DE69534369T2

DE69534369T2 - Von der alpha-amylase aus b. licheniformis abgeleitete amylolytische enzyme mit verbesserten eigenschaften

Info

Publication number: DE69534369T2
Application number: DE69534369T
Authority: DE
Inventors: Metske Jan VAN DER LAAN; Wolfgang Aehle
Original assignee: Genencor International Inc
Current assignee: Danisco US Inc
Priority date: 1994-06-17
Filing date: 1995-05-02
Publication date: 2006-03-09
Anticipated expiration: 2015-05-03
Also published as: DE69534369D1; EP0772684B1; US6939703B2; EP0772684A2; CA2194571A1; AU685638B2; AU2524795A; US20030022346A1; DK0772684T3; WO1995035382A3; WO1995035382A2; CA2194571C; ATE301719T1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft amylolytische Enzyme, insbesondere α-Amylasen, die von Enzymen, wie sie in Bacillus licheniformis vorliegen, abgeleitet sind.
α-Amylasen hydrolysieren Stärke, Glycogen und verwandte Polysaccharide durch zufällige Spaltung von internen α-1,4-glucosidischen Bindungen.
Stärke besteht aus einer Mischung von Amylose (15–30% w/w) (Gewicht/Gewicht) und Amylopectin (70–85% w/w). Amylose besteht aus linearen Ketten von α-1,4-verknüpften Glucoseeinheiten mit einem Molekulargewicht (MW) von etwa 60.000 bis etwa 800.000. Bei Amylopectin handelt es sich um ein verzweigtes Polymer, das α-1,6-Verzweigungspunkte alle 24 bis 30 Glucoseeinheiten enthält, und dessen Molekulargewicht bei bis zu 100 Millionen liegen kann.
Stärke und insbesondere derivatisierte Stärke oder verdünnte Stärke sind für eine Reihe technischer Anwendungen bedeutsam, beispielsweise als Substrat für die Zucker- und Alkoholproduktion, als ein Zwischenprodukt bei der Polymerproduktion oder als technischer Hilfsstoff während der Herstellung von Textilien und Papier. Stärke ist auch die Hauptkomponente von Flecken, die von z.B. Schokolade, Brei oder Porridge auf Kleidern und Geschirr stammen.
Das Verdünnen von Stärke (thinning), auch als Verflüssigung bezeichnet (liquefaction), ist ein erster Schritt, der in den meisten vorstehend angegebenen Stärkeanwendungen notwendig ist. Dieser Verdünnungsschritt wird geeigneterweise unter Verwendung einer α-Amylase durchgeführt.
Die bisher eingesetzten α-Amylasen werden aus einer breiten Vielzahl von bakteriellen, pilzlichen, pflanzlichen und tierischen Quellen isoliert. Die industriell am häufigsten eingesetzten Amylasen sind jene, die aus Bacilli isoliert wurden.
Ein bekannter Nachteil von enzymatischen Reaktionen liegt darin, dass Enzyme nur über einen recht beschränkten Bereich von Bedingungen wie z.B. pH, Ionenstärke und insbesondere Temperatur, aktiv sind.
Die α-Amylase aus B. licheniformis ist eine der stabilsten im Hinblick auf die Temperatur, die bisher bekannt ist, und wird daher in Anwendungen eingesetzt, bei denen die Thermostabilität des Enzyms entscheidend ist. Jedoch hängt die Stabilität dieses Enzyms von der Calciumkonzentration in der Anwendung ab und die optimale Aktivität wird bei neutralem pH beobachtet. Eine thermostabilere Variante von dem B. licheniformis Enzym, die die gleiche spezifische Aktivität wie das Wildtyp-Enzym aufweist, ist in der PCT/EP90/01042 beschrieben worden.
In der PCT/DK93/00230 konnte gezeigt werden, dass es möglich ist, die Oxidationsstabilität von α-Amylase aus B. licheniformis zu verbessern, indem Methionine durch eine der weiteren 19 möglichen Aminosäuren ersetzt werden. In dem beschriebenen Test unter den gegebenen Bedingungen zeigte eine dieser Mutanten ein leicht höheres Aktivitätsniveau als das Wildtyp-Enzym.
Auch wenn gezeigt wurde, dass es möglich ist, die Stabilität von amylolytischen Enzymen zu verbessern, insbesondere von α-Amylasen, für einige der schädlichen Bedingungen, besteht bisher noch keine α-Amylase zur Verfügung, die die gleiche oder eine bessere Aktivität unter suboptimalen Bedingungen als das Wildtyp-Enzym bei optimalen Bedingungen aufweist. Suboptimale Bedingungen werden im Rahmen der vorliegenden Beschreibung als Bedingungen definiert, die einen pH verwenden, der von neutral verschieden ist, z.B. niedriger als 6,5 oder höher als 7,5, und/oder Bedingungen, die eine niedrigere als die optimale Ca²⁺-Konzentration verwenden, z.B. niedriger als 50 ppm.
