JP2004518406A - 新規変種egiii様セルラーゼ組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
政府後援の研究及び開発
適用外。
【0002】
発明の背景
セルラーゼは、セルロース中のでβ−D−グルコシド結合の加水分解が可能な酵素である。セルロース分解酵素は伝統的に3つの主要なクラスに分類されてきた:エンドグルカナーゼ、エキソグルカナーゼ又はセロビオヒドラーゼ及びβ−グルコシダーゼであり(Knowles,J.et al.,(1987),TIBTECH 5,255−261);多数の細菌、酵母及び真菌により製造されることが知られている。
【0003】
多くの工業上のプロセスにおけるその有用性のため、ひとつ又は複数の特定の応用に関して特に有効な性能特性を有する特定のセルラーゼ組成物(compositions)又は成分(components)を研究する分野において時代の風潮があった。セルラーゼの可能な源として、実務家は真菌及び細菌に焦点を合わせた。例えば、特定の真菌、例えばTrichoderma種(特に、Trichoderma reesei)により生産されるセルラーゼは大いに注目されたが、何故ならばセルロースの結晶形態を分解することができる完全なセルラーゼが発酵の手法により大量に容易に提供されるからである。この特定のセルロース複合体を広く分析することにより、その特定の成分の性質及びそれらの成分が工業上のプロセスにおいて機能する能力を測定した(Wood et al.,”Methods in Enzymology”,160,25,pages 234,及び次参照(1988))。米国特許番号5,475,101(Ward et al.)は、Trichoderma reesei由来のエンドグルカナーゼIII(EGIII)と呼ばれる一つの特に有用な酵素の精製及び分子クローニングを開示する。
【0004】
PCT公開番号WO94/14953は、各20ヌクレアーゼ有する一連のDNA配列の何れか一つを含む核酸によりコードされるエンドグルカナーゼを開示する。
【0005】
Ooi,et al.,Curr.Genet.18:217−222(1990)は、アミノ酸ストリングスNNLWG,ELMIW及びGTEPFTを含むAspergillus aculeatusにより生産されるエンドグルカナーゼEF1−CMCをコードするcDNA配列を開示する。Sakamoto,et al.,Curr.Genet.27:435−439(1995)は、アミノ酸ストリングスELMIW及びGTEPFTを含むAspergillus kawachii由来のエンドグルカナーゼCMCase−1をコードするcDNA配列を開示する。Ward,et al.,は、アミノ酸ストリングスNNLWG,ELMIW及びGTEPFTを有するEGIIIの配列を開示する。さらに、2つのセルラーゼ配列、一方がErwinia carotovaraそしてRhodothermus marinusが、Saarilahti,et al.,Gene 90:9−14(1990)及びHreggvidsson,et al.,Appl.Environ.Microb.62:3047−3049(1996)に開示されており、アミノ酸ストリングELMIWを含む。
【0006】
上記のエリアの幾つか又は全てにおいて応用性を有する多くのセルラーゼ組成物に関する業界の知見に拘わらず、セルラーゼが有用な応用において存在する条件下で改良された安定性を有する新規のセルラーゼ組成物、例えば家庭の界面活性剤及びランドリーの界面活性剤及び織物処理用の組成物に関する継続する要求が存在する。
【0007】
発明の概要
本発明によれば、変種(variant)のEGIII又はEGIII様セルラーゼが提供され、一つ又は複数のアミノ酸が修飾されるか又は欠失していることにより、改善された性能を授与するが、酸化系においての安定性を含む。
【0008】
一つの態様において、EGIII様セルラーゼが提供されるが、当該変種は、Trichoderma reesei由来のEGIII中の残基M79,M154及び/又はM118の一つ又は複数に対応する位置において置換又は欠失を含む。好ましい態様において、上記変種は、79、118及び/又は154位におけるメチオニンの、ロイシン、イソロイシン、バリン、スレオニン、セリン又はアラニンによる置換を含む。
【0009】
この発明の別の態様において、EGIII様セルラーゼは、真菌、細菌又は放線菌に由来する。好ましい側面において、セルラーゼは真菌に由来する。より好ましい側面において、真菌は繊維状真菌である。もっとも好ましい態様において、繊維状真菌は、Euascomyceteに属し、限定ではないが、Aspergillus種、Gliocladium種、Fusarium種、Acremonium種、Myceliophtore種、Verticillium種、Myrothecium種又はPenicillium種を含む。この態様の別の側面において、セルラーゼはエンドグルカナーゼである。
【0010】
この発明の別の側面において、この発明のEGIII様セルラーゼをコードするDNAである。別の態様において、DNAはベクター中にある。さらに別の態様において、上記ベクターにより宿主細胞を形質転換する。
【0011】
別の態様において、この発明のセルラーゼを生産する方法が提供される。上記方法は、セルラーゼを生産するために適した条件下で適当な培養培地中で請求項12記載の宿主細胞を培養し、そして任意に上記セルラーゼを精製して、精製されたセルラーゼ生成物を提供する工程を含む。
【0012】
この発明の別の態様において、Trichoderma reesei由来のEGIII中の残基M79及び/又はM118の一つ又は複数に対応する位置において置換又は欠失を含む変種EGIII又はEGIIIセルラーゼを含む洗浄剤が提供される。好ましい態様において、上記変種は、79、118及び/又は154位におけるメチオニンの、ロイシン、イソロイシン、バリン、スレオニン、セリン又はアラニンによる置換を含む。
【0013】
この態様の別の側面において、洗浄剤はランドリー用洗浄剤である。さらに別の側面において、上記洗浄剤は皿用洗浄剤である。
別の態様において、この発明の変種EGIII又はEGIII様セルラーゼは、セルラーゼ含有織物の処理において使用される。
【0014】
発明の詳細な説明
出願人は、T.reesei由来のEGIIIの酸化が当該酵素中の特定の位置、+70,+118及び+154において起こることを発見した。天然のセルラーゼにおいて、これらの部位はメチオニンが占める。天然のメチオニンを別のアミノ酸に置換することにより、出願人は、酸化により安定な酵素を製造した。T.reeseiのEGIIIに対するセルラーゼ相同体は公知であって、EGIIIの中に見いだされるメチオニンに均等な残基が配列比較により決定され得るから;本発明は、さらに、酸化条件下でEGIII様セルラーゼの性能を変化させるアミノ酸修飾をもつEGIII様セルラーゼを包含する。
定義
他に定義しない限り、本明細書にて使用される全ての技術用語及び科学用語は、発明が属する分野の当業者に共通に理解されるのと同じ意味を有する。全ての文献は全ての目的のために引用により編入される。本明細書にて記載されたのと類似又は均等なあらゆる方法及び材料を本発明の実施又は試験において用いることができるが、好ましい方法及び材料が記載される。本発明のために、以下の用語を以下に定義する。
【0015】
「セルラーゼ」は、当業界においてよく分類されているカテゴリーの酵素であり、セルロースポリマーを短いロ−オリゴサッカライドオリゴマー、セロビオース及び/又はグルコースに加水分解できる酵素を含む。セロビオース酵素の共通の例は、セロビオヒドロラーゼ類及びエンドグルカナーゼ類であり、そしてセルロース分解性生物の多くの種から得ることができ、特に真菌及び細菌を含む。
【0016】
「EGIII」セルラーゼは、米国特許第5,475,101号及びProceedings on the Second TRICEL Symposium on Trichoderma Reesei Cellulases And Other Hydrolases,Suominen & Reinikainen eds.,Espoo Finland(1993),pp.153−158(Foundation for Biotechnological and Industrial Fermentation Research,Vol.8)に記載されたエンドグルカナーゼ成分を意味する。本明細書において議論されるとおり、EGIIIはTrichoderma reesei(longibrachiatum)に由来し、そして約5.8の至適pH、約7.4の等電点(pI)及び約25kDの分子量により特徴付けられる。Trichoderma reesei由来のEGIIと一般に呼ばれる酵素は、文献において数人の著者らにより名称EGIIIと呼ばれたが、その酵素は分子量、pI及び至適pHに関して本明細書中のEGIIIと定義した酵素とは実質的に異なる。
【0017】
本発明による「EGIII様酵素」、「EGIII様蛋白質」又は「EGIII様セルラーゼ」は、EGIIIと共通の特定のアミノ酸ストリングスを有することによりEGIIIに関連する酵素を意味する。本明細書にて使用されるとおり、EGIII様セルラーゼはTrichoderma reesei由来のEGIIIを包含することも意図する。即ち、EGIII様セルラーゼは、
【0018】
【化1】
【0019】
の一つ又は複数からなる群から選択されるアミノ酸ストリングスを中に含むアミノ酸配列を含む、セルロース溶解活性を有する酵素を含む。
EGIII様セルラーゼの非限定代表は、図3に見いだすことができる。
【0020】
