KR20220031657A

KR20220031657A - 개선된 만난아제 변이체

Info

Publication number: KR20220031657A
Application number: KR1020227003601A
Authority: KR
Inventors: 카리 윤투넨; 리나 발타카리; 수산나 마키넨; 메리아 오야; 헨드리크 헬무트; 펜티 오야팔로; 킴 랑펠더; 테르히 푸라넨
Original assignee: 에이비 엔자임스 오와이
Priority date: 2019-07-02
Filing date: 2020-06-16
Publication date: 2022-03-11
Also published as: EP3760714A1; US20220251529A1; WO2021001595A1; BR112021024945A2; CN114040973A; EP3994259A1; EP3994259A4

Abstract

서열번호: 1과 적어도 90%의 서열 동일성 및 위치 256에서 아미노산의 치환을 갖는 만난아제의 변이체가 개시되어 있다. 본 발명의 변이체를 포함하는 효소 조성물, 세제 조성물, 숙주 세포, 동물 사료 및 사료 보충제 뿐만 아니라 본 발명의 변이체를 포함하는 방법 및 용도가 개시되어 있다.

Description

개선된 만난아제 변이체

본 발명은 효소 기술 (enzyme technology) 분야에 관한 것이다. 구체적으로, 본원에는 다양한 화학적 환경에서 우수한 만난 (mannan) 분해 성능 및 안정성을 갖는 만난아제 변이체 (mannanase variants)가 개시되어 있고, 이들은 만난의 분해가 요구되는 다양한 응용 분야, 예컨대 세탁 및 세정 분야, 사료 및 식품 기술 뿐만 아니라 펄프 산업, 제지 산업 및 석유 산업에서 유용하다.

만난 (mannans)은 다양한 식물에서 발견되는 만노스 함유 폴리사카라이드이다. 만난은 수성 환경에서 잘 녹지 않으며, 이의 물리화학적 특성으로 인해 점성의 분산액을 생성한다. 또한, 만난은 높은 물 결합 능력 (water binding capacity)을 갖는다. 만난의 이들 특징들 각각은 만난 함유 물질이 처리되는 여러 산업, 예컨대 양조, 제빵, 동물 영양, 및 세탁 및 세정 분야에서 문제를 야기한다.

식물-기반의 식이 (plant-based diets)에서, 다양한 β-만난이 존재하며, 이들의 양과 특성에 따라 영양소 소화, 미생물 군집화 및 성장을 손상시킬 수 있다. 만난의 효소적 분해는 소화물 점도를 감소시키는데 사용될 수 있다. 만난의 만난아제 효소에 의한 분해는 만노-올리고사카라이드의 생성을 초래한다. 사료에서 만난아제의 사용은 단위 동물 (monogastric animals)에서 평균 일일 증체량, 사료 효율 (feed efficiency), 체중 균일성 및 생존율을 증가시킨다. 동물 사료 분야의 경우, 예컨대 곡류 식이를 갖는 단위 동물용 사료에서, 만난은 장 내용물의 점도에 기여하는 요인이므로, 이에 의해 사료 소화율 및 동물 성장 속도에 악영향을 미친다. 반추동물 (ruminants)의 경우, 만난은 섬유질 섭취의 실질적인 성분을 나타내며, 만난의 보다 완전한 소화는 사료 전환 효율을 더 높게 촉진할 수 있다.

세탁 및 세정 분야의 경우, 만난아제를 포함하는 효소 조성물은 예를 들어 만난 얼룩 (mannan stains)에서 만난을 분해하는데 사용될 수 있다. 그러나, 다양한 저장 및 사용 조건에서 안정하면서 여전히 우수한 만난 분해 활성을 나타내는 만난아제를 제공하는 것은 어렵다. 따라서, 산업 응용 분야에서 야생형 만난아제의 사용이 항상 가능한 것은 아니다.

본 발명의 목적은 만난아제 활성을 나타내고, 산업 공정에서 사용 가능한 성능 및/또는 안정성을 갖는 만난아제의 변이체를 제공하는 것이다. 다른 목적은 만난 분해 또는 변형을 위한 효소 조성물에 사용될 수 있는 변이체를 제공하는 것이다.

발명의 요약

본 출원은 첨부된 독립 청구항에 정의된 발명, 및 하기에 개시되는 이들의 구체예에 관한 것이다. 본 발명은 모체 만난아제를 단백질 공학에 의해 변형시킴으로써 만난아제 변이체의 개발에 기반한다. 본 발명자들은 놀랍게도 본 발명의 모체 만난아제의 아미노산 위치 256을 치환함으로써 만난 분해 성능이 개선된, 즉 증가된 변이체를 수득할 수 있음을 발견하고, 하기 실시예에서 보여준다. 특히 만난이 함유된 얼룩을 세척하기 위해 이를 세제에 사용하면 성능이 향상된다. 또한, 상기 변이체의 안정성은 선택된 위치에서 추가 치환을 수행함으로써 개선될 수 있다. 신규한 변이체는 광범위한 세제에서 매우 적은 투여량으로도 우수한 성능을 갖는다.

제1 양상에 따르면, 만난아제의 변이체가 제공되며, 상기 변이체는 하기를 갖는다:

서열번호: 1과 적어도 90%, 그러나 100% 미만의 서열 동일성,

위치 256, 바람직하게는 위치 S256에서 아미노산의 치환, 및

만난아제 활성.

본 변이체는 만난을 분해하는데 우수한 성능을 갖는다는 점에서 유리하다. 하기 제공된 실시예에 나타낸 바와 같이, 청구된 변이체는 천연, 즉 치환이 수행되는 야생형 만난아제와 비교하여 개선된 성능을 갖는다. 따라서, 청구된 치환 위치는 단독으로 또는 추가 치환 위치와 함께 사용되어, "모체 (parent)" 만난아제의 성능을 향상시킬 수 있다.

제2 양상에 따르면, 제1 양상의 변이체, 및 하기를 포함하는 효소 조성물이 제공된다:

a. 폴리올, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 헥실렌 글리콜, 글리세롤, 당, 당 알코올, 폴리사카라이드, 락트산, 펩티드, 계면활성제 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 적어도 하나의 안정화제; 또는 유기산, 시트르산, 아스코르브산, 벤조산 및 이들의 염 및 유도체, 벤조산 나트륨, 벤조에이트, 하이드록시벤조에이트 및 유도체, 포스페이트, 소르브산, 소르브산 나트륨, 소르베이트, 염, 염화나트륨 또는 염화칼륨, 1,2-벤즈이소티아졸린-3-온 (BIT) 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 적어도 하나의 보존제 또는 완충제;

b. 선택적으로, 붕산, 붕산 유도체, 방향족 보레이트 에스테르, 4-포르밀페닐 보론산, 페닐 보론산 유도체, 억제 기능을 가진 펩티드 화합물, 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 적어도 하나의 억제제;

c. 선택적으로, 매개체 (mediator)를 갖거나 또는 갖지 않는, 프로테아제, 아밀라제, 셀룰라제, 리파제, 자일라나제 (xylanases), 만난아제, 큐티나제 (cutinases), 에스테라제, 피타제 (phytases), 뉴클레아제, 펙티나제 (pectinases), 펙틴분해 효소 (pectinolytic enzymes), 펙테이트 리아제 (pectate lyases), 카보하이드라제 (carbohydrases), 아라비나제 (arabinases), 갈락타나제 (galactanases), 잔타나제 (xanthanases), 자일로글루카나제 (xyloglucanases), 락카제 (laccases), 퍼옥시다제 및 옥시다제, 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 적어도 하나의 효소; 및

d. 선택적으로, 말토덱스트린, 곡물가루 (flour), 염화나트륨, 설페이트, 황산나트륨, 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 적어도 하나의 충전제.

일 양상에 따르면, 제1 양상의 변이체 및 적어도 하나의 안정화제를 포함하는 효소 조성물이 제공된다.

다른 양상에 따르면, 제1 양상의 변이체 및 적어도 하나의 보존제를 포함하거나, 또는 제1 양상의 변이체 및 적어도 하나의 완충제를 포함하는, 효소 조성물이 제공된다.

본 발명의 변이체는 다양한 조성물에 사용하기에 적합하다. 상기 변이체의 우수한 안정성 때문에, 이는 또한 붕소를 함유하는 억제제와 같은 프로테아제 억제제 없이도 프로테아제의 존재하에 사용될 수 있다.

상기 성분들 a-e는 본 발명의 효소 조성물에 개선된 특성을 제공한다. 상기 효소 조성물은 성분들 a-e와 상용성이 있고, 상기 효소 조성물의 다양한 용도에서의 적용 가능성을 향상시킨다. 염 예컨대 염화나트륨 및 황산나트륨은 건조 보조제로서 작용한다.

제3 양상에 따르면, 본 발명의 변이체 또는 본 발명의 효소 조성물을 포함하는 세제 조성물이 제공된다.

본 발명의 변이체를 세제 조성물에 사용하는 이점은 이들이 잘 작용하고 장기간 안정하게 유지된다는 것이다. 유리하게는, 본 발명의 변이체를 함유하는 조성물은 장기간 저장될 수 있고, 만난 분해 활성이 붕소 또는 붕소 함유 화합물 없이도 프로테아제의 존재하에 보존된다는 것을 발견하였다. 따라서, 본 발명의 만난아제는 프로테아제에 대한 우수한 안정성을 갖는다.

제4 양상에 따르면, 제1 양상의 변이체를 포함하는 적어도 하나의 재조합 폴리펩티드를 생성 가능하게 하는 유전자 요소 (genetic elements)를 포함하는 재조합 숙주 세포가 제공된다.

제5 양상에 따르면, 제1 양상의 변이체를 제조하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 제4 양상의 재조합 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하고, 여기에서:

상기 유전자 요소는 상기 재조합 숙주 세포에서 재조합 폴리펩티드의 생성을 조절하는 적어도 하나의 조절 서열을 포함하고;

상기 유전자 요소는 선택적으로, 상기 재조합 폴리펩티드를 상기 숙주 세포 밖으로 운반하는 신호 서열을 코딩하는 적어도 하나의 서열을 포함하며;

상기 배양하는 단계는 상기 재조합 폴리펩티드를 생성 가능하게 하는 조건에서 수행된다.

제6 양상에 따르면, 만난 함유 물질을 분해 또는 변형시키는 방법이 제공되며, 상기 방법은 상기 만난 함유 물질을 유효량의 제2 양상의 효소 조성물 또는 제1 양상의 변이체로 처리하는 단계를 포함한다.

일 구체예에서, 상기 방법은 상기 만난 함유 물질을 수성 매질 중 효소 조성물 또는 변이체와 접촉시키는 단계를 포함한다.

