JP4907834B2 - 変異体ｅｇｉｉｉセルラーゼ、そのようなｅｇｉｉｉ組成物をコードするｄｎａ及びそれを得るための方法 - Google Patents

Description

【０００１】
政府後援の研究及び開発
適用外。
【０００２】
発明の背景
セルラーゼは、セルロース中のβ−Ｄ−グルコシド結合の加水分解が可能な酵素である。セルロース分解酵素は伝統的に３つの主要なクラスに分類されてきた：エンドグルカナーゼ、エキソグルカナーゼ又はセロビオヒドラーゼ及びβ−グルコシダーゼであり（Ｋｎｏｗｌｅｓ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，（１９８７），ＴＩＢＴＥＣＨ ５，２５５−２６１）；多数の細菌、酵母及び真菌により製造されることが知られている。
【０００３】
セルラーゼはウッドパルプ及び動物用飼料を分解するのに用いられるが、セルラーゼは主に織物の処理、例えば泥又は灰色傾向の除去の補助のための洗浄剤組成物において（例えば、大英帝国出願番号２，０７５，０２８、２，０９５，２７５及び２，０９４，８２６を参照）又は織物の感触及び外観を改良するための販売前の織物の処理にいおいて使用される。即ち、大英帝国出願番号１，３５８，５９９は、コットンを含む織物のざらつきを軽減するために洗浄剤中のセルラーゼの使用を例示する。
【０００４】
セルラーゼは、織物の色をより活気あるものにすることにより使用された織物を改良するために織物の処理においても使用されてきた（Ｔｈｅ Ｓｈｉｚｕｏｋａ Ｐｒｅｆｅｃｔｕｒａｌ Ｈａｍａｍａｔｓｕ Ｔｅｘｔｉｌｅ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｒｅｐｏｒｔ ２４：５４−６１（１９８６））。コットンを含む織物の繰り返しの洗浄は織物に灰色傾向をもたらすが、破壊されて不規則になった繊維によると信じられ、ときどき機械の作用による「毛玉（pills）」と呼ばれる。この灰色傾向は色付きの織物において特に目立つ。結果として、織物の不規則な上部層を除去して即ち織物の全体の外観を改良することにおけるセルラーゼの能力は価値がある。
【０００５】
多くの工業上のプロセスにおけるその有用性のため、ひとつ又は複数の特定の応用に関して特に有効な性能特性を有する特定のセルラーゼ組成物（compositions）又は成分（components）を研究する分野において時代の風潮があった。セルラーゼの可能な源として、実務家は真菌及び細菌に焦点を合わせた。例えば、特定の真菌、例えばＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ種（特に、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）により生産されるセルラーゼは大いに注目されたが、何故ならばセルロースの結晶形態を分解することができる完全なセルラーゼが発酵の手法により大量に容易に提供されるからである。この特定のセルロース複合体を広く分析することにより、その特定の成分の性質及びそれらの成分が工業上のプロセスにおいて機能する能力を測定した（Ｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．，”Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，１６０，２５，ｐａｇｅｓ ２３４，及び次参照（１９８８））。米国特許番号５，４７５，１０１（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．）は、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ由来のエンドグルカナーゼＩＩＩ（ＥＧＩＩＩ）と呼ばれる一つの特に有用な酵素の精製及び分子クローニングを開示する。
【０００６】
ＰＣＴ公開番号ＷＯ９４／１４９５３は、各２０ヌクレアーゼ有する一連のＤＮＡ配列の何れか一つを含む核酸によりコードされるエンドグルカナーゼを開示する。
【０００７】
Ｏｏｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１８：２１７−２２２（１９９０）は、アミノ酸ストリングスＮＮＬＷＧ，ＥＬＭＩＷ及びＧＴＥＰＦＴを含むＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｃｕｌｅａｔｕｓにより生産されるエンドグルカナーゼＥＦ１−ＣＭＣをコードするｃＤＮＡ配列を開示する。Ｓａｋａｍｏｔｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．２７：４３５−４３９（１９９５）は、アミノ酸ストリングスＥＬＭＩＷ及びＧＴＥＰＦＴを含むＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｋａｗａｃｈｉｉ由来のエンドグルカナーゼＣＭＣａｓｅ−１をコードするｃＤＮＡ配列を開示する。Ｗａｒｄ，ｅｔ ａｌ．，は、アミノ酸ストリングスＮＮＬＷＧ，ＥＬＭＩＷ及びＧＴＥＰＦＴを有するＥＧＩＩＩの配列を開示する。さらに、２つのセルラーゼ配列、一方がＥｒｗｉｎｉａ ｃａｒｏｔｏｖａｒａそしてＲｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｍａｒｉｎｕｓが、Ｓａａｒｉｌａｈｔｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ９０：９−１４（１９９０）及びＨｒｅｇｇｖｉｄｓｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂ．６２：３０４７−３０４９（１９９６）に開示されており、アミノ酸ストリングＥＬＭＩＷを含む。
【０００８】
上記のエリアの幾つか又は全てにおいて応用性を有する多くのセルラーゼ組成物に関する業界の知見に拘わらず、セルラーゼが有用な応用において存在する条件下で改良された安定性を有する新規のセルラーゼ組成物、例えば家庭の洗浄剤及びランドリーの洗浄剤及び織物処理用の組成物に関する継続する要求が存在する。
【０００９】
発明の概要
変種（variant）のＥＧＩＩＩセルラーゼが提供されるが、上記変種は、界面活性剤及び／又は温度のストレスに対して感受性の残基において置換を有し、そしてＴ．ｒｅｅｓｅｉのＥＧＩＩＩセルラーゼに由来する。好ましい態様において、変種は、残基Ｗ７，Ｔ１１，Ｔ１６，Ａ３５，Ｓ３９，Ｇ４１，Ｓ６３，Ａ６６，Ｓ７７，Ｎ９１，Ｓ１４３，Ｔ１６３，Ｎ１６７及び／又はＡ１８８の一つ又は複数に対応する位置において置換又は欠失を含む。より好ましい態様において、変種は、残基Ｗ７Ｙ，Ｔ１１Ｓ，Ｔ１６Ｉ，Ａ３５Ｓ，Ｓ３９Ｎ，Ｇ４１Ａ，Ｓ６３Ｖ，Ａ６６Ｎ，Ｓ７７Ｇ，Ｎ９１Ｄ，Ｓ１４３Ｔ，Ｔ１６３Ｓ，Ｎ１６７Ｓ及び／又はＡ１８８Ｇの一つ又は複数に対応する位置において置換又は欠失を含む。
【００１０】
発明の別の態様において、変種ＥＧＩＩＩセルラーゼをコードするＤＮＡが提供される。この態様の好ましい側面において、ＤＮＡはベクター中にある。個の態様の好ましい側面において、ベクターは宿主細胞を形質転換するために使用される。
【００１１】
さらに別の態様において、改良された安定性及び／又は性能を有する変種ＥＧＩＩＩセルラーゼを生産する方法が提供される。当該方法は、セルラーゼを生産するために適した条件下で適当な培養培地中で宿主細胞を培養し、そして生産されたセルラーゼを得る工程を含む。別の態様において、界面活性剤及び変種ＥＧＩＩＩセルラーゼを含む洗浄剤組成物が提供されるが、但し、変種ＥＧＩＩＩセルラーゼは界面活性剤及び／又は界面活性剤に感受性の残基において置換を含む。好ましい態様において、変種は、残基Ｗ７，Ｔ１１，Ｔ１６，Ａ３５，Ｓ３９，Ｇ４１，Ｓ６３，Ａ６６，Ｓ７７，Ｎ９１，Ｓ１４３，Ｔ１６３，Ｎ１６７及び／又はＡ１８８の一つ又は複数に対応する位置において置換又は欠失を含む。より好ましい態様において、変種ＥＧＩＩＩセルラーゼは、残基Ｗ７Ｙ，Ｔ１１Ｓ，Ｔ１６Ｉ，Ａ３５Ｓ，Ｓ３９Ｎ，Ｇ４１Ａ，Ｓ６３Ｖ，Ａ６６Ｎ，Ｓ７７Ｇ，Ｎ９１Ｄ，Ｓ１４３Ｔ，Ｔ１６３Ｓ，Ｎ１６７Ｓ及び／又はＡ１８８Ｇの一つ又は複数に対応する位置において置換又は欠失を含む。この態様の別の側面において、洗浄剤はランドリー又は家庭用の洗浄剤である。
【００１２】
この発明の別の態様において、セルロースを含む織物、好ましくはストーンウオッシングインディゴ染色デニムの処理において変種ＥＧＩＩＩセルラーゼを使用する。別の態様において、変種は飼料添加物として使用される。さらに別の態様において、変種はウッドパルプの処理において使用される。また別の態様において、変種はバイオマスのグルコースへの転化において使用される。
【００１３】
発明の詳細な説明
出願人は、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ由来のＥＧＩＩＩに有意な相同性を有するＨｙｐｏｃｒｅａ ｓｃｈｗｅｉｎｉｔｚｉｉ由来の新規なセルラーゼを単離した。このセルラーゼの分析は、有意な相同性にも拘わらず、２つのセルラーゼの間に性能に関する実質的な相異が存在するという発見をもたらした。事実、相同な酵素は、温度のストレスの条件下又は界面活性剤の存在下では顕著に減じられた性能を有する。この発見は、ＥＧＩＩＩがそのＨｙｐｏｃｒｅａ ｓｃｈｗｅｉｎｉｔｚｉｉの相同物と１４位においてのみ異なるので特に興味深く、これらの１４位がＥＧＩＩＩの安定性及び／又は性能に有意な影響力を有する、蛋白質の位置又はエリアに位置することを示唆する。即ち、出願人は、１４の異なる位置の一つ又は複数又はそれらに空間的に近い位置においてＥＧＩＩＩ内で残基を最適化することにより、ＥＧＩＩＩの性能を最適化することが可能であることを発見した。
【００１４】
従って、本発明は、例えば、界面活性剤又は温度のストレスの存在下で改良された性能を有する変種ＥＧＩＩＩセルラーゼに関する。当該変種は、安定性及び／又は性能に必須であると本明細書において同定された一つ又は複数の残基の、改良された安定性及び／又は性能を酵素に付与する残基による置換により特徴付けられる。好ましくは、しかし必然ではなく、感受性の残基を、その位置の野生型（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ ＥＧＩＩＩ）残基に比較して、改良された酸化性、アルカリ性又は熱安定性を有する残基に置換する。適切な置換は安定性を修飾する如何なる置換であってもよく、特に好ましい置換は、改良された安定性を提供する置換であり、そしてもっとも好ましくは、電荷、極性及び／又はサイズに関して保存された修飾を提供する置換である。非限定例として、特に価値のある置換は、ロイシンをイソロイシンに修飾する置換、イソロイシンをロイシンに修飾する置換、トリプトファンをチロシンに修飾する置換、スレオニンをアスパラギンに修飾する置換、アラニンをグリシンに修飾する置換、セリンをアスパラギンに修飾する置換、グリシンをプロリンに修飾する置換及びアスパラギンをスレオニンに修飾する置換を含む。
定義
明細書内では、特定の用語を以下のように定義して、特許請求の範囲の発明の性質を明らかにする。
【００１５】
「セルラーゼ」は、当業界においてよく分類されているカテゴリーの酵素であり、セルロースポリマーを短いロ−オリゴサッカライドオリゴマー、セロビオース及び／又はグルコースに加水分解できる酵素を含む。セロビオース酵素の共通の例は、セロビオヒドロラーゼ類及びエンドグルカナーゼ類であり、そしてセルロース分解性生物の多くの種から得ることができ、特に真菌及び細菌を含む。
【００１６】
「ＥＧＩＩＩセルラーゼ」は、米国特許第５，４７５，１０１号及びＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｎ ｔｈｅ Ｓｅｃｏｎｄ ＴＲＩＣＥＬ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ Ｒｅｅｓｅｉ Ｃｅｌｌｕｌａｓｅｓ Ａｎｄ Ｏｔｈｅｒ Ｈｙｄｒｏｌａｓｅｓ，Ｓｕｏｍｉｎｅｎ ＆ Ｒｅｉｎｉｋａｉｎｅｎ ｅｄｓ．，Ｅｓｐｏｏ Ｆｉｎｌａｎｄ（１９９３），ｐｐ．１５３−１５８（Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．８）に記載されたエンドグルカナーゼ成分を意味する。本明細書において議論されるとおり、ＥＧＩＩＩはＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ（ｒｅｅｓｅｉ）に由来し、そして約５．８の至適ｐＨ、約７．４の等電点（ｐＩ）及び約２５ｋＤの分子量により特徴付けられる。Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ由来のＥＧＩＩと一般に呼ばれる酵素は、文献において数人の著者らにより名称ＥＧＩＩＩと呼ばれたが、その酵素は分子量、ｐＩ及び至適ｐＨに関して本明細書中のＥＧＩＩＩと定義した酵素とは実質的に異なる。
【００１７】
「セルロース含有織物（fabric）」は、セルロースを含むコットン又は非コットン又はセルロースブレンドを含むコットン又は非コットンから作成された、あらゆる縫われたか又は縫われていない織物、編み糸又は繊維製品を意味し、天然セルロース誘導体及び人工セルロース誘導体（例えば、黄麻、亜麻、ラミー、レーヨン及びライオセル（lyocell））を含む。人工のセルロース含有織物の項に含まれるのは再生織物であり、当業界においてはレーヨンとしてよく知られている。他の人工セルロース含有織物は、化学修飾されたセルロース織物（例えば、アセテートにより誘導したセルロース）及び溶剤で紡いだ（solvent-spun）セルロース織物（例えば、ライオセル）を含む。セルロース含有織物に特別に含まれるのは、そのような材料から作成されたあらゆる編み糸又は繊維製品である。セルロース含有織物は、合成繊維のような材料及びウール及びシルクのような天然セルロース誘導繊維とのブレンドにしばしば取り込まれる。
【００１８】
ＥＧＩＩＩに存在する残基に「対応する」又は「均等な」Ｈ．ｓｃｈｗｅｉｎｉｔｚｉｉ由来のＥＧＩＩＩ相同物中の残基は、一次配列相同性、三次構造相同性（例えば、結晶構造又はコンピューターモデリングにより示される）又は機能均等性により示される、ＥＧＩＩＩ中のその均等な位置に存在する残基を意味する。
【００１９】
「均等な残基」は、ｘ線結晶解析によりその三次構造が決定された前駆体プロテアーゼに関する三次構造のレベルにおいて相同性を決定することにより定義してもよい。均等な残基はＨ．ｓｃｈｗｅｉｎｉｔｚｉｉ及びＴ．ｒｅｅｓｅｉからのＥＧＩＩＩ相同物の特定のアミノ酸残基の主鎖の２つ又は複数の原子の原子配位結合（Ｎ上のＮ、ＣＡ上のＣＡ、Ｃ上のＣ、Ｏ上のＯ）が整列化後に０．１３ｎｍ及び好ましくは０．１ｎｍの範囲であるものとして定義される。整列化は、最良のモデルが並べられて配置されることにより、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉのＥＧＩＩＩに対して問題のＥＧＩＩＩ相同物の非水素蛋白質原子の原子配位結合の最大のオーバーラップを提供した後に達成される。最良のモデルはもっとも高い解析において実験上異なるデータに関するもっとも低いＲ因子を利用可能にさせる結晶解析モデルである。
【００２０】
【数１】