「変種」は、C−末端及びN−末端のいずれか又は両方への一つ又は複数のアミノ酸の追加、アミノ酸配列中の一つ又は複数の異なる部位における一つ又は複数のアミノ酸の置換、蛋白質の一方又は両方の末端か又はアミノ酸配列中の一つ又は複数の部位における一つ又は複数のアミノ酸の欠失、又はアミノ酸配列中の一つ又は複数の部位における一つ又は複数のアミノ酸の挿入により、前駆体蛋白質(例えば、EGIII様セルラーゼ)から誘導される蛋白質を意味する。酵素の変種の調製は、好ましくは、天然蛋白質をコードするDNA配列を修飾し、そのDNA配列による適当な宿主の形質転換、及び修飾されたDNA配列の発現による変種酵素の形成により達成する。発明の変種EGIII様セルラーゼは、前駆体酵素のアミノ酸配列との比較の上で変更されたアミノ酸配列を含むペプチドを含み、但し上記変種EGIII様セルラーゼは前駆体酵素の特徴的な酵素の性質は保持するが、いくつかの特定の側面において変更された特性を有してよい。例えば,上記変種EGIII様セルラーゼは、酸化条件下で増加した安定性を有してよいが、その特徴的なセルロース溶解活性は保持する。しかしながら、変種の活性は前駆体酵素に比較して増加しているか又は低下していてよい。本発明による変種は、発現されたセルラーゼ変種の機能活性が保持されたEGIII様セルラーゼ誘導体をコードするDNA断片に由来してよいことが意図される。例えば、セルラーゼをコードするDNA断片は、コードされたセルラーゼの機能活性が保持されるように、5’又は3’の何れかにおいてセルラーゼDNA配列に連結したヒンジ又はリンカーをコードするDNA配列又はその一部をさらに含んでよい。
【0021】
EGIII内に存在する残基に「相当する」か又は「均等な」EGIII様セルラーゼ中の残基は、一次配列相同性、三次構造相同性(例えば、結晶構造又はコンピューターモデリングにより示される)又は機能均等性により示されるとおり、EGIII中のそれの均等な位置に存在する残基を意味する。変種EGIII様セルラーゼは、前駆体EGIII様セルラーゼのアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有する。前駆体セルラーゼは天然のセルラーゼ及び組換えセルラーゼを含む(本明細書において定義される)。EGIII様セルラーゼのアミノ酸配列は、前駆体アミノ酸配列の一つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失又は挿入により前駆体EGIII様セルラーゼアミノ酸配列に由来する。そのような修飾は、前駆体セルラーゼ酵素自体の操作よりむしろ前駆体セルラーゼのアミノ酸配列をコードする前駆体DNA配列の修飾である。前駆体DNA配列のそのような操作のための適切な方法は、本明細書そして権利者が同じ米国特許第4,760,025号及び第5,185,258号に開示された方法を含む。界面活性剤の存在下で不安定性に必須の位置に相当する特定の残基が置換又は欠失に関して本明細書に同定される。アミノ酸の数(例えば、+35)は、図1に示す成熟Trichoderma reeseiのEGIII配列に付された番号を意味する。発明は、Trichoderma reeseiのEGIII中で特に同定された残基に均等な位置のアミノ酸残基を含むEGIII様セルラーゼの変異に向けられる。前駆体セルラーゼの残基(アミノ酸)は、それがTrichoderma reeseiのEGIII中の特定の残基又は残基の位置に相同であるか(即ち、一次又は三次構造の何れかの位置に相当する)又は機能上類似である(即ち、同じか又は類似の、化学上又は構造上、結合、反応又は相互作用する能力を有する)なら、Trichoderma reeseiのEGIIIの残基に均等である。本明細書にて使用されるとおり、他に示さない限り、ナンバリングは図1に示した成熟EGIIIアミノ酸配列のそれに対応することを意図する。
【0022】
「洗浄剤組成物」は、汚れたセルロース含有織物の洗濯のための洗浄媒質中の使用のために意図される混合物を意味する。本発明のコンテクストにおいて、そのような組成物は、セルラーゼ及び界面活性剤に加えて、追加の加水分解酵素、研摩剤、漂白剤、漂白活性化剤、青み剤及び蛍光染料、ケーキング阻害剤、マスキング剤、セルラーゼ活性化剤、酸化防止剤、及び可溶化剤を含んでよい。そのような組成物は、汚れた衣服を洗濯するために一般的に使用されて、ストーンウオッシング組成物とは対照的に製造工程において使用されない。セルラーゼを含む界面活性剤組成物は、例えば米国特許第5,290,474号及びEP公開番号271 004に記載されており、引用により本明細書に編入される。
【0023】
「発現ベクター」は、適切な宿主において上記DNAの発現を作用させ得る適切な制御配列に作動可能なように連結させたDNA配列を含むDNA構築物を意味する。そのような制御配列は、転写を作用させるためのプロモーター、転写を制御するための追加のオペレーター配列、mRNA上の適切なリボソーム結合部位をコードする配列、及び転写及び翻訳の停止を制御する配列を含んでよい。別の細胞種が別の発現ベクターと共に使用されるのが好ましい。Bacillus subtilisにおいて使用されるベクターのための好ましいプロモーターはAprEプロモーターであり;E.coliにおいて使用される好ましいプロモーターはLacプロモーターであり、Saccharomyces cerevisiaeにおいて使用される好ましいプロモーターはPGK1であり、Aspergillus nigerにおいて使用される好ましいプロモーターはglaAであり、そしてTrichoderma reeseiのための好ましいプロモーターはcbhIである。ベクターはプラスミド、ファージ又は単純に有力なゲノミック挿入物であってよい。適切な宿主細胞を形質転換したら、ベクターを宿主のゲノムと独立に複製させて機能させてよく、あるいは適切な条件下でゲノム自体に組み込んでよい。本明細書においては、プラスミド及びベクターを時々交換可能に使用する。しかしながら、発明は、均等な機能を担う発現ベクターの他の形態を含むことを意図し、そして当業界にて公知であるか又は公知になる。即ち、様々な宿主/発現ベクターの組み合わせをこの発明のDNA配列を発現させるために用いてよい。有用な発現ベクターは、例えば、染色体のセグメント、非染色体及び合成DNA配列、例えばSV40の様々な公知の誘導体及び公知の細菌プラスミド、例えばcol E1,pCR1,pBR322,pMb9,pUC19及びそれらの誘導体を含むE.coli由来のプラスミド、ホストレンジの広いプラスミド、例えばRP4,ファージDNA、例えばファージλの多数の誘導体、例えばNM989及び他のDNAファージ、例えばM13繊維状一本鎖DNAファージ、酵母プラスミド例えば2μプラスミド又はそれらの誘導体、真核生物において有用なベクター、例えば動物細胞において有用なベクター及びプラスミドDNAとファージのDNAの組み合わせに由来するベクター、例えばファージDNA又は他の発現制御配列を用いるように修飾されたプラスミドからなってよい。本発明の発現ベクターを用いる発現技術は当業界公知であり、そして一般的には、例えば、Sambrookに記載される。しばしば、発明のDNA配列を含むそのような発現ベクターは、組み込み事象を通して特定の種のゲノムに直接挿入することにより単細胞生物を形質転換する(例えば、Bennett & Lasure,MORE GENE MANIPULATION IN FUNGI,Academic Press,San Diego,pp.70−76(1991)及び真菌宿主における標的化ゲノミック挿入を記載するその中で引用された文献を参照、引用により本明細書に編入される)。
【0024】
「宿主株」又は「宿主細胞」は、本発明によるDNAを含む発現ベクターに適した宿主を意味する。本発明において有用な宿主細胞は一般的に原核生物宿主及び真核生物宿主であり、発現を達成できるあらゆる形質転換可能な微生物を含む。好ましい宿主株は、限定ではないが、Bacillus subtilis、Escherichia coli,Trichoderma reesei(r)、Saccharomyces cerevisiae又はAspergillus nigerを含む。宿主細胞、組換えDNA技術を用いて構築ベクターにより形質転換されるか又はトランスフェクトされる。そのような形質転換された宿主細胞は、変種EGIII様セルラーゼをコードするベクターを複製することができるか又は所望のペプチド生成物を発現できる。本発明による好ましい態様において、「宿主細胞」はTrichoderma種の細胞及びTrichoderma種から創製されたプロトプラストの両方を意味する。
【0025】
「シグナル配列」は、細胞外への蛋白質の成熟形態の分泌を促進する蛋白質のN−末端部分に結合したアミノ酸の配列を意味する。シグナル配列のこの定義は機能性配列である。成熟形態の細胞外蛋白質は分泌プロセスの間に分断されるシグナル配列を欠く。
【0026】
「DNAベクター」は、上で記載されたEGIII様セルラーゼ又は変種をコードする一つ又は複数のDNA断片又はDNA変種断片を含むヌクレオチド配列を意味し、変種EGIII様セルラーゼの発現を誘導するために適切な宿主細胞を形質転換することに際して使用され得る。
【0027】
「機能的に結合させた」は、制御領域、例えばプロモーター、ターミネーター、分泌シグナル又は増強領域が構造遺伝子に連結されてその遺伝子の発現を制御することを意味する。
T.reeseiのEGIII
成熟EGIIIのアミノ酸配列は公知であり、図1に示す(SEQ ID NO:1)。認識し得るとおり、成熟EGIIIは3つのメチオニンを含む。即ち、EGIIIの酸化安定性を修飾するためには、これら3つの位置のメチオニンを他のアミノ酸で置換する。好ましくは、当該置換は、EGIII自体の操作よりもEGIIIをコードするDNA配列を変更することによりなされる。EGIIIのDNA配列のそのような操作の適切な方法は、本明細書及び引用により編入される、共通の譲受人の米国特許第4,760,025号、第5,185,258号に開示された方法を含む。
【0028】
好ましい態様において、EGIII変種ライブラリーを創製する。ライブラリー内に含まれるのは、EGIII変種をコードするDNA分子である。EGIII変種は79、118又は154位のいずれか又は全てにおいてアミノ酸の置換又は欠失を有する。より好ましい態様において、EGIII変種はEGIII変種に増加した酵素活性を提供する位置においても置換を有する。この態様の一つの側面において、ライブラリーはランダム化され、例えば、当該DNA分子は決定的な位置において12の天然に生じるアミノ酸の一つをコードするコドンを含む。好ましい側面においては、しかしながら、当該DNA分子は各々の決定的な位置において均等なアミノ酸をコードするコドンを含む。均等なアミノ酸はEGIII様セルラーゼを整列化することにより決定する。整列化は構造又は機能に基づき得る。例えば、図3において、メチオニンはT.reeseiのEGIIIの139位に存在することが認識され得る(これは図1に示すとおり成熟EGIIIの79位に相当する)。図3にリストされるEGIII様セルラーゼの11において、イソロイシンは139位にある。即ち、イソロイシンは成熟EGIIIの79位のメチオニンに対しての均等なアミノ酸である。
