JP4392778B2 - 新規なセルラーゼを産生する放線菌、その放線菌が産生するセルラーゼ、およびそのセルラーゼを作成する方法。 - Google Patents
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Description
【０００１】
関連特許出願に対する相互参照
本出願は、1997 年11 月19 日に出願し現在放棄されている米国特許出願第08/974,042 号の一部継続出願である1998 年6 月24 日出願の米国特許出願第09/104,308 号の一部継続出願である；前記2 つの特許出願は参照によって全てこの中に組み込まれている。
【０００２】
連邦政府委託研究および開発
該当しない。
【０００３】
発明の背景
セルラーゼは、セルロース中のβ−D −グルコシド結合を加水分解する酵素である。セルロース分解酵素は、伝統的に3 つのクラスに分類されている：エンドグルカナーゼ、エキソグルカナーゼまたはセロビオヒドロラーゼ、およびβ−グルコシダーゼである(Knowles, J. et al., TIBTECH 5: 255-261 (1987)) 。セルラーゼは、多くの細菌、酵母、および真菌によって産生されることが知られている。
【０００４】
セルロース分解酵素の使用のために開発された応用の中で主要なものは、（バイオ）エタノール製造のための（木材）セルロースパルプの糖への分解、“ストーンウォッシュ(stone washing) ”および“バイオポリッシング(biopolishing) ”のような織物加工、ならびに洗剤組成物における用途である。またセルラーゼは、泥を除去するため、すなわち洗濯のための洗剤組成物において有用であることが知られている。例えば、英国特許出願第2,075,028 号、第2,095,275 号、および第2,094,826 号は、セルラーゼを加えた洗剤を用いると洗濯能力が改善されることを示している。さらには、英国特許出願第1,358,599 号は、洗剤においてセルラーゼを用いると綿混織物のガサガサした感触を減らすことを示している。
【０００５】
織物加工におけるセルラーゼの別の有用な特徴は、使用済み織物の色を明るく鮮やかにすることによって、それらを再生できることである。例えば、綿混織物を繰り返し洗浄すると、その織物が灰色じみた外観となる。これは、機械的作用によって生じる、しばしば“毛玉(pills) ”と呼ばれる、破壊されかつ乱れた小繊維のせいであると考えられている。この灰色じみた外観は、特に着色織物において顕著である。結果として、セルラーゼが繊維の乱れた最上層を除去し、従って織物の全体的外観を改善し得ることは価値があると分かっている。
【０００６】
セルラーゼの主要な用途である洗剤は通常アルカリ性条件下で作用するため、pH7 −10 で高い活性を示すセルロースが強く要求されている。ヒュミコラ・インソレン(Humicola insolens) およびトリコダーマ・リーセイ(Trichoderma reesei) 由来のセルラーゼのようなよく特徴付けされている真菌セルラーゼは、中性から低いアルカリpH で十分に機能する。高いアルカリ性pH でセルラーゼ活性を示す多くの酵素が、バシラス菌および他の原核生物から単離されている（例えば国際特許出願第WO96/34092 号および第WO96/34108 号を参照）。従って、真菌および細菌のセルラーゼは完全に調査されている。しかしながら、第三の群のセルラーゼである放線菌から単離されたセルラーゼは、ほとんど注目されていなかった。Wilson et al., Critical Reviews in Biotechnology, 12: 45-63 (1992) は、サーモモノスポラ・フスカ(Thermomonospora fusca) 、サーモモノスポラ・カーベイト(Thermomonospora curvate) 、およびミクロビスポラ・ビスポラ(Microbispora bispora) によって産生されるセルラーゼについて研究しており、さらにそれらセルラーゼの多くが広いpH 特性および良好な温度安定性を有することを示している。同様に、Nakai, et al., Agric. Biol. Chem., 51: 3061-3065 (1987) およびNakai, et al., Gene, 65: 229-238 (1988) は、ストレプトミセス株KSM −9 由来のアルカリ耐性セルラーゼcasA について記載している。そのセルラーゼは、アルカリ性pH での最適条件および優れた温度安定性を有する。
【０００７】
放線菌からのいくつかの例を含む、所望の特性を有する多くのセルラーゼ組成物に関連する技術における知識にも関わらず、例えば織物加工、洗剤組成物の成分、パルプおよび紙の加工、動物飼料の補助物質、パン作りのための加工助剤、ならびにバイオマスコンバーター(biomass converer) 等として有用である様々な領域の特徴を有する新しいセルラーゼに対する要求が続いている。
【０００８】
発明の概要
本発明の目的は、放線菌によって産生され得る新規なセルラーゼ組成物、そのようなセルラーゼの誘導体、そのようなセルラーゼを作成する方法、およびそのようなセルラーゼの使用を提供することである。さらに本発明は：洗剤組成物の添加剤として；セルロース含有織物およびそれに用いられ得る繊維のような織物の加工において；動物飼料の添加剤として；パン作りにおける加工助剤として；パルプおよび紙の加工において；ならびに高フルクトール含有コーンシロップ(corn-syrup) またはエタノールの製造のためのデンプン加工において：の使用を含む、業界においてセルラーゼの添加が有利であると認められている組成物における新規なセルラーゼの使用に関する。
【０００９】
組換え宿主細胞による異種発現を介してそのような新規放線菌由来セルラーゼ組成物を作成する方法を提供することも本発明の別の目的である。
【００１０】
本発明の新規なセルラーゼ組成物の商業生産を容易にするDNA およびアミノ酸配列を提供することも本発明のさらに別の目的である。
【００１１】
洗剤、織物加工、飼料補助物質、ならびにパルプおよび紙の加工における使用のための優れた特性を有する新規なセルラーゼを提供することも本発明のさらに別の目的である。
【００１２】
本発明に基づき、放線菌から得ることができる新規なセルラーゼまたは誘導体を提供する。好ましくは、本発明のセルラーゼは、図1 （配列番号1 ）のアミノ酸配列、その断片、またはその活性部分に対して50％ 以上の配列同一性、好ましくは70％ 以上の配列同一性、さらにより好ましくは90％ 以上の配列同一性を有するそれらの誘導体を含む。
【００１３】
別の実施形態に基づき、本発明のセルラーゼをコードするDNA を含む組成物を提供する。好ましくは、そのDNA はアミノ酸配列をコードし、かつ図2 （配列番号2 ）に示される核酸配列、その断片、またはそれらの部分に対して76％ 以上の配列相同性、好ましくは80％ 以上の配列同一性、およびさらに好ましくは90％ 以上の配列同一性を有しかつそれによってセルラーゼが産生されるそれらの誘導体を含む。さらに本発明は、適切な条件下において図2 に表されるDNA から選んだDNA プローブに対してハイブリッド形成し、かつそれによってセルラーゼが産生されるようなDNA を具体的に示す。
【００１４】
本発明のさらに別の実施形態に基づき、本発明に基づくセルラーゼコードDNA で適切な微生物を形質転換させる方法、およびその形質転換微生物から本発明に基づくセルラーゼを産生させる方法を提供する。
【００１５】
本発明の好ましい実施形態において、完全長セルラーゼは放線菌由来であり、かつSDS −PAGE で測定して約36 ｋD の分子量を有する（この中で36 ｋD セルラーゼとして称されている）。完全長の約36 ｋD のセルラーゼは、等電点が約5.9 であり、さらにCMC （カルボキシメチルセルロース）におけるpH 最適条件が40 ℃で約8 でありかつ60 ℃で7 である。本発明のセルラーゼは、少なくともpH5 からpH10 の広い活性範囲を有し、40 ℃よりも60 ℃においてより高い活性を示す。
【００１６】
特に好ましい実施形態において、本発明のセルラーゼは、前記の完全長セルラーゼの切断形態である。その分子量は約25 ｋD である。
【００１７】
図面の簡単な説明
図1 は、本発明に基づく約36 ｋD のセルラーゼの推定アミノ酸配列を示しており（配列番号1 ）、リーダー配列をボールド体で示す。コード化文字はIUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission(GeneBank PatentIn User Mannual, PC-DOS/MS-DOS version, November 1990 に記載) に基づく。
【００１８】
図2 は、本発明に基づく約36 ｋD のセルラーゼをコードするDNA 配列を示す( 配列番号2) 。
【００１９】
図3 は、本発明に基づく約36 ｋD のセルラーゼの40 ℃および60 ℃におけるpH ／活性特性を示す。
【００２０】
図4 は、pHPLT ベクターを示す。
【００２１】
図5 は、pHP11AG8 ベクターを示す。
【００２２】
図6 は、本発明のセルラーゼが得られた放線菌の16s rRNA 配列を示す。
【００２３】
図7 は、pIJ488-101 の構造を示す。
【００２４】
図8 は、pWGxGIT の構造を示す。
【００２５】
図9 は、pTZ18Rsti の構造を示す。
【００２６】
図10 は、pWGxsGIT の構造を示す。
【００２７】
図11 は、pIJ488sti の構造を示す。
【００２８】
図12 は、pSEGCi の構造を示す。
【００２９】
図13 は、pSEGCT の構造を示す。
【００３０】
図14 は、pSEGCT11AG8 の構造を示す。
【００３１】
図15 は、GI プロモーター、celA シグナル配列、セルラーゼ11AG8 およびGI ターミネーターから成る完全発現カセットのDNA 配列を示す( 配列番号4) 。また、11AG8 のコードアミノ酸配列を示す( 配列番号5) 。
【００３２】
図16 は、pSEACT11AG8 の構造を示す。
【００３３】
図17 は、pSACT11AG8 の構造を示す。
【００３４】
図18 は、本発明の完全長セルラーゼと切断セルラーゼの能力を比較する。図18a は、Wisk（登録商標） において、完全長セルラーゼの毛玉除去能(depilling performance) が切断セルラーゼの毛玉除去能と同等であることを示唆する。図18 ｂは、切断セルラーゼにおいて、ピーク負荷値(peak load) がわずかに低く、かつTSL が高いことを示唆する。図18 ｃは、同じ毛玉除去率において、切断セルラーゼが完全長セルラーゼよりも高いTSL を有することを示唆する。
【００３５】
図19 は、本発明の完全長セルラーゼと切断セルラーゼの能力を比較する。図19a は、Gessy Lever#1 において、切断セルラーゼの毛玉除去能が、完全長セルラーゼの毛玉除去能よりも良いことを示唆する。図19 ｂは、切断セルラーゼにおいて、完全長セルラーゼよりもピーク負荷値が低いことを示唆する。
【００３６】
図20 は、漂白剤の存在下における本発明の完全長セルラーゼと切断セルラーゼの能力を比較する。図20a は、過ホウ酸一水塩および漂白活性剤の存在下において、切断酵素の毛玉除去能力がわずかに低下することを示唆する。図20 ｂは、漂白剤の存在下において、切断セルラーゼのピーク負荷値が上昇することを示唆する。
【００３７】
図21 は、プロテア−ゼの存在下における本発明の完全長セルラーゼと切断セルラーゼの能力を比較する。図21a は、プロテアーゼが切断酵素の毛玉除去能力に影響を及ぼさないことを示唆する。図21b は、プロテアーゼが切断酵素のピーク負荷値に影響を及ぼさないことを示す。
【００３８】
発明の詳細な説明
定義
この中で別段の定義がなければ、この中で用いられている全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する分野の当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。Singleton, et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 2D ED.,John Wiley and Sons, New York (1994), and Hale & Marham, The HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, NY (1991) は、本発明において用いられている多くの用語の全般的な辞書を当業者に提供する。この中に記載の方法および材料に類似または等価である任意の方法および材料を本発明の実施または試験において用いることができるが、好ましい方法および材料について記載している。数値範囲は、その範囲を特定する数値を含む。指摘がなければ、核酸は、5 ’から3 ’の方向で左から右に書く；アミノ酸配列は、アミノ末端からカルボキシ末端の方向で左から右に書く。この中に与えられた見出しは、明細書を全体として参照することによって理解し得る本発明の実施形態の種々の態様を限定するものではない。
【００３９】
「アミノ酸」の用語は、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチド（総称して「ポリペプチド」）に組み込まれたアミノ酸への言及を含む。アミノ酸は、天然アミノ酸であって差し支えなく、または別段限定がなければ、天然アミノ酸と同様に機能する天然アミノ酸の公知の類似物を含んでいて差し支えない。
【００４０】
「誘導体」は、天然タンパク質のC 末端およびN 末端の一方または両方への1 つ以上のアミノ酸の付加、天然アミノ酸配列における1 つまたは多くの異なる部位における1 つ以上のアミノ酸の置換、天然タンパク質の1 方あるいは両方の末端またはアミノ酸配列の1 つ以上の部位における1 つ以上のアミノ酸の欠失、あるいは天然アミノ酸配列における1 つ以上の部位への1 つ以上のアミノ酸の挿入により、天然タンパク質から派生する。酵素誘導体の調製は、好ましくは、天然タンパク質をコードするDNA 配列の修飾、そのDNA 配列による適切な宿主の形質転換、酵素誘導体を形成するための修飾DNA 配列の発現によって達成される。誘導体を調製する別の手段は、当業界で周知であり、例えば天然タンパク質またはその誘導体のタンパク質分解による切断を含む。本発明のセルラーゼの誘導体は、前駆酵素の特徴的な酵素特性を維持するがある特定側面において変化した特性を有するような、前駆酵素アミノ酸配列（例えば本発明に基づく野生型または天然型の酵素）と比較して変化したアミノ酸配列を含むペプチドを包含する。例えば、変化したセルラーゼは、最適pH が上昇し、または温度抵抗が上昇し得るが、その特有のセルロース分解活性を有するであろう。
【００４１】
特定アミノ酸配列の「保存的置換」とは、機能活性に重要でないアミノ酸配列のアミノ酸置換、または重要なアミノ酸の置換でさえ本質的に活性を変化させないような類似特性（例えば酸性、塩基性、正または負荷電、極性または非極性等）を有する他のアミノ酸でのアミノ酸置換を称する。機能的に類似のアミノ酸を提供する保存的置換表(conservative substitution tables) は、当業界で周知である。
【００４２】
2 つのポリペプチドまたは核酸配列の構造における「同一」の用語は、以下の「配列比較アルゴリズム」の1 つを用いて測定して一致が最大となるように並べた場合に、同じとなる2 つの配列中の残基を称する。比較のための配列の最適な整列は、例えばSmith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981) の局所的相同性アルゴリズム、Needleman & Wunsch, J. Mol. Bio. 48: 443 (1970) の相同性整列アルゴリズム、Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988) の類似性の調査方法、それらアルゴリズムのコンピューターによる実施(GAP, BESTFIT, FASTA, and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI) 、または目視検査によって実施することができる。
【００４３】
配列類似性を特定するのに適切であるアルゴリズムの1 つの例は、Altschul, et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990) に記載のBLAST アルゴリズムである。BLAST 解析を実施するためのソフトウェアは、国立バイオテクノロジー情報センターから公的に利用できる( 。そのアルゴリズムは、データベース中の長さW のワードと共に並べた場合にポジティブ評価の閾値T に適合しまたは充足させる照会配列中の長さW の短いワードを同定することによって、高得点配列対(high scoring sequence pairs(HSPs)) をまず同定することを含む。それら最初の隣接ワードのヒットは、それらを含む長いHSPs を見出すための開始点として働く。累積整列得点(cumulative alignment score) ができるだけ増えるように、比較する2 つの配列のそれぞれに沿って両方向にワードヒットを展開する。ワードヒットの延長は：累積整列得点が最大達成値より定めた定数X から遠ざかる；累積得点がゼロまたはそれ以下に下がる；または何れかの配列の末端に達する：場合に止まる。BLAST アルゴリズムパラメーターW 、T 、およびX は、整列の感度および速さを特定する。BLAST プログラムは、初期設定として、ワード長(W) が11 、BLOSUM62 スコアリングマトリックス(Henikoff & Henikoff, Prog. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915 (1989)) 整列(B) が50 、期待値(E) が10 、M ’5 、N ’−4 、および両鎖の比較を用いる。
【００４４】
さらに、BLAST アルゴリズムは、2 つの配列間の類似性の統計解析を実施する（例えばKarlin & Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5787 (1993) を参照）。BLAST アルゴリズムによってもたらされる類似性の1 つの指標は、2 つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の一致が偶然生じる確率の指標を提供する最小総確率(smallest sum probability) （P(N) ）である。例えば、評価核酸とセルラーゼ核酸との比較における最小総確率が、約0.1 より小さく、より好ましくは約0.01 より小さく、さらに最も好ましくは約0.001 よりも小さい場合に、ある核酸が本発明のセルラーゼ核酸に類似するとみなされる。評価核酸がセルラーゼポリペプチドをコードする場合には、比較によって約0.5 より小さく、より好ましくは約0.2 より小さい最小総確率をもたらす場合に、特定のセルラーゼ核酸に類似するとみなされる。
【００４５】
2 つのポリペプチドが実質的に同一であるとする別の指標として、第一ポリペプチドが第二ポリペプチドと免疫学的に交差反応性であることが挙げられる。従って、例えば2 つのペプチドが保存的置換によってのみ異なる場合に、そのポリペプチドは第二ポリペプチドと実質的に同一である。
【００４６】
この中で用いられている「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」の用語は、互換的に使われており、かつアミノ酸残基から成る高分子に対する言及を含む。その用語は、天然アミノ酸高分子に適用されるのと同様に、1 つ以上のアミノ酸残基が、対応する天然アミノ酸の人工的化学類似物であるようなアミノ酸高分子にも適応される。またその用語は、そのポリペプチドが機能を維持するような保存的アミノ酸置換を含む高分子にも適用される。
【００４７】
この中で用いられている「組換え」の用語は、天然状態ではそのポリペプチドを発現し得るＤＮＡの内生的複製を持たない宿主細胞を用いて産生されるポリペプチドに対する言及を含む。宿主細胞は、適切な単離核酸配列の導入によって遺伝子的に変化しているため、その組換えポリペプチドを産生する。またその用語は、異種核酸の導入または天然核酸の改変によってその細胞にとって天然でない形態に修飾されている宿主細胞、または核酸、またはベクターに対する言及、あるいは宿主細胞がそのように修飾された細胞由来であることを含む。従って、例えば、組換え宿主細胞は、その細胞の天然の（非組換えの）形態内に認められない遺伝子を発現し、天然の形態内に認められる遺伝子の変異体を発現し、あるいは全く発現されないかまたは発現されたとしても異常に発現される天然遺伝子を発現している。
【００４８】
「宿主細胞」は、宿主として、および本発明に基づく組換えＤＮＡベクターの発現媒体としてとして働く能力を有する細胞を意味する。本発明の好ましい実施形態において、「宿主細胞」はバシラス菌の細胞を意味する。しかしながら、当業者は、例えば細菌、真菌、真核、および植物細胞のような任意の適切な宿主細胞を用い得ることに気が付くであろう。
【００４９】
「ＤＮＡ構造」または「ＤＮＡベクター」は、上記の任意の新規セルラーゼまたはセルラーゼ誘導体をコードする1 つ以上のＤＮＡ断片を含むヌクレオチド配列を意味する。「ＤＮＡベクター」には「発現ベクター」が含まれる。典型的な発現ベクターは、転写および翻訳のターミネーター、転写および翻訳の開始配列、並びに特定核酸の発現を制御するのに有用であるプロモーターを含む。ベクターは、必要に応じて、1 つ以上の独立したターミネーター配列、原核細胞、真核細胞、または両方においてそのカセットの複製を可能とする配列（例えばシャトルベクター）および原核系および真核系の両方のための選択マーカーを包含する遺伝子発現カセットを含む。ベクターは、原核細胞、真核細胞、または両方における複製および導入に適している。Giliman and Smith, Gene 8: 81-97 (1979) ；Roberts et al., Nature 328: 731-734 (1987) ；Berger and Kimmel, GUIDE TO MOLECULAR CLONING TECHNIQUES, METHODS IN ENZYNOLOGY, VOL 152, Academic Press, Inc., San Diego, CA ( 「Berger 」) ；Scheider, B., et al., Protein Expr. Purig 6435: 10 (1995) ；Sambrook et al. MOLECULAR CLONING-A LABORATORY MANUAL(2ND ED.)VOL. 1-3, Cold Springs Harbor Publishing (1989) （「Sambrook 」）；and CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Ausubel et al.(eds.), Current Protocols, a joint venture between Green Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc.,(1997 Supplement) （「Ausubel 」）を参照。
【００５０】
完全長セルラーゼのクローニングおよび発現
本発明の1 つの実施形態において、本発明のセルラーゼは、例えば組換え的に産生されるのではなく、天然供給源から得られる。適切なセルラーゼ産生生物を単離するためにソーダ湖試料をスクリーニングすることによって、セルラーゼを得ることができる。さらに、放線菌のような細菌を増殖させるためにその分野で認められた手段に基づきその生物を培養することができる。
【００５１】
しかしながら、正確なセルラーゼ産生株を単離するよりもむしろ、遺伝子操作技術を利用する方がより効率的である。従って、この中で提供されるDNA で適切な宿主細胞を形質転換し、さらに宿主細胞の増殖およびセルラーゼ発現に適切な条件下で、得られた組換え微生物を培養することが可能である。
【００５２】
最初の処理として、例えばSaito and Miura の方法(Saito & Miura, Biochim. Biophys. Acta., 72: 619 (1963)) または類似の方法によって、供与体である放線菌株から染色体DNA を得ることができる。さらに得られた染色体DNA の制限酵素切断によって、アルカリセルラーゼ遺伝子を含むDNA 断片が得られる。この目的のために、例えば遺伝子のコード領域またはコード領域と遺伝子のプロモーターのような前記遺伝子の所望の領域を切断しないような任意の制限酵素を用いることができる。あるいは、部分的にのみ消化をもたらすために低い酵素濃度または短いインキュベーション時間を用いて遺伝子を切断するような制限酵素を用いることができる。好ましい制限酵素はSau3A である。得られた消化混合物から、約4-10kb の適切な断片を単離し、DNA ベクターに挿入し、さらに適切な宿主細胞を形質転換するのに用いることができる。
【００５３】
例えばλファージ（発現）ベクターおよびE.coli( 大腸菌) 宿主細胞を用いて、本発明のセルラーゼをコードする遺伝子をクローン化することができる。（あるいは、保存ドメインに基づき設計した共通プライマーを用いたPCR を使用しても差し支えない）。E.coli における最初のクローニング処理の後、バシラス菌またはストレプトミセス種のようなより好ましい工業的発現宿主、アスペルギルスまたはトリコダーマ(Trichoderma) のような糸状菌、あるいはサッカロミセスのような酵母に本発明に基づくセルラーゼ遺伝子を導入することができる。最も好ましいのはストレプトミセスである。また、好ましいのはトリコダーマである。しかしながら、トリコダーマにおいて発酵されたセルラーゼは、例えばストーンウォッシュのような織物加工で用いる場合に、バック染色(backstaining) のレベルを上げることが分かっている。理論に制限されないで、発酵培地にプロテアーゼを添加すると許容可能なレベルまでバック染色のレベルを下げると考えられている。従って、トリコダーマもまた、織物加工で用いるためのセルラーゼの条件を満たす宿主細胞を提供することができる。それら宿主生物において得られる高いレベルの発現および分泌によって発酵培地中へのセルラーゼの蓄積が可能となり、その培地から連続的にセルラーゼを回収できる。
【００５４】
遠心または濾過によって培地から細胞を分離し、もし必要であれば細胞を破壊し、さらに細胞断片および破片から上清を除去することを含む従来の方法によって、発酵培地からセルラーゼを回収できる。通常、分画後、上清または濾液のタンパク質成分を例えば硫酸アンモニウムのような塩によって沈殿させる。次にその沈殿タンパク質を溶解させ、さらに例えばイオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、またはその分野で認められている別の同様の方法のような種々のクロマトグラフィーによって精製する。本発明に基づくセルラーゼの産生のために、セルロースベースのエネルギー供給源を含む培地を用いて、アルカリ条件下において宿主細胞を培養することが好ましい。
【００５５】
機能活性によって本発明のセルラーゼの精製をモニターすることが好ましい。好ましい機能測定法として、セルラーゼによるNPC ( ニトロフェニルセロビオシド) の加水分解の速度をモニターする。その方法は以下の通りである：