【００２１】
Ｔ．ｒｅｅｓｅｉのＥＧＩＩＩの特定の残基に機能上類似する均等な残基は、それらがＴ．ｒｅｅｓｅｉのＥＧＩＩＩの特定の残基に対して定義され且つ原因とされるような様式にて蛋白質の構造、基質結合又は触媒性を変更するか又は修飾するか、又は一因となるコンフォメーションを採用してよい、セルラーゼのアミノ酸として定義される。さらに、それらは、与えられた残基の主鎖原子が相同の位置を占めることに基づいて均等の基準を満たさないかもしれないが、残基の側鎖原子の少なくとも２つの原子配位結合がＴ．ｒｅｅｓｅｉのＥＧＩＩＩの対応する側鎖原子の０．１３ｎｍに位置する範囲に類似の位置を占めるセルラーゼの残基（ｘ線結晶解析により得られた三次構造に関して）である。Ｔ．ｒｅｅｓｅｉのＥＧＩＩＩの結晶構造は、Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｆｏｕｒｔｅｅｎｔｈ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ．Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ．２０００年８月５−９日に存在し、その開示は全体を引用により編入する。ファミリー１２のグリコシルヒドロラーゼの相同メンバーである、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓのＣｅｌｌ Ｂの配位結合は、Ｓｕｌｚｅｎｂａｃｈｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３６：６０３２（１９９７）及びＳｕｌｚｅｎｂａｃｈｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３８：４８２６（１９９９）に提供される。
【００２２】
「コットン含有織物」は、純粋なコットンまたはコットンブレンドから作られた、縫われたか又は縫われていない織物、編み糸又は繊維製品を意味し、コットンを織り込まれた織物、コットンニット、コットンデニム、コットン編み糸、未加工のコットン等を含む。コットンブレンドを用いる場合、織物中のコットンの量は、好ましくは、コットンの重量あたり少なくとも約３５％である。ブレンドとして用いる場合、織物中に用いられる相手の材料は一つ又は複数の非コットン繊維を含むことができ、セルロース誘導体又は合成繊維、例えばポリアミド繊維（例えば、ナイロン６及びナイロン６６）、アクリル繊維（例えば、ポリアクリロニトリル繊維）、及びポリエステル繊維（例えば、ポリエチレンテレフタレート）、ポリビニルアルコール（例えば、ビニロン）、塩化ポリビニル繊維、ポリビニリデンクロリド繊維、ポリウレタン繊維、ポリウレア繊維及びアラミド繊維を含む。
【００２３】
「洗浄剤組成物」は、汚れたセルロース含有織物の洗濯のための洗浄媒質中での使用のために意図される混合物を意味する。本発明のコンテクストにおいては、そのような組成物は、セルラーゼ及び界面活性剤に加えて、追加の加水分解酵素、研摩剤、漂白剤、漂白活性化剤、青み剤及び蛍光染料、ケーキング阻害剤、マスキング剤、セルラーゼ活性化剤、酸化防止剤、及び可溶化剤を含んでよい。そのような組成物は、汚れた衣服を洗濯するために一般的に使用されて、ストーンウオッシング組成物とは対照的に製造工程において使用されない。セルラーゼを含む洗浄剤組成物は、例えば米国特許第５，２９０，４７４号及びＥＰ公開番号２７１ ００４に記載されており、引用により本明細書に編入される。
【００２４】
「ＤＮＡベクター」は、上で記載されたＥＧＩＩＩ又は変種をコードする一つ又は複数のＤＮＡ断片又はＤＮＡ変種断片を含むヌクレオチド配列を意味し、ＥＧＩＩＩの発現を誘導するために適切な宿主細胞を形質転換することに際して使用され得る。
【００２５】
「発現ベクター」は、適切な宿主において上記ＤＮＡの発現を作用させ得る適切な制御配列に作動可能なように連結させたＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物を意味する。そのような制御配列は、転写を作用させるためのプロモーター、転写を制御するための追加のオペレーター配列、ｍＲＮＡ上の適切なリボソーム結合部位をコードする配列、及び転写及び翻訳の停止を制御する配列を含んでよい。別の細胞種が別の発現ベクターと共に使用されるのが好ましい。Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓにおいて使用されるベクターのための好ましいプロモーターはＡｐｒＥプロモーターであり；Ｅ．ｃｏｌｉにおいて使用される好ましいプロモーターはＬａｃプロモーターであり、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて使用される好ましいプロモーターはＰＧＫ１であり、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒにおいて使用される好ましいプロモーターはｇｌａＡであり、そしてＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ（ｒｅｅｓｅｉ）のための好ましいプロモーターはｃｂｈＩである。ベクターはプラスミド、ファージ又は単純に有力なゲノミック挿入物であってよい。適切な宿主細胞を形質転換したら、ベクターを宿主のゲノムと独立に複製させて機能させてよく、あるいは適切な条件下でゲノム自体に組み込んでよい。本明細書においては、プラスミド及びベクターを時々交換可能に使用する。しかしながら、発明は、均等な機能を担う発現ベクターの他の形態を含むことを意図し、そして当業界にて公知であるか又は公知になる。即ち、様々な宿主／発現ベクターの組み合わせをこの発明のＤＮＡ配列を発現させるために用いてよい。有用な発現ベクターは、例えば、染色体のセグメント、非染色体及び合成ＤＮＡ配列、例えばＳＶ４０の様々な公知の誘導体及び公知の細菌プラスミド、例えばｃｏｌ Ｅ１，ｐＣＲ１，ｐＢＲ３２２，ｐＭｂ９，ｐＵＣ１９及びそれらの誘導体を含むＥ．ｃｏｌｉ由来のプラスミド、ホストレンジの広いプラスミド、例えばＲＰ４，ファージＤＮＡ、例えばファージλの多数の誘導体、例えばＮＭ９８９及び他のＤＮＡファージ、例えばＭ１３繊維状一本鎖ＤＮＡファージ、酵母プラスミド例えば２μプラスミド又はそれらの誘導体、真核生物において有用なベクター、例えば動物細胞において有用なベクター及びプラスミドＤＮＡとファージのＤＮＡの組み合わせに由来するベクター、例えばファージＤＮＡ又は他の発現制御配列を用いるように修飾されたプラスミドからなってよい。本発明の発現ベクターを用いる発現技術は当業界公知であり、そして一般的には、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）に記載される。しばしば、発明のＤＮＡ配列を含むそのような発現ベクターは、組み込み事象を通して特定の種のゲノムに直接挿入することにより単細胞生物を形質転換する（例えば、Ｂｅｎｎｅｔｔ ＆ Ｌａｓｕｒｅ，ＭＯＲＥ ＧＥＮＥ ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＩＯＮ ＩＮ ＦＵＮＧＩ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ｐｐ．７０−７６（１９９１）及び真菌宿主における標的化ゲノミック挿入を記載するその中で引用された文献を参照、引用により本明細書に編入される）。
【００２６】
「機能的に結合させた」は、制御領域、例えばプロモーター、ターミネーター、分泌シグナル又は増強領域が構造遺伝子に連結されてその遺伝子の発現を制御することを意味する。
【００２７】
「宿主株」又は「宿主細胞」は、本発明によるＤＮＡを含む発現ベクターに適した宿主を意味する。本発明において有用な宿主細胞は一般的に原核生物宿主及び真核生物宿主であり、発現を達成できるあらゆる形質転換可能な微生物を含む。特定すれば、宿主株は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ，Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ（ｒ）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ又はＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒであってよい。宿主細胞は、組換えＤＮＡ技術を用いて構築されたベクターにより形質転換されるか又はトランスフェクトされる。そのような形質転換された宿主細胞はスオレニン（swollenin）及びその変種（変異体）をコードして所望の生成物を発現する両複製ベクターを複製することができる。本発明による好ましい態様において、「宿主細胞」は、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ種の細胞から創製された細胞及びプロトプラストの両方を意味す。
【００２８】
「ストーンウオッシング」は、振動させ、そしてカスケードさせる条件、例えばデニムに対して「ストーンウオッシュ」された外観を付与するために回転ドラム洗濯機中でセルラーゼ溶液によりセルラーゼ含有織物を処理することを意味する。本発明によるセルラーゼ溶液は、そのような当業界で認識された方法においての石の使用を完全か又は一部、機能上置き換えることになる。デニムに対してストーンウオッシュされた外観を付与する方法は、米国特許第４，８３２，８６４号に記載されており、その全体を引用により本明細書に編入する。一般に、ストーンウオッシング技術はインディゴ染色したコットンデニムに適用されてきた。
【００２９】
「ストーンウオッシング組成物」は、セルロース含有織物をストーンウオッシュすることにおける使用のための製剤を意味する。ストーンウオッシング組成物は消費者への売買のための公開の前に、即ち製造プロセスの間に、セルロース含有織物を修飾するために使用する。対照的に、洗浄剤組成物は汚れた衣服の洗濯を意図している。
【００３０】
「シグナル配列」は、細胞外への蛋白質の成熟形態の分泌を促進する蛋白質のＮ−末端部分に結合したアミノ酸の配列を意味する。シグナル配列のこの定義は機能性配列である。成熟形態の細胞外蛋白質は分泌プロセスの間に分断されるシグナル配列を欠く。
【００３１】
「界面活性剤」は、界面活性の特性を有すると当業界において一般的に認識されたあらゆる化合物を意味する。即ち、例えば、界面活性剤は、アニオン性、カチオン性、及び非イオン性界面活性剤、例えば洗浄剤において共通に見いだされる界面活性剤を含む。カチオン性界面活性剤及び長鎖脂肪酸塩は、飽和又は未飽和の脂肪酸塩、アルキル又はアルケニルエーテルカルボキシル酸塩、α−スルフォ脂肪酸塩又はエステル、アミノ酸タイプの界面活性剤、リン酸エステル界面活性剤、３から４のアルキル置換基及び１までのフェニル置換されたアルキル置換基を有するものを含む第四級アンモニウム塩を含む。カチオン界面活性剤及び長鎖脂肪酸塩の例は、英国特許出願第２ ０９４ ８２６Ａ号に開示されており、その開示は引用により本明細書に編入される。上記組成物は約１から約２０重量パーセントのそのようなカチオン界面活性剤及び長鎖脂肪酸塩を含んでよい。
【００３２】
アニオン界面活性剤は、直鎖又は分枝したアルキルベンゼンスルフォネート；直鎖又は分枝したアルキル基又はアルケニルエーテル基を有するアルキル又はアルケニルエーテルスルフォネート；アルキル又はアルケニルスルフォネート；オレフィンスルフォネート；及びアルカンスフェロプラストを含む。アニオン界面活性剤の適当なカウンターイオンは、アルカリ金属イオン、例えばナトリウム及びカリウム、アルカリ土類金属イオン、例えばカルシウム及びマグネシウム；アンモニウムイオン；及び炭素数２又は３の１から３のアルカノール基を有するアルカノールアミンを含む。両性の界面活性剤は、第四級アンモニウムスルフォン酸塩及びベタインタイプの両性界面活性剤を含む。そのような両性界面活性剤は同じ分子内に陽性電荷した基及び陰性電荷した基の両方を有する。非イオン性界面活性剤は、ポリオキシアルキレンエーテル、並びに高脂肪酸アルカノールアミド又はそのアルキレンオキシド付加物、脂肪酸グリセリンモノエステル等を含んでよい。この発明における使用のための界面活性剤の例は、英国特許出願番号第２ ０９４ ８２６Ａ号に開示されており、その開示は引用により本明細書に編入される。そのような界面活性剤の混合物も使用できる。
【００３３】
「変種（variant）」は、Ｃ−末端及びＮ−末端のいずれか又は両方への一つ又は複数のアミノ酸の追加、アミノ酸配列中の一つ又は複数の異なる部位における一つ又は複数のアミノ酸の置換、蛋白質の一方又は両方の末端か又はアミノ酸配列中の一つ又は複数の部位における一つ又は複数のアミノ酸の欠失、又はアミノ酸配列中の一つ又は複数の部位における一つ又は複数のアミノ酸の挿入により、前駆体蛋白質（例えば、天然蛋白質）から誘導される蛋白質を意味する。酵素の変種の調製は、好ましくは、天然蛋白質をコードするＤＮＡ配列を修飾し、そのＤＮＡ配列による適当な宿主の形質転換、及び修飾されたＤＮＡ配列の発現による変種酵素の形成により達成する。発明の変種は、前駆体アミノ酸配列との比較の上で変更されたアミノ酸配列を含むペプチドを含み（例えば、野生型又は天然の状態の酵素）、そのペプチドは前駆体酵素の特徴的な酵素の性質は保持するが、いくつかの特定の側面において変更された特性を有する。例えば，ＥＧＩＩＩ変種は増加した至適ｐＨ又は増加した温度安定性又は酸化安定性を有してよいが、セルロース溶解活性は保持する。本発明による変種は、発現されたセルラーゼ誘導体の機能活性が保持されたセルラーゼ誘導体をコードするＤＮＡ断片に由来してよいことが意図される。例えば、セルラーゼをコードするＤＮＡ断片は、コードされたセルラーゼの機能活性が保持されるように、５’又は３’の何れかにおいてセルラーゼＤＮＡ配列に連結したヒンジ又はリンカーをコードするＤＮＡ配列又はその一部をさらに含んでよい。
アミノ酸配列の整列化
この発明の変種ＥＧＩＩＩは前駆体ＥＧＩＩＩのアミノ酸配列由来のアミノ酸配列を有する。ＥＧＩＩＩ変種のアミノ酸配列は、前駆体アミノ酸配列の一つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失又は挿入により前駆体ＥＧＩＩＩアミノ酸配列とは異なる。好ましい態様において、前駆体ＥＧＩＩＩはＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉのＥＧＩＩＩである。Ｔ．ｒｅｅｓｅｉのＥＧＩＩＩの成熟アミノ酸配列を図１に示す。即ち、この発明は、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉのＥＧＩＩＩ中に置いて特に同定された残基に均等な位置においてアミノ酸残基を含み並びにＨ．ｓｃｈｗｅｉｎｉｔｚｉｉのＥＧＩＩＩ相同体において同定された残基に均等な少なくとも一つの残基を含む、ＥＧＩＩＩ変種に向けられる。ＥＧＩＩＩ相同体の残基（アミノ酸）は、それがＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉのＥＧＩＩＩ中の特定の残基又はその残基の一部に相同であるか（即ち、一次構造及び三次構造の何れかにおいて位置が対応する）又は機能上類似であるなら（即ち、化学的又は構造的に化合、反応又は相互作用するための同じか又は類似の機能性能力を有する）、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉのＥＧＩＩＩの残基に均等である。本明細書において、ナンバリングは図２に示された成熟ＥＧＩＩＩアミノ酸配列のそれに対応することが意図される。前駆体ＥＧＩＩＩ内の位置に加えて、前駆体ＥＧＩＩＩが温度のストレス又は界面活性剤のストレス下にあるときに、不安定性の原因であるアミノ酸位置に対応する前駆体ＥＧＩＩＩ内の特定の残基が本明細書において置換又は欠失のために同定される。アミノ酸の位置の番号（例えば、＋３５）は、図１に表した成熟Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉのＥＧＩＩＩ配列に与えられた番号を意味する。
【００３４】
この発明の前駆体ＥＧＩＩＩは天然に生じるセルラーゼ及び組換えセルラーゼを含む（本明細書にて定義されたとおり）。前駆体ＥＧＩＩＩをコードするＤＮＡは、前駆体セルラーゼ酵素それ自体の操作よりも、修飾することを意図する。前駆体ＤＮＡ配列のそのような修飾の適当な方法は、本明細書そして権利者が同じ米国特許第４，７６０，０２５号及び第５，１８５，２５８号に開示された方法を含む。
【００３５】
相同性を測定するために適したアミノ酸配列の整列化は、好ましくは「配列比較計算式」により決定される。比較のための配列の最適な整列化は、例えば、Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性計算式によるか、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ＆ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３）１９７０）の相同性整列化計算式によるか、Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４（１９８８）の類似性検索法によるか、これらの計算式のコンピューター化の実行によるか（ウイスコンシンジェネティックスソフトパッケージ、ジェネティックスコンピューターグループ、５７５サイエンス Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩのＧＡＰ，ＢＥＳＴＦＩＴ，ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ）、又は可視点検により行うことができる。
【００３６】
配列類似性を決定するための計算式の例はＢＬＡＳＴ計算式であり、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）に記載される。ＢＬＡＳＴ計算式のを実行するためのソフトウエアは、バイオテクノロジー情報国立センター（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通して公的に利用可能である。この計算式は、データベース配列中の同じ長さの言葉と整列化したときに、いくつかの陽性評価された閾値スコアに適合するか又は満足する質問配列中の長さＷの短い言葉を同定することにより、高いスコアの配列対（ＨＳＰｓ）を最初に同定することを含む。これらの初期の隣接する言葉のヒットはそれらを含む長いＨＳＰｓを発見するための開始ポイントとして作用する。言葉のヒットは、蓄積する整列化のスコアが増加し得る限り、２つの配列の各々が比較される両方向に沿って伸長する。言葉のヒットの伸長は、蓄積する整列化スコアが達成された最大値からの量Ｘにより低下する場合；蓄積スコアがゼロ又はそれ以下になる場合；又は何れかの配列の末端が延びる（reached）場合に停止する。ＢＬＡＳＴ計算式のパラメーターＷ，Ｔ及びＸは整列化の感度と速度を決定する。ＢＬＡＳＴプログラムは欠点としてワード長（Ｗ）１１、ＢＬＯＳＵＭ＆２スコアリングマトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ＆ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，ＰｒｏｃＮａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５（１９８９）を参照）整列化（Ｂ）５０、気体（Ｅ）１０、Ｍ’５，Ｎ’−４、及び両鎖の比較を用いる。
【００３７】
ＢＬＡＳＴ計算式は次に、２つの配列間の類似性の統計分析を実施する（例えば、Ｋａｒｌｉｎ ＆ Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３−５７８７（１９９３）を参照）。ＢＬＡＳＴ計算式により提供される類似性の一つの測定は最少合計確率（Ｐ（Ｎ））であり２つのヌクレオチド又は間の配列の間の適合が偶然起こる確率の指標を提供する。例えば、プロテアーゼアミノ酸配列に対する試験アミノ酸配列の比較における最少合計確率が約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、そしてもっとも好ましくは約０．００１未満ならば、アミノ酸配列はプロテアーゼに類似であると考えられる。
【００３８】
Ｈ．ｓｃｈｗｅｉｎｉｔｚｉｉに存在するアミノ酸残基の置換に加えて、他の残基を熱感受性残基及び／又は界面活性剤感受性残基においてＥＧＩＩＩに置換できる。例えば、Ｈ．ｓｃｈｗｅｉｎｉｔｚｉｉ様ＥＧＩＩＩにおいて、セリンは３５位にある。この残基をＴ．ｒｅｅｓｅｉのＥＧＩＩＩに存在するアラニンに置換すると、熱安定性は約４℃低下する。しかしながら、バリンでアラニンを置換したら、Ｔｍは約６．５℃上昇する。即ち、３５位は温度感受性部位であり、そして安定性は置換に依存して上昇又は低下し得る。。
【００３９】
熱及び／又は界面活性剤の安定性を変調することに加えて、アミノ酸の置換はＴ．ｒｅｅｓｅｉのＥＧＩＩＩの他の特徴、例えば、基質結合性、阻害剤結合性、可溶性及びｐＨストレス下での性能に影響し得る。例えば、７位のトリプトファンをチロシンで置換するとＥＧＩＩＩ変種のＴｍが約１℃低下する。しかしながら、この置換はセロビオースの変種への結合を阻害する。セロビオースはＴ．ｒｅｅｓｅｉのＥＧＩＩＩの阻害剤である。即ち、上記変種はＴ．ｒｅｅｓｅｉのＥＧＩＩＩよりも熱安定性が低いかもしれないとしても、それは、例えばバイオマス転化のようにセロビオースが存在する場合の応用において良好な性能であるかもしれない。
【００４０】
ＥＧＩＩＩセルラーゼの安定性を修飾するための追加の特定の戦略を以下に提供する。
（１）主鎖の未フォールディングのエントロピーの増加は酵素に対して安定性を導入するかもしれない。例えば、αヘリックスのＮ末端及びループ構造におけるリバースターンの２位へのプロリン残基の導入は未フォールディングのエントロピーを増加させることにより当該蛋白質の安定性を顕著に増加させるかもしれない（Ｗａｔａｎａｂｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２６：２７７−２８３（１９９４）を参照）。類似して、グリシン残基はβ炭素を含まず、即ち、多くの他の残基よりも顕著に大きなバックボーンのコンフォメーションの自由度を有する。これは、その結果の弱い安定性を伴う高い柔軟性を導くかもしれない。グリシンの好ましくはアラニンへの置換は、柔軟性を低下させるか又は安定性を改善するかもしれない。さらに、外部のループを短くすることにより、安定性を改善する可能性があるかもしれない。高度に好熱性の生産蛋白質がそれらの中温性相同物よりも短い外部ループを有することが観察された（例えば、Ｒｕｓｓｅｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：３７０−３７４（１９９５）を参照）。ジスルフィド結合の導入は、互いの関係する異なる三次構造を安定化するのにも有用かもしれない。即ち、存在するシステインに接近可能な残基におけるシステインの導入又はジスルフィド結合を形成できるシステインの対の導入は、ＥＧＩＩＩ変種の安定性を変更するかもしれない。
（２）側鎖の疎水性を増加させることによる内部の空洞の減少は、酵素の安定性を変化させるかもしれない。内部の空洞の数及び容積を減少させることは、疎水性相互作用を最大にしてパッキングの欠点を減少させることにより酵素の安定性を増加させる（例えば、Ｍａｔｔｈｅｗｓ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１３９−１６０（１９９３）；Ｂｕｒｌｅｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：２３−２９（１９８５）；Ｚｕｂｅｒ，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．２９：１７１−１７９（１９８８）；Ｋｅｌｌｉｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３３：７８４−７８６（１９８８）を参照）。好熱性生物からのマルチマー蛋白質は、それらの中温性相当物よりも高い表面相補性の、より疎水性のサブユニット界面をしばしば有する（Ｒｕｓｓｅｌ，ｅｔ ａｌ．，前記）。この原理は、モノマー蛋白質のドメイン界面に適用可能であると信じられる。疎水性を増加させることにより安定性を改善するかもしれない特定の置換は、リシンからアルギニン、セリンからアラニン、及びスレオニンからアラニンを含む（Ｒｕｓｓｅｌ，ｅｔ ａｌ．，前記）。アラニン又はプロリンへの置換による修飾は、結果物の空洞の減少、良好なパッキング及び増加した疎水性を伴って側鎖サイズを増加させるかもしれない。空洞のサイズを減少させ、疎水性を増加させ、そして相補性を改善するための置換は、ＥＧＩＩＩのドメイン間の界面が酵素の安定性を改善するかもしれない。特に、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、ロイシン及びイソロイシンの何れかから選択される異なる残基によるこれらの位置の特定の残基の修飾は性能を改善するかもしれない。