【0029】
実施例3において認識され得るとおり、メチオニン残基の変更はEGIIIを不活性化させる。即ち、活性を回復させるためには、アミノ酸残基の置換、欠失又は付加によりEGIII変種をさらに操作することを必要とするかもしれない。この態様の一つの側面において、DNAシャッフリング技術または管理された進化の技術を使用することができる。DNAシャッフリング又は管理された進化の考察に関しては、その全体を引用により編入する、米国特許第5,830,721号を参照されたい。簡単に云えば、DNAライブラリーをEGIII又はEGIII変種の鋳型から創製する。EGIII配列を使用するなら、所望のメチオニン置換をシャッフリングの前にしなければならない。DNAコーディング配列へのコドンの変異の導入は、当業界においてよく知られており、例えば、Ausubelに見いだすことができる。所望の置換を有するEGIII変種を用いるなら、この停止は不要である。所望のメチオニン置換を有するEGIII変種が利用可能ならば、変異体のライブラリーを作成することができる。ライブラリーを創製するためには、EGIII変種及びシャッフルされる他の配列を断片化する。核酸配列の断片化は当業界においてよく知られており、例示の技術は米国特許第5,830,721号に見いだすことができる。他の配列は、限定ではないが、EGIII様セルラーゼを含んでよく、図3にリストしたものを含む。好ましくは、断片化された配列は二本鎖である。第1工程において二本鎖断片を変性する。これは、条件としては変性に適当な温度に核酸の混合物を加熱することにより達成され得る。好ましくは、温度は80℃と100℃の間である。
【0030】
核酸を一本鎖に変生した後に、鎖を再アニールさせる。アニーリングの忠実度は多くの因子に依存するが、特に温度に依存する。当業者は、相対的に低い温度、例えば20℃から30℃が低度の相同性の配列の再アニーリングを促進することになると認識する。即ち、様々な配列を望むならば、クロスオーバー事象を助長して低温において再アニールさせることが最良なはずである。しかしながら、ほとんどの応用に関しては、45℃から65℃の再アニーリング温度で十分である。
【0031】
再アニーリング工程の後又は再アニーリングと同時に、ポリメラーゼを加えて、完全なコーディング領域に断片を集合させる。相同の程度が低くて低温を使用するなら、クレノー断片を用いることができる。しかしながら、相同の程度が高くて再アニーリングに高温を用いるならば、Taqポリメラーゼを用いることによりコーディング領域を集合させてよい。
【0032】
集合の後に、上記核酸断片は、コンカテマー核酸断片を含む長いDNA分子上に存在することになる。この大きな核酸は、オリジナルのEGIII変種鋳型と同じサイズのDNAの複数コピーを含んでよい。EGIII変種及びEGIII様セルラーゼ変種の単一コピー(EGIII様セルラーゼコーディング領域が核酸断片混合物中で表されるなら)は、制限酵素消化又は当業者に知られている他の方法により大きなDNA分子から放出される。これらの単一コピーは、次に、伸長合成、クローン化及び分析のためにベクターに挿入される。当業者は、PCR増幅を利用することにより、制限消化前の大きなDNA分子、制限消化後の単一コピー又は特別上等の(of choice)ベクターに挿入した後の単一コピーのいずれかのコピー数を増加させてよいことを実感する。
【0033】
好ましい態様においては、どのアミノ酸の置換、欠失及び/又は付加が酵素活性を回復するのに必要な活性部位を復帰させるかを決定するために、EGIIIの三次構造を試験してモデル化する。これは、その三次構造がx線結晶解析により決定される、EGIIIを含むセルラーゼに関する三次構造のレベルにおいて相同性を決定することにより実施してよい。均等な残基はT.reeseiからのEGIII及びセルラーゼの特定のアミノ酸残基の主鎖の2つ又は複数の原子の原子配位結合(N上のN、CA上のCA、C上のC、O上のO)が整列化後に0.13nm及び好ましくは0.1nmの範囲であるものとして定義される。整列化は、最良のモデルが並べられて配置されることにより、T.reeseiのEGIIIに対して問題のEGIII相同物の非水素蛋白質原子の原子配位結合の最大のオーバーラップを提供した後に達成される。最良のモデルはもっとも高い解析において実験上異なるデータに関するもっとも低いR因子を利用可能にさせる結晶解析モデルである。
【0034】
【数1】
【0035】
構造上均等な残基に加えて、機能上均等な残基を置換してよい。T.reeseiのEGIIIの特定の残基に機能上類似する均等な残基は、それらがT.reeseiのEGIIIの特定の残基に対して定義され且つ原因とされるような様式にて蛋白質の構造、基質結合又は触媒性を変更するか又は修飾するか、又は一因となるコンフォメーションを採用してよい、セルラーゼのアミノ酸として定義される。さらに、それらは、与えられた残基の主鎖原子が相同の位置を占めることに基づいて均等の基準を満たさないかもしれないが、残基の側鎖原子の少なくとも2つの原子配位結合がT.reeseiのEGIIIの対応する側鎖原子の0.13nmに位置する範囲に類似の位置を占めるセルラーゼの残基(x線結晶解析により得られた三次構造に関して)である。T.reeseiのEGIIIの結晶構造は、The Protein Society,Fourteenth Symposium.San Diego,CA.2000年8月5−9日に存在し、その開示は全体を引用により編入する。ファミリー12のグリコシルヒドロラーゼの相同メンバーである、Streptomyces lividansのCell Bの配位結合は、Sulzenbacher,et al.,Biochemistry 36:6032(1997)及びSulzenbacher,et al.,Biochemistry 38:4826(1999)に提供される。
EGIII様セルラーゼ
この発明の別の態様において、EGIII(EGIII様セルラーゼ)に類似のセルラーゼは、酸化安定性を改善するために修飾される前駆体蛋白質である。例えば、図3の計算式から、リストされた21のEGIII様セルラーゼ全てが181位においてメチオニンを有することが認識され得る(成熟EGIIIの118位)。EGIIIにおけるように、この位置におけるアミノ酸の置換はEGIII様セルラーゼの酸化安定性を修飾する見込みがある。また、EGIIIにおけるように、EGIII様セルラーゼ変種の活性は他の決定的な残基の操作及び置換を通して回復されるか又は改善されてよい。
【0036】
図3に示されたセルラーゼに加えて、この発明はEGIIIに対して有意な構造上及び/又は配列上の相同性を有する他の酵素を包含する。即ち、発明のこの態様の一つの側面において、上記酵素は、EGIIIに対して少なくとも30%、好ましくは少なくとも40%そしてもっとも好ましくは少なくとも60%のアミノ酸同一性を有する。しかしながら、相同性のみでは、本明細書にて記載された上記方法により同定された特定の酵素がEGIII様セルラーゼを示すか否かについて、しばしば適当な基準でないことを認識するべきである。したがって、相同な酵素は、事実、本明細書にて記載及び例示された方法により検出できるが、相同の程度は発明の範囲を限定するものとして認識されるべきではない。
【0037】
相同性蛋白質は、「配列比較計算式」を用いて決定することもできる。比較のための配列の最適な整列化は、例えば、Smith & Waterman,Adv.Appl.Math.2:482(1981)の局所相同性計算式によるか、Needleman & Wunsch,J.Mol.Biol.48:443)1970)の相同性整列化計算式によるか、Pearson & Lipman,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 85:2444(1988)の類似性検索法によるか、これらの計算式のコンピューター化の実行によるか(ウイスコンシンジェネティックスソフトパッケージ、ジェネティックスコンピューターグループ、575サイエンス Dr.,Madison,WIのGAP,BESTFIT,FASTA及びTFASTA)、又は可視点検により行うことができる。
【0038】
配列類似性を決定するために適した計算式の例はBLAST計算式であり、Altschul,et al.,J.Mol.Biol.215:403−410(1990)に記載される。BLAST計算式のを実行するためのソフトウエアは、バイオテクノロジー情報国立センター(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)を通して公的に利用可能である。この計算式は、データベース配列中の同じ長さの言葉と整列化したときに、いくつかの陽性評価された閾値スコアに適合するか又は満足する質問配列中の長さWの短い言葉を同定することにより、高いスコアの配列対(HSPs)を最初に同定することを含む。これらの初期の隣接する言葉のヒットはそれらを含む長いHSPsを発見するための開始ポイントとして作用する。言葉のヒットは、蓄積する整列化のスコアが増加し得る限り、2つの配列の各々が比較される両方向に沿って伸長する。言葉のヒットの伸長は、蓄積する整列化スコアが達成された最大値からの量Xにより低下する場合;蓄積スコアがゼロ又はそれ以下になる場合;又は何れかの配列の末端が延びる(reached)場合に停止する。BLAST計算式のパラメーターW,T及びXは整列化の感度と速度を決定する。BLASTプログラムは欠点としてワード長(W)11、BLOSUM&2スコアリングマトリックス(Henikoff & Henikoff,ProcNatl.Acad.Sci.USA 89:10915(1989)を参照)整列化(B)50、気体(E)10、M’5,N’−4、及び両鎖の比較を用いる。
【0039】
