CN102016044B - 新型嵌合α-淀粉酶变体 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了具有高热稳定性和良好淀粉降解性能，尤其在高温液化过程特征中具有高热稳定性和良好淀粉降解性能的嵌合α淀粉酶。该α-淀粉酶是AmyL和AmyS酶的嵌合体，可用于淀粉降解过程。制备该嵌合酶的方法，以及将该嵌合α-淀粉酶用于液化、清洗表面淀粉残余以及处理纺织材料以去除涂层的方法。本发明提供了实施该方法的试剂盒。本发明还提供了编码该嵌合酶的多核苷酸，载体以及表达宿主。

Description

新型嵌合α-淀粉酶变体
交叉引用
本申请要求2008年4月30日提交的美国专利申请序列号No.61/126,066的优先权，其全部内容通过引用并入本文。
技术领域
本申请主要涉及用于工业过程的α-淀粉酶，例如用于液化、烘焙和清洗应用。更具体地说，本申请涉及在高温应用中活性改善和/或提供改善的淀粉降解性能的嵌合α-淀粉酶。
背景技术
对于许多使用淀粉的工业过程，希望具有可在高温下起作用以快速分解淀粉从而降低粘度的淀粉分解酶。这种酶的实例是本领域中已知的。例如，来自地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)或嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)的α-淀粉酶，分别为AmyL和AmyS，其利于在高温下淀粉的液化。在不加入钙的情况下，AmyL以及AmyL的变体具有比AmyS淀粉酶更高的热稳定性，因此优选用于葡萄糖和果糖的生产(例如HFCS)。AmyS以及AmyS的变体在乙醇产生过程中是优选的，因为它们在高温下具有比AmyL或其变体更高的对玉米淀粉的比活。因此，AmyS具有更快速的底物粘度降低初始速度，其在淀粉液化过程中是非常想要的属性。但是，AmyS具有不希望的特性，其催化活性导致在过程结束时比AmyL或其变体高的最终粘度。更高的最终粘度可能是低热稳定性的结果，即AmyS更快被液化过程的高温仅仅简单失活。
已经研究了增加酶热稳定性的方法。通过缺失AmyL序列中不存在的两个氨基酸R176-Gly177(相对于AmyQ的氨基酸序列计数)增加AmyQ(解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)淀粉酶)的热稳定性，如Suzuki等人(1989)(J.Biol.Chem.264：18933)所示。可通过缺失来自环(F178至A184)的两个氨基酸R179-G180(AmyS计数)增加AmyS类型淀粉酶的热稳定性，如Igarashi等人1998(Biochem.Biophys.Res.Comm.248：772)所示。但是，具有此缺失的突变AmyS酶具有比亲代酶低的高温下玉米淀粉水解比活，使得AmyS淀粉酶的主要优点之一不再存在，如Shiau等人(2003)(Appl.Environ.Micro.69：2383)所示。
如上所述，本领域中已知，在不加入钙的情况下，野生型AmyL淀粉酶比AmyS淀粉酶热稳定性更好。本领域中还已知，AmyQ，来自解淀粉芽孢杆菌的与AmyS和AmyL均高度同源的α-淀粉酶，比AmyS或AmyL热稳定性的差。Suzuki等人(1989)证明了，对于AmyL-AmyQ来源的杂化物，需要AmyL酶的N端部分以获得高稳定性。
发明内容
本文提供了优选由AmyL和AmySα-淀粉酶制成的嵌合多肽。该新嵌合淀粉酶是有用的，因为单个酶提供了比AmyL类型淀粉酶中可见的相对更高的热稳定性，以及比AmyS类型淀粉酶中可见的相对更高的比活。
因此，本文提供了改进的淀粉酶，其提供了改变的性能特征，例如在液化的高温条件下降低粘度的能力方面。如一般由AmyS类型淀粉酶观察到的，该嵌合淀粉酶显示比活提高或者提供淀粉液化中峰值粘度快速降低的能力。另外，嵌合α-淀粉酶具有良好的热稳定性，因此可提供如通常在AmyL类型酶中所见的低最终粘度。本文提供了热稳定性提高的多肽、比活增加的热稳定淀粉酶以及包含该多肽和酶的组合物，和使用该新型酶或组合物的方法。本文还提供了编码该嵌合酶的核酸，包括表达载体，以及表达该嵌合淀粉酶的宿主细胞。
嵌合α-淀粉酶提供了以下益处，单个嵌合酶可提供两个独立的酶中所提供的许多优点。本文所述的嵌合淀粉酶的利用可为制造商带来生产利益，并且为最终用户和制造商都带来经济效益。
嵌合α-淀粉酶特别可用于乙醇生产过程以及其他高温下的淀粉降解过程，例如糖浆生产或者发酵的液化过程、清洗应用(例如清洗、洗涤)、烘焙或者纺织材料的脱浆。该酶是相对热稳定的，并且在pH条件、钙离子浓度和氧化还原条件的大范围内具有良好的活性。
在一个方面中，本文提供了包含氨基端结构域和羧基端结构域的嵌合多肽。该氨基端结构域包含AmyL淀粉酶的约180个或更多连续氨基酸残基。优选地，该氨基端部分包含AmyL淀粉酶的N端部分。该嵌合多肽的羧基端结构域包括AmyS淀粉酶的羧基端部分。该嵌合多肽具有约480-515个氨基酸残基的全长。本文提供的嵌合多肽没有AmyL淀粉酶或AmyS淀粉酶的一级氨基酸序列，也不具有任何其他已知多肽的一级氨基酸序列。该嵌合多肽相对于至少AmyS淀粉酶具有提高的热稳定性。在一些实施方案中观察到相当于或甚至好于AmyL的热稳定性。
在另一个方面中，提供了热稳定嵌合α-淀粉酶。嵌合淀粉酶包含N端部分和C端部分；该N端部分包含来自AmyL淀粉酶N端部分的连续氨基酸序列。该嵌合淀粉酶的C端部分包含来自AmyS淀粉酶C端的连续氨基酸序列。嵌合α-淀粉酶通常具有高于AmyL淀粉酶的比活。该嵌合淀粉酶还具有高于AmyS淀粉酶的95℃下的热稳定性。该嵌合淀粉酶的一级氨基酸序列约为475-520个氨基酸残基长。
本文提供了包含一种或多种如上所述嵌合多肽或热稳定嵌合α-淀粉酶的组合物，或其组合。该组合物还可包含一种或多种另外的多肽或酶。还提供了包含该组合物的食品级冻干组合物。
在另一个方面中，提供了编码如上所述嵌合多肽或热稳定α-淀粉酶的多核苷酸，包含该多核苷酸的载体以及包含该载体或多核苷酸的宿主细胞。在一个实施方案中，该多核苷酸编码与SEQ ID NO：1-17中的任意序列具有至少约95％序列同一性但是不具有SEQ ID NO：1或2的确切序列的多肽。
还提供了制备和使用本文公开的嵌合多肽、热稳定α-淀粉酶以及组合物的方法。本文提供的方法考虑了与其一起使用一种或多种其他酶的可能性，包括一种或多种其他的淀粉酶。在一个方面中，提供了产生包含嵌合多肽或热稳定的α-淀粉酶的组合物的方法。该方法包括利用选自下列的宿主细胞用于表达蛋白质的发酵过程：地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和嗜热脂肪芽孢杆菌，所述蛋白质包含：(a)长度约为480-515个氨基酸残基的嵌合多肽，并且含有包含AmyL淀粉酶N端部分的约180个或更多连续的氨基酸残基的氨基端结构域，还含有包含AmyS淀粉酶的羧基端部分的羧基端结构域，该嵌合多肽具有相对于至少AmyS淀粉酶提高的热稳定性，或者(b)长度约为475-520个氨基酸残基的热稳定嵌合α-淀粉酶，并且含有包含来自AmyL淀粉酶N端部分的连续氨基酸序列的N端部分，还含有包含来自AmyS淀粉酶C端部分的连续氨基酸序列的C端部分，所述嵌合α-淀粉酶具有大于AmyL淀粉酶的比活以及高于AmyS淀粉酶的95℃下的热稳定性。该方法需要至少部分纯化表达的蛋白质，以产生该组合物。
提供了液化淀粉浆(starch slurry)的方法，其包括：制备包含淀粉的浆液，将该浆液加热至液化可接受的温度，向该浆液中添加包含本文所提供的一种或多种嵌合多肽或热稳定嵌合α-淀粉酶或其组合的组合物。在足以将淀粉浆液化的温度下和时间段内将该浆液与组合物一起孵育，来完成此方法。该方法可用作生产燃料酒精方法的一部分。
还提供了清洗表面以去除不希望的或不想要的淀粉残渣的方法。该方法包括以下步骤：提供具有待去除淀粉残渣的表面，在足以导致淀粉残渣去除的温度下和时间段内将该表面与包含本文公开的嵌合多肽、热稳定嵌合α-淀粉酶或其组合的组合物相接触。
还提供了处理纺织材料的方法，该纺织材料之前已经与包含淀粉或淀粉衍生物的涂层相接触。该方法包括在足以从该纺织材料基本上去除该涂层的时间段内和条件下，将该纺织材料与包含如上所述的嵌合α-淀粉酶的液体相接触。
还提供了利于淀粉浆液液化的试剂盒，所述试剂盒包含下列至少之一：(a)长度约为480-515个氨基酸残基的嵌合多肽，并且含有包含AmyL淀粉酶N端部分的约180个或更多连续的氨基酸残基的氨基端结构域，和含有包含AmyS淀粉酶的羧基端部分的羧基端结构域，该嵌合多肽具有相对于至少AmyS对照提高的热稳定性，或者(b)长度约为475-520个氨基酸残基的热稳定嵌合α-淀粉酶，并且含有包含来自AmyL淀粉酶N端部分的连续氨基酸序列的N端部分，和含有包含来自AmyS淀粉酶C端部分的连续氨基酸序列的C端部分，所述嵌合α-淀粉酶具有大于AmyL淀粉酶的比活以及高于AmyS淀粉酶的95℃下的热稳定性。该试剂盒还包含该试剂盒用于淀粉浆液化的使用说明书。
附图说明
图1是用于表达多种杂交体和淀粉酶的质粒图。质粒元件如下：Bla，编码氨苄青霉素/羧苄青霉素抗性标记的β内酰胺酶基因；AprE启动子区域，来自枯草芽孢杆菌AprE(碱性蛋白酶)的启动子，其具有与芽孢杆菌宿主染色体同源的区域，允许其整合进宿主基因组；AprE肽，枯草芽孢杆菌AprE信号序列；Hybrid 186，目的基因编码区域，例如杂化物186；LAT Term，来自地衣芽孢杆菌的天然淀粉酶LAT(热稳定的衣芽孢杆菌淀粉酶，licheniformis amylase thermostable)终止子；CAT，用于氯霉素抗生素抗性的氯霉素乙酰转移酶基因；ORI，用于大肠杆菌(E.coli)的复制起点。注意，该质粒缺乏用于芽孢杆菌属的复制起点。
图2显示与对照，AmyS对照相比在95℃下的热稳定性筛选中嵌合α-淀粉酶性能的结果。该嵌合α-淀粉酶包含来自AmyL的氨基端部分和来自AmyS的羧基端部分。所测试的嵌合体包括186、187、200、202、228、249、254和259。用于本文嵌合α-淀粉酶名称中的三位数字显示AmyL序列最后一个氨基酸残基的位置，嵌合体的剩余部分来源于AmyS序列。所用的对照酶(“AmyS对照”)(SEQ ID NO：3)是具有R179-G180缺失的变体AmyS[描述于WO2005/111203]。将酶保持于要求的温度下(95℃)，在测定所示的时间点移开样品。测定条件包括pH 5.650mM苹果酸盐缓冲液，2.6mM CaCl2和50mM NaCl。该图显示随着时间(分钟，X轴)的相对剩余催化活性(百分比，Y轴)，其使用MEGAZYME CERALPHA合成寡糖底物，如本文所述。孵育条件和测定的详细说明在方法部分提供。
图3显示其他嵌合α-淀粉酶在95℃下的热稳定性。图2中的图显示随着时间(分钟，X轴)的淀粉酶活性剩余(百分比，Y轴)。反应条件与图1相同。所测试的嵌合体包括200SB、202SB和228SB。本文中使用的“SB”表示通过引入S187D和S188T突变产生稳定用盐桥。对照是AmyS对照(SEQ ID NO：3)。
图4显示其他嵌合α-淀粉酶在95℃下的热稳定性。该图如图2和3。反应条件与图2和3中相同。所测试的样品包括AmyS对照，以及嵌合体249SB、254SB和259SB。
图5显示几种嵌合α-淀粉酶在75℃下的比活。如下所述(细节参见方法部分)，使用DNS还原糖检测测定来确定嵌合体186、228和228SB相比于AmyL和AmyS对照酶的反应速率。比活记录为反应中每秒每mg酶产生的mg葡萄糖。所测的所有三种嵌合酶显示在所测试的高温75℃下高于AmyL酶的比活。
图6显示在与多种杂交体淀粉酶一起孵育后玉米淀粉底物粘度的变化。比较杂交体186、202SB、228SB和228与AmyS对照降低粘度的能力，如具有扭矩读数输出的EUROSTAR/IKA Labortechnik control-viscP7电子顶部搅拌器所测。
图7，A-E图，显示SEQ ID 1至17的氨基酸序列。氨基酸序列标记：对于所有杂化物氨基酸序列，AmyL序列以普通文本显示，AmyS序列区域以黑体显示，盐桥序列以下划线显示。
图8，A-I图，显示SEQ ID 18至34的核苷酸序列。核苷酸序列标记：对于所有杂化物核苷酸序列，AmyL序列以普通文本显示，AmyS序列区域以黑体显示，盐桥序列以下划线显示。
发明详述
提供了相比现有的α淀粉酶具有有益优点的嵌合α淀粉酶。该嵌合α-淀粉酶包含来自AmyL淀粉酶的N端部分和来自AmyS淀粉酶的C端部分。该嵌合α-淀粉酶显示相对于AmyS酶提高的热稳定性，以及相对于AmyL酶提高的比活或或降低峰值粘度的能力。因此，这些性能使得该嵌合多肽和热稳定淀粉酶可用于高温淀粉液化，例如发酵产品例如醇，尤其乙醇的生产。它们导致相对于单独使用的AmyL淀粉酶峰值粘度降低，以及相对于单独使用的AmyS淀粉酶降低的最终粘度。本文提供的嵌合酶还可用于在其他高温过程例如烘焙中分解或去除淀粉、淀粉酶、支链淀粉或α-淀粉酶的其他底物，以及在纺织材料处理中用以去除基于淀粉的胶粘剂，或者用于清洁/洗涤过程。本文提供的嵌合酶还可彼此和/或与一种或多种其他酶联合使用，例如在混合物中。优选地，所用的其他酶在与嵌合α-淀粉酶所用的相同或类似反应条件下有活性。这为最终用户提供了更大的灵活性，以及某些经济和处理的优点。可建立允许α-淀粉酶和任何其他所存在的酶有活性的处理条件，例如pH、温度、离子强度以及所需辅因子的存在。这些处理条件可利于使用连续或半连续过程，而不是昂贵且耗时的分批过程。嵌合α-淀粉酶的某些实施方案中所提供的其他特征有比活增加，以及降低淀粉浆的峰值粘度或最终粘度的能力，其等同或优于AmyL和AmyS酶。
A.定义和缩写
根据该详细描述应用以下缩写和定义。应当指出如本文中所用，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数称谓，除非上下文另外清楚地说明。因此，例如，对“一种酶”的提及包括多种此类酶，并且对“该制剂”的提及包括对本领域技术人员已知的一种或多种制剂和其等同物的提及等。