제7 양상에 따르면, 제2 양상의 효소 조성물 또는 제1 양상의 변이체, 및 식물 기원의 적어도 하나의 단백질 공급원 또는 만난 함유 산물 또는 부산물, 및 하기를 포함하는 동물 사료 (animal feed)가 제공된다:

a. 선택적으로, 프로테아제, 아밀라제, 피타제, 자일라나제, 엔도글루카나제, 베타-글루카나제 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 적어도 하나의 효소; 및

b. 선택적으로, 말토덱스트린, 곡물가루, 염, 염화나트륨, 설페이트, 황산나트륨, 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 적어도 하나의 충전제.

제8 양상에 따르면, 제2 양상의 효소 조성물 또는 제1 양상의 변이체; 및 하기를 포함하는 사료 보충제 (feed supplement)가 제공된다:

a. 선택적으로, 프로테아제, 아밀라제, 피타제, 자일라나제, 엔도글루카나제, 베타-글루카나제, 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 적어도 하나의 효소; 및

제9 양상에 따르면, 오일 시추 (oil drilling) 또는 수압-파쇄 (hydro-fracturing); 커피 추출물, 과일 주스, 파인애플 주스 또는 두유 가공; 세제; 만난 함유 얼룩의 분해; 또는 수성 용액 중 만난의 분해에 있어서, 제1 양상의 변이체 또는 제2 양상의 효소 조성물의 용도가 제공된다.

도 1은 관심 유전자 (gene of interest: GOI)/만난아제 변이체 유전자의 발현을 위해 트리코더마 리세이 (Trichoderma reesei)의 형질전환에 사용되는 발현 플라스미드의 도식도이다. 재조합 유전자의 숙주 세포에서의 발현은 하기 유전자 요소들을 사용하여 조절되었다: 전사 개시를 위한 T. 리세이 cel7A 프로모터 (Pcel7A), 및 전사 종결을 위한 T. 리세이 cel6A (Tcel6A) 종결인자. 절단 부위로서 kex2를 갖는 천연 만난아제 신호 서열 대신에 T. 리세이 cel6A 운반체를 사용하였다. amdS 유전자 (amdS)가 형질전환체의 선택을 위해 포함되었고, T. 리세이 cel7A 3'- 및 5'-플랭킹 영역은 상기 발현을 cel7A 유전자좌에 선택적으로 표적화하기 위해 사용되었다. 사진은 Biomatters가 만든 Geneious Prime 2019를 사용하여 생성되었다.
도 2a는 Launder-Ometer에서 40℃, 16°dH, 60분, pH 대략 8.2에서 시판 중질 액체 세제 (commercial heavy duty liquid detergent) 4.4 g/l의 존재하에 밝기 (lightness)의 증가 (4개의 얼룩의 ΔL^*의 합)로서 변이체 CM124 및 모체 Man6 만난아제의 얼룩 제거 성능 (stain removal performance)을 나타낸다. 효소는 세척액 1 ml당 활성 유닛 (MNU)으로 투여되었다.
도 2b는 Launder-Ometer에서 40℃, 16°dH, 60분, pH 대략 10에서 시판 표백 세제 분말 (commercial bleach detergent powder) 3.8 g/l의 존재하에 밝기의 증가 (4개의 얼룩의 ΔL^*의 합)로서 변이체 CM124 및 모체 Man6 만난아제의 얼룩 제거 성능을 나타낸다. 효소는 세척액 1 ml당 활성 유닛 (MNU)으로 투여되었다.
도 3a는 Launder-Ometer에서 40℃, 16°dH, 60분, pH 대략 8.4에서 시판 HDL 베이스 세제 농축물 (commercial HDL Base detergent concentrate) 3.2 g/l의 존재하에 밝기의 증가 (4개의 얼룩의 ΔL^*의 합)로서 변이체 CM124, CM201, CM206 및 모체 Man6 만난아제의 얼룩 제거 성능을 나타낸다. 효소는 세척액 1 ml당 0.8 활성 유닛 (MNU)으로 투여되었다.
도 3b는 Launder-Ometer에서 40℃, 16°dH, 60분, pH 대략 10에서 시판 표백 세제 분말 3.8 g/l의 존재하에 밝기의 증가 (4개의 얼룩의 ΔL^*의 합)로서 변이체 CM124, CM201, CM204, CM206 및 모체 Man6 만난아제의 얼룩 제거 성능을 나타낸다. 효소는 세척액 1 ml당 0.8 활성 유닛 (MNU)으로 투여되었다.
도 4는 37℃ 및 4주에서 붕산 무함유 프로테아제 함유 시판 액체 세제 농축물 제제에서 변이체 CM124, CM201, CM204, CM206 및 모체 Man6 만난아제의 안정성을 보여준다.
도 5는 40℃ 및 16°dH에서 세탁기에서 전체 규모 실험 (full scale trials)으로 밝기의 증가 (6개의 얼룩의 ΔL^*의 합)로서 변이체 CM201, CM206 및 모체 Man6 만난아제의 얼룩 제거 성능을 나타낸다. 붕산을 함유하는 시판 액체 세제 농축물은 세척당 56.9 g을 투여하였다. 효소는 세척액 1 ml당 0.5 활성 유닛 (MNU)으로 투여되었다.
도 6은 40℃ 및 16°dH에서 세탁기에서 전체 규모 실험으로 밝기의 증가 (6개의 얼룩의 ΔL^*의 합)로서 변이체 CM201, CM206 및 모체 Man6 만난아제의 얼룩 제거 성능을 나타낸다. 시판 표백 세제 분말은 세척당 58.9 g을 투여하였다. 효소는 세척액 1 ml당 0.5 활성 유닛 (MNU)으로 투여되었다.
도 7a는 37℃ 및 4주에서 붕산 함유 프로테아제 함유 시판 액체 세제 농축물 중 변이체 CM201 및 CM206의 안정성을 시판 만난아제와 비교하여 보여준다.
도 7b는 37℃ 및 4주에서 붕산 무함유 프로테아제 함유 시판 액체 세제 농축물 중 변이체 CM201 및 CM206의 안정성을 시판 만난아제와 비교하여 보여준다.
도 8은 Launder-Ometer에서 40℃, 16°dH, 60분, pH 대략 10에서 시판 표백 세제 분말 3.8 g/l의 존재하에 밝기의 증가 (4개의 얼룩의 ΔL^*의 합)로서 변이체 CM201 및 CM206의 얼룩 제거 성능을 나타낸다. 시판 만난아제가 비교를 위해 사용되었다. 효소는 세척액 1 ml당 활성 유닛 (MNU)으로 투여되었다.
서열목록
서열번호: 1 신호 펩티드가 없는 성숙한 Man6 단백질의 아미노산 서열
서열번호: 2 신호 펩티드 코딩 서열이 없는 T. 리세이 코돈 최적화된 man6 유전자의 뉴클레오티드 서열.

일 구체예에서, 서열번호: 1의 위치 S256이 적어도 치환된다. 바람직하게는 상기 변이체는 치환이 수행되는 모체 만난아제 Man6보다 향상된 성능을 갖는다. 하기 실시예, 및 도 3a 및 3b에서 볼 수 있는 바와 같이, 위치 256이 상이한 아미노산으로 치환될 수 있고, 개선된 변이체를 수득할 수 있다. 예를 들어, 위치 256에서 상이한 치환을 갖는 변이체 CM201 및 CM204는 모두 모체 Man6 효소에 비해 개선된 성능을 갖는다. 따라서 상기 변이체가 만난아제 활성을 유지하는 한 위치 256에서 상이한 아미노산 치환이 사용될 수 있으며, 이는 예를 들어 실시예 2의 테스트를 사용하여 용이하게 테스트된다. 예를 들어, 위치 256에서 상이한 치환을 갖는 변이체 CM125 (S256T), CM79 (S256N), CM80 (S256R) 및 (S256H) CM81은 만난아제 활성을 갖는다. 또한, CM123 (S256A)은 상기 변이체와 유사한 활성을 갖는다. 결과적으로, 잔기 256의 Ala 또는 Gly로의 치환은 치환의 바람직한 구체예이지만, 다른 치환이 또한 사용될 수 있다.

일 구체예에서, 위치 256 예컨대 S256이 N, R, H, T, G 또는 A로 치환되어 활성 만난아제 변이체를 제공한다. 상기 변이체는 단일 치환 변이체일 수 있거나, 또는 이는 서열번호: 1과 비교하여 이의 아미노산 서열에 추가의 치환(들) 또는 변이(들)를 포함할 수 있다.

일 구체예에서, 상기 변이체는 위치 256에서 그룹 S, N, E 및 D로부터 선택되는 천연 아미노산의 치환을 포함한다. 바람직한 일 구체예에서, 상기 천연 아미노산은 G 또는 A로 치환된다.

일 구체예에서, 상기 변이체는 적어도 하나의 추가 치환을 포함한다.

일 구체예에서, 상기 변이체는 위치 256 예컨대 S256에서의 아미노산 치환, 및 위치 24 및/또는 123 예컨대 위치 V24 및/또는 V123에서의 추가 치환을 포함한다. 바람직하게는 상기 추가 치환은 그룹 G, A, V, L, I, F, W로부터 선택되는 치환과 같은, 다른 아미노산으로의 치환이다. 이러한 변이체의 성능 및 안정성은 실시예 2 및 4에 따라 테스트될 수 있다. 바람직하게는 상기 변이체는 서열번호: 1을 갖는 천연 만난아제와 비교하여 성능 및/또는 안정성이 증가하였다.

세제의 안정성 테스트에서 상기 변이체 CM201 및 CM204의 잔류 활성 (residual activity)이 또한 모체 Man6 효소보다 향상되었다 (실시예 4 및 도 4 참조). 결과로부터 위치 256에서 상이한 치환이 사용될 수 있고, 이러한 변이체의 저장 안정성이 위치 24를 치환에 의해 변형시킴으로써 추가로 향상될 수 있음을 확인하였다.

일 구체예에서, 상기 변이체는 하기 치환을 적어도 포함한다: 위치 24 및 256; 위치 24, 123 및 256; 또는 위치 123 및 256. 이들 구체예의 이점은 모체 만난아제에 비해 성능이 향상되었다. 다른 이점으로는 위치 256 예컨대 S256에서의 치환을 가진 변이체에 비해 안정성이 향상되었다.

일 구체예에서, 상기 변이체는 서열번호: 1의 아미노산 서열을 가진 만난아제와 비교하여 개선된 성능을 갖는다. 상기 성능은 실시예 2에 기재된 바와 같이 측정될 수 있다.

일 구체예에서, 상기 변이체는 서열번호: 1의 아미노산 서열을 가진 만난아제와 비교하여 개선된 안정성을 갖는다. 상기 안정성은 실시예 4에 기재된 바와 같이 측정될 수 있다.