Da bei den meisten industriellen Anwendungen die Bedingungen bestenfalls suboptimal sind, könnte das Problem einer verringerten Aktivität gelöst werden, indem ein Enzym bereit gestellt wird, das bei optimalen Bedingungen eine höhere Aktivität als das Wildtyp-Enzym aufweist. Es würde dann immer noch eine ausreichende Aktivität bei suboptimalen Bedingungen erzielen. Die vorliegende Erfindung stellt genau solche Enzyme bereit.
Die vorliegende Erfindung stellt ein amylolytisches Enzym bereit, das von dem amylolytischen Enzym aus Bacillus licheniformis abgeleitet ist, oder ein Enzym mit mindestens 70% oder vorzugsweise mindestens 90% Aminosäureidentität damit, umfassend:

i) einen Aminosäureaustausch an Position 188 der Aminosäuresequenz der α-Amylase aus Bacillus licheniformis, oder
ii) einen oder mehrere Aminosäureaustausche an Positionen, gewählt aus der Gruppe bestehend aus den Positionen 104, 187 und 128 der Aminosäuresequenz der α-Amylase aus Bacillus licheniformis, und mindestens einen zusätzlichen Aminosäureaustausch, der dem Enzym eine verbesserte Thermostabilität verleiht, gewählt aus der Gruppe bestehend aus His an Position 133 zu Tyr, und Thr an Position 149 zu Ile,

²⁺

Die Aminosäuresequenz der α-Amylase von B. licheniformis ist in der 1 dargestellt. Die Zahlen stehen für die Position einer Aminosäure in der Sequenz und werden als Hinweis auf die Aminosäureposition bei der Beschreibung der Aminosäureaustausche verwendet. Im Hinblick auf die entsprechenden Aminosäureaustausche in Enzymen mit mindestens 70% oder vorzugsweise mindestens 90% Aminosäureidentität mit der α-Amylase aus B. licheniformis ist es für den Fachmann selbstverständlich, dass die in der vorliegenden Beschreibung und den Ansprüchen verwendeten Aminosäurepositionen der α-Amylase aus B. licheniformis sich auf die entsprechenden konservierten Aminosäuren in der Aminosäuresequenz der verwandten Enzyme beziehen und nicht unbedingt auf deren Aminosäurepositionen in diesen Enzymen. Es ist ferner offensichtlich, dass diese entsprechenden konservierten Aminosäuren nicht zwangsläufig mit jenen der α-Amylase aus B. licheniformis identisch sind.
In einer zielgerichteten Mutagenese-Studie identifizierten wir Mutanten der Aminosäuresequenz, die das Aktivitätsniveau des Enzyms beeinflussen. Unter anderem führten wir die folgenden Mutationen durch: N104D, S187D, V128E und N188D, bei denen es sich um bevorzugte mutierte Enzyme gemäß der vorliegenden Erfindung handelt. Einige dieser Mutanten zeigten eine höhere Gesamtaktivität als das Wildtyp-Enzym. Alternativ dazu zeigten einige dieser Mutationen eine verbesserte Thermostabilität.
Auch wenn zielgerichtete Mutationen (site directed mutations) in der DNA, die für die amylolytischen Enzyme codiert, ein bevorzugter Weg zu den Enzymen gemäß der vorliegenden Erfindung darstellen, ist dem Fachmann bekannt, dass es verschiedene Wege zum Erhalten der Enzyme gemäß der vorliegenden Erfindung gibt, und dass diese folglich Teil der vorliegenden Erfindung sind.