有关数值或范围的术语“约”表示数值可以高于或低于所示值的10％。在另一些实施方案中，“约”表示数值可以高于或低于所示值的5％。本领域技术人员会了解术语“约”在与氨基酸残基或碱基对的个数或范围，或者以氨基酸残基表示的多肽长度，或者以碱基对表示的多核苷酸长度一起使用时，仅涵盖整数值。
除非另外定义，本文中所用的全部技术及科学术语具有与本领域普通技术人员通常所理解的相同意义。下文提供了以下术语。
1.1.定义
“淀粉酶”表示能够催化淀粉、直链淀粉、支链淀粉等降解等等的酶。一般来说，α-淀粉酶(EC 3.2.1.1；α-D-(1→4)-葡聚糖的葡聚糖水解酶)定义为内切作用酶，其切割含有三个或更多个α-D-(1→4)连接的葡萄糖单元的多糖中的α-D-(1→4)O-糖苷键。α-淀粉酶释放α-构型的还原基团。它们以随机形式作用于淀粉、糖原和相关的多糖和寡糖。相反，外切作用淀粉分解酶从非还原端依次切割底物分子。葡聚糖1，4-α-麦芽糖水解酶(麦芽糖α-淀粉酶；EC 3.2.1.133)产生α-麦芽糖作为终产物，而β-淀粉酶(EC 3.2.1.2)产生β-麦芽糖。β-淀粉酶、α-葡糖苷酶(EC 3.2.1.20；α-D-葡萄糖的葡萄糖水解酶)、葡糖淀粉酶(EC 3.2.1.3；α-D-(1→4)-葡聚糖葡糖水解酶)以及产物特异性淀粉酶可从其各自的底物产生特定长度的麦芽-寡糖。葡糖淀粉酶从直链淀粉和支链淀粉分子的非还原端释放葡糖残基。葡糖淀粉酶还催化α-1，6和α-1，3键的水解，尽管其速率比α-1，4键慢得多。
“嵌合多肽”或“嵌合体”表示含有来自多于一种多肽的序列的蛋白质。嵌合多肽或α-淀粉酶可以在下列意义上是嵌合的，即其包含来自一个分子的部分、区域或结构域，其与来自一个或多个其他分子的一个或多个部分、区域或结构域相融合。例如，嵌合多肽或嵌合α-淀粉酶可包含与另一种α-淀粉酶信号肽序列相连的成熟α-淀粉酶蛋白质的序列。本领域技术人员会了解嵌合多肽和α-淀粉酶不一定由实际融合蛋白质序列组成，而是也可使用相应编码序列的多核苷酸表达包含与实际或假定产生自或(“来源于”)其他淀粉酶的融合蛋白质相同的氨基酸序列的嵌合多肽或α-淀粉酶。因此，例如，本文的嵌合α-淀粉酶或嵌合多肽可包含第一淀粉酶的氨基端部分和第二淀粉酶的羧基端部分，或者该嵌合多肽或α-淀粉酶可表达自编码相同序列蛋白质的多核苷酸。就嵌合α-淀粉酶来说，α-淀粉酶的催化活性必须存在于所得分子中。本文使用的“嵌合分子”可以是多核苷酸或多肽，并且是非天然的。野生型α-淀粉酶天然存在。嵌合淀粉酶在成熟蛋白质的氨基酸残基(即不含信号序列的活性分子的一级氨基酸序列)上不同于野生型α-淀粉酶。
针对酶而言，“活性”表示“催化活性”，涵盖任何可接受的酶活性测量度，例如活性的比率、活性的量或者比活。催化活性指催化特定化学反应的能力，例如水解特定化学键。如本领域技术人员会了解地，酶的催化活性仅加速否则缓慢的化学反应的速率。因为酶仅用作催化剂，所以它不由反应自身产生，也不被消耗。本领域技术人员还会了解，并非所有多肽都具有催化活性。“比活”是每单位总蛋白或酶的酶活性度量。因此，比活可由单位重量(例如每克或每毫克)或者单位体积(例如每ml)的酶表示。另外，比活可包括酶纯度的度量，或者可提供纯度的指示，例如，当标准活性已知或者可获得比较时。
“变体”指多肽和核酸。术语“变体”有时可以与术语“突变体”互换地使用。变体包括在氨基酸或核酸序列的一个或多个位置处插入、取代、缺失、颠换、截短和/或倒位。变体核酸可包括与能够同本文所示核苷酸序列杂交的序列互补的序列。例如，变体序列与能够同本文所示核苷酸序列在严格条件(例如50℃和0.2X SSC(1X SSC＝0.15M NaCl，0.015M柠檬酸钠，pH 7.0))下杂交的序列互补。更优选地，术语“变体”包括与能够在高度严格条件(例如65℃和0.1X SSC)下同本文所示核苷酸序列杂交的序列互补的序列。在多个实施方案中，变体与本文明确提供的序列至少60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或甚至99％相同。
本文使用的术语“表达”表示基于基因的核酸序列或人工序列产生多肽的过程。该过程包括转录和翻译。“表达产物”一般指翻译产生的蛋白质，无论是体外还是体内。同样地，如果表达基因，则在细胞，例如包含基因的宿主细胞中产生基因产物(通常为蛋白质，有时为RNA)。
本文使用的“微生物”包括任何细菌、酵母或真菌物种。
对于蛋白质或核酸序列，“分离的”表示序列至少基本上不含至少一种序列天然关联的并且在自然中发现的其他成分。在核酸序列的实例中，分离表示与基因组序列相分离。
“纯化的”表示物质处于相对纯的状态，例如至少约90％纯，至少约95％纯，或者至少约98％纯。“部分纯化的”涵盖较低的纯度，只要蛋白质或核酸是如本文所用的“分离的”。
“热稳定”表示酶在暴露于高温后保持可测量的活性。酶(例如α-淀粉酶)的热稳定性的一种度量是其半衰期(t1/2)，其中半衰期时酶活性的一半丧失。在确定的条件下通过测量残余淀粉酶活性计算半衰期的值。在一些实施方案中，热稳定性的其他度量可能更有用或更实用，其可以测量和表示为，例如，在目的温度下特定暴露时间后剩余活性百分比。在另一个定义中，热稳定性表示为解链温度，或Tm，即F<＝>U转变的中点，其中F是折叠蛋白质，U是去折叠蛋白质。造成Tm提高的任何突变称为稳定化突变。在本文中“较高的热稳定性”或“提高的热稳定性”可互换使用。提高Tm或t1/2的任何突变提高相关多肽或酶的热稳定性。在一些情况下，使用稳定性的其他度量，而不是测定Tm或t1/2。因为从折叠到去折叠的过渡可能是不可逆的，所以Tm并不总能正确地测定。在这些情况下，稳定性可定义为Tx，即百分之x的蛋白质在特定时间后仍保持功能的温度。如果在已知酶必须保持活性约1小时的特定应用中，酶之间的有用比较可以是60分钟的Tx，以保证在至少实际上要求的温度下60分钟后仍有可接受量的活性。当出现不可逆变性时，必须考虑在类似于下列条件下的测定是有用的，该条件中酶将会晚一些施加，例如温度、pH的条件或者氧化剂、去污剂或螯合剂的存在。
一般来说，在酶暴露于目的温度所需时间后，将在包括温度的标准测定条件下测定酶。热稳定酶也可以是热活性酶，即它们可在高温下测定时显示活性。本文使用的热稳定酶可以对热变性有抗性并且在高温下有活性。
“热稳定嵌合α-淀粉酶”是本文定义的嵌合α-淀粉酶，其相对于至少一种其所来源的淀粉酶具有提高的热稳定性。热稳定嵌合淀粉酶优选具有高于嵌合体所来源的较低热稳定性的淀粉酶的热稳定性，以及约相当于嵌合体所来源的较高热稳定性的淀粉酶的热稳定性。
“pH范围”表示从酸性至碱性条件酶显示催化活性的能力。使用α-淀粉酶的常用过程可包括跨越5个或更多pH单位的pH条件。本文使用的“pH稳定的”涉及酶在宽的pH范围内保持可测量活性的能力，例如1、2、3、4、5或甚至更多pH单位。除了pH稳定性之外，本文所述嵌合α-淀粉酶还可提供pH最佳值，其中在否则保持恒定的温度、时间、底物浓度和钙离子浓度的条件下，在特定pH或pH范围活性最大。
本文使用的“氨基酸序列”有时与术语“多肽”和/或术语“蛋白质”是同义的。在有些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“肽”是同义的；在有些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“酶”是同义的。在另一些情况下，上下文可以清楚的看出，“氨基酸序列”表示氨基酸侧链的实际序列(“一级序列”)或者多肽主链中的“残基”。例如，本文提供的序列表提供了多个多肽或多肽结构域的氨基酸序列。
本文使用的“核苷酸序列”或“核酸序列”表示寡核苷酸序列或多核苷酸序列(“多核苷酸”)以及其变体、同源物、片段和衍生物。该核苷酸序列可以是基因组的、合成的或重组来源的，可以是双链或单链的，不论是有义链还是反义链。本文使用的术语“核苷酸序列”包括基因组DNA、cDNA、合成DNA和RNA。同多肽一样，术语“核苷酸序列”也用于讨论沿多核苷酸主链的核苷酸或碱基的实际序列，即一级序列。
“同源物”表示与对象氨基酸序列或对象核苷酸序列具有某些程度同一性或“同源性”的实体。通常，同源物会包含与对象氨基酸序列相同的活性位点残基。同源物还保留α-淀粉酶活性，尽管同源物可具有与对象蛋白质不同的酶性质。“同源序列”包括与另一个序列具有一定百分比同一性的多核苷酸或多肽，例如至少约80％、85％、90％、95％或99％。
“百分比同一性”或“百分比序列同一性”表示对象序列或蛋白质中给定百分比的碱基或氨基酸残基是参考序列或蛋白质中存在的完全相同的碱基或残基，例如在比对中比较两个多肽序列时。氨基酸序列可能是类似的，但是不“相同”，其中相对于参考序列，氨基酸被取代、缺失或插入到对象序列中。对于蛋白质，百分比序列同一性优选在有关翻译后修饰的类似状态下的序列之间测定。通常，对象蛋白质的“成熟序列”，即在加工去除信号序列后剩下的序列，与参考蛋白质的成熟序列进行比较。在其他情况下，对象多肽序列的前体序列可以与参考序列的前体进行比较。
本文使用的“杂交”包括核酸链通过碱基配对与互补链结合的过程，以及聚合酶链式反应(PCR)技术中进行的扩增过程。编码嵌合α-淀粉酶的核酸可作为单链或双链DNA或RNA、RNA/DNA异源双链体或者RNA/DNA共聚物存在。本文使用的“共聚物”表示包含核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的单个核酸链。α-淀粉酶的编码核酸可以是通过改变核酸以含有特定生物中翻译天然蛋白质优先使用的核酸而“优化的”，以增加在特定生物中的表达。
本文使用的“合成”化合物由化学或酶催化合成产生。合成化合物包括，但不限于编码嵌合α-淀粉酶的核酸，优选由用于表达选择的宿主生物最佳的密码子使用产生。合成多肽或核酸也可使用体外方法制备，例如体外转录或翻译，或PCR等等。
本文使用的“转化的细胞”包括已经通过重组DNA方法转化的细胞，包括细菌和真菌细胞。通常通过插入一个或多个核苷酸序列到细胞中进行转化。插入的核苷酸序列可以是异源核苷酸序列，即待转化的细胞中天然不存在的序列，例如编码融合蛋白质或嵌合多肽的核酸。
本文使用的“有效连接”表示所述组分处于允许其发挥预定形式的功能的关系。例如，调节序列可以以在与调节序列相容的条件下实现编码序列表达的方式与编码序列“有效连接”。
本文使用的“生物学活性的”表示具有与天然序列类似的结构、调节或生化功能的序列，尽管程度不一定相同。例如，生物学活性的α-淀粉酶是具有可测量α-淀粉酶活性的多肽。
本文使用的“基因毒性可能”表示化合物，例如多肽、淀粉酶或包含它们的组合物，在体外或体内研究中具有“基因毒性”的可能。“基因毒性”是广义的术语，其表示遗传物质的任何有害改变，不论引起改变的机制如何。基因毒性化合物，在没有其他数据的情况下，管理机构和研究人员一般假定为跨物种致癌物质，暗示对人的危险。因此，这些化合物不一定接受长期致癌研究。但是，如果这些化合物预定长期施用给人，可能必须进行慢性毒性研究(最多1年)以检测早期致瘤作用。体外和体内试验的试验组方法可用于检测基因毒性。该试验组优选设计成减少具有基因毒性可能的化合物的假阴性结果的风险。化合物基因毒性可能的评定优选作为独立客观调查进行。这样的评定优选考虑体外和体内试验的全部发现和固有值以及限制。基因毒性任何测定的单阳性结果不一定意味着测试化合物具有针对人的基因毒性。基因毒性可能优选根据官方指南进行评定，例如“ICH Guideline on Specific Aspects of Regulatory Genotoxicity Tests”。本发明中，也考虑将FDA食品安全与应用营养中心提供的针对基因毒性试验的指南(58FR 16536，1993年3月29日)用于判定基因毒性可能。
本文所用的术语“淀粉”表示任何由植物的复合多糖糖类组成的物质。淀粉通常包括式(C6H10O5)x的直链淀粉和支链淀粉，其中X可以是任何整数。术语“颗粒态淀粉(granular starch)”表示原始的即未煮过的淀粉，例如未糊化(gelatinize)的淀粉。本文使用的“淀粉衍生物”表示任何改性或衍生的淀粉，例如通过物理或化学处理改变以使得性质改变用于食品加工或其他用途的任何淀粉。这些变化可包括改变的糊化性质，干淀粉或由其制备的浆液的流动性质，浆液或浆糊的颜色、透明度、稳定性，等等。例如，如甜食中使用的，酸变性淀粉由酸处理产生，其减少了由其制备的浆液或浆糊的粘性。淀粉的化学衍生物，例如醚和酯，显示例如下列的性质，即热水中糊化减少，对酸和碱的稳定性增加(“惰性”淀粉)。淀粉衍生物的实例包括，糊精烘焙淀粉、酸处理淀粉、碱处理淀粉、漂白淀粉、氧化淀粉、酶处理淀粉、磷酸单淀粉(monostarch phosphate)、磷酸双淀粉、磷酸化磷酸双淀粉、乙酰化磷酸双淀粉、乙酸淀粉、乙酰化己二酸双淀粉、羟丙基淀粉、羟丙基磷酸双淀粉以及辛烯基琥珀酸淀粉钠，以及多种盐或酯，特别是上述的脂肪酸酯。
如本文中所用，术语“糖化”指淀粉经酶转化成葡萄糖。
术语“液化”表示淀粉转化的一个阶段，其中糊化淀粉水解得到低分子量的可溶糊精。术语“聚合程度(DP)”指给定糖中脱水吡喃葡萄糖单元的数目(n)。DP1的例子是单糖类葡萄糖和果糖。DP2的例子是二糖类麦芽糖和蔗糖。本文使用的“相当液化过程”表示对照液化过程。液化过程在受控条件下进行，例如液化过程包括指定的温度、pH、钙离子浓度和底物浓度的条件。通过尽可能多的控制除酶差异之外的部分，相当液化过程提供了比较不同酶或酶混合物液化淀粉能力的方式。本文使用的“利于液化”或“利于液化过程”涵盖淀粉浆液化中任何程度的改善，例如使得液化过程更有效率、更有效、更经济或更容易(便利)。该术语包括减少所要求酶的数目或数量，减少淀粉浆的峰值或最终粘性，增加淀粉降解的速率或程度，或者产生任何特定DP或极限糊精的片段。利于液化还包括减少净能量需要，改善底物的利用，或者改善其他情况例如钙离子浓度或对钙离子变化的耐受，使用不同淀粉(即底物)来源、类型或浓度的能力，在优选pH水平或范围操作的能力，最终产物的量和品质等。