（３）堅い二次構造、即ちαヘリックス及びβターンの変化の均衡は、安定性を改善するかもしれない。例えば、ヘリックスＮ−末端上の部分的な陽性電荷をアスパラギン酸上の陰性電荷により中和することは構造の安定性を改善するかもしれない（例えば、Ｅｒｉｋｓｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５：１７８−１８３（１９９２）を参照）。同様に、ヘリックスＣ−末端上の部分的な陰性電荷の陽性電荷による中和は構造の安定性を改善するかもしれない。βターン中のペプチドのＮ−末端との相互作用から陽性電荷を除去することは三次構造安定性を授与するのに有効であるべきである。非陽性電荷残基による置換はターン中に存在するアミド窒素との相互作用から好ましくない陽性電荷を除去することができた。
（４）三次構造を安定化させるための塩ブリッジ及び水素結合の導入は有効かもしれない。例えば、イオン対の相互作用、即ちアスパラギン酸又はグルタミン酸とリシン、アルギニン又はヒスチジンの間の相互作用は強い安定化作用を導入するかもしれず、そして熱安定性における結果としての改善を伴って別の三次構造を結合するのに使用されるかもしれない。さらに、荷電残基／非荷電残基水素結合の数、及び水素結合の数の増加は一般的に、熱安定性を改善するかもしれない（例えば、Ｔａｎｎｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３５：２５９７−２６０９を参照）。アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸又はグルタミンによる置換は、バックボーンのアミドによる水素結合を導入するかもしれない。アルギニンによる置換は、塩のブリッジを改善してバックボーンのカルボニルにＨ−結合を導入するかもしれない。
（５）一般的に熱不安定性残基を避けることは熱安定性を増加させるかもしれない。例えば、アスパラギン及びグルタミンは脱アミド化に感受性であり、そしてシステインは高温で酸化感受性である。感受性の位置におけるこれらの残基の数の減少は改善された熱安定性をもたらすかもしれない（Ｒｕｓｓｅｌ，ｅｔ ａｌ．，前記）。グルタミン及びシステイン以外の何れかの残基による置換又は欠失は熱安定性残基の回避により安定性を増加させるかもしれない。
（６）修飾された安定性をＥＧＩＩＩ変種に授与するリガンドの結合の安定化及び脱安定化。例えば、この発明のＥＧＩＩＩ変種を使用するマトリックスの成分は、ＥＧＩＩＩ変種の特定の界面活性剤／熱感受性部位に結合するかもしれない。置換を通して上記部位を修飾することにより、成分の変種への結合が強化されるか又は減じられるかもしれない。例えば、ＥＧＩＩＩの結合の割れ目の中の非芳香性残基をフェニルアラニン又はチロシンにより置換することにより、セルロース基質の相互作用がベンゼン環に好ましく相互作用するかもしれない芳香性側鎖安定化を導入して、ＥＧＩＩＩ変種の安定性を増加させてよい。
（８）界面活性剤／熱感受性リガンドの何れかの電気陰性度を増加させることは、界面活性剤ストレス又は熱ストレス下で安定性を改善するかもしれない。例えば、フェニルアラニン又はチロシンによる置換は、溶剤からの遮蔽を改善してＤ残基の電気陰性度を増加させるかもしれない。
変種ＥＧＩＩＩ
本発明は、変種ＥＧＩＩＩの発現、生成及び／又は単離及び使用に関する。これらの酵素は、以下に記載される方法に従い同定及び単離された遺伝子を利用する組換え方法により調製するのが好ましい。しかしながら、本発明における使用のための酵素は他の当業界で認識される手段、例えば天然単離物からの精製により得てよい。
【００４１】
ＥＧＩＩＩをコードするＤＮＡ配列を単離するために使用できる技術は当業界において公知であり、限定ではないが、相同のＤＮＡプローブを用いてスクリーニングするｃＤＮＡライブラリー及び／又はゲノミックライブラリー及び活性アッセイ又はＥＧＩＩＩに対する抗体を用いてスクリーニングする発現を含む。これらの方法の何れかは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．においてか又はＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８７）（「Ａｕｓｕｂｅｌ」）に見いだすことができる。
【００４２】
ＥＧＩＩＩの単離及びクローン化の後に、当業界において公知の他の方法、例えば、部位特異的変異導入を用いることにより、発現されたＥＧＩＩＩ変種内の置換されたアミノ酸に対応する置換、付加又は欠失を作成する。再び、部位特異的変異導入及びＤＮＡレベルにおいて発現蛋白質にアミノ酸の変化を取り入れる方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．及びＡｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌに見いだすことができる。
【００４３】
ＥＧＩＩＩ変種をコードするＤＮＡ配列をＤＮＡ構築物中にクローン化した後に、当該ＤＮＡを用いて微生物を形質転換する。本発明により変種ＥＧＩＩＩを発現するために形質転換される微生物は、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ種由来の株を含むのが有利かもしれない。即ち、本発明により変種ＥＧＩＩＩセルラーゼを調製するための好ましい様式は、変種ＥＧＩＩＩの全て又は一部をコードするＤＮＡの断片を少なくとも含むＤＮＡ構築物により、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ種の宿主細胞を形質転換することを含む。当該ＤＮＡ構築物は一般にプロモーターに機能するように連結されることになる。形質転換された宿主細胞は、次に所望の蛋白質を発現させる条件下で生育させる。次に、所望の蛋白質生成物を実質均一になるまで精製する。
【００４４】
しかしながら、変種ＥＧＩＩＩをコードする所定のＤＮＡのための最良の発現媒体はＴ．ｒｅｅｓｅｉとは異なるかもしれないのが事実かもしれない。即ち、変種ＥＧＩＩＩに関する源の生物に系統発生上類似性をもつ形質転換宿主中で蛋白質を発現させるのがもっとも有利になるといって差し支えない。従って、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ種の発現系の本記載は、例示の目的のためのみに提供されて且つ発明の変種ＥＧＩＩＩを発現するための一つのオプションとして提供される。当業者は、しかしながら、適切なら別の宿主細胞内で変種ＥＧＩＩＩをコードするＤＮＡを発現させる傾向であってよく、そして最適な発現宿主を決定することにおいて変種ＥＧＩＩＩの源を考慮するべきであることが認識されるべきである。例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒは発現宿主として使用できる。Ａ．ｎｉｇｅｒへの形質転換の記載はＷＯ ９８／３１８２１を参照されたい。さらに、当業者は、当業界において利用可能な手段を利用する日常的技術を通して特定の遺伝子のための最良の発現系を選択することができるようになる。
【００４５】
一つの態様において、株は過剰発現された蛋白質を得るための有用な株であるＴ．ｒｅｅｓｅｉ（ｒｅｅｓｅｉ）を含む。例えば、Ｓｈｅｉｒ−Ｎｅｉｓｓ，ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：４６−５３（１９８４）により記載されたＲＬ−Ｐ３７は上昇量のセルラーゼ酵素を分泌することが知られている。ＲＬ−Ｐ３７の機能上の均等物は、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ（ｒｅｅｓｅｉ）株ＲＵＴ−Ｃ３０（ＡＴＣＣ Ｎｏ．５６７６５）及び株ＱＭ９４１４（ＡＴＣＣ Ｎｏ．２６９２１）を含む。これらの株は変種ＥＧＩＩＩを過剰発現するためにも有用なはずである。
【００４６】
潜在的に有害な天然のセルロース溶解活性の不在下で変種ＥＧＩＩＩを得ることが望まれる場合、変種ＥＧＩＩＩをコードするＤＮＡ断片を含むＤＮＡ構築物又はプラスミドの導入前に欠損させた一つ又は複数のセルラーゼ遺伝子を有していたＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ宿主細胞株を得るために有用である。そのような株は、引用により編入される、米国特許第５，２４６，８５３号及びＷＯ ９２／０６２０９に開示された方法により調製してよい。一つ又は複数のセルラーゼ遺伝子を欠落している宿主微生物中で変種ＥＧＩＩＩを発現させることにより、同定及び次の精製の手法を単純化させる。クローン化されたＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ種からの何れの遺伝子も欠損させることができ、例えば、ｃｂｈ１，ｃｂｈ２，及びｅｇｌ３遺伝子並びにＥＧＩＩＩ及び／又はＥＧＶ蛋白質をコードするものである（例えば、それぞれ、米国特許第５，４７５，１０１号及びＷＯ ９４／２８１１７）。
【００４７】
遺伝子の欠損は、欠損されるか又は破壊されるべき所望の遺伝子の形態を当業界公知の方法によりプラスミドに挿入することにより達成してよい。欠損したプラスミドは次に適当な制限酵素部位において所望の遺伝子コーディング領域内部で切断されて、そして遺伝子コーディング配列又はその一部を選択マーカーで置き換える。欠損させるか又は破壊する遺伝子の位置の周辺のＤＮＡ配列は、好ましくは約０．５から２．０ｋｂであり、選択可能なマーカー遺伝子の何れかのサイド上に保持される。適当な欠損プラスミドはその中に存在する唯一の制限酵素部位を有することにより、欠損遺伝子を含む断片、周辺ＤＮＡ配列、及び選択可能なマーカー遺伝子が単一の直鎖片として除去されることを可能にさせる。
【００４８】
選択可能なマーカーは、形質転換された微生物の欠損を可能にさせるように選択されなければならない。選択された微生物において発現されるあらゆる選択可能なマーカー遺伝子が適することになる。例えば、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ種に関しては、選択可能なマーカーは形質転換体において選択可能なマーカーの存在がその特性に顕著に影響しないように選択される。そのような選択可能なマーカーはアッセイ可能な生成物をコードする遺伝子であってよい。例えば、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ種の遺伝子の機能性コピーを使用してよく、宿主内で欠損しているなら、栄養要求性表現型を表す宿主株をもたらす。
【００４９】
好ましい態様において、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ種のｐｙｒ４^-誘導株は機能性ｐｙｒ４遺伝子により形質転換されて、即ち、形質転換のための選択可能なマーカーを提供する。ｐｙｒ４^-誘導株は、フルオロオロティック酸（ＦＯＡ）に耐性のＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ種の株の選択により得てよい。ｐｙｒ４遺伝子はオロチジン−５’−モノホスフェートデカルボキシラーゼをコードし、ウリジンの生合成に必要な酵素である。完全なｐｙｒ４遺伝子を含む株はウリジン欠損培地中で生育するが、フルオロオロティック酸には感受性である。機能性のオロチジンモノホスフェートデカルボキシラーゼ酵素を欠くｐｙｒ４^-誘導株を選択して、ＦＯＡ耐性に関して選択することにより、生育のためにウリジンを要求することは可能である。ＦＯＡ選択技術を用いることにより、機能性オロテートピロホスホリボシルトランスフェラーゼを欠くウリジン要求株を得ることも可能である。この酵素をコードする遺伝子の機能するコピーによりこれらの細胞を形質転換することができる（Ｂｅｒｇｅｓ ＆ Ｂａｒｒｅａｕ，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１９：３５９−３６５（１９９１））。誘導株の選択は上で言及されたＦＯＡ耐性技術を用いて容易に実施され、即ち、ｐｙｒ４遺伝子は選択可能なマーカーとして好ましく用いられる。
【００５０】
一つ又は複数のセルラーゼ遺伝子を発現することに関する能力を欠如させるためにｐｙｒ４^-Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ種を形質転換するため、破壊されたか又は欠損させたセルラーゼ遺伝子を含む単一のＤＮＡ断片を次に欠損プラスミドから単離して、適当なｐｙｒ^-Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ宿主を形質転換するのに用いた。次に、ｐｙｒ４遺伝子産物を発現させて即ち宿主株のウリジン栄養要求性を相補するそれらの能力に基づいて、形質転換体を同定及び選択する。サザンブロット分析を次に結果の形質転換体に実施することにより、欠損させた遺伝子のゲノミックコピーのコード領域の一部又は全てをｐｙｒ４選択可能マーカーにより置き換える二重クロスオーバー組み込み事象を確認（identify）及び確証（confirm）する。
【００５１】
上記の特定のプラスミドベクターはｐｙｒ^-形質転換体の製造に関するが、本発明はこれらのベクターに限定されない。様々な遺伝子を上記技術を用いてＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ種において欠損及び置換させることができる。さらに、何れかの利用可能な選択可能なマーカーを上記のとおりに用いることができる。事実、クローン化されて即ち同定された何れのＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ種の遺伝子も上記の戦略を用いてゲノムから欠損させることができる。
【００５２】
上記のとおり、用いられた宿主株は、非機能性遺伝子又は選択された選択可能なマーカーに相当する遺伝子を欠くか又は有するＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ種の誘導体である。例えば、ｐｙｒ４の選択可能マーカーを選択したら、次に、特定のｐｙｒ４^-誘導株を形質転換法においてレシピエントとして用い。同様に、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓの遺伝子ａｍｄＳ，ａｒｇＳ，ａｒｇＢ，ｔｒｐＣ，ｎｉａＤに均等なＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ種遺伝子を含む選択可能なマーカーを用いてよい。対応するレシピエント株は、よって、誘導株、例えばそれぞれａｒｇＢ^-，ｔｒｐＣ^-，ｎｉａＤ^-でなければならない。
【００５３】
次に、適当な微生物への挿入のために、変種ＥＧＩＩＩセルラーゼをコードするＤＮＡを調製する。本発明によれば、変種ＥＧＩＩＩセルラーゼをコードするＤＮＡは、機能するセルロース溶解活性を有する蛋白質をコードするのに必要なＤＮＡを含む。変種ＥＧＩＩＩセルラーゼ又は誘導体をコードするＤＮＡ変種断片は、真菌のプロモーター配列、例えばｃｂｈ１又はｅｇｌ１遺伝子のプロモーターに機能するように連結されてよい。
【００５４】
変種ＥＧＩＩＩをコードするＤＮＡの一つより多いコピーを株の中で組換えることにより過剰発現を促進することも意図される。変種ＥＧＩＩＩをコードするＤＮＡは、セルラーゼをコードするＤＮＡを有する発現ベクターの構築により製造してよい。変種ＥＧＩＩＩセルラーゼをコードする挿入されたＤＮＡ断片を有する発現ベクターは、所定の宿主生物内で自律複製可能であるか、又は宿主のＤＮＡに組み込み可能であるあらゆるベクターであってよく、典型的にはプラスミドである。好ましい態様において、遺伝子発現を得るための２種類の発現ベクターが意図される。第１は、プロモーター、遺伝子コード領域、及びターミネーター配列の全てが発現される遺伝子起源である、ＤＮＡ配列を含む。遺伝子の末端削除は、不所望のＤＮＡ配列（例えば、望まないドメインをコードする配列）を欠損させることにより、それ自身の転写及び翻訳制御配列の制御下で発現されるドメインを残すことが望まれる場合に、得てよい。選択可能なマーカーも当該ベクター上に含まれることにより、新規の遺伝子配列の複数コピーの宿主への組み込みのための選択を可能にさせる。
【００５５】
第２の種類の発現ベクターは予め集合させ、そして高いレベルの転写に必要な配列及び選択可能なマーカーを含む。遺伝子又はその一部のコード領域をこの一般的な目的の発現ベクターに発現カセットプロモーター及びターミネーター配列の転写制御下に挿入できることが意図される。例えば、ｐＴＥＸはそのような一般的な目的の発現ベクターである。遺伝子又はその一部は強いｃｈｂ１プロモーターの下流に挿入することができる。
【００５６】
上記ベクター中では、本発明の変種ＥＧＩＩＩセルラーゼをコードするＤＮＡを転写及び翻訳配列、即ち適当なプロモーター配列及びシグナル配列に作動可能なように構造遺伝子とインフレームにて連結させるべきである。プロモーターは、宿主細胞中で転写活性を示す如何なるＤＮＡ配列でもよく、そして宿主細胞に対して同種又は異種の何れかの蛋白質をコードする遺伝子に由来してよい。上記シグナルペプチドは、変種ＥＧＩＩＩセルラーゼ又はその誘導体の細胞外生産を提供する。シグナル配列をコードするＤＮＡ配列は発現される遺伝子に天然では付随しているのが好ましいが、しかしながら、あらゆる適当な源、例えばＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ由来のエキソセロビオヒドラーゼ又はエンドグルカナーゼからのシグナル配列が本発明において意図される。
【００５７】
本発明の変種ＥＧＩＩＩセルラーゼをコードするＤＮＡ配列のプロモーターとの連結及び適当なベクターへの挿入に用いられる手法は、当業界においてよく知られている。
【００５８】
上記のＤＮＡベクター又は構築物は、公知の技術、例えば形質転換、トランスフェクション、マイクロインジェクション、マイクロポレーション、バイオリスティック砲撃等により宿主細胞に導入してよい。
【００５９】
好ましい形質転換技術において、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ種内のＤＮＡへの細胞壁の透過性が極めて低いことを考慮しなければならない。従って、所望のＤＮＡ配列、遺伝子又は遺伝子断片の取り込みはせいぜい最少である。形質転換プロセスの前に、誘導株（即ち、使用した選択可能なマーカーに相当する機能性遺伝子を欠く）内のＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ種の細胞壁の透過性を増加させるための多数の方法が存在する。
【００６０】
形質転換のためにＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ種を製造するために本発明において好ましい方法は、真菌の菌糸体からのプロトプラストの調製を含む。菌糸体は出芽した生長性胞子から得ることができる。菌糸体を、細胞壁を消化する酵素により処理することにより、プロトプラストをもたらす。次に、プロトプラストを懸濁媒質中で浸透圧スタビライザーの存在により保護する。これらのスタビライザーはソルビトール、マニトール、塩化カリウム、硫酸マグネシウム等を含む。通常、これらのスタビライザーの濃度は０．８Ｍと１．２Ｍの間で変動する。懸濁媒質中で約１．２Ｍのソルビトール溶液を用いることが好ましい。
【００６１】
宿主Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ種株へのＤＮＡの取り込みはカルシウムイオン濃度に依存する。通常、約１０ｍＭ ＣａＣｌ₂と５０ｍＭ ＣａＣｌ₂の間が取り込み溶液において用いられる。取り込み溶液におけるカルシウムイオンに関する要求のほかにも、通常含まれる他のアイテムは緩衝系、例えばＴＥバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．４；１ｍＭ ＥＤＴＡ）又は１０ｍＭ ＭＯＰＳ，ｐＨ６．０バッファー（モルフォリンプロパンスルフォニック酸）及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。ポリエチレングリコールは細胞膜を融合させて、即ち媒質の含有物がＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ種の細胞質へ送達されることを許容して、そしてプラスミドＤＮＡが核に移送されると信じられる。この融合は、宿主染色体へ優しく（tenderly）組み込まれたプラスミドＤＮＡの複数コピーをしばしば残す。
【００６２】
通常、１０⁸から１０⁹／ｍＬ、好ましくは２ｘ１０⁸／ｍＬの密度にて透過性処理に供されたＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ種のプロトプラスト又は細胞を含む懸濁液を形質転換に用いる。適当な溶液（例えば、１．２Ｍソルビトール；５０ｍＭ ＣａＣｌ₂）中のこれらのプロトプラスト又は細胞の１００μＬ容量を所望のＤＮＡと混合する。通常、高濃度のＰＥＧを取り込み溶液に加える。０．１から１容量の２５％ ＰＥＧ ４０００をプロトプラスト懸濁液に加えることができる。しかしながら、プロトプラスト懸濁液に約０．２５容量を加えるのが好ましい。付加物、例えばジメチルスルフォキシド、ヘパリン、スペルミジン、塩化カリウム等も取り込み溶液に加えて、形質転換を補助してよい。
【００６３】
通常、上記混合物を１０分から３０分の間０℃においてインキュベートする。追加のＰＥＧを次に混合物に加えることにより、所望の遺伝子又はＤＮＡ配列のとりこみをさらに増強する。２５％ ＰＥＧ４０００を通常は形質転換混合物の容量の５から１５倍の容量にて加える；しかしながら、より高いか又はより低い容量が適当かもしれない。２５％ ＰＥＧ４０００は形質転換混合物の容量の約１０倍が好ましい。ＰＥＧを加えた後に、形質転換混合物を次に室温においてソルビトールとＣａＣｌ₂溶液の添加前にインキュベートする。プロトプラスト懸濁液を次にさらに加えることにより生育培地のアリコートを溶解する。この生育培地は形質転換体の生育のみを許容する。所望の形質転換体を生育させるのに適した如何なる生育培地も本発明において使用できる。しかしながら、Ｐｙｒ⁺形質転換体が選択されるなら、ウリジンを含まない生育培地を用いることが好ましい。次のコロニーをウリジン枯渇生育培地上に移して精製する。
【００６４】
この段階において、ウリジンを欠く固形培養培地上でのそれらの早い生育及び不規則な輪郭よりむしろスムーズな環状コロニーの形成により、安定な形質転換体を不安定な形質転換体から識別してよい。さらに、いくつかの場合、安定性に関するさらなる試験を、固形の非選択培地上で形質転換体を生育させ（即ちウリジンを含む）、この培養培地から胞子を回収し、そしてウリジンを欠く選択培地上でのちに出芽及び生育するこれらの胞子のパーセンテージを測定することにより行ってよい。
【００６５】
上記の方法の特定の態様において、変種ＥＧＩＩＩセルラーゼ又はその誘導体は、新規な変種ＥＧＩＩＩセルラーゼ又はその誘導体の適切な後翻訳プロセスの結果として、液体培地中で生育させた後に宿主細胞から活性形態で回収される。
【００６６】
発現された変種ＥＧＩＩＩセルラーゼは、遠心分離、濾過及び塩、例えば硫酸アンモニウムによる上清又は濾過物中の蛋白質の沈殿により培地からの細胞の分離を含む慣用技術により培地か回収してよい。さらに、クロマトグラフィー手法、例えばイオン交換クロマトグラフィー又は親和性クロマトグラフィーを使用してよい。抗体（ポリクローナル又はモノクローナル）を天然の精製された変種ＥＧＩＩＩセルラーゼに対して生じさせてよく、あるいは合成ペプチドを変種ＥＧＩＩＩセルラーゼ分子の一部から製造して、ポリクローナル抗体を生じさせるために用いてよい。
この発明のＥＧＩＩＩ変種を含む組成物
本発明による織物の処理は、セルラーゼを含む織物の加工又は洗浄を意図する。そのような処理は、限定ではないが、ストーンウオッシング、セルロース含有織物の手ざわり、質感及び／又は外観を修飾すること又はセルロース含有織物の製造、洗濯／修理の間に使用される他の技術を含む。さらに、この発明のコンテクスト内での処理は、セルロース編み糸又は繊維製品からの「未成熟な」又は「死んだ」コットンの除去を意図する。未成熟なコットンは成熟コットンよりも顕著に無定形であり、そして例えば平行でない乾燥により存在する場合に質の低い織物をもたらす。本発明において意図される組成物は、さらに、よごして製造されたセルロース含有織物の洗浄における使用のためのセルラーゼ成分を含む。例えば、セルラーゼは洗濯ランドリーのための界面活性剤組成物中で使用してよい。本発明により有用な界面活性剤組成物は、特定の製剤、例えば、洗浄前の、前以て浸す、そしてホームユースの色再生組成物を含む。本明細書において記載されるそのような処理組成物は、希釈を必要とする濃縮物の形態又は希釈溶液の形態又はセルロース含有織物に直接適用できる形態であってよい。織物のセルラーゼ処理の一般的な処理技術は、例えば、ＥＰ公開番号２２０ ０１６及びＧＢ出願番号Ｎｏｓ．１，３６８，５９９号及び２，０９５，３７５号に記載される。
【００６７】
本発明によるセルロース溶解物質の処理は、さらに、動物用飼料、パルプ及び／又は紙、当業界公知の食品及び穀類の処理を意図する。例えば、セルラーゼは動物飼料の有用性を高め、ウッドパルプの排水性（drainability）を改善し、食品を増強し、そして穀類の湿潤製粉プロセス又は乾燥製粉プロセスの間に穀類中の繊維を減少させることが知られている。
【００６８】