일 구체예에서, 상기 변이체는 서열번호: 1의 아미노산 서열을 가진 만난아제와 비교하여, 프로테아제 억제제 무함유 프로테아제 함유 세제에서 개선된 안정성을 갖는다.

일 구체예에서, 상기 변이체는 하기 치환을 적어도 포함한다: 위치 V24I 및 S256A; 또는 위치 V24I 및 S256G; 또는 위치 V24I, V123I, S256A; 또는 위치 V24I, V123I, 및 S256G; 또는 위치 V123I 및 S256A; 또는 위치 V123I 및 S256G.

일 구체예에서, 서열번호: 1과 비교하여 상기 변이체에서 치환의 총 수는 1-10개, 2-10개, 3-10개, 또는 4-10개이다. 일 구체예에서, 상기 변이체는 1개의 치환을 갖는다. 일 구체예에서, 상기 변이체는 2개의 치환을 갖는다. 일 구체예에서, 상기 변이체는 3개의 치환을 갖는다. 일 구체예에서, 상기 변이체는 4개의 치환을 갖는다. 일 구체예에서, 상기 변이체는 5개의 치환을 갖는다.

일 구체예에서, 상기 변이체는 표 1에 개시된 변이체이다. 이들 변이체는 예를 들어 트리코더마 (Trichoderma) 숙주 세포에서 재조합 단백질로 생성될 수 있다.

일 구체예에서, 상기 효소 조성물은 액체 조성물 또는 고체 조성물, 용액, 분산액, 페이스트, 분말, 과립, 입자체 (granulate), 코팅된 입자체, 정제, 케이크, 결정, 결정 슬러리, 겔 또는 펠렛 (pellet)의 형태로 제공된다.

일 구체예에서, 상기 세제 조성물은 액체 세제 또는 고체 세제, 바 (bar), 균질 정제 (homogenous tablet), 2개 이상의 층을 갖는 정제, 1개 이상의 구획을 갖는 파우치, 일반 또는 콤팩트 분말, 과립, 입자체, 페이스트, 겔, 또는 일반, 콤팩트 또는 농축 액체의 형태로 제공된다.

일 구체예에서, 상기 세제 조성물은 프로테아제, 리파제, 큐티나제, 아밀라제, 카보하이드라제, 셀룰라제, 펙티나제, 펙테이트리아제, 펙틴분해 효소, 에스테라제, 만난아제, 아라비나제, 갈락타나제, 자일라나제, 옥시다제, 잔타나제, 자일로글루카나제, 락카제, 뉴클레아제 및/또는 퍼옥시다제로부터 선택되는, 바람직하게는 프로테아제, 아밀라제, 셀룰라제 및 리파제로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 추가 효소를 추가로 포함한다.

일 구체예에서, 상기 세제 조성물은 프로테아제 억제제, 붕산 또는 이의 유도체, 예컨대 보레이트 및 4-포르밀페닐 보론산 (4-FPBA), 또는 프로테아제 억제 기능을 가진 펩티드 화합물을 함유하지 않는다.

만난은 α-1,6-연결에 의해 백본에 부착된 갈락토스의 곁사슬과 β-1,4-연결에 의해 함께 연결된 만노스 백본으로 구성된 폴리사카라이드를 지칭한다. 만난은 구아 검 (guar gum) 및 로커스트빈 검 (locust bean gum)과 같은 식물-기반 물질을 포함한다. 글루코만난은 다소 규칙적으로 교대하는 β-1,4 연결된 만노스 및 글루코스의 백본을 가진 폴리사카라이드이며, 갈락토만난 및 갈락토글루코만난은 알파-1,6-연결된 갈락토스 곁가지를 가진 만난 및 글루코만난이다.

본원에서 사용되는, 용어 "만난아제" 또는 "갈락토만난아제"는 만난 엔도-1,4-베타-만노시다제로서 당해 분야에서 정의되고, 대체명으로서 베타-만난아제 및 엔도-1,4-만난아제로도 명명되며, 만난, 갈락토만난, 글루코만난 및 갈락토글루코만난에서 1,4-베타-D-만노사이드 연결의 가수분해를 촉매하는 만난아제 효소를 의미한다. 만난아제는 효소 명명법에 따라 EC 3.2.1.78로 분류된다.

본원에서 사용되는, "단리된 (isolated)"은 자연에서 발생되지 않는 형태 또는 환경에서의 물질을 의미한다. 단리된 물질의 비-제한적인 예로는 (1) 임의의 비-자연 발생하는 물질, (2) 자연 관련된 자연 발생하는 구성성분의 하나 이상 또는 전부로부터 적어도 부분적으로 제거되는 임의의 효소, 변이체, 핵산, 단백질, 펩티드 또는 보조인자를 포함하는 임의의 물질; (3) 자연에서 발견된 물질에 대해 인공으로 변형된 임의의 물질; 또는 (4) 자연 관련된 다른 구성성분에 대해 물질의 양을 증가시키거나 또는 감소시킴으로써 변형된 임의의 물질 (예: 숙주 세포에서의 재조합 생성; 물질을 코딩하는 유전자의 단일 또는 다중 카피; 및 물질을 코딩하는 유전자와 자연 관련된 프로모터에 대한 대체 프로모터의 사용)을 포함한다. 일 구체예에서, 본 발명의 변이체, 폴리펩티드, 효소, 폴리뉴클레오티드, 숙주 세포 또는 조성물이 단리된다.

본원에서 사용되는, 용어 "포함하는"은 "구성된" 및 "이로만 구성된"의 협의적 표현뿐만 아니라 "포함하는", "함유하는" 및 "포괄하는"의 광의적 의미를 포함한다.

용어 변이체는 만난아제 활성을 가지며, 하나 이상의 아미노산 위치(들)에서 변경을 포함하는 폴리펩티드를 의미한다. 상기 변경으로는 바람직하게는 하나 이상 (예: 수 개)의 위치에서 치환, 삽입 및/또는 결실이 있다. 치환은 위치를 차지하는 아미노산을 다른 아미노산 또는 다른 아미노산들로 대체하는 것을 의미하고; 결실은 위치를 차지하는 아미노산을 제거하는 것을 의미하며; 삽입은 위치를 차지하는 아미노산에 인접하게 및 바로 뒤에 아미노산을 추가하는 것을 의미한다. 일 구체예에서, 본 발명의 변이체는 서열번호: 1과 적어도 80%, 예를 들어, 적어도 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는다. 일 구체예에서, 상기 변이체는 서열번호: 1과 100%의 서열 동일성을 갖지 않는다.

일 구체예에서, 상기 변이체의 개선된 성능은 적어도 하나의 치환이 수행되는 모체 만난아제와 비교하여 증가된 만난 분해 활성을 포함한다. 만난 분해 활성은 하기 실시예에 기재된 분석을 사용하여 결정될 수 있다.

바람직하게는, 상기 변이체의 얼룩 제거 또는 세척 성능은 모체 또는 참조 만난아제와 비교하여 유사하거나 또는 개선된다. 상기 세척 성능은 하기 실시예에 따라 측정될 수 있다.

모체 또는 모체 만난아제는 본 발명의 변이체를 생성하기 위해 변경이 수행되는 만난아제를 의미한다. 상기 모체는 자연 발생 (야생형) 폴리펩티드 또는 이의 변이체, 또는 이의 단편일 수 있다. 바람직한 일 구체예에서, 상기 모체는 서열번호: 1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 바람직한 일 구체예에서, 상기 모체 만난아제는 서열번호: 1과 적어도 90%, 바람직하게는 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99%의 서열 동일성을 가진 박테리아성 만난아제이다.

본원에서 사용되는, "펩티드" 및 "폴리펩티드"는 복수의 연속 중합화된 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열이다. 본 발명의 목적을 위해, 펩티드는 최대 20개의 아미노산 잔기를 포함하는 분자이고, 폴리펩티드는 20개 초과의 아미노산 잔기를 포함한다. 상기 펩티드 또는 폴리펩티드는 변형된 아미노산 잔기, 코돈으로 코딩되지 않는 자연 발생하는 아미노산 잔기, 및 비-자연 발생 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는, "단백질"은 임의 크기의 폴리펩티드 또는 펩티드일 수 있다. 단백질은 효소, 단백질, 항체, 막 단백질, 펩티드 호르몬, 조절인자 (regulator) 또는 임의의 다른 단백질일 수 있다.

아미노산 치환의 경우, 하기 명명법이 사용된다: 원래 아미노산, 위치, 치환된 아미노산. 따라서, 위치 256에서 세린의 알라닌으로 치환은 "Ser256Ala" 또는 "S256A"로 지칭된다.

바람직하게는 상기 변이체의 아미노산 넘버링은 서열번호: 1의 넘버링에 상응한다. 2개의 폴리펩티드의 아미노산 넘버링은 이들의 서열들을 정렬하여 상응하는 것으로 간주될 수 있다.

용어 "폴리뉴클레오티드"는 5'에서 3' 말단으로 판독되는 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 염기의 단일가닥 또는 이중가닥 폴리머를 의미한다. 폴리뉴클레오티드는 RNA 및 DNA를 포함하고, 천연 자원으로부터 단리되거나, 인 비트로로 합성되거나, 또는 천연 및 합성 분자의 조합으로부터 제조될 수 있다.

본원에서 사용되는, "동일성 (identity)"은 두 서열에 존재하는 잔기가 있는 경우 위치의 수에 대해, 2개의 정렬된 서열들 간에 정확하게 일치하는 아미노산 잔기의 퍼센트를 의미한다. 하나의 서열이 다른 서열에서 상응하는 잔기가 없는 잔기를 갖는 경우, 정렬 프로그램은 정렬 시에 갭 (gap)을 허용하고, 해당 위치는 동일성 산출의 분모에서 계수되지 않는다. 동일성은 EMBL-EBI 웹사이트 (www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/)의 Pairwise Sequence Alignment tool EMBOSS Needle로 결정된 값이다.