本文使用的术语“干燥固体含量”(ds)表示以干重计的浆液中的固体总量。干燥固体含量和干重组成通常表示为对象物质重量占总干物质重量的百分比。术语“浆液”表示液体(通常为水或类似溶剂)中含有不溶性固体的混合物。为测试淀粉酶或液化过程，淀粉或面粉经常悬浮于基于水的溶液中，形成浆液。
术语“DE”或“葡萄糖当量”定义为还原糖占总糖类的百分比。
本文使用的术语“发酵”或“发酵过程”表示有机物的分解以及再装配成其他物质，如本文所使用地，可涵盖任何“工业发酵”、“生化发酵”或“食品发酵”的过程。“工业发酵”泛指高度供氧和好氧生长条件，而“生化发酵”泛指严格的厌氧过程。对于大多数工业发酵过程来说，要求糖类底物作为能量来源，以产生多种药物和前体以及食品组分。在本文中提到发酵用于生产酒精(例如乙醇)例如用于燃料生产时，通常是氧限制、氧除去或者甚至完全厌氧的过程。生物燃料是来自可再生资源的燃料，例如来源于糖类底物发酵的乙醇。“食品发酵”包括制造酒精饮料(例如啤酒、白酒)、面包及其他发酵食品产品的发酵过程。优选的食品发酵是从糖类底物产生酒精或食用酸的发酵。
本文使用的“食品加工助剂”表示用作增加食品或食品成分吸引力或用途的制造助剂的物质，包括澄清剂、混浊剂、催化剂、絮凝剂、助滤剂和结晶抑制剂等等。食品加工助剂一般由管理机构定义，例如美国食品和药物管理局、澳大利亚新西兰食品标准、或者欧洲经济共同体(EEC)管理委员会。参见，例如21C.F.R§§170.3(o)的“定义”，其描述了美国可添加到食品中的直接人食品添加剂的物理或技术功能性作用。本文所提供的定义，包括“加工助剂”的定义，采用自科学院(National Academy ofSciences)/国立食品工业科研委员会国家机构，其根据下列协议向食品和药物管理局报告，该协议名为“A Comprehensive Survey of Industry on theUse of Food Chemicals Generally Recognized as Safe”(1972年9月)，其通过引用以整体并入本文。该报告的副本可获得自国家技术信息服务处(NTIS)，5285Port Royal Rd.，Springfield，VA 22161，或者国家档案局(National Archives and Records Administration，NARA)。
本文使用的“稳定化结构”表示使得蛋白质更加稳定的一级、二级、三级或四级结构，特别是如上文所述更具热稳定性。如果在给定情况下保持适当的或足够的折叠，则蛋白质是“稳定的”。根据本文的稳定化结构由一个或多个稳定化突变形成。出于本文的目的，稳定化蛋白质的一些方式不被认为是“稳定化结构”。因此，实现稳定性提高的基本方式多种多样，例如使用增加或降低的离子浓度、无机溶剂、使用较高或较低的蛋白质浓度、增加辅助蛋白质、优化保存温度或者从介质中去除蛋白酶。例如，钙结合蛋白和许多使用钙作为辅因子的酶通常在较高钙浓度下更稳定。但是，出于本发明的目的，“稳定化结构”不涵盖环境因素等，而是一级或更高级序列中或者来自其的化学结构，并且其改变了蛋白质的稳定性。
“螺旋加帽”是本领域已知且可用于本发明的稳定化策略。“螺旋加帽基序”是稳定化结构，其包含特定的氢键合和疏水性相互作用模式，其发现于蛋白质和肽螺旋的末端或其附近。此类基序的共有序列模式以及来自简单分子建模的结果已用于制定可用的螺旋终止拇指规则。参见例如Aurora和Rose，“Helix capping”Protein Science，7(1)：21-38(1998，ColdSpring Harbor Laboratory Press)。还参见Presta和Rose，“Helix signals inproteins.”Science，240：1632-1641(1988)。
本文使用的“盐桥”表示多肽一级序列中带相反电荷氨基酸残基(例如Asp-Arg)之间的氢键。在电荷彼此远离6-8埃或更近时，盐桥对蛋白质稳定性有贡献。因此，带电残基可以在一级氨基酸序列中远距离分离，只要在折叠时带电残基接近至电荷相互作用所需的距离内。盐桥通常在与其他盐桥相组合时更好地工作。因此，带电残基排列，例如+、-、+、-比结构中彼此远离的一对或两对带电残基更好地发挥作用。例如，嗜极端蛋白质，即来自嗜极端生物的蛋白质，例如热稳定蛋白质，经常具有许多盐桥。如果折叠蛋白质中所涉及残基仅有有限的自由度，则引入的盐桥作用得更好。
B.缩写
除非另外指明，否则适用下列缩写：AmyL    地衣芽孢杆菌α-淀粉酶Amy Q   解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶AmyS    嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶AAU     α淀粉酶单位ATCC    美国典型培养物保藏中心cDNA    互补DNAC.F.R.  美国联邦法规CFU     集落形成单位DE      葡萄糖当量(Dextrose Equivalent)DEAE    二乙氨基乙醇DNA     脱氧核糖核酸DNS     3，5-二硝基水杨酸DPn    n个亚单位的聚合度ds     干燥固体EC     酶分类委员会EEC    欧洲经济共同体EDTA   乙二胺四乙酸EGTA   乙二醇四乙酸FDA    食品与药品管理局FAO    联合国粮食与农业组织GLP    药品实验室管理规范GMP    药品生产质量管理规范GRAS   公认安全可靠HFCS   高果糖玉米浆HPLC   高效液相色谱HS     高级糖(DPn，其中n＞3)JECFA  食品添加剂联合FAO/WHO专家委员会kb     千碱基kJ     千焦LAT    地衣芽孢杆菌α-淀粉酶LU     液化单位mRNA   信使核糖核酸mg     毫克mL     毫升mt     公吨(1000kg)N      正常(Normal)NTIS   国家技术信息服务部PCR    聚合酶链式反应PEG    聚乙二醇ppm    百万分之一部分RO       反渗透RT-PCR   逆转录酶聚合酶链式反应SB       盐桥SDS-PAGE 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳SGA      优秀谷类淀粉酶(Superior Grain Amylase)SKBU/g ds每克干燥固体的α-淀粉酶单位。在测定条件下每小时一个α-淀粉酶单位糊化1.0g极限糊精底物。1X SSC   0.15M NaCl、0.015M柠檬酸钠，pH 7.0WHO      世界卫生组织w/v      重量/体积w/w      重量/重量μg      微克μL      微升
C.嵌合α-淀粉酶
在数个方面的第一个中，提供了长度约为480-515个氨基酸残基的嵌合多肽。嵌合多肽具有包含AmyL淀粉酶N端部分的约180个或更多连续氨基酸残基的氨基端结构域，以及包含AmyS淀粉酶羧基端部分的羧基端结构域。该嵌合多肽不具有AmyL淀粉酶或AmyS淀粉酶的一级氨基酸序列，但是，该嵌合多肽相对于至少AmyS淀粉酶具有提高的热稳定性。
本文所述的嵌合多肽或热稳定嵌合淀粉酶不涵盖于已知的淀粉酶序列中。例如，特别排除Sajedi等人在J.Biochem.Mol.Biol.40：315-324(2006)中公开的序列。也明确排除了超过本公开提交日一年以前的欧洲分子生物学实验室(EMBL)或者国家生物技术信息中心(NCBI)的公共数据库中提供的α-淀粉酶序列作为本文提供的嵌合多肽和热稳定淀粉酶的序列。在一个实施方案中，该嵌合多肽或热稳定淀粉酶不具有任何其他已知的α-淀粉酶的序列，例如Van Der Laan和Aehle的美国专利No：6,939,703，Svendsen等人的美国专利No.6,143,708或者-Frantzen等人的美国专利No.5,830,837中公开的那些。
该嵌合多肽通常包括α-淀粉酶的催化活性。常规使用中，α-淀粉酶攻击底物例如淀粉的直链淀粉和/或支链淀粉的随机α-1，4键，将它们转化为糊精。在这样的过程中，α-淀粉酶降低了粘度并增加葡萄糖当量(DE)。因此，α-淀粉酶经常用于液化和糊精化淀粉，通常在用于生产糖浆的浆液中或者在复合糖类发酵之前。它们还用于去除淀粉，例如清洁过程，以及在烘焙及其他应用中。
该嵌合多肽证明相对于其他α-淀粉酶例如AmyL或AmyS性能特征改变。这些特征可包括改变的稳定性、pH范围、氧化稳定性和热稳定性。尤其是，在多个实施方案中，该嵌合多肽提供更好的高温稳定性(即70-120℃)。它们也可在对钙的要求、钙离子浓度改变的抗性和/或活性对pH极限(即pH4.0至6.0，或者pH 8.0至11.0)耐受性提高上具有有利的性能。
许多已知的热稳定淀粉酶可在约55℃至约80℃或更高的温度下降解淀粉。本文提供的嵌合多肽可在暴露于最高约95℃或更高的温度后保留α-淀粉酶活性。因此，本文提供的嵌合多肽和热稳定嵌合淀粉酶有利地可用于高温液化，以及使用或需要高温的其他过程，例如烹饪、烘焙等。
在一个实施方案中，该嵌合多肽在N端结构域中包含至少一个相对于AmyL淀粉酶取代的氨基酸残基，即对应于嵌合体N端部分的嵌合体部分具有相对于AmyL淀粉酶N端部分序列的取代。这一取代优选用于提供稳定化的结构，或者稳定化结构的至少一部分，其提高了该多肽的热稳定性。通常，对于蛋白质的热稳定性而言，多个稳定化结构是本领域技术人员已知的。任何这些结构在该嵌合多肽的多个实施方案中胜任。如上所定义的，“稳定化结构”是使得蛋白质更稳定尤其如上定义更具热稳定性的一级、二级、三级或四级结构。
本文的稳定化结构由一个或多个稳定化突变形成，所述稳定化突变形成位于一级或更高级序列之中或由其产生并改变蛋白质稳定性的化学结构。
蛋白质在折叠与去折叠状态之间转换。稳定化结构使得折叠和去折叠蛋白质之间的平衡朝折叠状态移动(即朝平衡的左边：折叠蛋白质<--->去折叠蛋白质)。本领域中已知如何使得该平衡进一步朝左移动，即使得蛋白质更加稳定。使得去折叠形式不稳定和/或使得折叠形式稳定的修饰同样都是作为提供稳定化结构所希望的。确定什么样的结构在特定蛋白质中起稳定化作用的方法是本领域已知的。加入稳定化结构的一种方法包括使用相同蛋白质家族的更稳定成员已经在该位置使用的氨基酸残基。因此，来自不同来源的蛋白质多序列比对的研究是有用的。
如上定义，螺旋加帽(Helix capping)是一种产生稳定化结构的策略，其为本领域已知的并且可用于本发明。螺旋-加帽基序是稳定化结构，其包含在蛋白质和肽中的螺旋处或附近、末端发现的具体的氢键合和疏水性相互作用模式。螺旋加帽已被认为桥连二级结构的构象，形成超二级结构。在α螺旋中，前四个＞N--H基团和最后四个＞C＝O基团必须缺少螺旋内氢键。取而代之地，这些基团经常由替代性氢键配偶体加帽。已鉴定到不同的加帽基序，一些在螺旋N端，另一些在C端。这些基序的共有序列模式，以及来自简单分子建模的结果，已用于构成螺旋终止的可用拇指规则(rules of thumb)。多见例如，Aurora和Rose，“Helix capping”ProteinScience，7(1)：21-38(1998，Cold Spring Harbor Laboratory Press)。还参见Presta和Rose，“Helix signals in proteins.”Science，240：1632-1641(1988)。
增加熵稳定(例如通过取代Gly-＞X，或X-＞Pro，其中X是任何氨基酸残基)是产生稳定化结构的另一个策略。其他策略包括添加一个或多个二硫键、填充三维结构内的空腔，尤其是在与熵稳定相联合时，例如Gly-＞Ala、添加一个或多个盐桥，尤其是表面盐桥、除去埋藏的水分子(例如取代Ala-＞Ser)、增加氢键键合、增加螺旋部分或结构域中的螺旋结构(例如“螺旋倾向”)、增加形成链的结构域中的链结构(例如“链倾向”)。优选地，通过取代或突变一个或多个表面氨基酸残基引入稳定化结构，但是，取代或突变高水平蛋白质结构中埋藏的或者折叠蛋白质内部的氨基酸残基也可用于稳定化。可使用一个或多个稳定化点突变(“稳定化突变”)将稳定化结构(例如如上所述的以及本领域中其他已知的)合理地并入已知蛋白质序列内
稳定化结构一般提供了折叠蛋白质相对于去折叠蛋白质的吉布斯自由能(ΔG)的降低(从而使得折叠和去折叠蛋白质之间的热力学平衡朝着折叠形式移动)。本发明中稳定化结构还为该结构提供了能量，或者需要一定量的断裂能。例如，熵稳定需要约2-5kJ/M使其断裂，而螺旋加帽需要约1-8kJ/M的范围(平均约4kJ/M)。氢键提供了1-6kJ/M，对于每平方埃的此相互作用，疏水性相互作用提供了约100J/M的增益。盐桥可提供最高5kJ/M，半胱氨酸键(即二硫键)提供-10至10kJ/M。
在一个实施方案中，稳定化结构是至少部分由取代的氨基酸残基形成的盐桥。如本发明定义地，盐桥包括多肽一级序列中相反电荷氨基酸残基之间的氢键。折叠多肽中具有彼此相距6-8埃或更近的带电残基的盐桥是本发明优选的。因此，带电残基在一级氨基酸序列中可远远分开，只要在折叠时带电残基在电荷相互作用所需的接近程度之内。盐桥与其他盐桥相组合更加好用。带电残基排列，例如+、-、+、-，比仅仅一对或两对结构中彼此离开的带电残基更好用。因此，优选地，引入超过一个盐桥。据此，所提供的一些多肽和淀粉酶具有许多盐桥。在一个实施方案中，在折叠蛋白质中引入盐桥所涉及氨基酸残基仅具有有限的自由度。
在一个实施方案中，取代的氨基酸残基对应于AmyL淀粉酶中的187位。在某些实施方案中，嵌合多肽中Asp和Thr残基取代AmyL淀粉酶中连续的Ser残基(即Ser Ser)(在AmyS中Asp190和Thr191是关联位置)。出人意料地，在本文所提供的AmyL-AmyS杂化物或嵌合体的背景中，发现这些取代，例如S187D-S188T，显著增加嵌合多肽的热稳定性。如本文提供的工作实施例中更完整讨论地，其他研究人员之前报道过，其他背景下(例如AmyL类型序列)任何S187D取代导致热稳定性丧失或降低。其他取代，例如嵌合体其他酸性残基可取代具体AmyL淀粉酶中天然存在的其他残基。在一个实施方案中，N端连续氨基酸所基于的AmyL淀粉酶具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列。在其他实施方案中，AmyS淀粉酶具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列。在目前的优选实施方案中，AmyL和AmyS分别具有SEQ ID NO：1和2所提供的序列。