本発明による処理は、有効量のセルラーゼ並びに他の任意の成分、例えばバッファー、界面活性剤、及び／又は研磨剤を包含する成分を含む水性溶液を含む。有効量のセルラーゼ酵素組成物はその意図される目的のために十分なセルラーゼ酵素の濃度である。即ち、例えば、本発明によるストーンウオッシング組成物中の「有効量の」セルラーゼは、例えば使い古されて色あせた外観を縫い目の中及び織物パネル中に生じさせる所望の効果を提供することになる量である。同様に、セルロース含有織物の質感及び／又は外観を改善することを意図した組成物中の「有効な量の」セルラーゼは、質感における測定可能な改善、例えば織物のスムーズさを改善すること、又は外観を改善すること、例えば織物の外観において鋭さを低下させる傾向がある毛玉（pills）及び原繊維（fibrils）を除去する量である。用いられるセルラーゼの量は、用いられる装置、用いられるプロセスパラメーター（セルラーゼ処理溶液の温度、セルラーゼ溶液への暴露時間等）、及びセルラーゼの活性（例えば、活性の低いセルラーゼ組成物に比較してより活性の高いセルラーゼ組成物を用いる場合、特定の溶液が低濃度のセルラーゼに必要となる）にも依存する。織物が処理される水性処理溶液中のセルラーゼの正確な濃度は、上記因子並びに所望の結果に基づいて当業者により容易に決定することができる。ストーンウオッシングプロセスにおいては、セルラーゼを約０．５から５，０００ｐｐｍ、もっとも好ましくは約１０から２００ｐｐｍ全蛋白質の濃度にて水性処理溶液中に存在させることが一般的には好ましかった。セルロース含有織物の質感及び／又は外観の改善のための組成物においては、約０．１から２０００ｐｐｍ、もっとも好ましくは約０．５から２００ｐｐｍ全蛋白質の濃度にてセルラーゼが水性処理溶液中に存在することが一般的に好ましいとされてきた。
【００６９】
好ましい処理態様において、バッファーは、用いられたセルラーゼが活性を呈し、そして今度は用いられたセルラーゼの性質に依存する範囲内で溶液のｐＨを保持するのにバッファーの濃度が十分であるように、処理用組成物中に存在するように用いる。用いられるバッファーの正確な濃度は、当業者が容易に参酌できるいくつかの因子に依存することになる。例えば、好ましい態様において、バッファー、並びにバッファー濃度は、最適なセルラーゼ活性に必要なｐＨ範囲内で最終セルラーゼ溶液のｐＨを維持するように選択される。発明のセルラーゼの最適なｐＨ範囲の測定はよく知られた技術に従い確かめることができる。上記セルラーゼの活性範囲内のｐＨにおける適切なバッファーは、当業者によく知られている。
【００７０】
セルラーゼ及びバッファーに加えて、処理組成物は任意に界面活性剤を含んでよい。適当な界面活性剤は、上記セルラーゼ及び織物に適合可能な何れの界面活性剤も含み、例えばアニオン性、非イオン性及び両性の界面活性剤を含む。本明細書中の使用のための適当なアニオン性界面活性剤は、直鎖又は分枝のアルキルベンゼンスルフォネート；直鎖又は分枝アルキル基又はアルケニル基を有するアルキル又はアルケニルエーテルスルフェート；アルキル又はアルケニルエーテルスルフェート；オレフィンスルフォネート；アルカンスルフォネート等を含む。アニオン性界面活性剤のための適当なカウンターイオンは、アルカリ金属イオン、例えばナトリウム及びカリウム；アルカリ土類金属イオン、例えばカルシウム及びマグネシウム；アンモニウムイオン；及び炭素数２又は３の１から３のアルカノール基を有するアルカノールアミンを含む。両性界面活性剤は、第四級スルホン酸アンモニウム、及びベタインタイプの両性界面活性剤を含む。そのような両性界面活性剤は、同じ分子中に陽性荷電基と陰性荷電基の両方を有する。非イオン性界面活性剤は一般的に、ポリオキシアルキレンエータル、並びに高脂肪酸アルカノールアミド又はそのアルキレンオキシド付加物、及び脂肪酸グリセリンモノエステルを含む。界面活性剤の混合物は、当業者に知られている様式にて用いられることもできる。
【００７１】
濃縮されたセルラーゼ組成物は本明細書に記載される方法における使用のために調製することができる。そのような濃縮物は、濃縮された量の上記セルラーゼ組成物、バッファー及び界面活性剤を、好ましくは水性溶液中に含む。そうして製剤化された場合、セルラーゼ濃縮物を水により希釈することにより、必要な濃度の各成分を有するセルラーゼ調製物を迅速かつ正確に調製することができる。水性濃縮物を製剤化する場合、これらの濃縮物を希釈することにより、上で示された通りに必要な濃度の成分をセルラーゼ溶液中にて達することができる。容易に明白なとおり、そのようなセルラーゼ濃縮物はセルラーゼ溶液の容易な製剤化を許容し、並びにそれが使用されることになる位置への上記組成物の便利な運搬を許容する。処理用濃縮物は当業界において認識された形態、例えば液体、エマルジョン、ゲル又はペーストであり得る。そのような形態は当業者によく知られている。
【００７２】
固形のセルラーゼ濃縮物を使用する場合、セルラーゼ組成物は顆粒、粉末、塊又は固形ディスクであってよい。顆粒を製剤化することにより、洗浄媒質への顆粒の溶解速度を減じる物質を含ませることができる。そのような物質及び顆粒は、米国特許第５，２５４，２８３号に記載されており、その全体を引用により本明細書に編入する。
【００７３】
他の物質も所望であれば本発明のセルラーゼ組成物と共にか又は代わりに用いることができ、石、軽石、充填剤、溶剤、酵素活性化剤、及び抗−再貯蔵剤（anti-redeposition）を含み、上記組成物の最後の用途に依存する。
【００７４】
例示の目的で、ストーンウオッシング法を詳細に記載するが、しかし、記載されたパラメーターは、他の応用のために、例えば織物の質感及び／又は外観の改善のために当業者により容易に修飾される。セルロース含有織物を有効量のセルラーゼを含むセルラーゼ含有ストーンウオッシング組成物と接触させるが、処理された組成物とストーンウオッシング組成物とを混ぜ合わせて、そして即ちセルラーゼ酵素を織物に近接させることによる。次に、セルラーゼを含む水性溶液と織物を撹拌する。処理組成物が水性溶液ならば、織物は直接上記溶液中に浸してよい。同様に、ストーンウオッシング組成物が濃縮物であれば、当該濃縮物をセルラーゼ含有織物を含む水浴中に希釈する。ストーンウオッシング組成物が固体の形態、例えば洗濯前のゲル又は固形スティックの形態の場合、ストーンウオッシング組成物を直接に織物又は洗浄液体にかけることにより当該組成物を接触させてよい。
【００７５】
セルラーゼ含有織物にストーンウオッシュの外観を授与させるような酵素の作用を可能にさせる条件下で、セルラーゼ含有織物をストーンウオッシング溶液とインキュベートさせる。例えば、ストーンウオッシュの間、ｐＨ，液体比率、温度及び反応時間を調節することにより、ストーンウオッシング組成物が作用する条件を最適にしてよい。「有効な条件」は必然的に、セルラーゼ酵素が、セルラーゼ含有織物と有効に反応すること、この場合にはストーンウオッシュ効果を生じさせることを可能にさせるｐＨ，液体比率、及び温度を意味する。しかしながら、そのような条件は、当業者により容易に確かめられ得る。本発明のストーンウオッシング組成物に有効な反応条件は、対応する従来技術のセルラーゼ組成物により用いられた公知の方法に実質類似である。従って、本発明に従いストーンウオッシング組成物を使用するための条件を最大にすることは当業者の範囲内である。
【００７６】
ストーンウオッシュの間の液体の比率、即ち織物の重量に対する、ウオッシング組成物溶液（即ち、洗浄液体）の重量比率は、本明細書で用いる場合、一般的に、デニムの織物において所望のストーンウオッシュ効果を達成するのに十分な量であり、使用されるプロセスに依存する。好ましくは、液体の比率は約４：１から約５０：１、より好ましくは約５：１から約２０：１、そしてもっとも好ましくは約１０：１から約１５：１である。
【００７７】
本発明のストーンウオッシング組成物によるストーンウオッシュの間の反応温度は２つの競合因子により支配される。第１に、高い温度は、増強された反応キネティックス、即ち速い反応に一般的には対応し、低温において必要な反応時間に比較して反応時間の減少を可能にさせる。従って、セルラーゼは所定の反応温度を越えて活性を損失する蛋白質であって、その温度は使用されるセルラーゼの性質に依存する。即ち、反応温度があまりに高くなるまで許容すればセルロース溶解活性はセルラーゼの変性の結果として損失する。当業界におけるセルラーゼ使用のための標準温度は一般的に３５℃から６５℃の範囲内であり、その条件は発明のセルラーゼに適していると予測されるはずでもあるから、最適な温度条件は、使用される特定のセルラーゼに関してよく知られた技術に従い確認するべきである。
【００７８】
反応時間はストーンウオッシュが起こる特定の条件に依存することになる。例えば、セルラーゼのｐＨ，温度及び濃度はすべて最適反応時間に影響することになる。一般的に、反応時間は約５分から約５時間、好ましくは約１０分から約３時間、そしてより好ましくは約２０分から約１時間である。
【００７９】
本発明のまた別の好ましい態様によると、発明のセルラーゼは洗浄剤組成物中に用いてよい。本発明による洗浄剤組成物は前洗浄剤組成物、前浸潤組成物として、又は通常の洗浄又はリンスサイクルの間の洗浄のために有用である。好ましくは、本発明の洗浄剤組成物は、有効量のセルラーゼ、界面活性剤を含み、そして任意に以下に記載される他の成分を含む。
【００８０】
この発明の洗浄剤組成物の中に用いられる有効量のセルラーゼは、例えば、毛玉除去（depilling）、軟化、抗−毛玉化、表面繊維除去、抗−灰色化及び洗浄を含む、セルラーゼ含有織物上でセルラーゼにより生じることが知られている所望の効果を授与するのに十分な量である。好ましくは、上記洗浄剤組成物中のセルラーゼは約１０ｐｐｍから約２０，０００ｐｐｍの洗浄剤の濃度にて用いられる。
【００８１】
洗浄剤組成物中に用いられるセルラーゼ酵素の濃度は、洗浄媒質への希釈に際してセルラーゼ酵素の濃度が約０．０１から約１０００ｐｐｍ、好ましくは約０．０２ｐｐｍから約５００ｐｐｍ、そしてもっとも好ましくは約０．５ｐｐｍから約２５０ｐｐｍ全蛋白質の範囲にあるように、選択されるのが好ましい。洗浄剤組成物中に用いられるセルラーゼ酵素の量は、洗浄剤が水への添加により希釈されて洗浄溶液を形成する程度に依存する。
【００８２】
本発明の洗浄剤組成物は、当業界において認識されている形態、例えば液体中、顆粒中、エマルジョン中、ゲル中、又はペースト中であってよい。そのような形態は当業者によく知られている。固形の洗浄剤組成物を用いる場合、セルラーゼは顆粒として用いるのが好ましい。好ましくは、顆粒を製剤化することにより、セルラーゼ保護剤を追加して含ませることができる。顆粒を製剤化することにより、洗浄媒質への顆粒の溶解速度を低下させるための物質を含ませることができる。そのような物質及び顆粒は米国特許第５，２５４，２８３号に記載されており、その全体を引用により本明細書に編入する。
【００８３】
この発明の洗浄剤組成物は表面活性化剤、例えば界面活性剤を用い、洗浄剤組成物中でのそれらの使用に関してよく知られた、アニオン性、非イオン性及び量性界面活性剤を含む。セルラーゼ組成物及び界面活性剤に加えて、この発明の洗浄剤組成物は、任意に一つ又は複数の以下の成分を含むことができる。
セルラーゼを除くヒドロラーゼ
適当なヒドロラーゼは、エステル結合に作用する、カルボキシレートエステルヒドロラーゼ、チオエステルヒドロラーゼ、ホスフェートモノエステルヒドロラーゼ、及びホスフェートジエステルヒドロラーゼ；グリコシル化合物に作用するグリコシドヒドロラーゼ；Ｎ−グリコシル化合物を加水分解する酵素；エーテル結合に作用するチオエーテルヒドロラーゼ；及びペプチド結合に作用するアミノ−アシル−ペプチドヒドロラーゼ、ペプチジル−アミノ酸ヒドロラーゼ、アシル−アミノ酸ヒドロラーゼ、ジペプチドヒドロラーゼ及びペプチジル−ペプチドヒドロラーゼを含む。とりわけ好ましいのは、カルボキシレートエステルヒドロラーゼ、グリコシドヒドロラーゼ、及びペプチジル−ペプチドヒドロラーゼである。適当なヒドロラーゼは（１）ペプチジル−ペプチドヒドロラーゼ、例えばペプシン、ペプシンＢ，レニン、トリプシン、キモトリプシンＡ、キモトリプシンＢ、エラスターゼ、エンテロキナーゼ、カテプシンＣ、パパイン、キモパパイン、フィシン、トロンビン、フィブリノリシン、レニン、ズブチリシン、アスペルギロペプチダーゼＡ、コラゲナーゼ、クロストリジオペプチダーゼＢ、カリクレイン、ガストリシン、カテプシンＤ、ブロメリン、ケラチナーゼ、キモトリプシンＣ、ペプシンＣ、アスペルギロペプチダーゼＢ、ウロキナーゼ、カルボキシペプチダーゼＡ及びＢ、及びアミノペプチダーゼ；（２）グリコシドヒドロラーゼ（必須成分であるセルラーゼはこのグループから除外される）、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、インベルターゼ、リゾチーム、ペクチナーゼ、キチナーゼ及びデキストラナーゼを含む。とりわけ好ましいのは、α−アミラーゼ及びβ−アミラーゼである。それらは酸から中性の系で機能するが、一つはアルカリ系においてもっとも高い活性を呈する細菌から得られる；（３）カルボキシルエステラーゼ、リパーゼ、ペクチネステラーゼ、及びクロロフィラーゼを含むカルボキシレートエステルヒドロラーゼ。それらの間で特に有効なのはリパーゼである。
【００８４】
セルラーゼ以外のヒドロラーゼは目的に従い要求されるほど、洗浄剤組成物中に混合される。好ましくは、精製された蛋白質に関して、０．００１から５重量パーセント、より好ましくは０．０２から３重量パーセントにて混合されるべきである。この酵素は、洗浄剤組成物中で単独又は他の成分と混合して粗酵素により作成された顆粒の形態で使用されるべきである。粗酵素の顆粒は、精製された酵素が顆粒の中で０．００１から５０重量パーセントである量にて使用される。顆粒は０．００２から２０、好ましくは０．１から１０重量パーセントの量にて使用される。セルラーゼに関するように、これらの顆粒を製剤化することにより、酵素保護剤及び溶解遅延剤を含ませることができる。
研磨剤
Ａ．二価封鎖剤（ sequestering agents ）
上記組成物は、以下の化合物：ホスフェート、ホスホネート、ホスホノカルボキシレート、アミノ酸の塩、アミノポリアセテート高分子量電解質、非解離ポリマー、ジカルボキシル酸も塩、及びアルミノシリケート塩のアルカリ金属塩及びアルカノールアミン塩からなる群から選択される一つまたは複数の研磨剤を約０から約５０重量パーセント含んでよい。適当な二価の封鎖剤は英国特許出願番号２ ０９４ ８２６Ａに開示されており、その開示は引用により本明細書に編入される。
【００８５】
Ｂ．アルカリ又は無機電解質
上記組成物は、約１から約５０重量パーセント、好ましくは約５から約３０重量パーセントを、アルカリ又は無機電解質として、以下の化合物：シリケート、カーボネート及びスルフェートの一つ又は複数のアルカリ金属塩並びに無機アルカリ、例えばトリエタノールアミン、ジエタノールアミン、モノエタノールアミン及びトリイソプロパノールアミンの組成物に基づいて含んでよい。
抗再沈殿剤
上記組成物は、抗再沈殿剤として約０．１から約５重量パーセントの一つ又は複数の以下の化合物：ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン及びカルボキシメチルセルロースを含んでよい。
【００８６】
それらの間で、カルボキシメチルセルロース及び／又はポリエチレングリコールと、本発明のセルラーゼ組成物の組み合わせは本質的に有用な泥除去組成物を提供する。
漂白剤
本発明のセルラーゼの漂白剤、例えばモノ過硫酸カリウム、過硫酸ナトリウム、過硼酸ナトリウム、硫酸ナトリウム／過酸化水素付加物及び塩化ナトリウム／過酸化水素付加物又は／及び光感受性漂白染料、例えばスルフォン酸フタロシアニンノアルミニウム塩と組み合わせた使用は、洗浄剤の効果をさらに改善する。同様に、ＥＰ ６８４ ３０４に記載された漂白剤及び漂白触媒を使用してよい。
青み剤及び蛍光染料
様々な青み剤及び蛍光剤を必要であれば上記組成物において用いてよい。適当な青み剤と蛍光染料は、英国特許出願番号２ ０９４ ８２６Ａに開示されており、その開示は引用により本明細書に編入される。
ケーキング阻害剤
以下のケーキング阻害剤を粉末洗浄剤の中に混合してよい：ｐ−トルエスルフォン酸塩、キシレンスルフォン酸塩、酢酸塩、スルフォン琥珀酸塩、タルク、微細に粉状にされたシリカ、非晶シリカ、クレイ、珪酸カルシウム（例えば、Ｊｏｈｎｓ Ｍａｎｖｉｌｌｅ社のマイクロセル）、炭酸カルシウム及び酸化マグネシウム。
セルラーゼ活性を阻害する因子のマスク剤
この発明のセルラーゼ組成物は、銅、亜鉛、クロミウム、水銀、鉛又は銀イオン又はそれらの化合物の存在下でいくつかの場合において脱活性化される。様々な金属キレート剤及び金属沈殿剤がこれらの阻害剤に有効である。それらは、例えば、任意の付加物並びに珪酸マグネシウム及び硫酸マグネシウムに関して上記の項目においてリストされた二価金属イオン封鎖剤を含む。
【００８７】
セロビオース、グルコース及びグルコノラクトンはときどき阻害剤として作用する。これらのサッカライドとセルラーゼの共存は出来る限り避けることが好ましい。共存が避けがたい場合には、例えばそれらをコーティングすることによりサッカライドとセルラーゼの直接の接触を避ける必要がある。
【００８８】
長鎖の脂肪酸塩及びカチオン性界面活性剤はいくつかの場合に阻害剤として作用する。しかしながら、これらの物質のセルラーゼとの共存は、それらの直接の接触がいくつかの手段、例えば錠剤化又はコーティングにより避けられるなら許容可能である。
【００８９】
上記のマスキング剤及び方法は必要であれば本発明において採用してよい。
セルラーゼ−活性化剤
活性化剤は特定のセルラーゼに依存して変更してよい。蛋白質、コバルト及びその塩、マグネシウム及びその塩、及びカルシウム及びその塩、カリウム及びその塩、ナトリウム及びその塩又はモノサッカライド、例えばマンノース及びキシロースの存在下において、多くのセルラーゼは活性化されて、それらの洗浄剤粉末が顕著に改善される。
抗酸化剤
抗酸化剤は、例えば、第三級−ブチル−ヒドロキシトルエン，４，４’−ブチリデンビス（６−第三級−ブチル−３−メチルフェノール）、２，２’−ブチリデンビス（６−第三級−ブチル−４−メチルフェノール），モノスチレン化クレゾール、ジスチレン化クレゾール、モノスチレン化フェノール、ジスチレン化フェノール及び１，１−ビス（４−ヒドロキシ−フェニル）シクロヘキサンを含む。
可溶化剤
可溶化剤は、例えば、低級アルコール、例えばエタノール、ベンゼンスルフォン酸塩、低級アルキルベンゼンスルフォン酸塩、例えばｐ−トルエンスルフォン酸塩、グリコール例えばプロピレングリコール、アセチルベンゼン−スルフォン酸塩、アセトアミド、ピリジンジカルボキシル酸アミド、安息香酸塩及び尿素を含む。
【００９０】
本発明の洗浄剤組成物は酸性からアルカリ性のｐＨにわたる広いｐＨ範囲において使用することができる。好ましい態様において、本発明の洗浄剤組成物は、５より上から約１２を越えないｐＨを有する弱酸性、中性、又はアルカリ洗浄剤洗浄媒質中で使用することができる。
【００９１】
上記成分とは別に、香料、バッファー、保存剤、染料等を、所望であれば、この発明の洗浄剤組成物と共に用いることができる。そのような成分は当業界において使用されたこれまでの量にて慣用的に使用される。
【００９２】
本発明において使用される洗浄剤ベースが粉末の形態の場合、スプレー乾燥法及び顆粒化法を含む公知のあらゆる製造方法により調製されるものであってよい。特にスプレー乾燥法、凝塊形成法、乾燥混合法又は非タワールート法により得られる洗浄剤ベースが好ましい。スプレー乾燥法により得られる洗浄剤ベースは中空の顆粒であって、熱耐性成分、例えば表面活性剤及び研磨剤の水性スラリーをホットスペースにスプレーすることにより得られる。スプレー乾燥した後に、香料、酵素、漂白剤、無機アルカリ研磨剤を加えてよい。例えばスプレー乾燥顆粒化又は凝塊形成法により得られる高い密度の顆粒洗浄剤ベースを用いる場合、様々な成分をベースの調製後に加えてもよい。
【００９３】
洗浄剤ベースが液体の場合、均質な溶液か又は不均質な分散の何れかであってよい。洗浄剤中のセルラーゼによるカルボキシルメチルセルラーゼの分解物を除去するためには、組成物の取り込み前にカルボキシルメチルセルラーゼを顆粒化するか又はコートする。
【００９４】
この発明の洗浄剤組成物は、これらの環境において慣用に用いられる温度、反応時間及び液体比率における工業上の使用及び家庭内の使用において、セルロース含有織物、例えば織物とインキュベートしてよい。インキュベーション時間、即ち本発明により洗浄剤組成物を用いてセルロース含有織物を処理するために有効な条件は、当業者により容易に確認されることになる。従って、本発明の洗浄剤による処理に有効な適切な条件は、公知のセルラーゼを含む類似の洗浄剤組成物を用いたものに相当する。
【００９５】
本発明による洗浄剤は、柔軟化、毛玉除去、毛玉化阻止、表面繊維除去又は洗浄に所望の改善を提供するための十分な活性が存在する中間ｐＨにおいて適切な溶液中での前洗浄としてさらに製剤化してよい。洗浄剤組成物が前浸潤（例えば、前洗浄又は前処理）組成物であり、液体、スプレー、ゲル又はペースト組成物のいずれかである場合、セルラーゼ酵素は、前浸潤組成物又は前処理組成物の全重量に対して、約０．０００１から約１重量パーセントにて用いるのが一般的である。そのような組成物においては、界面活性剤を用いてよく、用いる場合は、前浸潤の全重量に対して約０．００５から約２０重量パーセントの濃度にて存在してよい。組成物の残りは、前浸潤において使用される慣用の成分、例えば、希釈剤、バッファー、他の酵素（プロテアーゼ）等をそれらの慣用の濃度にて含む。
【００９６】
本明細書に記載されたセルラーゼ酵素含む組成物は、色あせた織物に色を復活させるために適した独立型（stand alone）組成物としての家庭内の使用において使用でき（例えば、その全体を引用により編入する米国特許第４，７３８，６８２号参照）、並びにスポット除去剤において及び毛玉除去及び抗毛玉化（毛玉化阻止）に使用することができることを意図する。
【００９７】
発明によるセルラーゼの使用は飼料の添加物において及びパルプ及び紙の加工において特に有効であるかもしれない。これらの追加の工業上の応用は、例えばそれぞれ、ＰＣＴ公開番号９５／１６３６０及び終了した許可された特許番号８７３７２に記載される。
【００９８】
本発明及びその利点をさらに例示するために、以下の特定の実施例を本発明を例示するために提供されるという理解のもとに提供するが、如何なる様式においてもその範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【００９９】
実施例
実施例１：Ｈｙｐｏｃｒｅａ ｓｃｈｗｅｉｎｉｔｚｉｉ由来のＥＧＩＩＩ及びＥＧＩＩＩ相同体の温度安定性試験
Ｈｙｐｏｃｒｅａ ｓｃｈｗｅｉｎｉｔｚｉｉ由来のＥＧＩＩＩ及びＥＧＩＩＩ相同体を温度ストレス下でそれらの安定性を測定するのに試験した。０．３ｍｇ／ｍｌの酵素を０．１Ｍ ＭＯＰＳ中でｐＨ７．３、４８℃において試験し、ｐＮＰＣ上の活性を時間をかけて測定及び比較した。実験は２回行った。活性の自然対数をインキュベーション時間に対してプロットし、そして不活性化の速度定数を直線のラインのスロープから得た。様々な変異体の結果を表１に示す。
【０１００】
【表１】
表１：ＥＧＩＩＩ及び相同体の半減期
Trichoderma reesei Hypocrea schweinitzii由来のＥＧＩＩＩ相同体
２０．２ ３．４０
２１．２ ３．９０
表１に示すとおり、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ由来のＥＧＩＩＩの半減期はＨｙｐｏｃｒｅａ ｓｃｈｗｅｉｎｉｔｚｉｉ由来のＥＧＩＩＩ相同体よりも顕著に大きい。
実施例２：Ｈｙｐｏｃｒｅａ ｓｃｈｗｅｉｎｉｔｚｉｉ由来のＥＧＩＩＩ及びＥＧＩＩＩ相同体による洗浄試験
ＥＧＩＩＩをＨｙｐｏｃｒｅａ ｓｃｈｗｅｉｎｉｔｚｉｉ由来の相同酵素と比較した。Ｈｙｐｏｃｒｅａ ｓｃｈｗｅｉｎｉｔｚｉｉ由来の酵素のアミノ酸配列をＥＧＩＩＩの配列と整列化した図３に提供する。図３に示すとおり、２つの酵素のアミノ酸配列は、７、１１、１６、３５、４１、６３、６６、７７、９１、１４３、１６３、１６７及び１８８位に相当する太字の残基以外は同一であることがわかった。
【０１０１】
洗浄試験においては、３つの異なる酵素混合物（ａ）ＥＧＩＩＩ、（ｂ）Ｈｙｐｏｃｒｅａ ｓｃｈｗｅｉｎｉｔｚｉｉ由来のＥＧＩＩＩ相同体、及び（ｃ）２つの酵素の混合物を調製して、コットンの布切れを含むＴｅｒｇ−ｏ−Ｔｏｍｅｔｅｒ中で４０℃において７０ｐｐｍのＣａＣＯ₃（２：１ Ｃａ：Ｍｇ）の硬度を有する水中の標準ＬＡＳ含有顆粒洗浄剤（４ｇ／Ｌ）と別々に混合した。撹拌は１２５ｒｐｍであり、そして試験は２．５時間行った。試験後に、布切れをＴｅｒｇ−ｏ−Ｔｏｍｅｔｅｒから取り出して、回転式乾燥機中で乾燥して、そして程度を変えて毛玉化させた織物のパネルに対しての毛玉化のレベルを比較した。Ｈｙｐｏｃｒｅａ ｓｃｈｗｅｉｎｉｔｚｉｉ由来のＥＧＩＩＩ様酵素は何れの濃度においても毛玉除去性能を示さなかった。対照的に、ＥＧＩＩＩは酵素濃度に従って増加した毛玉除去性能を示した。ＥＧＩＩＩ様酵素を含むＨｙｐｏｃｒｅａ ｓｃｈｗｅｉｎｉｔｚｉｉブロスへスパイクしたＥＧＩＩＩの均等な性能は、ＥＧＩＩＩ様酵素の性能を阻害するが代わりに酵素それ自体が貧困な安定性と性能しか有さなかったブロスの成分ではなかったことを示した。
【０１０２】
この実験はＨｙｐｏｃｒｅａ ｓｃｈｗｅｉｎｉｔｚｉｉ由来のＥＧＩＩＩ様酵素の安定性がＥＧＩＩＩよりはるかに劣ることを示した。事実、関連する酵素はＬＡＳ含有洗浄剤中で活性を呈さなっかったのに対して、ＥＧＩＩＩは優秀な活性を保持した。
実施例３：ＥＧＩＩＩ変種の温度安定性
部位特異的変異導入を実施することにより、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉのＥＧＩＩＩにアミノ酸の置換を取り込んだ。ＥＧＩＩＩに置換されたアミノ酸はＨ．ｓｃｈｗｅｉｎｉｔｚｉｉのＥＧＩＩＩ相同体中で相同の位置にあるものであった。
【０１０３】
ＰＣＲをよく知られた技術に従い実施した。
【０１０４】
【表２】