본원에서 사용되는, "숙주 세포"는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터 또는 핵산 구조체를 사용한 형질전환, 형질감염, 형질도입, 교배 (mating), 교차 (crossing) 또는 이와 유사한 것에 대해 영향을 받기 쉬운 임의의 세포 타입을 의미한다. 용어 "숙주 세포"는 복제 중에 발생하는 돌연변이로 인해 동일하지 않은 임의의 자손 (progeny)을 포함한다. 유용한 숙주 세포의 비-제한적인 예로는 진균 세포 (fungal cells), 사상 진균 세포 (filamentous fungal cells) 아스코마이코타 문 (Division Ascomycota), 페지조마이코티나 아문 (Subdivision Pezizomycotina); 바람직하게는 소르다리오마이세트 강 (Class Sordariomycetes), 하이포크레오마이세티다 아강 (Subclass Hypocreomycetidae), 하이포크레알레스 (Hypocreales) 및 마이크로아스칼레스 (Microascales) 및 아스페르길루스 (Aspergillus) 목, 크리소스포리움 (Chrysosporium), 마이셀리오프토라 (Myceliophthora) 및 휴미콜라 (Humicola)의 구성원으로 구성된 그룹; 더 바람직하게는 히포크레아세아 (Hypocreacea), 넥트리아세에 (Nectriaceae), 클라비시피타세에 (Clavicipitaceae), 마이크로아스카세에 (Microascaceae) 과, 및 트리코더마 (Trichoderma) (히포크레아 (Hypocrea)의 무성생식형 (anamorph)), 푸사리움 (Fusarium), 지베렐라 (Gibberella), 넥트리아 (Nectria), 스타키보트리스 (Stachybotrys), 클라비셉스 (Claviceps), 메타리지움 (Metarhizium), 빌로시클라바 (Villosiclava), 오피오코르다이셉스 (Ophiocordyceps), 세팔로스포리움 (Cephalosporium), 및 세도스포리움 (Scedosporium) 속으로 구성된 그룹; 더 바람직하게는 트리코더마 리세이 (히포크레아 제코리나 (Hypocrea jecorina)), T.시트리노비리데 (T. citrinoviridae), T. 롱지브라키아툼 (T. longibrachiatum), T. 바이렌스 (T. virens), T. 하지아눔 (T. harzianum), T. 아스페렐룸 (T. asperellum), T. 아트로비리데 (T. atroviridae), T. 파라리세이 (T. parareesei), 푸사리움 옥시스포룸 (Fusarium oxysporum), F. 그라미네아눔 (F. gramineanum), F. 슈도그라미네아룸 (F. pseudograminearum), F. 베네나툼 (F. venenatum), 지베렐라 후지쿠로이 (Gibberella fujikuroi), G. 모닐리포르미스 (G. moniliformis), G. 제아에 (G. zeaea), 넥트리아 (Nectria) (헤마토넥트리아 (Haematonectria)) 헤마토코카 (haematococca), 스타키보트리스 차르타룸 (Stachybotrys chartarum), S. 클로로할로나타 (S. chlorohalonata), 클라비셉스 푸르푸레아 (Claviceps purpurea), 메타리지움 아크리둠 (Metarhizium acridum), M. 아니소플리에 (M. anisopliae), 빌로시클라바 바이렌스 (Villosiclava virens), 오피오코르다이셉스 시넨시스 (Ophiocordyceps sinensis), 아크레모니움 (Acremonium) (세팔로스포리움 (Cephalosporium)) 크리소게눔 (chrysogenum), 및 세도스포리움 아피오스퍼뭄 (Scedosporium apiospermum), 및 아스페르길루스 나이저 (Aspergillus niger), 아스페르길루스 아와모리 (Aspergillus awamori), 아스페르길루스 오리제 (Aspergillus oryzae), 크리소스포리움 룩노웬세 (Chrysosporium lucknowense), 마이셀리오프토라 서모필라 (Myceliophthora thermophila), 휴미콜라 인솔렌스 (Humicola insolens), 및 휴미콜라 그리세아 (Humicola grisea)로 구성된 그룹, 가장 바람직하게는 트리코더마 리세이이다.

숙주 세포의 비-제한적인 예로는 박테리아 세포, 바람직하게는 그람 양성 바실리 (gram positive Bacilli) (예: 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis), B. 리체니포르미스 (B. licheniformis), B. 메가테리움 (B. megaterium), B. 아밀로리퀘파시엔스 (B. amyloliquefaciens), B. 푸밀루스 (B. pumilus)), 그람 음성 박테리아 (gram negative bacteria) (예: 대장균 (Escherichia coli)), 악티노마이세탈레스 (actinomycetales) (예: 스트렙토마이세스 종 (Streptomyces sp.)) 및 효모 (yeasts) (예: 사카로마이세스 세레비지에 (Saccharomyces cerevisiae), 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris), 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica))이다.

일 구체예에서, 상기 숙주 세포는 진균 세포, 바람직하게는 사상 진균 세포, 예컨대 트리코더마 또는 트리코더마 리세이이다. 일 구체예에서, 상기 숙주 세포는 박테리아 세포, 바람직하게는 그람-양성 바실러스 세포, 예컨대 B. 서브틸리스, B. 리체니포르미스, B. 메가테리움, B. 아밀로리퀘파시엔스, B. 푸밀루스이다.

"재조합 세포" 또는 "재조합 숙주 세포"는 세포 또는 숙주 세포에 고유하지 않은 핵산 서열을 포함하도록 유전자 변형 또는 변경된 세포 또는 숙주 세포를 지칭한다. 일 구체예에서, 상기 유전자 변형은 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포의 게놈에 통합시키는 것을 포함한다. 다른 구체예에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 숙주 세포에서 외인성이다.

본원에서 사용되는, "발현"은 전사, 번역, 번역 후 변형 및 분비를 포함하지만, 이에 한정되지 않는, 숙주 세포에서 폴리펩티드의 생성에 관련된 임의의 단계를 포함한다. 발현 후에는 숙주 세포 또는 발현 산물을 수확, 즉 회수할 수 있다.

용어 "발현 벡터"는 그의 전사를 제공하는 추가 세그먼트 (유전자 요소)에 작동 가능하게 연결된 관심 폴리펩티드를 코딩하는 세그먼트를 포함하는, 선형 또는 원형의 DNA 분자를 의미한다. 이러한 추가 세그먼트는 프로모터 및 종결 서열을 포함할 수 있고, 선택적으로 하나 이상의 복제 기원, 하나 이상의 선택 가능한 마커, 인핸서, 폴리아데닐화 신호, 운반체 및 유사체를 포함할 수 있다. 발현 벡터는 일반적으로 플라스미드 또는 바이러스 DNA로부터 유래되거나, 또는 이들 모두의 요소를 함유할 수 있다. 상기 발현 벡터는 재조합 DNA 절차에 편리하게 적용되는 임의의 발현 벡터일 수 있으며, 벡터의 선택은 주로 벡터가 도입될 숙주 세포에 좌우될 것이다. 따라서, 상기 벡터는 자율 복제 벡터, 즉, 플라스미드와 같이 염색체 복제와 무관하게 복제되는, 염색체외 엔티티 (extrachromosomal entity)로 존재하는 벡터일 수 있다. 대안으로서, 상기 벡터는 숙주 세포 내로 도입되는 경우, 숙주 세포의 게놈 내로 통합되고, 이를 통합한 염색체(들)와 함께 복제되는 벡터일 수 있다.

특정 미생물 출처과 관련하여 본원에서 사용되는, 용어 "~로부터 수득된" 및 "수득 가능한"은 폴리뉴클레오티드가 특정 출처 (동종 발현)에 의해 또는 출처로부터 유래된 유전자가 삽입된 세포 (이종 발현)에 의해 발현되는 것을 의미한다.

용어 "효소 조성물"은 단일 미생물 종으로부터 단리 및 정제 가능한 기존의 효소 발효 산물로, 통상 다수의 상이한 효소 활성을 갖는 제제; 또는 단일성분 효소들의 혼합물, 바람직하게는 박테리아 또는 진균 종으로부터 기존의 재조합 기술을 사용하여 유래되는 효소로서, 상기 효소는 발효되고, 개별적으로 단리 및 정제 가능하며, 또한 상이한 종, 바람직하게는 진균 또는 박테리아 종으로부터 유래될 수 있는 효소 또는 미생물이 재조합 만난아제의 생성을 위해 숙주 세포로서 작용하면서도 해당 미생물은 동시에 다른 효소를 생성하는 상기 미생물의 발효 산물을 의미한다.

DNA 세그먼트를 언급하는 경우, 용어 "작동 가능하게 연결된"은 상기 세그먼트가 의도된 목적을 위해 함께 기능하도록 배열되는 것을 의미하며, 예를 들어 전사는 프로모터에서 개시되고 코딩 세그먼트를 통해 종결인자로 진행된다. 용어 "프로모터"는 RNA 폴리머라제의 결합 및 전사의 개시를 제공하는 DNA 서열 함유 유전자의 일부를 의미한다. 프로모터 서열은 바람직하게는 유전자의 5' 비-코딩 영역에 존재한다.

용어 "분비 신호 서열" 또는 "신호 서열"은 보다 큰 폴리펩티드의 성분으로서, 이를 생산하는 숙주 세포의 분비 경로를 통해 더 큰 폴리펩티드를 지시하는 폴리펩티드 ("분비 펩티드" 또는 "신호 펩티드")를 코딩하는 DNA 서열을 의미한다. 상기 분비 신호 서열은 고유한 것일 수 있거나, 또는 이는 다른 출처 유래의 분비 신호 서열 또는 운반체 서열로 대체될 수 있다. 숙주 세포에 따라, 더 큰 펩티드는 분비 경로를 통해 통과하는 동안 분비 펩티드를 제거하기 위해 절단될 수 있다.

용어 "코어 영역 (core region)"은 변형 또는 변경되거나 또는 변경되지 않을 수 있지만, 이의 원래 활성의 적어도 일부를 유지하는 효소의 도메인을 의미하고; 당해 분야에 알려진 촉매 도메인은 기능적으로 남아있다. 본 발명에 따른 변이체의 코어 영역은 서열번호 1의 Man6의 아미노산 1-289와 정렬된 아미노산에 상응한다.

유효량은 변이체가 선택된 적용 또는 용도에서 만난을 분해하는데 충분한 양을 의미한다.

바람직하게는, 변이체의 개선된 성능은 소정의 실험 조건에서 변이체가 만난을 분해하는 성능 증가의 의미를 포함한다. 따라서, 상기 변이체의 성능은 당업자에 의해 테스트될 수 있고, 야생형 효소 또는 다른 변이체와 같은 참조와 비교될 수 있다.