在多个实施方案中，本文提供的嵌合多肽具有与SEQ ID NO：1-17中的任意序列至少约95％的序列同一性。尽管序列同一性如此，本领域技术人员会了解本文提供的嵌合多肽可能不具有SEQ ID NO：1或2的精确或确切氨基酸序列。在一个实施方案中，嵌合多肽具有与SEQ ID NO：1-17中的任意序列至少约95％的序列同一性，特别地具有嵌合多肽中取代AmyL淀粉酶187位Ser残基(计数对应于AmyL中的氨基酸残基)的Asp残基。
正如以上的讨论，本文提供的嵌合多肽优选包含α-淀粉酶的催化活性。在95℃下孵育约20、30、40、50或60或更多分钟后，该淀粉酶优选保留其至少约50％的活性。在一个实施方案中，该嵌合多肽具有在95℃下孵育约60分钟后保留其至少约50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或更多活性的淀粉酶活性，或者甚至在95℃下孵育约60、65或70分钟，或者甚至约75、80、85％或更多分钟后保留其至少约80％活性。在一个实施方案中，活性的降低(如果有的话)不大于嵌合序列部分获得自的AmyL淀粉酶的对应降低，甚至是在95℃下孵育90或更多分钟之后。因此，在一些实施方式中，该时间段后没有显著或可测量的活性损失。
在一个实施方案中，所提供的嵌合多肽包括α-淀粉酶的催化活性，其具有比至少部分氨基端部分来源于的AmyL淀粉酶更高的比活。
在另一个方面中，本文提供了热稳定嵌合α-淀粉酶。该嵌合淀粉酶与上文提供的嵌合多肽具有许多共有的特征。热稳定嵌合淀粉酶具有包含来自AmyL淀粉酶N端部分的连续氨基酸序列的N端部分，以及包含AmyS淀粉酶C端部分的连续氨基酸序列的C端部分。热稳定嵌合淀粉酶具有大于AmyL淀粉酶的比活，以及大于AmyS淀粉酶的95℃下的热稳定性。该热稳定淀粉酶具有的一级氨基酸序列约为475-520个氨基酸残基长。
热稳定嵌合淀粉酶提供了许多应用益处或者性能益处。例如，在一个实施方案中，该热稳定淀粉酶其特征在于，在用于淀粉浆液化过程中时，该嵌合淀粉酶降低淀粉浆的峰值粘度，AmyS淀粉酶在相当的液化过程中同样如此。该热稳定嵌合淀粉酶还降低淀粉浆的最终粘度，AmyL淀粉酶在相当的液化过程中同样如此。对于本文的目的，“相当的液化过程”表示在受控条件下进行的过程，例如液化过程包括确定的温度、pH、钙离子浓度和底物浓度的条件。
热稳定性在本文中经常表述为在95℃下孵育之后淀粉酶保留活性的时间的量。在一个实施方案中，在95℃下孵育约30、40、50或甚至60或更多分钟后，该嵌合淀粉酶保留其至少约50％的活性。在另一个实施方案中，在95℃下孵育约60或更多分钟后，该嵌合淀粉酶保留其至少约60、70或甚至80％的活性。
在一个实施方案中，AmyL淀粉酶具有SEQ ID NO：1的序列，AmyS淀粉酶具有SEQ ID NO：2的序列。该嵌合淀粉酶具有与SEQ IDNO：1-17任一至少约95％的序列同一性，但是不是SEQ ID NO：1或2的淀粉酶，如上文针对嵌合多肽所述的。
该嵌合淀粉酶还包含N端结构域中相对于AmyL淀粉酶的至少一个取代氨基酸残基，使得提供至少一部分的稳定化结构，其提高了该多肽的热稳定性。针对嵌合多肽讨论了稳定化结构，该讨论同样适用于热稳定嵌合淀粉酶。如上所述，稳定化结构优选是至少部分由取代的氨基酸残基形成的盐桥。如该嵌合多肽，取代的氨基酸残基对应于AmyL或AmyS淀粉酶中的187和188位中的一个或两个，更特别地包含嵌合多肽中取代一个Ser残基的一个Asp残基和/或一个Thr残基，或者如果Asp和Thr残基均有，这取代AmyL淀粉酶中的两个连续Ser残基。
D.包含嵌合α淀粉酶的组合物
还提供了包含一种或多种具有α淀粉酶催化活性的嵌合多肽或者热稳定嵌合淀粉酶的多种组合物。该组合物包括例如酶浓缩物、酶混合物、纯化的酶、部分纯化的酶产品、食品添加剂以及含有嵌合α-淀粉酶的清洁产品。
这些组合物具有多种用途。该组合物还可提供超过一种嵌合多肽或淀粉酶或者其他淀粉酶，或其组合。该组合物可以是高度纯化的或者仅仅部分纯化。在某些实施方案中，就活性单位而言，它们是标准化的。该组合物可以多种物理形式提供，包括多种浓度和纯度的液体、凝胶、块、半固体或固体。该组合物适用于任何物理形式，只要在最终组合物中保留可测量的活性。因此，该组合物可以方便地冻干、浓缩、冷冻、喷雾干燥或者以多种已知的或可用的方式处理。该组合物可以标准大小提供，以用于商业应用，或者定制包装。
在一个实施方案中，该组合物包含本文所述或举例的嵌合淀粉酶。提供了包含下列一个或多个的特定组合物：(a)长度约为480-515个氨基酸残基的嵌合多肽，例如上文所述，并且具有包含AmyL淀粉酶N端部分的约180个或更多连续的氨基酸残基的氨基端结构域，还具有包含AmyS淀粉酶的羧基端部分的羧基端结构域，该嵌合多肽具有相对于至少AmyS淀粉酶提高的热稳定性，(b)长度约为475-520个氨基酸残基的热稳定嵌合α-淀粉酶，其具有包含来自AmyL淀粉酶N端部分的连续氨基酸序列的N端部分，还具有包含来自AmyS淀粉酶C端部分的连续氨基酸序列的C端部分，所述嵌合α-淀粉酶具有大于AmyL淀粉酶的比活以及高于AmyS淀粉酶的95℃下的热稳定性；以及(c)(a)嵌合多肽和(b)热稳定嵌合淀粉酶的任何组合。
该组合物还可包含一种或多种另外的多肽。本领域技术人员会了解该一种或多种另外的多肽可包含任何已知的酶活性物。因此，可添加多种另外的酶中的任何种以为组合物提供另外的用途或便利。在多个实施方案中，该另外的酶可包括一种或多种细菌β-淀粉酶，例如BBA、真菌α-淀粉酶例如澄解L、或葡糖淀粉酶、异淀粉酶、异构酶、蛋白酶例如真菌和细菌蛋白酶、纤维素酶、木质素酶(lignase)、半纤维素酶、脂肪酶、磷脂肪酶和角质酶。包含一种或多种本发明公开的嵌合α-淀粉酶以及上述任一项或多项的组合的组合物设想用于本发明。如上所述，真菌蛋白酶包括，例如，获得自曲霉属物种(Aspergillus spp.)的任何降解蛋白质的酶活性物，例如黑曲霉(A.niger)、泡盛曲霉(A.awamori)、米曲霉(A.oryzae)；毛霉属物种(Mucor spp.)，例如米黑毛霉(M.miehei)；根霉属物种(Rhizopus spp.)等等。β-淀粉酶(EC 3.2.1.2)是外切麦芽糖淀粉酶，其催化1，4-α-糖苷键水解成支链淀粉和相关的葡萄糖聚合物，从而释放麦芽糖。β-淀粉酶已从多种植物和微生物中分离到。参见Fogarty等人，PROGRESS IN INDUSTRIAL MICROBIOLOGY，第15卷，第112-115页(1979)。这些β-淀粉酶具有40℃至65℃范围的最佳温度，以及约4.5至约7.0范围的最佳pH。设想的β-淀粉酶包括，但不限于，来自大麦的β-淀粉酶BBA 1500，DBA，OptimaltTM ME，OptimaltTM BBA(Genencor International，Inc.)和NovozymTM WBA(Novozymes A/S)。
在一个实施方案中，该组合物制备或配制用作食品添加剂或适用于食品加工的处理助剂。还提供了包含本文公开的嵌合多肽或热稳定嵌合淀粉酶的食品级冻干组合物。这些组合物可用于烹调和烘焙应用，以及需要在DP方面改变淀粉性能的任何高温应用。
在制备或配制用作食品添加剂或者用于食品加工时，组合物必须满足或超过某些规定的要求。这些要求用作对本领域技术人员制备该组合物的指导。因此，本领域技术人员会了解，尽管规定的要求可能在各个国家之间有所不同，但是一般来说该组合物的重金属含量非常低，并且铅和砷也很低。特别地，总重金属含量优选不超过约40ppm，更优选小于约30ppm。特别地，组合物的铅含量不超过约10ppm，更优选小于约5或3ppm。组合物的含砷量小于约3ppm。在用标准方法检测时，组合物还是真菌毒素和抗菌剂含量阴性的。
对于其微生物学含量来说，该组合物也是干净的，优选当旨在用于食品添加剂用途或作为食品加工助剂时，至少在GMP或GLP标准的最低限下生产。尤其是，总活菌计数不超过约5x104CFU每克组合物。该组合物优选具有每克组合物不超过约40CFU的大肠杆菌计数。更优选，大肠杆菌计数不超过约每克30CFU。另外，如标准微生物测定法所测定地，该组合物没有可检出的沙门氏菌属(Salmonella)或志贺氏菌属(Shigella)。当嵌合淀粉酶在宿主细胞中产生时，该组合物将具有每克小于1CFU的生物。
另外，该组合物在毒性等方面具有良好的安全标准。在一个实施方案中，该组合物在合适的体外测定中不显示基因毒性可能。在动物的急性和/或亚慢性给药研究中，该组合物也不显示毒性作用。
出于食品添加剂或食品加工助剂的目的，生产优选是标准的，如许多商业使用的食物酶那样。因此，在整个生产过程中使用GMP，满足例如FDA或国际组织建立的食品酶的要求和规格，例如Food ChemicalsCodex(第4版，1996)，食品添加剂联合FAO/WHO专家委员会(JECFA)的Compendium of Food Additives Specifications，第1卷，Annex 1Addendum 9(2001)中(以及较早的相关附录)。例如，包含嵌合α-淀粉酶的组合物使用例如补料分批发酵的过程生产，例如在公认安全的生物中的浸没补料分批发酵，或者其具有用于此类目的的悠久历史，例如用于生产食品级酶制剂。
出于本发明的一些目的，合适的生物包括芽孢杆菌属(Bacillus)的革兰氏阳性细菌，包括例如的脂肪嗜热芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、短芽孢杆菌(B.brevis)和解淀粉芽孢杆菌。其他的，包括凝结芽孢杆菌(B.coagulans)、环状芽孢杆菌(B.circulans)、灿烂芽孢杆菌(B.lautus)、迟缓芽孢杆菌(B.lentus)、苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)和嗜碱性芽孢杆菌(B.alkalophilus)。可用于生产某些本文所述组合物的其他革兰氏阳性细菌包括变铅青链霉菌(Streptomyceslividans)和鼠灰链霉菌(S.murinus)。革兰氏阴性细菌，包括大肠杆菌(Escherichia coli)或假单胞菌属(Pseudomonas)物种，也可用于产生本文提供的某些组合物。
本文还提供了包含嵌合多肽和热稳定嵌合α-淀粉酶的组合物，其可用于利于从多种非淀粉(因此非底物)材料(例如织物、纸、玻璃、塑料、金属、帆布、瓷器等)去除该酶的底物(例如淀粉)。因为这些材料经常在洗涤或清洗过程中去除，所以在一个实施方案中该组合物包含一种或多种皂、清洁剂、清洗剂、氧化剂或螯合剂。在一个实施方案中，该组合物用作洗衣去污剂，在另一个实施方案中其为洗涤用去污剂。对于本文所述的这些及其他目的，该组合物可配制为凝胶。多种此类凝胶是本领域中已知的，并提供某些优点，例如，在作用于待去除的底物的酶的接触时间和条件方面，除此之外，还有对消费者或用户来说有吸引力且便利的使用形式。含括标准清洗剂和去污剂、肥皂、氧化剂和/或螯合剂要求α-淀粉酶活性或多或少不仅仅能够容许最终使用时的状态并且优选容许产品自身在更浓缩或极端条件使用时的状态。
E.嵌合淀粉酶的表征
蛋白质和酶，例如本文提供的嵌合多肽和热稳定α-淀粉酶可通过本领域已知的多种方法和技术来表征。核酸和一级多肽序列可用于比较和分析本文提供的淀粉酶。三维结构建模和/或物理结晶也是有用的。比活的测定经常用于表征酶。可在多种底物、温度、pH、钙浓度及其他因素的条件下使用本领域技术人员已知的标准测定或者基于测定淀粉酶的已知方法设计新测定来检测酶活性。测定酶的动力学性质，包括动力学常数例如在特定条件下的Vmax或Km，也可用于表征本文提供的嵌合淀粉酶。确定稳定性或测定的最佳pH的方法是本领域已知的，确定最大活性的最佳钙离子浓度以及嵌合多肽和热稳定淀粉酶保存期间最大稳定性的条件的方法也是已知的。
表征该嵌合多肽和热稳定α-淀粉酶在宿主细胞中的表达可以是有用的特征，例如在确定制备嵌合蛋白质和酶的过程的商业潜力中。为了评价宿主细胞中嵌合多肽和热稳定嵌合α-淀粉酶的表达，可测量所表达蛋白质的量，对应mRNA的存在或量，或者酶活性(例如通过监测底物向产物的转变)。合适的测定包括Northern和Southern印迹、RT-PCR(逆转录酶聚合酶链式反应)和使用合适的带标记杂交探针的原位杂交。特定宿主细胞中产生的嵌合多肽和热稳定嵌合α-淀粉酶的表达的量、表达速率或者最大回收的测量都是涉及本文所提供的嵌合多肽和热稳定嵌合α-淀粉酶表达的可用特征的实例。
因为嵌合多肽和热稳定嵌合α-淀粉酶在热稳定性和比活方面性能改变，所以在某些实施方案中，与α-淀粉酶例如AmyL或AmyS酶相比，它们对氧化剂、去污剂或螯合剂的稳定性改变。因此，测试也提供这些性能的嵌合多肽和热稳定嵌合α-淀粉酶可能是有用的，以发现更有用的α-淀粉酶。例如，对氧化剂、去污剂、螯合剂或甚至肥皂的稳定性增加可能在用于清洁过程例如清洗、洗涤、纺织品脱浆或去污的组合物中是有利的。本领域技术人员会了解，在其稳定性或对清洗剂例如去污剂、氧化剂、螯合剂或肥皂的耐受性方面对酶的表征，可通过将该多肽暴露于预期条件包括清洗剂，然后在标准条件下测定活性进行；或者通过在预期条件包括清洗剂下测定活性来进行。前者提供了有关多肽对苛刻条件稳定性的信息。后者提供了有关酶在苛刻条件具有催化活性的能力的信息。