【０１０５】
簡単に云うと、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉのＥＧＩＩＩをコードするＤＮＡをｃＤＮＡクローンから（Ｗａｒｄ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．ｏｆ ｔｈｅ Ｔｒｉｃｅｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ ”Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ ｃｅｌｌｕｌａｓｅｓ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｈｙｄｒｏｌａｓｅｓ．”Ｅｓｐｏｏ，Ｆｉｎｌａｎｄ １９９３ Ｅｄ．Ｓｏｕｍｉｎｅｎ，Ｐ．ａｎｄ Ｒｅｉｎｉｋａｎｅｎ，Ｔ．Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．８，ｐｐ１５３−１５８；米国特許第５，４７５，１０１号）、ｅｇｌ３遺伝子の５’末端にＢｇｌＩＩ制限エンドヌクレアーゼ部位（最初のＡＴＧコドンのすぐ上流）及び３’末端にＸｂａＩ部位を導入した（「停止」コドンのすぐ下流）ＰＣＲプライマーを用いて、増幅した。増幅した断片を次にＢｇｌＩＩとＸｂａＩにより消化してＢｇｌＩとＸｂａＩにより消化したｐＵＣ１９に連結した。
【０１０６】
変種はこのプロトプラスト中においてＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）変異導入法（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて作成した。変種遺伝子を次にＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓの発現ベクターｐＰＧＰＴ−ｐｙｒＧ（Ｂｅｒｋａ ａｎｄ Ｂａｒｎｅｔｔ，Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ａｄｖ．７：１２７（１９８９））にサブクローン化した。変種遺伝子を有するベクターにより次にＡ．ｎｉｇｅｒ ｖａｒ：ａｗａｍｏｒを形質転換して、その結果の株を撹拌フラスコ培養にて成育させた（ＷＯ ９８／３１８２１）。
【０１０７】
ＥＧＩＩＩ変種を次にこれらの培養物の細胞不含上清からカラムクロマトグラフィーにより精製した。簡単に云えば、１０ｍｇのＥＧＩＩＩあたり、約１ｍＬのＰｈａｒｍａｃｉａ Ｂｕｔｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（高速流）樹脂を０．５Ｍ硫酸アンモニウムを含む使い捨てドリップカラムに負荷した。当該カラムを次に０．０５ＭのＢｉｓ Ｔｒｉｓ Ｐｒｏｐａｎｅ及び０．０５Ｍ酢酸アンモニウム、ｐＨ８により平衡化した。
【０１０８】
ＥＧＩＩＩ様セルラーゼを含む上清を一晩０．１８ｍｇ／ｍＬのエンドグルカナーゼＨにより３７℃において処理した。硫酸アンモニウムを処理上清に約０．５Ｍの最終濃度まで加えた。遠心分離後に、上清を上記カラムに負荷した。当該カラムを次に３容量の平衡化バッファーにより洗浄して、次に２ｘ１容量の０．０５Ｍ Ｂｉｓ Ｔｒｉｓ Ｐｒｏｐａｎｅ及び０．０５Ｍ酢酸アンモニウムによりｐＨ８にて溶出した。フロースルーの各容量を別々の画分として回収したところ、ＥＧＩＩＩ様セルラーゼは第２の画分に出現した。
【０１０９】
平衡ＣＤ実験を、Ａｖｉｖにより供給された５位の熱電気セルホルダーを備えたＡｖｉｖ ６２ＤＳ又は６２ＡＤＳ分光光度計により実施した。バッファー条件は酢酸によりｐＨ８．０に調節された５０ｍＭ ｂｉｓ−ｔｒｉｓプロパン及び５０ｍＭ酢酸アンモニウムであった。各実験に関する最終蛋白質濃度は、５−３０ｍＭの範囲であった。データを０．１ｃｍのパスの長さのセルに回収した。
【０１１０】
スペクトルを２６５〜２１０ｎｍにおいて回収した。熱変性は２１７ｎｍにおいて３０から９０℃において実施して、データを２℃おきに回収した。各温度における平衡時間は０．１分であり、そしてデータはサンプルあたり４秒間回収した。
【０１１１】
ｐＨ８．０サンプルの残りを５ｘ４００ｕＬアリコートに分割した。２つのサンプルを酢酸によｐＨ５から７に調節して、２つのその他を水酸化ナトリウムによりｐＨ９及び１０に調節した。全５サンプルの熱変性は上記のとおりに同時に実施した。融点を、Ｌｕｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３４：１０６６９及びＧｌｏｓｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３６：５６１２の方法により測定した。
【０１１２】
【表３】
表３：ＥＧＩＩＩ変種の熱安定性
アミノ酸置換 ΔＴｍ Ｔｍ（℃） フィットエラー
T．reeseiのEGIII ０．００ ５４．４３ ０．２０
Ｗ７Ｙ −１．０３ ５３．４０ ０．２４
Ｔ１１Ｓ／Ｔ１６Ｉ １．０７ ５５．５０ ０．１３
Ａ３５Ｓ −４．０３ ５０．４０ ０．１４
Ｓ３９Ｎ ０．４７ ５４．９０ ０．１７
Ｇ４１Ａ ２．４７ ５６．９０ ０．１１
Ｓ６３Ｖ −０．８３ ５３．６０ ０．１１
Ａ６６Ｎ ０．０７ ５４．５０ ０．１０
Ｓ７７Ｇ ０．０７ ５４．５０ ０．０９
Ｎ９１Ｄ ０．４７ ５４．９０ ０．１７
Ｓ１４３Ｔ ０．４７ ５４．９０ ０．１２
Ｔ１６３Ｓ ０．２７ ５４．７０ ０．０７
Ｎ１６７Ｓ ０．１７ ５４．６０ ０．１０
Ａ１８８Ｇ ０．４７ ５４．９０ ０．１７
表３から認識し得るとおり、ほとんどの置換は野生型のＥＧＩＩＩよりも融点を上昇させた。
実施例４：変種ＥＧＩＩＩセルラーゼの比活性
比活性をアッセイするため、ＮＰＣの加水分解アッセイを用いた。マイクロタイタープレート中で、１００μｌの５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．５及び２０μｌの２５ｍｇ／ｍＬ ｏ−ＮＰＣ（ｏ−ニトロフェニルｏ−Ｄ−セロビオシド（シグマＮ ４７６４））をアッセイバッファー中で加えた。プレートを１０分間４０℃においてインキュベートした。
【０１１３】
平衡化したら、１０μｌのＥＧＩＩＩ様セルラーゼを加えて、プレートを４０℃においてさらに１０分間インキュベートした。加水分解を消滅させて反応を停止するため、７０ｉＬの０．２Ｍグリシン、ｐＨ１０．０を加えた。次に、プレートをマイクロタイターリーダー中で４１０ｎｍにおいて読んだ。規準として、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉのＥＧＩＩＩの１０μＬの０．１ｍｇ／ｍｌ溶液は約０．３付近のＯＤを提供した。
【０１１４】
ＥＧＩＩＩ様セルラーゼの濃度を２８０ｎｍにおける吸光により測定したが、減衰定数はＰａｃｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏ．Ｓｃｉ．４：２４１１（１９９５）に記載されたＥｄｅｌｈｏｃｈの方法により実験上測定された７８７１１ Ｍ^-1ｃｍ^-1又は３．３５２ｇ／Ｌ^-1であった。
【０１１５】
【表４】
表４：変種ＥＧＩＩＩセルラーゼの比活性
変種 比活性（ＷＴ ＥＧＩＩＩに比較して）
ＷＴ ＥＧＩＩＩ １．００
Ｗ７Ｙ １．０９
Ｔ１１Ｓ／Ｔ１６Ｉ １．０２
Ａ３５Ｓ ０．７６
Ｓ３９Ｎ ０．８２
Ｇ４１Ａ ０．９０
Ｓ６３Ｖ ０．６８
Ａ６６Ｎ １．００
Ｓ７７Ｇ １．０２
Ｎ９１Ｄ ０．８９
Ｓ１４３Ｔ ０．８９
Ｔ１６３Ｓ ０．９９
Ｎ１６７Ｓ ０．９４
Ａ１８８Ｇ ０．８６
驚くことに、置換は野生型のＥＧＩＩＩに比較して変種の比活性にほとんど又は全く影響を有さなかった。
【配列表】
SEQUENCE LISTING