용어 "세제 조성물" 및 "세제"는 달리 명시하지 않는 한, 고체, 과립 또는 분말 형태의 다목적 또는 중질 세척제, 특히 세정 세제; 액체, 겔 또는 페이스트 형태의 다목적 세척제, 특히 소위 중질 액상형 (heavy-duty liquid (HDL) types); 액체 미세-직물 세제 (liquid fine-fabric detergents); 핸드 식기세척제 또는 경질 (light duty) 식기세척제, 특히 고-발포형의 식기세척제; 다양한 정제, 과립, 액체 및 헹굼-보조제 형태를 포함하는 가정용 및 산업용 기계식 식기세척제; 액체 세정 및 소독제, 차 또는 카페트 샴푸, 욕실 클리너; 금속 클리너; 뿐만 아니라, 표백 첨가제 및 "얼룩-스틱 (stain-stick)" 또는 전처리 타입과 같은 세척 보조제를 포함한다. 용어 "세제", "세제 조성물" 및 "세제 제제"는 오염된 물체의 세척을 위해 세척 매질에 사용하기 위한 혼합물과 관련하여 사용된다. 일부 구체예에서, 상기 용어는 직물 및/또는 의류를 세탁하는 것과 관련하여 사용된다 (예: "세탁 세제"). 대안의 구체예에서, 상기 용어는 식기, 식기류 등을 세척하는데 사용되는 것과 같은 다른 세제를 지칭한다 (예: "식기세척 세제"). 본 발명은 임의의 특정한 세제 제제 또는 조성물로 제한되지 않는다. 본 발명에 따른 만난아제 변이체를 함유하는 것에 추가하여, 상기 세제는 예를 들어, 계면활성제, 빌더 (builders), 킬레이터, 또는 킬레이트제, 표백 시스템 또는 표백 성분들, 폴리머, 직물 컨디셔너, 폼 부스터 (foam boosters), 비누 거품 억제제 (suds suppressors), 염료, 향료, 탈지 억제제, 형광 증백제, 살박테리아제 (bactericides), 살진균제 (fungicides), 소일 서스펜딩제 (soil suspending agents), 부식방지제 (anticorrosion agents), 향수성 물질 (hydrotropes), 직물 발색제 (fabric hueing agents), 분산제, 이염 억제제 (dye transfer inhibiting agents), 형광 미백제 (fluorescent whitening agents), 소일 릴리즈 폴리머 (soil release polymers), 재침착 방지제, 수축 방지제 (anti-shrink agents), 주름 방지제 (anti-wrinkling agents), 결합제, 운반체, 염료, 효소 안정화제 (enzyme stabilizers), 섬유 유연제 (fabric softeners), 충전제, 거품 조절제 (foam regulators), 향료, 안료, 소드 억제제 (sod suppressors), 용매, 및 액체 세제용 구조화제, 구조 탄성화제 (structure elasticizing agents), 효소 억제제 또는 안정화제, 효소 활성화제, 트란스퍼라제(들), 가수분해 효소, 산화 환원효소, 청분작용제 (bluing agents) 및 형광 염료, 산화방지제 및 가용화제를 함유할 수 있다는 것을 의미한다. 그러나, 상기 논의된 바와 같이, 본 발명의 변이체는 몇몇 세제 제제에서 프로테아제의 존재 하에 안정하기 때문에 프로테아제 억제제는 선택적이다. 프로테아제 억제제는 다른 효소를 분해로부터 보호하기 위해 다중-효소 조성물 및 세제에 유용할 수 있다.

용어 "섬유 (textile)"는 실 (yarns), 실 중간체 (yarn intermediates), 화이버 (fibers), 부직포 물질 (non-woven materials), 천연 물질 (natural materials), 합성 물질 (synthetic materials) 및 임의의 다른 섬유 물질, 이들 물질로 만들어진 직물 및 섬유로 만들어진 제품 (예: 의류, 린넨 및 기타 물품)을 의미한다. 상기 섬유 및 직물은 편직물, 직포, 데님, 부직포, 펠트, 실 및 타월 형태일 수 있다. 상기 섬유는 면, 아마/린넨 (flax/linen), 황마 (jute), 모시 (ramie), 사이잘 (sisal) 또는 코이어 (coir)를 포함하는 천연 셀룰로오스 화합물 또는 비스코스/레이온 (viscose/rayon), 모시 (ramie), 셀룰로오스 아세테이트 섬유 (cellulose acetate fibers (tricell)), 라이오셀 (lyocell) 또는 이의 블렌드를 포함하는 인조 셀룰로오스 화합물 (예: 나무 펄프 유래)과 같은 셀룰로오스계일 수 있다. 또한, 상기 섬유 또는 직물은 울, 카멜, 캐시미어, 모헤어, 토끼 및 실크를 포함하는 천연 폴리아미드, 또는 나일론, 아라미드, 폴리에스테르, 아크릴, 폴리프로필렌 및 스판덱스/엘라스탄과 같은 합성 폴리머, 또는 이의 블렌드와 같은 비-셀룰로오스계 뿐만 아니라, 셀룰로오스계 및 비-셀룰로오스계의 화이버의 블렌드일 수 있다. 블렌드의 예로는 면 및/또는 레이온/비스코스와 울, 합성 화이버 (예: 폴리아미드 화이버, 아크릴 화이버, 폴리에스테르 화이버, 폴리비닐 알코올 화이버, 폴리비닐 클로라이드 화이버, 폴리우레탄 화이버, 폴리우레아 화이버, 아라미드 화이버) 및 셀룰로오스-함유 화이버 (예: 레이온/비스코스, 모시, 아마/린넨, 황마, 셀룰로오스 아세테이트 화이버, 라이오셀)와 같은 하나 이상의 동반 물질과의 블렌드이다. 직물은 통상적인 세척가능한 세탁물, 예를 들어, 얼룩이 있는 가정용 세탁물일 수 있다. 용어 직물 또는 의류가 사용되는 경우, 더욱 광범위한 용어인 섬유를 포함하는 것으로 의도된다.

용어 "안정성"은 소정의 구체예에서 저장 안정성 및 사용 중 안정성, 예컨대 세척 과정 중 안정성 (세척 안정성)을 포함하며, 시간의 함수로서 본 발명에 따른 변이체의 안정성을 반영한다. 예를 들어, 만난아제를 용액, 특히 세제 용액에 보관하는 경우 얼마나 많은 활성이 유지되는지를 의미한다. 상기 안정성은 예를 들어, pH, 온도, 세제 조성물 예컨대 프로테아제, 안정화제, 빌더, 계면활성제, 프로테아제 억제제 등의 많은 요인에 의해 영향을 받는다. 만난아제 안정성은 실시예에 기재된 '활성 분석'을 사용하여 측정될 수 있다.

본원에서 사용되는 "만난아제 활성"은 폴리펩티드 예컨대 본 발명의 변이체의 만난 분해 활성을 나타낸다. 본원에서 사용된 분해 또는 변형은 만노스 유닛이 만난 폴리사카라이드로부터 만난아제에 의해 가수분해되는 것을 의미한다. 본 발명에 따른 폴리펩티드의 만난 분해 활성은 당해 분야에 알려져 있는 표준 테스트 절차에 따라 테스트될 수 있다. 실시예 2는 만난아제 활성을 결정하기 위한 방법의 예를 제공한다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 효소 조성물은 프로테아제, 리파제, 큐티나제, 아밀라제, 카보하이드라제, 셀룰라제, 펙티나제, 펙테이트리아제, 펙틴분해 효소, 에스테라제, 피타제, 만난아제, 아라비나제, 갈락타나제, 자일라나제, 옥시다제, 잔타나제, 자일로글루카나제, 뉴클레아제, 락카제, 및/또는 퍼옥시다제로 구성된 그룹, 바람직하게는 프로테아제, 아밀라제, 셀룰라제 및 리파제로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 추가 효소를 추가로 포함한다.

상기 변이체 및 추가 효소를 포함하는 본 발명의 효소 조성물은 상승 효과를 제공하는데 유리하다. 이러한 추가 효소는 만난아제를 포함하는 본 발명의 효소 조성물이 세제에 사용되는 경우, 예컨대 얼룩을 세척하는 경우 바람직하다. 만난아제 및 만난아제 변이체와 작용하는 특히 유익한 상승작용하는 효소로는 아밀라제, 프로테아제 및 셀룰라제, 또는 이들의 조합, 예컨대 만난아제, 아밀라제 및 프로테아제를 포함하는 조성물이다.

일반적으로, 선택된 효소(들)의 특성은 선택된 세제와 적합해야 하며 (즉, pH-최적, 다른 효소 및 비-효소 성분들과의 적합성 등), 상기 효소(들)는 유효량으로 존재해야 한다.

고체 세탁 세제에 사용하기 위한 조성물은 상기 조성물의 중량 기준으로, 예를 들어 0.000001% - 5%, 예컨대 0.000005-2%, 예컨대 0.00001%-1%, 예컨대 0.00001%-0.1%의 효소 단백질을 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 상기 효소 단백질은 본 발명의 변이체이다.

세탁 액체에 사용하기 위한 조성물은 상기 조성물의 중량 기준으로, 예를 들어 0.000001%-3%, 예컨대 0.000005%-1%, 예컨대 0.00001%-0.1%의 효소 단백질을 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 상기 효소 단백질은 본 발명의 변이체이다.

자동 식기세척제에 사용하기 위한 조성물은 상기 조성물의 중량 기준으로, 예를 들어 0.000001%-5%, 예컨대 0.000005%-2%, 예컨대 0.00001%-1%, 예컨대 0.00001%-0.1%의 효소 단백질을 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 상기 효소 단백질은 본 발명의 변이체이다.

본 발명의 추가 구체예에서, 상기 세제 조성물은 바 (bar), 균질 정제, 2개 이상의 층을 갖는 정제, 1개 이상의 구획을 갖는 파우치, 일반 또는 콤팩트 분말, 과립, 페이스트, 겔, 또는 일반, 콤팩트 또는 농축 액체의 형태이다. 일 구체예에서, 상기 세제 조성물은 세탁 세제 조성물, 바람직하게는 액체 또는 고체 세탁 세제 조성물일 수 있다. 층들 (동일하거나 또는 상이한 상들), 파우치 및 기계 투여 장치용 형태와 같은 다양한 세제 제제 형태가 있다.

실시예

하기 실시예는 본 발명의 다양한 양상을 예시하기 위해 제공된다. 이는 본 발명을 제한하려는 것은 아니며, 이는 수반된 청구범위에 의해 정의된다.

실시예 1. 변이체 디자인 및 합성 만난아제 변이체의 발현

대장균 (E. coli) 형질전환, 시퀀싱 등에서 DNA의 단리 및 효소 처리 (예: 플라스미드 DNA의 단리, DNA 단편을 생성하기 위한 DNA의 소화)에서 표준 분자 생물학 방법을 사용하였다. 효소, 시약 또는 키트 제조자가 설명하거나, 또는 표준 분자 생물학 핸드북 예컨대 Sambrook and Russell (2001)에서 설명하거나, 또는 하기 실시예에 기재된 바와 같이 기본 실험 방법을 사용하였다.