相对于AmyS或AmyL酶，本文所述嵌合多肽和热稳定嵌合α-淀粉酶还可显示在给定温度半衰期延长。在多个实施方案中，半衰期可以增加约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％或更多，特别是在约55℃至约95℃或更高的高温下，特别是在约80℃或更高。如上所述，相对于嵌合体所来源的α-淀粉酶，特别是AmyS，在95℃或以上的稳定性提高的嵌合多肽和热稳定淀粉酶是尤其有用的。
在一个实施方案中，本文提供的嵌合多肽和热稳定嵌合α-淀粉酶具有与嵌合体所来源的淀粉酶例如AmyL型或AmyS型淀粉酶相同的pH稳定性。另一个方面中，该嵌合多肽和热稳定淀粉酶显示更大范围的对pH变化的稳定性，或者最佳pH或稳定范围移到该酶最终商业目的所需的范围。例如，在一个实施方案中，嵌合多肽和热稳定淀粉酶可在约pH 4.5至约pH 10.5降解淀粉。在相同条件下，嵌合多肽和热稳定淀粉酶可具有比AmyL或AmyS更长的半衰期或更高的活性(取决于测定)。在相同pH条件下，嵌合α-淀粉酶多肽还可具有长约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％或更长的半衰期。在另一个实施方案中，在相同pH条件下，该嵌合α-淀粉酶可具有比AmyL或AmyS更高的比活。所提供的嵌合多肽和α-淀粉酶可具有本文所列出的任何理想特性的组合。
F.编码嵌合α-淀粉酶的多核苷酸
在数个方面的另一个中，提供了编码如本文所述嵌合多肽的多核苷酸。因为所编码的多肽不是自然存在的，所以该多肽必须由人工制成，例如合成或者或许通过直接诱变和筛选程序来产生。特别地，该多核苷酸编码下列任一：(a)长度约为480-515个氨基酸残基的嵌合多肽，例如上文所述，并且具有包含AmyL淀粉酶N端部分的约180个或更多连续的氨基酸残基的氨基端结构域，还具有包含AmyS淀粉酶的羧基端部分的羧基端结构域，该嵌合多肽具有相对于至少AmyS淀粉酶提高的热稳定性，(b)长度约为475-520个氨基酸残基的热稳定嵌合α-淀粉酶，其具有包含来自AmyL淀粉酶N端部分的连续氨基酸序列的N端部分，还具有包含来自AmyS淀粉酶C端部分的连续氨基酸序列的C端部分，所述嵌合α-淀粉酶具有大于AmyL淀粉酶的比活以及高于AmyS淀粉酶的95℃下的热稳定性。
在一个实施方案中，该多核苷酸编码与SEQ ID NO：1-17中的任意序列具有至少约95％序列同一性的多肽。在多个实施方案中，所编码的多肽具有与SEQ ID NO：1-17中的任意序列至少约90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％序列同一性；但是，该多肽不具有SEQ ID NO：1或2的确切序列。
目前优选的多核苷酸在序列表中以SEQ ID NO：18-34举例说明，其分别编码具有SEQ ID NO：1-17的氨基酸序列的多肽。如本领域技术人员所知，多核苷酸中可能有相当大的变化，而不对编码的氨基酸序列产生显著改变。特别地，由于遗传密码的冗余(例如“摆动”)以及由于不同生物中的密码子使用偏好，显著的密码子变化是可能的。因此，在多个实施方案中，本文有用的多核苷酸具有与SEQ ID NO：18-34的多核苷酸有60％或更高同一性的序列。更优选地是与SEQ ID NO：18-34具有65、70、75或80％序列同一性的序列的多核苷酸。具有大于80％同一性的多核苷酸，例如，具有85％或90％同一性的多核苷酸，也优选用于本发明。类似地，与SEQ ID NO：18-34任一项有至少约90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％序列同一性的多核苷酸也可用于本发明。上述对于所有多核苷酸的讨论服从下列条件，即在任何情况下编码多肽都不应具有SEQ ID NO：1或2的确切序列，该多核苷酸也不应具有与SEQ ID NO：18或19任一100％序列同一性。本领域技术人员会了解，为了用于构建或产生新型嵌合淀粉酶，具有与SEQ ID NO：18和19有100％同一性的序列的多核苷酸可能是有用的，编码SEQ ID NO：1或2的氨基酸序列的多核苷酸亦如此，但是，这些多核苷酸不编码用于本发明的新型嵌合淀粉酶。
在一个实施方案中，该多核苷酸是基因组DNA，而在另一个实施方案中，该多核苷酸是cDNA。由于遗传密码简并性，本发明提供了可编码相同多肽的多个多核苷酸。多核苷酸还包括编码本发明提供的嵌合多肽或热稳定α-淀粉酶的mRNA。
在一个目前的优选实施方案中，为在来自微生物或植物的宿主细胞中表达嵌合多肽，通过修改多核苷酸组成以利于宿主细胞中优先使用的那些密码子，优化编码嵌合多肽或α-淀粉酶的多核苷酸。优化密码子使用的方法是本领域已知的。标准资源中可获得多种生物的密码子使用表，例如生物技术教科书或操作手册。
还提供了包含编码嵌合多肽和α-淀粉酶的多核苷酸的载体。考虑将任何保持多核苷酸、产生大量多核苷酸、操纵多核苷酸序列或者在体外或宿主细胞内表达多核苷酸的载体用于本发明。合适载体的实例在标准生物技术手册和教科书中提供，例如Sambrook等人，MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，第三版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York(2001)。
在一个实施方案中，优选载体可用于在宿主细胞表达编码的多肽，特别是在微生物细胞，例如细菌细胞，或者植物细胞中。可修改表达载体以适于瞬时表达嵌合α-淀粉酶，例如，用于在放大之前证实催化及其他性质。用于长期使用和大规模生产的表达载体优选适于稳定表达，例如通过整合进宿主细胞染色体，或者通过稳定并入自我复制多核苷酸序列。在一个实施方案中，通过包含与嵌合多肽或嵌合α淀粉酶的编码序列有效连接的调节序列的表达载体将载体、DNA构建物转移到宿主细胞中。
目前优选的载体包括pBR322和pUC载体，例如pUC18，以及特别的修饰物和其衍生物。这些载体是适用于微生物体系的一般公知的载体。在一个实施方案中，载体是pJH101t，一种pBR322衍生物，其适于整合进枯草芽孢杆菌，其含有来自pUC18的多克隆位点以及一些有用的芽孢杆菌属系列。参见例如Ferrari等人，J.Bacteriology，154：1513-1515，其通过引用并入本文，用以全部目的。本文中举例说明了pJH101t载体在构建表达嵌合淀粉酶的杂化物上的用途(参见下文实施例中的方法)。可使用载体骨架的修饰以利于定点诱变，例如，产生具有盐桥特征的嵌合体，等等。
还提供了包含载体的微生物细胞，包括酵母、真菌或细菌细胞，该载体包含编码嵌合多肽或α-淀粉酶的多核苷酸。在一个实施方案中，该载体是适于编码多肽在宿主细胞中表达的表达载体。在另一个实施方案中，提供植物细胞，该细胞包含植物表达载体。用于在多种宿主细胞中表达的载体是本领域中已知的，了解这些载体含有所需的调节序列，例如启动子等，以利于所编码多核苷酸的表达。用于芽孢杆菌属的示例性启动子包括来自AmyL、AmyQ、AmyM或AmyS的淀粉酶基因的启动子，以及来自枯草芽孢杆菌中xylA和xylB基因的启动子。在一个实施方案中，表达载体含有一个或多个强启动子，其为组成型或者可诱导的，用以表达或过量表达所编码的多肽。在另一个实施方案中，多核苷酸包括用于肽翻译后修饰的序列，例如将所表达的多肽运送出细胞，或者运送到宿主细胞内的特定区室，以利于从宿主细胞生产、分离或纯化多肽。例如，多核苷酸可包含一个或多个序列，使得嵌合多肽或α-淀粉酶最初与连接到一端的异源多肽(例如来自地衣芽孢杆菌的信号肽)一起产生，以促进表达的蛋白质从细菌宿主细胞分泌。该多核苷酸还可包含使得嵌合淀粉酶最初与“纯化序列”一起产生的序列，即该序列利于所表达蛋白质的纯化，其中“纯化序列”在纯化过程中切割掉或去除。
当宿主细胞是植物时，在一个实施方案中考虑该植物是用于淀粉生产的农作物。嵌合多肽或α-淀粉酶可以在该植物中过量产生。该嵌合多肽或淀粉酶可过量产生，并定位于植物用于淀粉储存的部分，例如种子。因此，可收获植物，可分离淀粉，嵌合α-淀粉酶活性物与淀粉共纯化。该实施方案在植物用于酒精发酵尤其是燃料乙醇时特别有用。
在一个实施方案中，宿主细胞来自食品加工助剂或食品添加剂生产可接受的生物。目前，优选来自地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌或嗜热脂肪芽孢杆菌的宿主细胞。用于细菌细胞的合适质粒包括在芽孢杆菌属中自我复制的载体，其是本领域已知的。在本文举例的一个实施方案中，宿主细胞是枯草芽孢杆菌SC6.1，其包含控制作用(competency)基因的木糖可诱导启动子。因此，在木糖存在时，细胞能够结合或摄取DNA，例如多核苷酸、载体及其他本文提供的构建物。
产生和使用嵌合多肽和α-淀粉酶的方法
制备和/或使用嵌合多肽和热稳定嵌合α-淀粉酶的所有方法可以与一种或多种任意分类或类型或活性的其他酶联系在一起，如上文本文提供的嵌合多肽、热稳定淀粉酶以及组合物的上下文中所述。根据本发明公开的另一个方面提供了产生该嵌合淀粉酶多肽的方法。在一个实施方案中，所提供的方法产生如上所述至少一个嵌合多肽或热稳定α-淀粉酶。该方法利用了选自下列的宿主细胞：地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和嗜热脂肪芽孢杆菌，其用于在其中表达蛋白质的发酵过程。该蛋白质包含：
长度约为480-515个氨基酸残基的嵌合多肽，并且具有包含AmyL淀粉酶N端部分的约180个或更多连续的氨基酸残基的氨基端结构域，还具有包含AmyS淀粉酶的羧基端部分的羧基端结构域，该嵌合多肽具有相对于至少AmyS淀粉酶提高的热稳定性，或者
长度约为475-520个氨基酸残基的热稳定嵌合α-淀粉酶，其具有包含来自AmyL淀粉酶N端部分的连续氨基酸序列的N端部分，还具有包含来自AmyS淀粉酶C端部分的连续氨基酸序列的C端部分，所述嵌合α-淀粉酶具有大于AmyL淀粉酶的比活以及高于AmyS淀粉酶的95℃下的热稳定性。蛋白质表达之后，该方法提供了至少部分纯化所表达多肽的步骤，由此产生组合物。
该发酵过程可以是任何类型，尽管补料-分批发酵过程，例如浸没补料-分批发酵可用于本发明。在某些实施方案中，所提供的方法还包括进一步纯化嵌合多肽的步骤，以制备纯化的组合物，其在体外测定中未显示基因毒性可能的证据；并且在急性和亚慢性施用动物研究中，没有毒性作用的证据。这些组合物可用作食品加工助剂，或者在某些情况下，用作直接食品添加剂。
该方法产生纯化或部分纯化的组合物，其包含不超过40ppm的总重金属，不超过5ppm的砷，不超过10ppm的铅，不超过5x104总的活生物(CFU/g)，不超过30个大肠杆菌(CFU/g)以及标准检测未检出沙门氏菌属、真菌毒素或抗菌活性。
在多个实施方案中，该方法也可用于制备部分纯化或纯化的组合物，其包含多于一种α-淀粉酶活性，在一些实施方案中，还包含至少一种其他的酶活性。
还提供了使用包含嵌合α-淀粉酶的组合物的方法。特别提供了液化复合糖的方法。液化淀粉浆液的方法包括：制备包含淀粉的浆液，将浆液加热到液化可接受温度，将包含下列一种或多种的组合物添加至浆液：(a)长度约为480-515个氨基酸残基的嵌合多肽，具有包含AmyL淀粉酶N端部分的约180个或更多连续的氨基酸残基的氨基端结构域，还具有包含AmyS淀粉酶的羧基端部分的羧基端结构域，该嵌合多肽具有相对于至少AmyS淀粉酶提高的热稳定性，(b)长度约为475-520个氨基酸残基的热稳定嵌合α-淀粉酶，其具有包含来自AmyL淀粉酶N端部分的连续氨基酸序列的N端部分，还具有包含来自AmyS淀粉酶C端部分的连续氨基酸序列的C端部分，所述嵌合α-淀粉酶具有大于AmyL淀粉酶的比活以及高于AmyS淀粉酶的95℃下的热稳定性，或者(c)其组合，该方法还包括在足以液化淀粉浆液的时间和温度下将浆液与组合物一起孵育。
本文使用的“液化”不表示切割每个可用的底物的键，而是表示至少部分水解复合糖类，如最终粘度的可测量减少、浆液DE的增加或者还原基团、糊精或α-麦芽糖单元增加的另一种度量所证明的。
在如所要求保护的方法的一个实施方案中，底物是淀粉或者包含直链淀粉或支链淀粉的糖类。该方法优选利用包含以干重计约15-40％淀粉的浆液。在一个实施方案中，以干重计，浆液包含约20-40％淀粉，在另一个实施方案中，浆液包含约30至约36或37.5％的淀粉。可使用更低量的淀粉，但是可能受到经济方面考虑的限制。最大粘度和相关因素，例如混合所需功率输入，可限制浆液中所用淀粉的最大量。本领域技术人员会了解制备淀粉浆中的实际所考虑的问题。
在一个实施方案中，加入组合物与在相当液化中所用的加入AmyS淀粉酶一样多地降低了浆液的峰值粘度，并且与在相当液化中所用的加入AmyL淀粉酶一样多地降低浆液的最终粘度。
液化方法的温度可以从室温至高于100℃，但是更优选约50℃至约95℃。在一个实施方案中，温度为至少约80℃至约100℃。液化可伴有的复杂温度时间曲线，例如，反应可起始自较低温度，通过本领域已知的方法增加至所需的最终温度。温度还可在特定的时间后或者在就粘度、DE值或液化的另一种度量而言到达所需终点后降低。因此，本领域技术人员会了解该方法不一定要求在特定温度持续特定时间，只要淀粉酶活性物可在所提供的温度和条件下发挥作用即可。除了一种或多种去污剂、氧化剂或螯合剂的存在与否之外，可影响活性的其他条件包括pH和钙离子浓度。
在一个实施方案中，液化是发酵的一部分。在一些实施方式中，发酵用于产生食品产品、食品添加剂、燃料或燃料添加剂。在一些优选实施方案中，发酵用于燃料或燃料添加剂，其为醇，优选乙醇或另外的低级醇(例如小于约C6-C8)。
在另一个实施方案中，浆液的最大(峰值)粘度降低至至少由单独使用AmyS产生的。在多个实施方案中，最终粘度至少是由单独使用AmyL所实现的，并且比过程中最大粘度低2-、3-、5-、10-、15-、18-、20-、21-、22-、24-、25-、26-、27-、28-、29-或者甚至30-倍。本领域技术人员会了解，粘度降低地越多，淀粉液化的越多，糊精生产得越多(或者所得液化淀粉的DE越高)。