<110> Genencor International, Inc.

<120> Mutant EGIII Cellulase, DNA Encoding
Such EGIII Compositions and Methods for Obtaining Same


<130> GC546-C1-PCT

<140> PCT/US01/23990
<141> 2001-07-31

<150> US 09/633,084
<151> 2000-08-04

<160> 50

<170> FastSEQ for Windows Version 4.0

<210> 1
<211> 218
<212> PRT
<213> Trichoderma reesei

<400> 1
Gln Thr Ser Cys Asp Gln Trp Ala Thr Phe Thr Gly Asn Gly Tyr Thr
1 5 10 15
Val Ser Asn Asn Leu Trp Gly Ala Ser Ala Gly Ser Gly Phe Gly Cys
20 25 30
Val Thr Ala Val Ser Leu Ser Gly Gly Ala Ser Trp His Ala Asp Trp
35 40 45
Gln Trp Ser Gly Gly Gln Asn Asn Val Lys Ser Tyr Gln Asn Ser Gln
50 55 60
Ile Ala Ile Pro Gln Lys Arg Thr Val Asn Ser Ile Ser Ser Met Pro
65 70 75 80
Thr Thr Ala Ser Trp Ser Tyr Ser Gly Ser Asn Ile Arg Ala Asn Val
85 90 95
Ala Tyr Asp Leu Phe Thr Ala Ala Asn Pro Asn His Val Thr Tyr Ser
100 105 110
Gly Asp Tyr Glu Leu Met Ile Trp Leu Gly Lys Tyr Gly Asp Ile Gly
115 120 125
Pro Ile Gly Ser Ser Gln Gly Thr Val Asn Val Gly Gly Gln Ser Trp
130 135 140
Thr Leu Tyr Tyr Gly Tyr Asn Gly Ala Met Gln Val Tyr Ser Phe Val
145 150 155 160
Ala Gln Thr Asn Thr Thr Asn Tyr Ser Gly Asp Val Lys Asn Phe Phe
165 170 175
Asn Tyr Leu Arg Asp Asn Lys Gly Tyr Asn Ala Ala Gly Gln Tyr Val
180 185 190
Leu Ser Tyr Gln Phe Gly Thr Glu Pro Phe Thr Gly Ser Gly Thr Leu
195 200 205
Asn Val Ala Ser Trp Thr Ala Ser Ile Asn
210 215

<210> 2
<211> 702
<212> DNA
<213> Trichoderma reesei

<400> 2
atgaagttcc ttcaagtcct ccctgccctc ataccggccg ccctggccca aaccagctgt 60
gaccagtggg caaccttcac tggcaacggc tacacagtca gcaacaacct ttggggagca 120
tcagccggct ctggatttgg ctgcgtgacg gcggtatcgc tcagcggcgg ggcctcctgg 180
cacgcagact ggcagtggtc cggcggccag aacaacgtca agtcgtacca gaactctcag 240
attgccattc cccagaagag gaccgtcaac agcatcagca gcatgcccac cactgccagc 300
tggagctaca gcgggagcaa catccgcgct aatgttgcgt atgacttgtt caccgcagcc 360
aacccgaatc atgtcacgta ctcgggagac tacgaactca tgatctggct tggcaaatac 420
ggcgatattg ggccgattgg gtcctcacag ggaacagtca acgtcggtgg ccagagctgg 480
acgctctact atggctacaa cggagccatg caagtctatt cctttgtggc ccagaccaac 540
actaccaact acagcggaga tgtcaagaac ttcttcaatt atctccgaga caataaagga 600
tacaacgctg caggccaata tgttcttagc taccaatttg gtaccgagcc cttcacgggc 660
agtggaactc tgaacgtcgc atcctggacc gcatctatca ac 702

<210> 3
<211> 234
<212> PRT
<213> Trichoderma reesei

<400> 3
Met Lys Phe Leu Gln Val Leu Pro Ala Leu Ile Pro Ala Ala Leu Ala
1 5 10 15
Gln Thr Ser Cys Asp Gln Trp Ala Thr Phe Thr Gly Asn Gly Tyr Thr
20 25 30
Val Ser Asn Asn Leu Trp Gly Ala Ser Ala Gly Ser Gly Phe Gly Cys
35 40 45
Val Thr Ala Val Ser Leu Ser Gly Gly Ala Ser Trp His Ala Asp Trp
50 55 60
Gln Trp Ser Gly Gly Gln Asn Asn Val Lys Ser Tyr Gln Asn Ser Gln
65 70 75 80
Ile Ala Ile Pro Gln Lys Arg Thr Val Asn Ser Ile Ser Ser Met Pro
85 90 95
Thr Thr Ala Ser Trp Ser Tyr Ser Gly Ser Asn Ile Arg Ala Asn Val
100 105 110
Ala Tyr Asp Leu Phe Thr Ala Ala Asn Pro Asn His Val Thr Tyr Ser
115 120 125
Gly Asp Tyr Glu Leu Met Ile Trp Leu Gly Lys Tyr Gly Asp Ile Gly
130 135 140
Pro Ile Gly Ser Ser Gln Gly Thr Val Asn Val Gly Gly Gln Ser Trp
145 150 155 160
Thr Leu Tyr Tyr Gly Tyr Asn Gly Ala Met Gln Val Tyr Ser Phe Val
165 170 175
Ala Gln Thr Asn Thr Thr Asn Tyr Ser Gly Asp Val Lys Asn Phe Phe
180 185 190
Asn Tyr Leu Arg Asp Asn Lys Gly Tyr Asn Ala Ala Gly Gln Tyr Val
195 200 205
Leu Ser Tyr Gln Phe Gly Thr Glu Pro Phe Thr Gly Ser Gly Thr Leu
210 215 220
Asn Val Ala Ser Trp Thr Ala Ser Ile Asn
225 230

<210> 4
<211> 234
<212> PRT
<213> Hypocrea schweinitzii

<400> 4
Met Lys Phe Leu Gln Val Leu Pro Ala Ile Leu Pro Ala Ala Leu Ala
1 5 10 15
Gln Thr Ser Cys Asp Gln Tyr Ala Thr Phe Ser Gly Asn Gly Tyr Ile
20 25 30
Val Ser Asn Asn Leu Trp Gly Ala Ser Ala Gly Ser Gly Phe Gly Cys
35 40 45
Val Thr Ser Val Ser Leu Asn Gly Ala Ala Ser Trp His Ala Asp Trp
50 55 60
Gln Trp Ser Gly Gly Gln Asn Asn Val Lys Ser Tyr Gln Asn Val Gln
65 70 75 80
Ile Asn Ile Pro Gln Lys Arg Thr Val Asn Ser Ile Gly Ser Met Pro
85 90 95
Thr Thr Ala Ser Trp Ser Tyr Ser Gly Ser Asp Ile Arg Ala Asn Val
100 105 110
Ala Tyr Asp Leu Phe Thr Ala Ala Asn Pro Asn His Val Thr Tyr Ser
115 120 125
Gly Asp Tyr Glu Leu Met Ile Trp Leu Gly Lys Tyr Gly Asp Ile Gly
130 135 140
Pro Ile Gly Ser Ser Gln Gly Thr Val Asn Val Gly Gly Gln Thr Trp
145 150 155 160
Thr Leu Tyr Tyr Gly Tyr Asn Gly Ala Met Gln Val Tyr Ser Phe Val
165 170 175
Ala Gln Ser Asn Thr Thr Ser Tyr Ser Gly Asp Val Lys Asn Phe Phe
180 185 190
Asn Tyr Leu Arg Asp Asn Lys Gly Tyr Asn Ala Gly Gly Gln Tyr Val
195 200 205
Leu Ser Tyr Gln Phe Gly Thr Glu Pro Phe Thr Gly Ser Gly Thr Leu
210 215 220
Asn Val Ala Ser Trp Thr Ala Ser Ile Asn
225 230

<210> 5
<211> 259
<212> PRT
<213> Aspergillus aculeatus

<400> 5
Met Lys Ala Phe His Leu Leu Ala Ala Leu Ala Gly Ala Ala Val Ala
1 5 10 15
Gln Gln Ala Gln Leu Cys Asp Gln Tyr Ala Thr Tyr Thr Gly Gly Val
20 25 30
Tyr Thr Ile Asn Asn Asn Leu Trp Gly Lys Asp Ala Gly Ser Gly Ser
35 40 45
Gln Cys Thr Thr Val Asn Ser Ala Ser Ser Ala Gly Thr Ser Trp Ser
50 55 60
Thr Lys Trp Asn Trp Ser Gly Gly Glu Asn Ser Val Lys Ser Tyr Ala
65 70 75 80
Asn Ser Gly Leu Thr Phe Asn Lys Lys Leu Val Ser Gln Ile Ser Gln
85 90 95
Ile Pro Thr Thr Ala Arg Trp Ser Tyr Asp Asn Thr Gly Ile Arg Ala
100 105 110
Asp Val Ala Tyr Asp Leu Phe Thr Ala Ala Asp Ile Asn His Val Thr
115 120 125
Trp Ser Gly Asp Tyr Glu Leu Met Ile Trp Leu Ala Arg Tyr Gly Gly
130 135 140
Val Gln Pro Ile Gly Ser Gln Ile Ala Thr Ala Thr Val Asp Gly Gln
145 150 155 160
Thr Trp Glu Leu Trp Tyr Gly Ala Asn Gly Ser Gln Lys Thr Tyr Ser
165 170 175
Phe Val Ala Pro Thr Pro Ile Thr Ser Phe Gln Gly Asp Val Asn Asp
180 185 190
Phe Phe Lys Tyr Leu Thr Gln Asn His Gly Phe Pro Ala Ser Ser Gln
195 200 205
Tyr Leu Ile Thr Leu Gln Phe Gly Thr Glu Pro Phe Thr Gly Gly Pro
210 215 220
Ala Thr Leu Ser Val Ser Asn Trp Ser Ala Ser Val Gln Gln Ala Gly
225 230 235 240
Phe Glu Pro Trp Gln Asn Gly Ala Gly Leu Ala Val Asn Ser Phe Ser
245 250 255
Ser Thr Val


<210> 6
<211> 239
<212> PRT
<213> Aspergillus kawachii (1)

<400> 6
Met Lys Leu Ser Met Thr Leu Ser Leu Phe Ala Ala Thr Ala Met Gly
1 5 10 15
Gln Thr Met Cys Ser Gln Tyr Asp Ser Ala Ser Ser Pro Pro Tyr Ser
20 25 30
Val Asn Gln Asn Leu Trp Gly Glu Tyr Gln Gly Thr Gly Ser Gln Cys
35 40 45
Val Tyr Val Asp Lys Leu Ser Ser Ser Gly Ala Ser Trp His Thr Lys
50 55 60
Trp Thr Trp Ser Gly Gly Glu Gly Thr Val Lys Ser Tyr Ser Asn Ser
65 70 75 80
Gly Leu Thr Phe Asp Lys Lys Leu Val Ser Asp Val Ser Ser Ile Pro
85 90 95
Thr Ser Val Thr Trp Ser Gln Asp Asp Thr Asn Val Gln Ala Asp Val
100 105 110
Ser Tyr Asp Leu Phe Thr Ala Ala Asn Ala Asp His Ala Thr Ser Ser
115 120 125
Gly Asp Tyr Glu Leu Met Ile Trp Leu Ala Arg Tyr Gly Ser Val Gln
130 135 140
Pro Ile Gly Lys Gln Ile Ala Thr Ala Thr Val Gly Gly Lys Ser Trp
145 150 155 160
Glu Val Trp Tyr Gly Thr Ser Thr Gln Ala Gly Ala Glu Gln Lys Thr
165 170 175
Tyr Ser Phe Val Ala Gly Ser Pro Ile Asn Ser Trp Ser Gly Asp Ile
180 185 190
Lys Asp Phe Phe Asn Tyr Leu Thr Gln Asn Gln Gly Phe Pro Ala Ser
195 200 205
Ser Gln His Leu Ile Thr Leu Gln Cys Gly Thr Glu Pro Phe Thr Gly
210 215 220
Gly Pro Ala Thr Phe Thr Val Asp Asn Trp Thr Ala Ser Val Asn
225 230 235

<210> 7
<211> 239
<212> PRT
<213> Aspergillus kawachii (2)

<400> 7
Met Lys Ala Phe His Leu Leu Ala Ala Leu Ser Gly Ala Ala Val Ala
1 5 10 15
Gln Gln Ala Gln Leu Cys Asp Gln Tyr Ala Thr Tyr Thr Gly Gly Val
20 25 30
Tyr Thr Ile Asn Asn Asn Leu Trp Gly Lys Asp Ala Gly Ser Gly Ser
35 40 45
Gln Cys Thr Thr Val Asn Ser Ala Ser Ser Ala Gly Thr Ser Trp Ser
50 55 60
Thr Lys Trp Asn Trp Ser Gly Gly Glu Asn Ser Val Lys Ser Tyr Ala
65 70 75 80
Asn Ser Gly Leu Ser Phe Asn Lys Lys Leu Val Ser Gln Ile Ser His
85 90 95
Ile Pro Thr Ala Ala Arg Trp Ser Tyr Asp Asn Thr Cys Ile Arg Arg
100 105 110
Gly Arg Ala Tyr Asp Leu Phe Thr Ala Ala Asp Ile Asn His Val Thr
115 120 125
Trp Ser Gly Asp Tyr Glu Leu Met Ile Trp Leu Ala Arg Tyr Gly Gly
130 135 140
Val Gln Pro Leu Gly Ser Gln Ile Ala Thr Ala Thr Val Glu Gly Gln
145 150 155 160
Thr Trp Glu Leu Trp Tyr Gly Val Asn Gly Ala Gln Lys Thr Tyr Ser
165 170 175
Phe Val Ala Ala Asn Pro Ile Thr Ser Phe Gln Gly Asp Ile Asn Asp
180 185 190
Phe Phe Lys Tyr Leu Thr Gln Asn His Gly Phe Pro Ala Ser Ser Gln
195 200 205
Tyr Leu Ile Ile Leu Ala Leu Gln Phe Gly Thr Glu Pro Phe Thr Gly
210 215 220
Gly Pro Ala Thr Leu Asn Val Ala Asp Trp Ser Ala Ser Val Gln
225 230 235

<210> 8
<211> 247
<212> PRT
<213> Aspergillus oryzae

<400> 8
Met Lys Leu Ser Leu Ala Leu Ala Thr Leu Val Ala Thr Ala Phe Ser
1 5 10 15
Gln Glu Leu Cys Ala Gln Tyr Asp Ser Ala Ser Ser Pro Pro Tyr Ser
20 25 30
Val Asn Asn Asn Leu Trp Gly Gln Asp Ser Gly Thr Gly Phe Thr Ser
35 40 45
Gln Cys Val Tyr Val Asp Asn Leu Ser Ser Ser Gly Ala Ala Trp His
50 55 60
Thr Thr Trp Thr Trp Asn Gly Gly Glu Gly Ser Val Lys Ser Tyr Ser
65 70 75 80
Asn Ser Ala Val Thr Phe Asp Lys Lys Leu Val Ser Asp Val Gln Ser
85 90 95
Ile Pro Thr Asp Val Glu Trp Ser Gln Asp Phe Thr Asn Thr Asn Val
100 105 110
Asn Ala Asp Val Ala Tyr Asp Leu Phe Thr Ala Ala Asp Gln Asn His
115 120 125
Val Thr Tyr Ser Gly Asp Tyr Glu Leu Met Ile Trp Leu Ala Arg Tyr
130 135 140
Gly Thr Ile Gln Pro Ile Gly Thr Gln Ile Asp Thr Ala Thr Val Glu
145 150 155 160
Gly His Thr Trp Glu Leu Trp Phe Thr Tyr Gly Thr Thr Ile Gln Ala
165 170 175
Gly Ala Glu Gln Lys Thr Tyr Ser Phe Val Ser Ala Thr Pro Ile Asn
180 185 190
Thr Phe Gly Gly Asp Ile Lys Lys Phe Phe Asp Tyr Ile Thr Ser Lys
195 200 205
His Ser Phe Pro Ala Ser Ala Gln Tyr Leu Ile Asn Met Gln Phe Gly
210 215 220
Thr Glu Pro Phe Phe Thr Thr Gly Gly Pro Val Thr Phe Thr Val Pro
225 230 235 240
Asn Trp Thr Ala Ser Val Asn
245

<210> 9
<211> 254
<212> PRT
<213> Humicola grisei

<400> 9
Met Leu Lys Ser Ala Leu Leu Leu Gly Ala Ala Ala Val Ser Val Gln
1 5 10 15
Ser Ala Ser Ile Pro Thr Ile Pro Ala Asn Leu Glu Pro Arg Gln Ile
20 25 30
Arg Ser Leu Cys Glu Leu Tyr Gly Tyr Trp Ser Gly Asn Gly Tyr Glu
35 40 45
Leu Leu Asn Asn Leu Trp Gly Lys Asp Thr Ala Thr Ser Gly Trp Gln
50 55 60
Cys Thr Tyr Leu Asp Gly Thr Asn Asn Gly Gly Ile Gln Trp Ser Thr
65 70 75 80
Ala Trp Glu Trp Gln Gly Ala Pro Asp Asn Val Lys Ser Tyr Pro Tyr
85 90 95
Val Gly Lys Gln Ile Gln Arg Gly Arg Lys Ile Ser Asp Ile Asn Ser
100 105 110
Met Arg Thr Ser Val Ser Trp Thr Tyr Asp Arg Thr Asp Ile Arg Ala
115 120 125
Asn Val Ala Tyr Asp Val Phe Thr Ala Arg Asp Pro Asp His Pro Asn
130 135 140
Trp Gly Gly Asp Tyr Glu Leu Met Ile Trp Leu Ala Arg Tyr Gly Gly
145 150 155 160
Ile Tyr Pro Ile Gly Thr Phe His Ser Gln Val Asn Leu Ala Gly Arg
165 170 175
Thr Trp Asp Leu Trp Thr Gly Tyr Asn Gly Asn Met Arg Val Tyr Ser
180 185 190
Phe Leu Pro Pro Ser Gly Asp Ile Arg Asp Phe Ser Cys Asp Ile Lys
195 200 205
Asp Phe Phe Asn Tyr Leu Glu Arg Asn His Gly Tyr Pro Ala Arg Glu
210 215 220
Gln Asn Leu Ile Val Tyr Gln Val Gly Thr Glu Cys Phe Thr Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ala Arg Phe Thr Cys Arg Asp Phe Arg Ala Asp Leu Trp
245 250