BLAST計算式は次に、2つの配列間の類似性の統計分析を実施する(例えば、Karlin & Altschul,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 90:5873−5787(1993)を参照)。BLAST計算式により提供される類似性の一つの測定は最少合計確率(P(N))であり2つのヌクレオチド又は間の配列の間の適合が偶然起こる確率の指標を提供する。例えば、プロテアーゼアミノ酸配列に対する試験アミノ酸配列の比較における最少合計確率が約0.1未満、より好ましくは約0.01未満、そしてもっとも好ましくは約0.001未満ならば、アミノ酸配列はプロテアーゼに類似であると考えられる。
EGIII様セルラーゼをコードするDNAの単離
発明のEGIII様セルラーゼはセルラーゼを生産する多くの生物において見いだされるかもしれないことが予測される。しかしながら、おそらく、EGIII様セルラーゼの源は、細菌又は真菌、そしてより特定すれば放線菌、Bacillus又は繊維状真菌由来のものを含む。好ましい態様において、上記セルラーゼは、繊維状真菌ファミリー後生動物、好ましくはEuascomycetesに由来する。後生動物の中で、EGIII様セルラーゼを生成する真菌の系統発生上の分類は、栄養胞子Pyrenomycetes(Acremoniumを含む)、Sordariales(Thielaviaを含む)、Hypocreales(Nectriaceae、例えばFusarium、Necitia,Verticillium,Myrothecium及びGliocladium;及びHypocreaを含む)及びEurotiales(栄養胞子Trichocomaceae、例えばAspergillus及びPenicilliumを含む)に由来する。
【0040】
Euascomyceteは、好ましくは、Diaporthales,Halosphaeriales,Microascales,Ophiostomatales,Phyllachorales,Sordariales又はXylarialesに属する。また、好ましくは、Euascomycetesは、Clavicipitaceae,Melanosporaceae,Nectriaceae,Niessliaceae又はMitosportic Hypocrealesを含むHypocrealesに属する。さらに好ましくは、Euascomyceteは、Trichodermaを含まないHypocreaceaeに属する。もっとも好ましくは、Euascomyceteは、Gliocladium種、Fusarium種、Acremonium種、Myceliophtora種、Verticillium種、Myrothecium種、Penicillium種、Chaetomium種、Emercella種及びPhanerochaete種である。Emericella様セルラーゼを所有するものとして予期される特定の生物は、Chaetomium Thermophilum var.therm.,Chaetomium atrobrunneum,Chaetomium brasiliense,Chaetomium globosum,Chaetomium vitellium,Paecilomyces lilacinus,Chaetomium thermophilum var.dissitum,Humicola insolens,Humicola brevis,Memnoniella echinata,Fusarium equiseti,Fusarium oxysporum,Fusarium stilboides,Myceliophthora,Fusarium javanicum,Humicola grisea,var.thermoidea,Stibella thermophila,Melanocarpus albomyces,Arthrobotrys superba,Myceliophthora hinunilea,Chaetomium pachypodiodes,Myrothecium verrucaria,Penicillium crysogenum,Malbranchea sulfurea,Lunulospora curvula,Emericella desertorum,Acremonium strictum,Cylindrocarpon heteronema,及びUlocladium chartarumを含む。放線菌の中で、StreptomycesはEGIII様セルラーゼを所有しているらしい。
【0041】
本発明によるEGIII様セルラーゼは以下の方法に従い得てよい。縮重DNAプライマーを、
【0042】
【化2】
【0043】
の一つ又は複数からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするように構築し、そして確立された方法によりセルロース溶解活性を有する酵素をコードするDNA及び遺伝子をクローン化するのに使用される。縮重プライマーを用いてDNAを得る技術は当業者の範囲内であり、Sambrook,et al.においてか又はCURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY−A LABORATORY MANUAL(第2版)1−3巻、Cold Spring Harbor Publishing(1989)(「Sambrook」);及びCURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,Ausubel,et al.,(編纂),Current Protocols,a joint venture between Greene Publishing and Associates,Inc.and John Wiley & Sons,Inc.,(1997補遺)(「Ausubel」)に見いだすことができる。さらに、発明のEGIIIは、分子生物学の慣用の方法、例えば、標識プローブを用いたライブラリースクリーニング、発現スクリーニング及びPenicilliumクローン化により、本明細書においてEGIII様セルラーゼとして同定されたセルラーゼバックボーンの一つを用いて、得てよい。
【0044】
縮重プライマーは、与えられた断片が標的生物中で類似の配列に相関するか否かを分析するために、標的生物から得られたゲノミックライブラリーに対してハイブリダイゼーションプローブとして使用することができる。有用なハイブリダイゼーションアッセイは以下のとおりである:特定の標的源からのゲノミックDNAを制限酵素:例えばEcoRI,HindIII,BamHI,ClaI,KpnI,MluI,SpeI,BglII,NcoI,XbaI,XhoI及びXmaI(New England Biolabs,Inv.,Beverly,MA and Boeringer Mannheimにより供給された)による、製造者の支持書に従った消化により断片化する。次に、サンプルをアガロースゲルを通して電気泳動して(例えば、0.7%アガロースのような)、DNA断片の分離がサイズにより可視化できる。ゲルを簡単に蒸留水中で洗い、そして次に適切な溶液(例えば、0.25M HClのような)中でゆるやかな撹拌により脱プリン化し、そして30分間変性させる(例えば0.4M NaOH中で)。再生の工程は、ゲルを1.5M NaCl,1M Tris,pH7.0の中においてゆるやかに30分間撹拌する。次に、DNAを適切な陽性電荷膜、例えばMaximum Strength Nytran Plus膜(Schleicher & Schuell,Keene,N.H.)に、転写溶液(例えば、6XSSC(900mM NaCl,90mM)クエン酸3ナトリウムのような)を用いて転写する。転写後に、ゆるやかに2時間またはそれ以上、膜を洗浄して(例えば、2XSSC[2XSSC=300mM NaCl,30mMクエン酸3ナトリウム]中で)、室温において空気乾燥する。次に、膜を再度ハイブリダイズさせる(約2時間またはそれ以上)が、適切な再ハイブリダイゼーション溶液(例えば、100mLあたり:30−50mLホルムアミド、25mLの20X SSPE(1XSSPE=0.18M NaCl,1mM EDTA,10mM NaH2PO4,pH7.7),2.5mLの20%SDS、及び1mLの10mg/ml専断ニシン精子DNAを含む水溶液のような)中においてである。
【0045】
上記プライマー配列に相当するDNAプローブをアガロースゲル中で単離して、断片をゲルから切り出して、そして切り出したゲルから回収する。この精製されたDNA断片を次に標識する(例えば、製造者の支持書に従いMegaprine標識システムを用いることによりP32をDNAに取り込む(Amersham International PLC,Buckinghamshire,英国))。標識されたプローブを95℃において5分間変性させ、そしてすぐに上記膜を含む再ハイブリダイゼーション溶液に加える。ハイブリダイゼーション反応は適切な時間の間、適切な条件下で進行するべきであり、例えば、18時間37℃にてゆるやかに撹拌する。上記膜を洗浄し(例えば、2X SSC/0.3%SDS中)、次に適切な洗浄溶液を用いて洗浄して、ゆるやかに撹拌する。所望のストリンジェンシーが、膜(フィルター)を洗浄する条件の反映になる。
【0046】
特定すれば、与えられた反応のストリンジェンシー(即ち、ハイブリダイゼーションの成功に必要な相同性の程度)は、サザンブロットからのフィルターがハイブリダイゼーション後に供される洗浄条件に大きく依存する。本明細書にて定義される「低ストリンジェンシー」条件は、0.2X SSC/0.1% SDSの溶液を用いた20℃における15分間のサザンブロットからのフィルターを洗浄することを含む。標準のストリンジェンシー条件は、0.2X SSC/0.1% SDSの溶液を用いた37℃における30分間の2回目のサザンブロットからのフィルターの洗浄を含む洗浄工程をさらに含む。
【0047】