Aufgrund der Tatsache, dass bisher nur 3D-Strukturen von nicht-bakteriellen α-Amylasen zur Verfügung standen, (z.B. L. Brady et al. Acta Cryst. B47 (1991), 527–535, H. J. Swift et al. Acta Cryst. B47 (1991), 535–544, M. Quian et al. J. Mol. Biol. 231 (1993), 785–799), ist es schwierig, für die α-Amylase aus B. licheniformisvorauszusagen, ob eine gewisse Aminosäure an einer gewissen Position irgendeinen Einfluss auf das Aktivitätsniveau des Enzyms haben kann. In der Regel ist eine 3D-Struktur notwendig, um solche Vorhersagen zu treffen, da die räumliche Orientierung der Aminosäuren deren Rolle im katalytischen Prozess bestimmt. Ohne eine 3D-Struktur des untersuchten Enzyms müssen die Ergebnisse von zielgerichteten Mutagenese-Experimenten an möglichen aktiven Stelle-Resten auf verwandten Enzymen (siehe z.B. L. Holm et al. Protein Engineering 3 (1990) 181–191, M. Vihinen et al. J. Biochem, 107 (1990) 267–272, T. Nagashima et al. Biosci. Biotech. Biochem. 56 (1992) 207–210, K. Takase Eur. J. Biochem, 211 (1993) 899–902, M. Sogaard et al. J. Biol. Chem. 268 (1993) 22480–22484) über ein "Multiple Sequence Alignment" (siehe z.B. L. Holm et al. Protein Engineering 3 (1990) 181–191) mit bekannten 3D-Strukturen in Verbindung gebracht werden. Dies ermöglicht die Identifizierung der Reste der aktiven Stellen und ermöglicht die Identifizierung von Resten, die in allen ähnlichen Enzymen konserviert sind. Es wird in der Regel davon ausgegangen, dass konservierte Reste für die Funktion oder die Struktur des Enzyms entscheidend sind. Es wird daher angenommen, dass Mutationen in diesen Stellen die Aktivität des Enzyms beeinflussen. Durch Vornehmen von Mutationen in diesen aktiven Stellen würde daher erwartet werden, dass einige Mutationen zu einer höheren Aktivität führen.
Bei B. licheniformis sind jedoch keine der mutierten Reste an der Position 104, 128, 187 und 188 aktive Stellen-Reste. Lediglich die Position 104 ist am Ende einer konservierten Region angeordnet und könnte möglicherweise für die Aktivität von Bedeutung sein, jedoch ist in diesem konkreten Fall eine korrekte Voraussage der Wirkung einer Punktmutation nahezu unmöglich.
Ein weiterer wichtiger Aspekt der vorliegenden Erfindung ist der Befund, dass in einer Reihe von Fällen die stärker aktiven Mutanten etwas weniger thermostabil als das Wildtyp-Enzym waren, außer zumindest den Mutationen V128E und N188D, die stabiler sind, oder zumindest thermostabiler als das Wildtyp-Enzym. Wir kombinierten diese folglich mit zuvor identifizierten Mutationen, von denen bekannt ist, dass sie das Wildtyp-Enzym stabilisieren. Dabei handelt es sich um die Mutationen H133Y und T149I. Diese Extramutationen stabilisierten in der Tat die aktiveren Mutanten, zeigten jedoch überraschenderweise sogar noch ein höheres Aktivitätsniveau als die stärker aktiven Mutanten selbst.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die Mutanten gemäß der Erfindung mit Mutationen kombiniert, die die Oxidationsstabilität des amylolytischen Enzyms verbessern. Solche mutierten Enzyme können Mutationen umfassen, die im Stand der Technik zur Verbesserung der Oxidationsstabilität von amylolytischen Enzymen bekannt sind, wie z.B. die Mutationen, die Methionin an Position 197 ersetzen (wie z.B. PCT/DK93/00230).
Wie vorstehend angegeben, ist ein geeigneter Weg zum Erhalten der Enzyme gemäß der vorliegenden Erfindung eine zielgerichtet Mutagenese einer Nukleinsäure, insbesondere eines DNA-Moleküls, das die codierende Sequenz für die Enzyme umfasst. Die mutierten Nukleinsäuremoleküle selbst sind ebenfalls Teil der vorliegenden Erfindung, die neue und erfinderische Zwischenprodukte bei der Herstellung der Enzyme darstellen. Ferner ist es durch Bereitstellung dieser Nukleinsäuren in einem geeigneten Vektorformat (wobei ein Vektor jedes geeignete Vehikel für eine Expression in einer Zelle umfasst) ferner möglich, die Nukleinsäure in einer breiten Vielfalt von unterschiedlichen Wirten zu exprimieren, einschließlich homologen und heterologen Wirten wie z.B. Bakterien und/oder weiterer Prokaryoten, Hefen, Pilze, Pflanzenzellen, Insektenzellen oder Säugerzellen und weiterer eukaryotischer Wirtszellen. Diese Wirtszellen, die kultiviert werden können, um die Enzyme zu produzieren, sind ebenfalls Teil der vorliegenden Erfindung.
Diese Zellen können nach bekannten Techniken kultiviert werden, die an die besondere Art der zu propagierenden Zelle angepasst sind. Die Isolierung der Enzyme gemäß der vorliegenden Erfindung aus der Kultur oder dem Kulturüberstand ist ebenfalls im Stand der Technik bekannt.