96 穴マイクロタイタープレートのウェルに2 重または3 重で20 μL の試料または標準品を添加する。標準品は既に得られておりかつよく特徴づけされているセルラーゼ試料、または商業的に購入したセルラーゼであって差し支えない。測定溶液100 μL を添加する。測定溶液は、濃縮ストック液とリン酸緩衝液を1 対5 で混合して調製する。濃縮ストック液は、100mM のリン酸ナトリウム溶液(pH8.0) 中の25mg/mlNPC(Sigma N4764) から成る。測定溶液を希釈するために同じリン酸緩衝液を用いることができる。NPC 基質を試料または標準品に添加するとすぐに、30 ℃で予め保温しておいたマイクロタイタープレートリーダーにプレートを挿入する。1410nm での読出しを1 分間隔で6 分間とる。
【００５６】
標準品を用いて標準曲線を作成することができる。曲線のY 軸はVmax であり、X 軸は標準品中のセルラーゼの濃度である。もし試料のVmax が標準品を用いて作成した標準曲線の範囲を超える場合は、試料を希釈して測定を繰り返す必要がある。
【００５７】
本発明の1 つの実施形態において、発現宿主細胞は、バシラス種、より好ましくはバシラス・リケニホルミス(Bacillus licheniformis) または枯草菌を含む。しかしながら、より好ましい実施形態において、宿主発現細胞は、ストレプトミセス種、より好ましくはストレプトミセス・リビデンス(Streptomyces lividens) を含む。プロテアーゼ欠失バシラス菌株のための好ましい一般的な形質転換および発現プロトコールは、この中に引例によって組み込まれているFerrari, et al., 米国特許第5,264,366 号において提供されている。ストレプトミセス種における形質転換および発現は、この中に引例によってその全体が組み込まれているHopwood, et al., GENETIC MANIPULATION OF STREPTOMYCES: A LABORATORY MANUAL, Innis (1985) において見ることができる。
【００５８】
本発明のDNA 配列でバシラス菌を形質転換させることは、得られる発現の点で効果的ではないことが見出された。従って、バシラス種を形質転換させる場合には、公知のバシラス種由来シグナル配列および他の調節配列と組み合わせてaprE プロモーターを利用することが好ましい。形質転換宿主細胞がアスペルギルスである場合は、好ましいプロモーターはglaA である。ストレプトミセスを用いる場合には、好ましいプロモーターは、アクチノプラーネス・ミソウリエンシス(Actinoplanes missouriensis) のグルコースイソメラーゼ(GI) プロモーターである。
【００５９】
完全長セルラーゼおよびそれをコードするDNA に加えて、本発明は切断セルラーゼ(truncated cellulase) およびセルラーゼの誘導体、ならびにそれらをコードするDNA も含む。通常、セルラーゼは2 つの活性ドメイン：触媒活性ドメインおよびセルロース結合ドメイン：を含む。本発明の切断セルラーゼは、本発明の完全長セルラーゼの触媒活性部分を含む。
【００６０】
1 つの実施形態において、切断セルラーゼは、完全長セルラーゼを切断することによって作成する。完全長セルラーゼは、例えば放線菌のような天然の宿主、または組換え宿主細胞の何れかから単離することができる。理論によって制限されないで、組換え宿主細胞の発酵プロセスの間にプロテアーゼが本発明のセルラーゼを切断すると考えられている。従って、非組換えセルラーゼまたは発酵プロセスの間に切断されない組換えセルラーゼの場合、そのようなプロテアーゼを本発明の完全長セルラーゼに添加して切断形態を作成できると想定される。
【００６１】
切断後、本発明の切断セルラーゼをセルラーゼ結合ドメインから分離することが必要であろう。その分離は、例えば分離用電気泳動、ゲル濾過またはサイズ排除クロマトグラフィー、および限外濾過等によって、サイズに基づき実施できる。他の可能な方法は、当業者に明白であり、かつイオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィーおよびアフィニティクロマトグラフィー、沈降平衡法等を含んでいて差し支えない。
【００６２】
あるいは、切断セルラーゼは、組換え的に作成しても差し支えない。この態様において、完全長セルラーゼの触媒活性部分のコード領域のみを含むDNA 配列を調製する。好ましい実施形態において、触媒活性ドメインの230 または233 アミノ酸をコードするDNA を調製する。そのDNA 配列は、合成手段によって、または完全長コード配列の制限酵素消化によって、調製することができる。もし制限酵素を用いる場合は、その酵素に依存して、1 本鎖DNA が突き出た(protruding) 末端を平滑末端にすることが必要であろう。そのような平滑末端化は、他方の突き出していない鎖を埋めることによって、または突き出した鎖を切断することによって達成できる。それら両方法の技術は、当業者に周知である。また、終止コドンを所望のコード領域の後に加えなければならないことを等業者は知っているであろう。コード領域の3 ’末端に終止コドンを加える技術は周知であり、かつ例えばAusubel or Sambrook において見ることができる。
【００６３】
DNA 配列の合成は、当業界において周知であり、かつ例えば、Beaucage & Caruthers, Tetrahedron Letts. 22(20): 1859-1862 (1981) において見ることができ、Needham-VanDevanter, et al., Nucl Acids Res. 12: 6159-6168 (1984) 等に記載のように自動合成装置を用いて実施できる。またDNA 配列は、例えばPromega (Madison, WI) のような熟練者に知られている種々の商業的供給源から、注文作成することができる。DNA 配列の精製は、必要な場合には、通常、Pearson & Regnier, J. Chrom. 255: 137-149 (1983) に記載のように、天然 (native) アクリルアミドゲル電気泳動または陰イオン交換HPLC によって実施する。合成オリゴヌクレオチドの配列は、Maxam & Gilbert, Methods in Enzymology 65: 499-560 (1980) に記載の化学的分解法を用いて確認できる。
【００６４】
別の方法において、完全長セルラーゼ遺伝子のコード領域をそのまま維持しながら所望の切断点に終止コドンを挿入することが好ましいであろう。例えばポリペプチドを切断し得る終止コドンを挿入するために、所定の核酸配列に変異をもたらす多くの方法がある。そのような周知の方法として、特定部位の突然変異誘発、縮退オリゴヌクレオチド(degenerate oligonucleotide) を用いたPCR 増幅、変性剤または放射線への核酸含有細胞の暴露、所望のオリゴヌクレオチドの化学合成（例えば大きな核酸を作成するために連結および／またはクローニングと併せて）ならびに他の周知技術が挙げられる。Giliman & Smith, Gene 8: 81-97 (1979) ；Roberts, et al., Nature 328: 731-734 (1987) ；Sambrook ；and Ausubel を参照。
【００６５】
本発明は、切断セルラーゼに加えて、完全長および切断セルラーゼの他の誘導体を含む。そのような誘導体は、例えばアミノ酸置換、非天然アミノ酸による置換、D −アミノ酸による置換または付加、ならびに別の基との結合を含む。終止コドンの挿入のために上述した方法に類似の方法で実施し得るアミノ酸置換を除いて、非天然アミノ酸による置換および他の基との結合は化学的に行うべきである。タンパク質の化学的修飾技術は、当業界で周知であり、かつ例えばCHEMISTRY AND BIOCHEMISTRY OF AMINO ACIDS, PEPTIDES, AND PROTEINS, B. Weinstein, (ed.), Maecel Dekker, New York, p.267 (1983) において見ることができる。
【００６６】
本発明のセルラーゼの同定
本発明は、図1 に記載のアミノ酸配列( 配列番号1) 、その断片、または50％ 以上の配列同一性、好ましくは70％ 以上の配列同一性、さらに最も好ましくは90％ 以上の配列同一性を有するそれらの誘導体であるセルラーゼを含む。同様に、本発明は、さらに、図2 に記載のDNA( 配列番号2) 、その断片、または76％ 以上の配列同一性、好ましくは80％ 以上の配列同一性、さらに最も好ましくは90％ 以上の配列同一性を有するそれらの誘導体を含む。
【００６７】
本発明は、完全長セルラーゼに加えて、完全長セルラーゼの切断形態を提供する。好ましくは、切断セルラーゼは、配列番号1 のアミノ酸位置31 からアミノ酸位置261 または264 によって表されるアミノ酸配列を有し、あるいは50％ 以上の配列同一性、好ましくは70％ 以上の配列同一性、さらに最も好ましくは90％ 以上の配列同一性を有するそのような配列の誘導体である。同様に、本発明はさらに、切断セルラーゼまたはその誘導体をコードするDNA であって、図2 に示すDNA 配列( 配列番号2) または76％ 以上の配列同一性、好ましくは80％ 以上の配列同一性、さらに最も好ましくは90％ 以上の配列同一性を有するその誘導体に対応するDNA を含む。好ましくは、そのDNA 配列は、配列番号2 の位置93 で開始し、かつ位置783 または792 まで包括的に伸長するヌクレオチドを含む。
【００６８】
好ましい実施形態において、所定のDNA 断片または遺伝子が、この中に記載のセルラーゼDNA 配列に相当するか否か、および従って本発明の範囲内であるか否かを分析するために、ハイブリダイゼーション法を用いる。ハイブリダイゼーション法は、本質的に以下の通りである：例えばEcoR I 、Hind III 、Bam HI 、Cla I 、Kpn I 、Mlu I 、Spe I 、Bgl II 、Nco I 、Xba I 、Xho I 、およびXma I （New England Biolabs, Inc., Beverly, MA and Boehringer Mannheim から購入）等の適切な制限酵素を用いて、その取扱い説明書に従って消化することによって、特定の標的供給源由来のゲノムDNA を断片化する。次に、サイズによるDNA 断片の分離を可視化し得るように、アガロースゲル( 例えば0.8％ アガロース) を用いた電気泳動で試料を流した。通常、臭化エチジウム染色によってDNA 断片を可視化する。ゲルを蒸留水で軽く洗浄し、さらに続いて適切な溶液（例えば0.25M HCl のような）中において穏やかに振とうして脱プリン化し、その後（例えば0.4M NaOH 中において）30 分間、穏やかに振とうして変性させる。ゲルを1.5M NaCl 、1M Tris 、pH7.0 の溶液中に入れて30 分間穏やかに振とうする再生処理が含まれるであろう。次に、トランスファー溶液（例えば6x SSC(900mM NaCl, 90mM クエン酸3 ナトリウム) ）を用いて、例えば最強ニトランプラス膜(Maxmum Strength Nytran Plus membrane)(Schleicher & Schuell, Keene, N.H.) のような適切な正荷電膜上にDNA を転写させる。転写が完了するとすぐに（通常約2 時間後）、例えば2x SSC(2x SSC=300mM NaCl, 30mM クエン酸3 ナトリウム) 中で膜を洗浄し、さらに室温で風乾させる。次に、適切なプレハイブリダイゼーション溶液（例えば100mL 当たりホルムアミド20-50mL 、20x SSPE(1x SSPE=0.18M NaCl, 1mM EDTA, 10mM NaH2PO4, pH7.7) 25mL 、20％SDS 2.5mL 、および10mg/ml の剪断したニシン精子DNA 1mL を含有する水溶液）中において、その膜上でプレハイブリッド形成させる（約2 時間以上）。当業者に公知であるように、プレハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミドの量は、日常的な方法に従って得られる反応の性質に基づき変化し得る。従って、より少ない量のホルムアミドを用いると、ハイブリッド形成した分子を同定する点において、より多くの量のホルムアミドを用いた同じ方法よりもより完全なハイブリダイゼーションを達成することができる。一方、より多くのホルムアミドを用いると、強いハイブリダイゼーションバンドを視覚によってより容易に同定できる。
【００６９】
図2 の配列から選択した通常100 から1000 塩基の範囲の長さのDNA プローブは、アガロースゲルでの電気泳動によって単離し、そのゲルから断片を切り出し、さらに切り出したアガロースから回収しなければならない。さらに詳細な方法はSambrook を参照。次に、そのDNA の精製断片を標識し（例えば、Megaprime labeling system を用いて、その取扱い説明に従って）、32P をDNA に取り込ませる。95 ℃で5 分間加熱することによって標識プローブを変性させ、その後すぐに膜の入ったプレハイブリダイゼーション溶液に添加する。ハイブリダイゼーション反応は、例えば37 ℃で18 時間穏やかに振とうしまたは回転させる等、適切な条件下において、適切な時間進めなければならない。膜をすすぎ（例えば2x SSC/0.3％SDS 中において）、さらに適切な洗浄液中において穏やかに攪拌して洗浄する。所望の厳格性(stringency) は、膜（フィルター）を洗浄する条件を反映するであろう。
【００７０】
具体的には、所定の反応の厳格性（すなわちハイブリダイゼーションの成功のために必要な相同性の割合）は、ハイブリダイゼーション後におけるフィルターの洗浄条件に依存するであろう。この中で定義されている「低い厳格性」条件は、20 ℃で15 分間、0.2x SSC/0.1％ SDS を用いてフィルターを洗浄することを含む。「高い厳格性」条件は、二回目に37 ℃で30 分間、0.2x SSC/0.1％ SDS を用いてフィルターを洗浄することを含む更なる洗浄処理を含む。
【００７１】
洗浄後、膜を乾燥させ、さらに結合したプローブを検出する。標識試薬として32P または別の放射性同位体を用いる場合は、オートラジオグラフィーによって結合したプローブを検出できる。他のプローブの可視化のための他の技術は、当業者に周知である。結合したプローブの検出は、核酸配列が所望の相同性を有し、および従って配列番号2 に対する同一性を有し、さらには本発明の範囲に含まれることを示唆する。
【００７２】
本発明のセルラーゼタンパク質および誘導体は、物理化学的または機能的の何れか、ならびに好ましくは両方について特徴付けできる。物理化学的特徴付けは：タンパク質の分子量を特定するためのSDS 電気泳動、ゲル濾過、アミノ酸組成分析、質量分析、および沈降；タンパク質のpI （等電点）を特定するための等電点電気泳動；タンパク質のアミノ酸配列を特定するためのアミノ酸配列決定；タンパク質の三次構造を特定するための結晶解析；ならびにタンパク質に存在する抗原エピトープを特定するための抗体結合：のような当業界における周知技術を駆使して行う。
【００７３】
機能的特徴付けは、セルラーゼの分野の熟練者に周知の技術によって特定され、結晶性カルボキシメチルセルロース(CMC) の加水分解を含むが、それに限定はされない。機能的特徴付けのためのその好ましい技術は、後述の実施例5 においてさらに詳細に記載している。
【００７４】
上に挙げた技術のいくつかを用いて、本発明の完全長セルラーゼが、SDS −PAGE で測定すると、分子量約30 から40 ｋD であり、好ましくは34 ｋD から約38kD であり、さらに最も好ましくは36 ｋD であることを見出した。完全長セルラーゼは、計算された等電点が約4 から約5 であり、好ましくは4.5 であり、かつCMC でのpH 最適条件が温度に依存して約5 から約10 であることを見出した。pH 最適条件は、40 ℃では8 であり、かつ60 ℃では7 であることを見出した。本発明の切断セルラーゼは、分子量が20 から30kD の範囲であり、好ましくは約23 から26kD の範囲であり、さらに最も好ましくは24 から25kD の範囲であることを見出した。
【００７５】
本発明のセルラーゼの使用
本発明に基づく織物の加工は、本発明のセルラーゼを含む組成物を用いた織物処理または洗濯を含む。そのような加工として：ストーンウォッシュ；セルロース含有織物の織目、感触および／または外観の改善；またはセルロース含有織物の製造または洗濯／再生の間に用いられる他の技術：が挙げられるが、それらに限定はされない。従って、本発明の背景にある加工とは、セルロース製の織物または繊維から、「未熟な(immature) 」または「だめになった(dead) 」綿を除去することを意味する。未熟な綿は、成熟した綿よりも顕著にまとまりが無く、例えば染色むらのせいで生じる。さらに、本発明は、染みがついたセルロース含有織物製品を洗濯するのに用いるセルラーゼ成分を含む組成物を考えている。例えば、本発明のセルラーゼは、洗濯用の洗剤組成物において用いることができる。本発明に基いて有用である洗剤組成物は、前洗い用洗剤、浸置き用洗剤、および家庭で用いる色再生用組成物のような調製品を含む。この中に記載されているような加工用組成物は、希釈を必要とする濃縮した形態、あるいは希釈液の形態またはセルロース含有織物に直接用いることができる形態であって差し支えない。セルラーゼの織物加工のための一般的な加工技術は、例えば欧州特許出願公開第220016 号、ならびに英国特許出願第1,368,599 号および台2,095,275 号に記載されている。
【００７６】
本発明に基づくセルロース製物質の加工は、さらに、当業界で公知である目的のために、動物飼料、パルプおよび／または紙、食物、および穀物を加工することを含む。例えば、セルラーゼは、動物飼料の価値を高め、木材パルプの乾燥性を改善し、食品を強化し、さらに穀物の湿式製粉工程または乾式製粉工程の間に穀物中の繊維を減らすことが知られている。
【００７７】
本発明に基づく加工は、効果量のセルラーゼ、またはセルラーゼと例えば緩衝剤、界面活性剤、および／または精練剤等の他の最適成分との組合せを含有する水溶液を調製することを含む。セルラーゼ酵素組成物の効果量は、その意図する目的のために十分なセルラーゼの濃度である。従って、例えば、本発明に基づくストーンウォッシュ用の組成物におけるセルラーゼの「効果量」は、例えば縫い目およびはぎ布に着古したおよび色あせた外観をもたらすため等に所望の効果を提供するような量である。同様に、セルラーゼ含有織物の感触および／または外観を改善することを意図する組成物におけるセルラーゼの「効果量」は、例えば織物の滑らかさを改善するような感触における適度の改善、または例えば織物の外観における鮮明さを下げる傾向がある毛玉および小繊維を除去するような外観における適度の改善をもたらす量である。また、用いるセルラーゼの量は、用いる装置、用いる工程のパラメーター（セルラーゼ処理溶液の温度、セルラーゼ溶液に曝す時間等）、ならびにセルラーゼ活性（例えばより活性が低いセルラーゼ組成物と比較して、より活性が高いセルラーゼ組成物を用いた場合には、より低いセルラーゼ濃度が要求されるであろう）に依存する。加工すべき織物を加える加工用水溶液中の正確なセルラーゼ濃度は、上記因子ならびに所望の結果に基づき、当業者熟練者が容易に特定できる。ストーンウォッシュの工程において、加工用水溶液中、通常、セルラーゼは約0.5 から5,000ppm 全タンパク質の濃度、さらに最も好ましくは約10 から200ppm 全タンパク質の濃度で存在することが好ましい。セルラーゼ含有織物の感触および／または外観の改善のための組成物では、加工用水溶液中、通常、セルラーゼは約0.1 から2,000ppm 全タンパク質の濃度、さらに最も好ましくは約0.5 から200ppm 全タンパク質の濃度で存在することが望ましい。
【００７８】
加工の好ましい実施形態において、緩衝液の濃度が、用いるセルラーゼが活性を示す範囲内に溶液のpH を維持するのに十分であるように、加工用組成物において緩衝液を用いる。セルラーゼが活性を示すpH は、用いるセルラーゼの特性に依存する。用いる緩衝液の正確な濃度は、熟練者が容易に考慮し得るいくつかの因子に依存するであろう。例えば、好ましい実施形態において、緩衝液ならびに緩衝液の濃度は、最終セルラーゼ溶液のpH を最適セルラーゼ活性に必要なpH 範囲内に維持するように選択する。本発明のセルラーゼの最適pH 範囲の特定は、周知技術に基づいて確かめることができる。
【００７９】
セルラーゼおよび緩衝液に加えて、加工用組成物は、必要に応じて界面活性剤を含んでいて差し支えない。適切な界面活性剤として、例えば陰イオン性、非イオン性、および両性界面活性剤等の、用いるセルラーゼおよび織物と相性の良い任意の界面活性剤が挙げられる。適切な陰イオン性界面活性剤として：直鎖または分枝のアルキルベンゼンスルホン酸塩；直鎖または分枝アルキル基またはアルケニル基を有するアルキルまたはアルケニルエーテル硫酸塩；アルキルまたはアルケニル硫酸塩；オレフィンスルホン酸塩；アルカンスルホン酸塩等：が挙げられるが、それらに限定はされない。陰イオン性界面活性剤のための適切な対イオンとして：ナトリウムおよびカリウムのようなアルカリ金属イオン；カルシウムおよびマグネシウムイオンのようなアルカリ土類金属イオン；アンモニウムイオン；ならびに炭素数2 または3 のアルカノール基を1 から3 つ有するアルカノールアミン：が挙げられるが、それらに限定はされない。両性界面活性剤として、例えばスルホン酸第4 級アンモニウム塩、およびベタイン型両性界面活性剤が挙げられる。そのような両性界面活性剤は、同じ分子内に正および負電荷の両方の基を有する。非イオン性界面活性剤は通常、ポリオキシアルキレンエーテル、およびそれらの高級脂肪酸アルカノールアミドまたはアルキレンオキシド付加物、ならびに脂肪酸グリセリンモノエステルを含む。当業者に公知の方法において、界面活性剤の混合物を用いても差し支えない。
【００８０】
この中に記載の方法での使用のために濃縮セルラーゼ組成物を調製しても差し支えない。そのような濃縮物は、好ましくは水溶液中に、濃縮された量の上記セルラーゼ組成物、緩衝剤、および界面活性剤を含有する。そのように形成した場合、各成分の必要濃度を有するセルラーゼ調製液を迅速かつ正確に調製するために、セルラーゼ濃縮物を水で容易に希釈することができる。濃縮水溶液を形成した場合、上記のように、セルラーゼ溶液中の成分が必要濃度になるようにそれら濃縮液を希釈することができる。そのようなセルラーゼ濃縮物が、セルラーゼ溶液の容易な調製を可能とし、かつ用いる場所にその組成物を便利に運ぶことを可能とすることは容易に理解できる。加工用濃縮物は、例えば液体、エマルジョン、ゲル、またはペーストのような任意の当業界で公認の形態であって差し支えない。そのような形態は、当業者に周知である。
【００８１】
固形のセルラーゼ濃縮物を用いる場合、そのセルラーゼ組成物は、顆粒、粉末、塊、または固い円盤状の形態(solid disk) であって差し支えない。顆粒は、洗浄液(wash medium) への顆粒の溶解速度を下げるような物質を含むように形成しても差し支えない。そのような物質および顆粒については、引例によってその全体がこの中に組み込まれている米国特許第5,254,283 号に開示されている。
【００８２】
また、要望通りに、組成物の最終的な用途に基づいて石、軽石、充填剤、溶剤、酵素活性化剤、および再付着防止剤(anti-redeposition agents) 等の他の物質を本発明のセルラーゼ組成物と共に用いてもよく、あるいはその組成物中に含めても差し支えない。
【００８３】
実施例によって、ストーンウォッシュの方法が詳細に記載されているが、記載のパラメーターは、他の用途、すなわち織物の感触および／外観の改善のため等のために当業者が容易に変更できる。加工用組成物をストーンウォッシュ組成物と混ぜ、さらにセルラーゼ酵素を織物に接近させることによって、セルロース含有織物を効果量のセルラーゼを含有するセルラーゼ含有ストーンウォッシュ組成物と接触させる。続いて、セルラーゼを含む水溶液と織物をかき混ぜる。加工用組成物が水溶液である場合は、繊維を直接その溶液中に浸すことができる。同様に、ストーンウォッシュ組成物が濃縮物である場合は、セルロース含有織物の入った浴槽でその濃縮物を希釈する。ストーンウォッシュ組成物が例えば前洗い用ゲルまたは固形棒のような固形である場合は、その組成物を直接織物または洗浄液に加えることによって、そのストーンウォッシュ組成物を接触させることができる。
【００８４】
その酵素作用によってセルロース含有織物にストーンウォッシュした外観を与えるのに効果的な条件下において、セルロース含有織物をストーンウォッシュ組成物と共にインキュベートする。例えば、ストーンウォッシュの間、pH 、液体比、温度および反応時間は、ストーンショッシュ組成物が作用する条件を最適化するように調整することができる。「効果的な条件」とは、必然的に、セルラーゼ酵素がセルロース含有織物と効果的に反応できるような、すなわちこの場合にはストーンウォッシュ効果が得られるようなpH 、液体比、および温度を称する。本発明に基づくストーンウォッシュ組成物を用いるための条件を最適化することは、慣用技術の範囲内である。
【００８５】
この中で用いられるストーンウォッシュにおける液体比、すなわち織物の重量に対するストーンウォッシュ組成物溶液（すなわち洗浄液）の重量の比は、通常、デニムの織物において所望のストーンウォッシュ効果を得るのに十分な量であり、用いる工程に依存する。好ましくは、液体比は：約4 ：1 から約50 ：1 であり；より好ましくは約5 ：1 から約20 ：1 であり；さらに最も好ましくは約10 ：1 から約15 ：1 である。
【００８６】
本ストーンウォッシュ組成物を用いたストーンウォッシュの間の反応温度は、2 つの競合する因子によって制御される。第一に、高い温度は通常、反応速度を高め、すなわち反応を速くし、より低い温度で必要とされる反応時間よりも反応時間を短くする。従って、反応温度は通常、約10 ℃以上である。第二に、セルラーゼは、所定の反応温度を超えると活性を失うタンパク質であり、その温度は用いるセルラーゼの特性に依存する。従って、反応温度を過度に高くすると、セルラーゼ変性の結果としてセルロース分解活性を失う。セルラーゼ使用のための標準温度は通常、35 ℃から65 ℃であり、かつそれら条件は本発明のセルラーゼにも適していると予想するが、周知技術に基づいて、用いる特定のセルラーゼに関して最適温度条件を確かめるべきであろう。
【００８７】
反応時間は、ストーンウォッシュを行う特定の条件に依存する。例えば、pH 、温度、およびセルラーゼの濃度は、何れも最適反応時間に影響を及ぼすであろう。通常、反応時間は、約5 分から約5 時間であり、好ましくは約10 分から約3 時間であり、さらに好ましくは約20 分から約1 時間である。
【００８８】
本発明のさらに別の好ましい実施形態において、本発明のセルラーゼを洗剤組成物中において用いることができる。本発明に基づく洗剤組成物は、前洗い用組成物、浸置き用組成物として、または通常の洗浄またはすすぎサイクルによる洗濯のために有用である。好ましくは、本発明の洗剤組成物は、効果量のセルラーゼ、および界面活性剤を含み、さらに必要に応じて、下記の他の成分を含む。
【００８９】
本発明の洗剤組成物中において用いるセルラーゼの効果量は、例えば毛玉除去、柔軟化、毛玉防止、表面繊維除去、灰色化の防止(anti-graying) 、および洗浄のような、セルラーゼによるセルロース含有織物に対する所望の効果をもたらすのに十分な量である。好ましくは、洗剤組成物中のセルラーゼは、洗剤の約10ppm から約20,000ppm の濃度で使用する。
【００９０】