<210> 10
<211> 254
<212> PRT
<213> Humicola insolens

<400> 10
Met Leu Lys Ser Ala Leu Leu Leu Gly Pro Ala Ala Val Ser Val Gln
1 5 10 15
Ser Ala Ser Ile Pro Thr Ile Pro Ala Asn Leu Glu Pro Arg Gln Ile
20 25 30
Arg Ser Leu Cys Glu Leu Tyr Gly Tyr Trp Ser Gly Asn Gly Tyr Glu
35 40 45
Leu Leu Asn Asn Leu Trp Gly Lys Asp Thr Ala Thr Ser Gly Trp Gln
50 55 60
Cys Thr Tyr Leu Asp Gly Thr Asn Asn Gly Gly Ile Gln Trp Ser Thr
65 70 75 80
Ala Trp Glu Trp Gln Gly Ala Pro Asp Asn Val Lys Ser Tyr Pro Tyr
85 90 95
Val Gly Lys Gln Ile Gln Arg Gly Arg Lys Ile Ser Asp Ile Asn Ser
100 105 110
Met Arg Thr Ser Val Ser Trp Thr Tyr Asp Arg Thr Asp Ile Arg Ala
115 120 125
Asn Val Ala Tyr Asp Val Phe Thr Ala Arg Asp Pro Asp His Pro Asn
130 135 140
Trp Gly Gly Asp Tyr Glu Leu Met Ile Trp Leu Ala Arg Tyr Gly Gly
145 150 155 160
Ile Tyr Pro Ile Gly Thr Phe His Ser Gln Val Asn Leu Ala Gly Arg
165 170 175
Thr Trp Asp Leu Trp Thr Gly Tyr Asn Gly Asn Met Arg Val Tyr Ser
180 185 190
Phe Leu Pro Pro Ser Gly Asp Ile Arg Asp Phe Ser Cys Asp Ile Lys
195 200 205
Asp Phe Phe Asn Tyr Leu Glu Arg Asn His Gly Tyr Pro Ala Arg Glu
210 215 220
Gln Asn Leu Ile Val Tyr Gln Val Gly Thr Glu Cys Phe Thr Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ala Arg Phe Thr Cys Arg Asp Phe Arg Ala Asp Leu Trp
245 250

<210> 11
<211> 247
<212> PRT
<213> Chaetomium brasiliense

<400> 11
Met Lys Leu Thr Leu Val Leu Phe Val Ser Ser Leu Ala Ala Ala Thr
1 5 10 15
Pro Leu Gly Trp Arg Glu Arg Gln Gln Gln Val Ser Leu Cys Gly Gln
20 25 30
Ser Ser Ser Trp Ser Gly Asn Gly Tyr Gln Leu Asn Asn Asn Leu Trp
35 40 45
Gly Gln Ser Arg Ala Thr Ser Gly Ser Gln Cys Thr Tyr Leu Asp Ser
50 55 60
Ser Ser Asn Ser Gly Ile His Trp His Thr Thr Trp Thr Trp Glu Gly
65 70 75 80
Gly Glu Gly Glu Val Lys Ser Tyr Ala Tyr Ser Gly Arg Gln Val Ser
85 90 95
Thr Gly Leu Thr Ile Ala Ser Ile Asp Ser Met Gln Thr Ser Val Ser
100 105 110
Trp Glu Tyr Asn Thr Thr Asp Ile Gln Ala Asn Val Ala Tyr Asp Ile
115 120 125
Phe Thr Ala Glu Asp Pro Asp His Glu His Ser Ser Gly Asp Tyr Glu
130 135 140
Leu Met Ile Trp Leu Ala Arg Tyr Asn Asn Val Ser Pro Ile Gly Ser
145 150 155 160
Ser Val Ala Thr Ala Thr Val Gly Gly Asp Thr Trp Asp Leu Phe Ala
165 170 175
Gly Ala Asn Gly Asp Met Glu Val Tyr Ser Phe Val Ala Glu Asn Thr
180 185 190
Met Asn Ser Phe Ser Gly Asp Val Lys Asp Phe Phe Asp Tyr Leu Glu
195 200 205
Gln Asn Val Gly Phe Pro Val Asp Asp Gln Tyr Leu Leu Val Phe Glu
210 215 220
Leu Gly Ser Glu Ala Phe Thr Gly Gly Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser
225 230 235 240
Gln Phe Ser Ala Asn Ile Ala
245

<210> 12
<211> 238
<212> PRT
<213> Fusarium equiseti

<400> 12
Met Lys Ser Thr Leu Leu Leu Ala Gly Ala Phe Ala Pro Leu Ala Phe
1 5 10 15
Ala Lys Asp Leu Cys Glu Gln Tyr Gly Tyr Leu Ser Ser Asp Gly Tyr
20 25 30
Ser Leu Asn Asn Asn Val Trp Gly Lys Asp Ser Gly Thr Gly Asp Gln
35 40 45
Cys Thr His Val Asn Trp Asn Asn Ala Asn Gly Ala Gly Trp Asp Val
50 55 60
Glu Trp Asn Trp Ser Gly Gly Lys Asp Asn Val Lys Ser Tyr Pro Asn
65 70 75 80
Ser Ala Leu Leu Ile Gly Glu Asp Lys Lys Thr Ile Ser Ser Ile Thr
85 90 95
Asn Met Gln Ser Thr Ala Glu Trp Lys Tyr Ser Gly Asp Asn Leu Arg
100 105 110
Ala Asp Val Ala Tyr Asp Leu Phe Thr Ala Ala Asp Pro Asn His Glu
115 120 125
Thr Ser Ser Gly Glu Tyr Glu Leu Met Val Trp Leu Ala Arg Ile Gly
130 135 140
Gly Val Gln Pro Ile Gly Ser Leu Gln Thr Ser Val Thr Ile Glu Gly
145 150 155 160
His Thr Trp Glu Leu Trp Val Gly Met Asn Gly Ser Met Lys Val Phe
165 170 175
Ser Phe Val Ala Pro Thr Pro Val Asn Asn Phe Asn Ala Asp Ile Lys
180 185 190
Gln Phe Trp Asp Tyr Leu Thr Lys Ser Gln Asn Phe Pro Ala Asp Asn
195 200 205
Gln Tyr Leu Leu Thr Phe Gln Phe Gly Thr Glu Pro Phe Thr Gly Asp
210 215 220
Asn Ala Lys Phe Thr Val Thr Asn Phe Asn Ala His Leu Lys
225 230 235

<210> 13
<211> 244
<212> PRT
<213> Fusarium javanicum (1)

<400> 13
Met Lys Ser Ala Ile Val Ala Ala Leu Ala Gly Leu Ala Ala Ala Ser
1 5 10 15
Pro Thr Arg Leu Ile Pro Arg Gly Gln Phe Cys Gly Gln Trp Asp Ser
20 25 30
Glu Thr Ala Gly Ala Tyr Thr Ile Tyr Asn Asn Leu Trp Gly Lys Asp
35 40 45
Asn Ala Glu Ser Gly Glu Gln Cys Thr Thr Asn Ser Gly Glu Gln Ser
50 55 60
Asp Gly Ser Ile Ala Trp Ser Val Glu Trp Ser Trp Thr Gly Gly Gln
65 70 75 80
Gly Gln Val Lys Ser Tyr Pro Asn Ala Val Val Glu Ile Glu Lys Lys
85 90 95
Thr Leu Gly Glu Val Ser Ser Ile Pro Ser Ala Trp Asp Trp Thr Tyr
100 105 110
Thr Gly Asn Gly Ile Ile Ala Asn Val Ala Tyr Asp Leu Phe Thr Ser
115 120 125
Ser Thr Glu Ser Gly Asp Ala Glu Tyr Glu Phe Met Ile Trp Leu Ser
130 135 140
Ala Leu Gly Gly Ala Gly Pro Ile Ser Asn Asp Gly Ser Pro Val Ala
145 150 155 160
Thr Ala Glu Leu Ala Gly Thr Ser Trp Lys Leu Tyr Gln Gly Lys Asn
165 170 175
Asn Gln Met Thr Val Phe Ser Phe Val Ala Glu Ser Asp Val Asn Asn
180 185 190
Phe Cys Gly Asp Leu Ala Asp Phe Thr Asp Tyr Leu Val Asp Asn His
195 200 205
Gly Val Ser Ser Ser Gln Ile Leu Gln Ser Val Gly Ala Gly Thr Glu
210 215 220
Pro Phe Glu Gly Thr Asn Ala Val Phe Thr Thr Asn Asn Tyr His Ala
225 230 235 240
Asp Val Glu Tyr


<210> 14
<211> 250
<212> PRT
<213> Fusarium javanicum (2)

<400> 14
Met Lys Phe Phe Gly Val Val Ser Ala Ser Leu Ala Ala Thr Ala Val
1 5 10 15
Ala Thr Pro Thr Thr Pro Thr Glu Thr Ile Glu Lys Arg Asp Thr Thr
20 25 30
Trp Cys Asp Ala Phe Gly Ser Leu Ala Thr Ser Gly Tyr Thr Val Tyr
35 40 45
His Asn Asn Trp Gly Lys Gly Asp Ala Thr Ser Gly Ser Gln Cys Thr
50 55 60
Thr Phe Thr Ser Val Ser Asn Asn Asn Phe Val Trp Ser Thr Ser Trp
65 70 75 80
Thr Trp Ala Gly Gly Ala Gly Lys Val Lys Ser Tyr Ser Asn Val Ala
85 90 95
Leu Glu Lys Ile Asn Lys Lys Ile Ser Asp Ile Lys Ser Val Ser Thr
100 105 110
Arg Trp Ile Trp Arg Tyr Thr Gly Thr Lys Met Ile Ala Asn Val Ser
115 120 125
Tyr Asp Leu Trp Phe Ala Pro Thr Ala Ser Ser Asn Asn Ala Tyr Glu
130 135 140
Ile Met Ile Trp Val Gly Ala Tyr Gly Gly Ala Leu Pro Ile Ser Thr
145 150 155 160
Pro Gly Lys Gly Val Ile Asp Arg Pro Thr Leu Ala Gly Ile Pro Trp
165 170 175
Asp Val Tyr Lys Gly Pro Asn Gly Asp Val Thr Val Ile Ser Phe Val
180 185 190
Ala Ser Ser Asn Gln Gly Asn Phe Gln Ala Asp Leu Lys Glu Phe Leu
195 200 205
Asn Tyr Leu Thr Ser Lys Gln Gly Leu Pro Ser Asn Tyr Val Ala Thr
210 215 220
Ser Phe Gln Ala Gly Thr Glu Pro Phe Glu Gly Thr Asn Ala Val Leu
225 230 235 240
Lys Thr Ser Ala Tyr Thr Ile Ser Val Asn
245 250

<210> 15
<211> 238
<212> PRT
<213> Gliocladium roseum (1)

<400> 15
Met Lys Ala Asn Ile Val Ile Leu Ser Leu Phe Ala Pro Leu Ala Ala
1 5 10 15
Val Ala Gln Thr Leu Cys Gly Gln Tyr Ser Ser Asn Thr Gln Gly Gly
20 25 30
Tyr Ile Phe Asn Asn Asn Met Trp Gly Met Gly Ser Gly Ser Gly Ser
35 40 45
Gln Cys Thr Tyr Val Asp Lys Val Trp Ala Glu Gly Val Ala Trp His
50 55 60
Thr Asp Trp Ser Trp Ser Gly Gly Asp Asn Asn Val Lys Ser Tyr Pro
65 70 75 80
Tyr Ser Gly Arg Glu Leu Gly Thr Lys Arg Ile Val Ser Ser Ile Lys
85 90 95
Ser Ile Ser Ser Gly Ala Asp Trp Asp Tyr Thr Gly Ser Asn Leu Arg
100 105 110
Ala Asn Ala Ala Tyr Asp Ile Phe Thr Ser Ala Asn Pro Asn His Ala
115 120 125
Thr Ser Ser Gly Asp Tyr Glu Val Met Ile Trp Leu Ala Asn Leu Gly
130 135 140
Gly Leu Thr Pro Ile Gly Ser Pro Ile Gly Thr Val Lys Ala Ala Gly
145 150 155 160
Arg Asp Trp Glu Leu Trp Asp Gly Tyr Asn Gly Ala Met Arg Val Tyr
165 170 175
Ser Phe Val Ala Pro Ser Gln Leu Asn Ser Phe Asp Gly Glu Ile Met
180 185 190
Asp Phe Phe Tyr Val Val Lys Asp Met Arg Gly Phe Pro Ala Asp Ser
195 200 205
Gln His Leu Leu Thr Val Gln Phe Gly Thr Glu Pro Ile Ser Gly Ser
210 215 220
Gly Ala Lys Phe Ser Val Ser His Trp Ser Ala Lys Leu Gly
225 230 235

<210> 16
<211> 348
<212> PRT
<213> Gliocladium roseum (2)

<400> 16
Met Lys Ser Ile Ile Ser Phe Phe Gly Leu Ala Thr Leu Val Ala Ala
1 5 10 15
Ala Pro Ser Gln Asn Pro Thr Arg Thr Gln Pro Leu Glu Lys Arg Ala
20 25 30
Thr Thr Leu Cys Gly Gln Trp Asp Ser Val Glu Thr Gly Gly Tyr Thr
35 40 45
Ile Tyr Asn Asn Leu Trp Gly Gln Asp Asn Gly Ser Gly Ser Gln Cys
50 55 60
Leu Thr Val Glu Gly Val Thr Asp Gly Leu Ala Ala Trp Ser Ser Thr
65 70 75 80
Trp Ser Trp Ser Gly Gly Ser Ser Ser Val Lys Ser Tyr Ser Asn Ala
85 90 95
Val Leu Ser Ala Glu Ala Ala Arg Ile Ser Ala Ile Ser Ser Ile Pro
100 105 110
Ser Lys Trp Glu Trp Ser Tyr Thr Gly Thr Asp Ile Val Ala Asn Val
115 120 125
Ala Tyr Asp Leu Phe Ser Asn Thr Asp Cys Gly Asp Thr Pro Glu Tyr
130 135 140
Glu Ile Met Ile Trp Leu Ser Ala Leu Gly Gly Ala Gly Pro Ile Ser
145 150 155 160
Ser Thr Gly Ser Ser Ile Ala Thr Val Thr Ile Ala Gly Ala Ser Trp
165 170 175
Asn Leu Trp Gln Gly Gln Asn Asn Gln Met Ala Val Phe Ser Phe Val
180 185 190
Ala Glu Ser Asp Gln Lys Ser Phe Ser Gly Asp Leu Asn Asp Phe Ile
195 200 205
Gln Tyr Leu Val Asp Ser Gln Gly Tyr Ser Gly Ser Gln Cys Leu Tyr
210 215 220
Ser Ile Gly Ala Gly Thr Glu Pro Phe Thr Gly Thr Asp Ala Glu Phe
225 230 235 240
Ile Thr Thr Gly Tyr Ser Val Ser Val Ser Ala Gly Asp Ser Gly Cys
245 250 255
Asp Glu Thr Thr Thr Ser Ser Gln Ala Gln Ser Ser Thr Val Glu Thr
260 265 270
Ser Thr Ala Thr Gln Pro Gln Ser Ser Ser Thr Val Val Pro Thr Val
275 280 285
Thr Leu Ser Gln Pro Ser Asn Glu Ser Thr Thr Thr Pro Val Gln Ser
290 295 300
Gln Pro Ser Ser Val Glu Thr Thr Pro Thr Ala Gln Pro Gln Ser Ser
305 310 315 320
Ser Val Gln Thr Thr Thr Thr Ala Gln Ala Gln Pro Thr Ser Gly Thr
325 330 335
Gly Cys Ser Arg Arg Arg Lys Arg Arg Ala Val Val
340 345

<210> 17
<211> 236
<212> PRT
<213> Gliocladium roseum (3)

<400> 17
Met Lys Phe Gln Leu Leu Ser Leu Thr Ala Phe Ala Pro Leu Ser Leu
1 5 10 15
Ala Ala Leu Cys Gly Gln Tyr Gln Ser Gln Ser Gln Gly Gly Tyr Ile
20 25 30
Phe Asn Asn Asn Lys Trp Gly Gln Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gln Cys
35 40 45
Leu Thr Ile Asp Lys Thr Trp Asp Ser Asn Val Ala Phe His Ala Asp
50 55 60
Trp Ser Trp Ser Gly Gly Thr Asn Asn Val Lys Ser Tyr Pro Asn Ala
65 70 75 80
Gly Leu Glu Phe Ser Arg Gly Lys Lys Val Ser Ser Ile Gly Thr Ile
85 90 95
Asn Gly Gly Ala Asp Trp Asp Tyr Ser Gly Ser Asn Ile Arg Ala Asn
100 105 110
Val Ala Tyr Asp Ile Phe Thr Ser Ala Asp Pro Asn His Val Thr Ser
115 120 125
Ser Gly Asp Tyr Glu Leu Met Ile Trp Leu Gly Lys Leu Gly Asp Ile
130 135 140
Tyr Pro Ile Gly Asn Ser Ile Gly Arg Val Lys Ala Ala Asn Arg Glu
145 150 155 160
Trp Asp Leu His Val Gly Tyr Asn Gly Ala Met Lys Val Phe Ser Phe
165 170 175
Val Ala Pro Ser Pro Val Thr Arg Phe Asp Gly Asn Ile Met Asp Phe
180 185 190
Phe Tyr Val Met Arg Asp Met Gln Gly Tyr Pro Met Asp Lys Gln Tyr
195 200 205
Leu Leu Ser Leu Gln Phe Gly Thr Glu Pro Phe Thr Gly Ser Asn Ala
210 215 220
Lys Phe Ser Cys Trp Tyr Phe Gly Ala Lys Ile Lys
225 230 235

<210> 18
<211> 237
<212> PRT
<213> Gliocladium roseum (4)

<400> 18
Met Lys Thr Gly Ile Ala Tyr Leu Ala Ala Val Leu Pro Leu Ala Met
1 5 10 15
Ala Glu Ser Leu Cys Asp Gln Tyr Ala Tyr Leu Ser Arg Asp Gly Tyr
20 25 30
Asn Phe Asn Asn Asn Glu Trp Gly Ala Ala Thr Gly Thr Gly Asp Gln
35 40 45
Cys Thr Tyr Val Asp Ser Thr Ser Ser Gly Gly Val Ser Trp His Ser
50 55 60
Asp Trp Thr Trp Ser Gly Ser Glu Ser Glu Ile Lys Ser Tyr Pro Tyr
65 70 75 80
Ser Gly Leu Asp Leu Pro Glu Lys Lys Ile Val Thr Ser Ile Gly Ser
85 90 95
Ile Ser Thr Gly Ala Glu Trp Ser Tyr Ser Gly Ser Asp Ile Arg Ala
100 105 110
Asp Val Ala Tyr Asp Thr Phe Thr Ala Ala Asp Pro Asn His Ala Thr
115 120 125
Ser Ser Gly Asp Tyr Glu Val Met Ile Trp Leu Ala Asn Leu Gly Gly
130 135 140
Leu Thr Pro Ile Gly Ser Pro Ile Gly Thr Val Lys Ala Ala Gly Arg
145 150 155 160
Asp Trp Glu Leu Trp Asp Gly Tyr Asn Gly Ala Met Arg Val Tyr Ser
165 170 175
Phe Val Ala Pro Ser Gln Leu Asn Ser Phe Asp Gly Glu Ile Met Asp
180 185 190
Phe Phe Tyr Val Val Lys Asp Met Arg Gly Phe Pro Ala Asp Ser Gln
195 200 205
His Leu Leu Thr Val Gln Phe Gly Thr Glu Pro Ile Ser Gly Ser Gly
210 215 220
Ala Lys Phe Ser Val Ser His Trp Ser Ala Lys Leu Gly
225 230 235