바실러스 클라우시이 (Bacillus clausii) Man6 만난아제의 성능을 향상시키기 위해, 야생형 효소의 구조 분석에 기반하여 210개의 변이체를 디자인하였다 (표 1). Man6 만난아제 변이체는 트리코더마 리세이에서 생성된 천연 신호 펩티드가 없는 야생형 바실러스 클라우시이 Man6 만난아제 (서열번호: 1)인 모체 Man6 분자로부터 유래되었다. 상기 모체 만난아제를 코딩하는 핵산 서열은 T. 리세이에 대해 최적화된 코돈이었다 (서열번호: 2). 바실러스 클라우시이 Man6 만난아제의 천연 신호 서열 대신에 T. 리세이 cel6A 유래의 운반체 서열을 사용하여 재조합 만난아제 변이체 CM1-210의 생성을 위한 발현 벡터 (플라스미드)를 제작하였다. 상기 발현 구조체는 작동 가능하게 연결된 T. 리세이 cel7A 프로모터, 운반체로서 cel6A CBD, kex2 절단 부위, 만난아제 변이체 유전자 및 cel6A 종결인자, 그 다음에 문헌 (Paloheimo et al. 2003)에 기재된 바와 같은 amdS 마커 유전자를 함유한다. 또한, 상기 구조체는 상기 발현 벡터를 cel7A 유전자좌로 선택적으로 표적화하기 위한 cel7A 3' 및 5' 플랭킹 영역을 함유한다 (도 1). 모체 분자의 코어 영역에 도입된 돌연변이를 포함하는 합성 유전자는 NruI-BamHI 단편으로서 cel6A 운반체/kex2 리딩 프레임에 정확하게 융합된 후에 결찰에 의해 T. 리세이 cel7A 프로모터에 융합되었다.

원형 발현 플라스미드를 T. 리세이 원형질체 형질전환 (protoplast transformation)에 사용하였다. 형질전환체는 단독 질소 공급원으로서 아세트아미드를 사용하여 선택되었다. 숙주 균주에는 4가지 주요 내인성 셀룰라제가 결여되어 있다: CBHI/Cel7A, CBHII/Cel6A, EGI/Cel7B 및 EGII/Cel5A. 상기 형질전환은 Penttila et al, 1987에 따라 수행하였고, Karhunen et al., 1993에 기재된 변형을 포함하였다. 상기 형질전환체를 감자 덱스트로스 아가 (potato dextrose agar: PDA) 상에서 포자를 형성시킨 후에 진탕 플라스크에서 배양하였다.

상기 형질전환체의 만난아제 생성은 진탕 플라스크 배양의 배양물 상등액 (50 ml)으로 분석하였다. 상기 형질전환체를, pH 6.0에서 5% KH₂PO₄로 완충된 복합 셀룰라제-유도 배지 (Joutsjoki et al., 1993)에서 30℃, 250 rpm으로 7일 동안 성장시켰다. 재조합 단백질의 효소 활성은 실시예 2에 기재된 바와 같이 갈락토만난으로부터 환원당의 방출로서 배양물 상등액에서 측정하였다. 재조합 단백질의 생성은 또한 소듐 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-PAGE)에 의해 배양 상등액으로부터 검출하였다.

모체 Man6 만난아제를 생성하는 참조 균주 및 선택된 형질전환체를 단일 분생자를 통해 선별 플레이트에서 정제한 후에 PDA 상에서 이들 포자를 형성시키고, 진탕 플라스크 또는 생물 반응기내 복합 셀룰라제-유도 배지에서 배양하여 적용 테스트 (실시예 3 내지 7)를 위한 물질을 수득하였다.

실시예 2. DNS-방법에 의한 갈락토만난아제 활성의 분석

만난아제 활성 (MNU)은 50℃ 및 pH 7.0에서 5분 내에 갈락토만난 (0.3 w/w-%)으로부터 환원당의 방출로서 측정하였다. 방출된 환원당의 양은 디니트로살리실산을 사용하여 분광광도계로 결정하였다.

분석에 사용된 기질 (0.3 w/w-%)을 하기와 같이 제조하였다: 가열 자기 교반기를 사용하여 약 80 ℃에서 50 mM 시트르산 나트륨 버퍼 pH 7 (또는 시트레이트 포스페이트 버퍼 pH 7) 중에 0.6 g의 로커스트빈 검 (Sigma G-0753)을 용해시키고, 끓는점까지 가열하였다. 상기 용액을 냉각시키고, 밤새 차가운 방 (2 - 8 ℃)에서 계속 교반하면서 용해시키고, 불용성 잔류물을 원심분리로 제거하였다. 그 후에, 상기 용액에 버퍼로 200 ml까지 채웠다. 기질을 동결 상태로 저장하고, 가열로 약 80 ℃까지 끓는 수조 중에서 용융시키고, 실온으로 냉각하고, 사용 전에 조심스럽게 혼합하였다.

상기 분석에 사용된 DNS 시약은, 약 4 리터의 물에 50 g의 3.5-디니트로살리실산 (Sigma D-550)을 용해시켜서 제조하였다. 연속 자기 교반하면서, 80.0 g의 NaOH를 서서히 부가하고, 용해시켰다. 1500 g 양의 Rochelle 염 (K-Na-타르트레이트, Merck 8087)을 연속 교반하면서 소량씩 부가하였다. 상기 용액을 최대 45 ℃ 온도까지 조심스럽게 가온시키고, 실온으로 냉각하고, 5000 ml까지 채웠다. 그 후에, 이를 Whatman 1 여과지를 통해 여과하고, 실온에서 짙은 병에 저장하였다.

상기 반응은 먼저 2개의 테스트 튜브 각각에 1.8 ml의 기질 용액을 부가하여 반응을 개시하고, 50 ℃에서 5분 동안 평형화시킨 후에, 200 μl의 적절하게 희석된 효소 용액을 상기 튜브들 중 하나에 부가하고, 보텍스 믹서 (vortex mixer)로 잘 혼합하고, 50 ℃에서 정확하게 5분 동안 인큐베이션하였다. 효소 블랭크 (enzyme blanks)는 평형화 또는 인큐베이션하지 않았다. 상기 반응은 3.0 ml의 DNS 시약을 튜브 모두에 부가하고 혼합하여 정지시켰다. DNS 부가 후에, 200 μl의 샘플 용액을 효소 블랭크 튜브에 부가하였다. 튜브 모두를 끓는 수조에 넣었다. 정확하게 5분 동안 끓인 후에, 상기 튜브를 냉각 수조에 넣고, 이를 실온으로 냉각시켰다. 540 nm에서 효소 블랭크에 대해 샘플의 흡광도를 측정하고, 검정 곡선으로부터 활성을 판독하고, 희석 인자 (dilution factor)를 곱하였다. 적절하게 희석된 샘플은 0.3 - 0.45의 표적 흡광도 차이를 산출하였다.

360 mg의 만노스 (Sigma M-6020, 건조제 중에 저장)를 100 ml의 분석 버퍼 중에 용해시켜서 20 mM 만노스 스톡 용액으로부터 표준 곡선을 제조하였고, 3, 6, 10 및 14 μmol/ml의 만노스를 함유하는 용액으로 희석하였다. 표준은 50℃에서 인큐베이션하는 것을 제외하고 상기 샘플와 같이 취급하였다. 540 nm에서 시약 블랭크 (만노스의 표준 희석물 대신에 버퍼를 함유)에 대해 흡광도를 측정하였다. 검정 곡선을 모든 분석 시리즈에 대해 제작하였다.

1 만난아제 유닛 (MNU)은 분석 조건 하에 1초 내에 갈락토만난 유래의 만노스 1 nmol에 상응하는 환원력 (reductive power)을 갖는 환원당을 생성하는 효소의 양으로 정의되었다 (1 MNU = 1nkat).

실시예 3. Launder-Ometer에서 40℃에서 소규모 테스트로 모체 Man6 만난아제와 비교한, 만난아제 변이체 CM124, CM201, CM204 및 CM206의 얼룩 제거 성능

트리코더마에서 생성된 만난아제 변이체 CM124, CM201, CM204, 및 CM206의 진탕 플라스크 상등액 (실시예 1에 기재된 바와 같음)을, 시판 세제를 사용하여 40 ℃ 및 16°dH의 수경도 (water hardness)에서 만난아제 민감성 표준 얼룩을 제거하는 이들의 능력을 테스트하였다. 모체 Man6을 참조로 사용하였다. Center for testmaterial B.V. (네덜란드)로부터 하기와 같이 인위적으로 오염시킨 테스트 천을 사용하였다: 면에 민감한 초콜렛 푸딩 만난아제 (E-165), 면에 안료가 있는 로커스트빈 검 (C-S-73), 면에 카본 블랙의 구아검 (C-S-43), 및 면에 카본 블랙의 마요네즈 (C-S-05S). 상기 직물을 6 cm x 6 cm의 견본으로 자르고, 각각의 2개의 조각을 테스트에 사용하였다.

표 2에 기재된 시판 중질 액체 세제 (HDL)는, 세척액 1 리터당 4.4 g의 농도로 사용하였고, 시판 HDL 베이스 세제 농축물은 3.2 g/l로 사용하였으며, 시판 표백 세제 분말은 3.8 g/l로 사용하였다. 세제에는 만난아제를 제외한 다른 모든 효소를 함유하였다. 세제 함유 세척액은 경도가 16°dH인 합성 수돗물에서 제조하였다. 액체 세제의 세척액의 pH는 대략 8.2 - 8.4이고, 표백 세제의 경우 pH는 대략 10이었다.

시판 액체 세제의 조성

성분	%
음이온성 계면활성제, 비누	15 - 30
비이온성 계면활성제	5 - 15
포스포네이트	< 5
붕산	≤1
기타 성분: 예컨대 광학증백제, 향료, 보존제
pH 8.2-8.6

만난아제는 테스트 및 세제에 따라 세척액 1 ml당 0.05 - 0.8 MNU 활성으로 투여하였다. 실시예 2에 기재된 바와 같이 활성을 측정하였다. 대조군 샘플에는 만난아제가 없는 세제 용액을 함유하였다.

16˚dH의 경도를 갖는 합성 수돗물의 경우, 하기의 스톡 용액을 탈이온수 (Milli-Q 또는 동등물)에서 준비하였다:

1000˚d 칼슘-경도를 갖는 스톡 용액: CaCl₂ x 2 H₂O (1.02382.1000, Merck KGaA, Germany) 26.22 g/l

200˚d 마그네슘-경도를 갖는 스톡 용액: MgSO₄ x 7 H₂O (1.05886.1000, Merck KGaA, Germany) 8.79 g/l

NaHCO₃ 스톡 용액: NaHCO₃ (1.06329.1000 Merck KGaA, Germany) 29.6 g/l

13.3 ml의 CaCl₂ 용액, 13.3 ml의 MgSO₄ 용액 및 10.0 ml의 새로 제조된 NaHCO₃ 용액을 주어진 순서로 부피 플라스크에 부가하고, 탈이온수로 1L까지 만들어서 혼합하였다. 물의 경도는 착물형성 적정 (complexometric titration)에 의해 결정하고, 정확한 것을 확인하였다.

얼룩 제거 처리는 다음과 같이 Atlas LP-2 Launder-Ometer에서 수행하였다. Launder-Ometer를 먼저 40℃로 예열하였다. 그 다음에, 세제, 경도 16 °dH의 합성 수돗물 250 ml 및 희석된 효소 (<1.0 ml)를 1.2 리터 용기에 부가하였다. 얼룩을 부가하고, Launder-Ometer를 회전 속도 42 rpm으로 40 ℃에서 60 분 동안 작동시켰다. 그 후에, 상기 견본을 흐르는 물로 조심스럽게 헹구고, 일광으로부터 보호되는 그리드에서 밤새 실내 공기에서 건조시켰다.