洗剤組成物中において用いるセルラーゼ酵素の濃度は、好ましくは、洗浄液への希釈に基づき、セルラーゼ酵素の濃度が約0.01 から約1,000ppm 全タンパク質の範囲、好ましくは約0.02ppm から約500ppm 全タンパク質の範囲、さらに最も好ましくは約0.5ppm から約250ppm 全タンパク質になるように選択する。洗剤組成物中において用いるセルラーゼ酵素の量は、洗浄溶液を形成するために水に添加してその洗剤を希釈する程度に依存するであろう。
【００９１】
本発明の洗剤組成物は、例えば、液体、顆粒、エマルジョン、ゲル、またはペーストのような任意の当業界で公認の形態であって差し支えない。そのような形態は、熟練者に周知である。固形洗剤組成物を用いる場合、好ましくは顆粒としてセルラーゼを形成する。好ましくは、セルラーゼ保護剤を付加的に含むように顆粒を形成することができる。洗浄液への顆粒の溶解速度を下げるような物質を含むように顆粒を形成しても差し支えない。そのような物質および顆粒については、引例によってその全体がこの中に組み込まれている米国特許第5,254,283 号に開示されている。
【００９２】
本発明の洗剤組成物は、界面活性剤、すなわち洗剤組成物での使用が周知である陰イオン性、および両性界面活性剤等の界面活性剤を用いる。
【００９３】
本発明の洗剤組成物において用いるための適切な陰イオン性界面活性剤として：直鎖または分枝アルキルベンゼンスルホン酸塩；直鎖または分枝アルキル基またはアルケニル基を有するアルキルまたはアルケニルエーテル硫酸塩；アルキルまたはアルケニル硫酸塩；オレフィンスルホン酸塩；アルカンスルホン酸塩等：が挙げられる。陰イオン性界面活性剤のための適切な対イオンとして：ナトリウムおよびカリウムのようなアルカリ金属イオン；カルシウムおよびマグネシウム；ならびに炭素数2 または3 のアルカノール基を1 から3 つ有するアルカノールアミン：が挙げられる。両性界面活性剤として、スルホン酸第4 級アンモニウム塩、およびベタイン型両性界面活性剤が挙げられる。そのような両性界面活性剤は、同じ分子内に正および負電荷の両方の基を有する。非イオン性界面活性剤は通常、ポリオキシアルキレンエーテル、およびそれらの高級脂肪酸アルカノールアミドまたはアルキレンオキシド付加物、ならびに脂肪酸グリセリンモノエステル等を含む。そのような界面活性剤の混合物を用いても差し支えない。界面活性剤または界面活性剤の混合物は、本発明の洗剤組成物において通常、全洗剤組成物の約1 重量％ から約95 重量％ 、好ましくは全洗剤組成物の約5 重量％ から約45 重量％ の量で使用する。セルラーゼ組成物および界面活性剤に加えて、本発明の洗剤組成物は、必要に応じて、1 つ以上の以下の成分を含んでいて差し支えない。
【００９４】
セルラーゼ以外の加水分解酵素
適切な加水分解酵素として、エステル結合に作用する、カルボン酸エステル加水分解酵素、チオエステル加水分解酵素、リン酸モノエステル加水分解酵素、およびリン酸ジエステル加水分解酵素；グリコシル化合物に作用するグリコシド加水分解酵素；N −グリコシル化合物を加水分解する酵素；エーテル結合に作用するチオエーテル加水分解酵素；ならびにペプチド結合に作用するアミノ−アシル−ペプチド加水分解酵素、ペプチジル−アミノ酸加水分解酵素、アシル−アミノ酸加水分解酵素、ジペプチド加水分解酵素、およびペプチジル−ペプチド加水分解酵素が挙げられる。それらの中で好ましいのは、カルボン酸エステル加水分解酵素、グリコシド加水分解酵素、およびペプチジル−ペプチド加水分解酵素である。適切な加水分解酵素として、（1 ）ペプシン、ペプシンB 、レンニン、トリプシン、キモトリプシンA 、キモトリプシンB 、エラスターゼ、エンテロキナーゼ、カテプシンC 、パパイン、キモパパイン、フィシン、トロンビン、フィブリノリシン、レニン、ズブチリシン、アスペルギルスペプチダーゼ(aspergillopeptidase)A 、コラゲナーゼ、クロストリジウムペプチダーゼ(clostridiopetidase)B 、カリクレイン、ガストリシン、カテプシンD. 、ブロメリン、ケラチナーゼ、キモトリプシンC 、ペプシンC 、アスペルギルスペプチダーゼB 、ウロキナーゼ、カルボキシペプチダーゼA およびB 、ならびにアミノペプチダーゼのようなペプチジル−ペプチド加水分解酵素に属するプロテアーゼ；（2 ）α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、転換酵素、リゾチーム、ペクチナーゼ、キチナーゼ、およびデキストラナーゼのようなグリコシド加水分解酵素（本質的な構成要素であるセルラーゼはこのグループから除かれる）が挙げられる。それらの中でα−アミラーゼおよびβ−アミラーゼが好ましい。それら酵素は、酸性から中性の系で機能するが、細菌から得られた酵素は、アルカリ系で高い活性を示す；（3 ）カルボキシルエステラーゼ、リパーゼ、ペクチンエステラーゼ、およびクロロフィラーゼを含むカルボン酸エステル加水分解酵素。それらの中でリパーゼが特に効果的である。
【００９５】
セルラーゼ以外の加水分解酵素は、その目的に従って要求される量だけ洗剤組成物中に加える。好ましくは、精製タンパク質に関して、0.001 から5 重量％ 、さらにより好ましくは0.02 から3 重量％ の量で加えるべきである。本酵素は、単独で、あるいは洗剤組成物中の他の成分と組み合わせて、精製していない酵素から成る顆粒の形態で用いるべきである。精製していない酵素の顆粒は、その顆粒中の精製酵素が0.001 から50 重量％ となるような量で用いる。その顆粒は、0.002 から20 重量％ 、好ましくは0.1 から10 重量％ の量で用いる。セルラーゼを用いる場合と同様に、それら顆粒は、酵素保護剤および溶解遅延物質(dissolution retardant material) を含むように形成して差し支えない。
【００９６】
陽イオン性界面活性剤および長鎖脂肪酸塩
そのような陽イオン性界面活性剤および長鎖脂肪酸塩として、飽和または不飽和脂肪酸塩、アルキルまたはアルケニルエステルカルボン酸塩、3 から4 つのアルキル置換基および1 つまでのフェニル置換アルキル置換基を有するものを含むα−第4 級アンモニウム塩が挙げられる。適切な陽イオン性界面活性剤および長鎖脂肪酸塩は、英国特許出願第2 094 826 A 号に開示されており、その公報は引例によってこの中に組み込まれている。組成物は、約1 から20 重量％ のそのような陽イオン性界面活性剤および長鎖脂肪酸塩を含んでいて差し支えない。
【００９７】
ビルダー
Ａ． 2 価の金属イオン封鎖剤
組成物は、以下の化合物：リン酸塩、ホスホン酸塩、ホスホノカルボン酸塩、アミノ酸塩、アミノポリアセテート高分子電解質、非解離性高分子、ジカルボン酸塩、およびアルミノケイ酸塩：のアルカリ金属塩およびアルカノールアミン塩より成る群から選択した1 つ以上のビルダー成分を約0 から約50 重量％ の量で含んでいて差し支えない。適切な2 価の金属イオン封鎖剤は、英国特許出願第2 094 826 A 号に開示されており、その公報は引例によってこの中に組み込まれている。
【００９８】
Ｂ．アルカリまたは無機電解質
組成物は、アルカリまたは無機電解質として、1 つ以上の以下の化合物：ケイ酸塩、カルボン酸塩、ならびにトリエタノールアミン、ジエタノールアミン、モノエタノールアミンおよびトリイソプロパノールアミンのような有機アルカリ：のアルカリ金属塩をその組成物の約1 から約50 重量％ 、好ましくは約5 から約30 重量％ の量で含んでいて差し支えない。
【００９９】
再付着防止剤
組成物は、再付着防止剤として、1 つ以上の以下の化合物：ポリチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、およびカルボキシメチルセルロース：を約0.1 から約5 重量％ の量で含んでいて差し支えない。
【０１００】
それらの中で、カルボキシメチルセルロースおよび／またはポリエチレングリコールと本発明のセルラーゼ組成物の組合せは、特に有用な汚れ除去組成物を提供する。
【０１０１】
漂白剤
モノ過硫酸カリウム、過炭酸ナトリウム、過ホウ酸ナトリウム、硫酸ナトリウム／過酸化水素付加物、および塩化ナトリウム／過酸化水素付加物のような漂白剤または／およびスルホン化フタロシアニンの亜鉛もしくはアルミニウム塩のような光感受性の漂白色素と組み合わせた本発明のセルラーゼの使用は、洗浄効果をさらに改善する。同様に、欧州特許第684 304 号に記載の漂白剤および漂白触媒を用いることができる。
【０１０２】
青味剤および蛍光色素
もし必要であれば、種々の青味剤および蛍光色素を組成物中に加えても差し支えない。適切な青味剤および蛍光色素は、英国特許出願第2 194 826 A に開示されており、その公報は引例によってこの中に組み込まれている。
【０１０３】
粘結阻害剤 (caking inhibitors)
以下の粘結阻害剤：p −トルエンスルホン酸塩、キシレンスルホン酸塩、酢酸塩、スルホコハク酸塩、タルク、細かく粉砕したシリカ、アモルファスシリカ、粘土、ケイ酸カルシウム（Micro-Cell of Johns Manville Co. のような）、カルボン酸カルシウム、およびマグネシウムオキシド：を粉末洗剤に加えて差し支えない。
【０１０４】
酸化防止剤
酸化防止剤として、例えばtert −ブチル−ヒドロキシトルエン、4,4 ’−ブチリデンビス(6 −tert −ブチル−3 −メチルフェノール) 、2,2 ’−ブチリデンビス(6 −tert −ブチル−4 −メチルフェノール) 、モノスチレン化クレゾール、モノスチレン化フェノール、ジスチレン化フェノール、および1,1 −ビス(4 −ヒドロキシ−フェニル) シクロヘキサンが挙げられる。
【０１０５】
可溶化剤
可溶化剤として、例えばエタノールのような低級アルコール、ベンゼンスルホン酸塩、p −トルエンスルホン酸塩のような低級アルキルベンゼンスルホン酸塩、プロピレングリコールのようなグリコール、アセチルベンゼン−スルホン酸塩、アセトアミド、ピリジンジカルボン酸アミド、安息香酸塩、および尿素が挙げられる。
【０１０６】
本発明の洗剤組成物は、酸性からアルカリ性にわたる広いpH 範囲で用いることができる。好ましい実施形態において、本発明の洗剤組成物は、約5 から約12 以下の範囲のpH を有するわずかに酸性、中性、またはアルカリ性の洗剤の洗浄液中で用いることができる。
【０１０７】
もし望むのであれば、上記成分の他に、香料、緩衝剤、防腐剤、色素等を本発明の洗剤組成物と共に用いることができる。そのような成分は、等業界で用いられている量で普通に用いる。
【０１０８】
本発明において用いる洗剤基材(detergent base) が粉末の形態である場合、スプレー−乾燥法および造粒法等の任意の公知の調製法によって調製される基材であって差し支えない。特に、スプレー−乾燥法、凝集法、乾燥混合法、または非タワールート (non-tower route) 法によって得られる洗剤基材が好ましい。スプレー−乾燥法によって得られる洗剤基材は、調製条件に関して限定されない。スプレー−乾燥法によって得られる洗剤基材は、界面活性剤およびビルダーのような熱耐性成分の懸濁水溶液を熱い空間にスプレーすることによって得られる中空顆粒(hollow granules) である。スプレー−乾燥の後、香料、酵素、漂白剤、無機アルカリビルダーを加えて差し支えない。スプレー−乾燥−造粒または凝集法によって得られた非常に濃厚な顆粒状の洗剤基材と共に、種々の成分をその基材の調製後に加えても差し支えない。
【０１０９】
洗剤基材が液体である場合は、その液体は、均一溶液または不均一な分散液のいずれであっても差し支えない。洗剤中のセルラーゼによるカルボキシメチルセルロースの分解を防ぐために、組成物中に加える前に、カルボキシメチルセルロースを造粒し、または被覆するのが望ましい。
【０１１０】
工業的および家庭用の用途において、それらの環境で普通用いられている温度、反応時間、および液体比で、例えば汚れた織物のようなセルロース含有織物と共に本発明の洗剤組成物をインキュベートすることができる。
【０１１１】
さらに、本発明に基づく洗剤は、柔軟化、毛玉除去、毛玉防止、表面繊維除去、または洗浄に所望の改善をもたらすのに十分な活性が存在するような中間的pH の適切な溶液中における前洗い用洗剤として調製しても差し支えない。洗剤組成物が、液体、スプレー、ゲル、またはペースト状である浸置き用( 例えば前洗い用または前処理用) 組成物である場合、セルラーゼ酵素は、通常、浸置き用または前処理用組成物の全重量の約0.0001 から約1 重量％ の範囲で用いる。そのような組成物中において、必要に応じて界面活性剤を用いて差し支えなく、用いる場合は、通常、浸置き用組成物の全重量の約0.005 から約20 重量％ の範囲の濃度で含む。組成物の残りは、浸置き用洗剤において普通用いられている成分、すなわち希釈剤、緩衝剤、他の酵素（プロテアーゼ）等をそれらの普通の濃度で含有する。
【０１１２】
この中に記載のセルラーゼ酵素を含有する組成物は、色あせた織物の色の再生（例えば、引例によってその全体がこの中に組み込まれている米国特許第4,738,682 号を参照）に適した単独の組成物として家庭用に使用でき、ならびに染み抜きおよび毛玉除去や毛玉防止のために使用することができる。
【０１１３】
本発明に基づくセルラーゼの使用は、特に、飼料添加物ならびにパルプおよび紙の加工において有用である。それら付加的な産業上の利用は、それぞれ、例えば国際特許出願公開第95/16360 およびフィンランド特許第87372 号に記載されている。
【０１１４】
さらに本発明およびその利点を説明するために、以下の特定の実施例を示すが、
本発明を例示するために提示するものであり、何ら本発明の範囲を限定するものとみなしてはならないことを理解すべきである。
【０１１５】
実施例
実施例 1
アルカリ性土壌および水の試料からのセルラーゼ産生微生物の単離
アルカリ性泥の試料を4％(w/v)NaCl, 1％(w/v)Na2CO3 液5mL 中に懸濁させ、さらに力強く振る。同じ溶液での連続希釈液を50 μg/mL リファンピシン含有土壌抽出寒天(pH10) 上にのせた。
【０１１６】
土壌抽出寒天は、以下のように調製した：庭の土壌1Kg を脱塩水1L 中に懸濁させた。その懸濁液を1 ２0 ℃で20 分間オートクレーブ処理した。その懸濁液をガラス繊維フィルター(Whatman, GF/A) で濾過し、さらに残った固形物を脱塩水で2 回洗浄した(1x200mL, 1x100mL) 。濾液を水で1L に合わせる。固化のために2％(w/v) 寒天を添加した8％(w/v)NaCl, 2％(w/v)NaCO3 の滅菌溶液と等容量の滅菌濾液を混合した。
【０１１７】
蒸発を避けるために密閉箱において30 ℃で数週間プレートをインキュベートした。プレートを実体顕微鏡で定期的に観察し、さらに微小コロニーを0.3％(w/v) カルボキシメチルセルロース含有アルカリ性寒天に移した。セルラーゼ活性を検出するために二重(duplicate) で培養菌を用いた。プレートを二重で0.1％(w/v) コンゴレッドに15 分間浸し、さらに1M NaCl で30 分間染みを除く。コロニーの周りの除去地帯(cleaning zone) を表す細胞株を可能性のあるセルラーゼ産生微生物として選択した。
【０１１８】
国際特許出願公開第WO96/34108 号に記載のように、除去地帯を示す菌株を25 ｍL 中で発酵させ、その後CMC を添加した。
【０１１９】
上記の方法を用いて、本発明に基づくセルラーゼを産生した菌株を単離し、さらに糸状菌として特徴づけした。外観および部分的な16s rRNA 遺伝子配列分析( 実施例4) に基づき、その微生物をストレプトミセス種として分類した。
【０１２０】
セルラーゼ産生菌株の形態学的検査を行った。PH10 の土壌抽出寒天上で培養した場合、最初の小さな丸いキラキラ光る透明なコロニーが数日後には白から灰−白色の気性菌糸体(aerial mycelium) に発達する。アルカリ性寒天上では、その菌株は、成熟すると気性菌糸体を産生する乾燥して固いクリーム色の不透明なコロニーを形成する。顕微鏡下において、その菌株は、不規則な長さに寸断し、芽胞、および鎖内の芽胞を孤立させているような広範囲に分枝した偽似菌糸体を表す。
【０１２１】
実施例 2
DNA の単離、セルラーゼの形質転換および発現
実施例1 に基づき単離した好アルカリ性放線菌をE. coli. での発現クローニングのための供与菌株として選択した。Saito & Miura, Biochim. Biophys. Acta., 72: 619-629 (1963) に記載の方法に基づき、染色体DNA を単離した。
【０１２２】
単離した染色体DNA は、供給業者推薦の条件下において、制限酵素Sau3A の連続希釈した酵素溶液を用いて、反応緩衝液(Gibco BRL Life Technologies, Gaithersburg, Md., USA) 中、37 ℃で１時間、部分的に消化した。消化したDNA をアガロースゲル電気泳動によって分画し、さらに供給業者(QIAGEN Inc., Chatsworth, CA, USA) 記載のプロトコールに基づきQIAquick ゲル抽出キットを用いて、適切な断片(2 −6kb) をゲルから単離した。
【０１２３】
アルカリ耐性放線菌株のゲノム遺伝子ライブラリーをpUC19 派生プラスミド中に構築した(Yanisch-Perron, C. et al., Gene 33: 103 (1985)) 。Wood, et al., Meth. Enzym., 160: 59-74 (1988)2 記載のように、寒天ゲル拡散法によって組換えクローンをスクリーニングした。コロニーの周りの除去地帯を示した菌株を単離した。供給業者(QIAGEN Inc) 記載のプロトコールに基づき、QIAprep プラスミドキットを用いて、セルラーゼ産生組換え体のプラスミドDNA を単離した。公知の保存セルラーゼ配列に対するその配列の類似性が公開データベースでのFASTA 調査によって特定されるまで、両方の末端から3.5kb 断片のヌクレオチド配列を特定した。保存配列の特定に基づき、遺伝子の残りの配列を決定した。
【０１２４】
単離した遺伝子は、27 アミノ酸のシグナル配列を含む371 アミノ酸を有する前駆タンパク質をコードする1173 塩基対を包含する。成熟タンパク質は、推測分子量が35,766 であり、かつ計算したPI が5.9 の344 アミノ酸を包含する。セルラーゼをコードするその遺伝子のヌクレオチド配列( 配列番号1) 、および成熟セルラーゼの推測アミノ酸配列( 配列番号2) を図1 および図2 に示す。
【０１２５】
上記のように調製した構造遺伝子をコードするセルラーゼ遺伝子のDNA 断片をベクターpHPLT 中にクローン化した( 図4 を参照) 。そのベクターは、バシラス・リケニホルミスの耐熱性アミラーゼ遺伝子のプロモーターおよびシグナル配列をすでに含んでおり、さらにバシラス菌において高い発現をもたらすことが見出されている（図5 を参照）。コンピテントバシラス宿主細胞の形質転換を実施することによって、セルラーゼ産生組換えバシラスクローンを単離し、さらにクローン化セルラーゼの産生に適した条件下で培養した。
【０１２６】
近い類縁関係にある系統を特定するために、種々のライブラリーにおける利用可能な配列データ(GeneBank, Swiss-Prot, EMBL and PIR) と比較することによって、36kD セルラーゼのアミノ酸配列をコードする遺伝子を解析した。高い相同性が見出されたのは、アスペルギルス・アキュレアタス(Aspergillus aculeatus) 由来のエンドグルカナーゼI 、セルロモナス・フィミ(Cellulomonas fimi) 由来のエキソセルロビオヒドロラーゼ、およびクロストリジウム・セルロボラン(Clostridium celluloborans) 由来のエンドグルカナーゼC であった。Pearson & Lipman, Proc. Nat. Acad. Sci., 85: 2444-2448 (1988) に記載のTFASTA プログラムを用いると、約36kD のセルラーゼは、アスペルギルス・アキュレアタス由来のエンドグルカナーゼI に対して242 残基が一致し、35.1％ の配列が同一であり、セルロモナス・フィミ由来のエキソセルロビオヒドロラーゼに対して112 残基が一致し、48.2％ の配列が同一であり、さらにクロストリジウム・セルロボラン由来のエンドグルカナーゼに対して114 アミノ酸が一致し、44.7％ の配列が同一であることが示された。TFASTA データ探索プログラムは、配列解析ソフトウエアパッケージバージョン6(Sequence Analysis Software Package Version 6.0)(Genetic Computer Group, Univ. Wisconsin Biotechnology Center, Madison, Wisconsin 53705) において商業的に利用できる。36kD セルラーゼをコードするDNA 配列と公開データベースにおけるDNA 配列との比較によって、最も近い相同物は、ストレプトミセス・ロケイ(Streptomyces rochei) 由来のeglS をコードする遺伝子(823 塩基対が一致し、75.8％ の同一性) およびストレプトミセス・リビダンス由来のcelB をコードする遺伝子(765 塩基対が一致し、74.9％ の同一性) であることが示唆された。
【０１２７】
実施例 3
セルラーゼの精製
実施例2 によって得たセルラーゼ産生バシラス・リケニホルミスクローンは、3％ のトリプトン大豆培養液(Trypton Soya Broth)(Oxoid CM129) および20 μg/mL ネオマイシンを含む複合培地中において培養した。組換えセルルラ−ゼの精製は、以下のように実施した：遠心(8000rpm) によって培養液から発酵培養液を分離する。硫酸アンモニウム(65％ 飽和) を用いて上清中のセルラーゼを沈殿させる。伝導率が7mS/cm になるまでその沈殿物を5mM EDTA 含有25mM リン酸緩衝液(pH7) に溶解させる。その溶液をQ −セファロースFF( 直径5cm 、長さ10cm) 陰イオン交換カラムに添加し、その後、吸光度が0.2AU になるまで5mM EDTA 含有25mM リン酸緩衝液(pH7) でカラムを洗浄する。80 分間に0 から0.5M NaCl(25mM リン酸緩衝液(pH7) 中) の勾配をカラムに加え、その後10 分間に0.5 から1M NaCl の勾配を加えた。最初の勾配で溶出され得る。溶出後、1M NaOH でカラムを洗浄し( 逆流させる) 、さらに5mM EDTA 含有25mM リン酸緩衝液(pH7) で再び平衡化させる。
【０１２８】
実施例 4
セルラーゼ産生放線菌由来の 16S rRNA の特徴付け
実施例1 で単離されたセルラーゼ産生生物の16s rRNA 配列の最初の400bps のヌクレオチド配列が得られ、かつ図6 に示されている( 配列番号3) 。公開データベースにおける配列と比較するために、FASTA 配列解析ソフトウェアパッケージを用いてその配列を解析した。解析結果によって、最も近く類縁関係にあるのは465 塩基対が一致し、95.5％ の16s rRNA 同一性を有するストレプトミセス・サーモベロラシアウス(thermovelolaceous) であることが示唆された。その菌株の部分的16s rRNA 断片の同一性の割合(％) は、その菌株が未知の種の放線菌を表すことを強く示唆する。得られた16s rRNA 配列( 実施例1 における外観と合せて) の解析に基づき、その微生物をストレプトミセス種として分類した。
【０１２９】
実施例 5
本発明に基づくセルラーゼの特性
本発明の約36kD のセルラーゼのpH ／温度特性を特定するため、様々なpH および温度において、CMC 上でセルラーゼ活性を測定した。その測定法は、（全）セルラーゼ活性を特定するための比色分析法であり、基質としてカルボキシメチルセルロース(CMC) を利用する。セルラーゼの検出は、セルラーゼによるセルロースからの還元糖の遊離に基づく。遊離した糖は、高いpH および温度で「PAHBAH 」と反応する。その反応産物を分光光度計で測定した。活性は、グルコースの標準曲線を用いて特定した。
【０１３０】
薬品
−CMC( 低粘度)(Sigma C-5678, Batch#23H0244)
−p −ヒドロキシ安息香酸ヒドラジド( 「PAHBAH 」, Sigma H-9882)
−D −グルコース1 水塩(Boom 8342)
−NaH2PO4*1aq(Merck 6346)
−H3PO4(85％; Merck 573)
−クエン酸*1aq(Merck 244)
−4N NaOH
−0.5N HCl
インキュベーション緩衝液 A(0.01M リン酸塩 )
1.38 ｇNaH2PO4*1aq を800mL の脱塩水(demi water) に溶解させた。4N NaOH でPH を7 に調整し、さらにその混合物に脱塩水を加えて1000mL とした。最終的にpH をチェックし、必要ならば調整した。本緩衝液は、酵素試料を溶解し、かつ希釈するのに用いた。
【０１３１】
インキュベーション緩衝液 B(0.1M クエン酸＋ 0.1M リン酸塩 )
23.06g H3PO4 を脱塩水に溶解させ、最終容積を200mL(=1M) にした。42g クエン酸を脱塩水に溶解させ、最終容積を200mL(=1M) にした。クエン酸溶液20mL をリン酸溶液20mL に加え、さらに脱塩水で150mL にした。4N NaOH でpH を調整し(4 から10 の範囲) 、さらに脱塩水を加えて最終容積を200mL にした。本緩衝液は、基質調製液を希釈するのに用いた。
【０１３２】
インキュベーション緩衝液 C(0.05M クエン酸＋ 0.05M リン酸塩 )
インキュベーション緩衝液B を脱塩水で1 ：1 に希釈した。pH をチェックして、必要ならば補正した。その溶液は、グルコース標準曲線を作成するのに用いた。
【０１３３】
基質調製液 (1 ％ )
強く攪拌しながら、1g のCMC を脱塩水100mL にゆっくり添加した。1 時間以上激しく攪拌し続け、その後30 秒間ウルトラツラックス(ultraturrax) で処理した。
【０１３４】
酵素溶液
酵素試料をインキュベーション緩衝液に溶解させ、さらに約0.05U/mL の活性( グルコース標準曲線で50％) となるように希釈した。
【０１３５】
呈色試薬
5g PAHBAH を5N HCl 80 ｍL に溶解させ、その後0.5N HC ｌでその溶液を100mL にした。使用に先立ち、PAHBAH 溶液を0.5N NaOH で1 ：4 に希釈した。
【０１３６】
標準曲線
ストック溶液#1 ：1000mg グルコースを脱塩水100mL に溶解させた(10mg/mL) 。
【０１３７】
ストック溶液#2 ：ストック溶液#1 0.5mL を関心pH のインキュベーション緩衝液C 9.5mL で希釈した(0.5mg/mL) 。
【０１３８】
以下の滴定一覧表を用いた：
【表１】
測定方法：
（1 ） グルコース標準品、対照、試料、およびブランク用の試験管を基質(1％)0.5mL および所望のpH のインキュベーション緩衝液B 0.5mL で満たし、さらに所望の温度の浴槽中に置いた；
（2 ） その溶液を10 分間インキュベートした；
（3 ） 15 秒間隔で、各pH のグルコース標準液、対照、または試料100mL を基質の入った試験管に添加した；
（4 ） その溶液を3 秒間ボルテックスし、さらに浴槽中に戻した；
（5 ） 各試料を30 分間インキュベートした；
（6 ） PAHBAH 試薬3mL を添加することによって、酵素反応を止めた；
（7 ） 得られた溶液を3 秒間ボルテックスし、さらに浴槽の外のラックに置いた；
（8 ） 全ての反応を止めると、試料100 μL をブランクの試験管に加え、さらに3 秒間ボルテックスした；
（9 ） 試料を沸騰した水浴中に15 分間置いた；