発明のこの側面による好ましい態様において、縮重プライマーは、一つ又は複数の上記ペプチドに対応して調製される。上記プライマーを標準反応を開始するのに適した条件下で標的生物(即ち、EGIII様セルラーゼを検索した生物)からのゲノミックDNAと混合する。この態様において、(c)及び/又は(e)に対応するペプチド(a)及び/又は(d)プラスプライマーに相当する縮重プライマーを選択して、それらのプライマーを用いてDNAを増幅するのが有利である。PCR反応を実行後に、結果のDNAをポリアクリルアミドゲル上を移動させ、(c)及び/又は(e)に加えて、ペプチド(a)及び/又は(d)を含むEGIII断片にサイズが相当するバンド、即ち400−1000塩基対の範囲のバンドを選択する。これらの断片をプールして、ペプチド(b)に相当するペプチド(a)及び/又は(d)プラスプライマーに相当するプライマーを用いるかあるいはペプチド(b)に相当するペプチド(c)及び/又は(e)プラスプライマーに相当するプライマーを用いて再度増幅する。予測されたサイズの強いバンド(EGIII様セルラーゼの場合、バンドは約250−500塩基対に相当する)を切り出し、そして配列決定する。単離された配列を次にプライマーのデザインに用いて、これらのプライマーを、例えばゲノミックDNAの末端の迅速な増幅(RAGE)を通して用いることにより、完全長の遺伝子を得る。例えば、Mizobuchi,et al.,BioTechniques 15:215−216(1993)を参照。
【0048】
上記概要のDNAプライマーとハイブリダイズするDNA、即ち対応するEGIIIコーディング遺伝子をこの方法により同定したDNAを、日常的な方法により単離して、日常的な技術に従い対応するEGIII様セルラーゼを発現させるために使用してよい。クローン化された遺伝子を得る際、適切な宿主細胞を次に形質転換可能なベクターに上記DNAを挿入するための日常的な方法を用いる。適切な条件下で形質転換された宿主細胞を培養することは、必要に応じて特定の応用のために得ることができて、精製できてかつ調製できるEGIII様セルラーゼの生産をもたらす。
EGIII様セルラーゼ及び変種の製造と精製
発明のEGIII様セルラーゼは単離するか又は精製するのが好ましい。本発明のコンテクストにおいて、精製又は単離は一般的に、EGIII様セルラーゼを、天然において、例えば源生物において付随する天然に生じる置換体のいくつか又は全て、例えばEGIIIセルラーゼに関連して源生物から発現される他のセルラーゼ又は酵素から分離する目的で、EGIII様セルラーゼをその天然状態から変更させることを意味する。同様に、発明のEGIII様セルラーゼは天然状態において天然に存在しない他の成分と化合してよい。単離又は精製は、当業界において認識される分離技術、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、疎水性分離、透析、プロテアーゼ処理、硫酸アンモニウム沈殿又は他の蛋白質塩沈殿技術、遠心分離、サイズ排除クロマトグラフィー、濾過、マイクロ濾過、ゲル電気泳動又は勾配上の分離により、最終の組成物中において不所望な細胞、細胞残渣、不純物、無関係な蛋白質、又は酵素を除去してよい。
【0049】
本発明は、変種EGIII様セルラーゼの発現、生成及び/又は単離及び使用に関する。これらの酵素は、以下に記載される方法に従い同定及び単離された遺伝子を利用する組換え方法により調製するのが好ましい。しかしながら、本発明における使用のための酵素は他の当業界で認識される手段、例えば天然単離物からの精製により得てよい。
【0050】
本発明に従いEGIII様セルラーゼを発現させるために形質転換される微生物は、Trichoderma reesei種由来の株を含むのが有利であるかもしれない。即ち、本発明に従いEGIII様セルラーゼを製造するための好ましい様式は、上記のとおりに検出されたEGIII様セルラーゼの一部又は全部をコードするDNAの断片を少なくとも含むDNA構築物によりTrichoderma種の宿主細胞を形質転換することを含む。当該DNA構築物はプロモーターに機能するように結合させるのが一般的である。形質転換された宿主細胞は、次に、所望の蛋白質を発現する条件下にて生育させる。次に、所望の蛋白質生成物を実質均一までに精製する。
【0051】
しかしながら、変種EGIII様セルラーゼをコードする所定のDNAのための最良の媒体は、その天然の宿主により異なってよい。即ち、変種EGIII 様セルラーゼに関して源の生物に対して系統発生上類似性をもつ形質転換宿主内で蛋白質を発現させるもっとも有利な事になるかもしれない。例えば、別の態様において、Aspergillus nigerを発現宿主として用いることができる。A.nigerによる形質転換技術の記載に関しては、WO 98/31821を参照されたい。
【0052】
従って、Trichoderma種の発現系の本記載は、例示の目的のみ及び発明の変種EGIII様セルラーゼを発現するための一つのオプションとして提供される。当業者は、しかしながら、適切であれば別の宿主細胞内で変種EGIII様セルラーゼをコードするDNAを発現させる傾向にあってよく、そして変種EGIII様セルラーゼの源は最適な発現宿主を決定する際に考慮されるべきであることは認識されるべきである。さらに、当業者は、当業界において利用可能なツールを利用する日常の技術を通して特定の遺伝子のための最良の発現系を選択することができる。
【0053】
一つの態様において、株は過剰発現された蛋白質を得るための有用な株であるT.reesei(reesei)を含む。例えば、Sheir−Neiss,et al.,Appl.Microbiol.Biotechnol.20:46−53(1984)により記載されたRL−P37は上昇量のセルラーゼ酵素を分泌することが知られている。RL−P37の機能上の均等物は、Trichoderma reesei(reesei)株RUT−C30(ATCC No.56765)及び株QM9414(ATCC No.26921)を含む。これらの株は変種EGIIIを過剰発現するためにも有用なはずであることが予期される。
【0054】
潜在的に有害な天然のセルロース溶解活性の不在下で変種EGIIIを得ることが望まれる場合、変種EGIIIをコードするDNA断片を含むDNA構築物又はプラスミドの導入前に欠損させた一つ又は複数のセルラーゼ遺伝子を有していたTrichoderma宿主細胞株を得るために有用である。そのような株は、引用により編入される、米国特許第5,246,853号及びWO 92/06209に開示された方法により調製してよい。一つ又は複数のセルラーゼ遺伝子を欠落している宿主微生物中で変種EGIIIを発現させることにより、同定及び次の精製の手法を単純化させる。クローン化されたTrichoderma種からの何れの遺伝子も欠損させることができ、例えば、cbh1,cbh2,及びegl3遺伝子並びにEGIII及び/又はEGV蛋白質をコードするものである(例えば、それぞれ、米国特許第5,475,101号及びWO 94/28117)。
【0055】
遺伝子の欠損は、欠損されるか又は破壊されるべき所望の遺伝子の形態を当業界公知の方法によりプラスミドに挿入することにより達成してよい。欠損したプラスミドは次に適当な制限酵素部位において所望の遺伝子コーディング領域内部で切断されて、そして遺伝子コーディング配列又はその一部を選択マーカーで置き換える。欠損させるか又は破壊する遺伝子の位置の周辺のDNA配列は、好ましくは約0.5から2.0kbであり、選択可能なマーカー遺伝子の何れかのサイド上に保持される。適当な欠損プラスミドはその中に存在する唯一の制限酵素部位を有することにより、欠損遺伝子を含む断片、周辺DNA配列、及び選択可能なマーカー遺伝子が単一の直鎖片として除去されることを可能にさせる。
【0056】
選択可能なマーカーは、形質転換された微生物の欠損を可能にさせるように選択されなければならない。選択された微生物において発現されるあらゆる選択可能なマーカー遺伝子が適することになる。例えば、Trichoderma種に関しては、選択可能なマーカーは形質転換体において選択可能なマーカーの存在が上記真菌の特性に顕著に影響しないように選択される。そのような選択可能なマーカーはアッセイ可能な生成物をコードする遺伝子であってよい。例えば、Trichoderma種の遺伝子の機能性コピーを使用してよく、宿主内で欠損しているなら、栄養要求性表現型を表す宿主株をもたらす。
【0057】
好ましい態様において、Trichodermaのpyr4−誘導株は機能性pyr4遺伝子により形質転換されて、即ち、形質転換のための選択可能なマーカーを提供する。pyr4−誘導株は、フルオロオロティック酸(FOA)に耐性のTrichoderma種の株の選択により得てよい。pyr4遺伝子はオロチジン−5’−モノホスフェートデカルボキシラーゼをコードし、ウリジンの生合成に必要な酵素である。完全なpyr4遺伝子を含む株はウリジン欠損培地中で生育するが、フルオロオロティック酸には感受性である。機能性のオロチジンモノホスフェートデカルボキシラーゼ酵素を欠くpyr4−誘導株を選択して、FOA耐性に関して選択することにより、生育のためにウリジンを要求することは可能である。FOA選択技術を用いることにより、機能性オロテートピロホスホリボシルトランスフェラーゼを欠くウリジン要求株を得ることも可能である。この酵素をコードする遺伝子の機能するコピーによりこれらの細胞を形質転換することができる(Berges & Barreau,Curr.Genet.19:359−365(1991))。誘導株の選択は上で言及されたFOA耐性技術を用いて容易に実施され、即ち、pyr4遺伝子は選択可能なマーカーとして好ましく用いられる。
【0058】
一つ又は複数のセルラーゼ遺伝子を発現することに関する能力を欠如させるためにpyr4−Trichoderma種を形質転換するため、破壊されたか又は欠損させたセルラーゼ遺伝子を含む単一のDNA断片を次に欠損プラスミドから単離して、適当なpyr−Trichoderma宿主を形質転換するのに用いた。次に、pyr4遺伝子産物を発現させて即ち宿主株のウリジン栄養要求性を相補するそれらの能力に基づいて、形質転換体を同定及び選択する。サザンブロット分析を次に結果の形質転換体に実施することにより、欠損させた遺伝子のゲノミックコピーのコード領域の一部又は全てをpyr4選択可能マーカーにより置き換える二重クロスオーバー組み込み事象を確認(identify)及び確証(confirm)する。
【0059】
上記の特定のプラスミドベクターはpyr−形質転換体の製造に関するが、本発明はこれらのベクターに限定されない。様々な遺伝子を上記技術を用いてTrichoderma種において欠損及び置換させることができる。さらに、何れかの利用可能な選択可能なマーカーを上記のとおりに用いることができる。事実、クローン化されて即ち同定された何れのTrichoderma種の遺伝子も上記の戦略を用いてゲノムから欠損させることができる。