얼룩 제거 효과는 L*a*b*색 공간 좌표 (illuminant D65/10°, 420 nm cut)를 사용하여 Konica Minolta CM-3610A 분광광도계로 반사율 값으로 색상을 측정하여 평가하였다. 만난아제 성능 (얼룩 제거 효과/효율)을 나타내는 얼룩의 퇴색은 ΔL^* (delta L^*)로 산출하고, 이는 효소 처리된 직물의 명도값 L^* - 만난아제가 없는 세척액으로 처리된 직물의 명도값 L^* (대조군)을 의미한다. 최종 결과 (전체 얼룩 제거 효과)는 각 4개의 얼룩의 ΔL^*의 합으로 나타내었다. 각 얼룩의 색상 값은 2개의 견본의 평균이다.

세척액 1 ml당 0 - 0.4 MNU의 용량을 사용하여 시판 중질 액체 세제 (도 2a) 및 시판 표백 세제 분말 (도 2b)에서 변이체 CM124를 모체 Man6과 비교하였다. CM124는 두 세제 모두에서 모체 Man6과 비교하여 얼룩 제거 성능이 향상되었다.

참조로 모체 Man6을 사용하여 시판 HDL 베이스 세제 농축물 (도 3a) 및 시판 표백 세제 분말 (도 3b)에서 변이체 CM124, CM201 및 CM206으로 추가 테스트를 수행하였다. 만난아제는 두 테스트 모두에서 0.8 MNU/ml로 투여하였고, 표백 세제에서 변이체 CM204를 또한 테스트하였다. 결과에 따르면, 모든 변이체 만난아제는 모체 Man6보다 얼룩 제거 성능이 더 우수하였다.

실시예 4. 액체 세제에서 모체 Man6과 비교하여 만난아제 변이체 (CM124, CM201, CM204, CM206)의 안정성

최고 성능의 만난아제 변이체의 안정성을 모체 Man6 만난아제와 비교하였다. 트리코더마에서 생성된 변이체 CM124, CM201, CM204 및 CM206의 진탕 플라스크 배양물 상등액 (실시예 1에 기재된 바와 같음)을 세제에 4 w/w-%로 부가하였다. 붕산이 없는 시판 액체 세제 농축물을 사용하였다. 여기에는 프로테아제를 비롯한 다른 효소를 함유하였지만, 만난아제를 함유하지 않았다. 샘플을 37℃에서 4주 동안 캡이 있는 플라스틱 튜브에서 인큐베이션하였다. 30분의 인큐베이션 시간을 사용하는 것을 제외하고, 실시예 2에 기재된 활성 분석에 의해 소정의 간격으로 활성을 측정하였다. 결과는 소정의 시점에서 채취한 샘플의 활성을 샘플의 초기 활성으로 나누어 수득되는, 잔류 활성 (%)으로 계산하였다.

붕산이 없는 세제 제제로 수득된 결과를 도 4에 개시하였다. 변이체 CM124, CM201, CM204 및 CM206의 안정성은 4주 동안 37℃의 높은 온도에서 저장하는 경우 모체 Man6과 비교하여 향상되었다. 실온 (대략 20 - 22℃)에서, Man6 및 모든 변이체는 동일하게 안정적이었다. 결과로부터 상기 변이체의 저장 안정성은 위치 24 및 123에서의 치환과 같은 추가 치환으로 더욱 향상될 수 있음을 확인하였다.

실시예 5. 40℃에서 전체 규모 테스트에서 만난아제 변이체 CM201 및 CM206의 얼룩 제거 성능

변이체 CM201 및 CM206의 얼룩 제거 성능을 40℃에서 16°dH의 수경도를 사용하여, 액체 및 분말 세제들을 사용하는 세탁기에서 전체 규모로 테스트하였다. 모체 분자 Man6을 참조로 사용하였다. 테스트된 효소 제제는 생물반응기 배양으로부터 수득된 제품 유사 샘플이었고, 이를 세척액 1 ml당 0.5 MNU로 투여하였다. 실시예 2에 기재된 바와 같이 활성을 측정하였다. 시판 표백 세제 분말 (만난아제를 제외한 모든 다른 효소 함유)은 세척당 58.9 (대략 3.8 g/l)로 투여하였고, 프로테아제, 및 만난아제를 제외한 다른 효소를 함유하는 시판 액체 세제 농축물은 세척당 56.9 g으로 투여하였다. Center for testmaterial B.V. (CFT, the Netherlands)로부터 공급된 인공 오염된 만난아제 민감성 테스트 의류 (5개의 품목) 및 자연 얼룩 (1개의 품목)을 테스트 물질로 사용하였다 (표 3). 얼룩 견본을 허커백 타월 (huckaback towels)에 스티치하였다. 인공 테스트 의류를 먼저 10 cm x 10 cm의 조각으로 자른다. 테스트 모니터에 추가하여, 4 조각의 밸러스트 오염 시트 (WFK -SBL2004, CFT)를 각 세척에 부가하였다. 각 테스트 모니터 (tracers)의 2배 양을 세척당 사용하였고, 테스트를 반복하였다. 주요 세척 전에, 밸러스트 로드 (얼룩이 포함된 허커백 타월 없음)를 먼저 익스프레스 프로그램 (express- program)을 사용하여 사전-습윤시켰다. 주요 세척 단계는 면의 경우 짧은 프로그램 (45분)을 사용하여 40℃에서 수행하였다. 적절한 양의 CaCl₂ x 2 H₂O 및 MgSO₄ x 7 H₂O 용액을 부가하여 세척수의 경도를 16°dH로 조정하였다. 세척 후에, 견본을 일광으로부터 보호되는 그리드에서 밤새 실내 공기에서 건조시켰다. 공정 조건 및 파라미터를 표 4에 개시하였다.

얼룩 제거 효과는 최종 결과 (전체 얼룩 제거 효과)가 각 6개의 얼룩의 ΔL^*의 합으로 표시되는 것을 제외하고는, 실시예 3에 기재된 반사율 값으로 색상을 측정하여 평가하였다. 각 얼룩의 색상 값은 2회 세척으로부터 수득된 4개 견본의 평균이었다.

시판 액체 세제 농축물로 수득된 결과를 도 5에 도시하였고, 시판 표백 세제 분말은 도 6에 도시하였다. 변이체 CM201은 두 세제들 모두에서 Man6과 비교하여 얼룩 제거 효과가 더 우수하였다. 변이체 CM206은 모체 Man6과 비교하여, 액체 및 표백 세제에서 최소한의 양호한 성능을 보였다.

전체 규모 테스트에 사용된 얼룩

CFT 코드	기질
인공 얼룩
C-S-06	면에 내츄럴 블랙의 샐러드 드레싱
C-S-05S	면에 카본 블랙의 마요네즈
E-165	면에 민감한 초콜렛 푸딩 만난아제
C-S-73	면에 안료가 있는 로커스트빈 검
C-S-43	면에 카본 블랙의 구아검
자연 얼룩
WEL-067kc	초콜렛 아이스크림, 니트 면에 자체 라벨, Ø = 5cm

전체 규모 테스트에 사용되는 공정 파라미터 및 조건

머신	Miele Softronic W1935
프로그램	사전-습윤: Express 20 (40℃, 20분) 주요 세척: 40℃ 쇼트 프로그램 (면), 대략 45분
물의 경도 (주요 세척)	약 16°dH
밸러스트 로드	3.1 kg 깨끗한, 백색 밸러스트 천 (테리 타월, 티 타월, 베스트, 커버, 허커백 타월)
세제 투여량	액체 세제 56.9 g 또는 58.9 g 표백 세제 분말
추적제의 양	2의 각 타입/세척
테스트 수	2

실시예 6. 시판 만난아제와 비교하여 액체 세제 중 변이체 CM201 및 CM206의 안정성

CM201 및 CM206의 생물반응기 배양으로부터 제품 유사 샘플을 수득하고, 비교를 위해 시판 만난아제 제제를 사용하여, 다양한 온도에서 수주 동안 액체 세제에서의 안정성에 대해 테스트하였다.

테스트는 붕산이 없는 시판 액체 세제 농축물 (실시예 4에서 사용된 것과 동일) 및 붕산을 함유하는 다른 시판 액체 세제 농축물에서 수행하였다. 세제에는 프로테아제, 및 만난아제를 제외한 다른 효소를 함유하였다. 만난아제를 세제 중에 4 w/w-%로 부가하였다. 샘플을 캡이 있는 플라스틱 튜브에서 37℃에서 4주 동안 및 30℃ 및 실온 (20 - 22℃)에서 거의 7 또는 8주 동안 인큐베이션하였다. 60분의 인큐베이션 시간을 사용하는 것을 제외하고, 실시예 2에 기재된 활성 분석을 사용하여 소정의 간격으로 활성을 측정하였다. 결과는 소정의 시점에서 채취한 샘플의 활성을 샘플의 초기 활성으로 나누어 수득되는, 잔류 활성 (%)으로 계산하였다.

변이체 CM201 및 CM206은 붕산이 포함된 액체 세제 (도 7a) 및 붕산이 없는 액체 세제 (도 7b) 모두에서 시판 만난아제에 비해 안정성이 상당히 더 우수하였다.

실시예 7. Launder-Ometer에서 40℃에서 소규모 테스트로 시판 만난아제와 비교하여 변이체 CM201 및 CM206의 성능

생물반응기 배양으로부터 수득된 CM201 및 CM206의 효소 제제를, 시판 만난아제를 참조로 사용하여, 실시예 3에 기재된 바와 같이 40℃ 및 16°dH의 수경도에서 시판 표백 세제 분말에서 테스트하였다. 효소를 세척액 1 ml당 활성 유닛 (MNU)으로 투여하였고, 이는 세제 중량의 % 효소 생성물로서 계산되는 경우 시판 만난아제의 전형적인 투여 범위를 나타낸다.

결과를 도 8에 개시하였다. 변이체 CM201 및 CM206은 표백제 함유 세제 중 시판 만난아제와 비교하여 상당히 더 우수한 얼룩 제거 성능을 가졌다.