Eine Reihe von Mutanten werden aktiver (das heißt, höhere spezifische Aktivität) und/oder stabiler (im Hinblick auf die Oxidations- und/oder Thermostabilität) sein, selbst wenn lediglich Teile davon eingesetzt werden. Diese Fragmente sind selbstverständlich im Umfang der vorliegenden Erfindung enthalten. Es ist auch möglich, Mutationen auf der Basis der vorliegenden Erfindung zu entwickeln, die kaum irgendeinen Einfluss auf die Aktivität oder Stabilität aufweisen, wobei solche Derivate ebenfalls Teil der vorliegenden Erfindung sind. Einige reaktive Reste, die in den Aminosäuresequenzen gemäß der vorliegenden Erfindung vorliegen, können ferner auch chemisch modifiziert werden, ohne dass dies einen signifikanten Einfluss auf die Aktivität eines solchen Enzyms aufweist. Diese Derivate sind ebenfalls Teil der vorliegenden Erfindung.
Das gleiche kann für die Nukleinsäuren gemäß der vorliegenden Erfindung angegeben werden, die in einem gewissen Ausmaß modifiziert werden können, ohne die wichtigen Eigenschaften des resultierenden Enzyms zu beeinflussen. Folglich sind Nukleinsäuresequenzen, die mindestens 70% Identität, oder bevorzugter mindestens 90% Identität mit einer codierenden Sequenz für ein Enzym gemäß der vorliegenden Erfindung aufweisen oder die komplementär zu einer solchen Sequenz sind, ebenfalls Teil der vorliegenden Erfindung. Dies trifft auch zu, da es aufgrund der vorliegenden Erfindung möglich sein wird, in nahe verwandten Enzymen wie z.B. amylolytischen Enzymen aus B. stearothermophilus und B. amyloliquefaciens ähnliche Verbesserungen im Hinblick auf die Aktivität und/oder Stabilität zu erzielen.
Die neuen amylolytischen Enzyme gemäß der vorliegenden Erfindung können in sämtlichen bekannten Anwendungen von amylolytischen Enzymen aus dem Stand der Technik eingesetzt werden.
Diese Anwendungen umfassen die Verwendung bei der Verarbeitung von Stärke, zum Beispiel für die Polymerproduktion, bei welcher Stärke "verdünnt" werden muss, die Verwendung in Reinigungsmittelzusammensetzungen zum Auflösen von Flecken, die Stärke oder Stärkederivate umfassen, die Verwendung bei der Herstellung von Zucker oder Alkohol, oder die Verwendung bei der Verarbeitung von Textilien oder Papier, insbesondere die Verwendung zum Entschlichten von Textilien oder Papier.
Waschmittelzusammensetzungen, die die neuen amylolytischen Enzyme umfassen, sind ebenfalls Teil der vorliegenden Erfindung. Diese Zusammensetzungen können zum Geschirrspülen (entweder mit der Hand oder automatisch), für Haushalts- oder Industrie-Reinigungsanwendungen oder für Textilienreinigung vorgesehen sein. Diese Zusammensetzungen können übliche Additive und/oder Inhaltsstoffe wie z.B. Builder, oberflächenaktive Mittel, Bleichmittel und ähnliches enthalten.
Eine weiter bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist die Verwendung der Enzyme bei der Produktion von Sirup oder Isosirup aus Stärke. Sirup und Isosirup werden unter Verwendung einer α-Amylase gemäß der vorliegenden Erfindung produziert, welche die Verflüssigung (oder Verdünnung) der Stärke katalysiert, was zu Dextrinen mit einem durchschnittlichen Polymerisationsgrad von etwa 7 bis 10 führt, üblicherweise gefolgt von einer Verzuckerung der verflüssigten Stärke, was zu einem Sirup mit einem hohen Glucosegehalt führt. Gegebenenfalls kann der Sirup zu einer Dextrose/Fructose-Mischung isomerisiert werden, die als Isosirup bekannt ist.
Die vorliegende Erfindung wird im folgenden ausführlich durch die folgenden Beispiele erläutert, die lediglich der Veranschaulichung dienen.
Beispiele
Kurze Beschreibung der Figuren
Die 1 stellt die Aminosäuresequenz der α-Amylase von B. licheniformis dar. Die Zahlen beziehen sich auf die Positionen der Aminosäuren in der Sequenz. Sie werden verwendet, um die Mutationen zu identifizieren, die im Einbuchstaben-Aminosäurecode im Text der Anmeldung angegeben sind.