【0060】
上記のとおり、用いられた宿主株は、非機能性遺伝子又は選択された選択可能なマーカーに相当する遺伝子を欠くか又は有するTrichoderma種の誘導体である。例えば、pyr4の選択可能マーカーを選択したら、次に、特定のpyr4−誘導株を形質転換法においてレシピエントとして用い。同様に、Aspergillus nidulansの遺伝子amdS,argS,argB,trpC,niaDに均等なTrichoderma種遺伝子を含む選択可能なマーカーを用いてよい。対応するレシピエント株は、よって、誘導株、例えばそれぞれargB−,trpC−,niaD−でなければならない。
【0061】
次に、適当な微生物への挿入のために、変種EGIIIセルラーゼをコードするDNAを調製する。本発明によれば、変種EGIIIセルラーゼをコードするDNAは、機能するセルロース溶解活性を有する蛋白質をコードするのに必要なDNAを含む。変種EGIIIセルラーゼ又は誘導体をコードするDNA変種断片は、真菌のプロモーター配列、例えばcbh1又はegl1遺伝子のプロモーターに機能するように連結されてよい。
【0062】
EGIII様セルラーゼをコードするDNAの一つより多いコピーを株の中で組換えることにより過剰発現を促進することも意図される。EGIII様セルラーゼをコードするDNAは、セルラーゼをコードするDNAを有する発現ベクターの構築により製造してよい。EGIII様セルラーゼをコードする挿入されたDNA断片を有する発現ベクターは、所定の宿主生物内で自律複製可能であるか、又は宿主のDNAに組み込み可能であるあらゆるベクターであってよく、典型的にはプラスミドである。好ましい態様において、遺伝子発現を得るための2種類の発現ベクターが意図される。第1は、プロモーター、遺伝子コード領域、及びターミネーター配列の全てが発現される遺伝子起源である、DNA配列を含む。遺伝子の末端削除は、不所望のDNA配列(例えば、望まないドメインをコードする配列)を欠損させることにより、それ自身の転写及び翻訳制御配列の制御下で発現されるドメインを残すことが望まれる場合に、得てよい。選択可能なマーカーも当該ベクター上に含まれることにより、新規の遺伝子配列の複数コピーの宿主への組み込みのための選択を可能にさせる。
【0063】
第2の種類の発現ベクターは予め集合させ、そして高いレベルの転写に必要な配列及び選択可能なマーカーを含む。遺伝子又はその一部のコード領域をこの一般的な目的の発現ベクターに発現カセットプロモーター及びターミネーター配列の転写制御下に挿入できることが意図される。例えば、pTEXはそのような一般的な目的の発現ベクターである。遺伝子又はその一部は強いchb1プロモーターの下流に挿入することができる。
【0064】
上記ベクター中では、本発明のEGIII様セルラーゼをコードするDNAを転写及び翻訳配列、即ち適当なプロモーター配列及びシグナル配列に作動可能なように構造遺伝子とインフレームにて連結させるべきである。プロモーターは、宿主細胞中で転写活性を示す如何なるDNA配列でもよく、そして宿主細胞に対して同種又は異種の何れかの蛋白質をコードする遺伝子に由来してよい。上記シグナルペプチドは、EGIII様セルラーゼ又はその誘導体の細胞外生産を提供する。シグナル配列をコードするDNA配列は発現される遺伝子に天然では付随しているのが好ましいが、しかしながら、あらゆる適当な源、例えばTrichoderma由来のエキソセロビオヒドラーゼ又はエンドグルカナーゼからのシグナル配列が本発明において意図される。
【0065】
本発明のEGIII様セルラーゼをコードするDNA配列のプロモーターとの連結及び適当なベクターへの挿入に用いられる手法は、当業界においてよく知られている。
【0066】
上記のDNAベクター又は構築物は、公知の技術、例えば形質転換、トランスフェクション、マイクロインジェクション、マイクロポレーション、バイオリスティック砲撃等により宿主細胞に導入してよい。
【0067】
好ましい形質転換技術において、Trichoderma種内のDNAへの細胞壁の透過性が極めて低いことを考慮しなければならない。従って、所望のDNA配列、遺伝子又は遺伝子断片の取り込みはせいぜい最少である。形質転換プロセスの前に、誘導株(即ち、使用した選択可能なマーカーに相当する機能性遺伝子を欠く)内のTrichoderma種の細胞壁の透過性を増加させるための多数の方法が存在する。
【0068】
形質転換のためにTrichoderma種を製造するために本発明において好ましい方法は、真菌の菌糸体からのプロトプラストの調製を含む。菌糸体は出芽した生長性胞子から得ることができる。菌糸体を、細胞壁を消化する酵素により処理することにより、プロトプラストをもたらす。次に、プロトプラストを懸濁媒質中で浸透圧スタビライザーの存在により保護する。これらのスタビライザーはソルビトール、マニトール、塩化カリウム、硫酸マグネシウム等を含む。通常、これらのスタビライザーの濃度は0.8Mと1.2Mの間で変動する。懸濁媒質中で約1.2Mのソルビトール溶液を用いることが好ましい。
【0069】
宿主Trichoderma種株へのDNAの取り込みはカルシウムイオン濃度に依存する。通常、約10mM CaCl2と50mM CaCl2の間が取り込み溶液において用いられる。取り込み溶液におけるカルシウムイオンに関する要求のほかにも、通常含まれる他のアイテムは緩衝系、例えばTEバッファー(10mM Tris,pH7.4;1mM EDTA)又は10mM MOPS,pH6.0バッファー(モルフォリンプロパンスルフォニック酸)及びポリエチレングリコール(PEG)である。ポリエチレングリコールは細胞膜を融合させて、即ち媒質の含有物がTrichoderma種の細胞質へ送達されることを許容して、そしてプラスミドDNAが核に移送されると信じられる。この融合は、宿主染色体へ優しく(tenderly)組み込まれたプラスミドDNAの複数コピーをしばしば残す。
【0070】
通常、108から109/mL、好ましくは2x108/mLの密度にて透過性処理に供されたTrichoderma種のプロトプラスト又は細胞を含む懸濁液を形質転換に用いる。適当な溶液(例えば、1.2Mソルビトール;50mM CaCl2)中のこれらのプロトプラスト又は細胞の100マイクロリットル容量を所望のDNAと混合する。通常、高濃度のPEGを取り込み溶液に加える。0.1から1容量の25% PEG 4000をプロトプラスト懸濁液に加えることができる。しかしながら、プロトプラスト懸濁液に約0.25容量を加えるのが好ましい。付加物、例えばジメチルスルフォキシド、ヘパリン、スペルミジン、塩化カリウム等も取り込み溶液に加えて、形質転換を補助してよい。
【0071】
通常、上記混合物を10分から30分の間0℃においてインキュベートする。追加のPEGを次に混合物に加えることにより、所望の遺伝子又はDNA配列のとりこみをさらに増強する。25% PEG4000を通常は形質転換混合物の容量の5から15倍の容量にて加える;しかしながら、より高いか又はより低い容量が適当かもしれない。25% PEG4000は形質転換混合物の容量の約10倍が好ましい。PEGを加えた後に、形質転換混合物を次に室温においてソルビトールとCaCl2溶液の添加前にインキュベートする。プロトプラスト懸濁液を次にさらに加えることにより生育培地のアリコートを溶解する。この生育培地は形質転換体の生育のみを許容する。所望の形質転換体を生育させるのに適した如何なる生育培地も本発明において使用できる。しかしながら、Pyr+形質転換体が選択されるなら、ウリジンを含まない生育培地を用いることが好ましい。次のコロニーをウリジン枯渇生育培地上に移して精製する。
【0072】
この段階において、ウリジンを欠く固形培養培地上でのそれらの早い生育及び不規則な輪郭よりむしろスムーズな環状コロニーの形成により、安定な形質転換体を不安定な形質転換体から識別してよい。さらに、いくつかの場合、安定性に関するさらなる試験を、固形の非選択培地上で形質転換体を生育させ(即ちウリジンを含む)、この培養培地から胞子を回収し、そしてウリジンを欠く選択培地上でのちに出芽及び生育するこれらの胞子のパーセンテージを測定することにより行ってよい。
【0073】
上記の方法の特定の態様において、EGIII様セルラーゼ又はその誘導体は、新規なEGIII様セルラーゼ又はその誘導体の適切な後翻訳プロセスの結果として、液体培地中で生育させた後に宿主細胞から活性形態で回収される。
【0074】
発現されたEGIII様セルラーゼは、遠心分離、濾過及び塩、例えば硫酸アンモニウムによる上清又は濾過物中の蛋白質の沈殿により培地からの細胞の分離を含む慣用技術により培地か回収してよい。さらに、クロマトグラフィー手法、例えばイオン交換クロマトグラフィー又は親和性クロマトグラフィーを使用してよい。抗体(ポリクローナル又はモノクローナル)を天然の精製されたEGIII様セルラーゼに対して生じさせてよく、あるいは合成ペプチドをEGIII様セルラーゼ分子の一部から製造して、ポリクローナル抗体を生じさせるために用いてよい。
EGIII様セルラーゼ及び変種の使用
この発明のセルラーゼは、例えば織物の処理において多くの用途を有する。本発明による織物の処理は、セルラーゼを含む織物の加工又は洗浄を意図する。そのような処理は、限定ではないが、ストーンウオッシュ、セルロース含有織物の手ざわり、質感及び/又は外観を修飾すること又はセルロース含有織物の製造、洗濯/修理の間に使用される他の技術を含む。さらに、この発明のコンテクスト内での処理は、セルロース編み糸又は繊維製品からの「未成熟な」又は「死んだ」コットンの除去を意図する。未成熟なコットンは成熟コットンよりも顕著に無定形であり、そして例えば平行でない乾燥により存在する場合に質の低い織物をもたらす。本発明において意図される酵素は、よごして製造されたセルロース含有織物の洗浄において特に有用なはずであると信じられる。例えば、セルラーゼは洗濯ランドリーのための界面活性剤組成物中で使用してよい。本発明により有用な界面活性剤組成物は、特定の製剤、例えば、洗浄前の、前以て浸す、そしてホームユースの色再生組成物を含む。本明細書において記載されるそのような処理組成物は、希釈を必要とする濃縮物の形態又は希釈溶液の形態又はセルロース含有織物に直接適用できる形態であってよい。織物のセルラーゼ処理の一般的な処理技術は、例えば、EP公開番号220 016及びGB出願番号Nos.1,368,599号及び2,095,275号に記載される。