（10 ） 得られた試料を5 から10 分間、冷やした水道水中で冷却し、さらに3 秒間再度ボルテックスした；
（11 ） 水を対照として用いて、混合液の410nm での吸光度を測定した。
【０１３９】
結果を図3 に示す。図3 に示すように、36kD セルラーゼのpH 最適条件は、40 ℃で約8 であり、かつ60 ℃で7 であることが観察された。
【０１４０】
実施例 6
ストレプトミセス・リビダンスにおけるセルラーゼ産生
本実施例は、本発明のセルラーゼをコードする核酸を包含しかつストレプトミセス・リビダンスの形質転換に用いる、プラスミドの構築について記載する。最終的なプラスミドベクターは、pSEGCT と称する。
【０１４１】
pSEGCT の構築は、2 つの他のプラスミド(Ward, et al., Mol. Gen. Genet. 203: 468-478 (1986) に記載のpIJ486 およびpIJ488) を利用した。プラスミドpIJ488 は、pUC18(Yanisch-Perron, et al., Gene 33: 103-119 (1985)) のKpnI 部位にエリスロマイシン耐性をコードするサッカロポリスポラ・エリスレア(Saccharopolyspora erythrea) 由来の1.5kb ermE 断片を挿入したものである。その断片のヌクレオチド配列は特定されている(Uchiyama & Weisblum, Gene 38: 103-110 (1985) and Bibb, et al., Gene 38: 215-226(1985)) 。
【０１４２】
両方のプラスミドは、もともと、天然のストレプトミセスプラスミドpIJ101 に由来する(D.A.Hopwood, et al., J. Gen.Microbiol. 129: 2250-2260 (1983)) 。pIJ101 は、ストレプトミセス・アズレウス(Streptomyces azureus) 由来のチオストレプトン耐性をコードするtsr 遺伝子を包含する。しかしながら、pIJ486 およびpIJ488 プラスミド中には、pIJ101 の複製起点およびリプリカーゼ遺伝子のみが残存する。プラスミドpIJ488-101 は、pIJ101 の複製起点およびチオストレプトン耐性遺伝子を包含するpIJ486 の大きなPstI 断片をPstI で消化したpIJ488 と連結させることによって構築し、プラスミドpIJ488-101 をもたらした( 図7 を参照) 。
【０１４３】
適切なプロモーターを挿入するために、上記プラスミドpIJ488-101 からプラスミドを構築した。アクチノプラーネス・ミソウレイエンシス(Actinoplanes missoureiensis) のグルコースイソメラーゼ遺伝子をプラスミドpIJ488 に挿入した。その遺伝子(GI) 、ならびにGIT として知られているタンパク質工学によって得られた誘導体をコードする遺伝子は、既に記載されており( 欧州特許出願第351029 号) 、かつストレプトミセスにおいて機能する適切なプロモーター配列の供給源として働く。
【０１４４】
詳細には、プラスミドpIJ488-101 をEcoRI およびSphI で消化し、さらに大きな断片を単離してEcoRI −SphI 断片上のGIT 遺伝子に連結させる。得られたプラスミドpWGE.GIT は構造的に不安定であることが見出された。その不安定性は、ermE 遺伝子のせいであった。従って、XbaI 断片の欠失によって、その構造からermE 遺伝子を除去し、結果としてプラスミドpWGx.GIT を得た( 図8 を参照) 。
【０１４５】
プラスミドpWGx.GIT はまだ、わずかな分離不安定性を示すことが見出された。全てのここでのプラスミドが由来する天然のストレプトミセスプラスミドpIJ101 の複製について記載する研究が報告されている(Z. Deng, et al., Mol. Gen. Genet. 214: 286-294) ）。その研究において、pIJ101 は、「ローリングサークル(rolling circle) 」機構を用いて複製することが示されている。その機構を用いたプラスミド複製は、まず、プラス起点と呼ばれる公知の複製起点を用いて1 本鎖中間分子を合成する。活性2 本鎖分子に効率的に変換するには、マイナス起点と呼ばれる第二の複製起点が必要である。pIJ101 のほとんどの誘導体を構築する間に、そのマイナス起点は除去される。
【０１４６】
「sti 」とも呼ばれるマイナス起点をKpnI −FspI 断片として、pIJ101 の誘導体であるプラスミドpIJ211 から単離し、さらに一般的なクローニングベクターpTZ18R(Pharmacia, Analects 13, no.4.) に連結させた。そのベクターをBamHI で消化し、さらにKpnI で平滑末端にしかつ消化した。その結果、プラスミドpTZ18Rsti が得られた( 図9 を参照) 。
【０１４７】
プラスミドpWGxGIT をKpnI およびXbaI で消化した。大きな断片を単離し、さらにpTZ18Rsti のKpnI およびXbaI 断片から単離したsti −含有断片に連結させた。その方法でプラスミドpWGxsGIT を形成した( 図10 を参照) 。
【０１４８】
シャトルプラスミドは、プラスミドpIJ488 −101 およびプラスミドpWGxsGIT を組み合わせることによって構築した。pWGxsGIT 由来のストレプトミセス複製機能を含む断片( プラス起点、sti 、およびrep 遺伝子) は、XbaI およびSphI で消化後、単離した。E.coli 複製機能を含む断片は、XbaI 、SphI 、およびNcoI で消化後、pIJ488-101 から単離した。それら2 つの断片を連結させた後、プラスミドpIJ488sti を形成した( 図11 を参照) 。
【０１４９】
セルラーゼを発現させるため、GI プロモーターをストレプトミセス・リビダンスセルラーゼ(CelA) のシグナル配列と共に用いた。GI プロモーターとCelA シグナル配列との融合物は、融合−PCR 技術によって、XbaI −EcoRI 断片として構築した。クローニングのために、同じ断片上に、NheI 部位を挿入した。その断片をXbaI およびEcoRI で消化したプラスミドpIJ488sti に連結させ、結果としてプラスミドpIJSEGiCe を得た( 図12 を参照) 。
【０１５０】
発現ベクターを完成させるため、セルラーゼターミネーター配列を挿入した。ストレプトミセス株11AG3 は、同一でないとしても、実施例1 で単離したストレプトミセス株(11AG8) に非常に関連している。両方の菌株は、同じ試料から単離され、かつ2 つの菌株の配列決定された16s rRNA は同一であることが見出された。11AG3 セルラーゼ遺伝子をNheI −EcoRI PCR 断片として単離した。クローニングを容易にするため、同じ断片上に、BamHI およびHpaI 部位を挿入した。pIJSEGiCel をNheI およびEcoRI で消化し、さらにPCR −ターミネーター断片をその消化したプラスミドに連結させて、ベクターpIJSEGCi を作成した。次に、内部BamHI 断片の欠失によって、プラスミドpIJSEGCi からセルラーゼ11AG3 コード領域を除去し、結果としてベクターpSEGCT を得た( 図13 を参照) 。
【０１５１】
セルラーゼ11AG8 遺伝子は、PCR を用いて、ストレプトミセス・リビダンスTK23 からNheI −BamHI 断片として単離した。ベクターpSEGCT をNheI およびBamHI で消化し、さらに前記PCR 断片をその消化したベクターに連結させ、結果としてプラスミドpSEGCT11AG8 を得た( 図14 を参照) 。GI プロモーター、celA シグナル配列、セルラーゼ11AG8 およびGI ターミネーターから成る完全発現カセットのDNA ヌクレオチド配列、ならびにその産物のアミノ酸配列を図15 に示す( 配列番号4 および5) 。
【０１５２】
Hopwood, et al., GENETIC MANIPULATION OF STREPTOMYCES, A LABORATORY MANUAL. The John Innes Foundation, Norwich, United Kingdom (1985) に記載のプロトプラスト法を用いて、宿主ストレプトミセス・リビデンスTK23 をプラスミドベクターpSEGCT11AG8 で形質転換した。
【０１５３】
形質転換細胞の培養を拡大し、2 つの発酵培養を行った。種々の時間に、発酵培養液の試料を分析のため採取した。その実験の目的のため、その試料のCMC 活性および分子量(SDS −PAGE) を測定した。発酵実験の終わりに、かなりの量(5 −15％) の完全長セルラーゼがSDS −PAGE で観察された。
【０１５４】
1 方の発酵実験では、完全長セルラーゼが約110.3 時間までの間に迅速に蓄積した。その後205.5 時間までに、もう少し完全長セルラーゼが蓄積し、さらに完全長セルラーゼの大部分は、切断形態に進行した。他方の発酵実験では、完全長セルラーゼは、約66.2 時間までに、発酵層中に存在する支配的なセルラーゼとなった。その後、セルラーゼの切断形態が蓄積した。従って、それら両方の発酵実験において、宿主細胞は完全長セルラーゼを産生し、そのセルラーゼがその後発酵培地中で切断されて、セルラーゼの切断形態を形成すると思われる。
【０１５５】
実施例 7
切断放線菌セルラーゼの発現
実施例6 において認められるように、本発明の35kD セルラーゼは、ストレプトミセス・リビデンス発現系で発現した場合、最初に、分子量約35kD の全340 アミノ酸残基から成りかつ3 つのジスルフィド結合架橋を包含する「完全長」酵素(N −からC −末端：触媒コア、リンカー領域、およびセルロース結合ドメイン(CBD)) として細胞外スペースに現れる。発酵がかなりの時間、すなわち約66 時間進行した後、セルラーゼは、そのセルロース結合ドメインが短縮されることによって修飾される。得られた「コア」分子は、セルラーゼ活性を維持しており、かつ分子量約25kD である。完全長セルラーゼの最初の切断部位は、もし有るとしても特定されていないが、そのコアの正確なアミノ酸配列(mw) は、精製タンパク質またはUF 濃縮した細胞を含まない培養液のいずれかを用いて特定されている。そのアミノ酸配列から、切断タンパク質の平均分子量を計算した。
【０１５６】
切断コアの配列同一性を以下のように特定した：0.2mg の可溶化酵素液を冷水( 試料水溶液の2 倍以上の容量) で0.45mL まで希釈し、次に1N HCl 0.05mL と混合し、さらに氷冷しながら10 分間インキュベートした。その溶液を13,000 xg で2 分間遠心し、上清を採り、さらに50％(w/v) トリクロロ酢酸0.065mL を添加して、氷冷しながら10 分間インキュベートした。沈殿したタンパク質を遠心で回収し、沈降物を冷却した90％(v/v) アセトン1mL で1 回洗浄し、さらに0.5M 重炭酸アンモニウム中の8M 尿素0.025mL に溶解させた。沈降物を溶解させた後、0.2M ジチオスレイトール2.5 μL を添加し、さらにその溶液を50 ℃で15 分間インキュベートした。その後、0.1M 重炭酸アンモニウム中の0.44M ヨードアセトアミド2.5 μL を添加し、さらにその溶液を室温で暗所において15 分間インキュベートした。その溶液を0.1％(w/v) ｎ−オクチル−β−D −グルコシド0.1mL で希釈し、さらに6 μg のトリプシンを用いて37 ℃で60 分間タンパク質を消化した。C18 カラムを用いたRP −HPLC によって、得られたペプチドを分離し、さらにUV 吸光度および質量分析の両方で溶出特性をモニターした。所定の配列に対するペプチドの指定は、13 ピークのうち11 ピークの部分的配列決定によって支援した。
【０１５７】
質量決定によって、「コア」が2 つの分子、すなわちそれら2 つの分子の各配列から構成されているという情報がすでに得られているが、トリプシンによって生じたペプチドの混合物をエンドプロテイナーゼAspN で消化し、さらにLC/MS によって再度解析した。その結果は、「コア」たんぱく質が、約1 ：2 の分子比である2 つの分子から成り、1 方は分子量24,469.0 ダルトン(230 アミノ酸残基、2 つのジスルフィド結合架橋を含む) であり、他方は分子量24,724.3 ダルトン(233 アミノ酸残基、2 つのジスルフィド結合架橋を含む) である。PE Bioscience ESI-TOF mass spectrometer, model Mariner (Foster City, CA) を用いた直接質量測定によって前記結果を確認し、精製した変異コアタンパク質の分子量がそれぞれ、24,467.0 および24,727.6 であることが示唆された。
【０１５８】
実施例 8
異なるプロモーターによるセルラーゼの発現
GI プロモーターは、非常に高い発現をもたらすことが知られている。例えばプロモーターの不安定性のため、セルラーゼの高い発現が望ましくない可能性がある。従って、本発明のセルラーゼ発現ベクターに異なるプロモーターをクローン化した。用いたプロモーターは、ストレプトミセス・フラジアエ(Streptomyces fradiae ) アミノグリコシド3 ’−ホスホトランスフェラーゼ遺伝子の弱いaph プロモーターである。そのプロモーターは、天然のストレプトミセスプラスミドSLP1 の誘導体であるプラスミドpIJ61 から単離した。aph 遺伝子の完全なヌクレオチド配列は公知であり、かつプロモーター領域は特徴付けされている。
【０１５９】
融合−PCR 技術を用いて、celA シグナル配列に融合したaph プロモーターを包含するSpeI −NheI 断片を得た。プラスミドpSEGCT11AG8 をSpeI およびNheI で消化し、大きな断片を単離し、さらにその断片に前記PCR −断片を連結させることによって、プラスミドpSEGCT11AG8 中のGI プロモーターをaph プロモーターと置換した。その結果、プラスミドpSEACT11AG8 を得た( 図16 を参照) 。そのプラスミドは、プラスミドpSEGCT11AG8( 図14 を参照) と等価であり、セルラーゼ遺伝子の発現をもたらすために用いるプロモーター以外においてはベクターpSEGCT と同一であるベクターpSEACT に、ストレプトミセス・リビデンス11AG8 由来のセルラーゼを挿入することによって構築されると考えることができる。
【０１６０】
プラスミドpSEACT11AG8 から全てのE.coli 配列を除去するため、そのプラスミドをSphI で消化し、かつ再連結させた。これによって、プラスミドpSACT11AG8 を形成した( 図17 を参照) 。その構築物をバシラス宿主細胞にトランスフェクトした。プレート培養では、高いレベルのセルラーゼ発現が認められたが、発酵槽の環境では、バシラス宿主細胞によるセルラーゼの産生は非常に低かった。しかしながら、プロモーター誘導をうまく制御して、aph プロモーターの制御下におけるセルラーゼ産生を改善することが可能であろう。
【０１６１】
実施例 9
完全長セルラーゼと切断セルラーゼの比較
完全長セルラーゼと切断セルラーゼの毛玉除去能の比較を実施した。
【０１６２】
Wisk（登録商標） およびGessy Lever#1 液体洗剤において、20 ℃および40 ℃で、完全長セルラーゼ(15.4mg/mL) および切断セルラーゼ( 約14mg/mL) の用量反応を評価するために、３サイクルDetergent Cellulase Terg-O-Tometer Test(DCTT) を用いた。その試験は、毛玉のできた綿編物の布切れおよび毛織物の布切れの両方を用いて実施した。その試験の条件は：
温度： 40 ℃
サイクル時間： 2.5 時間
サイクル数： 3
攪拌スピード： 125rpm
水の硬度： 150ppm
酵素量： ０,45,90,135,180,225 NPC units/L
(225 NPC units=30mg 完全長タンパク質)
pH ： 8.85
pH は、酵素の添加前、および試験の間30 分ごとにチェックした。
【０１６３】
３ サイクル試験を実施する間、各サイクルの終わりに布切れをテルグポット(Terg pot) から取り出し、洗濯機ですすぎ、その後新しい酵素および洗剤を含むテルグポットに戻した。３ 回目のサイクルのすすぎの終わりに、タンブル乾燥機でその布切れを乾燥した。
【０１６４】
データ分析
毛玉除去：図18a は、Wisk（登録商標） における40 ℃での完全長セルラーゼ対切断セルラーゼの毛玉除去用量反応を示す。生データをミカエリス−メンテンの式に適合させてグラフにプロットした。それらの結果は、Wisk（登録商標） における40 ℃での完全長セルラーゼと切断セルラーゼの毛玉除去能に有意な差は無いことを示唆する。
【０１６５】
ピーク負荷：図18 ｂは、Wisk（登録商標） における40 ℃での完全長セルラーゼ対切断セルラーゼの用量反応を示す。ピーク負荷値は強度の損失に逆比例し、すなわちピーク負荷値が高いほどTSL は低い。ピーク負荷値は、完全長セルラーゼよりも切断セルラーゼにおいてわずかに低い。従って、完全長セルラーゼよりも切断セルラーゼにおいてピーク負荷値がわずかに低くかつTSL が高いが、２つの酵素は等しい毛玉除去能を有している。
【０１６６】
しかしながら、毛玉除去および％TSL を比較した場合、完全長セルラーゼと切断セルラーゼ間で多少の違いが認められる。図18 ｃは、Wisk（登録商標） における40 ℃での％TSL 対毛玉除去を完全長セルラーゼと切断セルラーゼで比較して示している。完全長セルラーゼおよび切断セルラーゼの両方のトレンドラインを描くことができ、毛玉除去が上昇するにつれてTSL が上昇することを示している。そのグラフは、毛玉除去評価が４の時に、切断セルラーゼが完全長セルラーゼよりも高いTSL を有することを示す。
【０１６７】
Wisk（登録商標） 液体洗剤に加えて、Gessy Lever#1 液体洗剤においても毛玉除去能を評価した。同じ条件下（洗浄溶液のpH が10.57 に上昇することを除いて）、Gessy Lever#1 において、20 ℃および40 ℃で、切断セルラーゼに対する完全長セルラーゼの用量反応を比較した。pH は、酵素添加前および30 分ごとにチェックした。
【０１６８】
データ分析
毛玉除去：図19a は、Gessy Lever#1 における20 ℃での完全長セルラーゼ対切断セルラーゼの用量反応を示す。生データをミカエリス−メンテンの式に適合させてグラフにプロットした。グラフに示すように、Gessy Lever#1 では、切断セルラーゼの毛玉除去能は完全長セルラーゼよりもよかった。要約すると、毛玉除去評価２に達するのに、完全長セルラーゼは切断セルラーゼと比較して1.6 倍の量が必要であった。
【０１６９】
ピーク負荷：図19 ｂは、Gessy Lever#1 における20 ℃での完全長セルラーゼ対切断セルラーゼのピーク負加値およびTSL を示す。予測した通り、ピーク負荷値は、完全長セルラーゼよりも切断セルラーゼで低かった。完全長セルラーゼデータにおける散乱、および低い相関係数は、完全長セルラーゼが織物に殆ど効果が無く、従ってTSL が生じないことを示唆した。TSL は、Wisk（登録商標） よりもGessy Lever#1 においてかなり低いが、おそらくpH の違いのせいであろう。
【０１７０】
漂白剤の存在下における毛玉除去能を特定するため、漂白剤の存在下で同じ実験を実施した。試験の条件は：
温度： 40 ℃
サイクル時間： 2.5 時間
サイクル数： 3
攪拌スピード： 125rpm
水の硬度： CaCO3 として70ppm(2:1 Ca:Mg)
洗剤基質： 0.51g LAS/0.35g STPP/0.68g Na2SO4
漂白系： 0.5g 過ホウ酸1 水塩(PBS)/0.1g TAED( 漂白活性化剤)
pH ： 8.85
酵素量： 225 NPC/L 完全長セルラーゼ(115.6 NPC/mL)
(30mg/L で使用)
225 NPC/L 切断セルラーゼ(149.2 NPC/mL)
( 完全長セルラーゼと同じ作用量)
34 NPC/L 「Super L 」EGIII(23 NPC/mL)
(30mg/L で使用)
pH は、酵素の添加前および添加後の両方に調整し、その後30 分ごとにチェックして必要に応じて調節した。
【０１７１】
毛玉除去：図20a は、アルカリ性洗剤基質±酸素漂白系における、完全長セルラーゼ、切断セルラーゼ、およびEGIII の毛玉除去能を示す。グラフから分かるように、PBS/TAED を添加すると、毛玉除去能は3 つの全ての酵素において低下した。完全長セルラーゼおよびEGIII が酸素漂白系の存在下において最も影響を受けた。切断セルラーゼは、酸素漂白系の存在下においてさえ、最も高い毛玉除去能を有し、毛玉除去評価が3.5 であった。このデータは、漂白系の存在下において、切断セルラーゼが、完全長セルラーゼおよびEGIII よりも安定であることを示唆する。
【０１７２】
ピーク負荷：図20 ｂは、アルカリ洗剤基質±酸素漂白系における完全長セルラーゼ、切断セルラーゼ、およびEGIII のピーク負荷値を示す。グラフから分かるように、漂白系の存在下において、ピーク負荷値は完全長セルラーゼおよびEGIII で変化しなかったが、切断セルラーゼではピーク負荷値が上昇した。TSL はピーク負荷値に反比例した。切断セルラーゼのピーク負荷値は、漂白系の存在下において上昇し、従ってTSL は低下した。
【０１７３】
漂白剤に加えて、選択洗剤はプロテアーゼを含んでいて差し支えない。従って、Purafect 4000L（登録商標）(Genencor, International) の存在下において上記の試験を実施した。試験の条件は：
温度： 40 ℃
サイクル時間： 2.5 時間
サイクル数： 3
攪拌スピード： 125rpm
水の硬度： CaCO3 として70ppm(2:1 Ca:Mg)
洗剤基質： 0.51g LAS/0.35g STPP/0.68g Na2SO4
プロテアーゼ： 1mg/L Purafect 4000L（登録商標）
pH ： 10
酵素量： 225 NPC/L 完全長セルラーゼ(115.6 NPC/mL)
(30mg/L で使用)
225 NPC/L 切断セルラーゼ(149.2 NPC/mL)
( 完全長セルラーゼと同じ作用量)
34 NPC/L 「Super L 」EGIII (23 NPC/mL)
(30mg/L で使用)
毛玉除去：図21a は、アルカリ性洗剤基質±Purafect 4000L（登録商標） プロテアーゼにおける、完全長セルラーゼ、切断セルラーゼ、およびEGIII の毛玉除去能を示す。セルラーゼ無しの対照±Purafect 4000L（登録商標） は全く毛玉除去能を示さなかった。完全長セルラーゼの毛玉除去能は、Purafect 4000L（登録商標） の存在下において上昇したが、切断セルラーゼの毛玉除去能は変化しなかった。このことは、切断セルラーゼは、完全長セルラーゼよりもタンパク質分解に対して安定であることを示唆した。完全長セルラーゼ＋Purafect 4000L（登録商標） の毛玉除去能は、切断セルラーゼの毛玉除去能と同じレベルに上昇した。この結果は、アルカリ条件下において、切断セルラーゼの毛玉除去能が完全長セルラーゼよりも良いという初期の観察に一致する。EGIII の毛玉除去能は、Purafect 4000L（登録商標） プロテアーゼの存在によって影響を受けない。
【０１７４】
ピーク負荷：図21b は、アルカリ洗剤基質±Purafect 4000L（登録商標） プロテアーゼにおける完全長セルラーゼ、切断セルラーゼ、およびEGIII のピーク負荷値を示す。ゼロ対照に対するPurafect 4000L（登録商標） の添加は、ピーク負荷値に影響を及ぼさなかった。完全長セルラーゼのピーク負荷値は、Purafect 4000L（登録商標） の存在下において低下した。TSL はピーク負荷値に反比例するため、Purafect 4000L（登録商標） の添加により完全長セルラーゼの毛玉除去が上昇すると、同様にTSL が上昇する。プロテアーゼは、殆ど、または全く切断セルラーゼに影響を及ぼさなかった。EGIII のピーク負荷値は、Purafect 4000L（登録商標） の存在下において影響を受けなかった。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図1 は、本発明に基づく約36 ｋD のセルラーゼの推定アミノ酸配列を示しており、リーダー配列をボールド体で示す（配列番号1 ）。
【図２】 図2 は、本発明に基づく約36 ｋD のセルラーゼをコードするDNA 配列を示す( 配列番号2) 。
【図３】 図3 は、本発明に基づく約36 ｋD のセルラーゼの40 ℃および60 ℃におけるpH ／活性特性を示す。
【図４】 図4 は、pHPLT ベクターを示す。
【図５】 図5 は、pHP11AG8 ベクターを示す。
【図６】 図6 は、本発明のセルラーゼが得られた放線菌の16s rRNA 配列を示す。
【図７】 図7 は、pIJ488-101 の構造を示す。
【図８】 図8 は、pWGxGIT の構造を示す。
【図９】 図9 は、pTZ18Rsti の構造を示す。
【図１０】 図10 は、pWGxsGIT の構造を示す。
【図１１】 図11 は、pIJ488sti の構造を示す。
【図１２】 図12 は、pSEGCi の構造を示す。
【図１３】 図13 は、pSEGCT の構造を示す。
【図１４】 図14 は、pSEGCT11AG8 の構造を示す。
【図１５】 図15 は、GI プロモーター、celA シグナル配列、セルラーゼ11AG8 およびGI ターミネーターから成る完全発現カセットのDNA 配列 ( 配列番号4) 、ならびに11AG8 のコードアミノ酸配列を示す( 配列番号5) 。
【図１６】 図16 は、pSEACT11AG8 の構造を示す。
【図１７】 図17 は、pSACT11AG8 の構造を示す。
【図１８】 図18 は、Wisk（登録商標） における本発明の完全長セルラーゼと切断セルラーゼの能力を比較する。
【図１９】 図19 は、Gessy Lever#1 における本発明の完全長セルラーゼと切断セルラーゼの能力を比較する。
【図２０】 図20 は、漂白剤の存在下における本発明の完全長セルラーゼと切断セルラーゼの能力を比較する。
【図２１】 図21 は、プロテア−ゼの存在下における本発明の完全長セルラーゼと切断セルラーゼの能力を比較する。
関連特許出願に対する相互参照
本出願は、1997 年11 月19 日に出願し現在放棄されている米国特許出願第08/974,042 号の一部継続出願である1998 年6 月24 日出願の米国特許出願第09/104,308 号の一部継続出願である；前記2 つの特許出願は参照によって全てこの中に組み込まれている。
【０００２】
連邦政府委託研究および開発
該当しない。
【０００３】
発明の背景
セルラーゼは、セルロース中のβ−D −グルコシド結合を加水分解する酵素である。セルロース分解酵素は、伝統的に3 つのクラスに分類されている：エンドグルカナーゼ、エキソグルカナーゼまたはセロビオヒドロラーゼ、およびβ−グルコシダーゼである(Knowles, J. et al., TIBTECH 5: 255-261 (1987)) 。セルラーゼは、多くの細菌、酵母、および真菌によって産生されることが知られている。
【０００４】
セルロース分解酵素の使用のために開発された応用の中で主要なものは、（バイオ）エタノール製造のための（木材）セルロースパルプの糖への分解、“ストーンウォッシュ(stone washing) ”および“バイオポリッシング(biopolishing) ”のような織物加工、ならびに洗剤組成物における用途である。またセルラーゼは、泥を除去するため、すなわち洗濯のための洗剤組成物において有用であることが知られている。例えば、英国特許出願第2,075,028 号、第2,095,275 号、および第2,094,826 号は、セルラーゼを加えた洗剤を用いると洗濯能力が改善されることを示している。さらには、英国特許出願第1,358,599 号は、洗剤においてセルラーゼを用いると綿混織物のガサガサした感触を減らすことを示している。