Die Nomenklatur, die für die Mutationen verwendet wird, ist wie folgt: S187D bedeutet den Austausch von dem Serin (Ser) an der Position 187 gegen eine Asparaginsäure (Asp). Mehrfach-Mutanten werden wie folgt bezeichnet: H133Y/T149I bedeutet den Austausch von Histidin (His) an der Position 133 durch Tyrosin (Tyr) plus den Austausch von Threonin (Thr) an der Position 149 durch Isoleucin (Ile).
2 zeigt eine Mappe des Plasmids pBHATLAT. α-Amylase: B. licheniformis α-Amylase kodierendes Gen. OripUB: Ursprung der Replikation des Plasmids pUB110. reppUB: Replikationsprotein des Plasmids pUB110. neo: Neomycin-Resistenzgen. bleo: Bleomycin-Resistenzgen. pHpaII: HpaII-Promotor. orifl: Ursprung der Replikation des Phagen fl. ori322: Ursprung der Replikation des Plasmid pBR322. bla: β-Lactamase (Ampicillinresistenz)-Gen. cat*: Inaktives Chloramphenicolacetyltransferase (Chloramphenicolresistenz)-Gen. p.Tac: Tac-Promotor.
Beispiel 1
Produktion und Reinigung von Wildtyp-Amylase und mutierten α-Amylase
a) Genetische Verfahren:
Alle molekulargenetischen Verfahren, die für E. coli verwendet wurden (Plasmidkonstruktion, Transformation, Plasmidisolierung usw.) wurden nach Maniatis et al. durchgeführt (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1989). Die Transformation von B. subtilis und die Plasmidisolierung wurden nach Harwood et al. durchgeführt (Molecular Biological Methods for Bacillus, Chichester, 1990). E. coli Stämme, die pBHATLAT oder dessen Derivate enthielten, wurden in Gegenwart von 100 mg/l Ampicillin und 2 mg/l Neomycin gezüchtet. Bacillus subtilis-Stämme, die pBHLAT 9-abgeleitete Plasmide trugen, wurden in einem Medium kultiviert, das 20 mg/l Neomycin enthielt.
Bei dem Plasmid pBHA/C1 handelt es sich um einen Bacillus/E. coli-Shuttlevektor, der von dem Zwillingsvektorsystem pMa/c5-8 von Stanssens et al. abgeleitet ist (Nucl. Acids Res. 17 (1989): 4441–4454). Eine vollständige Beschreibung von pBHA1 ist in der europäischen Patentanmeldung EP 414297 angegeben.
Das α-Amylasegen von B. licheniformis, das innerhalb der vorliegenden Studie eingesetzt wurde, wurde aus dem Plasmid pMcTLia6 (WO91/00353) als ein EcoRI-HinDIII-Restriktionsfragment, das nach wie vor den induzierbaren Tac-Promotor enthielt, erhalten. Dieses Fragment wurde in EcoRI-HinDIII-verdautes pBHA1 insertiert, um das Plasmid pBHATLAT zu ergeben (2). Dieses Plasmid wird für die Expression von α-Amylase in E. coli durch Induktion des Tac-Promotors durch 0,2 mM IPTG eingesetzt. Die Expression von mutierten α-Amylase wurde erhalten, indem das Wildtyp-α-Amylasegenfragment durch das korrespondierende mutierte Genfragment ersetzt wurde. Für eine Expression in Bacillus wurde das Plasmid pBHATLAT mit BamHI verdaut, und anschließender Relegation, wodurch das α-Amylasegen unter die Kontrolle des konstitutiven HpaII-Promotors gesetzt wurde. Wildtyp- und mutiertes α-Amylaseenzym wurden aus dem Bacillus-Kulturüberstand isoliert.
Eine zielgerichtete Mutagenese des α-Amylasegens wurde unter Verwendung der PCR-Überlappungsextensionstechnik durchgeführt, wie von Ho et al. beschrieben (Gene 77 (1989): 51–59).
b) Reinigung des α-Amylase-Wildtyps und der α-Amylase-Mutanten.
Ein Aliquot des Kulturüberstands wird zu fünf Aliquoten 85°C-warmen Wasser zugegeben und anschließend bei 75°C für 15 Minuten gehalten. Die Proteaseaktivität wird bei diesem Schritt entfernt. Das Enzym wird anschließend über eine Ionenaustauschchromatographie bei pH 5,5 auf einer S-Sepharose-FF-Säule isoliert. Die verwendeten Puffer waren 20 mM Natriumacetat-Puffer mit 1 mM CaCl₂, gefolgt, mit einem Gradienten, von 20 mM Natriumacetat-Puffer mit 1 mM CaCl₂ und 0,5 M KCl. Die vereinigten α-Amylasefraktionen wurden mittels Ultrafiltration über einen 10 kD-Filter konzentriert. Durch Waschen des Konzentrats mit 1,6 mM EDTA in 50 mM MOPS, ph 7,5, wurde das Enzym entmetallisiert. Schließlich wurde das Konzentrat zweimal mit 50 mM MOPS-Puffer pH 7,5 gewaschen.