SEQUENCE LISTING <110> AB Enzymes Oy <120> Mannanase variant <130> 31894WO-wp - ALLVAR-6 <160> 2 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 289 <212> PRT <213> Bacillus clausii <400> 1 Gln Asn Gly Phe His Val Ser Gly Thr Glu Leu Leu Asp Lys Asn Gly 1 5 10 15 Asp Pro Tyr Val Met Arg Gly Val Asn His Gly His Ser Trp Phe Lys 20 25 30 Gln Asp Leu Glu Glu Ala Ile Pro Ala Ile Ala Glu Thr Gly Ala Asn 35 40 45 Thr Val Arg Met Val Leu Ser Asn Gly Gln Gln Trp Glu Lys Asp Asp 50 55 60 Ala Ser Glu Leu Ala Arg Val Leu Ala Ala Thr Glu Thr Tyr Gly Leu 65 70 75 80 Thr Thr Val Leu Glu Val His Asp Ala Thr Gly Ser Asp Asp Pro Ala 85 90 95 Asp Leu Glu Lys Ala Val Asp Tyr Trp Ile Glu Met Ala Asp Val Leu 100 105 110 Lys Gly Thr Glu Asp Arg Val Ile Ile Asn Val Ala Asn Glu Trp Tyr 115 120 125 Gly Ser Trp Arg Ser Asp Val Trp Ala Glu Ala Tyr Ala Gln Ala Ile 130 135 140 Pro Arg Leu Arg Ser Ala Gly Leu Ser His Thr Leu Met Val Asp Ala 145 150 155 160 Ala Gly Trp Gly Gln Tyr Pro Ala Ser Ile His Glu Arg Gly Ala Asp 165 170 175 Val Phe Ala Ser Asp Pro Leu Lys Asn Thr Met Phe Ser Ile His Met 180 185 190 Tyr Glu Tyr Ala Gly Ala Asp Arg Ala Thr Ile Ala Tyr Asn Ile Asp 195 200 205 Arg Val Leu Ala Glu Asn Leu Ala Val Val Ile Gly Glu Phe Gly His 210 215 220 Arg His His Asp Gly Asp Val Asp Glu Asp Ala Ile Leu Ala Tyr Thr 225 230 235 240 Ala Glu Arg Gln Val Gly Trp Leu Ala Trp Ser Trp Tyr Gly Asn Ser 245 250 255 Gly Gly Val Glu Tyr Leu Asp Leu Ala Glu Gly Pro Ser Gly Pro Leu 260 265 270 Thr Ser Trp Gly Lys Arg Ile Val Tyr Gly Glu Asn Gly Leu Lys Ser 275 280 285 Asp <210> 2 <211> 870 <212> DNA <213> Bacillus clausii <400> 2 cagaacggct tccacgtctc cggcacggag ctcctggaca agaacggcga cccttacgtc 60 atgcgcggcg tcaaccacgg ccacagctgg ttcaagcagg acctcgagga agccatccct 120 gctatcgctg agacgggcgc taacacggtc cgcatggtcc tgagcaacgg ccagcagtgg 180 gagaaggacg acgctagcga gctggctcgc gtcctcgctg ctacggagac gtacggcctc 240 accacggtcc tggaggtcca cgacgctacg ggctcggacg accccgccga cctcgagaag 300 gccgtcgact actggatcga gatggctgac gtcctgaagg gcaccgagga ccgcgtcatc 360 atcaacgtcg ccaacgagtg gtacggctcc tggcgcagcg acgtctgggc cgaggcctac 420 gctcaggcta tccctcgcct ccgctcggcc ggcctctccc acacgctcat ggtcgacgct 480 gccggctggg gccagtaccc tgcttccatc cacgagcgcg gcgctgacgt ctttgcttcg 540 gaccccctga agaacaccat gttctccatc cacatgtacg agtacgctgg cgctgaccgc 600 gctaccatcg cctacaacat cgaccgcgtc ctggctgaga acctggctgt cgtcatcggc 660 gagtttggcc accgccacca cgacggcgac gtcgacgagg acgctatcct ggcttacacc 720 gccgagcgcc aggtcggctg gctggcttgg tcgtggtacg gcaactcggg cggcgtcgag 780 tacctggacc tggctgaggg cccttcgggc cctctcacga gctggggcaa gcgcatcgtc 840 tacggcgaga acggcctgaa gagcgactaa 870

Claims

만난아제 (mannanase)의 변이체로서, 상기 변이체는:
서열번호: 1과 적어도 90%, 그러나 100% 미만의 서열 동일성,
위치 S256에서 아미노산의 치환, 및
만난아제 활성을 갖는 만난아제의 변이체.
청구항 1에 있어서, 적어도 하나의 추가 치환을 포함하는 것인 변이체.
청구항 1 또는 2에 있어서,
위치 24 및 256;
위치 24, 123 및 256; 또는
위치 123 및 256에서의 치환을 적어도 포함하는 것인 변이체.
청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서,
위치 V24I 및 S256A; 또는
위치 V24I 및 S256G; 또는
위치 V24I, V123I, S256A; 또는
위치 V24I, V123I, 및 S256G; 또는
위치 V123I 및 S256A; 또는
위치 V123I 및 S256G의 치환을 적어도 포함하는 것인 변이체.
효소 조성물로서,
청구항 1 내지 4 중 어느 한 항의 변이체; 및
a. 폴리올, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 헥실렌 글리콜, 글리세롤, 당, 당 알코올, 폴리사카라이드, 락트산, 펩티드, 계면활성제 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 적어도 하나의 안정화제; 또는 유기산, 시트르산, 아스코르브산, 벤조산 및 이들의 염 및 유도체, 벤조산 나트륨, 벤조에이트, 하이드록시벤조에이트 및 유도체, 포스페이트, 소르브산, 소르브산 나트륨, 소르베이트, 염, 염화나트륨 또는 염화칼륨, 1,2-벤즈이소티아졸린-3-온 (BIT) 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 적어도 하나의 보존제 또는 완충제;
b. 선택적으로, 붕산, 붕산 유도체, 방향족 보레이트 에스테르, 4-포르밀페닐 보론산, 페닐 보론산 유도체, 억제 기능을 가진 펩티드 화합물, 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 적어도 하나의 억제제;
c. 선택적으로, 매개체 (mediator)를 갖거나 또는 갖지 않는, 프로테아제, 아밀라제, 셀룰라제, 리파제, 자일라나제 (xylanases), 만난아제, 큐티나제 (cutinases), 에스테라제, 피타제 (phytases), 뉴클레아제, 펙티나제 (pectinases), 펙틴분해 효소 (pectinolytic enzymes), 펙테이트 리아제 (pectate lyases), 카보하이드라제 (carbohydrases), 아라비나제 (arabinases), 갈락타나제 (galactanases), 잔타나제 (xanthanases), 자일로글루카나제 (xyloglucanases), 락카제 (laccases), 퍼옥시다제 및 옥시다제, 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 적어도 하나의 효소; 및
d. 선택적으로, 말토덱스트린, 곡물가루 (flour), 염화나트륨, 설페이트, 황산나트륨, 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 적어도 하나의 충전제를 포함하는 효소 조성물.
청구항 5에 있어서, 액체 조성물 또는 고체 조성물, 용액, 분산액, 페이스트, 분말, 과립, 입자체 (granulate), 코팅된 입자체, 정제, 케이크, 결정, 결정 슬러리, 겔 또는 펠렛 (pellet)의 형태인 것인 효소 조성물.
청구항 1 내지 4 중 어느 한 항의 변이체, 또는 청구항 5 또는 6의 효소 조성물을 포함하는 세제 조성물.
청구항 7에 있어서, 액체 세제 또는 고체 세제, 바 (bar), 균질 정제 (homogenous tablet), 2개 이상의 층을 갖는 정제, 1개 이상의 구획 (compartments)을 갖는 파우치, 일반 또는 콤팩트 분말, 과립, 입자체, 페이스트, 겔, 또는 일반, 콤팩트 또는 농축 액체의 형태인 것인 세제 조성물.
청구항 7 또는 8에 있어서, 프로테아제, 리파제, 큐티나제, 아밀라제, 카보하이드라제, 셀룰라제, 펙티나제, 펙테이트리아제, 펙틴분해 효소, 에스테라제, 만난아제, 아라비나제, 갈락타나제, 자일라나제, 옥시다제, 잔타나제, 자일로글루카나제, 락카제, 뉴클레아제 및/또는 퍼옥시다제로부터 선택되는, 바람직하게는 프로테아제, 아밀라제, 셀룰라제 및 리파제로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 추가 효소를 추가로 포함하는 것인 세제 조성물.
청구항 1 내지 4 중 어느 한 항의 변이체를 포함하는 적어도 하나의 재조합 폴리펩티드를 생성 가능하게 하는 유전자 요소 (genetic elements)를 포함하는 재조합 숙주 세포.
청구항 1 내지 4 중 어느 한 항의 변이체를 제조하는 방법으로서, 상기 방법은 청구항 10의 재조합 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하고, 여기에서:
유전자 요소는 상기 재조합 숙주 세포에서 재조합 폴리펩티드의 생성을 조절하는 적어도 하나의 조절 서열을 포함하고;
유전자 요소는 선택적으로, 상기 재조합 폴리펩티드를 상기 숙주 세포 밖으로 운반하는 신호 서열을 코딩하는 적어도 하나의 서열을 포함하며;
상기 배양하는 단계는 상기 재조합 폴리펩티드를 생성 가능하게 하는 조건에서 수행되는 것인 방법.
만난 (mannan) 함유 물질을 분해 또는 변형시키는 방법으로서, 상기 만난 함유 물질을 유효량의 청구항 5 또는 6의 효소 조성물, 또는 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항의 변이체로 처리하는 단계를 포함하는 방법.
동물 사료 (animal feed)로서,
청구항 5 또는 6의 효소 조성물, 또는 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항의 변이체, 및 식물 기원의 적어도 하나의 단백질 공급원 또는 만난 함유 산물 또는 부산물; 및
a. 선택적으로, 프로테아제, 아밀라제, 피타제, 자일라나제, 엔도글루카나제, 베타-글루카나제 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 적어도 하나의 효소; 및
b. 선택적으로, 말토덱스트린, 곡물가루, 염, 염화나트륨, 설페이트, 황산나트륨 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 적어도 하나의 충전제를 포함하는 동물 사료.
사료 보충제 (feed supplement)로서,
청구항 5 또는 6의 효소 조성물, 또는 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항의 변이체; 및
a. 선택적으로, 프로테아제, 아밀라제, 피타제, 자일라나제, 엔도글루카나제, 베타-글루카나제 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 적어도 하나의 효소; 및
b. 선택적으로, 말토덱스트린, 곡물가루, 염, 염화나트륨, 설페이트, 황산나트륨 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 적어도 하나의 충전제를 포함하는 사료 보충제.
오일 시추 (oil drilling) 또는 수압-파쇄 (hydro-fracturing); 커피 추출물, 과일 주스, 파인애플 주스 또는 두유 가공; 세제; 만난 함유 얼룩의 분해; 또는 수성 용액 중 만난의 분해에 있어서, 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항의 변이체, 또는 청구항 5 또는 6의 효소 조성물의 용도.