【０００５】
織物加工におけるセルラーゼの別の有用な特徴は、使用済み織物の色を明るく鮮やかにすることによって、それらを再生できることである。例えば、綿混織物を繰り返し洗浄すると、その織物が灰色じみた外観となる。これは、機械的作用によって生じる、しばしば“毛玉(pills) ”と呼ばれる、破壊されかつ乱れた小繊維のせいであると考えられている。この灰色じみた外観は、特に着色織物において顕著である。結果として、セルラーゼが繊維の乱れた最上層を除去し、従って織物の全体的外観を改善し得ることは価値があると分かっている。
【０００６】
セルラーゼの主要な用途である洗剤は通常アルカリ性条件下で作用するため、pH7 −10 で高い活性を示すセルロースが強く要求されている。ヒュミコラ・インソレン(Humicola insolens) およびトリコダーマ・リーセイ(Trichoderma reesei) 由来のセルラーゼのようなよく特徴付けされている真菌セルラーゼは、中性から低いアルカリpH で十分に機能する。高いアルカリ性pH でセルラーゼ活性を示す多くの酵素が、バシラス菌および他の原核生物から単離されている（例えば国際特許出願第WO96/34092 号および第WO96/34108 号を参照）。従って、真菌および細菌のセルラーゼは完全に調査されている。しかしながら、第三の群のセルラーゼである放線菌から単離されたセルラーゼは、ほとんど注目されていなかった。Wilson et al., Critical Reviews in Biotechnology, 12: 45-63 (1992) は、サーモモノスポラ・フスカ(Thermomonospora fusca) 、サーモモノスポラ・カーベイト(Thermomonospora curvate) 、およびミクロビスポラ・ビスポラ(Microbispora bispora) によって産生されるセルラーゼについて研究しており、さらにそれらセルラーゼの多くが広いpH 特性および良好な温度安定性を有することを示している。同様に、Nakai, et al., Agric. Biol. Chem., 51: 3061-3065 (1987) およびNakai, et al., Gene, 65: 229-238 (1988) は、ストレプトミセス株KSM −9 由来のアルカリ耐性セルラーゼcasA について記載している。そのセルラーゼは、アルカリ性pH での最適条件および優れた温度安定性を有する。
【０００７】
放線菌からのいくつかの例を含む、所望の特性を有する多くのセルラーゼ組成物に関連する技術における知識にも関わらず、例えば織物加工、洗剤組成物の成分、パルプおよび紙の加工、動物飼料の補助物質、パン作りのための加工助剤、ならびにバイオマスコンバーター(biomass converer) 等として有用である様々な領域の特徴を有する新しいセルラーゼに対する要求が続いている。
【０００８】
発明の概要
本発明の目的は、放線菌によって産生され得る新規なセルラーゼ組成物、そのようなセルラーゼの誘導体、そのようなセルラーゼを作成する方法、およびそのようなセルラーゼの使用を提供することである。さらに本発明は：洗剤組成物の添加剤として；セルロース含有織物およびそれに用いられ得る繊維のような織物の加工において；動物飼料の添加剤として；パン作りにおける加工助剤として；パルプおよび紙の加工において；ならびに高フルクトール含有コーンシロップ(corn-syrup) またはエタノールの製造のためのデンプン加工において：の使用を含む、業界においてセルラーゼの添加が有利であると認められている組成物における新規なセルラーゼの使用に関する。
【０００９】
組換え宿主細胞による異種発現を介してそのような新規放線菌由来セルラーゼ組成物を作成する方法を提供することも本発明の別の目的である。
【００１０】
本発明の新規なセルラーゼ組成物の商業生産を容易にするDNA およびアミノ酸配列を提供することも本発明のさらに別の目的である。
【００１１】
洗剤、織物加工、飼料補助物質、ならびにパルプおよび紙の加工における使用のための優れた特性を有する新規なセルラーゼを提供することも本発明のさらに別の目的である。
【００１２】
本発明に基づき、放線菌から得ることができる新規なセルラーゼまたは誘導体を提供する。好ましくは、本発明のセルラーゼは、図1 （配列番号1 ）のアミノ酸配列、その断片、またはその活性部分に対して50％ 以上の配列同一性、好ましくは70％ 以上の配列同一性、さらにより好ましくは90％ 以上の配列同一性を有するそれらの誘導体を含む。
【００１３】
別の実施形態に基づき、本発明のセルラーゼをコードするDNA を含む組成物を提供する。好ましくは、そのDNA はアミノ酸配列をコードし、かつ図2 （配列番号2 ）に示される核酸配列、その断片、またはそれらの部分に対して76％ 以上の配列相同性、好ましくは80％ 以上の配列同一性、およびさらに好ましくは90％ 以上の配列同一性を有しかつそれによってセルラーゼが産生されるそれらの誘導体を含む。さらに本発明は、適切な条件下において図2 に表されるDNA から選んだDNA プローブに対してハイブリッド形成し、かつそれによってセルラーゼが産生されるようなDNA を具体的に示す。
【００１４】
本発明のさらに別の実施形態に基づき、本発明に基づくセルラーゼコードDNA で適切な微生物を形質転換させる方法、およびその形質転換微生物から本発明に基づくセルラーゼを産生させる方法を提供する。
【００１５】
本発明の好ましい実施形態において、完全長セルラーゼは放線菌由来であり、かつSDS −PAGE で測定して約36 ｋD の分子量を有する（この中で36 ｋD セルラーゼとして称されている）。完全長の約36 ｋD のセルラーゼは、等電点が約5.9 であり、さらにCMC （カルボキシメチルセルロース）におけるpH 最適条件が40 ℃で約8 でありかつ60 ℃で7 である。本発明のセルラーゼは、少なくともpH5 からpH10 の広い活性範囲を有し、40 ℃よりも60 ℃においてより高い活性を示す。
【００１６】
特に好ましい実施形態において、本発明のセルラーゼは、前記の完全長セルラーゼの切断形態である。その分子量は約25 ｋD である。
【００１７】
図面の簡単な説明
図1 は、本発明に基づく約36 ｋD のセルラーゼの推定アミノ酸配列を示しており（配列番号1 ）、リーダー配列をボールド体で示す。コード化文字はIUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission(GeneBank PatentIn User Mannual, PC-DOS/MS-DOS version, November 1990 に記載) に基づく。
【００１８】
図2 は、本発明に基づく約36 ｋD のセルラーゼをコードするDNA 配列を示す( 配列番号2) 。
【００１９】
図3 は、本発明に基づく約36 ｋD のセルラーゼの40 ℃および60 ℃におけるpH ／活性特性を示す。
【００２０】
図4 は、pHPLT ベクターを示す。
【００２１】
図5 は、pHP11AG8 ベクターを示す。
【００２２】
図6 は、本発明のセルラーゼが得られた放線菌の16s rRNA 配列を示す。
【００２３】
図7 は、pIJ488-101 の構造を示す。
【００２４】
図8 は、pWGxGIT の構造を示す。
【００２５】
図9 は、pTZ18Rsti の構造を示す。
【００２６】
図10 は、pWGxsGIT の構造を示す。
【００２７】
図11 は、pIJ488sti の構造を示す。
【００２８】
図12 は、pSEGCi の構造を示す。
【００２９】
図13 は、pSEGCT の構造を示す。
【００３０】
図14 は、pSEGCT11AG8 の構造を示す。
【００３１】
図15 は、GI プロモーター、celA シグナル配列、セルラーゼ11AG8 およびGI ターミネーターから成る完全発現カセットのDNA 配列を示す( 配列番号4) 。また、11AG8 のコードアミノ酸配列を示す( 配列番号5) 。
【００３２】
図16 は、pSEACT11AG8 の構造を示す。
【００３３】
図17 は、pSACT11AG8 の構造を示す。
【００３４】
図18 は、本発明の完全長セルラーゼと切断セルラーゼの能力を比較する。図18a は、Wisk（登録商標） において、完全長セルラーゼの毛玉除去能(depilling performance) が切断セルラーゼの毛玉除去能と同等であることを示唆する。図18 ｂは、切断セルラーゼにおいて、ピーク負荷値(peak load) がわずかに低く、かつTSL が高いことを示唆する。図18 ｃは、同じ毛玉除去率において、切断セルラーゼが完全長セルラーゼよりも高いTSL を有することを示唆する。
【００３５】
図19 は、本発明の完全長セルラーゼと切断セルラーゼの能力を比較する。図19a は、Gessy Lever#1 において、切断セルラーゼの毛玉除去能が、完全長セルラーゼの毛玉除去能よりも良いことを示唆する。図19 ｂは、切断セルラーゼにおいて、完全長セルラーゼよりもピーク負荷値が低いことを示唆する。
【００３６】
図20 は、漂白剤の存在下における本発明の完全長セルラーゼと切断セルラーゼの能力を比較する。図20a は、過ホウ酸一水塩および漂白活性剤の存在下において、切断酵素の毛玉除去能力がわずかに低下することを示唆する。図20 ｂは、漂白剤の存在下において、切断セルラーゼのピーク負荷値が上昇することを示唆する。
【００３７】
図21 は、プロテア−ゼの存在下における本発明の完全長セルラーゼと切断セルラーゼの能力を比較する。図21a は、プロテアーゼが切断酵素の毛玉除去能力に影響を及ぼさないことを示唆する。図21b は、プロテアーゼが切断酵素のピーク負荷値に影響を及ぼさないことを示す。
【００３８】
発明の詳細な説明
定義
この中で別段の定義がなければ、この中で用いられている全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する分野の当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。Singleton, et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 2D ED.,John Wiley and Sons, New York (1994), and Hale & Marham, The HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, NY (1991) は、本発明において用いられている多くの用語の全般的な辞書を当業者に提供する。この中に記載の方法および材料に類似または等価である任意の方法および材料を本発明の実施または試験において用いることができるが、好ましい方法および材料について記載している。数値範囲は、その範囲を特定する数値を含む。指摘がなければ、核酸は、5 ’から3 ’の方向で左から右に書く；アミノ酸配列は、アミノ末端からカルボキシ末端の方向で左から右に書く。この中に与えられた見出しは、明細書を全体として参照することによって理解し得る本発明の実施形態の種々の態様を限定するものではない。
【００３９】
「アミノ酸」の用語は、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチド（総称して「ポリペプチド」）に組み込まれたアミノ酸への言及を含む。アミノ酸は、天然アミノ酸であって差し支えなく、または別段限定がなければ、天然アミノ酸と同様に機能する天然アミノ酸の公知の類似物を含んでいて差し支えない。
【００４０】
「誘導体」は、天然タンパク質のC 末端およびN 末端の一方または両方への1 つ以上のアミノ酸の付加、天然アミノ酸配列における1 つまたは多くの異なる部位における1 つ以上のアミノ酸の置換、天然タンパク質の1 方あるいは両方の末端またはアミノ酸配列の1 つ以上の部位における1 つ以上のアミノ酸の欠失、あるいは天然アミノ酸配列における1 つ以上の部位への1 つ以上のアミノ酸の挿入により、天然タンパク質から派生する。酵素誘導体の調製は、好ましくは、天然タンパク質をコードするDNA 配列の修飾、そのDNA 配列による適切な宿主の形質転換、酵素誘導体を形成するための修飾DNA 配列の発現によって達成される。誘導体を調製する別の手段は、当業界で周知であり、例えば天然タンパク質またはその誘導体のタンパク質分解による切断を含む。本発明のセルラーゼの誘導体は、前駆酵素の特徴的な酵素特性を維持するがある特定側面において変化した特性を有するような、前駆酵素アミノ酸配列（例えば本発明に基づく野生型または天然型の酵素）と比較して変化したアミノ酸配列を含むペプチドを包含する。例えば、変化したセルラーゼは、最適pH が上昇し、または温度抵抗が上昇し得るが、その特有のセルロース分解活性を有するであろう。
【００４１】
特定アミノ酸配列の「保存的置換」とは、機能活性に重要でないアミノ酸配列のアミノ酸置換、または重要なアミノ酸の置換でさえ本質的に活性を変化させないような類似特性（例えば酸性、塩基性、正または負荷電、極性または非極性等）を有する他のアミノ酸でのアミノ酸置換を称する。機能的に類似のアミノ酸を提供する保存的置換表(conservative substitution tables) は、当業界で周知である。
【００４２】
2 つのポリペプチドまたは核酸配列の構造における「同一」の用語は、以下の「配列比較アルゴリズム」の1 つを用いて測定して一致が最大となるように並べた場合に、同じとなる2 つの配列中の残基を称する。比較のための配列の最適な整列は、例えばSmith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981) の局所的相同性アルゴリズム、Needleman & Wunsch, J. Mol. Bio. 48: 443 (1970) の相同性整列アルゴリズム、Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988) の類似性の調査方法、それらアルゴリズムのコンピューターによる実施(GAP, BESTFIT, FASTA, and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI) 、または目視検査によって実施することができる。
【００４３】
配列類似性を特定するのに適切であるアルゴリズムの1 つの例は、Altschul, et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990) に記載のBLAST アルゴリズムである。BLAST 解析を実施するためのソフトウェアは、国立バイオテクノロジー情報センターから公的に利用できる( 。そのアルゴリズムは、データベース中の長さW のワードと共に並べた場合にポジティブ評価の閾値T に適合しまたは充足させる照会配列中の長さW の短いワードを同定することによって、高得点配列対(high scoring sequence pairs(HSPs)) をまず同定することを含む。それら最初の隣接ワードのヒットは、それらを含む長いHSPs を見出すための開始点として働く。累積整列得点(cumulative alignment score) ができるだけ増えるように、比較する2 つの配列のそれぞれに沿って両方向にワードヒットを展開する。ワードヒットの延長は：累積整列得点が最大達成値より定めた定数X から遠ざかる；累積得点がゼロまたはそれ以下に下がる；または何れかの配列の末端に達する：場合に止まる。BLAST アルゴリズムパラメーターW 、T 、およびX は、整列の感度および速さを特定する。BLAST プログラムは、初期設定として、ワード長(W) が11 、BLOSUM62 スコアリングマトリックス(Henikoff & Henikoff, Prog. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915 (1989)) 整列(B) が50 、期待値(E) が10 、M ’5 、N ’−4 、および両鎖の比較を用いる。
【００４４】
さらに、BLAST アルゴリズムは、2 つの配列間の類似性の統計解析を実施する（例えばKarlin & Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5787 (1993) を参照）。BLAST アルゴリズムによってもたらされる類似性の1 つの指標は、2 つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の一致が偶然生じる確率の指標を提供する最小総確率(smallest sum probability) （P(N) ）である。例えば、評価核酸とセルラーゼ核酸との比較における最小総確率が、約0.1 より小さく、より好ましくは約0.01 より小さく、さらに最も好ましくは約0.001 よりも小さい場合に、ある核酸が本発明のセルラーゼ核酸に類似するとみなされる。評価核酸がセルラーゼポリペプチドをコードする場合には、比較によって約0.5 より小さく、より好ましくは約0.2 より小さい最小総確率をもたらす場合に、特定のセルラーゼ核酸に類似するとみなされる。
【００４５】
2 つのポリペプチドが実質的に同一であるとする別の指標として、第一ポリペプチドが第二ポリペプチドと免疫学的に交差反応性であることが挙げられる。従って、例えば2 つのペプチドが保存的置換によってのみ異なる場合に、そのポリペプチドは第二ポリペプチドと実質的に同一である。
【００４６】
この中で用いられている「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」の用語は、互換的に使われており、かつアミノ酸残基から成る高分子に対する言及を含む。その用語は、天然アミノ酸高分子に適用されるのと同様に、1 つ以上のアミノ酸残基が、対応する天然アミノ酸の人工的化学類似物であるようなアミノ酸高分子にも適応される。またその用語は、そのポリペプチドが機能を維持するような保存的アミノ酸置換を含む高分子にも適用される。
【００４７】
この中で用いられている「組換え」の用語は、天然状態ではそのポリペプチドを発現し得るＤＮＡの内生的複製を持たない宿主細胞を用いて産生されるポリペプチドに対する言及を含む。宿主細胞は、適切な単離核酸配列の導入によって遺伝子的に変化しているため、その組換えポリペプチドを産生する。またその用語は、異種核酸の導入または天然核酸の改変によってその細胞にとって天然でない形態に修飾されている宿主細胞、または核酸、またはベクターに対する言及、あるいは宿主細胞がそのように修飾された細胞由来であることを含む。従って、例えば、組換え宿主細胞は、その細胞の天然の（非組換えの）形態内に認められない遺伝子を発現し、天然の形態内に認められる遺伝子の変異体を発現し、あるいは全く発現されないかまたは発現されたとしても異常に発現される天然遺伝子を発現している。
【００４８】
「宿主細胞」は、宿主として、および本発明に基づく組換えＤＮＡベクターの発現媒体としてとして働く能力を有する細胞を意味する。本発明の好ましい実施形態において、「宿主細胞」はバシラス菌の細胞を意味する。しかしながら、当業者は、例えば細菌、真菌、真核、および植物細胞のような任意の適切な宿主細胞を用い得ることに気が付くであろう。
【００４９】
「ＤＮＡ構造」または「ＤＮＡベクター」は、上記の任意の新規セルラーゼまたはセルラーゼ誘導体をコードする1 つ以上のＤＮＡ断片を含むヌクレオチド配列を意味する。「ＤＮＡベクター」には「発現ベクター」が含まれる。典型的な発現ベクターは、転写および翻訳のターミネーター、転写および翻訳の開始配列、並びに特定核酸の発現を制御するのに有用であるプロモーターを含む。ベクターは、必要に応じて、1 つ以上の独立したターミネーター配列、原核細胞、真核細胞、または両方においてそのカセットの複製を可能とする配列（例えばシャトルベクター）および原核系および真核系の両方のための選択マーカーを包含する遺伝子発現カセットを含む。ベクターは、原核細胞、真核細胞、または両方における複製および導入に適している。Giliman and Smith, Gene 8: 81-97 (1979) ；Roberts et al., Nature 328: 731-734 (1987) ；Berger and Kimmel, GUIDE TO MOLECULAR CLONING TECHNIQUES, METHODS IN ENZYNOLOGY, VOL 152, Academic Press, Inc., San Diego, CA ( 「Berger 」) ；Scheider, B., et al., Protein Expr. Purig 6435: 10 (1995) ；Sambrook et al. MOLECULAR CLONING-A LABORATORY MANUAL(2ND ED.)VOL. 1-3, Cold Springs Harbor Publishing (1989) （「Sambrook 」）；and CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Ausubel et al.(eds.), Current Protocols, a joint venture between Green Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc.,(1997 Supplement) （「Ausubel 」）を参照。
【００５０】
完全長セルラーゼのクローニングおよび発現
本発明の1 つの実施形態において、本発明のセルラーゼは、例えば組換え的に産生されるのではなく、天然供給源から得られる。適切なセルラーゼ産生生物を単離するためにソーダ湖試料をスクリーニングすることによって、セルラーゼを得ることができる。さらに、放線菌のような細菌を増殖させるためにその分野で認められた手段に基づきその生物を培養することができる。
【００５１】
しかしながら、正確なセルラーゼ産生株を単離するよりもむしろ、遺伝子操作技術を利用する方がより効率的である。従って、この中で提供されるDNA で適切な宿主細胞を形質転換し、さらに宿主細胞の増殖およびセルラーゼ発現に適切な条件下で、得られた組換え微生物を培養することが可能である。
【００５２】
最初の処理として、例えばSaito and Miura の方法(Saito & Miura, Biochim. Biophys. Acta., 72: 619 (1963)) または類似の方法によって、供与体である放線菌株から染色体DNA を得ることができる。さらに得られた染色体DNA の制限酵素切断によって、アルカリセルラーゼ遺伝子を含むDNA 断片が得られる。この目的のために、例えば遺伝子のコード領域またはコード領域と遺伝子のプロモーターのような前記遺伝子の所望の領域を切断しないような任意の制限酵素を用いることができる。あるいは、部分的にのみ消化をもたらすために低い酵素濃度または短いインキュベーション時間を用いて遺伝子を切断するような制限酵素を用いることができる。好ましい制限酵素はSau3A である。得られた消化混合物から、約4-10kb の適切な断片を単離し、DNA ベクターに挿入し、さらに適切な宿主細胞を形質転換するのに用いることができる。
【００５３】
例えばλファージ（発現）ベクターおよびE.coli( 大腸菌) 宿主細胞を用いて、本発明のセルラーゼをコードする遺伝子をクローン化することができる。（あるいは、保存ドメインに基づき設計した共通プライマーを用いたPCR を使用しても差し支えない）。E.coli における最初のクローニング処理の後、バシラス菌またはストレプトミセス種のようなより好ましい工業的発現宿主、アスペルギルスまたはトリコダーマ(Trichoderma) のような糸状菌、あるいはサッカロミセスのような酵母に本発明に基づくセルラーゼ遺伝子を導入することができる。最も好ましいのはストレプトミセスである。また、好ましいのはトリコダーマである。しかしながら、トリコダーマにおいて発酵されたセルラーゼは、例えばストーンウォッシュのような織物加工で用いる場合に、バック染色(backstaining) のレベルを上げることが分かっている。理論に制限されないで、発酵培地にプロテアーゼを添加すると許容可能なレベルまでバック染色のレベルを下げると考えられている。従って、トリコダーマもまた、織物加工で用いるためのセルラーゼの条件を満たす宿主細胞を提供することができる。それら宿主生物において得られる高いレベルの発現および分泌によって発酵培地中へのセルラーゼの蓄積が可能となり、その培地から連続的にセルラーゼを回収できる。
【００５４】
遠心または濾過によって培地から細胞を分離し、もし必要であれば細胞を破壊し、さらに細胞断片および破片から上清を除去することを含む従来の方法によって、発酵培地からセルラーゼを回収できる。通常、分画後、上清または濾液のタンパク質成分を例えば硫酸アンモニウムのような塩によって沈殿させる。次にその沈殿タンパク質を溶解させ、さらに例えばイオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、またはその分野で認められている別の同様の方法のような種々のクロマトグラフィーによって精製する。本発明に基づくセルラーゼの産生のために、セルロースベースのエネルギー供給源を含む培地を用いて、アルカリ条件下において宿主細胞を培養することが好ましい。
【００５５】
機能活性によって本発明のセルラーゼの精製をモニターすることが好ましい。好ましい機能測定法として、セルラーゼによるNPC ( ニトロフェニルセロビオシド) の加水分解の速度をモニターする。その方法は以下の通りである：
96 穴マイクロタイタープレートのウェルに2 重または3 重で20 μL の試料または標準品を添加する。標準品は既に得られておりかつよく特徴づけされているセルラーゼ試料、または商業的に購入したセルラーゼであって差し支えない。測定溶液100 μL を添加する。測定溶液は、濃縮ストック液とリン酸緩衝液を1 対5 で混合して調製する。濃縮ストック液は、100mM のリン酸ナトリウム溶液(pH8.0) 中の25mg/mlNPC(Sigma N4764) から成る。測定溶液を希釈するために同じリン酸緩衝液を用いることができる。NPC 基質を試料または標準品に添加するとすぐに、30 ℃で予め保温しておいたマイクロタイタープレートリーダーにプレートを挿入する。1410nm での読出しを1 分間隔で6 分間とる。
【００５６】
標準品を用いて標準曲線を作成することができる。曲線のY 軸はVmax であり、X 軸は標準品中のセルラーゼの濃度である。もし試料のVmax が標準品を用いて作成した標準曲線の範囲を超える場合は、試料を希釈して測定を繰り返す必要がある。
【００５７】
本発明の1 つの実施形態において、発現宿主細胞は、バシラス種、より好ましくはバシラス・リケニホルミス(Bacillus licheniformis) または枯草菌を含む。しかしながら、より好ましい実施形態において、宿主発現細胞は、ストレプトミセス種、より好ましくはストレプトミセス・リビデンス(Streptomyces lividens) を含む。プロテアーゼ欠失バシラス菌株のための好ましい一般的な形質転換および発現プロトコールは、この中に引例によって組み込まれているFerrari, et al., 米国特許第5,264,366 号において提供されている。ストレプトミセス種における形質転換および発現は、この中に引例によってその全体が組み込まれているHopwood, et al., GENETIC MANIPULATION OF STREPTOMYCES: A LABORATORY MANUAL, Innis (1985) において見ることができる。