另一个方面设想了其他酶与本发明提供的嵌合多肽、淀粉酶和组合物一起用于浆液液化和后续加工的用途。因此，两种或更多种α-淀粉酶可单独或与本文所讨论的其他酶联合使用。例如，第三种酶可以是另一种α-淀粉酶，例如酵母α-淀粉酶或者另一种α-淀粉酶，芽孢杆菌属α-淀粉酶或者非芽孢杆菌属α-淀粉酶。在液化过程中通过提高水解活性改进的液化增加了后续加工步骤的效率(参见例如WO 98/22613)。例如，结果可以是糖化步骤中对葡糖淀粉酶的要求降低。
另外的酶，例如β-淀粉酶，可与该多肽、淀粉酶或组合物一起或者在其中使用。适用于本发明的β-淀粉酶包括但不限于：来自大麦的β-淀粉酶BBA 1500、DBA、OptimaltTM ME、OptimaltTM BBA(Genencor International，Inc.)和NovozymTM WBA(Novozymes A/S)。
考虑用于组合物的另一种酶是葡糖淀粉酶(EC 3.2.1.3)。葡糖淀粉酶来自于微生物或植物。例如，葡糖淀粉酶可以是真菌或细菌来源的。示例性细菌葡糖淀粉酶有曲霉葡糖淀粉酶，特别是黑曲霉G1或G2葡糖淀粉酶(Boel等人(1984)，EMBO J.3(5)：1097-1102)或者其变体，例如WO 92/00381和WO 00/04136所公开的；泡盛曲霉葡糖淀粉酶(WO84/02921)；米曲霉葡糖淀粉酶(Agric.Biol.Chem.(1991)，55(4)：941-949)或者其变体或片段。葡糖淀粉酶有利地以不超过或甚至小于0.5葡糖淀粉酶活性单位(AGU)/g DS(即每克干固体的葡糖淀粉酶活性单位)的量存在。葡糖淀粉酶来源于曲霉属、篮状菌属物种(Talaromyces sp.)、厚孢孔菌属物种(Pachykytospora sp.)或栓菌属物种(Trametes sp.)，示例性实例有黑曲霉、Talaromyces emersonii、Trametes cingulata或者Pachykytosporapapyracea。在一个实施方案中，该过程还包括使用例如WO 98/22613中所公开类型的糖类结合结构域。
其他考虑的曲霉葡糖淀粉酶变体包括增加热稳定性的变体：G137A和G139A(Chen等人(1996)，Prot.Eng.9：499-505)；D257E和D293E/Q(Chen等人(1995)，Prot.Eng.8：575-582)；N182(Chen等人(1994)，Biochem.J.301：275-281)；二硫键，A246C(Fierobe等人(1996)，Biochemistry，35：8698-8704)；以及在A435和S436位引入Pro残基(Li等人(1997)Protein Eng.10：1199-1204)。其他考虑的葡糖淀粉酶包括篮状菌属葡糖淀粉酶，特别是来源于T.emersonii(WO99/28448)、T.leycettanus(美国专利No.RE 32,153)、T.duponti或T.thermophilus(美国专利No.4,587,215)的葡糖淀粉酶。考虑的细菌葡糖淀粉酶包括来自梭菌属(Clostridium)的葡糖淀粉酶，特别是C.thermoamylolyticum(EP 135138)和C.thermohydrosulfuricum(WO86/01831)。合适的葡糖淀粉酶包括来自米曲霉的葡糖淀粉酶，例如与WO 00/04136中SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列有50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或甚至90％同源性的葡糖淀粉酶。市售葡糖淀粉酶也是合适的，例如AMG 200L；AMG 300L；SANTM SUPER和AMGTM E(Novozymes)；300(Genencor International，Inc.)；AMIGASETM和AMIGASETM PLUS(来自DSM)；G900(Enzyme Bio-Systems)；以及G990ZR(黑曲霉葡糖淀粉酶和低蛋白酶含量)。葡糖淀粉酶可以0.02-2.0AGU/gDS或0.1-1.0AGU/gDS，例如0.2AGU/g DS的量添加。
可任选加入的另一种酶是脱支酶，例如异淀粉酶(EC 3.2.1.68)或支链淀粉酶(EC 3.2.1.41)。异淀粉酶水解支链淀粉和β-极限糊精中的α-1，6-D-支链糖苷键(α-1，6-D-glucosidic branch linkage)，其与支链淀粉酶的区别可在于异淀粉酶无法攻击支链淀粉以及异淀粉酶对α-极限糊精的作用有限。脱支酶可以本领域技术人员公知的有效量加入。
本发明中提供的多肽、淀粉酶和组合物可用于焙烘过程，它们可单独或以与其他酶的组合加入，用以多种目的中的任意目的。它们可以与其他淀粉酶一起加入，例如抗老化(anti-staling)淀粉酶，以预防或延迟老化，即焙烤产品的碎屑固化。抗老化淀粉酶的量通常为0.01-10mg酶蛋白/kg面粉，例如0.5mg/kg ds。可用于与本文提供的嵌合多肽、淀粉酶和组合物组合的其他抗老化淀粉酶包括内切淀粉酶，例如来自芽孢杆菌属的细菌内切淀粉酶。其他淀粉酶有麦芽糖α-淀粉酶(EC 3.2.1.133)，例如在一个实施方案中来自芽孢杆菌属。是示例性麦芽糖α-淀粉酶，其来自嗜热脂肪芽孢杆菌菌株NCIB 11837，描述于Christophersen等人，Starch 50：39-45(1997)。抗老化内切淀粉酶的其他实例包括来源于芽孢杆菌属的细菌α-淀粉酶，例如地衣芽孢杆菌或解淀粉芽孢杆菌。抗老化淀粉酶可以是外切淀粉酶，例如β-淀粉酶，例如来自植物来源，例如大豆，或者来自微生物来源，例如芽孢杆菌属。
在用于烘焙应用的某些实施方案中，磷脂肪酶也可与本发明公开的嵌合多肽、淀粉酶和组合物一起使用。该磷脂肪酶可具有A1或A2活性，以从磷脂除去脂肪酸形成溶血磷脂。其可以或可以不具有脂肪酶活性，即对甘油三酯底物的活性。该磷脂肪酶通常具有30-90℃范围的最佳温度，例如30-70℃。所加入的磷脂肪酶可以是动物来源，例如来自胰腺，例如牛或猪胰腺，蛇毒或蜂毒。或者，磷脂肪酶可以是微生物来源的，例如来自丝状真菌、酵母或细菌，例如其属或种。磷脂肪酶的示例性来源包括曲霉属，黑曲霉；网柄菌属(Dictyostelium)，盘基网柄菌(D.discoideum)；毛霉属，爪哇毛霉(M.javanicus)、大毛霉(M.mucedo)、细孢毛霉(M.subtilissimus)；脉胞菌属(Neurospora)，粗糙脉胞菌(N.crassa)；根毛霉属(Rhizomucor)，微小根毛霉(R.pusillus)；根霉属，少根根霉(R.arrhizus)、日本根霉(R.japonicus)、葡枝根霉(R.stolonifer)；核盘菌属(Sclerotinia)，大豆核盘菌(S.libertiana)；发藓菌属(Trichophyton)，红色发藓菌(T.rubrum)；维氏核盘菌属(Whetzelinia)，W.sclerotiorum；芽孢杆菌属，巨大芽孢杆菌属(B.megaterium)、枯草芽孢杆菌属；柠檬酸细菌属(Citrobacter)，弗氏柠檬酸细菌(C.freundii)；肠杆菌属(Enterobacter)，产气肠杆菌(E.aerogenes)、阴沟肠杆菌(E.cloacae)；爱德华氏菌属(Edwardsiella)、迟钝爱德华氏菌(E.tarda)；欧文氏菌属(Etwinia)，草生欧文氏菌(E.herbicola)；埃希氏菌属(Escherichia)，大肠杆菌(E.coli)；克雷伯氏菌属(Klebsiella)，肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae)；变形菌属(Proteus)，普通变形菌(P.vulgaris)；普罗威登斯菌属(Providencia)，斯氏普罗威登斯菌(P.stuartii)；沙门氏菌属，鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)；沙雷氏菌属(Serratia)，液化沙雷氏菌(S.liquefasciens)、粘质沙雷氏菌(S.marcescens)；志贺氏菌属(Shigella)，福氏志贺氏菌(S.flexneri)；链霉菌属(Streptomyces)，紫红链霉菌(S.violeceoruber)；耶尔森氏菌属(Yersinia)，小肠结肠炎耶尔森氏菌(Y.enterocolitica)；镰刀菌属(Fusarium)，尖孢镰刀菌(F.oxysporum)(例如菌株DSM 2672)。
该磷脂肪酶以焙烧后初始阶段过程中特别是前24小时改善面包软度的量加入。磷脂肪酶的量通常为约0.01-10mg酶蛋白/kg面粉，例如0.1-5mg/kg。磷脂肪酶活性物通常在约20-1000脂肪酶单位(LU)/kg面粉的范围内，其中脂肪酶单位定义为以阿拉伯树胶作为乳化剂，三丁酸甘油酯作为底物在30℃，pH7.0下每分钟释放1μmol丁酸需要的酶的量。
任选地，可将其他酶与抗老化淀粉酶和磷脂肪酶一起使用。该其他酶可以是第二种淀粉酶，例如淀粉葡糖苷酶、β-淀粉酶、环糊精葡聚糖转移酶，或者该其他酶可以是肽酶，特别是外肽酶、转谷氨酰胺酶、脂肪酶、纤维素酶、半纤维素酶，尤其是戊聚糖酶例如木聚糖酶，蛋白酶，蛋白质二硫异构酶，例如WO 95/00636中公开的蛋白质二硫异构酶，例如糖基转移酶、分支酶(1，4-α-葡聚糖分支酶)、4-α-葡聚糖转移酶(糊精糖基转移酶)或者氧化还原酶，例如过氧化物酶、漆酶、葡萄糖氧化酶、吡喃糖氧化酶、脂氧化酶、L-氨基酸氧化酶或者糖类氧化酶。该其他酶可以是任何来源的，包括哺乳动物和植物，特别是微生物(细菌、酵母或真菌)来源，可通过本领域通常使用的方法获得。
木聚糖酶通常是微生物来源的，例如来源于细菌或真菌，例如曲霉属菌株，特别是棘孢曲霉(A.aculeatus)、黑曲霉(参考WO91/19782)、泡盛曲霉(例如WO 91/18977)或者塔宾曲霉(A.tubigensis)(例如WO 92/01793)；来自木霉属菌株，例如里氏木霉(T.reesei)，或者来自腐质霉属(Humicola)菌株例如特异腐质霉(H.insolens)(例如WO 92/17573)。和Novozym是市售木聚糖酶制剂，其产生自里氏木霉。淀粉葡糖苷酶可以是黑曲霉淀粉葡糖苷酶(例如)。其他可用的淀粉酶产品包括A 1000或A 5000(可得自Grindsted Products，丹麦)和H或P(可得自Gist-Brocades，荷兰)。葡萄糖氧化酶可以是真菌葡萄糖氧化酶，特别是黑曲霉葡萄糖氧化酶(例如)。示例性蛋白酶有示例性脂肪酶可来自下列的菌株：嗜热丝孢菌属(Thermomyces)(腐质霉属(Humicola))、毛霉属、假丝酵母属(Candida)、曲霉属、根霉属或者假单胞菌属，特别是来自疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyceslanuginosus)(棉毛状腐质菌(Humicola lanuginosa))、米黑毛霉(Rhizomucor miehei)、南极假丝酵母(Candida antarctica)、黑曲霉、戴尔根霉(Rhizopus delemar)或少根根霉(Rhizopus arrhizus)或者洋葱假单胞菌(Pseudomonas cepacia)。在某些实施方案中，脂肪酶可以是脂肪酶A或脂肪酶B，例如其来自于南极假丝酵母，如WO 88/02775中所述，或者脂肪酶例如可来自米黑毛霉，如EP 238,023中所述，或者例如棉毛状腐质菌，如EP 305,216中所述，例如或者洋葱假单胞菌，如EP 214,761和WO 89/01032中所述。
本发明提供了清洗表面以去除不希望的或不想要的淀粉残渣的方法。该方法包括下列步骤：提供具有待去除淀粉残渣的表面，在允许去除淀粉残渣的条件下在足够的温度下将该表面与包含一种或多种嵌合多肽或α-淀粉酶的组合物相接触足够的时间。该表面可以是在任何材料上；例如，可以在盘、板、玻璃等上，或者其可以在衣服或布上。其还可以例如是工作台面或者工作面，或者任何类型的必须周期性或定期清洗的市售容器。
在一个实施方案中，该组合物包含至少一种其他酶，例如一种或多种蛋白酶、脂肪酶、其他淀粉酶或其组合。在另一个实施方案中，漂洗或大致去除残渣的步骤在接触步骤之前进行。该步骤去除了来自清洗过程的大量淀粉，使得酶针对剩余的更难以去除的底物进行作用。清洗方法可以在任何温度下进行，但是优选在接触步骤过程中的温度达到至少50-100℃。在一个实施方案中，该方法包括对表面灭菌的步骤，或者在去除残渣之后对表面进行蒸汽处理。在数个实施方案中，该组合物还包含至少一种去污剂、氧化剂、螯合剂或其组合。
在组合物包含一种或多种其他酶的实施方案中，尽管组合可包含任何有用的酶活性物，下列实施方案可提供特别的优点。
该组合物可包含2，6-β-D-果聚糖水解酶、一种或多种α-淀粉酶以及一种或多种其他清洗酶，例如蛋白酶、脂肪酶、角质酶、糖酶、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶、漆酶和/或过氧化物酶和/或其组合。一般说来，所选酶的性能优选与所选去污剂相容(例如pH-最佳值，与其他酶和非酶成分相容，等)，并且该酶优选以有效量提供。
来自任何来源的蛋白酶适用于本发明，包括来自动物、蔬菜或微生物来源的那些。化学修饰或改造的酶也是合适的。根据使用条件，蛋白酶可具有任何类型的已知活性或活性位点，例如丝氨酸的外切或内切蛋白水解活性，金属或碱性或酸性蛋白酶。碱性蛋白酶在某些实施方案中是优选的，如胰蛋白酶样蛋白酶。碱性蛋白酶的实例有枯草杆菌蛋白酶(subtilisin)，尤其是来源于芽孢杆菌属物种的，例如枯草杆菌蛋白酶Novo、枯草杆菌蛋白酶Carlsberg、枯草杆菌蛋白酶309(参见例如美国专利No.6,287,841)、枯草杆菌蛋白酶147以及枯草杆菌蛋白酶168(参见例如WO 89/06279)。胰蛋白酶样蛋白酶的实例有胰蛋白酶(例如猪或牛来源的)以及镰刀霉属(Fusarium)蛋白酶(参见例如WO 89/06270和WO 94/25583)。可用的蛋白酶实例还包括但不限于，WO 92/19729和WO 98/20115中描述的变体。合适的市售蛋白酶包括 PrimaseTM、DuralaseTM、和KannaseTM(NovoNordisk A/S)；MaxacalPM、MaxapemTM、ProperaseTM、Purafect OxpTM、FN2TM、和FN3TM(Genencor International、Inc.)。