<210> 19
<211> 237
<212> PRT
<213> Memnoniella echinata

<400> 19
Met Lys Val Ala Ala Leu Leu Val Ala Leu Ser Pro Leu Ala Phe Ala
1 5 10 15
Gln Ser Leu Cys Asp Gln Tyr Ser Tyr Tyr Ser Ser Asn Gly Tyr Glu
20 25 30
Phe Asn Asn Asn Met Trp Gly Arg Asn Ser Gly Gln Gly Asn Gln Cys
35 40 45
Thr Tyr Val Asp Tyr Ser Ser Pro Asn Gly Val Gly Trp Arg Val Asn
50 55 60
Trp Asn Trp Ser Gly Gly Asp Asn Asn Val Lys Ser Tyr Pro Tyr Ser
65 70 75 80
Gly Arg Gln Leu Pro Thr Lys Arg Ile Val Ser Trp Ile Gly Ser Leu
85 90 95
Pro Thr Thr Val Ser Trp Asn Tyr Gln Gly Asn Asn Leu Arg Ala Asn
100 105 110
Val Ala Tyr Asp Leu Phe Thr Ala Ala Asn Pro Asn His Pro Asn Ser
115 120 125
Ser Gly Asp Tyr Glu Leu Met Ile Trp Leu Gly Arg Leu Gly Asn Val
130 135 140
Tyr Pro Ile Gly Asn Gln Val Ala Thr Val Asn Ile Ala Gly Gln Gln
145 150 155 160
Trp Asn Leu Tyr Tyr Gly Tyr Asn Gly Ala Met Gln Val Tyr Ser Phe
165 170 175
Val Ser Pro Asn Gln Leu Asn Tyr Phe Ser Gly Asn Val Lys Asp Phe
180 185 190
Phe Thr Tyr Leu Gln Tyr Asn Arg Ala Tyr Pro Ala Asp Ser Gln Tyr
195 200 205
Leu Ile Thr Tyr Gln Phe Gly Thr Glu Pro Phe Thr Gly Gln Asn Ala
210 215 220
Val Phe Thr Val Ser Asn Trp Ser Ala Gln Gln Asn Asn
225 230 235

<210> 20
<211> 246
<212> PRT
<213> Emericella desertoru

<400> 20
Met Lys Leu Leu Ala Leu Ser Leu Val Ser Leu Ala Ser Ala Ala Ser
1 5 10 15
Ala Ala Ser Ile Leu Ser Asn Thr Phe Thr Arg Arg Ser Asp Phe Cys
20 25 30
Gly Gln Trp Asp Thr Ala Thr Val Gly Asn Phe Ile Val Tyr Asn Asn
35 40 45
Leu Trp Gly Gln Asp Asn Ala Asp Ser Gly Ser Gln Thr Gly Val Asp
50 55 60
Ser Ala Asn Gly Asn Ser Ile Ser Trp His Thr Thr Trp Ser Trp Ser
65 70 75 80
Gly Gly Ser Ser Ser Val Lys Ser Tyr Ala Asn Ala Ala Tyr Gln Phe
85 90 95
Thr Ser Thr Lys Leu Asn Ser Leu Ser Ser Ile Pro Thr Ser Trp Lys
100 105 110
Trp Gln Tyr Ser Thr Thr Asp Ile Val Ala Asn Val Ala Tyr Asp Leu
115 120 125
Phe Thr Ser Ser Ser Ala Gly Gly Asp Ser Glu Tyr Glu Ile Met Ile
130 135 140
Trp Leu Ala Ala Leu Gly Gly Ala Gly Pro Ile Ser Ser Thr Gly Ser
145 150 155 160
Ser Ile Ala Thr Val Thr Leu Gly Gly Val Thr Trp Ser Leu Tyr Ser
165 170 175
Gly Pro Asn Gly Ser Met Gln Val Tyr Ser Phe Val Ala Ser Ser Thr
180 185 190
Thr Glu Ser Phe Ser Ala Asp Leu Met Asp Phe Ile Asn Tyr Leu Ala
195 200 205
Glu Asn Gln Gly Leu Ser Ser Ser Gln Tyr Leu Thr His Val Gln Ala
210 215 220
Gly Thr Glu Pro Phe Thr Gly Thr Asp Ala Thr Leu Thr Val Ser Ser
225 230 235 240
Tyr Ser Val Ser Val Ser
245

<210> 21
<211> 371
<212> PRT
<213> Actinomycete 11AG8

<400> 21
Met Arg Ser His Pro Arg Ser Ala Thr Met Thr Val Leu Val Val Leu
1 5 10 15
Ala Ser Leu Gly Ala Leu Leu Thr Ala Ala Ala Pro Ala Gln Ala Asn
20 25 30
Gln Gln Ile Cys Asp Arg Tyr Gly Thr Thr Thr Ile Gln Asp Arg Tyr
35 40 45
Val Val Gln Asn Asn Arg Trp Gly Thr Ser Ala Thr Gln Cys Ile Asn
50 55 60
Val Thr Gly Asn Gly Phe Glu Ile Thr Gln Ala Asp Gly Ser Val Pro
65 70 75 80
Thr Asn Gly Ala Pro Lys Ser Tyr Pro Ser Val Tyr Asp Gly Cys His
85 90 95
Tyr Gly Asn Cys Ala Pro Arg Thr Thr Leu Pro Met Arg Ile Ser Ser
100 105 110
Ile Gly Ser Ala Pro Ser Ser Val Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Asn Gly
115 120 125
Val Tyr Asn Ala Ala Tyr Asp Ile Trp Leu Asp Pro Thr Pro Arg Thr
130 135 140
Asn Gly Val Asn Arg Thr Glu Ile Met Ile Trp Phe Asn Arg Val Gly
145 150 155 160
Pro Val Gln Pro Ile Gly Ser Pro Val Gly Thr Ala His Val Gly Gly
165 170 175
Arg Ser Trp Glu Val Trp Thr Gly Ser Asn Gly Ser Asn Asp Val Ile
180 185 190
Ser Phe Leu Ala Pro Ser Ala Ile Ser Ser Trp Ser Phe Asp Val Lys
195 200 205
Asp Phe Val Asp Gln Ala Val Ser His Gly Leu Ala Thr Pro Asp Trp
210 215 220
Tyr Leu Thr Ser Ile Gln Ala Gly Phe Glu Pro Trp Glu Gly Gly Thr
225 230 235 240
Gly Leu Ala Val Asn Ser Phe Ser Ser Ala Val Asn Ala Gly Gly Gly
245 250 255
Asn Gly Gly Thr Pro Gly Thr Pro Ala Ala Cys Gln Val Ser Tyr Ser
260 265 270
Thr His Thr Trp Pro Gly Gly Phe Thr Val Asp Thr Thr Ile Thr Asn
275 280 285
Thr Gly Ser Thr Pro Val Asp Gly Trp Glu Leu Asp Phe Thr Leu Pro
290 295 300
Ala Gly His Thr Val Thr Ser Ala Trp Asn Ala Leu Ile Ser Pro Ala
305 310 315 320
Ser Gly Ala Val Thr Ala Arg Ser Thr Gly Ser Asn Gly Arg Ile Ala
325 330 335
Ala Asn Gly Gly Thr Gln Ser Phe Gly Phe Gln Gly Thr Ser Ser Gly
340 345 350
Thr Gly Phe Asn Ala Pro Ala Gly Gly Arg Leu Asn Gly Thr Ser Cys
355 360 365
Thr Val Arg
370

<210> 22
<211> 381
<212> PRT
<213> Streptomyces lividans CelB

<400> 22
Met Arg Thr Leu Arg Pro Gln Ala Arg Ala Pro Arg Gly Leu Leu Ala
1 5 10 15
Ala Leu Gly Ala Val Leu Ala Ala Phe Ala Leu Val Ser Ser Leu Val
20 25 30
Thr Ala Ala Ala Pro Ala Gln Ala Asp Thr Thr Ile Cys Glu Pro Phe
35 40 45
Gly Thr Thr Thr Ile Gln Gly Arg Tyr Val Val Gln Asn Asn Arg Trp
50 55 60
Gly Ser Thr Ala Pro Gln Cys Val Thr Ala Thr Asp Thr Gly Phe Arg
65 70 75 80
Val Thr Gln Ala Asp Gly Ser Ala Pro Thr Asn Gly Ala Pro Lys Ser
85 90 95
Tyr Pro Ser Val Phe Asn Gly Cys His Tyr Thr Asn Cys Ser Pro Gly
100 105 110
Thr Asp Leu Pro Val Arg Leu Asp Thr Val Ser Ala Ala Pro Ser Ser
115 120 125
Ile Ser Tyr Gly Phe Val Asp Gly Ala Val Tyr Asn Ala Ser Tyr Asp
130 135 140
Ile Trp Leu Asp Pro Thr Ala Arg Thr Asp Gly Val Asn Gln Thr Glu
145 150 155 160
Ile Met Ile Trp Phe Asn Arg Val Gly Pro Ile Gln Pro Ile Gly Ser
165 170 175
Pro Val Gly Thr Ala Ser Val Gly Gly Arg Thr Trp Glu Val Trp Ser
180 185 190
Gly Gly Asn Gly Ser Asn Asp Val Leu Ser Phe Val Ala Pro Ser Ala
195 200 205
Ile Ser Gly Trp Ser Phe Asp Val Met Asp Phe Val Arg Ala Thr Val
210 215 220
Ala Arg Gly Leu Ala Glu Asn Asp Trp Tyr Leu Thr Ser Val Gln Ala
225 230 235 240
Gly Phe Glu Pro Trp Gln Asn Gly Ala Gly Leu Ala Val Asn Ser Phe
245 250 255
Ser Ser Thr Val Glu Thr Gly Thr Pro Gly Gly Thr Asp Pro Gly Asp
260 265 270
Pro Gly Gly Pro Ser Ala Cys Ala Val Ser Tyr Gly Thr Asn Val Trp
275 280 285
Gln Asp Gly Phe Thr Ala Asp Val Thr Val Thr Asn Thr Gly Thr Ala
290 295 300
Pro Val Asp Gly Trp Gln Leu Ala Phe Thr Leu Pro Ser Gly Gln Arg
305 310 315 320
Ile Thr Asn Ala Trp Asn Ala Ser Leu Thr Pro Ser Ser Gly Ser Val
325 330 335
Thr Ala Thr Gly Ala Ser His Asn Ala Arg Ile Ala Pro Gly Gly Ser
340 345 350
Leu Ser Phe Gly Phe Gln Gly Thr Tyr Gly Gly Ala Phe Ala Glu Pro
355 360 365
Thr Gly Phe Arg Leu Asn Gly Thr Ala Cys Thr Thr Val
370 375 380

<210> 23
<211> 260
<212> PRT
<213> Rhodothermus marinus

<400> 23
Met Asn Val Met Arg Ala Val Leu Val Leu Ser Leu Leu Leu Leu Phe
1 5 10 15
Gly Cys Asp Trp Leu Phe Pro Asp Gly Asp Asn Gly Lys Glu Pro Glu
20 25 30
Pro Glu Pro Glu Pro Thr Val Glu Leu Cys Gly Arg Trp Asp Ala Arg
35 40 45
Asp Val Ala Gly Gly Arg Tyr Arg Val Ile Asn Asn Val Trp Gly Ala
50 55 60
Glu Thr Ala Gln Cys Ile Glu Val Gly Leu Glu Thr Gly Asn Phe Thr
65 70 75 80
Ile Thr Arg Ala Asp His Asp Asn Gly Asn Asn Val Ala Ala Tyr Pro
85 90 95
Ala Ile Tyr Phe Gly Cys His Trp Ala Pro Ala Arg Ala Ile Arg Asp
100 105 110
Cys Ala Ala Arg Ala Gly Ala Val Arg Arg Ala His Glu Leu Asp Val
115 120 125
Thr Pro Ile Thr Thr Gly Arg Trp Asn Ala Ala Tyr Asp Ile Trp Phe
130 135 140
Ser Pro Val Thr Asn Ser Gly Asn Gly Tyr Ser Gly Gly Ala Glu Leu
145 150 155 160
Met Ile Trp Leu Asn Trp Asn Gly Gly Val Met Pro Gly Gly Ser Arg
165 170 175
Val Ala Thr Val Glu Leu Ala Gly Ala Thr Trp Glu Val Trp Tyr Ala
180 185 190
Asp Trp Asp Trp Asn Tyr Ile Ala Tyr Arg Arg Thr Thr Pro Thr Thr
195 200 205
Ser Val Ser Glu Leu Asp Leu Lys Ala Phe Ile Asp Asp Ala Val Ala
210 215 220
Arg Gly Tyr Ile Arg Pro Glu Trp Tyr Leu His Ala Val Glu Thr Gly
225 230 235 240
Phe Glu Leu Trp Glu Gly Gly Ala Gly Leu Arg Thr Ala Asp Phe Ser
245 250 255
Val Thr Val Gln
260

<210> 24
<211> 264
<212> PRT
<213> Erwinia carotovara

<400> 24
Met Gln Thr Val Asn Thr Gln Pro His Arg Ile Phe Arg Val Leu Leu
1 5 10 15
Pro Ala Val Phe Ser Ser Leu Leu Leu Ser Ser Leu Thr Val Ser Ala
20 25 30
Ala Ser Ser Ser Asn Asp Ala Asp Lys Leu Tyr Phe Gly Asn Asn Lys
35 40 45
Tyr Tyr Leu Phe Asn Asn Val Trp Gly Lys Asp Glu Ile Lys Gly Trp
50 55 60
Gln Gln Thr Ile Phe Tyr Asn Ser Pro Ile Ser Met Gly Trp Asn Trp
65 70 75 80
His Trp Pro Ser Ser Thr His Ser Val Lys Ala Tyr Pro Ser Leu Val
85 90 95
Ser Gly Trp His Trp Thr Ala Gly Tyr Thr Glu Asn Ser Gly Leu Pro
100 105 110
Ile Gln Leu Ser Ser Asn Lys Ser Ile Thr Ser Asn Val Thr Tyr Ser
115 120 125
Ile Lys Ala Thr Gly Thr Tyr Asn Ala Ala Tyr Asp Ile Trp Phe His
130 135 140
Thr Thr Asp Lys Ala Asn Trp Asp Ser Ser Pro Thr Asp Glu Leu Met
145 150 155 160
Ile Trp Leu Asn Asp Thr Asn Ala Gly Pro Ala Gly Asp Tyr Ile Glu
165 170 175
Thr Val Phe Leu Gly Asp Ser Ser Trp Asn Val Phe Lys Gly Trp Ile
180 185 190
Asn Ala Asp Asn Gly Gly Gly Trp Asn Val Phe Ser Phe Val His Thr
195 200 205
Ser Gly Thr Asn Ser Ala Ser Leu Asn Ile Arg His Phe Thr Asp Tyr
210 215 220
Leu Val Gln Thr Lys Gln Trp Met Ser Asp Glu Lys Tyr Ile Ser Ser
225 230 235 240
Val Glu Phe Gly Thr Glu Ile Phe Gly Gly Asp Gly Gln Ile Asp Ile
245 250 255
Thr Glu Trp Arg Val Asp Val Lys
260

<210> 25
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> primer

<400> 25
gctgtgacca gtacgcaacc ttcac 25

<210> 26
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> primer

<400> 26
ggcaaccttc tctggcaacg gctacatcgt cagcaacaac c 41

<210> 27
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> primer

<400> 27
ggctgcgtga cgtcggtatc gctc 24

<210> 28
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> primer

<400> 28
ggtatcgctc aacggcgggg cctcc 25

<210> 29
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> primer

<400> 29
cgctcagcgg cgcggcctcc tggc 24

<210> 30
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> primer

<400> 30
cgtaccagaa cgttcagatt gccattcc 28

<210> 31
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> primer

<400> 31
ctctcagatt aacattcccc agaagagg 28

<210> 32
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> primer

<400> 32
cgtcaacagc atcggcagca tgccc 25

<210> 33
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> primer

<400> 33
gcgggagcga catccgcgct aatgttgc 28

<210> 34
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> primer

<400> 34
cgtcggtggc cagacctgga cgc 23

<210> 35
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> primer

<400> 35
cctttgtggc ccagagcaac actacc 26

<210> 36
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> primer

<400> 36
ccaacactac cagctacagc ggagatg 27

<210> 37
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> primer

<400> 37
ggatacaacg ctggaggcca atatg 25

<210> 38
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> primer

<400> 38
gtgaaggttg cgtactggtc acagc 25

<210> 39
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> primer

<400> 39
ggttgttgct gacgatgtag ccgttgccag agaaggttgc c 41

<210> 40
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> primer

<400> 40
gagcgatacc gacgtcacgc agcc 24

<210> 41
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> primer

<400> 41
ggaggccccg ccgttgagcg atacc 25

<210> 42
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> primer

<400> 42
gccaggaggc cgcgccgctg agcg 24

<210> 43
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> primer

<400> 43
ggaatggcaa tctgaacgtt ctggtacg 28

<210> 44
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> primer

<400> 44
cctcttctgg ggaatgttaa tctgagag 28

<210> 45
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> primer

<400> 45
gggcatgctg ccgatgctgt tgacg 25

<210> 46
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> primer

<400> 46
gcaacattag cgcggatgtc gctcccgc 28

<210> 47
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> primer

<400> 47
gcgtccaggt ctggccaccg acg 23

<210> 48
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> primer

<400> 48
ggtagtgttg ctctgggcca caaagg 26

<210> 49
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> primer

<400> 49
catctccgct gtagctggta gtgttgg 27

<210> 50
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> primer

<400> 50
catattggcc tccagcgttg tatcc 25
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉのＥＧＩＩＩのアミノ酸配列を示す。
【図２】 図２は、イントロンを除いたＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉのＥＧＩＩＩのＤＮＡ配列を示す。
【図３】 図３は、ＥＧＩＩＩ及びＥＧＩＩＩ様セルラーゼ中のアミノ酸の整列化を図解により示す。

Claims (13)

1. 配列番号：１のトリコデルマ リーセイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）のＥＧＩＩＩセルラーゼ中のＧ４１に対応する残基をアラニンにする置換を含む変種ＥＧＩＩＩセルラーゼであって、トリコデルマ リーセイのＥＧＩＩＩセルラーゼに由来し、そして、野生型のトリコデルマ リーセイのＥＧＩＩＩセルラーゼに比較して増加した熱安定性を有する、上記変種ＥＧＩＩＩセルラーゼ。
2. 請求項１記載の変種ＥＧＩＩＩセルラーゼをコードするＤＮＡ。
3. 請求項２記載のＤＮＡを含むベクター。
4. 請求項３記載のベクターにより形質転換された宿主細胞。
5. 工程：
   （ａ）セルラーゼを生成するのに適した条件下で適当な培地中で請求項４記載の宿主細胞を培養し；そして
   （ｂ）生成された変種ＥＧＩＩＩセルラーゼを得ること
   を含む、改善された安定性を有する変種ＥＧＩＩＩセルラーゼを生成する方法。
6. 界面活性剤及びセルラーゼを含む洗浄剤組成物であって、セルラーゼが請求項１記載の変種ＥＧＩＩＩセルラーゼである、上記洗浄剤組成物。
7. 洗浄剤組成物がランドリー用洗浄剤組成物である、請求項６記載の洗浄剤組成物。
8. 洗浄剤組成物が皿洗い用洗浄剤組成物である、請求項６記載の洗浄剤組成物。
9. セルロース含有織物の処理における、請求項１記載の変種ＥＧＩＩＩセルラーゼの使用。
10. 飼料添加物としての、請求項１記載の変種ＥＧＩＩＩセルラーゼの使用。
11. ウッドパルプ処理における、請求項１記載の変種ＥＧＩＩＩセルラーゼの使用。
12. バイオマスのグルコースへの転化における、請求項１記載の変種ＥＧＩＩＩセルラーゼの使用。
13. インディゴ染色されたデニムのストーンウオッシングにおける、請求項９記載の変種ＥＧＩＩＩセルラーゼの使用。

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