【0075】
濃縮されたセルラーゼ組成物は本明細書に記載される方法における使用のために調製することができる。そのような濃縮物は、濃縮された量の上記セルラーゼ組成物、バッファー及び界面活性剤を、好ましくは水性溶液中に含む。そうして製剤化された場合、セルラーゼ濃縮物を水により希釈することにより、必要な濃度の各成分を有するセルラーゼ調製物を迅速かつ正確に調製することができる。水性濃縮物を製剤化する場合、これらの濃縮物を希釈することにより、上で示された通りに必要な濃度の成分をセルラーゼ溶液中にて達することができる。容易に明白なとおり、そのようなセルラーゼ濃縮物はセルラーゼ溶液の容易な製剤化を許容し、並びにそれが使用されることになる位置への上記組成物の便利な運搬を許容する。処理用濃縮物は当業界において認識された形態、例えば液体、エマルジョン、ゲル又はペーストであり得る。そのような形態は当業者によく知られている。
【0076】
固形のセルラーゼ濃縮物を使用する場合、セルラーゼ組成物は顆粒、粉末、塊又は固形ディスクであってよい。顆粒を製剤化することにより、洗浄媒質への顆粒の溶解速度を減じる物質を含ませることができる。そのような物質及び顆粒は、米国特許第5,254,283号に記載されており、その全体を引用により本明細書に編入する。
【0077】
本発明の好ましい態様において、発明のセルラーゼは洗浄剤組成物中に用いてよい。本発明による洗浄剤組成物は前洗浄剤組成物、前浸潤組成物として、又は通常の洗浄又はリンスサイクルの間の洗浄のために有用である。好ましくは、本発明の洗浄剤組成物は、有効量のセルラーゼ、界面活性剤を含み、そして任意に以下に記載される他の成分を含む。特にこの発明のセルラーゼは、酸化剤、例えば漂白剤を含む洗浄剤中で特に有用になる。
【0078】
この発明の洗浄剤組成物の中に用いられる有効量のセルラーゼは、例えば、毛玉除去(depilling)、軟化、抗−毛玉化、表面繊維除去、抗−灰色化及び洗浄を含む、セルラーゼ含有織物上でセルラーゼにより生じることが知られている所望の効果を授与するのに十分な量である。好ましくは、上記洗浄剤組成物中のセルラーゼは約10ppmから約20,000ppmの洗浄剤の濃度にて用いられる。
【0079】
洗浄剤組成物中に用いられるセルラーゼ酵素の濃度は、洗浄媒質への希釈に際してセルラーゼ酵素の濃度が約0.01から約1000ppm、好ましくは約0.02ppmから約500ppm、そしてもっとも好ましくは約0.5ppmから約250ppm全蛋白質の範囲にあるように、選択されるのが好ましい。洗浄剤組成物中に用いられるセルラーゼ酵素の量は、洗浄剤が水への添加により希釈されて洗浄溶液を形成する程度に依存する。
【0080】
本発明の洗浄剤組成物は、当業界において認識されている形態、例えば液体中、顆粒中、エマルジョン中、ゲル中、又はペースト中であってよい。そのような形態は当業者によく知られている。固形の洗浄剤組成物を用いる場合、セルラーゼは顆粒として用いるのが好ましい。好ましくは、顆粒を製剤化することにより、セルラーゼ保護剤を追加して含ませることができる。顆粒を製剤化することにより、洗浄媒質への顆粒の溶解速度を低下させるための物質を含ませることができる。そのような物質及び顆粒は米国特許第5,254,283号に記載されており、その全体を引用により本明細書に編入する。
【0081】
この発明の洗浄剤組成物は表面活性化剤、例えば界面活性剤を用い、洗浄剤組成物中でのそれらの使用に関してよく知られた、アニオン性、非イオン性及び量性界面活性剤を用いる。上記セルラーゼ組成物及び界面活性剤に加えて、この発明の洗浄剤は以下の成分一つ又は複数を任意に含むことができる。
【0082】
本発明によるセルロース溶解物質の処理は、さらに、動物用飼料、パルプ及び/又は紙、当業界公知の食品及び穀類の処理を意図する。例えば、セルラーゼは動物飼料の有用性を高め、ウッドパルプの排水性(drainability)を改善し、食品を増強し、そして穀類の湿潤製粉プロセス又は乾燥製粉プロセスの間に穀類中の繊維を減少させることが知られている。
【0083】
本発明及びその利点をさらに例示するために、以下の特定の実施例を、本発明を例示するために提供されるという理解のもとに提供するが、如何なる様式においてもその範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【0084】
実施例
実施例1:EGIII様セルラーゼをコードするゲノミックDNAの調製
EGIII様セルラーゼが特定の生物のDNAによりコードされているか否かを決定するためにPCR反応に着手する目的で、いくつかの異なる微生物に関してゲノミックDNAを調製した。
【0085】
ゲノミックDNAは、Acremonium brachypenium 寄託番号 CBS 866.73;Chaetomium brasillience 寄託番号 CBS 140.50;Chaetomium vitellium 寄託番号 CBS 250.85;Emericella desertoru 寄託番号 CBS 653.73;Fusarium equiseti 寄託番号 CBS 185.34;Gliocladium roseum 寄託番号 CBS 443.65;Humicola grisea var.thermoidia 寄託番号 CBS 225.63;Myceliophtora thermophila 寄託番号 ATCC 48103−48104;Penicillium notatum 寄託番号 ATCC 9178,9179;及びPhanerochaete chrysosporium 寄託番号 ATCC 28326から得て、標準の方法に従い単離した。
【0086】
PCRは、MJリサーチ社のPCT−150 MicroCyclerのような標準のPCRマシン上で、以下の条件下において実施した:
1)1分間、98℃、1サイクル;
2)1分間、94℃、
90秒間、40℃、
1分間、72℃
3)工程2を30サイクル繰り返す、
4)7分間、72℃、1サイクル、及び
5)低温から15℃にて貯蔵及び次の分析。
【0087】
以下のDNAプライマーを、様々な微生物から構築されたライブラリーからのEGIII遺伝子の増幅における使用のために構築した。蛋白質及びDNAの配列に関する本明細書中の全てのシンボルは、IUPAC IUB Biochemical Nomenclature Commissionコードに対応する。
【0088】
【化3】
【0089】
PCR条件は以下のとおりであった:10μLの10X反応バッファー(100mM Tris HCl,pH8−8.5;250mM KCl;50mM (NH4)2SO4;20mM MgSO4を含む10X反応バッファー);0.2mMの各dATP,dTTP,dGTP,dCTP(最終濃度);1μLの100ng/μLのゲノミックDNA;1μLのPWOポリメラーゼ(ベーリンガーマンハイム、カタログ番号1644−947)をμLあたり1ユニット;500mMのプライマー(最終濃度)及び水を100μLまで。上記溶液にミネラルオイルを重層した。
【0090】
PCRの戦略は以下のとおりであった:BOX1(それぞれ、SEQ ID NO:31及び32)及びBOX2(SEQ ID NO:34)のフォワードプライマーを、BOX3(SEQ ID NO:42−46)からのリバースドプライマーと、所望のゲノミックDNAサンプルと共に混合し、そして400−1000塩基対の範囲の断片を得るためゲル上を移動させた。そうして得られた断片をプールして、当該プールを2つのおおよそ等しい部分に分割した(split)。第1のプールを、BOX1(それぞれ、SEQ ID NO:31及び32)及びBOX1’(SEQ ID NO:34)からのフォワードプライマーと、BOX2(SEQ ID NO:37)からのリバースドプライマーと共に、混合した。第2のプールを、BOX2(SEQ ID NO:36)と、BOX3(SEQ ID NO:42−46)からのリバースドプライマーと共に、混合した。上記遺伝子内のプライマーの位置を考慮してEGIII様セルラーゼに比較して近似のサイズを有する断片、この場合約250−500塩基対に相当する断片を単離して配列決定した。
【0091】
配列決定した断片から、完全長の遺伝子の配列を迅速に得るために、RAGE技術(ゲノミックの末端の迅速な増幅)を使用することが可能であった。完全長の遺伝子を得て、図3のいくつかの追加のEGIII様セルラーゼを提供する。図3に示すとおり、Hypocrea schweinitzii(SEQ ID NO:4)、Aspergillus aculeatus(SEQ ID NO:5),Aspergillus kawachii(1)(SEQ ID NO:6),Aspergillus kawachii(2)(SEQ ID NO:7),Aspergillus oryzae(SEQ ID NO:8),Humicola grisea(SEQ ID NO:9),Humicola insolens(SEQ ID NO:10)、Chaetomium brasilliense(SEQ ID NO:11),Fusarium equiseti(SEQ ID NO:12),Fusarium javanicum(1)(SEQ ID NO:13),Fusarium javanicum(2)(SEQ ID NO:14),Gliocladium roseum(1)(SEQ ID NO:15),Gliocladium roseum(2)(SEQ ID NO:16),Gliocladium roseum(3)(SEQ ID NO:17),Gliocladium roseum(4)(SEQ ID NO:18),Memnoniella echinata(SEQ ID NO:19),Emericella desertoru(SEQ ID NO:20),Actinomycete 11AG8(SEQ ID NO:21),Streptomyces lividans CelB(SEQ ID NO:22),Rhodothermus marinus(SEQ ID NO:23)、及びErwinia carotovara(SEQ ID NO:24)から単離された全部が、Trichoderma reesei由来のEGIIIに有意な相同性を含んだ。