可将任何类型的脂肪酶与本文提供的组合物联用。示例性的脂肪酶包括细菌或真菌来源的那些。化学修饰和改造的酶也可用于本发明。可用的脂肪酶实例包括但不限于：来自腐质菌(与嗜热丝孢菌同义)，例如棉毛状腐质菌(疏棉状嗜热丝孢菌)(参见例如EP 258068和EP 305216)和特异腐质霉(参见例如WO 96/13580)的脂肪酶；假单胞菌脂肪酶(例如来自产碱假单胞菌(P.alcaligenes)或假产碱假单胞菌(P.pseudoalcaligenes)；参见例如EP 218272)、洋葱假单胞菌(P.cepacia)(参见例如EP 331376)、斯氏假单胞菌(P.stutzeri)(参见例如GB1,372,034)、荧光假单胞菌(P.fluorescens)、假单胞菌属菌株SD 705(参见例如WO 95/06720和WO 96/27002)、P.wisconsinensis(参见例如WO96/12012)；芽孢杆菌属脂肪酶(例如来自枯草芽孢杆菌；参见例如Dartois等人Biochemica Biophysica Acta，1131：253-360(1993))、嗜热脂肪芽孢杆菌(参见例如JP 64/744992)或者短小芽孢杆菌(B.pumilus)(参见例如WO 91/16422)。设想用于制剂的其他脂肪酶变体包括例如下列中所述的：WO 92/05249、WO 94/01541、WO 95/35381、WO 96/00292、WO 95/30744、WO 94/25578、WO 95/14783、WO 95/22615、WO 97/04079、WO 97/07202、EP 407225和EP 260105。一些市售脂肪酶包括和Ultra(Novo Nordisk A/S)。
可用于本发明的聚酯酶包括但不限于，WO 01/34899(Genencor International，Inc.)和WO 01/14629(Genencor International，Inc.)中描述的那些，并且可包含在与本发明所述的其他酶的任何组合中。
组合物还可与其他α-淀粉酶相组合，其包含市售淀粉酶，例如但不限于TermamylTM、和BANTM(Novo NordiskA/S)，以及和(Genencor International，Inc.)。
任何类型或来源的纤维素酶，例如细菌或真菌来源的那些，可加入组合物或与其一起使用，化学修饰或改造的酶亦如此。合适的纤维素酶包括来自芽孢杆菌属、假单胞菌属、腐殖菌属、镰刀菌属、梭孢壳属(Thielavia)和枝顶孢属(Acremonium)。例如，产生自特异腐质霉、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)和尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)的真菌纤维素酶，其公开于美国专利No.4,435,307；5,648,263；5,691,178；5,776,757和WO 89/09259。示例性纤维素酶具有用于纺织品颜色保护的益处。这些纤维素酶的实例描述于例如EP 0495257；EP 531372；WO 99/25846(Genencor International，Inc.)、WO 96/34108(GenencorInternational，Inc.)、WO 96/11262、WO 96/29397和WO 98/08940。其他实例有纤维素酶变体，例如WO 94/07998、WO 98/12307、WO 95/24471、PCT/DK98/00299、EP 531315、美国专利No.5,457,046、5,686,593和5,763,254中描述的那些。市售纤维素酶包括and(Novo Nordisk A/S)；ClazinaseTM和HA(GenencorInternational，Inc.)；和KAC-500(B)TM(Kao Corporation)。
过氧化酶和氧化酶也适用于本发明提供的组合物中或者与其一起使用，其包括植物、细菌或真菌来源的酶。化学修饰和改造的酶也非常适用于本发明。可用的过氧化酶实例包括来自鬼伞属(Coprinus)的过氧化酶，例如来自灰盖鬼伞(C.cinereus)以及其变体，如WO 93/24618、WO 95/10602和WO 98/15257中所述的。市售过氧化酶包括例如GuardzymeTM(Novo Nordisk A/S)。
本发明还提供了使用本文所述嵌合α-淀粉酶处理纺织材料的方法。用淀粉酶处理纺织材料例如布的方法是本领域中已知的。所提供的方法可改善纺织材料例如织物或布的触感和/或外观。该方法包括将纺织材料与包含嵌合多肽或热稳定α-淀粉酶的液体相接触。在一个实施方案中，纺织材料是布或织物。在另一个实施方案中，在压力下用液体处理纺织材料。该液体通常是水溶液。
该方法通常在纺织过程期间或之后应用，例如布或织物的纺织。或者，该方法可在脱浆阶段使用，或者在进一步处理纺织材料的一个或多个其他步骤期间使用。该方法是可用的，因为在许多材料的纺织过程中，例如布和织物，材料(例如待纺织的纤维)受到相当多的机械张力。在纺织过程之前，特别是在商业织布机上，待纺织的材料经常涂覆有“胶料”，其包括淀粉或淀粉衍生物，以增加其拉伸强度并且防止断裂。本发明提供的嵌合多肽和热稳定淀粉酶可在纺织期间或之后施加，以去除这些胶料淀粉或淀粉衍生物。
本发明提供的嵌合多肽和嵌合α-淀粉酶可单独使用或者与其他脱浆化学试剂一起使用，例如去污剂和/或脱浆酶，从而使得纺织材料例如布脱浆，所述材料包括棉和含有棉的布。
本发明提供的嵌合多肽和α-淀粉酶还具有酶抛光方法方面的应用，其开发以用于服装，例如在工装牛仔裤的制造中。淀粉分解酶的作用可为布提供柔软度，使得棉更易于随后的酶抛光步骤(例如实现石磨洗的外观)。
本发明还提供了实施下列上述方法的试剂盒，所述方法即液化淀粉浆，从表面清洗淀粉残渣，以及处理纺织材料以去除包含淀粉或淀粉衍生物的涂层。该试剂盒包含至少一种本文提供的嵌合多肽或嵌合α-淀粉酶或者一种本文提供的组合物，以及实施相应方法的说明。
本文引用的所有参考文献通过引用以整体并入本文用以所有目的。提供了下文提供的工作实施例，以进一步描述和举例说明嵌合α-淀粉酶的某些方面，因此不应解释为限制。
实施例
方法
杂交菌株构建
所有嵌合核苷酸序列以全长合成基因订购自DNA 2.0(MenloPark，CA)。用EcoRI和BamHI限制性内切核酸酶消化全部质粒。根据制造商的方案，使用Qiagen凝胶提取试剂盒凝胶提取基因片段。类似地，用EcoRI和BamHI限制性内切核酸酶消化整合枯草芽孢杆菌载体pJH101t。琼脂糖凝胶分离之后，用Qiagen凝胶提取试剂盒凝胶提取约5kb质粒主链的条带并清洗。质粒pJH101t是最初分离自大肠杆菌的质粒pBR322的衍生物，其中用pUC18多克隆位点EcoRI/HindIII片段取代EcoRI/HindIII片段，用解淀粉枯草杆菌碱性蛋白酶(apr)基因终止子序列取代HindIII/BamHI片段，以及还含有天然枯草杆菌质粒pC194的HpaII/Sau3a片段，其在PvuII位点带有氯霉素乙酰转移酶(CAT)基因(平端)。(Ferrari，FA，Nguyen A，Lang D和Hoch JA(1983)Constructionand Properties of an Integrable Plasmid for Bacillus subtilis J.Bacteriology，154：1513-1515)。
使用来自Takara(Madison，WI)的DNA连接试剂盒，MightyMix将所有嵌合基因连接进入pJH101t的EcoRI-HindIII位点。根据制造商的方案，将5μL连接混合物转化进Invitrogen Oneshot Top10大肠杆菌化学感受态细胞。LA+50ppm羧苄青霉素平板用于选择转化体。
通过使用Qiagen Miniprep试剂盒从克隆提取质粒DNA筛选转化体以确定嵌合基因是否存在。然后，用EcoRI-BamHI消化质粒，看看是否存在约2.2kb条带，其标志着载体含有杂交基因。对于最终的确认，提取小量制备的DNA，由Sequetech(Mountain View，CA)使用下列测序引物测序：
Fred550-F 5’aaccgcggttgaagtcgatccc 3’(SEQ ID NO：35)
Fred610-R 5’cccggaaaatgaaaatgtgtcc 3’(SEQ IDNO：36)
Ethyl 1130-F 5’cgcacgttaatgaccaatactc 3’(SEQ ID NO：37)
Ethyl 1190-R  5’gcttggccgggctcggtgtcat 3’(SEQ IDNO：38)
该构建物命名为pJH101-AprFr186Et、pJH101-AprFr187Et等等(参见图1)，表示其中编码的嵌合淀粉酶。通过将5-10μL质粒添加到200μL感受态细胞，然后以250转/分钟在37℃下孵育1小时，将含有嵌合构建物的质粒DNA转化进冷冻枯草芽孢杆菌SC6.1感受态细胞(也称为BG3594comK，基因型：DaprE，DnprE，degUHy32，oppA，DspoIIE3501，amyE::xylRPxylAcomK-phleo))。SC6.1枯草芽孢杆菌细胞具有感受态基因(comK)，其置于木糖诱导启动子之下，因此使用木糖诱导DNA结合和摄入的感受态。将转化反应置于LA+5ppm氯霉素+1％不溶淀粉，在37℃下孵育过夜。
选择菌落周围的琼脂显示澄清(或光晕)的转化体，通过在LA+25ppm氯霉素+1％不溶淀粉上划线进行扩增。菌落周围的琼脂形成光晕反映出转化细胞产生淀粉酶的能力，该淀粉酶降解琼脂培养基中的不溶性淀粉。将平板在37℃下孵育过夜。选择具有较大光晕的菌落在摇瓶中培养。为了蛋白质表达的目的，将新鲜单菌落接种于5ml LB+25ppm氯霉素，在37℃下以250转/分钟孵育6-8小时。将30ml此预培养物加入装有30ml培养基(如下所述)的250ml烧瓶，培养基中添加有25ppm氯霉素和5mMCaCl2。将摇瓶在37℃下孵育60-65小时，伴随以250转/分钟混合。通过在锥形管以5000转/分钟离心20分钟收获培养物。将富含重组淀粉酶的培养上清用于测定。
培养基是富集的半合成(semi-defined)培养基，其基于MOP缓冲液，用尿素作为主要氮源，葡萄糖作为主要碳源，以及添加1％大豆蛋白胨用以强健的细胞培养。
为了构建具有盐桥突变的嵌合体，将初始主链载体pJH101-AprFr200Et(和202、228、249、254、259)用作定点诱变反应的模板，其使用Stratagene QuikChange定点诱变试剂盒。将50ng模板DNA用于PCR，其使用下列引物：
SS 187DT-200etc fwd5’-gcttgggattgggaagttgacacagaaaacggcaactatg-3’(SEQ ID NO：39)
SS 187DT-200etc rev5’-catagttgccgttttctgtgtcaacttcccaatcccaagc-3’(SEQ ID NO：40)
热循环条件为1X的95℃1分钟，18X的95℃50秒，60℃50秒，68℃8.5分钟，然后是1X的68℃7分钟，以及保持在4℃。PCR之后，添加1μL DpnI后将所有反应在37℃下孵育过夜。按照制造商方案，将1.5μL的消化后反应物转化进Invitrogen Oneshot Top10大肠杆菌化学感受态细胞。将反应物铺板于LA+50ppm羧苄青霉素。为了提取质粒DNA用于测序，在37℃下以250转/分钟将转化体培养于5mL LA+50ppm羧苄青霉素过夜。使用Qiagen Miniprep Kit按照制造商的方案提取质粒DNA。由Sequetech(Mountain View，CA)使用下列测序引物对质粒DNA测序：
Fred550-F 5’aaccgcggttgaagtcgatccc 3’(SEQ ID NO：35)
Fred610-R 5’cccggaaaatgaaaatgtgtcc 3’(SEQ IDNO：36)
Ethyl 1130-F 5’cgcacgttaatgaccaatactc 3’(SEQ ID NO：37)
Ethyl 1190-R 5’gcttggccgggctcggtgtcat 3’(SEQ IDNO：38)
在确定分离物具有正确序列之后，将10ml质粒DNA转化进100μl冷冻的枯草芽孢杆菌SC6.感受态细胞。转化体如上所述培养。
酶热稳定性测定
在该测定中，使用PCR热循环仪确定淀粉酶的热稳定性。在设定温度例如95℃下孵育之后如下测定淀粉酶淀粉酶的剩余活性，以标准时间间隔例如60分钟取样，以获得在该温度下的失活曲线。对于每个时间点，将110μl样品置于薄壁PCR管，在将管密封后在热循环仪中25℃下保持4分钟。温度斜坡升至例如95℃。当达到目标温度时，开始计时。经过合适的时间间隔，将管移走并置于冰上。如下所述使用Megazyme Ceralpha测定来测定样品的残余内切α淀粉酶活性。
Megazvme Ceralpha测定：该测定是公开的Megazyme内切α淀粉酶试剂盒K-CERA 08/05(AOAC Method 2002.01)(MegazymeInternational，Ireland)方案的修改。试剂管含有底物，其为非还原末端封闭对硝基苯麦芽庚糖苷(BPNPG7，54.5mg)和热稳定葡糖苷酶(pH 6.0，125U)。对于每个测定，将一个瓶的全部内含物溶于10.0ml的蒸馏水。将30mL测定缓冲液(50mM苹果酸钠、2.6mM CaCl2、50mM NaCl、0.002％Triton X-100，pH 6.7)添加到瓶溶液，将其的10ml等分试样冷冻备用。将缓冲液中的0.79mL底物溶液添加到(优选遮盖的)比色杯。将比色杯置于底座中，获得空白读数。然后，将10酶样品添加到比色杯，开始测定。测量400nm或410nm处的每分钟吸光度，针对稀释和蛋白质浓度对值进行修正。在相对于AmyS对照100％归一化之后，报告每个嵌合酶的％剩余活性。