Beispiel 2
Bestimmung der Aktivität und der Enzymkonzentration
Die Enzymkonzentration wird bestimmt, indem die optische Dichte bei 280 nm gemessen wird. Der Extinktionskoeffizient des Wildtyp-Enzyms liegt bei 135100 M^–1 cm^–1. Die Mutanten mit der Mutation H133Y besitzen einen Extinktionskoeffizienten von 136430 M^–1 cm^–1. Das Molekulargewicht liegt bei 55 kD.
Die α-Amylaseaktivität wird mittels des Substrates para-Nitrophenyl-maltoheptaosoid (4NP-DP7) bestimmt. Das Reagenz von Abbott (code LN5A23-22) wird verwendet.
Neben 4NP-DP7 liegen auch α-Glucosidase und Glucoamylase im Substrat vor. Die α-Amylaseaktivität wird durch die Endfreisetzung des Chromophors p-Nitrophenol (pNP) gemessen.
Die terminale Glucoseeinheit des Substrats wird mit einer Benzylidengruppe blockiert. Diese terminate Blockierung inhibiert die Spaltung durch α-Glucosidase, bis die Anfangsbindungen durch α-Amylase gespalten werden können, gefolgt von der Glucoamylase. Der Anstieg des OD405 pro Minute ist direkt proportional zur α-Amylaseaktivität.
Der molare Extinktionskoeffizient von pNP bei 405 nm und pH 6,8 liegt bei 7600 M^–1 cm^–1. 1 Einheit steht für 1 μmol umgesetztes Substrat pro Minute. Nach dem „Lambert-Beer"-Gesetz wird die folgende Beziehung aufgestellt: Aktivität =
worin t = Zeit [Minuten], l = Lichtpfad [cm], ε⁴⁰⁵ = molarer Extinktionskoeffizient bei 405 nm [M^–1 * cm^–1], OD405 = Extinktion bei 405 nm, 10⁶ = Berechnungsfaktor von mol/l → μmol/l
Aktivitäts-Assay:

– Zugabe von 0,8 ml Reagenzlösung (R1) zu einer Flasche R2 (Abbott).
– Erwärmen des temperaturgesteuerten Küvettenhalters des Spektrophotometers auf 37°C.
– Erwärmen des Aktivitätspuffers auf 37°C (50 mM MOPS + 50 mM NaCl + 2 mM CaCl₂, pH 6,8).
– Zugabe in die Küvette im Küvettenhalter von: 500 μl Reagenz x μl Probe 500 – x μl Aktivitätspuffer
– Messen des Anstiegs an Extinktion bei 405 nm während 2 Minuten.
– Berechnen der Aktivität unter Verwendung der vorstehend angegebenen Gleichung.

Tabelle 1 Spezifische Aktivitäten von Wildtyp-α-Amylase (WT) und mutierten α-Amylasen
Beispiel 3
Bestimmung der Thermostabilität
Das Enzym wird in einem Ölbad bei 93°C in geschlossenen Eppendorff-Mikroteströhrchen mit einem Sicherheitsverschluss inkubiert (Bestellnr. 0030 120.086). Die Calciumkonzentration wird variiert, während die Ionenstärke konstant gehalten wird. Der Puffer besitzt bei Raumtemperatur einen pH 7,5, der bei der Inkubationstemperatur auf einen pH 7,0 ansteigt. Eine Lösung von ± 0,25 mg/ml Protein in 50 mM MOPS pH 7,5 wird erhalten durch Mischen der richtigen Menge an Enzym an 50 mM MOPS pH 7,5 mit X mM CaCl₂ + X mM K₂SO₄ + 100 mM MOPS pH 7,5 + Wasser. Die Endpufferkonzentration muss bei 50 mM liegen und das Endvolumen sollte 500 bis 1000 μl betragen (am besten sind 1000 μl). Die Salzzusammensetzung ist in der folgenden Tabelle angegeben:
Beispiel für 0,5 mM CaCl₂:
250,0 μl 100 mM MOPS pH 7,5
88,0 μl Enzym (1,42 mg/ml)
50,0 μl 5 mM CaCl₂
72,5 μl 100 mM K₂SO₄
39,5 μl demineralisiertes Wasser
500,0 μl Gesamtvolumen
Die Enzymlösungen werden in fest verschlossenen Röhrchen bei 93°C inkubiert. 50 μl der Proben werden nach 0,5, 10, 20, 30, 60, 90 und 120 Minuten entnommen. Die Restaktivität wird mit dem Abbott-Quickstart-Amylase-Assay bestimmt (siehe vorstehend). Die Halbwertszeit wird unter Verwendung des Fittingprogramms GraFit berechnet (Leatherbarrow, R. J. 1990 GraFit version 2.0, Erithacus Software Ltd., Staines, UK).