【００５８】
本発明のDNA 配列でバシラス菌を形質転換させることは、得られる発現の点で効果的ではないことが見出された。従って、バシラス種を形質転換させる場合には、公知のバシラス種由来シグナル配列および他の調節配列と組み合わせてaprE プロモーターを利用することが好ましい。形質転換宿主細胞がアスペルギルスである場合は、好ましいプロモーターはglaA である。ストレプトミセスを用いる場合には、好ましいプロモーターは、アクチノプラーネス・ミソウリエンシス(Actinoplanes missouriensis) のグルコースイソメラーゼ(GI) プロモーターである。
【００５９】
完全長セルラーゼおよびそれをコードするDNA に加えて、本発明は切断セルラーゼ(truncated cellulase) およびセルラーゼの誘導体、ならびにそれらをコードするDNA も含む。通常、セルラーゼは2 つの活性ドメイン：触媒活性ドメインおよびセルロース結合ドメイン：を含む。本発明の切断セルラーゼは、本発明の完全長セルラーゼの触媒活性部分を含む。
【００６０】
1 つの実施形態において、切断セルラーゼは、完全長セルラーゼを切断することによって作成する。完全長セルラーゼは、例えば放線菌のような天然の宿主、または組換え宿主細胞の何れかから単離することができる。理論によって制限されないで、組換え宿主細胞の発酵プロセスの間にプロテアーゼが本発明のセルラーゼを切断すると考えられている。従って、非組換えセルラーゼまたは発酵プロセスの間に切断されない組換えセルラーゼの場合、そのようなプロテアーゼを本発明の完全長セルラーゼに添加して切断形態を作成できると想定される。
【００６１】
切断後、本発明の切断セルラーゼをセルラーゼ結合ドメインから分離することが必要であろう。その分離は、例えば分離用電気泳動、ゲル濾過またはサイズ排除クロマトグラフィー、および限外濾過等によって、サイズに基づき実施できる。他の可能な方法は、当業者に明白であり、かつイオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィーおよびアフィニティクロマトグラフィー、沈降平衡法等を含んでいて差し支えない。
【００６２】
あるいは、切断セルラーゼは、組換え的に作成しても差し支えない。この態様において、完全長セルラーゼの触媒活性部分のコード領域のみを含むDNA 配列を調製する。好ましい実施形態において、触媒活性ドメインの230 または233 アミノ酸をコードするDNA を調製する。そのDNA 配列は、合成手段によって、または完全長コード配列の制限酵素消化によって、調製することができる。もし制限酵素を用いる場合は、その酵素に依存して、1 本鎖DNA が突き出た(protruding) 末端を平滑末端にすることが必要であろう。そのような平滑末端化は、他方の突き出していない鎖を埋めることによって、または突き出した鎖を切断することによって達成できる。それら両方法の技術は、当業者に周知である。また、終止コドンを所望のコード領域の後に加えなければならないことを等業者は知っているであろう。コード領域の3 ’末端に終止コドンを加える技術は周知であり、かつ例えばAusubel or Sambrook において見ることができる。
【００６３】
DNA 配列の合成は、当業界において周知であり、かつ例えば、Beaucage & Caruthers, Tetrahedron Letts. 22(20): 1859-1862 (1981) において見ることができ、Needham-VanDevanter, et al., Nucl Acids Res. 12: 6159-6168 (1984) 等に記載のように自動合成装置を用いて実施できる。またDNA 配列は、例えばPromega (Madison, WI) のような熟練者に知られている種々の商業的供給源から、注文作成することができる。DNA 配列の精製は、必要な場合には、通常、Pearson & Regnier, J. Chrom. 255: 137-149 (1983) に記載のように、天然 (native) アクリルアミドゲル電気泳動または陰イオン交換HPLC によって実施する。合成オリゴヌクレオチドの配列は、Maxam & Gilbert, Methods in Enzymology 65: 499-560 (1980) に記載の化学的分解法を用いて確認できる。
【００６４】
別の方法において、完全長セルラーゼ遺伝子のコード領域をそのまま維持しながら所望の切断点に終止コドンを挿入することが好ましいであろう。例えばポリペプチドを切断し得る終止コドンを挿入するために、所定の核酸配列に変異をもたらす多くの方法がある。そのような周知の方法として、特定部位の突然変異誘発、縮退オリゴヌクレオチド(degenerate oligonucleotide) を用いたPCR 増幅、変性剤または放射線への核酸含有細胞の暴露、所望のオリゴヌクレオチドの化学合成（例えば大きな核酸を作成するために連結および／またはクローニングと併せて）ならびに他の周知技術が挙げられる。Giliman & Smith, Gene 8: 81-97 (1979) ；Roberts, et al., Nature 328: 731-734 (1987) ；Sambrook ；and Ausubel を参照。
【００６５】
本発明は、切断セルラーゼに加えて、完全長および切断セルラーゼの他の誘導体を含む。そのような誘導体は、例えばアミノ酸置換、非天然アミノ酸による置換、D −アミノ酸による置換または付加、ならびに別の基との結合を含む。終止コドンの挿入のために上述した方法に類似の方法で実施し得るアミノ酸置換を除いて、非天然アミノ酸による置換および他の基との結合は化学的に行うべきである。タンパク質の化学的修飾技術は、当業界で周知であり、かつ例えばCHEMISTRY AND BIOCHEMISTRY OF AMINO ACIDS, PEPTIDES, AND PROTEINS, B. Weinstein, (ed.), Maecel Dekker, New York, p.267 (1983) において見ることができる。
【００６６】
本発明のセルラーゼの同定
本発明は、図1 に記載のアミノ酸配列( 配列番号1) 、その断片、または50％ 以上の配列同一性、好ましくは70％ 以上の配列同一性、さらに最も好ましくは90％ 以上の配列同一性を有するそれらの誘導体であるセルラーゼを含む。同様に、本発明は、さらに、図2 に記載のDNA( 配列番号2) 、その断片、または76％ 以上の配列同一性、好ましくは80％ 以上の配列同一性、さらに最も好ましくは90％ 以上の配列同一性を有するそれらの誘導体を含む。
【００６７】
本発明は、完全長セルラーゼに加えて、完全長セルラーゼの切断形態を提供する。好ましくは、切断セルラーゼは、配列番号1 のアミノ酸位置31 からアミノ酸位置261 または264 によって表されるアミノ酸配列を有し、あるいは50％ 以上の配列同一性、好ましくは70％ 以上の配列同一性、さらに最も好ましくは90％ 以上の配列同一性を有するそのような配列の誘導体である。同様に、本発明はさらに、切断セルラーゼまたはその誘導体をコードするDNA であって、図2 に示すDNA 配列( 配列番号2) または76％ 以上の配列同一性、好ましくは80％ 以上の配列同一性、さらに最も好ましくは90％ 以上の配列同一性を有するその誘導体に対応するDNA を含む。好ましくは、そのDNA 配列は、配列番号2 の位置93 で開始し、かつ位置783 または792 まで包括的に伸長するヌクレオチドを含む。
【００６８】
好ましい実施形態において、所定のDNA 断片または遺伝子が、この中に記載のセルラーゼDNA 配列に相当するか否か、および従って本発明の範囲内であるか否かを分析するために、ハイブリダイゼーション法を用いる。ハイブリダイゼーション法は、本質的に以下の通りである：例えばEcoR I 、Hind III 、Bam HI 、Cla I 、Kpn I 、Mlu I 、Spe I 、Bgl II 、Nco I 、Xba I 、Xho I 、およびXma I （New England Biolabs, Inc., Beverly, MA and Boehringer Mannheim から購入）等の適切な制限酵素を用いて、その取扱い説明書に従って消化することによって、特定の標的供給源由来のゲノムDNA を断片化する。次に、サイズによるDNA 断片の分離を可視化し得るように、アガロースゲル( 例えば0.8％ アガロース) を用いた電気泳動で試料を流した。通常、臭化エチジウム染色によってDNA 断片を可視化する。ゲルを蒸留水で軽く洗浄し、さらに続いて適切な溶液（例えば0.25M HCl のような）中において穏やかに振とうして脱プリン化し、その後（例えば0.4M NaOH 中において）30 分間、穏やかに振とうして変性させる。ゲルを1.5M NaCl 、1M Tris 、pH7.0 の溶液中に入れて30 分間穏やかに振とうする再生処理が含まれるであろう。次に、トランスファー溶液（例えば6x SSC(900mM NaCl, 90mM クエン酸3 ナトリウム) ）を用いて、例えば最強ニトランプラス膜(Maxmum Strength Nytran Plus membrane)(Schleicher & Schuell, Keene, N.H.) のような適切な正荷電膜上にDNA を転写させる。転写が完了するとすぐに（通常約2 時間後）、例えば2x SSC(2x SSC=300mM NaCl, 30mM クエン酸3 ナトリウム) 中で膜を洗浄し、さらに室温で風乾させる。次に、適切なプレハイブリダイゼーション溶液（例えば100mL 当たりホルムアミド20-50mL 、20x SSPE(1x SSPE=0.18M NaCl, 1mM EDTA, 10mM NaH2PO4, pH7.7) 25mL 、20％SDS 2.5mL 、および10mg/ml の剪断したニシン精子DNA 1mL を含有する水溶液）中において、その膜上でプレハイブリッド形成させる（約2 時間以上）。当業者に公知であるように、プレハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミドの量は、日常的な方法に従って得られる反応の性質に基づき変化し得る。従って、より少ない量のホルムアミドを用いると、ハイブリッド形成した分子を同定する点において、より多くの量のホルムアミドを用いた同じ方法よりもより完全なハイブリダイゼーションを達成することができる。一方、より多くのホルムアミドを用いると、強いハイブリダイゼーションバンドを視覚によってより容易に同定できる。
【００６９】
図2 の配列から選択した通常100 から1000 塩基の範囲の長さのDNA プローブは、アガロースゲルでの電気泳動によって単離し、そのゲルから断片を切り出し、さらに切り出したアガロースから回収しなければならない。さらに詳細な方法はSambrook を参照。次に、そのDNA の精製断片を標識し（例えば、Megaprime labeling system を用いて、その取扱い説明に従って）、32P をDNA に取り込ませる。95 ℃で5 分間加熱することによって標識プローブを変性させ、その後すぐに膜の入ったプレハイブリダイゼーション溶液に添加する。ハイブリダイゼーション反応は、例えば37 ℃で18 時間穏やかに振とうしまたは回転させる等、適切な条件下において、適切な時間進めなければならない。膜をすすぎ（例えば2x SSC/0.3％SDS 中において）、さらに適切な洗浄液中において穏やかに攪拌して洗浄する。所望の厳格性(stringency) は、膜（フィルター）を洗浄する条件を反映するであろう。
【００７０】
具体的には、所定の反応の厳格性（すなわちハイブリダイゼーションの成功のために必要な相同性の割合）は、ハイブリダイゼーション後におけるフィルターの洗浄条件に依存するであろう。この中で定義されている「低い厳格性」条件は、20 ℃で15 分間、0.2x SSC/0.1％ SDS を用いてフィルターを洗浄することを含む。「高い厳格性」条件は、二回目に37 ℃で30 分間、0.2x SSC/0.1％ SDS を用いてフィルターを洗浄することを含む更なる洗浄処理を含む。
【００７１】
洗浄後、膜を乾燥させ、さらに結合したプローブを検出する。標識試薬として32P または別の放射性同位体を用いる場合は、オートラジオグラフィーによって結合したプローブを検出できる。他のプローブの可視化のための他の技術は、当業者に周知である。結合したプローブの検出は、核酸配列が所望の相同性を有し、および従って配列番号2 に対する同一性を有し、さらには本発明の範囲に含まれることを示唆する。
【００７２】
本発明のセルラーゼタンパク質および誘導体は、物理化学的または機能的の何れか、ならびに好ましくは両方について特徴付けできる。物理化学的特徴付けは：タンパク質の分子量を特定するためのSDS 電気泳動、ゲル濾過、アミノ酸組成分析、質量分析、および沈降；タンパク質のpI （等電点）を特定するための等電点電気泳動；タンパク質のアミノ酸配列を特定するためのアミノ酸配列決定；タンパク質の三次構造を特定するための結晶解析；ならびにタンパク質に存在する抗原エピトープを特定するための抗体結合：のような当業界における周知技術を駆使して行う。
【００７３】
機能的特徴付けは、セルラーゼの分野の熟練者に周知の技術によって特定され、結晶性カルボキシメチルセルロース(CMC) の加水分解を含むが、それに限定はされない。機能的特徴付けのためのその好ましい技術は、後述の実施例5 においてさらに詳細に記載している。
【００７４】
上に挙げた技術のいくつかを用いて、本発明の完全長セルラーゼが、SDS −PAGE で測定すると、分子量約30 から40 ｋD であり、好ましくは34 ｋD から約38kD であり、さらに最も好ましくは36 ｋD であることを見出した。完全長セルラーゼは、計算された等電点が約4 から約5 であり、好ましくは4.5 であり、かつCMC でのpH 最適条件が温度に依存して約5 から約10 であることを見出した。pH 最適条件は、40 ℃では8 であり、かつ60 ℃では7 であることを見出した。本発明の切断セルラーゼは、分子量が20 から30kD の範囲であり、好ましくは約23 から26kD の範囲であり、さらに最も好ましくは24 から25kD の範囲であることを見出した。
【００７５】
本発明のセルラーゼの使用
本発明に基づく織物の加工は、本発明のセルラーゼを含む組成物を用いた織物処理または洗濯を含む。そのような加工として：ストーンウォッシュ；セルロース含有織物の織目、感触および／または外観の改善；またはセルロース含有織物の製造または洗濯／再生の間に用いられる他の技術：が挙げられるが、それらに限定はされない。従って、本発明の背景にある加工とは、セルロース製の織物または繊維から、「未熟な(immature) 」または「だめになった(dead) 」綿を除去することを意味する。未熟な綿は、成熟した綿よりも顕著にまとまりが無く、例えば染色むらのせいで生じる。さらに、本発明は、染みがついたセルロース含有織物製品を洗濯するのに用いるセルラーゼ成分を含む組成物を考えている。例えば、本発明のセルラーゼは、洗濯用の洗剤組成物において用いることができる。本発明に基いて有用である洗剤組成物は、前洗い用洗剤、浸置き用洗剤、および家庭で用いる色再生用組成物のような調製品を含む。この中に記載されているような加工用組成物は、希釈を必要とする濃縮した形態、あるいは希釈液の形態またはセルロース含有織物に直接用いることができる形態であって差し支えない。セルラーゼの織物加工のための一般的な加工技術は、例えば欧州特許出願公開第220016 号、ならびに英国特許出願第1,368,599 号および台2,095,275 号に記載されている。
【００７６】
本発明に基づくセルロース製物質の加工は、さらに、当業界で公知である目的のために、動物飼料、パルプおよび／または紙、食物、および穀物を加工することを含む。例えば、セルラーゼは、動物飼料の価値を高め、木材パルプの乾燥性を改善し、食品を強化し、さらに穀物の湿式製粉工程または乾式製粉工程の間に穀物中の繊維を減らすことが知られている。
【００７７】
本発明に基づく加工は、効果量のセルラーゼ、またはセルラーゼと例えば緩衝剤、界面活性剤、および／または精練剤等の他の最適成分との組合せを含有する水溶液を調製することを含む。セルラーゼ酵素組成物の効果量は、その意図する目的のために十分なセルラーゼの濃度である。従って、例えば、本発明に基づくストーンウォッシュ用の組成物におけるセルラーゼの「効果量」は、例えば縫い目およびはぎ布に着古したおよび色あせた外観をもたらすため等に所望の効果を提供するような量である。同様に、セルラーゼ含有織物の感触および／または外観を改善することを意図する組成物におけるセルラーゼの「効果量」は、例えば織物の滑らかさを改善するような感触における適度の改善、または例えば織物の外観における鮮明さを下げる傾向がある毛玉および小繊維を除去するような外観における適度の改善をもたらす量である。また、用いるセルラーゼの量は、用いる装置、用いる工程のパラメーター（セルラーゼ処理溶液の温度、セルラーゼ溶液に曝す時間等）、ならびにセルラーゼ活性（例えばより活性が低いセルラーゼ組成物と比較して、より活性が高いセルラーゼ組成物を用いた場合には、より低いセルラーゼ濃度が要求されるであろう）に依存する。加工すべき織物を加える加工用水溶液中の正確なセルラーゼ濃度は、上記因子ならびに所望の結果に基づき、当業者熟練者が容易に特定できる。ストーンウォッシュの工程において、加工用水溶液中、通常、セルラーゼは約0.5 から5,000ppm 全タンパク質の濃度、さらに最も好ましくは約10 から200ppm 全タンパク質の濃度で存在することが好ましい。セルラーゼ含有織物の感触および／または外観の改善のための組成物では、加工用水溶液中、通常、セルラーゼは約0.1 から2,000ppm 全タンパク質の濃度、さらに最も好ましくは約0.5 から200ppm 全タンパク質の濃度で存在することが望ましい。
【００７８】
加工の好ましい実施形態において、緩衝液の濃度が、用いるセルラーゼが活性を示す範囲内に溶液のpH を維持するのに十分であるように、加工用組成物において緩衝液を用いる。セルラーゼが活性を示すpH は、用いるセルラーゼの特性に依存する。用いる緩衝液の正確な濃度は、熟練者が容易に考慮し得るいくつかの因子に依存するであろう。例えば、好ましい実施形態において、緩衝液ならびに緩衝液の濃度は、最終セルラーゼ溶液のpH を最適セルラーゼ活性に必要なpH 範囲内に維持するように選択する。本発明のセルラーゼの最適pH 範囲の特定は、周知技術に基づいて確かめることができる。
【００７９】
セルラーゼおよび緩衝液に加えて、加工用組成物は、必要に応じて界面活性剤を含んでいて差し支えない。適切な界面活性剤として、例えば陰イオン性、非イオン性、および両性界面活性剤等の、用いるセルラーゼおよび織物と相性の良い任意の界面活性剤が挙げられる。適切な陰イオン性界面活性剤として：直鎖または分枝のアルキルベンゼンスルホン酸塩；直鎖または分枝アルキル基またはアルケニル基を有するアルキルまたはアルケニルエーテル硫酸塩；アルキルまたはアルケニル硫酸塩；オレフィンスルホン酸塩；アルカンスルホン酸塩等：が挙げられるが、それらに限定はされない。陰イオン性界面活性剤のための適切な対イオンとして：ナトリウムおよびカリウムのようなアルカリ金属イオン；カルシウムおよびマグネシウムイオンのようなアルカリ土類金属イオン；アンモニウムイオン；ならびに炭素数2 または3 のアルカノール基を1 から3 つ有するアルカノールアミン：が挙げられるが、それらに限定はされない。両性界面活性剤として、例えばスルホン酸第4 級アンモニウム塩、およびベタイン型両性界面活性剤が挙げられる。そのような両性界面活性剤は、同じ分子内に正および負電荷の両方の基を有する。非イオン性界面活性剤は通常、ポリオキシアルキレンエーテル、およびそれらの高級脂肪酸アルカノールアミドまたはアルキレンオキシド付加物、ならびに脂肪酸グリセリンモノエステルを含む。当業者に公知の方法において、界面活性剤の混合物を用いても差し支えない。
【００８０】
この中に記載の方法での使用のために濃縮セルラーゼ組成物を調製しても差し支えない。そのような濃縮物は、好ましくは水溶液中に、濃縮された量の上記セルラーゼ組成物、緩衝剤、および界面活性剤を含有する。そのように形成した場合、各成分の必要濃度を有するセルラーゼ調製液を迅速かつ正確に調製するために、セルラーゼ濃縮物を水で容易に希釈することができる。濃縮水溶液を形成した場合、上記のように、セルラーゼ溶液中の成分が必要濃度になるようにそれら濃縮液を希釈することができる。そのようなセルラーゼ濃縮物が、セルラーゼ溶液の容易な調製を可能とし、かつ用いる場所にその組成物を便利に運ぶことを可能とすることは容易に理解できる。加工用濃縮物は、例えば液体、エマルジョン、ゲル、またはペーストのような任意の当業界で公認の形態であって差し支えない。そのような形態は、当業者に周知である。
【００８１】
固形のセルラーゼ濃縮物を用いる場合、そのセルラーゼ組成物は、顆粒、粉末、塊、または固い円盤状の形態(solid disk) であって差し支えない。顆粒は、洗浄液(wash medium) への顆粒の溶解速度を下げるような物質を含むように形成しても差し支えない。そのような物質および顆粒については、引例によってその全体がこの中に組み込まれている米国特許第5,254,283 号に開示されている。
【００８２】
また、要望通りに、組成物の最終的な用途に基づいて石、軽石、充填剤、溶剤、酵素活性化剤、および再付着防止剤(anti-redeposition agents) 等の他の物質を本発明のセルラーゼ組成物と共に用いてもよく、あるいはその組成物中に含めても差し支えない。
【００８３】
実施例によって、ストーンウォッシュの方法が詳細に記載されているが、記載のパラメーターは、他の用途、すなわち織物の感触および／外観の改善のため等のために当業者が容易に変更できる。加工用組成物をストーンウォッシュ組成物と混ぜ、さらにセルラーゼ酵素を織物に接近させることによって、セルロース含有織物を効果量のセルラーゼを含有するセルラーゼ含有ストーンウォッシュ組成物と接触させる。続いて、セルラーゼを含む水溶液と織物をかき混ぜる。加工用組成物が水溶液である場合は、繊維を直接その溶液中に浸すことができる。同様に、ストーンウォッシュ組成物が濃縮物である場合は、セルロース含有織物の入った浴槽でその濃縮物を希釈する。ストーンウォッシュ組成物が例えば前洗い用ゲルまたは固形棒のような固形である場合は、その組成物を直接織物または洗浄液に加えることによって、そのストーンウォッシュ組成物を接触させることができる。
【００８４】
その酵素作用によってセルロース含有織物にストーンウォッシュした外観を与えるのに効果的な条件下において、セルロース含有織物をストーンウォッシュ組成物と共にインキュベートする。例えば、ストーンウォッシュの間、pH 、液体比、温度および反応時間は、ストーンショッシュ組成物が作用する条件を最適化するように調整することができる。「効果的な条件」とは、必然的に、セルラーゼ酵素がセルロース含有織物と効果的に反応できるような、すなわちこの場合にはストーンウォッシュ効果が得られるようなpH 、液体比、および温度を称する。本発明に基づくストーンウォッシュ組成物を用いるための条件を最適化することは、慣用技術の範囲内である。
【００８５】
この中で用いられるストーンウォッシュにおける液体比、すなわち織物の重量に対するストーンウォッシュ組成物溶液（すなわち洗浄液）の重量の比は、通常、デニムの織物において所望のストーンウォッシュ効果を得るのに十分な量であり、用いる工程に依存する。好ましくは、液体比は：約4 ：1 から約50 ：1 であり；より好ましくは約5 ：1 から約20 ：1 であり；さらに最も好ましくは約10 ：1 から約15 ：1 である。
【００８６】
本ストーンウォッシュ組成物を用いたストーンウォッシュの間の反応温度は、2 つの競合する因子によって制御される。第一に、高い温度は通常、反応速度を高め、すなわち反応を速くし、より低い温度で必要とされる反応時間よりも反応時間を短くする。従って、反応温度は通常、約10 ℃以上である。第二に、セルラーゼは、所定の反応温度を超えると活性を失うタンパク質であり、その温度は用いるセルラーゼの特性に依存する。従って、反応温度を過度に高くすると、セルラーゼ変性の結果としてセルロース分解活性を失う。セルラーゼ使用のための標準温度は通常、35 ℃から65 ℃であり、かつそれら条件は本発明のセルラーゼにも適していると予想するが、周知技術に基づいて、用いる特定のセルラーゼに関して最適温度条件を確かめるべきであろう。
【００８７】
反応時間は、ストーンウォッシュを行う特定の条件に依存する。例えば、pH 、温度、およびセルラーゼの濃度は、何れも最適反応時間に影響を及ぼすであろう。通常、反応時間は、約5 分から約5 時間であり、好ましくは約10 分から約3 時間であり、さらに好ましくは約20 分から約1 時間である。
【００８８】
本発明のさらに別の好ましい実施形態において、本発明のセルラーゼを洗剤組成物中において用いることができる。本発明に基づく洗剤組成物は、前洗い用組成物、浸置き用組成物として、または通常の洗浄またはすすぎサイクルによる洗濯のために有用である。好ましくは、本発明の洗剤組成物は、効果量のセルラーゼ、および界面活性剤を含み、さらに必要に応じて、下記の他の成分を含む。
【００８９】
本発明の洗剤組成物中において用いるセルラーゼの効果量は、例えば毛玉除去、柔軟化、毛玉防止、表面繊維除去、灰色化の防止(anti-graying) 、および洗浄のような、セルラーゼによるセルロース含有織物に対する所望の効果をもたらすのに十分な量である。好ましくは、洗剤組成物中のセルラーゼは、洗剤の約10ppm から約20,000ppm の濃度で使用する。
【００９０】
洗剤組成物中において用いるセルラーゼ酵素の濃度は、好ましくは、洗浄液への希釈に基づき、セルラーゼ酵素の濃度が約0.01 から約1,000ppm 全タンパク質の範囲、好ましくは約0.02ppm から約500ppm 全タンパク質の範囲、さらに最も好ましくは約0.5ppm から約250ppm 全タンパク質になるように選択する。洗剤組成物中において用いるセルラーゼ酵素の量は、洗浄溶液を形成するために水に添加してその洗剤を希釈する程度に依存するであろう。
【００９１】
本発明の洗剤組成物は、例えば、液体、顆粒、エマルジョン、ゲル、またはペーストのような任意の当業界で公認の形態であって差し支えない。そのような形態は、熟練者に周知である。固形洗剤組成物を用いる場合、好ましくは顆粒としてセルラーゼを形成する。好ましくは、セルラーゼ保護剤を付加的に含むように顆粒を形成することができる。洗浄液への顆粒の溶解速度を下げるような物質を含むように顆粒を形成しても差し支えない。そのような物質および顆粒については、引例によってその全体がこの中に組み込まれている米国特許第5,254,283 号に開示されている。
【００９２】
本発明の洗剤組成物は、界面活性剤、すなわち洗剤組成物での使用が周知である陰イオン性、および両性界面活性剤等の界面活性剤を用いる。
【００９３】
