118935A8 (en) | 2009-07-30 |
ES2384276T3 (es) | 2012-07-03 |
EP2007884B1 (en) | 2012-05-16 |
BRPI0710187B1 (pt) | 2017-02-21 |
CA2648926A1 (en) | 2007-10-25 |
KR101439352B1 (ko) | 2014-09-16 |
EP2007884A4 (en) | 2010-07-14 |
KR20090006182A (ko) | 2009-01-14 |
BRPI0710187A2 (pt) | 2011-08-09 |
CA2648926C (en) | 2015-11-24 |
MY149883A (en) | 2013-10-31 |
BRPI0710187A8 (pt) | 2016-04-19 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2458127C2 (ru) | Целлюлозные белки слияния и их применение | |
EP1969123B1 (en) | Novel enzymes | |
FI122028B (fi) | Sieniperäiset endoglukanaasit, niiden tuotto ja käyttö | |
JP3661995B2 (ja) | 放線菌類により産生されるセルラーゼとその産生方法 | |
EP1088080B1 (en) | Recombinant production of cellulase from actinomycetes | |
US7256032B2 (en) | Enzymes | |
EP2370573B1 (en) | Fungal endoglucanases, their production and use | |
US6566112B2 (en) | Cellulase producing actinomycetes, cellulase produced therefrom and method of producing same | |
KR20010032218A (ko) | 악티노미케테스에 의하여 제조되는 셀룰라제 및 이를제조하는 방법 | |
WO2002050245A2 (en) | Novel cellulase producing actinomycetes, cellulase produced therefrom and method of producing same | |
US7361487B2 (en) | Enzyme fusion proteins and their use | |
BRPI0806921A2 (pt) | Endoglicanase ii modificada e métodos de uso | |
CN101346464A (zh) | 新型酶 | |
FI119434B (fi) | Entsyymifuusioproteiineja ja niiden käyttö | |
US6190899B1 (en) | Cellulase producing actinomycetes, cellulase produced therefrom and method of producing same | |
AU4437002A (en) | Cellulase producing actinomycetes, cellulase produced therefrom and method of producing same |