Tabelle 2 Halbwertszeit von WT-α-Amylase und mutierten α-Amylasen bei unterschiedlichen Ca²⁺-Konzentrationen
Beispiel 4
Stärkeverflüssigung unter Verwendung einer mutierten α-Amylase gemäß der vorliegenden Erfindung
Es zeigte sich, dass das mutierte Enzym in dem Stärkeverflüssigungstest unter Verwendung von industriell relevanten Bedingungen wirksam war. Es wurde unter identischen Bedingungen im Vergleich mit dem Wildtyp-Enzym getestet.
Eine Stärkeaufschlämmung mit 34,3% Feststoffgehalt wurde unter Verwendung eines Jet-Kochapparats einer Pilotanlage, Hydroheater Modell # M 103-MS, verflüssigt, mit einer Fließgeschwindigkeit von 2,8 l pro Minute. Eine 5 minütige Retentionszeit bei 105°C der primären Verflüssigung wurde von einer 120 minütigen zweiten Verflüssigung bei 93°C gefolgt. Die Vergleichstests vis-à-vis dem Wildtyp-Enzym wurden auf der Grundlage von entsprechenden modifizierten Wohlgemuth-Einheiten (Modified Wohlgemuth Units (MWU)) 168 Einheiten/Gramm Stärke durchgeführt. Die spezifische Aktivität lag für den Wildtyp bei 18,447 MWU/mg und für H133Y/S187D bei 48,000 MWU/mg.
Die Enzyme wurden unter zwei Sets von Bedingungen getestet. Das erste Experiment verwendete industrielle Standardbedingungen (pH 6,4, 44 ppm Calcium), während das zweite Experiment Stressbedingungen verwendete (ph 5,8, 8 ppm Calcium).
Die Abnahme der Viskosität während der Verflüssigung wurde mit einem #3 Zahn-Cup gemessen, während die Dextroseäquivalent (DE)-Entwicklung unter Verwendung eines reduzierenden Zucker-Assays gemessen wurde. Die Ergebnisse sind in den folgenden Tabellen zusammengefasst:
Tabelle 3 Experiment 1: pH 6,4, 44 ppm Calcium
Tabelle 4 Experiment 2: pH 5,8, 8 ppm Calcium
Beispiel 5
Textilentschlichten unter Verwendung einer mutierten α-Amylase gemäß der Erfindung
Cretonne-Baumwollflicken (30·30 cm, J. Hacot et Cie., 48 Rue Mermoz, La Gorgue, Frankreich) werden mit 12% löslicher Stärke (Gewicht/Gewicht) als Schlichtmittel imprägniert. Die geschlichtete Baumwolle wird mit einem Liter Leitungswasser und 0,5 ml/l Netzmittel bei 25°C und pH 7,0 in einen Becher gegeben. α-Amylase wird in einer Konzentration, die in der Tabelle angegeben ist, zugefügt. Die Mischung wird gerührt und mit einem Gradienten von 2°C pro Minute während 30 Minuten auf eine Endtemperatur von 85°C erwärmt. Nach 10 Minuten Rühren bei der Endtemperatur wird der Stoff für zwei Minuten mit kaltem Wasser gespült und getrocknet.
Die Reststärke wird nach einem reflektometrischen Verfahren bestimmt. Die Reststärke auf den Fasern wird mit einer Lösung angefärbt, die aus 0,15 g Jod, 0,5 g Kaliumiodid und 10 ml 2 N H₂SO₄ in einem Volumen von 1 l Wasser hergestellt wurde. Die getrocknete Baumwollflicke wird mit Alkohol befeuchtet und in der Färbelösung für 15 Minuten eingetaucht. Die Reflektion des angefärbten Flickens wird bei 700 nm mit einem Reflektometer „Universal Messeinheit UME 1 III/LR 90 (Dr. Bruno Lange GmbH, Berlin, Deutschland) gemessen. Die Menge an Reststärke kann mit einer Kalibrierungskurve, die mit bekannten Stärkemengen auf dem Stoff aufgenommen wurde, berechnet werden.