本発明の洗剤組成物において用いるための適切な陰イオン性界面活性剤として：直鎖または分枝アルキルベンゼンスルホン酸塩；直鎖または分枝アルキル基またはアルケニル基を有するアルキルまたはアルケニルエーテル硫酸塩；アルキルまたはアルケニル硫酸塩；オレフィンスルホン酸塩；アルカンスルホン酸塩等：が挙げられる。陰イオン性界面活性剤のための適切な対イオンとして：ナトリウムおよびカリウムのようなアルカリ金属イオン；カルシウムおよびマグネシウム；ならびに炭素数2 または3 のアルカノール基を1 から3 つ有するアルカノールアミン：が挙げられる。両性界面活性剤として、スルホン酸第4 級アンモニウム塩、およびベタイン型両性界面活性剤が挙げられる。そのような両性界面活性剤は、同じ分子内に正および負電荷の両方の基を有する。非イオン性界面活性剤は通常、ポリオキシアルキレンエーテル、およびそれらの高級脂肪酸アルカノールアミドまたはアルキレンオキシド付加物、ならびに脂肪酸グリセリンモノエステル等を含む。そのような界面活性剤の混合物を用いても差し支えない。界面活性剤または界面活性剤の混合物は、本発明の洗剤組成物において通常、全洗剤組成物の約1 重量％ から約95 重量％ 、好ましくは全洗剤組成物の約5 重量％ から約45 重量％ の量で使用する。セルラーゼ組成物および界面活性剤に加えて、本発明の洗剤組成物は、必要に応じて、1 つ以上の以下の成分を含んでいて差し支えない。
【００９４】
セルラーゼ以外の加水分解酵素
適切な加水分解酵素として、エステル結合に作用する、カルボン酸エステル加水分解酵素、チオエステル加水分解酵素、リン酸モノエステル加水分解酵素、およびリン酸ジエステル加水分解酵素；グリコシル化合物に作用するグリコシド加水分解酵素；N −グリコシル化合物を加水分解する酵素；エーテル結合に作用するチオエーテル加水分解酵素；ならびにペプチド結合に作用するアミノ−アシル−ペプチド加水分解酵素、ペプチジル−アミノ酸加水分解酵素、アシル−アミノ酸加水分解酵素、ジペプチド加水分解酵素、およびペプチジル−ペプチド加水分解酵素が挙げられる。それらの中で好ましいのは、カルボン酸エステル加水分解酵素、グリコシド加水分解酵素、およびペプチジル−ペプチド加水分解酵素である。適切な加水分解酵素として、（1 ）ペプシン、ペプシンB 、レンニン、トリプシン、キモトリプシンA 、キモトリプシンB 、エラスターゼ、エンテロキナーゼ、カテプシンC 、パパイン、キモパパイン、フィシン、トロンビン、フィブリノリシン、レニン、ズブチリシン、アスペルギルスペプチダーゼ(aspergillopeptidase)A 、コラゲナーゼ、クロストリジウムペプチダーゼ(clostridiopetidase)B 、カリクレイン、ガストリシン、カテプシンD. 、ブロメリン、ケラチナーゼ、キモトリプシンC 、ペプシンC 、アスペルギルスペプチダーゼB 、ウロキナーゼ、カルボキシペプチダーゼA およびB 、ならびにアミノペプチダーゼのようなペプチジル−ペプチド加水分解酵素に属するプロテアーゼ；（2 ）α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、転換酵素、リゾチーム、ペクチナーゼ、キチナーゼ、およびデキストラナーゼのようなグリコシド加水分解酵素（本質的な構成要素であるセルラーゼはこのグループから除かれる）が挙げられる。それらの中でα−アミラーゼおよびβ−アミラーゼが好ましい。それら酵素は、酸性から中性の系で機能するが、細菌から得られた酵素は、アルカリ系で高い活性を示す；（3 ）カルボキシルエステラーゼ、リパーゼ、ペクチンエステラーゼ、およびクロロフィラーゼを含むカルボン酸エステル加水分解酵素。それらの中でリパーゼが特に効果的である。
【００９５】
セルラーゼ以外の加水分解酵素は、その目的に従って要求される量だけ洗剤組成物中に加える。好ましくは、精製タンパク質に関して、0.001 から5 重量％ 、さらにより好ましくは0.02 から3 重量％ の量で加えるべきである。本酵素は、単独で、あるいは洗剤組成物中の他の成分と組み合わせて、精製していない酵素から成る顆粒の形態で用いるべきである。精製していない酵素の顆粒は、その顆粒中の精製酵素が0.001 から50 重量％ となるような量で用いる。その顆粒は、0.002 から20 重量％ 、好ましくは0.1 から10 重量％ の量で用いる。セルラーゼを用いる場合と同様に、それら顆粒は、酵素保護剤および溶解遅延物質(dissolution retardant material) を含むように形成して差し支えない。
【００９６】
陽イオン性界面活性剤および長鎖脂肪酸塩
そのような陽イオン性界面活性剤および長鎖脂肪酸塩として、飽和または不飽和脂肪酸塩、アルキルまたはアルケニルエステルカルボン酸塩、3 から4 つのアルキル置換基および1 つまでのフェニル置換アルキル置換基を有するものを含むα−第4 級アンモニウム塩が挙げられる。適切な陽イオン性界面活性剤および長鎖脂肪酸塩は、英国特許出願第2 094 826 A 号に開示されており、その公報は引例によってこの中に組み込まれている。組成物は、約1 から20 重量％ のそのような陽イオン性界面活性剤および長鎖脂肪酸塩を含んでいて差し支えない。
【００９７】
ビルダー
Ａ． 2 価の金属イオン封鎖剤
組成物は、以下の化合物：リン酸塩、ホスホン酸塩、ホスホノカルボン酸塩、アミノ酸塩、アミノポリアセテート高分子電解質、非解離性高分子、ジカルボン酸塩、およびアルミノケイ酸塩：のアルカリ金属塩およびアルカノールアミン塩より成る群から選択した1 つ以上のビルダー成分を約0 から約50 重量％ の量で含んでいて差し支えない。適切な2 価の金属イオン封鎖剤は、英国特許出願第2 094 826 A 号に開示されており、その公報は引例によってこの中に組み込まれている。
【００９８】
Ｂ．アルカリまたは無機電解質
組成物は、アルカリまたは無機電解質として、1 つ以上の以下の化合物：ケイ酸塩、カルボン酸塩、ならびにトリエタノールアミン、ジエタノールアミン、モノエタノールアミンおよびトリイソプロパノールアミンのような有機アルカリ：のアルカリ金属塩をその組成物の約1 から約50 重量％ 、好ましくは約5 から約30 重量％ の量で含んでいて差し支えない。
【００９９】
再付着防止剤
組成物は、再付着防止剤として、1 つ以上の以下の化合物：ポリチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、およびカルボキシメチルセルロース：を約0.1 から約5 重量％ の量で含んでいて差し支えない。
【０１００】
それらの中で、カルボキシメチルセルロースおよび／またはポリエチレングリコールと本発明のセルラーゼ組成物の組合せは、特に有用な汚れ除去組成物を提供する。
【０１０１】
漂白剤
モノ過硫酸カリウム、過炭酸ナトリウム、過ホウ酸ナトリウム、硫酸ナトリウム／過酸化水素付加物、および塩化ナトリウム／過酸化水素付加物のような漂白剤または／およびスルホン化フタロシアニンの亜鉛もしくはアルミニウム塩のような光感受性の漂白色素と組み合わせた本発明のセルラーゼの使用は、洗浄効果をさらに改善する。同様に、欧州特許第684 304 号に記載の漂白剤および漂白触媒を用いることができる。
【０１０２】
青味剤および蛍光色素
もし必要であれば、種々の青味剤および蛍光色素を組成物中に加えても差し支えない。適切な青味剤および蛍光色素は、英国特許出願第2 194 826 A に開示されており、その公報は引例によってこの中に組み込まれている。
【０１０３】
粘結阻害剤 (caking inhibitors)
以下の粘結阻害剤：p −トルエンスルホン酸塩、キシレンスルホン酸塩、酢酸塩、スルホコハク酸塩、タルク、細かく粉砕したシリカ、アモルファスシリカ、粘土、ケイ酸カルシウム（Micro-Cell of Johns Manville Co. のような）、カルボン酸カルシウム、およびマグネシウムオキシド：を粉末洗剤に加えて差し支えない。
【０１０４】
酸化防止剤
酸化防止剤として、例えばtert −ブチル−ヒドロキシトルエン、4,4 ’−ブチリデンビス(6 −tert −ブチル−3 −メチルフェノール) 、2,2 ’−ブチリデンビス(6 −tert −ブチル−4 −メチルフェノール) 、モノスチレン化クレゾール、モノスチレン化フェノール、ジスチレン化フェノール、および1,1 −ビス(4 −ヒドロキシ−フェニル) シクロヘキサンが挙げられる。
【０１０５】
可溶化剤
可溶化剤として、例えばエタノールのような低級アルコール、ベンゼンスルホン酸塩、p −トルエンスルホン酸塩のような低級アルキルベンゼンスルホン酸塩、プロピレングリコールのようなグリコール、アセチルベンゼン−スルホン酸塩、アセトアミド、ピリジンジカルボン酸アミド、安息香酸塩、および尿素が挙げられる。
【０１０６】
本発明の洗剤組成物は、酸性からアルカリ性にわたる広いpH 範囲で用いることができる。好ましい実施形態において、本発明の洗剤組成物は、約5 から約12 以下の範囲のpH を有するわずかに酸性、中性、またはアルカリ性の洗剤の洗浄液中で用いることができる。
【０１０７】
もし望むのであれば、上記成分の他に、香料、緩衝剤、防腐剤、色素等を本発明の洗剤組成物と共に用いることができる。そのような成分は、等業界で用いられている量で普通に用いる。
【０１０８】
本発明において用いる洗剤基材(detergent base) が粉末の形態である場合、スプレー−乾燥法および造粒法等の任意の公知の調製法によって調製される基材であって差し支えない。特に、スプレー−乾燥法、凝集法、乾燥混合法、または非タワールート (non-tower route) 法によって得られる洗剤基材が好ましい。スプレー−乾燥法によって得られる洗剤基材は、調製条件に関して限定されない。スプレー−乾燥法によって得られる洗剤基材は、界面活性剤およびビルダーのような熱耐性成分の懸濁水溶液を熱い空間にスプレーすることによって得られる中空顆粒(hollow granules) である。スプレー−乾燥の後、香料、酵素、漂白剤、無機アルカリビルダーを加えて差し支えない。スプレー−乾燥−造粒または凝集法によって得られた非常に濃厚な顆粒状の洗剤基材と共に、種々の成分をその基材の調製後に加えても差し支えない。
【０１０９】
洗剤基材が液体である場合は、その液体は、均一溶液または不均一な分散液のいずれであっても差し支えない。洗剤中のセルラーゼによるカルボキシメチルセルロースの分解を防ぐために、組成物中に加える前に、カルボキシメチルセルロースを造粒し、または被覆するのが望ましい。
【０１１０】
工業的および家庭用の用途において、それらの環境で普通用いられている温度、反応時間、および液体比で、例えば汚れた織物のようなセルロース含有織物と共に本発明の洗剤組成物をインキュベートすることができる。
【０１１１】
さらに、本発明に基づく洗剤は、柔軟化、毛玉除去、毛玉防止、表面繊維除去、または洗浄に所望の改善をもたらすのに十分な活性が存在するような中間的pH の適切な溶液中における前洗い用洗剤として調製しても差し支えない。洗剤組成物が、液体、スプレー、ゲル、またはペースト状である浸置き用( 例えば前洗い用または前処理用) 組成物である場合、セルラーゼ酵素は、通常、浸置き用または前処理用組成物の全重量の約0.0001 から約1 重量％ の範囲で用いる。そのような組成物中において、必要に応じて界面活性剤を用いて差し支えなく、用いる場合は、通常、浸置き用組成物の全重量の約0.005 から約20 重量％ の範囲の濃度で含む。組成物の残りは、浸置き用洗剤において普通用いられている成分、すなわち希釈剤、緩衝剤、他の酵素（プロテアーゼ）等をそれらの普通の濃度で含有する。
【０１１２】
この中に記載のセルラーゼ酵素を含有する組成物は、色あせた織物の色の再生（例えば、引例によってその全体がこの中に組み込まれている米国特許第4,738,682 号を参照）に適した単独の組成物として家庭用に使用でき、ならびに染み抜きおよび毛玉除去や毛玉防止のために使用することができる。
【０１１３】
本発明に基づくセルラーゼの使用は、特に、飼料添加物ならびにパルプおよび紙の加工において有用である。それら付加的な産業上の利用は、それぞれ、例えば国際特許出願公開第95/16360 およびフィンランド特許第87372 号に記載されている。
【０１１４】
さらに本発明およびその利点を説明するために、以下の特定の実施例を示すが、
本発明を例示するために提示するものであり、何ら本発明の範囲を限定するものとみなしてはならないことを理解すべきである。
【０１１５】
実施例
実施例 1
アルカリ性土壌および水の試料からのセルラーゼ産生微生物の単離
アルカリ性泥の試料を4％(w/v)NaCl, 1％(w/v)Na2CO3 液5mL 中に懸濁させ、さらに力強く振る。同じ溶液での連続希釈液を50 μg/mL リファンピシン含有土壌抽出寒天(pH10) 上にのせた。
【０１１６】
土壌抽出寒天は、以下のように調製した：庭の土壌1Kg を脱塩水1L 中に懸濁させた。その懸濁液を1 ２0 ℃で20 分間オートクレーブ処理した。その懸濁液をガラス繊維フィルター(Whatman, GF/A) で濾過し、さらに残った固形物を脱塩水で2 回洗浄した(1x200mL, 1x100mL) 。濾液を水で1L に合わせる。固化のために2％(w/v) 寒天を添加した8％(w/v)NaCl, 2％(w/v)NaCO3 の滅菌溶液と等容量の滅菌濾液を混合した。
【０１１７】
蒸発を避けるために密閉箱において30 ℃で数週間プレートをインキュベートした。プレートを実体顕微鏡で定期的に観察し、さらに微小コロニーを0.3％(w/v) カルボキシメチルセルロース含有アルカリ性寒天に移した。セルラーゼ活性を検出するために二重(duplicate) で培養菌を用いた。プレートを二重で0.1％(w/v) コンゴレッドに15 分間浸し、さらに1M NaCl で30 分間染みを除く。コロニーの周りの除去地帯(cleaning zone) を表す細胞株を可能性のあるセルラーゼ産生微生物として選択した。
【０１１８】
国際特許出願公開第WO96/34108 号に記載のように、除去地帯を示す菌株を25 ｍL 中で発酵させ、その後CMC を添加した。
【０１１９】
上記の方法を用いて、本発明に基づくセルラーゼを産生した菌株を単離し、さらに糸状菌として特徴づけした。外観および部分的な16s rRNA 遺伝子配列分析( 実施例4) に基づき、その微生物をストレプトミセス種として分類した。
【０１２０】
セルラーゼ産生菌株の形態学的検査を行った。PH10 の土壌抽出寒天上で培養した場合、最初の小さな丸いキラキラ光る透明なコロニーが数日後には白から灰−白色の気性菌糸体(aerial mycelium) に発達する。アルカリ性寒天上では、その菌株は、成熟すると気性菌糸体を産生する乾燥して固いクリーム色の不透明なコロニーを形成する。顕微鏡下において、その菌株は、不規則な長さに寸断し、芽胞、および鎖内の芽胞を孤立させているような広範囲に分枝した偽似菌糸体を表す。
【０１２１】
実施例 2
DNA の単離、セルラーゼの形質転換および発現
実施例1 に基づき単離した好アルカリ性放線菌をE. coli. での発現クローニングのための供与菌株として選択した。Saito & Miura, Biochim. Biophys. Acta., 72: 619-629 (1963) に記載の方法に基づき、染色体DNA を単離した。
【０１２２】
単離した染色体DNA は、供給業者推薦の条件下において、制限酵素Sau3A の連続希釈した酵素溶液を用いて、反応緩衝液(Gibco BRL Life Technologies, Gaithersburg, Md., USA) 中、37 ℃で１時間、部分的に消化した。消化したDNA をアガロースゲル電気泳動によって分画し、さらに供給業者(QIAGEN Inc., Chatsworth, CA, USA) 記載のプロトコールに基づきQIAquick ゲル抽出キットを用いて、適切な断片(2 −6kb) をゲルから単離した。
【０１２３】
アルカリ耐性放線菌株のゲノム遺伝子ライブラリーをpUC19 派生プラスミド中に構築した(Yanisch-Perron, C. et al., Gene 33: 103 (1985)) 。Wood, et al., Meth. Enzym., 160: 59-74 (1988)2 記載のように、寒天ゲル拡散法によって組換えクローンをスクリーニングした。コロニーの周りの除去地帯を示した菌株を単離した。供給業者(QIAGEN Inc) 記載のプロトコールに基づき、QIAprep プラスミドキットを用いて、セルラーゼ産生組換え体のプラスミドDNA を単離した。公知の保存セルラーゼ配列に対するその配列の類似性が公開データベースでのFASTA 調査によって特定されるまで、両方の末端から3.5kb 断片のヌクレオチド配列を特定した。保存配列の特定に基づき、遺伝子の残りの配列を決定した。
【０１２４】
単離した遺伝子は、27 アミノ酸のシグナル配列を含む371 アミノ酸を有する前駆タンパク質をコードする1173 塩基対を包含する。成熟タンパク質は、推測分子量が35,766 であり、かつ計算したPI が5.9 の344 アミノ酸を包含する。セルラーゼをコードするその遺伝子のヌクレオチド配列( 配列番号1) 、および成熟セルラーゼの推測アミノ酸配列( 配列番号2) を図1 および図2 に示す。
【０１２５】
上記のように調製した構造遺伝子をコードするセルラーゼ遺伝子のDNA 断片をベクターpHPLT 中にクローン化した( 図4 を参照) 。そのベクターは、バシラス・リケニホルミスの耐熱性アミラーゼ遺伝子のプロモーターおよびシグナル配列をすでに含んでおり、さらにバシラス菌において高い発現をもたらすことが見出されている（図5 を参照）。コンピテントバシラス宿主細胞の形質転換を実施することによって、セルラーゼ産生組換えバシラスクローンを単離し、さらにクローン化セルラーゼの産生に適した条件下で培養した。
【０１２６】
近い類縁関係にある系統を特定するために、種々のライブラリーにおける利用可能な配列データ(GeneBank, Swiss-Prot, EMBL and PIR) と比較することによって、36kD セルラーゼのアミノ酸配列をコードする遺伝子を解析した。高い相同性が見出されたのは、アスペルギルス・アキュレアタス(Aspergillus aculeatus) 由来のエンドグルカナーゼI 、セルロモナス・フィミ(Cellulomonas fimi) 由来のエキソセルロビオヒドロラーゼ、およびクロストリジウム・セルロボラン(Clostridium celluloborans) 由来のエンドグルカナーゼC であった。Pearson & Lipman, Proc. Nat. Acad. Sci., 85: 2444-2448 (1988) に記載のTFASTA プログラムを用いると、約36kD のセルラーゼは、アスペルギルス・アキュレアタス由来のエンドグルカナーゼI に対して242 残基が一致し、35.1％ の配列が同一であり、セルロモナス・フィミ由来のエキソセルロビオヒドロラーゼに対して112 残基が一致し、48.2％ の配列が同一であり、さらにクロストリジウム・セルロボラン由来のエンドグルカナーゼに対して114 アミノ酸が一致し、44.7％ の配列が同一であることが示された。TFASTA データ探索プログラムは、配列解析ソフトウエアパッケージバージョン6(Sequence Analysis Software Package Version 6.0)(Genetic Computer Group, Univ. Wisconsin Biotechnology Center, Madison, Wisconsin 53705) において商業的に利用できる。36kD セルラーゼをコードするDNA 配列と公開データベースにおけるDNA 配列との比較によって、最も近い相同物は、ストレプトミセス・ロケイ(Streptomyces rochei) 由来のeglS をコードする遺伝子(823 塩基対が一致し、75.8％ の同一性) およびストレプトミセス・リビダンス由来のcelB をコードする遺伝子(765 塩基対が一致し、74.9％ の同一性) であることが示唆された。
【０１２７】
実施例 3
セルラーゼの精製
実施例2 によって得たセルラーゼ産生バシラス・リケニホルミスクローンは、3％ のトリプトン大豆培養液(Trypton Soya Broth)(Oxoid CM129) および20 μg/mL ネオマイシンを含む複合培地中において培養した。組換えセルルラ−ゼの精製は、以下のように実施した：遠心(8000rpm) によって培養液から発酵培養液を分離する。硫酸アンモニウム(65％ 飽和) を用いて上清中のセルラーゼを沈殿させる。伝導率が7mS/cm になるまでその沈殿物を5mM EDTA 含有25mM リン酸緩衝液(pH7) に溶解させる。その溶液をQ −セファロースFF( 直径5cm 、長さ10cm) 陰イオン交換カラムに添加し、その後、吸光度が0.2AU になるまで5mM EDTA 含有25mM リン酸緩衝液(pH7) でカラムを洗浄する。80 分間に0 から0.5M NaCl(25mM リン酸緩衝液(pH7) 中) の勾配をカラムに加え、その後10 分間に0.5 から1M NaCl の勾配を加えた。最初の勾配で溶出され得る。溶出後、1M NaOH でカラムを洗浄し( 逆流させる) 、さらに5mM EDTA 含有25mM リン酸緩衝液(pH7) で再び平衡化させる。
【０１２８】
実施例 4
セルラーゼ産生放線菌由来の 16S rRNA の特徴付け
実施例1 で単離されたセルラーゼ産生生物の16s rRNA 配列の最初の400bps のヌクレオチド配列が得られ、かつ図6 に示されている( 配列番号3) 。公開データベースにおける配列と比較するために、FASTA 配列解析ソフトウェアパッケージを用いてその配列を解析した。解析結果によって、最も近く類縁関係にあるのは465 塩基対が一致し、95.5％ の16s rRNA 同一性を有するストレプトミセス・サーモベロラシアウス(thermovelolaceous) であることが示唆された。その菌株の部分的16s rRNA 断片の同一性の割合(％) は、その菌株が未知の種の放線菌を表すことを強く示唆する。得られた16s rRNA 配列( 実施例1 における外観と合せて) の解析に基づき、その微生物をストレプトミセス種として分類した。
【０１２９】
実施例 5
本発明に基づくセルラーゼの特性
本発明の約36kD のセルラーゼのpH ／温度特性を特定するため、様々なpH および温度において、CMC 上でセルラーゼ活性を測定した。その測定法は、（全）セルラーゼ活性を特定するための比色分析法であり、基質としてカルボキシメチルセルロース(CMC) を利用する。セルラーゼの検出は、セルラーゼによるセルロースからの還元糖の遊離に基づく。遊離した糖は、高いpH および温度で「PAHBAH 」と反応する。その反応産物を分光光度計で測定した。活性は、グルコースの標準曲線を用いて特定した。
【０１３０】
薬品
−CMC( 低粘度)(Sigma C-5678, Batch#23H0244)
−p −ヒドロキシ安息香酸ヒドラジド( 「PAHBAH 」, Sigma H-9882)
−D −グルコース1 水塩(Boom 8342)
−NaH2PO4*1aq(Merck 6346)
−H3PO4(85％; Merck 573)
−クエン酸*1aq(Merck 244)
−4N NaOH
−0.5N HCl
インキュベーション緩衝液 A(0.01M リン酸塩 )
1.38 ｇNaH2PO4*1aq を800mL の脱塩水(demi water) に溶解させた。4N NaOH でPH を7 に調整し、さらにその混合物に脱塩水を加えて1000mL とした。最終的にpH をチェックし、必要ならば調整した。本緩衝液は、酵素試料を溶解し、かつ希釈するのに用いた。
【０１３１】
インキュベーション緩衝液 B(0.1M クエン酸＋ 0.1M リン酸塩 )
23.06g H3PO4 を脱塩水に溶解させ、最終容積を200mL(=1M) にした。42g クエン酸を脱塩水に溶解させ、最終容積を200mL(=1M) にした。クエン酸溶液20mL をリン酸溶液20mL に加え、さらに脱塩水で150mL にした。4N NaOH でpH を調整し(4 から10 の範囲) 、さらに脱塩水を加えて最終容積を200mL にした。本緩衝液は、基質調製液を希釈するのに用いた。
【０１３２】
インキュベーション緩衝液 C(0.05M クエン酸＋ 0.05M リン酸塩 )
インキュベーション緩衝液B を脱塩水で1 ：1 に希釈した。pH をチェックして、必要ならば補正した。その溶液は、グルコース標準曲線を作成するのに用いた。
【０１３３】
基質調製液 (1 ％ )
強く攪拌しながら、1g のCMC を脱塩水100mL にゆっくり添加した。1 時間以上激しく攪拌し続け、その後30 秒間ウルトラツラックス(ultraturrax) で処理した。
【０１３４】
酵素溶液
酵素試料をインキュベーション緩衝液に溶解させ、さらに約0.05U/mL の活性( グルコース標準曲線で50％) となるように希釈した。
【０１３５】
呈色試薬
5g PAHBAH を5N HCl 80 ｍL に溶解させ、その後0.5N HC ｌでその溶液を100mL にした。使用に先立ち、PAHBAH 溶液を0.5N NaOH で1 ：4 に希釈した。
【０１３６】
標準曲線
ストック溶液#1 ：1000mg グルコースを脱塩水100mL に溶解させた(10mg/mL) 。
【０１３７】
ストック溶液#2 ：ストック溶液#1 0.5mL を関心pH のインキュベーション緩衝液C 9.5mL で希釈した(0.5mg/mL) 。
【０１３８】
以下の滴定一覧表を用いた：
【表１】
（1 ） グルコース標準品、対照、試料、およびブランク用の試験管を基質(1％)0.5mL および所望のpH のインキュベーション緩衝液B 0.5mL で満たし、さらに所望の温度の浴槽中に置いた；
（2 ） その溶液を10 分間インキュベートした；
（3 ） 15 秒間隔で、各pH のグルコース標準液、対照、または試料100mL を基質の入った試験管に添加した；
（4 ） その溶液を3 秒間ボルテックスし、さらに浴槽中に戻した；
（5 ） 各試料を30 分間インキュベートした；
（6 ） PAHBAH 試薬3mL を添加することによって、酵素反応を止めた；
（7 ） 得られた溶液を3 秒間ボルテックスし、さらに浴槽の外のラックに置いた；
（8 ） 全ての反応を止めると、試料100 μL をブランクの試験管に加え、さらに3 秒間ボルテックスした；
（9 ） 試料を沸騰した水浴中に15 分間置いた；
（10 ） 得られた試料を5 から10 分間、冷やした水道水中で冷却し、さらに3 秒間再度ボルテックスした；
（11 ） 水を対照として用いて、混合液の410nm での吸光度を測定した。
【０１３９】
結果を図3 に示す。図3 に示すように、36kD セルラーゼのpH 最適条件は、40 ℃で約8 であり、かつ60 ℃で7 であることが観察された。
【０１４０】
実施例 6
ストレプトミセス・リビダンスにおけるセルラーゼ産生
本実施例は、本発明のセルラーゼをコードする核酸を包含しかつストレプトミセス・リビダンスの形質転換に用いる、プラスミドの構築について記載する。最終的なプラスミドベクターは、pSEGCT と称する。
【０１４１】
pSEGCT の構築は、2 つの他のプラスミド(Ward, et al., Mol. Gen. Genet. 203: 468-478 (1986) に記載のpIJ486 およびpIJ488) を利用した。プラスミドpIJ488 は、pUC18(Yanisch-Perron, et al., Gene 33: 103-119 (1985)) のKpnI 部位にエリスロマイシン耐性をコードするサッカロポリスポラ・エリスレア(Saccharopolyspora erythrea) 由来の1.5kb ermE 断片を挿入したものである。その断片のヌクレオチド配列は特定されている(Uchiyama & Weisblum, Gene 38: 103-110 (1985) and Bibb, et al., Gene 38: 215-226(1985)) 。
【０１４２】