通过DNA还原糖测试的比活测定
在该测试中，通过使用如下所述DNS还原糖检测法测量马铃薯淀粉底物中释放的葡萄糖，来确定嵌合酶相对于非嵌合酶的相对比活。
所用试剂：
缓冲液：200mM乙酸钠+2.5mM CaCl2和0.002％吐温20
DNS溶液：将8g NaOH溶于300mL水，将5g 3-5地乐酚水杨酸添加到该溶液并溶解，必要时加热。然后，将150g酒石酸钠钾添加到该溶液，将总体积补至500ml。
底物：4％马铃薯淀粉溶液(5.33g马铃薯淀粉溶于100ml水)。对于工作底物溶液，将1份缓冲液加至3份淀粉溶液。每天制备新鲜的底物溶液。
步骤：将110μl底物的等分试样加至200μl PCR管。将该管置于PCR热循环仪。通过首先将管保持在4℃几分钟开始程序。在此过程中，将10μl酶，用含有0.002％吐温20的缓冲液适当地稀释，加入该管。将管快速混合，一旦热循环仪达到所需95℃的反应温度，就通过加入10μl1％NaOH停止0时间点反应。在每个时间点，将一个反应管移出，并用10μl 1％NaOH停止。当所有反应完成时，将32.5μl的每个反应混合物置于另一个含有75μl水的200μlPCR管中。将100μl的DNS溶液加入每个管，彻底混合内容物。在PCR热循环仪中，将管在99℃下孵育5分钟。孵育后，将管冷却，将150μl每个反应混合物置于微量滴定板孔中，测量543nm的吸光度。使用葡萄糖作为标准品。比活值表示为mg葡萄糖/秒/mg酶。
4)粘度测量测定(玻璃炊具/粘度计方法)
在该测定中，在玻璃炊具/粘度计中测定淀粉酶在pH 5.8时导致的玉米淀粉底物溶液的粘度降低。用36％玉米粉干固体在蒸馏水分批新鲜配制玉米淀粉底物浆液，使用硫酸调节至pH 5.8。将浆液在大塑料烧杯中60℃下预孵育1小时。对于粘度测定，使用油浴将反应容器加热至110℃，在加热至温度的过程中反应容器周围有保温套(thernal coat)。将浆液倒入反应容器，伴随100转/分钟转速的搅拌。将稀释的α淀粉酶样品直接加入反应容器，使得用1.33U/gDS的量加至浆液。从反应容器除去保温套，使得容器在实验过程中保持在85℃。使用EUROSTAR/IKA Labortechnikcontrol-visc P7电子顶部搅拌器测量内部温度和粘度，最初10分钟每30秒有扭矩读数输出，然后每四分钟有扭矩读数输出，总共62分钟。
实施例1
由AmyL和AmyS序列创造新型嵌合淀粉酶
进行了制备AmyL和AmyS嵌合体的努力，从而将AmyL型酶(AmyL及其变体)与AmyS型酶(AmyS及其变体)的优选特征组合到单个酶中。理想地，所得嵌合酶将具有每种酶的最佳性能，例如类似于AmyL型酶的热稳定性，同高温下AmyS型酶对淀粉底物的高比活相结合。这些酶将可用于淀粉液化，例如乙醇生产，获得自它们的催化活性会理想地导致快速的粘度降低初速度和低的最终粘度。
由AmyL和AmyS构建了一系列嵌合分子(SEQ ID NO：4-17)。嵌合体包含来自AmyL(SEQ ID NO：1)的N端部分和来自AmyS(SEQ IDNO：2)的C端部分。该嵌合体的N端部分包含来自AmyL成熟多肽序列(SEQ ID NO：1)N端的最少186个氨基酸残基以及最多约260个这些氨基酸残基。嵌合体的剩余部分(即C端部分)包含来自AmyS成熟多肽序列(SEQ ID NO：2)C端部分的氨基酸残基。来自AmyS(SEQ ID NO：2)C端最多297-326个氨基酸残基，最少224-253个这些氨基酸残基。该嵌合体的C端部分都包含对应于AmyS成熟多肽序列(SEQ ID NO：2)484-486位的K-T-T氨基酸残基。该嵌合体一般根据AmyL衍生序列的最后残基命名。参见上文“方法”中的杂交菌株构建，以及图1对克隆过程的描述。
在工作实施例中构建下列嵌合α-淀粉酶用于本发明：
第一代嵌合体包括：186、187、200、202、228、249、254和259。
第二代嵌合体包括：200SB、202SB和228SB。
第三代嵌合体包括：249SB、254SB和259SB。
实施例2：
来自AmyL和AmyS酶的第一代嵌合α-淀粉酶的热稳定性筛选
第一代嵌合体由单交换突变体组成，其中如上所述嵌合淀粉酶的N端部分来源于AmyL，C端部分来源于AmyS。筛选热稳定性的嵌合淀粉酶为186、187、200、202、228、249、254和259。整个时间过程中在95℃下测定嵌合淀粉酶。在所示时间点移走样品，测量活性。对于每个嵌合体，将百分比活相对于酶保持在95℃，pH 5.6含有2.6mM CaCl2和50mM NaCl的50mM苹果酸盐缓冲液中的分钟数作图。测定条件如上文方法部分所述。对于每个酶，剩余活性计算为活性相对于未在95℃下孵育的酶活性的百分比。对照酶是AmyS对照(SEQ ID NO：3)。
结果和讨论。结果显示于图2。根据之前对AmyL和AmyS热稳定性已知或者认为的，在单交换嵌合体中，预期来自AmyL的氨基酸残基数目越多，嵌合体的热稳定性越强。但是，如图2所见，出人意料地发现，具有最少个数AmyL来源氨基酸残基的嵌合α-淀粉酶是热稳定性最强的。有趣地，含有来自AmyL的前187个残基的嵌合淀粉酶不是非常热稳定的，尽管仅相差187位的一个氨基酸残基。
实施例3：
来自AmyL和AmyS酶的第二代嵌合α-淀粉酶的热稳定性筛选：稳定化结构的加入
实施例2的稳定性数据显示，在所测试的嵌合α-淀粉酶中，仅含有AmyL序列的前186个氨基酸残基的嵌合体具有高热稳定性，而含有更多AmyL序列的其他嵌合α-淀粉酶不是热稳定的，包括187嵌合体，其与186嵌合体的差异仅在187位。数据表明，在187位用Ser残基替代Asp残基与187嵌合体热稳定性的缺乏直接相关，并且可能与含有多于186个来自AmyL的氨基酸残基的每个嵌合淀粉酶的热稳定性缺乏相关。
非常出人意料地，已知其他研究报道称，AmyL来源淀粉酶中突变S187D降低了淀粉酶的热稳定性。例如，Van Der Laan和Aehle的美国专利No.6,939,703公开了，尽管S187D突变体在某些测定中具有较高的比活，但是在所测试的所有钙离子浓度下S187D淀粉酶在93℃下具有比地衣芽孢杆菌野生型淀粉酶显著更短的半衰期。Svendson等人的美国专利No.6,143,708也公开了，地衣芽孢杆菌淀粉酶的S187D突变体具有提高的比活，但是他们还报道称，在70℃下pH 4.5或6.2时某个钙离子浓度范围内热稳定性显著降低。
因此，在本发明要求保护的嵌合淀粉酶的背景中，187位Ser改变为Asp增加热稳定性是完全出人意料的。为了验证这一假说，将突变S187D和S188T引入许多在第一代嵌合体的筛选中不具有高度热稳定性的嵌合α-淀粉酶。所检测的嵌合α-淀粉酶包括200SB、202SB和228SB。如实施例2，每个嵌合酶在95℃下的热稳定性与AmyS对照进行比较。如实施例2中进行剩余活性的测定和计算。
结果和讨论。第一组嵌合分子的热稳定性筛选的结果显示于表3中。出人意料地，实际上发现两个氨基酸残基的改变改善了嵌合体的稳定性。不受特定工作原理的限制，认为S187D和S188T突变可能帮助形成稳定酶的活性部位或者整体三级结构的盐桥，从而提高了热稳定性。尽管在AmyL氨基酸序列的背景中S187D突变使得针对热攻击不稳定，但是在本文嵌合淀粉酶的背景中，很明显S187D突变体中存在的Asp残基与来自分子AmyS部分的一个或多个氨基酸残基相互作用，导致稳定性提高。因此，例如具有来自AmyL序列的200、202以及甚至228个残基的嵌合淀粉酶具有良好的热稳定性，只要包含了盐桥或者其他稳定化结构。
实施例4
来自AmyL和AmyS酶的第三代嵌合α-淀粉酶的热稳定性筛选。盐桥稳定化嵌合体与较长AmyL序列的结合
基于实施例2和3对第一和第二代嵌合体的观察结果，认为具有的AmyL部分越长，相应地可产生的AmyS序列也越短。产生具有来自于AmyL的N端部分最多259个氨基酸残基的嵌合体，以确定是否可产生热稳定性提高同时比活也高的嵌合淀粉酶。
所测试的嵌合α-淀粉酶包括249SB、254SB和259SB。如前述实施例，测试每个嵌合酶在95℃下的热稳定性，并与AmyS对照进行比较。也如前述实施例进行剩余活性的测定和计算。
结果和讨论。第二组嵌合淀粉酶的热稳定性筛选的结果显示于表4中。可见，每个嵌合淀粉酶在所测试的条件下显示极好的热稳定性。这些第三代嵌合酶具有比未显示良好热稳定性的第一代酶多30-40％的AmyL序列，其显示合理的加入根据策略放置的稳定化结构，特别是盐桥，使得产生同时具有AmyL和AmyS的有利性质的嵌合α-淀粉酶。因此，这些酶可用于所有目前使用热稳定淀粉酶的应用，例如淀粉降解、HFCS生产、脱浆和清洗。由于其比活增加以及高热稳定性，所以它们尤其可用于淀粉液化过程，因为它们提供降低的淀粉浆峰值粘度以及低淀粉浆最终粘度。
实施例5
来自于AmyL和AmyS酶的嵌合α-淀粉酶的比活。
测试比活的嵌合α-淀粉酶为186、228和228SB。评价包括AmyL蛋白质(SEQ ID NO：1)和AmyS对照(SEQ ID NO：3)。这五种酶的比活测定如下：在75℃下使用马铃薯淀粉作为底物以及使用DNS还原糖测定来测定相对反应速率。
结果和讨论。比活比较结果以每秒每mg/ml酶产生的mg/ml葡萄糖显示于图5。所有三种嵌合淀粉酶显示在该高温下对底物的比活显著高于AmyL淀粉酶。
实施例6
杂交淀粉酶的粘度变化
在该实施例中，在粘度计中进行实验，以测量几种嵌合淀粉酶：186、228、202SB和228SB以及AmyS对照(SEQ ID NO：3)的粘度降低，其在pH 5.8下使用所述的粘度测量实验进行，使用具有扭矩读数输出的EUROSTAR/IKA Labortechnik Control-Visc P7电子顶部搅拌器。
结果和讨论。图6显示，对于几种所测试的淀粉酶嵌合体观察到整个玉米底物的粘度降低。与蛋白质稳定性所观察到的结果相一致(图2)，杂交体186在最终粘度上与AmyS对照相当。嵌合体228在这些条件下对粘度降低没有效果，与高温下其稳定性差相一致(图2)。在该测定中具有盐桥的嵌合体202SB和228SB都显示粘度降低。就具有盐桥的嵌合体228SB来说，峰值粘度与AmyS对照相同，最终粘度低于AmyS对照所观察到的(图6)，清楚地表明了性能的益处。
对本领域技术人员来说显而易见地，嵌合α-淀粉酶以及制备和使用这些嵌合淀粉酶的方法可以在不脱离本公开范围或精神的情况下进行修改或修饰。因此，这些修改和修饰包含在所附权利要求的范围内。

Claims (20)

1.嵌合多肽，其选自氨基酸序列SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15或SEQID NO：17。
2.根据权利要求1中的嵌合多肽，其包含下述α-淀粉酶的催化活性：
(a)在95℃下孵育30分钟后，保留其至少50％活性的α-淀粉酶；
(b)在95℃下孵育60分钟后，保留其至少60％或至少80％的催化活性的α-淀粉酶；
(c)比活大于AmyL淀粉酶的α-淀粉酶。
3.组合物，其包含权利要求1-2中任一项的嵌合多肽。
4.根据权利要求3的组合物，其(a)还包含一种或多种其他多肽；(b)包含一种或多种去污剂或清洗剂；或(c)配制用于食品或食品加工。
5.权利要求4的组合物，其中一种或多种其他多肽是酶。
6.多核苷酸，其编码权利要求1-2中任一项的嵌合多肽。
7.权利要求6的多核苷酸，其中密码子使用针对嵌合多肽在微生物或植物中的表达而优化。
8.载体，其包含权利要求6的多核苷酸。
9.权利要求8的载体，其是表达载体。
10.非植物的宿主细胞，其包含权利要求6或7的多核苷酸，或权利要求8或9的载体，并表达权利要求6或7的多核苷酸。
11.非植物的宿主细胞，其包含权利要求6或7的多核苷酸，或权利要求8或9的载体，并且不表达权利要求6或7的多核苷酸。
12.权利要求10或11的宿主细胞，其中所述宿主细胞是细菌。
13.权利要求10或11的宿主细胞，其中所述宿主细胞是食品加工助剂生产可接受的生物。
14.权利要求10或11的宿主细胞，其中所述宿主细胞是地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌或者嗜热脂肪芽孢杆菌。
15.产生包含根据权利要求1-2中任一项的嵌合多肽的组合物的方法，该方法包括：
使用选自地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌或者嗜热脂肪芽孢杆菌的宿主细胞用于表达所述嵌合多肽的发酵过程；以及
至少部分纯化所表达多肽，由此产生组合物。
16.液化淀粉浆的方法，其包括：
制备包含淀粉的浆液，
将浆液加热到液化可接受温度，
将包含根据权利要求1-2中任一项的嵌合多肽的组合物添加到浆液，以及
在足以液化淀粉浆的温度下将浆液与组合物孵育足以液化淀粉浆的时间。
17.清洁表面以去除淀粉残余的方法，其包括下列步骤：提供具有待去除淀粉残余的表面，在足以导致淀粉残余去除的温度下将该表面与下述组合物接触足以导致淀粉残余去除的时间，所述组合物包含根据权利要求1-2中任一项的嵌合多肽。
18.处理纺织材料的方法，该纺织材料之前已经与包含淀粉或淀粉衍生物的涂层相接触，该方法包括在足以从该纺织材料基本上去除该涂层的条件下，将该纺织材料与包含下述组合物的溶液相接触足以从该纺织材料基本上去除该涂层的时间，所述组合物包含根据权利要求1-2中任一项的嵌合多肽。
19.便于淀粉浆液化的试剂盒，所述试剂盒包含：
权利要求1-2中任一项的嵌合多肽。
20.便于淀粉浆液化的试剂盒，所述试剂盒包含：
权利要求1-2中任一项的嵌合多肽，以及
该试剂盒用于液化淀粉浆的说明书。
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