Tabelle 5 Ein Vergleich der Performance der Wildtyp-Amylase und einer mutierten α-Amylase beim Entschlichten von Textilien
Beispiel 6
Ein Vergleich der Waschperfomance der Wildtyp-Amylase und einer mutierten α-Amylase
Die Waschperformance von dem Wildtyp gegenüber der Mutante H133Y/S187D wurde in einem großtechnischen Waschexperiment getestet, wobei der Amylase-empfindliche Baumwollteststoff EMPA 112 als Monitor verwendet wurde. In allen Tests lag die α-Amylasedosierung bei 1,3 mg/l Lauge. Eine Kontrolle wurde als Referenz genommen. Bei der Waschpulverbasis handelte es sich um das IEC Referenzreinigungsmittel A, das Bleichmittel und Protease enthält.
Alle Tests wurden 5mal durchgeführt. Die Stoffe wurden in einer Waschmaschine vom Typ Miele W701 bei 40°C und einer Gesamtbeladung von 4 kg Stoffen gewaschen. Die Schmutzentfernung wurde gemessen, indem die Reflektion von weißem Licht mit einem Reflektometer Cologard-Modell 05 (Gardner Lab., USA) gemessen wurde. Die folgende Tabelle stellt die Ergebnisse zusammen. Sie zeigt, dass die Mutante bei der gleichen Dosierung eine bessere Performance aufweist als der Wildtyp.
Tabelle 6 Ein Vergleich der Waschperformance der Wildtyp-Amylase und einer mutierten α-Amylase
Sequenzliste

Claims

Amylolytisches Enzym, abgeleitet von einer α-Amylase aus Bacillus licheniformis oder einem Enzym mit mindestens 70% Aminosäureidentität damit, dadurch gekennzeichnet, dass es umfaßt: i) einen Aminosäureaustausch an Position 188 der Aminosäuresequenz der α-Amylase aus Bacillus licheniformis, oder ii) einen oder mehrere Aminosäureaustausche an Positionen, gewählt aus der Gruppe bestehend aus den Position 104, 187 und 128 der Aminosäuresequenz der α-Amylase aus Bacillus licheniformis, und mindestens einen zusätzlichen Aminosäureaustausch, der dem Enzym eine verbesserte Thermostabilität verleiht, gewählt aus der Gruppe bestehend aus His an Position 133 zu Tyr, und Thr an Position 149 zu Ile.
Enzym gemäß Anspruch 1, worin ein oder mehrere der Aminosäureaustausche gewählt sind aus der Gruppe, die aus Asn an Position 104 zu Asp, Val an Position 128 zu Glu, Ser an Position 187 zu Asp, und Asn an Position 188 zu Asp besteht.
Enzym gemäß Anspruch 1 oder 2, umfassend einen Aminosäureaustausch an Position 188 der Aminosäuresequenz der α-Amylase aus Bacillus licheniformis und mindestens einen zusätzlichen Aminosäureaustausch, der dem Enzym eine verbesserte Thermostabilität verleiht, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus His an Position 133 zu Tyr, und Thr an Position 149 zu Ile.
Enzym gemäß einem der Ansprüche 1–3, das mindestens einen zusätzlichen Aminosäureaustausch umfaßt, der dem Enzym eine verbesserte Oxidationsstabilität verleiht, wobei der zusätzliche Aminosäureaustausch einen Austausch eines Methionins zu einer anderen Aminosäure umfaßt.
Enzym gemäß Anspruch 4, worin es sich bei dem Methionin um das Methionin an Position 197 handelt.
Nukleinsäuremolekül, das für ein Enzym gemäß einem der Ansprüche 1–5 kodiert, oder eine Nukleinsäure, die zu dieser Nukleinsäure komplementär ist.
Vektor zur Expression eines Enzyms gemäß einem der Ansprüche 1–5, umfassend eine Nukleinsäure gemäß Anspruch 6, zusammen mit geeigneten Elementen zur Expression.
Zelle zum Exprimieren eines Enzyms gemäß einem der Ansprüche 1–5, umfassend ein Nukleinsäuremolekül gemäß Anspruch 6 oder einen Vektor gemäß Anspruch 7.
Verfahren zur Herstellung eines Enzyms gemäß einem der Ansprüche 1–5, umfassend das Kultivieren einer Zelle gemäß Anspruch 8 in einem geeigneten Medium zur Expression des Enzyms und Isolieren des Enzyms nach geeigneter Dauer aus der Kultur oder dem Kulturüberstand.
Verwendung eines Enzyms gemäß einem der Ansprüche 1–5 bei der Verarbeitung von Stärke, bei der Produktion von Zuckersäften, Isozuckersäften oder Ethanol, beim Entschlichten von Textilien oder Papier, bei Brauverfahren, in Reinigungsmitteln oder in der Getränkeindustrie.
Reinigungsmittelzusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, dass sie ein Enzym gemäß einem der Ansprüche 1–5 umfaßt.