両方のプラスミドは、もともと、天然のストレプトミセスプラスミドpIJ101 に由来する(D.A.Hopwood, et al., J. Gen.Microbiol. 129: 2250-2260 (1983)) 。pIJ101 は、ストレプトミセス・アズレウス(Streptomyces azureus) 由来のチオストレプトン耐性をコードするtsr 遺伝子を包含する。しかしながら、pIJ486 およびpIJ488 プラスミド中には、pIJ101 の複製起点およびリプリカーゼ遺伝子のみが残存する。プラスミドpIJ488-101 は、pIJ101 の複製起点およびチオストレプトン耐性遺伝子を包含するpIJ486 の大きなPstI 断片をPstI で消化したpIJ488 と連結させることによって構築し、プラスミドpIJ488-101 をもたらした( 図7 を参照) 。
【０１４３】
適切なプロモーターを挿入するために、上記プラスミドpIJ488-101 からプラスミドを構築した。アクチノプラーネス・ミソウレイエンシス(Actinoplanes missoureiensis) のグルコースイソメラーゼ遺伝子をプラスミドpIJ488 に挿入した。その遺伝子(GI) 、ならびにGIT として知られているタンパク質工学によって得られた誘導体をコードする遺伝子は、既に記載されており( 欧州特許出願第351029 号) 、かつストレプトミセスにおいて機能する適切なプロモーター配列の供給源として働く。
【０１４４】
詳細には、プラスミドpIJ488-101 をEcoRI およびSphI で消化し、さらに大きな断片を単離してEcoRI −SphI 断片上のGIT 遺伝子に連結させる。得られたプラスミドpWGE.GIT は構造的に不安定であることが見出された。その不安定性は、ermE 遺伝子のせいであった。従って、XbaI 断片の欠失によって、その構造からermE 遺伝子を除去し、結果としてプラスミドpWGx.GIT を得た( 図8 を参照) 。
【０１４５】
プラスミドpWGx.GIT はまだ、わずかな分離不安定性を示すことが見出された。全てのここでのプラスミドが由来する天然のストレプトミセスプラスミドpIJ101 の複製について記載する研究が報告されている(Z. Deng, et al., Mol. Gen. Genet. 214: 286-294) ）。その研究において、pIJ101 は、「ローリングサークル(rolling circle) 」機構を用いて複製することが示されている。その機構を用いたプラスミド複製は、まず、プラス起点と呼ばれる公知の複製起点を用いて1 本鎖中間分子を合成する。活性2 本鎖分子に効率的に変換するには、マイナス起点と呼ばれる第二の複製起点が必要である。pIJ101 のほとんどの誘導体を構築する間に、そのマイナス起点は除去される。
【０１４６】
「sti 」とも呼ばれるマイナス起点をKpnI −FspI 断片として、pIJ101 の誘導体であるプラスミドpIJ211 から単離し、さらに一般的なクローニングベクターpTZ18R(Pharmacia, Analects 13, no.4.) に連結させた。そのベクターをBamHI で消化し、さらにKpnI で平滑末端にしかつ消化した。その結果、プラスミドpTZ18Rsti が得られた( 図9 を参照) 。
【０１４７】
プラスミドpWGxGIT をKpnI およびXbaI で消化した。大きな断片を単離し、さらにpTZ18Rsti のKpnI およびXbaI 断片から単離したsti −含有断片に連結させた。その方法でプラスミドpWGxsGIT を形成した( 図10 を参照) 。
【０１４８】
シャトルプラスミドは、プラスミドpIJ488 −101 およびプラスミドpWGxsGIT を組み合わせることによって構築した。pWGxsGIT 由来のストレプトミセス複製機能を含む断片( プラス起点、sti 、およびrep 遺伝子) は、XbaI およびSphI で消化後、単離した。E.coli 複製機能を含む断片は、XbaI 、SphI 、およびNcoI で消化後、pIJ488-101 から単離した。それら2 つの断片を連結させた後、プラスミドpIJ488sti を形成した( 図11 を参照) 。
【０１４９】
セルラーゼを発現させるため、GI プロモーターをストレプトミセス・リビダンスセルラーゼ(CelA) のシグナル配列と共に用いた。GI プロモーターとCelA シグナル配列との融合物は、融合−PCR 技術によって、XbaI −EcoRI 断片として構築した。クローニングのために、同じ断片上に、NheI 部位を挿入した。その断片をXbaI およびEcoRI で消化したプラスミドpIJ488sti に連結させ、結果としてプラスミドpIJSEGiCe を得た( 図12 を参照) 。
【０１５０】
発現ベクターを完成させるため、セルラーゼターミネーター配列を挿入した。ストレプトミセス株11AG3 は、同一でないとしても、実施例1 で単離したストレプトミセス株(11AG8) に非常に関連している。両方の菌株は、同じ試料から単離され、かつ2 つの菌株の配列決定された16s rRNA は同一であることが見出された。11AG3 セルラーゼ遺伝子をNheI −EcoRI PCR 断片として単離した。クローニングを容易にするため、同じ断片上に、BamHI およびHpaI 部位を挿入した。pIJSEGiCel をNheI およびEcoRI で消化し、さらにPCR −ターミネーター断片をその消化したプラスミドに連結させて、ベクターpIJSEGCi を作成した。次に、内部BamHI 断片の欠失によって、プラスミドpIJSEGCi からセルラーゼ11AG3 コード領域を除去し、結果としてベクターpSEGCT を得た( 図13 を参照) 。
【０１５１】
セルラーゼ11AG8 遺伝子は、PCR を用いて、ストレプトミセス・リビダンスTK23 からNheI −BamHI 断片として単離した。ベクターpSEGCT をNheI およびBamHI で消化し、さらに前記PCR 断片をその消化したベクターに連結させ、結果としてプラスミドpSEGCT11AG8 を得た( 図14 を参照) 。GI プロモーター、celA シグナル配列、セルラーゼ11AG8 およびGI ターミネーターから成る完全発現カセットのDNA ヌクレオチド配列、ならびにその産物のアミノ酸配列を図15 に示す( 配列番号4 および5) 。
【０１５２】
Hopwood, et al., GENETIC MANIPULATION OF STREPTOMYCES, A LABORATORY MANUAL. The John Innes Foundation, Norwich, United Kingdom (1985) に記載のプロトプラスト法を用いて、宿主ストレプトミセス・リビデンスTK23 をプラスミドベクターpSEGCT11AG8 で形質転換した。
【０１５３】
形質転換細胞の培養を拡大し、2 つの発酵培養を行った。種々の時間に、発酵培養液の試料を分析のため採取した。その実験の目的のため、その試料のCMC 活性および分子量(SDS −PAGE) を測定した。発酵実験の終わりに、かなりの量(5 −15％) の完全長セルラーゼがSDS −PAGE で観察された。
【０１５４】
1 方の発酵実験では、完全長セルラーゼが約110.3 時間までの間に迅速に蓄積した。その後205.5 時間までに、もう少し完全長セルラーゼが蓄積し、さらに完全長セルラーゼの大部分は、切断形態に進行した。他方の発酵実験では、完全長セルラーゼは、約66.2 時間までに、発酵層中に存在する支配的なセルラーゼとなった。その後、セルラーゼの切断形態が蓄積した。従って、それら両方の発酵実験において、宿主細胞は完全長セルラーゼを産生し、そのセルラーゼがその後発酵培地中で切断されて、セルラーゼの切断形態を形成すると思われる。
【０１５５】
実施例 7
切断放線菌セルラーゼの発現
実施例6 において認められるように、本発明の35kD セルラーゼは、ストレプトミセス・リビデンス発現系で発現した場合、最初に、分子量約35kD の全340 アミノ酸残基から成りかつ3 つのジスルフィド結合架橋を包含する「完全長」酵素(N −からC −末端：触媒コア、リンカー領域、およびセルロース結合ドメイン(CBD)) として細胞外スペースに現れる。発酵がかなりの時間、すなわち約66 時間進行した後、セルラーゼは、そのセルロース結合ドメインが短縮されることによって修飾される。得られた「コア」分子は、セルラーゼ活性を維持しており、かつ分子量約25kD である。完全長セルラーゼの最初の切断部位は、もし有るとしても特定されていないが、そのコアの正確なアミノ酸配列(mw) は、精製タンパク質またはUF 濃縮した細胞を含まない培養液のいずれかを用いて特定されている。そのアミノ酸配列から、切断タンパク質の平均分子量を計算した。
【０１５６】
切断コアの配列同一性を以下のように特定した：0.2mg の可溶化酵素液を冷水( 試料水溶液の2 倍以上の容量) で0.45mL まで希釈し、次に1N HCl 0.05mL と混合し、さらに氷冷しながら10 分間インキュベートした。その溶液を13,000 xg で2 分間遠心し、上清を採り、さらに50％(w/v) トリクロロ酢酸0.065mL を添加して、氷冷しながら10 分間インキュベートした。沈殿したタンパク質を遠心で回収し、沈降物を冷却した90％(v/v) アセトン1mL で1 回洗浄し、さらに0.5M 重炭酸アンモニウム中の8M 尿素0.025mL に溶解させた。沈降物を溶解させた後、0.2M ジチオスレイトール2.5 μL を添加し、さらにその溶液を50 ℃で15 分間インキュベートした。その後、0.1M 重炭酸アンモニウム中の0.44M ヨードアセトアミド2.5 μL を添加し、さらにその溶液を室温で暗所において15 分間インキュベートした。その溶液を0.1％(w/v) ｎ−オクチル−β−D −グルコシド0.1mL で希釈し、さらに6 μg のトリプシンを用いて37 ℃で60 分間タンパク質を消化した。C18 カラムを用いたRP −HPLC によって、得られたペプチドを分離し、さらにUV 吸光度および質量分析の両方で溶出特性をモニターした。所定の配列に対するペプチドの指定は、13 ピークのうち11 ピークの部分的配列決定によって支援した。
【０１５７】
質量決定によって、「コア」が2 つの分子、すなわちそれら2 つの分子の各配列から構成されているという情報がすでに得られているが、トリプシンによって生じたペプチドの混合物をエンドプロテイナーゼAspN で消化し、さらにLC/MS によって再度解析した。その結果は、「コア」たんぱく質が、約1 ：2 の分子比である2 つの分子から成り、1 方は分子量24,469.0 ダルトン(230 アミノ酸残基、2 つのジスルフィド結合架橋を含む) であり、他方は分子量24,724.3 ダルトン(233 アミノ酸残基、2 つのジスルフィド結合架橋を含む) である。PE Bioscience ESI-TOF mass spectrometer, model Mariner (Foster City, CA) を用いた直接質量測定によって前記結果を確認し、精製した変異コアタンパク質の分子量がそれぞれ、24,467.0 および24,727.6 であることが示唆された。
【０１５８】
実施例 8
異なるプロモーターによるセルラーゼの発現
GI プロモーターは、非常に高い発現をもたらすことが知られている。例えばプロモーターの不安定性のため、セルラーゼの高い発現が望ましくない可能性がある。従って、本発明のセルラーゼ発現ベクターに異なるプロモーターをクローン化した。用いたプロモーターは、ストレプトミセス・フラジアエ(Streptomyces fradiae ) アミノグリコシド3 ’−ホスホトランスフェラーゼ遺伝子の弱いaph プロモーターである。そのプロモーターは、天然のストレプトミセスプラスミドSLP1 の誘導体であるプラスミドpIJ61 から単離した。aph 遺伝子の完全なヌクレオチド配列は公知であり、かつプロモーター領域は特徴付けされている。
【０１５９】
融合−PCR 技術を用いて、celA シグナル配列に融合したaph プロモーターを包含するSpeI −NheI 断片を得た。プラスミドpSEGCT11AG8 をSpeI およびNheI で消化し、大きな断片を単離し、さらにその断片に前記PCR −断片を連結させることによって、プラスミドpSEGCT11AG8 中のGI プロモーターをaph プロモーターと置換した。その結果、プラスミドpSEACT11AG8 を得た( 図16 を参照) 。そのプラスミドは、プラスミドpSEGCT11AG8( 図14 を参照) と等価であり、セルラーゼ遺伝子の発現をもたらすために用いるプロモーター以外においてはベクターpSEGCT と同一であるベクターpSEACT に、ストレプトミセス・リビデンス11AG8 由来のセルラーゼを挿入することによって構築されると考えることができる。
【０１６０】
プラスミドpSEACT11AG8 から全てのE.coli 配列を除去するため、そのプラスミドをSphI で消化し、かつ再連結させた。これによって、プラスミドpSACT11AG8 を形成した( 図17 を参照) 。その構築物をバシラス宿主細胞にトランスフェクトした。プレート培養では、高いレベルのセルラーゼ発現が認められたが、発酵槽の環境では、バシラス宿主細胞によるセルラーゼの産生は非常に低かった。しかしながら、プロモーター誘導をうまく制御して、aph プロモーターの制御下におけるセルラーゼ産生を改善することが可能であろう。
【０１６１】
実施例 9
完全長セルラーゼと切断セルラーゼの比較
完全長セルラーゼと切断セルラーゼの毛玉除去能の比較を実施した。
【０１６２】
Wisk（登録商標） およびGessy Lever#1 液体洗剤において、20 ℃および40 ℃で、完全長セルラーゼ(15.4mg/mL) および切断セルラーゼ( 約14mg/mL) の用量反応を評価するために、３サイクルDetergent Cellulase Terg-O-Tometer Test(DCTT) を用いた。その試験は、毛玉のできた綿編物の布切れおよび毛織物の布切れの両方を用いて実施した。その試験の条件は：
温度： 40 ℃
サイクル時間： 2.5 時間
サイクル数： 3
攪拌スピード： 125rpm
水の硬度： 150ppm
酵素量： ０,45,90,135,180,225 NPC units/L
(225 NPC units=30mg 完全長タンパク質)
pH ： 8.85
pH は、酵素の添加前、および試験の間30 分ごとにチェックした。
【０１６３】
３ サイクル試験を実施する間、各サイクルの終わりに布切れをテルグポット(Terg pot) から取り出し、洗濯機ですすぎ、その後新しい酵素および洗剤を含むテルグポットに戻した。３ 回目のサイクルのすすぎの終わりに、タンブル乾燥機でその布切れを乾燥した。
【０１６４】
データ分析
毛玉除去：図18a は、Wisk（登録商標） における40 ℃での完全長セルラーゼ対切断セルラーゼの毛玉除去用量反応を示す。生データをミカエリス−メンテンの式に適合させてグラフにプロットした。それらの結果は、Wisk（登録商標） における40 ℃での完全長セルラーゼと切断セルラーゼの毛玉除去能に有意な差は無いことを示唆する。
【０１６５】
ピーク負荷：図18 ｂは、Wisk（登録商標） における40 ℃での完全長セルラーゼ対切断セルラーゼの用量反応を示す。ピーク負荷値は強度の損失に逆比例し、すなわちピーク負荷値が高いほどTSL は低い。ピーク負荷値は、完全長セルラーゼよりも切断セルラーゼにおいてわずかに低い。従って、完全長セルラーゼよりも切断セルラーゼにおいてピーク負荷値がわずかに低くかつTSL が高いが、２つの酵素は等しい毛玉除去能を有している。
【０１６６】
しかしながら、毛玉除去および％TSL を比較した場合、完全長セルラーゼと切断セルラーゼ間で多少の違いが認められる。図18 ｃは、Wisk（登録商標） における40 ℃での％TSL 対毛玉除去を完全長セルラーゼと切断セルラーゼで比較して示している。完全長セルラーゼおよび切断セルラーゼの両方のトレンドラインを描くことができ、毛玉除去が上昇するにつれてTSL が上昇することを示している。そのグラフは、毛玉除去評価が４の時に、切断セルラーゼが完全長セルラーゼよりも高いTSL を有することを示す。
【０１６７】
Wisk（登録商標） 液体洗剤に加えて、Gessy Lever#1 液体洗剤においても毛玉除去能を評価した。同じ条件下（洗浄溶液のpH が10.57 に上昇することを除いて）、Gessy Lever#1 において、20 ℃および40 ℃で、切断セルラーゼに対する完全長セルラーゼの用量反応を比較した。pH は、酵素添加前および30 分ごとにチェックした。
【０１６８】
データ分析
毛玉除去：図19a は、Gessy Lever#1 における20 ℃での完全長セルラーゼ対切断セルラーゼの用量反応を示す。生データをミカエリス−メンテンの式に適合させてグラフにプロットした。グラフに示すように、Gessy Lever#1 では、切断セルラーゼの毛玉除去能は完全長セルラーゼよりもよかった。要約すると、毛玉除去評価２に達するのに、完全長セルラーゼは切断セルラーゼと比較して1.6 倍の量が必要であった。
【０１６９】
ピーク負荷：図19 ｂは、Gessy Lever#1 における20 ℃での完全長セルラーゼ対切断セルラーゼのピーク負加値およびTSL を示す。予測した通り、ピーク負荷値は、完全長セルラーゼよりも切断セルラーゼで低かった。完全長セルラーゼデータにおける散乱、および低い相関係数は、完全長セルラーゼが織物に殆ど効果が無く、従ってTSL が生じないことを示唆した。TSL は、Wisk（登録商標） よりもGessy Lever#1 においてかなり低いが、おそらくpH の違いのせいであろう。
【０１７０】
漂白剤の存在下における毛玉除去能を特定するため、漂白剤の存在下で同じ実験を実施した。試験の条件は：
温度： 40 ℃
サイクル時間： 2.5 時間
サイクル数： 3
攪拌スピード： 125rpm
水の硬度： CaCO3 として70ppm(2:1 Ca:Mg)
洗剤基質： 0.51g LAS/0.35g STPP/0.68g Na2SO4
漂白系： 0.5g 過ホウ酸1 水塩(PBS)/0.1g TAED( 漂白活性化剤)
pH ： 8.85
酵素量： 225 NPC/L 完全長セルラーゼ(115.6 NPC/mL)
(30mg/L で使用)
225 NPC/L 切断セルラーゼ(149.2 NPC/mL)
( 完全長セルラーゼと同じ作用量)
34 NPC/L 「Super L 」EGIII(23 NPC/mL)
(30mg/L で使用)
pH は、酵素の添加前および添加後の両方に調整し、その後30 分ごとにチェックして必要に応じて調節した。
【０１７１】
毛玉除去：図20a は、アルカリ性洗剤基質±酸素漂白系における、完全長セルラーゼ、切断セルラーゼ、およびEGIII の毛玉除去能を示す。グラフから分かるように、PBS/TAED を添加すると、毛玉除去能は3 つの全ての酵素において低下した。完全長セルラーゼおよびEGIII が酸素漂白系の存在下において最も影響を受けた。切断セルラーゼは、酸素漂白系の存在下においてさえ、最も高い毛玉除去能を有し、毛玉除去評価が3.5 であった。このデータは、漂白系の存在下において、切断セルラーゼが、完全長セルラーゼおよびEGIII よりも安定であることを示唆する。
【０１７２】
ピーク負荷：図20 ｂは、アルカリ洗剤基質±酸素漂白系における完全長セルラーゼ、切断セルラーゼ、およびEGIII のピーク負荷値を示す。グラフから分かるように、漂白系の存在下において、ピーク負荷値は完全長セルラーゼおよびEGIII で変化しなかったが、切断セルラーゼではピーク負荷値が上昇した。TSL はピーク負荷値に反比例した。切断セルラーゼのピーク負荷値は、漂白系の存在下において上昇し、従ってTSL は低下した。
【０１７３】
漂白剤に加えて、選択洗剤はプロテアーゼを含んでいて差し支えない。従って、Purafect 4000L（登録商標）(Genencor, International) の存在下において上記の試験を実施した。試験の条件は：
温度： 40 ℃
サイクル時間： 2.5 時間
サイクル数： 3
攪拌スピード： 125rpm
水の硬度： CaCO3 として70ppm(2:1 Ca:Mg)
洗剤基質： 0.51g LAS/0.35g STPP/0.68g Na2SO4
プロテアーゼ： 1mg/L Purafect 4000L（登録商標）
pH ： 10
酵素量： 225 NPC/L 完全長セルラーゼ(115.6 NPC/mL)
(30mg/L で使用)
225 NPC/L 切断セルラーゼ(149.2 NPC/mL)
( 完全長セルラーゼと同じ作用量)
34 NPC/L 「Super L 」EGIII (23 NPC/mL)
(30mg/L で使用)
毛玉除去：図21a は、アルカリ性洗剤基質±Purafect 4000L（登録商標） プロテアーゼにおける、完全長セルラーゼ、切断セルラーゼ、およびEGIII の毛玉除去能を示す。セルラーゼ無しの対照±Purafect 4000L（登録商標） は全く毛玉除去能を示さなかった。完全長セルラーゼの毛玉除去能は、Purafect 4000L（登録商標） の存在下において上昇したが、切断セルラーゼの毛玉除去能は変化しなかった。このことは、切断セルラーゼは、完全長セルラーゼよりもタンパク質分解に対して安定であることを示唆した。完全長セルラーゼ＋Purafect 4000L（登録商標） の毛玉除去能は、切断セルラーゼの毛玉除去能と同じレベルに上昇した。この結果は、アルカリ条件下において、切断セルラーゼの毛玉除去能が完全長セルラーゼよりも良いという初期の観察に一致する。EGIII の毛玉除去能は、Purafect 4000L（登録商標） プロテアーゼの存在によって影響を受けない。
【０１７４】
ピーク負荷：図21b は、アルカリ洗剤基質±Purafect 4000L（登録商標） プロテアーゼにおける完全長セルラーゼ、切断セルラーゼ、およびEGIII のピーク負荷値を示す。ゼロ対照に対するPurafect 4000L（登録商標） の添加は、ピーク負荷値に影響を及ぼさなかった。完全長セルラーゼのピーク負荷値は、Purafect 4000L（登録商標） の存在下において低下した。TSL はピーク負荷値に反比例するため、Purafect 4000L（登録商標） の添加により完全長セルラーゼの毛玉除去が上昇すると、同様にTSL が上昇する。プロテアーゼは、殆ど、または全く切断セルラーゼに影響を及ぼさなかった。EGIII のピーク負荷値は、Purafect 4000L（登録商標） の存在下において影響を受けなかった。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図1 は、本発明に基づく約36 ｋD のセルラーゼの推定アミノ酸配列を示しており、リーダー配列をボールド体で示す（配列番号1 ）。
【図２】 図2 は、本発明に基づく約36 ｋD のセルラーゼをコードするDNA 配列を示す( 配列番号2) 。
【図３】 図3 は、本発明に基づく約36 ｋD のセルラーゼの40 ℃および60 ℃におけるpH ／活性特性を示す。
【図４】 図4 は、pHPLT ベクターを示す。
【図５】 図5 は、pHP11AG8 ベクターを示す。
【図６】 図6 は、本発明のセルラーゼが得られた放線菌の16s rRNA 配列を示す。
【図７】 図7 は、pIJ488-101 の構造を示す。
【図８】 図8 は、pWGxGIT の構造を示す。
【図９】 図9 は、pTZ18Rsti の構造を示す。
【図１０】 図10 は、pWGxsGIT の構造を示す。
【図１１】 図11 は、pIJ488sti の構造を示す。
【図１２】 図12 は、pSEGCi の構造を示す。
【図１３】 図13 は、pSEGCT の構造を示す。
【図１４】 図14 は、pSEGCT11AG8 の構造を示す。
【図１５】 図15 は、GI プロモーター、celA シグナル配列、セルラーゼ11AG8 およびGI ターミネーターから成る完全発現カセットのDNA 配列 ( 配列番号4) 、ならびに11AG8 のコードアミノ酸配列を示す( 配列番号5) 。
【図１６】 図16 は、pSEACT11AG8 の構造を示す。
【図１７】 図17 は、pSACT11AG8 の構造を示す。
【図１８】 図18 は、Wisk（登録商標） における本発明の完全長セルラーゼと切断セルラーゼの能力を比較する。
【図１９】 図19 は、Gessy Lever#1 における本発明の完全長セルラーゼと切断セルラーゼの能力を比較する。
【図２０】 図20 は、漂白剤の存在下における本発明の完全長セルラーゼと切断セルラーゼの能力を比較する。
【図２１】 図21 は、プロテア−ゼの存在下における本発明の完全長セルラーゼと切断セルラーゼの能力を比較する。
Claims (18)
- 配列番号１のアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有する配列、あるいは配列番号１のアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加された配列から成り、セルロース分解活性を有することを特徴とするセルラーゼ。
- 配列番号１の位置３１から位置２６１まで伸びるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有する連続アミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項１記載のセルラーゼ。
- 配列番号２の配列に対応するＤＮＡ；高ストリンジェント条件下において配列番号２の配列にハイブリダイズするＤＮＡ；配列番号２の配列に対して７６％以上の配列同一性を有するＤＮＡ；より成る群から選択されるＤＮＡ配列によりコードされることを特徴とする請求項１記載のセルラーゼ。
- 配列番号１記載のアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項１記載のセルラーゼ。
- 放線菌から得られたものである請求項１記載のセルラーゼ。
- 切断されてセルラーゼ活性を有しかつ分子量２５ｋＤの断片を形成することを特徴とする請求項１記載のセルラーゼ。
- ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定して分子量が３６ｋＤであり、計算した等電点が５．９であり、至適ｐＨが４０℃で８および６０℃で７であり、放線菌由来のものである、請求項１記載のセルラーゼ。
- 請求項１から３いずれか１項記載のセルラーゼをコードするＤＮＡ 。
- 配列番号２の配列から成るＤＮＡ、または配列番号２の配列の相補配列に対して高ストリンジェント条件下においてハイブリダイズするＤＮＡであって、セルロース分解活性を有するタンパク質をコードすることを特徴とするＤＮＡ。
- セルラーゼを作成する方法であって：
（ａ）請求項８記載のＤＮＡ分子を単離し；
（ｂ）発現に適した生物体を前記ＤＮＡで形質転換し；
（ｃ）セルラーゼをコードする前記ＤＮＡの発現に適した条件下において前記形質転換生物体を増殖させ；さらに
（ｄ）セルラーゼを含む水性混合物を回収する；工程を含むことを特徴とする方法。 - 前記水性混合物から前記セルラーゼを精製する工程をさらに含むことを特徴とする請求項１０記載の方法。
- 前記生物体がバシラス種を含むことを特徴とする請求項１０記載の方法。
- 前記生物体がストレプトミセス種を含むことを特徴とする請求項１０記載の方法。
- 前記生物体がストレプトミセス・リビデンスを含むことを特徴とする請求項１３記載の方法。
- 請求項１から７いずれか１項記載のセルラーゼを含有する洗剤組成物。
- 動物飼料の添加物としての請求項１から７いずれか１項記載のセルラーゼの使用。
- 織物加工のための請求項１から７いずれか１項記載のセルラーゼの使用。
- パルプおよび紙の加工における請求項１から７いずれか１項記載のセルラーゼの使用。
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