実施例2:EGIII変種
部位特異的変異導入を実施して、T.reeseiのEGIIIにアミノ酸置換を取り込んだ。以下のプライマーを用いて、T.reesei由来のEGIII中のシステイン置換を生じさせた。PCRは公知の技術に従い実施した。
【0092】
【表1】
【0093】
簡単に云うと、T.reeseiのEGIIIをコードするDNAをcDNAクローンから(Ward,et al.,Proc.of the Tricel Symposium on ”Trichoderma reesei cellulases and other hydrolases.”Espoo,Finland 1993 Ed.Souminen,P.and Reinikanen,T.Foundation for Biotechnical and Industrial Research.8,pp153−158;米国特許第5,475,101号)、egl3遺伝子の5’末端にBglII制限エンドヌクレアーゼ部位(最初のATGコドンのすぐ上流)及び3’末端にXbaI部位を導入した(「停止」コドンのすぐ下流)PCRプライマーを用いて、増幅した。増幅された断片は、次に、BglII及びXbaIにより消化し、そしてBglII及びXbaIにより消化されたpUC19に連結した。
【0094】
変種はこのプロトプラスト中においてQuickChange(登録商標)変異導入法(Stratagene)を用いて作成した。変種遺伝子を次にAspergillusの発現ベクターpPGPT−pyrG(Berka and Barnett,Biotech,Adv.7:127(1989))にサブクローン化した。変種遺伝子を有するベクターにより次にA.niger var:awamorを形質転換して、その結果の株を撹拌フラスコ培養にて成育させた(WO 98/31821)。
【0095】
EGIII変種を次にこれらの培養物の細胞不含上清からカラムクロマトグラフィーにより精製した。簡単に云えば、10mgのEGIIIあたり、約1mLのPharmacia Butyl Sepharose(高速流)樹脂を0.5M硫酸アンモニウムを含む使い捨てドリップカラムに負荷した。当該カラムを次に0.05MのBis Tris Propane及び0.05M酢酸アンモニウム、pH8により平衡化した。
【0096】
EGIII様セルラーゼを含む上清を一晩0.18mg/mLのエンドグルカナーゼHにより37℃において処理した。硫酸アンモニウムを処理上清に約0.5Mの最終濃度まで加えた。遠心分離後に、上清を上記カラムに負荷した。当該カラムを次に3容量の平衡化バッファーにより洗浄して、次に2x1容量の0.05M Bis Tris Propane及び0.05M酢酸安アンモニウムによりpH8にて溶出した。フロースルーの各容量を別々の画分として回収したところ、EGIII様セルラーゼは第2の画分に出現した。
実施例3:EGIII様セルラーゼの比活性
比活性をアッセイするため、NPCの加水分解アッセイを用いた。マイクロタイタープレート中で、100μlの50mM酢酸ナトリウム、pH5.5及び20μlの25mg/mL o−NPC(o−ニトロフェニルo−D−セロビオシド(シグマN 4764))をアッセイバッファー中で加えた。プレートを10分間40℃においてインキュベートした。
【0097】
平衡化したら、10μlのEGIII様セルラーゼを加えて、プレートを40℃においてさらに10分間インキュベートした。加水分解を消滅させて反応を停止するため、70μLの0.2Mグリシン、pH10.0を加えた。次に、プレートをマイクロタイターリーダー中で410nmにおいて読んだ。規準として、T.reeseiのEGIIIの10μLの0.1mg/ml溶液は約0.3付近のODを提供した。
【0098】
EGIII様セルラーゼの濃度を280nmにおける吸光により測定したが、減衰定数はPace,et al.,Pro.Sci.4:2411(1995)に記載されたEdelhochの方法により実験上測定された78711 M−1cm−1又は3.352g/L−1であった。
【0099】
EGIII変種の融点は平衡CDにより測定した。実験は、Avivにより供給された5位置熱電気セルホルダーを備えた、Aviv 62DS又は62ADS分光計上で実施した。バッファー条件は、酢酸によりpH8.0に調節された50mM bis−trisプロパン及び50mM酢酸アンモニウムであった。各実験の最終蛋白質濃度は5−30mMの範囲であった。データは0.1cmパス長のセル中で回収した。
【0100】
スペクトルは、265−〜210nmにおいて回収した。熱変性は217nmにおいて30から90℃において実施し、データは2度おきに回収した。各温度における平衡時間は0.1分であり、そしてデータはサンプルあたり4秒間回収した。
【0101】
pH8.0サンプルの残りは5x400μLアリコートに分割した。2つのサンプルを酢酸によりpH5と7に調節し、そして他の2つを水酸化ナトリウムによりpH9と10に調節した。全5サンプルの熱変性を上記のとおりに同時に実施した。融点は、Luo,et al.,Biochemistry 34:10669及びGloss et al.,Biochemistry 36:5612の方法に従い測定した。
【0102】
【表2】
【0103】
表2から認識され得るとおり、他のアミノ酸による置換はEGIII変種の比活性を有意に減少させた。しかしながら、他のアミノ酸のEGIII変種への置換は変種の比活性を回復させるらしい。
【図面の簡単な説明】
【図1】
図1は、本発明により記載された残基を示すTrichoderma reeseiの成熟EGIII蛋白質のアミノ酸配列を示す(SEQ ID NO:1)。
【図2】
図2は、イントロンを除いたTrichoderma reeseiのEGIIIのDNA配列を示す(SEQ ID NO:2)。
【図3】
図3は、20のEGIII様セルラーゼの完全長のEGIIIの整列化における整列化を示し、一次配列モデリングに基づいた均等残基を示し、Trichoderma reesei(SEQ ID NO:3),Hypocrea schweinitzii(SEQ ID NO:4),Aspergillus aculeatus(SEQ ID NO:5),Aspergillus kawachii(1)(SEQ ID NO:6),Aspergillus kawachii(2)(SEQ ID NO:7),Aspergillus oryzae(SEQ ID NO:8),Humicola grisea(SEQ ID NO:9),Humicola insolens(SEQ ID NO:10),Chaetomium brasilliense(SEQ ID NO:11),Fusarium equiseti(SEQ ID NO:12),Fusarium javanicum(1)(SEQ ID NO:13),Fusarium javanicum(2)(SEQ ID NO:14),Gliocladium roseum(1)(SEQ ID NO:15),Gliocladium roseum(2)(SEQ ID NO:16),Gliocladium roseum(3)(SEQ ID NO:17),Gliocladium roseum(4)(SEQ ID NO:18),Memnoniella echinata(SEQ ID NO:19),Emericella desertoru(SEQ ID NO:20),Actinomycete 11AG8(SEQ ID NO:21),Streptomyces lividans CelB(SEQ ID NO:22),Rhodothermus marinus(SEQ ID NO:23),及びErwinia carotovara(SEQ ID NO:24)を含む。
Claims (17)
- Trichoderma reesei由来のEGIII中の残基M79,M154及び/又はM118の一つ又は複数に相当する位置において置換又は欠失を含む、EGIII様セルラーゼ。
- EGIII中の残基M79,M154及び/又はM118の一つ又は複数に対応する位置の、ロイシン、イソロイシン、バリン、スレオニン、セリン又はアラニンからなる群から選択されるアミノ酸を含む、請求項1記載の変種。
- 真菌、細菌又は放線菌に由来する、請求項1記載のセルラーゼ。
- 真菌に由来する、請求項3記載のセルラーゼ。
- 繊維状真菌に由来する、請求項4記載のセルラーゼ。
- 繊維状真菌がEuascomyceteに属する、請求項5記載のセルラーゼ。
- Euascomyceteが、Aspergillus種、Gliocladium種、Fusarium種、Acremonium種、Myceliophtore種、Verticillium種、Myrothecium種又はPenicillium種に属する、請求項6記載のセルラーゼ。
- セルラーゼがエンドグルカナーゼである、請求項1記載のセルラーゼ。
- 請求項1記載のセルラーゼをコードするDNA。
- 請求項9記載のDNAを含むベクター。
- 請求項10記載のベクターにより形質転換された宿主細胞。
- 工程:
(a)セルラーゼを生成するのに適した条件下で適当な培養培地中で請求項11記載の宿主細胞を培養し;そして
(b)生成されたセルラーゼを得ること
を含む、セルラーゼを生成する方法。 - 界面活性剤及びセルラーゼを含む洗浄剤組成物であって、上記セルラーゼが酸化感受性残基において置換を含む変種EGIII様セルラーゼを含む、洗浄剤組成物。
- 上記変種EGIII又はEGIIIセルラーゼがTrichoderma reesei由来のEGIII中の残基M79,M154及び/又はM118の一つ又は複数に相当する位置において置換又は欠失を含む、請求項13記載の洗浄剤。
- 上記変種がEGIII中の残基M79,M154及び/又はM118の一つ又は複数に対応する位置の、ロイシン、イソロイシン、バリン、スレオニン、セリン又はアラニンからなる群から選択されるアミノ酸を含む、請求項14記載の洗浄剤。
- 洗浄剤がランドリー用洗浄剤である、請求項13記載の洗浄剤。
- セルロース含有織物の処理における、請求項1記載の変種EGIII又はEGIII様セルラーゼの使用。
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